ES2343564T3 - Vectores de eiav con codones optimizados. - Google Patents

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Ekaterini Kotsopoulou
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Abstract

Uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico en una partícula retrovírica en una célula productora para generar un retrovirus de replicación defectuosa en una célula diana, en el que la secuencia nucleotídica está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y en el que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.

Description

Vectores de EIAV con codones optimizados.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a usos para la seguridad de vectores retrovíricos capaces de suministrar genes terapéuticos para uso en terapia génica, y a nuevas secuencias nucleotídicas para dicho uso.
Antecedentes de la invención
Los vectores retrovíricos se usan ahora ampliamente como vehículos para suministrar genes en células. Su popularidad deriva del hecho de que son fáciles de producir y median la integración estable del gen que portan al genoma de la célula diana. Esto permite la expresión a largo plazo del gen suministrado (1).
Durante cierto tiempo, ha habido un considerable interés en el desarrollo de sistemas de vectores retrovíricos basados en lentivirus. Los lentivirus son un pequeño subgrupo de retrovirus complejos. Contienen, además de los genes retrovíricos habituales (gag, pol y env), genes que les permiten regular su ciclo de vida e infectar células que no se dividen (2). Los sistemas de vectores basados en ellos son por lo tanto de interés debido a su uso potencial en la transferencia de un gen de interés a células que no se dividen, tales como neuronas. Además, los vectores lentivíricos permiten la expresión muy estable a largo plazo del gen de interés. Este se ha demostrado que es por lo menos tres meses para células neuronales de rata transducidas, mientras que los vectores a base de MLV sólo fueron capaces de expresar el gen de interés durante seis semanas.
El lentivirus usado más habitualmente es el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), el agente etiológico del SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). Los vectores a base de VIH han demostrado que transducen eficazmente células que no se dividen (3), y se pueden usar, por ejemplo, para dirigir genes terapéuticos anti-VIH a células susceptibles al VIH.
Sin embargo, los vectores a base de VIH tienen un número de desventajas significativas que pueden limitar su aplicación terapéutica a ciertas enfermedades. En particular, VIH-1 es un patógeno humano que posee proteínas y secuencias potencialmente oncogénicas. Existe riesgo de que la introducción de partículas vectoriales producidas en células que se empaquetan, que expresan gag-pol de VIH, introducirá estas proteínas en el paciente, conduciendo a la seroconversión.
Por lo tanto, se ha puesto énfasis en la seguridad de estos vectores. Una estrategia se fija en el diseño de sistemas de producción para vectores retrovíricos. Un sistema de vector retrovírico consiste básicamente en dos elementos, una estirpe celular de empaquetamiento, y un genoma del vector. La estirpe de empaquetamiento más simple consiste en un provirus en el que se ha suprimido la secuencia \psi (un determinante del empaquetamiento del ARN que en VIH se encuentra entre U5 y gag). Cuando se transfectan de forma estable en una célula, se producirán partículas víricas que contienen transcriptasa inversa, pero el ARN viriónico no se empaquetará dentro de estas partículas. El componente complementador en un sistema de vector retrovírico es el propio vector genómico. El vector genómico necesita contener una secuencia de empaquetamiento, pero gran parte de las regiones codificantes estructurales se pueden suprimir. A menudo se incorpora en el vector un gen marcador seleccionable, u otra secuencia nucleotídica de interés. Entonces, los lotes de vectores de la estirpe de empaquetamiento se pueden usar para infectar células diana. Si la célula es infectada con éxito por la partícula vírica, la secuencia del vector genómico se transcribirá de forma inversa y se integrará por la maquinaria retrovírica. Sin embargo, la infección es un proceso final, de forma que no debería ocurrir ninguna replicación o diseminación posterior del vector.
Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, se encuentran problemas en el diseño de vectores retrovíricos seguros y eficaces. Estos incluyen la posibilidad de que la recombinación entre el vector de empaquetamiento y la secuencia de empaquetamiento puede conducir a la generación de virus competente para la replicación de tipo salvaje. En consecuencia, se han realizado esfuerzos para mejorar la seguridad de los constructos de células de empaquetamiento.
En las estirpes celulares de empaquetamiento de segunda generación, además de la supresión de la secuencia de empaquetamiento, también se suprimió la 3'LTR, de forma que son necesarias dos recombinaciones para generar un virus de tipo salvaje.
En estirpes de empaquetamiento de tercera generación, los genes gag-pol y el gen env se colocan en constructos separados que se introducen secuencialmente en las células de empaquetamiento, para evitar la recombinación durante la transfección.
Con respecto a la señal de empaquetamiento, el documento EP 0.368.882A (Sodroski) describe que en VIH corresponde a la región entre el donante de corte y empalme principal de 5' y el codón de iniciación de gag, y particularmente corresponde a un segmento justo en dirección 3' del donante de corte y empalme principal de 5', y alrededor de 14 bases en dirección 5' del codón de iniciación de gag. Esta región es la que Sodroski enseña que se debe de suprimir del casete de gag-pol. El documento WO 97/12622 (Verma) describe que en VIH-1 se puede realizar una supresión interna de 39 pb en la secuencia \psi entre el sitio donante de corte y empalme de 5' y el codón de partida del gen gag.
Se puede usar el bamboleo de codones para reducir la frecuencia de recombinación a la vez que se mantiene la secuencia proteica primaria de los constructos, véase (4) en el que la región de solapamiento entre los constructos de expresión de gag-pol y env se redujo hasta 61 pb que se extienden a lo largo de la región común entre pol y env que están en marcos de lectura diferentes. Se introdujeron mutaciones de transversión en los 20 codones finales de pol, reteniendo la integridad de la región codificante a la vez que se reduce la homología con env hasta 55% en la región de solapamiento. De forma similar, se introdujeron mutaciones de bamboleo en el 3' de env, y se suprimieron todas las secuencias en dirección 3' del codón de parada de env.
Los vectores eficientes contienen habitualmente parte de gag en el vector genómico, para incrementar el título de viriones. A diferencia de la secuencia de empaquetamiento que puede estar en cualquier posición dentro de una secuencia para efectuar el empaquetamiento, la secuencia de gag debe de estar en su posición nativa adyacente a \psi para que tenga algún efecto.
Se apreciará que, mientras se pueden hacer mejoras significativas en el diseño de células de empaquetamiento y vectores, todavía hay alcance para un refinamiento adicional de las estirpes de empaquetamiento actuales.
Sumario de la invención
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar partículas retrovíricas, en particular partículas lentivíricas, y particularmente aquellas que poseen constructos nucleotídicos que codifican proteínas terapéuticas, que tengan seguridad mejorada con respecto a la partícula vírica de tipo salvaje correspondiente. En el documento WO 99/41397 se describe la optimización de codones de los genes gag-pol como un medio para superar el requisito de Rev/RRE para exportar y para potenciar la estabilidad de ARN. Sin embargo, ahora se ha encontrado que la secuencia de gag-pol con codones optimizados resuelve los problemas de recombinación potenciales con genomas vectoriales que poseen parte de una secuencia de gag con el objeto de incrementar el título. Esta estrategia también evita la necesidad de usar regiones de gag procedentes de diferentes virus en los constructos de empaquetamiento y de genomas vectoriales.
Otra ventaja significativa proporcionada por la invención es que la optimización de codones interrumpe las estructuras secundarias de ARN, tal como la señal de empaquetamiento, haciendo así al ARNm de gag-pol no empaquetable. De este modo, la presente invención permite que se retenga la secuencia retrovírica en dirección 5' del codón de iniciación de gag, en contraste con Sodroski y Verma, sin comprometer significativamente la seguridad.
Exposición de la invención
En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona el uso de una secuencia nucleotídica que codifica las proteínas gag y pol retrovíricas, capaz de ensamblar un genoma de vector retrovírico en una partícula retrovírica en una célula productora, para generar un retrovirus con replicación defectuosa en una célula diana, en el que la secuencia nucleotídica está optimizada en codones para la expresión en la célula productora, y en el que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16. En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico en una partícula retrovírica en una célula productora para evitar el empaquetamiento del genoma del vector retrovírico en una célula diana, en el que la secuencia nucleotídica está optimizada en codones para la expresión en la célula productora, y en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV; y la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico, que comprende por lo menos parte de una secuencia nucleotídica de gag, en una partícula retrovírica en una célula productora para evitar la recombinación entre dicha secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol y la por lo menos parte de una secuencia nucleotídica de gag, en el que la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en codones para la expresión en la célula productora, y en el que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
De otro modo, la presente invención proporciona un método para producir un retrovirus de replicación defectuosa, que comprende transfectar una célula productora con lo siguiente:
i)
un genoma retrovírico;
ii)
una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol; y
iii)
secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes del empaquetamiento vírico esenciales, no codificados por la secuencia nucleotídica de (ii);
caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica optimizada en codones comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
De este modo, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para evitar el empaquetamiento de un genoma retrovírico en una célula diana, que comprende las etapas siguientes:
a.
transfectar una célula productora con lo siguiente, para producir partículas retrovíricas:
i)
un genoma retrovírico;
ii)
una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol; y
iii)
secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes del empaquetamiento vírico esenciales, no codificados por una o más de las secuencias nucleotídicas de (ii); y
b.
transfectar una célula diana con partículas retrovíricas de la etapa (a);
caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica optimizada en codones comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
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En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para evitar la recombinación entre un genoma de vector retrovírico y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido vírico requerido para el ensamblaje del genoma vírico en partículas retrovíricas, que comprende transfectar una célula productora con lo siguiente:
i)
un genoma retrovírico que comprende por lo menos parte de una secuencia nucleotídica de gag;
ii)
una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol; y
iii)
secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes del empaquetamiento vírico esenciales, no codificados por la secuencia nucleotídica de (ii);
caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica optimizada en codones comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
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También se describe una secuencia optimizada en codones como se muestra en SEC ID nº: 15.
La presente invención proporciona además una partícula retrovírica producida usando la secuencia de la presente invención, y métodos de producción para hacer esto.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula vírica según la presente invención, junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Por "reducir" se hace referencia a la posibilidad de que ocurra un suceso se reduce en comparación con una población comparable que tiene la secuencia de gag-pol de tipo salvaje. Dentro de una población, la posibilidad de que ocurra un suceso se puede evitar para un vector o partícula retrovírica individual.
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Descripción detallada de la invención
A continuación se describirán a título de ejemplo no limitativo diversas características y formas de realización preferidas de la presente invención.
La presente invención utiliza el concepto de optimización de codones.
La optimización de codones se ha descrito previamente en el documento WO 99/41397 como un medio para superar el requisito de Rev/RRE para exportar y para potenciar la estabilidad del ARN. Las alteraciones en la secuencia codificante para los componentes víricos mejoran las secuencias para uso de codones en las células de mamíferos u otras células que van a actuar como las células productoras para la producción de partículas del vector retrovírico. Esta mejora en el uso de codones se denomina como "optimización de codones". Muchos virus, incluyendo VIH y otros lentivirus, usan un gran número de codones raros, y, cambiando estos para que correspondan a codones de mamífero usados habitualmente, se puede lograr el aumento de la expresión de los componentes del empaquetamiento en células productoras de mamíferos. En la técnica se conocen tablas de uso de codones para células de mamífero, así como para una variedad de otros organismos.
En virtud de las alteraciones en sus secuencias, las secuencias nucleotídicas que codifican los componentes de empaquetamiento de las partículas víricas requeridos para el ensamblaje de las partículas víricas en las células productoras/células de empaquetamiento tienen eliminadas de ellas las secuencias de inestabilidad (INS) de ARN. Al mismo tiempo, se retiene la secuencia codificante de aminoácidos para los componentes de empaquetamiento, de forma que los componentes víricos codificados por las secuencias siguen siendo los mismos, o por lo menos suficientemente similares, de forma que la función de los componentes del empaquetamiento no se ve comprometida.
La expresión "polipéptido vírico requerido para el ensamblaje de partículas víricas" significa un polipéptido codificado normalmente por el genoma vírico a empaquetar en partículas víricas, en cuya ausencia el genoma vírico no se puede empaquetar. Por ejemplo, en el contexto de retrovirus, tales polipéptidos incluirían gag-pol y env. La expresión "componente de empaquetamiento" también se incluye dentro de esta definición.
Como se explica en el documento WO 99/32646, los requisitos de secuencias para genomas de vectores de VIH de empaquetamiento son complejos. La señal de empaquetamiento del VIH-1 engloba el sitio donante de corte y empalme, y contiene una porción de la región no traducida en 5' del gen gag, que tiene una estructura secundaria putativa que contiene 4 bucles principales cortos. Sin embargo, también se sabe que las secuencias adicionales en cualquier otra parte en el genoma son importantes para el encapsidamiento eficaz del VIH. Por ejemplo, los primeros 350 pb de la secuencia codificante de la proteína gag pueden contribuir al empaquetamiento eficiente. De este modo, para la construcción de vectores de VIH-1 capaces de expresar genes heterólogos, se ha usado en el genoma vectorial una señal de empaquetamiento que se extiende hasta 350 pb de la región codificante de la proteína gag. Ahora se ha encontrado que la optimización de codones de la región codificante de gag en el vector de empaquetamiento, por lo menos en la región en la que se extiende la señal de empaquetamiento, también tiene el efecto de interrumpir el empaquetamiento del genoma del vector. De este modo, la optimización de codones es un nuevo método para obtener una partícula vírica de replicación defectuosa.
También, como se describe en el documento WO 99/32646, la estructura de la señal de empaquetamiento en lentivirus equinos es diferente de la del VIH. En lugar de una secuencia corta de 4 bucles principales junto con una señal de empaquetamiento que se extiende hasta 350 pb de la región codificante de la proteína gag, se ha encontrado que, en lentivirus equinos, la señal de empaquetamiento puede no extenderse tanto en la región codificante de la proteína gag como se puede haber pensado.
En un ejemplo, sólo los codones que están relacionados con la señal de empaquetamiento son codones optimizados. De este modo, la optimización de codones se extiende a por lo menos los primos 350 pb de la región codificante de la proteína gag. En lentivirus equinos, por lo menos, la optimización de codones se extiende hasta por lo menos el nucleótido 300 de la región codificante de gag, más preferentemente hasta por lo menos el nucleótido 150 de la región codificante de gag. Aunque no óptima, la optimización de codones se podría extender hasta, digamos, sólo los primeros 109 nucleótidos de la región codificante de gag. También puede ser posible que la optimización de codones se extienda hasta sólo el primer codón de la región codificante de gag.
Sin embargo, las secuencias están optimizadas en los codones en su totalidad, con la excepción de la secuencia que engloba el sitio de desplazamiento del marco.
El gen gag-pol comprende dos marcos de lectura que solapan, que codifican las proteínas gag y pol, respectivamente. La expresión de ambas proteínas depende de un desplazamiento del marco durante la traducción. Este desplazamiento del marco se produce como resultado del "resbalamiento" del ribosoma durante la traducción. Se piensa que este resbalamiento está provocado por lo menos en parte por estructuras secundarias de ARN que detienen el ribosoma. Tales estructuras secundarias existen en dirección 3' del sitio de desplazamiento del marco en el gen gag-pol. Para VIH, la región de solapamiento se extiende desde el nucleótido 1222 en dirección 3' del comienzo de gag (en el que el nucleótido 1 es el A del ATG de gag) hasta el final de gag (nt 1503). En consecuencia, un fragmento de 281 pb que se expande desde el sitio de desplazamiento del marco y la región de solapamiento de los dos marcos de lectura preferentemente no se optimiza en los codones. La retención de este fragmento permitirá una expresión más eficiente de las proteínas gag-pol.
Para EIAV, el comienzo del solapamiento se ha tomado como nt 1262 (en el que el nucleótido 1 es el A del ATG de gag). El final del solapamiento está en 1461 pb. A fin de asegurarse de que el sitio de desplazamiento del marco y el gag, gag-pol solapen, se ha retenido la secuencia de tipo salvaje desde nt 1156 hasta 1465. Esto se puede ver en la Figura 9b.
Se pueden hacer derivaciones a partir del uso de codones óptimos, por ejemplo, a fin de acomodar los sitios de restricción convenientes, y se pueden introducir en las proteínas gag-pol cambios de aminoácidos conservativos.
La optimización de codones se basó en genes de mamíferos ligeramente expresados. Se puede cambiar la tercera y algunas veces la segunda y tercera base. En la Figura 3b se da un ejemplo de una tabla de uso de codones.
Debido a la naturaleza degenerativa del Código Genético, se apreciará que numerosas secuencias de gag-pol se pueden lograr por un trabajador experto. También, hay muchas variantes retrovíricas descritas y que se pueden usar como punto de partida para generar una secuencia de gag-pol con codones optimizados. Los genomas lentivíricos pueden ser bastante variables. Por ejemplo, hay muchas cuasiespecies de VIH-1 que todavía son funcionales. Este es el caso para EIAV. Estas variantes se pueden usar para potenciar partes particulares del proceso de transducción. Los ejemplos de variantes de VIH-1 se pueden encontrar en http://hiv-web.lanl.gov. Los detalles de los clones de EIAV se pueden encontrar en la base de datos de NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
La estrategia para las secuencias de gag-pol con codones optimizados se puede usar en relación con cualquier retrovirus. Esto se aplicaría a todos los lentivirus, incluyendo EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, Sly, VIH-1 y VIH-2. Además, este método se podría usar para incrementar la expresión de genes de HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV y retrovirus endógenos humanos (HERV).
Puesto que la optimización de codones puede dar como resultado la interrupción de las estructuras secundarias del ARN tales como una señal de empaquetamiento, se apreciará que cualquier señal de empaquetamiento endógena en dirección 5' del codón de iniciación de gag se podría retener sin comprometer la seguridad.
Una ventaja adicional de los componentes de empaquetamiento con codones optimizados es que esto puede incrementar la expresión del gen. En particular, puede hacer que la expresión de gag-pol sea independiente de Rev. A fin de permitir el uso de factores anti-rev o RRE en el vector retrovírico, sin embargo, sería necesario hacer al sistema de generación del vector vírico totalmente independiente de Rev/RRE (5). De este modo, también es necesario que se modifique el genoma. Esto se logra optimizando componentes del genoma del vector. Ventajosamente, estas modificaciones también conducen a la producción de un sistema más seguro ausente de todas las proteínas accesorias tanto en la célula productora como en la célula transducida, y se describen más abajo.
Como se describe anteriormente, los componentes de empaquetamiento para un vector retrovírico incluyen productos de expresión de genes gag, pol y env. Además, el empaquetamiento eficiente depende de una secuencia corta de 4 bucles principales, seguida de una secuencia parcial de gag y env (la "señal de empaquetamiento"). De este modo, la inclusión de una secuencia de gag suprimida en el genoma del vector retrovírico (además de la secuencia de gag completa en el constructo de empaquetamiento) optimizará el título del vector. Hasta la fecha, se han dado a conocer un empaquetamiento eficiente que requiere de 255 a 360 nucleótidos de gag en vectores que todavía retienen secuencias de env, o alrededor de 40 nucleótidos de gag en una combinación particular de mutación de donante de corte y empalme, supresiones de gag y env. Sorprendentemente se ha encontrado que una supresión de hasta 360 nucleótidos en gag conduce a un incremento en el título del vector. Otras supresiones dieron como resultado títulos más bajos. Se encontró que las mutaciones adicionales en el sitio del donante de corte y empalme principal en dirección 5' de gag interrumpe la estructura secundaria de la señal de empaquetamiento, y por lo tanto conduce a un título reducido de vectores. De este modo, preferentemente, el genoma del vector retrovírico incluye una secuencia de gag a partir de la cual se han eliminado hasta 360 nucleótidos.
