PT1278878E

PT1278878E - Vectores de eiav com codões optimizados

Info

Publication number: PT1278878E
Application number: PT01921651T
Authority: PT
Inventors: Alan John Kingsman; Narry Kim; Ekaterini Kotsopoulou; Jonathan Rohll; Kyriacos Andreou Mitrophanous
Original assignee: Oxford Biomedica Ltd
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2001-04-18
Publication date: 2010-05-31
Also published as: DK1278878T3; CN101024845B; JP4981231B2; GB0009760D0; AU4861901A; US20050042234A1; ES2343564T3; EP2194137A3; US20080269473A1; EP1278878B1; US20100273996A1; EP2194137B1; CA2404129A1; CN1426477A; DE60141690D1; ATE462796T1; WO2001079518A3; CY1110123T1; WO2001079518A2; EP2194137A2

Description

DESCRIÇÃO "VECTORES DE EIAV COM CODÕES OPTIMIZADOS"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a utilizações para a segurança de vectores retrovirais, capazes de transferência de genes terapêuticos para utilização em terapia génica e a novas sequências nucleotidicas para tal utilização.

Antecedentes à Invenção

Os vectores retrovirais são agora largamente utilizados como veículos para a transferência de genes para células. A sua popularidade deriva do facto de que são fáceis de produzir e medeiam a integração estável do gene que transportam para no genoma da célula alvo. Isto possibilita a expressão de longo prazo do gene transferido (1).

Tem havido interesse considerável, durante algum tempo, no desenvolvimento de sistemas de vectores retrovirais baseados em lentivírus. Os lentivírus são um pequeno subgrupo de retrovírus complexos. Contêm, adicionalmente aos genes retrovirais comuns (gag, pol e env) , genes que lhes possibilitam regularem o seu ciclo de vida e infectarem células que não se dividem (2). Os sistemas de vector baseados nestes são, por conseguinte, de interesse, em virtude da sua potencial utilização na transferência de um gene de interesse para células que não se 1 dividem, tal como neurónios. Adicionalmente, os vectores lentivirais possibilitam a expressão de longo prazo muito estável do gene de interesse. Demonstrou-se que esta é, pelo menos, três meses para células neuronais de rato transduzidas, enquanto os vectores baseados em MLV eram apenas capazes de expressar o gene de interesse durante seis semanas. 0 lentivírus geralmente mais utilizado é o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), o agente etiológico da SIDA (síndrome de imunodeficiência adquirida). Foi demonstrado que os vectores baseados em HIV transduzem eficientemente células (3) que não se dividem e podem ser utilizados, por exemplo, para direccionarem genes terapêuticos anti-HIV para células susceptíveis a HIV.

Contudo, os vectores de HIV têm um determinado número de desvantagens significativas que podem limitar a sua aplicação terapêutica a determinadas doenças. Em particular, o HIV-1 é um patógeno humano transportando proteínas e sequências potencialmente oncogénicas. Existe o risco de que a introdução de partículas de vector, produzidas em células de empacotamento que expressam gag-pol de HIV, irá introduzir estas proteínas no doente, conduzindo a seroconversão. A ênfase tem sido, por conseguinte, colocada na segurança destes vectores. Uma estratégia tem em conta a concepção de sistemas de produção para vectores retrovirais. Um sistema vector de retrovírus consiste basicamente em dois elementos, uma linha celular de empacotamento e um genoma de vector. A linha de empacotamento mais simples consiste num provírus, no qual a sequência ψ (um determinante de empacotamento de ARN referido em HIV como se situando entre U5 e gag) foi removida. Quando 2 transfectadas, de um modo estável, para uma célula, as partículas virais contendo transcritase reversa irão ser produzidas mas o ARN de virião não irá ficar empacotado nestas partículas. 0 componente de complementação num sistema vector de retrovírus é o próprio vector de genoma. 0 vector de genoma necessita de conter uma sequência de empacotamento mas muitas das regiões codificantes estruturais podem ser removidas. Frequentemente, um gene marcador de selecção, ou outra sequência nucleotídica de interesse, é incorporada no vector. Os stocks no vector da linha de empacotamento podem ser, depois, utilizados para infectar células alvo. Desde que a célula seja infectada com sucesso pela partícula virai, a sequência de vector de genoma irá ser transcrita de um modo reverso e integrada pela maquinaria retroviral. Contudo, a infecção é um processo final, assim não deverá ocorrer replicação ou propagação adicional do vector.

Como anteriormente indicado, contudo, são encontrados problemas na concepção de vectores retrovirais seguros e eficazes. Estes incluem a possibilidade de que a recombinação entre o vector de empacotamento e a sequência de empacotamento possa conduzir à produção de vírus de replicação competente de tipo selvagem. Consequentemente, os esforços têm sido dirigidos ao melhoramento da segurança de construções de linhas celulares de empacotamento.

Em linhas celulares de empacotamento de segunda geração, adicionalmente à remoção da sequência de empacotamento, a 3' LTR foi, também, removida, de modo que são necessárias duas recombinações para produzir um vírus de tipo selvagem. 3

Em linhas de empacotamento de terceira produção, os genes gag-pol e o gene env são colocados em construções separadas que são sequencialmente introduzidas nas células de empacotamento, de modo a prevenir a recombinação durante a transfecção.

Em relação ao sinal de empacotamento, o documento EP 0368882A (Sodroski) divulga que no HIV corresponde à região entre o dador de excisão 5' principal e o codão de iniciação de gag e, particularmente, corresponde a um segmento mesmo a jusante do dador de excisão 5' principal e cerca de 14 bases a montante do codão de iniciação de gag. É esta região que Sodroski ensina que deve ser removida da cassete gag-pol. 0 documento W097/12622 (Verma) descreve que em HIV-1 pode ser realizada uma remoção interna de 39 pb na sequência ψ, entre o sitio de dador de excisão 5' e o codão de iniciação do gene gag. A modulação de codão pode ser utilizada para reduzir a frequência de recombinação mantendo, simultaneamente, a sequência proteica primária das construções, c.f. (4), em que a região de sobreposição entre as construções de expressão de gag-pol e env foi reduzida para 61 pb, estendendo-se para lá da região comum de pol e env que estão em fases de leitura diferentes. As mutações de transversão foram introduzidas nos 20 codões finais de pol, retendo a integridade da região codificante reduzindo, simultaneamente, a homologia com env a 55% na região de sobreposição. De modo semelhante, foram introduzidas mutações de modulação no 3' de env e todas as sequências a jusante do codão de terminação de env foram removidos.

Os vectores eficientes contêm, habitualmente, parte de gag no vector de genoma, de modo a aumentar o titulo de virião. Ao 4 contrário da sequência de empacotamento que pode estar em qualquer posição numa sequência para efectuar o empacotamento, a sequência gag deve estar na sua posição nativa adjacente a ψ, de modo a ter algum efeito.

Será entendido que, embora tenham sido realizados melhoramentos significativos na concepção de célula e vector de empacotamento, existe ainda âmbito para aperfeiçoamentos adicionais de linhas de empacotamento actuais.

Sumário da Invenção E, por conseguinte, um objectivo da invenção proporcionar partículas retrovirais, em particular partículas lentivirais e, particularmente, aquelas que transportam construções nucleotídicas codificando proteínas terapêuticas que têm segurança melhorada em relação à partícula virai de tipo selvagem correspondente. No documento W099/41397 é descrita a optimização de codões dos genes gag-pol como um meio de superar o requisito de Rev/RRE para exportar e para melhorar a estabilidade de ARN. Foi, agora, contudo, verificado que a sequência gag-pol com codões optimizados supera potenciais problemas de recombinação com genomas de vector que transportam parte de uma sequência gag com o objectivo de aumento de título. Esta estratégia evita também a necessidade de utilização de regiões gag de diferentes vírus nas construções de empacotamento e genoma de vector.

Outra vantagem significativa proporcionada pela invenção é que a optimização de codões dissocia estruturas secundárias de ARN, tal como o sinal de empacotamento, tornando, deste modo, o 5 ARNm de gag-pol não empacotável. Deste modo, a presente invenção permite que a sequência retroviral a montante do codão de iniciação de gag seja retida, em contraste com Sodroski e Verma, sem comprometer significativamente a segurança.

Constatações da Invenção

Consequentemente, num aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol capazes de montagem de um genoma de vector retroviral numa partícula retroviral numa célula produtora, de modo a produzir um retrovírus de replicação defeituosa numa célula alvo, em que a sequência nucleotídica tem codões optimizados para expressão na célula produtora e em que a sequência nucleotídica compreende a sequência mostrada na SEQ ID N° 16. Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol capazes de montagem de um genoma de vector retroviral numa partícula retroviral numa célula produtora, de modo a prevenir o empacotamento do genoma de vector retroviral numa célula alvo, em que a sequência nucleotídica tem codões optimizados para expressão na célula produtora e em que a partícula retroviral é, substancialmente, derivada de EIAV; e a sequência nucleotídica compreende a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol capazes de montagem de um genoma de vector retroviral compreendendo, pelo menos, parte, de uma sequência nucleotídica gag, numa partícula retroviral numa célula 6 produtora, de modo a prevenir a recombinação entre a referida sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol e a, pelo menos, parte de uma sequência nucleotidica gag, em que a sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol tem codões optimizados para expressão na célula produtora e em que a sequência nucleotidica compreende a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.

Dito de outro modo, a presente invenção proporciona um método de produção de um retrovírus de replicação defeituosa, compreendendo a transfecção de uma célula produtora com o seguinte: i) um genoma retroviral; ii) uma sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol; e iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virai essenciais não codificados pela sequência nucleotidica de (ii); caracterizado por a sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol ter codões optimizados para expressão na célula produtora e por a sequência nucleotidica com codões optimizados compreender a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.

Deste modo, num aspecto, a presente invenção proporciona um método de prevenção do empacotamento de um genoma retroviral numa célula alvo, compreendendo os passos de: a. transfecção de uma célula produtora com o seguinte, de modo a produzir partículas retrovirais: 7 i) um genoma retroviral; ii) uma sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol; e iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virai essenciais não codificados por uma ou mais das sequências nucleotídicas de (ii); e b. transfecção de uma célula alvo com partículas retrovirais do passo (a); caracterizado por a sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol ter codões optimizados para expressão na célula produtora e por a sequência nucleotídica com codões optimizados compreender a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de prevenção da recombinação entre um genoma de vector retroviral e uma sequência nucleotídica codificando um polipéptido virai requerido para a montagem do genoma virai em partículas retrovirais, compreendendo a transfecção de uma célula produtora com o seguinte: (i) um genoma retroviral compreendendo, pelo menos, parte de uma sequência nucleotídica gag; (ii) uma sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol; e (iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virai essenciais não codificados pela sequência nucleotídica de (ii); caracterizado por a sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol ter codões optimizados para expressão na célula produtora e por a sequência nucleotídica com codões optimizados compreender a sequência mostrada na SEQ ID N° 16. É, também, descrita uma sequência com codões optimizados como mostrada na SEQ ID N° 15. A presente invenção proporciona adicionalmente uma partícula retroviral, produzida utilizando a sequência da presente invenção e métodos de produção para a sua preparação. A presente invenção proporciona, também, uma composição farmacêutica compreendendo uma partícula virai de acordo com a presente invenção, juntamente com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Por "redução", significa-se que a probabilidade de um evento ocorrer é reduzida, em comparação com uma população comparável tendo a sequência gag-pol de tipo selvagem. Numa população, a probabilidade de um evento ocorrer pode ser prevenida para um vector ou partícula de retrovírus individual.

Descrição Detalhada da Invenção

Diversas características e formas de realização preferidas da presente invenção irão ser agora descritas a título de exemplo não limitativo. A presente invenção emprega o conceito de optimização de codões. 9 A optimização de codões foi anteriormente descrita no documento W099/41397 como um meio de superar o requisito de Rev/RRE para exportar e para melhorar a estabilidade de ARN. As alterações à sequência codificante para os componentes virais melhoram as sequências para a utilização de codão nas células de mamífero ou outras células que devem actuar como as células produtoras para a produção de partícula de vector retroviral. Este melhoramento na utilização de codão é designado por "optimização de codões". Muitos vírus, incluindo HIV e outros lentivírus, utilizam um grande número de codões raros e por alteração destes, de modo a corresponderem a codões de mamífero geralmente utilizados, pode ser alcançada a expressão aumentada dos componentes de empacotamento em células produtoras de mamífero. As tabelas de utilização de codões são conhecidas na técnica para células de mamífero, assim como para uma variedade de outros organismos.

Em virtude de alterações nas suas sequências, as sequências nucleotídicas codificando os componentes de empacotamento das partículas virais requeridas para montagem de partículas virais nas células produtoras/células de empacotamento têm sequências de instabilidade de ARN (INS) eliminadas destas. Ao mesmo tempo, a sequência codificante de aminoácidos para os componentes de empacotamento é retida, de modo que os componentes virais codificados pelas sequências permanecem os mesmos ou, pelo menos, suficientemente semelhantes, de modo que a função dos componentes de empacotamento não seja comprometida. 0 termo "polipéptido virai requerido para a montagem de partículas virais" significa um polipéptido normalmente codificado pelo genoma virai a ser empacotado dentro de partículas virais, na ausência do qual o genoma virai não pode 10 ser empacotado. Por exemplo, no contexto de retrovírus, tais polipéptidos incluiriam gag-pol e env. 0 termo "componente de empacotamento" é, também, incluído dentro desta definição.

Como discutido no documento W099/32646 da requerente, os requisitos de sequência para o empacotamento de genomas de vectores de HIV são complexos. 0 sinal de empacotamento de HIV-1 abrange o sítio dador de excisão e contém uma porção da região não traduzida 5' do gene gag, que tem uma putativa estrutura secundária contendo 4 hastes em ansa curtas. Contudo, sequências adicionais em qualquer outra parte no genoma são, também, conhecidas como sendo importantes para encapsidação eficiente de HIV. Por exemplo, os primeiros 350 pb da sequência codificante da proteína gag podem contribuir para empacotamento eficiente. Deste modo, para construção de vectores de HIV-1 capazes de expressão de genes heterólogos, um sinal de empacotamento estendendo-se a 350 pb da região codificante da proteína gag tem sido utilizado no genoma de vector. Foi agora verificado que a optimização de codões da região codificante de gag no vector de empacotamento, pelo menos, na região na qual se estende o sinal de empacotamento tem, também, o efeito de perturbação de empacotamento do genoma de vector. Deste modo, a optimização de codões é um novo método de obtenção de uma partícula virai de replicação defeituosa.

Também, como divulgado no documento W099/32646, a estrutura do sinal de empacotamento em lentivírus equinos é diferente daquela de HIV. Em vez de uma curta sequência de 4 hastes em ansa, juntamente com um sinal de empacotamento estendendo-se a 350 pb da região codificante da proteína gag, verificou-se que em lentivírus equinos o sinal de empacotamento pode não se 11 estender para tao próximo da região codificante da proteína gag como se possa ter pensado.

Num exemplo, apenas os codões referentes ao sinal de empacotamento têm os codões optimizados. Deste modo, a optimização de codões estende-se para, pelo menos, os primeiros 350 pb da região codificante da proteína gag. Em lentivírus equinos, pelo menos, a optimização de codões estende-se a, pelo menos, o nucleótido 300 da região codificante de gag, de um modo mais preferido a, pelo menos, o nucleótido 150 da região codificante de gag. Embora não óptima, a optimização de codões poderia estender-se a, digamos, apenas os primeiros 109 nucleótidos da região codificante de gag. Pode ser, também, possível que a optimização de codões se estenda apenas ao primeiro codão da região codificante de gag.

Contudo, as sequências têm os codões optimizados na sua totalidade, com a excepção da sequência abrangendo o sítio de deslocação de fase. O gene gag-pol compreende duas fases de leitura de sobreposição codificando as proteínas gag e pol, respectivamente. A expressão de ambas as proteínas depende da deslocação de fase durante a tradução. Esta deslocação de fase ocorre como resultado de "resvalamento" de ribossoma durante a tradução. Pensa-se que este resvalamento seja causado, pelo menos em parte, por estruturas secundárias de ARN de paragem do ribossoma. Tais estruturas secundárias existem a jusante do sítio de deslocação de fase no gene gag-pol. Para o HIV, a região de sobreposição estende-se do nucleótido 1222 a jusante do início de gag (em que o nucleótido 1 é o A do ATG de gag) até ao fim de gag (nt 1503). Consequentemente, um fragmento de 12 281 pb abarcando o sítio de deslocação de fase e a região de sobreposição das duas fases de leitura não tem, de um modo preferido, codões optimizados. A retenção deste fragmento irá possibilitar expressão mais eficiente das proteínas gag-pol.

Para o EIAV, partiu-se do pressuposto que o início da sobreposição seria o nt 1262 (onde o nucleótido 1 é o A do ATG de gag) . 0 fim da sobreposição é a 1461 pb. Para garantir que o sítio de deslocação de fase e o gag, gag-pol se sobreponham, a sequência de tipo selvagem foi retida desde o nt 1156 ao 1465 . Isto pode observar-se na Figura 9b.

Podem ser realizadas derivações da utilização de codão óptima, por exemplo, para acomodar sítios de restrição convenientes e podem ser introduzidas alterações conservativas de aminoácidos nas proteínas gag-pol. A optimização de codões foi baseada em genes de mamífero ligeiramente expressos. A terceira e, por vezes, a segunda e terceira bases podem ser alteradas. Um exemplo de uma tabela de utilização de codão é proporcionado na Figura 3b.

Devido à natureza degenerada do Código Genético, será entendido que numerosas sequências de gag-pol podem ser alcançadas por um especialista. Também, existem muitos variantes retrovirais descritas e que podem ser utilizadas como um ponto de partida para a produção de uma sequência gag-pol com codões optimizados. Os genomas lentivirais podem ser bastante variáveis. Por exemplo, existem muitas quase-espécies de HIV-1 que ainda são funcionais. Este é, também, o caso para o EIAV. Estas variantes podem ser utilizados para melhorar partes particulares do processo de transdução. Exemplos de variantes de 13 HTV-1 podem ser consultados em http://hiv-web.lanl.qpy. Detalhes de clones de EIAV podem ser consultados na base de dados NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.qov. A estratégia para sequências de gag-pol com codões optimizados pode ser utilizada em relação a qualquer retrovirus. Isto seria aplicado a todos os lentivirus, incluindo EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV—1 e HIV—2. Adicionalmente, este método poderia ser utilizado para aumentar a expressão de genes a partir de HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV e retrovirus endógenos humanos (HERV).

Como a optimização de codões pode resultar em disrupção de estruturas secundárias de ARN, tal como o sinal de empacotamento, será entendido que qualquer sinal de empacotamento endógeno a montante do codão de iniciação de gag poderia ser retido, sem comprometer a segurança.

Uma vantagem adicional de componentes de empacotamento de optimização de codões é que estes podem aumentar a expressão génica. Em particular, podem tornar a expressão de gag-pol independente de Rev. Para possibilitar a utilização de factores anti-rev ou RRE no vector retroviral, contudo, seria necessário tornar o sistema de produção de vector virai totalmente independente de Rev/RRE (5). Deste modo, o genoma necessita, também, de ser modificado. Isto é alcançado por optimização de componentes de genoma de vector. De um modo vantajoso, estas modificações conduzem, também, à produção de um sistema mais seguro, ausente de todas as proteínas acessórias na célula produtora e na célula transduzida e são descritas abaixo. 14

Como anteriormente descrito, os componentes de empacotamento para um vector retroviral, incluem produtos de expressão de genes gag, pol e env. Adicionalmente, o empacotamento eficiente depende de uma curta sequência de 4 hastes em ansa, seguido de uma sequência parcial de gag e env (o "sinal de empacotamento"). Deste modo, a inclusão de uma sequência gag removida no genoma de vector retroviral (adicionalmente à sequência gag completa na construção de empacotamento) irá optimizar o título de vector. Até à data, foi referido que o empacotamento eficiente requer de 255 a 360 nucleótidos de gag em vectores que ainda retenham sequências de env ou cerca de 40 nucleótidos de gag numa particular combinação de mutação de dador de excisão, deleções de gag e env. Foi surpreendentemente verificado que uma remoção de até 360 nucleótidos em gag conduz a um aumento no título de vector. Deleções adicionais resultaram em títulos inferiores. Verificou-se que mutações adicionais no sítio dador de excisão principal de gag dissociam a estrutura secundária de sinal de empacotamento e, por conseguinte, conduzem a título de vector diminuído. Deste modo, de um modo preferido, o genoma de vector retroviral inclui uma sequência gag a partir da qual foram removidos até 360 nucleótidos.

Foi, por conseguinte, permitida a preparação de um denominado sistema "mínimo", no qual a totalidade de genes acessórios pode ser removida. Em HIV, estes genes acessórios são vpr, vif, tat, nef, vpu e rev. De modo semelhante, em outros lentivírus os genes acessórios análogos normalmente presentes no lentivírus podem ser removidos. Para evitar a dúvida, contudo, seria de mencionar que a presente invenção abrange, também, sistemas, partículas e vectores, nos quais um ou mais destes genes acessórios está presente e em qualquer combinação. 15 0 termo "vector virai" refere-se a uma construção nucleotídica compreendendo um genoma virai capaz de ser transcrito numa célula hospedeira, cujo genoma compreende informação genética virai suficiente, de modo a permitir o empacotamento do genoma de ARN virai, na presença de componentes de empacotamento, numa partícula virai capaz de infectar uma célula alvo. A infecção da célula alvo inclui transcrição reversa e integração no genoma da célula alvo, se apropriado para vírus particulares. 0 vector virai em utilização, de um modo típico, transporta sequências codificantes heterólogas (nucleótidos de interesse ou "NOI") que devem ser distribuídos pelo vector à célula alvo, por exemplo, uma primeira sequência nucleotídica codificando uma ribozima. Por "de replicação defeituosa" significa-se que um vector virai é incapaz de replicação independente para produzir partículas virais infecciosas na célula alvo final. 0 termo "sistema de vector virai" pretende significar um kit de peças que pode ser utilizado quando combinado com outros componentes necessários para produção de partícula virai, de modo a produzir partículas virais em células hospedeiras. Por exemplo, um NOI pode, de um modo típico, estar presente numa construção de vector de plasmídeo adequada para clonagem do NOI numa construção de vector de genoma virai. Quando combinado num kit com uma sequência nucleotídica adicional que irá, também, de um modo típico, estar presente numa construção de vector de plasmídeo separada, a combinação resultante de plasmídeo contendo o NOI e plasmídeo contendo a sequência nucleotídica adicional compreende os elementos essenciais da invenção. Um tal kit pode ser, depois, utilizado pelo especialista na produção de construções de genoma de vector virai adequadas que, quando transfectadas para uma célula hospedeira juntamente com o 16 plasmídeo contendo a sequência nucleotídica adicional e, opcionalmente, construções de ácidos nucleicos codificando outros componentes requeridos para montagem virai, irão conduzir à produção de partículas virais infecciosas.

Alternativamente, a sequência nucleotídica adicional pode estar presente, de um modo estável, numa linha celular de empacotamento que está incluída no kit. 0 kit pode incluir os outros componentes necessários para produzir partículas virais, tais como células hospedeiras e outros plasmídeos codificando polipéptidos virais essenciais requeridos para montagem virai. A título exemplificativo, o kit pode conter (i) um plasmídeo contendo um NOI e (ii) um plasmídeo contendo uma sequência nucleotídica adicional codificando uma construção de gag-pol retroviral modificada que tem codões optimizados para expressão num produtor de escolha. Os componentes opcionais seriam então (a) uma construção de genoma retroviral, com sítios de reconhecimento de restrição enzimática adequados para clonagem do NOI no genoma virai, opcionalmente com, pelo menos, uma sequência de gag parcial; (b) um plasmídeo codificando uma proteína env VSV-G. Alternativamente, a sequência nucleotídica codificando polipéptidos virais requeridos para montagem de partículas virais pode ser proporcionada no kit como linhas celulares de empacotamento compreendendo as sequências nucleotídicas, por exemplo uma linha celular expressando VSV-G. 0 termo "sistema de produção de vector virai" refere-se ao sistema de vector virai anteriormente descrito, em que o NOI já foi inserido num genoma de vector virai adequado. 17

Na presente divulgação, diversos termos são utilizados alternadamente. Deste modo, "virião", "vírus", "partícula virai", "partícula retroviral", "retrovírus" e "partícula de vector", significam vírus e partículas de tipo virai que são capazes da introdução de um ácido nucleico dentro numa célula através de um mecanismo de entrada de tipo virai. Tais partículas virais podem, em determinadas circunstâncias, mediar a transferência de NOI para células que estes infectam. Um retrovírus é capaz de transcrever de um modo reverso o seu material genético em ADN e incorporar este material genético no ADN de uma célula alvo após transdução. Tais células são aqui designadas como "células alvo".

Como aqui utilizado, o termo "célula alvo" refere-se simplesmente a uma célula que o vector retroviral regulado nativo ou direccionado, é capaz de infectar ou transduzir.

Uma partícula de vector lentiviral será capaz de transduzir células que estão em divisão lenta e que os não lentivírus, tal como MLV, não seriam capazes de transduzir eficientemente. As células em divisão lenta dividem-se uma vez a cada três a quatro dias, incluindo determinadas células tumorais. Embora os tumores contenham células em divisão rápida, algumas células tumorais, especialmente aquelas no centro do tumor, dividem-se pouco frequentemente.

Alternativamente, a célula alvo pode ser uma célula de crescimento interrompido capaz de ser submetida a divisão celular, tais como uma célula numa porção central de uma massa tumoral ou uma célula estaminal, tais como uma célula estaminal hematopoiética ou uma célula positiva para CD34. 18

Como uma alternativa adicional, a célula alvo pode ser um precursor de uma célula diferenciada, tais como um precursor de monócito, uma célula positiva para CD33 ou um precursor mielóide.

Como uma alternativa adicional, a célula alvo pode ser uma célula diferenciada, tais como um neurónio, astrócito, célula glial, célula microglial, macrófago, monócito, célula epitelial, célula endotelial, hepatócito, espermatócito, espermatídio ou espermatozóides.

As células alvo podem ser transduzidas in vitro após isolamento a partir de um indivíduo humano ou podem ser transduzidas directamente in vivo.

Os vectores virais são vectores retrovirais, em particular vectores lentivirais, tais como vectores HIV e EIAV. O vector retroviral pode ser derivado ou pode ser derivável de qualquer retrovírus adequado. Foi identificado um grande número de diferentes retrovírus. Os exemplos incluem: vírus da leucemia murina (MLV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da imunodeficiência símia, vírus da leucemia de células T humana (HTLV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV), vírus do tumor mamário de murganho (MMTV) , vírus do sarcoma de Rous (RSV), vírus do sarcoma de Fujinami (FuSV), vírus da leucemia murina de Moloney (Mo-MLV) , vírus do osteossarcoma murino FBR (FBR MSV) , vírus do sarcoma murino de Moloney (Mo-MSV), vírus da leucemia murina de Abelson (A-MLV); vírus da mielocitomatose Aviária 29 (MC29) e vírus da eritroblastose Aviária (AEV). Uma lista detalhada de retrovírus pode ser consultada em Coffin et ai., 1997, "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus p. 758-763. 19 0 termo "derivável" é utilizado no seu sentido normal, como significando uma sequência nucleotidica, tal como uma LTR ou uma sua parte que não tem de ser necessariamente obtida de um vector, tal como um vector retroviral mas, como alternativa, poderia ser derivada desta. A título exemplificativo, a sequência pode ser preparada sinteticamente ou por utilização de técnicas de ADN recombinante.

Os detalhes sobre a estrutura genómica de alguns retrovírus podem ser consultados na técnica. A título exemplificativo, os detalhes sobre HIV e Mo-MLV podem ser consultados a partir do NCBI Genbank (Acesso de Genoma N° AF033819 e AF033811, respectivamente). Os detalhes de variantes de HIV podem ser, também, consultados em http://hiv-web.lanl.gov. Os detalhes de variantes de EIAV podem ser consultados através de http;//www.ncbi.nlm.nih.gov. 0 grupo de lentivírus pode ser dividido ainda mais em "primata" e "não primata". Os exemplos de lentivírus de primata incluem vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente causativo da síndrome de auto-imunodeficiência humana (SIDA) e vírus da imunodeficiência símia (SIV). 0 grupo lentiviral não primata inclui o protótipo "vírus lento" vírus de visna/maedi (VMV), assim como o vírus de artrite-encefalite caprina relacionado (CAEV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) e o mais recentemente descrito vírus da imunodeficiência felina (FIV) e vírus da imunodeficiência bovina (BIV). A estrutura básica de um genoma de retrovírus é uma 5' LTR e uma 3' LTR, entre ou na qual estão localizados um sinal de empacotamento, de modo a possibilitar que o genoma seja empacotado, um sítio de ligação de iniciador, sítios de 20 integração, de modo a possibilitar a integração num genoma de célula hospedeira e genes gag, pol e env codificando os componentes de empacotamento - estes são polipéptidos requeridos para a montagem de partículas virais. Os retrovirus mais complexos têm caracteristicas adicionais, tais como sequências rev e RRE em HIV, que possibilitam a exportação eficiente de transcritos de ARN do provírus integrado do núcleo para o citoplasma de uma célula alvo infectada.

No provírus, estes genes são flanqueados em ambas as extremidades por regiões denominadas repetições terminais longas (LTR). As LTR são responsáveis por integração proviral e transcrição. As LTR servem, também, como sequências promotoras estimuladoras e podem controlar a expressão dos genes virais. A encapsidação dos ARNs retrovirais ocorre em virtude de uma sequência psi que foi divulgada em relação ao HIV, pelo menos, está localizada na extremidade 5' do genoma virai.

As próprias LTR são sequências idênticas que podem ser divididas em três elementos que são denominados U3, R e U5. U3 é derivado da sequência única à extremidade 3' do ARN. 0 R é derivado de uma sequência repetida em ambas as extremidades do ARN e U5 é derivado da sequência única à extremidade 5' do ARN. Os tamanhos dos três elementos podem variar consideravelmente entre diferentes retrovirus.

Num genoma de vector retroviral defeituoso gag, pol e env podem estar ausentes ou não funcionais. As regiões R em ambas as extremidades do ARN são sequências repetidas. U5 e U3 representam sequências únicas nas extremidades 5' e 3' do genoma de ARN, respectivamente. 21

Como discutido anteriormente, num vector retroviral típico para utilização em terapia génica, pelo menos, parte de um ou mais das regiões codificantes de proteínas gag, pol e env essenciais para replicação podem ser removidas do vector virai. Isto torna o vector retroviral de replicação defeituosa. As porções removidas podem ainda ser substituídas por uma sequência nucleotídica de interesse (NOI), como na presente invenção, de modo a produzir um vírus capaz de integrar o seu genoma num genoma hospedeiro mas em que o próprio genoma virai modificado não é capaz de se propagar, em virtude de uma ausência de proteínas estruturais. Quando integrado no genoma hospedeiro, a expressão do NOI ocorre - resultando em, por exemplo, um efeito terapêutico e/ou de diagnóstico. Deste modo, a transferência de um NOI num sítio de interesse é, de um modo típico, alcançada por: integração do NOI no vector virai recombinante; empacotamento do vector virai modificado na camada de um virião; e permitindo a transdução de um sítio de interesse - tais como uma célula visada ou uma população celular visada.

Um genoma retroviral mínimo para utilização na presente invenção pode, por conseguinte, compreender (5') R - U5 - um ou mais NOI - U3-R {3'). Contudo, o vector plasmidico utilizado para produzir o genoma retroviral numa célula hospedeira/célula de empacotamento irá, também, incluir sequências de controlo regulatórias transcricionais ligadas, de um modo operativo, ao genoma retroviral, de modo a dirigir a transcrição do genoma numa célula hospedeira/célula de empacotamento. Estas sequências reguladoras podem ser as sequências naturais associadas à sequência retroviral transcrita, i. e., a região 5' U3, ou podem ser um promotor heterólogo, tal como outro promotor virai, por exemplo o promotor CMV. 22

Alguns genomas retrovirais requerem sequências adicionais para produção de vírus eficiente. Por exemplo, no caso de HIV, devem ser incluídas as sequências rev e RRE. Contudo, verificou-se que o requisito para rev e RRE pode ser reduzido ou eliminado por optimização de codões. Como a expressão do gag-pol com codões optimizados é independente de REV, a RRE pode ser removida da cassete de expressão gag-pol removendo, deste modo, qualquer potencial para recombinação com qualquer RRE contida no genoma de vector.

Uma vez que as sequências NOI de vector retroviral necessitam de ser expressas. Num retrovírus, o promotor está situado na região LTR U3 5' do provírus. Em vectores retrovirais, o promotor dirigindo a expressão de um gene terapêutico pode ser o promotor retroviral nativo na região U3 5' ou um promotor alternativo manipulado no vector. 0 promotor alternativo pode substituir fisicamente o promotor nativo U3 5' para o retrovírus ou pode ser incorporado num local diferente no genoma de vector, tal como entre a LTR.

Deste modo, o NOI irá ser, também, ligado de um modo operativo, a uma sequência de controlo regulatória transcricional, de modo a permitir que ocorra a transcrição da primeira sequência nucleotídica na célula alvo . A sequência de controlo irá, de um modo típico, estar activa em células de mamífero. A sequência de controlo pode ser, por exemplo, um promotor virai , tais como o promotor virai natural ou um promotor CMV ou pode ser um promotor de mamífero. É particularmente preferido utilizar um promotor que seja activo, de um modo preferido, num particular tipo de célula ou tipo de tecido, no qual o vírus principalmente a ser tratado infecta. Deste modo, numa forma de realização, pode ser utilizada uma 23 sequência reguladora específica de tecido. As sequências de controlo regulatórias dirigindo a expressão da uma ou mais primeiras sequências nucleotídicas podem ser promotores constitutivos ou regulados. 0 termo "ligado de um modo operativo" denota uma relação entre uma região reguladora (de um modo típico, um elemento promotor, mas pode incluir um elemento estimulador) e a região codificante de um gene, pelo que a transcrição da região codificante está sob o controlo da região reguladora.

Como aqui utilizado, o termo "estimulador" inclui uma sequência de ADN que se liga a outros componentes proteicos do complexo de iniciação de transcrição e, deste modo, facilita a iniciação de transcrição dirigida pelo seu promotor associado.

Num exemplo preferido, o estimulador é um elemento de resposta de tipo isquémico (ILRE). 0 termo "elemento de resposta de tipo isquémico" - de outro modo escrito como ILRE - inclui um elemento que é responsivo ou activo sob condições de isquemia ou condições que são de tipo isquémico ou são causadas por isquemia. A título exemplificativo, as condições que são semelhantes a isquemia ou são causadas por isquemia incluem hipoxia e/ou baixa (s) concentração (concentrações) de glucose. 0 termo "hipoxia" significa uma condição sob a qual um particular órgão ou tecido recebe um aporte inadequado de oxigénio. 2 4 A isquemia pode ser um aporte insuficiente de sangue a um órgão ou tecido especifico. Uma consequência do decréscimo de aporte sanguíneo é um aporte inadequado de oxigénio ao órgão ou tecido (hipoxia). A hipoxia prolongada pode resultar em lesão ao órgão ou tecido afectado.

Um ILRE preferido é um elemento de resposta de hipoxia (HRE).

Num aspecto preferido, existe expressão regulável de hipoxia ou isquemia dos componentes de vector retroviral. A este respeito, a hipoxia é um poderoso regulador de expressão génica numa ampla gama de diferentes tipos de células e actua pela indução da actividade de factores de transcrição indutíveis por hipoxia, tal como o factor-1 indutível de hipoxia (HIF-1; 6), que se liga a sítios de reconhecimento de ADN correlacionados, os elementos responsivos de hipoxia (HRE) em diversos promotores génicos. Dachs et al. (7) utilizaram uma forma multimérica do HRE do gene da fosfoglicerato cinase-1 (PGK-1) de murganho (8) para controlar a expressão de genes marcadores e terapêuticos por células de fibrossarcoma humano, em resposta a hipoxia in vitro e em tumores sólidos in vivo (7 ibid).

Os elementos estimuladores de resposta de hipoxia (HREEs) foram, também, verificados em associação com um determinado número de genes incluindo o gene da eritropoetina (EPO) (9; 10). Outros HREEs foram isolados de regiões regulatórias do gene da enzima glicolítica muscular piruvato cinase (PKM) (11), o gene da β-enolase específica do músculo humano (EN03; 12) e o gene da endotelina-1 (ET-1) (13). 25

De um modo preferido, o HRE é seleccionado de, por exemplo, o elemento HRE da eritropoetina (HREE1), elemento HRE da piruvato cinase muscular (PKM), HRE da fosfoglicerato cinase (PGK), elemento HRE da B-enolase (enolase 3; EN03), elemento HRE de endotelina-1 (ET-1) e o elemento HRE da metalotioneína II (MT11) .

De um modo preferido, o ILRE é utilizado em combinação com um elemento regulatório transcricional, tal como um promotor, cujo elemento regulatório transcricional é, de um modo preferido, activo em um ou mais tipo(s) de célula(s) seleccionada (s), de um modo preferido, sendo apenas activos num tipo de célula.

Como delineado anteriormente, este aspecto de combinação é denominado um elemento responsivo.

De um modo preferido, o elemento responsivo compreende, pelo menos, o ILRE como aqui definido.

Exemplos não limitativos de um tal elemento responsivo são apresentados como 0BHRE1 e XiaMac. Outro exemplo não limitativo, inclui o ILRE em utilização em conjunto com um promotor MLV e/ou um promotor responsivo isquémico restringido a tecido. Estes elementos responsivos são divulgados no documento W099/15684.

Outros exemplos adequados de promotores/estimuladores restringidos a tecido são aqueles que são altamente activos em células tumorais, tais como um promotor/estimulador de um gene MUC1, um gene CEA ou um gene de antigénio 5T4. 0 promotor da alfa-fetoproteina (AFP) é, também, um promotor específico de tumor. Uma combinação promotor-estimulador preferida, é uma 26 combinação do promotor/estimulador precoce (MIE) imediato principal do citomegalovírus (hCMV) humano. 0 termo "promotor" é utilizado no sentido normal da técnica, e. g., um sítio de ligação de ARN polimerase. 0 promotor pode estar situado na 5' LTR retroviral para controlar a expressão de um ADNc codificando um NOI e/ou proteínas gag-pol.

De um modo preferido, o NOI e/ou proteínas gag-pol são capazes de ser expressas a partir do genoma do retrovírus, tal como a partir de promotores retrovirais endógenos na repetição terminal longa (LTR).

De um modo preferido, o NOI e/ou proteínas gag-pol são expressos a partir de um promotor heterólogo ao qual o gene ou sequência heteróloga e/ou sequência gag-pol com codões optimizados é ligado de um modo operativo.

Alternativamente, o promotor pode ser um promotor interno.

De um modo preferido, o NOI é expresso a partir de um promotor interno.

Os vectores contendo promotores internos foram, também, largamente utilizados para expressar múltiplos genes. Um promotor interno torna possível explorar combinações de promotor/estimulador com excepção daquelas verificadas na LTR virai para dirigir a expressão génica. Podem ser incluídos múltiplos promotores internos num vector retroviral e provou-se que era possível expressar, pelo menos, três diferentes ADNcs, 27 cada um a partir do seu próprio promotor (14). Foram, também, utilizados elementos do sitio interno de entrada do ribossoma (IRES) de modo a permitir a tradução de múltiplas regiões codificantes a partir de um único ARNm ou a partir de proteínas de fusão que podem ser, depois, expressas a partir de uma fase de leitura aberta. 0 promotor da presente invenção pode ser constitutivamente eficiente ou pode ser restringido a tecido ou temporalmente na sua actividade.

De um modo preferido, o promotor é um promotor constitutivo, tal como CMV.

De um modo preferido, os promotores da presente invenção são específicos de tecido. Isto é, são capazes de dirigir a transcrição de um NOI ou vários (s) num tecido, permanecendo, simultaneamente, largamente , "silenciosos " em outros tipos de tecido. 0 termo "específico de tecido" significa um promotor que não está restringido em actividade a um único tipo de tecido mas que, não obstante, mostra selectividade na medida em que podem estar activos num grupo de tecidos e menos activos ou silenciosos noutro grupo. 0 nível de expressão de um NOI ou vários, sob o controlo de um particular promotor, pode ser modulado por manipulação da região promotora. Por exemplo, diferentes domínios numa região promotora podem possuir diferentes actividades regulatórias génicas. Os papéis destas diferentes regiões são, de um modo típico, avaliados utilizando construções de vectores tendo 28 diferentes variantes do promotor com regiões especificas removidas (isto é, análise de remoção). Esta abordagem pode ser utilizada para identificar, por exemplo, a região mais pequena capaz de conferir especificidade de tecido ou a região mais pequena conferindo sensibilidade de hipoxia.

Um determinado número de promotores específicos de tecido, anteriormente descritos, pode ser particularmente vantajoso. Na maioria dos casos, estes promotores podem ser isolados como fragmentos de digestão de restrição convenientes, adequados para clonagem num vector seleccionado. Alternativamente, os fragmentos de promotor podem ser isolados utilizando a reacção de polimerização em cadeia. A clonagem dos fragmentos amplificados pode ser facilitada por incorporação de sítios de restrição na extremidade 5' dos iniciadores. 0 NOI ou vários podem estar sob o controlo de expressão de um elemento regulatório de expressão, tais como um promotor e estimulador.

De um modo preferido, o promotor responsivo isquémico é um promotor responsivo isquémico restringido a tecido.

De um modo preferido, o promotor responsivo isquémico restringido a tecido é um promotor específico de macrófago, restringido por repressão.

De um modo preferido, o promotor responsivo isquémico restringido a tecido é um promotor específico de endotélio.

De um modo preferido, o vector retroviral regulado é um vector retroviral regulado ILRE. 29

De um modo preferido, o vector retroviral regulado é um vector lentiviral regulado ILRE.

De um modo preferido, o vector retroviral regulado é um vector lentiviral responsivo a hipoxia auto-regulado.

De um modo preferido, o vector retroviral regulado é regulado por concentração de glucose.

Por exemplo, as proteínas reguladas por glucose (grp), tais como grp78 e grp94, são proteínas altamente conservadas, conhecidas por serem induzidas por privação de glucose (15). 0 gene grp 78 é expresso a baixos níveis, na maioria de tecidos saudáveis normais, sob a influência de elementos promotores de nível basal, mas tem, pelo menos, dois "elementos regulatórios indutíveis por stress" críticos a montante do elemento TATA (15 ibid; 16). A conjugação de uma sequência truncada de 632 pares de bases da extremidade 5' do promotor grp78 confere elevada inducibilidade à privação de glucose em genes repórter in vitro (16, ibid). Além disso, esta sequência promotora em vectores retrovirais foi capaz de dirigir uma expressão de elevado nível de um gene repórter em células tumorais em fibrossarcomas murinos, particularmente em sítios centrais relativamente isquémicos/fibróticos (16, ibid).

De um modo preferido, o vector retroviral regulado é um vector auto-inactivador (SIN). A título exemplificativo, os vectores retrovirais auto-inactivadores foram construídos por remoção dos estimuladores transcricionais ou os estimuladores e promotor na região U3 da 3' LTR. Após uma série de transcrição reversa de 30 vector e integração, estas alterações são copiadas para dentro de ambas as LTR, 5' e 3', produzindo um provírus inactivo transcricionalmente (17; 18; 19; 20). Contudo, qualquer (quaisquer) promotor (promotores) interno(s) às LTR em tais vectores irá (irão) ser ainda transcricionalmente activo(s). Esta estratégia foi empregue para eliminar efeitos dos estimuladores e promotores nas LTR virais na transcrição a partir de genes internamente colocados. Tais efeitos incluem transcrição aumentada (21) ou supressão de transcrição (22). Esta estratégia pode ser, também, utilizada para eliminar a transcrição a jusante da 3' LTR em ADN genómico (23) . Isto é de particular preocupação em terapia génica humana, onde é de importância critica prevenir a activação adventícia de um oncogene endógeno.

Como discutido acima, os vectores retrovirais de replicação defeituosa são propagados, de um modo típico, por exemplo, para preparar títulos adequados do vector retroviral para transdução subsequente, através da utilização de uma combinação de uma linha celular de empacotamento ou auxiliar e um vector recombinante. Ou seja, que as três proteínas de empacotamento podem ser proporcionadas em trans.

Em geral, uma "linha celular de empacotamento" contém um ou mais dos genes retrovirais gag, pol e env. Na presente invenção, contém genes gag-pol com codões optimizados e, opcionalmente, um gene env. A linha celular de empacotamento produz as proteínas requeridas para empacotamento de ADN retroviral mas não pode concretizar a encapsidação. De modo convencional, isto foi alcançado através da ausência de uma região psi. Contudo, quando um vector recombinante transportando uma região NOI e uma psi é introduzido na linha celular de empacotamento, as proteínas 31 auxiliares podem empacotar o vector recombinante positivo para psi, de modo a produzir o stock de virus recombinante. Este stock de virus pode ser utilizado para transduzir células para introduzir o NOI no genoma das células alvo. De modo convencional, foi utilizado um sinal de empacotamento psi, denominado psi mais que contém sequências adicionais abarcando a partir de montante do dador de excisão até a jusante do codão de iniciação de gag (24) , visto que se demonstrou que isto aumenta os títulos virais. 0 vírus recombinante cujo genoma não tem todos os genes requeridos para preparar proteínas virais pode transduzir apenas uma vez e não pode ser propagado. Estes vectores virais que são apenas capazes de uma única série de transdução de células alvo são conhecidos como vectores de replicação defeituosa. Por este motivo, o NOI é introduzido no genoma da célula hospedeira/alvo, sem a produção de retrovírus potencialmente nocivos. Um resumo das linhas de empacotamento disponíveis é apresentado em Coffin et al., 1997 (ibid). A linha celular de empacotamento retroviral é, de um modo preferido, na forma de uma linha celular transfectada de forma transiente. As transfecções transientes podem ser utilizadas, de um modo vantajoso, para medir níveis de produção de vector quando estão a ser desenvolvidos vectores. A este respeito, a transfecção transiente evita o tempo mais longo requerido para produzir linhas celulares produzindo vectores estáveis e pode ser, também, utilizada se o vector ou componentes de empacotamento retrovirais forem tóxicos para as células. Os componentes utilizados, de um modo típico, para produzir os vectores retrovirais, incluem um plasmídeo codificando as proteínas gag-pol, um plasmídeo codificando a proteína env e um 32 plasmídeo contendo um NOI. A produção de vector envolve a transfecção transiente de um ou mais destes componentes para as células contendo os outros componentes requeridos. Se o vector codifica genes tóxicos ou genes que interferem com a replicação da célula hospedeira, tais como inibidores do ciclo celular ou genes que induzem a apoptose, pode ser difícil produzir linhas celulares produzindo vectores estáveis, mas a transfecção transiente pode ser utilizada para produzir o vector antes das células morrerem. Foram, também, desenvolvidas linhas celulares utilizando a transfecção transiente que produz níveis de títulos de vector que são comparáveis aos níveis obtidos de linhas celulares produzindo vectores estáveis (25) .

