CN101024845A - 方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产复制缺陷型逆转录病毒的方法，包括用下列成分转染生产细胞：i)逆转录病毒基因组；ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列；和iii)编码不是由(ii)的核苷酸序列所编码的其他必需的病毒包装成分的核苷酸序列；其特征在于，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。

Description

方法
本申请是申请日为2001年4月18日的中国专利申请01808404.4“方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及改进能够输送用于基因疗法的治疗基因的逆转录病毒的安全性的方法，并且涉及用于所述方法的新型核苷酸序列。
背景技术
目前，逆转录病毒载体被广泛用作将基因输送到细胞中的运载工具。这种载体的流行是由于以下事实：它们容易生产，并且能介导它们所携带的基因稳定整合到靶细胞的基因组中。这使得所输送的基因能够长期表达(1)。
对基于慢病毒的逆转录载体系统的开发怀有很大兴趣已经有一段时间了。慢病毒是复杂的逆转录病毒的一小类。除了常见的逆转录基因(gag，pol和env)之外，它们还含有使其能够调控其生命周期，并感染非分裂细胞的基因(2)。因此，以它们为基础的载体系统是有价值的，因为它们具有用于将感兴趣的基因转入诸如神经元的非分裂细胞的潜力。另外，慢病毒能够对所述感兴趣的基因进行非常稳定的长期表达。业已证实转导过的大鼠神经元细胞的表达时间至少为3个月，而基于MLV的载体只能表达感兴趣的基因6周时间。
最常用的慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，它是AIDS(获得性免疫缺陷综合症)的病原体。业已证实，基于HIV的载体能有效转导非分裂细胞(3)，并可用于，例如，将抗HIV治疗基因导向HIV易感细胞。
不过，HIV载体具有多种明显的缺陷，这些缺陷可能限制其在某些疾病上的治疗应用。具体地讲，HIV-1是具有潜在的致癌蛋白和序列的人类病原体。导入在能表达HIV gag-pol的包装细胞中产生的载体颗粒，存在将所述蛋白导入患者体内引起血清转变的危险。
因此，一直都很关注这种载体的安全性。一种方法着重于设计逆转录病毒载体的生产系统。逆转录病毒载体系统基本上由两部分因素构成：包装细胞系和载体基因组。最简单的包装系由原病毒组成，其中，业已去掉了ψ序列(RNA包装决定子，在HIV上报导为位于U5和gag之间)。在稳定转染到细胞中之后，就会产生含有逆转录酶的病毒颗粒，不过，毒粒RNA不会被包装到这些颗粒中。逆转录病毒载体系统的补体成分是基因组载体本身。所述基因组载体必须包括包装序列，不过大部分结构编码区可以缺失。通常，将选择标记基因或其他感兴趣的核苷酸序列整合在载体上。然后，就可以用所述包装系的载体原种感染靶细胞。如果细胞被所述病毒颗粒成功地感染，所述基因组载体序列就会进行逆转录，并且由所述逆转录病毒机制整合。不过，感染是最终的过程，因此不会发生该病毒的进一步的复制或扩散。
不过，如上文所述，在设计安全并且有效的逆转录病毒载体时遇到了问题。这些问题包括包装载体和包装序列之间的重组会导致产生野生型复制感受态病毒的可能性。因此，一直致力于改善包装细胞结构的安全性。
在第二代包装细胞系中，除了所述包装序列的缺失之外，还缺失了3’LTR，因此，要产生野生型病毒就需要两次重组。
在第三代包装细胞系中，gag-pol和env基因分别位于独立的结构上，这些结构被依次导入包装细胞，从而避免了在转染期间的重组。
就包装信号而言，EP0368882A(Sodroski)披露，在HIV中它相对于5’主要剪接供体和gag起始密码子之间的部分，并且，特别是相当于紧靠5’主要剪接供体下游以及gag起始密码子上游大约14个碱基的片段。Sodroski介绍，该片段应当从gag-pol框中去掉。WO 97/12622(Verma)披露，HIV-1的ψ序列上的39bp的内部缺失，可以发生在5’剪接供体位点和gag基因的起始密码子之间。
可以利用密码子摆动来降低重组的几率，同时又能保持该结构的一级蛋白序列，参考文献(4)，其中，gag-pol和env表达结构之间的重叠部分被减少到超出pol和env之间的公用部分61bp，该部分处在不同的读框内。将颠换突变导入pol的最后20个密码子中，这样既保持了编码区的完整性，同时又将在所述重叠部分上的与env的同源性降低到55％。同样将摆动突变导入env的3’部分，并将env终止密码子下游的所有序列去掉。
有效的载体通常包括所述基因组载体上的gag的一部分，以便提高毒粒效价。与包装序列不同的是，包装序列在一个序列的任意位置都可以进行包装，而gag序列要具有任何作用都必须位于靠近ψ的天然位置上。
可以理解的是，尽管在包装细胞和载体设计方面已经取得了突出的改进，不过，仍然有对现有包装系作进一步改良的空间。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供逆转录病毒颗粒，特别是慢病毒颗粒，尤其是携带编码治疗蛋白的核苷酸结构的慢病毒颗粒，与相应的野生型病毒颗粒相比，这种病毒颗粒具有改善了的安全性。在我们的WO 99/41397中，我们披露了将对gag-pol基因的密码子优化作为克服输出对Rev/RRE的需要，以及提高RNA稳定性的措施。不过，现在我们业已发现，密码子优化了的gag-pol序列克服了足以提高效价目的而携带了gag序列的一部分的载体基因组的潜在的重组问题。这种方法还避免了来自不同病毒的gag用于包装和载体基因组结构上的必要性。
本发明所提供的另一个显著优点是，密码子优化破坏了诸如包装信号的RNA二级结构，因此使得gag-pol mRNA不可包装。因此，本发明与Sodroski和Verma所披露的方法不同，允许保留gag起始密码子上游的逆转录病毒序列，而又不会明显损害安全性。
因此，在一方面，本发明提供了利用编码可以将逆转录病毒载体基因组组装到生产细胞中的逆转录病毒颗粒中的逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸，在靶细胞中产生复制缺陷型逆转录病毒，其中，为了在所述生产细胞中表达而对所述核苷酸序列进行了密码子优化。
因此，在一种实施方案中，本发明提供了利用编码可以将逆转录病毒载体基因组组装到生产细胞中的逆转录病毒颗粒中的逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸，减少或防止所述逆转录病毒载体基因组在靶细胞中包装，其中，为了在所述生产细胞中表达而对所述核苷酸序列进行了密码子优化。
在一种实施方案中，本发明提供了利用编码可以将包括gag核苷酸序列的至少一部分的逆转录病毒载体基因组组装到生产细胞中的逆转录病毒颗粒中的逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列，减少或防止所述编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列与gag核苷酸序列的至少一部分之间的重组，其中，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。
另一方面，本发明提供了一种生产复制缺陷型逆转录病毒的方法，包括用下列成分转染生产细胞：
i)逆转录病毒基因组；
ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列；和
iii)编码不是由(ii)的核苷酸序列所编码的其他必需的病毒包装成分的核苷酸序列；
其特征在于，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。
因此，在一种实施方案中，本发明提供了一种减少或防止逆转录病毒基因组在靶细胞中包装的方法，该方法包括以下步骤：
a.为了生产逆转录病毒颗粒，用下列成分转染生产细胞：
i)逆转录病毒基因组；
ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列；和
iii)编码不是由(ii)的一个或多个核苷酸序列所编码的其他必需的病毒包装成分的核苷酸序列；和
b.用步骤(a)的逆转录病毒颗粒转染靶细胞；
其特征在于，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。
在另一种实施方案中，本发明提供了一种减少或防止逆转录病毒载体基因组和编码将所述病毒基因组组装到逆转录病毒颗粒中所需要的病毒多肽的核苷酸序列之间的重组的方法，该方法包括用下列成分转染生产细胞：
(i)包括gag核苷酸序列的至少一部分的逆转录病毒基因组；
(ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列；
(iii)编码不是由(ii)的核苷酸序列所编码的其他必需的病毒包装成分的核苷酸序列；
其特征在于，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。
我们还提供了如SEQ ID NO：15和16所示的新型密码子优化的序列，并且，可将这些序列用于本发明。不过，可以理解的是，任何常见的密码子优化的gag-pol序列都可用于本发明中。
本发明还提供了利用本发明的所述序列所生产的逆转录病毒颗粒，以及发明的生产方法。
本发明还提供了含有本发明的病毒颗粒以及可以药用的稀释剂或载体的药用组合物。
在说到“减少”时，我们是指与具有野生型gag-pol序列的群体相比，一种事件发生的机会减少了。对于单个逆转录病毒载体或颗粒来说，在一个群体内一种事件发生的机会可以避免。
下面将通过非限定性实施例的方式，说明本发明的各种优选特征和实施方案。
本发明采用密码子优化的概念。
早先，我们在WO 99/41397中披露了将密码子优化，作为克服输出对Rev/RRE的需要，以及提高RNA稳定性的措施。改变病毒成分的编码序列，能改善该序列在被用作逆转录病毒载体颗粒生产的生产细胞的哺乳动物细胞或其他细胞中的密码子使用。这种密码子使用的改善被称为“密码子优化”。包括HIV和其他慢病毒在内的很多病毒，使用大量罕见的密码子，通过将这些罕见的密码子改变成相应的常见哺乳动物密码子，就可以增强其包装成分在哺乳动物生产细胞中的表达。哺乳动物细胞，以及多种其他生物的密码子使用表为本领域所公知。
通过改变其序列，消除了编码将病毒颗粒组装到生产细胞/包装细胞中所必需的病毒颗粒的包装成分的核苷酸序列上的RNA不稳定序列(INS)。与此同时，保留了所述包装成分的氨基酸编码序列，这样，由所述序列所编码的病毒成分保持相同，或者至少足够相似，以便不损害所述包装成分的功能。
术语“组装病毒颗粒所需要的病毒多肽”表示在正常情况下由待包装到病毒颗粒中的病毒基因组所编码的多肽，在缺失这种多肽的情况下，所述病毒基因组不能包装。例如，对于逆转录病毒来说，所述多肽包括gag-pol和env。术语“包装成分”也包括在该定义范围内。
正如在我们在WO 99/32646中所披露的，包装HIV载体基因组的序列要求是复杂的。HIV-1包装信号包括所述剪接位点，并且包括gag基因的5’非翻译区的一部分。它具有包括4个短的茎-环的推测的二级结构。不过，对HIV进行有效衣壳化来说，该基因组中其他部分的其他序列，同样被认为是重要的。例如，gag蛋白编码序列的头350个bp可能决定着有效包装。因此，为了构建能够表达外源基因的HIV-1载体，业已将延伸到gag蛋白编码区的350bp的包装信号应用在所述载体基因组上。我们现在业已发现，在所述包装载体上对所述gag编码区进行密码子优化，至少是在所述包装信号所延伸到的部分进行的优化，同样具有破坏所述载体基因组的包装的作用。因此，密码子优化，是获得复制缺陷型病毒颗粒的新方法。
在WO 99/32646中还披露，马慢病毒中的所述包装信号的结构，不同于所述HIV的包装信号的结构。我们发现，在马慢病毒中，所述包装信号可以延伸到所述gag蛋白编码区中人们可以想象到的地方，而不是具有一个短的4个茎-环序列和延伸到gag蛋白编码区的350bp的包装信号。
在一种实施方案中，只对与所述包装信号相关的密码子进行密码子优化。因此，在一种实施方案中，密码子优化扩展到至少gag蛋白编码区的头350bp。在马慢病毒中，密码子优化要进行到gag编码区的至少300号核苷酸，更优选进行到gag编码区的至少150号核苷酸。尽管不是最好，密码子优化可以只进行到，例如，gag编码区的头109个核苷酸。同样可以将密码子优化只进行到gag编码区的第一个密码子。
不过，在更优选的和更实用的实施方案中，要对所述序列进行全面的密码子优化，包括移码位点的序列除外。
gag-pol基因包括两个相互重叠的分别编码gag和pol蛋白的读框。这两种蛋白的表达取决于在翻译期间的移码。这种移码的发生是在翻译期间核糖体“滑动”的结果。这种滑动被认为至少在某种程度是由核糖体-陷落RNA二级结构所导致的。这种二级结构存在于gag-pol基因上的所述移码位点的下游。对于HIV来说，所述重叠区自gag的起点下游的1222号核苷酸(其中，1号核苷酸是gag ATG中的A)延伸到gag的末端(1503号核苷酸)，因此，优选不对跨越所述移码位点和两个读框的重叠部分的281bp的片段进行密码子优化。保留该片段就能更有效地表达gag-pol蛋白。
对于EIAV来说，所述重叠的起点被认为是1262号核苷酸(其1号核苷酸是gag ATG中的A)。该重叠部分的末端是1461号核苷酸。为了确保所述移码位点和gag，gag-pol重叠，保留了野生型序列的1156-1465号核苷酸。如图9b所示。
为了包括常见的限制位点，可以对最佳的密码子使用进行衍生化，并且，可将保守性氨基酸变化导入gag-pol蛋白。
在一种高度优选的实施方案中，密码子优化是基于轻度表达的哺乳动物基因。可以改变第三个碱基，并且有时候可以改变第二和第三个碱基。在图3b中提供了密码子使用的一个例子。
由于遗传密码的简并性质，可以理解的是，技术人员可以获得多种gag-pol序列。同样存在多种公开的逆转录病毒变体，并且，可将其用作制备密码子优化的gag-pol序列的起点。慢病毒基因组可能是高度可变的。例如，有很多类似HIV-1的类型仍然是有功能的。对于EIAV来说情况也是如此。可将这些变体用于增强所述转导过程的特定部分。HIV-1变体的例子可以在 http://hiv-web.lanl.gov.网站上查到。有关EIAV克隆的细节可以在NCBI数据库上查到：网址是 http://www.ncbi.nlm.nih.gov.。
对gag-pol序列进行密码子优化的方法可以用在任何逆转录病毒上。该方法可应用于所有慢病毒上，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1和HIV-2。另外，这种方法可用于增强来自HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV和人内源逆转录病毒(HERV)的基因的表达。
密码子优化会导致诸如包装信号的RNA二级结构的破坏，可以理解的是，可以保留gag起始密码子上游的任何内源包装信号，而又不损害其安全性。
密码子优化包装成分的另一个优点是，它可以增强基因表达。具体地讲，它能使得gag-pol表达不依赖于Rev。不过，为了能将抗rev或RRE因子用在逆转录病毒载体上，必须使得该病毒载体生产系统完全不依赖于Rev/RRE(5)。因此，还需要对基因组进行修饰，这一目的可以通过优化载体基因组成分而实现。有利的是，这种修饰还会导致产生缺乏生产细胞和转导细胞中所有附属蛋白的较安全的系统，正如下面将要介绍的。
如上文所述，逆转录病毒载体的包装成分包括gag、pol和env基因的表达产物。另外，有效包装取决于随后是gag和env的部分序列(包装信号)的4个茎-环的短序列。因此，在所述逆转录病毒载体基因组中包括缺失的gag序列(作为所述包装结构上的完整gag序列的补充)能优化载体的效价。迄今为止所报导的有效包装需要在载体中包括来自gag的255-360个核苷酸，它仍然保留了env序列，或者在剪接供体突变、gag和env缺失的特定组合中包括gag的大约40个核苷酸。我们业已惊讶地发现，gag上最多360个核苷酸的缺失会导致载体效价的提高。进一步的缺失会产生较低的效价。发现在gag上游的主要剪接位点上的其他突变，会破坏包装信号二级结构，并因此导致载体效价降低。因此，所述逆转录病毒载体基因组优选包括业已从中去掉了最多360个核苷酸的gag序列。
因此，我们可以制备可以去掉所有附属基因的所谓“最小”系统。在HIV上，所述附属基因是vpr、vif、tat、nef、vpu和rev。类似地，在其他慢病毒上，可以去掉正常情况下存在于该慢病毒上的类似的附属基因。不过，为了避免争议，我们会提到，本发明还包括其中存在一个或多个上述附属基因和其任意组合的系统、颗粒和载体。
术语“病毒载体”是指包括能够在宿主细胞中转录的病毒基因组的核苷酸结构，所述基因组包括足够的病毒遗传信号，使得病毒RNA基因组在有包装成分的情况下，可以包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的感染包括逆转录，以及整合到适合特定病毒的所述靶细胞的基因组中。在使用时，所述病毒载体通常携带将要由该载体输送到靶细胞中的异源编码序列(感兴趣的核苷酸或NOIs)，例如，编码一种核酶的第一种核苷酸序列。至于“复制缺陷型”我们指的是在最终靶细胞中不能够独立复制以便产生传染性病毒颗粒的病毒载体。
术语“病毒载体系统”意在表示一组部件，这些部件可以与病毒颗粒生产的其他必需成分组合使用，以便在宿主细胞中生产病毒颗粒。例如，在适用于将NOI克隆到病毒基因组载体结构上的质粒载体结构上，通常存在NOI。与通常存在于独立的质粒载体结构上的其他核苷酸序列组合成试剂盒之后，所得到含有NOI的质粒和含有其他核苷酸序列的质粒的组合中包括本发明的必需成分。技术人员可以将这种试剂盒用于生产合适的病毒载体基因组结构，这种结构在与所述含有其他核苷酸序列以及选择性地含有编码病毒组装所需要的其他成分的核酸的质粒一起转染到宿主细胞中时，会导致传染性病毒颗粒的产生。
另外，所述其他核苷酸序列可以稳定地存在于所述试剂盒所包括的一个包装细胞系内。
所述试剂盒可以包括生产病毒颗粒所需要的其他成分，如宿主细胞和编码病毒组装所必需的病毒多肽的其他质粒。举例来说，所述试剂盒可以包括(i)含有NOI的质粒和(ii)含有编码修饰过的逆转录病毒gag-pol结构的其他核苷酸序列的质粒，该结构作过密码子优化，以便在所选择的生产细胞中表达。选择性的成分可以是(a)逆转录病毒基因组结构，它具有适用于将NOI克隆到病毒基因组中的限制酶识别位点，还选择性地具有至少一部分gag序列；(b)编码VSV-G env蛋白的质粒。另外，能够以包括所述核苷酸序列的包装细胞系的形式，例如VSV-G表达细胞系，在所述试剂盒中提供编码组装病毒颗粒所需要的病毒多肽的核苷酸序列。
术语“病毒载体生产系统”是指上文所述的病毒载体系统，其中，业已将NOI插入合适的病毒载体基因组中。
在本发明中，有一些术语可以交换使用。因此，“毒粒”、“病毒”、“病毒颗粒”、“逆转录病毒颗粒”、“逆转录病毒”和“载体颗粒”表示能够通过病毒样进入机制，将一种核酸导入细胞的病毒和病毒样颗粒。在特定场合下，所述载体颗粒可以介导NOIs转移到它所感染的细胞中。逆转录病毒能够将其遗传材料逆转录成DNA，并通过转导将该遗传材料整合到靶细胞的DNA上。在本文中，所述细胞被称为“靶细胞”。
在本文中，术语“靶细胞”简单地表示本发明的天然或定向调控的逆转录病毒载体能够感染或转导的细胞。
本发明的慢病毒载体颗粒能够转导缓慢分裂的细胞，而诸如MLV的非慢病毒不能有效转导这种细胞。大约每3-4天分裂一次的缓慢分裂的细胞包括某些肿瘤细胞。尽管肿瘤包括快速分裂的细胞，但是，某些肿瘤细胞，特别是肿瘤中央的细胞很少分裂。
另外，所述靶细胞可以是能够进行细胞分裂的生长抑制细胞，如肿瘤体中央部分的细胞，或诸如造血干细胞的干细胞或CD34阳性细胞。
作为另一种选择，所述靶细胞可以是分化细胞的前体，如单核细胞前体、CD33阳性细胞或骨髓前体。
作为另一种选择方案，所述靶细胞可以是分化细胞，如神经元、星形细胞、胶质、微胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞、表皮细胞、内皮细胞、肝细胞、精母细胞、精子细胞或精子。
可以在从人体内分离之后，在体外对靶细胞进行转导或者可以直接在体内转导。
本发明的病毒载体是逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体，如HIV和EIAV载体。本发明的逆转录病毒载体可以源于任何合适的逆转录病毒或者由这些逆转录病毒衍生。业已鉴定了大量不同的逆转录病毒。这些病毒的例子包括：鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒、人T-细胞白血病病毒(HTLV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、Moloney鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽成髓细胞瘤病毒-29(MC29)、和禽成红细胞瘤病毒(AEV)。逆转录病毒的详细目录可以在Coffin等的文章中查到(1997，逆转录病毒，冷泉港实验室出版社，JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，758-767页)。
术语“可衍生的”以其普通含义使用，表示LTR的核苷酸序列或其一部分，所述序列不一定是从诸如逆转录病毒载体的载体中获得的，它可以由这些载体衍生而来。举例来说，所述序列可以通过合成方法制备或者利用重组DNA技术制备。
