CN104480143A - 一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法 - Google Patents
一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3三个基因中任一个基因位于启动子1下游；另外两个基因之间通过2A序列连接位于启动子2下游；2个启动子启动表达的方向相反。脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法为将前文所述的载体转染相应的宿主细胞，培养后可获得病毒样颗粒或者重组杆状病毒，若获得的是重组杆状病毒，再将该病毒感染宿主细胞，即可获得病毒样颗粒。本发明获得的脊髓灰质炎病毒样颗粒可以在体内分别诱导高效价的中和滴度，可作为防治脊髓灰质炎病毒感染相关疾病的疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物医药领域；涉及一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法。
背景技术
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒感染引起的以肢体麻痹为主的急性肠道传染病，主要影响五岁以下的儿童，脊髓灰质炎没有特效治疗方法，是全球性广泛传播的、危害极大的急性传染病，由于具有特异的病理变化，及脊髓前角灰白质细胞的损害，尤其在灰质区，故称脊髓灰质炎。临床特征为肌肉麻痹，特别是机体的弛缓性麻痹，多发生在5岁以下儿童，尤其是婴幼儿，故亦称小儿麻痹症(niafntelipaarylsis)，但其并非仅仅侵害幼儿，成年人中亦多有发生，主要是隐性感染，发生麻痹病例只占0.1%-1%。病毒侵犯脊髓前角运动神经元，造成弛缓性肌肉麻痹，病情轻重不一，轻者无瘫痪出现，严重者累及生命中枢而死亡。
脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）属于小 RNA 病毒科肠道病毒属，内含单股正链 RNA 基因，脊髓灰质炎病毒基因组 RNA 长约 7.5kb。基因组分为四个部分：5’端非编码区、多聚蛋白编码区、3’端非编码区和 3’端 Poly(A)尾。其中多聚蛋白编码区编码产生一个多聚蛋白前体，分为 P1、P2 和 P3 区，其中 P1区可经蛋白酶水解产生衣壳蛋白 VP1、VP2、VP3 和 VP4，P2 和 P3 区则可水解产生蛋白酶、RNA 复制酶及用于识别细胞、调节基因的其他蛋白。P3 区水解产生的蛋白 3C 在多聚蛋白前体加工过程中完成绝大多数裂解功能，其前体 3CD 也有 3C的活性。5 个拷贝的 VP1、VP2、VP3 和 VP4 构成了五聚体，12 个五聚体构成二十面体核壳，脊髓灰质炎病毒主要抗原位点位于结构蛋白VP1，VP2 和VP3 上。脊髓灰质炎病毒有三个血清型，即I 型、II型、III型，各型之间无交叉免疫反应。
脊髓灰质炎没有特效治疗方法，只能疫苗预防。目前有上市的有两种脊髓灰质炎疫苗，口服减毒活疫苗(OPV)和灭活疫苗(IPV)。在我国，脊髓灰质炎疫苗属于国家免疫规划，由于成本问题，还主要使用OPV疫苗，但是由于口服炎减毒活疫苗可能有相关麻痹型脊灰（VAPP）和疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(VDPV)的风险， VAPP年发生率为每100万发生0.14例，只要继续使用口服脊髓灰质炎疫苗，就不能根除脊灰，世界上很多国家使用巴斯德生产的IPV疫苗，但是IPV生产需要严格的实验条件，成本控制是很大问题，且IPV疫苗中可以检测到猿猴病毒SV40，可以使培养的细胞发生转化，并可导致动物产生肿瘤，因此需要开发新型的安全的脊髓灰质炎疫苗。
病毒样颗粒(Viruse Like Particles，VLPs)疫苗是近年来发展起来的一种新型亚单位疫苗,它是体外表达的病毒结构蛋白在特定的条件下自动装配成的在形态上类似于天然病毒的空心颗粒，内部无病毒核酸结构，没有感染性，具有病毒的天然空间构象，具有很强的免疫原性和生物学活性，因此在新型疫苗开发方面有巨大优势。目前已有人乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒的 VLPs 已经被成功研制成疫苗且已投放市场。早在1990年David和1989年Toyohiko、1992年Sandra分别成功获得了脊灰I型和III型VLPs，Toyohiko等还用纯化得到的III型VLPs免疫小鼠，能够诱导小鼠产生中和抗体。因此，针对脊髓灰质炎病毒样颗粒研究是发展脊髓灰质炎病毒疫苗的首选目标。
由于形成该类病毒VLP需要多个蛋白参与，需要构建多顺反子载体才能满足该目的。目前构建多顺反子载体的策略主要包括：
（1）多个载体共同转染细胞，是目的蛋白共表达。但该方法需要同时转染多个载体到一个细胞中，其转染效率低，载体之间互相干扰，蛋白表达不平衡。