As células produtoras/células de empacotamento podem ser de qualquer tipo de célula adequado. As células produtoras são, em geral, células de mamífero mas podem ser, por exemplo, células de insecto. Uma célula produtora pode ser uma célula de empacotamento contendo os genes estruturais do vírus, normalmente integrados no seu genoma, no qual os vectores retrovirais regulados da presente invenção são introduzidos. Alternativamente a célula produtora pode ser transfectada com sequências de ácidos nucleicos codificando componentes estruturais, tais como gag-pol e env com codões optimizados, num ou mais vectores, tais como plasmídeos, vectores de adenovírus, vectores virais de herpes ou qualquer método conhecido por distribuir ADN funcional para as células alvo. Os vectores são, depois, introduzidos na célula de empacotamento.

Como aqui utilizado, o termo "célula produtora" ou "célula produzindo vector", refere-se a uma célula que contém todos os elementos necessários para produção de partículas de vector 33 retroviral regulado e sistemas de distribuição retroviral regulados.

De um modo preferido, a célula produtora é obtida de uma linha celular produtora estável.

De um modo preferido, a célula produtora é obtida de uma linha celular produtora estável derivada.

De um modo preferido, a célula produtora é obtida de uma linha celular produtora derivada.

Como derivada" rastreada marcador. sítios de partir do derivada" produtora estável". aqui utilizado, o termo "linha celular produtora é uma linha celular produtora transduzida que foi e seleccionada para elevada expressão de um gene Tais linhas celulares contêm inserções retrovirais em integração que suportam expressão de elevado nível a genoma retroviral. 0 termo "linha celular produtora é utilizado alternadamente com o termo "linha celular estável derivada" e o termo "linha celular produtora

De um modo preferido, a linha celular produtora derivada, inclui mas não está limitada a uma célula produtora retroviral e/ou uma lentiviral.

De um modo preferido, a linha celular produtora derivada é uma linha celular produtora de HIV ou EIAV, de um modo mais preferido uma linha celular produtora de EIAV.

De um modo preferido, as sequências proteicas do envelope e as sequências da nucleocápside são todas integradas, de um modo 34 estável, na célula produtora e/ou de empacotamento. Contudo, uma ou mais destas sequências, pode também existir na forma epissomal e a expressão génica poderia ocorrer a partir do epissoma.

Como aqui utilizado, o termo "célula de empacotamento" refere-se a uma célula que contém aqueles elementos necessários para produção de virus recombinante infeccioso que estão em falta num vector virai recombinante. De um modo típico, tais células de empacotamento contêm um ou mais vectores que são capazes de expressão de proteínas estruturais (tais como gag-pol e env com codões optimizados) mas não contêm um sinal de empacotamento. 0 termo "sinal de empacotamento" que é referido alternadamente como "sequência de empacotamento" ou "psi" é utilizado em referência à sequência não codificante, actuando em cis, requerida para encapsidação de cadeias de ARN retroviral durante a formação de partícula virai. Em HIV-1, esta sequência foi mapeada para loci estendendo-se desde montante do sítio dador de excisão principal (SD) até, pelo menos, ao codão de iniciação de gag.

As linhas celulares de empacotamento adequadas para utilização com as construções de vector anteriormente descritas podem ser facilmente preparadas (ver, também, o documento WO 92/05266) e utilizadas para criar linhas celulares produtoras para a produção de partículas de vector retroviral. Como já mencionado, um resumo das linhas de empacotamento disponíveis é apresentado em "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus p. 449). 35

Também, como discutido anteriormente, verificou-se que as linhas celulares de empacotamento simples, compreendendo um provirus no qual o sinal de empacotamento foi removido, conduzem à rápida produção de virus competentes de replicação indesejável através de recombinação. Para melhorar a segurança, foram produzidas linhas celulares de segunda produção, em que a 3'LTR do provirus é removida. Em tais células, seriam necessárias duas recombinações para produzir um virus de tipo selvagem. Um melhoramento adicional envolve a introdução dos genes gag-pol e do gene env em construções separadas, denominadas linhas celulares de empacotamento de terceira produção. Estas construções são introduzidas sequencialmente, de modo a prevenir a recombinação durante a transfecção (26; 27).

De um modo preferido, as linhas celulares de empacotamento são linhas celulares de empacotamento de segunda produção.

De um modo preferido, as linhas celulares de empacotamento são linhas celulares de empacotamento de terceira produção.

Nestas linhas celulares de terceira geração, de construção separada, uma redução adicional em recombinação pode ser alcançada por intermédio de "modulação de codão". Esta técnica, baseada na redundância do código genético, visar reduzir a homologia entre as construções separadas, por exemplo entre as regiões de sobreposição nas fases de leitura aberta de gag-pol e env.

As linhas celulares de empacotamento são úteis para proporcionarem os produtos génicos necessários para encapsular e proporcionar uma proteína de membrana para a produção de elevado título de um vector de retrovírus regulado e veículo de 36 tranferência génica de ácido nucleico regulado. Quando as sequências de retrovirus reguladas são introduzidas nas linhas celulares de empacotamento, tais sequências são encapsuladas com as proteínas de nucleocápside (gag-pol) e estas unidades, depois, florescem através da membrana celular, de modo a ficarem rodeadas em membrana celular e conterem a proteína de envelope produzida na linha celular de empacotamento. Estes retrovirus regulados infecciosos são úteis como unidades infecciosas per se ou como vectores de tranferência génica. A célula de empacotamento pode ser uma célula cultivada in vitrOf tal como uma linha celular de cultura de tecidos. As linhas celulares adequadas, incluem mas não estão limitadas a células de mamífero, tais como linhas celulares derivadas de fibroblastos murinos ou linhas celulares humanas. De um modo preferido, a linha celular de empacotamento é uma linha celular humana, tais como por exemplo: HEK293, 293-T, TE671, HT1080.

Alternativamente, a célula de empacotamento pode ser uma célula derivada do indivíduo a ser tratado, tais como um monócito, macrófago, célula sanguínea ou fibroblasto. A célula pode ser isolada de um indivíduo e os componentes de empacotamento e vector administrados ex vivo, seguido de readministração das células de empacotamento autólogas. É altamente desejável utilizar preparações de vírus de elevado título tanto em aplicações experimentais como práticas. As técnicas para aumentar o título virai incluem a utilização de um sinal de empacotamento psi mais, como discutido acima e concentração de stocks virais. Adicionalmente, a utilização de diferentes proteínas de envelope, tal como a proteína G do vírus da estomatite vesicular, melhorou os títulos após concentração 37 para 109 por mL (28). Contudo, de um modo típico, a proteína de envelope irá ser escolhida de modo a que a partícula virai irá, de um modo preferido, infectar células que estão infectadas com o vírus que é desejável tratar. Por exemplo, se um vector de HIV estiver a ser utilizado para tratar a infecção por HIV, a proteína env utilizada irá ser a proteína env de HIV. 0 processo de produção de um vector retroviral em que a proteína de envelope não é o envelope nativo do retrovírus é conhecido como "pseudotipagem". Determinadas proteínas de envelope, tais como a proteína de envelope de MLV e proteína G do vírus de estomatite vesicular (VSV-G), pseudotipam muito bem os retrovírus. A pseudotipagem não é um fenómeno novo e os exemplos podem ser consultados nos documentos WO-A-98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 e (29) .

Como aqui utilizado, o termo "elevado título" significa uma quantidade eficaz de um vector ou partícula retroviral que é capaz de transdução de um sítio alvo, tal como uma célula.

Como aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz" significa uma quantidade de um vector retroviral ou lentiviral regulado ou partícula de vector que é suficiente para induzir a expressão de um NOI num sítio alvo.

De um modo preferido, o título é de, pelo menos, 106 partículas de retrovírus por mL, tal como de 106 a 107 por mL, de um modo mais preferido, pelo menos, 107 partículas de retrovírus por mL. 38 É possível manipular o genoma virai ou a sequência nucleotídica de vector retroviral regulada, de modo que os genes virais são substituídos ou suplementados com um ou mais NOI que podem ser NOI heterólogos. 0 termo "heterólogo" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos ou sequência proteica ligada a uma sequência de ácidos nucleicos ou proteínas a que a mesma não está ligada de um modo natural. 0 termo NOI (i. e., sequência nucleotídica de interesse) inclui qualquer sequência nucleotídica adequada que não tem que ser necessariamente uma sequência de ADN de ocorrência natural completa. Deste modo, a sequência de ADN pode ser, por exemplo, uma sequência de ADN sintética, uma sequência de ADN recombinante (i. e., preparada por utilização de técnicas de ADN recombinante) , uma sequência de ADNc ou uma sequência de ADN genómico parcial, incluindo as suas combinações. A sequência de ADN não necessita de ser uma região codificante. Se for uma região codificante, não necessita de ser uma região de codificação inteira. Adicionalmente, a sequência de ADN pode estar numa orientação de sentido ou numa orientação anti-sentido. De um modo preferido, está numa orientação de sentido. De um modo preferido, o ADN é ou compreende ADNc. 0(s) NOI(s) pode (podem) ser um ou mais gene(s) de selecção, gene(s) marcador (marcadores) e gene(s) terapêutico (s) .

Como aqui utilizado, o termo "gene de selecção" refere-se à utilização de um NOI que codifica um marcador de selecção que pode ter uma actividade enzimática que confere resistência a um 39 antibiótico ou fármaco à célula, na qual o marcador de selecção é expresso. Têm sido utilizados muitos marcadores de selecção diferentes com sucesso em vectores retrovirais. Estes são revistos em "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus p. 444) e incluem mas não estão limitados aos genes bacterianos de neomicina (neo) e higromicina fosfotransferase que conferem resistência a G418 e higromicina, respectivamente; um gene mutante da di-hidrofolato redutase de murganho que confere resistência a metotrexato; o gene bacteriano gpt que permite que as células cresçam em meio contendo ácido micofenólico, xantina e aminopterina; o gene bacteriano hisD que permite que as células cresçam em meio sem sem histidina mas contendo histidinol; o gene de resistência a múltiplos fármacos (mdr) que confere resistência a uma variedade de fármacos; e os genes bacterianos que conferem resistência a puromicina ou fleomicina. Todos estes marcadores são de selecção dominantes e permitem a selecção química da maioria das células expressando estes genes. Outros marcadores de selecção não são dominantes, na medida em que a sua utilização deve ser em conjunto com uma linha celular que não tem a actividade enzimática relevante. Exemplos de marcadores de selecção não dominantes incluem o gene da timidina cinase (tk) que é utilizado em conjunto com linhas celulares tk. São marcadores particularmente preferidos a blasticidina e neomicina, opcionalmente ligados, de um modo operativo, a uma sequência codificante de timidina cinase, de um modo típico sob o controlo transcricional de um forte promotor virai, tal como o promotor SV40. 40

Sequências NOI adequadas incluem aquelas que são de aplicação terapêutica e/ou de diagnóstico, tais como, mas não estão limitadas a: sequências codificando citocinas, quimiocinas, hormonas, anticorpos, moléculas semelhantes a imunoglobulina manipuladas, um anticorpo de cadeia simples, proteínas de fusão, enzimas, moléculas imunes co-estimuladoras, moléculas imunomoduladoras, ARN anti-sentido, um mutante negativo transdominante de uma proteína alvo, uma toxina, uma toxina condicional, um antigénio, uma proteína supressora tumoral e factores de crescimento, proteínas de membrana, proteínas e péptidos vasoactivos, proteínas antivirais e ribozimas e derivados destes (tal como com um grupo repórter associado).

Quando incluídas, tais sequências codificantes podem estar ligadas, de um modo típico, a um promotor adequado que pode ser um promotor dirigindo a expressão de ribozima(s), ou um promotor ou promotores diferentes, tais como em um ou mais tipos específicos de células. NOI adequados no tratamento ou profilaxia do cancro incluem NOI codificando proteínas que: destroem a célula alvo (por exemplo uma toxina ribossómica), actuam como: supressores tumorais (tal como p53 de tipo selvagem); activadores de mecanismos imunes antitumorais (tais como citocinas, moléculas co-estimuladoras e imunoglobulinas); inibidores de angiogénese; ou que proporcionam sensibilidade melhorada a fármacos (tal como enzimas de activação de profármacos); indirectamente estimulam a destruição de uma célula alvo por células efectoras naturais (por exemplo, forte antigénio para estimular o sistema imunitário ou converter uma substância precursora numa 41 substância tóxica que destrói a célula alvo (por exemplo, uma enzima de activação de profármaco).

Exemplos de profármacos incluem mas não estão limitados a etoposido fosfato (utilizado com fosfatase alcalina; 5-fluorocitosina (com citosina desaminase); Doxorubina-N-p-hidroxifenoxiacetamida (com Penicilina-V-Amidase); Para-N-bis (2-cloroetil)aminobenzoílglutamato (com Carboxipeptidase G2); carbamatos de iperite de azoto de Cefalosporina (com B-lactamase); SR4233 (com p450 redutase); Ganciclovir (com timidina cinase de HSV); profármacos de mostarda com nitroredutase e ciclofosfamida ou ifosfamida (com citocromo p450).

Os NOI adequados para utilização no tratamento ou prevenção de doença cardíaca isquémica incluem NOI codificando activadores de plasminogénio. Os NOI adequados para o tratamento ou prevenção de artrite reumatóide ou malária cerebral incluem genes codificando proteínas anti-inflamatórias, anticorpos dirigidos contra o factor de necrose tumoral (TNF) alfa e moléculas de anti-adesão (tais como moléculas de anticorpos ou receptores específicos para moléculas de adesão).

Os produtos de expressão codificados pelos NOI podem ser proteínas que são segregadas da célula. Alternativamente, os produtos de expressão de NOI não são segregados e são activos na célula. Em qualquer dos casos, prefere-se que o produto de expressão de NOI demonstre um efeito de proximidade ou um efeito de proximidade distante; que é a produção do produto de expressão numa célula conduzindo à morte de células relacionadas adicionais, na vizinhança ou distantes (e. g., metastáticas) , que possuem um fenótipo comum. As proteínas codificadas 42 poderiam, também, destruir células tumorais de proximidade (por exemplo, com proteína de fusão de toxina ribossómica de anticorpo antitumoral), destruição indirectamente estimulada de células tumorais de proximidade (por exemplo, citocinas para estimular o sistema imunitário ou proteínas procoagulantes causando oclusão vascular local) ou converter uma substância precursora numa substância tóxica que destrói células tumorais de proximidade (e. g., uma enzima que activa um profármaco num fármaco difusível). Também, a distribuição de NOI(s) codificando transcritos anti-sentido ou ribozimas que interferem com a expressão de genes celulares para persistência tumoral (por exemplo, contra transcritos myc aberrantes em linfoma de Burkitts ou contra transcritos bcr-abl em leucemia mielóide crónica). Está, também, prevista a utilização de combinações de tais NOI. 0 NOI ou vários podem compreender, também, um ou mais NOI codificando citocina. As citocinas e factores de crescimento adequados incluem, mas não estão limitados a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2,

Exodus-2, FGF-acídico, FGF-básico, factor de crescimento de fibroblastos 10 (30). Ligando FLT3, Fractalcina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-βΙ, insulina, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-la, IL 1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inibina a, Inibina β, IP-10, factor de crescimento de queratinócitos 2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF,

Linfotactina, substância inibitória de Mulleriana, factor inibitório de colónias de monócitos, proteína de atracção de monócitos (30 ibid), M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, ΜΙΡ-Ια, MEP—1β, MIP-3a, MIP-3 β, MIP-4, factor inibidor dos 43 progenitores mielóides 1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crescimento do tecido Nervoso, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDFloí, SDF^, SCF, SCGF, factor de células estaminais (SCF), TARC, TGF-a, TGF-β, TGF^2, TGF~33, factor de necrose tumoral (TNF), TNF-a, TNF-β, TNIL-1, TPO, VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309. O NOI ou vários podem estar sob o controlo de expressão de um elemento regulatório de expressão, tais como um promotor e/ou um estimulador de promotor, conhecido como "elementos responsivos" na presente divulgação.

Quando as partículas de vector retroviral reguladas são utilizadas para a transferência de NOI para as células que transduzem, tais partículas de vector, também designadas "sistemas de distribuição virai" ou "sistemas de distribuição retroviral". Os vectores virais, incluindo vectores retrovirais, têm sido utilizados para transferir eficientemente NOI explorando o processo de transdução virai. Os NOI clonados no genoma retroviral podem ser eficientemente distribuídos a células susceptíveis a transdução por um retrovírus. Através de outras manipulações genéticas, a capacidade replicativa do genoma retroviral pode ser destruída. Os vectores introduzem novo material genético numa célula mas são incapazes de se replicar. O vector retroviral regulado pode ser distribuído por técnicas virais ou não virais. Os sistemas de distribuição não virai incluem, mas não estão limitados a métodos de transfecção de ADN. Aqui, a transfecção inclui um processo utilizando um vector não virai para a distribuição de um gene a uma célula alvo. 44

Os métodos de transfecção típicos incluem electroporação, biolística de ADN, transfecção mediada por lípido, transfecção mediada por ADN compactado, lipossomas, imunolipossomas, lipofectina, mediado por agente catiónico, anfifílicos faciais catiónicos (CFA) (31), catiões multivalentes, tais como espermina, lípidos catiónicos ou polilisina, complexos de 1,2,-bis (oleoiloxi)-3-(trimetilamónio) propano (DOTAP)-colesterol (32) e as suas combinações.

Os sistemas de distribuição virai, incluem mas não estão limitados a vector de adenovírus, um vector virai adeno-associado (AAV), um vector virai de herpes, um vector retroviral, um vector lentiviral ou um vector baculoviral. Estes sistemas de distribuição virai podem ser configurados como vector de intrão interrompido. Um vector de intrão interrompido é descrito no documento WO 99/15653.

Outros exemplos de vectores incluem sistemas de distribuição ex vivo que incluem mas não estão limitados a métodos de transfecção de ADN, tais como electroporação, biolística de ADN, transfecção mediada por lípido, transfecção mediada por ADN compactado. 0 vector pode ser um vector de ADN plasmídico. Alternativamente, o vector pode ser um vector virai recombinante. Os vectores virais recombinantes adequados incluem vectores de adenovírus, vectores virais adeno-associados (AAV), vectores de Herpesvírus ou vectores retrovirais, vectores lentivirais ou uma combinação de vectores adenovirais e lentivirais. No caso de vectores virais, a tranferência génica é mediada por infecção virai de uma célula alvo. 45

Se as características de adenovírus forem combinadas com a estabilidade genética de retro/lentivirus o adenovírus pode, então, ser, essencialmente, utilizado para transduzir células alvo para se tornarem células produtoras retrovirais transientes que poderiam infectar, de um modo estável, células vizinhas. A presente divulgação proporciona, também, uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo por terapia génica, em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vector retroviral regulado de acordo com a presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser para utilização humana ou animal. De um modo típico, um médico irá determinar a dosagem própria que irá ser mais adequada para um determinado indivíduo e irá variar com a idade, peso e resposta do particular doente. A composição pode compreender, opcionalmente, um transportador, diluente, excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A escolha de veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser seleccionada em relação à via de administração pretendida e prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como - ou adicionalmente a - veículo, excipiente ou diluente qualquer (quaisquer) aglutinante(s), lubrificante(s), agente(s) de suspensão, agente(s) de revestimento, agente(s) solubilizante(s) e outros agentes transportadores que possam auxiliar ou aumentar a entrada virai no sítio alvo (tal como, por exemplo, um sistema de distribuição de lípidos).

Se apropriado, a composição farmacêutica pode ser administrada por um ou mais de: minibombas, inalação, na forma de um supositório ou pessário, topicamente na forma de uma 46 loção, solução, creme, pomada ou pó de polvilhamento, por utilização de um adesivo para pele, oralmente na forma de comprimidos contendo excipientes, tais como amido ou lactose, ou em cápsulas ou óvulos, isoladamente ou em mistura com excipientes, ou na forma de elixires, soluções ou suspensões contendo agentes aromatizantes ou corantes, ou podem ser injectados parentericamente, por exemplo, intracavernosamente, intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. Para administração parentérica, as composições podem ser mais bem utilizadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou monossacáridos suficientes para preparar a solução isotónica com sangue. Para administração bucal ou sublingual, as composições podem ser administradas na forma de comprimidos ou pastilhas que podem ser formulados num modo convencional.

Pensa-se que a presente composição tem uma ampla aplicabilidade terapêutica - dependendo, inter alia, da selecção de um ou mais NOI.

Por exemplo, pode ser útil no tratamento dos distúrbios listados no documento WO-A-98/05635. Para facilidade de referência, parte daquela lista é, agora, proporcionada: cancro, inflamação ou doença inflamatória, distúrbios dermatológicos, febre, efeitos cardiovasculares, hemorragia, coagulação e resposta de fase aguda, caquexia, anorexia, infecção aguda, infecção por HIV, estados de choque, reacções enxerto-versus-hospedeiro, doença auto-imune, lesão de reperfusão, meningite, enxaqueca e antitrombose dependente de aspirina; crescimento tumoral, invasão e propagação, angiogénese, metástases, malignidade, ascite e efusão pleural maligna; isquemia cerebral, doença cardíaca isquémica, osteoartrite, artrite reumatóide, 47 osteoporose, asma, esclerose múltipla, neurodegeneração, doença de Alzheimer, aterosclerose, acidente vascular cerebral, vasculite, doença de Crohn e colite ulcerosa; periodontite, gengivite; psoríase, dermatite atópica, úlceras crónicas, epidermólise bolhosa; ulceração corneai, retinopatia e cicatrização cirúrgica; rinite, conjuntivite alérgica, eczema, anafilaxia; restenose, insuficiência cardiaca congestiva, endometriose, aterosclerose ou endosclerose.

Adicionalmente, ou em alternativa, pode ser útil no tratamento de distúrbios listados no documento WO-A-98/07859. Para facilidade de referência, parte daquela lista é, agora, proporcionada: actividade de proliferação/diferenciação de citocina e celular; actividade imunossupressora ou imunoestimulante (e. g., para o tratamento de deficiência imunitária, incluindo infecção por vírus da deficiência imunitária humana; regulação de crescimento de linfócitos; tratamento do cancro e muitas doenças auto-imunes e para a prevenção da rejeição de transplante ou induzir imunidade tumoral) ; regulação da hematopoese, e. g., tratamento de doenças mielóides ou linfóides; promoção do crescimento de osso, cartilagem, tendão, ligamento e tecido nervoso, e. g., para a cicatrização de feridas, tratamento de queimaduras, úlceras e doença periodontal e neurodegeneração; inibição ou activação de hormona folículo-estimulante (modulação de fertilidade); actividade quimiotáctita/quimiocinética (e. g., para a mobilização de tipos específicos de células para sítios de lesão ou infecção); actividade hemostática e trombolítica (e. g., para o tratamento de hemofilia e acidente vascular cerebral);actividade anti-inflamatória (para o tratamento, e. g., choque séptico ou doença de Crohn); como antimicrobianos; moduladores de, e. g., metabolismo ou comportamento; como 48 analgésicos; tratamento de distúrbios de deficiências especificas; no tratamento de, e. g., psoríase, em medicina humana ou veterinária.

Adicionalmente, ou em alternativa, pode ser útil no tratamento de distúrbios listados no documento WO-A-98/09985. Para facilidade de referência, parte daquela lista é, agora, proporcionada: actividade inibitória de macrófagos e/ou inibitória de célula T e, deste modo, actividade anti-inflamatória; actividade anti-imunitária, i. e., efeitos inibitórios contra uma resposta imunitária celular e/ou humoral, incluindo uma resposta não associada a inflamação; inibição da capacidade de macrófagos e células T aderirem a componentes da matriz extracelular e fibronectina, assim como a regulação positiva do receptor fas em células T; inibição de reacção imunitária não desejada e inflamação incluindo artrite, incluindo artrite reumatóide, inflamação associada a hipersensibilidade, reacções alérgicas, asma, lúpus eritematoso sistémico, doenças de colagénio e outras doenças auto-imunes, inflamação associada a aterosclerose, arteriosclerose, doença cardíaca aterosclerótica, lesão de reperfusão, paragem cardíaca, enfarte do miocárdio, distúrbios vasculares inflamatórios, síndrome de insuficiência respiratória ou outras doenças cardiopulmonares, inflamação associada a úlcera péptica, colite ulcerosa e outras doenças do aparelho gastrointestinal, fibrose hepática, cirrose do fígado ou outras doenças hepáticas, tiroidite ou outras doenças glandulares, glomerulonefrite ou outras doenças renais e urológicas, otite ou outras doenças otorrinolaringológicas, dermatite ou outras doenças dérmicas, doença periodontal ou outras doenças dentais, orquite ou epididimo-orquite, infertilidade, trauma orquidal ou outras doenças testiculares relacionadas com imunidade, disfunção 49 placentária, insuficiência placentária, aborto habitual, eclampsia, pré-eclampsia e outras doenças ginecológicas relacionadas com imunidade e/ou inflamatórias, uveite posterior, uveite intermédia, uveite anterior, conjuntivite, coriorretinite, uveorretinite, nevrite óptica, inflamação intra-ocular, e. g. , retinite ou edema macular cistóide, oftalmia simpática, esclerite, retinite pigmentar, componentes imunitários e inflamatórios de doença de fundo degenerativo, componentes inflamatórios de trauma ocular, inflamação ocular causada por infecção, vítreo-retinopatias proliferativas, neuropatia óptica isquémica aguda, cicatrização excessiva, e. g., após operação de filtração de glaucoma, reacção imunitária e/ou de inflamação contra implantes oculares e outras doenças oftálmicas relacionadas com imunidade e inflamatórias, inflamação associada a doenças auto-imunes ou estados ou distúrbios onde, tanto no sistema nervoso central (SNC) como em qualquer outro órgão, a supressão de imunidade e/ou inflamação seria benéfica, doença de Parkinson, complicação e/ou efeitos secundários do tratamento da doença de Parkinson, demência relacionada com SIDA, encefalopatia complexa relacionada com HIV, doença de Devic, coreia de Sydenham, doença de Alzheimer e outras doenças degenerativas, estados ou distúrbios do SNC, componentes inflamatórios de Stokes, sindrome pós-polio, componentes imunitários e inflamatórios de distúrbios psiquiátricos, mielite, encefalite, panencefalite esclerosante subaguda, encefalomielite, neuropatia aguda, neuropatia subaguda, neuropatia crónica, sindrome de Guillaim-Barre, coreia de Sydenham, miastenia grave, pseudo-tumor cerebral, sindrome de Down, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, componentes inflamatórios da compressão do SNC ou trauma do SNC ou infecções do SNC, componentes inflamatórios de atrofias musculares e distrofias, e doenças relacionadas com imunidade e 50 inflamatórias, estados ou distúrbios dos sistemas nervosos central e periférico, inflamação pós-traumática, choque séptico, doenças infecciosas, complicações inflamatórias ou efeitos secundários de cirurgia, transplantação de medula óssea ou outras complicações e/ou efeitos secundários de transplantação, complicações inflamatórias e/ou imunitárias e efeitos secundários de terapia génica, e. g., em virtude de infecção com um veiculo virai, ou inflamação associada a SIDA, para suprimir ou inibir uma resposta imunitária humoral e/ou celular, para tratar ou melhorar doenças proliferativas de monócitos ou leucócitos, e. g., leucemia, por redução da quantidade de monócitos ou linfócitos, para a prevenção e/ou tratamento de rejeição de enxerto em casos de transplantação de células, tecido e órgãos naturais ou artificiais, tais como córnea, medula óssea, órgãos, cristalinos, pacemakers, tecido de pele natural ou artificial. A invenção irá ser, agora, adicionalmente descrita por meio de Exemplos. Os Exemplos referem-se às Figuras. Nas Figuras:

Descrição das Figuras A Figura 1 mostra esquematicamente como criar uma 3' LTR adequada por PCR; A Figura 2 mostra a tabela de utilização de codão para gag-pol de HIV de tipo selvagem da estirpe HXB2 (número de acesso: K03455); A Figura 3a mostra a tabela utilização de codão da sequência com codões optimizados, designada gagpol-SYNgp. a 51

Figura 3b mostra uma tabela de utilização de codao comparativa; A Figura 4 mostra a tabela de utilização de codão do env de HIV de tipo selvagem, denominado env-mn; A Figura 5 mostra a tabela de utilização de codão da sequência env de HIV com codões optimizados, designada SYNgpl60mn. A Figura 6 mostra duas construções plasmidicas para utilização na invenção; A Figura 7 mostra o principio na base de dois sistemas para a produção de partículas de vector retroviral; A Figura 8 mostra uma comparação de sequência entre a sequência gag-pol de HIV de tipo selvagem (pGP-RRE3) e a sequência gag-pol com codões optimizados (pSYNGP); A Figura 9 mostra uma comparação de sequência entre a sequência gag-pol de EIAV de tipo selvagem (WT) e a sequência gag-pol com codões optimizados (CO); A Figura 10 mostra a independência de Rev da formação de partícula de expressão de proteína; A Figura 11 mostra taxas de tradução de gag-pol de tipo selvagem (WT) e com codões optimizados; A Figura 12 mostra níveis de ARNm de gag-pol em fracções totais e citoplasmáticas; 52 A Figura 13 mostra o efeito da inserção de WT gag a jusante do gene com codões optimizados sobre os níveis de ARN e proteína; A Figura 14 mostra os plasmídeos utilizados para estudar o efeito de gag de HIV-1 sobre o gene com codões optimizados; A Figura 15 mostra o efeito sobre ARN citoplasmático da inserção de gag de HIV-1 a montante do gene com codões optimizados; A Figura 16 mostra o efeito de Leptomicina B (LMB) sobre a produção de proteína; A Figura 17 mostra os níveis de ARN citoplasmático dos genomas de vector; A Figura 18 mostra a eficiência de transdução a MOI 1; A Figura 19 mostra uma representação esquemática de pGP-RRE3; A Figura 20 mostra uma representação esquemática de pSYNGP; A Figura 21 mostra títulos de vector produzidos com diferentes construções de gag-pol; A Figura 22 mostra títulos de vector dos genomas Rev/RRE (-) e (+); A Figura 23 mostra títulos de vector da série pHS de genomas de vector; 53 A Figura 24 mostra títulos de vector para a série pHS de genomas de vector na presença ou ausência de Rev/RRE; A Figura 25 mostra uma análise de construções de gag-pol; A Figura 26 mostra uma transferência de Western de extractos de 293T; A Figura 27 é uma representação esquemática de pESYNGP; A Figura 28 é uma representação esquemática de LpESYNGP; A Figura 29 é uma representação esquemática de LpESYNGPRRE; A Figura 30 é uma representação esquemática de pESYNGPRRE; A Figura 31 é uma representação esquemática de pONY4.0Z; A Figura 32 é uma representação esquemática de pONY8.0Z; A Figura 33 é uma representação esquemática de pONY8.1Z; A Figura 34 é uma representação esquemática de pONY3.1; A Figura 35 é uma representação esquemática de pCIneoERev; A Figura 36 é uma representação esquemática de pESYNREV;

As Figuras 37 e 38 mostram o efeito de diferentes construções de vector sobre os títulos de vector virai; 54

As Figuras 39 e 40 mostram o efeito de diferentes construções de vector sobre a actividade de RT; A Figura 41 mostra o efeito da sequência condutora 5' sobre o titulo de vector virai; A Figura 42 mostra títulos de vector virai quando se utiliza pONY8.1Z; A Figura 43 mostra uma comparação entre as sequências de pONY3.1 e p0NY3.20PTI com codões optimizados nos primeiros 372 nucleótidos de gag; A Figura 44 é uma representação esquemática de pIRESlhygESYNGP;

As Figuras 45 e 46 mostram os resultados de experiências para confirmar que gag-pol com codões optimizados pode ser utilizado na produção de linhas celulares de empacotamento e produtoras;

As Figuras 47 e 48 mostram os resultados de experiências que confirmam que o ARN de gag-pol com codões optimizados é empacotado de um modo menos eficiente do que aquele do gene de tipo selvagem; A Figura 49 mostra os resultados de uma experiência que confirma que a expressão de pESYNGP e pESDSYNGP é semelhante; A Figura 50 é uma representação esquemática de pESDSYNGP; e 55 A Figura 51 mostra mostra os resultados de uma experiência que confirma que a eficiência de encapsidação de ARN de gag-pol em células PEV-17 e células B-241 é semelhante.

Em maior detalhe, a Figura 8 mostra uma comparação de sequência entre a sequência gag-pol de HIV de tipo selvagem (pGP-RRE3) e a sequência gag-pol com codões optimizados (pSYNGP), em que a sequência superior representa pSYNGP e a sequência inferior representa pGP-RRE3. A Figura 10 mostra a independência de Rev da formação de partícula de expressão de proteína. 5 pg dos plasmídeos de expressão de gag-pol foram transfectados para as células 293T, na presença ou ausência de Rev (pCMV-Rev, 1 pg) e os níveis de proteína foram determinados 48 horas após transfecção em sobrenadantes de cultura (A) e lisados celulares (B) . O soro humano positivo para HIV-1 foi utilizado para detectar as proteínas gag-pol. As transferências foram ressondadas com anticorpo anti-actina, como um controlo interno (C) . Os tamanhos do marcador (New England Biolabs) de proteína (em kDa) são mostrados na margem do gel. Pistas: 1. Células 293T falsamente transfectadas, 2. pGP-RRE3, 3. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 4. pSYNGP, 5. pSYNGP + pCMV-Rev, 6. pSYNGP-RRE, 7. pSYNGP-RRE +pCMV-Rev, 8. pSYNGP-ERR, 9. pSYNGP-ERR + pCMV-Rev. A Figura 11 mostra taxas de tradução de WT e gag-pol com codões optimizados; As células 293T foram transfectadas com 2 pg de pGP-RRE3 ( + /- 1 pg de pCMV-Rev) ou 2 pg pSYNGP. As amostras de proteína de sobrenadantes (A) de cultura e extractos (B) celulares foram analisadas por transferência de Western 12, 25, 37 e 48 horas pós-transfecção. O soro humano positivo para HIV-1 foi utilizado para detectar proteínas (A, B) gag-pol e um 56 anticorpo anti-actina foi utilizado como um controlo (C) interno. Os tamanhos do marcador de proteína são mostrados na margem do gel (em kDa) . Um Phosphorimager foi utilizado para quantificação dos resultados. Pistas: 1. pGP-RRE3 12h, 2. pGP-RRE3 25h, 3. pGP-RRE3 37h, 4. pGP-RRE3 48h, 5. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 12h, 6. pGP-RRE3 +pCMV-Rev 25h, 7. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 37h, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 48h, 9. pSYNGP 12h, 10. pSYNGP 25h, 11. pSYNGP 37h, 12. pSYNGP 48h, 13. Células 293T falsamente transfectadas. A Figura 12 mostra níveis de ARNm de gag-pol em fracções totais e citoplasmáticas. O ARN total e citoplasmático foi extraído de células 293T, 36 horas após transfecção com 5 pg do plasmídeo de expressão de gag-pol ( + /- 1 pg de pCMV-Rev) e os níveis de ARNm foram estimados por análise de transferência de Northern. Foi utilizada uma sonda complementar aos nt 1222-1503, do gene de tipo selvagem e do que tem codões optimizados. O painel A mostra a banda correspondendo ao gag-pol de HIV-1. Os tamanhos dos ARNm são 4, 4 kb para o gene com codões optimizados e 6 kb para o de tipo selvagem. O painel B mostra a banda correspondendo a ubiquitina humana (controlo interno para normalização de resultados). A quantificação foi realizada utilizando um Phosphorimager. Numeração das pistas: c indica a fracção citoplasmática e t indica a fracção de ARN total. Pistas: 1. PGP-RRE3, 2. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 3. pSYNGP, 4. pSYNGP + pCMV-Rev, 5. pSYNGP-RRE, 6. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 7. Células 293T falsamente transfectadas, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 9. Células 293T falsamente transfectadas, 10. pSYNGP. A Figura 13 mostra o efeito da inserção de WT gag a jusante do gene com codões optimizados sobre os níveis de ARN e proteína. A sequência wt gag foi inserida a jusante do gene com 57 codões optimizados em ambas as orientações (sítio Notl), resultando nos plasmídeos pSYN6 (orientação correcta, ver a Figura 14) e pSYN7 (orientação inversa, ver a Figura 14). 0 gene codificando para a β-galactosidase (LacZ) foi, também, inserido no mesmo sítio e na orientação correcta (plasmídeo pSYN8, ver a Figura 14). As células 293T foram transfectadas com 5 pg de cada plasmídeo e 48 horas após transfecção os níveis de ARNm e proteína foram determinados como anteriormente descrito, por meio de análise de transferência de Northern e Western, respectivamente.

Análise de transferência de Northern em fracções de ARN citoplasmático. A transferência foi sondada com uma sonda complementar aos nt 1510-2290 do gene com codões optimizados (I) e foi re-sondada com uma sonda específica para a ubiquitina humana (II). Pistas: 1. pSYNGP, 2. pSYN8, 3. pSYN7, 4. pSYN6

Análise de transferência de Western: 0 soro humano positivo para HIV-1 foi utilizado para detectar as proteínas (I) gag-pol e um anticorpo anti-actina foi utilizado como um controlo (II) interno. Pistas: Lisados celulares: 1. Células 293T falsamente transfectadas, 2. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 3. pSYNGP, 4. pSYN6, 5. pSYN7, 6. pSYN8. Sobrenadantes: 7. Células 293T falsamente transfectadas, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 9. pSYNGP, 10. pSYN6, 11. pSYN7, 12. pSYN8. Os tamanhos do marcador (New England Biolabs) de proteína são mostrados na margem do gel. A Figura 14 mostra os plasmídeos utilizados para estudar o efeito de gag de HIV-1 sobre o gene com codões optimizados. A estrutura para todas as construções foi pCI-Neo. Syn gp: O gene gag-pol de HIV-1 com codões optimizados. HXB2 gag: O gene gag de HIV-1 de tipo selvagem. HXB2 gag, r: O gene gag de HIV-1 de 58 tipo selvagem na orientação inversa. HXB2 gagAATG: 0 gene gag de HIV-1 de tipo selvagem, sem o ATG de gag. HXB2 gag-fr.sh.: 0 gene gag de HIV-1 de tipo selvagem com uma mutação de deslocação de fase. HXB2 gag 625-1503: Nucleótidos 625-1503 do gene gag de HIV-1 de tipo selvagem. HXB2 gag 1-625: Nucleótidos 1-625 do gene gag de HIV-1 de tipo selvagem. A Figura 15 mostra o efeito sobre ARN citoplasmático da inserção de gag de HIV-1 a montante do gene com codões optimizados. 0 ARN citoplasmático foi extraído 48 horas após transfecção de células 293T (5 pg de cada plasmideo pSYN foram utilizados e, em alguns casos, foi co-transfectado 1 pg de pCMV-Rev) . A sonda que foi utilizada foi concebida para ser complementar aos nt 1510-2290 do gene (I) com codões optimizados. Uma sonda especifica para a ubiquitina humana foi utilizada como um controlo (II) interno. Pistas: 1. pSYNGP, 2. pSYN9, 3. pSYNIO, 4. pSYNlO + pCMV-Rev, 5. pSYNll, 6. pSYNll + pCMV-Rev, 7. pCMV-Rev. Pistas: 1. pSYNGP, 2. pSYNGP-RRE, 3. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 4. pSYN12, 5. pSYN14, 6. pSYN14 + pCMV-Rev, 7. pSYN13, 8. pSYN15, 9. pSYN17, 10. pGP-RRE3, 11. pSYN6, 12. pSYN9, 13. pCMV-Rev. A Figura 16 mostra o efeito de LMB sobre a produção de proteína. As células 293T foram transfectadas com 1 pg de pCMV-Rev e 3 pg de pGP-RRE3/pSYNGP/pSYNGP-RRE ( + /- 1 pg de pCMV-Rev). As transfecções foram realizadas em duplicado. 5 horas após transfecção, o meio foi substituído com meio novo no primeiro conjunto e meio novo contendo LMB a 7,5 nM no segundo. 20 horas mais tarde, as células foram lisadas e a produção de proteína foi estimada por análise de transferência de Western. O soro humano positivo para HIV-1 foi utilizado para detectar as proteínas (A) gag-pol e um anticorpo anti-actina 59 foi utilizado como um controlo (B) interno. Pistas: 1. pGP-RRE3, 2. pGP-RRE3 + LMB, 3. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 4. pGP-RRE3 + pCMV-Rev + LMB, 5. pSYNGP, 6. pSYNGP + LMB, 7. pSYNGP + pCMV-Rev, 8. pSYNGP + pCMV-Rev + LMB, 9. pSYNGP-RRE, 10. pSYNGP-RRE + LMB, 11. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 12. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev + LMB. A Figura 17 mostra os níveis de ARN citoplasmático dos genomas de vector. As células 293T foram transfectadas com 10 pg de cada genoma de vector. O ARN citoplasmático foi extraído 48 horas após transfecção. Para a análise de transferência de Northern foram utilizados 20 pg de ARN de cada amostra. A sonda de 700 pb foi concebida para se hibridar a todos os ARNs de genoma de vector (ver Materiais e Métodos). Pistas: 1. ρΗβηΖ, 2. pHônZ + pCMV-Rev, 3. pHô.lnZ, 4. pH6.lnZ + pCMV-Rev, 5. pHSlnZ, 6. pHS2nZ, 7. pHS3nZ, 8. pHS4nZ, 9. pHS5nZ, 10. pHSônZ, 11. pHS7nZ, 12. pHS8nZ, 13. pCMV-Rev.

A Figura 18 mostra a eficiência de transdução a MOI 1. Os stocks virais foram produzidos por co-transfecção de cada plasmídeo de expressão de gag-pol (5 ou 0,5 pg) , 15 pg de ρΗβηΖ ou pHS3nZ (plasmídeo de genoma de vector) e 5 pg de pHCMVG (plasmídeo de expressão de envelope VSV) em células 293T. 0 vírus foi concentrado como anteriormente descrito (45) e a eficiência de transdução foi determinada a m.o.i. de 0,01-1 em células HT1080. Em todos os casos existia uma correlação linear de eficiência de transdução e m.o.i. Uma fotografia indicativa a m.o.i. de 1 é aqui mostrada. A eficiência de transdução foi > 80% com qualquer genoma, qualquer gag-pol e quaisquer quantidades elevadas ou baixas de pSYNGP. Títulos antes de concentração (I.U./mL): em células 293T: A. β,βχΙΟ5, B. 7,6xl05, C. 9,2xl05, D. 1,5xl05, em células HT1080 : A. β,ΟχΙΟ4, B. 9,9xl04, 60 C. 8,OxlO4, D. 2,9xl04. Títulos após concentração (I.U./mL) em células HT1080: A. 6,OxlO5, B. 2,OxlO6, C. I,4xl06, D. 2,OxlO5. A Figura 21 mostra títulos de vector obtidos com diferentes construções de gag-pol. Os stocks virais foram produzidos por co-transfecção de cada plasmídeo de expressão de gag-pol, pH6nZ (plasmídeo de genoma de vector) e pHCMVG (plasmídeo de expressão de envelope VSV, 2,5 pg para cada transfecção) em células 293T. Os títulos (I.U./mL de stock virai) foram medidos em células 293T por contagem do número de colónias azuis após coloração de X-Gal, 48 horas após transdução. As experiências foram realizadas, pelo menos, duas vezes e a variação entre experiências foi inferior a 15%. A Figura 22 mostra títulos de vector dos genomas Rev/RRE (-) e (+): Os vectores retrovirais foram produzidos como descrito nos Exemplos. Os títulos (I.U./mL de stock virai + SD) foram determinados em células 293T. A Figura 23 mostra títulos de vector da série pHS de genomas de vector. 0 vector retroviral foi produzido como descrito nos Exemplos. Os títulos (I.U./mL de stock virai + SD) foram determinados em células 293T. O Rev é proporcionado a partir de pCMV-Rev. Notar que ρΗβηΖ expressa Rev e contém o RRE. Nenhum dos outros genomas expressa Rev ou contém o RRE. A expressão a partir de pSYNGP é independente de Rev, enquanto é dependente de Rev para pGP-RRE3. A Figura 24 mostra títulos de vector para a série pHS de genomas de vector na presença ou ausência de Rev/RRE. 0 vector retroviral foi produzido como descrito nos Exemplos. Foram utilizados 5 pg de genoma de vector, 5 pg de pSYNGP e 2,5 pg de 61 pHCMVG e os títulos (I.U./mL) foram determinados em células 293T. As experiências foram realizadas, pelo menos, duas vezes e a variação entre experiências foi inferior a 15%. 0 Rev é proporcionado a partir de pCMV-Rev (1 pg) . Notar que pH6nZ expressa Rev e contém o RRE. Nenhum dos genomas de pHS expressa Rev e apenas pHSlnZR, pHS3nZR, pHS7nZR e pH6.lnZR contêm o RRE. A expressão de gag-pol a partir de pSYNGP é independente de Rev. A Figura 26 mostra uma transferência de Western de extractos de 293T, em que 30 :g de proteína celular total foram separados por electroforese de SDS/PAGE, transferidos para nitrocelulose e sondados com anticorpos anti-EIAV. O anticorpo secundário foi HRP (Sigma) anti-Cavalo.

Na Figura 38 os títulos são mostrados em unidades de formação de lacZ (L.F.U.)/mL. Os vectores utilizados são indicados em caixas por cima das barras.

Para facilidade de referência são, também, mostradas as sequências listadas na concomitante Listagem de Sequências: SEQ ID N° 1 mostra a sequência da sequência gag-pol de tipo selvagem para a estirpe HXB2 (acesso N° K03455); SEQ ID N° 2 mostra a sequência de pSYNGP; SEQ ID N° 3 mostra a sequência do gene de Envelope para HIV-1 MN (acesso Genbank N° M17449); SEQ ID N° 4 mostra a sequência de SYNgp-160mn - sequência env com codões optimizados; SEQ ID N° 5 mostra a sequência de pESYNGP; SEQ ID N° 6 mostra a sequência de LpESYNGP; SEQ ID N° 7 mostra a sequência de pESYNGPRRE; 62 SEQ ID N° 8 mostra a sequência de LpESYNGPRRE; SEQ ID N° 9 mostra a sequência de pONY4.0Z; SEQ ID N° 10 mostra a sequência de ρΟΝΥδ.ΟΖ; SEQ ID N° 11 mostra a sequência de pONY8.1Z; SEQ ID N° 12 mostra a sequência de pONY3.I; SEQ ID N° 13 mostra a sequência de pCIneoERev; SEQ ID N° 14 mostra a sequência de pESYNREV; SEQ ID N° 15 mostra a sequência gag-pol de HIV com codões optimizados; SEQ ID N° 16 mostra a sequência gag-pol de EIAV com codões optimizados; SEQ ID N° 17 mostra a sequência de pIRESlhygESYNGP; SEQ ID N° 18 mostra a sequência de pESDSYNGP; e SEQ ID N° 19 mostra a sequência de pONY8.3G FB29(-).

Exemplo 1 - HIV Linhas celulares Células (33) 293T e células (34) HeLa foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dubecco contendo soro de vitelo fetal a 10% (v/v) e suplementado com L-glutamina e antibióticos (penicilina-estreptomicina). As células 293T foram obtidas de D. Baltimore (Rockefeller University). 63 (36) .

Clones provirais de HIV-1

Foram utilizados os clones provirais pWl3 (35) e pNL4-3

Construção de um Sistema de Empacotamento

Num dos presentes exemplos, é utilizada uma sequência env de HIV com codões optimizados (SEQ ID N° 4) . 0 correspondente plasmideo de expressão de env é designado pSYNgpl60mn. A sequência modificada contém motivos extra não utilizados por (37) . As sequências extra foram retiradas da sequência env de HIV da estirpe MN e com codões optimizados. Qualquer modificação semelhante da sequência de ácidos nucleicos iria funcionar de modo semelhante, desde que utilize codões correspondendo a ARNt (38) abundantes.