在现有技术中可以查阅到有关某些逆转录病毒基因组结构的细节。例如，有关HIV和Mo-MLV的细节可以从NCBI基因文库中查到(基因组保藏号分别为AF033819和AF033811)。有关HIV变体的细节还可以在 http://hiv-web.lanl.gov.网址上查到。EIAV变体的细节可以通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov网址查到。
慢病毒类型可以进一步分成“灵长类”和“非灵长类”。灵长类慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)、人自身免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体、和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒包括原型“慢病毒”绵羊髓鞘脱落/呼吸困难病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)以及最近披露的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
逆转录病毒基因组的基本结构是5’LTR和3’LTR，在它们之间或内部有一个使得该基因组能被包装的包装信号，一个引物结合位点，使得它能够整合到宿主细胞基因组中的整合位点，以及编码包装成分——这些成分是组装病毒颗粒所需要的多肽的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有其他特征，如HIV中的rev和RRE序列，这些序列使得所整合的原病毒的RNA转录物，能从受感染的靶细胞的细胞核有效排出到细胞质中。
在所述原病毒中，在所述基因的两侧是被称为长的末端重复(LTRs)的片段。LTRs决定原病毒整合和转录。LTRs还起着增强子-启动子序列的作用，并且可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是通过ψ序列进行的，该序列业已在HIV上披露过，它至少位于所述病毒基因组的5’末端。
LTRs本身是相同的序列，它可以分成三个因子，这些因子被称为U3、R和U5。U3源于所述RNA的3’末端所特有的序列。R源于所述RNA两端的重复序列，而U5源于所述RNA5’末端所特有的序列。不同逆转录病毒的上述三个因子的大小明显不同。
在缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以缺乏或者没有功能。位于所述RNA两端的R区是重复序列。U5和U3分别表示所述RNA基因组5’和3’末端的特有序列。
如上文所述，在用于基因治疗的典型的逆转录病毒载体上，可以从该病毒载体上去掉复制所必需的gag、pol和env蛋白编码区中的一种或几种的至少一部分。这会使得该逆转录病毒载体成为复制缺陷型。甚至可以像在本发明中那样，用一个感兴趣的核苷酸序列(NOI)取代去掉的部分，以便制备可将其基因组整合到宿主基因组中的病毒，不过，其中，修饰过的病毒基因组本身不能繁殖，因为缺乏结构蛋白。在整合到宿主基因组中之后，会出现NOI的表达——导致，例如，治疗和/或诊断效果。因此，将NOI转移到感兴趣的部位通常是通过以下方式实现的：将NOI整合到重组病毒载体上；将修饰过的病毒载体包装到毒粒外被中；并对感兴趣的部位——如靶细胞或靶细胞群体进行转导。
因此，用于本发明的最小逆转录病毒基因组包括(5’)R-U5-一个或多个NOIs-U3-R(3’)。不过，在宿主细胞/包装细胞中生产所述逆转录病毒基因组的质粒载体还包括可操作地连接于逆转录病毒基因组上的转录调控序列，以便指导该基因组在宿主细胞/包装细胞中转录。所述调控序列可以是与所述转录的逆转录病毒序列结合的天然序列，即5’U3区，或者它们可以是诸如另一种病毒启动子的异源启动子，例如CMV启动子。
为了有效生产病毒，某些逆转录病毒基因组需要其他序列。例如，对于HIV来说，应当包括rev和RRE序列。不过，我们发现通过密码子优化可以减少或消除对rev和RRE的需求。由于密码子优化的gag-pol的表达是不依赖于REV的，可以将RRE从gag-pol表达框上去掉，从而消除了与所述载体基因组上所包含的任何RRE发生重组的可能性。
一旦需要表达所述逆转录病毒载体NOIs序列，就需要有启动子。在逆转录病毒中，所述启动子位于所述原病毒的5’LTR U3区。在逆转录病毒载体上，驱动治疗基因表达的启动子可以是位于5’U3区的天然逆转录病毒启动子，或者是通过工程方法插入所述载体的其他启动子。所述其他启动子可以机械取代所述逆转录病毒天然拥有的5’U3启动子，或者将其插入该载体基因组内的不同部位，如插在LTRs之间。
因此，NOI还可以与转录调控序列可操作地连接，以便所述第一个核苷酸序列能够在靶细胞中转录。所述调控序列通常可以在哺乳动物细胞中起作用。例如，所述控制序列可以是病毒启动子，如天然的病毒启动子或CMV启动子或者可以是哺乳动物启动子。特别优选的是使用能优先在特定的细胞类型或组织类型中起作用的启动子，其中，所述细胞类型或组织类型受到了需要治疗的病毒的初步感染。因此，在一种实施方案中，可以使用组织专一性调控序列。所述启动一个或多个所述第一核苷酸序列表达的调控序列，可以是组成型的或调控的启动子。
术语“可操作地连接”表示一个基因的调控区(通常是启动子因子，但可以包括增强子因子)和编码区之间的关系，其中，所述编码区的转录受所述调控区的控制。
在本文中，术语“增强子”包括能结合转录起始复合体的其他蛋白成分，并因此促进由相关的启动子指导的转录开始的DNA序列。
在本发明的一种优选实施方案中，所述增强子是局部缺血样反应因子(ILRE)。
术语“局部缺血样反应因子”——或者写成ILRE——包括在局部缺血条件或类似局部缺血条件或由局部缺血所导致的条件有反应或者是在这种条件下有活性。举例来说，类似局部缺血或者由局部缺血所导致的条件包括缺氧和/或低葡萄糖浓度。
术语“缺氧”表示特定器官或组织得到的氧气供应不足的情况。
局部缺血可以是对特定器官或组织的供血不足。血液供应减少的一个后果是，对所述器官或组织的氧气供应不足(缺氧)。长期缺氧会导致对受影响器官或组织的损伤。
优选的ILRE是缺氧反应因子(HRE)。
在本发明的一个优选方面，存在逆转录病毒载体成分的缺氧或局部缺血可调控的表达。就此而言，缺氧是在多种不同类型细胞中基因表达的有效调控剂，并且通过诱导诸如缺氧诱导因子-1(HIF-1；6)的缺氧诱导型转录因子的活性而发挥作用，该因子与各种基因启动子上的缺氧反应因子(HREs)-关联DNA识别位点结合。Dachs等(7)业已利用多聚体形式的、来自小鼠磷酸甘油酸激酶-1(PGK-1)基因(8)的HRE，来控制人纤维肌瘤细胞在体外和在实质肿瘤内缺氧的条件下对标记基因和治疗基因的表达(7，同上)。
业已证实，缺氧反应增强因子(HREEs)与包括促红细胞生成素(EPO)基因在内的多个基因相关(9；10)。业已从肌肉糖酵解酶丙酮酸激酶(PKM)基因(11)、人肌肉专一性β-烯醇化酶基因(ENO3；12)和内皮素-1(ET-1)基因(13)的调控区中分离了其他HREEs。
例如，本发明的优选HRE选自促红细胞生成素HRE因子(HRE1)、肌肉丙酮酸激酶(PKM)HRE因子、磷酸甘油酸激酶(PGK)HRE因子、β-烯醇化酶(烯醇化酶3；ENO3)HRE因子、内皮素-1(ET-1)HRE因子和金属硫蛋白II(MTII)HRE因子。
所述ILRE优选与启动子的转录调控因子组合使用，所述转录调控因子优选能在一种或多种特定类型的细胞中起作用，优选只能在一种细胞中起作用。
如上文所述，本发明的这种组合特征被称为反应因子。
所述反应因子优选至少包括本文所定义的ILRE。
所述反应因子的非限定性例子是以OBHRE1和XiaMac形式出现的。另一种非限定性的例子包括与LMV启动子和/或组织限制性局部缺血反应启动子组合使用的ILRE。所述反应因子披露于WO 99/15684中。
合适的组织限制性启动子/增强子的其他例子有在肿瘤细胞中高度活跃的启动子，如源于MUCI基因、CEA基因或5T4抗原基因的启动子/增强子。α-胎球蛋白(AFP)启动子也是一种肿瘤专一性启动子。一种优选的启动子-增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)启动子/增强子组合。
术语“启动子”是以本领域的普通含义使用的，例如，表示RNA聚合酶结合位点。
所述启动子可以位于逆转录病毒5’LTR，以便控制编码NOI和/或gag-pol蛋白的cDNA表达。
所述NOI和/或gag-pol蛋白优选能够由所述逆转录病毒基因组表达，如由位于所述长的末端重复(LTR)上的内源逆转录病毒启动子表达。
所述NOI和/或gag-pol蛋白优选由一个异源启动子表达，在该异源启动子上可操作地连接了异源基因或序列，和/或密码子优化的gag-pol序列。
另外，所述启动子可以是内部启动子。
所述NOI优选是由内部启动子表达的。
含有内部启动子的载体业已被广泛用于表达多种基因。内部启动子使得可以利用不同于所述病毒LTR中的启动子/增强子的组合启动基因表达。在一个逆转录病毒载体上可以包括多个启动子，并且业已证实可以各自由它自身的启动子表达至少三种不同的cDNA(14)。另外，业已将内部核糖体进入位点(IRES)因子用于由一种单一的mRNA或由融合蛋白翻译多个编码区，随后就可以由一个开放读框表达所述编码区。
本发明的启动子可以是组成型有效的，或者可以是其活性是受到组织或时间限制的。
所述启动子优选是诸如CMV的组成型启动子。
本发明的启动子优选是组织专一型的。就是说，它能够启动NOI或NOI(s)在一种组织中转录，而在其他类型的组织中主要保持“沉默”。
术语“组织专一性”表示一种启动子不仅将其活性局限在一种类型的组织中，而且，还表现在它能在一种类型的组织中有活性，而在另一种类型的组织中活性较低或无活性的选择性方面。
可以通过操作所述启动子区调控NOI或NOIs在特定启动子控制之下的表达水平。例如，一个启动子区内的不同结构域可能具有不同的基因调控活性。这些不同区域的作用通常是用具有缺失了特定区域的该启动子的不同的变体的载体结构评估的(即缺失分析)。例如，该方法可用于鉴定能产生组织专一性的最小的片段或能产生的缺氧敏感性的最小的片段。
上述多种组织专一性启动子可能特别适用于实施本发明。在大多数情况下，这些启动子可以作为适合克隆到特定载体上的常见限制性消化片段分离。另外，可以通过聚合酶链式反应分离启动子片段。通过在引物的5’末端结合限制位点有利于扩增片段的克隆。
NOI或NOIs可以受诸如启动子和增强子的表达调控因子的表达调控。
所述局部缺血反应启动子优选是组织限制性局部缺氧反应启动子。
所述组织限制性局部缺血反应启动子优选是通过抑制限制的巨噬细胞专一性启动子。
所述组织限制性局部缺血反应启动子优选是内皮细胞专一性启动子。
本发明的受调控的逆转录病毒载体优选是ILRE调控的逆转录病毒载体。
本发明的受调控的逆转录病毒载体优选是ILRE调控的慢病毒载体。
本发明的受调控的逆转录病毒载体优选是自身调控的缺氧反应慢病毒载体。
本发明的受调控的逆转录病毒载体优选是通过葡萄糖浓度调控的。
例如，诸如grp78和grp94的葡萄糖调控蛋白(grp’s)是已知通过葡萄糖丧失诱导的高度保守的蛋白(15)。在大多数正常健康组织中，grp78基因是在基础含量的启动子因子的影响下以低水平表达的，不过，在TATA因子上游具有至少两个关键的胁迫诱导型调控因子(15同上，16)与grp78启动子的5’末端的截短的632bp的序列结合之后，能在体内对报导基因产生葡萄糖丧失的高度诱导性(16，同上)。另外，存在于逆转录病毒载体上的该启动子序列在鼠纤维肌瘤上的肿瘤细胞中，特别是在局部缺血/纤维化部位的相对中央部位，能启动报导基因的高水平表达(16，同上)。
本发明的所述调控的逆转录病毒载体优选是自我失活(SIN)载体。
举例来说，业已通过去掉3’LTR的U3区的转录增强子或增强子或启动子构建了自我失活的逆转录病毒载体。在经过一轮载体逆转录和整合之后，这些变化被拷贝到5’和3’LTRs，产生一种无转录活性的原病毒(17；18；19；20)。不过，所述载体的LTRs内部的任何启动子都仍然有转录活性。业已将这种方法用于消除所述病毒LTRs上的增强子和启动子对来自内部基因转录的影响。所述影响包括增强转录(21)或抑制转录(22)。该方法还可用于消除从3’LTR到基因组DNA的下游转录(23)。这一点在人类基因治疗上特别重要，其中，抑制内源癌基因的意外活化是极其重要的。
如上文所述，通常要繁殖复制缺陷型逆转录病毒载体，以便通过使用包装或辅助细胞系和重组载体的组合来制备，例如合适效价的逆转录病毒载体用于随后的转导，就是说，能够以反式形式提供三种包装蛋白。
一般，“包装细胞系”包括所述逆转录病毒gag、pol和env基因中的一个或多个。在本发明中，它含有密码子优化的gag-pol基因，并选择性地含有env基因。所述包装细胞系能产生包装逆转录病毒DNA所需要的蛋白，但它不能进行衣壳化。通常，这一目的是通过缺少ψ区而实现的。不过，当把一种携带NOI和ψ区的重组载体导入所述包装细胞系时，所述辅助蛋白能包装所述ψ阳性重组载体，以便产生重组的病毒原种。可以用这种病毒原种转导细胞，以便将所述NOI导入靶细胞的基因组。通常是使用被称为ψ+的ψ包装信号，它包括从所述供体上游到gag起始密码子下游的额外序列(24)，因为已经证实这样能提高病毒效价。
其基因组缺乏产生病毒蛋白所需要的所有基因的重组病毒只能转导一次，而不能繁殖。这些只能对靶细胞进行一轮转导的病毒载体被称为复制缺陷型载体。因此，将NOI导入宿主/靶细胞基因组，而又不会产生有潜在危害的逆转录病毒。Coffin等(1977，同上)对现有的包装系进行了总结。
所述逆转录病毒包装细胞系优选是瞬时转染的细胞系形式的。在开发载体时，优选通过瞬时转染测定载体生产水平。在这一方面，瞬时转染避免了制备稳定的载体生产细胞系所需要的较长的时间，并且还可以在载体或逆转录病毒包装成分对细胞有毒性时使用。通常被用于制备逆转录病毒载体的成分，包括编码gag-pol蛋白的质粒，编码env蛋白的质粒，以及含有NOI的质粒。载体生产包括将所述一种或多种成分瞬时转染到含有其他所需成分的细胞中。如果所述载体编码毒性基因或会干扰宿主细胞复制的基因，如细胞周期抑制剂或能诱导细胞程序死亡的基因的话，要制备稳定的载体生产细胞系是困难的，但是可以在所述细胞死亡之前，通过瞬时转染生产所述载体。业已通过瞬时转染开发出了这样的细胞系：该细胞系所产生的载体效价水平，与由稳定的载体生产细胞系所获得的水平相当(25)。
生产细胞/包装细胞可以是任何合适类型的细胞。生产细胞通常是哺乳动物细胞，不过，也可以是，例如，昆虫细胞。生产细胞可以是含有病毒结构基因的包装细胞，该结构基因通常整合在导入了本发明的受调控的逆转录病毒载体的细胞的基因组中。另外，所述生产细胞可以用编码结构成分的核酸序列转染，如一个或多个载体上的密码子优化的gag-pol和env，所述载体如质粒、腺病毒载体、疱疹病毒载体或者使用任何已知的、将功能DNA输送到靶细胞中的方法。然后，通过本发明的方法将本发明的载体导入所述包装细胞。
在本文中，术语“生产细胞”或“载体生产细胞”是指含有生产受调控的逆转录病毒载体颗粒所需要的所有因子的细胞，以及受调控的逆转录病毒输送系统。
所述生产细胞优选是从稳定的生产细胞系中获得的。
所述生产细胞优选是从衍生的稳定生产细胞系中获得的。
所述生产细胞优选是从衍生的生产细胞系中获得的。
在本文中，术语“衍生的生产细胞系”是一种转导过的生产细胞系，以便对它作出筛选，并且选择了标记基因的高水平表达。所述细胞系含有在整合位点上的逆转录病毒插入片段，这样，能支持所述逆转录病毒基因组的高水平表达。术语“衍生的生产细胞系”可以与术语“衍生的稳定的生产细胞系”和术语“稳定的生产细胞系”交换使用。
所述衍生的生产细胞系优选包括，但不限于逆转录病毒和/或慢病毒生产细胞。
所述衍生的生产细胞系优选是HIV或EIAV生产细胞系，更优选是EIAV生产细胞系。
所述外被蛋白序列和核衣壳序列优选都稳定地整合到生产细胞和/或包装细胞中。不过，所述序列中的一种或几种还可以以附加体的形式存在，并且，基因的表达可以在附加体中进行。
在本文中，术语“包装细胞”是指含有生产感染性重组病毒所需要的因子的细胞，这些因子是重组病毒载体所缺乏的。通常，所述包装细胞含有一种或多种载体，这些载体能够表达病毒结构蛋白(如密码子优化的gag-pol和env)，但是，它们不包含包装信号。
术语“包装信号”可以与“包装序列”或“psi”交换使用，它被用于表示在病毒颗粒形成期间将逆转录病毒RNA链衣壳化所需要的非编码、顺式作用序列。在HIV-1中，该序列业已被作图在从主要剪接供体位点(SD)上游延伸到至少gag起始密码子的基因座上。
可以方便地制备适用于上述载体结构的包装细胞系(还可参见WO 92/05266)，并用于制备用来生产逆转录病毒载体颗粒的生产细胞系。正如已经提到过的，在“逆转录病毒”一书中提供了对现有包装细胞系的总结(1997，冷泉港实验室出版社，JM Coffin，SM Hughes，HEVermus，449页)。
正如上文所讨论的，业已发现含有缺失了包装信号的原病毒的简单的包装细胞系，能导致通过重组快速产生所需要的复制感受态病毒。为了改善安全性，业已生产出了缺失了所述原病毒的3’LTR的第二代细胞系。在所述细胞中，要产生野生型病毒必须进行两次重复。进一步的改进包括将位于独立结构上的gag-pol基因和env基因导入所谓的第三代细胞系中。所述结构是依次导入的，以避免在转染期间发生重组(26；27)。
所述包装细胞系优选是第二代包装细胞系。
所述包装细胞系优选是第三代包装细胞系。
在所述具有分离结构的第三代细胞系中，通过“密码子摆动”可以进一步减少重组。这种基于遗传密码丰度的技术，其目的是要降低所述独立结构之间的同源性，例如，gag-pol的重叠部分与env开放读框之间的同源性。
所述包装细胞系可用于提供衣壳化所需要的基因产物，并且，提供用于高效价受调控的逆转录病毒载体和受调控的核基因输送载体的膜蛋白。当受调控的逆转录病毒序列被导入所述包装细胞系时，所述序列被核衣壳(gag-pol)蛋白衣壳化，并且这些单位随后通过所述细胞膜突出，从而被包围在细胞膜中，并且含有在所述包装细胞系中所产生的外被蛋白。这种具有传染性的受调控的逆转录病毒可以被周作感染单位本身或者被用作基因输送载体。
所述包装细胞可以是在体外培养的细胞，如组织培养细胞系。合适的细胞系包括，但不限于哺乳动物细胞，如鼠成纤维细胞衍生的细胞系或人细胞系。所述包装细胞系优选是人细胞系，例如，HEK293，293-T，TE671，HT1080。
另外，所述包装细胞可以是来自需要治疗的个体的细胞，如单核细胞、巨噬细胞、血细胞或成纤维细胞。所述细胞可以是从个体体内分离的，而所述包装和载体成分是从体外服用的，然后，再次服用自身的包装细胞。
将高效价病毒制剂用于实验和实际应用中是非常理想的。提高病毒效价的技术，包括使用上文所述的ψ+包装信号以及病毒原种的浓度。另外，使用不同的外被蛋白，如浓度为109/毫升来自水疱性口炎病毒的G蛋白具有提高了的效价(28)。不过，通常要对所述外被蛋白进行选择，以便所述病毒颗粒能优先感染那些受到需要治疗的病毒感染的细胞。例如，在用HIV载体治疗HIV感染时，所使用的env蛋白可以是HIV env蛋白。
生产其外被蛋白不是逆转录病毒的天然外被的逆转录病毒载体的过程被称为“假模”。某些外被蛋白，如MLV外被蛋白和水疱性口炎病毒的G(VSVG)蛋白能很好地假模逆转录病毒。假模并不是一种新的现象，并且其例子可以在以下文献中查阅到：WO-A-98/05759，WO-A-98/05754，WO-A-97/17457，WO-A-96/09440，WO-A-91/00047和(29)。
在本文中，术语“高效价”表示能够转导诸如细胞的靶位点的逆转录病毒载体或颗粒的有效量。
在本文中，术语“有效量”表示足以在靶位点诱导NOI表达的受调控的逆转录病毒或慢病毒载体或载体颗粒的量。
所述效价优选为至少106逆转录病毒颗粒/毫升，如106-107/毫升，更优选至少107逆转录病毒颗粒/毫升。
根据本发明，可以操纵病毒基因组或受调控的逆转录病毒载体核苷酸序列，以便病毒基因被一个或多个NOIs所取代或补充，所述NOIs可以是异源NOIs。
术语“异源”是指一种核酸序列或蛋白序列与另一种核酸或蛋白序列的连接不是天然连接。
对本发明来说，术语NOI(即感兴趣的核苷酸序列)包括任何合适的核苷酸序列，它不一定是完全的天然存在的DNA序列，因此，所述DNA可以是，例如，合成DNA序列、重组DNA序列(即通过重组DNA技术制备的序列)。cDNA序列或部分基因组DNA序列，包括它们的组合。所述DNA序列不一定是编码区。如果它是编码区的话，也不一定是完整的编码区。另外，所述DNA序列可以是正义方向或反义方向的，优选是正义方向的。所述DNA优选是或包括cDNA。
NOIs可以是选择基因、标记基因和治疗基因中的一种或多种。
在本文中，术语“选择基因”表示使用编码可能具有酶促活性的一种选择标记的NOI，该标记能对表达这种选择标记的细胞产生对抗生素或药物的抗性。
业已将多种不同的选择标记成功地用在逆转录病毒载体上。这些载体在“逆转录病毒”一书中作过综述(1997，冷泉港实验室出版社，JMCoffin，SM Hughes，HE Varmus，444页)，并且包括，但不限于细菌新霉素(NEO)和潮霉素磷酸转移酶基因，这两种基因分别能产生对G418和潮霉素的抗性；能产生氨甲蝶呤抗性的突变型小鼠二氢叶酸还原酶基因；使得细胞能在含有霉酚酸、黄嘌呤和氨基蝶呤的培养基中生长的细胞gpt基因；使得细胞能在不含组胺，而含有组胺醇的培养基中生长的细菌hisD基因；能产生对多种药物的抗性的多种药物抗性基因(mdr)；以及能产生对嘌呤霉素或phleomycin的抗性的细菌基因。上述所有标记都是可以显性选择的，并且，能够对表达这些基因的大多数细胞进行化学选择。其他选择标记不是显性的，就是说，它必须与缺乏所述相关酶活性的细胞系一起使用。非显性选择标记的例子包括胸苷激酶(tk)基因，该基因与tk细胞系组合使用。
