CN108130333A - 重组脊髓灰质炎ⅰ型病毒样颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类密码子优化的编码I型野生型脊髓灰质炎病毒外壳前体蛋白的基因以及编码I型减毒脊髓灰质炎病毒3CD蛋白的基因，前述基因在被转入酵母细胞后利用共表达可高效地胞内自发组装成VLP颗粒。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子，其主要由前述基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了前述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。

Description

重组脊髓灰质炎I型病毒样颗粒

技术领域

本发明涉一种新的毕赤酵母表达系统，其可用于生产脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒。

背景技术

脊髓灰质炎是一种急性传染病，由脊髓灰质炎病毒引起，主要通过消化道传播。病毒常侵犯中枢神经系统，损害脊髓前角运动神经细胞，导致肢体松弛性麻痹，多见于儿童，又名小儿麻痹症。部分小孩得病后可以自行痊愈，但多数小孩患病后会出现下肢肌肉萎缩、畸形，结果引起终身残疾，多为跛行甚至根本不能站立、行走。目前针对这种疾病尚无有效的治疗方法，只能通过疫苗预防。

截止到2005年，全球范围内仍有6个国家存在脊灰野病毒的流行，其中与中国接壤的有3个，印度尼西亚、也门等一些已经消灭脊灰的国家相继发生了输入性脊灰野病毒传播，造成局部地区脊灰重新暴发流行。自2004年以来此类输入事件已在全球18个无脊灰国家重演。一旦条件适宜，脊灰野病毒仍可能卷土重来。2000年10月，世界卫生组织西太平洋地区宣布成为无脊髓灰质炎区域，标志着中国已达到无脊髓灰质炎目标。但这三个存在野毒株的邻国对中国构成输入性威胁，使我国的维持无脊灰工作面临严峻挑战。

口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral polio vaccine，OPV)在1958年研制成功在美国上市，后来推广至全球。OPV的接种简单(口服)、费用低、可产生稳定的肠道粘膜免疫、有效阻断脊灰病毒传播等。OPV的推广使脊髓灰质炎疫情得到了有效的控制，全球的小儿麻痹症发病率逐年下降。但每服用250万剂-1000万剂OPV，可能发生1例疫苗相关病例，包括疫苗相关麻痹型脊灰(Vaccine associated paralytic poliomyelitis，VAPP)病例，疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus，VDPV)及其所引起的疫苗衍生脊灰病毒的循环(Circulating vaccine-derived polioviruses，cVDPVs)和免疫缺陷疫苗衍生脊灰病毒(Immunodeficient related vaccine-derived poliovirus，iVDPV)病例。

IPV是通过用甲醛灭活的脊灰毒株生产的传统灭活疫苗(Conventionalinactivated poliovirus vaccine，cIPV)。国外研发的IPV使用野毒株灭活，其免疫原性和安全性都很理想，能有效预防脊灰爆发，并且IPV不存在引起VAPP、cVDPVs等风险，其群体免疫优于OPV。但是对技术及生产要求较高，价格昂贵。2015年我国上市的自主研发的IPV使用减毒株灭活，也同样具有很好的免疫原性及安全性。随着全世界消灭脊灰目标的推进，将会更加严格管理脊灰毒株，包括弱毒株及野毒株。所以新一代脊髓灰质炎疫苗的开发迫在眉睫。

脊髓灰质炎病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enteroviruse)，直径20～30nm，立体对称12面体。病毒颗粒中心为单股正链RNA，核衣壳体裸露无囊膜。脊髓灰质炎病毒基因组RNA长约7.5kb。基因组分为5′端非编码区、多聚蛋白编码区、3′端非编码区和3′端Poly(A)尾四部分。其中多聚蛋白编码区编码产生一个多聚蛋白前体，分为P1、P2和P3区；P1区可经蛋白酶水解产生衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，P2和P3区则可水解产生蛋白酶、RNA复制酶及用于识别细胞、调节基因的其他蛋白。核衣壳含4种结构蛋白VP1、VP3和由VP0分裂而成的VP2和VP4。VP1为主要的外露蛋白至少含2个表位(epitope)，可诱导中和抗体的产生，VP1对人体细胞膜上受体有特殊亲和力，与病毒的致病性和毒性有关。VP0分裂为VP2与VP4，为内在蛋白与RNA密切结合。VP2与VP3半暴露具抗原性。5个拷贝的VP1、VP2、VP3和VP4构成了五聚体，12个五聚体构成二十面体核壳。

