CN102946907A - 慢病毒载体向脑的递送 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于递送至脑用于治疗神经病的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体通过将所述慢病毒载体经由每半球六管道或更少、以每管道一个沉淀点的方式直接递送至脑。

Description

慢病毒载体向脑的递送
发明领域
本发明涉及用于递送至脑用于治疗神经病的慢病毒载体。所述慢病毒载体通过利用小口径递送装置(narrow bore delivery device)的连续输注直接递送至脑，与先前的方法相比，其沉积点(deposit point)减少。
发明背景
基于病毒的方法已知用于治疗多种神经病，其经过引入治疗基因转导(tranduce)神经元和/或支持细胞。例如，已经研发了一种多顺反子慢病毒载体产品
Figure BDA00002478609200011
用于治疗帕金森氏病。
Figure BDA00002478609200012
通过将芳香L-氨基酸脱羧酶、酪氨酸羟化酶和GTP环式水解酶I的基因转导至非-多巴胺细胞中介导纹状体内的多巴胺生成(Azzouz等人，(2002)J Neurosci.22:10302-10312)。
之前的慢病毒载体递送方法已经将所述载体引入至脑内的特定区域，其以不连续的流速经过多次小量沉积，以确保在大区域充分转导靶细胞(Azzouz等人，(2002)J Neurosci 22:10302-10312)。例如，
Figure BDA00002478609200013
使用多个管道(高达5个/半球)使用逐步递送方法给药，其包括沿各个管道多次沉积所述载体(Jarraya等人，(2009)Sci Transl Med 14:1(2)2-4)。
该方法要求复杂的手术前计划以确定插管管道的位置，以及耗时的手术，并且出血和其它手术并发症(与使用多插管管道引入所述载体有关)的风险增加。
因此，存在对该慢病毒载体的递送方法改进的需求。
已经报道了使用增强对流输送(CED)作为递送治疗剂至脑内的有效方法，包括磁赤铁矿纳米颗粒、脂质体和小的病毒载体，例如腺-相关的病毒载体(AAV)(Lieberman等人，(1985)J.Neurosurg.82:1021-1029；Bankiewicz等人，(2000)Exp.Neurol.164:2-14；Cunningham等人，(2000)Cell Transplant9:585-594；Nguyen等人，(2001)Neuroreport 12:1961-1964；Mamot等人，(2004)J Neurooncol.68:1-9；Hadaczek等人，(2006)Hum.Gene Ther 17:291-302以及Perlstein等人，(2008)Neuro-Oncol 10:153-161)。已经报道，使用加压注入(pressurised infusate)，颗粒和大分子经过血管周间隙的分布得以提高，超过扩散自身所能达到的分布(Chen等人，(2004)J.Neurosurg.101:314-322以及Hadaczek等人，(2009)Hum.Gene Ther 20:229-237)。
CED利用在输注导管的尖端建立的压力梯度，其最初产生"推动"治疗剂经过脑细胞之间的间隙的湍流。
尽管已经报道了成功使用CED递送小的AAV(Bankiewicz等人，(2000)Exp.Neurol.164:2-14；Cunningham等人，(2000)Cell Transplant 9:585-594；以及Hadaczek等人，(2009)Hum.Gene Ther 20:229-237)，但是这些结果对慢病毒载体的递送影响较小，因为脑内的细胞内空间已经计算为介于38和64nm之间(Thorne and Nicholson(2006)PNAS 104；5567-5572)，而慢病毒的典型直径约为100nm，典型地比AAV载体大大约4倍(Fields Virology FifthEdition(2007)Eds.Knipe and Howle y.Lippincott Williams and Wilkins)。AAV载体为无包膜病毒，其直径约为18-26nm，并且比计算的细胞内间隙小得多。
考虑细胞嗜性(Davidson等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97，PP.3428-3432；Azzouz等人，(2002)J Neurosci 22:10302-10312以及Eschemacher等人，(2004)Exp Med 90:61-69)是改变载体递送时的重要因素，因为当载体以加速的方式递送时，神经元或其它细胞靶点可以明显缺乏抵抗力(compromised)。此外，当改进手术给药至特异的脑区域的方法时，对中枢载体给药的相对免疫应答也可被改变。
附图说明
图1：给药50μL的EIAV-LacZ载体悬浮液后，在非-人灵长类的豆状核壳中的抗-β-半乳糖苷酶染色，利用以下方法给药：(A)5针头管道，用23-号Hamilton不锈钢针头在3点各递送10μL；(B)单次输注，以3μL/分钟经28-号石英插管；或(C)输注50μL的TSSM制剂缓冲液，仅经过28-号石英插管，以1μL/分钟。该图表明了，与已经确立的5针头管道方法(A)(其中载体更大程度被限制在注射管道的附近)相比，在使用单次输注(B)给药后，EIAV载体在豆状核壳中优异的中外侧和背腹侧扩散。高倍图像显示出EIAV转导细胞的神经元形态学，其在两种递送方法中类似。TSSM缓冲液注射提供了组织学染色的阴性对照。
图2：使用不同的递送方法给药50μL的EIAV-LacZ载体悬浮液后，使用立体学方法评估分布非-人灵长类的豆状核壳中的载体的量。
该数据表明了，与使用23-号针头和注射器的5管道递送方法相比，使用单次输注经28-号石英插管以1或3μL/分钟之间的恒定流速给药载体，改善了载体在豆状核壳中的分布。3μL/分钟的较高流速证明了与低流速相比，使用单次输注产生更大量的载体分布。使用23-号针头和注射器的单次输注的载体递送产生了比两种上述方法更低量的载体分布，表明针头的规格对在脑中达成改善的载体分布是至关重要的。
图3：显示在接受50μL的EIAV-LacZ载体悬浮液的切片中的活化的小神经胶质细胞的CD68-阳性染色的低倍显微照片，其使用：(A)5针头管道，其使用23-号Hamilton不锈钢针头，或(B)经28-号石英插管的单次输注。该图表明了对于两种递送方法，炎症应答是局部的并限制在针头管道的区域。
发明概述
本发明人令人吃惊地发现，尽管慢病毒载体相对于细胞间隙的尺寸，仍可能改进多-管道不连续递送的方法增加每管道递送慢病毒载体的量和输注的流速，从而反过来导致更大量的载体分散在脑内。
使用基于马传染性贫血病毒(EIAV)(其表达报道基因β-半乳糖苷酶(EIAV-LacZ))的慢病毒载体，它们显示单次连续输注的该基因改良的慢病毒载体有效地分布在食蟹猴的豆状核壳中。尽管与使用之前公开的多重5针头管道方法手动扩展载体分布相比，载体分布在豆状核壳的首尾轴中较少，使用连续单次输注方式使得载体分布在中外侧和背腹侧轴优于5-管道多次沉积方法。此外，与5-管道多次沉积方法相比，使用单次连续输注的载体分布在脑中的总量几乎大2倍。
尽管给药量增加和给药流速增加，但是所述连续输注系统没有在载体扩散的区域产生明显的神经元损伤，而且没有损伤血脑屏障的证据。动物未显示任何明显毒性或明显炎症应答的体征，而且未观察到异常的临床体征或运动障碍。这对相对大尺寸的慢病毒载体是令人惊讶的。此外，也几乎没有沿着输注插管的外表面回流的证据，这先前在使用5-管道方法使用23-号针头时观察到。
上述表明，与它们的大尺寸的预期不同，不但不需要缓慢、不连续的(多次沉积)输注少量，反而大量的慢病毒载体可以利用流体对流经细胞间的神经元基质"推入"，而不导致明显的组织损伤迹象，并且导致在靶向区域内的优异的载体分布。