Por lo tanto, se permite la preparación de un sistema denominado "mínimo" en el que se pueden eliminar todos los genes accesorios. En el VIH, estos genes accesorios son vpr, vif, tat, nef, vpu y rev. De forma similar, en otros lentivirus, se pueden eliminar los genes accesorios análogos normalmente presentes en el lentivirus. Sin embargo, para evitar dudas, se mencionaría que la presente invención también se extiende a sistema, partículas y vectores en los que uno o más de estos genes accesorios está presente y en cualquier combinación.
La expresión "vector vírico" se refiere a un constructo nucleotídico que comprende un genoma vírico capaz de ser transcrito en una célula hospedante, genoma el cual comprende suficiente información genética vírica para permitir el empaquetamiento del genoma de ARN vírico, en presencia de componentes de empaquetamiento, en una partícula vírica capaz de infectar una célula diana. La infección de la célula diana incluye la transcripción inversa y la integración en el genoma de la célula diana, cuando sea apropiado para virus particulares. El vector vírico en uso tiene típicamente secuencias codificantes heterólogas (nucleotídicos de interés o "NOI") que se suministran mediante el vector a la célula diana, por ejemplo una primera secuencia nucleotídica que codifica una ribozima. Mediante "replicación defectuosa" se quiere decir que un vector vírico es incapaz de una replicación dependiente para producir partículas víricas infecciosas en la célula diana final.
La expresión "sistema de vector vírico" quiere decir un kit de partes que se puede usar cuando se combina con otros componentes necesarios para la producción de partículas víricas para producir partículas víricas en células hospedantes. Por ejemplo, un NOI puede estar presente típicamente en un constructo de vector plasmídico adecuado para clonar el NOI en un constructo de vector de genoma vírico. Cuando se combina en un kit con una secuencia nucleotídica adicional, que también estará típicamente presente en un constructo de vector plasmídico separado, la combinación resultante de plásmido que contiene el NOI y el plásmido que contiene la secuencia nucleotídica adicional comprende los elementos esenciales de la invención. Tal kit se puede usar entonces por la persona experta en la producción de constructos de genomas de vectores víricos adecuados que, cuando se transfectan en una célula hospedante junto con el plásmido que contiene la secuencia nucleotídica adicional, y opcionalmente constructos de ácido nucleico que codifican otros componentes requeridos para el ensamblaje vírico, conducirá a la producción de partículas víricas infecciosas.
Como alternativa, la secuencia nucleotídica adicional puede estar presente de forma estable dentro de una estirpe celular de empaquetamiento que está incluida en el kit.
El kit puede incluir los otros componentes necesarios para producir partículas víricas, tales como células hospedantes y otros plásmidos que codifican polipéptidos víricos esenciales requeridos para el ensamblaje vírico. A título de ejemplo, el kit puede contener (i) un plásmido que contiene un NOI, y (ii) un plásmido que contiene una secuencia nucleotídica adicional que codifica un constructo retrovírico de gag-pol modificado que se ha optimizado en codones para la expresión en una productora de elección. Los componentes opcionales serían entonces (a) un constructo de genoma retrovírico con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados para clonar el NOI en el genoma vírico, opcionalmente con por lo menos una secuencia de gag parcial; (b) un plásmido que codifica una proteína env de VSV-G. Como alternativa, la secuencia nucleotídica que codifica polipéptidos víricos requeridos para el ensamblaje de partículas víricas se puede proporcionar en el kit como estirpes de células de empaquetamiento que comprenden las secuencias nucleotídicas, por ejemplo una estirpe celular que expresa VSV-G.
La expresión "sistema de producción de vector vírico" se refiere al sistema de vector vírico descrito anteriormente en el que el NOI ya se ha insertado en un genoma de vector vírico adecuado.
En la presente descripción, varios términos se usan de forma intercambiable. De este modo, "virión", "virus", "partícula vírica", "partícula retrovírica", "retrovirus", y "partícula vectorial" significan virus y partículas similares a virus que son capaces de introducir un ácido nucleico en una célula a través de un mecanismo de entrada similar al vírico. Tales partículas vectoriales pueden, en ciertas circunstancias, mediar la transferencia de los NOI en las células que infectan. Un retrovirus es capaz de transcribir de forma inversa su material genético en ADN, e incorporar este material genético en un ADN de la célula diana con la transducción. Tales células se denominan aquí como "células diana".
Como se usa aquí, la expresión "célula diana" se refiere simplemente a una célula cuyo vector retrovírico regulado, ya sea nativo o escogido como diana, es capaz de infectar o transducir.
Una partícula de vector lentivírico será capaz de transducir células que se dividen lentamente y que los no lentivirus tales como MLV no serían capaces de transducir eficientemente. Las células que se dividen lentamente se dividen una vez alrededor de cada tres a cuatro días, incluyendo ciertas células tumorales. Aunque los tumores contienen células que se dividen rápidamente, algunas células tumorales, especialmente aquellas en el centro del tumor, se dividen infrecuentemente.
Como alternativa, la célula diana puede ser una célula con crecimiento detenido, capaz de sufrir una división celular, tal como una célula en una porción central de una masa tumoral, o una célula madre tal como una célula madre hematopoyética o una célula CD34-positiva.
Como alternativa adicional, la célula diana puede ser un precursor de una célula diferenciada tal como un precursor monocítico, una célula CD33-positiva, o un precursor de mieloide.
Como una alternativa adicional, la célula diana puede ser una célula diferenciada, tal como una neurona, astrocito, gliocito, microgliocito, macrófago, monocito, célula epitelial, célula endotelial, hepatocito, espermatocito, espermátida o espermatozoa.
Las células diana se pueden transducir ya sea in vitro tras el aislamiento de un individuo humano, o se pueden transducir directamente in vivo.
Los vectores víricos son vectores retrovíricos, en particular vectores lentivíricos tales como vectores de VIH y EIAV. El vector retrovírico puede derivar de, o puede ser derivable de, cualquier retrovirus adecuado. Se ha identificado un gran número de diferentes retrovirus. Los ejemplos incluyen: virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la inmunodeficiencia del simio, virus de la leucemia de células T humana (HTLV), virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), virus del tumor mamario de ratón (MMTV), virus del sarcoma de Rous (RSV), virus del sarcoma de Fujinami (FuSV), virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV), virus del osteosarcoma murino FBR (FBR MSV), virus del sarcoma murino de Moloney (Mo-MSV), virus de la leucemia murina de Abelson (A-MLV); virus 29 de mielocitomatosis aviar (MC29); y virus de la eritoblastosis aviar (AEV). En Coffin et al., 1997, "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus p. 758-763 se puede encontrar una lista detallada de retrovirus.
El término "derivable" se usa en su sentido normal, queriendo decir una secuencia nucleotídica, tal como una LTR o una parte de la misma, que no necesariamente necesita ser obtenida de un vector, tal como un vector retrovírico, sino que en su lugar podría derivar de él. A título de ejemplo, la secuencia se puede preparar sintéticamente o mediante uso de técnicas de ADN recombinante.
Los detalles sobre la estructura genómica de algunos retrovirus se pueden encontrar en la técnica. A título de ejemplo, los detalles sobre VIH y Mo-MLV se pueden encontrar a partir del NCBI Genbank (Números de Acceso de Genoma AF033819 y AF033811, respectivamente. Los detalles de las variantes de VIH también se pueden encontrar en http://hiv-web.lanl.gov. Los detalles de las variantes de EIAV se pueden a través de http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
El grupo de lentivirus se puede dividir incluso adicionalmente en "primate" y "no primate". Los ejemplos de lentivirus primates incluyen virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente etiológico del síndrome de la autoinmunodeficiencia humana (SIDA), y el virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV). El grupo de lentivirus no primate incluye el prototipo virus visna/maedi (VMV) de "virus lento", así como el virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV) relacionado, el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), y el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV) descritos más recientemente.
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La estructura básica de un genoma de un retrovirus es una 5'LTR y una 3'LTR, entre las cuales o dentro de las cuales están localizados una señal de empaquetamiento para permitir que el genoma se empaquete, un sitio de unión a cebador, sitios de integración para permitir la integración en un genoma de la célula hospedante, y los genes gag, pol y env que codifican los componentes del empaquetamiento - estos son polipéptidos requeridos para el ensamblaje de partículas víricas. Los retrovirus más complejos tienen características adicionales, tales como las secuencias rev y RRE en VIH, que permite la exportación eficiente de transcrito de ARN del provirus integrado desde el núcleo al citoplasma de una célula diana infectada.
En el provirus, estos genes están flanqueados en ambos extremos por regiones denominadas repeticiones terminales largas (LTR). Las LTR son responsables de la integración provírica, y de la transcripción. Las LTR también sirven como secuencias promotoras potenciadoras, y pueden controlar la expresión de los genes víricos. El encapsidamiento de los ARN retrovíricos se produce en virtud de su secuencia psi, que se ha descrito que, con respecto al VIH, por lo menos, está localizado en el extremo 5' del genoma vírico.
Las propias LTR son secuencias idénticas que se pueden dividir en tres elementos, que se denominan U3, R y U5. U3 deriva de la secuencia única al extremo 3' del ARN. R deriva de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN, y U5 deriva de la secuencia única al extremo 5' del ARN. Los tamaños de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes retrovirus.
En un vector retrovírico defectuoso, gag, pol y env pueden estar ausentes o no ser funcionales. Las regiones R en ambos extremos del ARN son secuencias repetidas. U5 y U3 representan secuencias únicas en los extremos 5' y 3' del genoma de ARN, respectivamente.
Como se explica anteriormente, en un vector retrovírico típico para uso en terapia génica, por lo menos parte de una o más de las regiones codificantes de las proteínas gag, pol y env, esenciales para la replicación, se pueden eliminar del vector retrovírico. Esto hace al vector retrovírico defectuoso para la replicación. Las porciones eliminadas se pueden sustituir incluso por una secuencia nucleotídica de interés (NOI), como en la presente invención, para generar un virus capaz de integrar su genoma en un genoma hospedante, pero en el que el genoma vírico codificado es incapaz de propagarse por sí mismo debido a la falta de proteínas estructurales. Cuando se integra en el genoma hospedante, se produce la expresión del NOI - dando como resultado, por ejemplo, un efecto terapéutico y/o de diagnóstico. De este modo, la transferencia de un NOI a un sitio de interés se logra típicamente: integrando el NOI en el vector vírico recombinante; empaquetando el vector vírico modificado en una cubierta viriónica; y permitiendo la transducción de un sitio de interés - tal como una célula seleccionada como diana o una población de células seleccionadas como
diana.
Por lo tanto, un genoma retrovírico mínimo para uso en la presente invención puede comprender (5')R-U5-uno o más NOI-U3-R(3'). Sin embargo, el vector plasmídico usado para producir el genoma retrovírico en una célula hospedante/célula de empaquetamiento también incluirá secuencias de control reguladoras transcripcionales enlazadas operablemente al genoma retrovírico para dirigir la transcripción del genoma en una célula hospedante/célula de empaquetamiento. Estas secuencias reguladoras pueden ser las secuencias naturales asociadas con la secuencia retrovírica transcrita, es decir la región U3 en 5', o pueden ser un promotor heterólogo, tal como otro promotor vírico, por ejemplo el promotor de CMV.
Algunos genomas retrovíricos requieren secuencias adicionales para la producción eficiente del virus. Por ejemplo, en el caso de VIH, se debería de incluir la secuencia de rev y RRE. Sin embargo, se ha encontrado que el requisito para rev y RRE se puede reducir o eliminar mediante la optimización de codones. Puesto que la expresión del gag-pol con codones optimizados es independiente de REV, se puede eliminar RRE del casete de expresión de gag-pol, eliminando así cualquier potencial de recombinación con cualquier RRE contenido en el genoma del vector.
Una vez, es necesario expresar las secuencias de los NOI del vector retrovírico. En un retrovirus, el promotor está localizado en la región 5' LTR U3 del provirus. En vectores retrovíricos, el promotor que conduce la expresión de un gen terapéutico puede ser el promotor retrovírico nativo en la región 5' U3, o un promotor alternativo manipulado mediante ingeniería en el vector. El promotor alternativo puede sustituir físicamente al promotor 5' U3 nativo al retrovirus, o se puede incorporar en un sitio diferente dentro del genoma del vector, tal como entre la LTR.
De este modo, el NOI también estará enlazado operablemente a una secuencia de control reguladora transcripcional para permitir que se produzca la transcripción de la primera secuencia nucleotídica en la célula diana. La secuencia de control será típicamente activa en células de mamífero. La secuencia de control puede ser, por ejemplo, un promotor vírico tal como el promotor vírico natural o un promotor de CMV, o puede ser un promotor de mamífero. Se prefiere particularmente usar un promotor que es preferentemente activo en un tipo celular o tipo tisular particular, en el que infecta principalmente el virus a tratar. De este modo, en una realización, se pueden usar secuencias reguladoras específicas de tejidos. Las secuencias de control reguladoras que dirigen la expresión de la una o más primeras secuencias nucleotídicas pueden ser promotores constitutivos o regulados.
La expresión "operablemente enlazada" representa una relación entre una región reguladora (típicamente un elemento promotor, pero puede incluir un elemento potenciador) y la región codificante de un gen, mediante lo cual la transcripción de la región codificante está bajo el control de la región reguladora.
Como se usa aquí, el término "potenciador" incluye una secuencia de ADN que se une a otros componentes proteicos del complejo de iniciación de la transcripción y facilita así el inicio de la transcripción dirigida por su promotor asociado.
En un ejemplo preferido, el potenciador es un elemento de respuesta similar a isquemia (ILRE).
La expresión "elemento de respuesta similar a isquemia" - descrito de otro modo como ILRE - incluye un elemento que es sensible a o es activo en condiciones de isquemia o condiciones que son similares a la isquemia o están provocadas por la isquemia. A título de ejemplo, las condiciones que son similares a la isquemia o están provocadas por la isquemia incluyen hipoxia y/o una concentración o concentraciones bajas de glucosa.
El término "hipoxia" significa un estado en el que un órgano o tejido particular recibe un suministro inadecuado de oxígeno.
La isquemia puede ser un suministro insuficiente de sangre a un órgano o tejido específico. Una consecuencia de la disminución del suministro de sangre es un suministro inadecuado de oxígeno al órgano o tejido (hipoxia). La hipoxia prolongada puede dar como resultado una lesión al órgano o tejido afectado.
Un ILRE preferido es un elemento de respuesta a hipoxia (HRE).
En un aspecto preferido, hay una expresión regulable por hipoxia o isquemia de los componentes del vector retrovírico. A este respecto, la hipoxia es un regulador poderoso de la expresión génica en un amplio intervalo de diferentes tipos celulares, y actúa mediante la inducción de la actividad de factores de transcripción inducibles por hipoxia, tales como factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1; 6); que se une a sitios de reconocimiento de ADN cognatos, los elementos sensibles a hipoxia (HRE) en diversos promotores génicos. Dachs et al (7) han usado una forma multimérica del HRE procedente del gen de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK-1) de ratón (8) para controlar la expresión de genes tanto marcadores como terapéuticos mediante células de fibrosarcoma humano en respuesta a hipoxia in vitro y dentro de tumores sólidos in vivo (7 ibid).
Los elementos potenciadores de la respuesta a hipoxia (HREE) también se han encontrado en asociación con un número de genes, incluyendo el gen de la eritropoyetina (EPO) (9; 10). Otros HREE se han aislado de regiones reguladoras tanto del gen de la enzima glucolítica muscular piruvato cinasa (PKM) (11), el gen de \beta-enolasa específico del músculo humano (ENO3; 12) como el gen de endotelina-1 (ET-1) (13).
Preferentemente, el HRE se selecciona de, por ejemplo, el elemento HRE de eritropoyetina (HREE1), el elemento HRE de piruvato cinasa (PKM) muscular, el elemento HRE de fosfoglicerato cinasa (PGK), el elemento HRE de B-enolasa (enolasa 3; ENO3), el elemento HRE de endotelina-1 (ET-1), y el elemento HRE de metalotioneína II (MTII).
Preferentemente, el ILRE se usa en combinación con un elemento regulador transcripcional, tal como un promotor, elemento regulador transcripcional el cual es preferentemente activo en uno o más tipos celulares seleccionados, siendo preferentemente activo sólo en un tipo celular.
Como se esquematiza anteriormente, este aspecto de combinación se denomina un elemento sensible.
Preferentemente, el elemento sensible comprende por lo menos el ILRE como se define aquí.
Los ejemplos no limitantes de tal elemento sensible se presentan como OBHRE1 y XiaMac. Otro ejemplo no limitante incluye el ILRE en uso conjuntamente con un promotor de MLV y/o un promotor sensible a isquemia restringido a tejidos. Estos elementos sensibles se describen en el documento WO99/15684.
Otros ejemplos de promotores/potenciadores restringidos a tejidos, adecuados, son aquellos que son muy activos en células tumorales, tales como un promotor/potenciador de un gen MUC1, un gen CEA o un gen antigénico 5T4. El promotor de alfa-fetoproteína (AFP) es también un promotor específico de tumores. Una combinación preferida de promotor/potenciador es una combinación del promotor/potenciador temprano inmediato principal (MIE) del citomegalovirus humano (hCMV).
El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo un sitio de unión a ARN polimerasa.
El promotor puede estar localizado en la 5' LTR retrovírica para controlar la expresión de un ADNc que codifica un NOI, y/o proteínas gag-pol.
Preferentemente, el NOI y/o las proteínas gag-pol son capaces de ser expresados a partir del genoma del retrovirus, tal como a partir de promotores retrovíricos endógenos en la repetición terminal larga (LTR).
Preferentemente, el NOI y/o las proteínas gag-pol se expresan a partir de un promotor heterólogo al que está operablemente enlazado el gen o secuencia heterólogo, y/o la secuencia de gag-pol con codones optimizados.
Como alternativa, el promotor puede ser un promotor interno.
Preferentemente, el NOI se expresa a partir de un promotor interno.
Los vectores que contienen promotores internos también se han usado ampliamente para expresar múltiples genes. Un promotor interno hace posible explotar las combinaciones de promotor/potenciador distintas de las encontradas en la LTR vírica para conducir la expresión génica. En un vector retrovírico se pueden incluir múltiples promotores internos, y se ha demostrado que es posible expresar por lo menos tres ADNc diferentes, cada uno procedente de su propio promotor (14). También, los elementos de sitios de entrada ribosómicos internos (IRES) se han usado para permitir la traducción de múltiples regiones codificantes procedentes de un solo ARNm o de proteínas de fusión que entonces se pueden expresar a partir de un marco de lectura abierto.
El promotor de la presente invención puede ser constitutivamente eficiente, o puede estar restringido temporalmente en su actividad.
Preferentemente, el promotor es un promotor constitutivo tal como CMV.
Preferentemente, los promotores de la presente invención son específicos de tejidos. Esto es, son capaces de conducir la transcripción de un NOI o NOIs en un tejido mientras que permanecen en gran parte "silenciosos" en otros tipos de tejidos.
La expresión "específico de tejidos" significa un promotor que no está restringido en actividad a un solo tipo de tejido, pero que no obstante muestra selectividad por cuanto puede ser activo en un grupo de tejidos y menos activo o silencioso en otro grupo.
El nivel de expresión de un NOI o NOIs bajo el control de un promotor particular se puede modular manipulando la región promotora. Por ejemplo, dominios diferentes dentro de una región promotora pueden poseer diferentes actividades reguladoras génicas. Los papeles de estas diferentes regiones se evalúan típicamente usando constructos vectoriales que tienen diferentes variantes del promotor con regiones específicas suprimidas (esto es, análisis de supresión). Este enfoque se puede usar para identificar, por ejemplo, la región más pequeña capaz de conferir especificidad tisular, o la región más pequeña que confiere sensibilidad a hipoxia.