Gene gag-pol de HIV-1 com codões optimizados

Um gene gag-pol com codões optimizados, mostrado dos nt 1108 a 5414 de SEQ ID N° 2, foi construído por emparelhamento de uma série de curtos oligonucleótidos de sobreposição (aproximadamente 30-40 mers com sobreposição de 25%, i. e., aproximadamente, 9 nucleótidos). Os oligonucleótidos foram adquiridos a R&D SYSTEMS (R&D Systems Europe Ltd, 4-10 The

Quadrant, Barton Lane, Abingdon, 0X14 3YS, UK). A optimização de codões foi realizada utilizando a sequência da estirpe HXB-2 (AC: K03455) (39) . A sequência consenso Kozak para iniciação (40) de tradução óptima foi, também, incluída. Um fragmento desde a base 1222 do início de gag até ao fim de gag (1503) não foi optimizado, para manter o sítio de deslocação de fase e a sobreposição entre as fases de leitura de gag e pol. Este era do clone pNL4-3. (quando se faz referência a números de bases no gene gag-pol, a base 1 é o A do ATG de gag, que corresponde à base 790 do início da sequência HXB2. Quando se faz referência a sequências fora de gag-pol, então, os números referem-se a bases do início da sequência HXB2, onde a base 1 corresponde ao início da 5' LTR). Foram realizados alguns desvios da optimização, para introduzir sítios de restrição convenientes. A utilização de codão final é mostrada na Figura 3b que se assemelha, agora, àquela de genes humanos altamente expressos e é muito diferente daquela de gag-pol de HIV-1 de tipo selvagem. O gene foi clonado no vector de expressão de mamífero pCIneo (Promega) nos sítios EcoRI-Notl. O plasmídeo resultante foi denominado pSYNGP (Figura 20, SEQ ID N° 2) . A sequenciação do gene em ambas as cadeias verificou a ausência de quaisquer erros. Uma comparação de sequência entre a sequência gag-pol de HIV com codões optimizados e de tipo selvagem é mostrada na Figura 8.

Construções de Rev/RRE A sequência RRE de HIV-1 (bases 7769-8021 da sequência HXB2) foi amplificada por PCR a partir do clone proviral pWl3, com os iniciadores transportando o sítio de restrição NotI e foi subsequentemente clonada no sítio NotI de pSYNGP. Os plasmídeos resultantes foram denominados pSYNGP-RRE (RRE na orientação correcta) e pSYNGP-ERR (RRE na orientação inversa).

Partículas virais pseudotipadas

Numa forma do sistema de empacotamento, uma cassete gag-pol sintética é coexpressa com uma sequência codificante de envelope 65 heteróloga. Esta poderia ser, por exemplo, VSV-G (44, 45), env de MLV anfotrópico (46, 47) ou qualquer outra proteína que fosse incorporada na partícula de HIV ou EIAV (48). Esta inclui moléculas capazes de direccionarem o vector para tecidos específicos.

Construções de genoma de vector de HIV-1 0 pH6nZ é derivado de pH4Z (49) pela adição de um único nucleótido para colocar um resíduo de guanina extra, que estava em falta em pH4Z, na extremidade 5' do transcrito de genoma de vector, de modo a optimizar a transcrição reversa. Adicionalmente, o gene codificando para a β-galactosidase (LacZ) foi substituído por um gene codificando para uma β-galactosidase de localização nuclear. (A requerente agradece a Enca Martin-Rendon e Said Ismail por proporcionarem o pH6nZ). Para construir construções de genoma Rev(-), foram realizadas as seguintes modificações: a) Um fragmento PstI - PstI de 1,8 kb foi removido de pH6nZ, resultando no plasmídeo pH6.lnZ e b) um fragmento EcoNI (preenchido) - Sphl foi substituído com um fragmento SpeI (preenchido) - Sphl do mesmo plasmídeo (pH6nZ), resultando no plasmídeo pH6.2nZ. Em ambos os casos, as sequências de gag (nt 1-625) foram retidas, visto que se demonstrou que desempenham um papel no empacotamento (93). Rev, RRE e quaisquer outras sequências env residuais foram removidas. pH6.2nZ contém, adicionalmente, o aceitador de excisão env, enquanto pH6.lnZ não contém.

Uma série de vectores abrangendo deleções de gag adicionais, mais ou menos um dador de excisão mutante principal (SD) (mutação GT para CA), foi também derivada de pH6Z. Estes 66 foram preparados por PCR com iniciadores transportando um sitio NarI (iniciadores 5') e um SpeI (iniciadores 3') · Os produtos de PCR foram inseridos dentro de pH6Z nos sitios Narl - Spel. Os vectores resultantes foram denominados pHSlnZ (contendo sequências de HIV-1 até gag 40), pHS2nZ (contendo sequências de HIV-1 até gag 260), pHS3nZ (contendo sequências de HIV-1 até gag 360), pHS4nZ (contendo sequências de HIV-1 até gag 625), pHS5nZ (mesmo que pHSlnZ mas com um SD mutante) , pHS6nZ (mesmo que pHS2nZ mas com um SD mutante) , pHS7nZ (mesmo que pHS3nZ mas com um SD mutante) e pHS8nZ (mesmo que pHS4nZ mas com um SD mutante).

Adicionalmente, a sequência RRE (nt 7769-8021 da sequência HXB2) foi inserida no sítio Spel (preenchido) de pH6.1nZ, pHSlnZ, pHS3nZ e pHS7nZ, resultando nos plasmídeos pHô.lnZR, pHSlnZR, pHS3nZR e pHS7nZR, respectivamente.

Foram realizadas outras modificações ao genoma, incluindo a produção de um vector SIN (por remoção de parte da 3' U3), a substituição das LTR com aquelas de MLV ou substituição de parte da 3'U3 com a região U3 de MLV.

Transfecções transientes, transduções e determinação de títulos virais

Estas foram realizadas como anteriormente descrito (49, 50). Resumidamente, células 293T foram inoculadas sobre placas de 6 cm e 24 horas mais tarde foram transfectadas, de forma transiente, por tratamento, de um dia para o outro, com fosfato de cálcio. O meio foi substituído 12 horas pós-transfecção e, salvo indicação em contrário, os sobrenadantes foram recolhidos 67 48 horas pós-transfecção, filtrados (através de filtros de 0,22 ou 0,45 pm) e titulados por transdução de células 293T. Por esta razão, o sobrenadante a diluições apropriadas do stock original foi adicionado a células 293T (plaqueadas sobre placas de 6 ou 12 poços, 24 horas antes de transdução). A cada poço foi adicionado Polybrene (Sigma) a 8 pg/mL e, 48 horas após transdução, foram determinados títulos virais por coloração de X-gal.

Ensaios de β-gatactosidase (β-gal) luminescente

Estes foram realizados em extractos celulares totais utilizando um sistema repórter de β-gal luminescente (CLONTECH). As células 293T não transfectadas foram utilizadas como controlo negativo e as células 293T transfectadas com pCMV-3-gal (CLONTECH) foram utilizadas como controlo positivo.

Análise de ARN O ARN total ou citoplasmático foi extraído de células 293T por utilização do kit RNeasy mini (QUIAGEN) , 36-48 horas pós-transfecção. Foram submetidos 5-10 pg de ARN a análise de transferência de Northern, como anteriormente descrito (51). O fraccionamento correcto foi verificado por coloração do gel de agarose. Uma sonda complementar às bases 1222-1503 do gene gag-pol foi amplificada por PCR a partir do clone proviral pNL4-3 de HIV-1 e foi utilizada para detectar os ARNms de gag-pol, tanto com codões optimizados como de tipo selvagem. Uma segunda sonda, complementar aos nt 1510-2290 do gene com codões optimizados foi, também, amplificada por PCR a partir do 68 plasmídeo pSYNGP e foi utilizada para detectar apenas os genes com codões optimizados. Um fragmento de 732 pb, complementar a todos os genomas de vector utilizados neste estudo, foi preparado por uma digestão com Spel-Avrll de pH6nZ. Uma sonda específica para ubiquitina (CLONTECH) foi utilizada para normalizar os resultados. Todas as sondas foram marcadas por marcação aleatória (STRATAGENE) com oí-32P dCTP (Amersham) . Os resultados foram quantificados por utilização de um Storm Phosphorlmager (Molecular Dynamics) e são mostrados na Figura 12. Nas fracções celulares totais, o precursor de ARNr 47S poderia ser claramente verificado, ao passo que estava ausente das fracções citoplasmáticas. Como esperado (52), o Rev estimula a acumulação citoplasmática de ARNm de gag-pol de tipo selvagem (pistas lc e 2c) . Os níveis de ARN foram 10-20 vezes superiores para o gene com codões optimizados, comparativamente com o de tipo selvagem, nas fracções totais como citoplasmáticas (comparar os pistas 3t-2t, 3c-2c, 10c-8c). A sequência RRE não desestabilizou significativamente os ARN com codões optimizados, visto que os níveis de ARN eram semelhantes para os ARNs com codões optimizados, quer contivessem ou não a sequência RRE (comparar os pistas 3 e 5) . 0 Rev não melhorou vincadamente a acumulação citoplasmática dos ARNm de gag-pol com codões optimizados, mesmo quando continham a sequência RRE (as diferenças em níveis de ARN foram inferiores a 2 vezes, comparar os pistas 3-4 ou 5-6). A partir de uma comparação das Figuras 10 e 12 parecem que a totalidade do aumento em expressão de proteína a partir de syngp poderia ser atribuída ao aumento nos níveis de ARN. Para investigar se isto se devia a níveis de saturação de ARN na célula, 0,1, 1 e 10 pg dos vectores de expressão de tipo selvagem ou com codões optimizados foram transfectados para as 69 células 293T e a produção de proteína comparada. Em todos os casos, para a mesma quantidade de ADN transfectado, a produção de proteína foi 10 vezes superior para o gene com codões optimizados, enquanto o aumento nos níveis de proteína foi proporcional à quantidade de ADN transfectado para cada gene individual. Por conseguinte, parece provável que a expressão melhorada do gene com codões optimizados pode ser principalmente atribuída aos níveis de ARN melhorados presentes no citoplasma e não à tradução aumentada.

Análise de proteína

Os lisados celulares totais foram preparados a partir de células 293T, 48 horas pós-transfecção (salvo indicação em contrário) com um tampão de lise alcalino. Para extracção de proteínas de sobrenadantes celulares, o sobrenadante foi primeiro passado através de um filtro de 0,22 pm e as partículas de vector foram recolhidas por centrifugação de 1 mL de sobrenadante, a 21000 g, durante 30 minutos. Os sedimentos foram lavados com PB e, depois, ressuspensos num pequeno volume (2-10 il) de tampão de lise. Quantidades iguais de proteína foram separadas num gel de poliacrilamida de SDS a 10-12% (v/v). As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose que foram sondadas sequencialmente com uma diluição 1:500 de soro humano positivo para HIV-1 (SIDA Reagent Project, ADP508, Painel E) e uma diluição 1:1000 de IgG anti-humano, marcado com peroxidase de rábano (Sigma, A0176). As proteínas foram visualizadas utilizando o reagente de detecção de transferência de Western ECL ou ECL-plus (Amersham). Para verificar o carregamento igual de proteína, as membranas foram lavadas e ressondadas com uma diluição 1:1000 de anticorpo anti-actina 70 (Sigma, A2066), seguido de uma diluição 1:2000 de IgG anti-coelho marcado com peroxidase de rábano (Vector Laboratories, PI-1000).

Expressão de produtos génicos de gag-pol e produção de partícula de vector

Os vectores de expressão gag-pol (pGP-RRE3 - Figura 19) de tipo selvagem (49) e com codões optimizados (pSYNGP, pSYNGP-RRE e pSYNGP-ERR) foram transfectados, de forma transiente, para as células 293T. As transfecções foram realizadas na presença ou ausência de um vector de expressão de Rev, pCMV-Rev (53), para avaliar a dependência de Rev para expressão. A análise de transferência de Western foi realizada em lisados celulares e sobrenadantes, de modo a avaliar a produção de proteína. Os resultados são mostrados na Figura 10. Como esperado (54), a expressão do gene de tipo selvagem é observada apenas guando o Rev é proporcionado em trans (pistas 2 e 3). Em contraste, quando foi utilizado o gag-pol com codões optimizados, existiu expressão de elevado nível, tanto na presença como ausência de Rev (pistas 4 e 5), indicando que neste sistema não havia requisito para Rev. Os níveis de proteína eram superiores para o gene com codões optimizados do que para o gag-pol de tipo selvagem (comparar os pistas 4-9 com o pista 3). A diferença foi mais evidente nos sobrenadantes celulares (níveis de proteína, aproximadamente, 10 vezes superiores para o gene com codões optimizados, comparativamente com o de tipo selvagem, quantificados por utilização de um Phosphorlmager) do que nos lisados celulares. 71

Em estudos anteriores, onde o RRE foi incluído em vectores de expressão de gag-pol que tinham sido manipulados para remover sequências INS, a inclusão do RRE conduziu a uma diminuição nos níveis de proteína, que foram restabelecidos por provimento de Rev em trans (55). No presente estudo, a presença do RRE no ARNm de gag-pol totalmente com codões optimizados, não afectou os níveis de proteína e a disposição de Rev em trans não melhorou adicionalmente a expressão (pistas 6 e 7).

Para comparar as taxas de tradução do gene de tipo selvagem e com codões optimizados, a produção de proteína a partir do vector de expressão de tipo selvagem e com codões optimizados foi determinada em diversos intervalos de tempo, após transfecção em células 293T. A produção de proteína e formação de partícula foram determinadas por análise de transferência de Western e os resultados são mostrados na Figura 11. A produção de proteína e formação de partícula foi 10 vezes superior para o gag-pol com codões optimizados em todos os intervalos de tempo.

Para determinar adicionalmente se esta expressão melhorada que foi observada com o gene com codões optimizados se devia a melhor tradução ou devia a efeitos sobre o ARN, foi efectuada análise de ARN. A eficiência da produção de vector utilizando o gene gag-pol com codões optimizados

Para determinar os efeitos do gag-pol com codões optimizados sobre a produção de vector, foi utilizado um genoma de vector de HIV, ρΗβηΖ e o plasmídeo de expressão de envelope de VSV-G pHCMVG (113), em combinação com pSYNGP, pSYNGP-RRE, 72 pSYNGP-ERR ou pGP-RRE3, como uma fonte para o gag-pol numa proporção de plasmídeo de 2:1:2 numa co-transfecção de 3 plasmídeos de células 293T (49). Extractos celulares intactos e sobrenadantes de cultura foram avaliados por análise de transferência de Western para a presença dos produtos génicos de gag e gag-pol. A produção de partícula foi, como esperado (Figura 10), 5-10 vezes superior para os genes com codões optimizados quando comparada aos de tipo selvagem.

Para determinar os efeitos do gene gag-pol com codões optimizados sobre os títulos de vector, foram utilizadas diversas proporções dos componentes de vector. Os resultados são mostrados na Figura 21. Se o gag-pol era o componente limitante no sistema (como determinado pela queda nos títulos observada com o gene de tipo selvagem), os títulos eram 10 vezes superiores para os vectores com codões optimizados. Isto está em concordância com a produção superior de proteína para estes vectores mas sugere que, sob condições normais de produção de vector, o gag-pol é saturante e a optimização de codões não proporciona vantagem de rendimento máximo. O efeito de sequências INS de gag de HIV-1 sobre o gene com codões optimizados é dependente de posição

Foi anteriormente demonstrado que a inserção de sequências gag de HIV-1 de tipo selvagem a jusante de outros ARN, e. g., tat de HIV-1 (56), gag de HIV-1 (55) ou CAT (57) pode conduzir a uma diminuição dramática em níveis de ARNm de estado estacionário, presumivelmente como resultado das sequências INS. Em outros casos, e. g., para β-globina (58), demonstrou-se que o efeito era dependente de sítio de excisão. Os AREs celulares 73 (elementos ricos em AU) que se encontram na 3'UTR de ARNm lábeis podem conferir desestabilização de ARNm por indução de desadenilação citoplasmática dos transcritos (59). Para testar se as sequências INS de gag de HTV-1 iriam desestabiliza o ARN com codões optimizados, a sequência gag de HIV-1 de tipo selvagem, ou partes dela (nt 1-625 ou nt 625-1503), foi amplificada por PCR a partir do clone proviral pW13. Todos os fragmentos foram cortados em extremidades rombas e foram inseridos dentro pSYNGP de pSYNGP-RRE, quer num sitio rombo EcoRl ou NotI (a montante ou jusante do gene gag-pol com codões optimizados, respectivamente) . Como controlos, o wt gag de HIV-1 na orientação inversa (visto que se demonstrou que as sequências INS actuam num modo dependente de orientação, (57) (pSYN7) e lacZ, excisado do plasmídeo pCMV^gal (CLONTECH) (na orientação correcta) (pSYN8) foram, também, inseridos no mesmo sitio. Contrariamente à presente expectativa, como mostrado na Figura 13, a sequência gag de HIV-1 de tipo selvagem não pareceu afectar significativamente os niveis de ARN ou proteína do gene com codões optimizados. Foi adicionalmente construída outra série de plasmídeos (por PCR e a partir dos mesmos plasmídeos), onde o gag de HIV-1 de tipo selvagem na orientação sentido ou inversa, subfragmentos de gag (nt 1-625 ou nt 625-1503), o gag de HIV-1 de tipo selvagem sem o ATG ou com uma mutação de deslocação de fase de 25 bases a jusante do ATG, ou nt 72-1093 de LacZ (excisado do plasmídeo pH6Z), ou as primeiras 1093 bases de lacZ, com ou sem o ATG, foram inseridos a montante do gene gag-pol de HIV-1 com codões optimizados em pSYNGP e/ou pSYNGP-RRE (pSYN9-pSYN22, Figura 14).A análise de transferência de Northern mostrou que a inserção do gene gag de HIV-1 de tipo selvagem a montante do gag-pol de HIV-1 com codões optimizados (pSYN9, pSYNIO) conduziu a níveis diminuídos de ARN na presença ou ausência de Rev/RRE (Figura 15A, pistas 1-4 e Figura 15B, 74 pistas 1+12). 0 efeito não era dependente de tradução, visto que a inserção de um gag de HIV-1 de tipo selvagem desprovido do ATG ou com uma mutação de deslocação de fase (pSYN12, pSYN13 e pSYN14) diminuiu, também, os níveis de ARN (Figura 15B, pistas 1-7) . A análise de transferência de Western verificou que não havia produto de tradução de gag de HIV-1 para pSYN12-14. Contudo, é possível que, como o wt gag de HIV-1 exibe uma utilização de codão tão adversa, pode actuar como um condutor 5' longo não traduzível para syngp e, se for esse o caso, então a mutação de ATG não deverá ter quaisquer efeitos. A inserção de partes mais pequenas do gene gag de HIV-1 de tipo selvagem (pSYN15 e pSYNl7) conduziu, também, a uma diminuição em níveis de ARN (Figura 15B, pistas 1-3 e 8-9), mas não a níveis tão baixos como quando foi utilizada toda a sequência gag (pistas 1-3, 4-7 e 8-9 na Figura 15B). Isto indica que o efeito de sequências INS está dependente do seu tamanho. A inserção do gag de HIV-1 de tipo selvagem na orientação inversa (pSYNll) não teve qualquer efeito sobre os níveis de ARN (Figura 15A, pistas 1 e 5-6). Contudo, nesse caso, pareceu ocorrer um evento de excisão, como indicado pelo tamanho do ARN (igual ao tamanho do ARN de gag-pol com codões optimizados) e pelo produto de tradução (gag-pol, em quantidades iguais, em comparação com pSYNGP, como verificado por análise de transferência de Western).

Estes dados indicam que, por conseguinte, aquelas sequências de instabilidade de gag de HIV-1 de tipo selvagem actuam num modo dependente de posição e tamanho, provavelmente independentemente de tradução. Deve ser, também, notado que o RRE foi incapaz de resgatar os ARN desestabilizados através de interacção com Rev. 75

Construção de um sistema vector baseado em HIV-1 que não tem as proteínas acessórias

Até agora, tem sido referido que diversos sistemas vector baseados em HIV-1 carecem de todas as proteínas acessórias, excepto Rev (49, 60) . Foi decidido investigar se o gene com codões optimizados permitiria a construção de um sistema vector baseado em HIV-1 que não tivesse todas as proteínas acessórias. Inicialmente, foram removidos rev/RRE e quaisquer sequências env residuais, mas foram mantidos os primeiros 625 nucleótidos de gag, visto que se demonstrou que desempenham um papel no empacotamento eficiente (61). Foram preparadas duas construções de genoma de vector, pH6.lnZ (retendo apenas as sequências de HIV até aos nt 625 de gag) e pH6.2nZ (mesmo que pH6. lnZ mas, também, retendo o aceitador de excisão de env) . Estas eram derivadas de um genoma de vector de HIV convencional que contém RRE e expressa Rev (pH6nZ). O presente sistema vector de 3 plasmídeos expressou, então, apenas gag-pol de HIV-1 e as proteínas de envelope de VSV-G. Os títulos de partícula de vector foram determinados como descrito na secção anterior. Foi utilizada uma proporção de 2 : 2 : 1 de genoma de vector (pH6Z ou pH6.1nZ ou pH6.2nZ) : vector de expressão de gag-pol (pGP-RRE3 ou pSYNGP) : pHCMV-G. As transfecções foram realizadas na presença ou ausência de pCMV-Rev, visto que a expressão de gag-pol era ainda dependente de Rev para o gene de tipo selvagem. Os resultados são sumariados na Figura 22 e indicam que um vector de HIV poderia ser produzido na ausência total de Rev, mas que os títulos máximos estavam comprometidos a 20 vezes mais baixos do que poderia ser alcançado na presença de Rev. Como a expressão de gag-pol deve ser a mesma para pSYNGP com pH6nZ ou pHô.lnZ ou pH6.2nZ (visto que é independente de Rev), assim como para pGP-RRE3 quando Rev é proporcionado em trans, 76 suspeitou-se que o genoma de vector retivesse um requisito para Rev e estava, por conseguinte, a limitar os títulos. Para confirmar isto, foi realizada análise de transferência de Northern em ARN citoplasmático, preparado a partir de células transfectadas com ρΗβηΖ ou ρΗβ.ΙηΖ, na presença ou ausência de pCMV-Rev. Como pode ser verificado na Figura 17, pistas 1-4, os níveis de ARN citoplasmático derivado de ρΗβηΖ eram 5-10 vezes superiores aos daqueles obtidos com ρΗβ.ΙηΖ (comparar os pistas 1-2 aos pistas 3-4) . Estes dados comprovam a noção de que o ARN produzido a partir do genoma de vector requer que o sistema Rev/RRE garanta elevados níveis citoplasmáticos. Isto pode dever-se a exportação nuclear ineficiente do ARN, visto que as sequências INS residindo dentro de gag ainda estavam presentes.

Deleções adicionais nas sequências gag do genoma de vector podem ser, por conseguinte, necessárias para restaurar os títulos. Até à data, foi referido que o empacotamento eficiente requer 360 (62) ou 255 (63) nucleótidos de gag em vectores que ainda retenham sequências env, ou cerca de 40 nucleótidos de gag numa particular combinação de mutação de dador de excisão, deleções de gag e env (64, 63) . Numa tentativa para remover o requisito para Rev/RRE no presente genoma de vector, sem comprometer o empacotamento eficiente, foi construída uma série de vectores derivados de pH6nZ contendo deleções progressivamente maiores de sequências de HIV-1 (apenas sequências a montante e dentro de gag foram retidas) mais e menos um dador de excisão mutante principal (SD) (mutação de GT para CA) . Os títulos de partícula de vector foram determinados como anteriormente e os resultados são resumidos na Figura 23. Como pode ser verificado, a remoção de até nt 360 em gag (vector pHS3nZ) resultou num aumento em títulos (em comparação com ρΗβ.lnZ ou pH6.2nZ) e apenas uma diminuição de 5 vezes (os 77 títulos eram 1,3-1,7 x 105) em comparação com pH6nZ. Deleções adicionais resultaram em títulos mais baixos que pHS3nZ e semelhantes a ρΗβ.ΙηΖ. Adicionalmente, a mutação SD não teve um efeito positivo sobre os títulos de vector e, no caso de pHS3nZ, resultou numa diminuição de 10 vezes em títulos (comparar os títulos para pHS3nZ e pHS7nZ na Figura 23). A análise de transferência de Northern em ARN citoplasmático (Figura 17, pistas 1 e 5-12) mostrou que os níveis de ARN eram, de facto, superiores para ρΗβηΖ, os quais poderiam ser responsáveis pelos títulos máximos observados com este vector. Os níveis de ARN eram iguais para pHSlnZ (pista 5), pHS2nZ (pista 6) e pHS3nZ (pista 7), enquanto os títulos eram 5-8 vezes superiores para pHS3nZ. É possível que deleções adicionais (do que aquelas verificadas em pHS3nZ) em gag pudessem resultar em empacotamento menos eficiente (quanto a HIV-1, o sinal de empacotamento estende-se em gag) e, por conseguinte, apesar de todos os 3 vectores produzirem quantidades semelhantes de ARN, apenas pHS3nZ retém a eficiência de empacotamento máxima. É, também, interessante notar que a mutação SD resultou em níveis aumentados de ARN no citoplasma (comparar os pistas 6 e 10, 7 e

11 ou 8 e 12 na Figura 17) mas títulos iguais ou diminuídos (Figura 23). O dinucleótido GT que foi mutado está na base de SL2 do sinal de empacotamento (65) . Foi referido que o SL2 pode não ser muito importante para a encapsidação de ARN de HIV-1 (65, 66), enquanto o SL3 é de grande importância (67) . O

enrolamento das sequências de vector de tipo selvagem e SD mutante com o programa de software ARNdraw revelou que a mutação altera significativamente a estrutura secundária do ARN e não apenas de SL2. Por conseguinte, é provável que, embora a mutação SD melhore os níveis de ARN citoplasmático, não aumenta os títulos como altera a estrutura secundaria do sinal de empacotamento. 78

Para investigar se as diferenças de titulo que foram observadas nos vectores Rev menos se deviam, de facto, à dependência de Rev dos genomas, a sequência RRE (nt 7769 - 8021 da sequência HXB2) foi inserida no sitio SpeI (a jusante da sequência gag e mesmo a montante do promotor CMV interno) de ρΗβ.ΙηΖ, pHSlnZ, pHS3nZ epHS7nZ, resultando nos plasmideos pHô.lnZR, pHSlnZR, pHS3nZR e pHS7nZR, respectivamente. Os títulos de partícula de vector foram determinados com pSYNGP e pHCMVG, na presença ou ausência de Rev (pCMV-Rev), como anteriormente e os resultados são sumariados na Figura 24. Na ausência de Rev, os títulos estavam adicionalmente comprometidos para pH6.lnZR (7 vezes em comparação com ρΗβ.ΙηΖ), pHS3nZR (6 vezes em comparação com pHS3nZ) e pHS7nZR (2,5 vezes em comparação com pHS7nZ). Tal era esperado, visto que o RRE actua, também, como uma sequência de instabilidade (68) e, portanto, seria esperado que conferisse dependência de Rev. Na presença de Rev, os títulos foram restaurados para os títulos máximos observados para pH6nZ, no caso de pHS3nZR (5 x 105) e pH6.lnZR (2 x 105). Os títulos não foram restaurados para pHS7nZR na presença de Rev. Isto comprova a hipótese de que a mutação SD em pHS7nZ afecta a estrutura do sinal de empacotamento e, deste modo, a capacidade de empacotamento deste genoma de vector, visto que neste caso o Rev pode ser capaz de estimular os níveis de ARN de genoma de vector, como para pHS3nZR e pHô.lnZR, mas não pode afectar a estrutura secundária do sinal de empacotamento. Para o vector pHSlnZ, a inclusão do RRE não conduziu a uma diminuição em títulos. Isto poderia dever-se ao facto de que pHSlnZ contém apenas 40 nucleótidos de sequências gag e, por conseguinte, mesmo com o RRE, o tamanho de sequências de instabilidade não é superior do que para pHS2nZ que proporciona títulos iguais para pHSlnZ. O Rev foi capaz de restaurar parcialmente os títulos para pHSlnZR (aumento de 10 vezes quando comparado com pHSlnZ e 79 8 vezes inferior a pH6nZ) mas não totalmente como no caso de pHS3nZ. Isto está, também, em concordância com a hipótese de que 40 nucleótidos de sequências gag de HIV-1 podem não ser suficientes para empacotamento eficiente de ARN de vector e isto poderia ser responsável pelo restabelecimento parcial e não completo em títulos observado em pHSlnZR na presença de Rev.

Adicionalmente, foram determinados títulos de ponto final para pHS3nZ e pH6nZ com pSYNGP em linhas celulares humanas HeLa e HT1080. Em ambos os casos, os títulos seguiram o padrão observado em células 293T, com os títulos sendo 2-3 vezes mais baixos para pHS3nZ do que para ρΗβηΖ (Ver a Figura 10).

Finalmente, a eficiência de transdução de vector produzido com pHS3nZ ou ρΗβηΖ e diferentes quantidades de pSYNGP ou pGP-RRE3 a diferentes m.o.i. (e tão elevado como 1) foram determinadas em células HT1080. Esta experiência foi realizada porque a expressão de gag-pol de elevado nível a partir de pSYNGP pode resultar em interferência por partículas vazias de genoma a elevadas concentrações de vector. Como esperado para partículas retrovirais pseudotipadas de VSVG (69), as eficiências de transdução correlacionaram-se com as m.o.i., fossem utilizadas quantidades altas ou baixas de pSYNGP e com ρΗβηΖ ou pHS3nZ. Para m.o.i. 1, a eficiência de transdução foi, aproximadamente, 50-60% em todos os casos (Figura 18) . Os dados anteriores indicam que, neste sistema experimental, não é observada qualquer interferência causada por partículas vazias de genoma. O gene gag-pol com codões optimizados não utiliza a via de exportação nuclear de exportina 1 O Rev medeia a exportação de ARNms de HIV-1, não excisados e individualmente excisados, por meio do receptor de exportação 80 nuclear exportina 1 (CRM1) ( 70, 71, 72, 73, 74) . Foi demonstrado que a leptomicina B (LMB) inibe a exportação nuclear mediada por NES, rica em leucina, por perturbação da formação do complexo exportina 1/NES/RanGTP (75, 12) . Em particular, a LMB inibe a translocação núcleo- citoplasmática de Rev e ARNm de HIV dependentes de Rev (76) . Para investigar se a exportina 1 medeia a exportação das construções de gag-pol com codões optimizados, foi testado o efeito de LMB sobre a produção de proteína. A análise de transferência de Western foi realizada em lisados celulares de células transfectadas com as construções de gag-pol ( + /- pCMV-Rev) e tratadas ou não com LMB (7,5 nM, durante 20 horas, começando o tratamento 5 horas pós-transfecção). Para confirmar que a LMB não tinha quaisquer efeitos globais sobre o transporte, a expressão de β-gal a partir do plasmídeo de controlo pCMV-pGal foi, também, medida. Um controlo interno de actina foi utilizado para dar conta de variações de proteína entre amostras. Os resultados são mostrados na Figura 16. Como esperado (76), o gag-pol de tipo selvagem não era expresso na presença de LMB (comparar os pistas 3 e 4), enquanto a LMB não teve qualquer efeito sobre a produção de proteína do gag-pol com codões optimizados, independentemente da presença do RRE no transcrito e da disposição de Rev em trans (comparar os pistas 5 e 6, 7 e 8, 9 e 10, 11 e 12, 5-6 e 11-12) . A resistência da expressão do gag-pol com codões optimizados à inibição por LMB indica que a via de exportina 1 não é utilizada e, por conseguinte, deve ser utilizada uma via de exportação alternativa. Isto oferece uma possível explicação para a expressão independente de Rev. O facto da presença de uma interacção Rev/RRE não funcional não afectou a expressão implica que o RRE não actua necessariamente como um sinal inibitório (e. g. , retenção nuclear) per se, o que que está em concordância com observações anteriores (5, 58). 81

Em conclusão, trata-se da primeira descrição de um sistema vector baseado em HIV-1, composto por pSYNGP, pHS3nZ e pHCMVG, onde pode ser alcançada produção significativa de vector, na ausência de todas as proteínas acessórias. Estes dados indicam que, para se alcançarem títulos máximos, o genoma de vector de HIV deve ser configurado para reter empacotamento eficiente e que este requer a retenção de sequências gag e um dador de excisão. Ao se reduzir a sequência gag para 360 nt em pHS3nZ e combinando isto com pSYNGP é possível alcançar um título de, pelo menos, 105 I.U./mL que é apenas 5 vezes mais baixo do que os níveis máximos alcançados na presença de Rev.

Exemplo 2 - EIAV

Cassetes de expressão de gag-pol de EIAV com codões optimizados

Examinou-se, também, se o processo de optimização de codões iria alterar as propriedades do gene gag-pol do EIAV de lentivírus não primata. A sequência do gene com codões optimizados é mostrada a partir de ntll03 a 5760 de SEQ ID N° 5 (Figura 9) . As sequências de tipo selvagem e de com codões optimizados são denotadas WT e CO, respectivamente. A utilização de codão foi alterada para aquela de genes de mamífero altamente expresso.O pESYNGP (Figura 27 e SEQ ID N° 5) foi preparado por transferência de um fragmento Xbal-Notl de um plasmídeo contendo um gene gag/pol de EIAV com codões optimizados, sintetizado pela Operon Technologies Inc., Alameda, CA, em pCIneo (Promega). O gene foi proporcionado numa estrutura plasmídica proprietária, GeneOp. O fragmento transferido para pCIneo inclui sequências flanqueando a ORF de gag/pol de EIAV com codões optimizados: 82 tctagaGAATTCGCCACCATG— EIAV gag/pol-TGAACCCGGGgcggccgc. Os codões de iniciação ATG e terminação TGA são mostrados em negrito e as sequências de reconhecimento para os sitios XbaI e NotI em letra minúscula. A expressão de Gag/Pol a partir do gene com codões optimizados foi avaliada em relação àquela de diversas construções de expressão de gag/pol de EIAV de tipo selvagem por transfecção transiente de células 293T de HEK (Figura 25) . As transfecções foram efectuadas utilizando a técnica de fosfato de cálcio, utilizando moles iguais de cada plasmideo de expressão de Gag/Pol, juntamente com um plasmideo que expressava Rev de EIAV, quer a partir da sequência de tipo selvagem ou a partir da vertêm os codões optimizados do gene: pCIneoEREV (documento WO 99/32646) (Figura 35 e SEQ ID N° 13) ou pESYNREV (Figura 36 e SEQ ID N° 14), respectivamente. 0 pESYNREV é um plasmideo baseado em pCIneo (Promega) que foi preparado por introdução da EcoRI ao fragmento Sall a partir de um plasmideo REV de EIAV sintético, preparado pela Operon Technologies Alameda, CA. A estrutura do plasmideo era o plasmideo proprietário GeneOp, no qual foi inserido um gene REV de EIAV com codões optimizados, flanqueado por sequências de reconhecimento de EcoRI e Sall e uma sequência consenso Kozak, de modo a dirigir a tradução eficiente do gene. A massa de ADN em cada transfecção foi igualada por adição de plasmideo pCIneo. Em transfecções nas quais foi omitido um plasmideo de expressão de Rev, uma massa semelhante de pCIneo (Promega) foi utilizada no seu lugar (pistas marcados pCIneo). Os extractos citoplasmáticos foram preparados 48 horas após transfecção e quantidades de 15 pg de proteína foram fraccionadas por SDS-PAGE e, depois, transferidas para Hybond ECL. A transferência de Western foi sondada com anti-soros policlonais de um cavalo infectado por 83 EIAV e, depois, com um anticorpo secundário, anti-cavalo conjugado a peroxidase de rábano. 0 desenvolvimento da transferência foi efectuado utilizando o kit ECL (Amersham). Os controlos positivos para o processo de transferência e desenvolvimento e o extracto citoplasmático de células 293T de HEK não transfectadas são como indicado. As posições de diversas proteínas de EIAV estão indicadas.

A expressão de gag/pol de tipo selvagem foi alcançada a partir de diversos plasmídeos (ver a Figura 25). 0 pONY3.2T é um derivado de pONY3.1 (documento W099/32646) (Figura 34 e SEQ ID N° 12) no qual foram preparadas mutações que proporcionam ablação da expressão de Tat e S2. Adicionalmente, a sequência de EIAV está truncada a jusante do segundo exão de rev. Especificamente, a expressão de Tat é submetida a ablação por uma remoção de 83 nt no exão 2 de tat que corresponde, em relação à sequência de EIAV de tipo selvagem, N° de Acesso U01866, à remoção de nt 5234-5316, inclusivamente. A expressão da ORF de S2 é submetida a ablação por uma remoção de 51 nt, correspondendo aos nt 5346-5396 de N° de Acesso U01866. A sequência de EIAV é removida a jusante de uma posição correspondendo a nt 7815 de N° de Acesso U01866. Estas alterações não alteram rev, por este motivo a expressão deste gene é expressa como para pONY3.1. 0 pONY3.2 OPTI é um derivado de pONY3.1 que tem as mesmas deleções para ablação da expressão de Tat e S2, como anteriormente descrito. Adicionalmente, os primeiros 372 nt de gag foram submetidos a "optimização de codões" para expressão em células humanas. A sequência das sequências de tipo selvagem e com codões optimizados presentes em p0NY3.20PTI nesta região são comparadas na Figura 43. As diferenças de bases entre as sequências estão indicadas. A região que foi submetida a "optimização de codões" representa a 84 região de sobreposição entre o vector e as construções de expressão de gag/pol de tipo selvagem. Seria esperado gue a redução de homologia dentro desta região melhorasse o perfil de segurança do sistema vector, em virtude das reduzidas probabilidades de recombinação entre o genoma de vector e os transcritos gag/pol. 0 3.2 OPTI-Ihyg é um derivado de 3.2 OPTI, no gual o fragmento SnaBI-iVotl de 3.2 OPTI é transferido para pIRESlhygro (Clontech) preparado para ligação por digestão com os mesmos sítios. 0 gene gag/po/ é, deste modo, colocado a montante do IRES de higromicina fosfotransferase. De notar é o facto de que a construção resultante contém o intrão de pCIneo, não de pIRESlhygro. 0 pEV53B é um derivado de PEV53A (documento WO 98/51810), no qual a sequência derivada de EIAV a montante do codão de iniciação Gag é reduzida, de modo a incluir apenas o dador de excisão principal e sequências circundantes: CAG/GTAAGATG, onde o codão de iniciação Gag é mostrado a negrito.

Os resultados (Figura 26) mostram a dependência de Rev da expressão de Gag/Pol a partir de pH0RSE3.1 (documento WO 99/32646) que tem uma sequência condutora derivada de EIAV, começando mesmo a jusante do sítio de ligação de iniciador e um RRE colocado a jusante de gag/pol, composto pelas duas sequências de EIAV referidas como tendo actividade de RRE. A expressão foi melhorada pela mesma quantidade quando a expressão de Rev era dirigida por genes de tipo selvagem (pCIneoERev) (Figura 35) ou com codões optimizados (pESYNREV) (Figura 36) . Este resultado confirma a funcionalidade do plasmídeo de expressão de Rev com codões optimizados.

Em contraste coma expressão de Gag/Pol a partir de pONY3.1, a expressão a partir de pESYNGP não foi influenciada pela 85 presença de Rev, contudo, foi ligeiramente mais baixa do que a partir de pONY3.1 ou pON3.2T. A expressão a partir de pESYNGPRRE (Figura 30 e SEQ ID N° 7), no qual a sequência RRE de EIAV presente em pHORSE3.1 é colocada a jusante de gag/pol, surgiu ligeiramente mais baixa do que a partir de pESYNGP. Os níveis de expressão a partir de 3 .20PTI e 3.20PTI- -Ihyg foram significativamente mais baixos do que a partir de pESYNGP ou pONY3.1, mesmo na presença de Rev. Este resultado sugeriu que podem existir determinantes de expressão de Gag/Pol nos primeiros 372 nt do gag e mostrou que não é provável que 3.20PTI seja útil como uma base para a produção de vector de EIAV. Além disso, demonstra que a optimização de codões de apenas determinadas regiões de todo o gene gag/pol pode não conduzir a elevados níveis de expressão independente de Rev.

Foi anteriormente demonstrado (43) que o condutor 5' (121 pb a montante do codão de iniciação ATG) e a sequência RRE (43) são importantes para a expressão elevada do gag-pol de EIAV de tipo selvagem. Foram preparadas três construções que continham, a sequência condutora (LpESYNGP), as sequências condutora e RRE (LpESYNGPRRE) ou a sequência RRE (pESYNGPRRE). As sequências destas construções são mostradas na SEQ ID N° 6-8 e Figuras 28-30. Foram transfectadas para as células 293T na presença ou ausência do plasmídeo de expressão de Rev. O sobrenadante celular foi, depois, medido para actividade de transcritase reversa (RT), utilizando um ensaio RT convencional, de modo a avaliar que construção gerava a quantidade mais elevada de ARNm de gag-pol. Os resultados são mostrados nas Figuras 39 e 40. A partir de destes resultados é manifesto que o condutor 5' conduz a um aumento em actividade de RT. A capacidade de estas construções de expressão de Gag/Pol suportarem a formação de partículas de vírus infecciosas foi, 86 também, testada por transfecção transiente de células 293 HEK. Os resultados desta análise mostram que a totalidade das construções poderia proporcionar Gag/Pol de EIAV funcional e mostram a dependência de Rev de titulo com o plasmídeo de genoma de vector ρΟΝΥδ.ΟΖ que não codifica quaisquer proteínas de EIAV (Figura 41). A capacidade de pESYNGP actuar em concertação com um plasmídeo de genoma de vector de EIAV mínimo pONY8.1Z (Figura 33, SEQ ID N° 11) foi avaliada (Figura 42) . 0 resultado mostra que os títulos obtidos com pESYNGP e ρΟΝΥδ.ΙΖ são cerca de 10 vezes mais baixos do que a partir de pONY3.1 e ρΟΝΥδ.ΙΖ. Este título reduzido reflecte a ausência da proteína Rev no sistema e não uma deficiência de produção de Gag/Pol que já tinha sido mostrada como sendo independente da expressão de Rev. A expressão de Gag/Pol de EIAV foi também testada a partir de pESDSYNGP (Figura 50 e SEQ ID N° 16) na qual a sequência consenso Kozak de Gag é substituída pelo dador de excisão de EIAV natural. O pESDSYNGP foi preparado a partir de pESYNGP por troca do fragmento EcoRI-Nhel de 306 pb que corre desde mesmo a montante do codão de iniciação para gag/pol até, aproximadamente, 300 pares de bases para a ORF de gag/pol, com um fragmento EcoRI-Nhel de 308 pb derivado por digestão de um produto de PCR preparado utilizando pESYNGP com molde e utilizando os seguintes iniciadores: SD FOR [GGCTAGAGAATTCCAGGTAAGATGGGCGATCCCCTCACCTGG] e SD REV [TTGGGTACTCCTCGCTAGGTTC]. Esta manipulação substitui a sequência consenso Kozak, a montante do ATG em pESYNGP, com o dador de excisão verificado em EIAV. A sequência entre o sítio EcoRI e o ATG de gag/pol é, deste modo, CAGGTAAG, exactamente como verificada na sequência virai natural. Por conseguinte, o ARNm é 87 removido em relação a sequências a montante mas não a jusante do dador de excisão. 0 desempenho de pESDSYNGP foi avaliado em relação a pESYNGP e outros plasmídeos de expressão por medição de actividade de transcritase reversa em sobrenadantes de células 293T de HEK transfectadas de um modo transiente, utilizando uma versão baseada em Taqman do ensaio de transcritase reversa de produto melhorado (PERT). Neste método, a transcritase reversa, associada a partículas de vector, é libertada por tratamento com detergente moderado e utilizada para sintetizar ADNc utilizando ARN de bacteriófago MS2 como molde. 0 molde de ARN de MS2 e iniciador estão presentes em excesso, por este motivo a quantidade de ADNc é proporcional à quantidade de RT libertada das partículas. Por conseguinte, a quantidade de ADNc sintetizada é proporcional ao número de partículas. 0 ADNc de MS2 é, depois, quantificado utilizando a tecnologia Taqman. 0 ensaio é efectuado em amostras de teste em paralelo com um stock de vector de título conhecido e o teor de partícula estimado. A utilização do padrão permite a criação de uma 'curva-padrão' e permite que o teor de RT relativo de várias amostras seja calculado. Os resultados desta análise são mostrados na Figura 49. Os resultados mostram que a expressão de Gag/Pol é virtualmente idêntica a partir de pESYNGP e pESDSYNGP. Os resultados indicam, também, que a expressão não é significativamente melhorada por Rev. A actividade do plasmídeo de expressão de Rev é confirmada pelo resultado obtido com pHORSE+, no qual existe um RRE a jusante do gag/pol de EIAV de tipo selvagem e que mostra um melhoramento de expressão de 6 vezes na presença de Rev. Foi, também, notado que a expressão a partir de pHORSE foi melhorada por um factor de 3 na presença de Rev. Visto que esta construção não tem qualquer RRE, sugere que o Rev pode estar a ter um efeito de melhoramento não específico sobre a expressão, possivelmente como resultado de ser expresso a níveis elevados neste sistema experimental. A capacidade de pESYNGP participar na formação de partículas infecciosas de vector virai, quando co-transfectado com plasmídeos para o genoma de vector e envelope, foi avaliada por transfecção transiente de 293T de HEK, como descrito anteriormente (49, 50) . Resumidamente, as células 293T foram inoculadas em placas de 6 cm (1,2 x 106/placa) e 24 horas mais tarde foram transfectadas pelo processo de fosfato de cálcio. O meio foi substituído 12 horas pós-transfecção e os sobrenadantes foram recolhidos 48 horas pós-transfecção, filtrados (filtros de 0,45 pm) e titulados por transdução de células de osteossarcoma canino, D17, na presença de Polybrene (Sigma) a 8 pg/mL. As células foram inoculadas a 0,9 x 105/poço em placas de 12 poços, 24 horas antes de utilização em ensaios de titulação. As diluições de sobrenadante foram realizadas em meios completos (DMEM/FBS a 10%) e alíquotas de 0,5 mL plaqueadas sobre as células Dl 7. 4 horas após adição do vector, os meios foram suplementados com 1 mL adicional de meios. A transdução foi avaliada por coloração de X-gal de células, 48 horas após adição de diluições virais.

Os genomas de vector utilizados para estas experiências foram pONY4.0Z (Figura 31 e SEQ ID N° 9) e pONY8.0Z (Figura 32 e SEQ ID N° 10). 89 Ο ρΟΝΥ4.0Ζ (documento WO 99/32646) foi derivado de pONY2.11Z por substituição da região U3 na 5'LTR com o promotor precoce imediato de citomegalovírus (pCMV). Isto foi efectuado de tal modo que a primeira base do transcrito derivado deste promotor CMV corresponde à primeira base da região R. Esta manipulação resulta na produção de níveis elevados de genoma de vector em células transduzidas, particularmente células 293T de HEK e foi anteriormente descrita (50). O pONY4.0Z expressa todas as proteínas de EIAV à excepção de envelope, cuja expressão é submetida a ablação por uma remoção de 736 nt entre os sítios HindiII presentes em env. Ο ρΟΝΥδ.ΟΖ foi derivado de pONY4.0Z por introdução de mutações que 1) preveniram a expressão de TAT por uma remoção de 83 nt no exão de tat, 2) preveniram a expressão da ORF de S2 por uma remoção de 51 nt, 3) preveniram a expressão de REV por remoção de uma única base no exão 1 de rev e 4) preveniram a expressão da porção N-terminal de gag por inserção de T no codão de iniciação ATG alterando, desse modo, a sequência de ATG para ATTG. Em relação ao N° de Acesso U01866 da sequência de EIAV de tipo selvagem, estas correspondem à remoção dos nt 5234-5316 inclusivamente, nt 5346-5396 inclusivamente e nt 5538. A inserção de resíduos T foi depois dos nt 526 e 543.