这使得需要用于递送给定量的注入物的管道数降低。因此，可被递送的流速增加和量增加同时减少手术时间和与放置许多插管位点有关的风险，以及允许递送更大剂量的慢病毒载体。
还发现小号插管比宽口插管产生更好量的载体分布。认为这是由于使用小号插管减少了回流，以及来自增强载体分布的更小插管的压力增加。在压力下递送治疗剂时，回流是一个关键问题，因为如果发生回流，则大量的载体会沿插管管道向上损失，而且不会递送至靶向区域。
因此，在第一方面中，本发明提供用于递送至脑用于治疗神经病的慢病毒载体，其中包含所述慢病毒载体的组合物通过使用插管的连续输注直接递送至脑，而且其中每管以至少2μL/分钟的流速递送10-600μL之间的所述载体组合物。
所述插管可以为足以防止所述载体组合物的实质性回流的小口径。
所述流速可为恒定的或在输注所述慢病毒载体期间内逐渐递增。
所述载体可为马传染性贫血病毒(EIAV)载体，例如EIAV载体，其包括编码酪氨酸羟化酶、GTP-环式水解酶I和芳香氨基酸多巴脱羧酶的核苷酸序列。
所述慢病毒载体可以通过每半球单个插管管道递送。
所述输注可具有大约50μL的量。
所述载体递送的流速可以介于2-6μL/分钟，例如大约3μL/分钟。
所述慢病毒载体可以使用口径等于或小于28号的插管递送。
所述慢病毒载体可以用于治疗帕金森氏病。
在第二方面，本发明提供一种在受试者中治疗神经障碍的方法，该方法包括向受试者给药上述权利要求中任一项定义的慢病毒载体步骤，在该方法中，将包含所述慢病毒载体的组合物通过使用插管的连续输注直接递送至脑，其中每管以至少2μL/分钟的流速递送10-600μL之间的所述载体组合物。
在第三方面，提供了一种当直接给予至受试者的脑时改善慢病毒载体在豆状核壳中的分布量的方法，其通过使用插管的连续输注，其中每管以至少2μL/分钟的流速递送10-600μL之间的所述载体组合物。
在第四方面，提供了用于直接递送本发明的第一方面的慢病毒载体至所述受试者的脑的试剂盒，其包括一个或多个插管。
所述插管可以以10-600μL之间的量预先装满慢病毒载体组合物。
所述试剂盒可以包括一个或多个插管用于递送所述载体，其中所述插管为28号或更小。
发明详述
本发明涉及用于递送至脑的慢病毒载体。
慢病毒载体
根据本发明的慢病毒载体可以来自或可以衍生自任何合适的慢病毒。重组慢病毒颗粒能够用感兴趣的核苷酸(NOI)转导靶细胞。一旦进入细胞内，来自所述载体颗粒的RNA基因组逆转录进DNA，并整合至靶细胞的基因组中。
慢病毒载体为逆转录病毒载体大组的一部分。慢病毒的详细列表可见于Coffin等，(1997)“Retroviruses”Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds:JMCoffin，SM Hughes，HE Varmus pp 758-763)。简言之，慢病毒可以分为灵长类和非-灵长类组。灵长类慢病毒的实例包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV)，人自动免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。所述非-灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒”Visna/Maedi病毒(VMV)，以及有关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和最近公开的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒与逆转录病毒家族的群体成员之间的区别在于慢病毒能够同时感染分裂中的和非-分裂中的细胞(Lewis等人，(1992)EMBO J 11(8):3053-3058)和Lewis and Emerman(1994)J Virol 68(1):510-516)。不同的是，其它逆转录病毒(例如MLV)不能感染非-分裂中的或缓慢分裂的细胞，例如组成肌肉、大脑、肺和肝脏组织的细胞。
本文所用的慢病毒载体是一种载体，其包括至少一个来自慢病毒的组成部分。优选地，所述组成部分参与生物机理，通过该机理所述载体感染细胞，表达基因或被复制。
逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构共享许多共同特征，例如5’LTR和3’LTR，在其之间或之内坐落有包装信号，使得基因组的包装、引物结合位点、整合位点，使得整合至宿主细胞基因组，以及编码所述包装组件(它们为组装病毒颗粒所需的多肽)的gag、pol和env基因。慢病毒具有其它性质，例如在HIV中的rev和RRE序列，其使得整合的原病毒的RNA转录物从细胞核有效地输出至感染的靶细胞的细胞质。
在原病毒中，病毒基因通过称为长末端重复(LTR)的区域位于两端的侧面。所述LTR负责原病毒整合和转录。LTR还作为增强子-启动子序列，并且可以控制病毒基因的表达。
LTR自身为相同序列，其可分为三个元件，称为U3、R和U5。U3来自在RNA的3’末端独特的序列。R来自在RNA的两端重复的序列，且U5来自在RNA的5’末端独特的序列。三个元件的大小在不同的病毒之间非常地不同。
在缺陷的慢病毒载体中，基因组gag、pol和env可以不存在或不具功能化。在RNA两端的R区域为重复序列。U5和U3代表分别在RNA基因组的5’和3’末端的独特的序列。
在本发明典型的慢病毒载体中，至少部分的一个或多个对复制必须的蛋白编码区域可从病毒中除去。这使得病毒载体复制缺陷。病毒基因组的部分也可被NOI代替，以便产生包括NOI的载体，其能够转导靶点非-分裂中的宿主细胞和/或整合其基因组至宿主基因组。
在一个实施方式中，所述慢病毒载体为非-整合的载体，如WO2007/071994所述。
在另一个实施方式中，所述载体能够递送没有或缺乏病毒RNA的序列。在另一个实施方式中，异源性结合区域(异源的gag)位于待递送的RNA上，并且gag或pol上的同源结合区域可以用于确保待递送的RNA的包装。两种载体均公开于WO 2007/072056中。
所述慢病毒载体可为“非-灵长类”载体，即，来自主要不感染灵长类，尤其人的病毒。
非-灵长类慢病毒的实例可为慢病毒家族的任何成员，其天然不感染灵长类，且可以包括猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、梅-维病毒(MVV)或马传染性贫血病毒(EIAV)。
在尤其优选的实施方式中，所述病毒载体来自EIAV。EIAV具有最简单的慢病毒几何结构，并且尤其优选用于本发明。除了gag、pol和env基因，EIAV还编码三种其它基因：tat、rev和S2。Tat作为病毒LTR的转录激活剂起作用(Derse and Newbold(1993)Virology 194(2):530-536和Maury等人，(1994)Virology 200(2):632-642)，且Rev经过rev反应元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达(Martarano等人(1994)J Virol 68(5):3102-3111)。认为这两种蛋白的作用机理大致与灵长类病毒的相似机理类似(Martarano等人(1994)JVirol 68(5):3102-3111)。S2的功能是未知的。另外，EIAV蛋白Ttm已经鉴定被tat的第一个外显子编码，剪接为在跨膜蛋白的起点处的env编码序列。
本发明优选的载体为重组慢病毒载体。
术语“重组慢病毒载体”是指具有充分的慢病毒遗传信息的载体，以允许在包装组件的存在下，包装RNA基因组至能够感染靶细胞的病毒颗粒中。所述靶细胞的感染可以包括逆转录和整合至靶细胞基因组。所述重组慢病毒载体携带非-病毒编码序列，其待通过所述载体递送至靶细胞。重组慢病毒载体不能在最终靶细胞内独立复制产生感染性慢病毒颗粒。通常，所述重组慢病毒载体缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或其它复制必须的基因。本发明的载体可以装配为剪接-内含子载体。剪接内含子载体公开在PCT专利申请WO 99/15683中。