Un número de promotores específicos de tejidos, descritos anteriormente, pueden ser particularmente ventajosos. En la mayoría de los casos, estos promotores se pueden aislar como fragmentos de digestión de restricción convenientes, adecuados para la clonación en un vector seleccionado. Como alternativa, los fragmentos de promotores se pueden aislar usando la reacción en cadena de la polimerasa. La clonación de los fragmentos amplificados se puede facilitar incorporando sitios de restricción en el extremo 5' de los cebadores.
El NOI o NOIs pueden estar bajo el control de expresión de un elemento regulador de la expresión, tal como un promotor y potenciador.
Preferentemente, el promotor sensible a isquemia es un promotor sensible a isquemia restringido a tejidos.
Preferentemente, el promotor sensible a isquemia restringido a tejidos es un promotor específico de macrófagos restringido mediante represión.
Preferentemente, el promotor sensible a isquemia restringido a tejidos es un promotor específico del endotelio.
Preferentemente, el vector retrovírico regulado es un vector retrovírico regulado por ILRE.
Preferentemente, el vector retrovírico regulado es un vector lentivírico regulado por ILRE.
Preferentemente, el vector retrovírico regulado es un vector lentivírico sensible a hipoxia autorregulado.
Preferentemente, el vector retrovírico regulado está regulado por la concentración de glucosa.
Por ejemplo, las proteínas reguladas por glucosa (grp), tales como grp78 y grp94, son proteínas muy conservadas que se sabe que son inducidas por la falta de glucosa (15). El gen de grp 78 se expresa a niveles bajos en la mayoría de los tejidos sanos normales bajo la influencia de elementos promotores de nivel basal, pero tiene por lo menos dos "elementos reguladores inducibles por estrés" en dirección 5' del elemento TATA (15 ibid; 16). La unión a una secuencia truncada de 632 pares de bases del extremo 5' del promotor de grp78 confiere una elevada capacidad de inducción a la falta de glucosa en genes informadores in vitro (16 ibid). Además, esta secuencia promotora en vectores retrovíricos fue capaz de conducir una expresión de alto nivel de un gen informador en células tumorales en fibrosarcomas murinos, particularmente en sitios relativamente isquémicos/fibróticos centrales (16 ibid).
Preferentemente, el vector retrovírico regulado es un vector que se inactiva por sí mismo (SIN).
A título de ejemplo, se han construido vectores retrovíricos que se inactivan a sí mismos suprimiendo los potenciadores transcripcionales o los potenciadores y el promotor en la región U3 de la 3' LTR. Tras una ronda de transcripción inversa de integración del vector, estos cambios se copian tanto en la 5' como en la 3' LTR, produciendo un provirus transcripcionalmente inactivo (17; 18; 19; 20). Sin embargo, cualquier promotor o promotores internos a las LTR en tales vectores todavía serán transcripcionalmente activos. Esta estrategia se ha empleado para eliminar efectos de los potenciadores y promotores en las LTR víricas en la transcripción a partir de genes colocados internamente. Tales efectos incluyen transcripción incrementada (21) o supresión de la transcripción (22). Esta estrategia también se puede usar para eliminar la transcripción en dirección 3' a partir de la 3' LTR en ADN genómico (23). Esto es de particular importancia en terapia génica humana, en la que es de importancia crítica evitar la activación accidental de un oncogén endógeno.
Como se explica anteriormente, los vectores retrovíricos de replicación defectuosa se propagan típicamente, por ejemplo para preparar títulos adecuados del vector retrovírico para la transducción subsiguiente, usando una combinación de una estirpe de células de empaquetamiento o de células auxiliares y el vector recombinante. Esto es, que las tres proteínas de empaquetamiento se pueden proporcionar en trans.
En general, una "estirpe celular de empaquetamiento" contiene uno o más de los genes retrovíricos gag, pol y env. En la presente invención, contiene genes gag-pol de codones optimizados, y opcionalmente un gen env. La estirpe celular de empaquetamiento produce las proteínas requeridas para empaquetar ADN retrovírico, pero no puede provocar el encapsidamiento. Convencionalmente, esto se ha logrado a través de la falta de una región psi. Sin embargo, cuando un vector recombinante que posee un NOI y una región psi se introduce en la estirpe celular de empaquetamiento, las proteínas auxiliares pueden empaquetar el vector recombinante psi-positivo para producir el lote de virus recombinante. Este lote de virus se puede usar para transducir células para introducir el NOI en el genoma de las células diana. Convencionalmente se ha usado una señal de empaquetamiento psi, denominada psi plus, que contiene secuencias adicionales que abarcan desde la dirección 5' del donante de corte y empalme hasta la dirección 3' del codón de partida de gag (24), puesto que se ha mostrado que esto incrementa los títulos víricos.
El virus recombinante cuyo genoma carece de todos los genes requeridos para obtener proteínas víricas sólo se puede transducir una vez, y no se puede propagar. Estos vectores víricos que sólo son capaces de una sola ronda de transducción de células diana son conocidos como vectores de replicación defectuosa. Por tanto, el NOI se introduce en el genoma de la célula hospedante/diana sin la generación de retrovirus potencialmente nocivo. En Coffin et al., 1997 (ibid) se presenta un resumen de las estirpes de empaquetamiento disponibles.
La estirpe celular de empaquetamiento retrovírico está preferentemente en forma de una estirpe celular transfectada transitoriamente. Las transfecciones transitorias se pueden usar ventajosamente para medir niveles de producción del vector cuando se desarrollan vectores. A este respecto, la transfección transitoria evita el tiempo más prolongado requerido para generar estirpes celulares productoras de vectores estables, y también se puede usar si el vector o los componentes de empaquetamiento retrovírico son tóxicos para las células. Los componentes usados típicamente para generar vectores retrovíricos incluyen un plásmido que codifica las proteínas gag-pol, un plásmido que codifica la proteína env, y un plásmido que contiene un NOI. La producción de vectores implica la transfección transitoria de uno o más de estos componentes en células que contienen los otros componentes requeridos. Si el vector codifica genes tóxicos o genes que interfieren con la replicación de la célula huésped, tales como inhibidores del ciclo celular o genes que inducen apoptosis, puede ser difícil generar estirpes celulares que produzcan vectores estables, pero la transfección transitoria se puede usar para producir el vector antes de que las células mueran. También, se han desarrollado estirpes celulares usando transfección transitoria que produce niveles de títulos de vectores que son comparables a los niveles obtenidos a partir de estirpes celulares productoras de vectores estables (25).
Las células productoras/células de empaquetamiento pueden ser cualquier tipo de célula adecuada. Las células productoras son generalmente células de mamíferos, pero pueden ser, por ejemplo, células de insectos. Una célula productora puede ser una célula de empaquetamiento que contiene los genes estructurales del virus, normalmente integrados en su genoma en el que se introducen los vectores retrovíricos regulados de la presente invención. Como alternativa, la célula productora se puede transfectar con secuencias de ácido nucleico que codifican componentes estructurales, tales como gag-pol y env de codones optimizados en uno o más vectores tales como plásmidos, vectores de adenovirus, vectores víricos del herpes, o cualquier método conocido para suministrar ADN funcional en células diana. Los vectores se introducen entonces en la célula de empaquetamiento.
Como se usa aquí, la expresión "célula productora" o "célula productora de vectores" se refiere a una célula que contiene todos los elementos necesarios para la producción de partículas de vectores retrovíricos regulados, y sistemas de suministro retrovírico regulados.
Preferentemente, la célula productora se obtiene de una estirpe celular productora estable.
Preferentemente, la célula productora se obtiene de una estirpe celular productora estable derivada.
Preferentemente, la célula productora se obtiene de una estirpe celular productora derivada.
Como se usa aquí, la expresión "estirpe celular productora derivada" es una estirpe celular productora transducida que se ha identificado y seleccionado para la expresión elevada de un gen marcador. Tales estirpes celulares contienen inserciones retrovíricas en sitios de integración que soportan la expresión de nivel elevado a partir del genoma retrovírico. La expresión "estirpe celular productora derivada" se usa de forma intercambiable con la expresión "estirpe celular productora estable derivada" y la expresión "estirpe celular productora estable".
Preferentemente, la estirpe celular productora derivada incluye, pero no se limita a, una célula productora retrovírica y/o lentivírica.
Preferentemente, estirpe celular productora derivada es una estirpe celular productora de VIH o EIAV, más preferentemente una estirpe celular productora de EIAV.
Preferentemente, las secuencias proteicas de la cubierta, y las secuencias de las nucleocápsidas se integran todas de forma estable en la célula productora y/o de empaquetamiento. Sin embargo, una o más de estas secuencias también podría existir en forma episómica, y la expresión génica se produciría a partir del episoma.
Como se usa aquí, la expresión "célula de empaquetamiento" se refiere a una célula que contiene aquellos elementos necesarios para la producción de virus recombinante infeccioso que no están presentes en un vector vírico recombinante. Típicamente, tales células de empaquetamiento contienen uno o más vectores que son capaces de expresar proteínas estructurales víricas (tales como gag-pol y env de codones optimizados), pero no contienen una señal de empaquetamiento.
La expresión "señal de empaquetamiento", que se cita de forma intercambiable como "secuencia de empaquetamiento" o "psi" se usa con referencia a la secuencia no codificante, que actúa en cis, requerida para el encapsidamiento de hebras de ARN retrovírico durante la formación de las partículas víricas. En VIH-1, esta secuencia se ha cartografiado hasta los loci que se extienden desde la dirección 5' del sitio donante (SD) de corte y empalme principal hasta por lo menos el codón de partida de gag.
Las estirpes celulares de empaquetamiento, adecuadas para uso con los constructos vectoriales descritos anteriormente, se pueden preparar fácilmente (véase también el documento WO 92/05266), y se pueden utilizar para crear estirpes celulares productoras para la producción de partículas de vectores retrovíricos. Como ya se ha mencionado, en "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus p. 449) se presenta un resumen de las estirpes de empaquetamiento disponibles.
También como se explica anteriormente, se ha encontrado que las estirpes celulares de empaquetamiento simples, que comprenden un provirus en el que se ha suprimido la señal de empaquetamiento, conducen a la producción rápida de virus competentes para la replicación, indeseables, a través de la recombinación. A fin de mejorar la seguridad, se han producido estirpes celulares de segunda generación en las que la 3'LTR del provirus está eliminada. En tales células, serían necesarias dos recombinaciones para producir un virus de tipo salvaje. Una mejora adicional implica la introducción de los genes gag-pol y del gen env en constructos separados, las denominadas estirpes celulares de empaquetamiento de tercera generación. Estos constructos se introducen secuencialmente para evitar la recombinación durante la transfección.
Preferentemente, las estirpes celulares de empaquetamiento son estirpes celulares de empaquetamiento de segunda generación.
Preferentemente, las estirpes celulares de empaquetamiento son estirpes celulares de empaquetamiento de tercera generación.
En estas estirpes celulares de tercera generación, de constructos divididos, se puede lograr una reducción adicional en la recombinación mediante "bamboleo de codones". Esta técnica, basada en la redundancia del código genético, sirve para reducir la homología entre los constructos separados, por ejemplo entre las regiones de solapamiento en los marcos de lectura abiertos de gag-pol y env.
Las estirpes celulares de empaquetamiento son útiles para proporcionar los productos génicos necesarios para encapsidar y proporcionar una proteína de membrana para un vector retrovírico regulado de título elevado y la producción de vehículo de suministro génico nucleico regulado. Cuando se introducen secuencias retrovíricas reguladas en las estirpes celulares de empaquetamiento, tales secuencias se encapsidan con las proteínas de la nucleocápsida (gag-pol), y estas unidades florecen entonces a lo largo de la membrana celular para estar rodeadas en la membrana celular y contener la proteína de cubierta producida en la estirpe celular de empaquetamiento. Estos retrovirus regulados infecciosos son útiles como unidades infecciosas per se, o como vectores de suministro génico.
La célula de empaquetamiento puede ser una célula cultivada in vitro, tal como una estirpe celular de cultivo de tejidos. Las estirpes celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos tales como estirpes celulares derivadas de fibroblastos murinos, o estirpes celulares humanas. Preferentemente, la estirpe celular de empaquetamiento es una estirpe celular humana, tal como, por ejemplo: HEK293, 293-T, TE671, HT1080.
Como alternativa, la célula de empaquetamiento puede ser una célula derivada del individuo a tratar, tal como un monocito, macrófago, glóbulo rojo o fibroblasto. La célula se puede aislar de un individuo, y los componentes de empaquetamiento y del vector se administran ex vivo seguido de la readministración de las células de empaquetamiento autólogas.
Es muy deseable usar preparaciones víricas de título elevado en aplicaciones tanto experimentales como prácticas. Las técnicas para incrementar el título vírico incluyen usar una señal de empaquetamiento psi plus, como se explica anteriormente, y la concentración de lotes víricos. Además, el uso de diferentes proteínas de cubierta, tales como la proteína G del virus de la estomatitis vesicular, ha mejorado los títulos tras la concentración hasta 10^{9} por ml (28). Sin embargo, típicamente, la proteína de cubierta se elegirá de forma que la partícula vírica infectará preferentemente células que están infectadas con el virus que se desea tratar. Por ejemplo, cuando se usa un vector de VIH para tratar la infección por VIH, la proteína env usada será la proteína env del VIH.
El proceso para producir un vector retrovírico en el que la proteína de cubierta no es la cubierta nativa del retrovirus se conoce como "pseudotipaje". Ciertas proteínas de cubierta, tales como la proteína de cubierta de MLV y la proteína del virus G de la estomatitis vesicular (VSV-G), pseudotipan retrovirus muy bien. El pseudotipado no es un nuevo fenómeno, y los ejemplos se pueden encontrar en los documentos WO-A-98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 y (29).
Como se usa aquí, la expresión "título elevado" significa una cantidad eficaz de un vector retrovírico o partícula que es capaz de transducir un sitio diana tal como una célula.
Como se usa aquí, la expresión "cantidad eficaz" significa una cantidad de un vector retrovírico o lentivírico regulado, o partícula vectorial, que es suficiente para inducir la expresión de un NOI en un sitio diana.
Preferentemente, el título es de por lo menos 10^{6} partículas retrovíricas por ml, tal como de 10^{6} a 10^{7} por ml, más preferentemente por lo menos 10^{7} partículas de retrovirus por ml.
Es posible manipular el genoma vírico o la secuencia nucleotídica del vector retrovírico regulado de forma que los genes víricos se sustituyen o suplementan con uno o más NOI que pueden ser NOI heterólogos.
El término "heterólogo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico o secuencia proteica ligada a una secuencia de ácido nucleico o de proteína que no está ligada de forma natural.
El término NOI (es decir, secuencia nucleotídica de interés) incluye cualquier secuencia nucleotídica adecuada, que no necesariamente necesita ser una secuencia de ADN de origen natural completa. De este modo, la secuencia de ADN puede ser, por ejemplo, una secuencia de ADN sintético, una secuencia de ADN recombinante (es decir, preparada mediante uso de técnicas de ADN recombinante), una secuencia de ADNc o una secuencia de ADN genómico parcial, incluyendo sus combinaciones. La secuencia de ADN no necesita ser una región codificante. Si es una región codificante, no necesita ser una región codificante entera. Además, la secuencia de ADN puede estar en una orientación sentido, o en una orientación antisentido. Preferentemente, está en una orientación sentido. Preferentemente, el ADN es o comprende ADNc.
El NOI o los NOI pueden ser uno cualquiera o más de gen o genes de selección, gen o genes marcadores, y gen o genes terapéuticos.
Como se usa aquí, la expresión "gen de selección" se refiere al uso de un NOI que codifica un marcador seleccionable que puede tener una actividad enzimática que confiere resistencia a un antibiótico o fármaco a la célula en la que se expresa el marcador seleccionable.
Muchos marcadores seleccionables diferentes se han usado con éxito en vectores retrovíricos. Estos se repasan en "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus p. 444), e incluyen, pero no se limitan a, los genes de neomicina (neo) e higromicina fosfotransferasa bacterianos, que confieren resistencia a G418 e higromicina respectivamente; un gen de dihidrofolato reductasa de ratón mutante, que confiere resistencia a metotrexato, el gen de gpt bacteriano, que permite a las células crecer en medio que contiene ácido micofenólico, xantina y aminopterina; el gen hisD bacteriano, que permite a las células crecer en medio sin histidina pero que contiene histidinol; el gen de resistencia a múltiples fármacos (mdr), que confiere resistencia a una variedad de fármacos; y los genes bacterianos que confieren resistencia a puromicina y fleomicina. Todos estos marcadores son seleccionables dominantes, y permite la selección química de la mayoría de las células que expresan estos genes. Otros marcadores seleccionables no son dominantes por cuanto su uso se debe de hacer conjuntamente con una estirpe celular que carezca de la actividad enzimática pertinente. Los ejemplos de marcadores seleccionables no dominantes incluyen el gen de timidina cinasa (tk), que se usa conjuntamente con estirpes celulares de tk.
Los marcadores particularmente preferidos son blasticidina y neomicina, opcionalmente enlazados operablemente a una secuencia codificante de timidina cinasa típicamente bajo el control transcripcional de un fuerte promotor vírico tal como el promotor SV40.
Las secuencias de NOI adecuadas incluyen aquellas que son de aplicación terapéutica y/o diagnóstica tal como, pero sin limitarse a: secuencias que codifican citocinas, quimiocinas, hormonas, anticuerpos, moléculas similares a inmunoglobulinas manipuladas por ingeniería, un anticuerpo monocatenario, proteínas de fusión, enzimas, moléculas coestimulantes inmunitarias, moléculas inmunomoduladoras, ARN antisentido, un mutante negativo transdominante de una proteína diana, una toxina, una toxina condicional, un antígeno, una proteína y factores de crecimiento supresores de tumores, proteínas membránicas, proteínas y péptidos vasoactivos, proteínas y ribozimas antivíricas, y sus derivados (tales como con un grupo informador asociado).
Cuando se incluyen, tales secuencias codificantes pueden estar ligadas típicamente de forma operativa a un promotor adecuado, que puede ser un promotor que conduzca la expresión de una ribozima o ribozimas, o un promotor o promotores diferentes, tal como en uno o más tipos celulares específicos.
Los NOI adecuados en el tratamiento o profilaxis de cáncer incluyen NOI que codifican proteínas que: destruyen la célula diana (por ejemplo una toxina ribosómica), actúan como: supresores de tumores (tal como p53 de tipo salvaje); activadores de mecanismos inmunitarios antitumorales (tales como citocinas, moléculas coestimulantes e inmunoglobulinas); inhibidores de la angiogénesis; o que proporcionan sensibilidad potenciada a fármacos (tales como enzimas de activación de profármacos); estimulan indirectamente la destrucción de la célula diana por células efectoras naturales (por ejemplo, un potente antígeno para estimular el sistema inmunitario o convertir una sustancia precursora en una sustancia tóxica que destruya la célula diana (por ejemplo una enzima activadora de profármacos).
Los ejemplos de profármacos incluyen pero no se limitan a fosfato de etopósido (usado con fosfatasa alcalina; 5-fluorocitosina (con citosina desaminasa); doxorrubin-N-p-hidroxifenoxiacetamida (con penicilin-V-amidasa); glutamato de para-N-bis(2-cloroetil)aminobenzoílo (con carboxipeptidasa G2); carbamatos de mostaza de nitrógeno de cefalosporina (con B-lactamasa); SR4233 (con p450 reductasa); ganciclovir (con HSV timidina cinasa); profármacos de mostaza con nitrorreductasa y ciclofosfamida o ifosfamida (con citocromo p450).
Los NOI adecuados para uso en el tratamiento o prevención de cardiopatía isquémica incluyen los NOI que codifican activadores del plasminógeno. Los NOI adecuados para el tratamiento o prevención de artritis reumatoide o malaria cerebral incluyen genes que codifican proteínas antiinflamatorias, anticuerpos dirigidos contra el factor alfa de necrosis tumoral (TNF), y moléculas anti-adhesión (tales como moléculas de anticuerpos o receptores específicos para moléculas de adhesión).