Os resultados desta análise são mostrados tabelados na Figura 37 e graficamente na Figura 38. As transfecções foram efectuadas com apenas 3 plasmídeos (genoma de vector, plasmídeo de expressão de gag/pol e plasmídeo de expressão de VSV-G) - barras pautadas diagonais, ou com quatro plasmídeos que incluiu o conjunto anterior de plasmídeos, juntamente com um plasmídeo adicional codificando Rev ou um plasmídeo semelhante não codificando uma proteína funcional - barras a cheio. O 90 resultado mostra que podem ser alcançados elevados títulos de vector utilizando pESYNGP para proporcionar Gag/Pol de EIAV. Os títulos mais elevados foram obtidos utilizando o plasmídeo de genoma de vector expressando Rev, pONY4.0Z, e foram apenas ligeiramente mais baixos do que o observado quando Gag/Pol era proporcionado por pONY3.1. Títulos mais baixos foram observados com o plasmídeo de genoma de vector ρΟΝΥδ.ΟΖ com pESYNGP do que com pONY3.1. Isto deve-se ao requisito de expressão de Rev de ρΟΝΥδ.ΟΖ. 0 Rev e expresso por pONY3.1 mas não pESYNGP. Estes resultados confirmam a utilidade do plasmídeo de expressão de Gag/Pol com codões optimizados.

Utilização do gene gag/pol de EIAV sintético na construção de linhas celulares que expressam, de um modo estável, gag/pol de EIAV.

As linhas celulares que expressam elevadas quantidades de Gag/pol de EIAV são requeridas para a construção de células de empacotamento e produtoras para os vectores de EIAV. Como uma primeiro passo na sua construção, as células 293 de HEK foram transfectadas, de um modo estável, com pIRESlhyg ESYNGP (Figura 44 e SEQ ID N° 17) , em que a expressão de Gag/pol de EIAV é dirigida por um promotor CMV e está ligada a uma ORF para expressão de higromicina fosfotransferase por um IRES de EMCV. 0 pIRESlhyg ESYNGP foi preparado como se segue. 0 gene gag/pol de EIAV sintético e sequências flanqueantes foram transferidos de pESYNGP para o vector de expressão pIRESlhygro (Clontech). Primeiro, o pESYNGP foi digerido com FcoRI e as extremidades preenchidas por tratamento com T4 ADN polimerase e, depois, digerido com NotI, o pIRESlhygro foi preparado para ligação com este fragmento por digestão com NsiI, as extremidades cortadas 91 por tratamento com T4 ADN polimerase, depois, digerido com NotI. Antes de transfecção para as células 293 de HEK, o pIRESlhyg ESYNGP foi digerido com Ahdl que lineariza o plasmídeo.

As linhas celulares clonais foram derivadas por diluição em série e analisadas para expressão de Gag/Pol por um ensaio de transcritase reversa de produto melhorado baseado em Taqman. São mostrados os dados para a linha celular Q3.29 que expressaram o nível mais elevado de Gag/Pol. A análise mostrou que o nível de expressão a partir da cassete de Gag/Pol de EIAV com codões optimizados em Q3.29 foi muito semelhante àquele verificado para uma linha produtora de EIAV, 8Z.20, na qual Gag/Pol é expresso a partir da cassete de expressão de tipo selvagem pEV53B, que produziu partículas de vector a títulos de quase 106 unidades de transdução por mL. (Figura 45) Assumindo amplificação exponencial durante o ensaio, uma diferença de valor Ct de 1,0 corresponde a uma diferença de 2 vezes em concentração da transcritase reversa libertada das partículas. Por conseguinte, a diferença na expressão de Gag/Pol entre células Q3.29 e 8Z.20 é, aproximadamente, 2-8 vezes. Além disso, os valores Ct observados indicam que o nível de expressão de Gag/Pol é significativamente mais elevado do que em amostras de partículas de vector pONY8G, com um título de 2 x 106 unidades de transdução por mL em células D17, mas preparadas por transfecção transiente de células 293T de HEK. Estes dados indicam que a construção de Gag/Pol de EIAV com codões optimizados pode ser utilizada na construção de linhas de empacotamento e produtoras de EIAV e confirma o resultado anterior de que a expressão é independente da expressão de Rev. 92 A linha celular Q3.29 foi, depois, testada para a sua capacidade de suportar a produção de partículas de vector infecciosas quando transfectada com um plasmídeo de genoma de vector, pONY8.0Z, e o plasmídeo de expressão de envelope de VSV-G, pRV67 e o plasmídeo de expressão de REV de EIAV, pESYNREV. Adicionalmente foi também avaliado o desempenho de um plasmídeo pONY8.3G FB29 (-) que é modificado a partir do plasmídeo genoma de vector pONY8G. 0 P0NY8G é um genoma de vector de EIAV padrão utilizado para efeitos de comparação. As modificações e construção de pONY8.3G FB29 (-) (SEQ ID N° 19) são descritas no documento PCT/GB00/03837 e resumidamente são 1) a introdução de sítio de reconhecimento de loxP a montante e jusante da cassete de genoma de vector 2) a colocação de uma cassete de expressão para o REV com codões optimizados, derivado de pESYNREV e dirigido pelo promotor FB29 U3 a jusante da cassete de genoma de vector e orientado de modo que a direcção de transcrição fosse em direcção à cassete de genoma de vector. A cassete de expressão de REV está localizada a montante do sítio 3' loxP. Deste modo, o plasmídeo pONY8.3G FB29 transporta cassetes de expressão para o ARN de genoma de vector e para o Rev de EIAV.

Os títulos foram estabelecidos por diluição limitante em células de osteossarcoma canino D17 e são mostrados na Figura 46. 93

Os títulos obtidos das transfecções 2-6 foram de até 4,5 x 106 unidades de transdução por mL, indicando níveis de expressão de Gag/Pol suficientes para suportar títulos, pelo menos, tão elevados como estes. Os títulos obtidos não foram superiores quando foi proporcionado Gag/Pol adicional (transfecção 1), indicando que a expressão de Gag/Pol não era a limitação no titulo.

Perfil de segurança melhorado em virtude de expressão de Gag/Pol a partir de uma construção de expresssão com codões optimizados A formação de RCR ocorre por recombinação entre diferentes componentes do sistema vector ou por recombinação de componentes do sistema vector com sequências nucleotidicas presentes nas células produtoras. Embora a recombinação ao nível de ADN durante a construção de linhas celulares produtoras seja possível (talvez conduzindo a activação insercional de retroelementos ou retrovírus endógenos), pensa-se que a recombinação para produzir RCR ocorre principalmente entre ARNs sofrendo transcrição reversa, por este motivo ocorre nas partículas de vector maduras. Consequentemente, será mais provável que a recombinação ocorra entre ARNs que contenham sinais de empacotamento, tais como o genoma de vector e o ARNm de gag/pol. Contudo, habitualmente, o transcrito gag/pol é modificado de modo que seja removido em relação a alguns ou todos os elementos de empacotamento definidos reduzindo, desse modo, as probabilidades do seu envolvimento em recombinação. 94 0 processo de optimização de codões utilizado para criar o plasmideo de expressão de Gag/Pol de HIV e EIAV, pSYNGP e pESYNGP resulta, também, na disrupção de sequências e estruturas que dirigem o empacotamento como resultado da introdução de alterações em, aproximadamente, cada 3a posição nucleotidica. Foram obtidas provas para o nivel inferior de incorporação do ARN com codões optimizados derivado de pESYNGP dentro de viriões.

Foi comparado o empacotamento de ARNm derivados de uma cassete de expressão de gag/pol de tipo selvagem, pEV53B, e da cassete de expressão de gag/pol de EIAV com codões optimizados, pESYNGP. 0 meio foi recolhido de linhas celulares baseadas numa 293 de HEK que foram transf ectadas, de um modo estável, com pEV53B (linha celular B-241) ou com pESYNGP. Ambas as linhas celulares produzem partículas de vector que não contêm ARN de vector e não têm envelopes. Em algumas experiências, um plasmideo de genoma de vector de EIAV (pECG3-CZW) foi transfectado para as células, de modo a servir como um controlo positivo interno para hibridação e para a presença de partículas capazes de empacotarem RNA. 0 pECG3-CZW é um derivado de pEC-

LacZ (documento WO 98/51810) e foi preparado a partir deste último por 1) redução de sequências gag, de modo que apenas os primeiros 200 nt de gag, e não os primeiros 577 nt, fossem incluídos e 2) inclusão do elemento regulatório pós- transcricional do virus da hepatite de marmota americana (WHV PRE) (correspondendo aos nt 901-1800 de N° de Acesso J04514) no sitio NotI a jusante do gene repórter LacZ.

As partículas virais derivadas de cada das linhas celulares foram, depois, parcialmente purificadas do meio por centrifugação de gradiente de densidade de equilíbrio. Para o 95 efeito, 10 mL de meio de células produtoras, recolhidas a 24 horas após indução com butirato de sódio, foram dispostos em camada sobre um gradiente de sacarose a 20-60% (p/p) em tampão TNE (pH 7,4) e centrifugados, durante 24 horas, a 25000 rpm e 4 °C, num rotor SW28. As fracções foram recolhidas do fundo e 10 pL de cada fracção ensaiados para actividade de transcritase reversa, de modo a localizar partículas virais. Os resultados desta análise são mostrados na (Figura 47) onde o perfil de actividade de transcritase reversa é mostrado como uma função da fracção de gradiente. Nestas figuras, o topo do gradiente está à direita. Deve ser notado que os níveis de actividade de RT da célula expressando pESYNGP foram significativamente mais baixos do que de células expressando pEV53B. Para determinar o teor de ARN dos viriões purificados, alíquotas de fracções do topo, meio ou fundo foram agregadas (como indicado pelas barras rotuladas T, M e B) e o ARN de cada fracção foi submetido a análise de hibridação de transferência slot. Utilizando uma sonda específica para uma região comum de gag/pol de tipo selvagem e sintético, a encapsidação de ARN era facilmente detectável nas fracções de pico (M) de viriões sintetizados a partir das construções de tipo selvagem (pEV53B), mas não foi detectada a partir de viriões sintetizados a partir da construção de Gag/Pol sintética (pESYNGP) (Figura 48). 0 controlo para a presença de cápside capaz de efectuar a encapsidação foi o genoma de vector de G3-CZW de EIAV que foi facilmente detectado em fracções de pico a partir de células expressando proteínas gag/pol, quer de tipo selvagem ou sintéticas. Mesmo tendo em conta os diferentes níveis de expressão das construções de expressão de Gag/Pol de tipo selvagem e sintéticas, este resultado indica que o ARN do gene gag/pol com codões optimizados é empacotado, significativamente, menos eficientemente do que o gene de tipo selvagem e representa um melhoramento significativo para o 96 perfil de segurança do sistema. De nota adicional, é que o ARN transcrito a partir de pEV53B foi empacotado. Este ARN é removido em relação a sequências a montante da sequência dadora de excisão (CAG/GTAAG) e, contudo, ainda foi empacotado. Isto aponta para a localização de determinantes de empacotamento principais na região codificante de gag e está em contraste com as observações recolhidas na localização do sinal de empacotamento de HIV-1.

Em experiências adicionais foi mostrado que o empacotamento de transcritos a partir de pEV53B é apenas ligeiramente mais baixo do que a partir de pEV53A (Figura 51). Isto indica adicionalmente que as sequências de empacotamento principais estão localizadas na região codificante de gag. Nestas experiências, a linha celular B-241 expressou ARN de pEV53B e PEV-17 expressou ARN de pEV53A. 0 genoma de vector de EIAV utilizado para confirmar a presença de partículas de vector competentes para empacotamento foi G3-CZR, que é o mesmo que G3-CZW, anteriormente descrito, à excepção da substituição do elemento regulatório pós-transcricional de marmota americana com uma sequência contendo os elementos RRE de EIAV. A metodologia foi anteriormente descrita. 97

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PARTE DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DA DESCRIÇÃO SEQ. ID. Into. I - Sequência gagpol de tipo selvagem para a estirpe HXB2 (acesso N° K03455)

ATGGGTGCGA GAGCGTCAGT ATTAAGCGGG TTAAGGCCAG GGGGAAAGAA AAAATATAAA CTAGAACGAT TCGCAGTTAA TCCTGGCCTG CTGGGACAGC TACAACCATC CCTTCAGACA ACAGTAGCAA CCCTCTATTG TGTGCATCAA TTAGACAAGA TAGAGGAAGA GCAAAACAAA GACACAGGAC ACAGCAATCA GGTCAGCCAA CAAATGGTAC ATCAGGCCAT ATCACCTAGA GAGAAGGCTT TCAGCCCAGA AGTGATACCC CCACAAGATT TAAACACCAT GCTAAACACA TTAAAAGAGA CCATCAATGA GGAAGCTGCA GGGCCTATTG CACCAGGCCA GATGAGAGAA AGTACCCTTC AGGAACAAAT AGGATGGATG ATTTATAAAA GATGGATAAT CCTGGGAHA GGAGAATTAG ATCGATGGGA AAAAATTCGG 60 TTAAAACATA TAGTATGGGC AAGCAGGGAG 120 TTAGAAACAT CAGAAGGCTG TAGACAAATA 180 GGATCAGAAG AACTTAGATC ATTATATAAT 240 AGGATAGAGA TAAAAGACAC CAAGGAAGCT 300 AGTAAGAAAA AAGCACAGCA AGCAGCAGCT 360 AATTACCCTA TAGTGCAGAA CATCCAGGGG 420 ACTTTAAATG CATGGGTAAA AGTAGTAGAA 480 ATGTTTTCAG CATTATCAGA AGGAGCCACC 540 GTGGGGGGAC ATCAAGCAGC CATGCAAATG 600 GAATGGGATA GAGTGCATCC AGTGCATGCA 660 CCAAGGGGAA GTGACATAGC AGGAACTACT 720 ACAAATAATC CACCTATCCC AGTAGGAGAA 780 AATAAAATAG TAAGAATGTA TAGCCCTACC 840 102 AGCATTCTGG ACATAAGACA AGGACCAAAG GAACCCTTTA GAGACTATGT AGACCGGTTC 900 TATAAAACTC TAAGAGCCGA GCAAGCTTCA CAGGAGGTM AAAATTGGAT GACAGAAACC 960 TTGrTCfôTCC AAAATGCGAA CCCAGATTGT AAGACTATTT TAAAAGCATT GGGACCAGCG 1020 GCTACACTAG AAGAAATGAT GACAGCATGT CAGGGAGTAG GAGGACCCGG CCATAAGGCA 1080 AGAGTTTTGG CTGAAGCAAT GAGCCAAGTA ACAAATTCAG CTACCATAAT GATGCAGAGA 1140 GGCAATTTTA GGAACCAAAG AAAGATTGTT AAGTGTTTCA A1TGTGGCAA AGAAGGGCAC 1200 ACAGCCAGAA ATTGCAGGGC CCCTAGGAAA AAGGGCTGTT GGAAATGTGG AAAGGAAGGA 1260 CACCAAATGA AAGATTGTAC TGAGAGACAG GCTAATTTTT TAGGGAAGAT CTGGCCTTCC 1320 TACAAGGGAA GGCCAGGGAA TTTTCTTCAG AGCAGACCAG AGCCAACAGC CCCACCAGAA 1380 GAGAGCTTCA GGTCTGGGGT AGAGACAACA ACTCCCCCTC AGAAGCAGGA GCCGATAGAC 1440 AAGGAACTGT ATCCT7TAAC TTCCCTCAGG TCACTCTTTG GCAACGACCC CTCGTCACAA 1500 TAAAGATAGG GGGGCAACTA AAGGAAGCTC TATTAGATAC AGGAGCAGAT GATACAGTAT 1560 TAGAAGAAAT GAGTTTGCCA GGAAGATGGA AACCAAAAAT GATAGGGGGA ATTGGAGGTT 1620 TTATCAAAGT AAGACAGTAT GATCAGATAC TCATAGAAAT CTGTGGACAT AAAGCTATAG 1680 GTACAGTATT AGTAGGACCT ACACCTGTCA ACATAATTGG AAGAAATCTG TTGACTCAGA 1740 TTGGTTGCAC TTTAAATTTT CCCATTAGCC CTATTGAGAC TGTACCAGTA AAAHAAAGC 1800 CAGGAATGGA TGGCCCAAAA GTTAAACAAT GGCCAHGAC AGAAGAAAAA ATAAAAGCAT 1860 TAGTAGAAAT TTGTACAGAG ATGGAAAAGG AAGGGAAAAT TTCAAAAATT GGGCCTGAAA 1920 ATCCATACAA TACTCCAGTA TTTGCCATAA AGAAAAAAGA CAGTACTAAA TGGAGAAAAT 1980 TAGTAGATTT CAGAGAACTT AATAAGAGAA CTCAAGACTT CTGGGAAGTT CAATTAGGAA 2040 TACCACATCC CGCAGGGTTA AAAAAGAAAA AATCAGTAAC AGTACTGGAT GTGGGTGATG 2100 CATATTTTTC AGTTCCCTTA GATGAAGACT TCAGGAAGTA TACTGCATTT ACCATACCTA 2160 GTATAAACAA TGAGACACCA GGGATTAGAT ATCAGTACAA TGTGCTTCCA CAGGGATGGA 2220 AAGGATCACC AGCAATATTC CAAAGTAGCA TGACAAAAAT CTTAGAGCCT TTTAGAAAAC 2280 AAAATCCAGA CATAGHATC TATCAATACA TGGATGATTT GTATGTAGGA TCTGACTTAG 2340 AAATAGGGCA GCATAGAACA AAAATAGAGG AGCTGAGACA ACATCTGTTG AGGTGGGGAC 2400 TTACCACACC AGACAAAAAA CATCAGAAAG AACCTCCATT CCTTTGGATG GGTTATGAAC 2460 TCCATCCTGA TAAATGGACA GTACAGCCTA TAGTGCTGCC AGAAAAAGAC AGCTGGACTG 2520 TCAATGACAT ACAGAAGTTA GTGGGGAAAT TGAATTGGGC AAGTCAGATT TACCCAGGGA 2580 TTAAAGTAAG GCAATTATGT AAACTCCTTA GAGGAACCAA AGCACTAACA GAAGTAATAC 2640 CACTAACAGA AGAAGCAGAG CTAGAACTGG CAGAAAACAG AGAGATTCTA AAAGAACCAG 2700 TACATGGAGT GTATTATGAC CCATCAAAAG ACTTAATAGC AGAAATACAG AAGCAGGGGC 2760 AAGGCCAATG GACATATCAA ATTTATCAAG AGCCATTTAA AAATCTGAAA ACAGGAAAAT 2820 ATGCAAGAAT GAGGGGTGCC CACACTAATG ATGTAAAACA ATTAACAGAG GCAGTGCAAA 2880 AAATAACCAC AGAAAGCATA GTAATATGGG GAAAGACTCC TAAATTTAAA CTGCCCATAC 2940 AAAAGGAAAC ATGGGAAACA TGGTGGACAG AGTATTGGCA AGCCACCTGG ATTCCTGAGT 3000 GGGAGTTTGT TAATACCCCT CCCTTAGTGA AATTATGGTA CCAGTTAGAG AAAGAACCCA 3060 TAGTAGGAGC AGAAACCTTC TATGTAGATG GGGCAGCTAA CAGGGAGACT AAATTAGGAA 3120 AAGCAGGATA TGTTACTAAT AGAGGAAGAC AAAAAGTTGT CACCCTAACT GACACAACAA 3180 ATCAGAAGAC TGAGTTACAA GCAATTTATC TAGCTTTGCA GGATTCGGGA TTAGAAGTAA 3240 ACATAGTAAC AGACTCACAA TATGCATTAG GAATCATTCA AGCACAACCA GATCAAAGTG 3300 AATCAGAGTT AGTCAATCAA ATAATAGAGC AGTTAATAAA AAAGGAAAAG GTCTATCTGG 3360 CATGGGTACC AGCACACAAA GGAATTGGAG GAAATGAACA AGTAGATAAA TTAGTCAGTG 3420 103

CTGGAATCAG AATATCACAG AAGAAATAGT TAGACTGTAG TGGTAGCAGT GGCAGGAAAC ATACTGACAA GAATCAAGCA TGAATAAAGA CAGCAGTACA ACAGTGCAGG AAAAACAAAT TTTGGAAAGG ATAGTGACAT AGATGGCAGG GAAAGTACTA TTTTTAGATG GAATAGATAA GGCCCAAGAT GAACATGAGA 3480 TAATTGGAGA GCAATGGCTA GTGATTTTAA CCTGCCACCT GTAGTAGCAA 3540 AGCCAGCTGT GATAAATGTC AGCTAAAAGG AGAAGCCATG CATGGACAAG 3600 TCCAGGAATA TGGCAACTAG ATTGTACACA TTTAGAAGGA AAAGTTATCC 3660 TCATGTAGCC AGTGGATATA TAGAAGCAGA AGTTATTCCA GCAGAAACAG 3720 AGCATATTTT CTTTTAAAAT TAGCAGGAAG ATGGCCAGTA AAAACAATAC 3780 TGGCAGCAAT TTCACCGGTG CTACGGTTAG GGCCGCCTGT TGGTGGGCGG 3840 GGAATTTGGA ATTCCCTACA ATCCCCAAAG TCAAGGAGTA GTAGAATCTA 3900 ATTAAAGAAA ATTATAGGAC AGGTAAGAGA TCAGGCTGAA CATCTTAAGA 3960 AATGGCAGTA TTCATCCACA ATTTTAAAAG AAAAGGGGGG AHGGGGGGT 4020 GGAAAGAATA GTAGACATAA TAGCAACAGA CATACAAACT AAAGAATTAC 4080 TACAAAAATT CAAAATTTTC GGGTTTATTA CAGGGACAGC AGAAATTCAC 4140 ACCAGCAAAG CTCCTCTGGA AAGGTGAAGG GGCAGTAGTA ATACAAGATA 4200 AAAAGTAGTG CCAAGAAGAA AAGCAAAGAT CATTAGGGAT TATGGAAAAC 4260 TGATGATTGT GTGGCAAGTA GACAGGATGA GG/ttTAG 4307

pSYNGP SEQ ID N° 2

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTA ttggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtcc

AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG

GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC

GCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAT

AGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC

CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGA

CGGTAAATGGCCÇGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTG

GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACAC

CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT

CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTG

CGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATA

AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCAC

AGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGT

GACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAA

GGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACT

CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCAC

AGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACT

ATAGGCTAGCCTCGAGAATTCGCCACCATGGGCGCCCGCGCCAGCGTGCTGTCGGGCGGC

GAGCTGGACCGCTGGGAGAAGATCCGCCTGCGCCCCGGCGGCAAAAAGAAGTACAAGCTG

AAGCACATCGTGTGGGCCAGCCGCGAACTGGAGCGCTTCGCCGTGAACCCCGGGCTCCTG

GAGACCAGCGAGGGGTGCCGCCAGATCCTCGGCCAACTGCAGCCCAGCCTGCAAACCGGC

AGCGAGGAGCTGCGCAGCCTGTACAACACCGTGGCCACGCTGTACTGCGTCCAGCAGCGC atcgaaatcaaggatacgaaagaggccctggataaaatcgaagaggaacagaataaqagc

AAAAAGAAGGCCCAACAGGCCGCCGCGGACACCGGACACAGCAACCAGGTCAGCCAGAAC

TACCCCATCGTGCAGAACATCCAGGGGCAGATGGTGCACCAGGCCATCTCCCCCCGCACG

CTGAACGCCTGGGTGAAGGTGGTGGAAGAGAAGGCTTTTAGCCCGGAGGTGATACCCATG

TTCTCAGCCCTGTCAGAGGGAGCCACCCCCCAAGATCTGAACACCATGCTCAACACAGTG 104

GGGGGACACCAGGCCGCCATGCAGATGCTGAAGGAGACCATCAATGAGGAGGCTGCCGAA

TGGGATCGTGTGCATCCGGTGCACGCAGGGCCCATCGCACCGGGCCAGATGCGTGAGCCA

CGGGGCrCAGACATCGCCGGAACGACTAGTACCCTTCAGGAACAGATCGGCTGGATGACC

AACAACCCACCCATCCCGGTGGGAGAAATCTACAAACGCTGGATCATCCTGGGCCTGAAC

AAGATCGTGCGCATGTATAGCCCTACCAGCATCCTGGACATCCGCCAAGGCCCGAAGGAA

CCCTTTCGCGACTACGTGGACCGGTTCTACAAAACGCTCCGCGCCGAGCAGGCTAGCCAG gaggtgaagaactggatgaccgaaaccctgctggtccagaacgcgaacccggactgcaag

ACGATCCTGAAGGCCCTGGGCCCAGCGGCTACCCTAGAGGAAATGATGACCGCCTGTCAG ggagtgggcggacccggccacaaggcacgcgtcctggctgaggccatgagccaggtgacc aactccgctaccatcatgatgcagcgcggcaactttcggaaccaacgcaagatcgtcaag

TGCTTCAACTGTGGCAAAGAAGGGCACACAGCCCGCAACTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAG

GGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGATTGTACTGAGAGACAGGCT aattttttagggaagatctggccttcccacaagggaaggccagggaattttcttcagagc agaccagagccaacagccccaccagaagagagcttcaggtttggggaagagacaacaact ccctctcagaagcaggagccgatagacaaggaactgtatcctttagcttccctcagatca ctctttggcagcgacccctcgtcacaataaagataggggggcagctcaaggaggctctcc tggacaccggagcagacgacaccgtgctggaggagatgtcgttgccaggccgctggaagc cgaagatgatcgggggaatcggcggtttcatcaaggtgcgccagtatgaccagatcctca tcgaaatctgcggccacaaggctatcggtaccgtgctggtgggccccacacccgtcaaca tcatcggacgcaacctgttgacgcagatcggttgcacgctgaacttccccattagcccta tcgagacggtaccggtgaagctgaagcccgggatggacggcccgaaggtcaagcaatggc cattgacagaggagaagatcaaggcactggtggagatttgcacagagatggaaaaggaag ggaaaatctccaagattgggcctgagaacccgtacaacacgccggtgttcgcaatcaaga agaaggactcgacgaaatggcgcaagctggtggacttccgcgagctgaacaagcgcacgc aagacttctgggaggttcagctgggcatcccgcaccccgcagggctgaagaagaagaaat ccgtgaccgtactggatgtgggtgatgcctacttctccgttcccctggacgaagacttca ggaagtacactgccttcacaatcccttcgatcaacaacgagacaccggggattcgatatc agtacaacgtgctgccccagggctggaaaggctctcccgcaatcttccagagtagcatga ccaaaatcctggagcctttccgcaaacagaaccccgacatcgtcatctatcagtacatgg atgacttgtacgtgggctctgatctagagatagggcagcaccgcaccaagatcgaggagc tgcgccagcacctgttgaggtggggactgaccacacccgacaagaagcaccagaaggagc ctcccttcctctggatgggttacgagctgcaccctgacaaatggaccgtgcagcctatcg

TGCTGCCAGAGAAAGACAGCTGGACTGTCAACGACATACAGAAGCTGGTGGGGAAGTTGA

ACTGGGCCAGTCAGATTTACCCAGGGATTAAGGTGAGGCAGCTGTGCAAACTCCTCCGCG

GAACCAAGGCACTCACAGAGGTGATCCCCCTAACCGAGGAGGCCGAGCTCGAACTGGCAG

AAAACCGAGAGATCCTAAAGGAGCCCGTGCACGGCGTGTACTATGACCCCTCCAAGGACC

TGATCGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAAGGCCAGTGGACCTATCAGATTTACCAGGAGC

CCTTCAAGAACCTGAAGACCGGCAAGTACGCCCGGATGAGGGGTGCCCACACTAACGACG

TCAAGCAGCTGACCGAGGCCGTGCAGAAGATCACCACCGAAAGCATCGTGATCTGGGGAA

AGACTCCTAAGTTCAAGCTGCCCATCCAGAAGGAAACCTGGGAAACCTGGTGGACAGAGT

ATTGGCAGGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAGTTCGTCAACACCCCTCCCCTGGTGAAGC

TGTGGTACCAGCTGGAGAAGGAGCCCATAGTGGGCGCCGAAACCTTCTACGTGGATGGGG

CCGCTAACAGGGAGACTAAGCTGGGCAAAGCCGGATACGTCACTAACCGGGGCAGACAGA

AGGTTGTCACCCTCACTGACACCACCAACCAGAAGACTGAGCTGCAGGCCATTTACCTCG

CTTTGCAGGACTCGGGCCTGGAGGTGAACATCGTGACAGACTCTCAGTATGCCCTGGGCA

TCATTCAAGCCCAGCCAGACCAGAGTGAGTCCGAGCTGGTCAATCAGATCATCGAGCAGC

TGATCAAGAAGGAAAAGGTCTATCTGGCCTGGGTACCCGCCCACAAAGGCATTGGCGGCA

ATGAGCAGGTCGACAAGCTGGTCTCGGCTGGCATCAGGAAGGTGCTATTCCTGGATGGCA

TCGACAAGGCCCAGGACGAGCACGAGAAATACCACAGCAACTGGCGGGCCATGGCTAGCG 105

ACTTCAACCTGCCCCCTGTGGTGGCCAAAGAGATCGTGGCCAGCTGTGACAAGTGTCAGC TCAAGGGCGAAGCCATGCATGGCCAGGTGGACTGTAGCCCCGGCATCTGGCAACTCGATT GCACCCATCTGGAGGGCAAGGTTATCCTGGTAGCCGTCCATGTGGCCAGTGGCTACATCG AGGCCGAGGTCATTCCCGCCGAAACAGGGCAGGAGACAGCCTACTTCCTCCTGAAGCTGG CAGGCCGGTGGCCAGTGAAGACCATCCATACTGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTGCTA CGGTTAAGGCCGCCTGCTGGTGGGCGGGAATCAAGCAGGAGTTCGGGATCCCCTACAATC CCCAGAGTCAGGGCGTCGTCGAGTCTATGAATAAGGAGTTAAAGAAGATTATCGGCCAGG TCAGAGATCAGGCTGAGCATCTCAAGACCGCGGTCCAAATGGCGGTATTCATCCACAATT TCAAGCGGAAGGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCGGGGGAGCGGATCGTGGACATCATCG CGACCGACATCCAGACTAAGGAGCTGCAAAAGCAGATTACCAAGATTCAGAATTTCCGGG TCTACTACAGGGACAGCAGAAATCCCCTCTGGAAAGGCCCAGCGAAGCTCCTCTGGAAGG GTGAGGGGGCAGTAGTGATCCAGGATAATAGCGACATCAAGGTGGTGCCCAGAAGAAAGG CGAAGATCATTAGGGATTATGGCAAACAGATGGCGGGTGATGATTGCGTGGCGAGCAGAC AGGATGAGGATTAGGAATTGGGCTAGAGCGGCCGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTT CGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGA AAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGC TCCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAG ATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCCGATAAGGA TCGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGC GCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGT GGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTT CTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCT CCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGG TGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGA GTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTC GGT CTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTG C CGATTTCGG C CTATTGGTTAAAAAATGA GCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCGCC TGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGCGGATCTG CGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGG CGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCC AGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTC CCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAT AGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCC GCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGA GCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGA TTCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGGCTAGAGCCACCATGATTGAACAAGATGGA TTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAA CAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTT CTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGG CTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAA gcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcac

CTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTT

GATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACT

CGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCG

CCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTG

ACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTC

ATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGT

GATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATC

GCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCG

GGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGATGGCCGC

AATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGCG 106

ATAAGGATCCGCGTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGC

CAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCA

TCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCG

TCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAAT

GTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGA acccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataa

CCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGT

GTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACG

CTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG

GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATG

AGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAG

CAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACA

GAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATG

AGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACC gcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctg

AATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACG

TTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGAC

TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGG

TTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTG

GGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACT

ATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAA

CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTT

AAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAG

TTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCT

TTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTT

TGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCG

CAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACrCT gtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggc

GATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGG

TCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAA

CTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCG

GACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGG

GGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGA

TTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTT

TTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT SEQ ID N° 3 N° Ml 7 4 4 9)

Gene de Envelope de HIV-1 MN (Acesso Genbank

ATGAGAGTGA AGGGGATCAG GAGGAATTAT CTTGGGTTAT TAATGATCTG TAGTGCTACA GTACCTGTGT GGAAAGAAGC AACCACCACT GATACAGAGG TACATAATGT TTGGGCCACA CAAGAAGTAG AATTGGTAAA TGTGACAGAA GAACAGATGC ATGAGGATAT AATCAGTTTA CAGCACTGGT GGGGATGGGG CACGATGCTC 60 ΰΑΑΑΑΑπθΤ GGGTCACAGT CTATTATGGG 120 CTATTTTGTG CATCAGATGC TAAAGCATAT 180 CAAGCCTGTG TACCCACAGA CCCCAACCCA 240 AATTTTAACA TGTGGAAAAA TAACATGGTA 300 TGGGATCAAA GCCTAAAGCC ATGTGTAAAA 360 107

CTATAGTGAA TAGAGTTAGG CAGGGATACT TTCCGAGGGG ACCCGACAGG CCCGAAGGAA ACACATCCGG TCGATTAGTG CATGGATTCT TGTTCCTCTT CAGCTACCAC CACAGAGA.CT TTCTGGGACG CAGGGGGTGG GAAGTCCTCA GTCAGGAACT AAAGAGTAGT GCTGTTAGCT AGGGGACAGA TAGGGTTATA GAAGTACTGC CTACAAGAAT AAGACAGGGC TTGGAAAGGG

TTAACCCCAC TCTGTGTTAC tttaaattgc AATAGTACTG CTAATAACAA TAGTAATAGC AACTGCTCTT TCAATATCAC CACAAGCATA C7TTATAAAC TTGATATAGT ATCAATAGAT TGTAATACCT CAGTCATTAC ACAAGCTTGT CACTATTGTG CCCCGGCTGG TTTTGCGATT AAAGGATCAT GTAAAAATGT CAGCACAGTA TCAACTCAAC TGCTGTTAAA TGGCAGTCTA AATTTCACTG ATAATGCTAA AACCATCATA TGTACAAGAC CCAACTACAA TAAAAGAAAA TATACAACAA AAAATATAAT AGGAACTATA AAATGGAATG ACACTTTAAG ACAGATAGTT ACAATAGTCT TTAATCAATC CTCAGGAGGG TGTGGAGGGG AATTTTTCTA CTGTAATACA AATAATACTT GGAATAATAC TACAGGGTCA AAACAAATTA TAAACATGTG GCAGGAAGTA GGACAAATTA GATGTTCATC AAATATTACA GACACGGACA CGAACGACAC CGAGATCTTC TGGAGAAGTG AATTATATAA ATATAAAGTA ACCAAGGCAA AGAGAAGAGT GGTGCAGAGA CTTGGGTTCT TAGGAGCAGC AGGAAGCACT CAGGCCAGAC TATTATTGTC TGGTATAGTG GAGGCGCAAC AGCATATGTT GCAACTCACA GTCCTGGCTG TGGAAAGATA CCTAAAGGAT GGAAAACTCA TTTGCACCAC TACTGTGCCT GATGATATTT GGAATAACAT GACCTGGATG AGCTTAATAT ACTCATTACT AGAAAAATCG TTATTGGAAT TGGATAAATG GGCAAGTTTG TGGTATATAA AAATATTCAT AATGATAGTA

GCTGTACTTT CGCCCCCCAG AGAGACAGAG CTGCGGAGCC ATTGTGGAAC CAGTATTGGA GCAGTAGCTG CTCCACATAC ACTGATTTGA GGAATACTAC TAATACCAAT 420 GAGGGAACAA TAAAGGGAGG AGAAATGAAA 480 AGAGATAAGA TGCAGAAAGA ATATGCACTT 540 AATGATAGTA CCAGCTATAG GTTGATAAGT 600 CCAAAGATAT CCTTTGAGCC AATTCCCATA 660 CTAAAATGTA ACGATAAAAA GTTCAGTGGA 720 CAATGTACAC ATGGAATTAG GCCAGTAGTA 780 GCAGAAGAAG AGGTAGTAAT TAGATCTGAG 840 GTACATCTGA ATGAATCTGT ACAAATTAAT 900 AGGATACATA TAGGACCAGG GAGAGCATTT 960 AGACAAGCAC ATTGTAACAT TAGTAGAGCA 1020 AGCAAATTAA AAGAACAATT TAAGAATAAA 1080 GACCCAGAAA TTGTAATGCA CAGTTTTAAT 1140 TCACCACTGT TTAATAGTAC TTGGAATGGT 1200 AATAACAATA TCACACTTCA ATGCAAAATA 1260 GGAAAAGCAA TGTATGCCCC TCCCATTGAA 1320 GGGCTACTAT TAACAAGAGA TGGTGGTAAG 1380 AGACCTGGAG GAGGAGATAT GAGGGACAAT 1440 GTAACAATTG AACCATTAGG AGTAGCACCC 1500 GAAAAAAGAG CAGCGATAGG AGCTCTGTTC 1560 ATGGGCGCAG CGTCAGTGAC GCTGACGGTA 1620 CAACAGCAGA ACAATTTGCT GAGGGCCATT 1680 GTCTGGGGCA TCAAGCAGCT CCAGGCAAGA 1740 CAACAGCTCC TGGGGTTTTG GGGTTGCTCT 1800 TGGAATGCTA GTTGGAGTAA TAAATCTCTG 1860 CAGTGGGAAA GAGAAATTGA CAATTACACA 1920 CAAACCCAAC AAGAAAAGAA TGAACAAGAA 1980 TGGAATTGGT TTGACATAAC AAATTGGCTG 2040 GGAGGCTTGG TAGGTTTAAG AATAGTTTTT 2100 CACCATTGTC GTTGCAGACC 2160 TCGAAGAAGA AGGTGGAGAG 2220 TAGCAATTAT CTGGGTCGAC 2280 TACTCTTGAT TGCAGCGAGG 2340 AATATTGGTG GAATCTCCTA 2400 TGCTTAATGC CACAGCTATA 2460 AAAGAGCTGG TAGAGCTATT 2520 CTTTGCTATA A 2571 SEQ ID N° 4 SYNgp-160mn - sequência env com codoes optimizados ATGAGGGTGA AGGGGATCCG CCGCAACTAC CAGCACTGGT GGGGCTGGGG CACGATGCTC 60 108 CTGGGGCTGC TGATGATCTG CAGCGCCACC GAGAAGCTGT GGGTGACCGT GTACTACGGC 120 GTGCCCGTGT GGAA.GGAGGC CACCACCACC CTGTTCTGCG CCAGCGACGC CAAGGCGTAC 180 GACACCGAGG TGCACAACGT GTGGGCCACC CAGGCGTGCG TGCCCACCGA CCCCAACCCC 240 CAGGAGGTGG AGCTCGTGAA CGTGACCGAG AACTTCAACA TGTGGAAGAA CAACATGGTG 300 GAGCAGATGC ATGAGGACAT CATCAGCCTG TGGGACCAGA GCCTGMGCC CTGCGTGAAG 360 CTGACCCCCC TGTGCGTGAC CCTGAACTGC ACCGACCTGA GGAACACCAC CAACACCAAC 420 AACAGCACCG CCAACAACAA CAGCAACAGC GAGGGCACCA TCAAGGGCGG CGAGATGAAG 480 AACTGCAGCT TCAACATCAC CACCAGCATC CGCGACAAGA TGCAGAAGGA GTACGCCCTG 540 CTGTACAAGC TGGATATCGT GAGCATCGAC AACGACAGCA CCAGCTACCG CCTGATCTCC 600 TGCAACACCA GCGTGATCAC CCAGGCCTGC CCCAAGATCA GCTTCGAGCC CATCCCCATC 660 CACTACTGCG CCCCCGCCGG CTTCGCCATC CTGAAGTGCA ACGACAAGAA GTTCAGCGGC 720 AAGGGCAGCT GCAAGAACGT GAGCACCGTG CAGTGCACCC ACGGCATCCG GCCGGTGGTG 780 AGCACCCAGC TCCTGCTGAA CGGCAGCCTG GCCGAGGAGG AGGTGGTGAT CCGCAGCGAG 840 AACTTCACCG ACAACGCCAA GACCATCATC GTGCACCTGA ATGAGAGCGT GCAGATCAAC 900 TGCACGCGTC CCAACTACAA CAAGCGCAAG CGCATCCACA TCGGCCCCGG GCGCGCCTTC 960 TACACCACCA AGAACATCAT CGGCACCATC CGCCAGGCCC ACTGCAACAT CTCTAGAGCC 1020 AAGTGGAACG ACACCCTGCG CCAGATCGTG AGCAAGCTGA AGGAGCAGTT CAAGAACAAG 1080 ACCATCGTGT TCAACCAGAG CAGCGGCGGC GACCCCGAGA TCGTGATGCA CAGCTTCAAC 1140 TGCGGCGGCG AATTCTTCTA CTGCAACACC AGCCCCCTGT TCAACAGCAC CTGGAACGGC 1200 AACAACACCT GGAACAACAC CACCGGCAGC AACAACAATA nACCCTCCA GTGCAAGATC 1260 AAGCAGATCA TCAACATGTG GCAGGAGGTG GGCAAGGCCA TGTACGCCCC CCCCATCGAG 1320 GGCCAGATCC GGTGCAGCAG CAACATCACC GGTCTGCTGC TGACCCGCGA CGGCGGCAAG 1380 GACACCGACA CCAACGACAC CGAAATCTTC CGCCCCGGCG GCGGCGACAT GCGCGACAAC 1440 TGGAGATCTG AGCTGTACAA GTACAAGGTG GTGACGATCG AGCCCCTGGG CGTGGCCCCC 1500 ACCAAGGCCA AGCGCCGCGT GGTGCAGCGC GAGAAGCGGG CCGCCATCGG CGCCCTGTTC 1560 CTGGGCTTCC TGGGGGCGGC GGGCAGCACC ATGGGGGCCG CCAGCGTGAC CCTGACCGTG 1620 CAGGCCCGCC TGCTCCTGAG CGGCATCGTG CAGCAGCAGA ACAACCTCCT CCGCGCCATC 1680 GAGGCCCAGC AGCATATGCT CCAGCTCACC GTGTGGGGCA TCAAGCAGCT CCAGGCCCGC 1740 GTGCTGGCCG TGGAGCGCTA CCTGAAGGAC CAGCAGCTCC TGGGCTTCTG GGGCTGCTCC 1800 GGCAAGCTGA TCTGCACCAC CACGGTACCC TGGAACGCCT CCTGGAGCAA CAAGAGCCTG 1860 GACGACATCT GGAACAACAT GACCTGGATG CAGTGGGAGC GCGAGATCGA TAACTACACC 1920 AGCCTGATCT ACAGCCTGCT GGAGAAGAGC CAGACCCAGC AGGAGAAGAA CGAGCAGGAG 1980 CTGCTGGAGC TGGACAAGTG GGCGAGCCTG TGGAACTGGT TCGACATCAC CAACTGGCTG 2040 TGGTACATCA AAATCTTCAT CATGATTGTG GGCGGCCTGG TGGGCCTCCG CATCGTGTTC 2100 GCCGTGCTGA GCATCGTGAA CCGCGTGCGC CAGGGCTACA GCCCCCTGAG CCTCCAGACC 2160 CGGCCCCCCG TGCCGCGCGG GCCCGACCGC CCCGAGGGCA TCGAGGAGGA GGGCGGCGAG 2220 CGCGACCGCG ACACCAGCGG CAGGCTCGTG CACGGCTTCC TGGCGATCAT CTGGGTCGAC 2280 CTCCGCAGCC ΤΰΤΤΟαΰπ CAGCTACCAC CACCGCGACC TGCTGCTGAT CGCCGCCCGC 2340 ATCGTGGAAC TCCTAGGCCG CCGCGGCTGG GAGGTGCTGA AGTACTGGTG GAACCTCCTC 2400 CAGTATTGGA GCCAGGAGCT GAAGTCCAGC GCCGTGAGCC TGCTGAACGC CACCGCCATC 2460 GCCGTGGCCG AGGGCACCGA CCGCGTGATC GAGGTGCTCC AGAGGGCCGG GAGGGCGATC 2520 CTGCACATCC CCACCCGCAT CCGCCAGGGG CTCGAGAGGG CGCTGCTGTA A 2571 109 5

SEQ ID N

pESYNGP

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTA

TTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC

AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG

GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC

GCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAT

AGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC

CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGA

CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTG

GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACAC

CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT

CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTG

CGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATA

AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCAC

AGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGT

GACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAA

GGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACT

CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCAC

AGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACT

ATAGGCTAGAGAATTCGCCACCATGGGCGATCCCCTCACCTGGTCCAAAGCCCTGAAGAA

ACTGGAAAAAGTCACCGTTCAGGGTAGCCAAAAGCTTACCACAGGCAATTGCAACTGGGC attgtccctggtggatcttttccacgacactaatttcgttaaggagaaagattggcaact