优选地，本发明的重组慢病毒载体具有最小的病毒基因组。
本文所用的术语“最小的病毒基因组”是指所述病毒载体已经被处理，以便除去非-必须元件，并保留必须元件以提供感染所需的功能，转导和递送感兴趣的核苷酸序列至靶宿主细胞。该策略的进一步细节可以在我们的专利WO 98/17815中找到。
在本发明的一个实施方式中，所述载体为自身失活的载体。
通过例示的方式，自身失活的逆转录病毒载体已经通过在3′LTR的U3区域删除转录增强子或增强子和启动子构建。一轮载体逆转录和整合后，这些变化复制到5′和3′LTR中，产生转录失活的原病毒(Yu等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.83:3194-3198；Dougherty and Temin等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.84:1197-1201；Hawley(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.84:2406-2410和Yee等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.91:9564-9568)。然而，在该载体中任何在LTR内部的启动子将仍然对转录具有活性。该策略已经用于消除病毒LTR中的增强子和启动子对从内部放置的基因的转录的影响。该影响包括增加转录(Jolly等人，(1983)Nucleic Acids Res.11:1855-1872)或抑制转录(Emerman and Temin(1984)Cell 39:449-467)。该策略也可用于消除从3′LTR下游转录至基因组DNA(Herman and Coffin(1987)Science 236:845-848)。这在人基因治疗中尤其得到关注，其中防止内源性癌基因的偶然激活非常重要。
然而，用于在宿主细胞/包装细胞内生产病毒基因组的质粒载体也可包括转录调节控制序列，其可操作地连接至所述慢病毒基因组以直接转录宿主细胞/包装细胞中的基因组。这些调节序列可为与转录的慢病毒序列有关的天然序列，即所述5’U3区域，或它们可为异源性启动子，例如另一病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组需要其它序列用于有效的病毒生产。例如，在HIV的情况下，优选包括rev和RRE序列。然而对rev和RRE的需求可以通过密码子优化而减少或消除。该策略的进一步细节可以在WO 01/79518中找到。也已知执行与rev/RRE系统相同功能的备选序列。例如，rev/RRE系统的功能性同源体发现于Mason Pfizer猴病毒中。其已知为组成性运转元件(constitutive transport element,CTE)并在基因组中包括RRE-型序列，认为其与受感染细胞中的因子相互作用。所述细胞因子可视为rev同源体。因此，CTE可以用作rev/RRE系统的备选。任何已知的或可以获得的其他功能性等价物可以与本发明有关。例如，还已知HTLV-I的Rex蛋白可以在功能上代替HIV-1的Rev蛋白。还已知Rev和Rex对IRE-BP具有相似的作用。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的慢病毒载体由自身失活最小的慢病毒载体组成，其来自马传染性贫血病毒(EIAV)，优选地编码三种包括在多巴胺合成途径中的酶。该载体编码的蛋白可包括人酪氨酸羟化酶(TH*)基因(其缺乏TH的反馈性调节中包括的N-末端160个氨基酸)、人芳香L-氨基-酸脱羧酶(AADC)，以及人GTP-环式水解酶1(GTP-CH1)基因的截短形式。所述载体可以用三种质粒暂时转染细胞(例如HEK293T细胞)制备，所述质粒编码：(1)重组EIAV(Oxford BioMedica plc，Oxford UK)载体基因组(pONYK1-ORT，WO 02/29065和Farley等人，(2007)J.Gen.Med.9:345-356)；(2)合成的EIAV gag/pol表达载体(pESGPK，WO 01/79518和WO 05/29065)以及(3)VSV-G外壳表达载体(pHGK)。
包装序列
如在本发明上下文中所用，术语“包装信号”与“包装序列”或“psi”互换使用，用于表示非-编码的，顺式作用序列，在病毒颗粒形成中，需要其用于包装慢病毒RNA链至壳内。在HIV-1中，已经定位该序列至从主要剪接供体位点(SD)的上游延伸至至少gag起始密码子的基因座。
本文所用的术语“扩展的包装信号”或“扩展的包装序列”是指使用围绕psi序列的序列进一步扩展至gag基因。包含这些其它包装序列可以增加插入载体RNA至病毒颗粒的效率。
假型化(pseudotyping)
优选地，本发明的慢病毒载体已经被假型化。因此，假型化可以提供一种或多种优势。例如，使用慢病毒载体，基于HIV的载体的env基因产物将限制这些载体仅感染表达称为CD4的蛋白的细胞。但是，如果这些载体中的env基因已经用来自其它RNA病毒的env序列替换，则它们具有更广的感染谱(Verma and Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。通过实施例的方式，Miller等将MoMLV载体用来自双向性逆转录病毒4070A的外壳假型化(Mol.Cell.Biol.5:431-437)，其它研究人员已经将基于HIV的慢病毒载体用来自VSV的糖蛋白假型化(Verma and Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。
在另一替代方案中，所述Env蛋白可为修饰的Env蛋白，例如突变的或设计的Env蛋白。可以制造或选择修饰，以引入靶向能力或降低毒性或用于另一目的(Marin等人，(1996)J Virol 70(5):2957-2962；Nilson等人，(1996)Gene Ther 3(4):280-286；以及Fielding等人，(1998)Blood 91(5):1802-1809以及其中引用的参考文献)。
所述载体可以被假型化，例如用编码至少部分狂犬病G蛋白或VSV-G蛋白的基因进行。
VSV-G：
水疱性口炎病毒(VSV，一种棒状病毒)的外壳糖蛋白(G)为已经显示能够假型化一些逆转录病毒(包括慢病毒)的外壳蛋白。
其在缺乏任何逆转录病毒外壳蛋白时假型化基于MoMLV的逆转录病毒载体的能力首次被Emi等人，(1991)J.Virol.65:1202-1207)公开。WO94/294440教导了逆转录病毒载体可以成功地用VSV-G假型化。这些假型化的VSV-G载体可以用于转导大范围的哺乳动物细胞。最近，Abe等人，(1998)J.Virol 72(8):6356-6361教导了非-感染性逆转录病毒颗粒可以通过加入VSV-G引入感染性。
Burns等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037)成功地用VSV-G将逆转录病毒MLV假型化，并产生了与MLV的天然形式相比，具有改变的宿主范围的载体。VSV-G假型化的载体已经显示不仅感染哺乳动物细胞，而且感染来自鱼、爬行动物和昆虫的细胞系(Burns等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037)。它们还显示对多种细胞系比常规的双向性外壳更有效(Yee等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9564-9568和Emi等人(1991)J.Virol.65:1202-1207)。VSV-G蛋白还可用于假型化一些慢病毒和逆转录病毒，因为其胞质尾区能够与逆转录病毒核心相互作用。