Los productos de expresión codificados por los NOI pueden ser proteínas que se segregan a partir de la célula. Como alternativa, los productos de expresión de los NOI no se segregan y son activos en la célula. En cualquier caso, se prefiere que el producto de expresión de los NOI demuestre un efecto espectador o un efecto espectador distante; esto es, la producción del producto de expresión en una célula que conduce al exterminio de células relacionadas, adicionales, ya sea en la vecindad o distantes (por ejemplo metastásicas), que poseen un fenotipo común. Las proteínas codificadas también podrían destruir células tumorales espectadoras (por ejemplo con proteína de fusión de anticuerpo antitumoral-toxina ribosómica segregada), indirectamente podrían estimular la destrucción de células tumorales espectadoras (por ejemplo citocinas para estimular el sistema inmunitario, o proteínas procoagulantes que provocan la oclusión vascular local), o convertir una sustancia precursora en una sustancia tóxica que destruya células tumorales espectadoras (por ejemplo una enzima que activa un profármaco en un fármaco difusible). También, el suministro de NOI que codifican transcritos antisentido o ribozimas que interfieren con la expresión de genes celulares para la persistencia tumoral (por ejemplo frente a transcritos de myc aberrantes en linfoma de Burkitts, o frente a transcritos de bcr-abl en leucemia mieloide crónica. También se prevé el uso de combinaciones de tales
NOI.
El NOI o NOIs también pueden comprender uno o más NOI que codifican citocinas. Las citocinas y factores de crecimiento adecuados incluyen pero no se limitan a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento fibroblástico 10 (30), el ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-\beta1, insulina, IFN-\gamma, IGF-I, IGF-II, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina \alpha, Inhibina \beta, IP-10, factor 2 de crecimiento de queratinocitos (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibidora Mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína que atrae a monocitos (30 ibid), M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69a.a.), MIG, MIP-1\alpha, MEP-1\beta, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, factor-1 inhibidor del progenitor de mieloide (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento de nervios, \beta-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1\alpha, SDF1\beta, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-\alpha, TGF-\beta, TGF-\beta2, TGF-\beta3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-\alpha, TNF-\beta, TNIL-1, TPO, VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-\beta, GRO-\gamma, HCC1, 1-309.
El NOI o NOIs pueden estar bajo el control de expresión de un elemento regulador de la expresión, tal como un promotor y/o un potenciador promotor como se conoce como "elementos sensibles" en la presente descripción.
Cuando las partículas del vector retrovírico regulado se usan para transferir los NOI en células que transducen, tales partículas vectoriales también se denominan "sistemas de suministro vírico" o "sistemas de suministro retrovírico". Los vectores víricos, incluyendo los vectores retrovíricos, se han usado para transferir NOIs eficientemente explotando el proceso de transducción vírica. Los NOI clonados en el genoma retrovírico se pueden suministrar eficientemente a células susceptibles a la transducción mediante un retrovirus. A través de otras manipulaciones genéticas, se puede destruir la capacidad replicativa del genoma retrovírico. Los vectores introducen nuevo material genético en una célula, pero son incapaces de replicarse.
El vector retrovírico regulado se puede suministrar mediante técnicas víricas o no víricas. Los sistemas de suministro no vírico incluyen, pero no se limitan a, métodos de transfección de ADN. Aquí, la transfección incluye un proceso que usa un vector no vírico para suministrar un gen a una célula de mamífero diana.
Los métodos de transfección típicos incluyen electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípidos, transfección mediada por ADN compactado, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, mediación por agentes catiónicos, anfífilos faciales catiónicos (CFAs) (31), cationes multivalentes tales como espermina, lípidos catiónicos o polilisina, complejos de 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP)-colesterol (32), y sus combinaciones.
Los sistemas de suministro vírico incluyen, pero no se limitan a, vector adenovírico, un vector vírico adenoasociado (AAV), un vector vírico del herpes, un vector retrovírico, un vector lentivírico, o un vector baculovírico. Estos sistemas de suministro vírico se pueden configurar como un vector de intrón dividido. En el documento WO 99/15653 se describe un vector de intrón dividido.
Otros ejemplos de vectores incluyen sistemas de suministro ex vivo, que incluyen pero no se limitan a métodos de transfección de ADN tales como electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípidos, transfección mediada por ADN compactado.
El vector puede ser un vector de ADN plasmídico. Como alternativa, el vector puede ser un vector vírico recombinante. Los vectores víricos recombinantes adecuados incluyen vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores del virus del herpes, o vectores retrovíricos, vectores lentivíricos o una combinación de vectores adenovíricos y lentivíricos. En el caso de vectores víricos, el suministro génico está mediado por la infección vírica de una célula diana.
Si las características de los adenovirus se combinan con la estabilidad genética de retro/lentivirus, entonces esencialmente el adenovirus se puede usar para transducir células diana para que se conviertan en células productoras retrovíricas transitorias que podrían infectar de forma estable a las células vecinas.
La presente descripción también proporciona una composición farmacéutica para tratar un individuo mediante terapia génica, en la que la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector retrovírico regulado según la presente invención. La composición farmacéutica puede ser para uso humano o animal. Típicamente, un médico determinará la dosis real que será la más adecuada para un individuo, y variará con la edad, peso y respuesta del paciente particular.
La composición puede comprender opcionalmente un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La elección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico se puede seleccionar con respecto a la vía pretendida de administración y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como - o además de - el vehículo, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante o aglutinante, lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspensión, agente o agentes de revestimiento, agente o agentes solubilizantes, y otros agentes vehículo adecuados que puedan ayudar o incrementar la entrada vírica en el sitio diana (tal como por ejemplo un sistema de suministro lipídico).
Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante una o más de: minibombas, inhalación, en forma de un supositorio o pesario, tópicamente en forma de una loción, disolución, crema, ungüento o polvo, mediante uso de un parche para la piel, oralmente en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos ya sea solos o en mezcla con excipientes, o en forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes saborizantes o colorantes, o se pueden inyectar parenteralmente, por ejemplo intracavernosamente, intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente. Para la administración parenteral, las composiciones se pueden usar mejor en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para hacer a la disolución isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones se pueden administrar en forma de comprimidos o pastillas que se pueden formular de manera convencional.
Se cree que la presente composición tiene una aplicabilidad terapéutica amplia - dependiendo entre otros de la selección del uno o más NOI.
Por ejemplo, puede ser útil en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO-A-98/05635. Para facilidad de referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: cáncer, inflamación o enfermedad inflamatoria, trastornos dermatológicos, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulación y respuesta de fase agua, caquexia, anorexia, infección aguda, infección por VIH, estados de choque, reacciones de injerto frente a hospedante, enfermedad autoinmunitaria, lesión por reperfusión, meningitis, migraña y antitrombosis dependiente de aspirina; crecimiento, invasión y extensión tumoral, angiogénesis, metástasis, tumor maligno, ascitis y efusión pleural maligna; isquemia cerebral, cardiopatía isquémica, osteoartritis, artritis reumatoide, osteoporosis, asma, esclerosis múltiple, neurodegeneración, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, apoplejía, vasculitis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; periodontitis, gingivitis; psoriasis, dermatitis atópica, úlceras crónicas, epidermólisis ampollosa, ulceración córnea, retinopatía y curación de heridas quirúrgicas, rinitis, conjuntivitis alérgica, eccema, anafilaxis; restenosis, insuficiencia cardíaca congestiva, endometriosis, aterosclerosis o endosclerosis.
Además, o como alternativa, puede ser útil en el tratamiento de trastornos enumerados en el documento WO-A-98/07859. Para facilidad de referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: citocina y actividad de proliferación/diferenciación celular; actividad inmunosupresora o inmunoestimulante (por ejemplo para tratar deficiencia inmunitaria, incluyendo infección con un virus de inmunodeficiencia humana; regulación del crecimiento linfocítico; tratar cáncer y muchas enfermedades autoinmunitarias, y para prevenir el rechazo de transplantes o inducir inmunidad tumoral); regulación de hematopoyesis, por ejemplo tratamiento de enfermedades mieloides o linfoides; promover el crecimiento de hueso, cartílago, tendón, ligamento y tejido nervioso, por ejemplo para sanar heridas, tratamiento de quemaduras, úlceras y enfermedad periodontal y neurodegeneración; inhibición o activación de la hormona estimulante de folículos (modulación de la fertilidad); actividad quimiotáctica/quimiocinética (por ejemplo para movilizar tipos celulares específicos a sitios de lesión o infección); actividad hemostática y trombolítica (por ejemplo para tratar hemofilia y apoplejía); actividad antiinflamatoria (para tratar, por ejemplo, choque séptico o enfermedad de Crohn); como antimicrobianos; moduladores de por ejemplo metabolismo o comportamiento; como analgésicos; para tratar trastornos de deficiencia específica; en el tratamiento de por ejemplo psoriasis, en medicina humana o
veterinaria.
Además, o como alternativa, puede ser útil en el tratamiento de trastornos enumerados en el documento WO-A-98/09985. Para facilidad de referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: actividad inhibidora de macrófagos y/o inhibidora de células T y de este modo actividad antiinflamatoria; actividad antiinmunitaria, es decir, efectos inhibidores frente a respuesta inmunitaria celular y/o humoral, incluyendo una respuesta no asociada con inflamación; inhibir la capacidad de macrófagos y células T para adherirse a componentes de la matriz extracelular y fibronectina, así como expresión del receptor fas aumentada en células T; inhibir la reacción inmunitaria indeseada y la inflamación, incluyendo artritis, incluyendo artritis reumatoide, inflamación asociada con hipersensibilidad, reacciones alérgicas, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades de colágeno y otras enfermedades autoinmunitarias, inflamación asociada con aterosclerosis, arteriosclerosis, cardiopatía aterosclerótica, lesión por reperfusión, parada cardíaca, infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, síndrome disneico u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamación asociada con úlcera péptica, colitis ulcerosa y otras enfermedades del tubo digestivo, fibrosis hepática, cirrosis hepática u otras enfermedades hepáticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urológicas, otitis u otras enfermedades otorrinolaringológicas, dermatitis u otras enfermedades dérmicas, enfermedades periodontales u otras enfermedades dentales, orquitis o epididimo-orquitis, infertilidad, trauma testicular u otras enfermedades testiculares inmunorrelacionadas, disfunción placentaria, insuficiencia placentaria, aborto recidivante, eclampsia, preeclampsia y otras enfermedades ginecológicas inmunorrelacionadas y/o relacionadas con inflamación, uveítis posterior, uveítis intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveorretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, por ejemplo retinitis o edema macular cistoide, oftalmia simpática, escleritis, retinitis pigmentosa, componentes inmunitarios e inflamatorios de enfermedad del fondus degenerativa, componentes inflamatorios de trauma ocular, inflamación ocular provocada por infección, vitreorretinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva, por ejemplo tras operación de filtración de glaucoma, reacción inmunitaria y/o de inflamación frente a implantes oculares, y otras enfermedades oftálmicas inmunorrelacionadas y relacionadas con inflamación, inflamación asociada con enfermedades autoinmunitarias o afecciones o trastornos en los que, tanto en el sistema nervioso central (SNC) o en cualquier órgano, sería beneficioso la supresión inmunitaria y/o de la inflamación, enfermedad de Parkinson, complicación y/o efectos secundarios debidos al tratamiento de la enfermedad de Parkinson, complejo de demencia relacionada con SIDA, encefalopatía relacionada con VIH, enfermedad de Devic, corea de Syndenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades degenerativas, afecciones o trastornos del SNC, componentes inflamatorios de apoplejías, síndrome post-polio, componentes inmunitarios e inflamatorios de trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, síndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastenia grave, cerebri pseudotumoral, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorios de compresión del SNC o trauma del SNC o infecciones del SNC, componentes inflamatorios de atrofias y distrofias musculares, enfermedades inmunorrelacionadas y relacionadas con inflamación, afecciones o trastornos de los sistemas nerviosos central y periférico, inflamación post-traumática, choque séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones inflamatorias o efectos secundarios de la cirugía, transplante de médula ósea u otras complicaciones y/o efectos secundarios del transplante, complicaciones inflamatorias y/o inmunitarias y efectos secundarios de la terapia génica, por ejemplo debido a infección con un vehículo vírico, o inflamación asociada con SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, para tratar o mejorar enfermedades proliferativas de monocitos o leucocitos, por ejemplo leucemia, reduciendo la cantidad de monocitos o linfocitos, para la prevención y/o tratamiento de rechazo de injerto en los casos de transplante de células, tejido y órganos naturales o artificiales, tales como córnea, médula ósea, órganos, lentes, marcapasos, tejido de piel natural o
artificial.
La invención se describirá ahora adicionalmente a título de Ejemplos. Los Ejemplos se refieren a las Figuras. En las Figuras:
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Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra esquemáticamente cómo crear una 3' LTR adecuada mediante PCR;
la Figura 2 muestra la tabla de uso de codones para gag-pol de VIH de tipo salvaje de la cepa HXB2 (número de acceso: K03455);
la Figura 3a muestra la tabla de uso de codones de la secuencia de codones optimizados denominada gagpol-SYNgp. La Figura 3b muestra una tabla de uso de codones comparativa;
la Figura 4 muestra la tabla de uso de codones del env del VIH de tipo salvaje denominado env-mn;
la Figura 5 muestra la tabla de uso de codones de la secuencia de codones optimizados de env de VIH denominada SYNgp160mm;
la Figura 6 muestra dos constructos plasmídicos para uso en la invención;
la Figura 7 muestra el principio detrás de dos sistemas para producir partículas de vector retrovírico;
la Figura 8 muestra una comparación de secuencias entre la secuencia de gag-pol de VIH de tipo salvaje (pGP-RRE3) y la secuencia de gag-pol de codones optimizados (pSYNGP);
la Figura 9 muestra una comparación de secuencias entre la secuencia de gag-pol de EIAV de tipo salvaje (WT) y la secuencia de gag-pol de codones optimizados (CO);
la Figura 10 muestra la independencia de Rev de la formación de partículas de expresión de proteína;
la Figura 11 muestra las velocidades de traducción de gag-pol de tipo salvaje (WT) y de codones optimizados;
la Figura 12 muestra los niveles de ARNm de gag-pol en fracciones totales y citoplásmicas;
la Figura 13 muestra el efecto de la inserción de gag de WT en dirección 3' del gen de codones optimizados sobre los niveles de ARN y de proteína;
la Figura 14 muestra los plásmidos usados para estudiar el efecto de gag de VIH-1 sobre el gen de codones optimizados;
la Figura 15 muestra el efecto sobre el ARN citoplásmico de la inserción de gag de VIH-1 en dirección 5' del gen de codones optimizados;
la Figura 16 muestra el efecto de Leptomicina B (LMB) sobre la producción de proteína;
la Figura 17 muestra los niveles de ARN citoplásmico de los genomas del vector;
la Figura 18 muestra la eficiencia de la transducción a MOI 1;
la Figura 19 muestra una representación esquemática de pGP-RRE3;
la Figura 20 muestra una representación esquemática de pSYNGP;
la Figura 21 muestra títulos del vector generados con diferentes constructos de gag-pol;
la Figura 22 muestra títulos del vector a partir de los genomas Rev/RRE (-) y (+);
la Figura 23 muestra títulos del vector a partir de la serie pHS de genomas del vector;
la Figura 24 muestra títulos del vector para la serie de pHS de genomas del vector en presencia o ausencia de Rev/RRE;
la Figura 25 muestra un análisis de los constructos de gag-pol;
la Figura 26 muestra una transferencia Western de extractos de 293T;
la Figura 27 es una representación esquemática de pESYNGP;
la Figura 28 es una representación esquemática de LpESYNGP;
la Figura 29 es una representación esquemática de LpESYNGPRRE;
la Figura 30 es una representación esquemática de pESYNGPRRE;
la Figura 31 es una representación esquemática de pONY4.0Z;
la Figura 32 es una representación esquemática de pONY8.0Z;
la Figura 33 es una representación esquemática de pONY8.1Z;
la Figura 34 es una representación esquemática de pONY3.1;
la Figura 35 es una representación esquemática de pClneoERev;
la Figura 36 es una representación esquemática de pESYNREV;
las Figuras 37 y 38 muestran el efecto de diferentes constructos vectoriales sobre los títulos de vectores víricos;
las Figuras 39 y 40 muestran el efecto de diferentes constructos vectoriales sobre la actividad de RT;
la Figura 41 muestra el efecto de la secuencia líder de 5' en el título del vector vírico;
la Figura 42 muestra títulos del vector vírico cuando se usa pONY8.1Z;
la Figura 43 muestra una comparación entre las secuencias de pONY3.1 y pONY3.2OPTI de codones optimizados en los primeros 372 nucleótidos de gag;
la Figura 44 es una representación esquemática de pIRES1hygESYNGP;
las Figuras 45 y 46 muestran los resultados de experimentos para confirmar que gag-pol de codones optimizados se puede usar en la producción de estirpes celulares de empaquetamiento y productoras;
las Figuras 47 y 48 muestran los resultados de experimentos que confirman que el ARN procedente de gag-pol de codones optimizados está empaquetado menos eficientemente que el procedente del gen de tipo salvaje;
la Figura 49 muestra los resultados de un experimento que confirma que la expresión de pESYNGP y pESDSYNGP son similares;
la Figura 50 es una representación esquemática de pESDSYNGP; y
la Figura 51 muestra los resultados de un experimento que confirma que la eficiencia de encapsidar ARN de gag-pol en células PEV-17 y células B-241 es similar.
En más detalle, la Figura 8 muestra una comparación de secuencias entre la secuencia de gag-pol de VIH de tipo salvaje (pGP-RRE3) y la secuencia de gag-pol de codones optimizados (pSYNGP), en la que la secuencia superior representa pSYNGP y la secuencia inferior representa pGP-RRE3.
La Figura 10 muestra la independencia con respecto a Rev de la formación de partículas para la expresión de proteínas. Se transfectaron 5 \mug de los plásmidos de expresión de gag-pol en células 293T en presencia o ausencia de Rev (pCMV-Rev, 1 \mug), y los niveles de proteína se determinaron 48 horas después de la transfección en sobrenadantes de cultivo (A) y lisados celulares (B). Para detectar las proteínas gag-pol, se usó suero humano positivo a VIH-1. Las transferencias se volvieron a sondar con un anticuerpo anti-actina, como control interno (C). Los tamaños (en kDa) de los marcadores proteicos (New England Biolabs) se muestran al lado del gel. Líneas: 1. células 293T transfectadas simuladamente, 2. pGP-RRE3, 3. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 4. pSYNGP, 5. pSYNGP + pCMV-Rev, 6. pSYNGP-RRE, 7. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 8. pSYNGP-ERR, 9. pSYNGP-ERR + pCMV-Rev.
La Figura 11 muestra las velocidades de traducción de gag-pol de WT y de codones optimizados. Se transfectaron células 293T con 2 \mug de pGP-RRE3 (+/- 1 \mug de pCMV-Rev) o 2 \mug de pSYNGP. Las muestras de proteínas procedentes de sobrenadantes de cultivo (A) y de extractos celulares (B) se analizaron mediante transferencia Western 12, 25, 37 y 48 horas después de la transfección. Para detectar las proteínas gag-pol (A, B), se usó suero humano positivo a VIH-1, y como control interno (C) se usó un anticuerpo anti-actina. Los tamaños de los marcadores proteicos se muestran al lado del gel (en kD). Se usó un Phosphorimager para la cuantificación de los resultados. Líneas: 1. pGP-RRE3 12 h, 2. pGP-RRE3 25 h, 3. pGP-RRE3 37 h, 4. pGP-RRE3 48 h, 5. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 12 h, 6. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 25 h, 7. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 37 h, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 48 h, 9. pSYNGP 12 h, 10. pSYNGP 25 h, 11. pSYNGP 37 h, 12. pSYNGP 48 h, 13. células 293T transfectadas simuladamente.