很多病毒的病毒结构蛋白重组表达后可以自发组装成病毒样颗粒(VLP)，大部分VLP的抗原性与真病毒没有区别，但缺少病毒核酸因而不具有感染性。VLP已经成为开放安全有效的病毒性疾病疫苗的一个有效策略，因此，开发脊髓灰质炎病毒的VLP是彻底消灭脊灰病毒的有效途径。

脊髓灰质炎病毒有三个血清型，即I型Mahoney、II型MEF-1、III型Saukett，各型之间无交叉免疫反应。2015年，WHO正式宣布II型毒株已在全球范围内彻底消灭。本申请的研究主要集中在I型脊灰VLP的开发。

发明内容

本发明的目的之一为：提供一种经过密码子优化的编码I型野生型脊髓灰质炎病毒(Polio 1)外壳前体蛋白(P1蛋白)的基因以及编码I型减毒脊髓灰质炎病毒(Sabin 1)3CD蛋白的基因。

本发明的第一个目的通过以下方法实现：首先，对天然Polio 1 P1蛋白及Sabin 13CD蛋白基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子，设计出全新的DNA序列；然后，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率的影响，避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行一定的修正，具体来说有以下修正：天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT；赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA；天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC；苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC；酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAT修正为TAT。但又不限于以上所列举的这些修正，以进一步提高目标蛋白的表达量，同时，对P1与3CD两种重组蛋白表达量也进行了特别调控，使得在共表达系统中P1蛋白的表达量高于3CD蛋白，便于3CD蛋白酶工作形成VLP。设计出两个全新的DNA序列，并合成经过修正的全新的DNA序列。

本发明所提供的密码子优化后Polio 1之P1蛋白的基因，其序列最优选地如SEQID NO：1所示。

本发明所提供的密码子优化后Sabin 1之3CD蛋白的基因，其序列最优选地如SEQID NO：2所示。

通过上述密码子优化后的DNA，可构建重组毕赤酵母表达载体及表达菌株，进而表达P1蛋白及3CD蛋白。P1蛋白经3CD酶切割后会在胞内自发组装成VLP颗粒。

本发明的另一目的为：提供一种表达上述密码子优化后基因的毕赤酵母表达载体。

具体方式为：分别将密码子优化后Polio 1之P1蛋白的基因克隆到一毕赤酵母表达载体中，将编码脊髓灰质炎病毒3CD蛋白的基因克隆到另一毕赤酵母表达载体中。

更具体的方式为：将密码子优化后Polio 1之P1蛋白的基因以及Sabin 1之3CD蛋白的基因，分别克隆至毕赤酵母表达载体中，所用的表达载体包括pPICZ、pPIC6、pGAPZ、pAO815、pPIC9k。例如，将优化后的P1蛋白的基因进行人工合成，连接到毕赤酵母表达载体pPICZa B中，得到Polio 1 P1蛋白的表达载体pPICZ-Polio 1 P1，将优化后的3CD蛋白的基因进行人工合成，连接到毕赤酵母表达载体pPIC 9K中，得到3CD蛋白的表达载体pPIC 9K-Sabin 1 3CD。

本发明的又一目的为：提供一种表共达上述密码子优化后基因的毕赤酵母表达菌株。

具体方式为：通过同源重组及筛选构建表达3CD基因的重组毕赤酵母表达菌株，再以此重组菌作为宿主，通过同源重组及筛选P1基因和3CD基因共表达的重组毕赤酵母表达菌株。

更具体的方式为：将含3CD基因的表达载体(例如pPIC 9K-Sabin 1 3CD)转化毕赤酵母宿主菌株，通过筛选获得3CD重组毕赤酵母工程菌，转化方法可用电转化或脂质体转化，所用的宿主酵母菌包括毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168、X33等菌株，筛选方式可为组氨酸缺陷型的筛选。将含P1基因的表达载体(例如pPICZ-Polio 1 P1)转化至上述重组菌，通过筛选获得3CD基因与P1基因共表达的重组毕赤酵母工程菌，转化方法可用电转化或脂质体转化，筛选方式可为高浓度抗生素的筛选。通过该方法，诱导表达P1蛋白与3CD蛋白，并可在胞内形成病毒样颗粒。