CAGAGACGTGATCCCCCTCTTGGAGGACGTGACCCAAACATTGTCTGGGCAGGAGCGCGA

AGCTTTCGAGCGCACCTGGTGGGCCATCAGCGCAGTCAAAATGGGGCTGCAAATCAACAA

CGTGGTTGACGGTAAAGCTAGCTTTCAACTGCTCCGCGCTAAGTACGAGAAGAAAACCGC

CAACAAGAAACAATCCGAACCTAGCGAGGAGTACCCAATTATGATCGACGGCGCCGGCAA

TAGGAACTTCCGCCCACTGACTCCCAGGGGCTATACCACCTGGGTCAACACCATCCAGAC

AAACGGACTTTTGAACGAAGCCTCCCAGAACCTGTTCGGCATCCTGTCTGTGGACTGCAC

CTCCGAAGAAATGAATGCTTTTCTCGACGTGGTGCCAGGACAGGCTGGACAGAAACAGAT

CCTGCTCGATGCCATTGACAAGATCGCCGACGACTGGGATAATCGCCACCCCCTGCCAAA

CGCCCCTCTGGTGGCTCCCCCACAGGGGCCTATCCCTATGACCGCTAGGTTCATTAGGGG

ACTGGGGGTGCCCCGCGAACGCCAGATGGAGCCAGCATTTGACCAATTTAGGCAGACCTA

CAGACAGTGGATCATCGAAGCCATGAGCGAGGGGATTAAAGTCATGATCGGAAAGCCCAA

GGCACAGAACATCAGGCAGGGGGCCAAGGAACCATACCCTGAGTTTGTCGACAGGCTTCT

GTCCCAGATTAAATCCGAAGGCCACCCTCAGGAGATCTCCAAGTTCTTGACAGACACACT

GACTATCCAAAATGCAAATGAAGAGTGCAGAAACGCCATGAGGCACCTCAGACCTGAAGA

TACCCTGGAGGAGAAAATGTACGCATGTCGCGACATTGGCACTACCAAGCAAAAGATGAT

GCTGCTCGCCAAGGCTCTGCAAACCGGCCTGGCTGGTCCATTCAAAGGAGGAGCACTGAA

GGGAGGTCCATTGAAAGCTGCACAAACATGTTATAATTGTGGGAAGCCAGGACATTTATC

TAGTCAATGTAGAGCACCTAAAGTCTQTTTTAAATGTAAACAGCCTGGACATTTCTCAAA

GCAATGCAGAAGTGTTCCAAAAAACGGGAAGCAAGGGGCTCAAGGGAGGCCCCAGAAACA

AACTTTCCCGATACAACAGAAGAGTCAGCACAACAAATCTGTTGTACAAGAGACTCCTCA

GACTCAAAATCTGTACCCAGATCTGAGCGAAATAAAAAAGGAATACAATGTCAAGGAGAA

GGATCAAGTAGAGGATCTCAACCTGGACAGTTTGTGGGAGTAACATACAATCTCGAGAAG

AGGCCCACTACCATCGTCCTGATCAATGACACCCCTCTTAATGTGCTGCTGGACACCGGA

GCCGACACCAGCGTTCTCACTACTGCTCACTATAACAGACTGAAATACAGAGGAAGGAAA

TACCAGGGCACAGGCATCATCGGCGTTGGAGGCAACGTCGAAACCTTTTCCACTCCTGTC 110

ACCATCAAAAAGAAGGGGAGACACATTAAAACCAGAATGCTGGTCGCCGACATCCCCGTC

ACCATCCTTGGCAGAGACATTCTCCAGGACCTGGGCGCTAAACTCGTGCTGGCACAACTG

TCTAAGGAAATCAAGTTCCGCAAGATCGAGCTGAAAGAGGGCACAATGGGTCCAAAAATC

CCCCAGTGGCCCCTGACCAAAGAGAAGCTTGAGGGCGCTAAGGAAATCGTGCAGCGCCTG

CTTTCTGAGGGCAAGATTAGCGAGGCCAGCGAGAATAACCCTTACAACAGCCCCATCTTT

GTGATTAAGAAAAGGAGCGGCAAATGGAGACTCCTGCAGGACCTGAGGGAACTCAACAAG

ACCGTCCAGGTCGGAACTGAGATCTCTCGCGGACTGCCTCACCCCGGCGGCCTGATTAAA

TGCAAGCACATGACAGTCCTTGACATTGGAGACGCTTATTTTACCATCCCCCTCGATCCT

GAATTTCGCCCCTATACTGCTTTTACCATCCCCAGCATCAATCACCAGGAGCCCGATAAA

CGCTATGTGTGGAAGTGCCTCCCCCAGGGATTTGTGCTTAGCCCCTACATTTACCAGAAG

ACACTTCAAGAGATCCTCCAACCTTTCCGCGAAAGATACCCAGAGGTTCAACTCTACCAA

TATATGGACGACCTGTTCATGGGGTCCAACGGGTCTAAGAAGCAGCACAAGGAACTCATC

ATCGAACTGAGGGCAATCCTCCTGGAGAAAGGCTTCGAGACACCCGACGACAAGCTGCAA

GAAGTTCCTCCATATAGCTGGCTGGGCTACCAGCTTTGCCCTGAAAACTGGAAAGTCCAG

AAGATGCAGTTGGATATGGTCAAGAACCCAACACTGAACGACGTCCAGAAGCTCATGGGC

AATATTACCTGGATGAGCTCCGGAATCCCTGGGCTTACCGTTAAGCACATTGCCGCAACT

ACAAAAGGATGCCTGGAGTTGAACCAGAAGGTCATTTGGACAGAGGAAGCTCAGAAGGAA

CTGGAGGAGAATAATGAAAAGATTAAGAATGCTCAAGGGCTCCAATACTACAATCCCGAA

GAAGAAATGTTGTGCGAGGTCGAAATCACTAAGAACTACGAAGCCACCTATGTCATCAAA

CAGTCCCAAGGCATCTTGTGGGCCGGAAAGAAAATCATGAAGGCCAACAAAGGCTGGTCC

ACCGTTAAAAATCTGATGCTCCTGCTCCAGCACGTCGCCACCGAGTCTATCACCCGCGTC

GGCAAGTGCCCCACCTTCAAAGTTCCCTTCACTAAGGAGCAGGTGATGTGGGAGATGCAA

AAAGGCTGGTACTACTCTTGGCTTCCCGAGATCGTCTACACCCACCAAGTGGTGCACGAC

GACTGGAGAATGAAGCTTGTCGAGGAGCCCACTAGCGGAATTACAATCTATACCGACGGC

GGAAAGCAAAACGGAGAGGGAATCGCTGCATACGTCACATCTAACGGCCGCACCAAGCAA aagaggctcggccctgtcactcaccaggtggctgagaggatggctatccagatggccctt

GAGGACACTAGAGACAAGCAGGTGAACATTGTGACTGACAGCTACTACTGCTGGAAAAAC

ATCACAGAGGGCCTTGGCCTGGAGGGACCCCAGTCTCCCTGGTGGCCTATCATCCAGAAT

ATCCGCGAAAAGGAAATTGTCTATTTCGCCTGGGTGCCTGGACACAAAGGAATTTACGGC

AACCAACTCGCCGATGAAGCCGCCAAAATTAAAGAGGAAATCATGCTTGCCTACCAGGGC

ACACAGATTAAGGAGAAGAGAGACGAGGACGCTGGCTTTGACCTGTGTGTGCCATACGAC

ATCATGATTCCCGTTAGCGACACAAAGATCATTCCAACCGATGTCAAGATCCAGGTGCCA cccaattcatttggttgggtgaccggaaagtccagcatggctaagcagggtcttctgatt

AACGGGGGAATCATTGATGAAGGATACACCGGCGAAATCCAGGTGATCTGCACAAATATC

GGCAAAAGCAATATTAAGCTTATCGAAGGGCAGAAGTTCGCTCAACTCATCATCCTCCAG caccacagcaattcaagacaaccttgggacgaaaacaagattagccagagaggtgacaag

GGCTTCGGCAGCACAGGTGTGTTCTGGGTGGAGAACATCCAGGAAGCACAGGACGAGCAC gagaattggcacacctcccctaagattttggcccgcaattacaagatcccactgactgtg gctaagcagatcacacaggaatgcccccactgcaccaaacaaggttctggccccgccggc tgcgtgatgaggtcccccaatcactggcaggcagattgcacccacctcgacaacaaaatt atcctgaccttcgtggagagcaattccggctacatccacgcaacactcctctccaaggaa aatgcattgtgcacctccctcgcaattctggaatgggccaggctgttctctccaaaatcc

CTGCACACCGACAACGGCACCAACTTTGTGGCTGAACCTGTGGTGAATCrGCTGAAGTTC

CTGAAAATCGCCCACACCACTGGCATTCCCTATCACCCTGAAAGCCAGGGCATTGTCGAG

AGGGCCAACAGAACTCTGAAAGAAAAGATCCAATCTCACAGAGACAATACACAGACATTG

GAGGCCGCACTTCAGCTCGCCCTTATCACCTGCAACAAAGGAAGAGAAAGCATGGGCGGC

CAGACCCCCTGGGAGGTCTTCATCACTAACCAGGCCCAGGTCATCCATGAAAAGCTGCTC

TTGCAGCAGGCCCAGTCCTCCAAAAAGTTCTGCTTTTATAAGATCCCCGGTGAGCACGAC

TGGAAAGGTCCTACAAGAGTTTTGTGGAAAGGAGACGGCGCAGTTGTGGTGAACGATGAG 111 ggcaaggggatcatcgctgtgcccctgacacgcaccaagcttctcatcaagccaaactga

ACCCGGGGCGGCCGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATA

CATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGA

AATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAA

CAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAG

CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCCGATAAGGATCGATCCGGGCTGGCGTAAT

AGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGG

ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCG

CTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCA

CGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTA

GAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGC

CATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTG

GACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTAT

AAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTA

ACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTrACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTT

ACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGCGGATCTGCGCAGCACCATGGCCTGAAA

TAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGA

ATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA

GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCA

GAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGC

CCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTT

TTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAG gaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgattcttctgacacaacagtct

CGAACTTAAGGCTAGAGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGC cgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctga tgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacct gtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgac

GGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCT

ATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGT

ATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATT

CGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGT

CGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAG

GCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTT

GCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGG

TGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGG

CGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCG

CATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATG

ACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGATGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTC

ATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGCGATAAGGATCCGCGTATGGTG

CACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAAC

ACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGT

GACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAG

ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTC

TTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTT

CTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATA

ATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTT

TGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGC

TGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGAT

CCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCT

ATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACA 112

CTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGG

CATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA

CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGG

GGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGA

CGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGG

CGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGT

TGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGG

AGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTC

CCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACA

GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTC

ATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGAT

CCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTC

AGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTG

CTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCT

ACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCT

TCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCT

CGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGG

GTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTC

GTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA

GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGG

CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTA

TAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGG

GGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTG

CTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT

SEQ ID N° 6 - LpESYNGP

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTA

TTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC

AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTQACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG

GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCQCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC gcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccat

AGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC

CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGA

CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTG

GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACAC

CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT

CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTG

CGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATA

AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCAC

AGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGT

GACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAA

GGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACT

CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCAC

AGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACT

ATAGGCTAGAGAATTCGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTAGG 113

ATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAAC

ACAGGAGGACAGGTAAGATGGGCGATCCCCTCACCTGGTCCAAAGCCCTGAAGAAACTGG

AAAAAGTCACCGTTCAGGGTAGCCAAAAGCTTACCACAGGCAATTGCAACTGGGCATTGT

CCCTGGTGGATCTTTTCCACGACACTAATTTCGTTAAGGAGAAAGATTGGCAACTCAGAG

ACGTGATCCCCCTCTTGGAGGACGTGACCCAAACATTGTCTGGGCAGGAGCGCGAAGCTT

TCGAGCGCACCTGGTGGGCCATCAGCGCAGTCAAAATGGGGCTGCAAATCAACAACGTGG

TTGACGGTAAAGCTAGCTTTCAACTGCTCCGCGCTAAGTACGAGAAGAAAACCGCCAACA

AGAAACAATCCGAACCTAGCGAGGAGTACCCAATTATGATCGACGGCGCCGGCAATAGGA

ACTTCCGCCCACTGACTCCCAGGGGCTATACCACCTGGGTCAACACCATCCAGACAAACG

GACTTTTGAACGAAGCCTCCCAGAACCTGTTCGGCATCCTGTCTGTGGACTGCACCTCCG

AAGAAATGAATGCTTTTCTCGACGTGGTGCCAGGACAGGCTGGACAGAAACAGATCCTGC

TCGATGCCATTGACAAGATCGCCGACGACTGGGATAATCGCCACCCCCTGCCAAACGCCC

CTCTGGTGGCTCCCCCACAGGGGCCTATCCCTATGACCGCTAGGTTCATTAGGGGACTGG

GGGTGCCCCGCGAACGCCAGATGGAGCCAGCATTTGACCAATTTAGGCAGACCTACAGAC

AGTGGATCATCGAAGCCATGAGCGAGGGGATTAAAGTCATGATCGGAAAGCCCAAGGCAC

AGAACATCAGGCAGGGGGCCAAGGAACCATACCCTGAGTTTGTCGACAGGCTTCTGTCCC

AGATTAAATCCGAAGGCCACCCTCAGGAGATCTCCAAGTTCTTGACAGACACACTGACTA

TCCAAAATGCAAATGAAGAGTGCAGAAACGCCATGAGGCACCTCAGACCTGAAGATACCC

TGGAGGAGAAAATGTACGCATGTCGCGACATTGGCACTACCAAGCAAAAGATGATGCTGC

TCGCCAAGGCTCTGCAAACCGGCCTGGCTGGTCCATTCAAAGGAGGAGCACTGAAGGGAG

GTCCATTGAAAGCTGCACAAACATGTTATAATTGTGGGAAGCCAGGACATTTATCTAGTC aatgtagagcacctaaagtctgttttaaatgtaaacagcctggacatttctcaaagcaat gcagaagtgttccaaaaaacgggaagcaaggggctcaagggaggccccagaaacaaactt tcccgatacaacagaagagtcagcacaacaaatctgttgtacaagagactcctcagactc aaaatctgtacccagatctgagcgaaataaaaaaggaatacaatgtcaaggagaaggatc aagtagaggatctcaacctggacagtttgtgggagtaacatacaatctcgagaagaggcc cactaccatcgtcctgatcaatgacacccctcttaatgtgctgctggacaccggagccga

CACCAGCGTTCTCACTACTGCTCACTATAACAGACTGAAATACAGAGGAAGGAAATACCA

GGGCACAGGCATCATCGGCGTTGGAGGCAACGTCGAAACCTTTTCCACTCCTGTCACCAT

CAAAAAGAAGGGGAGACACATTAAAACCAGAATGCTGGTCGCCGACATCCCCGTCACCAT

CCTTGGCAGAGACATTCTCCAGGACCTGGGCGCTAAACTCGTGCTGGCACAACTGTCTAA

GGAAATCAAGTTCCGCAAGATCGAGCTGAAAGAGGGCACAATGGGTCCAAAAATCCCCCA

GTGGCCCCTGACCAAAGAGAAGCTTGAGGGCGCTAAGGAAATCGTGCAGCGCCTGCTTTC

TGAGGGCAAGATTAGCGAGGCCAGCGACAATAACCCTTACAACAGCCCCATCTTTGTGAT

TAAGAAAAGGAGCGGCAAATGGAGACTCCTGCAGGACCTGAGGGAACTCAACAAGACCGT

CCAGGTCGGAACTGAGATCTCTCGCGGACTGCCTCACCCCGGCGGCCTGATTAAATGCAA

GCACATGACAGTCCTTGACATTGGAGACGCTTATTTTACCATCCCCCTCGATCCTGAATT

TCGCCCCTATACTGCTTTTACCATCCCCAGCATCAATCACCAGGAGCCCGATAAACGCTA

TGTGTGGAAGTGCCTCCCCCAGGGATTTGTGCTTAGCCCCTACATTTACCAGAAGACACT

TCAAGAGATCCTCCAACCTTTCCGCGAAAGATACCCAGAGGTTCAACTCTACCAATATAT

GGACGACCTGTTCATGGGGTCCAACGGGTCTAAGAAGCAGCACAAGGAACTCATCATCGA actgagggcaatcctcctggagaaaggcttcgagacacccgacgacaagctgcaagaagt

TCCTCCATATAGCTGGCTGGGCTACCAGCTTTGCCCTGAAAACTGGAAAGTCCAGAAGAT

GCAGTTGGATATGGTCAAGAACCCAACACTGAACGACGTCCAGAAGCTCATGGGCAATAT

TACCTGGATGAGCTCCGGAATCCCTGGGCTTACCGTTAAGCACATTGCCGCAACTACAAA

AGGATGCCTGGAGTTGAACCAGAAGGTCATTTGGACAGAGGAAGCTCAGAAGGAACTGGA

GGAGAATAATGAAAAGATTAAGAATGCTCAAGGGCTCCAATACTACAATCCCGAAGAAGA

AATGTTGTGCGAGGTCGAAATCACTAAGAACTACGAAGCCACCTATGTCATCAAACAGTC

CCAAGGCATCTTGTGGGCCGGAAAGAAAATCATGAAGGCCAACAAAGGCTGGTCCACCGT

TAAAAATCTGATGCTCCTGCTCCAGCACGTCGCCACCGAGTCTATCACCCGCGTCGGCAA 114

GTGCCCCACCTTCAAAGTTCCCTTCACTAAGGAGCAGGTGATGTGGGAGATGCAAAAAGG CTGGTACTACTCTTGGCTTCCCGAGATCGTCTACACCCACCAAGTGGTGCACGACGACTG GAGAATGAAGCTTGTCGAGGAGCCCACTAGCGGAATTACAATCTATACCGACGGCGGAAA GCAAAACGGAGAGGGAATCGCTGCATACGTCACATCTAACGGCCGCACCAAGCAAAAGAG GCTCGGCCCTGTCACTCACCAGGTGGCTGAGAGGATGGCTATCCAGATGGCCCTTGAGGA CACTAGAGACAAGCAGGTGAACATTGTGACTGACAGCTACTACTGCTGGAAAAACATCAC AGAGGGCCTTGGCCTGGAGGGACCCCAGTCTCCCTGGTGGCCTATCATCCAGAATATCCG CGAAAAGGAAATTGTCTATTTCGCCTGGGTGCCTGGACACAAAGGAATTTACGGCAACCA ACTCGCCGATGAAGCCGCCAAAATTAAAGAGGAAATCATGCTTGCCTACCAGGGCACACA GATTAAGGAGAAGAGAGACGAGGACGCTGGCTTTGACCTGTGTGTGCCATACGACATCAT GATTCCCGTTAGCGACACAAAGATCATTCCAACCGATGTCAAGATCCAGGTGCCACCCAA TTCATTTGGTTGGGTGACCGGAAAGTCCAGCATGGCTAAGCAGGGTCTTCTGATTAACGG GGGAATCATTGATGAAGGATACACCGGCGAAATCCAGGTGATCTGCACAAATATCGGCAA AAGCAATATTAAGCTTATCGAAGGGCAGAAGTTCGCTCAACTCATCATCCTCCAGCACCA CAGCAATTCAAGACAACCTTGGGACGAAAACAAGATTAGCCAGAGAGGTGACAAGGGCTT CGGCAGCACAGGTGTGTTCTGGGTGGAGAACATCCAGGAAGCACAGGACGAGCACGAGAA TTGGCACACCTCCCCTAAGATTTTGGCCCGCAATTACAAGATCCCACTGACTGTGGCTAA GCAGATCACACAGGAATGCCCCCACTGCACCAAACAAGGTTCTGGCCCCGCCGGCTGCGT GATGAGGTCCCCCAATCACTGGCAGGCAGATTGCACCCACCTCGACAACAAAATTATCCT GACCTTCGTGGAGAGCAATTCCGGCTACATCCACGCAACACTCCTCTCCAAGGAAAATGC ATTGTGCACCTCCCTCGCAATTCTGGAATGGGCCAGGCTGTTCTCTCCAAAATCCCTGCA CACC GACAACGG CACCAACTTTGTGG CTGAACCTGTGGTGAATCTGCTGAAGTTCCTGAA AATCGCCCACACCACTGGCATTCCCTATCACCCTGAAAGCCAGGGCATTGTCGAGAGGGC CAACAGAACTCTGAAAGAAAAGATCCAATCTCACAGAGACAATACACAGACATTGGAGGC CGCACTTCAGCTCGCCCTTATCACCTGCAACAAAGGAAGAGAAAGCATGGGCGGCCAGAC CCCCTGGGAGGTCTTCATCACTAACCAGGCCCAGGTCATCCATGAAAAGCTGCTCTTGCA GCAGGCCCAGTCCTCCAAAAAGTTCTGCTTTTATAAGATCCCCGGTGAGCACGACTGGAA AGGTCCTACAAGAGTTTTGTGGAAAGGAGACGGCGCAGTTGTGGTGAACGATGAGGGCAA GGGGATCATCGCTGTGCCCCTGACACGCACCAAGCTTCTCATCAAGCCAAACTGAACCCG GGGCGGCCGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTG ATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTT GTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACA ATTGCATTCATTTTATG TTT CAGGTTCAG GGGGAG ATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGT AAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCCGATAAGGATCGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGA AGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCG CCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACA CTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTC GCCGGCTrrCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCT TTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCG CCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTC TTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGG ATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCG AATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCA tctgtgcggtatttcacaccgcatacgcggatctgcgcagcaccatggcctgaaataacc

TCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTG

TGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATG

CATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGT

ATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATC

CCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTT

ATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC

TTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACAGTCTCGAAC 115

TTAAGGCTAGAGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTT

GGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCG

CCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCG

GTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCG

TTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGG

GCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCA

TCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACC

ACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATC

AGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCA

AGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGA

ATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGG

CGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCG

AATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCG

CCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGA

CCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGATGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTAC

ATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGCGATAAGGATCCGCGTATGGTGCACTC

TCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCG

CTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCG

TCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAA

AGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGA

CGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAA

TACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATT

GAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGG

CATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAG

ATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTG

AGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTG

GCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATT

CTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGA

CAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTAC

TTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATC

ATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGC

GTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAAC

TACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAG

GACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCG

GTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTA

TCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCG

CTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATA

TACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTT

TTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACC

CCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCT

TGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAA

CTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAG

TGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTC

TGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGG

ACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCA

CACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTAT

GAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGG

TCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTC

CTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGC

GGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGC

CTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT 116

SEQ ID N 7

pESYNGPRRE

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTA

TTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC

AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG

GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC

GCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAT

AGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC

CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGA

CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCrTACGGGACTTTCCTACTTG

GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACAC

CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT

CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTG

CGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATA

AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCAC

AGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGT

GACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAA

GGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACT

CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCAC

AGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACT

ATAGGCTAGAGAATTCGCCACCATGGGCGATCCCCTCACCTGGTCCAAAGCCCTGAAGAA

ACTGGAAAAAGTCACCGTTCAGGGTAGCCAAAAGCTTACCACAGGCAATTGCAACTGGGC

ATTGTCCCTGGTGGATCTTTTCCACGACACTAATTTCGTTAAGGAGAAAGATTGGCAACT

CAGAGACGTGATCCCCCTCTTGGAGGACGTGACCCAAACATTGTCTGGGCAGGAGCGCGA

AGCTTTCGAGCGCACCTGGTGGGCCATCAGCGCAGTCAAAATGGGGCTGCAAATCAACAA

CGTGGTTGACGGTAAAGCTAGCTTTCAACTGCTCCGCGCTAAGTACGAGAAGAAAACCGC

CAACAAGAAACAATCCGAACCTAGCGAGGAGTACCCAATTATGATCGACGGCGCCGGCAA taggaacttccgcccactgactcccaggggctataccacctgggtcaacaccatccagac

AAACGGACTTTTGAACGAAGCCTCCCAGAACCTGTTCGGCATCCTGTCTGTGGACTGCAC ctccgaagaaatgaatgcttttctcgacgtggtgccaggacaggctggacagaaacagat

CCTGCTCGATGCCATTGACAAGATCGCCGACGACTGGGATAATCGCCACCCCCTGCCAAA

CGCCCCTCTGGTGGCTCCCCCACAGGGGCCTATCCCTATGACCGCTAGGTTCATTAGGGG

ACTGGGGGTGCCCCGCGAACGCCAGATGGAGCCAGCATTTGACCAATTTAGGCAGACCTA

CAGACAGTGGATCATCGAAGCCATGAGCGAGGGGATTAAAGTCATGATCGGAAAGCCCAA

GGCACAGAACATCAGGCAGGGGGCCAAGGAACCATACCCTGAGTTTGTCGACAGGCTTCT

GTCCCAGATTAAATCCGAAGGCCACCCTCAGGAGATCTCCAAGTTCTTGACAGACACACT

GACTATCCAAAATGCAAATGAAGAGTGCAGAAACGCCATGAGGCACCTCAGACCTGAAGA

TACCCTGGAGGAGAAAATGTACGCATGTCGCGACATTGGCACTACCAAGCAAAAGATGAT gctgctcgccaaggctctgcaaaccggcctggctggtccattcaaaggaggagcactgaa

GGGAGGTCCATTGAAAGCTGCACAAACATGTTATAATTGTGGGAAGOCAGGACATTTATC

TAGTCAATGTAGAGCACCTAAAGTCTGTTTTAAATGTAAACAGCCTGGACATTTCTCAAA gcaatgcagaagtgttccaaaaaacgggaagcaaggggctcaagggaggccccagaaaca

AACTTTCCCGATACAACAGAAGAGTCAGCACAACAAATCTGTTGTACAAGAGACTCCTCA

GACTCAAAATCTGTACCCAGATCTGAGCGAAATAAAAAAGGAATACAATGTCAAGGAGAA

GGATCAAGTAGAGGATCTCAACCTGGACAGTTTGTGGGAGTAACATACAATCTCGAGAAG

AGGCCCACTACCATCGTCCTGATCAATGACACCCCTCTTAATGTGCTGCTGGACACCGGA

GCCGACACCAGCGTTCTCACTACTGCTCACTATAACAGACTGAAATACAGAGGAAGGAAA

TACCAGGGCACAGGCATCATCGGCGTTGGAGGCAACGTCGAAACCTTTTCCACTCCTGTC accatcaaaaagaaggggagacacattaaaaccagaatgctggtcgccgacatccccgtc 117 accatccttggcagagacattctccaggacctgggcgctaaactcgtgctggcacaactg

TCTAAGGAAATCAAGTTCCGCAAGATCGAGCTGAAAGAGGGCACAATGGGTCCAAAAATC CCCCAGTGGCCCCTGACCAAAGAGAAGCTTGAGGGCGCTAAGGAAATCGTGCAGCGCCTG CTTTCTGAGGGCAAGATTAGCGAGGCCAGCGACAATAACCCTTACAACAGCCCCATCTTT GTGATTAAGAAAAGGAGCGGCAAATGGAGACTCCTGCAGGACCTGAGGGAACTCAACAAG ACCGTCCAGGTCGGAACTGAGATCTCTCGCGGACTGCCTCACCCCGGCGGCCTGATTAAA TGCAAGCACATGACAGTCCTTGACATTGGAGACGCTTATTTTACCATCCCCCTCGATCCT GAATTTCGCCCCTATACTGCTTTTACCATCCCCAGCATCAATCACCAGGAGCCCGATAAA CGCTATGTGTGGAAGTGCCTCCCCCAGGGATTTGTGCTTAGCCCCTACATTTACCAGAAG ACACTTCAAGAGATCCTCCAACCTTTCCGCGAAAGATACCCAGAGGTTCAACTCTACCAA TATATGGACGACCTGTTCATGGGGTCCAACGGGTCTAAGAAGCAGCACAAGGAACTCATC ATCGAACTGAGGGCAATCCTCCTGGAGAAAGGCTTCGAGACACCCGACGACAAGCTGCAA GAAGTTCCTCCATATAGCTGGCTGGGCTACCAGCTTTGCCCTGAAAACTGGAAAGTCCAG AAGATGCAGTTGGATATGGTCAAGAACCCAACACTGAACGACGTCCAGAAGCTCATGGGC AATATTACCTGGATGAGCTCCGGAATCCCTGGGCTTACCGTTAAGCACATTGCCGCAACT ACAAAAGGATGCCTGGAGTTGAACCAGAAGGTCATTTGGACAGAGGAAGCTCAGAAGGAA CTGGAGG AG AATAATGAAAAGATTAAGAATG C T CAAGGGCTC CAAT ACTACAATC C CG AA GAAGAAATGTTGTGCGAGGTCGAAATCACTAAGAACTACGAAGCCACCTATGTCATCAAA CAGTCCCAAGGCATCTTGTGGGCCGGAAAGAAAATCATGAAGGCCAACAAAGGCTGGTCC ACCGTTAAAAATCTGATGCTCCTGCTCCAGCACGTCGCCACCGAGTCTATCACCCGCGTC GGCAAGTGCCCCACCTTCAAAGTTCCCTTCACTAAGGAGCAGGTGATGTGGGAGATGCAA AAAGGCTGGTACTACTCTTGGCTTCCCGAGATCGTCTACACCCACCAAGTGGTGCACGAC GACTGGAGAATGAAGCTTGTCGAGGAGCCCACTAGCGGAATTACAATCTATACCGACGGC GGAAAGCAAAACGGAGAGGGAATCGCTGCATACGTCACATCTAACGGCCGCACCAAGCAA AAGAGGCTCGGCCCTGTCACTCACCAGGTGGCTGAGAGGATGGCTATCCAGATGGCCCTT GAGGACACTAGAGACAAGCAGGTGAACATTGTGACTGACAGCTACTACTGCTGGAAAAAC ATCACAGAGGGCCTTGGCCTGGAGGGACCCCAGTCTCCCTGGTGGCCTATCATCCAGAAT atccgcgaaaaggaaattgtctatttcgcctgggtgcctGgacacaaaggaatttacggc aaccaactcgccgatgaagccgccaaaattaaagaggaaatcatgcttgcctaccagggc acacagattaaggagaagagagacgaggacgctggctttgacctgtgtgtgccatacgac atcatgattcccgttagcgacacaaagatcattccaaccgatgtcaagatccaggtgcca cccaattcatttggttgggtgaccggaaagtccagcatggctaagcagggtcttctgatt aacgggggaatcattgatgaaggatacaccggcgaaatccaggtgatctgcacaaatatc ggcaaaagcaatattaagcttatcgaagggcagaagttcgctcaactcatcatcctccag caccacagcaattcaagacaaccttgggacgaaaacaagattagccagagaggtgacaag ggcttcggcagcacaggtgtgttctgggtggagaacatccaggaagcacaggacgagcac gagaattggcacacctcccctaagattttggcccgcaattacaagatcccactgactgtg gctaagcagatcacacaggaatgcccccactgcaccaaacaaggttctggccccgccggc tgcgtgatgaggtcccccaatcactggcaggcagattgcacccacctcgacaacaaaatt atcctgaccttcgtggagagcaattccggctacatccacgcaacactcctctccaaggaa aatgcattgtgcacctccctcgcaattctggaatgggccaggctgttctctccaaaatcc ctgcacaccgacaacggcaccaactttgtggctgaacctgtggtgaatctgctgaagttc ctgaaaatcgcccacaccactggcattccctatcaccctgaaagccagggcattgtcgag agggccaacagaactctgaaagaaaagatccaatctcacagagacaatacacagacattg gaggccgcacttcagctcgcccttatcacctgcaacaaaggaagagaaagcatgggcggc cagaccccctgggaggtcttcatcactaaccaggcccaggtcatccatgaaaagctgctc ttgcagcaggcccagtcctccaaaaagttctgcttttataagatccccggtgagcacgac tggaaaggtcctacaagagttttgtggaaaggagacggcgcagttgtggtgaacgatgag 118 GGC AAGGGG AT CAT CG CTGTGCCCCTGACACGCAC CAAGCTTCTCATCAAGC CAAAC TGA ACC CG ACGAAT CCCAGGGGGAATCTCAAC CC CTATTACCCAAC AGTC AGAAAAATC TAAG TGTGAGGAGAACACAATGTTTCAACCTTATTGTTATAATAATGACAGTAAGAACAGCATG G CAGAATCG AAGGAAG C AAGAGAC C AAGAAATG AACCTGAAAG AAG AATCTAAAGAAGAA AAAAGAAGAAATGACTGGTGGAAAATAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTC TGGAAGGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCAGTCGTTACCTGAAGAAAAAATTCCAT cacaaacatgcatcgcgagaagacacctgggaccaggcccaacacaacatacacctagca ggcgtgaccggtggatcaggggacaaatactacaagcagaagtactccaggaacgactgg aatggagaatcagaggagtacaacaggcggccaaagagctgggtgaagtcaatcgaggca tttggagagagctatatttccgagaagaccaaaggggagatttctcagcctggggcggct atcaacgagcacaagaacggctctggggggaacaatcctcaccaagggtccttagacctg gagattcgaagcgaaggaggaaacatttatgactgttgcattaaagcccaagaaggaact ctcgctatcccttgctgtggatttcccttatggctattttgggggtcggggcggccgctt

CCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGAC AAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTG CTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATT TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACA AATGTGGTAAAATCCGATAAGGATCGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCAC CGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGC GCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCC CTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCC CGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACGGCACCTC GACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACG GTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACT GGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATT TCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAATTTTAACAAA ATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTAT TTCACACCGCATACGCGGATCTGCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGA ACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGG TGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAG TCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATG CATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCGCATCCCGCCCCTAACT CCG C C CAGTTC CGCCC ATT CTCCGC C CCATGG CTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAG GCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGC CTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGGCTAGAG CCACCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGC TATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGC TGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATG AACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG CTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGG GGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATG CAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAAC ATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGG ACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGC CCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGG AAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATC AGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACC GCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCC TTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCC CAACCTGCCATCACGATGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTG 119

GTTTTTTGTGTGAATCGATAGCGATAAGGATCCGCGTATGGTGCACTCTCAGTACAATCT

GCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCT

GACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCT

GCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGA

TACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCA

CTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATA

TGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGA

GTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTC

CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG

CACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCC

CCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTAT

CCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACT

TGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAAT

TATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGA

TCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCC

TTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGA

TGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAG

CTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGC

GCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGT

CTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCT

ACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTG

CCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTG atttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctca tgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaaga tcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaa aaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccga aggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagt taggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt taccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgat agttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagct tggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgcca cgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggag agcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttc gccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatgga aaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcaca

TGGCTCGACAGATCT SEQ ID N° 8 - LpESYNGPRRE tcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggcta ttggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtcc aatatgaccgccatgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggg gtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggccc gcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccat agtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgc ccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatga cggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttg gcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacac caatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgt caatgggagtttgtxttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactg 120

CGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATA

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CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCAC

AGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACT

ATAGGCTAGAGAATTCGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTAGG

ATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAAC

ACAGGAGGACAGGTAAGATGGGCGATCCCCTCACCTGGTCCAAAGCCCTGAAGAAACTGG

AAAAAGTCACCGTTCAGGGTAGCCAAAAGCTTACCACAGGCAATTGCAACTGGGCATTGT

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ACGTGATCCCCCTCTTGGAGGACGTGACCCAAACATTGTCTGGGCAGGAGCGCGAAGCTT

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AGAAACAATCCGAACCTAGCGAGGAGTACCCAATTATGATCGACGGCGCCGGCAATAGGA

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GACTTTTGAACGAAGCCTCCCAGAACCTGTTCGGCATCCTGTCTGTGGACTGCACCTCCG

AAGAAATGAATGCTTTTCTCGACGTGGTGCCAGGACAGGCTGGACAGAAACAGATCCTGC

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CTCTGGTGGCTCCCCCACAGGGGCCTATCCCTATGACCGCTAGGTTCATTAGGGGACTGG

GGGTGCCCCGCGAACGCCAGATGGAGCCAGCATTTGACCAATTTAGGCAGACCTACAGAC

AGTGGATCATCGAAGCCATGAGCGAGGGGATTAAAGTCATGATCGGAAAGCCCAAGGCAC

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AGATTAAATCCGAAGGCCACCCTCAGGAGATCTCCAAGTTCTTGACAGACACACTGACTA

TCCAAAATGCAAATGAAGAGTGCAGAAACGCCATGAGGCACCTCAGACCTGAAGATACCC

TGGAGGAGAAAATGTACGCATGTCGCGACATTGGCACTACCAAGCAAAAGATGATGCTGC

TCGCCAAGGCTCTGCAAACCGGCCTGGCTGGTCCATTCAAAGGAGGAGCACTGAAGGGAG

GTCCATTGAAAGCTGCACAAACATGTTATAATTGTGGGAAGCCAGGACATTTATCTAGTC

AATGTAGAGCACCTAAAGTCTGTTTTAAATGTAAACAGCCTGGACATTTCTCAAAGCAAT

GCAGAAGTGTTCCAAAAAACGGGAAGCAAGGGGCTCAAGGGAGGCCCCAGAAACAAACTT

TCCCGATACAACAGAAGAGTCAGCACAACAAATCTGTTGTACAAGAGACTCCTCAGACTC

AAAATCTGTACCCAGATCTGAGCGAAATAAAAAAGGAATACAATGTCAAGGAGAAGGATC

AAGTAGAGGATCTCAACCTGGACAGTTTGTGGGAGTAACATACAATCTCGAGAAGAGGCC

CACTACCATCGTCCTGATCAATGACACCCCTCTTAATGTGCTGCTGGACACCGGAGCCGA

CACCAGCGTTCTCACTACTGCTCACTATAACAGACTGAAATACAGAGGAAGGAAATACCA

GGGCACAGGCATCATCGGCGTTGGAGGCAACGTCGAAACCTTTTCCACTCCTGTCACCAT

CAAAAAGAAGGGGAGACACATTAAAACCAGAATGCTGGTCGCCGACATCCCCGTCACCAT

CCTTGGCAGAGACATTCTCCAGGACCTGGGCGCTAAACTCGTGCTGGCACAACTGTCTAA

GGAAATCAAGTTCCGCAAGATCGAGCTGAAAGAGGGCACAATGGGTCCAAAAATCCCCCA

GTGGCCCCTGACCAAAGAGAAGCTTGAGGGCGCTAAGGAAATCGTGCAGCGCCTGCTTTC

TGAGGGCAAGATTAGCGAGGCCAGCGACAATAACCCTTACAACAGCCCCATCTTTGTGAT

TAAGAAAAGGAGCGGCAAATGGAGACTCCTGCAGGACCTGAGGGAACTCAACAAGACCGT

CCAGGTCGGAACTGAGATCTCTCGCGGACTGCCTCACCCCGGCGGCCTGATTAAATGCAA

GCACATGACAGTCCTTGACATTGGAGACGCTTATTTTACCATCCCCCTCGATCCTGAATT

TCGCCCCTATACTGCTTTTACCATCCCCAGCATCAATCACCAGGAGCCCGATAAACGCTA

TGTGTGGAAGTGCCTCCCCCAGGGATTTGTGCTTAGCCCCTACATTTACCAGAAGACACT

TCAAGAGATCCTCCAACCTTTCCGCGAAAGATACCCAGAGGTTCAACTCTACCAATATAT

GGACGACCTGTTCATGGGGTCCAACGGGTCTAAGAAGCAGCACAAGGAACTCATCATCGA

ACTGAGGGCAATCCTCCTGGAGAAAGGCTTCGAGACACCCGACGACAAGCTGCAAGAAGT 121

TCCTCCATATAGCTGGCTGGGCTACCAGCTTTGCCCTGAAAACTGGAAAGTCCAGAAGAT

GCAGTTGGATATGGTCAAGAACCCAACACTGAACGACGTCCAGAAGCTCATGGGCAATAT

TACCTGGATGAGCTCCGGAATCCCTGGGCTTACCGTTAAGCACATTGCCGCAACTACAAA

AGGATGCCTGGAGTTGAACCAGAAGGTCATTTGGACAGAGGAAGCTCAGAAGGAACTGGA

GGAGAATAATGAAAAGATTAAGAATGCTCAAGGGCTCCAATACTACAATCCCGAAGAAGA

AATGTTGTGCGAGGTCGAAATCACTAAGAACTACGAAGCCACCTATGTCATCAAACAGTC

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TAAAAATCTGATGCTCCTGCTCCAGCACGTCGCCACCGAGTCTATCACCCGCGTCGGCAA

GTGCCCCACCTTCAAAGTTCCCTTCACTAAGGAGCAGGTGATGTGGGAGATGCAAAAAGG ctggtactactcttggcttcccgagatcgtctacacccaccaagtggtgcacgacgactg

GAGAATGAAGCTTGTCGAGGAGCCCACTAGCGGAATTACAATCTATACCGACGGCGGAAA GCAAAACGGAGAGGGAATCGCTGCATACGTCACATCTAACGGCCGCACCAAGCAAAAGAG GCTCGGCCCTGTCACTCACCAGGTGGCTGAGAGGATGGCTATCCAGATGGCCCTTGAGGA CAC TAGAGACAAGCAGGTG AACATTGTGACTG ACAG CTAC TACTGCTGGAAAAACAT CAC AGAGGGCCTTGGCCTGGAGGGACCCCAGTCTCCCTGGTGGCCTATCATCCAGAATATCCG CGAAAAGGAAATTGTCTATTTCGCCTGGGTGCCTGGACACAAAGGAATTTACGGCAACCA ACTCGCCGATGAAGCCGCCAAAATTAAAGAGGAAATCATGCTTGCCTACCAGGGCACACA GATTAAGGAGAAGAGAGACGAGGACGCTGGCTTTGACCTGTGTGTGCCATACGACATCAT GATTCCCGTTAGCGACACAAAGATCATTCCAACCGATGTCAAGATCCAGGTGCCACCCAA TTCATTTGGTTGGGTGACCGGAAAGTCCAGCATGGCTAAGCAGGGTCTTCTGATTAACGG GGGAATCATTGATGAAGGATACACCGGCGAAATCCAGGTGATCTGCACAAATATCGGCAA AAGCAATATTAAGCTTATCGAAGGGCAGAAGTTCGCTCAACTCATCATCCTCCAGCACCA CAG CAAT T CAAGACAAC CTTGGGAC GAAAACAAGATTAGC CAGAGAGGTGACAAGGGCTT CGGCAGCACAGGTGTGTTCTGGGTGGAGAACATCCAGGAAGCACAGGACGAGCACGAGAA TTGGCACACCTCCCCTAAGATTTTGGCCCGCAATTACAAGATCCCACTGACTGTGGCTAA GCAGATCACACAGGAATGCCCCCACTGCACCAAACAAGGTTCTGGCCCCGCCGGCTGCGT GATGAGGTCCCCCAATCACTGGCAGGCAGATTGCACCCACCTCGACAACAAAATTATCCT GACCTTCGTGGAGAGCAATTCCGGCTACATCCACGCAACACTCCTCTCCAAGGAAAATGC ATTGTGCACCTCCCTCGCAATTCTGGAATGGGCCAGGCTGTTCTCTCCAAAATCCCTGCA CACCGACAACGGCACCAACTTTGTGGCTGAACCTGTGGTGAATCTGCTGAAGTTCCTGAA AATCGCCCACACCACTGGCATTCCCTATCACCCTGAAAGCCAGGGCATTGTCGAGAGGGC CAACAGAACT CTGAAAGAAAAGAT C CAAT C TGACAGAGACAATACACAGACATTGGAG G C CGCACTTCAGCTCGCCCTTATCACCTGCAACAAAGGAAGAGAAAGCATGGGCGGCCAGAC CCCCTGGGAGGTCTTCATCACTAACCAGGCCCAGGTCATCCATGAAAAGCTGCTCTTGCA GCAGGCCCAGTCCTCCAAAAAGTTCTGCTTTTATAAGATCCCCGGTGAGCACGACTGGAA AGGTCCTACAAGAGTTTTGTGGAAAGGAGACGGCGCAGTTGTGGTGAACGATGAGGGCAA GGGGATCATCGCTGTGCCCCTGACACGCACCAAGCTTCTCATCAAGCCAAACTGAACCCG ACGAATCCCAGGGGGAATCTCAACCCCTATTACCCAACAGTCAGAAAAATCTAAGTGTGA ggagaacacaatgtttcaaccttattgttataataatgacagtaagaacagcatggcaga atcgaaggaagcaagagaccaagaaatgaacctgaaagaagaatctaaagaagaaaaaag

AAGAAATGACTGGTGGAAAATAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTCTGGAA

GGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCAGTCGTTACCTGAAGAAAAAATTCCATCACAA

ACATGCATCGCGAGAAGACACCTGGGACCAGGCCCAACACAACATACACCTAGCAGGCGT

GACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACAAGCAGAAGTACTCCAGGAACGACTGGAATGG agaatcagaggagtacaacaggcggccaaagagctgggtgaagtcaatcgaggcatttgg agagagctatatttccgagaagaccaaaggggagatttctcagcctggggcggctatcaa cgagcacaagaacggctctggggggaacaatcctcaccaagggtccttagacctggagat tcgaagcgaaggaggaaacatttatgactgttgcattaaagcccaagaaggaactctcgc tatcccttgctgtggatttcccttatggctattttgggggtcggggcggccgcttccctt tagtgagggttaatgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaacc acaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgcttta 122

TTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATG

TTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGT

GGTAAAATCCGATAAGGATCGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATC

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AAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGC

GCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCA

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CAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTT

TCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAAC

AACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGC

CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATT

AACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCAC

ACCGCATACGCGGATCTGCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTG

GTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGG

AAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGC

AACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCT

CAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCC

CAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGA

GGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGG

CTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGGCTAGAGCCACC

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GGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCA

GCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTG

CAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTG

CTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAG

GATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATG

CGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGC

ATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAA

GAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGAC

GGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT

GGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGAC

ATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTC

CTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTT

GACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACC

TGCCATCACGATGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTT

TTGTGTGAATCGATAGCGATAAGGATCCGCGTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCT

GATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGG

GCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGAGAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATG

TGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGC

CTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTT

CGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTAT

CCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATG

TTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGA

GTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAA

GAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGT

ATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTT

GAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC

AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGA

GGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGAT

CGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCT 123

GTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCC

CGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCG

GCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGC

GGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACG

ACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCA

CTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTA

AAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACC

AAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAA

GGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCA

CCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTA

ACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGC

CACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCA

GTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTA

CCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAG

CGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTT

CCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGC

ACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCAC

CTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAAC

GCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCT

CGACAGATCT

SEQ ID N° 9 - pONY4.0Z

CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTC

ATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGA

GATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTC

CAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACC

CTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAG

CCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCAACCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCA

CTATAGGGAGACCGGCAGATCTTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTT

TGAGATTTCTGTCGCCGACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGA

GATGGCGATATTGGAAAAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATG

TGAGTTTCTGTGTAACTGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGAT

ATCTGGCGATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTG

GGCGATTCTGTGTGTCGCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCT

ATATCGCCGATAGAGGCGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACAT

TGAATCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTG gctattggccattgcatacgttgtatccatatcgtaatatgtacatttatattggctcat gtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaatta cggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatg gcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttc ccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaa ctgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtca atgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttccta cttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagt acaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattg 124

ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACA ACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTA TATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTC TGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGT TTGTCTGTTCGAGATCCTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCC TACCTGTTGAACCTGGCTGATCGrAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAG TCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATGGGAGACCCTTTGA CATGGAGCAAGGCGCTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAGAAATTAA CTACTGGTAACTGTAATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGATACCAACTTTG TAAAAGAAAAGGACTGGCAGCTGAGGGATGTCATTCCATTGCTGGAAGATGTAACTCAGA CGCTGTCAGGACAAGAAAGAGAGGCCTTTGAAAGAACATGGTGGGCAATTTCTGCTGTAA AGATGGGCCTCCAGATTAATAATGTAGTAGATGGAAAGGCATCATTCCAGCTCCTAAGAG CGAAATATGAAAAGAAGACTGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCCTCTGAAGAATATCTCT AGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAGTGGGGAGGCACGATGGCCGCTTTGGTCGAG GCGGATCCGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTA TTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC AACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC GCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAT AGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGA CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACAT CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTC CGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCATGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGC TCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCGATAG AAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCAAGCTTCAGCTGCTCGAGGATCTGCG GATCCGGGGAATTCCCCAGTCTCAGGATCCACCATGGGGGATCCCGTCGTTTTACAACGT CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTC GCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGC CTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGG CTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCAC GGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTT GTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGG CTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGG TG CAACGGG CGCTGGGTCGGTTACGG C CAGGACAGTCGTTTG C CGTCTGAATTTGACCTG AGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGGAGTGAC ggcagttatctggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcg

TTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGAT gatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactac ctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcct ttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctg aacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggtt

GAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGC

GAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGC

GTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTG

CAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCG

AACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCC

AATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTA 125

CCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTG

ATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGC

TGG AT C AAATCTGTCGATCC TTCCCGCCCGGTG CAGTATGAAGG CGGCGGAGC CGACACC

ACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCG

GCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTG

ATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGG

CAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAG

TCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGC

GATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCG

CATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGG

CAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCAC

TGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCT

CCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAA

CTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCAC

ATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCG

TCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAAT

AAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAA AAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATr

GGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCG

GGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCG

GTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGG

AAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCG

AGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAG

CGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCC

TGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGC

GAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGC

GACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGC

CATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATT

GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGC

TACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAATAATAACCGGGCAGGGGGGATCCGCAG

ATCCGGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGC

AGAAGTATGCAAAGCATGCCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCT

CGAGGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGGGAAG

TATTTATCACTAATCAAGCACAAGTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAAT

CCTCCAAAAAATTTTGTTTTTACAAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTA

GGGTGCTGTGGAAGGGTGATGGTGCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTG

CTGTACCATTAACCAGGACTAAGTTACTAATAAAACCAAATTGAGTATTGTTGCAGGAAG

CAAGACCCAACTAC CATTGTC AGCTGTGTTTC CTGAGGTCTC TAGGAATTGATTACCTCG

ATGCTTCATTAAGGAAGAAGAATAAACAAAGACTGAAGGCAATCCAACAAGGAAGACAAC

CTCAATATTTGTTATAAGGTTTGATATATGGGAGTATTTGGTAAAGGGGTAACATGGTCA

GCATCGCATTCTATGGGGGAATCCCAGGGGGAATCTCAACCCCTATTACCCAACAGTCAG

AAAAATCTAAGTGTGAGGAGAACACAATGTTTCAACCTTATTGTTATAATAATGACAGTA

AGAACAGCATGGCAGAATCGAAGGAAGCAAGAGACCAAGAAATGAACCTGAAAGAAGAAT

CTAAAGAAGAAAAAAGAAGAAATGACTGGTGGAAAATAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAG

CAGGAACTACTGGAGGAATACTTTGGTGGTATGAAGGACTCCCACAGCAACATTATATAG

GGTTGGTGGCGATAGGGGGAAGATTAAACGGATCTGGCCAATCAAATGCTATAGAATGCT

GGGGTTCCTTCCCGGGGTGTAGACCATTTCAAAATTACTTCAGTTATGAGACCAATAGAA

GCATGCATATGGATAATAATACTGCTACATTATTAGAAGCTTTAACCAATATAACTGCTC

TATAAATAACAAAACAGAATTAGAAACATGGAAGTTAGTAAAGACTTCTGGCATAACTCC

TTTACCTATTTCTTCTGAAGCTAACACTGGACTAATTAGACATAAGAGAGATTTTGGTAT

AAGTGCAATAGTGGCAGCTATTGTAGCCGCTACTGCTATTGCTGCTAGCGCTACTATGTC 126

TTATGTTGCTCTAACTGAGGTTAACAAAATAATGGAAGTACAAAATCATACTTTTGAGGT

AGAAAATAGTACTCTAAATGGTATGGATTTAATAGAACGACAAATAAAGATATTATATGC

TATGATTCTTCAAACACATGCAGATGTTCAACTGTTAAAGGAAAGACAACAGGTAGAGGA

GACATTTAATTTAATTGGATGTATAGAAAGAACACATGTATTTTGTCATACTGGTCATCC

CTGGAATATGTCATGGGGACATTTAAATGAGTCAACACAATGGGATGACTGGGTAAGCAA

AATGGAAGATTTAAATCAAGAGATACTAACTACACTTCATGGAGCCAGGAACAATTTGGC

ACAATCCATGATAACATTCAATACACCAGATAGTATAGCTCAATTTGGAAAAGACCTTTG

GAGTCATATTGGAAATTGGATTCCTGGATTGGGAGCTTCCATTATAAAATATATAGTGAT

GTTTTTGCTTATTTATTTGTTACTAACCTCTTCGCCTAAGATCCTCAGGGCCCTCTGGAA

GGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCAGTCGTTACCTGAAGAAAAAATTCCATCACAA

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GACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACAAGCAGAAGTACTCCAGGAACGACTGGAATGG

AGAATCAGAGGAGTACAACAGGCGGCCAAAGAGCTGGGTGAAGTCAATCGAGGCATTTGG

AGAGAGCTATATTTCCGAGAAGACCAAAGGGGAGATTTCTCAGCCTGGGGCGGCTATCAA

CGAGCACAAGAACGGCTCTGGGGGGAACAATCCTCACCAAGGGTCCTTAGACCTGGAGAT

TCGAAGCGAAGGAGGAAACATTTATGACTGTTGCATTAAAGCCCAAGAAGGAACTCTCGC

TATCCCTTGCTGTGGATTTCCCTTATGGCTATTTTGGGGACTAGTAATTATAGTAGGACG

CATAGCAGGCTATGGATTACGTGGACTCGCTGTTATAATAAGGATTTGTATTAGAGGCTT

AAATTTGATATTTGAAATAATCAGAAAAATGCTTGATTATATTGGAAGAGCTTTAAATCC

TGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGG

GTTTTTATGAGGGGTTTTATAAATGATTATAAGAGTAAAAAGAAAGTTGCTGATGCTCTC

ATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCTCATGTTGCTAGGCAACTAAACCGCAATAACC

GCATTTGTGACGCGAGTTCCCCATTGGTGACGCGTTAACTTCCTGTTTTTACAGTATATA

AGTGCTTGTATTCTGACAATTGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTG

GGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTC

TGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTG

TGAAATTGXTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAA

GCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCT

TTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGA

GGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTC

GTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAA

TCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGT

AAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAA

AATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTT

CCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTG

TCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTC

AGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCC

GACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTA

TCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCT

ACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATC

TGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAA

CAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAA

AAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAA

AACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTT

TTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGAC

AGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCC atagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggc

CCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATA

AACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATC

CAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGC 127

AACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACQCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCA

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GCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCA

CTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT

TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGT

TGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTG

CTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGA

TCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACC

AGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCG

ACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAG

GGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGG

GTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC SEQ ID N° 10 - ρΟΝΥδ.ΟΖ

AGATCTTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCC GACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAA AAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAAC TGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCT TATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTC GCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGG CGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCC ATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCA TACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCC ATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCA TAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAAT AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGrATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCC CGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGG ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT GTTTTGGC AC CAAAAT CAACGGGACTTTC CAAAATGT CGTAACAACTGCGATCGCCCGCC CCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGT TTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGG CCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATC CTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGG CTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGeAGGTGTTC CTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCG ctcaagaagttagagaaggtgacggtacaagggtctcagaaattaactactggtaactgt aattgggcgctaagtctagtagacttatttcatgataccaactttgtaaaagaaaaggac tggcagctgagggatgtcattccattgctggaagatgtaactcagacgctgtcaggacaa gaaagagaggcctttgaaagaacatggtgggcaatttctgctgtaaagatgggcctccag attaataatgtagtagatggaaaggcatcattccagctcctaagagcgaaatatgaaaag aagactgctaataaaaagcagtctgagccctctgaagaatatctctagaactagtggatc ccccgggctgcaggagtggggaggcacgatggccgctttggtcgaggcggatccggccat 128

TAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATA

CGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCAT

GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATA

GCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGC

CCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG

GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTAC

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TATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGAT

AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGT

TTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGC

AAATGGGCGGTAGGCATGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACC

GTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACC

GATCCAGCCTCCGCGGCCCCAAGCTTCAGCTGCTCGAGGATCTGCGGATCCGGGGAATTC

CCCAGTCTCAGGATCCACCATGGGGGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAA

CCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAA

TAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATG

GCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCT

TCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCC

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TCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCA gacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctg

GGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACG

CGCCGGAGAAAACOGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGA

AGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACC

GACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGC

TGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGT

TTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAAT

TATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCC

GAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGC

CGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGA

AAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGA

GCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCT

GATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTG

GTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCA

CGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGA

ACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCT

GGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGT

CGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATAT

TATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATG

GTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATA

CGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCA gtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactgggtggatcagtcgctgattaaata

TGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGA TCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGAC GGAAG CAAAACACCAGC AGCAGTTTTT CC AG TTCCGTTTATCCGGG CAAAC CATC GAAGT GAC CAG CGAATACCTGTTC CGTCATAG CGATAACGAGCTCCTGCAC TGGATG GTG GCGCT GGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACA GTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGT ACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCA GCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCC 129

G CATCTGAC CACCAG CGAAATGGATTTTTGCAT CGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATT TAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGAC GCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGC GACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGC CGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGAC CGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGAT TGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCA TCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCT CGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTG GGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCG CTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAA CATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGC GGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTC CTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTT GGTCTGGTGTCAAAAATAATAATAACCGGGCAGGGGGGATCCGCAGATCCGGCTGTGGAA TGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAG CATGCCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCG GTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGGGAAGTATTTATCACTAAT CAAG CACAAGTAATACATGAGAAACTTTTACTAC AGCAAGCACAATC CTC CAAAAAATTT TGTTTTTACAAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTAGGGTGCTGTGGAAG GGTGATGGTGCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTGCTGTACCATTAACC AGGACTAAGTTACTAATAAAACCAAATTGAGTATTGTTGCAGGAAGCAAGACCCAACTAC CATTGTCAGCTGTGTTTCCTGACCTCAATATTTGTTATAAGGTTTGATATGAATCCCAGG GGGAATCTCAACCCCTATTACCCAACAGTCAGAAAAATCTAAGTGTGAGGAGAACACAAT GTTTCAACCTTATTGTTATAATAATGACAGTAAGAACAGCATGGCAGAATCGAAGGAAGC AAGAGACCAAGAATGAACCTGAAAGAAGAATCTAAAGAAGAAAAAAGAAGAAATGACTGG TGGAAAATAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCAGGAACTACTGGAGGAATACTTTGGTGG TATGAAGGACTCCCACAGCAACATTATATAGGGTTGGTGGCGATAGGGGGAAGATTAAAC GGATCTGGCCAATCAAATGCTATAGAATGCTGGGGTTCCTTCCCGGGGTGTAGACCATTT CAAAATTACTTCAGTTATGAGACCAATAGAAGCATGCATATGGATAATAATACTGCTACA TTATTAGAAGCTTTAACCAATATAACTGCTCTATAAATAACAAAACAGAATTAGAAACAT GGAAGTTAGTAAAGACTTCTGGCATAACTCCTTTACCTATTTCTTCTGAAGCTAACACTG GACTAATTAGACATAAGAGAGATTTTGGTATAAGTGCAATAGTGGCAGCTATTGTAGCCG CTACTGCTATTGCTGCTAGCGCTACTATGTCTTATGTTGCTCTAACTGAGGTTAACAAAA TAATGGAAGTACAAAATCATACTTTTGAGGTAGAAAATAGTACTCTAAATGGTATGGATT taatagaacgacaaataaagatattatatgctatgattcttcaaacacatgcagatgttc

AACTGTTAAAGGAAAGACAACAGGTAGAGGAGACATTTAATTTAATTGGATGTATAGAAA gaacacatgtattttgtcatactggtcatccctggaatatgtí-atggggacatttaaatg agtcaacacaatgggatgactgggtaagcaaaatggaagatttaaatcaagagatactaa ctacacttcatggagccaggaacaatttggcacaatccatgataacattcaatacaccag atagtatagctcaatttggaaaagacctttggagtcatattggaaattggattcctggat tgggagcttccattataaaatatatagtgatgtttttgcttatttatttgttactaacct cttcgcctaagatcctcagggccctctggaaggtgaccagtggtgcagggtcctccggca gtcgttacctgaagaaaaaattccatcacaaacatgcatcgcgagaagacacctgggacc aggcccaacacaacatacacctagcaggcgtgaccggtggatcaggggacaaatactaca agcagaagtactccaggaacgactggaatggagaatcagaggagtacaacaggcggccaa agagctgggtgaagtcaatcgaggcatttggagagagctatatttccgagaagaccaaag gggagatttctcagcctggggcggctatcaacgagcacaagaacggctctggggggaaca atcctcaccaagggtccttagacctggagattcgaagcgaaggaggaaacatttatgact

GTTGCATTAAAGCCCAAGAAGGAACTCTCGCTATCCCTTGCTGTGGATTTCCCTTATGGC

TATTTTGGGGACTAGTAATTATAGTAGGACGCATAGCAGGCTATGGATTACGTGGACTCG

C TGTTATAATAAG GAT TTGTATTAGAGGC TTAAATT TGATATTTGAAATAATCAGAAAAA 130 tgcttgattatattggaagagctttaaatcctggcacatctcatgtatcaatgcctcagt atgtttagaaaaacaaggggggaactgtggggtttttatgaggggttttataaatgatta

TAAGAGTAAAAAGAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCT

CATGTTGCTAGGCAACTAAACCGCAATAACCGCATTTGTGACGCGAGTTCCCCATTGGTG acgcgttaacttcctgtttttacagtatataagtgcttgtattctgacaattgggcactc

AGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAA

TTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTT ggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccaca caacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaact cacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagct gcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgc ttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctca

CTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTG agcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttcca taggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaa cccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcc tgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggc gctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagct gggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcg tcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacag gattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaacta cggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcgg aaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttt tgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatctt ttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgag attatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaat ctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacc tatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagat aactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagaccc acgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcag aagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctag agtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgt ggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcg agttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgt tgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattc

TCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTC

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TACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCG

AAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACC

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GCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTT

CCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATT

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CACTATAGGGAGACCGGC 131

SEQ ID N° 11 - pONY8.1Z

AGATCTTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCC

GACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAA

AAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAAC

TGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCT

TATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTC

GCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGG

CGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCC

ATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCA

TACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCC atgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttca tagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc gcccaaogacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagt

ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCX3CCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCC

CGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA cgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtgg

ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT

GTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCC ccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtaoggtgggaggtctatataagcagagctcgt

TTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGG

CCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATC

CTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGG

CTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTC

CTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCG

CTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAGAAATTAACTACTGGTAACTGT

AATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGATACCAACTTTGTAAAAGAAAAGGAC

TGGCAGCTGAGGGATGTCATTCCATTGCTGGAAGATGTAACTCAGACGCTGTCAGGACAA

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ATTAATAATGTAGTAGATGGAAAGGCATCATTCCAGCTCCTAAGAGCGAAATATGAAAAG

AAGACTGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCCTCTGAAGAATATCTCTAGAACTAGTGGATC

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TAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATA

CGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCAT

GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATA

GCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGC

CCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG

GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTAC

ATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG

CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACG

TATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGAT

AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGT

TTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGC

AAATGGGCGGTAGGCATGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACC

GTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACC

GATCCAGCCTCCGCGGCCCCAAGCTTCAGCTGCTCGAGGATCTGCGGATCCGGGGAATTC

CCCAGTCTCAGGATCCACCATGGGGGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAA

CCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAA

TAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATG 132

GCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCT

TCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCC

CATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAA

TCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCA

GACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTG

GGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACG

CGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGA

AGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACC

GACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGC

TGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGT

TTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAAT

TATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCC

GAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGC

CGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGA

AAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGA

GCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCT

GATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTG

GTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCA

CGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGA

ACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCT

GGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGT

CGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATAT

TATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATG

GTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATA

CGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCA

GTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATA

TGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGA

TCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGAC

GGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGT

GACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCT

GGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACA

GTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGT

ACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCA

GCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCC

GCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATT

TAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGAC

GCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGC

GACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGC

CGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGAC

CGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGAT

TGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCA

TCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCT

CGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTG

GGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCG

CTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAA

CATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGC

GGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTC

CTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTT

GGTCTGGTGTCAAAAATAATAATAACCGGGCAGGGGGGATCCGCAGATCCGGCTGTGGAA

TGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAG

CATGCCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGAATTGGAAGAGCTTTAAA 133

TCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGT

GGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAAATGATTATAAGAGTAAAAAGAAAGTTGCTGATGCT

CTCATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCTCATGTTGCTAGGCAACTAAACCGCAATA

ACCGCATTTGTGACGCGAGTTCCCCATTGGTGACGCGTTAACTTCCTGTTTTTACAGTAT

ATAAGTGCTTGTATTCTGACAATTGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTG

CTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTT

GTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCT

GTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGT

AAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCC

GCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGG

AGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCG

GTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACA

GAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAAC

CGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCAC

AAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCG

TTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATAC

CTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTAT

CTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAG

CCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGAC

TTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGT

GCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGT

ATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGC

AAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGA

AAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAAC

GAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATC

CTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCT

GACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCA

TCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCT

GGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCA

ATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC

ATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTG

CGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCT

TCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAA aaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgtta

TCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGC

TTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCG agttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaa

GTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTG

AGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTC

ACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGG gcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttat

CAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATA

GGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGT

TAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCG

GCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTT

GGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCT

ATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGT

GCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAA

AGCCAACCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGC 134 12

SEQ ID N pONY3.1

AGATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATAT

TGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTC

ATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAAT

TACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAA

TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGT

TCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTA

AACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGT

CAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCC

TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCA

GTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCAT

TGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAA

CAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTC

TATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTT

TATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGC

TGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAG

TATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAG

AAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCT

CTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGA

CTCACTATAGGCTAGCCTCGAGGTCGACGGTATCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCG

CAGACCCTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTT

ACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATGGGAGAC

CCTTTGACATGGAGCAAGGCGCTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAG aaattaactactggtaactgtaattgggcgctaagtctagtagacttatttcatgatacc aactttgtaaaagaaaaggactggcagctgagggatgtcattccattgctggaagatgta actcagacgctgtcaggacaagaaagagaggcctttgaaagaacatggtgggcaatttct gctgtaaagatgggcctccagattaataatgtagtagatggaaaggcatcattccagctc

CTAAGAGCGAAATATGAAAAGAAGACTGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCCTCTGAAGAA tatccaatcatgatagatggggctggaaacagaaattttagacctctaacacctagagga

TATACTACTTGGGTGAATACCATACAGACAAATGGTCTATTAAATGAAGCTAGTCAAAAC

TTATTTGGGATATTATCAGTAGACTGTACTTCTGAAGAAATGAATGCATTTTTGGATGTG

GTACCTGGCCAGGCAGGACAAAAGCAGATATTACTTGATGCAATTGATAAGATAGCAGAT

GATTGGGATAATAGACATCCATTACCGAATGCTCCACTGGTGGCACCACCACAAGGGCCT

ATTCCCATGACAGCAAGGTTTATTAGAGGTTTAGGAGTACCTAGAGAAAGACAGATGGAG

CCTGCTTTTGATCAGTTTAGGCAGACATATAGACAATGGATAATAGAAGCCATGTCAGAA

GGCATCAAAGTGATGATTGGAAAACCTAAAGCTCAAAATATTAGGCAAGGAGCTAAGGAA

CCTTACCCAGAATTTGTAGACAGACTATTATCCCAAATAAAAAGTGAGGGACATCCACAA

GAGATTTCAAAATTCTTGACTGATACACTGACTATTCAGAACGCAAATGAGGAATGTAGA

AATGCTATGAGACATTTAAGACCAGAGGATACATTAGAAGAGAAAATGTATGCTTGCAGA

GACATTGGAACTACAAAACAAAAGATGATGTTATTGGCAAAAGCACTTCAGACTGGTCTT

GCGGGCCCATTTAAAGGTGGAGCCTTGAAAGGAGGGCCACTAAAGGCAGCACAAACATGT

TATAACTGTGGGAAGCCAGGACATTTATCTAGTCAATGTAGAGCACCTAAAQTCTGTTTT

AAATGTAAACAGCCTGGACATTTCTCAAAGCAATGCAGAAGTGTTCCAAAAAACGGGAAG

CAAGGGGCTCAAGGGAGGCCCCAGAAACAAACTTTCCCGATACAACAGAAGAGTCAGCAC

AACAAATCTGTTGTACAAGAGACTCCTCAGACTCAAAATCTGTACCCAGATCTGAGCGAA

ATAAAAAAGGAATACAATGTCAAGGAGAAGGATCAAGTAGAGGATCTCAACCTGGACAGT

TTGTGGGAGTAACATATAATCTAGAGAAAAGGCCTACTACAATAGTATTAATTAATGATA 135

CTCCCTTAAATGTACTGTTAGACACAGGAGCAGATACTTCAGTGTTGACTACTGCACATT ATAATAGGTTAAAATATAGAGGGAGAAAATATCAAGGGACGGGAATAATAGGAGTGGGAG GAAATGTGGAAACATTTTCTACGCCTGTGACTATAAAGAAAAAGGGTAGACACATTAAGA CAAGAATGCTAGTGGCAGATATTCCAGTGACTATTTTGGGACGAGATATTCTTCAGGACT TAGGTGCAAAATTGGTTTTGGCACAGCTCTCCAAGGAAATAAAATTTAGAAAAATAGAGT TAAAAGAGGGCACAATGGGGCCAAAAATTCCTCAATGGCCACTCACTAAGGAGAAACTAG AAGGGGCCAAAGAGATAGTCCAAAGACTATTGTCAGAGGGAAAAATATCAGAAGCTAGTG ACAATAATCCTTATAATTCACCCATATTTGTAATAAAAAAGAGGTCTGGCAAATGGAGGT TATTACAAGATCTGAGAGAATTAAACAAAACAGTACAAGTAGGAACGGAAATAT C CAGAG GATTGCCTCACCCGGGAGGATTAATTAAATGTAAACACATGACTGTATTAGATATTGGAG ATGCATATTTCACTATACCCTTAGATCCAGAGTTTAGACCATATACAGCTTTCACTATTC CCTCCATTAATCATCAAGAACCAGATAAAAGATATGTGTGGAAATGTTTACCACAAGGAT TCGTGTTGAGCCCATATATATATCAGAAAACATTACAGGAAATTTTACAACCTTTTAGGG AAAGATATCCTGAAGTACAATTGTATCAATATATGGATGATTTGTTCATGGGAAGTAATG GTTCTAAAAAACAACACAAAGAGTTAATCATAGAATTAAGGGCGATCTTACTGGAAAAGG GTTTTGAGACACCAGATGATAAATTACAAGAAGTGCCACCTTATAGCTGGCTAGGTTATC AACTTTGTCCTGAAAATTGGAAAGTACAAAAAATGCAATTAGACATGGTAAAGAATCCAA CCCTTAATGATGTGCAAAAATTAATGGGGAATATAACATGGATGAGCTCAGGGATCCCAG GGTTGACAGTAAAACACATTGCAGCTACTACTAAGGGATGTTTAGAGTTGAATCAAAAAG TAATTTGGACGGAAGAGGCACAAAAAGAGTTAGAAGAAAATAATGAGAAGATTAAAAATG CTCAAGGGTTACAATATTATAATCCAGAAGAAGAAATGTTATGTGAGGTTGAAATTACAA AAAATTATGAGGCAACTTATGTTATAAAACAATCACAAGGAATCCTATGGGCAGGTAAAA AGATTATGAAGGCTAATAAGGGATGGTCAACAGTAAAAAATTTAATGTTATTGTTGCAAC atgtggcaacagaaagtattactagagtaggaaaatgtccaacgtttaaggtaccattta

CCAAAGAGCAAGTAATGTGGGAAATGCAAAAAGGATGGTATTATTCTTGGCTCCCAGAAA

TAGTATATACACATCAAGTAGTTCATGATGATTGGAGAATGAAATTGGTAGAAGAACCTA

CATCAGGAATAACAATATACACTGATGGGGGAAAACAAAATGGAGAAGGAATAGCAGCTT

ATGTGACCAGTAATGGGAGAACTAAACAGAAAAGGTTAGGACCTGTCACTCATCAAGTTG

CTGAAAGAATGGCAATACAAATGGCATTAGAGGATACCAGAGATAAACAAGTAAATATAG

TAACTGATAGTTATTATTGTTGGAAAAATATTACAGAAGGATTAGGTTTAGAAGGACCAC

AAAGTCCTTGGTGGCCTATAATACAAAATATACGAGAAAAAGAGATAGTTTATTTTGCTT

GGGTACCTGGTCACAAAGGGATATATGGTAATCAATTGGCAGATGAAGCCGCAAAAATAA

AAGAAGAAATCATGCTAGCATACCAAGGCACACAAATTAAAGAGAAAAGAGATGAAGATG

CAGGGTTTGACTTATGTGTTCCTTATGACATCATGATACCTGTATCTGACACAAAAATCA

TACCCACAGATGTAAAAATTCAAGTTCCTCCTAATAGCTTTGGATGGGTCACTGGGAAAT

CATCAATGGCAAAACAGGGGTTATTAATTAATGGAGGAATAATTGATGAAGGATATACAG

GAGAAATACAAGTGATATGTACTAATATTGGAAAAAGTAATATTAAATTAATAGAGGGAC

AAAAATTTGCACAATTAATTATACTACAGCATCACTCAAATTCCAGACAGCCTTGGGATG

AAAATAAAATATCTCAGAGAGGGGATAAAGGATTTGGAAGTACAGGAGTATTCTGGGTAG

AAAATATTCAGGAAGCACAAGATGAACATGAGAATTGGCATACATCACCAAAGATATTGG

CAAGAAATTATAAGATACCATTGACTGTAGCAAAACAGATAACTCAAGAATGTCCTCATT

GCACTAAGCAAGGATCAGGACCTGCAGGTTGTGTCATGAGATCTCCTAATCATTGGCAGG

CAGATTGCACACATTTGGACAATAAGATAATATTGACTTTTGTAGAGTCAAATTCAGGAT

ACATACATGCTACATTATTGTCAAAAGAAAATGCATTATGTACTTCATTGGCTATTTTAG

AATGGGCAAGATTGTTTTCACCAAAGTCCTTACACACAGATAACGGCACTAATTTTGTGG

CAGAACCAGTTGTAAATTTGTTGAAGTTCCTAAAGATAGCACATAGCACAGGAATACCAT

ATCATCCAGAAAGTCAGGGTATTGTAGAAAGGGCAAATAGGACCTTGAAAGAGAAGATTC

AAAGTCATAGAGACAACACTCAAACACTGGAGGCAGCTTTACAACTTGCTCTCATTACTT

GTAACAAAGGGAGGGAAAGTATGGGAGGACAGACACCATGGGAAGTATTTATCACTAATC 136

AAGCACAAGTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAATCCTCCAAAAAATTTT

GTTTTTACAAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTAGGGTGCTGTGGAAGG

GTGATGGTGCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTGCTGTACCATTAACCA

GGACTAAGTTACTAATAAAACCAAATTGAGTATTGTTGCAGGAAGCAAGACCCAACTACC

ATTGTCAGCTGTGTTTCCTGAGGTCTCTAGGAATTGATTACCTCGATGCTTCATTAAGGA

AGAAGAATAAACAAAGACTGAAGGCAATCCAACAAGGAAGACAACCTCAATATTTGTTAT

AAGGTTTGATATATGGGAGTATTTGGTAAAGGGGTAACATGGTCAGCATCGCATTCTATG

GGGGAATCCCAGGGGGAATCTCAACCCCTATTACCCAACAGTCAGAAAAATCTAAGTGTG

AGGAGAACACAATGTTTCAACCTTATTGTTATAATAATGACAGTAAGAACAGCATGGCAG

AATCGAAGGAAGCAAGAGACCAAGAAATGAACCTGAAAGAAGAATCTAAAGAAGAAAAAA

GAAGAAATGACTGGTGGAAAATAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCAGGAACTACTGGAG

GAATACTTTGGTGGTATGAAGGACTCCCACAGCAACATTATATAGGGTTGGTGGCGATAG

GGGGAAGATTAAACGGATCTGGCCAATCAAATGCTATAGAATGCTGGGGTTCCTTCCCGG

GGTGTAGACCATTTCAAAATTACTTCAGTTATGAGACCAATAGAAGCATGCATATGGATA

ATAATACTGCTACATTATTAGAAGCTTTAACCAATATAACTGCTCTATAAATAACAAAAC

AGAATTAGAAACATGGAAGTTAGTAAAGACTTCTGGCATAACTCCTTTACCTATTTCTTC

TGAAGCTAACACTGGACTAATTAGACATAAGAGAGATTTTGGTATAAGTGCAATAGTGGC

AGCTATTGTAGCCGCTACTGCTATTGCTGCTAGCGCTACTATGTCTTATGTTGCTCTAAC

TGAGGTTAACAAAATAATGGAAGTACAAAATCATACTTTTGAGGTAGAAAATAGTACTCT

AAATGGTATGGATTTAATAGAACGACAAATAAAGATATTATATGCTATGATTCTTCAAAC

ACATGCAGATGTTCAACTGTTAAAGGAAAGACAACAGGTAGAGGAGACATTTAATTTAAT

TGGATGTATAGAAAGAACACATGTATTTTGTCATACTGGTCATCCCTGGAATATGTCATG

GGGACATTTAAATGAGTCAACACAATGGGATGACTGGGTAAGCAAAATGGAAGATTTAAA

TCAAGAGATACTAACTACACTTCATGGAGCCAGGAACAATTTGGCACAATCCATGATAAC

ATTCAATACACCAGATAGTATAGCTCAATTTGGAAAAGACCTTTGGAGTCATATTGGAAA

TTGGATTCCTGGATTGGGAGCTTCCATTATAAAATATATAGTGATGTTTTTGCTTATTTA

TTTGTTACTAACCTCTTCGCCTAAGATCCTCAGGGCCCTCTGGAAGGTGACCAGTGGTGC

AGGGTCCTCCGGCAGTCGTTACCTGAAGAAAAAATTCCATCACAAACATGCATCGCGAGA

AGACACCTGGGACCAGGCCCAACACAACATACACCTAGCAGGCGTGACCGGTGGATCAGG

GGACAAATACTACAAGCAGAAGTACTCCAGGAACGACTGGAATGGAGAATCAGAGGAGTA

CAACAGGCGGCCAAAGAGCTGGGTGAAGTCAATCGAGGCATTTGGAGAGAGCTATATTTC

CGAGAAGACCAAAGGGGAGATTTCTCAGCCTGGGGCGGCTATCAACGAGCACAAGAACGG

CTCTGGGGGGAACAATCCTCACCAAGGGTCCTTAGACCTGGAGATTCGAAGCGAAGGAGG

AAACATTTATGACTGTTGCATTAAAGCCCAAGAAGGAACTCTCGCTATCCCTTGCTGTGG

ATTTCCCTTATGGCTATTTTGGGGACTAGTAATTATAGTAGGACGCATAGCAGGCTATGG

ATTACGTGGACTCGCTGTTATAATAAGGATTTGTATTAGAGGCTTAAATTTGATATTTGA

AATAATCAGAAAAATGCTTGATTATATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGT

ATCAATGCCTCAGTATGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGGGTTTTTATGAGGGGT

TTTATAAATGATTATAAGAGTAAAAAGAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACCTTGTATAAC

CCAAAGGACTAGCTCATGTTGCTAGGCAACTAAACCGCAATAACCGCATTTGTGACGCGA

GTTCCCCATTGGTGACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGCTTCCCTTTAG

TGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACA

ACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTT

GTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTT

CAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGT

AAAATCCGATAAGGATCGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCC

CTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAG

CGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCC

CGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGC 137

TCTAAATCGGGGG CTC CCTTTAGGGTTC CGATTXAGAGCTTTACGGCACCTCGAC CGCAA AAAACTTGATTTGGGTGAXGGTXCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGAXAGACGGTTXTTCG CCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAAC ACXCAACCCXATCTCGGXCXATXCTTXTGATXTAXAAGGGAXXTXGCCGATTTCGGCCTA TTGGXTAAAAAATGAGCTGAXTXAACAAATAXTTAACGCGAATTXTAACAAAAXAXTAAC GTXTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTXCTCCTTACGCATCXGTGCGGXATTXCACACC GCATACGCGGATCTGCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTXGGTT AGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAA GTCCCCAGGCXCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATXAGXCAGCAAC CAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGXATGCAAAGCATGCATCTCAA TTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCGCCTAACXCCGCCCAG XTCCGCCCATTCXCCGCCCCATGGCTGACXAATXXTTXTXAXXTATGCAGAGGCCGAGGC CGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTT XTGCAAAAAGCTTGAXXCTTCTGACACAACAGTCXCGAACTXAAGGCXAGAGCCACCATG ATXGAACAAGAXGGAXTGCACGCAGGTTCXCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATXCGGC XATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGAXGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCG CAGGGGCGCCCGGTTCTTTXTGTCAAGACCGACCXGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAG GACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTXCCTXGCGCAGCTGTGCTC GACGTXGTCACXGAAGCGGGAAGGGACTGGCXGCXAXXGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGAX CTCCTGTCAXCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGXATCCATCATGGCTGATGCAATGCGG CGGCTGCAXACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATXCGACCACCAAGCGAAACATCGCATC GAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGAXCTGGACGAAGAG CATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGC GAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGXGGAAAATGGC CGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATA GCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTXGGCGGCGAATGGGCXGACCGCTTCCTC GTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCAXCGCCTTCTATCGCCTTCTTGAC GAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCXGC CATCACGAXGGCCGCAATAAAATATCXTXATTTTCATTACATCTGXGTGXTGGXTXTXTG TGTGAATCGATAGCGATAAGGATCCGCGTATGGTGCACTCTCAGTACAAXCTGCTCTGAT GCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCXGACGCGCCCTGACGGGCT TGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGT CAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTA TTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTXTCGG GGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCG CTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGT ATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTT GCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTG GGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAA CGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATT GACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAG TACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGT GCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGA CCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGT TGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTA GCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTXCCCGG CAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCC CTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGT ATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACG GGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTG ATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAA 138

CTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAA ATC C CTTAACGTGAGTTTTCGTT CCACTGAGCGTCAGACC CCGTAGAAAAGATCAAAGGA TCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCG CTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACT GGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCAC CACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTG GCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCG GATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGA ACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCC GAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACG AGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTC TGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCC AGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGA C SEQ ID N° 13 - pCIneoERev

TGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCCGACTAA ATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAAAAATTG ATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAACTGATAT CGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCTTATATC GTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTCGCAAAT ATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGGCGACAT CAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCCATTAGC CATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGXT GTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTG ACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCC ATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAA CGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGAC TTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCA AGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTG GCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATT AGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCG GTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG gcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactgcgatcgcccgccccgttg ACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTG AACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCA GTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCC TTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTA AGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGC ACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTT CAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGTAACGGCCG CCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTATGGCAGAATCGAAGGAAGCAAGAGACCAAGAAATGAA CCTGAAAGAAGAATCTAAAGAAGAAAAAAGAAGAAATGACTGGTGGAAAATAGATCCTCA GGGCCCTCTGGAAGGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCAGTCGTTACCTGAAGAAAA AATTCCATCACAAACATGCATCGCGAGAAGACACCTGGGACCAGGCCCAACACAACATAC ACCTAGCAGGCGTGACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACAAGCAGAAGTACTCCAGGA ACG AC TGG AATGGAGAATCAGAGGAG TACAACAGG CGG CCAAAGAG CTGGGTGAAGTCAA TCGAGGCATTTGGAGAGAGCTATATTTCCGAGAAGACCAAAGGGGAGATTTCTCAGCCTG 139 gggcggctatcaacgagcacaagaacggctctggggggaacaatcctcaccaagggtcct

TAGACCTGGAGATTCGAAGCGAAGGAGGAAACATTTATGAAGCCGAATTCTGCAGATATC

CATCACACTGGCGGCCGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAG

ATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTG

TGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAA

CAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTA

AAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCCGATAAGGATCGATCCGGGCTGGCGT aatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaa

TGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGA

CCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCG

CCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGAT

TTAGAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTG

GGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATA

GTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATT

TATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATAT

TTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTC

CTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGCGGATCTGCGCAGCACCATGGCCTG

AAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGT

GGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGC

AAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAG

GCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTC

CGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA

TTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT

GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACAG

TCTCGAACTTAAGGCTAGAGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCC

GGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTC

TGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGA

CCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCAC

GACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCT

GCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAA

AGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCC

ATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCT

TGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGC

CAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGAGGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTG

CTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCT

GGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCT

TGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCA

GCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAA

ATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGATGGCCGCAATAAAATATCTTTATT

TTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGCGATAAGGATCCGCGTATG

GTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCC

AACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGC

TGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGC

GAGAGGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGT

TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATT

TTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCA

ATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTT

TTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGA

TGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAA

GATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCT 140

GCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCAT

ACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGA

TGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGC

CAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACAT

GGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAA

CGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAAC

TGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAA

AGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATC

TGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC

CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAG

ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTA

CTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAA

GATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGC

CTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGA

GCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGT

CCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATA

CCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTAC

CGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGG

TTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCG

TGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAG

CGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCT

TTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTC

AGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTT

TTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT

SEQ ID N° 14 - pESYNREV

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTA

TTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC aatatgaccgccatgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggg

GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC

GCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAT

AGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC

CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGA

CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTG

GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACAC

CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT

CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTG

CGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATA

AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCAC

AGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGT

GACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAA

GGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACT

CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCAC

AGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACT

ATAGGCTAGCCTCGAGAATTCGCCACCATGGCTGAGAGCAAGGAGGCCAGGGATCAAGAG

ATGAACCTCAAGGAAGAGAGCAAAGAGGAGAAGCGCCGCAACGACTGGTGGAAGATCGAC 141

CCACAAGGCCCCCTGGAGGGGGACCAGTGGTGCCGCGTGCTGAGACAGTCCCTGCCCGAG

GAGAAGATTCCTAGCCAGACCTGCATCGCCAGAAGACACCTCGGCCCCGGTCCCACCCAG

CACACACCCTCCAGAAGGGATAGGTGGATTAGGGGCCAGATTTTGCAAGCCGAGGTCCTC

CAAGAAAGGCTGGAATGGAGAATTAGGGGCGTGCAACAAGCCGCTAAAGAGCTGGGAGAG

GTGAATCGCGGCATCTGGAGGGAGCTCTACTTCCGCGAGGACCAGAGGGGCGATTTCTCC

GCATGGGGAGGCTACCAGAGGGCACAAGAAAGGCTGTGGGGCGAGCAGAGCAGCCCCCGC

GTCTTGAGGCCCGGAGACTCCAAAAGACGCCGCAAACACCTGTGAAGTCGACCCGGGCGG

CCGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT

TTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATG

CTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCA

TTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACC

TCTACAAATGTGGTAAAATCCGATAAGGATCGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGC

CCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGT

AGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCC

AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGC

TTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACGG

CACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGA

TAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTC

C AAACTGGAAC AAC ACTCAACC CTAT CT CGGT CTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTG

CCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAATTTT

AACAAAATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTG

CGGTATTTCACACCGCATACGCGGATCTGCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAA

AGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAG

TTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTC

AATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAA

AGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCC

CTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTAT

GCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTT

GGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGG

CTAGAGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGG

AGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGT

TCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCC

TGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTT

GCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAG

TGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGG

CTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAG

CGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATG

ATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGC

GCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCA

TGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACC

GCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGG

CTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCT

ATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGC

GACGCCCAACCTGCCATCACGATGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGT

GTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGCGATAAGGATCCGCGTATGGTGCACTCTCAGTA

CAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACG

CGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCG

GGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCC

TCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAG

GTGGCACTTTTCGGGGAAATGTÇ CGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATT

CAAATATGTATCCGCTCATGAGÀwÁTAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAA 142

GGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTT

GCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGT

TGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTT

TTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGG

TATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA

ATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAA

GAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGA

CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAA

CTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACA

CCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTA

CTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCAC

TTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGC

GTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAG

TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGA

TAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTT

AGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATA

ATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAG

AAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAA

CAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTT

TTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGC

CGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAA

TCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAA

GACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGC ccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaa

GCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAA caggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcg ggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc tatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttg ctcacatggctcgacagatct

Seq ID N° 15 gag-pol de HIV com codões optimizados

ATGGGCGC CCGCGCCAGCGTGCTGTCGGGC GGCGAGCTGGACCGCTGGGAG AAGATCCGC CTGCGCCCCGGCGGCAAAAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTGTGGGCCAGCCGCGAA C TGGAGCGCTTCGCCGTGAACCCCGGGCTC CTGGAGACCAGCGAGGGGTGCCGCCAGATC CTCGGCCAACTGCAGCCCAGCCTGCAAACCGGCAGCGAGGAGCTGCGCAGCCTGTACAAC ACCGTGGCCACGCTGTACTGCGTCCACCAGCGGATCGAAATCAAGGATACGAAAGAGGCC CTGGATAAAATCGAAGAGGAACAGAATAAGAGCAAAAAGAAGGCCCAACAGGCCGCCGCG GACACCGGACACAGCAACCAGGTCAGCCAGAACTACCCCATCGTGCAGAACATCCAGGGG CAGATGGTGCACCAGGCCATCTCCCCCCGCACGCTGAACGCCTGGGTGAAGGTGGTGGAA GAGAAGGCTTTTAGCCCGGAGGTGATACCCATGTTCTCAGCCCTGTCAGAGGGAGCCACC CCCCAAGATCTGAACACCATGCTCAACACAGTGGGGGGACAGCAGGCCGCCATGCAGATG C7GAAGGAGACCATCAATGAGGAGGCTGCCGAATGGGATCGTGTGCATCCGGTGCACGCA GGGCCCATCGCACCGGGCCAGATGCGTGAGCCACGGGGCTCAGACATCGCCGGAACGACT AGTACCCTTCAGGAACAGATCGGCTGGATGACCAACAACCCACCCATCCCGGTGGGAGAA ATCTACAAACGCTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGCATGTATAGCCCTACC ACCATCCTGGACATCCGCCAAGGCCCGAAGGAACCCTTTCGCGACTACGTGGACCGGTTC TACAAAACGCTCCGCGCCGAGCAGGCTAGCCAGGAGGTGAAGAACTGGATGACCGAAACC CTGCTGCTCCAGAACGCGAACCCGGACTGCAAGACGATCCTGAAGGCCCTGGGCCCAGCG GCTACCCTAGAGGAAATGATGACCGCCTGTCAGGGAGTGGGCGGACCCGGCCACAAGGCA 143

CGCGTCCTGGCTGAGGCCATGAGCCAGGTGACCAACTCCGCTACCATCATGATGCAGCGC

GGCAAGTTTCGGAACCAACGCAAGATCGTCAAGTGCTTCAACTGTGGCAAAGAAGGGCAC

ACAGCCCGCAAC7GCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGA

CACCAAA7GAAAGAT7GTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCC

CACAAGGGAAGGCCAGGGAATTTrCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGAA

GAGAGCTTCAGGTTTGGGGAAGAGACAACAACTCCCTCTCAGAAGCAGGAGCCGATAGAC

AAGGAACTGTATCCTTTAGCTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTCGTCACAA

TAAAGATAGGGGGGCAGCTCAAGGAGGCTCTCCTGGACACCGGAGCAGACGACACCGTGC

TGGAGGAGATGTCGTTGCCAGGCCGCTGGAAGCCGAAGATGATCGGGGGAATCGGCGGTT

TCATCAAGGTGCGCCACTATGACCAGATCCTCATCGAAATCTGCGGCCACAAGGCTATCG

GTACCGTGCTGGTGGGCCCCACACCCGTCAACATCATCGGACGCAACCTGTTGACGCAGA

TCGGTTGCACGCTGAACTTCCCCATTAGCCCTATCGAGACGGTACCGGTGAAGCTGAAGC

CCGGCATGCACGGCCCGAAGGTCAAGCAATGGCCATTGACAGAGGAGAAGATCAAGGCAC

TGGTGGASATTTGCACAGAGA7GGAAAAGGAAGGGAAAATCTCCAAGATTGGGCCTGAGA

ACCCG7ACAACACGCCGGTG7TCGCAATCAAGAAGAAGGACTCGACGAAATGGCGCAAGC

?GGTGGACTTCCGCGAGCTGAACAAGCGCACGCAAGACTTCTGGGAGGTTCAGCTGGGCA

TCCCGCACCCCGCAGGGCTGAAGAAGAAGAAATCCGTGACCGTACTGGATGTGGGTGATG

CCTACTTCTCCGTTCCCCTGGACGAAGACTTCAGGAAGTACACTGCCTTCACAATCCCTT

CGATCAACAACGAGACACCGGGGATTCGATATCAGTACAACGTGCTGCCCCAGGGCTGGA

AAGGCTCTCCCGCAATCTTCCAGAGTAGCATGACCAAAATCCTGGAGCCTTTCCGCAAAC

AGAACCCCGACATCGTCATCTATCAGTACATGGATGACTTGTACGTGGGCTCTGATCTAG

AGATAGGGCAGCACCGCACCAAGATCGAGGAGCTGCGCCAGCACCTGTTGAGGTGGGGAC

TGACCACACCCGACAAGAAGCACCAGAAGGAGCCTCCCTTCCTCTGGATGGGTTACGAGC

TGCACCCTGACAAATGGACCGTGCAGCCTATCGTGCTGCCAGAGAAAGACAGCTGGACTG

rCAACGACATACAGAAGCTGGTGGGGAAGTTGAACTGGGCCAGTCAGATTTACCCAGGGA

TTAAGGTGAGGCAGCTGTGCAAACTCCTCCGCGGAACCAAGGCACTCACAGAGGTGATCC

CCCTAACCGAGGAGGCCGAGCTCGAACTGGCAGAAAACCGAGAGATCCTAAAGGAGCCCG tgcacggcgtgtactatgacccctccaaggacctgatcgccgagatccagaagcaggggc

AAGGCCAGTGGACCTATCAGATTTACCAGGAGCCCTTCAAGAACCTGAAGACCGGCAAGT

ACGCCCGGATGAGGGGTGCCCACACTAACGACGTCAAGCAGCTGACCGAGGCCGTGCAGA

AGATCACCACCGAAAGCATCGTGATCTGGGGAAAGACTCCTAAGTTCAAGCTGCCCATCC

AGAAGGAAACCTGGGAAACCTGGTGGACAGAGTATTGGCAGGCCACCTGGATTCCTGAGT

GGGAGTTCGTCAACACCCCTCCCCTGGTGAAGCTGTGGTACCAGCTGGAGAAGGAGCCCA

TAGTGGGCGCCGAAACCTTCTACGTGGATGGGGCCGCTAACAGGGAGACTAAGCTGGGCA

AAGCCGGATACGTCACTAACCGGGGCAGACAGAAGGTTGTCACCCTCACTGACACCACCA

ACCAGAAGACTGAGCTGCAGGCCATTTACCTCGCTTTGCAGGACTCGGGCCTGGAGGTGA

ACATCGTGACAGACTCTCAGTATGCCCTGGGCATCATTCAAGCCCAGCCAGACCAGAGTG

AGTCCGAGCTGGTCAATCAGATCATCGAGCAGCTGATCAAGAAGGAAAAGGTCTATCTGG

CCTGGGTACCCGCCCACAAAGGCATTGGCGGCAATGAGCAGGTCGACAAGCTGGTCTCGG

CTGGCATCAGGAAGGTGCTATTCCTGGATGGCATCGACAAGGCCCAGGACGAGCACGAGA

AATACCACAGCAACTGGCGGGCCATGGCTAGCGACTTCAACCTGCCCCCTGTGGTGGCCA

AAGAGATCGTGGCCAGCTGTGACAAGTGTCAGCTCAAGGGCGAAGCCATGCATGGCCAGG

TGGACTGTAGCCCCGGCATCTGGCAACTCGATTGCACCCATCTGGAGGGCAAGGTTATCC

TGGTAGCCGTCCATGTGGCCAGTGGCTACATCGAGGCCGAGGTCATTCCCGCCGAAACAG

GGCAGGAGACAGCCTACTTCCTCCTGAAGCTGGCAGGCCGGTGGCCAGTGAAGACCATCC

ATACTGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTGCTACGGTSAAGGCCGCCTGCTGGXGGGCGG

GAATCAAGCAGGAGTTCGGGATCCCCTACAATCCCCAGAGTCAGGGCGTCGTCGAGTCTA

TGAATAAGGAGTTAAAGAAGATTATCGGCCAGGTCAGAGATCAGGCTGAGCATCTCAAGA ccgcggtccaaatggcggtattcatccacaatttcaagcggaagggggggattggggggt