La Figura 12 muestra los niveles de ARNm de gag-pol en fracciones totales y citoplásmicas. Se extrajo ARN total y citoplásmico a partir de células 293T 36 horas después de la transfección con 5 \mug del plásmido de expresión de gag-pol (+/- 1 \mug de pCMV-Rev), y los niveles de ARNm se estimaron mediante análisis de transferencia Northern. Se usó una sonda complementaria a nt 1222-1503 de tanto el gen de tipo salvaje como el gen de codones optimizados. El panel A muestra la banda que corresponde a la gag-pol de VIH-1. Los tamaños de los ARNm son 4,4 kb para el gen de codones optimizados, y 6 kb para el gen de tipo salvaje. El panel B muestra la banda que corresponde a ubiquitina humana (control interno para la normalización de los resultados). La cuantificación se llevó a cabo usando un Phosphorimager. Numeración de las líneas: c indica fracción citoplásmica y t indica fracción de ARN total. Líneas: 1. pGP-RRE3, 2. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 3. pSYNGP, 4. pSYNGP + pCMV-Rev, 5. pSYNGP-RRE, 6. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 7. células 293T transfectadas simuladamente, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 9. células 293T transfectadas simuladamente, 10. pSYNGP.
La Figura 13 muestra el efecto de la inserción de gag de WT en dirección 3' del gen de codones optimizados sobre los niveles de ARN y de proteína. La secuencia de gag de wt se insertó en dirección 3' del gen de codones optimizados en ambas orientaciones (sitio NotI), dando como resultado los plásmidos pSYN6 (orientación correcta, véase la Figura 14) y pSYN7 (orientación inversa, véase la Figura 14). También se insertó el gen que codifica \beta-galactosidasa (LacZ) en el mismo sitio y la orientación correcta (plásmido pSYN8, véase la Figura 14). Se transfectaron células 293T con 5 \mug de cada plásmido, y 48 horas después de la transfección se determinaron los niveles de ARNm y de proteína como se describió previamente, por medio de análisis de transferencia Northern y Western.
Análisis de transferencia Northern en fracciones de ARN citoplásmico. La transferencia se sondó con una sonda complementaria a nt 1510-2290 del gen de codones optimizados (I), y se volvió a sondar con una sonda específica para ubiquitina humana (II). Líneas: 1. pSYNGP, 2. pSYN8, 3. pSYN7, 4. pSYN6.
Análisis de transferencia Western: se usó suero humano positivo a VIH-1 para detectar las proteínas gag-pol (I), y como control interno se usó un anticuerpo anti-actina (II). Líneas: lisados celulares: 1. células 293T transfectadas simuladamente, 2. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 3. pSYNGP, 4. pSYN6, 5. pSYN7, 6. pSYN8. Sobrenadantes: 7. células 293T transfectadas simuladamente, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 9. pSYNGP, 10. pSYN6, 11. pSYN7, 12. pSYN8. Los tamaños de los marcadores proteicos (New England Biolabs) se muestran al lado del gel.
La Figura 14 muestra los plásmidos usados para estudiar el efecto de gag de VIH-1 sobre el gen de codones optimizados. La estructura principal para todos los constructos fue pCI-Neo. Syn gp: el gen gag-pol de VIH-1 de codones optimizados. HXB2 gag: el gen gag de VIH-1 de tipo salvaje. HXB2 gag: el gen gag de VIH-1 de tipo salvaje en la orientación inversa. HXB2 gag\DeltaATG: el gen gag de VIH-1 de tipo salvaje sin el ATG de gag. HXB2 gag-fr.sh.: el gen gag de VIH-1 de tipo salvaje con una mutación de desplazamiento de marco. HXB2 gag 625-1503: nucleótidos 625-1503 del gen gag de VIH-1 de tipo salvaje. HXB2 gag 1-625: nucleótidos 1-625 del gen gag de VIH-1 de tipo salvaje.
La Figura 15 muestra el efecto sobre el ARN citoplásmico de la inserción de gag de VIH-1 en dirección 5' del gen de codones optimizados. Se extrajo ARN citoplásmico 48 horas después de la transfección de células 293T (se usaron n5 \mug de cada plásmido pSYN, y en algunos casos se cotransfectó 1 \mug de pCMV-Rev). La sonda que se usó se diseñó para ser complementaria a nt 1510-2290 del gen de codones optimizados (I). Como control interno, se usó una sonda específica para ubiquitina humana (II). Líneas: 1. pSYNGP, 2. pSYN9, 3. pSYN10, 4. pSYN10 + pCMV-Rev, 5. pSYN11, 6. pSYN11 + pCMV-Rev, 7. pCMV-Rev. Líneas: 1. pSYNGP, 2. pSYNGP-RRE, 3. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 4. pSYN12, 5. pSYN14, 6. pSYN14 + pCMV-Rev, 7. pSYN13, 8. pSYN15, 9. pSYN17, 10. pGP-RRE3, 11. pSYN6, 12. pSYN9, 13. pCMV-Rev.
La Figura 16 muestra el efecto de LMB sobre la producción de proteínas. Se transfectaron células 293T con 1 \mug de pCMV-Rev y 3 \mug de pGP-RRE3/pSYNGP/pSYNGP-RRE (+/- 1 \mug de pCMV-Rev). Las transfecciones se hicieron por duplicado. Cinco horas después de la transfección, el medio se sustituyó con medio reciente en el primer conjunto, y con medio reciente que contiene 7,5 nM de LMB en el segundo. Veinte horas más tarde, las células se lisaron, y la producción de proteína se estimó mediante análisis de transferencia Western. Para detectar las proteínas gag-pol, se usó suero humano positivo a VIH-1 (A) y como control interno se usó un anticuerpo anti-actina (B). Líneas: 1. pGP-RRE3, 2. pGP-RRE3 + LMB, 3. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 4. pGP-RRE3 + pCMV-Rev + LMB, 5. pSYNGP, 6. pSYNGP + LMB, 7. pSYNGP + pCMV-Rev, 8. pSYNGP + pCMV-Rev + LMB, 9. pSYNGP-RRE, 10. pSYNGP-RRE + LMB, 11. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 12. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev + LMB.
La Figura 17 muestra los niveles de ARN citoplásmico de los genomas de los vectores. Se transfectaron células 293T con 10 \mug de cada genoma vectorial. Se extrajo ARN citoplásmico 48 horas después de la transfección. Se usaron 20 \mug de ARN de cada muestra para análisis de transferencia Northern. Se diseñó la sonda de 700 pb para que se hibridara a todos los ARN de los genomas vectoriales (véase Materiales y Métodos). Líneas: 1. pH6nZ, 2. pH6nZ + pCMV-Rev, 3. pH6.1nZ, 4. pH6.1nZ + pCMV-Rev, 5. pHS1nZ, 6. pHS2nZ, 7. pHS3nZ, 8. pHS4nZ, 9. pHS5nZ, 10. pHS6nZ, 11. pHS7nZ, 12. pHS8nZ, 13. pCMV-Rev.
La Figura 18 muestra la eficiencia de la transducción a MOI 1. Se generaron lotes víricos mediante cotransfección de cada plásmido de expresión de gag-pol (5 ó 0,5 \mug), 15 \mug de pH6nZ o pHS3nZ (plásmido de genoma vectorial) y 5 \mug de pHCMVG (plásmido de la expresión de la cubierta de VSV), en células 293T. El virus se concentró como se describe previamente (45), y la eficiencia de la transducción se determinó a una m.o.i. de 0,01-1 en células HT1080. Hubo una correlación lineal de la eficiencia de la transducción y m.o.i. en todos los casos. Aquí se muestra un dibujo representativo a m.o.i. 1. La eficiencia de la transducción fue >80% con cualquier genoma, cualquier gag-pol y cualquier cantidad alta o baja de pSYNGP. Títulos antes de la concentración (I.U./ml): en células 293T: A. 6,6x10^{5}, B. 7,6x10^{5}, C. 9,2x10^{5}, D. 1,5x10^{5}, en células HT1080: A. 6,0x10^{4}, B. 9,9x10^{4}, C. 8,0x10^{4}, D. 2,9x10^{4}. Títulos después de la concentración (I.U./ml) en células HT1080: A. 6,0x105, B. 2,0x106, C. 1.4x10^{6}, D.
2,0x10^{5}.
La Figura 21 muestra títulos de vectores obtenidos con diferentes constructos de gag-pol. Se generaron lotes víricos mediante cotransfección de cada plásmido de expresión de gag-pol, pH6nZ (plásmido de genoma vectorial) y pHCMVG (plásmido de la expresión de la cubierta de VSV, 2,5 \mug para cada transfección), en células 293T. Los títulos (I.U./ml de lote vírico) se midieron en células 293T contando el número de colonias azules tras la tinción con X-Gal 48 horas después de la transducción. Se llevaron a cabo experimentos por lo menos dos veces, y la variación entre los experimentos fue menor que 15%.
La Figura 22 muestra títulos de vectores a partir de los genomas Rev/RRE (-) y (+): los vectores retrovíricos se generaron como se describe en los Ejemplos. Los títulos (I.U./ml de lote vírico + SD) se determinaron en células
293T.
La Figura 23 muestra títulos de vectores a partir de las series de pHS de genomas vectoriales. El vector retrovírico se generó como se describe en los Ejemplos. Los títulos (I.U./ml de lote vírico + SD) se determinaron en células 293T. Rev se proporciona a partir de pCMV-Rev. Obsérvese que pH6nZ expresa Rev y contiene el RRE. Ninguno de los otros genomas expresa Rev o contiene el RRE. La expresión de pSYNGP es independiente Rev, mientras que es dependiente de Rev para pGP-RRE3.
La Figura 24 muestra títulos de vectores para la serie de pHS de genomas vectoriales en presencia o ausencia de Rev/RRE. El vector retrovírico se generó como se describe en los Ejemplos. Se usaron 5 \mug de genoma vectorial, 5 \mug de pSYNGP y 2,5 \mug de pHCMVG, y los títulos (I.U./ml) se determinaron en células 293T. Los experimentos se llevaron a cabo por lo menos dos veces, y la variación entre experimentos fue menor que 15%. Rev se proporciona a partir de pCMV-Rev (1 \mug). Obsérvese que pH6nZ expresa Rev y contiene el RRE. Ninguno de los genomas de pHS expresa Rev, y sólo pHS1nZR, pHS3nZR, pHS7nZR y pH6.1nZR contienen el RRE. La expresión de gag-pol a partir de pSYNGP es independiente de Rev.
La Figura 26 muestra una transferencia Western de extractos de 293T, en los que 30:g de proteína celular total se separó mediante electroforesis de SDS/Page, se transfirieron a nitrocelulosa y se sondaron con anticuerpos anti-EIAV. El anticuerpo secundario fue anti-HRP de caballo (Sigma).
En la Figura 38, los títulos se muestran en unidades formadoras de lacZ (L.F.U.)/ml. Los vectores usados se indican en cajas encimas de las barras.
Para una mejor comprensión, se exponen asimismo las secuencias enumeradas en el Listado de Secuencia que se adjunta:
SEC ID nº:1
muestra la secuencia de la secuencia de gag-pol de tipo salvaje para la cepa HXB2 (número de acceso K03455);
SEC ID nº:2
muestra la secuencia de pSYNGP;
SEC ID nº:3
muestra la secuencia del gen de cubierta para MN VIH-1 (número de acceso de Genbank M17449);
SEC ID nº:4
muestra la secuencia de SYNgp-160mn - secuencia de env de codones optimizados;
SEC ID nº: 5
muestra la secuencia de pESYNGP;
SEC ID nº:6
muestra la secuencia de LpESYNGP;
SEC ID nº:7
muestra la secuencia de pESYNGPRRE;
SEC ID nº:8
muestra la secuencia de LpESYNGPRRE;
SEC ID nº:9
muestra la secuencia de pONY4.0Z;
SEC ID nº:10
muestra la secuencia de pONY8.0Z;
SEC ID nº:11
muestra la secuencia de pONY8.1Z;
SEC ID nº:12
muestra la secuencia de pONY3.I;
SEC ID nº:13
muestra la secuencia de pClneoERev;
SEC ID nº:14
muestra la secuencia de pESYNREV;
SEC ID nº:15
muestra la secuencia de gag-pol de VIH de codones optimizados;
SEC ID nº:16
muestra la secuencia de gag-pol de EIAV codones optimizados;
SEC ID nº:17
muestra la secuencia de pIRES1hygESYNGP;
SEC ID nº:18
muestra la secuencia de pESDSYNGP; y
SEC ID nº:19
muestra la secuencia de pONY8.3G FB29(-).
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Ejemplo 1
VIH Estirpes celulares
Células 293T (33) y células HeLa (34) se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco que contiene 10% (v/v) de suero fetal de ternera y suplementado con L-glutamina y antibióticos (penicilina-estreptomicina). Las células 293T se obtuvieron de D. Baltimore (Rockefeller University).
Clones províricos de VIH-1
Se usaron clones províricos pWI3 (35) y pNL4-3 (36).
Construcción de un sistema de empaquetamiento
En uno de los presentes ejemplos, se usó una secuencia de env de VIH de codones optimizados modificada (SEC ID. No. 4). El plásmido de expresión de env correspondiente se denomina pSYNgp160mn. La secuencia modificada contiene motivos adicionales no usados por (37). Las secuencias adicionales se tomaron de la secuencia de env de VIH de cepa MN y de codones optimizados. Cualquier modificación similar de la secuencia de ácido nucleico funcionaría de forma similar en tanto que usase codones que corresponden a ARNt abundantes (38).
Gen de gag-pol de VIH-1 de codones optimizados
Se construyó un gen de gag-pol de codones optimizados, mostrado desde nt 1108 a 5414 de SEC ID nº: 2, hibridando una serie de oligonucleótidos solapantes cortos (aproximadamente 30-40meros con un solapamiento de 25%, es decir, aproximadamente 9 nucleótidos). Los oligonucleótidos se adquirieron de R&D SYSTEMS (R&D Systems Europe Ltd, 4-10 The Quadrant, Barton Lane, Abingdon, OX14 3YS, UK). La optimización de los codones se llevó a cabo usando la secuencia de la cepa (AC: K03455) de HXB-2 (39). También se incluyó la secuencia de consenso de Kozak para el inicio de la traducción óptima (40). Un fragmento desde la base 1222 a partir del comienzo de gag hasta el final de gag (1503) no se optimizó a fin de mantener el sitio de desplazamiento del marco y el solapamiento entre los marcos de lectura de gag y pol. Esto fue del clon pNL4-3. (Cuando se hace referencia a los números de bases dentro del gen de gag-pol, la base 1 es la A del ATG de gag, que corresponde a la base 790 desde el comienzo de la secuencia de HXB2. Cuando se hace referencia a secuencias fuera del gag-pol, entonces los números se refieren a bases desde el comienzo de la secuencia de HXB2, en la que la base 1 corresponde al comienzo de la 5' LTR). Se realizaron algunas desviaciones de la optimización a fin de introducir sitios de restricción convenientes. En la Figura 3b se muestra el uso final de los codones, que ahora se parece al de los genes humanos muy expresados y es bastante diferente del de gag-pol de VIH-1 de tipo salvaje. El gen se clonó en el vector de expresión de mamífero pClneo (Promega) en los sitios EcoRI-NotI. El plásmido resultante se denominó pSYNGP (Figura 20, SEC ID No 2). La secuenciación del gen en ambas hebras verificó la ausencia de cualesquiera errores. En la Figura 8 se muestra una comparación de secuencias entre la secuencia de gag-pol de VIH de codones optimizados y de tipo salvaje.
Constructos de Rev/REE
La secuencia de RRE de VIH-1 (bases 7769-8021 de la secuencia de HXB2) se amplificó mediante PCR a partir del clon provírico pWI3 con cebadores que poseen el sitio de restricción NotI, y se clonó subsiguientemente en el sitio NotI de pSYNGP. Los plásmidos resultantes se denominaron pSYNGP-RRE (RRE en la orientación correcta) y pSYNGP-ERR (RRE en la orientación inversa).
Partículas víricas pseudotipadas
En una forma del sistema de empaquetamiento, un casete de gag-pol sintético se coexpresa con una secuencia codificante de cubierta heteróloga. Esta podría ser, por ejemplo, VSV-G (44, 45), env de MLV anfotrópico (46, 47), o cualquier otra proteína que se incorporaría en la partícula de VIH o EIAV (48). Esto incluye moléculas capaces de dirigir el vector hacia tejidos específicos.
Constructos de genoma vectorial de VIH-1
pH6nZ deriva de pH4Z (49) mediante adición de un único nucleótido para colocar un resto de guanina adicional que estaba perdido de pH4Z en el extremo 5' del transcrito del genoma del vector para optimizar la transcripción inversa. Además, el gen que codifica \beta-galactosidasa (LacZ) se sustituyó por un gen que codifica una \beta-galactosidasa localizante nuclear. (Agradecemos a Enca Martin-Rendon y Said Ismail que hayan proporcionado pH6nZ). A fin de construir constructos genómicos de Rev(-), se hicieron las siguientes modificaciones: a) se eliminó un fragmento PstI-PstI de 1,8 kb de pH6nZ, dando como resultado un plásmido pH6.1nZ, y b) se sustituyó un fragmento de EcoNI (lleno)-SphI por un fragmento de SpeI (lleno)-SphI del mismo plásmido (pH6nZ), dando como resultado el plásmido pH6.2nZ. En ambos casos, se retuvieron las secuencias en gag (nt 1-625), puesto que han demostrado desempeñar un papel en el empaquetamiento (93). Se eliminaron Rev, RRE y cualesquiera otras secuencias de env residuales. pH6.2nZ contiene además el aceptor de corte y empalme de env, mientras que pH6.1nZ no lo tiene.
Una serie de vectores que comprenden supresiones de gag adicionales más o menos un donante de corte y empalme (SD) principal mutante (mutación GT a CA) también se derivaron de pH6Z. Estos se obtuvieron mediante PCR con cebadores que tienen un sitio de NarI (cebadores 5') y SpeI (cebadores 3'). Los productos se insertaron en pH6Z en los sitios de NarI-SpeI. Los vectores resultantes se denominaron pHS1nZ (que contiene las secuencias de VIH-1 hasta gag 40), pHS2nZ (que contiene las secuencias de VIH-1 hasta gag 260), pHS3nZ (que contienen las secuencias de VIH-1 hasta gag 360), pHS4nZ (que contienen las secuencias de VIH-1 hasta gag 625), pHS5nZ (igual que pHS1nZ, pero con un SD mutante), pHS6nZ (igual que pHS2nZ, pero con un SD mutante), pHS7nZ (igual que pHS3nZ, pero con un SD mutante) y pHS8nZ (igual que pHS4nZ, pero con un SD mutante).
Además, la secuencia de RRE (nt 7769-8021 de la secuencia de HXB2) se insertó en el sitio de SpeI (lleno) de pH6.1nZ, pHS1nZ, pHS3nZ y pHS7nZ, dando como resultado los plásmidos pH6.1nZR, pHS1nZR, pHS3nZR y pHS7nZR, respectivamente.
Se han realizado otras modificaciones al genoma, incluyendo la generación de un vector SIN (mediante supresión de parte del 3' U3), la sustitución de las LTR con aquellas procedentes de MLV, o la sustitución de parte de 3'U3 por la región U3 de MLV.