本发明的又一目的为：提供一种表达上述密码子优化后基因的毕赤酵母表达菌株的构建方法，包括以下步骤：

A、设计并合成密码子优化的3CD基因及P1基因；

B、构建3CD基因的毕赤酵母表达载体以及P1基因的毕赤酵母表达载体；

C、构建P1蛋白与3CD蛋白共表达的毕赤酵母表达菌株。

更具体地，上述步骤A包括：对天然Polio 1 P1蛋白及Sabin 1 3CD蛋白基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子，设计出全新的DNA序列；然后，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率的影响，避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行一定的修正，具体来说有以下修正：天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT；赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA；天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC；苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC；酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAT修正为TAT。但又不限于以上所列举的这些修正，以进一步提高目标蛋白的表达量，设计出两个全新的DNA序列，并合成经过修正的全新的DNA序列。本发明所提供的密码子优化后Polio 1之P1蛋白的基因，其序列最优选地如SEQ ID NO：1所示。本发明所提供的密码子优化后Sabin 1之3CD蛋白的基因，其序列最优选地如SEQ ID NO：2所示。通过对序列的优化，一方面，P1与3CD基因可适应毕赤酵母表达系统，达到高效表达的目的，另一方面，P1与3CD两种重组蛋白表达量也进行了特别调控，使得在共表达系统中P1蛋白的表达量高于3CD蛋白，便于3CD蛋白酶工作形成VLP。

更具体地，上述步骤B包括：将密码子优化后Polio 1之P1蛋白的基因以及Sabin 1之3CD蛋白的基因，分别克隆至毕赤酵母表达载体中，所用的表达载体包括pPICZ、pPIC6、pGAPZ、pAO815、pPIC9k。例如，将优化后的P1蛋白的基因进行人工合成，连接到毕赤酵母表达载体pPICZa B中，得到Polio 1 P1蛋白的表达载体pPICZ-Polio 1 P1，将优化后的3CD蛋白的基因进行人工合成，连接到毕赤酵母表达载体pPIC 9K中，得到3CD蛋白的表达载体pPIC 9K-Sabin 1 3CD。

更具体地，上述步骤C包括：将含3CD基因的表达载体(例如pPIC 9K-Sabin 1 3CD)转化毕赤酵母宿主菌株，通过筛选获得3CD重组毕赤酵母工程菌，转化方法可用电转化或脂质体转化，所用的宿主酵母菌包括毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168、X33等菌株，筛选方式可为组氨酸缺陷型的筛选。将合P1基因的表达载体(例如pPICZ-Polio1 P1)转化至上述重组菌，通过筛选获得3CD基因与P1基因共表达的重组毕赤酵母工程菌，转化方法可用电转化或脂质体转化，筛选方式可为高浓度抗生素的筛选。诱导表达P1蛋白与3CD蛋白，并可在胞内形成病毒样颗粒。

本发明具有以下优点：

1.经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求，需要特别说明的是，本申请密码子优化的方法和一般文献中公开的方法存在不同，本申请在一些关键位点上采用了次优密码子。在这些关键位点上的密码子替换避开了数个内含子识别序列和可能的转录因子的结合位点，并有利于mRNA结构的稳定。这种密码子优化后可以有以下两个优点：a，表达收获量高，具有明显的工业化优势；b，密码子优化时除了表达量外，还兼顾了mRNA的结构稳定性和翻译的完整性，使蛋白表达后更易正确折叠，体现在形成的VLP颗粒更加均匀，VLP颗粒的基本结构单元清晰可见，更加适合做成疫苗成品。

2.同时，由于采用酵母表达系统，因此成本低，产量高，且产品性质更加均一稳定。

附图说明

图1 Polio1 VLP与抗脊灰病毒I型免疫血清国家参考品反应的ED50图；

图2 Polio1 VLP电镜照片。

序列说明

SEQ ID NO：1：密码子优化后Polio 1之P1蛋白的基因；

SEQ ID NO：2：密码子优化后Sabin 1之3CD蛋白的基因。

具体实施方式

通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，温度以℃为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。除非另有说明，在下述各实施例中用到的限制性内切酶均购自New England Biolab公司。应当理解的是，除非另有说明，下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备。除非另有说明，所使用的培养基均为市售可得的常规培养基，本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见，在本文中有可能使用各种通用的缩写，本领域技术人员完全能够理解其含义。