特别优选的标记是选择性地、可操作地与胸苷激酶编码序列连接的，通常受诸如SV40启动子的强的病毒启动子控制的杀稻瘟素和新霉素。
根据本发明，稳定的NOI序列包括具有治疗和/或诊断用途的序列，例如，但不局限于：编码以下成分的序列：细胞因子、趋化因子、抗体、工程产生的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调控分子、反义RNA、靶蛋白的显性转隐性变体、毒素、调节毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白和生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶、及其衍生物(如具有一个相关的报导组)。
在包括所述编码序列时，这些序列通常可以可操作地与合适的启动子连接，所述启动子可以是启动核酶表达的启动子，或者是不同的启动子，如在一种或多种类型特殊细胞中的启动子。在本发明中被用于治疗或预防癌症的NOIs包括编码能破坏靶细胞的蛋白(例如，核糖体毒素)的NOIs，所述蛋白具有以下作用：肿瘤抑制剂(如野生型p53)；抗肿瘤免疫机制的活化剂(如细胞因子、共刺激分子和免疫球蛋白)；血管形成的抑制剂；或能提供增强了的药物免疫性(如药物前体活化酶)；通过天然反应细胞间接刺激靶细胞的破坏(例如，刺激其免疫系统的强的抗原)或将一种前体物质转化成能破坏靶细胞的毒性物质(例如，药物前体活化酶)。
药物前体的例子包括，但不限于磷酸依托泊苷(与碱性磷酸酶一起使用)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶一起使用)；阿霉素-N-p-羟基苯氧乙酰胺(与青霉素-V-酰胺酶一起使用)；对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰基谷氨酸(与羧基肽酶G2一起使用)；头孢菌素氮芥子氨甲酸(与B-内酰胺酶一起使用)；SR4233(与p450还原酶一起使用)；更昔落韦(与HSV胸苷激酶一起使用)；芥子药物前体(与硝酸还原酶一起使用)以及环磷酰胺或异环酰胺(与细胞色素p450一起使用)。
适用于治疗或预防局部缺血心脏病的NOIs包括编码纤溶酶原激活剂的NOIs。适用于治疗或预防类风湿关节炎或大脑疟疾的NOIs包括编码抗炎蛋白、抗肿瘤坏死因子(TNF)α的抗体、以及抗粘附分子(如对粘附分子专一的抗体分子或受体)的基因。
由NOIs编码的表达产物可以是从细胞中分泌出来的蛋白。另外，所述NOI表达产物不分泌，而是在细胞内起作用。在任意一种情况下，所述NOI表达产物优选都具有旁观者反应或远处旁观者反应，就是说，所述表达产物在一个细胞中的产生，会导致杀伤相邻的或远处的(例如，转移的)具有共同表型的其他相关细胞。所编码的蛋白还能破坏旁边的肿瘤细胞(例如，利用所分泌的抗肿瘤抗体-核糖体毒素如核蛋白)，间接促进破坏旁边的肿瘤细胞(例如，由细胞因子刺激免疫系统或由前凝固蛋白导致血管局部阻塞)或将前体物质转化成能破坏旁边肿瘤细胞的有毒物质(例如，一种能将药物前体活化成扩散性药物的酶)。另外，输送编码反义转录物或核酶的NOIs，能干扰决定肿瘤存在的细胞基因的表达(例如，抗Burkitts淋巴瘤中的异常myc转录物或抗慢性髓样白血病中的bcr-abl转录物)。还可以使用所述NOIs的组合。
本发明的NOI或NOIs还可以包括一个或多个细胞因子编码NOIs。合适的细胞因子和生长因子包括，但不限于：ApoE，Apo-SAA，BDNF，心脏营养蛋白-1，EGF，ENA-78，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-2，FGF-酸性，FGF-碱性，成纤维细胞生长因子-10(30).FLT3配体，Fractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，胰岛素，IFN-γ，IGF-I，IGF-II，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72a.a.)，IL-8(77a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，抑制素α，抑制素β，IP-10，角质细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，苗条素，LIF，Lymphotactin，Mullerian抑制物质，单核细胞集落刺激因子，单核细胞趋化蛋白(30同上)，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MIG，MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，骨髓祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)，NAP-2，神经营养蛋白，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制癌蛋白M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNIL-1，TPO，VEGF，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309。
所述NOI或NOIs可以由表达调控因子进行表达控制，如启动子和/或启动子增强子，在本发明中它被称为“反应因子”。
在利用所述受调控的逆转录病毒载体颗粒将NOIs转入它们所转导的细胞中时，所述载体颗粒还可以被称为“病毒输送系统”或“逆转录病毒输送系统”。业已利用包括逆转录病毒载体的病毒载体，通过利用病毒转导方法有效转移NOIs。可以将克隆到逆转录病毒基因组中的NOIs有效输送到容易受逆转录病毒转导的细胞中。通过其他遗传学操作，可以破坏所述逆转录病毒基因组的复制能力。所述载体能将新的遗传材料导入细胞，但是不能复制。
本发明的受调控的逆转录病毒载体，可以通过病毒或非病毒技术输送。非病毒输送系统包括，但不限于DNA转染方法。在本文中，转染包括利用非病毒载体将基因输送到目标哺乳动物细胞中的过程。
典型的转染方法包括电穿孔、DNA biolistics、脂介导的转染、紧密DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染试剂、阳离子试剂介导的、阳离子表面两亲物(CFAs)(31)、多价阳离子，如亚精胺、阳离子脂类或聚赖氨酸、1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)苯烷(DOTAP)-胆甾醇复合物)及其组合。
病毒输送系统包括，但不限于腺病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、或杆状病毒载体。所述病毒输送系统可以设计成分离的内含子载体。分离的内含子载体披露于WO 99/15683中。
载体的其他例子包括来自体内的输送系统，其中，包括，但不限于DNA转染方法，如电穿孔、DNA biolistics、脂介导的转染、紧密DNA介导的转染。
所述载体可以是质粒DNA载体。另外，所述载体可以是重组病毒载体。合适的重组病毒载体包括腺病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体或逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒或慢病毒载体的组合。对病毒载体来说，基因输送是由病毒感染靶细胞介导的。
如果将腺病毒的特征与逆转录病毒/慢病毒的遗传学稳定性结合在一起的话，基本上就可以用所述腺病毒转导靶细胞，使其成为能稳定感染相邻细胞的瞬时逆转录病毒细胞。
本发明还提供了用于通过基因疗法治疗个体的药物组合物，其中，该组合物包括药理学有效量的本发明的受调控的逆转录病毒载体。所述药用组合物可用于人或动物。通常，医生能确定最合适接受治疗个体的实际剂量，并且剂量随着特定患者的年龄、体重和反应而变化。
所述组合物可以选择性地含有可以药用的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择，可以根据预期的服用途径和标准药理学措施选择。所述药用组合物可以直接含有——或额外含有——所述载体、赋形剂或稀释剂、任何合适的粘接剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂、以及能帮助或加强病毒进入靶位点的其他载体制剂(例如，脂输送系统)。
在合适的时候，所述药用组合物可以通过下面任意一种或几种方法服用：微型泵、吸入、栓剂或子宫药栓形式，以洗液、溶液、乳剂、软膏或干粉形式局部使用，使用皮肤膏，以含有诸如淀粉或乳糖的赋形剂的片剂形式口服，或单独或与赋形剂混合包含在胶囊或小球中，或者为酏剂形式，含有香味剂或着色剂的溶液或悬浮液，或者还可以进行肠胃外注射，例如，intracavernosally注射、静脉内注射、肌内注射或皮下注射。对于肠胃外服用来说，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，该溶液可以含有其他物质，例如，足够的盐或单糖，使得该溶液与血液渗透压相等。为了口腔或舌下服用，所述组合物能以片剂或酊剂形式服用，这种制剂可以用常规方法制备。
相信本发明具有多种治疗用途，这特别是取决于一种或多种NOIs的选择。
例如，本发明可用于治疗在WO-A-98/05635中所列举的疾病。为了便于参考，在这里提供了所列举的部分疾病：癌症、发炎或炎性疾病、皮肤病或发烧、心血管反应、出血、凝固和急性期反应、恶病质、厌食、急性感染、HIV感染、休克状态、接肢-宿主反应、自身免疫病、再灌注损伤、脑膜炎、周期性偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓病；肿瘤生长、入侵和扩增、血管生成、转移瘤、恶性肿瘤、腹水和恶性胸膜渗漏；大脑局部缺血、局部缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿关节炎、骨质疏松、哮喘、多发性硬化、神经变性、老年性痴呆、动脉粥样硬化、中风、脉管炎、Crohn’s病和溃疡性大肠炎；骨膜炎、牙龈炎；牛皮癣、易位皮肤炎、慢性溃疡、表皮松解大泡；角膜溃疡、视网膜病和手术伤口愈合；鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、过敏性反应；再狭窄、充血性心衰、子宫内膜易位、动脉粥样硬化或内部硬化。
另外，或者作为替代方案，本发明还可用于治疗在WO-A-98/07859中所列举的疾病。为了便于参考，在这里提供了所列举的部分疾病：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如，用于治疗免疫缺陷，包括用人免疫缺陷病毒感染；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和很多自身免疫疾病，并且预防移植排斥或诱导肿瘤免疫性)；调节血细胞生成，例如，治疗骨髓或淋巴疾病；促进骨骼、软骨、腱、韧带和神经组织的生长，例如，用于愈合伤口、治疗烧伤、溃疡和牙周疾病和神经变性；抑制或活化滤泡刺激激素(调节育性)；趋化/化学激动活性(例如，用于将特定类型的细胞转移到损伤或感染部位)；止血和溶解血栓活性(例如，用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(例如，用于治疗脓毒性休克或Crohn’s病)；作为抗微生物剂；诸如代谢或行为的调节剂；作为止痛药；治疗特殊缺陷疾病；作为人用药或兽用药用于治疗牛皮癣。
另外，或作为替代方案，本发明还可用于治疗在WO-A-98/09985中所列举的疾病。为了便于参考，在这里提供了所列举的部分疾病：巨噬抑制和/或T细胞抑制活性，并因此具有抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞和/或免疫反应的抑制作用，包括与发炎无关的反应；抑制巨噬细胞和T细胞与细胞外基质成分和纤连蛋白连接的能力，以及上调T细胞中fas受体表达；抑制不希望有的免疫反应和包括关节炎在内的炎症，包括类风湿关节炎、与发炎相关的过敏、过敏性反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其他自身免疫病、与发炎相关的动脉粥样硬化、动脉硬化、动脉粥样硬化心脏病、再灌注损伤、心动停止、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸困难综合症或其他肺心病、与发炎相关的消化道溃疡、溃疡性大肠炎和其他胃肠道疾病、肝纤维化、肝硬化或其他肝脏疾病，甲状腺炎或其他腺体疾病，肾小球性肾炎或其他肾病和其他泌尿道疾病，耳炎或其他耳鼻喉疾病，皮肤炎或其他皮肤疾病，牙周疾病或其他牙病，睾丸炎或睾丸附睾炎、不育、睾丸创伤或其他与免疫相关的睾丸疾病，胎盘异常，胎盘不全，习惯性流产，惊厥、子痫前期和其他免疫和/或炎症相关的妇科疾病，后期眼色素层炎、中期眼色素层炎、前期眼色素层炎，结膜炎，脉络膜视网膜炎，眼色素层视网膜炎，眼神经炎，眼内发炎，例如，视网膜炎或内囊肿斑点性水肿，交感性眼炎，巩膜炎，视网膜炎色素，变性fondus病的免疫和炎性成分，眼睛创伤的炎性成分，由感染所引起的眼睛发发炎，增殖性玻璃体视网膜病，急性局部缺血性视神经病，疤痕过多，在青光眼过滤手术之后的疤痕过多，针对眼睛移植的免疫和/或炎性反应以及其他与免疫和发炎相关的眼科疾病，出现在中枢神经系统(CNS)或任何其他器官中的与自身免疫病或症状或失调相关的炎症，免疫和/或炎症抑制是有利的，帕金森病，由治疗帕金森病所产生的并发症和/或副作用，AIDS相关的痴呆，复杂的HIV相关的大脑疾病，Devic’s病，小舞蹈病，老年性痴呆和其他变性疾病，CNS的症状或失调，中风的炎性成分，后脊髓灰质炎综合症，精神病的免疫和炎性成分，脊髓炎，脑炎，亚急性硬化泛脑炎，脑脊髓炎，急性神经病，亚急性神经病，慢性神经病，急性热病性多神经炎，小舞蹈病，重症肌无力，假肿瘤脑炎，Down’s综合症，亨廷顿病，肌肉萎缩性侧硬化，CNS压迫或CNS创伤或CNS感染的炎性成分，肌肉萎缩和营养不良的炎性成分，以及与免疫和炎症相关的疾病，中枢和外周神经系统的症状或失调，创伤后发炎，脓毒性休克，传染病，手术的炎性并发症或副作用，骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用，基因治疗的炎性和/或免疫并发症和副作用，例如，由于感染病毒载体而引起的，或与AIDS相关的炎症，抑制或抑制人体和/或细胞免疫反应，通过减少单细胞或淋巴细胞的数量来治疗或缓解单细胞或白细胞增殖疾病，例如，白血病，用于预防和/或治疗在移植天然或人工细胞、组织和器官时的接枝排斥，如角膜、骨髓、器官、水晶体、起搏器、天然或人工皮肤组织。
下面将通过实施例对本发明作进一步的说明，提供这些实施例是为了帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不是要以任何方式限制本发明的范围。在实施例中涉及到附图。在这些附图中：
附图说明
图1表示通过PCR制备合适的3’LTR的示意图；
图2表示菌株HXB2(保藏号K03455)的野生型HIV gag-pol的密码子使用表；
图3a表示被称为gag-pol-SYNgp的密码子优化序列的密码子使用表；
图3b表示对照性密码子使用表；
图4表示被称为“env-mn”的野生型HIV env密码子使用表；
图5表示被称为SYNgp160mn的HIV env的密码子优化序列的密码子使用表；
图6表示用于本发明的两种质粒结构；
图7表示利用两种系统生产逆转录病毒载体颗粒的原理；
图8表示野生型HIV gag-pol序列(pGP-RRE3)和密码子优化的gag-pol序列(pSYNGP)的序列比较；
图9表示野生型EIAV gag-pol序列(WT)和密码子优化的gag-pol序列(CO)的序列比较；
图10表示蛋白表达颗粒形成的Rev独立性；
图11表示野生型(WT)和密码子优化的gag-pol的翻译速度；
图12表示总的和细胞质中的gag-pol mRNA水平；
图13表示将Wtgag插在所述密码子优化基因的下游对RNA和蛋白含量的影响；
图14表示用于研究HIV-1gag对密码子优化基因的影响的质粒；
图15表示表示将HIVgag插在所述密码子优化基因的上游细胞质RNA的影响；
图16表示细霉素B(LMB)对蛋白生成的影响；
图17表示载体基因组的细胞质RNA含量；
图18表示对MOI1的转导效率；
图19表示pGP-RRE3的示意图；
图20表示pSYNGP的示意图；
图21表示用不同gag-pol结构制备的载体效价；
图22表示Rev/RRE(-)和(+)基因组的载体效价；
图23表示载体基因组的pHS系列的载体效价；
图24表示在有或没有Rev/RRE的情况下pHS系列的效价；
图25表示gag-pol结构的分析；
图26表示293T提取物的Western印迹；
图27是pESYNGP的示意图；
图28是LpESYNGP的示意图；
图29是LpESYNGPRRE的示意图；
图30是pESYNGPRRE的示意图；
图31是pONY4.0Z的示意图；
图32是pONY8.0Z的示意图；
图33是pONY8.1Z的示意图；
图34是pONY3.1的示意图；
图35是pCIneoERev的示意图；
图36是pESYNREV的示意图；
图37和38表示不同载体结构对病毒载体效价的影响；
图39和40表示不同载体结构对RT活性的影响；
图41表示5’前导序列对病毒载体效价的影响；
图42表示在使用pONY8.1Z时的病毒载体效价；
图43表示pONY3.1的序列和密码子优化的pONY3.2OPTI在gag的头372个核苷酸上的比较；
图44是pIRES1hygESYNGP的示意图；
图45和46表示验证密码子优化的gag-pol可用于生产包装和生产细胞系的实验结果；
图47和48表示验证来自密码子优化的gag-pol的RNA的包装效率低于来自野生型基因的RNA的包装效率的实验结果；
图49表示验证pESYNGP和pESDSYNGP的表达相似的实验结果；
图50是pESDSYNGP的示意图；和
图51表示验证在PEV-17细胞和B-241细胞中gag-pol RNA衣壳化的效率相似的实验结果。
更具体地讲，图8表示野生型HIV gag-pol序列(pGP-RRE3)和密码子优化的gag-pol序列(pSYNGP)之间的序列比较，其中，上面的序列表示pSYNGP，而下面的序列表示pGP-RRE3。
图10表示蛋白表达颗粒形成的Rev独立性。在有或没有Rev(pCMV-Rev，1微克)的条件下将5微克gag-pol表达质转染到293T中，并在转染48小时之后测定培养上清液(A)和细胞裂解物(B)中的蛋白含量。用HIV-1阳性人血清检测gag-pol蛋白。用抗肌动蛋白抗体作为内部对照(C)再次检测所述印迹。在凝胶的侧面示出了蛋白标记(New England Biolabs)大小(以kDa计)。泳道1.模拟转染的293T细胞，2.pGP-RRE3，3.pGP-RRE3+pCMV-Rev，4.pSYNGP，5.pSYNGP+pCMV-Rev，6.pSYNGP-RRE，7.pSYNGP-RRE+pCMV-Rev，8.pSYNGP-ERR，9.pSYNGP-ERR+pCMV-Rev.。
图11表示WT和密码子优化的gag-pol的翻译速度。泳2微克pGP-RRE3(+/-1微克pCMV-Rev)或2微克pSYNGP转染293T细胞。在转染之后12，25，37和48小时之后通过Western印迹分析来自培养物上清液(A)和细胞提取物(B)的蛋白样品。泳HIV-1阳性人血清检测gag-pol蛋白(A，B)并用抗激动蛋白抗体作为内部对照(C)。在凝胶侧面示出了蛋白标记的大小(以kD计)。用磷光成像仪对所述结果进行定量。泳道：1.pGP-RRE3 12h，2.pGP-RRE3 25h，3.pGP-RRE3 37h，4.pGP-RRE3 48h，5.pGP-RRE3+pCMV-Rev 12h，6.pGP-RRE3+pCMV-Rev 25h，7.pGP-RRE3+pCMV-Rev 37h，8.pGP-RRE3+pCMV-Rev 48h，9.pSYNGP 12h，10.pSYNGP 25h，11.pSYNGP 37h，12.pSYNGP 48h，13.模拟转染的293T细胞。
图12表示总的和细胞质级份中的gag-polmRNA含量。总的和细胞质RNA是在用5微克gag-pol表达质粒(+/-1微克pCMV-Rev)转染之后36小时从293T细胞中提取的，而mRNA含量是通过Northern印迹分析估算的。使用互补于野生型和密码子优化型基因的1222-1503号核苷酸的探针。照片A表示相对于HIV-1gag-pol的带，照片B表示相当于人便在蛋白的带(用于将结果归一化的内在对照)，用磷光成像仪进行定量。泳道编号：c表示细胞质级份而t表示总RNA级份。泳道：1.pGP-RRE3，2.pGP-RRE3+pCMV-Rev，3.pSYNGP，4.pSYNGP+pCMV-Rev，5.pSYNGP-RRE，6.pSYNGP-RRE+pCMV-Rev，7.模拟转染的293T细胞，8.pGP-RRE3+pCMV-Rev，9.模拟转染的293T细胞，10.pSYNGP.