Transfecciones transitorias, transducciones y determinación de títulos víricos
Éstas se llevaron a cabo como se describe previamente (49, 50). De forma breve, se sembraron células 293T sobre cápsulas de 6 cm, y 24 horas más tarde se transfectaron transitoriamente mediante tratamiento durante toda la noche con fosfato de calcio. El medio se sustituyó 12 horas tras la transfección, y, excepto que se señale de otro modo, los sobrenadantes se cosecharon 48 horas después de la transfección, se filtraron (a través de filtros de 0,22 ó 0,45 \mum) y se titularon mediante transducción de células 293T. Por esta razón, se añadió sobrenadante a diluciones apropiadas del lote original a células 293T (cultivadas en placas de 6 ó 12 pocillos 24 horas antes de la transducción). A cada pocillo se añadieron 8 \mug/ml de Polybrene (Sigma), y, 48 horas después de la transducción, los títulos víricos se determinaron mediante tinción con X-gal.
Ensayos de \beta-galactosidasa (\beta-gal) luminiscentes
Estos se llevaron a cabo sobre extractos de células totales usando un sistema informador de \beta-gal luminiscente (CLONTECH). Como control negativo, se usaron células 293T no transfectadas, y como control positivo se usaron células 293T transfectadas con pCMV-\beta-gal (CLONTECH).
Análisis de ARN
Se extrajo ARN total o citoplásmico de células 293T usando el mini kit RNeasy (QUIAGEN) 36-48 horas después de la transfección. 5-10 \mug de ARN se sometieron a análisis de transferencia Northern como se describe previamente (51). El fraccionamiento correcto se verificó mediante tinción del gel de agarosa. Una sonda complementaria a las bases 1222-1503 del gen gag-pol se amplificó mediante PCR a partir del clon provírico pNL4-3 de VIH-1, y se usó para detectar los ARNm de gag-pol tanto de codones optimizados como de tipo salvaje. Una segunda sonda, complementaria a nt 1510-2290 del gen de codones optimizados, también se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pSYNGP, y se usó para detectar sólo los genes de codones optimizados. Se preparó un fragmento de 732 pb, complementario a todos los genomas vectoriales usados en este estudio, mediante una digestión con SpeI-AvrII de pH6nZ. Para normalizar los resultados, se usó una sonda específica para ubiquitina (CLONTECH). Todas las sondas se marcaron mediante marcado al azar (STRATAGENE) con \alpha-^{32}P dCTP (Amersham). Los resultados se cuantificaron usando un Storm Phosphorlmager (Molecular Dynamics), y se muestran en la Figura 12. En las fracciones celulares totales, el precursor de ARNr 47S se pudo ver claramente, mientras que estaba ausente de las fracciones citoplásmicas. Como se esperaba (52), Rev estimula la acumulación citoplásmica de ARNm de gag-pol de tipo salvaje (líneas 1c y 2c). Los niveles de ARN fueron 10-20 veces mayores para el gen de codones optimizados, en comparación con el de tipo salvaje, tanto en las fracciones totales como citoplásmicas (compárense las líneas 3t-2t, 3c-2c, 10c-8c). La secuencia de RRE no desestabilizó significativamente los ARN de codones optimizados, puesto que los niveles de ARN fueron similares para los ARN de codones optimizados, tanto si contenían la secuencia de RRE como si no (compárense las líneas 3 y 5). Rev no potenció notablemente la acumulación citoplásmica de los ARNm de gag-pol de codones optimizados, incluso cuando contenían la secuencia de RRE (las diferencias en los niveles de ARN fueron menores de 2 veces; compárense las líneas 3-4 ó 5-6).
A partir de la comparación de las Figuras 10 y 12, parece que todo el incremento en la expresión proteica de syngp podría explicarse por el incremento en los niveles de ARN. A fin de investigar si esto fue debido a niveles saturantes de ARN en la célula, se transfectaron 0,1, 1 y 10 \mug de los vectores de expresión de tipo salvaje o de codones optimizados en células 293T, y se comparó con la producción de proteínas. En todos los casos, la producción de proteínas fue 10 veces mayor para el gen de codones optimizados para la misma cantidad de ADN transfectado, mientras que el incremento en los niveles de proteína fue proporcional a la cantidad de ADN transfectado para cada gen individual. Por lo tanto, parece probable que la expresión potenciada del gen de codones optimizados se puede atribuir principalmente a los niveles potenciados de ARN presentes en el citoplasma, y no a una traducción incrementada.
Análisis de proteínas
Se prepararon lisados de células totales a partir de células 293T 48 horas después de la transfección (excepto que se establezca de otro modo) con un tampón de lisis alcalina. Para la extracción de proteínas de los sobrenadantes de células, el sobrenadante se hizo pasar en primer lugar a través de un filtro de 0,22 \mum, y las partículas de los vectores se recogieron mediante centrifugación de 1 ml de sobrenadante a 21.000 g durante 30 minutos. Los peletes se lavaron con PBS, y después se resuspendieron en un pequeño volumen (2-10 il) de tampón de lisis. Se separaron cantidades de proteína iguales en un gel de SDS-poliacrilamida al 10-12% (v/v). Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, las cuales se sondaron secuencialmente con una dilución 1:500 de suero humano positivo a VIH-1 (AIDS Reagent Project, ADP508, Panel E) y una dilución 1:1000 de anti-IgG humana marcada con peroxidasa de rábano picante (Sigma, A0176). Las proteínas se visualizaron usando el reactivo de detección de transferencia Western ECL o ECL-plus (Amersham). Para verificar igual carga de proteína, las membranas se lavaron y se volvieron a sondar con una dilución 1:1000 de anticuerpo anti-actina (Sigma, A2066), seguido de una dilución 1:2000 de anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (Vector Laboratories, PI-1000).
Expresión de productos génicos de gag-pol, y producción de partículas vectoriales
El gag-pol de tipo salvaje (pGP-RRE3 - Figura 19) (49), y los vectores de expresión de codones optimizados (pSYNGP, pSYN-GP-RRE y pSYNGP-ERR) se transfectaron transitoriamente en células 293T. Se realizaron transfecciones en presencia o ausencia de un vector de expresión de Rev, pCMV-Rev (53), a fin de evaluar para la expresión la dependencia de Rev. Se llevó a cabo un análisis de transferencia Western sobre lisados celulares y sobrenadantes para evaluar la producción de proteínas. Los resultados se muestran en la Figura 10. Como se esperaba (54), la expresión del gen de tipo salvaje se observa sólo cuando Rev se proporciona en trans (líneas 2 y 3). Por el contrario, cuando se usó el gag-pol de codones optimizados, hubo una expresión de alto nivel tanto en presencia como en ausencia de Rev (líneas 4 y 5), indicando que en este sistema no había necesidad de Rev. Los niveles de proteína fueron mayores para el gen de codones optimizados que para el gag-pol de tipo salvaje (compárense las líneas 4-9 con la línea 3). La diferencia fue más evidente en los sobrenadantes celulares (niveles de proteína aproximadamente 10 veces mayores para el gen de codones optimizados en comparación con el de tipo salvaje, cuantificado usando un PhosphorImager) que en los lisados celulares.
En estudios previos en los que se ha incluido RRE en los vectores de expresión de gag-pol que se habían manipulado mediante ingeniería para eliminar las secuencias de INS, la inclusión del RRE conduce a una disminución en los niveles de proteína, que se restauró proporcionando Rev en trans (55). En nuestras manos, la presencia del RRE en el ARNm de gag-pol de codones completamente optimizados no afectó a los niveles de proteína, y la provisión de Rev en trans no potenció adicionalmente la expresión (líneas 6 y 7).
A fin de comparar las velocidades de traducción entre el gen de tipo salvaje y de codones optimizados, se determinó la producción de proteínas a partir del vector de expresión de tipo salvaje y de codones optimizados a varios intervalos de tiempo tras la transfección en células 293T. La producción de proteínas y la formación de partículas se determinó mediante análisis de transferencia Western, y los resultados se muestran en la Figura 11. La producción de proteínas y la formación de partículas fue 10 veces mayor para el gag-pol de codones optimizados en todos los puntos de tiempo.
Para determinar adicionalmente si esta expresión potenciada que se observó con el gen de codones optimizados fue debido a una mejor traducción o debido a efectos sobre el ARN, se llevó a cabo el análisis de ARN.
La eficiencia de la producción de vectores usando el gen de gag-pol de codones optimizados
Para determinar los efectos del gag-pol de codones optimizados sobre la producción de vectores, se usó un genoma de vector de VIH, pH6nZ, y el plásmido de expresión de cubierta de VSV-G pHCMVG (113), en combinación con pSYNGP, pSYNGP-RRE, pSYNGP-ERR o pGP-RRE3 como fuente para el gag-pol, en una relación de plásmido de 2:1:2 en una cotransfección de 3 plásmidos de células 293T (49). Extractos de células completas y sobrenadantes de cultivos se evaluaron mediante análisis de transferencia Western para determinar la presencia de los productos génicos de gag y gag-pol. La producción de partículas fue, como se esperaba (Figura 10), 5-10 veces superior para los genes de codones optimizados cuando se compara con el tipo salvaje.
Para determinar los efectos del gen de gag-pol de codones optimizados sobre los títulos de los vectores, se usaron varias relaciones de los componentes vectoriales. Los resultados se muestran en la Figura 21. Cuando el gag-pol fue el componente limitante en el sistema (según se determina mediante la caída en los títulos observada con el gen de tipo salvaje), los títulos fueron 10 veces mayores para los vectores de codones optimizados. Esto está de acuerdo con la mayor producción de proteínas observada para estos vectores, pero sugiere que, en condiciones normales de producción de vectores, gag-pol se satura y la optimización de codones no da ninguna ventaja de rendimiento
máximo.
El efecto de las secuencias de INS de gag de VIH-1 sobre el gen de codones optimizados depende de la posición
Se ha demostrado previamente que la inserción de secuencias de gag de VIH-1 de tipo salvaje, en dirección 3' de otros ARN, por ejemplo tat de VIH-1 (56), gag de VIH-1 (55) o CAT (57), puede conducir a una drástica disminución en los niveles de ARNm del estado estacionario, presumiblemente como resultado de las secuencias de INS. En otros casos, por ejemplo para \beta-globina (58), se demostró que el efecto fue dependiente del sitio de corte y empalme. Los ARE (elementos ricos en AU) celulares que se encuentran en la 3'UTR de los ARNm lábiles pueden conferir desestabilización del ARNm induciendo desadenilación citoplásmica de los transcritos (59). Para ensayar si las secuencias de INS de gag de HTV-1 desestabilizarían el ARN de codones optimizados, la secuencia de gag de VIH-1 de tipo salvaje, o partes de ella (nt 1-625 o nt 625-1503), se amplificó mediante PCR a partir del clon provírico pW13. Todos los fragmentos se achataron en sus extremos y se insertaron en pSYNGP o pSYNGP-RRE en un sitio de EcoRI o NotI romo (en dirección 5' o en dirección 3' del gen de gag-pol de codones optimizados, respectivamente). Como controles, también se insertaron en el mismo sitio el gag de VIH-1 de wt en la orientación inversa (puesto que se ha mostrado que las secuencias de INS actúan de una manera dependiente de la orientación, (57) (pSYN7) y lacZ, cortado del plásmido pCMV-\betagal (CLONTECH) (en la orientación correcta) (pSYN8). Contrariamente a lo esperado, como se muestra en la Figura 13, la secuencia de gag de VIH-1 de tipo salvaje no parece afectar significativamente a los niveles de proteína o ARN del gen de codones optimizados. Se construyó adicionalmente otra serie de plásmidos (mediante PCR y a partir de los mismos plásmidos) en los que el gag de VIH-1 de tipo salvaje en la orientación sentido o inversa, subfragmentos de gag (nt 1-625 o nt 625-1503), el gag de VIH-1 de tipo salvaje sin el ATG o con una mutación del desplazamiento del marco de 25 bases en dirección 3' del ATG, o nt 72-1093 de LacZ (cortado del plásmido pH6Z), o las primeras 1093 bases de lacZ con o sin el ATG se insertaron en dirección 5' del gen de gag-pol de VIH-1 de codones optimizados en pSYNGP y/o pSYNGP-RRE (pSYN9-pSYN22, Figura 14). El análisis de transferencia Northern mostró que la inserción del gen de gag de VIH-1 de tipo salvaje en dirección 5' del gag-pol de VIH-1 de codones optimizados (pSYN9, pSYN10) conduce a niveles reducidos de ARN en presencia o ausencia de Rev/RRE (Figura 15A, líneas 1-4, y Figura 15B, líneas 1 + 12). El efecto no dependió de la traducción, puesto que la inserción de un gag de VIH-1 de tipo salvaje que carece del ATG o con una mutación de desplazamiento de marco (pSYN12, pSYN13 y pSYN14) también disminuyó los niveles de ARN (Figura 15B, líneas 1-7). El análisis de transferencia Western verificó que no hubo producto de traducción de gag de VIH-1 para pSYN12-14. Sin embargo, es posible que, puesto que el gag de VIH-1 de wt muestra tal uso adverso de codones, puede actuar como un líder de 5' largo no traducible para syngp, y, si este es el caso, entonces la mutación de ATG no debería tener ningún
efecto.
La inserción de partes más pequeñas del gen de gag de VIH-1 de tipo salvaje (pSYN15 y pSYN17) también conduce a una disminución en los niveles de ARN (Figura 15B, líneas 1-3 y 8-9), pero no a niveles tan bajos como cuando se usó la secuencia completa de gag (líneas 1-3, 4-7 y 8-9 en la Figura 15B). Esto indica que el efecto de las secuencias de INS depende de su tamaño. La inserción del gag de VIH-1 de tipo salvaje en la orientación inversa (pSYN11) no tuvo ningún efecto sobre los niveles de ARN (Figura 15A, líneas 1 y 5-6). Sin embargo, parece que en ese caso tuvo lugar un suceso de corte y empalme, como se indica por el tamaño del ARN (igual al tamaño del ARN de gag-pol de codones optimizados) y por el producto de traducción (gag-pol, en cantidades iguales en comparación con pSYNGP, como se verificó mediante análisis de transferencia de Western).
Por lo tanto, estos datos indican que las secuencias de inestabilidad de gag de VIH-1 de tipo salvaje actúan de una manera dependiente de la posición y del tamaño, probablemente independientemente de la traducción. También se debería observar que el RRE fue incapaz de rescatar los ARN desestabilizados a través de la interacción con
Rev.
Construcción de un sistema de vector a base de VIH-1 que carece de todas las proteínas accesorias
Hasta ahora, se han dado a conocer varios sistemas de vectores a base de VIH-1 que carecen de todas las proteínas accesorias salvo Rev (49, 60). Se deseó investigar si el gen de codones optimizados permitiría la construcción de un sistema de vectores a base de VIH-1 que carezca de todas las proteínas accesorias. Inicialmente se suprimió rev/RRE y cualesquiera secuencias de env residuales, pero se mantuvieron los primeros 625 nucleótidos de gag, puesto que han mostrado desempeñar un papel en el empaquetamiento eficiente (61). Se obtuvieron dos constructos genómicos vectoriales, pH6.1nZ (que retiene sólo secuencias de VIH hasta nt 625 de gag) y pH6.2nZ (igual que pH6.1nZ, pero que también retiene el aceptor de corte y empalme de env). Estos derivaron de un genoma vectorial de VIH convencional que contiene RRE y expresa Rev (pH6nZ). Nuestro sistema detector de tres plásmidos sólo expresó ahora gag-pol de VIH-1 y las proteínas de cubierta de VSV-G. Los títulos de partículas vectoriales se determinaron como se describe en la sección previa. Se usó una relación de 2:2:1 de genoma vectorial (pH6Z o pH6.1nZ o pH6.2nZ): vector de expresión de gag-pol (pGP-RRE3 o pSYNGP):pHCMV-G. Las transfecciones se llevaron a cabo en presencia o ausencia de pCMV-Rev, puesto que la expresión de gag-pol todavía era dependiente de Rev para el gen de tipo salvaje. Los resultados se resumen en la Figura 22, e indican que un vector de VIH se podría producir en ausencia total de Rev, pero que los títulos máximos se vieron comprometidos a 20 veces menores que los que se podrían lograr en presencia de Rev. Puesto que la expresión de gag-pol debería ser la misma para pSYNGP con pH6nZ o pH6.1nZ o pH6.2nZ (puesto que es independiente de Rev), así como para pGP-RRE3 cuando se proporciona Rev en trans, se sospecha que el genoma vectorial retenía un requisito para Rev, y por lo tanto limitaba los títulos. Para confirmar esto, se llevó a cabo el análisis de transferencia Northern sobre ARN citoplásmico preparado a partir de células transfectadas con pH6nZ o pH6.1nZ en presencia o ausencia de pCMV-Rev. Como se puede observar en la Figura 17, líneas 1-4, los niveles de ARN citoplásmico derivado de pH6nZ fueron 5-10 veces mayores que los obtenidos con pH6.1nZ (compárense las líneas 1-2 con las líneas 3-4). Estos datos apoyan la noción de que ARN producido a partir del genoma vectorial requiere el sistema de Rev/RRE para asegurar niveles citoplásmicos elevados. Esto puede ser debido a la exportación nuclear ineficiente del ARN, puesto que las secuencias de INS que residen en gag todavía estaban
presentes.
Por lo tanto, para restaurar los títulos, pueden ser necesarias supresiones adicionales en las secuencias de gag del genoma vectorial. Hasta la fecha se ha dado a conocer un empaquetamiento eficiente que requiere 360 (62) o 255 (63) nucleótidos de gag en vectores que todavía retienen secuencias de env, o alrededor de 40 nucleótidos de gag en una combinación particular de supresiones de mutación de donante de corte y empalme, gag y env (64, 63). En un intento para eliminar el requisito de Rev/RRE en nuestro genoma vectorial sin comprometer el empaquetamiento eficiente, se construyó una serie de vectores derivados de pH6nZ que contienen supresiones progresivamente más grandes de las secuencias de VIH-1 (sólo se retuvieron las secuencias en dirección 5' y en gag más y menos un donante de corte y empalme principal mutante (SD) (mutación GT a CA). Se determinaron los títulos de partículas vectoriales como antes, y los resultados se resumen en la Figura 23. Como se puede observar, la supresión de hasta nt 360 en gag (vector pHS3nZ) dio como resultado un incremento en los títulos (comparado con pH6.1nZ o pH6.2nZ), y sólo una disminución de 5 veces (los títulos fueron 1,3-1,7 x 10^{5}) en comparación con pH6nZ. Supresiones adicionales dieron como resultado títulos menores que pHS3nZ, y similares a pH6.1nZ. Además, la mutación de SD no tuvo un efecto positivo sobre los títulos de los vectores, y, en el caso de pHS3nZ, dio como resultado una disminución de 10 veces en los títulos (compárense los títulos para pHS3nZ y pHS7nZ en la Figura 23). El análisis de la transferencia Northern sobre ARN citoplásmico (Figura 17, líneas 1 y 5-12) mostró que los niveles de ARN fueron de hecho mayores para pH6nZ, lo que podría explicar los títulos máximos observados con este vector. Los niveles de ARN fueron iguales para pHS1nZ (línea 5), pHS2nZ (línea 6) y pHS3nZ (línea 7), mientras que los títulos fueron 5-8 veces mayores para pHS3nZ. Es posible que supresiones adicionales (de las encontradas en pHS3nZ) en gag puedan dar como resultado un empaquetamiento menos eficiente (en cuanto a VIH-1, la señal de empaquetamiento se extiende en gag) y por lo tanto incluso aunque los 3 vectores produzcan cantidades similares de ARN, sólo pHS3nZ retiene la eficiencia de empaquetamiento máximo. También es interesante observar que la mutación de SD dio como resultado niveles aumentados de ARN en el citoplasma (compárense las líneas 6 y 10, 7 y 11 u 8 y 12 en la Figura 17) pero títulos iguales o menores (Figura 23). El dinucleótido GT que se mutó está en el tronco de SL2 de la señal de empaquetamiento (65). Se ha dado a conocer que SL2 puede no ser muy importante para el encapsidamiento de ARN de VIH-1 (65, 66), mientras que SL3 es de gran importancia (67). El plegamiento de las secuencias de los vectores de tipo salvaje y mutante de SD con el programa de ordenador RNAdraw reveló que la mutación altera significativamente la estructura secundaria del ARN, y no sólo de SL2. Por lo tanto, es probable que, aunque la mutación de SD potencie los niveles de ARN citoplásmicos, no incremente los títulos puesto que altera la estructura secundaria de la señal de empaquetamiento.