实施例

实施例1：密码子优化设计

遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。毕赤酵母和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的，每个氨基酸都由一个以上的密码子编码，同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同的。毕赤酵母的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平，本发明人根据野生型的3CD蛋白及P1蛋白进行基因序列改造：对其所有的氨基酸基因全部采用使用频率最高和较高的密码子。Pichia酵母密码子使用频率见表1(参见http：//www，kazusa.or.jp/codon/)。然后在此基础上，又为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构影响翻译的效率和一些常用的酶切位点，本发明人对最高频率的密码子进行一定的修正，例如将一些天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT，赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA，天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC，苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC，酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT，甘氨酸(Gly)最高频率密码子GGT修正为GGA。改造后的基因序列不含有以下内含子识别序列及转录因子结合位点：ATGACTCAT和TGACTA(转录因子GCN4结合位点)；ATATAA(GAL4的结合位点)；TATTTAA(TBP结合位点)；TTAGTAA和TTACTAA(YAP1结合位点)；ATGACTAAT；ACTAATTAGG。

由此，本发明人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的核苷酸序列，按照所述的序列全合成了3CD基因及P1基因，将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中，通过同源重组及筛选构建重组毕赤酵母表达菌株；利用重组毕赤酵母进行发酵培养和甲醇诱导胞内表达P1蛋白及3CD蛋白。P1蛋白经3CD酶切割后会在胞内自发组装成病毒样颗粒(VLP)；破菌上清经过层析方法纯化后，得到自组装成病毒样颗粒。这些优化设计的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2所示。通过对序列的优化，一方面，P1与3CD基因可适应毕赤酵母表达系统，达到高效表达的目的，另一方面，P1与3CD两种重组蛋白表达量也进行了特别调控，使得在共表达系统中P1蛋白的表达量高于3CD蛋白，便于3CD蛋白酶工作形成VLP。

表1 Pichia酵母密码子表

实施例2：Sabin 1 3CD基因的合成以及3CD表达载体的构建

脊髓灰质炎病毒的P1蛋白经特异性的3CD酶切割后，可自组装成VLP结构，鉴于脊髓灰质炎病毒的3CD酶具有很高的同源性。本发明选用脊髓灰质炎减毒株sabin 1的3CD酶作为特异性的切割酶。

为了提高sabin 1 3CD蛋白在毕赤酵母中的表达水平，在进行sabin 1 3CD基因合成前，我们对sabin 1 3CD的基因进行了密码子偏好、mRNA二级结构、GC含量以及常用限制性酶切位点等的优化。我们采取在不改变氨基酸序列的前提下，对其所有的氨基酸优先采用毕赤酵母中使用频率最高的密码子，同时兼顾mRNA的GC比例以及mRNA的二级结构等，并避开一些常用的限制性酶切位点，设计出一个全新的DNA序列。

优化后的DNA序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，合成后的基因连接到载体pPIC9K中，获得Sabin 1 3CD pPIC9K。密码子优化后合成的sabin 1 3CD基因序列如SEQ IDNO：2所示。

实施例三：Polio 1 P1基因的合成及表达载体的构建

脊髓灰质炎I型P1基因选用野生型polio 1菌株Mahoney的P1基因，为了提高Polio1 P1蛋白在毕赤酵母中的表达水平，在进行Polio1 P1基因合成前，我们对Polio1 P1的基因进行了密码子偏好、mRNA二级结构、GC含量以及常用限制性酶切位点等的优化。我们采取在不改变氨基酸序列的前提下，对其所有的氨基酸优先采用毕赤酵母中使用频率最高的密码子，同时兼顾mRNA的GC比例以及mRNA的二级结构等，并避开一些常用的限制性酶切位点，设计出一个全新的DNA序列。

优化后的DNA序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，连接到载体pPICZa B中，得到Polio 1 P1的表达载体pPICZ-Polio 1 P1。密码子优化后合成的Polio 1 P1基因序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例四：Sabin 1 3CD毕赤酵母表达菌株的构建和筛选