图13表示将WT gag插在密码子基因的下游对RNA和蛋白质含量的影响。将Wt gag序列沿两种方向插在密码子优化的基因的下游(NotI位点)，得到质粒pSYN6(正方向，参见图14)和pSYN7(反方向，参见图14)。将编码β-半乳糖苷酶(LacZ)的基因沿正方向插入相同位点(质粒pSYN8，参见图14)。用5微克每一种质粒转染293T细胞，并在转染48小时之后按上述方法，分别通过Northern和Western印迹分析测定mRNA和蛋白含量。
细胞质RNA级份的Northern印迹分析。用互补于密码子优化的基因的1510-2290号核苷酸的探针(I)检测所述印迹，并且用对人便在蛋白专一的探针再次检测(II)。泳道：1.pSYNGP，2.pSYN8，3.pSYN7，4.pSYN6。
Western印迹分析：用HIV-1阳性人血清检测gag-pol蛋白(I)，并用抗激动蛋白抗体作内部对照(II)。泳道：细胞裂解物：：1.模拟转染的293T细胞，2.pGP-RRE3+pCMV-Rev，3.pSYNGP，4.pSYN6，5.pSYN7，6.pSYN8.上清液：7.模拟转染的293T细胞，8.pGP-RRE3+pCMV-Rev，9.pSYNGP，10.pSYN6，11.pSYN7，12.pSYN8.在凝胶的侧面示出了蛋白标记(新英格兰实验室)大小。
图14表示用于研究HIV-1gag对密码子优化基因的影响的质粒。所有结构的主链是pCI-Neo。Syn gp：密码子优化的HIV-1 gag-pol基因。HXB2 gag：野生型HIV-1 gag基因。HXB2 gag，r：反方向的野生型HIV-1 gag基因。HXB2 gagΔATG：没有gag ATG的野生型HIV-1 gag基因。HXB2 gag-fr.sh.：具有移码突变的野生型HIV-1 gag基因。HXB2 gag625-1503：野生型HIV-1 gag基因的625-1503号核苷酸。HXB2 gah1-625：野生型HIV-1 gag基因的1-625号核苷酸。
图15表示将HIV-1 gag插在密码子优化基因上游对细胞质RNA的影响。细胞质RNA是在转染293T细胞48小时之后提取的(在某些场合下，用5微克每一种pSYN质粒和1微克pCMV-Rev进行共转染。将所使用的探针设计成互补于密码子优化基因的1510-2290号核苷酸(I)。用对人便在蛋白专一的探针作内部对照(II)。
泳道：1.pSYNGP，2.pSYN9，3.pSYN10，4.pSYN10+pCMV-Rev，5.pSYN11，6.pSYN11+pCMV-Rev，7.pCMV-Rev。
泳道：1.pSYNGP，2.pSYNGP-RRE，3.pSYNGP-RRE+pCMV-Rev，4.pSYN12，5.pSYN14，6.pSYN14+pCMV-Rev，7.pSYN13，8.pSYN15，9.pSYN17，10.pGP-RRE3，11.pSYN6，12.pSYN9，13.pCMV-Rev。
图16表示LMB对蛋白生成的影响。用1微克pCMV-Rev和3微克pGP-RRE3/pSYNGP/pSYNGP-RRE(+/-1μg pCMV-Rev)转染293T细胞。转染是重复进行的。在转染之后5小时，在第一组用新的培养基取代原有培养基，而在第二组用含有7.5nM LMB的新的培养基取代原有培养基。在20小时之后，裂解细胞，并通过Western印迹分析估算蛋白产量。用HIV-1阳性人血清检测gag-pol蛋白(A)并用抗激动蛋白抗体作内部对照(B)。泳道：1.pGP-RRE3，2.pGP-RRE3+LMB，3.pGP-RRE3+pCMV-Rev，4.pGP-RRE3+pCMV-Rev+LMB，5.pSYNGP，6.pSYNGP+LMB，7.pSYNGP+pCMV-Rev，8.pSYNGP+pCMV-Rev+LMB，9.pSYNGP-RRE，10.pSYNGP-RRE+LMB，11.pSYNGP-RRE+pCMV-Rev，12.pSYNGP-RRE+pCMV-Rev+LMB。
图17表示载体基因组的细胞质RNA含量。用10微克每一种载体基因组转染293T细胞。在转染之后48小时提取细胞质RNA。将来自每一种样品的20微克RNA用于Northern印迹分析。设计700bp探针用于与所有基因组RNAs杂交(参见材料和方法)。泳道：1.pH6nZ，2.pH6nZ+pCMV-Rev，3.pH6.1nZ，4.pH6.1nZ+pCMV-Rev，5.pHSlnZ，6.pHS2nZ，7.pHS3nZ，8.pHS4nZ，9.pHS5nZ，10.pHS6nZ，11.pHS7nZ，12.pHS8nZ，13.pCMV-Rev。
图18表示在MOI1下的转导效率。通过用每一种gag-pol表达质粒(5或0.5微克)，15微克pH6nZ或pHS3nZ(载体基因组质粒)和5微克pHCMVG(VSV外被表达质粒)对293T细胞进行共转染制备病毒原种。按以前披露的方法浓缩病毒(45)，并在m.o.i.’s0.01-1条件下测定对HT1080细胞的转导效率。在所有情况下，转导效率和m.o.i.之间都存在线性关系。在这里示出了在m.o.i.1的条件下的指示性图片。任意一种基因组、任意一种gag-pol和高或低含量的pSYNGP的转导效率都大于80％。浓缩之前的效价(I.U./ml)：对293T细胞：A.6.6×105，B.7.6×105，C.9.2×105，D.1.5×105，用于HT1080细胞：A.6.0×104，B.9.9×104，C.8.0×104，D.2.9×104。在浓缩之后对HT1080细胞的效价(I.U./ml)：A.6.0×105，B.2.0×106，C.1.4×106，D.2.0×105。
图21表示用不同的gag-pol结构获得的载体效价。通过用每一种gag-pol表达质粒，pH6nZ(载体基因组质粒)和pHCMVG(VSV外被表达质粒，每次转染用2.5微克)共转染293T细胞制备的病毒原种。通过在转导之后48小时用X-Gal染色计数兰色菌落的数量而测定的293T细胞的效价(I.U./ml病毒原种)。至少进行两次实验，两次实验之间的波动低于15％。
图22表示Rev/RRE(-)和(+)基因组的载体效价。按照实施例中所披露的方法制备逆转录病毒载体。在293T细胞中测定效价(I.U./ml病毒原种+SD)。
图23表示来自载体基因组的pHS系列的载体效价。按照实施例中所披露的方法制备逆转录病毒载体。在293T细胞中测定效价(I.U./ml病毒原种+SD)。所提供的Rev来自pCMV-Rev。应当指出的是，pH6nZ能表达Rev并含有RRE。没有其他的基因组能表达Rev或含有RRE。来自pSYNGP是Rev独立型的，而pGP-RRE3的表达是Rev依赖型的。
图24表示在有或没有Rev/RRE的条件下载体基因组的pHS系列的载体效价。按照实施例中所披露的方法制备逆转录病毒载体。使用5微克载体基因组，5微克pSYNGP和2.5微克pHCMVG，并在293T细胞中测定效价(I.U./ml)。实验至少重复进行两次，两次实验之间的波动低于15％。提供来自pCMV-Rev的Rev(1微克)。应当指出的是，pH6nZ能表达Rev并含有RRE。没有pHS基因组能表达Rev，并且只有pHS1nZR，pHS3nZR，pHS7nZR和pH6.1nZR含有RRE。来自pSYNGP的gag-pol表达是Rev独立型的。
图26表示293T的Western印迹，其中，通过SDS/Page电泳分离30：克总的细胞蛋白，转移到硝酸纤维素膜上，并且用EIAV抗体检测。二级抗体是抗马HRP(Sigma)。
图38是用lacZ生产单位(L.F.U.)/ml表示的效价。所使用的载体在有关柱上面的方框中标出。
为了便于参考，我们还示出了在所附录的序列表中所列举的序列：
SEQ ID NO：1表示菌株HXB2(保藏号K03455)的野生型gag-pol的序列；
SEQ ID NO：2表示pSYNGP的序列；
SEQ ID NO：3表示HIV-1 MN(Genbank保藏号M17449)的外被基因的序列；
SEQ ID NO：4表示SYNgp-160mn的序列-密码子优化的env序列；
SEQ ID NO：5表示pESYNGP的序列；
SEQ ID NO：6表示LpESYNGP的序列；
SEQ ID NO：7表示pESYNGPRRE的序列；
SEQ ID NO：8表示LpESYNGPRRE的序列；
SEQ ID NO：9表示pONY4.0Z的序列；
SEQ ID NO：10表示pONY8.0Z的序列；
SEQ ID NO：11表示pONY8.1Z的序列；
SEQ ID NO：12表示pONY3.1的序列；
SEQ ID NO：13表示pCIneoERev的序列；
SEQ ID NO：14表示pESYNREV的序列；
SEQ ID NO：15表示密码子优化的HIVgag-pol的序列；
SEQ ID NO：16表示密码子优化的EIAVgag-pol的序列；
SEQ ID NO：17表示pIRES1hygESYNGP的序列；
SEQ ID NO：18表示pESDSYNGP的序列；和
SEQ ID NO：19表示pONY8.3G FB29(-)的序列。
具体实施方式
例1-HIV
细胞系
在含有10％(v/v)胎牛血清并补充了L-谷氨酰胺和抗生素(青霉素-链霉素)的Dubecco’s改性的Eagle’s培养基中维持293T细胞(33)和Hela细胞(34)。293T细胞是从D.Baltimore(Rockefeller大学获得的)。
HIV-1原病毒克隆
使用pWI3(35)克隆和pNL4-3(36)。
包装系统的构建
在本发明的一个实施例中，使用修饰过的密码子优化的HIV env序列(SEQ ID NO：4)。相应的env表达质粒被，命名为pSYNgp160mn。修饰过的序列含有没有被利用的额外基序(37)。所述额外序列是从菌株MN的HIV env序列中提取的，并且进行过密码子优化。对所述核酸序列进行任何类似的修饰都能产生类似的作用，只要它使用相应于丰裕tRNAs的密码子就行(38)。
密码子优化HIV-1 gag-pol基因
通过将一系列短的重叠寡核苷酸(具有25％重叠的大约30-40聚体，即大约9个核苷酸)退火构建在SEQ ID NO：2的1108-5414号核苷酸所示的密码子优化的gag-pol基因。寡核苷酸是从R&D系统购买的(R&D Systems欧洲有限公司，4-10 The Quadrant，Barton Lane，Abingdon，OX14 3YS，英国)。密码子优化是用HXB-2菌株(AC：K03455)的序列进行的(39)。还包括用于优化翻译开始的Kozak共有序列。不对从gag的开始(1222号碱基)到gag的结束(1503号碱基)的片段进行优化，以便保持移码位点和gag和pol读框之间的重叠。它是来自克隆pNL4-3(在涉及到gag-pol基因内的碱基编号时，1号碱基是gag ATGA，它相当于从HXB2序列的起点开始算的790号碱基。在涉及到gag-pol以外的序列时，其编码表示从HXB2序列的开始部分酸的碱基，1号碱基相当于5’LTR的起点)。为了导入常见的限制位点，对优化进行一些改变。最终的密码子使用在图3b中示出，现在的密码子使用非常类似于高度表达的人的基因，并且与野生型HIV-1 gag-pol的表达明显不同。将该基因克隆到哺乳动物表达载体pCIneo(Promega)上的EcoRI-NotI位点上。所得到的质粒被命名为pSYNGP(图20，序列2)。对两条链上的基因进行的测序证实了没有任何错误出现。在图8中示出了密码子优化的和野生型HIVgag-pol序列之间的序列比较。
Rev/RRE结构
使用具有NotI限制位点的引物通过PCR由pWI3原病毒克隆扩增HIV-1RRE序列(HXB2序列的7769-8021号碱基)，并且随后克隆到pSYNGP的NotI位点上。所得到的质粒被命名为pSYNGP-RRE(RRE为正方向)和pSYNGP-ERR(RRE为反方向)。
假型原病毒颗粒
在一种形式的包装系统中，将一种合成的gag-pol框与异源外被编码序列共同表达。例如，所述蛋白可以是能够整合到HIV或EIAV颗粒中的(48)VSV-G(44，45)，双嗜性MLV env(46，47)或任何其他蛋白。其中包括能够将所述载体导向特定组织的分子。
HIV-1载体基因组结构
由pH4Z(49)衍生的pH6nZ是通过在载体基因组转录物的5’末端添加一个核苷酸取代pH4Z所缺少的一个额外的鸟嘌呤残基而产生的，从而优化逆转录。另外，编码β-半乳糖苷酶(LacZ)的基因被编码核定位β-半乳糖苷酶的基因所取代(我们感谢Enca Martin-Rendon和Said Ismail给我们提供pH6nZ)。为了构建Rev(-)基因组结构，我们进行了以下改进：a)去掉了pH6nZ上的1.8 kb PstI-PstI片段，得到质粒pH6.1nZ和b)用来自同一种质粒(pH6nZ)的SphI(填充的)-SphI片段取代EcoNI(填充的)-SphI片段，得到了质粒pH6.2nZ。在这两种情况下，都保留了gag内的序列(1-625号核苷酸)，因为业已它们在包装中起作用(93)。去掉RRE和任何残余的env序列。pH6.2nZ还含有env剪接受体，而pH6.1nZ没有。
还由pH6Z产生了一系列包括有或没有突变型主要剪接供体(SD)(GT→CA突变)的其他gag缺失的载体。这些载体是通过用具有NarI(5’引物)和SpeI(3’引物)位点的引物进行PCR制备的。将所述PCR产物插入pH6Z的NarI-SpeI位点。所得到的载体被命名为pHS1nZ(含有直到gag40的HIV-1序列)，pHS2nZ(含有直到gag260的HIV-1序列)，pHS3nZ(含有直到gag360的HIV-1序列)，pHS4nZ(含有直到gag625的HIV-1序列)，pHS5nZ(与pHS1nZ相同，但是有突变型SD)，pHS6nZ(与pHS2nZ相同，但是有突变型SD)，pHS7nZ(与pHS3nZ相同，但是有突变型SD)和pHS8nZ(与pHS4nZ相同，但是有突变型SD)。
另外，将RRE序列(HXB2序列的7769-8021号核苷酸)分别插入pH6.1nZ，pHS1nZ，pHS3nZ和pHS7nZ的SpeI(填充的)位点，得到了质粒pH6.1nZR，pHS1nZR，pHS3nZR和pHS7nZR。
对所述基因组所做的其他修饰包括制备SIN载体(通过缺失部分3’U3)用来自MLV的LTRs取代其中的LTRs，或者用MLV U3片段取代部分3’U3。
瞬时转染，转导和效价测定
按以前披露的方法进行上述操作(49，50)。简单地讲，将293T细胞接种到6厘米的培养皿上，并在24小时之后，通过过夜磷酸钙处理进行瞬时转染。在转染之后12小时更换培养基，并且除非特别声名，在转染之后48小时收获上清液，过滤(通过0.22或0.45微米的滤膜过滤)，并且通过转导293T细胞滴定。为此，将原有母液的适当稀释的上清液添加到293T细胞中(在转导之前24小时铺平板到6或12孔的平板上)向每一个孔中添加8微克/毫升Poltbrene(Sigma)，并在转导48小时之后通过X-gal染色测定病毒效价。
发光β-半乳糖苷酶(β-gal)测定
用发光β-gal报导系统(CLONTECH)对总细胞提取物进行上述测定。用未转染过的293T细胞作负对照，而用由pCMV-β-gal(CLONTECH)转染过的293T细胞作正对照。
RNA分析
在转染之后36-48小时，利用Rneasy微型试剂盒(QUIAGEN)从293T细胞中提取总RNA或细胞质RNA。按上述方法对5-10微克RNA进行Northern印迹分析(51)，通过将琼脂糖凝胶染色证实正确的分离。通过PCR由HIV-1pNL4-3原病毒克隆扩增互补于gag-pol基因的1222-1503号碱基的探针，并用于检测密码子优化的和野生型gag-pol mRNAs。同样通过PCR由质粒pSYNGP扩增互补于密码子优化基因的1510-2290号核苷酸的第二种探针。在本研究中所使用的互补于所有载体基因组的732 bp的片段是通过用SpeI-AvrII消化pH6nZ而制备成的。用对便在蛋白(CLONTECH)专一的探针将所述结果归一化。通过用α-32P dCTP(Amersham)进行随机标记(STRATAGENE)对所有探针进行标记。使用Storm磷光成像仪(分子动力学公司)对所述结果进行定量，并且示于图12中。在总的细胞级份中，可以清楚地看到47S rRNA前体，而在细胞质级份中没有这种前体。正如所预料的(52)，Rev能刺激野生型gag-polmRNA在细胞质中的积累(泳道1c和2c)。无论是在总的级份还是在细胞质级份中，与野生型相比，密码子优化基因的RNA含量都高出10-20倍(比较泳道3t-2t，3c-2c，10c-8c)。RRE序列不能明显使密码子优化的RNA去稳定，因为无论是否含有RRE序列密码子优化的RNA含量都相似(比较泳道3和5)。即使在含有RRE的情况下，Rev也不能显著增加密码子优化的gag-pol mRNAs在细胞质中的积累(RNA含量的差异不超过2倍，比较泳道3-4或5-6)。
通过比较图10和12可以看出，由syngp所导致的所有蛋白表达的提高都可以通过RNA含量的提高来解释。为了研究这一结果是否是因为细胞中RNA的饱和含量，我们将0.1，1和10微克的野生型或密码子优化的表达载体转染到293T细胞中，并且比较蛋白产量。在所有情况下，对于相同量的转染DNA来说，密码子优化基因的蛋白产量都高出10倍，并且蛋白含量的提高与每一种基因的转染DNA的量成正比。因此，加强了的密码子优化基因的表达似乎主要是由于存在于细胞质中的提高了的RNA含量，而不是由于加强了的翻译。蛋白分析
在转染之后48小时(除非另有说明)，用碱性裂解缓冲液由293T细胞制备总的细胞裂解物。为了从细胞上清液中提取蛋白，首先让上清液通过0.22微米的滤膜，并且通过以21,000g将1毫升上清液离心30分钟收集载体颗粒。用PBS洗涤沉淀，然后重新悬浮在少量(2-10ìl)裂解缓冲液中。在SDS 10-12％(v/v)聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白。将蛋白专一到硝酸纤维素膜上，然后依次用1∶500的HIV-1阳性人血清(AIDS试剂项目，ADP508，照片E)稀释液和1∶1000辣根过氧化物酶标记过的抗人IgG(Sigma，A0176)检测所述膜。用ECL或ECL-+Western印迹检测试剂(Amersham)显现蛋白。为了证实蛋白加样相等，对所述膜进行剥离，并用1∶1000的抗激动蛋白抗体(Sigma，A2066)的稀释液再次检测，然后用1∶2000的辣根过氧化物酶抗兔IgG(载体实验室PI-1000)的稀释液检测。
gag-pol基因产物的表达和载体颗粒生产
将野生型gag-pol(pGP-RRE3-图19)(49)和密码子优化的表达载体(pSYNGP，pSYNGP-RRE和pSYNGP-ERR)瞬时转染到293T细胞中。转染是在有或没有Rev表达载体pCMV-Rev的条件下进行的(53)，以便评估表达对Rev的依赖性。对细胞裂解物和上清液进行Western印迹分析，以便评估蛋白产量，结果如图10所示。正如所预料的(54)，野生型基因的表达仅出现在提供反式Rev的情况下(泳道2和3)。相反，在使用密码子优化的gag-pol时，在有和没有Rev的条件下都能进行高水平表达(泳道4和5)，这表明在该系统中，不需要Rev。密码子优化基因的蛋白含量比野生型gag-pol的高(比较泳道4-9和泳道3)。细胞上清液中的差异比细胞裂解物中的差异更明显(通过用磷光成像仪定量测定证实，密码子优化基因的蛋白含量比野生型基因的大约高10倍)。
在以前的研究中已经将RRE包括在gag-pol表达载体中，对这种载体作过工程改造，以便去掉INS序列，含有RRE会导致蛋白含量降低，通过提供反式Rev能恢复这种降低。在我们看来，RRE在完整的密码子优化的gag-polmRNA中的存在不会影响蛋白含量，并且提供反式Rev，不会进一步增强表达(泳道6和7)。
为了比较野生型和密码子优化基因之间的翻译速度，在转染到293T细胞中之后以若干时间间隔测定由野生型和密码子优化型表达载体进行的蛋白表达。通过Western印迹分析测定蛋白产量和颗粒形成，其结果如图11所示。在所有时间点上，密码子优化的gag-pol的蛋白产量和颗粒形成都高出10倍。
为了进一步确定在密码子优化基因上观察到的上述增强了的表达是由于更好地翻译或者是由于对RNA的影响，进行了RNA分析。
使用密码子优化的gag-pol基因的载体生产效率
为了确定密码子优化的gag-pol对载体产量的影响，我们将HIV载体基因组、pH6nZ和VSV-G外被表达质粒pHCMVG(113)与pSYNGP，pSYNGP-RRE，pSYNGP-ERR或pGP-RRE3组合使用，作为gag-pol的来源，在用三种质粒对293T细胞进行共转染时，质粒的比例为2∶1∶2(49)。通过Western印迹分析评估完整细胞提取物和培养上清液中gag和gag-pol基因产物的存在。正如所预料的(图10)，与野生型相比，密码子优化基因的颗粒产量高出5-10倍。
为了确定密码子优化的gag-pol基因对载体效价的影响，使用若干种比例的载体成分，结果如图21所示。当gag-pol是该系统的限制因素时(通过在野生型基因上观察到的效价降低确定)，密码子优化载体的效价高出10倍。这一结果与这种载体上所出现的较高的蛋白产量吻合，不过，它表明在载体生产的正常情况下，gag-pol是饱和的，并且密码子优化不会增加产量优势。
HIV-1 gag INS序列对密码子优化基因的影响是位置决定型的
以前业已证实，将野生型HIV-1 gag序列插在诸如HIV-1 tat(56)，HIV-1gag(55)或CAT(57)的其RNA的下游会导致稳态mRNA含量的急剧下降，推测这是由于INS序列造成的。在其他情况下，例如，对于β-珠蛋白来说(58)，证实所述影响是剪接位点决定型的。出现在不稳定mRNA的3’UTR上的细胞AREs(富含AU的因子)，可以通过诱导转录物的细胞质脱腺苷酸化而将mRNA去稳定(59)。为了验证HIV-1 gagINS序列是否会将密码子优化的RNA去稳定化，通过PCR通过原病毒克隆pW13扩增了野生型HIV-1 gag序列或其部分(1-625号核苷酸或625-1503号核苷酸)。将所有片段的末端补平，并插入pSYNGP或pSYNGP-RRE的补平了的EcoR1或NotI位点(位于密码子优化的gag-pol基因的上游或下游)。作为对照也要将wt HIV-1 gag沿反方向(因为业已证实INS序列以方向决定型方式起作用)(57)(pSYN7)和从质粒pCMV-βgal(CLONTECH)上切除的lacZ(沿正方向)(pSYN8)插入相同位点。与我们的预料相反，如图13所示，野生型HIV-1 gag序列似乎不能对密码子优化基因的RNA或蛋白含量产生明显影响。我们进一步构建了的另一个序列的质粒(通过PCR由相同的质粒制备)，其中将正方向或反方向的野生型HIV-1gag、gag的亚片段(1-625号核苷酸或625-1503号核苷酸)，没有ATG或在ATG下游25个碱基处有一个密码突变的野生型HIV-1 gag，或LacZ的72-1093号核苷酸(从质粒pH6Z中切除)，或有或没有ATG lacZ的前1093号碱基插在pSYNGP和/或pSYNGP-RRE的密码子优化的HIV-1 gag-pol基因的上游(pSYN9-pSYN22，图14)。Northern印迹分析证实，将野生型HIV-1 gag基因插在密码子优化的HIV-1 gag-pol的上游(pSYN9，pSYN10)，在有或没有Rev/RRE的条件下会导致RNA含量降低(图15A，泳道1-4和图15B，泳道1+12)。以上作用不取决于翻译，因为插入缺乏ATG或具有移码突变的野生型HIV-1 gag(pSYN12，pSYN13和pSYN14)同样会降低RNA含量(图15B，泳道1-7)。Western印迹分析证实，没有pSYN12-14的HIV-1 gag翻译产物。不过，由于wt HIV-1 gag具有上述负面密码子使用，也有可能它起着syngp的非翻译的长的5’前导序列的作用，如果情况真是这样的话，ATG突变就没有任何作用。
插入野生型HIV-1 gag基因的较小的部分(pSYN15和pSYN17)也会导致RNA含量降低(图15B，泳道1-3和8-9)，但是其含量不会降低到在使用gag序列时的程度(图15B，泳道1-3，4-7和8-9)。这表明INS序列的作用取决于它的大小。沿反方向插入野生型HIV-1 gag(pSYN11)对RNA含量没有影响(图15A，泳道1和5-6)。不过，根据RNA的大小(与密码子优化的gag-pol RNA的大小相等)以及通过翻译产物(gag-pol，通过Western印迹分析证实与pSYNGP等量)，在这种情况下似乎发生了剪接事件。
因此，以上资料表明，野生型HIV-1 gag不稳定性序列以位置和大小决定型方式起作用，有可能与翻译无关。还应当指出的是，RRE不能通过与Rev相互作用挽救去稳定化的RNA。
构建缺乏所有附属蛋白的基于HIV-1的载体系统
到目前为止，业已报导了若干种除了Rev之外缺乏所有附属蛋白的基于HIV-1的载体系统(49，60)。我们希望研究，所述密码子优化的基因是否可用于构建缺乏所有附属蛋白的基于HIV-1的载体系统。我们首先去掉了rev/RRE和所有其余的env序列，不过保留了gag的头625个核苷酸，因为业已证实它们能在有效包装中发挥作用(61)。制备了两种载体基因组结构pH6.1nZ(只保留了HIV序列到gag的625号核苷酸)和pH6.2nZ(与pH6.1nZ相同，但是还保留了env剪接受体)。以上结构是由常见的含有RRE的并且表达Rev的HIV载体基因组(pH6nZ)产生的。我们的3质粒系统现在只能表达HIV-1 gag-pol和VSV-G外被蛋白。按照在前面部分所披露的方法测定载体颗粒的效价。所使用的载体基因组(pH6Z或pH6.1 nZ或pH6.2nZ)∶gag-pol表达载体(pGP-RRE3或pSYNGP)∶pHCMV-G的比例为2∶2∶1。在有或没有pCMV-Rev的条件下进行转染，因为对于野生型基因来说gag-pol表达仍然是Rev决定型的。以上结果归纳在图22中，并且证实在完全缺乏Rev的条件下能够产生HIV载体，但是其最高效价受到损害，比在有Rev的条件下所获得的效价低20倍。由于在提供反式Rev的条件下，pSYNGP与pH6nZ或pH6.1nZ或pH6.2nZ(因为它是Rev决定型的)，以及pGP-RRE3的gag-pol表达相同，我们推测所述基因组仍然需要Rev，并因此限制了其效价。为了证实这一点，对在有或没有pCMV-Rev的条件下由用pH6nZ或pH6.1nZ转染过的细胞制备的细胞质RNA进行Northern印迹分析。如图17的泳道1-2所示，来自pH6nZ的细胞质RNA的含量比来自pH6.1nZ的含量高5-10倍(比较泳道1-2和泳道3-4)。以上结果支持这样的看法，即由所述载体基因组所产生的RNA需要所述Rev/RRE系统，以便确保高的细胞质含量。这可能是因为RNA从细胞核中输出的效率不高，因为仍然存在留在gag内的INS序列。
因此，为了恢复效价有必要进一步去掉所述载体基因组中的gag序列。迄今为止，业已报导的有效包装需要仍然保留了env序列的在载体上含有gag的360(62)或255(63)个核苷酸，或者在与剪接供体突变、gag和env缺失的特殊组合中需要gag的大约40个核苷酸(64，63)。为了消除我们的载体基因组对Rev.RRE的需要而又不损害有效包装，我们构建了一系列来自pH6nZ的载体，这些载体含有逐渐增加的HIV-1序列的缺失(只保留了gag上游和内部的序列)，有和没有突变型主要剪接位点(SD)(GT→CA突变)。按上述方法测定载体颗粒效价，并将结果归纳在图23中。正如所看到的，缺失gag中的最多360个核苷酸(载体pHS3nZ)会导致效价的提高(与pH6.1nZ或pH6.2nZ相比)，并且与pH6nZ相比只降低了5倍(效价为1.3-1.7×105)。进一步的缺失会导致效价低于pHS3nZ，而与pH6.1nZ相似。另外，SD突变不会对载体效价产生正面影响，并且对于pHS3nZ来说，它会导致效价降低10倍(比较图23中pHS3nZ和pHS7nZ的效价)。对细胞质RNA进行的Northern印迹分析(图17，泳道1和5-12)证实，pH6nZ的RNA含量确实较高，它可以解释在该载体上所出现的最高的效价。pHS1nZ(泳道5)，pHS2nZ(泳道6)和pHS3nZ(泳道7)的RNA含量相等，而pHS3nZ的效价高出5-8倍。Gag的进一步的缺失(与pHS3nZ相比)，有可能导致包装效率较低(因为对于HIV-1来说，包装信号延伸到gag中)。并且因此即使所有三种载体都产生相似量的RNA，但只有pHS3nZ保留了最高的包装效率。同样另人感兴趣的是，SD突变会在细胞质中导致RNA含量提高(比较图17中的泳道6和10，7和11或8或12)，但是具有相同或较低的效价(图23)。发生突变的GT双核苷酸位于包装信号的SL2的茎干上(65)。业已报导过SL2对于HIV-1 RNA衣壳化可能不是很重要(65，66)，而SL3具有很重要作用(67)。用RNA绘图软件程序将野生型和SD突变型载体序列折叠，发现所述突变明显改变了该RNA的二级结构，而不仅仅是改变SL2的结构。因此，可能的情形是，尽管SD突变会提高细胞质RNA含量，但它不能提高效价，因为它改变了包装信号的二级结构。
为了研究在Rev-载体上所观察到的效价差异是否确实因为其基因组的Rev依赖性，将RRE序列(HXB2序列的7769-8021号核苷酸)分别插在pH6.1nZ、pHS1nZ，pHS3nZ和pHS7nZ的SpeI位点上(gag序列的下游，并且紧挨着内部CMV启动子的上游)，得到了质粒pH6.1nZR，pHS1nZR，pHS3nZR和pHS7nZR。按上述方法，在有或没有Rev(pCMV-Rev)的条件下，用pSYNGP和pHCMVG测定载体颗粒效价，并将结果归纳在图24中。在没有Rev的条件下，进一步损害了pH6.1nZR(是pH6.1nZ的7倍)，pHS3nZR(是pHS3nZ的6倍)和pHS7nZR(是pHS7nZ的2.5倍)的Rev效价。这是预料之中的，RRE同样起着不稳定性序列的作用(68)，并因此预计它会产生Rev依赖性。在有Rev的情况下，将pHS3nZR(5×105)和pH6.1nZR(2×105)效价被恢复到pH6nZ上所观察到的最高效价。在有Rev的情况下，pHS7nZR的效价没有得到恢复。这一结果支持了下面的假说：即pHS7nZ上的SD突变影响了其包装信号的结构，并因此影响该载体基因组的包装能力，因为在这种情况下，Rev可能能够刺激pHS3nZR和pH6.1nZR的载体基因组RNA含量，不过，它不能影响所述包装信号的二级结构。对于含有RRE的载体pHS1nZ来说，不会导致效价降低。这可能是由于以下事实：pHS1nZ只含量gag序列的40个核苷酸，因此，即使存在RRE，所述不稳定序列的大小也不会超过pHS2nZ，后者能产生与pHS1nZ相同的效价。Rev能部分恢复pHS1nZR的效价(比pHS1nZ提高了10倍，而比pH6nZ降低了8倍)，但是不能像在pHS3nZ中那样完全恢复。这一结果同样与这样的假设吻合：HIV-1 gag序列的40个核苷酸可能不足以进行有效的载体RNA包装，并且这一假说可以解释在有Rev的条件下pHS1nZR的效价部分恢复而不是完全恢复。
另外，在HeLa和HT1080人细胞系上用pSYNGP测定pHS3nZ和pH6nZ的最终效价。在这两种情况下，其效价都遵循在293T细胞中观察到的模式，pHS3nZ比pH6nZ低2-3倍(参见图10)。最后，用HT1080细胞测定了用pHS3nZ或pH6nZ和不同量的pSYNGP或pGP-RRE3以不同的m.o.i.’s(最高为1)产生的载体转导效率。之所有进行该实验，是因为由pSYNGP进行的高水平gag-pol表达可能导致由高载体浓度的无基因组颗粒的干扰。正如所预料的，对于VSVG假拟逆转录病毒颗粒来说(69)，转导效率与m.o.i.’s相关是使用大量或少量pSYNGP以及是使用pH6nZ或pHS3nZ。对于m.o.i.1来说，在所有场合下的转导效率都为大约50-60％(图18)。以上结果表明，在该实验系统中没有出现由无基因组颗粒导致的干扰。
密码子优化的gag-pol基因不使用输出蛋白-1核输出途径
Rev通过核输出受体输出蛋白-1(CRM1)介导未剪接过的和单一剪接过的HIV-1 mRNA的输出(70，71，72，73，74)。业已证实细霉素B(LMB)能通过破坏输出蛋白-1/NES/RanGTP复合体的形成来介导抑制富含亮氨酸的NES介导的核输出(75，72)。具体地讲，LMB能抑制Rev和Rev依赖型HIV mRNAs的细胞核-细胞质转运(76)。为了研究输出蛋白-1是否能介导密码子优化的gag-pol结构的输出，测定了LMB对蛋白产量的影响。对来自用gag-pol结构(+/-pCMV-Rev)转染过的并且用或不用LMB处理(7.5nM，20小时，在转染之后5小时开始处理)的细胞的细胞裂解物进行Western印迹分析。为了证实LMB对转运没有总的影响，还测定了来自对照质粒pCMV-βGal的βGal表达。为了解决样品之间的蛋白波动，使用一种激动蛋白内部对照。结果如图16所示。正如所预料的(76)，在有LMB的情况下，野生型gag-pol不表达(比较泳道3和4)，而LMB对来自密码子优化的gag-pol的蛋白产量没有影响，无论在转录物中是否存在RRE并且提供反式Rev(比较泳道5和6，7和8，9和10，11和12，5-6和11-12)。密码子优化的gag-pol的表达对LMB抑制作用的抗性表明没有利用所述输出蛋白-1途径，并且，因此必然使用了另外的输出途径。这样就提供了对Rev独立型表达的一种可能的解释。无功能Rev/RRE相互作用的存在不能影响表达这一事实暗示了RRE本身并不一定起着抑制(例如，核保留)信号的作用，这一结果与以前的观察吻合(5，58)。
总之，这是包括pSYNGP，pHS3nZ和pHCMVG的基于HIV-1的载体系统的第一例报导，其中，显著的载体生产可以在缺乏所有附属蛋白的情况下完成。以上结果表明，为了获得最大的效价，必须将HIV载体基因组设计成保持能有效包装，并且这样就需要保留gag序列以及剪接位点。通过将pHS3nZ中的gag序列降低到360个核苷酸，并且将它与pSYNGP结合，就有可能获得至少105 I.U./ml的效价，该效价仅仅比在有Rev的条件下所获得的最高水平低5倍。
例2-EIAV
密码子优化的EIAV gag-pol表达框
我们还验证了密码子优化过程是否会改变非灵长类慢病毒EIAV的gag-pol基因的性质。所述序列是在SEQ ID NO：5的1103-5760号核苷酸所示的密码子优化的基因(图9)。野生型和密码子优化型序列分别被称为WT和CO。将密码子使用改变成高度表达的哺乳动物基因。pESYNGP(图27和SEQID NO：5)是通过转移来自密码子优化的EIAV gag/pol基因的质粒的XbaI-NotI片段转移到pCIneo(Promega)而制备成的，所述质粒是由操纵子技术公司合成的(Alameda，CA)。所述基因是以专有质粒主链GeneOp形式提供的。所述转移到pCIneo中的片段包括所述密码子优化的EIAV gag/pol ORF旁侧的序列：tctagaGAATTCGCCACCATG-EIAV gag/pol-TGAACCCGGGgcggccgc。ATG起始密码子和TGA终止密码子用粗体表示，而XbaI和NotI位点的识别序列用小写字母表示。
通过瞬时转染HEK 293T细胞，与来自各种野生型Gag/Pol表达结构进行比较，评估了来自所述密码子优化基因的Gag/Pol的表达(图25)。转染是使用磷酸钙技术进行的，使用等摩尔数的每一种Gag/Pol表达质粒，以及能表达来自野生型序列或来自密码子优化形式的基因的EIAVRev的质粒：分别为：pCIneoEREV(W0 99/32646)(图35和SEQ ID NO：13)或pESYNREV(图36和SEQ ID NO：14)。pESYNREV是基于pCIneo的质粒(Promega)，该质粒是通过将EcoRI导入来自由操纵子技术公司(Alameda，CA)制备的合成EIAV REV质粒中而制备成的。所述质粒主链是专有的质粒GeneOp，其中，插入了密码子优化的EIAV REV基因，该基因的旁侧是EcoRI和SalI识别序列，以及Kozak共有序列，以便启动该基因的有效表达。通过添加pCIneo质粒，使每一次转染的DNA的质量相等。在去掉了Rev表达质粒的转染中，用类似量的pCIneo(Promega)来取代它(标有pCIneo的泳道)。在转染之后48小时制备细胞质提取物，并通过SDS-PAGE分离15微克的蛋白，然后转移到HybondECL上。用来自EIAV感染的马的多克隆抗血清检测所述Western印迹，然后用抗马辣根过氧化物酶缀合物的二级抗体进行检测。所述印迹的显影是用ECL试剂盒(Amersham)进行的。表明了用于吸印和显影过程的阳性对照以及来自未转染过的HEK 293T细胞的细胞质提取物。
进行了来自各种质粒的野生型gag/pol的表达(参见图25)。pONY3.2T是pONY3.1的衍生物(WO 99/32646)(图34和SEQ ID NO：12)，其中，产生了能破坏Tat和S2表达的突变。另外，在rev的第二个外显子下游将EIAV序列截短。另外，通过缺失tat的外显子2中的83个核苷酸破坏了Tat的表达，相当于缺失了野生型EIAV序列(保藏号U01866)中的5234-5316号核苷酸。通过缺失相当于保藏号U01866的5346-5396号核苷酸的51个核苷酸破坏了S2 ORF的表达。缺失了相当于保藏号U01866的7815号核苷酸位置下游的EIAV序列。以上变化没有改变rev，因此该基因的表达与pONY3.1相同。pONY3.2 OPTI是pONY3.1的衍生物，它具有上文所述的用于破坏Tat和S2表达的相同的缺失。另外，为了在人细胞中表达，业已对gag的头372个核苷酸进行密码子优化。在图43中比较了野生型序列和存在于pONY3.2OPTI中的密码子优化的序列。标明了这两个序列之间的差别。密码子优化的部分表示所述载体和野生型gag/pol表达结构之间的重叠部分。预计降低该部分的同源性，能提高所述载体系统的安全特性，因为降低了所述载体基因组和gag/pol转录物之间发生重组的可能性。3.2 OPTI-Ihyg是3.2 OPTI的衍生物，其中，将3.2 OPTI的SnaBI-NotI片段转移到了通过消化相同的位点而制备的用于连接的pIRES1hygro(Clontech)上。因此，gag/pol基因位于IRES潮霉素磷酸转移酶上游。要注意的事实是，所得到的结构含有pCIneo的内含子，而不是来自pIRES1hygro。pEV53B是PEV53A的衍生物(WO 98/51810)，其中，缩小了Gag起始密码子上游的EIAV衍生的序列，使它只包括所述主要剪接供体和旁侧序列：CAG/GTAAGATG，其中，Gag起始密码子用黑体表示。
结果(图26)证实，来自pHORSE3.1(WO 99/32646)的Gag/Pol表达的Rev依赖性，它具有一个始于引物结合位点下游的EIAV衍生的前导序列，以及位于gag/pol下游的RRE，它包括被报导具有RRE活性的两个EIAV序列。在用野生型(pCIneoERev)(图35)或密码子优化的(pESYNREV)(图36)基因启动Rev的表达时，表达能提高相同的量。这一结果证实了密码子优化的Rev表达质粒的功能。