提供非-慢病毒假型化外壳(例如VSV-G蛋白)得到如下优势：载体颗粒可以浓缩至高效价而不丧失感染性(Akkina等人，(1996)J.Virol.70:2581-2585)。慢病毒和逆转录病毒外壳蛋白明显不能经受住超速离心中的剪切应力，可能因为它们是由两个非-共价键连接的亚基组成。亚基之间的相互作用可被离心破坏。与之相比，VSV糖蛋白则由单个亚基组成。因此，VSV-G蛋白假型化可以提供可能的优势。
WO 00/52188公开了由稳定的生产细胞系(其具有水泡性口炎病毒-G蛋白(VSV-G)作为与膜相关的病毒外壳蛋白)生产假型化的逆转录病毒和慢病毒载体，并提供了VSV-G蛋白的基因序列。
罗斯可病毒(Ross River Virus)
罗斯河病毒外壳已经用于假型化非灵长类慢病毒载体(FIV)，并在全身给药后主要转导肝脏(Kang等人，(2002)J Virol 76(18):9378-9388.)。报道的效率比使用VSV-G假型化的载体高20倍，并导致较低的毒性，如通过表明肝毒性的肝脏酶的血清水平所测量。
罗斯河病毒(RRV)是一种通过蚊子扩散的α病毒，其在澳大利亚的热带和温带地区具有地方性和流行性。在温带海岸地区的正常人群中的抗体率较低(6%至15%)，虽然在默里山谷河系(Murray Valley River system)的平原中血清流行病学达到27至37%。在1979至1980，罗斯河病毒在太平洋群岛流行。所述疾病在人之间不具传染性且并不致命，最初症状为在大约半数患者中的关节疼痛伴随疲劳和嗜睡(Fields Virology Fifth Edition(2007)Eds.Knipeand Howley.Lippincott Williams and Wilkins)。
杆状病毒GP64(Baculovirus GP64)
杆状病毒GP64蛋白已经显示为具有吸引力的VSV-G的替代性蛋白，用于在大规模生产临床和商品化应用所需的高效价病毒中所用的病毒载体(Kumar M，Bradow BP，Zimmerberg J(2003)Hum.Gene The r.14(1):67-77)。与VSV-G-假型化的载体相比，GP64-假型化的载体具有相似的广的细胞向性和相似的天然效价。因为，GP64表达不会杀死细胞，可以产生组成性表达GP64的基于293T的细胞系。
狂犬病G(Rabis G)
在本发明中，所述载体可以用至少部分狂犬病G蛋白或其突变株、变异株、同源体或片段假型化。
对狂犬病G蛋白以及其突变株的教导可以在WO 99/61639以及Rose等人，(1982)J.Virol.43:361-364，Hanham等人，(1993)J.Virol.67:530-542；Tuffereau等人，(1998)J.Virol.72:1085-1091，Kucera等人，(1985)J.Virol.55:158-162；Dietzschold等人，(1983)PNAS 80:70-74；Seif等人，(1985)J.Virol.53:926-934；Coulon等人，(1998)J.Virol.72:273-278；Tuffereau等人，(1998)J.Virol.72:1085-10910；Burger等人，(1991)J.Gen.Virol.72:359-367；Gaudin等人，(1995)J.Virol.69:5528-5534；Benmansour等人，(1991)J.Virol.65:4198-4203；Luo等人，(1998)Microbiol.Immunol.42:187-193，Coll(1997)Arch.Virol.142:2089-2097；Luo等人，(1997)Virus Res.51:35-41；Luo等人，(1998)Microbiol.Immunol.42:187-193；Coll(1995)Arch.Virol.140:827-851；Tuchiya等人，(1992)Virus Res.25:1-13；Morimoto等人，(1992)Virology 189:203-216；Gaudin等人，(1992)Virology 187:627-632；Whitt等人，(1991)Virology 185:681-688；Dietzschold等人，(1978)J.Gen.Virol.40:131-139；Dietzschold等人，(1978)Dev.Biol.Stand.40:45-55；Dietzschold等人，(1977)J.Virol.23:286-293以及Otvos等人，(1994)Biochim.Biophys.Acta 1224:68-76中找到。狂犬病G蛋白也公开在EP 0445625中。
其他被膜
可用于假型化慢病毒载体的其它被膜包括Mokola、Ebola、4070A和LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)。
逆转录病毒和慢病毒载体已经提出作为在体内转移感兴趣的核苷酸(NOI)至一个或多个感兴趣的位点的递送系统。
NOI编码的表达产物可为蛋白，其由细胞分泌。或者，NOI表达产物并不分泌而且在细胞内具有活性。
各种NOI可能预防性、治疗性和/或诊断性地与神经障碍有关。合适的NOI包括，但不限于：编码酶、细胞因子、炎症趋化因子、激素、抗体、抗-氧化剂分子、设计的免疫球蛋白-样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、小RNA、shRNA、siRNA、核糖酶、靶蛋白的跨域负变株、毒素、条件毒素(conditional toxin)、抗原、肿瘤抑制蛋白和生长因子、膜蛋白、作用于血管的蛋白和肽、抗-病毒蛋白和核糖酶，及其衍生物(例如相关报道基)的序列。NOI还可编码前药活化酶。
在本发明中，所述NOI可为，例如，合成的RNA/DNA序列、重组RNA/DNA序列(即通过使用重组DNA技术制备)、cDNA序列或部分基因组DNA序列。
所述NOI可用于治疗神经变性障碍，例如帕金森氏病。
所述NOI可以编码多巴胺合成或储存中涉及的酶。例如，所述酶可为以下一种或多种：酪氨酸羟化酶(TH)、GTP-环式水解酶I(GTP-CH1)和/或芳香氨基酸多巴脱羧酶(AADC)。所有三种基因的序列均可获得：登记号分别为X05290、U19523和M76180。
或者，所述NOI可以编码小泡单胺转运蛋白2(VMAT2，登记号为L23205.1)。所述病毒基因组可以包括编码AADC的NOI和编码VMAT 2的NOI。该基因组可用于治疗帕金森氏病，尤其与外周给药L-多巴相结合。
或者，所述NOI可以编码能够阻断或抑制黑质纹状体系变性的生长因子，或其防止TH-阳性的神经元死亡，或其刺激再生和功能恢复。例如，所述NOI可以编码胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、persephin生长因子、artemin生长因子或neurturin生长因子、睫状神经营养因子(CNTF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)、泛嗜性神经营养因子、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)，胰岛素生长因子-2、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C/VEGF-2、VEGF-D、VEGF-E、PDGF-A、PDGF-B、PDFG-A和PDFG-B的杂二聚体和同二聚体，以及其它相关的或不相关的神经营养因子。所述慢病毒载体可以包含编码神经营养因子的这些NOI中的一个或多个。