脊髓灰质炎P1蛋白需要经3CD酶切后才能形成VLP颗粒，因此需要脊髓灰质炎的P1蛋白与3CD蛋白在同一宿主内共同表达。本发明采用先通过载体pPIC 9K载体将3CD基因导入毕赤酵母宿主菌基因组后，再在其基础上通过pPICZa B载体将脊髓灰质炎的P1基因整合到毕赤酵母宿主菌基因组上，实现脊髓灰质炎P1蛋白与3CD蛋白的共表达。

Sabin 1 3CD表达载体pPIC 9k-sabin 1 3CD经限制性内切酶SalI线性化后，使用QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit进行纯化，用10ul双蒸水溶解线性化的质粒片段，按分子克隆实验指南(第三版)的步骤电击转化毕赤酵母菌SMD1168(Invitrogen)。电转化条件为：DNA片段5微克，电压1500伏，电阻25欧姆，电击时间为5毫秒。电转化产物铺板于MD琼脂上，分离已转化细胞的单菌落，筛选表达sabin 1 3CD酶的重组菌株。

实施例五：Polio 1 P1 3CD毕赤酵母表达菌株的构建和筛选

为了提高重组质粒在酵母染色体上的整合效率，用Sac I限制性内切酶单酶切pPICZ-Polio 1 P1质粒使其线性化。线性化产物使用QIAGEN MinElute Gel ExtractionKit进行纯化，用10ul双蒸水溶解线性化的质粒片段，按分子克隆实验指南(第三版)的步骤电击转化毕赤酵母菌Sabin 1 3CD-SMD1168。

电转化条件为：DNA片段5微克，电压1500伏，电阻25欧姆，电击时间为5毫秒。电转化产物铺板于含1000ug/ml，1500ug/ml的零霉素(Zeocin)的YPDS琼脂上，在高浓度抗性平板上挑选单克隆，分别用4ml YPD液体培养基培养，24hr后换成BMMY培养基诱导基因表达，表达48hr后离心收获菌体。玻璃珠法破菌，ELISA检测各个菌株的表达量，筛选后获得Polio1 P1蛋白表达量较高的菌株Polio 1 P1 3CD SMD1168。

实施案例六：少量VLP样品的制备

取筛选得到的Polio 1重组菌株接种于500mlYPD培养基中，30℃，250rpm培养，24hr后换成500ml BMMY培养基诱导基因表达，表达48hr后，采用冷冻离心机对发酵液进行固液分离，离心转速8000rpm，离心10分钟。离心结束后弃上清，收集菌泥，收获的菌泥放在-20℃冰箱内冻存。

取10g发酵菌体，加入4℃预冷的破菌缓冲溶液(50mM citrate，0.1MNaCl，pH5.2)20ml，使用均质机，70Hz，震荡6min，破菌液10000rpm，30min，8℃，离心分离，收集离心后的上清液。

上清液使用poros 50Hs层析柱进行初步纯化。纯化条件如下：

A液：0.1M NaCl，50mM citrate，pH 5.2。

B液：1M NaCl，50mM citrate，pH 5.2。

平衡：使用B液将柱子洗平后，使用A液按1ml/min速度平衡柱子，2CV。

上样：破菌液上清，按1ml/min速度上样，收集流穿。

洗杂：使用A液冲洗杂质。

洗脱：使用B液洗脱，收集洗脱峰，即得纯化的病毒样颗粒蛋白样品。

再生：使用1M NaOH再生柱子。

需要说明的是，上述发酵及纯化方法仅为示例，而非对本申请的特别限制。

其他合适的发酵方法可为：筛选后获得的菌株接入活化培养基(YPD或BMGY、或SOC)，25～30℃培养过夜。将镜检合格的活化液离心后去掉培养基上清，按0.8～1.5OD/mL加入发酵培养基BMMY。发酵温度为25～30℃180～250rpm摇瓶发酵，每隔24小时补加0.5％的甲醇。发酵48H后离心，将收获的菌泥在-20℃冻存。