Para investigar si las diferencias de títulos que se observaron con los vectores menos Rev fueron de hecho debidas a la dependencia de Rev de los genomas, se insertó la secuencia de RRE (nt 7769-8021 de la secuencia de HXB2) en el sitio de SpeI (en dirección 3' de la secuencia de gag, y justo en dirección 5' del promotor de CMV interno) de pH6.1nZ, pHS1nZ, pHS3nZ y pHS7nZ, dando como resultado los plásmidos pH6.1nZR, pHS1nZR, pHS3nZR y pHS7nZR, respectivamente. Los títulos de las partículas vectoriales se determinaron con pSYNGP y pHCMVG, en presencia o ausencia de Rev (pCMV-Rev) como antes, y los resultados se resumen en la Figura 24. En ausencia de Rev, los títulos se vieron adicionalmente comprometidos para pH6.1nZR (7 veces en comparación con pH6.1nZ), pHS3nZR (6 veces en comparación con pHS3nZ) y pHS7nZR (2,5 veces encomparación con pHS7nZ). Esto era lo esperado, puesto que el RRE también actúa como una secuencia de inestabilidad (68), y de esta forma sería de esperar que confiriese dependencia de Rev. En presencia de Rev, los títulos se restauraron hasta los títulos máximos observados para pH6nZ en el caso de pHS3nZR (5 x 105) y pH6.1nZR (2 x 105). Los títulos no se restauraron para pHS7nZR en presencia de Rev. Esto apoya la hipótesis de que la mutación de SD en pHS7nZ afecta a la estructura de la señal de empaquetamiento, y de este modo la capacidad de empaquetamiento de este genoma vectorial, ya que en este caso Rev puede ser capaz de estimular los niveles de ARN del genoma vectorial, al igual que para pHS3nZR y pH6.1nZR, pero no puede afectar a la estructura secundaria de la señal de empaquetamiento. Para el vector pHS1nZ, la inclusión del RRE no condujo a una disminución en los títulos. Esto podría ser debido al hecho de que pHS1nZ contiene sólo 40 nucleótidos de secuencias de gag, y por lo tanto, incluso con el RRE, el tamaño de las secuencias de inestabilidad no es mayor que para pHS2nZ que da títulos iguales a pHS1nZ. Rev fue capaz de restaurar parcialmente los títulos para pHS1nZR (incremento de 10 veces cuando se compara con pHS1nZ, y 8 veces menor que pH6nZ), pero no completamente como en el caso de pHS3nZ. Esto también está de acuerdo con la hipótesis de que 40 nucleótidos de las secuencias de gag de VIH-1 pueden no ser suficientes para el empaquetamiento eficiente del ARN del vector, y esto podría explicar la restauración parcial y no completa en los títulos observada con pHS1nZR en presencia de Rev.
Además, se determinaron los títulos de punto final para pHS3nZ y pH6nZ con pSYNGP en las estirpes celulares humanas HeLa y HT1080. En ambos casos, los títulos siguieron el patrón observado en las células 293T, siendo los títulos 2-3 veces menores para pHS3nZ que para pH6nZ (véase la Figura 10). Finalmente, se determinó la eficiencia de la transducción del vector producido con pHS3nZ o pH6nZ y diferentes cantidades de pSYNGP o pGP-RRE3 a diferentes m.o.i. (y tan elevada como 1) en células HT1080. Este experimento se llevó a cabo puesto que la expresión de gag-pol de alto nivel a partir de pSYNGP puede dar lugar a la interferencia por partículas vacías de genoma a concentraciones elevadas del vector. Como se esperaba para partículas retrovíricas pseudotipadas de VSVG (69), las eficiencias de transducción se correlacionan con los m.o.i., tanto si se usaron cantidades elevadas o bajas de pSYNGP, y con pH6nZ o pHS3nZ. Para m.o.i. 1, la eficiencia de la transducción fue aproximadamente 50-60% en todos los casos (Figura 18). Los datos anteriores indican que no se observa en este sistema experimental ninguna interferencia debido a partículas vacías de genoma.
El gen gag-pol de codones optimizados no usa la ruta de exportación nuclear de exportina-1.
Rev media la exportación de ARNm de VIH-1 sin corte y empalme y con corte y empalme individual, vía el receptor de exportación nuclear exportina-1 (CRM1) (70, 71, 72, 73, 74). Se ha demostrado que leptomicina B (LMB) inhibe la exportación nuclear mediada por NES rica en leucina interrumpiendo la formación del complejo de exportina-1/NES/RanGTP (75, 72). En particular, LMB inhibe la translocación nucleocitoplásmica de Rev y ARNm de VIH dependientes de Rev (76). Para investigar si exportina-1 media la exportación de los constructos de gag-pol de codones optimizados, se ensayó el efecto de LMB sobre la producción de proteína. Se llevó a cabo un análisis de transferencia Western sobre lisados celulares a partir de células transfectadas con los constructos de gag-pol (+/- pCMV-Rev) y tratadas o no con LMB (7,5 nM, durante 20 horas, comenzando el tratamiento 5 horas después de la transfección). Para confirmar que LMB no tuvo efectos globales sobre el transporte, también se midió la expresión de \beta-gal a partir del pCMV-\betaGal plasmídico de control. Se usó un control interno de actina para explicar las variaciones proteicas entre muestras. Los resultados se muestran en la Figura 16. Como se esperaba (76), el gag-pol de tipo salvaje no se expresó en presencia de LMB (compárense las líneas 3 y 4), mientras que LMB no tuvo ningún efecto sobre la producción de proteína a partir del gag-pol de codones optimizados, independientemente de la presencia del RRE en el transcrito y la provisión de Rev en trans (compárense las líneas 5 y 6, 7 y 8, 9 y 10, 11 y 12, 5-6 y 11-12). La resistencia de la expresión del gag-pol de codones optimizados a la inhibición por LMB indica que no se usó la ruta de exportina-1, y por lo tanto se debe de usar una ruta de exportación alternativa. Esto ofrece una posible explicación para la expresión independiente de Rev. El hecho de que la presencia de una interacción no funcional de Rev/RRE no afecte a la expresión implica que el RRE no actúa necesariamente como una señal inhibidora (por ejemplo retención nuclear) per se, lo que está de acuerdo con las observaciones previas (5, 58).
En conclusión, este es el primer informe de un sistema de vector a base de VIH-1, compuesto de pSYNGP, pHS3nZ y pHCMVG, en el que la producción significativa del vector se puede lograr en ausencia de todas las proteínas accesorias. Estos datos indican que, a fin de lograr títulos máximos, el genoma del vector de VIH se debe de configurar para retener el empaquetamiento eficiente, y que esto requiere la retención de secuencias de gag y un donante de corte y empalme. Reduciendo la secuencia de gag hasta 360 nt en pHS3nZ y combinando esto con pSYNGP es posible lograr un título de por lo menos 10^{5} I.U./ml, que es sólo 5 veces menor que los niveles máximos logrados en presencia de Rev.
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Ejemplo 2
EIAV Casetes de expresión de gag-pol de EIAV de codones optimizados
También se examinó si el proceso de optimización de los codones alteraría las propiedades del gen gag-pol del lentivirus no primate EIAV. La secuencia del gen de codones optimizados se muestra de nt1103 a 5760 de SEC ID nº:5 (Figura 9). Las secuencias de tipo salvaje y de codones optimizados se representan WT y CO, respectivamente. El uso de codones se cambió al de genes de mamíferos altamente expresados. pESYNGP (Figura 27 y SEC ID nº:5) se obtuvo transfiriendo un fragmento XbaI-NotI desde un plásmido que contiene un gen gag/pol de EIAV de codones optimizados, sintetizado por Operon Technologies Inc., Alameda, CA, en pClneo (Promega). El gen se suministró en una estructura plasmídica patentada, GeneOp. El fragmento transferido a pClneo incluye secuencias que flanquean el ORF de gag/pol de EIAV de codones optimizados: tctagaGAATTCGCCACCATG- EIAV gag/pol-TGAACCCGGGgcggccgc. Los codones de comienzo ATG y de parada TGA se muestran en negrita, y las secuencias de reconocimiento para los sitios XbaI y NotI se muestran en minúsculas.
La expresión de Gag/Pol a partir del gen de codones optimizados se evaluó con respecto a la de diversos constructos de expresión de gag/pol de EIAV de tipo salvaje mediante transfección transitoria de células HEK 293T (Figura 25). Se llevaron a cabo transfecciones usando la técnica de fosfato de calcio, usando moles iguales de cada plásmido de expresión de Gag/Pol junto con un plásmido que expresó Rev de EIAV a partir de la secuencia de tipo salvaje o a partir de una versión de codón optimizado del gen: pClneoEREV (documento WO 99/32646) (Figura 35 y SEC ID nº:13) o pESYNREV (Figura 36 y SEC ID nº:14), respectivamente. pESYNREV es un plásmido a base de pClneo (Promega) que se obtuvo introduciendo el fragmento de EcoRI a SalI a partir de un plásmido de REV de EIAV sintético, obtenido por Operon Technologies Alameda, CA. La estructura principal del plásmido fue el plásmido patentado GeneOp en el que se insertó un gen de REV de EIAV de codones optimizados flanqueado por secuencias de reconocimiento de EcoRI y SalI y una secuencia de consenso de Kozak para conducir la traducción eficiente del gen. La masa de AND en cada transfección se ecualizó mediante adición del plásmido pClneo. En las transfecciones en las que se omitió un plásmido de expresión de Rev, se usó en su lugar una masa similar de pClneo (Promega) (líneas etiquetadas pClneo). Se prepararon extractos citoplásmicos 48 horas después de la transfección, y se fraccionaron cantidades de 15 \mug de proteína mediante SDS-PAGE y después se transfirieron a Hybond ECL. La transferencia Western se sondó con antisuero policlonal procedente de un caballo infectado con EIAV y después con un anticuerpo secundario, conjugado de anticaballo con peroxidasa de rábano picante. El desarrollo de la transferencia se llevó a cabo usando el kit ECL (Amersham). Los controles positivos para el procedimiento de transferencia y desarrollo, y el extracto citoplásmico procedente de células HEK 293T sin transfectar son como se indica. Se indican las posiciones de diversas proteínas de EIAV.
La expresión a partir de gag/pol de tipo salvaje se logró a partir de diversos plásmidos (véase la Figura 25). pONY3.2T es un derivado de pONY3.1 (documento WO 99/32646) (Figura 34 y SEC ID nº:12) en el que se han hecho mutaciones que suprimen la expresión de Tat y S2. Además, la secuencia de EIAV está truncada en dirección 3' del segundo exón de rev. Específicamente, la expresión de Tat está suprimida por una supresión de 83 nt en el exón 2 de tat, que corresponde, con respecto a la secuencia de EIAV de tipo salvaje, nº Acc. U01866, a la supresión de nt 5234-5316 inclusive. La expresión del ORF de S2 está suprimida mediante una supresión de 51 nt, que corresponde a nt 5346-5396 de nº Acc. U01866. La secuencia de EIAV está suprimida en dirección 3' de una posición que corresponde a nt 7815 de nº Acc. U01866. Estas alteraciones no alteran rev, y por tanto la expresión de este gen es expresado igual que para pONY3.1. pONY3.2 OPTI es un derivado de pONY3.1 que tiene las mismas supresiones para la ablación de la expresión de Tat y S2 como se describe anteriormente. Además, los primeros 372 nt de gag se han "optimizado en los codones" para la expresión en células humanas. La secuencia del tipo salvaje y las secuencias de codones optimizados presentes en pONY3.2OPTI en esta región se comparan en la Figura 43. Se indican las diferencias de las bases entre las secuencias. La región que se optimizó en los codones representa la región de solapamiento entre el vector y los constructos de expresión de gag/pol de tipo salvaje. Sería de esperar que la reducción de homología en esta región mejore el perfil de seguridad del sistema de vector, debido a las ocasiones reducidas de recombinación entre el genoma vectorial y los transcritos de gag/pol. 3.2 OPTI-Ihyg es un derivado de 3.2 OPTI en el que el fragmento de SnaBI-NotI de 3.2 OPTI se transfiere a pIRESIhygro (Clontech) preparado para ligación mediante digestión con los mismos sitios. De este modo, el gen gag/pol se coloca en dirección 5' de la IRES higromicina fosfotransferasa. Es de señalar el hecho de que el constructo resultante contiene el intrón de pClneo, no de pIRESIhygro. pEV53B es un derivado de PEV53A (documento WO 98/51810) en el que la secuencia derivada de EIAV en dirección 5' del codón de iniciación de Gag se reduce para inducir sólo el donante de corte y empalme principal y las secuencias circundantes: CAG/GTAAGATG, en las que el codón de iniciación de Gag se muestra en negrita.
Los resultados (Figura 26) muestran la dependencia de Rev de la expresión de Gag/Pol de pHORSE3.1 (documento WO 99/32646), que tiene una secuencia líder derivada de EIAV que empieza justo en dirección 3' del sitio de unión al cebador y un RRE situado en dirección 3' de gag/pol compuesto de las dos secuencias de EIAV que se afirma que tienen actividad de RRE. La expresión se potenció por la misma cantidad cuando la expresión de Rev se dirigió por los genes de tipo salvaje (pClneoERev) (Figura 35) o de codones optimizados (pESYNREV) (Figura 36). Este resultado confirma la funcionalidad del plásmido de expresión de Rev de codones optimizados.
En contraste con la expresión de Gag/Pol de pONY3.1, la expresión de pESYNGP no se vio influida por la presencia de REv; Sin embargo fue ligeramente menor que la de pONY3.1 o pON3.2T. La expresión a partir de pESYNGPRRE (Figura 30 y SEC ID nº:7), en el que la secuencia de RRE de EIAV presente en pHORSE3.1 se coloca en dirección 5' de gag/pol, pareció ligeramente menor que la de pESYNGP. Los niveles de expresión de 3.2 OPTI y 3.2OPTI-Ihyg fueron significativamente menores que los de pESYNGP o pONY3.1, incluso en presencia de Rev. Este resultado sugiere que puede haber muchos determinantes de la expresión de Gag/Pol dentro de los primeros 372 nt del gag, y mostró que 3.2 OPTI fue improbable que fuese útil como una base para la producción del vector de EIAV. Además, demuestra que la optimización de codones de sólo ciertas regiones del gen completo de gag/pol puede no conducir a niveles elevados de expresión independiente de Rev.
Se ha demostrado previamente (43) que la secuencia líder 5' (121 pb en dirección 5' del codón de partida ATG) y la secuencia RRE (43) son importantes para la expresión elevada del gag-pol de EIAV de tipo salvaje. Se obtuvieron tres constructos que contenían la secuencia líder (LpESYNGP), las secuencias líder y de RRE (LpESYNGPRRE) o la secuencia de RRE (pESYNGPRRE). Las secuencias de estos constructos se muestran en SEC ID NOS:6-8 y en las Figuras 28-30. Se transfectaron en células 293T en presencia o ausencia del plásmido de expresión de Rev. El sobrenadante celular se midió entonces para determinar la actividad de transcriptasa inversa (RT), usando un ensayo de RT convencional, para evaluar qué constructo generó la cantidad más elevada de ARNm de gag-pol. Los resultados se muestran en las Figuras 39 y 40. A partir de estos resultados está claro que la secuencia líder 5' conduce a un incremento en la actividad de RT. La capacidad de estos constructos de expresión de Gag/Pol para apoyar la formación de partículas de vectores infecciosas también se ensayó mediante trransfección transitoria de células HEK 293. Los resultados de este análisis muestran que todos los constructos podrían proporcionar Gag/Pol de EIAV funcional, y muestran la dependencia de Rev del título con el plásmido del genoma del vector pONY8.0Z, que no codifica ninguna de las proteínas de EAIV (Figura 41).
Se evaluó la capacidad de pESYNGP para actuar en concierto con un plásmido de genoma de vector de EIAV mínimo pONY8.1Z (Figura 33, SEC ID nº:11) (Figura 42). Los resultados muestran que los títulos obtenidos con pESYNGP y pONY8.1Z son alrededor de 10 veces menores que los de pONY3.1 y pONY8.1Z. Este título reducido refleja la falta de proteína Rev en el sistema, en lugar de una deficiencia de la producción de Gag/Pol que ya se había demostrado que es independiente de la expresión de Rev.
La expresión de Gag/Pol de EIAV también se ensayó a partir de pESDSYNGP (Figura 50 y SEC ID nº:18), en el que la secuencia de consenso de Kozak de Gag se sustituye por el donante de corte y empalme de EIAV natural. pESDSYNGP se obtuvo de pESYNGP mediante intercambio del fragmento de EcoRI-NheI de 306 pb, que va desde justo en la dirección 5' del codón de partida para gag/pol hasta aproximadamente 300 pares de bases dentro del ORF de gag/pol, con un fragmento de EcoRI-NheI de 308 pb derivado mediante digestión de un producto de PCR obtenido usando pESYNGP como mueble y usando los siguientes cebadores: SD FOR [GGCTAGAGAATTCCAGGTAA
GATGGGCGATCCCCTCACCTGG] y SD REV [TTGGGTACTCCTCGCTAGGTTC]. Esta manipulación sustituye la secuencia de consenso de Kozak en dirección 5' del ATG en pESYNGP por el donante de corte y empalme encontrado en EIAV. La secuencia entre el sitio EcoRI y el ATG de gag/pol es así CAGGTAAG, exactamente como se encuentra en la secuencia vírica natural. Por lo tanto, el ARNm se suprime con respecto a secuencias en dirección 5', pero no en dirección 3' del donante de corte y empalme. El comportamiento de pESDSYNGP se evaluó con relación a pESYNGP y otros plásmidos de expresión midiendo la actividad de transfectasa inversa en sobrenadantes a partir de células HEK 293T transfectadas transitoriamente usando una versión a base de Taqman del ensayo de transcriptasa inversa potenciada por producto (PERT). En este método, la transcriptasa inversa asociada con partículas vectoriales se libera mediante tratamiento con detergente suave y se usa para sintetizar ADNc usando ARN del bacteriófago MS2 como molde. El molde de ARN de MS2 y el cebador están presentes en exceso; por tanto, la cantidad de ADNc es proporcional a la cantidad de RT liberada de las partículas. Por lo tanto, la cantidad de ADNc sintetizado es proporcional al número de partículas. El ADNc de MS2 se cuantifica entonces usando tecnología Taqman. El ensayo se lleva a cabo en muestras de ensayo en paralelo con un lote de vectores de título conocido y contenido de partículas estimado. El uso del patrón permite la creación de una "curva estándar", y permite que se calcule el contenido relativo de RT de diversas muestras. En la Figura 49 se muestran los resultados de este análisis. Los resultados muestran que la expresión de Gag/Pol es virtualmente idéntica a partir de pESYNGP y pESDSYNGP. Los resultados también indican que la expresión no está significativamente potenciada por Rev. La actividad del plásmido de expresión de Rev está confirmada por el resultado obtenido con pHORSE +, en el que hay un RRE en dirección 3' del gag/pol de EIAV de tipo salvaje, y que muestra una potenciación de 6 veces de la expresión en presencia de Rev. También se observó que la expresión a partir de pHORSE se potenció 3 veces en presencia de Rev. Puesto que este constructo no tiene RRE, sugiere que Rev puede estar teniendo un efecto potenciador no específico sobre la expresión, posiblemente como resultado de ser expresado en niveles elevados en este sistema experimental.