所述NOI还可编码抗-血管生成蛋白，其选自血管生成抑制因子、内皮他丁、血小板因子4、色素上皮细胞源因子(PEDF)、网状内皮系统刺激素、干扰素-α、干扰素-诱导性蛋白、gro-β和tubedown-1、白介素(IL)-1、IL-12、维甲酸、抗-VEGF抗体、适体、反义oligos、siRNA、凝血酶敏感蛋白、VEGF受体蛋白，例如US 5,952,199和US 6,100,071中公开那些，以及抗-VEGF受体抗体。
所述NOI可以编码所有或部分感兴趣的蛋白(“POI”)，或其突变株、同源体或变异株。例如，所述NOI可以编码POI的片段，其能够以与野生型蛋白相似的方式在体内起作用。
其中一种NOI可以包括TH基因的截短的形式，其缺乏调节区。该NOI避免了多巴胺的反馈抑制，其可能限制全长酶的表达。
术语“突变株”包括其中包括一个或多个氨基酸由野生型序列变异的POI。例如，突变株可能包括一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。突变株可以天然出现，或可以人工创造(例如通过定点诱变)。
本文中，术语“同源体”是指与NOI具有一定同源性的实体，或其编码与POI具有一定程度的同源性的蛋白。本文中，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
在上下文中，同源序列可以为在氨基酸或核苷酸水平至少75、85或90%等同，或至少95或98%等同于对象序列。典型地，所述同源体将包括或编码与对象序列相同的活性位点等。
许多NOI可组合使用。若所述慢病毒载体包括两种或多种NOI，以使两种NOI得以表达，则可能在载体基因组内存在两种或多种转录单位，每个NOI一种转录单位。然而，文献清楚地表明，当逆转录病毒载体在遗传学上保持简单时，它们能达到最高的效价和最有效的基因表达性质，因此优选使用一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)启动在多顺反子信息中的第二(和随后的)编码序列的翻译(Adam等人，1991J.Virol.65:4985)。该载体的实例公开在WO 02/29605中。
药物组合物
本发明的慢病毒载体可以以药物组合物的形式提供。所述药物组合物可以通过基因治疗用于治疗个体，其中所述组合物包含治疗有效量的所述慢病毒载体。
所述病毒制品可以通过超速离心浓缩。WO 2009/153563公开了下游处理慢病毒载体的方法。所得药物组合物可以具有至少107T.U./mL，例如107至109T.U./mL，或至少109T.U./mL。(效价表示为转导单位/mL(T.U./mL)，在HEK293T细胞系的标准D17上滴定)。
所述药物组合物可以用于治疗人或动物，例如灵长类动物受试者或伴侣动物受试者。
所述组合物可以任选包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据既定给药途径和标准制药实践进行。除了载体、赋形剂或稀释剂，所述药物组合物可以包含任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂和其它可以帮助或增加所述病毒进入靶点(例如脂质递送)的载剂。
疾病
本发明中使用的慢病毒载体用于治疗神经病。例如，所述载体可用于治疗和/或预防神经变性疾病。
可以治疗的疾病包括，但不限于：帕金森氏病；肌萎缩侧索硬化(运动神经元疾病)；亨廷顿舞蹈症，以及运动障碍，例如弗里德赖希共济失调、小脑性共济失调、distonias、重复性运动障碍、不宁腿综合征、颤抖和肌阵挛；阿尔茨海默氏病和皮克病；中风；病灶性和全身性或特发性癫痫；慢性疼痛，包括感觉异常、背痛和糖尿病神经病；脑肿瘤；慢性疲劳综合征；Creutzfeldt-Jakob病(CJD)和变异的CJD；脑白质营养不良，包括Tay-Sachs病和威尔逊病；颅内压改变；集束性头痛和偏头痛；多发性硬化；慢性进食障碍，包括Prader-Willi障碍；精神分裂症；情感障碍；躁狂和睡眠障碍，包括睡眠呼吸暂停。
尤其是，本发明有用于治疗和/或预防帕金森氏病。
通过具有能够递送例如TH、GTP-CH1和任选的AADC或AADC和VMAT2的载体的基因治疗进行治疗，可能特别有用于PD患者的晚期，其对L-多巴治疗不起显著响应。使用AADC或AADC和VMAT2组合外周给药L-多巴的治疗也可有用于晚期PD患者。
给药
用于本发明的慢病毒载体(例如通过注射至尾状壳核)给药至脑。
所述载体可以通过每半球1、2、3、4、5、6或更多管道给药。
本文所用的术语“插管(cannula)”应当包括插管、导管(cathethers)、针头或任何其它用于直接递送治疗剂至脑中的合适的装置。WO 2008/100930、WO 2008/144585和WO 2009/101397公开了所述插管，其可被使用。
在之前所述的慢病毒载体的给药系统中(Jarraya等人，(2009)Sci TranslMed 14:1(2)2-4)，所述载体组合物以不连续或“点式”方式给药，通过在管道底部给药等量部分(4μL)，抽出针头少许，然后给药第二等量部分(3μL)并进一步抽出针头少许(第二次)；然后给药第三等量部分(3μL)；因此等量部分已经沿着各针头管道在3点处沉积，递送共计10μL。
与该系统有关的缺点包括：其非常缓慢和耗费劳力，以及由于有5个针头管道/半球且每个管道有3个给药位置，因此在各个半球中存在15个可能的位置导致组织损伤和炎症。因此，不可能使用该载体递送方法增加给予各个半球的载体剂量，因为这样显著增加了手术时间。
在本发明的方法中，所述载体可以对各个管道在一个沉积点递送，且可以经各个管道递送较大量。在本发明的方法中，所述载体组合物连续地输注。在单点连续给药克服了之前系统有关的上述缺点。使用该方法，可以在实际的手术时间内向各个半球给药更高剂量的载体。
术语“连续输注”是指所述载体组合物的输注不停止且针头在递送期间不移动。对于给定的插管，待递送的载体组合物的全部量在单个沉积点且以一次“推入”的方式给予。
在连续输注过程中，所述载体组合物的流速可以实质上恒定，逐渐增加或以逐步方式增加。
递送“直接至脑”是指使用侵入式手术(例如注射)将所述慢病毒载体直接给予至脑组织。所述慢病毒载体可以递送至豆状核壳(putamen)，例如运动豆状核壳(motor putamen)。
在递送过程中，经各个插管管道递送的慢病毒载体的量可为10-600μL，或每管道可以递送大约40-200μL。对各个半球可以使用1至6个管道。
所述载体可以使用足够小口径的插管递送，以防止载体组合物的实质性回流。例如，所述插管可为以下口径，使得在递送中或递送后，少于20%、15%、10%或5%的所述载体组合物沿针头向上回流。
所述载体可以使用具有直径等于或小于23-号针头的出口的插管递送。所述出口可为大约28-号。所述装置可以具有小于23-号且大于33-号的出口。
所述插管的内径可以小于0.35、0.3、0.35、0.2或0.15mm。
本发明还提供一种当直接给予至受试者的脑中时改善慢病毒载体在豆状核壳的中外侧和背腹侧轴分布的方法，所述方法通过使用对各个插管管道连续输注递送所述慢病毒载体。
改编现有方法以改善慢病毒载体在豆状核壳的中外侧和背腹侧轴的分布并允许剂量增加，所述改编可以包括以下任一或全部：
(i)减少每管道的沉积点数；
(ii)使用慢病毒载体组合物的连续输注；
(iii)在间隙输注过程中，创造和/或维持压力梯度;
(iv)使用更高流速；和/或
(v)递送更大量。
典型地，慢病毒载体使用插管或其它插入所选受试者的脑组织的注射装置递送。当递送
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用于治疗帕金森氏病时，纹状体为所靶向的合适的脑区域。其它区域将适于其它神经障碍的治疗。本领域技术人员将容易地确定CNS的哪个一般区域将适合靶向。可用立体定位图和定位装置。定位还可通过使用患者脑部的CT和/或MR成像获得的解剖学图进行，以帮助引导所述注射装置至所选的靶向区域。
流体对流
在之前公开的慢病毒载体的给药系统中(Jarraya等人，(2009)，如上所述)，所述载体组合物通过扩散渗入脑实质。扩散取决于所述药剂的扩散率的游离浓度梯度。通过扩散的分散可能导致渗透较差，尤其对于高分子量药剂，例如慢病毒载体。