其他合适的纯化方法可为：取-20℃冷冻的表达目的蛋白的菌体，通过中性缓冲盐溶液或纯化水解冻并清洗菌体，去除其中的培养基成分(盐、色素等)，减少对后期纯化的影响。经过清洗后的菌体，使用适当的含有一定盐浓度和表面活性剂成分的破菌缓冲液混合：可使用的盐成分有NaCl、KCl等，浓度范围在0.1-0.8mol/l左右；可使用的表面活性剂有Tween-80、Tween-20、Triton 100等，浓度范围在0.005-0.05％(w/v)左右，可使用的缓冲系统有磷酸盐缓冲、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液等，使用浓度范围在0.02-0.2mol/l左右。混合后的菌体加入适量的玻璃珠，使用均质机，70Hz，震荡破菌，均质机选用玻璃珠直径0.2-0.4μm，震荡破菌3min可至破菌率>80％以上。将破碎后的破菌液通过高速离心的方法分离沉淀和上清，离心机的转速控制在6000-1000rpm(SORVALL、HITACHI等)，离心时间20-60分钟，收集上清用于后期纯化。

初步纯化选用阳离子柱poros 50HS，破菌上清上样前先使用平衡液平衡柱子。平衡液里一般含有适当浓度的NaCl及具有特定pH缓冲范围的buffer。柱子平衡好后将上述破菌上清液按1ml/min的速度上样，使用平衡buffer将部分杂质蛋白洗下。使用含高NaCl的洗脱液将蛋白洗下，得到经过初步纯化的polio 1 VLP样品。使用过的柱子使用1M NaOH再生。

实施案例七：ELISA鉴定病毒样颗粒

用PBS稀释纯化的脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白至适当浓度后，按照1∶3进行梯度稀释，取0.1ml稀释好的蛋白溶液加入酶标板中，4℃包被过夜。除去包被液，洗板。每孔加入0.3ml封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。除去包被液，每孔加入用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)以1∶1000稀释的血清标准品各0.1ml，于37℃保温1小时，除去血清液，洗板。然后向每孔加入用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)以1∶5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG(BIO-RAD，货号170-8241-MSDS，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP Conjugate)各0.1ml，37℃保温0.5小时后除去酶标液，洗板；然后向每孔中加入0.1ml DAB显色液，室温避光作用10分钟后加2M H₂5O₄0.05ml终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值，

纯化的Polio 1的病毒样颗粒蛋白样品经过ELISA检测，可与抗脊灰病毒I型免疫血清国家参考品发生反应，ED50曲线见图1，ED50值约为0.0473g/L。

实施案例八：电镜检测病毒样颗粒

将polio1的蛋白溶液置于200目碳覆盖的铜网上，加一滴2％的pH7.0的磷钨酸(PTA)，晾干后用透射电子显微镜(日本电子JEM 2011型)进行观察，图片的放大倍数为20000×，如图2所示，观察到样品中呈现病毒样颗粒，颗粒直径在30～40nm。

综上所述，本发明提供的3CD基因及P1基因是一种优化过的基因，具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，其能够自组装形成病毒样颗粒(VLPs)结构，纯化的Polio 1的病毒样颗粒蛋白样品经过ELISA检测，可与抗脊灰病毒I型免疫血清国家参考品发生反应，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此该方法具有以下优点：成本低，产量高，产品性质更加均一稳定。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海泽润生物科技有限公司