La capacidad de pESYNGP para participar en la formación de partículas de vectores víricos infecciosas, cuando se cotransfecta con plásmidos para el genoma vectorial y la cubierta, se evaluó mediante transfección transitoria de HEK 293T, como se describe previamente (49, 50). De forma breve, se sembraron células 293T en cápsulas de 6 cm (1,2 x 10^{6}/cápsula), y 24 horas más tarde se transfectaron mediante procedimiento con fosfato de calcio. El medio se sustituyó 12 horas después de la transfección, y los sobrenadantes se cosecharon 48 horas después de la transfección, se filtraron (filtros de 0,45 \mum) y se titularon mediante transducción de D 17, células de osteosarcoma canino, en presencia de 8 \mug/ml de Polybrene (Sigma). Las células se sembraron a 0,9 x 10^{5}/pocillo en placas de 12 pocillos 24 horas antes del uso en ensayos de titulación. Se realizaron diluciones del sobrenadante en medio completo (DMEM/10% de FBS), y alícuotas de 0,5 ml se colocaron en placas sobre las células D17. Cuatro horas después de la adición del vector, el medio se suplementó con otros 1 ml de medio. La transducción se evaluó mediante tinción con X-gal de las células 48 horas después de la adición de diluciones víricas.
Los genomas vectoriales usados para estos experimentos fueron pONY4.0Z (Figura 31 y SEC ID nº:9) y pONY8.0Z (Figura 32 y SEC ID nº:10).
pONY4.0Z (documento WO 99/32646) derivó de pONY2.11Z mediante sustitución de la región U3 en la 5'LTR por el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (pCMV). Esto se llevó a cabo de tal forma que la primera base del transcrito derivado de este promotor de CMV corresponde a la primera base de la región R. Esta manipulación da como resultado la producción de niveles elevados de genoma vectorial en células transducidas, particularmente células HEK 293T, y se ha descrito previamente (50). pONY4.0Z expresa todas las proteínas de EIAV excepto para la cubierta, cuya expresión está eliminada por una supresión de 736 nt entre los sitios HindIII presentes en env.
pONY8.0Z derivó de pONY4.0Z introduciendo mutaciones que 1) evitaron la expresión de TAT por una supresión de 83 nt en el exón 2 de tat, 2) evitaron la expresión de S2 ORF por una supresión de 51 nt, 3) evitaron la expresión de REV por supresión de una sola base en el exón 1 de rev, y 4) evitaron la expresión de la porción N-terminal de gag mediante inserción de T en los codones de partida de ATG, cambiando de ese modo la secuencia a ATTG a partir de ATG. Con respecto a la secuencia de EIAV de tipo salvaje, nº Acc. U01866, estos corresponden a la supresión de nt 5234-5316 inclusive, nt 5346-5396 inclusive, y nt 5538. La inserción de los restos de T fue después de nt 526 y 543.
En la Figura 37, y gráficamente en la Figura 38, se muestran tabulados los resultados de este análisis. Las transfecciones se llevaron a cabo con sólo 3 plásmidos (genoma de vector, plásmido de expresión de gag/pol, y plásmido de expresión de VSV-G) - barras con líneas en diagonal, o con cuatro plásmidos, que incluyeron el conjunto previo de plásmidos junto con un plásmido adicional que codifica Rev o un plásmido similar que no codifica una proteína funcional - barras rellenas. El resultado muestra que se pueden lograr títulos elevados de vector usando pESYNGP para suministrar Gag/Pol de EIAV. Los títulos más elevados se obtuvieron usando el plásmido del genoma de vector que expresa Rev, pONY4.0Z, y fueron sólo ligeramente menores que los observados cuando Gag/Pol se suministró por pONY3.1. Se observaron títulos más bajos con el plásmido del genoma vectorial pONY8.0Z con pESYNGP que con pONY3.1. Esto es debido al requisito de expresión de Rev de pONY8.0Z. Rev es expresado por pONY3.1, pero no por pESYNGP. Estos resultados confirman la utilidad del plásmido de expresión de Gag/Pol de codones optimizados.
Uso del gen de gag/pol de EIAV sintético en la construcción de estirpes celulares que expresan de forma estable gag/pol de EIAV
Para la construcción de células de empaquetamiento y productoras para vectores de EIAV se requieren estirpes celulares que expresan cantidades elevadas de gag/pol de EIAV. Como una primera etapa en su construcción, se transfectaron de forma estable células HEK 293 con pIRES1hyg ESYNGP (Figura 44 y SEC ID nº:17), en el que la expresión de gag/pol de EIAV está dirigida por un promotor de CMV, y está enlazada a un ORF para la expresión de higromicina fosfotransferasa mediante un EMCV IRES. pIRES1hyg ESYNGP se obtuvo según lo siguiente. El gen gag/pol de EIAV sintético y las secuencias flanqueantes se transfirieron desde pESYNGP en el vector de expresión pIRES1hygro (Clontech). En primer lugar, pESYNGP se digirió con EcoRI, y los extremos se llenaron mediante tratamiento con T4DNA polimerasa, y después se digirieron con NotI, pIRES1hygro se preparó para ligación con este fragmento mediante digestión con NsiI, los extremos se recortaron mediante tratamiento con ADN polimerasa de T4, y después se digirieron con NotI. Antes de la transfección en células HEK 293, pIRES1hyg ESYNGP se digirió con AhdI, que linealiza el plásmido.
Las estirpes celulares clonales se derivaron mediante dilución en serie y se analizaron para determinar la expresión de Gag/Pol mediante un ensayo de transcriptasa inversa potenciada por producto a base de Taqman (PERT). Se muestra el dato para la estirpe celular Q3.29, que expresó el nivel más elevado de Gag/Pol. El análisis mostró que el nivel de expresión a partir del casete de Gag/Pol de EIAV de codones optimizados en Q3.29 fue muy similar a lo observado para una línea productora de EIAV, 8Z.20, en la que Gag/Pol se expresa a partir del casete de expresión de tipo salvaje pEV53B, que produjo partículas de vectores a títulos de casi 10^{6} unidades transductoras por ml (Figura 45). Asumiendo amplificación exponencial durante el ensayo, una diferencia de valor de Ct de 1,0 corresponde a una diferencia de 2 veces en la concentración de la transcriptasa inversa liberada de las partículas. Por lo tanto, la diferencia en la expresión de Gag/Pol entre las células Q3-29 y 8Z.20 es aproximadamente 2-8 veces. Además, los valores de Ct observados indican que el nivel de expresión de Gag/Pol es significativamente mayor que en las muestras de las partículas del vector de pONY8G, con un título de 2 x 10^{6} unidades transductoras por ml en células D17, pero obtenidas mediante transfección transitoria de células HEK 293T. Estos datos indican que el constructo de Gag/Pol de EIAV de codones optimizados se puede usar en la construcción de estirpes de empaquetamiento y productoras de EIAV, y confirma el resultado previo de que la expresión es independiente de la expresión de Rev.
La estirpe celular Q3.29 se ensayó entonces para determinar su capacidad para soportar la producción de partículas vectoriales infecciosas cuando se transfecta con un plásmido de genoma vectorial, pONY8.0Z, y el plásmido de expresión de cubierta de VSV-G, pRV67 y el plásmido de expresión de REV de EIAV, pESYNREV. Además, también se evaluó el comportamiento de un plásmido pONY8.3G FB29 (-) que es la forma modificada del plásmido del genoma vectorial pONY8G. PONY8G es un genoma de vector de EIAV estándar, usado con fines de comparación. Las modificaciones y construcción de pONY8.3G FB29 (-) (SEC ID N0:19) se describen en el documento PCT/GB00/03837 y de forma breve son 1) la introducción de sitios de reconocimiento de loxP en dirección 5' y en dirección 3' del casete del genoma vectorial, 2) la colocación de un casete de expresión para REV de codones optimizados, derivado de pESYNREV, y dirigido por el promotor FB29 U3 en dirección 3' del casete del genoma vectorial y orientado de forma que la dirección de la transcripción fue hacia el casete del genoma vectorial. El casete de expresión de REV está localizado en dirección 3' del sitio 3'loxP. De este modo, el plásmido pONY8.3G FB29 - posee casetes de expresión para el ARN del genoma vectorial y para Rev de EIAV.
Los títulos se establecieron mediante dilución limitante en células de osteosarcoma canino D17, y se muestran en la Figura 46.
Los títulos obtenidos de las transfecciones 2-6 fueron hasta 4,5 x 10^{6} unidades transductoras por ml, indicando niveles de expresión de Gag/Pol suficientes para apoyar títulos al menos tan altos. Los títulos obtenidos no fueron mayores cuando se suministró Gag/Pol adicional (transfección 1), indicando que la expresión de Gag/Pol no fue la limitación del título.
Perfil de seguridad mejorado debido a la expresión de Gag/Pol a partir de un constructo de expresión de codones optimizados
La formación de RCR tiene lugar mediante recombinación entre diferentes componentes del sistema vectorial, o mediante recombinación de componentes del sistema vectorial con secuencias nucleotídicas presentes en las células productoras. Aunque es posible la recombinación al nivel de ADN durante la construcción de estirpes de células productoras (conduciendo quizás a la activación insercional de retroelementos o retrovirus endógenos), se piensa que la recombinación para producir RCR ocurre principalmente entre los ARN que sufren transcripción inversa, y por tanto ocurre dentro de las partículas vectoriales maduras. En consecuencia, la recombinación ocurrirá más probablemente entre los ARN que contienen señales de empaquetamiento, tal como el genoma vectorial y el ARNm de gag/pol. Sin embargo, habitualmente el transcrito de gag/pol se modifica de forma que se suprime con respecto a alguno o a todos los elementos de empaquetamiento definidos, reduciendo de ese modo las ocasiones de su implicación en la recombinación.
El proceso de optimización de codones usado para crear el plásmido de expresión de Gag/Pol de VIH y de EIAV, pSYNGP y pESYNGP, también da como resultado la interrupción de las secuencias y estructuras que dirigen el empaquetamiento, como resultado de introducir cambios a aproximadamente cada 3ª posición nucleotídica. Se han obtenido pruebas para el menor nivel de incorporación del ARN de codón optimizado derivado de pESYNGP en viriones.
Se comparó el empaquetamiento de los ARNm derivados de un casete de expresión de pEV53B de gag/pol de tipo salvaje, y del casete de expresión de gag/pol de EIAV de codones optimizados, pESYNGP. Se recogió medio de estirpes celulares a base de HEK 293 que se transfectaron de forma estable con pEV53B (estirpe celular B-241), o con pESYNGP. Ambas estirpes celulares producen partículas vectoriales que no contienen ARN vectorial y no tienen cubiertas. En algunos experimentos, un plásmido de genoma vectorial de EIAV (pECG3-CZW) se transfectó en las células para que sirva como un control interno positivo para la hibridación y para determinar la presencia de partículas capaces de empaquetar ARN. pECG3-CZW es un derivado de pEC-LacZ (documento WO 98/51810), y se obtuvo de este último mediante 1) reducción de secuencias de gag de forma que sólo se incluyeron los primeros 200 nt de gag, en lugar de los primeros 577 nt, y 2) mediante inclusión del elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de marmota (WHV PRE) (que corresponde a nt 901-1800 de nº Acc. J04514) en el sitio de NotI en dirección 3' del gen informador de LacZ.
Las partículas víricas derivadas de cada una de las estirpes celulares se purificaron entonces parcialmente del medio mediante centrifugación con gradiente de densidad en equilibrio. Para hacer esto, se dispusieron en capas 10 ml de medio procedente de células productoras, cosechadas 24 horas después de la inducción con butirato de sodio, sobre un gradiente de sacarosa de 20-60% (p/p) en tampón de TNE (pH 7,4), y se centrifugaron durante 24 horas a 25.000 rpm y 4ºC en un rotor SW28. Las fracciones se recogieron de la parte inferior, y 10 \mul de cada fracción se evaluaron para determinar la actividad de transcriptasa inversa para localizar partículas víricas. Los resultados de este análisis se muestran en (Figura 47), en la que se muestra el perfil de actividad de transcriptasa inversa como una función de fracción de gradiente. En estas figuras, la parte superior del gradiente está a la derecha. Se debería observar que los niveles de actividad de RT a partir de la célula que expresa pESYNGP fueron significativamente menores que a partir de las células que expresan pEV53B. Para determinar el contenido de ARN de los viriones purificados, se reunieron alícuotas de las fracciones de la parte superior, media o inferior (según se indica por las barras etiquetadas T, M y B), y el ARN procedente de cada fracción se sometió a análisis de hibridación de transferencia por ranura. Usando una sonda específica para una región común de gag/pol de tipo salvaje y sintético, el encapsidamiento de ARN fue fácilmente detectable en las fracciones pico (M) de viriones sintetizados a partir del constructo de tipo salvaje (pEV53B), pero no se detectó a partir de viriones sintetizados a partir del constructo de Gag/Pol sintético (pESYNGP) (Figura 48). El control para la presencia de cápsida capaz de llevar a cabo el encapsidamiento fue el genoma vectorial de EIAV G3-CZW, que se detectó fácilmente en fracciones pico a partir de células que expresan las proteínas gag/pol de tipo salvaje o sintéticas. Incluso teniendo en cuenta los diferentes niveles de expresión a partir de los constructos de expresión de Gag/Pol de tipo salvaje y sintético, este resultado indica que el ARN del gen gag/pol de codones optimizados está empaquetado significativamente de forma menos eficiente que el gen de tipo salvaje, y representa una mejora significativa para el perfil de seguridad del sistema. Es de señalar adicionalmente que el ARN transcrito a partir de pEV53B estaba empaquetado. Este ARN está suprimido con respecto a las secuencias en dirección 5' de la secuencia del donante de corte y empalme (CAG/GTAAG), y todavía estaba empaquetado. Esto apunta a la localización de determinantes de empaquetamiento principales dentro de la región codificante de gag, y contrasta con las observaciones recogidas sobre la localización de la señal de empaquetamiento de
VIH-1.
En experimentos adicionales se ha demostrado que el empaquetamiento de transcritos a partir de pEV53B es sólo ligeramente menor que el de pEV53A (Figura 51). Esto indica además que las secuencias de empaquetamiento principales están localizadas en la región codificante de gag. En estos experimentos, la estirpe celular B-241 expresó ARN de pEV53B, y PEV-17 expresó ARN de pEV53A. El genoma vectorial de EIAV usado para confirmar la presencia de partículas vectoriales competentes para el empaquetamiento fue G3-CZR, que es el mismo que G3-CZW, descrito anteriormente, excepto por la sustitución del elemento regulador post-transcripcional de la marmota con una secuencia que contiene los elementos de RRE de EIAV. La metodología fue como se ha descrito anteriormente.
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Claims (38)

1. Uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico en una partícula retrovírica en una célula productora para generar un retrovirus de replicación defectuosa en una célula diana, en el que la secuencia nucleotídica está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y en el que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.
3. Uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico en una partícula retrovírica en una célula productora para evitar el empaquetamiento del genoma del vector retrovírico en una célula diana, en el que la secuencia nucleotídica está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV; y la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
4. Uso de una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol capaces de ensamblar un genoma de vector retrovírico, que comprende por lo menos parte de una secuencia nucleotídica de gag, en una partícula retrovírica en una célula productora para prevenir la recombinación entre dicha secuencia nucleotídica que codifica las proteínas retrovíricas gag y pol y la al menos parte de una secuencia nucleotídica de gag, en el que la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y en el que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el genoma retrovírico comprende además un nucleótido de interés (NOI).
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia nucleotídica es independiente de Rev.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia nucleotídica no contiene la secuencia de RRE.
9. Método para producir un retrovirus de replicación defectuosa, que comprende transfectar una célula productora con lo siguiente:
i)
un genoma retrovírico;
ii)
una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol; y
iii)
secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes del empaquetamiento vírico esenciales no codificados por la secuencia nucleotídica de (ii);
caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica de codones optimizados comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
10. Método según la reivindicación 9, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.
11. Método para evitar el empaquetamiento de un genoma retrovírico en una célula diana, que comprende las etapas siguientes:
a.
transfectar una célula productora con lo siguiente para producir partículas retrovíricas:
i)
un genoma retrovírico;
ii)
una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol; y
iii)
secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes del empaquetamiento vírico esenciales no codificados por una o más de las secuencias nucleotídicas de (ii); y
b.
transfectar una célula diana con partículas retrovíricas de la etapa (a);
caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica de codones optimizados comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
12. Método según la reivindicación 11, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.
13. Método para evitar la recombinación entre un genoma de vector retrovírico y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido vírico requerido para el ensamblaje del genoma vírico en partículas retrovíricas, que comprende transfectar una célula productora con lo siguiente:
i)
un genoma retrovírico que comprende al menos parte de una secuencia nucleotídica de gag;
ii)
una secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol; y
iii)
secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes del empaquetamiento vírico esenciales no codificados por la secuencia nucleotídica de (ii);
caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, y porque la secuencia nucleotídica de codones optimizados comprende la secuencia mostrada en SEC ID nº: 16.
14. Método según la reivindicación 13, en el que la partícula retrovírica deriva sustancialmente de EIAV.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que el genoma retrovírico comprende además un nucleótido de interés (NOI).
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que iii) comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína env.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que por lo menos uno de i) a iii) contiene uno o más genes accesorios funcionales.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que i) a iii) están desprovistos de cualesquiera genes accesorios funcionales.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, en el que la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas retrovíricas gag y pol es independiente de Rev.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 19, en el que la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas retrovíricas gag y pol no contiene la secuencia de RRE.
21. Secuencia nucleotídica que codifica proteínas retrovíricas gag y pol que comprende la secuencia de SEC ID nº: 16.
22. Vector que comprende una secuencia nucleotídica según la reivindicación 21, en el que el vector es independiente de Rev.
23. Sistema de vector vírico que comprende:
i)
una secuencia nucleotídica de interés; y
ii)
una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido vírico requerido para el ensamblaje de partículas víricas, en el que la secuencia nucleotídica es tal como se define en la reivindicación 21.
24. Sistema de producción vírico que comprende:
i)
un genoma vírico que comprende por lo menos una secuencia nucleotídica de interés; y
ii)
una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido vírico requerido para el ensamblaje del genoma vírico en partículas víricas, en el que la secuencia nucleotídica es tal como se define en la reivindicación 21.
25. Sistema según la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en el que el vector vírico es un vector retrovírico.
26. Sistema según la reivindicación 25, en el que el vector retrovírico es un vector lentivírico.
27. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que el vector lentivírico deriva sustancialmente de EIAV.
28. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que la secuencia nucleotídica definida en i-ii) también incluye una proteína de cubierta.
29. Sistema según la reivindicación 28, en el que el gen de cubierta tiene codones optimizados.
30. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el que el nucleótido de interés se selecciona de entre un gen terapéutico, un gen marcador y un gen de selección.
31. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, que comprende uno o más genes accesorios funcionales.
32. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, desprovisto de cualesquiera genes accesorios funcionales.
33. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, en el que la secuencia nucleotídica (ii) no contiene la secuencia de RRE.
34. Sistema vírico según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, para uso en un método para producir partículas víricas.
35. Método para producir una partícula vírica, comprendiendo dicho método introducir en una célula productora:
i)
un genoma vírico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33,
ii)
una o más secuencias nucleotídicas tal como se define en la reivindicación 21, y
iii)
secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes del empaquetamiento vírico esenciales no codificados por una o más de las secuencias nucleotídicas de (ii).
36. Partícula vírica producida por el sistema de producción según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, o por el método según la reivindicación 35.
37. Sistema vírico según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34, o una partícula vírica según la reivindicación 36, para tratar una infección vírica.
38. Composición farmacéutica que comprende el sistema vírico según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34, o la partícula vírica según la reivindicación 37, junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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