治疗剂在细胞外隙内的扩散对于确保所述治疗剂进入靶组织(例如神经元和神经胶质细胞)是必要的。Thorne和Nicholson(Thorne and Nicholson(2006)PNAS 104；5567-5572)已经确定正常细胞外隙为38至64nm。他们指出大于100nm的纳米颗粒递送系统对于穿越正常细胞外隙来说过大。如上所述，慢病毒载体为基于病毒的纳米颗粒递送系统，其直径约为100nm。
在本发明的方法中，所述慢病毒载体溶液通过流体对流分散。间质的输注使用高流速进行，本发明人已经证明其极大增强了所述慢病毒载体的分布。
在载体的连续输注期间，所述流速可以维持在稳定状态，或者流速可以增加以维持对流压力(见下文)。在连续输注期间，增加的压力梯度可，例如，稳定地增加或可以遵循变化的过程，所述过程特征在于几个小的逐步增加的流速。
在使用本领域已知的系统(例如程序性渗透、输注或本领域技术人员已知的其它泵)递送期间，液体压力可以维持、逐渐增加或变化。
在整个输注过程中维持高流速，递送完整量的载体(例如10至600μL)。
输注压力为流速、慢病毒载体制品的粘度以及插管尺寸的函数。应该选择输注压力，以便提供充分的压力梯度以增强慢病毒载体的分布，但是不足以a)对给药部位周围的组织造成显著损伤；和/或b)导致“回流”和溶液渗漏至插管管道外。
在本发明的方法中，所述慢病毒载体可以以至少1.0μL/分钟、1.5μL/分钟或2μL/分钟，或1-2μL/分钟、1-3μL/分钟、2-6μL/分钟、2-4μL/分钟或2.5-3.5μL/分钟的流速输注至脑内。所述慢病毒载体可以以大约3μL/分钟的流速输注至脑内。
在输注期间，所述对流压力(其为输注压力与颅内压力之差)可以随递送的总量增加而降低。为了维持对流压力，所述流速可以在给药期间稳定地增加。如果应用所述系统，上一段中提到的流速可以代表开始流速。
试剂盒
本发明还提供直接递送慢病毒载体至受试者的脑内的试剂盒，其包括1至12个插管。插管可以重复用于各个患者的多个管道，或者新的插管可以用于各个管道。
所述载体可以例如使用插管或导管或针头(例如Hamilton针头)递送。本文所用的术语插管应当包括插管、导管、针头或用于直接递送治疗剂至脑内的任何其它合适的装置。WO 2008/100930、WO 2008/144585和WO2009/101397公开了可以使用的所述插管。
所述插管可以预先装满所述慢病毒载体组合物。在脑中定位之前可以预处理所述插管。
所述递送装置可以例如为不锈钢的28-号Hamilton注射器或石英的28-号输注插管。
如果所述试剂盒用于每半球应用1个递送管道的方法，则所述插管可以，例如，能够递送大约40μL、100μL、150μL、200μL、300μL、400μL、500μL或600μL之间的所述慢病毒载体。如果所述试剂盒用于每半球应用2个递送管道的方法，则所述试剂盒可以包括4个插管。或者，单个插管可以重复用于各个管道，或者1个插管可以用于递送载体至各个半球，在该情况下，其将被装满所述慢病毒载体组合物，并在每次插入靶向区域之前经预处理。
所述插管还可以预连接或适于连接至输注装置，例如上述泵。或者，所述插管可以接合至已知的系统(例如注射器)用于载体给药，其通过微泵控制，例如World Precision Instruments销售的微泵，或微量注射器系统(Kopf，USA)。该递送系统可以适于与立体定位框一起使用。
在本发明的另一方面，与本发明的方法结合使用的小口径递送装置可以植入受试者内，以维持从至少几小时至数天或更久的实际时期，因此允许载体的输注发生在手术室之外。可能需要该装置具有足够弹性，使其能够使用固定装置固定从而防止脱离靶位的运动，而不损坏所述插管输注系统。还需要可以成像该装置，以确定在脑内的位置和确保所述导管在任意点不脱离所述靶位。
适于用于本发明的小口径递送装置可以在末端(输注端)具有足够小的直径，以最小化局部组织外伤，并具有非常小的无效腔但具有较大导管的强度以防止断裂并允许固定，并且具有通过成像显影所述导管的能力。
如本领域技术人员所知，存在许多小口径递送装置适合用于本发明(例如，参见WO 2007/044023中所述的递送装置)。
本发明的小口径输注装置任选地接合至受试者的头部。可能的固定方法包括，但不限于，用金属板(例如钛板)固定至钻孔附近的头骨，用钻孔内放置的塑料封盖系统固定，或经头皮外在化(externalization)并缝合引导导管至头皮。
所述试剂盒还可包含用于保存和/或使用的说明书。
本发明现将通过实施例进一步公开，其旨在协助本领域技术人员实施本发明，并非打算以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：a)常规递送和b)使用单点和高流速递送后，慢病毒载体在豆状核壳中的分布比较
使用之前公开的技术(使用Hamilton注射器和23-号针头经5针头管道给药50μL总量的载体至豆状核壳，各管道递送10μL管道(经三次沉积))给药EIAV-LacZ载体悬浮液，提供了在豆状核壳的背腹侧轴中适度的载体扩散，其到达脑结构的40至50%深度(图1)。
载体在中外侧轴中的扩散极其少于在背腹侧轴中的扩散，且所述载体仅在最大点扩散约1-2mm。然而，由于5个针头管道沿着豆状核壳的轴定位，因此载体沿着首尾轴同时在两个通过该方式递送载体的半球中扩散约7.8mm。
不同的是，与5管道用药法相比，使用本发明的方法(经23-号针头和Hamilton注射器或使用28-号石英插管以1或3μL/分钟在1个点输注总计50μL载体悬浮液至豆状核壳)产生了载体在中外侧和背腹侧轴中改善的扩散，且使用28-号插管以1或3μL/分钟流速观察到最大程度的扩散。
载体递送50μL载体(使用单管道28-号插管装置递送)产生与两个流速的5管道方式相似的首尾扩散(28-号插管为6.2-8.6mm扩散，且5管道和不连续流速为7.8mm扩散)。使用23-号针头和Hamilton注射器的单次输注观察到较少的首尾扩散(5.0-6.2mm扩散)。
当比较载体分布的总量时，令人惊讶地发现使用23-号递送装置单次给药50μL载体少于5-管道递送方法。更令人惊讶地，所述28-号递送装置达到比5-管道方法更大量的载体分布：超过较高流速的量的两倍。认为量的增加至少部分归因于使用该小口径递送装置时，载体沿着针头管道的回流减少。
总之，当使用28-号插管进行单次输注时，这些观察符合载体从所述装置的顶部均匀扩散。相反，使用23-号针头和注射器的5管道递送方法和较小程度的单次输注，载体的分布更多地限制在针头管道附近的区域。在所有组的输注中，并无迹象表明损伤周围神经元组织或破坏血脑屏障。也评估了33-号塑料插管，但认为其太柔软不宜用于可能促使外科医生无法在豆状核壳的正确位置放置插管的常规手术。使用两种流速(1或3μL/分钟)，所述28-号石英插管产生了相似的载体扩散。较小号的28-号插管产生了比23-号Hamilton针头少的疤痕。不论哪种递送方式均有相似数量的细胞(>90%)同时染色了β-半乳糖苷酶和NeuN，证明了在所有情况下载体对神经元的靶向。
在该研究中通过组织学评估炎症标记CD4和CD8(T-细胞)核CD68(活化的小神经胶质细胞)，评价了对输注EIAV-LacZ载体的局部炎症应答。对于所有的递送方法和注射装置，在针头管道的附近观察到各种标记的正染色，然而，仅观察到非常少的与载体有关的炎症应答，而且在给药方法之间没有区别。该结果表明不存在与使用单次输注以较高流速递送载体有关的炎症应答增加。
在任一研究动物中均未观察到载体给药的明显毒性或异常临床体征。动物未显示任何异常运动活动或行为，并且观察到动物进食正常。
表1.使用不同载体递送参数的载体分布的概况
Figure BDA00002478609200201
表2.显示分布量的单次实验的数据。
结论
之前，已经使用慢流速经各个插管管道内的多次沉积递送少量慢病毒载体至脑中。该方法较为繁琐而且不能进行剂量升高研究。认为允许以较快流速给药较大量载体的简化的连续输注方式更适于在治疗各种神经病中外科应用。