<120> 重组脊髓灰质炎Ⅰ型病毒样颗粒

<130> ZR1610002

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2649

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工合成密码子优化后Polio 1 之P1蛋白的基因

<400> 1

atgggtgctc aagtctcttc tcaaaaggtc ggtgctcacg agaactctaa cagagcttac 60

ggaggatcta ctatcaacta caccaccatt aactactaca gagattcagc ttctaacgct 120

gcttctaagc aagatttctc tcaagatcca tctaagttca ccgaaccaat taaggatgtc 180

ttgattaaga ccgctcctat gttgaactct ccaaacatcg aggcttgtgg atactctgat 240

agagtcttgc aattgactct tggaaactct actattacta cacaggaagc tgctaactct 300

gtcgtcgctt acggaagatg gccagaatac ttgagagatt ctgaagctaa cccagtcgat 360

caaccaaccg aaccagatgt cgctgcttgt agattctaca ctttggatac cgtctcatgg 420

acaaaggagt ccagaggatg gtggtggaag ttgccagatg ctttgagaga tatgggattg 480

ttcggacaaa acatgtacta tcattactta ggtagatcag gatacaccgt ccatgtccaa 540

tgtaacgctt ctaaattcca tcaaggagct ttgggagtct tcgctgtccc agaaatgtgt 600

ttggctggag attctaacac taccactatg catacctctt accaaaacgc taacccagga 660

gaaaagggag gaaccttcac cggaactttc actccagata ataaccaaac ctctcctgca 720

agaagattct gtccagtcga ttacttgtta ggtaacggaa ccttattggg aaacgctttc 780

gtcttcccac atcaaattat taacttgaga accaacaact gtgctacttt ggtcttgcca 840

tacgtcaact ctttgtctat tgattctatg gtcaagcata acaactgggg aattgctatt 900

ttgccattgg ctccattgaa cttcgcttct gaatcatctc cagaaattcc aattaccttg 960

accattgctc caatgtgttg tgagttcaac ggattgagaa acattactct tccaagattg 1020

cagggattgc cagtcatgaa caccccagga tctaaccaat acttgaccgc tgataacttc 1080

caatctccat gtgctttgcc agagttcgat gtcacccctc caattgatat tccaggagaa 1140

gtcaagaaca tgatggaatt ggctgaaatt gataccatga ttccattcga tttgtctgct 1200

actaagaaga acactatgga aatgtacaga gtcagattgt ctgataagcc acataccgat 1260

gatccaattt tgtgtttgtc tttgtctcca gcttctgatc caagattgtc tcataccatg 1320

ttgggagaaa ttttgaacta ctacacccat tgggcaggat ctttgaagtt caccttcttg 1380

ttctgtggat ttatgatggc taccggaaag ttgttggtct cttacgctcc acctggtgct 1440

gatccaccaa agaagagaaa ggaagctatg ttgggaaccc atgtcatctg ggatattgga 1500

ttgcaatctt cttgtactat ggtcgttcct tggatttcta acaccaccta cagacaaacc 1560

attgatgatt ctttcaccga aggaggatac atttctgtct tctaccaaac cagaattgtc 1620

gtcccattgt ctacccctag agaaatggac atcttgggat tcgtctctgc ttgtaacgat 1680

ttctctgtca gattgttgag agataccacc catattgaac aaaaggcttt ggctcaagga 1740

ttgggacaaa tgttggaatc tatgattgat aacaccgtca gagaaaccgt cggagctgct 1800

acttccagag atgctttgcc aaacaccgag gcttctggac caactcattc taaggaaatt 1860

ccagctttga ccgctgtcga aaccggagct accaatcctt tagtcccatc tgatactgtc 1920

caaaccagac atgtcgtcca acatagatca agatcagaat cttctattga atctttcttc 1980

gctagaggag cttgtgtcac tattatgacc gtcgataacc cagcttctac cactaacaag 2040

gataagttgt tcgctgtctg gaagattacc tacaaggata ccgttcaatt gagaagaaag 2100

ttggagttct tcacctattc aagattcgat atggagttga ccttcgtcgt caccgctaac 2160

ttcaccgaaa ccaacaacgg acatgctttg aaccaagtct accaaattat gtacgtccct 2220

ccaggtgcac ctgtccctga gaagtgggat gattacacct ggcaaacctc ttctaaccca 2280

tctattttct acacctacgg aaccgctcct gctagaattt ctgtcccata cgtcggaatt 2340

tctaacgctt actctcattt ctacgatgga ttctctaagg tcccattgaa ggatcaatct 2400

gctgctttgg gagattcttt gtacggagct gcttctttga acgatttcgg aattttggct 2460

gtcagagtcg tcaacgatca taacccaacc aaagtcacct ctaagattag agtctacttg 2520

aagccaaagc atattagagt ctggtgtcca agaccaccta gagcagtcgc ttactacgga 2580

ccaggtgttg attacaagga tggaaccttg actccattgt caactaagga tttgaccacc 2640