与来自pONY3.1的Gag/Pol的表达不同，来自pESYNGP的表达不受Rev存在的影响，不过，它的表达略低于来自pONY3.1或pON3.2T的表达。来自pESYNGPRRE(图30和SEQ ID NO：7)的表达(其中，出现在pHORSE3.1中的EIAV RRE序列位于gag/pol，的下游)似乎略低于来自pESYNGP的表达。来自3.2 OPTI和3.2OPTI-Ihyg的表达水平明显低于pESYNGP或pONY3.1的表达水平，即使是存在Rev也是这样。这一结果表明，在gag的头372个核苷酸中可能存在Gag/Pol表达的决定子，并且证实，3.2 OPTI不可能被用作EIAV载体生产的基础。另外证实，仅仅对整个gag/pol基因的某些部分进行密码子优化，可能不会导致高水平的Rev独立型表达。
早先我们业已证实(43)，5′前导序列(ATG起始密码子上游121bp)和RRE序列(43)对于野生型EIAV gag-pol的高度表达来说是重要的，制备了三种结构，这种结构要么含有所述前导(LpESYNGP)，要么含有前导序列和RRE序列(LpESYNGPRRE)，或者是RRE序列(pESYNGPRRE)。所述结构的序列示于SEQ ID NOS：6-8以及图28-30中。在有或没有Rev表达质粒的情况下，将其转染到293T细胞中。然后通过常规的RT测定，测定细胞上清液中逆转录酶活性(RT)，以便评估哪一种结构能产生最大量的gag-pol mRNA。结果图如39和40所示。以上结果表明，所述5’前导序列能导致RT活性的提高。还通过瞬时转染HEK 293细胞测定了所述Gag/Pol表达结构支持传染性载体颗粒形成的能力。该分析的结果表明，以上所有结构都能提供有功能的EIAVGag/Pol，并且证实了不编码任何EIAV蛋白的pONY8.0Z载体基因组质粒的Rev独立性(图41)。
还评估了pESYNGP与最小EIAV载体基因组质粒pONY8.1Z(图31，SEQID NO：11)一起起作用的能力(图42)。结果表明，用pESYNGP和pONY8.1Z所获得的效价比由pONY3.1和pONY8.1Z获得的结果低大约10倍。这种降低了的效价反映了是该系统中Rev蛋白的缺乏而不是我们已经证实的Gag/Pol生产的缺陷是Rev表达依赖型的。
还测定了来自pESDSYNGP的EIAV Gag/Pol的表达(图50和SEQ IDNO：18)，其中，Gag的Kozak共有序列被天然EIAV剪接供体所取代。PESDSYNGP是通过用消化一种PCR产物而产生的308bp的EcoRI-NheI片段取代从gag/pol起始密码子上游到gag/pol ORF内部大约300个碱基对的306bp的EcoRI-NheI片段，而由pESYNGP制成的，所述PCR产物是用pESYNGP作模板，并且使用以下引物制备的：SD正向[GGCTAGAGAATTCCAGGTAAGATGGGCGATCCCCTCACCTGG]和SD反向[TTGGGTACTCCTCGCTAGGTTC]。用出现在EIAV中的剪接供体取代了pESYNGP的ATG上游的Kozak共有序列。因此，EcoRI位点和ATG的gag/pol之间的序列是CAGGTAAG，与天然病毒序列中的序列完全相同。因此，所述mRNA缺失了剪接供体上游而不是下游的序列。通过使用基于Taqman的产物增强的逆转录酶(PERT)测定来自瞬时转染的HEK 293T细胞的上清液中的逆转录酶活性，评估了pESDSYNGP相对pESYNGP和其他表达质粒的性能。在该方法中，与载体颗粒相关的逆转录酶是通过温和的洗涤剂处理释放的，并用MS2噬菌体RNA作模板来合成cDNA。MS2 RNA模板和引物是过量使用的，因此，cDNA的量与从所述颗粒中释放的RT的量成正比。因此，所合成的eDNA的量与颗粒的数量成正比。然后通过Taqman技术对MS2cDNA进行定量。对测试样品的测定是与具有已知效价的载体原种同时进行的，并估算颗粒含量。由于使用了标准误，可以制成标准曲线，并可以计算各种样品的相对RT含量。该分析的结果如图49所示。结果表明，来自pESYNGP和pESDSYNGP的Gag/Pol表达基本相同。该结果还表明，Rev不能明显增强表达。通过用pHORSE+获得的结果证实Rev表达质粒的活性，其中，在野生型EIAV gag/pol下游有一个RRE，并且证实了在有Rev的情况下表达提高了6倍。我们还发现，在有Rev的条件下，来自pHORSE的表达提高了3倍。由于该结构没有RRE，这表明Rev对可能对表达非专一性增强作用，可能是在该实验系统中被高水平表达的结果。
通过以前所披露的方法(49，50)瞬时转染HEK 293T评估在与载体基因组和外被的质粒共转染时，pESYNGP参与形成传染性病毒载体颗粒的能力。简单地讲，将293T细胞接种到6厘米的培养皿(1.2×106/皿上)，并且在24小时之后通过磷酸钙方法进行转染。转染之后12小时更换培养基。并在转染之后48小时收获上清液，过滤(0.45微米滤膜)，并通过在有8微米/毫升Polybrene(Sigma)的条件下转导D17犬骨肉瘤细胞进行滴定。在用于滴定测定之前，以0.9×105/孔的密度将细胞接种在12孔平板上。用完全培养基(DMEM/10％FBS)制备上清液稀释液，并将0.5ml的样品铺在D17细胞上。在添加载体4小时之后，再向所述培养基中补充另外1毫升培养基。在添加病毒稀释液48小时之后，通过对细胞进行X-gal染色评估转导。
用于上述实验的载体基因组是pONY4.0Z(图31和SEQ ID NO：9)和pONY8.0Z(图32和序列SEQ ID NO：10)。
pONY4.0Z(WO 99/32646)是通过用巨细胞病毒立即早期启动子(pCMV)取代5’LTR中的U3区而由pONY2.11Z产生的。上述目的是以这种方式实现的：由CMV启动子所产生的转录物的第一个碱基相当于所述R区的第一个碱基，正如早先业已披露过的(50)，这种操作会导致在转导的细胞中，特别是在HEK 293T细胞中产生高水平的载体基因组。pONY4.0Z能表达除了外被蛋白以外的所有EIAV蛋白，外被蛋白的表达是通过缺失出现在env上的HindIII位点之间的736个核苷酸而破坏的。
pONY8.0Z是通过导入突变由pONY4.0Z产生的，它能1)通过缺失tat的外显子2上的83个核苷酸抑制TAT表达，2)通过缺失51个核苷酸抑制S2ORF表达，3)通过缺失rev的外显子1的内的一个碱基抑制REV表达，以及4)通过在ATG起始密码子中从而将ATG的序列改变成ATTG而插入T抑制gag的N-末端的表达。对于野生型EIAV序列保藏号U01866来说，以上缺失相当于5234-5316号核苷酸、5346-5396号核苷酸以及5538号核苷酸。T残基是插在526和543号核苷酸之后。
该分析的结果的以表格的形式在图37中示出，并在图38中绘成曲线。转染是仅仅用三种质粒(载体基因组，gag/pol表达质粒和VSV-G表达质粒)进行的-加斜线的柱，或者是用四种质粒进行的，其中包括前面的三种质粒和编码Rev的另一种质粒或不编码功能性蛋白的类似质粒-实心柱。结果表明，用pESYNGP补充EIAV Gag/Pol能够获得高效价的载体。最高的效价是用Rev-表达载体基因组质粒pONY4.0Z获得的，该效价仅仅略低于在用pONY3.1补充Gag/Pol时所观察到的效价。与pONY3.1相比，在使用pESYNGP时，用pONY8.0Z载体基础组质粒所观察到的效价较低。这是因为Rev表达需要pONY8.0Z。Rev是由pONY3.1表达的，而不是由pESYNGP表达的。以上结果证实了密码子优化的Gag/Pol表达质粒的用途。
用合成的EIAV gag/pol基因构建能稳定表达EIAV gag/pol的细胞系
为了构建EIAV载体的包装和生产细胞，需要能表达大量EIAV Gag/pol的细胞系。作为这种构建的第一步，用pIRES1hygESYNGP(图44和SEQ IDNO：17)稳定地转染HEK293细胞，其中，EIAV Gag/pol表达是由CMVQ启动子启动的，并且与一个ORF连接，以便通过EMCV IRES表达潮霉素磷酸转移酶。pIRES1hyg ESYNGP是按以下方法制备的。将合成的EIAV gag/pol基因和旁侧序列从pESYNGP中转移到pIRES1hygro表达载体(Clontech)上。首先，用EcoRI消化pESYNGP，并通过用T4DNA聚合酶处理补平末端，然后用NotI消化。为了与该片段连接，通过以下方法制备pIRES1hygro：用NsiI消化，通过用T4 DNA聚合酶补平末端，然后用NotI消化。在转染到HEK 293细胞中之前，用AhdI消化pIRES1hyg ESYNGP，这种消化能使该质粒线性化。
通过系列稀释制备无性细胞系，并通过基于Taqman的产品增强的逆转录酶(PERT)测定分析Gag/Pol的表达。示出了能表达最高含量的Gag/Pol的细胞系Q3.29的数据。以上分析证实，来自Q3.29中的密码子优化的EIAVGag/Pol框的表达水平与EIAV生产系8Z.20的表达水平非常相似，其中，Gag/Pol是由pEV53B野生型表达框表达的，并且所产生的载体颗粒的效价大约为106转导单位/毫升(图45)。假设在所述测定期间为指数扩增，Ct值的1.0的差异相当于从颗粒中释放的逆转录酶的浓度相差2倍，因此，Q3.29和8Z.20细胞之间的Gag/Pol表达的差异大约为2-8倍。另外，所述观察到的Ct值表明，Gag/Pol的表达水平略高于pONY8G载体颗粒的样品的表达水平，它在D17细胞上的效价为2×106转导单位/毫升，不过是通过瞬时转染HEK 293T细胞而制备的。以上结果表明，所述密码子优化的EIAV Gag/Pol结构可用于构建EIAV包装和生产系，并且证实以前的有关表达是不依赖于Rev表达的结果。
然后在用载体基因组质粒pONY8.0Z，和VSV-G外被表达质粒，pRV67和EIAV REV表达质粒pESYNREV转染时，检测Q3.29细胞系支持传染性载体颗粒生成的能力。另外，我们还评估了pONY8.3G FB29(-)的性能，该质粒是pONY8G载体基因组质粒的改进形式。PONY8G是用于比较目的的标准EIAV载体基因组。在PCT/GB00/03837中披露了pONY8.3G FB29(-)(SEQ ID NO：19)的改进和结构，并且可以扼要地归纳如下：1)将loxP识别位点导入载体基因组框的上游和下游，2)插入一个来自pESYNREV密码子优化的REV的表达框，该表达框是由该载体基因组框下游的FB29 U3启动子启动的，并且其定向使得转录的方向朝向该载体基因组框。REV表达框位于3’loxP位点上游，因此，pONY8.3G FB29-是具有载体基因组RNA和EIAVRev的表达框的质粒。
通过有限稀释用D17犬骨肉瘤细胞确定其效价，并且示于图46中
由转染2-6所获得的效价高达4.5×106转导单位/毫升，表明Gag/Pol表达的水平足于支持至少这种高度的效价。在补充额外的Gag/Pol时，没有实现效价的进一步提高(转染1)，表明Gag/Pol表达不是效价的制约因素。
由于来自密码子优化的表达结构的Gag/Pol的表达而改善了的安全特性
通过载体系统的不同成分之间的重组，或者通过载体系统成分与生产细胞中的核苷酸序列之间的重组形成RCR。尽管在构建生产细胞系期间在DNA水平上的重组是可能的(有可能会导致内源逆转录因子或逆转录病毒的插入活化)，但一般认为产生RCR的重组主要发生在进行逆转录的RNA’s之间，因此，是在成熟载体颗粒中进行的。结果，重组更可能发生在含有包装信号的RNA’s之间，如所述载体基因组和gag/pol mRNA。不过，gag/pol转录物通常是修饰过的，以便它缺失了某些或全部的特定包装因子，因此降低了它参与重组的机会。
用于制备HIV和EIAV Gag/Pol表达质粒pSYNGP和pESYNGP的密码子优化方法还会导致序列和结构的破坏，因为在每隔大约3个核苷酸的位置上导入了变化而导致了对包装的指导。我们业已获得了有关来自pESYNGP的密码子优化的RNA以较低水平整合到毒粒中的证据。
比较了来自野生型gag/pol pEV53B表达框和来自密码子优化的EIAVgag/pol表达框pESYNGP的mRNA’s的包装。培养基是从用pEV53B(细胞系B-241)或pESYNGP稳定转染过的基于HEK293的细胞系中收集的。这两种细胞系所产生的载体颗粒不包含载体RNA，并且没有外被蛋白。在某些实验，将EIAV载体基因组质粒(pECG3-CZW)转染到所述细胞中，将其用作杂交和能够包装RNA的颗粒存在的内部正对照。pECG3-CZW是由pEC-LacZ(WO98/51810)制备而成的衍生物，它是通过以下方法制备而成的：1)缩小gag序列，以为只包括gag的头200个核苷酸，而不是头577个核苷酸，和2)将土拨鼠肝炎病毒转录后调控因子(WHV PRE)(相当于保藏号J04514的901-1800号核苷酸)插入LacZ报导基因下游的NotI位点。
通过平衡密度梯度离心从所述培养基中部分纯化来自每一个细胞系的病毒颗粒。为此，将在用丁酸钠诱导之后24小时收获的生产细胞的10毫升的培养基铺在TNE缓冲液(pH7.4)中的20-60％(w/w)蔗糖梯度上，并用SW28转子在4℃下以25,000rpm的速度离心24小时。收集离心管底部的级份，并对每一种级份的10微升样品进行逆转录酶活性测定，以便对病毒颗粒进行定位。该分析的结果如图47所示，其中，逆转录酶活性的特征是作为梯度级份的函数给出的。在所述附图中，梯度的上部在右侧。应当指出的是，来自pESYNGP-表达细胞的RT活性水平明显低于pEV53B表达细胞的水平。为了测定纯化毒粒的RNA含量，收集来自上部、中部或底部级份的式样(通过标有T、M和B的柱表示)，并对来自每一种级份的RNA进行狭线印迹杂交分析。使用对野生型和合成的gag/pol的公共区专一的探针，很容易在由野生型结构(pEV53B)合成的毒粒的峰级份(M)中检测到RNA的衣壳化，但是，在由合成的Gag/Pol结构(pESYNGP)合成的毒粒中检测不到(图48)。存在能够进行衣壳化的衣壳的对照是EIAV G3-CZW载体基因组，这种载体在来自表达野生型或合成gag/pol蛋白的细胞的峰级份中都能很方便地检测到。即使考虑了来自野生型和合成的Gag/Pol表达结构的不同的表达水平，这一结果仍然表明来自密码子优化的gag/pol基因的RNA的包装效率明显低于野生型基因的，并且体现了该系统的安全特性的显著改善。还要指出的是，由pEV53B转录而成的RNA是包装过的。该RNA缺失了剪接供体序列上游的序列(CAG/GTAAG)，但仍然包装过。这表明主要包装决定子位于gag编码区内，并且与有关HIV-1的包装信号位置的总体上的看法矛盾。
在其他实验中我们业已证实，来自pEV53B的转录物的包装只是略低于来自pEV53A的包装(图51)。这进一步表明，主要包装序列位于gag编码区内。在上述实验中，细胞系B-241表达pEV53B RNA，而PEV-17表达pEV53ARNA。用于证实包装成分载体颗粒存在的EIAV载体是G3-CZR，它与上面所披露的G3-CZW相同，所不同的是用含有EIAV RRE因子的序列取代了土拨鼠转录后调控因子。方法如上文所述。
在上面的说明书中所提到的所有都被收作本文参考。在不超出本发明范围和构思的前提下，对所披露的本发明的方法和系统所作的各种改进和改变，对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管业已结合具体的优选实施方案对本发明进行了说明，但应当理解的是，本发明并非仅仅局限于所述特定实施方案。实际上，对所述实施本发明的方式所作的，在分子生物学或相关领域的技术人员看来是显而易见的各种改进，都被视为属于以下权利要求的范围。
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                                     序列表
<110>牛津生物医学(英国)有限公司(Oxford Biomedica(UK)Limited)
A.J.金斯曼(Kingsman，Alan J)
N.金(Kim，Narry)
E.科特索普洛(Kotsopoulou，Ekaterini)
J.罗尔(Rohll，Jonathan)
K.A.米特罗法诺斯(Mitrophanous，Kyriacos A)
<120>方法
<130>P008827WO CLM
<140>PCT/GB01/01784
<141>2001-04-18
<150>GB 0009760.0
<151>2000-04-19
<160>37
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>4307
<212>DNA
<213>人类免疫缺损病毒
<400>1
atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60
ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120
ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180
ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240
acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300
ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360
gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420
caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480
gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540
ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600
ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660
gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720
agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acaaataatc cacctatccc agtaggagaa 780
atttataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840
agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccggttc 900
tataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960
ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagcg 1020
gctacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtag gaggacccgg ccataaggca 1080
agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaattcag ctaccataat gatgcagaga 1140
ggcaatttta ggaaccaaag aaagattgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200
acagccagaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260
caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320
tacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380
gagagcttca ggtctggggt agagacaaca actccccctc agaagcagga gccgatagac 1440
aaggaactgt atcctttaac ttccctcagg tcactctttg gcaacgaccc ctcgtcacaa 1500
taaagatagg ggggcaacta aaggaagctc tattagatac aggagcagat gatacagtat 1560
tagaagaaat gagtttgcca ggaagatgga aaccaaaaat gataggggga attggaggtt 1620
ttatcaaagt aagacagtat gatcagatac tcatagaaat ctgtggacat aaagctatag 1680
gtacagtatt agtaggacct acacctgtca acataattgg aagaaatctg ttgactcaga 1740
ttggttgcac tttaaatttt cccattagcc ctattgagac tgtaccagta aaattaaagc 1800
caggaatgga tggcccaaaa gttaaacaat ggccattgac agaagaaaaa ataaaagcat 1860
tagtagaaat ttgtacagag atggaaaagg aagggaaaat ttcaaaaatt gggcctgaaa 1920
atccatacaa tactccagta tttgccataa agaaaaaaga cagtactaaa tggagaaaat 1980
tagtagattt cagagaactt aataagagaa ctcaagactt ctgggaagtt caattaggaa 2040
taccacatcc cgcagggtta aaaaagaaaa aatcagtaac agtactggat gtgggtgatg 2100
catatttttc agttccctta gatgaagact tcaggaagta tactgcattt accataccta 2160
gtataaacaa tgagacacca gggattagat atcagtacaa tgtgcttcca cagggatgga 2220
aaggatcacc agcaatattc caaagtagca tgacaaaaat cttagagcct tttagaaaac 2280
aaaatccaga catagttatc tatcaataca tggatgattt gtatgtagga tctgacttag 2340
aaatagggca gcatagaaca aaaatagagg agctgagaca acatctgttg aggtggggac 2400
ttaccacacc agacaaaaaa catcagaaag aacctccatt cctttggatg ggttatgaac 2460
tccatcctga taaatggaca gtacagccta tagtgctgcc agaaaaagac agctggactg 2520
tcaatgacat acagaagtta gtggggaaat tgaattgggc aagtcagatt tacccaggga 2580
ttaaagtaag gcaattatgt aaactcctta gaggaaccaa agcactaaca gaagtaatac 2640
cactaacaga agaagcagag ctagaactgg cagaaaacag agagattcta aaagaaccag 2700
tacatggagt gtattatgac ccatcaaaag acttaatagc agaaatacag aagcaggggc 2760
aaggccaatg gacatatcaa atttatcaag agccatttaa aaatctgaaa acaggaaaat 2820
atgcaagaat gaggggtgcc cacactaatg atgtaaaaca attaacagag gcagtgcaaa 2880
aaataaccac agaaagcata gtaatatggg gaaagactcc taaatttaaa ctgcccatac 2940
aaaaggaaac atgggaaaca tggtggacag agtattggca agccacctgg attcctgagt 3000
gggagtttgt taatacccct cccttagtga aattatggta ccagttagag aaagaaccca 3060
tagtaggagc agaaaccttc tatgtagatg gggcagctaa cagggagact aaattaggaa 3120
aagcaggata tgttactaat agaggaagac aaaaagttgt caccctaact gacacaacaa 3180
atcagaagac tgagttacaa gcaatttatc tagctttgca ggattcggga ttagaagtaa 3240
acatagtaac agactcacaa tatgcattag gaatcattca agcacaacca gatcaaagtg 3300
aatcagagtt agtcaatcaa ataatagagc agttaataaa aaaggaaaag gtctatctgg 3360
catgggtacc agcacacaaa ggaattggag gaaatgaaca agtagataaa ttagtcagtg 3420
ctggaatcag gaaagtacta tttttagatg gaatagataa ggcccaagat gaacatgaga 3480
aatatcacag taattggaga gcaatggcta gtgattttaa cctgccacct gtagtagcaa 3540
aagaaatagt agccagctgt gataaatgtc agctaaaagg agaagccatg catggacaag 3600
tagactgtag tccaggaata tggcaactag attgtacaca tttagaagga aaagttatcc 3660
tggtagcagt tcatgtagcc agtggatata tagaagcaga agttattcca gcagaaacag 3720
ggcaggaaac agcatatttt cttttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacaatac 3780
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gaatcaagca ggaatttgga attccctaca atccccaaag tcaaggagta gtagaatcta 3900
tgaataaaga attaaagaaa attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga 3960
cagcagtaca aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt 4020
acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac 4080
aaaaacaaat tacaaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agaaattcac 4140
tttggaaagg accagcaaag ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata 4200
atagtgacat aaaagtagtg ccaagaagaa aagcaaagat cattagggat tatggaaaac 4260
agatggcagg tgatgattgt gtggcaagta gacaggatga ggattag               4307
<210>2
<211>9772
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pSYNGP
<400>2
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg 660
cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 720
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 780
agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt 840
gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 900
ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact 960
cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac 1020
aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact 1080
ataggctagc ctcgagaatt cgccaccatg ggcgcccgcg ccagcgtgct gtcgggcggc 1140
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taccccatcg tgcagaacat ccaggggcag atggtgcacc aggccatctc cccccgcacg 1560
ctgaacgcct gggtgaaggt ggtggaagag aaggctttta gcccggaggt gatacccatg 1620
ttctcagccc tgtcagaggg agccaccccc caagatctga acaccatgct caacacagtg 1680
gggggacacc aggccgccat gcagatgctg aaggagacca tcaatgagga ggctgccgaa 1740
tgggatcgtg tgcatccggt gcacgcaggg cccatcgcac cgggccagat gcgtgagcca 1800
cggggctcag acatcgccgg aacgactagt acccttcagg aacagatcgg ctggatgacc 1860
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aactccgcta ccatcatgat gcagcgcggc aactttcgga accaacgcaa gatcgtcaag 2280
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ctctttggca gcgacccctc gtcacaataa agataggggg gcagctcaag gaggctctcc 2640
tggacaccgg agcagacgac accgtgctgg aggagatgtc gttgccaggc cgctggaagc 2700
cgaagatgat cgggggaatc ggcggtttca tcaaggtgcg ccagtatgac cagatcctca 2760
tcgaaatctg cggccacaag gctatcggta ccgtgctggt gggccccaca cccgtcaaca 2820
tcatcggacg caacctgttg acgcagatcg gttgcacgct gaacttcccc attagcccta 2880
tcgagacggt accggtgaag ctgaagcccg ggatggacgg cccgaaggtc aagcaatggc 2940
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ggaaaatctc caagattggg cctgagaacc cgtacaacac gccggtgttc gcaatcaaga 3060
agaaggactc gacgaaatgg cgcaagctgg tggacttccg cgagctgaac aagcgcacgc 3120
aagacttctg ggaggttcag ctgggcatcc cgcaccccgc agggctgaag aagaagaaat 3180
ccgtgaccgt actggatgtg ggtgatgcct acttctccgt tcccctggac gaagacttca 3240
ggaagtacac tgccttcaca atcccttcga tcaacaacga gacaccgggg attcgatatc 3300
agtacaacgt gctgccccag ggctggaaag gctctcccgc aatcttccag agtagcatga 3360
ccaaaatcct ggagcctttc cgcaaacaga accccgacat cgtcatctat cagtacatgg 3420
atgacttgta cgtgggctct gatctagaga tagggcagca ccgcaccaag atcgaggagc 3480
tgcgccagca cctgttgagg tggggactga ccacacccga caagaagcac cagaaggagc 3540
ctcccttcct ctggatgggt tacgagctgc accctgacaa atggaccgtg cagcctatcg 3600
tgctgccaga gaaagacagc tggactgtca acgacataca gaagctggtg gggaagttga 3660
actgggccag tcagatttac ccagggatta aggtgaggca gctgtgcaaa ctcctccgcg 3720
gaaccaaggc actcacagag gtgatccccc taaccgagga ggccgagctc gaactggcag 3780
aaaaccgaga gatcctaaag gagcccgtgc acggcgtgta ctatgacccc tccaaggacc 3840
tgatcgccga gatccagaag caggggcaag gccagtggac ctatcagatt taccaggagc 3900
ccttcaagaa cctgaagacc ggcaagtacg cccggatgag gggtgcccac actaacgacg 3960
tcaagcagct gaccgaggcc gtgcagaaga tcaccaccga aagcatcgtg atctggggaa 4020
agactcctaa gttcaagctg cccatccaga aggaaacctg ggaaacctgg tggacagagt 4080
attggcaggc cacctggatt cctgagtggg agttcgtcaa cacccctccc ctggtgaagc 4140
tgtggtacca gctggagaag gagcccatag tgggcgccga aaccttctac gtggatgggg 4200
ccgctaacag ggagactaag ctgggcaaag ccggatacgt cactaaccgg ggcagacaga 4260
aggttgtcac cctcactgac accaccaacc agaagactga gctgcaggcc atttacctcg 4320
ctttgcagga ctcgggcctg gaggtgaaca tcgtgacaga ctctcagtat gccctgggca 4380
tcattcaagc ccagccagac cagagtgagt ccgagctggt caatcagatc atcgagcagc 4440
tgatcaagaa ggaaaaggtc tatctggcct gggtacccgc ccacaaaggc attggcggca 4500
atgagcaggt cgacaagctg gtctcggctg gcatcaggaa ggtgctattc ctggatggca 4560
tcgacaaggc ccaggacgag cacgagaaat accacagcaa ctggcgggcc atggctagcg 4620
acttcaacct gccccctgtg gtggccaaag agatcgtggc cagctgtgac aagtgtcagc 4680
tcaagggcga agccatgcat ggccaggtgg actgtagccc cggcatctgg caactcgatt 4740
gcacccatct ggagggcaag gttatcctgg tagccgtcca tgtggccagt ggctacatcg 4800
aggccgaggt cattcccgcc gaaacagggc aggagacagc ctacttcctc ctgaagctgg 4860
caggccggtg gccagtgaag accatccata ctgacaatgg cagcaatttc accagtgcta 4920
cggttaaggc cgcctgctgg tgggcgggaa tcaagcagga gttcgggatc ccctacaatc 4980
cccagagtca gggcgtcgtc gagtctatga ataaggagtt aaagaagatt atcggccagg 5040
tcagagatca ggctgagcat ctcaagaccg cggtccaaat ggcggtattc atccacaatt 5100
tcaagcggaa gggggggatt ggggggtaca gtgcggggga gcggatcgtg gacatcatcg 5160
cgaccgacat ccagactaag gagctgcaaa agcagattac caagattcag aatttccggg 5220
tctactacag ggacagcaga aatcccctct ggaaaggccc agcgaagctc ctctggaagg 5280
gtgagggggc agtagtgatc caggataata gcgacatcaa ggtggtgccc agaagaaagg 5340
cgaagatcat tagggattat ggcaaacaga tggcgggtga tgattgcgtg gcgagcagac 5400
aggatgagga ttaggaattg ggctagagcg gccgcttccc tttagtgagg gttaatgctt 5460
cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga 5520
aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 5580
tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag 5640
atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat ccgataagga 5700
tcgatccggg ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 5760
gcagcctgaa tggcgaatgg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 5820
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 5880
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 5940
ccctttaggg ttccgattta gagctttacg gcacctcgac cgcaaaaaac ttgatttggg 6000
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 6060
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 6120
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 6180
gctgatttaa caaatattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttcgcc 6240
tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata cgcggatctg 6300
cgcagcacca tggcctgaaa taacctctga aagaggaact tggttaggta ccttctgagg 6360
cggaaagaac cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc 6420
agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc 6480
cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat 6540
agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc 6600
gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga 6660
gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagcttga 6720
ttcttctgac acaacagtct cgaacttaag gctagagcca ccatgattga acaagatgga 6780
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 6840
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 6900
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg 6960
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 7020
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 7080
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 7140
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 7200
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 7260
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 7320
acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 7380
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 7440
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 7500
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg 7560
ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgatggccgc 7620
aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagcg 7680
ataaggatcc gcgtatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 7740
cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 7800
tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 7860
tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat 7920
gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 7980
acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 8040
ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 8100
gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 8160
ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 8220
gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 8280
agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 8340
caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 8400
gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 8460
agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 8520
gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 8580
aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 8640
ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 8700
tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 8760
tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 8820
gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 8880
atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 8940
ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 9000
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 9060
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 9120
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 9180
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 9240
cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 9300
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 9360
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 9420
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 9480
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 9540
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 9600
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 9660
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 9720
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgg ctcgacagat ct         9772
<210>3
<211>2571
<212>DNA
<213>人类免疫缺损病毒
<400>3
atgagagtga aggggatcag gaggaattat cagcactggt ggggatgggg cacgatgctc 60
cttgggttat taatgatctg tagtgctaca gaaaaattgt gggtcacagt ctattatggg 120
gtacctgtgt ggaaagaagc aaccaccact ctattttgtg catcagatgc taaagcatat 180
gatacagagg tacataatgt ttgggccaca caagcctgtg tacccacaga ccccaaccca 240
caagaagtag aattggtaaa tgtgacagaa aattttaaca tgtggaaaaa taacatggta 300
gaacagatgc atgaggatataatcagttta tgggatcaaa gcctaaagcc atgtgtaaaa 360
ttaaccccac tctgtgttac tttaaattgc actgatttga ggaatactac taataccaat 420
aatagtactg ctaataacaa tagtaatagc gagggaacaa taaagggagg agaaatgaaa 480
aactgctctt tcaatatcac cacaagcata agagataaga tgcagaaaga atatgcactt 540
ctttataaac ttgatatagt atcaatagat aatgatagta ccagctatag gttgataagt 600
tgtaatacct cagtcattac acaagcttgt ccaaagatat cctttgagcc aattcccata 660
cactattgtg ccccggctgg ttttgcgatt ctaaaatgta acgataaaaa gttcagtgga 720
aaaggatcat gtaaaaatgt cagcacagta caatgtacac atggaattag gccagtagta 780
tcaactcaac tgctgttaaa tggcagtcta gcagaagaag aggtagtaat tagatctgag 840
aatttcactg ataatgctaa aaccatcata gtacatctga atgaatctgt acaaattaat 900
tgtacaagac ccaactacaa taaaagaaaa aggatacata taggaccagg gagagcattt 960
tatacaacaa aaaatataat aggaactata agacaagcac attgtaacat tagtagagca 1020
aaatggaatg acactttaag acagatagtt agcaaattaa aagaacaatt taagaataaa 1080
acaatagtct ttaatcaatc ctcaggaggg gacccagaaa ttgtaatgca cagttttaat 1140
tgtggagggg aatttttcta ctgtaataca tcaccactgt ttaatagtac ttggaatggt 1200
aataatactt ggaataatac tacagggtca aataacaata tcacacttca atgcaaaata 1260
aaacaaatta taaacatgtg gcaggaagta ggaaaagcaa tgtatgcccc tcccattgaa 1320
ggacaaatta gatgttcatc aaatattaca gggctactat taacaagaga tggtggtaag 1380
gacacggaca cgaacgacac cgagatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat 1440
tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaacaattg aaccattagg agtagcaccc 1500
accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagcgatagg agctctgttc 1560
cttgggttct taggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcagtgac gctgacggta 1620
caggccagac tattattgtc tggtatagtg caacagcaga acaatttgct gagggccatt 1680
gaggcgcaac agcatatgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga 1740
gtcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggttttg gggttgctct 1800
ggaaaactca tttgcaccac tactgtgcct tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg 1860
gatgatattt ggaataacat gacctggatg cagtgggaaa gagaaattga caattacaca 1920
agcttaatat actcattact agaaaaatcg caaacccaac aagaaaagaa tgaacaagaa 1980
ttattggaat tggataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttgacataac aaattggctg 2040
tggtatataa aaatattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag aatagttttt 2100
gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatact caccattgtc gttgcagacc 2160
cgccccccag ttccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tcgaagaaga aggtggagag 2220
agagacagag acacatccgg tcgattagtg catggattct tagcaattat ctgggtcgac 2280
ctgcggagcc tgttcctctt cagctaccac cacagagact tactcttgat tgcagcgagg 2340
attgtggaac ttctgggacg cagggggtgg gaagtcctca aatattggtg gaatctccta 2400
cagtattgga gtcaggaact aaagagtagt gctgttagct tgcttaatgc cacagctata 2460
gcagtagctg aggggacaga tagggttata gaagtactgc aaagagctgg tagagctatt 2520
ctccacatac ctacaagaat aagacagggc ttggaaaggg ctttgctata a          2571
<210>4
<211>2571
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：SYNgp-160mn-密码子优化env序列
<400>4
atgagggtga aggggatccg ccgcaactac cagcactggt ggggctgggg cacgatgctc 60
ctggggctgc tgatgatctg cagcgccacc gagaagctgt gggtgaccgt gtactacggc 120
gtgcccgtgt ggaaggaggc caccaccacc ctgttctgcg ccagcgacgc caaggcgtac 180
gacaccgagg tgcacaacgt gtgggccacc caggcgtgcg tgcccaccga ccccaacccc 240
caggaggtgg agctcgtgaa cgtgaccgag aacttcaaca tgtggaagaa caacatggtg 300
gagcagatgc atgaggacat catcagcctg tgggaccaga gcctgaagcc ctgcgtgaag 360
ctgacccccc tgtgcgtgac cctgaactgc accgacctga ggaacaccac caacaccaac 420
aacagcaccg ccaacaacaa cagcaacagc gagggcacca tcaagggcgg cgagatgaag 480
aactgcagct tcaacatcac caccagcatc cgcgacaaga tgcagaagga gtacgccctg 540
ctgtacaagc tggatatcgt gagcatcgac aacgacagca ccagctaccg cctgatctcc 600
tgcaacacca gcgtgatcac ccaggcctgc cccaagatca gcttcgagcc catccccatc 660
cactactgcg cccccgccgg cttcgccatc ctgaagtgca acgacaagaa gttcagcggc 720
aagggcagct gcaagaacgt gagcaccgtg cagtgcaccc acggcatccg gccggtggtg 780
agcacccagc tcctgctgaa cggcagcctg gccgaggagg aggtggtgat ccgcagcgag 840
aacttcaccg acaacgccaa gaccatcatc gtgcacctga atgagagcgt gcagatcaac 900
tgcacgcgtc ccaactacaa caagcgcaag cgcatccaca tcggccccgg gcgcgccttc 960
tacaccacca agaacatcat cggcaccatc cgccaggccc actgcaacat ctctagagcc 1020
aagtggaacg acaccctgcg ccagatcgtg agcaagctga aggagcagtt caagaacaag 1080
accatcgtgt tcaaccagag cagcggcggc gaccccgaga tcgtgatgca cagcttcaac 1140
tgcggcggcg aattcttcta ctgcaacacc agccccctgt tcaacagcac ctggaacggc 1200
aacaacacct ggaacaacac caccggcagc aacaacaata ttaccctcca gtgcaagatc 1260
aagcagatca tcaacatgtg gcaggaggtg ggcaaggcca tgtacgcccc ccccatcgag 1320
ggccagatcc ggtgcagcag caacatcacc ggtctgctgc tgacccgcga cggcggcaag 1380
gacaccgaca ccaacgacac cgaaatcttc cgccccggcg gcggcgacat gcgcgacaac 1440
tggagatctg agctgtacaa gtacaaggtg gtgacgatcg agcccctggg cgtggccccc 1500
accaaggcca agcgccgcgt ggtgcagcgc gagaagcggg ccgccatcgg cgccctgttc 1560
ctgggcttcc tgggggcggc gggcagcacc atgggggccg ccagcgtgac cctgaccgtg 1620
caggcccgcc tgctcctgag cggcatcgtg cagcagcaga acaacctcct ccgcgccatc 1680
gaggcccagc agcatatgct ccagctcacc gtgtggggca tcaagcagct ccaggcccgc 1740
gtgctggccg tggagcgcta cctgaaggac cagcagctcc tgggcttctg gggctgctcc 1800
ggcaagctga tctgcaccac cacggtaccc tggaacgcct cctggagcaa caagagcctg 1860
gacgacatct ggaacaacat gacctggatg cagtgggagc gcgagatcga taactacacc 1920
agcctgatct acagcctgct ggagaagagc cagacccagc aggagaagaa cgagcaggag 1980
ctgctggagc tggacaagtg ggcgagcctg tggaactggt tcgacatcac caactggctg 2040
tggtacatca aaatcttcat catgattgtg ggcggcctgg tgggcctccg catcgtgttc 2100
gccgtgctga gcatcgtgaa ccgcgtgcgc cagggctaca gccccctgag cctccagacc 2160
cggccccccg tgccgcgcgg gcccgaccgc cccgagggca tcgaggagga gggcggcgag 2220
cgcgaccgcg acaccagcgg caggctcgtg cacggcttcc tggcgatcat ctgggtcgac 2280
ctccgcagcc tgttcctgtt cagctaccac caccgcgacc tgctgctgat cgccgcccgc 2340
atcgtggaac tcctaggccg ccgcggctgg gaggtgctga agtactggtg gaacctcctc 2400
cagtattgga gccaggagct gaagtccagc gccgtgagcc tgctgaacgc caccgccatc 2460
gccgtggccg agggcaccga ccgcgtgatc gaggtgctcc agagggccgg gagggcgatc 2520
ctgcacatcc ccacccgcat ccgccagggg ctcgagaggg cgctgctgta a          2571
<210>5
<211>10112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pESYNGP
<400>5
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg 660
cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 720
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 780
agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt 840
gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 900
ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact 960
cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac 1020
aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact 1080
ataggctaga gaattcgcca ccatgggcga tcccctcacc tggtccaaag ccctgaagaa 1140
actggaaaaa gtcaccgttc agggtagcca aaagcttacc acaggcaatt gcaactgggc 1200
attgtccctg gtggatcttt tccacgacac taatttcgtt aaggagaaag attggcaact 1260
cagagacgtg atccccctct tggaggacgt gacccaaaca ttgtctgggc aggagcgcga 1320
agctttcgag cgcacctggt gggccatcag cgcagtcaaa atggggctgc aaatcaacaa 1380
cgtggttgac ggtaaagcta gctttcaact gctccgcgct aagtacgaga agaaaaccgc 1440
caacaagaaa caatccgaac ctagcgagga gtacccaatt atgatcgacg gcgccggcaa 1500
taggaacttc cgcccactga ctcccagggg ctataccacc tgggtcaaca ccatccagac 1560
aaacggactt ttgaacgaag cctcccagaa cctgttcggc atcctgtctg tggactgcac 1620
ctccgaagaa atgaatgctt ttctcgacgt ggtgccagga caggctggac agaaacagat 1680
cctgctcgat gccattgaca agatcgccga cgactgggat aatcgccacc ccctgccaaa 1740
cgcccctctg gtggctcccc cacaggggcc tatccctatg accgctaggt tcattagggg 1800
actgggggtg ccccgcgaac gccagatgga gccagcattt gaccaattta ggcagaccta 1860
cagacagtgg atcatcgaag ccatgagcga ggggattaaa gtcatgatcg gaaagcccaa 1920
ggcacagaac atcaggcagg gggccaagga accataccct gagtttgtcg acaggcttct 1980
gtcccagatt aaatccgaag gccaccctca ggagatctcc aagttcttga cagacacact 2040
gactatccaa aatgcaaatg aagagtgcag aaacgccatg aggcacctca gacctgaaga 2100
taccctggag gagaaaatgt acgcatgtcg cgacattggc actaccaagc aaaagatgat 2160
gctgctcgcc aaggctctgc aaaccggcct ggctggtcca ttcaaaggag gagcactgaa 2220
gggaggtcca ttgaaagctg cacaaacatg ttataattgt gggaagccag gacatttatc 2280
tagtcaatgt agagcaccta aagtctgttt taaatgtaaa cagcctggac atttctcaaa 2340
gcaatgcaga agtgttccaa aaaacgggaa gcaaggggct caagggaggc cccagaaaca 2400
aactttcccg atacaacaga agagtcagca caacaaatct gttgtacaag agactcctca 2460
gactcaaaat ctgtacccag atctgagcga aataaaaaag gaatacaatg tcaaggagaa 2520
ggatcaagta gaggatctca acctggacag tttgtgggag taacatacaa tctcgagaag 2580
aggcccacta ccatcgtcct gatcaatgac acccctctta atgtgctgct ggacaccgga 2640
gccgacacca gcgttctcac tactgctcac tataacagac tgaaatacag aggaaggaaa 2700
taccagggca caggcatcat cggcgttgga ggcaacgtcg aaaccttttc cactcctgtc 2760
accatcaaaa agaaggggag acacattaaa accagaatgc tggtcgccga catccccgtc 2820
accatccttg gcagagacat tctccaggac ctgggcgcta aactcgtgct ggcacaactg 2880
tctaaggaaa tcaagttccg caagatcgag ctgaaagagg gcacaatggg tccaaaaatc 2940
ccccagtggc ccctgaccaa agagaagctt gagggcgcta aggaaatcgt gcagcgcctg 3000
ctttctgagg gcaagattag cgaggccagc gacaataacc cttacaacag ccccatcttt 3060
gtgattaaga aaaggagcgg caaatggaga ctcctgcagg acctgaggga actcaacaag 3120
accgtccagg tcggaactga gatctctcgc ggactgcctc accccggcgg cctgattaaa 3180
tgcaagcaca tgacagtcct tgacattgga gacgcttatt ttaccatccc cctcgatcct 3240
gaatttcgcc cctatactgc ttttaccatc cccagcatca atcaccagga gcccgataaa 3300
cgctatgtgt ggaagtgcct cccccaggga tttgtgctta gcccctacat ttaccagaag 3360
acacttcaag agatcctcca acctttccgc gaaagatacc cagaggttca actctaccaa 3420
tatatggacg acctgttcat ggggtccaac gggtctaaga agcagcacaa ggaactcatc 3480
atcgaactga gggcaatcct cctggagaaa ggcttcgaga cacccgacga caagctgcaa 3540
gaagttcctc catatagctg gctgggctac cagctttgcc ctgaaaactg gaaagtccag 3600
aagatgcagt tggatatggt caagaaccca acactgaacg acgtccagaa gctcatgggc 3660
aatattacct ggatgagctc cggaatccct gggcttaccg ttaagcacat tgccgcaact 3720
acaaaaggat gcctggagtt gaaccagaag gtcatttgga cagaggaagc tcagaaggaa 3780
ctggaggaga ataatgaaaa gattaagaat gctcaagggc tccaatacta caatcccgaa 3840
gaagaaatgt tgtgcgaggt cgaaatcact aagaactacg aagccaccta tgtcatcaaa 3900
cagtcccaag gcatcttgtg ggccggaaag aaaatcatga aggccaacaa aggctggtcc 3960
accgttaaaa atctgatgct cctgctccag cacgtcgcca ccgagtctat cacccgcgtc 4020
ggcaagtgcc ccaccttcaa agttcccttc actaaggagc aggtgatgtg ggagatgcaa 4080
aaaggctggt actactcttg gcttcccgag atcgtctaca cccaccaagt ggtgcacgac 4140
gactggagaa tgaagcttgt cgaggagccc actagcggaa ttacaatcta taccgacggc 4200
ggaaagcaaa acggagaggg aatcgctgca tacgtcacat ctaacggccg caccaagcaa 4260
aagaggctcg gccctgtcac tcaccaggtg gctgagagga tggctatcca gatggccctt 4320
gaggacacta gagacaagca ggtgaacatt gtgactgaca gctactactg ctggaaaaac 4380
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atccgcgaaa aggaaattgt ctatttcgcc tgggtgcctg gacacaaagg aatttacggc 4500
aaccaactcg ccgatgaagc cgccaaaatt aaagaggaaa tcatgcttgc ctaccagggc 4560
acacagatta aggagaagag agacgaggac gctggctttg acctgtgtgt gccatacgac 4620
atcatgattc ccgttagcga cacaaagatc attccaaccg atgtcaagat ccaggtgcca 4680
cccaattcat ttggttgggt gaccggaaag tccagcatgg ctaagcaggg tcttctgatt 4740
aacgggggaa tcattgatga aggatacacc ggcgaaatcc aggtgatctg cacaaatatc 4800
ggcaaaagca atattaagct tatcgaaggg cagaagttcg ctcaactcat catcctccag 4860
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ggcttcggca gcacaggtgt gttctgggtg gagaacatcc aggaagcaca ggacgagcac 4980
gagaattggc acacctcccc taagattttg gcccgcaatt acaagatccc actgactgtg 5040
gctaagcaga tcacacagga atgcccccac tgcaccaaac aaggttctgg ccccgccggc 5100
tgcgtgatga ggtcccccaa tcactggcag gcagattgca cccacctcga caacaaaatt 5160
atcctgacct tcgtggagag caattccggc tacatccacg caacactcct ctccaaggaa 5220
aatgcattgt gcacctccct cgcaattctg gaatgggcca ggctgttctc tccaaaatcc 5280
ctgcacaccg acaacggcac caactttgtg gctgaacctg tggtgaatct gctgaagttc 5340
ctgaaaatcg cccacaccac tggcattccc tatcaccctg aaagccaggg cattgtcgag 5400
agggccaaca gaactctgaa agaaaagatc caatctcaca gagacaatac acagacattg 5460
gaggccgcac ttcagctcgc ccttatcacc tgcaacaaag gaagagaaag catgggcggc 5520
cagaccccct gggaggtctt catcactaac caggcccagg tcatccatga aaagctgctc 5580
ttgcagcagg cccagtcctc caaaaagttc tgcttttata agatccccgg tgagcacgac 5640
tggaaaggtc ctacaagagt tttgtggaaa ggagacggcg cagttgtggt gaacgatgag 5700
ggcaagggga tcatcgctgt gcccctgaca cgcaccaagc ttctcatcaa gccaaactga 5760
acccggggcg gccgcttccc tttagtgagg gttaatgctt cgagcagaca tgataagata 5820
cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga 5880
aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa 5940
caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag 6000
caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat ccgataagga tcgatccggg ctggcgtaat 6060
agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 6120
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cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 6300
gagctttacg gcacctcgac cgcaaaaaac ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc 6360
catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 6420
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 6480
aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaatattta 6540
acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttcgcc tgatgcggta ttttctcctt 6600
acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata cgcggatctg cgcagcacca tggcctgaaa 6660
taacctctga aagaggaact tggttaggta ccttctgagg cggaaagaac cagctgtgga 6720
atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa 6780
gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 6840
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc 6900
ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 6960
tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag 7020
gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagcttga ttcttctgac acaacagtct 7080
cgaacttaag gctagagcca ccatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 7140
cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 7200
tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 7260
gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 7320
gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 7380
attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 7440
atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 7500
cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 7560
cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 7620
gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 7680
gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 7740
tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 7800
cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 7860
catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg 7920
accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgatggccgc aataaaatat ctttattttc 7980
attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagcg ataaggatcc gcgtatggtg 8040
cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac 8100
acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt 8160
gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag 8220
acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc 8280
ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 8340
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 8400
atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 8460
tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 8520
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ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 8640
atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 8700
ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 8760
catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 8820
cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 8880
ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 8940
cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 9000
cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 9060
tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 9120
agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 9180
ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 9240
gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 9300
atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 9360
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 9420
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 9480
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 9540
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 9600
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 9660
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 9720
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 9780
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 9840
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 9900
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 9960
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 10020
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 10080
ctggcctttt gctcacatgg ctcgacagat ct                               10112
<210>6
<211>10227
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：LpESYNGP
<400>6
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg 660
cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 720
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 780
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gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 900
ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact 960
cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac 1020
aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact 1080
ataggctaga gaattcgaga ggggcgcaga ccctacctgt tgaacctggc tgatcgtagg 1140
atccccggga cagcagagga gaacttacag aagtcttctg gaggtgttcc tggccagaac 1200
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aaaaagtcac cgttcagggt agccaaaagc ttaccacagg caattgcaac tgggcattgt 1320
ccctggtgga tcttttccac gacactaatt tcgttaagga gaaagattgg caactcagag 1380
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agaaacaatc cgaacctagc gaggagtacc caattatgat cgacggcgcc ggcaatagga 1620
acttccgccc actgactccc aggggctata ccacctgggt caacaccatc cagacaaacg 1680
gacttttgaa cgaagcctcc cagaacctgt tcggcatcct gtctgtggac tgcacctccg 1740
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tcgatgccat tgacaagatc gccgacgact gggataatcg ccaccccctg ccaaacgccc 1860
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ccttggcaga gacattctcc aggacctggg cgctaaactc gtgctggcac aactgtctaa 3000
ggaaatcaag ttccgcaaga tcgagctgaa agagggcaca atgggtccaa aaatccccca 3060
gtggcccctg accaaagaga agcttgaggg cgctaaggaa atcgtgcagc gcctgctttc 3120
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taagaaaagg agcggcaaat ggagactcct gcaggacctg agggaactca acaagaccgt 3240
ccaggtcgga actgagatct ctcgcggact gcctcacccc ggcggcctga ttaaatgcaa 3300
gcacatgaca gtccttgaca ttggagacgc ttattttacc atccccctcg atcctgaatt 3360
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tgtgtggaag tgcctccccc agggatttgt gcttagcccc tacatttacc agaagacact 3480
tcaagagatc ctccaacctt tccgcgaaag atacccagag gttcaactct accaatatat 3540
ggacgacctg ttcatggggt ccaacgggtc taagaagcag cacaaggaac tcatcatcga 3600
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tcctccatat agctggctgg gctaccagct ttgccctgaa aactggaaag tccagaagat 3720
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cttttgctca catggctcga cagatct                                     10227
<210>7
<211>10815
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pESYNGPRRE
<400>7
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tttggagaga gctatatttc cgagaagacc aaaggggaga tttctcagcc tggggcggct 6300
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ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 6660
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tggctcgaca gatct                                                   10815
<210>8
<211>10930
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：LpESYNGPRRE
<400>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pONY4.0Z
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gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 9300
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aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 9480
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aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 10080
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gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca c                                11131
<210>10
<211>10998
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pONY8.0Z
<400>10
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c                                                                 12481
<210>13
<211>6395
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pCIneoERev
<400>13
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gtttacgggg gatggcgata gacgactttg gtgacttggg cgattctgtg tgtcgcaaat 300
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<223>人工序列说明：密码子优化HIV gag-pol
<400>15
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<220>
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优化EIAV gag-pol
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pIRES1hygESYNGP
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<210>18
<211>10114
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pESDSYNGP
<400>18
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taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 8460
tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 8520
gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 8580
atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 8640
ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 8700
cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 8760
ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 8820
aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 8880
ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 8940
gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 9000
ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 9060
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tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga 9240
cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 9300
tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 9360
atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 9420
tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 9480
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ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 9600
cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 9660
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gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 9780
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ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 10080
tgctggcctt ttgctcacat ggctcgacag atct                             10114
<210>19
<211>10384
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pONY8.3G FB29
<400>19
agatcttgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat ttctgtcgcc 60
gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga tagagatggc gatattggaa 120
aaattgatat ttgaaaatat ggcatattga aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac 180
tgatatcgcc atttttccaa aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatagcgct 240
tatatcgttt acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat tctgtgtgtc 300
gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg ccgatagagg 360
cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat acattgaatc aatattggcc 420
attagccata ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca 480
tacgttgtat ccatatcgta atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 540
atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 600
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 660
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 720
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 780
acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 840
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta 900
cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg 960
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gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc 1080
ccgttgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 1140
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cctttgtaat aaatataatt ctctactcag tccctgtctc tagtttgtct gttcgagatc 1260
ctacagttgg cgcccgaaca gggacctgag aggggcgcag accctacctg ttgaacctgg 1320
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ctggccagaa cacaggagga caggtaagat tgggagaccc tttgacattg gagcaaggcg 1440
ctcaagaagt tagagaaggt gacggtacaa gggtctcaga aattaactac tggtaactgt 1500
aattgggcgc taagtctagt agacttattt catgatacca actttgtaaa agaaaaggac 1560
tggcagctga gggatgtcat tccattgctg gaagatgtaa ctcagacgct gtcaggacaa 1620
gaaagagagg cctttgaaag aacatggtgg gcaatttctg ctgtaaagat gggcctccag 1680
attaataatg tagtagatgg aaaggcatca ttccagctcc taagagcgaa atatgaaaag 1740
aagactgcta ataaaaagca gtctgagccc tctgaagaat atctctagaa ctagtggatc 1800
ccccgggctg caggagtggg gaggcacgat ggccgctttg gtcgaggcgg atccggccat 1860
tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata 1920
cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat 1980
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 2040
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ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 2160
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 2220
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cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 2340
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agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 2460
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ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 3360
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ctctagagtc gacctgcagg catgcaagct tcagctgctc gagggggggc ccggtaccca 3480
gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgggaagt atttatcact aatcaagcac 3540
aagtaataca tgagaaactt ttactacagc aagcacaatc ctccaaaaaa ttttgttttt 3600
acaaaatccc tggtgaacat gattggaagg gacctactag ggtgctgtgg aagggtgatg 3660
gtgcagtagt agttaatgat gaaggaaagg gaataattgc tgtaccatta accaggacta 3720
agttactaat aaaaccaaat tgagtattgt tgcaggaagc aagacccaac taccattgtc 3780
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tcaaccccta ttacccaaca gtcagaaaaa tctaagtgtg aggagaacac aatgtttcaa 3900
ccttattgtt ataataatga cagtaagaac agcatggcag aatcgaagga agcaagagac 3960
caagaatgaa cctgaaagaa gaatctaaag aagaaaaaag aagaaatgac tggtggaaaa 4020
taggtatgtt tctgttatgc ttagcaggaa ctactggagg aatactttgg tggtatgaag 4080
gactcccaca gcaacattat atagggttgg tggcgatagg gggaagatta aacggatctg 4140
gccaatcaaa tgctatagaa tgctggggtt ccttcccggg gtgtagacca tttcaaaatt 4200
acttcagtta tgagaccaat agaagcatgc atatggataa taatactgct acattattag 4260
aagctttaac caatataact gctctataaa taacaaaaca gaattagaaa catggaagtt 4320
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tagacataag agagattttg gtataagtgc aatagtggca gctattgtag ccgctactgc 4440
tattgctgct agcgctacta tgtcttatgt tgctctaact gaggttaaca aaataatgga 4500
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ccaagggtcc ttagacctgg agattcgaag cgaaggagga aacatttatg actgttgcat 5400
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ttatattgga agagctttaa atcctggcac atctcatgta tcaatgcctc agtatgttta 5640
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gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 9720
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cggc                                                              10384
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：密码子-优化EIAV gag/pol ORF侧翼序列
<400>20
tctagagaat tcgccaccat  g                                          21
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：密码子-优化EIAV gag/pol ORF侧翼序列
<400>21
tgaacccggg gcggccgc                                          18
<210>22
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pEV53B
<400>22
caggtaagat g                                                   11
<210>23
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>23
ggctagagaa  ttccaggtaa  gatgggcgat  cccctcacct  gg              42
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>24
ttgggtactc ctcgctaggt tc                                          22
<210>25
<211>4307
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：密码子优化gag-pol序列(pSYNGP)
<400>25
atgggcgccc gcgccagcgt gctgtcgggc ggcgagctgg accgctggga gaagatccgc 60
ctgcgccccg gcggcaaaaa gaagtacaag ctgaagcaca tcgtgtgggc cagccgcgaa 120
ctggagcgct tcgccgtgaa ccccgggctc ctggagacca gcgaggggtg ccgccagatc 180
ctcggccaac tgcagcccag cctgcaaacc ggcagcgagg agctgcgcag cctgtacaac 240
accgtggcca cgctgtactg cgtccaccag cgcatcgaaa tcaaggatac gaaagaggcc 300
ctggataaaa tcgaagagga acagaataag agcaaaaaga aggcccaaca ggccgccgcg 360
gacaccggac acagcaacca ggtcagccag aactacccca tcgtgcagaa catccagggg 420
cagatggtgc accaggccat ctccccccgc acgctgaacg cctgggtgaa ggtggtggaa 480
gagaaggctt ttagcccgga ggtgataccc atgttctcag ccctgtcaga gggagccacc 540
ccccaagatc tgaacaccat gctcaacaca gtggggggac accaggccgc catgcagatg 600
ctgaaggaga ccatcaatga ggaggctgcc gaatgggatc gtgtgcatcc ggtgcacgca 660
gggcccatcg caccgggcca gatgcgtgag ccacggggct cagacatcgc cggaacgact 720
agtacccttc aggaacagat cggctggatg accaacaacc cacccatccc ggtgggagaa 780
atctacaaac gctggatcat cctgggcctg aacaagatcg tgcgcatgta tagccctacc 840
agcatcctgg acatccgcca aggcccgaag gaaccctttc gcgactacgt ggaccggttc 900
tacaaaacgc tccgcgccga gcaggctagc caggaggtga agaactggat gaccgaaacc 960
ctgctggtcc agaacgcgaa cccggactgc aagacgatcc tgaaggccct gggcccagcg 1020
gctaccctag aggaaatgat gaccgcctgt cagggagtgg gcggacccgg ccacaaggca 1080
cgcgtcctgg ctgaggccat gagccaggtg accaactccg ctaccatcat gatgcagcgc 1140