尚不明确是否与慢病毒一样大的载体可以经单次输注方式有效地分布至脑中，因为这些载体比之前在灵长类脑中检查到的AAV颗粒大得多(Bankiewicz等人，(2000)Exp.Neurol.164:2-14；Hadaczek等人，(2006)Hum.Gene Ther 17:291-302以及Hadaczek等人，(2009)Hum.Gene Ther 20:229-237)。由于慢病毒载体的直径(约100nm)大于细胞外隙(38-64nm)，因此有可能慢病毒载体颗粒将不会有效地驱使经过细胞外隙，其可能阻止慢病毒载体一样大的颗粒。然而，很明显，使用容易地控制的连续输注方法，慢病毒载体(例如EIAV载体)可以有效地驱使经过豆状核壳区域，并且其提供比使用多插管布置在靶向区域区域散布所述载体更佳的转导量。
之前的啮齿动物研究已经报道，以低流速和在CED方法中，载体可以扩散经过血管周间隙，可能是受到经过大脑毛细血管网的血流的脉动作用驱使(Hadaczek等人，(2004)Hum Gene Ther.15:469-79)。然而，当流速维持在高水平时，却仅发现很少的该现象。限制该血管周运输可能减少载体分布至非-靶向区域。
存在以下担忧：一些病毒载体可能产生中枢炎症风险，而且以单一流速或经CED方法输注载体可能加剧炎症应答。近期已经证明当给予灵长类的纹状体和皮质时，AAV血清型-1载体(其已经作为治疗基因的载体被检验)产生了稳健的体液和细胞应答(Hadaczek等人，(2009)Hum.Gene Ther20:229-237)。使用28-号插管以1至3μL/分钟的给药流速单次输注基于EIAV的载体，观察到没有局部炎症应答的增加。
总之，这些研究指出，目的在于治疗各种神经病的治疗基因可以通过使用所述简化的输注方式将EIAV载体安全地给予脑的靶向区域，而且大量的靶细胞可以被有效地转导。
方法和材料
动物
在载体给药前，在适应期间以恒定温度(22±2°C)和湿度(45%-65%)以及12小时昼夜循环(光照开始于07:30)，按单一性别的相容组圈养6只雄性和6只雌性食蟹猴。然后在手术给药载体后，将动物单独圈养在分别的不锈钢盒中(标准尺寸为1.10m2地表x 1m高。动物房间中的空气每小时更换大约10次。喂食动物Old World Monkey pellets(SDS DIETEX#808004)，并且动物自由取水。遵守用于英国的Directive 86/609/EEC European Conventionfor the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and OtherScientific Purposes and the Animals(Scientific Procedure)Act 86管理动物使用和看护。
载体给药
手术前将动物禁食，并防止取水大约6小时。向动物给药硫酸阿托品(0.04mg/kg，肌内)、盐酸氯胺酮(10mg/kg，肌内)和丁丙诺啡(0.01mg/g，肌内)，然后在10分钟后用丙泊酚(3mg/kg，静脉内)麻醉。在手术前24小时然后在手术后每48小时至1周，还向动物注射阿莫西林(30mg/kg，皮下)。将动物用经调节容量的呼吸机递送的异氟烷吸入麻醉剂维持麻醉。监测和记录ECG、O2饱和度和心率。在整个手术过程中使用直肠温度计监测体温。将动物放置在立体定位架(Unim′ecanique，France)中，并使用微量注射器系统(Kopf，USA)给药载体至豆状核壳中，所述微量注射器用于以在豆状核壳中的单次小沉积给药载体，其使用接合至710Hamilton注射器的6.5mm长的23-号不锈钢Hamilton针头(Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzerland)。对于单次豆状核壳输注，使用6.5mm长的23-号不锈钢Hamilton针头和注射器、6.5mm长的28-号不锈钢Hamilton针头和注射器，或通过一小段用于最小化死体积的塑料管(Plastics-1，Roanoke，VA，USA)接合至Hamilton注射器的6.5mm长的石英注射插管输注载体悬浮液。在不损伤硬膜的情况下在头骨钻孔后，将安装在玻璃注射器上的脑室造影插管引入侧脑室的前角，并注射造影剂(Omnipaque，Nycomed，Norway)。在插入头骨前，使用立体定位图进行精确调整(Martin&Bowden(1996)Neuroimage 4(2):119-150)。前联合(AC)的准确位置由脑室造影术得出，然后将其用于定位左右豆状核壳二者。布置输注插管的坐标为AC-1mm(豆状核壳的运动区的正中央)。对于在各个豆状核壳内的多次沉积，在3个深度注射载体，在最深沉积处递送4mL，然后在另两个沉积处(各在1mm之上递送)递送3mL，每个针头管道递送10mL。第一个5Hamilton针头管道处于前联合(AC)的高度，即AC 0mm，第二次注射：在AC尾侧2mm(AC-2mm)，第三次注射：在AC尾侧3mm(AC-3mm)，第四次注射：在AC尾侧5mm(AC-5mm)，以及第五次注射：在AC尾侧6mm(AC-6mm)，以沿着豆状核壳的首尾长度分布载体。在取出前，在每次注射/输注后将所述Hamilton注射器和输注导管在原位停留另外2分钟。
载体以0.5、1或3μL/分钟的单一流速输注，使用编程的小输注泵(UltraMicroPump III;World Precision Instruments,Sarasota,FL,USA)进行。双侧给药载体至豆状核壳，总量为每半球50μL，且各个半球接受通过不同流速或插管装置递送的载体。在一只动物中，将TSSM制剂缓冲液输注至豆状核壳，在一个半球中使用23-号Hamilton针头以1mL/分钟递送缓冲液，并在另一个半球中通过28-号Hamilton针头以1mL/分钟递送载体。所述TSSM-输注的动物用于评价在不存在病毒载体时，无菌制剂缓冲液本身对神经元损伤和炎症应答的相对扩大。手术后，密切观察动物并保持温暖，直至它们恢复翻正反射和舌咽反射，然后将它们放回笼舍中。每天两次给药丁丙诺啡麻醉，共3天(0.02mg/kg，肌内)，并在手术后每周记录体重。
组织学
给药4周后，经注射氯胺酮(10mg/g)禁食过夜然后使用戊巴比妥钠麻醉剂(10-30mg/kg，静脉内)安乐死，并对动物进行尸检。收集血样用于评价对病毒的免疫应答后，将动物放血，灌注肝素化的磷酸盐缓冲液盐水(0.9%w/v氯化钠，USP，含有大约25U/mL肝素)，然后灌注4%缓冲的多聚甲醛的磷酸盐缓冲液盐水(PBS)溶液。小心切开脑部(取出硬脑膜)，并在5±3°C放入新鲜的4%多聚甲醛中过夜，然后转移至冷却过滤的30%蔗糖溶液的PBS溶液共2至4天。然后将脑部沿中线向下切成两个半球，并将各个半球在冷的异戊烷(-40至-50°C)中急冻并保存在-80°C，然后使用低温恒温器以40微米(40μm)厚切片。将含有豆状核壳区域的脑切片收集在含有5个切片的罐中，以深入脑半球的首尾轴200微米(200μm)的等距收集。用抗-β-半乳糖苷酶单克隆抗体染色自由漂浮的脑切片。二抗和三抗获自Vectastain的抗小鼠ABC试剂盒(#PK-6102)，并且方法根据试剂盒说明书。使用DAB过氧化底物试剂盒(目录号SK-4100)实现DAB显影。然后将切片放在玻璃显微镜载玻片上。或者，用抗-GFAP抗体(Chemicon#MAB3402)以1:200的浓度染色脑半球切片。还使用H&E染色所选切片，并且用显微镜分析切片，以评价细胞渗入的水平和组织形态学的改变。用10%过氧化氢除去非-特异的染色后，染色载体输注区域中的所选切片的免疫标记CD8、CD4和CD68，然后在含0.5%triton X-100的10%血清中培养过夜。仅应用一抗(IgG阴性对照，无主要阴性对照，小鼠抗人CD4、CD8和CD68)共2小时。在PBS+0.02%Tween 20中的三次5分钟清洗后，使用抗-小鼠载体elite ABC试剂盒，在各步骤之间进行三次5分钟清洗。然后使用DAB过氧化物酶试剂盒进行显影。