tactaatag 2649

<210> 2

<211> 1941

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工合成密码子优化后Sabin 1 之3CD蛋白的基因

<400> 2

atgggtcctg gtttcgatta cgctgtggct atggctaaaa gaaacatcgt cactgctact 60

acctctaaag gtgagttcac tatgttgggt gtccatgata atgtcgctat cttgcctact 120

catgcttctc ctggtgaatc tatcgtcatt gatggtaagg aagttgaaat cttggatgct 180

aaagcattgg aggatcaagc tggtactaac ttggaaatca ctattatcac tttgaagaga 240

aatgaaaaat tcagagatat cagacctcac attcctactc aaatcactga aactaatgat 300

ggtgtcttga tcgtcaatac ttctaagtac cctaatatgt acgttcctgt tggtgctgtc 360

actgagcaag gttacttgaa cttgggtggt agacaaactg ctagaacttt gatgtacaac 420

ttccctacta gagctggtca atgcggtgga gttatcactt gcactggtaa agtcatcggt 480

atgcacgttg gtggtaacgg ttctcatggt ttcgctgccg ctcttaagag atcatacttc 540

actcagtctc aaggtgaaat ccaatggatg agaccttcta aagaagttgg ttatccaatc 600

attaacgctc cttctaaaac taagttggaa ccttcagcct tccactacgt cttcgagggt 660

gtcaaagaac ctgctgtctt gaccaaaaac gatcctagat tgaaaactaa cttcgaggaa 720

gctatcttct ctaagtacgt cggtaacaag atcactgagg ttgatgaaca catgaaagaa 780

gctgttgatc actacgctgg tcagttgatg tctttggata tcaacactga acaaatgtgc 840

ttggaagatg ctatgtacgg tactgatgga ttggaggctt tagacttgtc tacttctgct 900

ggttaccctt acgttgctat gggtaagaag aaaagagata tcttgaacaa acaaactaga 960

gatactaaag agatgcaaaa gttgttggat acttacggta tcaacttgcc tttggtcact 1020

tacgtcaaag atgaattgag atcaaaaact aaagtcgaac aaggtaagtc aagattgatc 1080

gaggcttctt ctttgaacga ttctgtcgct atgagaatgg ctttcggtaa cttgtacgct 1140

gccttccaca aaaaccctgg tgtcatcact ggttctgctg ttggttgcga tcctgacttg 1200

ttctggtcta agatccctgt cttgatggaa gagaagttgt tcgccttcga ttacactggt 1260

tacgatgctt cattgtctcc tgcttggttc gaggctcttg aaatggtctt ggagaagatc 1320

ggtttcggtg atagagttga ttacattgat tatttgaacc actctcatca cttgtacaag 1380

aacaaaactt actgcgtcaa aggtggtatg ccttctggtt gctctggtac ttctatcttc 1440

aactctatga tcaacaactt gatcattaga accttgttgt tgaaaactta caaaggtatt 1500

gacttggatc acttgaaaat gatcgcttac ggtgatgatg tcatcgcttc ttaccctcat 1560

gaagttgatg cttctttgtt ggctcaatct ggtaaagatt acggtttgac aatgactcct 1620

gctgataaat ctgctatctt cgagactgtc acttgggaaa acgtcacctt cttgaagaga 1680

ttcttcagag ctgatgaaaa gtaccctttc ttgatccatc ctgtcatgcc tatgaaagaa 1740

atccatgagt ctatcagatg gactaaagat cctagaaaca ctcaagatca tgtcagatca 1800

ttgtgcttgt tggcttggca caacggtgaa gaagagtaca acaagttctt ggctaagatc 1860

agatcagttc ctatcggtag agctttgttg ttgcctgaat actctacttt gtacagaaga 1920

tggttggatt ctttctaata g 1941

Claims (10)

1.一种利用毕赤酵母表达系统制备重组脊髓灰质炎I型P1蛋白的方法，包括：

A、设计并合成密码子优化的3CD基因及P1基因；

B、构建3CD基因的毕赤酵母表达载体以及P1基因的毕赤酵母表达载体；

C、构建P1蛋白与3CD蛋白共表达的毕赤酵母表达菌株；

其中，所述密码子优化的P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述3CD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，所述毕赤酵母表达载体包括pPICZ、pPIC6、pGAPZ、pAO815、pPIC9k。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C中，所述的毕赤酵母菌株包括GS115、KM71、SMD1168、X33。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C包括将构建完成的毕赤酵母表达载体转化到毕赤酵母表达菌株的步骤。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的P1蛋白能在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒。

6.一种如SEQ ID NO：1所示的编码工型脊髓灰质炎P1蛋白的基因。

7.一种如SEQ ID NO：2所示的编码I型减毒脊髓灰质炎病毒3CD蛋白的基因。

8.一种毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述表达载体具有权利要求6中所述基因的序列。

9.一种毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述表达载体具有权利要求7中所述基因的序列。

10.一种表达权利要求6与7中所述基因编码的P1蛋白及3CD蛋白的毕赤酵母表达菌株。