ggcaactttc ggaaccaacg caagatcgtc aagtgcttca actgtggcaa agaagggcac 1200
acagcccgca actgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260
caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320
cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380
gagagcttca ggtttgggga agagacaaca actccctctc agaagcagga gccgatagac 1440
aaggaactgt atcctttagc ttccctcaga tcactctttg gcagcgaccc ctcgtcacaa 1500
taaagatagg ggggcagctc aaggaggctc tcctggacac cggagcagac gacaccgtgc 1560
tggaggagat gtcgttgcca ggccgctgga agccgaagat gatcggggga atcggcggtt 1620
tcatcaaggt gcgccagtat gaccagatcc tcatcgaaat ctgcggccac aaggctatcg 1680
gtaccgtgct ggtgggcccc acacccgtca acatcatcgg acgcaacctg ttgacgcaga 1740
tcggttgcac gctgaacttc cccattagcc ctatcgagac ggtaccggtg aagctgaagc 1800
ccgggatgga cggcccgaag gtcaagcaat ggccattgac agaggagaag atcaaggcac 1860
tggtggagat ttgcacagag atggaaaagg aagggaaaat ctccaagatt gggcctgaga 1920
acccgtacaa cacgccggtg ttcgcaatca agaagaagga ctcgacgaaa tggcgcaagc 1980
tggtggactt ccgcgagctg aacaagcgca cgcaagactt ctgggaggtt cagctgggca 2040
tcccgcaccc cgcagggctg aagaagaaga aatccgtgac cgtactggat gtgggtgatg 2100
cctacttctc cgttcccctg gacgaagact tcaggaagta cactgccttc acaatccctt 2160
cgatcaacaa cgagacaccg gggattcgat atcagtacaa cgtgctgccc cagggctgga 2220
aaggctctcc cgcaatcttc cagagtagca tgaccaaaat cctggagcct ttccgcaaac 2280
agaaccccga catcgtcatc tatcagtaca tggatgactt gtacgtgggc tctgatctag 2340
agatagggca gcaccgcacc aagatcgagg agctgcgcca gcacctgttg aggtggggac 2400
tgaccacacc cgacaagaag caccagaagg agcctccctt cctctggatg ggttacgagc 2460
tgcaccctga caaatggacc gtgcagccta tcgtgctgcc agagaaagac agctggactg 2520
tcaacgacat acagaagctg gtggggaagt tgaactgggc cagtcagatt tacccaggga 2580
ttaaggtgag gcagctgtgc aaactcctcc gcggaaccaa ggcactcaca gaggtgatcc 2640
ccctaaccga ggaggccgag ctcgaactgg cagaaaaccg agagatccta aaggagcccg 2700
tgcacggcgt gtactatgac ccctccaagg acctgatcgc cgagatccag aagcaggggc 2760
aaggccagtg gacctatcag atttaccagg agcccttcaa gaacctgaag accggcaagt 2820
acgcccggat gaggggtgcc cacactaacg acgtcaagca gctgaccgag gccgtgcaga 2880
agatcaccac cgaaagcatc gtgatctggg gaaagactcc taagttcaag ctgcccatcc 2940
agaaggaaac ctgggaaacc tggtggacag agtattggca ggccacctgg attcctgagt 3000
gggagttcgt caacacccct cccctggtga agctgtggta ccagctggag aaggagccca 3060
tagtgggcgc cgaaaccttc tacgtggatg gggccgctaa cagggagact aagctgggca 3120
aagccggata cgtcactaac cggggcagac agaaggttgt caccctcact gacaccacca 3180
accagaagac tgagctgcag gccatttacc tcgctttgca ggactcgggc ctggaggtga 3240
acatcgtgac agactctcag tatgccctgg gcatcattca agcccagcca gaccagagtg 3300
agtccgagct ggtcaatcag atcatcgagc agctgatcaa gaaggaaaag gtctatctgg 3360
cctgggtacc cgcccacaaa ggcattggcg gcaatgagca ggtcgacaag ctggtctcgg 3420
ctggcatcag gaaggtgcta ttcctggatg gcatcgacaa ggcccaggac gagcacgaga 3480
aataccacag caactggcgg gccatggcta gcgacttcaa cctgccccct gtggtggcca 3540
aagagatcgt ggccagctgt gacaagtgtc agctcaaggg cgaagccatg catggccagg 3600
tggactgtag ccccggcatc tggcaactcg attgcaccca tctggagggc aaggttatcc 3660
tggtagccgt ccatgtggcc agtggctaca tcgaggccga ggtcattccc gccgaaacag 3720
ggcaggagac agcctacttc ctcctgaagc tggcaggccg gtggccagtg aagaccatcc 3780
atactgacaa tggcagcaat ttcaccagtg ctacggttaa ggccgcctgc tggtgggcgg 3840
gaatcaagca ggagttcggg atcccctaca atccccagag tcagggcgtc gtcgagtcta 3900
tgaataagga gttaaagaag attatcggcc aggtcagaga tcaggctgag catctcaaga 3960
ccgcggtcca aatggcggta ttcatccaca atttcaagcg gaaggggggg attggggggt 4020
acagtgcggg ggagcggatc gtggacatca tcgcgaccga catccagact aaggagctgc 4080
aaaagcagat taccaagatt cagaatttcc gggtctacta cagggacagc agaaatcccc 4140
tctggaaagg cccagcgaag ctcctctgga agggtgaggg ggcagtagtg atccaggata 4200
atagcgacat caaggtggtg cccagaagaa aggcgaagat cattagggat tatggcaaac 4260
agatggcggg tgatgattgc gtggcgagca gacaggatga ggattag               4307
<210>26
<211>4307
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pGP-RRE3
<400>26
atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60
ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120
ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180
ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240
acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300
ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360
gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420
caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480
gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540
ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600
ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660
gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720
agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acaaataatc cacctatccc agtaggagaa 780
atttataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840
agcattctgg acataagaca aggaccaaaa gaacccttta gagactatgt agaccggttc 900
tataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960
ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagcg 1020
gctacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtag gaggacccgg ccataaggca 1080
agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaattcag ctaccataat gatgcagaga 1140
ggcaatttta ggaaccaaag aaagattgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200
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caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320
tacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380
gagagcttca ggtctggggt agagacaaca actccccctc agaagcagga gccgatagac 1440
aaggaactgt atcctttaac ttccctcaga tcactctttg gcaacgaccc ctcgtcacaa 1500
taaagatagg ggggcaacta aaggaagctc tattagatac aggagcagat gatacagtat 1560
tagaagaaat gagtttgcca ggaagatgga aaccaaaaat gataggggga attggaggtt 1620
ttatcaaagt aagacagtat gatcagatac tcatagaaat ctgtggacat aaagctatag 1680
gtacagtatt agtaggacct acacctgtca acataattgg aagaaatctg ttgactcaga 1740
ttggttgcac tttaaatttt cccattagcc ctattgagac tgtaccagta aaattaaagc 1800
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catatttttc agttccctta gatgaagact tcaggaaata tactgcattt accataccta 2160
gtataaacaa tgagacacca gggattagat atcagtacaa tgtgcttcca cagggatgga 2220
aaggatcacc agcaatattc caaagtagca tgacaaaaat cttagagcct tttagaaaac 2280
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ttaaagtaag gcaattatgt aaactcctta gaggaaccaa agcactaaca gaagtaatac 2640
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tacatggagt gtattatgac ccatcaaaag acttaatagc agaaatacag aagcaggggc 2760
aaggccaatg gacatatcaa atttatcaag agccatttaa aaatctgaaa acaggaaaat 2820
atgcaagaat gaggggtgcc cacactaatg atgtaaaaca attaacagag gcagtgcaaa 2880
aaataaccac agaaagcata gtaatatggg gaaagactcc taaatttaaa ctgcccatac 2940
aaaaggaaac atgggaaaca tggtggacag agtattggca agccacctgg attcctgagt 3000
gggagtttgt taatacccct cctttagtga aattatggta ccagttagag aaagaaccca 3060
tagtaggagc agaaaccttc tatgtagatg gggcagctaa cagggagact aaattaggaa 3120
aagcaggata tgttactaat agaggaagac aaaaagttgt caccctaact gacacaacaa 3180
atcagaagac tgagttacaa gcaatttatc tagctttgca ggattcggga ttagaagtaa 3240
acatagtaac agactcacaa tatgcattag gaatcattca agcacaacca gatcaaagtg 3300
aatcagagtt agtcaatcaa ataatagagc agttaataaa aaaggaaaag gtctatctgg 3360
catgggtacc agcacacaaa ggaattggag gaaatgaaca agtagataaa ttagtcagtg 3420
ctggaatcag gaaagtacta tttttagatg gaatagataa ggcccaagat gaacatgaga 3480
aatatcacag taattggaga gcaatggcta gtgattttaa cctgccacct gtagtagcaa 3540
aagaaatagt agccagctgt gataaatgtc agctaaaagg agaagccatg catggacaag 3600
tagactgtag tccaggaata tggcaactag attgtacaca tttagaagga aaagttatcc 3660
tggtagcagt tcatgtagcc agtggatata tagaagcaga agttattcca gcagaaacag 3720
ggcaggaaac agcatatttt cttttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacaatac 3780
atacagacaa tggcagcaat ttcaccagtg ctacggttaa ggccgcctgt tggtgggcgg 3840
gaatcaagca ggaatttgga attccctaca atccccaaag tcaaggagta gtagaatcta 3900
tgaataaaga attaaagaaa attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga 3960
cagcagtaca aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt 4020
acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac 4080
aaaaacaaat tacaaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agaaatccac 4140
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<210>27
<211>4658
<212>DNA
<213>马感染性贫血病毒
<400>27
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catgatacca actttgtaaa agaaaaggac tggcagctga gggatgtcat tccattgctg 180
gaagatgtaa ctcagacgct gtcaggacaa gaaagagagg cctttgaaag aacatggtgg 240
gcaatttctg ctgtaaagat gggcctccag attaataatg tagtagatgg aaaggcatca 300
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acattaagac aagaatgcta gtggcagata ttccagtgac tattttggga cgagatattc 1740
ttcaggactt aggtgcaaaa ttggttttgg cacagctctc caaggaaata aaatttagaa 1800
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aatggaggtt attacaagat ctgagagaat taaacaaaac agtacaagta ggaacggaaa 2040
tatccagagg attgcctcac ccgggaggat taattaaatg taaacacatg actgtattag 2100
atattggaga tgcatatttc actataccct tagatccaga gtttagacca tatacagctt 2160
tcactattcc ctccattaat catcaagaac cagataaaag atatgtgtgg aaatgtttac 2220
cacaaggatt cgtgttgagc ccatatatat atcagaaaac attacaggaa attttacaac 2280
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gaagtaatgg ttctaaaaaa caacacaaag agttaatcat agaattaagg gcgatcttac 2400
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atcaaaaagt aatttggacg gaagaggcac aaaaagagtt agaagaaaat aatgagaaga 2700
ttaaaaatgc tcaagggtta caatattata atccagaaga agaaatgtta tgtgaggttg 2760
aaattacaaa aaattatgag gcaacttatg ttataaaaca atcacaagga atcctatggg 2820
caggtaaaaa gattatgaag gctaataagg gatggtcaac agtaaaaaat ttaatgttat 2880
tgttgcaaca tgtggcaaca gaaagtatta ctagagtagg aaaatgtcca acgtttaagg 2940
taccatttac caaagagcaa gtaatgtggg aaatgcaaaa aggatggtat tattcttggc 3000
tcccagaaat agtatataca catcaagtag ttcatgatga ttggagaatg aaattggtag 3060
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tagcagctta tgtgaccagt aatgggagaa ctaaacagaa aaggttagga cctgtcactc 3180
atcaagttgc tgaaagaatg gcaatacaaa tggcattaga ggataccaga gataaacaag 3240
taaatatagt aactgatagt tattattgtt ggaaaaatat tacagaagga ttaggtttag 3300
aaggaccaca aagtccttgg tggcctataa tacaaaatat acgagaaaaa gagatagttt 3360
attttgcttg ggtacctggt cacaaaggga tatatggtaa tcaattggca gatgaagccg 3420
caaaaataaa agaagaaatc atgctagcat accaaggcac acaaattaaa gagaaaagag 3480
atgaagatgc agggtttgac ttatgtgttc cttatgacat catgatacct gtatctgaca 3540
caaaaatcat acccacagat gtaaaaattc aagttcctcc taatagcttt ggatgggtca 3600
ctgggaaatc atcaatggca aaacaggggt tattaattaa tggaggaata attgatgaag 3660
gatatacagg agaaatacaa gtgatatgta ctaatattgg aaaaagtaat attaaattaa 3720
tagagggaca aaaatttgca caattaatta tactacagca tcactcaaat tccagacagc 3780
cttgggatga aaataaaata tctcagagag gggataaagg atttggaagt acaggagtat 3840
tctgggtaga aaatattcag gaagcacaag atgaacatga gaattggcat acatcaccaa 3900
agatattggc aagaaattat aagataccat tgactgtagc aaaacagata actcaagaat 3960
gtcctcattg cactaagcaa ggatcaggac ctgcaggttg tgtcatgaga tctcctaatc 4020
attggcaggc agattgcaca catttggaca ataagataat attgactttt gtagagtcaa 4080
attcaggata catacatgct acattattgt caaaagaaaa tgcattatgt acttcattgg 4140
ctattttaga atgggcaaga ttgttttcac caaagtcctt acacacagat aacggcacta 4200
attttgtggc agaaccagtt gtaaatttgt tgaagttcct aaagatagca cataccacag 4260
gaataccata tcatccagaa agtcagggta ttgtagaaag ggcaaatagg accttgaaag 4320
agaagattca aagtcataga gacaacactc aaacactgga ggcagcttta caacttgctc 4380
tcattacttg taacaaaggg agggaaagta tgggaggaca gacaccatgg gaagtattta 4440
tcactaatca agcacaagta atacatgaga aacttttact acagcaagca caatcctcca 4500
aaaaattttg tttttacaaa atccctggtg aacatgattg gaagggacct actagggtgc 4560
tgtggaaggg tgatggtgca gtagtagtta atgatgaagg aaagggaata attgctgtac 4620
cattaaccag gactaagtta ctaataaaac caaattga                         4658
<210>28
<211>385
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pONY3.1
<400>28
atgggagacc ctttgacatg gagcaaggcg ctcaagaagt tagagaaggt gacggtacaa 60
gggtctcaga aattaactac tggtaactgt aattgggcgc taagtctagt agacttattt 120
catgatacca actttgtaaa agaaaaggac tggcagctga gggatgtcat tccattgctg 180
gaagatgtaa ctcagacgct gtcaggacaa gaaagagagg cctttgaaag aacatggtgg 240
gcaatttctg ctgtaaagat gggcctccag attaataatg tagtagatgg aaaggcatca 300
ttccagctcc taagagcgaa atatgaaaag aagactgcta ataaaaagca gtctgagccc 360
tctgaagaat atccaatcat gatag                                       385
<210>29
<211>385
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：pONY3.2opti
<400>29
atgggcgatc ccctcacctg gtccaaagcc ctgaaaaaac tggaaaaagt caccgttcag 60
ggtagccaaa agcttaccac aggcaattgc aactgggcat tgtccctggt ggatcttttc 120
cacgacacta atttcgttaa ggagaaagat tggcaactca gagacgtgat ccccctcttg 180
gaggacgtga cccaaacatt gtctgggcag gagcgcgaag ctttcgagcg cacctggtgg 240
gccatcagcg cagtcaaaat ggggctgcaa atcaacaacg tggttgacgg taaagctagc 300
tttcaactgc tccgcgctaa gtacgagaaa aaaaccgcca acaagaaaca atccgaacct 360
agcgaggagt acccaatcat gatag                                       385
<210>30
<211>12
<212>DNA
<213>人类免疫缺损病毒
<400>30
atgggtgcga  ga                                                    12
<210>31
<211>12
<212>DNA
<213>人类免疫缺损病毒
<400>31
gatgaggatt ag                                                     12
<210>32
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：gagpol-SYNgp
<400>32
atgggcgccc gc                                                     12
<210>33
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：gagpol-SYNgp
<400>33
gatgaggatt  ag                                    12
<210>34
<211>12
<212>DNA
<213>人类免疫缺损病毒
<400>34
atgagagtga  ag                                    12
<210>35
<211>12
<212>DNA
<213>人类免疫缺损病毒
<400>35
gctttgctat  aa                                    12
<210>36
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：synGP160mn
<400>36
atgagggtga  ag                                     12
<210>37
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：synGP160mn
<400>37
 gcgctgctgt  aa                                     12

Claims (43)

1.利用编码可以将包括gag核苷酸序列的至少一部分的逆转录病毒载体基因组组装到生产细胞中的逆转录病毒颗粒中的逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列，防止所述编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列与gag核苷酸序列的至少一部分之间的重组的用途，其中，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。
2.利用编码可以将逆转录病毒载体基因组组装到生产细胞中的逆转录病毒颗粒中的逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列，在靶细胞中产生复制缺陷型逆转录病毒的用途，其中，为了在所述生产细胞中表达而对所述核苷酸序列进行了密码子优化。
3.利用编码可以将逆转录病毒载体基因组组装到生产细胞中的逆转录病毒颗粒中的逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列，防止所述逆转录病毒载体基因组在靶细胞中包装的用途，其中，为了在所述生产细胞中表达而对所述核苷酸序列进行了密码子优化。
4.如上述任意一项权利要求的用途，其中gag和pol蛋白的表达不依赖于Rev。
5.如上述任意一项权利要求的用途，其中不存在RRE。
6.如上述任意一项权利要求的用途，其中，所述逆转录病毒基因组还包括感兴趣的核苷酸(NOI)。
7.如上述任意一项权利要求的用途，其中，所述逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
8.如权利要求7的用途，其中，所述逆转录病毒颗粒基本上源于HIV-1。
9.如权利要求8的用途，其中，所述密码子优化的核苷酸序列具有SEQ ID NO：15所示的序列。
10.如权利要求7的用途，其中，所述逆转录病毒颗粒基本上源于EIAV。
11.如权利要求10的用途，其中，所述密码子优化的核苷酸序列具有SEQ ID NO：16所示的序列。
12.一种生产复制缺陷型逆转录病毒的方法，包括用下列成分转染生产细胞：
i)逆转录病毒基因组；
ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列；和
iii)编码不是由(ii)的核苷酸序列所编码的其他必需的病毒包装成分的核苷酸序列；
其特征在于，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。
13.一种防止逆转录病毒基因组在靶细胞中包装的方法，该方法包括以下步骤：
a.为了生产逆转录病毒颗粒，用下列成分转染生产细胞：
i)逆转录病毒基因组；
ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列；和
iii)编码不是由(ii)的一个或多个核苷酸序列所编码的其他必需的病毒包装成分的核苷酸序列；和
b.用步骤(a)的逆转录病毒颗粒转染靶细胞；
其特征在于，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。
14.一种防止逆转录病毒载体基因组和编码将所述病毒基因组组装到逆转录病毒颗粒中所需要的病毒多肽的核苷酸序列之间的重组的方法，该方法包括用下列成分转染生产细胞：
(i)包括gag核苷酸序列的至少一部分的逆转录病毒基因组；
(ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列；
(iii)编码不是由(ii)的核苷酸序列所编码的其他必需的病毒包装成分的核苷酸序列；
其特征在于，为了在所述生产细胞中表达，对编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化。
15.如权利要求12-14中任意一项的方法，其中gag和pol蛋白的表达不依赖于Rev。
16.如权利要求12-14中任意一项的方法，其中不存在RRE。
17.如权利要求12-16中任意一项的方法，其中，所述逆转录病毒基因组还包括感兴趣的核苷酸(NOI)。
18.如权利要求12-17中任意一项的方法，其中，所述逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
19.如权利要求18的方法，其中，所述逆转录病毒颗粒基本上源于HIV-1。
20.如权利要求19的方法，其中，所述密码子优化的核苷酸序列具有SEQ ID NO：15所示的序列。
21.如权利要求18的方法，其中，所述逆转录病毒颗粒基本上源于EIAV。
22.如权利要求21的方法，其中，所述密码子优化的核苷酸序列具有SEQ ID NO：16所示的序列。
23.如权利要求12-22中任意一项的方法，其中，iii)包括编码env蛋白的核苷酸序列。
24.如权利要求12-23中任意一项的方法，其中，i)-iii)中的至少一个包括一个或多个有功能的附属基因。
25.如权利要求12-24中任意一项的方法，其中，i)-iii)缺乏任何有功能的附属基因。
26.一种编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列，它具有SEQ IDNO：15或16的序列。
27.一种病毒载体系统，包括：
i)感兴趣的核苷酸序列；和
ii)编码组装病毒颗粒所需要的病毒多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是权利要求26所限定的。
28.一种病毒生产系统，包括：
i)含有至少一种感兴趣的核苷酸序列的病毒基因组；和
ii)编码将所述病毒基因组组装到病毒颗粒中所需要的病毒多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是权利要求26所限定的。
29.如权利要求27或28的系统，其中gag和pol蛋白的表达不依赖于Rev。
30.如权利要求27-29中任意一项的系统，其中不存在RRE。
31.如权利要求27-30中任意一项的系统，其中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。
32.如权利要求31的系统，其中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
33.如权利要求32的系统，其中，慢病毒载体基本上源于HIV-1或EIAV。
34.如权利要求27-33中任意一项的系统，其中，在i-ii)中所限定的核苷酸序列还包括外被蛋白。
35.如权利要求34的系统，其中，所述外被基因是密码子优化过的。
36.如权利要求27-35中任意一项的系统，其中，所述感兴趣的核苷酸选自治疗基因、标记基因和筛选基因。
37.如权利要求27-36中任意一项的系统，包括一个或多个有功能的附属基因。
38.如权利要求27-36中任意一项的系统，缺乏任何有功能的附属基因。
39.用于生产病毒颗粒的方法中的权利要求27-38中任意一项的病毒系统。
40.一种生产病毒颗粒的方法，该方法包括将下列成分导入生产细胞：
i)权利要求27-39中任意一项所限定的病毒基因组；
ii)权利要求26所限定的一种或多种核苷酸序列；和
iii)编码不是由(ii)中的一种或多种核苷酸序列所编码的其他必需的病毒包装成分的核苷酸序列。
41.用权利要求27-39中任意一项的生产系统或权利要求40的方法生产的病毒颗粒。
42.权利要求27-39中任意一项的病毒系统或权利要求41的病毒颗粒，用于治疗病毒感染。
43.一种药用组合物，含有权利要求27-39中任意一项的病毒系统，或权利要求41的病毒颗粒，以及可以药用的载体或稀释剂。
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