在贯穿注射的豆状核壳的系列脑切片中，通过测量正性β-半乳糖苷酶染色的区域计算载体分布的量，并采用标准立体学方法(使用卡瓦列里原理)估计总体积覆盖度。
实施例2：使用a)常规递送和b)具有较小号装置和高流速且减少注射部位的数量的递送，在给药至帕金森氏病患者的运动豆状核壳后，慢病毒载体对于帕金森氏病的有效性比较
进行一项I/II期临床试验，以评估基于慢病毒载体的治疗(称为
Figure BDA00002478609200241
)对帕金森氏病的安全性和有效性。
Figure BDA00002478609200242
为EIAV慢病毒载体，其包括三种编码多巴胺生物合成途径中的酶的基因。作为试验的部分，使用以下评估
Figure BDA00002478609200243
纠正帕金森氏病的症状的治疗可能：1)常规的给药方法和2)连续输注方法。所述常规方法包括使用Hamilton注射器和23-号针头以及1μL/分钟的给药速率经5针头管道，注射总量为125μL的给予各个豆状核壳的载体。沿着各个注射管道给药总计25μL载体，且5μL载体的5次沉积沿着所述管道分布。在递送的连续方法中，使用Hamilton注射器和较小的28-号针头给药相同总量的载体(125μL)。向各个豆状核壳进行三次注射，并且使用3μL/分钟的增加的给药速率在各个注射部位连续输注载体。在三个注射部位递送的载体量为42μL、42μL和43μL。使用输注方法用于载体给药的手术时间几乎为常规方法的一半。
所述手术操作在使用两种给药方法所有患者中均为安全和良好耐受的。未在任何患者中报道与
Figure BDA00002478609200251
或两种给药方法有关的严重不良事件。
所述研究的主要有效性终点为在治疗后6个月，与基线分数相比的Unified Parkinson’s Disease Rating Scale(UPDRS)的运动部分(部分III)的改善。至今为止运动功能的改善的概况示于表3(在患者的“OFF”状态(即停止帕金森氏病用药后)中，根据Unified Parkinson’s Disease Rating Scale[UPDRS]评价运动功能)中。在使用常规的、不连续、5个沉积点/管道方法接受
Figure BDA00002478609200252
的患者组中，在6个月观察到UPDRS部分III得分改善34%。有意思的是，使用连续输注方法接受相同总量的载体的患者显示出更大的UPDRS部分III得分改善，在术后6个月达到43%改善。
此外，在6个月，患者在UPDRS部分III“ON”分数显示了26%的平均改善。患者日记数据显示在口服L多巴有效且无麻烦的运动失调3.2小时的时候功能性改善增加，且在口服L多巴无效4.1小时的时候功能性改善降低。
结果显示与之前使用的不连续、5-个沉积点/管道方法相比，连续输注方法在帕金森患者中提供了增加的有效性。这是因为
Figure BDA00002478609200254
载体在注射的豆状核壳中分布改善，尽管不可能在活着的患者中进行该评价。另外，使用连续输注方法的载体给药的手术时间几乎为常规方法的一半。
方法和材料
所以患者均在全身麻醉下使用双侧脑功能区定位注射向纹状体内注射
Figure BDA00002478609200261
在给药前进行颅内MRI扫描，以提供精确的注射坐标以靶向豆状核壳的感觉运动豆状核壳区域。
对于每次注射，使用所述来自MRI的坐标将长130mm口径1.2mm的引导管插入脑内的正确位置，而不进入豆状核壳。对于常规给药方法，将
Figure BDA00002478609200262
装入接合至长150mm的23号两点型斜面的不成芯针头的Hamilton注射器中。对于连续输注方法，将
Figure BDA00002478609200263
装入接合至相同长度的28-号针头的Hamilton注射器中。将所述针头经引导管下降至脑中并穿刺运动豆状核壳。然后在输注前将所述引导管抽出大约10mm。对于脑的各个半球使用新的引导管、Hamilton注射器和针头。
对于常规给药方法，将25μL的给药至两个脑半球中的各5个单独的管道中。各个管道接受5次5μL的
Figure BDA00002478609200266
沉积。首先给药最深的沉积，然后将针头抽出1mm并给药第二个5μL的沉积。如此重复直至完成所有5个沉积。在各个注射管道以1μL/分钟的速率手动进行给药(先注射0.5μL，然后暂停30秒，再注射第二个0.5μL，以此类推)，直至沿着各个管道注射5μL至5个沉积。在单个管道完成所有5个沉积后将针头原位停留1分钟。
对于连续输注方法，将
Figure BDA00002478609200267
给药至三个注射管道/半球。使用连续输注以3μL/分钟的恒定递送速率给药量为42μL、42μL和43μL的
Figure BDA00002478609200268
通过使用泵而非上述用于常规方法的手动系统控制流速。
上文说明书中提及的所有出版物在此通过引用方式并入本文。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本领域技术人员显而易见对所述方法和本发明的系统作出各种改进和变化。尽管已经结合具体优选实施方式阐明了本发明，但是应当理解，请求保护的本发明不应当过分限制于该具体实施方式。事实上，对实施本发明的公开方式的各种改进既定包括在权利要求书的范围内，而且它们对于分子生物学、病毒学、神经学或相关领域的技术人员显而易见。

Claims (17)

1.用于递送至脑治疗神经病的慢病毒载体，其中通过利用插管的连续输注将包含该慢病毒载体的组合物直接递送至脑，并且其中每管以至少2μL/分钟的流速递送10-600μL之间的所述载体组合物。
2.权利要求1的慢病毒载体，其中所述插管具有足以防止所述载体组合物的实质性回流的小口径。
3.权利要求1或2的慢病毒载体，其中在输注所述慢病毒载体期间保持恒定流速。
4.权利要求1或2的慢病毒载体，其中在输注所述慢病毒载体期间增加流速。
5.上述权利要求中任一项的慢病毒载体，其为马传染性贫血病毒(EIAV)载体。
6.权利要求5的EIAV载体，其包括编码酪氨酸羟化酶、GTP-环式水解酶I和芳香氨基酸多巴脱羧酶的核苷酸序列。
7.上述权利要求中任一项的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体通过每个半球一个管道递送。
8.权利要求7的慢病毒载体，其中所述输注量为大约50μL。
9.上述权利要求中任一项的慢病毒载体，其中所述载体递送的流速介于2-4μL/分钟。
10.上述权利要求中任一项的慢病毒载体，其中所述载体递送的流速为大约3μL/分钟。
11.上述权要求中任一项的慢病毒载体，其中使用口径等于或小于28号的插管递送所述慢病毒载体。
12.上述权利要求中任一项的慢病毒载体，用于治疗帕金森氏病。
13.一种在受试者中治疗神经障碍的方法，所述方法包括向所述受试者给药上述权利要求中任一项定义的慢病毒载体的步骤，在该方法中通过使用插管的连续输注将包含该慢病毒载体的组合物直接递送至脑，并且其中每管以至少2μL/分钟的流速递送10-600μL之间的所述载体组合物。
14.一种当直接给药受试者的脑时改善慢病毒载体在豆状核壳中的分布量的方法，其中所述方法包括使用插管连续输注包含载体的组合物，其中每管道以至少2μL/分钟的流速递送10-600μL之间的所述载体组合物。
15.试剂盒，其用于直接递送权利要求1-12中任一项定义的慢病毒载体至受试者的脑，其包括一个或多个插管。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述插管预先装满量为10至600μL之间的所述慢病毒载体。
17.权利要求15或16的试剂盒，其包括一个或多个用于递送所述载体的插管，其中所述插管为28号或更小。
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