ACAGTGCGGGGGAGCGGATCGTGGACATCATCGCGACCGACATCCAGACTAAGGAGCTGC

AAAAGCAGATTACCAAGATTCAGAATTTCCGGGTCTACTACAGGGACAGCAGAAATCCCC tctggaaaggcccagcgaagctcctctggaagggtgagggggcagtagtgatccaggata

ATAGCGACATCAAGGTGGTGCCCAGAAGAAAGGCGAAGATCATTAGGGATTATGGCAAAC agatggcgggtgatgattgcgtggcgagcagacaggatgaggattag 144 SEQ ID N° 16 gag-pol de EIAV com codões optimizados

ATGGGCGATCCCCTCACCTGGTCCAAAGCCCTGAAGAAACTGGAAAAAGTCACCGTTCAG ggtagccaaaagcttaccacaggcaattgcaactgggcattgtccctggtggatcttttc

CACGACACTAATTTCGTTAAGGAGAAAGATTGGCAACTCAGAGACGTGATCCCCCTCTTG

GAGGACGTGACCCAAACATTGTCTGGGCAGGAGCGCGAAGCTTTCGAGCGCACCTGGTGG gccatcagcgcagtcaaaatggggctgcaaatcaacaacgtggttgacggtaaagctagc

TTTCAACTGCTCCGCGCTAAGTACGAGAAGAAAACCGCCAACAAGAAACAATCCGAACCT

AGCGAGGAGTACCCAATTATGATCGACGGCGCCGGCAATAGGAACTTCCGCCCACTGACT

CCCAGGGGCTATACCACCTGGGTCAACACCATCCAGACAAACGGACTTTTGAACGAAGCC

TCCCAGAACCTGTTCGGCATCCTGTCTGTGGACTGCACCTCCGAAGAAATGAATGCTTTT

CTCGACGTGGTGCCAGGACAGGCTGGACAGAAACAGATCCTGCTCGATGCCATTGACAAG

ATCGCCGACGACTGGGATAATCGCCACCCCCTGCCAAACGCCCCTCTGGTGGCTCCCCCA

CAGGGGCCTATCCCTATGACCGCTAGGTTCATTAGGGGACTGGGGGTGCCCCGCGAACGC

CAGATGGAGCCAGCATTTGACCAATTTAGGCAGACCTACAGACAGTGGATCATCGAAGCC

ATGAGCGAGGGGATTAAAGTCATGATCGGAAAGCCCAAGGCACAGAACATCAGGCAGGGG

GCCAAGGAACCATACCCTGAGTTTGTCGACAGGCTTCTGTCCCAGATTAAATCCGAAGGC

CACCCTCAGGAGATCTCCAAGTTCTTGACAGACACACTGACTATCCAAAATGCAAATGAA

GAGTGCAGAAACGCCATGAGGCACCTCAGACCTGAAGATACCCTGGAGGAGAAAATGTAC gcatgtcgcgacattggcactaccaagcaaaagatgatgctgctcgccaaggctctgcaa

ACCGGCCTGGCTGGTCCATTCAAAGGAGGAGCACTGAAGGGAGGTCCATTGAAAGCTGCA caaacatgttataattgtgggaagccaggacatttatctagtcaatgtagagcacctaaa gtctgttttaaatgtaaacagcctggacatttctcaaagcaatgcagaagtgttccaaaa aacgggaagcaaggggctcaagggaggccccagaaacaaactttcccgatacaacagaag agtcagcacaacaaatctgttgtacaagagactcctcagactcaaaatctgtacccagat ctgagcgaaataaaaaaggaatacaatgtcaaggagaaggatcaagtagaggatctcaac ctggacagtttgtgggagtaacatacaatctcgagaagaggcccactaccatcgtcctga tcaatgacacccctcttaatgtgctgctggacaccggagccgacaccagcgttctcacta ctgctcactataacagactgaaatacagaggaaggaaataccagggcacaggcatcatcg gcgttggaggcaacgtcgaaaccttttccactcctgtcaccatcaaaaagaaggggagac acattaaaaccagaatgctggtcgccgacatccccgtcaccatccttggcagagacattc tccaggacctgggcgctaaactcgtgctggcacaactgtctaaggaaatcaagttccgca agatcgagctgaaagagggcacaatgggtccaaaaatcccccagtggcccctgaccaaag agaagcttgagggcgctaaggaaatcgtgcagcgcctgctttctgagggcaagattagcg aggccagcgacaataacccttacaacagccccatctttgtgattaagaaaaggagcggca aatggagactcctgcaggacctgagggaactcaacaagaccgtccaggtcggaactgaga tctctcgcggactgcctcaccccggcggcctgattaaatgcaagcacatgacagtccttg acattggagacgcttattttaccatccccctcgatcctgaatttcgcccctatactgctt ttaccatccccagcatcaatcaccaggagcccgataaacgctatgtgtggaagtgcctcc

CCCAGGGATTTGTGCTTAGCCCCTACATTTACCAGAAGACACTTCAAGAGATCCTCCAAC ctttccgcgaaagatacccagaggttcaactctaccaatatatggacgacctgttcatgg ggtccaacgggtctaagaagcagcacaaggaactcatcatcgaactgagggcaatcctcc tggagaaaggcttcgagacacccgacgacaagctgcaagaagttcctccatatagctggc tgggctaccagctttgccctgaaaactggaaagtccagaagatgcagttggatatggtca agaacccaacactgaacgacgtccagaagctcatgggcaatattacctggatgagctccg gaatccctgggcttaccgttaagcacattgccgcaactacaaaaggatgcctggagttga accagaaggtcatttggacagaggaagctcagaaggaactggaggagaataatgaaaaga ttaagaatgctcaagggctccaatactacaatcccgaagaagaaatgttgtgcgaggtcg aaatcactaagaactacgaagccacctatgtcatcaaacagtcccaaggcatcttgtggg ccggaaagaaaatcatgaaggccaacaaaggctggtccaccgttaaaaatctgatgctcc tgctccagcacgtcgccaccgagtctatcacccgcgtcggcaagtgccccaccttcaaag ttcccttcactaaggagcaggtgatgtgggagatgcaaaaaggctggtactactcttggc ttcccgagatcgtctacacccaccaagtggtgcacgacgactggagaatgaagcttgtcg aggagcccactagcggaattacaatctataccgacggcggaaagcaaaacggagagggaa tcgctgcatacgtcacatctaacggccgcaccaagcaaaagaggctcggccctgtcactc accaggtggctgagaggatggctatccagatggcccttgaggacactagagacaagcagg tgaacattgtgactgacagctactactgctggaaaaacatcacagagggccttggcctgg agggaccccagtctccctggtggcctatcatccagaatatccgcgaaaaggaaattgtct atttcgcctgggtgcctggacacaaaggaatttacggcaaccaactcgccgatgaagccg 145 ccaaaattaaagaggaaatcatgcttgcctaccagggcacacagattaaggagaagagag acgaggacgctggctttgacctgtgtgtgccatacgacatcatgattcccgttagcgaca

CAAAGATCATTCCAACCGATGTCAAGATCCAGGTGCCACCCAATTCATTTGGTTGGGTGA

CCGGAAAGTCCAGCATGGCTAAGCAGGGTCTTCTGATTAACGGGGGAATCATTGATGAAG gatacaccggcgaaatccaggtgatctgcacaaatatcggcaaaagcaatattaagctta tcgaagggcagaagttcgctcaactcatcatcctccagcaccacagcaattcaagacaac cttgggacgaaaacaagattagccagagaggtgacaagggcttcggcagcacaggtgtgt tctgggtggagaacatccaggaagcacaggacgagcacgagaattggcacacctccccta agattttggcccgcaattacaagatcccactgactgtggctaagcagatcacacaggaat gcccccactgcaccaaacaaggttctggccccgccggctgcgtgatgaggtcccccaatc actggcaggcagattgcacccacctcgacaacaaaattatcctgaccttcgtggagagca

ArTrrrasCTACATCrarGCAACACTCCTCTCCAAGGAAAATGCATTGTGCACCTCCCTCG

CAATTCTGGAATGGGCCAGGCTGTTCTCTCCAAAATCCCTGCACACCGACAACGGCACCA actttgtggctgaacctgtggtgaatctgctgaagttcctgaaaatcgcccacaccactg

GCATTCCCTATCACCCTGAAAGCCAGGGCATTGTCGAGAGGGCCAACAGAACTCTGAAAG aaaagatccaatctcacagagacaatacacagacattggaggccgcacttcagctcgccc

TTATCACCTGCAACAAAGGAAGAGAAAGCATGGGCGGCCAGACCCCCTGGGAGGTCTTCA

TCACTAACCAGGCCCAGGTCATCCATGAAAAGCTGCTCTTGCAGCAGGCCCAGTCCTCCA

AAAAGTTCTGCTTTTATAAGATCCCCGGTGAGCACGACTGGAAAGGTCCTACAAGAGTTT

TGTGGAAAGGAGACGGCGCAGTTGTGGTGAACGATGAGGGCAAGGGGATCATCGCTGTGC

CCCTGACACGCACCAAGCTTCTCATCAAGCCAAACTGA

SEQ ID N° 17 pIRESlhyg ESYNGP

AATTCGCCACCATGGGCGATCCCCTCACCTGGTCCAAAGCCCTGAAGAAACTGGAAAAAG

TCACCGTTCAGGGTAGCCAAAAGCTTACCACAGGCAATTGCAACTGGGCATTGTCCCTGG

TGGATCTTTTCCACGACACTAATTTCGTTAAGGAGAAAGATTGGCAACTCAGAGACGTGA

TCCCCCTCTTGGAGGACGTGACCCAAACATTGTCTGGGCAGGAGCGCGAAGCTTTCGAGC

GCACCTGGTGGGCCATCAGCGCAGTCAAAATGGGGCTGCAAATCAACAACGTGGTTGACG

GTAAAGCTAGCTTTCAACTGCTCCGCGCTAAGTACGAGAAGAAAACCGCCAACAAGAAAC

AATCCGAACCTAGCGAGGAGTACCCAATTATGATCGACGGCGCCGGCAATAGGAACTTCC

GCCCACTGACTCCCAGGGGCTATACCACCTGGGTCAACACCATCCAGACAAACGGACTTT

TGAACGAAGCCTCCCAGAACCTGTTCGGCATCCTGTCTGTGGACTGCACCTCCGAAGAAA

TGAATGCTTTTCTCGACGTGGTGCCAGGACAGGCTGGACAGAAACAGATCCTGCTCGATG

CCATTGACAAGATCGCCGACGACTGGGATAATCGCCACCCCCTGCCAAACGCCCCTCTGG

TGGCTCCCCCACAGGGGCCTATCCCTATGACCGCTAGGTTCATTAGGGGACTGGGGGTGC

CCCGCGAACGCCAGATGGAGCCAGCATTTGACCAATTTAGGCAGACCTACAGACAGTGGA

TCATCGAAGCCATGAGCGAGGGGATTAAAGTCATGATCGGAAAGCCCAAGGCACAGAACA

TCAGGCAGGGGGCCAAGGAACCATACCCTGAGTTTGTCGACAGGCTTCTGTCCCAGATTA

AATCCGAAGGCCACCCTCAGGAGATCTCCAAGTTCTTGACAGACACACTGACTATCCAAA

ATGCAAATGAAGAGTGCAGAAACGCCATGAGGCACCTCAGACCTGAAGATACCCTGGAGG

AGAAAATGTACGCATGTCGCGACATTGGCACTACCAAGCAAAAGATGATGCTGCTCGCCA

AGGCTCTGCAAACCGGCCTGGCTGGTCCATTCAAAGGAGGAGCACTGAAGGGAGGTCCAT

TGAAAGCTGCACAAACATGTTATAATTGTGGGAAGCCAGGACATTTATCTAGTCAATGTA

GAGCACCTAAAGTCTGTTTTAAATGTAAACAGCCTGGACATTTCTCAAAGCAATGCAGAA

GTGTTCCAAAAAACGGGAAGCAAGGGGCTCAAGGGAGGCCCCAGAAACAAACTTTCCCGA

TACAACAGAAGAGTCAGCACAACAAATCTGTTGTACAAGAGACTCCTCAGACTCAAAATC 146

TGTACCCAGATCTGAGCGAAATAAAAAAGGAATACAATGTCAAGGAGAAGGATCAAGTAG

AGGATCTCAACCTGGACAGTTTGTGGGAGTAACATACAATCTCGAGAAGAGGCCCACTAC

CATCGTCCTGATCAATGACACCCCTCTTAATGTGCTGCTGGACACCGGAGCCGACACCAG

CGTTCTCACTACTGCTCACTATAACAGACTGAAATACAGAGGAAGGAAATACCAGGGCAC

AGGCATCATCGGCGTTGGAGGCAACGTCGAAACCTTTTCCACTCCTGTCACCATCAAAAA

GAAGGGGAGACACATTAAAACCAGAATGCTGGTCGCCGACATCCCCGTCACCATCCTTGG

CAGAGACATTCTCCAGGACCTGGGCGCTAAACTCGTGCTGGCACAACTGTCTAAGGAAAT

CAAGTTCCGCAAGATCGAGCTGAAAGAGGGCACAATGGGTCCAAAAATCCCCCAGTGGCC

CCTGACCAAAGAGAAGCTTGAGGGCGCTAAGGAAATCGTGCAGCGCCTGCTTTCTGAGGG

CAAGATTAGCGAGGCCAGCGACAATAACCCTTACAACAGCCCCATCTTTGTGATTAAGAA

AAGGAGCGGCAAATGGAGACTCCTGCAGGACCTGAGGGAACTCAACAAGACCGTCCAGGT

CGGAACTGAGATCTCTCGCGGACTGCCTCACCCCGGCGGCCTGATTAAATGCAAGCACAT

GACAGTCCTTGACATTGGAGACGCTTATTTTACCATCCCCCTCGATCCTGAATTTCGCCC

CTATACTGCTTTTACCATCCCCAGCATCAATCACCAGGAGCCCGATAAACGCTATGTGTG

GAAGTGCCTCCCCCAGGGATTTGTGCTTAGCCCCTACATTTACCAGAAGACACTTCAAGA

GATCCTCCAACCTTTCCGCGAAAGATACCCAGAGGTTCAACTCTACCAATATATGGACGA

CCTGTTCATGGGGTCCAACGGGTCTAAGAAGCAGCACAAGGAACTCATCATCGAACTGAG

GGCAATCCTCCTGGAGAAAGGCTTCGAGACACCCGACGACAAGCTGCAAGAAGTTCCTCC

ATATAGCTGGCTGGGCTACCAGCTTTGCCCTGAAAACTGGAAAGTCCAGAAGATGCAGTT

GGATATGGTCAAGAACCCAACACTGAACGACGTCCAGAAGCTCATGGGCAATATTACCTG

GATGAGCTCCGGAATCCCTGGGCTTACCGTTAAGCACATTGCCGCAACTACAAAAGGATG

CCTGGAGTTGAACCAGAAGGTCATTTGGACAGAGGAAGCTCAGAAGGAACTGGAGGAGAA

TAATGAAAAGATTAAGAATGCTCAAGGGCTCCAATACTACAATCCCGAAGAAGAAATGTT

GTGCGAGGTCGAAATCACTAAGAACTACGAAGCCACCTATGTCATCAAACAGTCCCAAGG

CATCTTGTGGGCCGGAAAGAAAATCATGAAGGCCAACAAAGGCTGGTCCACCGTTAAAAA

TCTGATGCTCCTGCTCCAGCACGTCGCCACCGAGTCTATCACCCGCGTCGGCAAGTGCCC

CACCTTCAAAGTTCCCTTCACTAAGGAGCAGGTGATGTGGGAGATGCAAAAAGGCTGGTA

CTACTCTTGGCTTCCCGAGATCGTCTACACCCACCAAGTGGTGCACGACGACTGGAGAAT

GAAGCTTGTCGAGGAGCCCACTAGCGGAATTACAATCTATACCGACGGCGGAAAGCAAAA

CGGAGAGGGAATCGCTGCATACGTCACATCTAACGGCCGCACCAAGCAAAAGAGGCTCGG

CCCTGTCACTCACCAGGTGGCTGAGAGGATGGCTATCCAGATGGCCCTTGAGGACACTAG

AGACAAGCAGGTGAACATTGTGACTGACAGCTACTACTGCTGGAAAAACATCACAGAGGG

CCTTGGCCTGGAGGGACCCCAGTCTCCCTGGTGGCCTATCATCCAGAATATCCGCGAAAA

GGAAATTGTCTATTTCGCCTGGGTGCCTGGACACAAAGGAATTTACGGCAACCAACTCGC

CGATGAAGCCGCCAAAATTAAAGAGGAAATCATGCTTGCCTACCAGGGCACACAGATTAA

GGAGAAGAGAGACGAGGACGCTGGCTTTGACCTGTGTGTGCCATACGACATCATGATTCC

CGTTAGCGACACAAAGATCATTCCAACCGATGTCAAGATCCAGGTGCCACCCAATTCATT

TGGTTGGGTGACCGGAAAGTCCAGCATGGCTAAGCAGGGTCTTCTGATTAACGGGGGAAT

CATTGATGAAGGATACACCGGCGAAATCCAGGTGATCTGCACAAATATCGGCAAAAGCAA

TATTAAGCTTATCGAAGGGCAGAAGTTCGCTCAACTCATCATCCTCCAGCACCACAGCAA

TTCAAGACAACCTTGGGACGAAAACAAGATTAGCCAGAGAGGTGACAAGGGCTTCGGCAG

CACAGGTGTGTTCTGGGTGGAGAACATCCAGGAAGCACAGGACGAGCACGAGAATTGGCA

CACCTCCCCTAAGATTTTGGCCCGCAATTACAAGATCCCACTGACTGTGGCTAAGCAGAT

CACACAGGAATGCCCCCACTGCACCAAACAAGGTTCTGGCCCCGCCGGCTGCGTGATGAG

GTCCCCCAATCACTGGCAGGCAGATTGCACCCACCTCGACAACAAAATTATCCTGACCTT

CGTGGAGAGCAATTCCGGCTACATCCACGCAACACTCCTCTCCAAGGAAAATGCATTGTG

CACCTCCCTCGCAATTCTGGAATGGGCCAGGCTGTTCTCTCCAAAATCCCTGCACACCGA

CAACGGCACCAACTTTGTGGCTGAACCTGTGGTGAATCTGCTGAAGTTCCTGAAAATCGC

CCACACCACTGGCATTCCCTATCACCCTGAAAGCCAGGGCATTGTCGAGAGGGCCAACAG aactctgaaagaaaagatccaatctcacagagacaatacacagacattggaggccgcact 147

TCAGCTCGCCCTTATCACCTGCAACAAAGGAAGAGAAAGCATGGGCGGCCAGACCCCCTG

GGAGGTCTTCATCACTAACCAGGCCCAGGTCATCCATGAAAAGCTGCTCTTGCAGCAGGC

CCAGTCCTCCAAAAAGTTCTGCTTTTATAAGATCCCCGGTGAGCACGACTGGAAAGGTCC

TACAAGAGTTTTGTGGAAAGGAGACGGCGCAGTTGTGGTGAACGATGAGGGCAAGGGGAT

CATCGCTGTGCCCCTGACACGCACCAAGCTTCTCATCAAGCCAAACTGAACCCGGGGCGG

CCGCACTAGAGGAATTCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCG

CTTGGAATAAGGCCGGTGTGTGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTT

TGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCT

TTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCT

GGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCC

ACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGC

GGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTC

CTCAAGCGTAGTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGAAT

CTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAGCTCT

AGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCA

CAACCCCGTACCAAAGATGGATAGATCCGGAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGA

GAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGA

AGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAG

CTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCT

CCCGATTCCGGAAGTGCTTGACAXTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTC

CCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCT

GCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGG

GTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATG

CGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGC

GTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCG

GCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAAC

AGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACAT

CTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAG

GCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGA

CCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCG

ATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAG

AAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACG

CCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGATGCCGACCGAACAAGAGCTGATT

TCGAGAACGCCTCAGCCAGCAACTCGCGCGAGCCTAGCAAGGCAAATGCGAGAGAACGGC

CTTACGCTTGGTGGCACAGTTCTCGTCCACAGTTCGCTAAGCTCGCTCGGCTGGGTCGCG

GGAGGGCCGGTCGCAGTGATTCAGGCCCTTCTGGATTGTGTTGGTCCCCAGGGCACGATT

GTCATGCCCACGCACTCGGGTGATCTGACTGATCCCGCAGATTGGAGATCGCCGCCCGTG

CCTGCCGATTGGGTGCAGATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTCTAGTTGC

CAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCC

ACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCT

ATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGG

CATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCG

AGTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACC

GTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG

TTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGG

TGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC

GGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTT

GCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCT

GCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGA

TAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGC 148

CGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACG

CTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGG

AAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTT

TCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGT

GTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTG

CGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACT

GGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTT

CTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCT

GCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCAC

CGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATC

TCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACG

TTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTA

AAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCA

ATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGC

CTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGC

TGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCC

AGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTAT

TAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGT

TGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTC

CGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAG

CTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGT

TATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGAC

TGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG

CCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCAT

TGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTC

GATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTC

TGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAA

ATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTG

TCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCG

CACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTA

TGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCT

GCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAA

GGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGC

GATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCA

ATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTA

AATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTAT

GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGG

TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGAC

GTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTT

CCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGG

CAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCC

ATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGT

AACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATA

AGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACG

ACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCA

GTGTGCTGGAATTAATTCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTC

AAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGAT

ATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCAGAAAAGAC

AATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCATACACTTGAGT

GACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAG

GTCGATCGAGCA 149

SEQ ID N° 18 pESDSYNGP

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTA

TTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC

AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG

GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC

GCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCAT

AGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC

CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGA

CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTG

GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACAC

CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT

CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTG

CGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATA

AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCAC

AGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGT

GACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAA

GGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACT

CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCAC

AGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACT

ATAGGCTAGAGAATTCCAGGTAAGATGGGCGATCCCCTCACCTGGTCCAAAGCCCTGAAG

AAACTGGAAAAAGTCACCGTTCAGGGTAGCCAAAAGCTTACCACAGGCAATTGCAACTGG

GCATTGTCCCTGGTGGATCTTTTCCACGACACTAATTTCGTTAAGGAGAAAGATTGGCAA

CTCAGAGACGTGATCCCCCTCTTGGAGGACGTGACCCAAACATTGTCTGGGCAGGAGCGC

GAAGCTTTCGAGCGCACCTGGTGGGCCATCAGCGCAGTCAAAATGGGGCTGCAAATCAAC

AACGTGGTTGACGGTAAAGCTAGCTTTCAACTGCTCCGCGCTAAGTACGAGAAGAAAACC

GCCAACAAGAAACAATCCGAACCTAGCGAGGAGTACCCAATTATGATCGACGGCGCCGGC

AATAGGAACTTCCGCCCACTGACTCCCAGGGGCTATACCACCTGGGTCAACACCATCCAG

ACAAACGGACTTTTGAACGAAGCCTCCCAGAACCTGTTCGGCATCCTGTCTGTGGACTGC

ACCTCCGAAGAAATGAATGCTTTTCTCGACGTGGTGCCAGGACAGGCTGGACAGAAACAG

ATCCTGCTCGATGCCATTGACAAGATCGCCGACGACTGGGATAATCGCCACCCCCTGCCA

AACGCCCCTCTGGTGGCTCCCCCACAGGGGCCTATCCCTATGACCGCTAGGTTCATTAGG

GGACTGGGGGTGCCCCGCGAACGCCAGATGGAGCCAGCATTTGACCAATTTAGGCAGACC

TACAGACAGTGGATCATCGAAGCCATGAGCGAGGGGATTAAAGTCATGATCGGAAAGCCC

AAGGCACAGAACATCAGGCAGGGGGCCAAGGAACCATACCCTGAGTTTGTCGACAGGCTT

CTGTCCCAGATTAAATCCGAAGGCCACCCTCAGGAGATCTCCAAGTTCTTGACAGACACA

CTGACTATCCAAAATGCAAATGAAGAGTGCAGAAACGCCATGAGGCACCTCAGACCTGAA

GATACCCTGGAGGAGAAAATGTACGCATGTCGCGACATTGGCACTACCAAGCAAAAGATG

ATGCTGCTCGCCAAGGCTCTGCAAACCGGCCTGGCTGGTCCATTCAAAGGAGGAGCACTG

AAGGGAGGTCCATTGAAAGCTGCACAAACATGTTATAATTGTGGGAAGCCAGGACATTTA

TCTAGTCAATGTAGAGCACCTAAAGTCTGTTTTAAATGTAAACAGCCTGGACATTTCTCA

AAGCAATGCAGAAGTGTTCCAAAAAACGGGAAGCAAGGGGCTCAAGGGAGGCCCCAGAAA

CAAACTTTCCCGATACAACAGAAGAGTCAGCACAACAAATCTGTTGTACAAGAGACTCCT

CAGACTCAAAATCTGTACCCAGATCTGAGCGAAATAAAAAAGGAATACAATGTCAAGGAG

AAGGATCAAGTAGAGGATCTCAACCTGGACAGTTTGTGGGAGTAACATACAATCTCGAGA

AGAGGCCCACTACCATCGTCCTGATCAATGACACCCCTCTTAATGTGCTGCTGGACACCG

GAGCCGACACCAGCGTTCTCACTACTGCTCACTATAACAGACTGAAATACAGAGGAAGGA

AATACCAGGGCACAGGCATCATCGGCGTTGGAGGCAACGTCGAAACCTTTTCCACTCCTG

TCACCATCAAAAAGAAGGGGAGACACATTAAAACCAGAATGCTGGTCGCCGACATCCCCG 150

TCACCATCCTTGGCAGAGACATTCTCCAGGACCTGGGCGCTAAACTCGTGCTGGCACAAC

TGTCTAAGGAAATCAAGTTCCGCAAGATCGAGCTGAAAGAGGGCACAATGGGTCCAAAAA

TCCCCCAGTGGCCCCTGACCAAAGAGAAGCTTGAGGGCGCTAAGGAAATCGTGCAGCGCC

TGCTTTCTGAGGGCAAGATTAGCGAGGCCAGCGACAATAACCCTTACAACAGCCCCATCT

TTGTGATTAAGAAAAGGAGCGGCAAATGGAGACTCCTGCAGGACCTGAGGGAACTCAACA

AGACCGTCCAGGTCGGAACTGAGATCTCTCGCGGACTGCCTCACCCCGGCGGCCTGATTA

AATGCAAGCACATGACAGTCCTTGACATTGGAGACGCTTATTTTACCATCCCCCTCGATC

CTGAATTTCGCCCCTATACTGCTTTTACCATCCCCAGCATCAATCACCAGGAGCCCGATA

AACGCTATGTGTGGAAGTGCCTCCCCCAGGGATTTGTGCTTAGCCCCTACATTTACCAGA

AGACACTTCAAGAGATCCTCCAACCTTTCCGCGAAAGATACCCAGAGGTTCAACTCTACC

AATATATGGACGACCTGTTCATGGGGTCCAACGGGTCTAAGAAGCAGCACAAGGAACTCA

TCATCGAACTGAGGGCAATCCTCCTGGAGAAAGGCTTCGAGACACCCGACGACAAGCTGC

AAGAAGTTCCTCCATATAGCTGGCTGGGCTACCAGCTTTGCCCTGAAAACTGGAAAGTCC

AGAAGATGCAGTTGGATATGGTCAAGAACCCAACACTGAACGACGTCCAGAAGCTCATGG

GCAATATTACCTGGATGAGCTCCGGAATCCCTGGGCTTACCGTTAAGCACATTGCCGCAA

CTACAAAAGGATGCCTGGAGTTGAACCAGAAGGTCATTTGGACAGAGGAAGCTCAGAAGG

AACTGGAGGAGAATAATGAAAAGATTAAGAATGCTCAAGGGCTCCAATACTACAATCCCG

AAGAAGAAATGTTGTGCGAGGTCGAAATCACTAAGAACTACGAAGCCACCTATGTCATCA

AÂCAGTCCCAAGGCATCTTGTGGGCCGGAAAGAAAATCATGAAGGCCAACAAAGGCTGGT

CCACCGTTAAAAATCTGATGCTCCTGCTCCAGCACGTCGCCACCGAGTCTATCACCCGCG

TCGGCAAGTGCCCCACCTTCAAAGTTCCCTTCACTAAGGAGCAGGTGATGTGGGAGATGC

AAAAAGGCTGGTACTACTCTTGGCTTCCCGAGATCGTCTACACCCACCAAGTGGTGCACG

ACGACTGGAGAATGAAGCTTGTCGAGGAGCCCACTAGCGGAATTACAATCTATACCGACG

GCGGAAAGCAAAACGGAGAGGGAATCGCTGCATACGTCACATCTAACGGCCGCACCAAGC

AAAAGAGGCTCGGCCCTGTCACTCACCAGGTGGCTGAGAGGATGGCTATCCAGATGGCCC

TTGAGGACACTAGAGACAAGCAGGTGAACATTGTGACTGACAGCTACTACTGCTGGAAAA

ACATCACAGAGGGCCTTGGCCTGGAGGGACCCCAGTCTCCCTGGTGGCCTATCATCCAGA

A7ATCCGCGAAAAGGAAATTGTCTATTTCGCCTGGGTGCCTGGACACAAAGGAATTTACG

CCAACCAACTCGCCGATGAAGCCGCCAAAATTAAAGAGGAAATCATGCTTGCCTACCAGG

GCACACAGATTAAGGAGAAGAGAGACGAGGACGCTGGCTTTGACCTGTGTGTGCCATACG

ACA7CATGATTCCCGTTAGCGACACAAAGATCATTCCAACCGATGTCAAGATCCAGGTGC

CACCCAATTCATrTGGTTGGGTGACCGGAAAGTCCAGCATGGCTAAGCAGGGTCTTCTGA

TTAACGGGGGAATCATTGATGAAGGATACACCGGCGAAATCCAGGTGATCTGCACAAATA

TCGGCAAAAGCAATATTAAGCTTATCGAAGGGCAGAAGTTCGCTCAACTCATCATCCTCC

AGCACCACAGCAATTCAAGACAACCTTGGGACGAAAACAAGATTAGCCAGAGAGGTGACA

AGGGCTTCGGCAGCACAGGTGTGTTCTGGGTGGAGAACATCCAGGAAGCACAGGACGAGC

ACGAGAATTGGCACACCTCCCCTAAGATTTTGGCCCGCAATTACAAGATCCCACTGACTG

TGGCTAAGCAGATCACACAGGAATGCCCCCACTGCACCAAACAAGGTTCTGGCCCCGCCG

GCTGCGTGATGAGGTCCCCCAATCACTGGCAGGCAGATTGCACCCACCTCGACAACAAAA

TTATCCTGACCTTCGTGGAGAGCAATTCCGGCTACATCCACGCAACACTCCTCTCCAAGG

AAAATGCATTGTGCACCTCCCTCGCAATTCTGGAATGGGCCAGGCTGTTCTCTCCAAAAT

CCCTGCACACCGACAACGGCACCAACTTTGTGGCTGAACCTGTGGTGAATCTGCTGAAGT

TCCTGAAAATCGCCCACACCACTGGCATTCCCTATCACCCTGAAAGCCAGGGCATTGTCG

AGAGGGCCAACAGAACTCTGAAAGAAAAGATCCAATCTCACAGAGACAATACACAGACAT

TGGAGGCCGCACTTCAGCTCGCCCTTATCACCTGCAACAAAGGAAGAGAAAGCATGGGCG

GCCAGACCCCCTGGGAGGTCTTCATCACTAACCAGGCCCAGGTCATCCATGAAAAGCTGC

TCTTGCAGCAGGCCCAGTCCTCCAAAAAGTTCTGCTTTTATAAGATCCCCGGTGAGCACG

ACTGGAAAGGTCCTACAAGAGTTTTGTGGAAAGGAGACGGCGCAGTTGTGGTGAACGATG

AGGGCAAGGGGATCATCGCTGTGCCCCTGACACGCACCAAGCTTCTCATCAAGCCAAACT

GAACCCGGGGCGGCCGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGA 151

TACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGT

GAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAAC

AACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAA

AGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCCGATAAGGATCGATCCGGGCTGGCGTA

ATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAAT

GGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGAC

CGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGC

CACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTÇAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATT

TAGAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGG

GCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAG

TGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTT

ATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATT

TAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCC

TTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGCGGATCTGCGCAGCACCATGGCCTGA

AATAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTG

GAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCA

AAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGG

CAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCC

GCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAAT

TTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTG

AGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACAGT

CTCGAACTTAAGGCTAGAGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCG

GCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCT

GATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGAC

CTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACG

ACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTG

CTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAA

GTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCA

TTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTT

GTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCC

AGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGC

TTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTG

GGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTT

GGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAG

CGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAA

TGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGATGGCCGCAATAAAATATCTTTATTT

TCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGCGATAAGGATCCGCGTATGG

TGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCA

ACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCT

GTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCG

AGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTT

TCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTT

TTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAA

TAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTT

TTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGAT

GCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAG

ATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTG

CTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATA

CACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGAT 152

GGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCC

AACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATG

GGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAAC

GACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACT

GGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAA

GTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCT

GGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCC

TCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGA

CAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTAC

TCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAG

ATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCG

TCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATC

TGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAG

CTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTC

CTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATAC

CTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACC

GGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGT

TCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGT

GAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGC

GGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTT

TATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA

GGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTT TGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT pONY8.3G FB29 - (SEQ ID 19)

AGATCTTGAAT AATAAAAT GTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCC gactaaattcatgtcgcgcgatagtggtgtttatcgccgatagagatggcgatattggaa aaattgatatttgaaaatatggcatattgaaaatgtcgccgatgtgagtttctgtgtaac

TGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGA TT T11GGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCT

TATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTC

GCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGG

CGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCC

ATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCA

TACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCXÍCC

ATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCA1TAGTTCA

TAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC

GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATOACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAAT

AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCXACTTGGCAGT

ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCC

CGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA

CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGG

ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT 153

GTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCCCC

CCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGT

TTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGG

CCTTTGT AAT AAAT AT AATTCTCTACTC AGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCG AGATC

CTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGG

CTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTC

CTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCG

CTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAGAAATTAACTACTGGTAACTGT

AATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGATACCAACTTTGTAAAAGAAAAGGAC

TGGCAGCTGAGGGATGTCATTCCATTGCTGGAAGATGTAACTCAGACGCTGTCAGGACAA

GAAAGAGAGGCCTTTGAAAGAACATGGTGGGCAATTTCTGCTGTAAAGATGGGCCTCCAG

ATTAATAATGTAGTAGATGGAAAGGCATCATTCCAGCTCCTAAGAGCGAAATATGAAAAG

AAGACTGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCCTCTGAAGAATATCTCTAGAACTAGTGGATC

CCCCGGGCTGCAGGAGTGGGGAGGCACGATGGCCGCTTTGGTCGAGGCGGATCCGGCCAT

TAGCC AT ATT ATTC ATT GGTTAT ATAGC ATAAATCAATATTGGCTATTG GCC ATTGCAT A

CGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCAT

GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAAITACGGGGTCATTAGTTCATA

GCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGC

CC AACG ACCCCCGCCCATTG ACGTC AATAATG ACGTATGTTCCC ATAGTAACGCCAAT AG

GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACOGTAAACTGCCCACTTGGCAGTAC

ATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG

CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACITGGCAGTACATCTACG

TATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGAT

AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGT

TTTGGCACCAAAATC AACGGG ACTTTCC AAAAT GTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG C

AAATGGGCGGTAGGCATGTACGGTGGOAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACC

GTC AG ATCG CCTGG AGACGCCATCC ACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAG ACACCGGGACC

GATCCAGCCTCCGCGGCCCCAAGCTTGTTGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAA

GGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAA

CGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGAC

CCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCAC

CCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTT

CTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGA

CGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCAT

CGAGCrGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTA

CAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGT

GAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCA

GCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC

CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTT 154

CGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGA

CTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCAGCTGCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCA

GCTΠ1GI ICCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGGGAAGTATTTATCACTAATCAAGCAC

AAGT AATACATG AG AAACTTTT ACT ACAGC AAGC ACAATCCTCCAAAAAATTTTGTTTTT

ACAAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTAGGGTGCTGTGGAAGGGTGATG

GTGCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTGCTGTACCATTAACCAGGACTA

AGTTACTAATAAAACCAAATTGAGTATTGTTGCAGGAAGCAAGACCCAACTACCATTGTC

AGCTGTGTTTCCTGACCTCAATATTTGTTATAAGGTTTGATATGAATCCCAGGGGGAATC

TCAACCCCTATTACCCAACAGTCAGAAAAATCTAAGTGTGAGGAGAACACAATGTTTCAA

CCTTATTGTTATAATAATGACAGTAAGAACAGCATGGCAGAATCGAAGGAAGCAAGAGAC

CAAGAATG AACCTGAAAG AAGA ATCTAAAG AAGAAAAAAGAAGAAATGACTGGTGGAAAA

TAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCAGGAACTACTGGAGGAATACTTTGGTGGTATGAAG

GACTCCCACAGCAACATTATATAGGGTTGGTGGCGATAGGGGGAAGATTAAACGGATCTG

GCCAATCAAATGCTATAGAATGCTGGGGTTCCTTCCCGGGGTGTAGACCATTTCAAAATT

ACTTCAGTTATGAGACCAATAGAAGCATGCATATGGATAATAATACTGCTACATTATTAG

AAGCTTT AACCAATAT AACTGCTCT ATAAATAAC AAAAC AG AATTAG AAACATGGAAGTT

AGT AAAG ACTTCTGGC AT AACTCCTTTACCT ATTTCTTCTGAAGCTAACACTGGACTAAT

TAGACATAAGAGAGATTTTGGTATAAGTGCAATAGTGGCAGCTATTGTAGCCGCTACTGC

TATTGCTGCTAGCGCTACTATGTCTTATGTTGCTCTAACTGAGGTTAACAAAATAATGGA

AGTACAAAATCATACTTTTGAGGTAGAAAATAGTACTCTAAATGGTATGGATTTAATAGA

ACGACAAATAAAGATATTATATGCTATGATrCTTCAAACACATGCAGATGTTCAACTGTT

AAAGG AAAG AC AAC AGGT AG AG G AG ACATTT AATTT AATTGGATGTAT AG AAAG AACACA

TGTATTTTGTCATACTGGTCATCCCTGGAATATGTCATGGGGACATTTAAATGAGTCAAC

ACAATGGG ATGACTG GGT AAGCAAAATGGAAGATTTAAATCAAGAGATACTAACTACACT

TCATGGAGCCAGGAACAATTTGGCACAATCCATGATAACATTCAATACACCAGATAGTAT

AGCTCAATTTGGAAAAGACCTTTGGAGTCATATTGGAAATTGGATTCCTGGATTGGGAGC

TTCCATTATAAAATATATAGTGATGI f Π Γ GCTTATTTATTTGTTACTAACCTCTTCGCC

TAAGATCCTCAGGGCCCTCTGGAAGGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCAGTCGTTA

CCTGAAGAAAAAATTCCATCACAAACATGCATCGCGAGAAGACACCTGGGACCAGGCCCA

ACACAACATACACCTAGCAGGCGTGACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACAAGCAGAA

GTACTCCAGGAACGACTGGAATGOAGAATCAGAGGAGTACAACAGGCGGCCAAAGAGCTG

GGTGAAGTCAATCGAGGCATTTGGAGAGAGCTATATTTCCGAGAAGACCAAAGGGGAGAT

TTCTC AGCCTGGGGCGG CTATC AACG AGC AC AAG AACGGCTCTGG G GGGAAC AATCCTCA

CCAAGGGTCCTTAGACCTGGAGATTCGAAGCGAAGGAGGAAACATTTATGACTGTTGCAT

TAAAGCCCAAGAAGGAACTCTCGCTATCCCTTGCrGTGGATTTCCCTTATGGCTATTTTG

G GG ACTAGT AATT AT AGTAGG ACGCATAGC AGGCTAT GGATTACGTGG ACTCGCTGTTAT

AATAAGG ATTTGTATTAGAGGCTT AAATTTG ATATTTG AAATAATCAG AAAAATGCTT GA

TTATATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTA

GAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGGGI Till ATGAGGGG1111ATAAATGATTATAAGAGT

AAAAAGAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCTCATGTTG 155 ctaggcaactaaaccgcaataaccgcatttgtgacgcgagttccccattggtgacgcgtt

AACTTCCTGTTTTTACAGTATATAAGTGCTTGTATTCTGACAATTGGGCACTCAGATTCT

GCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTA

CTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCGTAA

TCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATA

CGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTA

ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGTGATGCCCG

GGCGGCCGAGGCGGCCTACGTGAACCATCACCCAAATCAAGTTTTTTGCGGTCGAGGTGC

CGTAAAGCTCTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAG

CCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTG

GCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTA

CAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGCCTGCGCAACTGTTGGOAAGGGCGATCGGTGCGGO

CCTCTTCGCTATTACGCCAGCCCGGATCGATCCTTATCGGATTTTACCACATTTGTAGAG

GTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACATCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAAT

GCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGC

ATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAA

CTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCATTAACCCTCACTAAAGGGAAGCGGC

CGCCCGGGTCGACTTCACAGGTGTTTGCGGCGTCTTTTGGAGTCTCCGGGCCTCAAGACG

CGGGGGCTGCTCTGCTCGCCCCACAGCCTTTCTTGTGCCCTCTGGTAGCCTCCCCATGCG

GAGAAATCGCCCCTCTGGTCCTCGCGGAAGTAGAGCTCCCTCCAGATGCCGCGATTCACC

TCTCCCAGCTCTTTAGCGGCTTGTTGCACGCCCCTAATTCTCCATTCCAOCCTTTCTTGG

AGGACCTCGGCTTGCAAAATCTGGCCCCTAATCCACCTATCCCTTCTGGAGGGTGTGTGC

TGGGTGGGACCGGGGCCGAGGTGTCTTCTGGCGATGCAGGTCTGGCTAGGAATCTTCTCC

TCGGGCAGGGACTGTCTCAGCACGCGGCACCACTGGTCCCCCTCCAGGGGGCCTTGTGGG

TCGATCTTCCACCAGTCGTTGCGGCGCTTCTCCTCTTTGCTCTCTTCCTTGAGGTTCATC

TCTTGATCCCTGGCCTCCTTGCTCTCAGCCATGGTGGCGAATTCTCGAGGCTAGCCTCCC

GGTGGTGGGTCGGTGGTCCCTGGGCAGGGGTCTCCAGATCCCGGACGAGCCCCCAAATGA

AAGACCCCCGAGACGGGTAGTCAATCACTCTGAGGAGACCCTCCCAAGGAACAGCGAGAC

CACGAGTCGGATGCAACAGCAAGAGGATTTATTGGATACACGGGTACCCGGGCGACTCAG

TCTATCGGAGGACTGGCGCGCCGAGTGAGGGGTTGTGAGCTCTTTTATAGAGCTCGOGAA

GCAGAAGCGCGCGAACAGAAGCGAGAAGCAGGCTGATTGGTTAATTCAAATAAGGCACAG

GGTCATTTCAGGTCCTTGGGGGAGCCTGGAAACATCTGATGGGTCTTAAGAAACTGCTGA

GGGTTGGGCCATATCTGGGGACCATCTGTTCTTGGCCCCGGGCCGGGGCCGAACCGCGGT

GACCATCTGTTCTTGGCCCCGGGCCGGGGCCGAAACTGCTCACCGCAGATATCCTGTTTG

GCCCAACGTTAGCTGTTTTCGTGTACCCGCCCTTGATCTGAACTTCTCTATTCTTGGTTT

GGTATTTTTCCATGCCTTGCAAAATGGCGTTACTGCGGCTATCAGGCTAAGCAATTTGAG

ATCTGGCCGAGGCGGCCTACTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGT

TTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGG

CTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGG

GATAACGCAGGAAAGAACATGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACAT

GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTT

CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCG 156

AAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTC tcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgt

GGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAA

GCTGGGCT GTGTGCACG AACCCCCCGTTC AGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTA

TCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAA

CAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAA

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CGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTT

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AATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC

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GATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGA

CCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCG cagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagc tagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcat cgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaag GCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGAr

CGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAA

TTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAA

GTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGITGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGA

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GCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAOTTCGATGTAACCCACTCGTGC

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AAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACT

CTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACAT

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GACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGATAAC

TTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTT

TnGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAG

AGCTTGACGGGGAAAGCCAACCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAC

CGGC

Lisboa, 21 de Maio de 2010 157

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol capazes de montagem de um genoma de vector retroviral numa partícula retroviral numa célula produtora, de modo a produzir um retrovírus de replicação defeituosa numa célula alvo, em que a sequência nucleotidica tem codões optimizados para expressão na célula produtora e em que a sequência nucleotidica compreende a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a partícula retroviral é substancialmente derivada de EIAV.
3. Utilização de uma sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol capazes de montagem de um genoma de vector retroviral numa partícula retroviral numa célula produtora, de modo a prevenir o empacotamento do genoma de vector retroviral numa célula alvo, em que a sequência nucleotidica tem codões optimizados para expressão na célula produtora e em que a partícula retroviral é substancialmente derivada de EIAV; e a sequência nucleotidica compreende a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.
4. Utilização de uma sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol capazes de montagem de um genoma de vector retroviral compreendendo, pelo menos, parte de uma sequência nucleotidica gag, numa partícula retroviral numa célula produtora, de modo a prevenir a recombinação entre a referida sequência nucleotidica 1 codificando proteínas retrovirais gag e pol e a, pelo menos, parte de uma sequência nucleotídica gag, em que a sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol tem codões optimizados para expressão na célula produtora e em que a sequência nucleotídica compreende a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a partícula retroviral é substancialmente derivada de EIAV.
6. Utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o genoma retroviral compreende, adicionalmente, um nucleótido de interesse (NOI).
7. Utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a sequência nucleotídica é independente de Rev.
8. Utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a sequência nucleotídica não contém a sequência RRE.
9. Método de produção de um retrovírus de replicação defeituosa, compreendendo a transfecção de uma célula produtora com o seguinte: i) um genoma retroviral; ii) uma sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol; e iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virai essenciais não codificados pela sequência nucleotídica de (ii) ; 2 caracterizado por a sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol ter codões optimizados para expressão na célula produtora e por a sequência nucleotídica com codões optimizados compreender a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a partícula retroviral é substancialmente derivada de EIAV.
11. Método de prevenção do empacotamento de um genoma retroviral numa célula alvo, compreendendo os passos de: a. transfecção de uma célula produtora com o seguinte, de modo a produzir partículas retrovirais: i) um genoma retroviral; ii) uma sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol; e iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de Empacotamento virai essenciais não codificados por uma ou mais das sequências nucleotídicas de (ii); e b. transfecção de uma célula alvo com partículas retrovirais do passo (a); caracterizado por a sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol ter codões optimizados para expressão na célula produtora e por a sequência nucleotídica com codões optimizados compreender a sequência mostrada na SEQ ID N° 16. 3
12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a partícula retroviral é substancialmente derivada de EIAV.
13. Método de prevenção da recombinação entre um genoma de vector retroviral e uma sequência nucleotídica codificando um polipéptido virai requerido para a montagem do genoma virai em partículas retrovirais, compreendendo a transfecção de uma célula produtora com o seguinte: (i) um genoma retroviral compreendendo, pelo menos, parte de uma sequência nucleotídica gag; (ii) uma sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol; e (iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virai essenciais não codificados pela sequência nucleotídica de (ii); caracterizado por a sequência nucleotídica codificando proteínas retrovirais gag e pol ter codões optimizados para expressão na célula produtora e por a sequência nucleotídica com codões optimizados compreender a sequência mostrada na SEQ ID N° 16.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a partícula retroviral é substancialmente derivada de EIAV.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, em que o genoma retroviral compreende, adicionalmente, um nucleótido de interesse (NOI). 4
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, em que iii) compreende uma sequência nucleotidica codificando uma proteina env.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, em que pelo menos um de i) a iii) contém um ou mais genes acessórios funcionais.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, em que i) a iii) são desprovidos de quaisquer genes acessórios funcionais.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18, em que a sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol é independente de Rev.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 19, em que a sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol não contém a sequência RRE.
21. Sequência nucleotidica codificando proteínas retrovirais gag e pol, compreendendo a sequência de SEQ ID N° 16.
22. Vector compreendendo uma sequência nucleotidica de acordo com a reivindicação 21, em que o vector é independente de Rev.
23. Sistema de vector virai compreendendo: i) uma sequência nucleotidica de interesse; e ii) uma sequência nucleotidica codificando um polipéptido virai requerido para a montagem de 5 partículas virais, em que a sequência nucleotídica é como definida na reivindicação 21.
24. Sistema de produção virai compreendendo: i) um genoma virai compreendendo, pelo menos, uma sequência nucleotídica de interesse; e ii) uma sequência nucleotídica codificando um polipéptido virai requerido para a montagem do genoma virai em partículas virais, em que a sequência nucleotídica é como definida na reivindicação 21.
25. Sistema de acordo com a reivindicação 23 ou reivindicação 24, em que o vector virai é um vector retroviral.
26. Sistema de acordo com a reivindicação 25, em que o vector retroviral é um vector lentiviral.
27. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, em que o vector lentiviral é substancialmente derivado de EIAV.
28. Sistema de acordo com qualquer das reivindicações 23 a 27, em que a sequência nucleotídica definida em i-ii) inclui, também, uma proteína de envelope.
29. Sistema de acordo com a reivindicação 28, em que o gene de envelope tem com codões optimizados.
30. Sistema de acordo com qualquer das reivindicações 23 a 29, em que o nucleótido de interesse é seleccionado de um gene terapêutico, um gene marcador e um gene de selecção. 6
31. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30, compreendendo um ou mais genes acessórios funcionais.
32. Sistema de acordo com qualquer das reivindicações 23 a 30, desprovido de quaisquer genes acessórios funcionais.
33. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 32, em que a sequência nucleotidica (i i) não contém a sequência RRE.
34. Sistema virai de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 33, para utilização num método de produção de partículas virais.
35. Método para a produção de uma partícula virai, cujo método compreende a introdução numa célula produtora: i) de um genoma virai, como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 33, ii) de uma ou mais sequências nucleotídicas, como definidas na reivindicação 21 e, iii) de sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virai essenciais não codificados por uma ou mais das sequências nucleotídicas de (ii).
36. Partícula virai produzida pelo sistema de produção de qualquer uma das reivindicações 29 a 34 ou pelo método da reivindicação 35. 7
37. Sistema virai de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 34, ou uma partícula virai de acordo com a reivindicação 36, para o tratamento de uma infecção virai.
38. Composição farmacêutica compreendendo o sistema virai de qualquer uma das reivindicações 24 a 34, ou a partícula virai da reivindicação 37, juntamente com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 21 de Maio de 2010 8 1/59 FIGURA 1 A Sph I Sal I 38 pb | PPT . - -/-: rmv D U5 i rv ◄-► ◄- HIV-1 HXB2 (455-634) 2' PCR de pH4 HIV-1 HXB2 Promotor HCMV (8900-9123) (-421 a -1) B 1' PCR de pH4 PPT HIV 3’ U3 R IU5 Moldes R |u5 RIB1 RIB2

Produto de 1' PCR

RIB3

Produto de 2' PCR 2/59 FIGURA 2 gagpol-HXB2 -> Utilização de Codão Sequência de ADN 430S pb ATGGGTGCGAGA . . . GATGAGGATTAG linear 1436 codões PM : 161929 Dalton CAI(S.c.) : 0.083 CAI(E.c.) : 0.151 TTT phe F 21 TCT ser s 3 TAT tyr Y 30 TGT cys c 18 TTC phe F 14 TCC ser s 3 TAC tyr Y 9 TGC eys c 2 TTA leu L 46 TCA ser s 19 TAA OCH z - TGA OPA z - TTG leu L 11 TCG ser s 1 TAG AMB z 1 TGG trp w 37 CTT leu L 13 CCT pro P 21 CAT his H 20 CGT arg R - CTC leu L 7 ccc pro P 14 CAC his H 7 CGC arg R - CTA leu L 17 CCA pro P 41 CAA gin Q 56 CGA arg R 3 CTG leu L 16 CCG pro P - CAG gin Q 39 CGG arg R 3 ATT ile I 30 ACT thr T 24 AAT asn N 42 AGT ser S 18 ATC.ile Z 14 ACC thr T 20 AAC asn N 16 AGC ser s 16 ATA ile z 56 ACA thr T 43 ΑΑΆ lys K 88 AGA arg R 45 ATG met M 29 ACC thr T 1 AAG lys K 34 AGG arg R 18 GTT vai V 15 GCT ala A 17 GAT asp D 37 GGT gly G 11 GTC vai V 11 CCC ala A 19 GAC asp □ 26 GGC gly G 10 GTA vai V ss CCA ala A 55 GAA glu E 7S GGA gly G 61 CTG val V 15 CCG ala A 5 GAG glu E 32 GGG gly G 26 3/59 FIGURA 3a gagpol-SYHgp [1 a 4308] -> Utilização de Codão Sequência de ADN 4308 pb ATGGGCGCCCGC ... GATGAGGATTAG linear 1436 codões PM : 161929 Dalton CAI(S.c.) : 0.080 CAI(E.c.) : 0.296 TTT pbe P 5 TCT ser s S TAT tyr Y 10 TGT c ys c 6 TTC phe P 30 TCC ser s 11 TAC tyr Y 29 TGC cys c 14 TTA leu L 2 TCA ser s 4 TAA OCH Z - TGA OPA z - TTG leu L 7 TCG ser s 6 TAG AMB Z 1 TGG trp w 37 CTT leu L 3 CCT pro P 14 CAT his H 6 CGT arg R 2 CTC leu L 22 CCC pro P 39 CAC his H 21 CGC arg R 34 CTA leu L 6 CCA pro P 10 CAA gin Q 14 CGA arg R 3 CTG leu L 70 CCG pro P 13 CAG gin Q 31 CGG arg R 10 ATT ile 1 17 ACT thr T 11 AAT asn N 13 AGT ser S 7 ATC ile 1 79 ACC thr T 48 AAC asn N 45 AGC ser S 27 ATA ile I 4 ACA thr T 13 AAA lys K 25 AGA arg R 7 ATG met M 29 ACG thr T 16 AAG lys K 97 AGG arg R 13 GTT vai V 5 GCT ala A 15 GAT asp D 19 GGT gly G 10 GTC vai V 27 GCC ala A 56 GAC asp D 44 GGC gly G 54 GTA vai V 6 GCA ala A 13 GAA glu E 29 GGA gly G 16 GTG vai V 58 GCG ala A 12 GAG glu £ 78 GGG gly G 28 4/59 Utilização de codão em genes humanos (MH), Gag-pol de HIV-1 de tipo selvagem (WT) e o Gag-pol de HIV-1 com codões optimizados (CO) MH WT ÊQ MH WT £Q MH m SS. MH WT £β Ala A 13 46 8 Cys C 68 10 70 Leu A 3 14 3 Ser C 34 35 55 GC C 53 19 65 TG T 32 90 30 CT c 26 8 17 AG T 10 10 3 G 17 11 8 G 58 14 70 TC A 5 38 17 T 17 24 19 Gin A 12 53 21 T 5 11 6 C 28 10 14 CA G 88 47 79 TT A 2 42 6 G 9 3 7 Arg A 10 58 10 G 6 11 0 T 13 3 3 AG G 18 29 11 Glu A 25 65 38 CG A 6 6 0 GA G 75 35 62 Lys A 18 58 28 Thr A 14 45 16 C 37 0 61 AA G 82 42 72 AC C 57 29 52 G 21 6 10 Gly A 14 53 21 G 15 0 19 T 7 0 5 GG C 50 21 55 Phe C 80 45 45 T 14 26 13 G 24 24 24 TT T 20 55 55 Asn c 78 29 71 T 12 3 0 Tyr c 74 20 80 AA T 22 71 29 Pro A 16 52 24 TA T 26 80 20 His c 79 30 90 CC C 48 15 39 Asp c 75 64 70 CA T 21 70 10 G 17 3 21 Vai A 5 56 4 GA T 25 36 30 T 19 30 15 GT C 25 6 20 Ite A 5 58 8 G 64 24 76 AT c 18 19 92 T 7 12 0 T 77 23 0 FIGURA 3b 5/59 FIGURA 4 env-mn [1 a 2571] -> Utilização de Codão Sequência de ADN 2571 pb ATGAGAGTGAAG . . . GCTTTGCTATAA linear 857 codões 999Q S$g§ 9QSQ 1333ο > η >-3 a > n ο > η 4 ο > η *4 PM : 97078 Dalton CAIlS.c.) : 0.083 CAI(E.c.| : 0.140 phe F 13 TCT ser s 7 TAT tyr Y 15 TGT cys c 16 phe F 11 TCC ser s 3 TAC tyr Y 7 TGC cys c 5 leu L 20 TCA ser s 13 TAA OCH Z 1 TGA OPA z - leu L 17 TCG ser s 2 TAG AMB z - TGG trp w 30 leu L 9 CCT pro P 5 CAT bis H 8 CGT arg R - leu L 11 ccc pro P 9 CAC his H 6 CGC arg R 2 leu L 12 CCA pro P 12 CAA gin Q 22 CGA arg R 1 leu L 15 CCG pro P 2 CAG gin Q 19 CGG arg R 1 ile I 21 ACT thr T 16 AAT asn N 50 AGT ser S 18 ile X 10 ACC thr T 14 AAC asn N 13 AGC ser s 11 ile I 32 ACA thr T 28 AAA 1Υ£ K 32 AGA arg R 30 met M 17 ACG thr T 5 AAG lys K 14 AGG arg R 15 vai V 8 GCT ala A 15 GAT asp D 18 GGT gly G 10 vai V 9 GCC ala A 7 GAC asp D 14 GGC gly G 6 vai V 26 GCA ala A 20 GAA glu E 36 GGA gly G 28 vai V 12 GCG ala A 5 GAG glu E 10 GGG gly G 12 6/59 FIGURA 5 SYNgplÊOmn -> Utilização de Codão Sequência de ADN 2571 pb ATGAGGGTGAAG . . . GCGCTGCTGTAA linear 857 codões PM : 97078 Dalton CAI(S.c.) : 0.074 CAI(E.c.) : 0.419 TTT phe P - TCT ser s 2 TAT tyr Y 1 TGT cys c - TTC phe F 24 tcc ser s 4 TAC tyr Y 21 TGC cys c 21 TTA leu L - TCA ser s - TAA OCH Z 1 TGA OPA z - TTG leu L - TCG ser s - TAG AMB Z - TGG trp w 30 CTT leu L _ CCT pro P _ CAT his H 2 CGT arg R 1 CTC leu L 20 ccc pro P 26 CAC his H 12 CGC arg R 36 CTA leu L 1 CCA pro P - CAA gin Q - CGA arg R - CTG leu L 63 CCG pro P 2 CAG gin Q 41 CGG arg R 4 ATT ile I 2 ACT thr T _ AAT asn N 2 AGT ser S _ ATC ile I 61 ACC thr T 59 AAC asn N 61 AGC ser S 48 ATA ile I - ACA thr T - AAA lys K 1 AGA arg R 2 ATG met M 17 ACG thr T 4 AAG lys K 45 AGG arg R 6 GTT vai V — GCT ala A - GAT asp D 2 GGT gly G 1 GTC vai V 1 GCC ala A 40 GAC asp D 30 GGC giy G 47 GTA vai V 1 GCA ala A - GAA glu E 3 GGA gly G - GTG vai V 53 GCG ala A 8 GAG glu E 43 GGG gly G 8 7/59 FIGURA 6 Construções de HIV pSYNgpl pRV67

8/59 FIGURA 7 Linhas celulares auxiliares de O Sistema Vector Hit empacotamento

Construção de genoma de vector

e.g. 293T, COS 9/59

8 —οnu•s l-s

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4151 CCCAGCGAAGCTCCTCTGGAAGGGTGAGGGGGCASTAGTOATCCAGGATA 4200 13/59 WT ATGGGAGACCCTTTGACATGGAGCAAGGCGCTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAA 60 CO ATGGGCGATCCCCTCACCTGGTCCAAAGCCCTGAAGAAACTGGAAAAAGTCACCGTTCAG 60 WT GGGTCTCAGAAATTAACTACTGGTAACTGTAATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTT 120 CO GGTAGCCAAAAGCTTACCACAGGCAATTGCAACTGGGCATTGTCCCTGGTGGATCTTTTC 120 WT CATGATACCAACTTTGTAAAAGAAAAGGACTGGCAGCTGAGGGATGTCATTCCATTGCTG 180 CO CACGACACTAATTTCGTTAAGGAGAAAGATTGGCAACTCAGAGACGTGATCCCCCTCTTG 180 WT GAAGATGTAACTCAGACGCTGTCAGGACAAGAAAGAGAGGCCTTTGAAAGAACATGGTGG 240 CO GAGGACGTGACCCAAACATTGTCTGGGCAGGAGCGCGAAGCTTTCGAGCGCACCTGGTGG 240 WT GCAATTTCTGCTGTAAAGATGGGCCTCCAGATTAATAATGTAGTAGATGGAAAGGCATCA 300 CO GCCATCAGCGCAGTCAAAATGGGGCTGCAAATCAACAACGTGGTTGACGGTAAAGCTAGC 300 WT TTCCAGCTCCTAAGAGCGAAATATGAAAAGAAGACTGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCC 360 CO TTTCAACTGCTCCGCGCTAAGTACGAGAAGAAAACCGCCAACAAGAAACAATCCGAACCT 360 WT TCTGAAGAATATCCAATCATGATAGATGGGGCTGGAAACAGAAATTTTAGACCTCTAACA 420 CO AGCGAGGAGTACCCAATTATGATCGACGGCGCCGGCAATAGGAACTTCCGCCCACTGACT 420 WT CCTAGAGGATATACTACTTGGGTGAATACCATACAGACAAATGGTCTATTAAATGAAGCT 480 CO CCCAGGGGCTATACCACCTGGGTCAACACCATCCAGACAAACGGACTTTTGAACGAAGCC 480 WT AGTCAAAACTTATTTGGGATATTATCAGTAGACTGTACTTCTGAAGAAATGAATGCATTT 540 CO TCCCAGAACCTGTTCGGCATCCTGTCTGTGGACTGCACCTCCGAAGAAATGAATGCTTTT 540 WT TTGGATGTGGTACCTGGCCAGGCAGGACAAAAGCAGATATTACTTGATGCAATTGATAAG 600 CO CTCGACGTGGTGCCAGGACAGGCTGGACAGAAACAGATCCTGCTCGATGCCATTGACAAG 600 WT ATAGCAGATGATTGGGATAATAGACATCCATTACCGAATGCTCCACTGGTGGCACCACCA 660 CO ATCGCCGACGACTGGGATAATCGCCACCCCCTGCCAAACGCCCCTCTGGTGGCTCCCCCA 660 WT CAAGGGC CTATTCCCATGACAG CAAGGTTTATTAGAGGTTTAGGAGTACCTAGAGAAAGA 720 CO CAGGGGCCTATCCCTATGACCGCTAGGTTCATTAGGGGACTGGGGGTGCCCCGCGAACGC 720 WT CAGATG GAG CCTG CTTTTGAT CAGTTTAGG CAGACATATAGACAATGGATAATAGAAG C C 780 CO CAGATGGAGCCAGCATTTGACCAATTTAGGCAGACCTACAGACAGTGGATCATCGAAGCC 780 WT ATGTCAGAAGGCATCAAAGTGATGATTGGAAAACCTAAAGCTCAAAATATTAGGCAAGGA 840 CO ATGAGCGAGGGGATTAAAGTCATGATCGGAAAGCCCAAGGCACAGAACATCAGGCAGGGG 840 WT gctaaggaaccttacccagaatttgtagacagactattatcccaaataaaaagtgaggga 900 CO gccaaggaaccataccctgagtttgtcgacaggcttctgtcccagattaaatccgaaggc 900 WT CATCCACAAGAGATTTCAAAATTCTTGACTGATACACTGACTATTCAGAACQCAAATGAG 960 CO CACCCTCAGGAGATCTCCAAGTTCTTGACAGACACACTGACTATCCAAAATGCAAATGAA 960 14/59 MT GAATGTAGAAATGCTATGAGACATTTAAGACCAGAGGATACATTAGAAGAGAAAATGTAT CO GAGTGCAGAAACGCCATGAGGCACCTCAGACCTGAAGATACCCTGGAGGAGAAAATGTAC 1020 1020 WT GCTTGCAGAGACATTGGAACTACAAAACAAAAGATGATGTTATTGGCAAAAGCACTTCAG CO GCATGTCGCGACATTGGCACTACCAAGCAAAAGATGATGCTGCTCGCCAAGGCTCTGCAA 1080 1080 WT ACTGGrCTTGCGGGCCCATTTAAAGGTGGAGCCTTGAAAGGACGGCCACTAAAGGCAGCA CO ACCGGCCTGGCTGGTCCATTCAAAGGAGGAGCACTGAAGGGAGGTCCATTGAAAGCTGCA 1140 1140 WT CAAACATGTTATAACTGTGGGAAGCCAGGACATTTATCTAGTCAATGTAGAGCACCTAAA CO CAAACATGTTATAATTGTGGGAAGCCAGGACATTTATCTAGTCAATGTAGAGCACCTAAA 1200 1200 WT GTCTGTTTTAAATGTAAACAGCCTGGACATTTCTCAAAGCAATGCAGAAGTGTTCCAAAA CO GTCTGTTTTAAATGTAAACAGCCTGGACATTTCTCAAAGCAATGCAGAAGTGTTCCAAAA 1260 1260 WT AACGGGAAGCAAGGGGCTCAAGGGAGGCCCCAGAAACAAACTTTCCCGATACAACAGAAG CO AACGGGAAGCAAGGGGCTCAAGGGAGGGCCCAGAAACAAACTTTCCCGATACAACAGAAG 1320 1320 WT AGTCAGCACAACAAATCTGTTGTACAAGAGACTCCTCAGACTCAAAATCTGTACCCAGAT CO AGTCAGCACAACAAATCTGTTGTACAAGAGACTCCTCAGACTCAAAATCTGTACCCAGAT 1380 1380 WT ctgagcgaaataaaaaagoaatacaatgtcaaggagaaggatcaagtagaggatctcaac CO ctgagcgaaataaaaaaggaatacaatgtcaaggagaaggatcaagtagaggatctcaac 1440 1440 WT CTGGACAGTTTGTGGGAGTAACATATAATCTAGAGAAAAGGCCTACTACAATAGTATTAA CO CTGGACAGTTTGTGGGAGTAACATACAATCTCGAGAAGAGGCCCACTACCATCGTCCTGA 1500 1500 ttaatgatactcccttaaatgtactgttagacacaggagcagatacttcagtgttgacta TCAATGACACCCCTCTTAATGTGCTGCTGGACACCGGAGCCGACACCAGCGTTCTCACTA 1560 1S60 CTGCACATTATAATAGGTTAAAATATAGAGGGAGAAAATATCAAGGGACGGGAATAATAG ctgctcaceataacagactgaaatacagaggaaggaaataccagggcacaggcatcatcg 1620 1620 gagtgggaggaaatgtggaaacattttctacgcctgtgactataaagaaaaagggtagac gcgttggaggcaacgtcgaaaccttttccactcctgtcaccatcaaaaagaaggggagac 1680 1680 acattaagacaagaatgctagtggcagatattccagtgactattttgggacgagatattc acattaaaaccagaatgctggtcgccgacatccccgtcaccatccttggcagagacattc 1740 1740 ttcaggacttaogtgcaaaattggttttggcacagctctccaaggaaataaaatttagaa tccaggacctgggcgctaaactcgtgctggcacaactgtctaaggaaatcaagttccgca 1800 1800 WT aaatagagttaaaagagggcacaatggggccaaaaattcctcaatggccactcactaagg CO agatcgagctgaaagagggcacaatgggtccaaaaatcccccagtggcccctgaccaaag 1860 1860 WT CO agaaactagaaggggccaaagagatagtccaaagactattgtcagagggaaaaatatcag AGAAGCTTGAGGGCGCTAAGGAAATCGTGCAGCGCCTGCTTTCTGAGGGGAAGATTAGCG 1920 1920 WT CO AAGCTAGTGACAATAATCCTTATAATTCACCCATATTTGTAATAAAAAAGAGGTCTGGCA AGGCCAGCGACAATAACCCTTACAACAGCCCCATCTTTGTGATTAAGAAAAGGAGCGGCA 1980 1980 15/59 AATGGAGGTTATTACAAGATCTGAGAGAATTAAACAAAACAGTACAAGTAGGAACGGAAA aatggagactcctgcaggacctgagggaactcaacaagaccgtccaggtcggaactgaca 2040 2040 tatccagaggattgcctcacccgggaggattaattaaatgtaaacacatgactgtattag tctctcgcggactgcctcaccccggcggcctgattaaatgcaagcacatgacagtccttg 2100 2100 atattggagatgcatatttcactatacccttagatccagagtttagaccatatacagctt ACATTGGAGACGCTTATTTTACCATCCCCCTCGATCCTGAATTTCGCCCCTATACTGCTT 2160 2160 TCACTATTCCCTCCATTAATCATCAAGAACCAGATAAAAGATATGTGTGGAAATGTTTAC TTACCATCCCCAGCATCAATCACCAGGAGCCCGATAAAOGCTATGTGTGGAAGTGCerCC 2220 2220 CACAAGGATTCGTGTTGAGCCCATATATATATCAGAAAACATTACAGGAAATTTTACAAC CCCAGGGATTTGTGCTTAGCCCCTACATTTACCAGPAGACACTTCAftGTiGATCCrCCAAC 2280 2280 CTTTTAGGGAAAGATATCCTGAAGTACAATTGTATCAATATATGGATGATTTGTTCATGG CTTTCCGCGAAAGATACCCAGAGGTTCAACTCTACCAATATATGGACGACCTGTTCATGG 2340 2340 GAAGTAATGGTTCTAAAAAACAACACAAAGAGTTAArCATAGAATTAAGGGCGATCTTAC GGTCCAACGGGTCTAAGAAGCAGCACAAGGAACTCATCATCGAACTGAGGGCAATCCTCC 2400 2400 TGGAAAAGGGTTrTGAGACACCAGATGATAAATTACAAGAAGTGCCACCTTATAGCTGGC TGGAGAAAGGCTTCGAGACACCCGACGACAAGCTGCAAGAAGTTCCTCCATATAGCTGGC 2460 2460 WT TAGGTTATCAACTTTGTCCTGAAAATTGGAAAGTACAAAAAATGCAATTAGACATGGTAA CO TGGGCTACCAOCTTTGCCCTGAAAAcrGGAAAGTCCAGAAGATGCAGTTGGATATGGTCA 2S20 2520 HT AGAATCCAACCCTTAATGATGTGCAAAAATTAATGGGGAATATAACATGGATGAGCTCAG CO AGAACCCAACACTGAACGACGTCCAGAAGCTCAXGGGCAATATTACCTGGATGAGCTCCG 2580 2580 wr GGATCCCAGGGTTGACAGTAAAACACATTGCAGCTACTACTAAGGGATGTTTAGAGTTGA CO GAATCCCTGGGCTTACCGTTAAGCACATTGCCGCAACTACAAAAGGATGCCTGGAGTTGA 2640 2640 HT ATCAAAAAGTAATTTGGACGGAAGAGGCACAAAAAGAGTTAGAAGAAAATAATGAGAAGA CO ACCAGAAGGTCATTTGGACAGAGGAAGCTCASAAGGAACTGGAGGAGAATAATGAAAAGA 2700 2700 HT TTAAAAATGCTCAAGGGTTACAATATTATAATCCAGAAGAAGAAATGTTATGTGAGGTTG CO TTAAGAATGCTCAAGGGCTCCAATACTACAATCCCGAAGAAGAAATGTTGTGCGAGGTCG 2760 2760 HT AAATTACAAAAAATTATGAGGCAACTTATGTTATAAAACAATCACAAGGAATCCTATGGG CO AAATCACTAAGAACTACGAAGCCACCTATGTCATCAAACAGTCCCAAGGCATCTTGTGGG 2820 2820 HT caggtaaaaagattatgaaggctaataagggatggtcaacagtaaaaaatttaatgttat CO CCGGAAAGAAAATCATGAAGGCCAACAAAGGCTGGTCCACCGTTAAAAATCTGATGCTCC 2880 2880 HT TGTTGCAACATGTGGCAACAGAAAGTATTACTAGAGTAGGAAAATGTCCAACGTTTAAGG CO TGCTCCAGCACGTCGCCACCGAGTCTATCACCCGCGTCGGCAAGTGCCCCACCTTCAAAG 2940 2940 WT TACCATTTACCAAAGAGCAAGTAATGTGGGAAATGCAAAAAGGATGGTATTATTCTTGGC CO TTCCCTTCACTAAGGAGCAGGTGATGTGGGAGATGCAAAAAGGCTGGTACTACTCTTGGC 3000 3000 16/59 WT TCCCAGAAATAGTATATACACATCAAGTAGTTCATGATGATTGGAGAATGAAATTGGTAG CO TTCCCGAGATCGTCTACACCCACCAAGTGGTGCACGACGACTGGAGAATGAAGCTTGTCG 3060 3060 WT aagaacctacatcaggaataacaatatacactgatgggggaaaacaaaatggagaaggaa CO AGGAGCCCACTAGCGGAATTACAATCTATACCGACGGCGGAAAGCAAAACGGAGAGGGAA 3120 3120 WT tagcagcttatgtgaccagtaatgggagaactaaacagaaaaggttaggacctgtcactc CO tcgctgcatacgtcacatctaacggccgcaccaagcaaaagaggctcggccctgtcactc 3180 3180 WT ATCAAGTTGCTGAAAGAATGGCAATACAAATGGCATTAGAGGATACCAGAGATAAACAAG CO ACCAGGTGGCTGAGAGGATGGCTATCCAGATGGCCCTTGAGGACACTAGAGACAAGCAGG 3240 3240 WT TAAATATAGTAACTGATAGTTATTATTGTTGGAAAAATATTACAGAAGGATTAGGTTTAG CO TGAACATTGTGACTGACAGCTACTACTGCTGGAAAAACATCACAGAGGGCCTTGGCCTGG 3300 3300 WT AAGGACCACAAAGTCCTTGGTGGCCTATAATACAAAATATACGAGAAAAAGAGATAGTTT CO AGGGACCCCAGTCTCCCTGGTGGCCTATCATCCAGAATATCCGCGAAAAGOAAATTGTCT 3360 3360 WT ATTTTGCTTGGGTACCTGGTCACAAAGGGATATATGGTAATCAATTGGCAGATGAAGCCG 00 ATTTCGCCTGGGTGCCTGGACACAAAGGAATTTACGGCAACCAACTCGCCGATGAAGCCG 3420 3420 WT caaaaataaaagaagaaatcatgctagcataccaaggcacacaaattaaagagaaaagag CO CCAAAATTAAAGAGGAAATCATGCTTGCCTACCAGGGCACACAGATTAAGGAGAAGAGAG 3480 3480 WT ATGAAGATGCAGGGTTTGACTTATGTGTTCCTTATGACATCATGATACCTGTATCTGACA CO ACGAGGACOCTGGCTTTGACCTGTGTGTGCCATACGACATCATGATTCCCGTTAGCaACA 3540 3540 WT CAAAAATCATACCCACAGATGTAAAAATTCAAGTTCCTCCTAATAGCTTTGGATGGGTCA CO CAAAGATCATTCCAACCGATGTCAAGATCCAGGTGCCACCCAATTCATTTGGTTGGGTGA 3600 3600 WT CTGGGAAATCATCAATGGCAAAACAGGGGTTATTAATTAATGGAGGAATAATTGATGAAG CO CCGGAAAGTCCAG CATGGCTAAGCAGGGTCTTCTGATTAACGGGGGAATCATTGATGAAG 3660 3660 WT GATATACAGGAGAAATACAAGTGATATGTACTAATATTGGAAAAAGTAATATTAAATTAA CO GATACACCGGCGAAATCCAGGTGATCTGCACAAATATCGGCAAAAGCAATATTAAGCTTA 3720 3720 WT TAGAGGGACAAAAATTTGCACAATTAATTATACTACAGCATCACTCAAATTCCAGACAGC CO TCGAAGGGCAGAAGTTCGCTCAACTCATCATCCTCCAGCACCACAGCAATTCAAGACAAC 3780 3780 WT CTTGGGATGAAAATAAAATATCTCAGAGAGGGGATAAAGGATTTGGAAGTACAGGAGTAT CO CTTGGGACGAAAACAAGATTAGCCAGAGAGGTOACAAGGGCTTCGGCAGCACAGGTGTGT 3840 3840 WT TCTGGGTAGAAAATATTCAGGAAGCACAAGATGAACATGAGAATTGGCATACATCACCAA CO TCTGGGTGGAGAACATCCAGGAAGCACAGGACGAGCACGAGAATTGGCACACCTCCCCTA 3900 3900 WT AGATATTGGCAAGAAATTATAAGATACCATTGACTGTAGCAAAACAGATAACTCAAGAAT CO AGATTTTGGCCCGCAATTACAAGATCCCACTGACTGTGGCTAAGCAGATCACACAGGAAT 3960 3960 WT GTCCTCATTGCACTAAGCAAGGATCAGGACCTGCAGGTTGTGTCATGAGATCTCCTAATC CO GCCCCCACTGCACCAAACAAGGTTCTGGCCCCGCCGGCTGCGTGATGAGGTCCCCCAATC 4020 4020 ATTGGCAGGCAGATTGCACACATTTGGACAATAAGATAATATTGACTTTTGTAGAGTCAA 4080 ACTGGCAGGCAGATTGCACCCACCTCGACAACAAAATTATCCTGACCTTCGTGGAGAGCA 4080 ATTCAGGATACATACATGCTACATTATTGTCAAAAGAAAATGCATTATGTACTTCATTGG ATTCCGGCTACATCCACGCAACACTCCTCTCCAAGGAAAATGCATTGTGCACCTCCCTCG 4140 4140 CTATTTTAGAATGGGCAAGATTGTTTTCACCAAAGTCCTTACACACAGATAACGGCACTA CAATTCTGGAATGGGCCAGGCTGTTCTCTCCAAAATCCCTGCACACCGACAACGGCACCA 4200 4200 ATTTTGTGGCAGAACCAGTTGTAAATTTGTTGAAGTTCCTAAAGATAGCACATACCACAG ACTTTGTGGCTGAACCTGTGGTGAATCTGCTGAAGTTCCTGAAAATCGCCCACACCACTG 4260 4260 gaataccatatcatccagaaagtcagggtattgtagaaagggcaaataggaccttgaaag GCATTCCCTATCACCCTGAAAGCCAGGGCATTGTCGAGAGGGCCAACAGAACTCTGAAAG 4320 4320 AGAAGATTCAAAGTCATAGAGACAACACTCAAACACTGGAGGCAGCTTTACAACTTGCTC AAAAGATCCAATCTCACAGAGACAATACACAGACATTGGAGGCCGCACTTCAGCTCGCCC 4380 4380 TCATTACTTGTAACAAAGGGAGGGAAAGTATGGGAGGACAGACACCATGGGAAGTATTTA TTATCACCTGCAACAAAGGAAGAGAAAGCATGGGCGGCCAGACCCCCTGGGAGGTCTTCA 4440 4440 TCACTAATCAAGCACAAGTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAArCCTCCA TCACTAACCAGGCCCAGGTCATCCATGAAAAGCTGCTCTTGCAGCAGGCCCAGTCCTCCA 4500 4500 AAAAATTTTGTTTTTACAAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTAGGGTGC AAAAGTTCTGCTTTTATAAGATCCCCGGTGAGCACGACTGGAAAGGTCCTACAAGAGTTT 4560 4560 TGTGGAAGGGTGATGGTGCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTGCTGTAC TGTGGAAAGGAGACGGCGCAGTTGTGGTGAACGATGAGGGCAAGGGGATCATCGCTGTGC 4620 4620 CATTAACCAGGACTAAGTTACTAATAAAACCAAATTGA CCCTGACACGCACCAAGCTTCTCATCAAGCCAAACrGA 4658 4658 18/59

19/59 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 I I I I. I. 175 83 62 47.5 ι V""· >.:<i .·>' Μ'τ Λ·» m-

p66(RT) p51(RT), Pr55Gag p31(IN) raÁV. •Γν·^ 1-.:. 32.5 ' “ ' --1 Ο '

PrSSGag p41 Actina FIGURA 11 20/59 lt 2t 3t 4t St 6t 7t

lc 2c 3c 4c 5c 6c 7c 8c 9c 10c

4-Wt gag-pol ◄-syngp Intensidade do sinal de gagpol, normalizada (unidades arbitrárias) FIGURA 12 21/59 A B syngplacz syngpgag syngp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Pr55Gag(+p51,p66 p41 p31(IN) p!7(MA) Actina FIGURA 13 22/59 pSYÍNô CMVp —Syn gp-UXJK2 gag-pA pSYN7 CMVp —Syn gp-HXB2 gag,r-pA pSYN8 CMVp Syn gp LacZ pA pSYN9 CMVp— HXB2 gag-Syn gp-pA pSYNIO CMVp —HXB2 gag-Syn gp-RRE- pA pSYNll CMVp —HXB2 gag,r-Syn gp-RRE-pA pSYN12 CMVp HXB2 sy^-AATG—Syn gp pA pSYN13 CMVp— —HXB2 »«g-fr.sh.-Syn gp- pA pSYN14 CMVp- ΓΙΧΒ2 gag-AATG—Syn gp -RRE-pA pSYN15 CMVp HXB2 gag 625-1503 Syn gp -pA pSYN17 CMVp HXB2 gag 1-625 Syn gp -pA FIGURA 23/59 A 1 2 3 4 5 6 7 B 1 2 3 4 5 6 7 8 91011 1213 gag-syngp syngp II f#l •Zw' gag-syngp - syngp-¾ \

FIGURA 15 24/59

1959 1837 1549 1565 1237 2040 1546 1365 2561 2389 2579 2020 β-gal/mg de proteína (ensaio luminescente) FIGURA 16 25/59 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

FIGURA 17 26/59

C. pH6nZ (15pg) + pGP-RRE3 (Spg) D. pHS3nZ (15pg) + pSYNGP (0.5pg)

FIGURA 18 27/59

FIGURA 19 28/59

Bpu11021 FIGURA 20 29/59 FIGURA 21 Quantidade de pH6nZ (pg) Proporção de plasmideo de expressão de gagpol para pH6nZ (pg/pg) Título, Título, Título, Título, pGP-KRE3 pSYNGP pSYNGP-RRE pSYNGP-EER 5 1:1 6x105 5x105 4x105 3 xlO5 12.5 1:2.5 8x105 6.5xl05 10 1:10 3x105 4x10S 5 1:20 3.5xlOs 2.5xl05 12.5 1:50 3.5x104 3x105 3xl05 3x105 18 1:180 2.5xl04 3xl05 30/59 FIGURA 22 Vector de expressão de Gag—pol Genoma de vector Expressão de Rev Titulo (IU/mL)* pGP-RRE3 pH6nZ Sim / de pH6Z 8.0+0.2 x 105 pGP-RRE3 pH6.1 nZ Não 2.1+0.3 x 103 pGP-RRE3 pHó.l nZ Sim / de pCMV-Rev 4.1+0.3 x 10“ pG P-RRE3 pH6.2nZ Não 1.7+0.4 x 103 pGP-RRE3 pH6.2nZ Sim / de pCMV-Rev 5.6+0.3 x 10“ pSYNGP pHónZ Sim / de pH6Z 7.8 + 0.2 x 105 pSYNGP pH 6.1 nZ Não 5.4+0.3 x 104 pSYNGP pH 6.1 nZ Sim / de pCMV-Rev 5.2 + 0.4 x 104 pSYNGP pH6.2nZ Não 5.0 + 0.2 x 104 pSYNGP pH6.2nZ Sim / de pCMV-Rev 5.5 + 0.3 x 104 31/59 FIGURA 23 Genoma de vector Comprimento de Gag (nt) Mutação SD pSYNGP pGP-RRE3 pGP-RRE + Rev * pH6nZ 625 Não 6.7+0.7 x 10s Não realizado Não realizado pHó.lnZ 625 Não 3.2+0.1 x 104 Não realizado Não realizado pH6.2nZ 527 Não 2.7+0.3 x 104 Não realizado Não realizado pHSlnZ 40 Não 2.1+0.4 x 104 2.1+0.9 x 103 1.4+0.3 x 104 pHS2nZ 260 Não 1.5+0.3 x 104 4.2+0.6 x 103 3.0+0.5 x 104 pHS3nZ 360 Não 1.3+0.3 x 105 6.5+0.7 x 103 1.7+0.4 x 105 pHS4nZ 625 Não 1.0+0.9 x 104 1.2+0.7 x 103 1.0+0.3 x 104 pHS5nZ 40 Sim 2.0+0.5 x 104 6.0+0.8 x 102 2.3+0.5 x 104 pHSónZ 260 Sim 1.0+0.2 x 104 8.1+0.6 x 102 1.0+0.4 x 104 pHS7nZ 360 Sim 1.9+x 104 2.4+0.9 x 103 4.2+0.8 x 104 pHSSnZ 625 Sim 8.0+1.0 x 103 1.0+0.5 x 103 4.0+0.9 x 103 32/59 FIGURA 24 Genoma de pSYNGP PSYNGP vector + Rev * pH 6nZ 6.5 x 10s 6.9 x IO5 pH6.1 nZ 1.5 x 104 i.7 x :o4 pHó.lnZR 2.3 x 103 1.6 x 105 pHSlnZ 8.5 x 103 8.4 x IO3 pHSlnZR 8.1 x 103 8.8 x IO4 pH S3nZ 1.2 x 1 O5 1.4 x 10s pHS3nZR 2.5 x IO3 4.8 x 10s pHS7nZ 7.3 x 103 7.0 x IO3 pH S7nZR 3.4 x IO3 5.8 x IO3 33/59 FIGURA 25 HORSE 3.1 PONY3.1 pONY3.2T 3.2 OPTI pESYNGP pESYNGPRRE pEV53B 3.2 OPTI-lhyg

34/59 FIGURA 26 Transferência de Western de extractos de > > > > tu Ui UJ UJ DL 0£ oc cé Ui UI UJ LU 0 O o O 0 O o c c c c c O O z 0) φζ õõõuõoõõ aaaaaaaa

s> a. uj ui DL £ £ w οοαιοουοου ααααααααα m m ω OL DL DL ui tu Ui o o o o o o ®α>α>α)οα>φφ çccçcccc anti-soros policlonais de um cavalo infectado 35/59

FIGURA 27 36/59

SgrAI 37/59

38/59

FIGURA 30 39/59 .Bglll

Bst1107l FIGURA 31 40/59

FIGURA 32 41/59

Bbel Ehel Kasl Narl EcoO109l PpuMI FIGURA 33 42/59

FIGURA 34 43/59

FIGURA 35 44/59

FIGURA 36 45/59 TU/ml 1 TU/ml 2 Média Genoma Outro FIGURA 37 GAG-POL pONY3.1 pONY4.0Z Nenhum pESYNGP pONY4.0Z Nenhum pHORSE3.1 pONY4.0Z pCIneo pHORSE3.1 pONY4.0Z pCIneoREV pONY3.1 pONYS.OZ Nenhum pESYNGP pONY8.0Z Nenhum pESYNGP pONY8.0Z pCIneo pESYNGP pONYS.OZ pCIneoREV pHORSE3.1 pONYS.OZ pCIneo PHORSE3.1 ρΟΝΥβ.ΟΖ pCIneoREV 1.84E+06 2.50E+06 2.01E+06 9.00E+05 1.04E+06 9.67E+05 8.80E+04 1.26E+05 1.07E+05 1.48E+05 1.42E+05 1.45E+05 1.66E+06 1.48E+06 1.6IE+06 2.06E+05 1.10E+05 1.9IE+05 4.00E+04 3.40E+04 2.93E+04 6.40E+04 8.20E+04 6.47E+04 2.00E+03 2.00E+03 2.00E+03 1.80E+05 2.48E+05 2.14E+05 46/59 FIGURA 38

47/59 FIGURA 39 GAG/POL OUTRO Actividade de RT pONY3.1 pCIneo 87557.9 pONY3.1 pCIneoREV 147061.5 pESYNGP pCIneo 45701.3 pESYNGP pCIneoREV 63610.2 L pESYNGP pCIneo 91729.9 L pESYNGP pCIneoREV 88487.9 L pESYNGPREE pCIneo 71873.4 L pESYNGPRRE pCIneoREV 101010.7 pESYNGPRRE pCIneo 32823.1 pESYNGPRRE pCIneoREV 44863.4 Células 293T não transfectadas NA 1024.6 Sem Células NA 1330.6 48/59 FIGURA 40 160000 tf 140000 % 120000 ω 100000 I 80000 I 60000 Tj 40000 § 20000 0 Actividade de RT

EípCIneo BpCIneoREV s Ω 4

Construções de gag/pol ε (U OT 49/59 FIGURA 41 VECTOR GAG/POL OUTRO título/mL 1 título/mL 2 Média ρΟΝΥδ.ΟΖ PONY3.1 pCIneo 3.20E+05 2.68E+05 2.94E+05 ρΟΝΥδ.ΟΖ PONY3.1 pCIneoREV 3.00E+05 5.00E+05 4.00E+05 ρΟΝΥδ.ΟΖ pESYNGP pCIneo 4.00E+04 5.60E+04 4.80E+04 ρΟΝΥδ.ΟΖ pESYNGP pCIneoREV 2.22E+05 2.40E+05 2.3IE+05 ρΟΝΥδ.ΟΖ L pESYNGP pCIneo 6.00E+04 6.60E+04 6.30E+04 ρΟΝΥδ.ΟΖ L pESYNGP pCIneoREV 2.S0E+05 2.70E+05 2.75E+05 ρΟΝΥδ.ΟΖ L pESYNGPRRE pCIneo 9.20E+04 6.60E+04 7.90E+04 ρΟΝΥδ.ΟΖ L pESYNGPRRE pCIneoREV 3.68E+05 2.82E+05 3.25E+05 ρΟΝΥδ.ΟΖ pESYNGPRRE pCIneo 3.20E+04 1.40E+04 2.30E+04 ρΟΝΥδ.ΟΖ pESYNGPRRE pCIneoREV 1.20E+05 1.40E+05 1.30E+05 50/59 FIGURA 42 GAG/POL VECTOR OUTRO título/mL 1 PONY3.1 PONY8.0Z pCIneo 1.2E+06 PONY3.1 PONY8.0Z pCIneoERev 1.0E+06 PONY3.1 pONY8.1Z pCIneo 1.0E+05 PONY3.1 pONY8.1Z pCIneoERev 8.0E+05 pESYNGP PONY8.0Z pCIneo 2.3E+05 pESYNGP PONY8.0Z pCIneoRev 1.0E+05 pESYNGP PONY8.1Z pCIneo 1.0E+04 pESYNGP PONY8.1Z pCIneoRev 5.1E+04 51/59 FIGURA 43 Comparação de pONY3.1 (nt 1246-1606) (TOPO) e pONY3.2opti (nt 366-726) (BAIXO) atgggagaccctttgacatggagcaaggcgctcaagaagttagagaaggtgacggtacaa .....e..t..cc.c..c...tc...a..c..g..a..ac.g..a..a..c..c..t..g gggtctcagaaattaactactggtaactgtaattgggcgctaagtctagtagacttattt ..tagc..a..gc.t..c..a..c..t..c..c.....at.gtcc..g..g..tc.t..c catgataccaactttgtaaaagaaaaggactggcagctgagggatgtcattccattgctg ..c..c..t..t..c..t..g..g..a..t.....a..c..a..c..g..c..cc.ct.. gaagatgtaactcagacgctgtcaggacaagaaagagaggcctttgaaagaacatggtgg ..g..c..g..c..a..at....t..g..g..gc.c..a..t..c..gc.c..c...... gcaatttctgctgtaaagatgggcctccagattaataatgtagtagatggaaaggcatca ..c..cagc..a..c..a.....g..g..a..c..c..c..g..t..c..t..a..tagc ttccagctcctaagagcgaaatatgaaaagaagactgctaataaaaagcagtctgagccc ..t..a..g..cc.c..t..g..c..g..a..a..c..c..c..g..a..a..c..a..t tctgaagaatatccaatcatgatag age..g..g..c............. 52/59 FIGURA 44 pIRESIhyg ESYNGP

53/59 FIGURA 45 linha celular valor Ct Ct Unha celular CfcpCNYgG transiente Q3.29 (3 x IO6 células) 17.4 -2.9 8Z.20 (24 h após indução) 14.35 -6.08 8Z.20 (48 h após indução) 14.81 -5.62 8Z.20 (72 h após indução) 16.19 -4.24 PONY8G 20.43 - 54/59 FIGURA 46 massa de plasmídeo transfectado (μg)/placa de diâmetro de 10 cm título em células D17 (unidades de formação de LacZ/mL) número de transfecção pESYNGP PONY8.3G pONYS.OZ _ pESYNREV pRV67 i—-- | pCIneo Ia recolha 2a recolha 1 16ug 16 8 1.4x10i 1.6 x 10s 2 16 8 16 1Í4 x 1Õ5 1.6 x 10b 3 16 8 1.4 x105 2.6 x 10s 4 32 8 2.8x106 1.1 x 106 5 16 8 8 2.4x101 2.8 x 10s 6 32 8 8 4.5 x 10ô 1.1 x 10B 55/59 FIGURA 47 Actividade de RT CPM/10

1 0 0 0 0 4 0 0 0 0 Ie S V N G P 30000 “ 20000 _

0 2 5 0 0 0 2 0 0 0 0 1 5 0 0 0 1 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 E S Y N G P 63-CZW 0 1 0 Fracção de Gradiente (1 mL/fracção) 56/59 FIGURA 48 SONDA DE GAL-POL B M T WT

G3-CZW +

SONDA DE LACZ WT

SYN-GP

57/59 FIGURA 49 m (0 H 3 O Ή +J H n> A

□ pCIneo BI pESYNREV 100000000 10000000 1000000 100000 10000 58/59 FIGURA 50

59/59 FIGURA 51