（2）构建多启动子(multiple promotors) 表达载体。通过把多个基因分别连接不同类型的启动子下，通过各个启动子进行控制表达。但是由于不同的启动子的启动效率的差异，也会造成蛋白表达不均衡，蛋白相互作用距离较远。同时各个启动子元件较大，如果使用多个启动子就会加重载体的负担，影响转染和表达效率。
（3）利用IRES系统构建多顺反子表达载体。利用内核糖体进入位点（IRES）连接多个目的基因，构建融合蛋白表达载体，实现在一个载体上多个基因共表达。其原理是在翻译蛋白的过程中不依赖RNA帽子结构，能够独立的募集核糖体，进而翻译下游基因，各个蛋白独立表达。该系统存在以下缺陷：（1）IRES 自身结构较大（约为0.5kb），其应用常受到载体容量的限制，同时会增加载体的负担，导致转染效率降低。（2）IRES介导的上下游基因表达不平衡，通常下游基因的表达量仅是上游的20%到50%。所以在构建多顺反子载体系统中，IRES并不是理想的连接元件。
（4）利用剪切多肽连接目的基因。常用的连接肽有2A序列、LP4序列、IRES序列、NIa蛋白酶及其识别序列及可以被宿主细胞蛋白酶识别的连接序列等。在不同种类的病毒中，具有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列统称为2A样序列。例如：小核糖核酸病毒的2A序列、昆虫病毒的2A样序列；C型轮状病毒的2A样序列。猪捷申病毒 (Porcine teschovirus, PTV，一种小核糖核酸病毒) 2A 是自剪切多肽的典型，与其他自剪切肽相比具有结构短，大小为22个氨基酸（GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP），剪切效率高，上下游基因表达平衡性好，使其成为构建多顺反子载体的理想工具之一。
在真核生物体内翻译的过程中，折叠后的2A对核糖体肽基造成空间位阻，使Pro-tRNA氨基亲核进攻无法完成，从而无法形成2A-tRNA酯键，因此在第19个氨基酸和第20个氨基酸之间会发生剪切作用，释放出融合了2A 多肽尾巴的上游蛋白，形成与2A 的融合蛋白，同时核糖体能继续翻译下游蛋白，形成N 端带有一个脯氨酸的完整下游蛋白。整个过程不需要任何蛋白酶参与，上下游基因表达平衡，剪切效率高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体。
本发明的另一目的在于提供一种及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3三个基因中任一个基因位于启动子1下游；另外两个基因之间通过2A序列连接位于启动子2下游；2个启动子启动表达的方向相反；
其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；
所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I 型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；
所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列。
进一步的，上述一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP1基因位于启动子1下游，构成“启动子1-VP1”的结构；脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0和VP3基因通过2A序列连接位于启动子2下游，构成“启动子2-VP3-2A-VP0”的结构；上述2个启动子启动表达的方向相反；
其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；
所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I 型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；
所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列。
一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，包括以下步骤：
1）根据脊髓灰质炎病毒的P1基因序列，根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化，合成优化的 P1基因序列；
2）根据优化的 P1基因序列，设计引物将VP0、VP1、VP3中任一个基因先克隆至骨架载体中，位于骨架载体的一个启动子的下游，再将另2个基因通过2A序列进行连接，并将连接好的片段克隆至同一骨架载体的另一个启动子的下游；所得重组载体即为表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体。
进一步的，上述宿主细胞为Spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞Sf9、酿酒酵母或哺乳细胞。
进一步的，上述骨架载体根据宿主细胞的类型选择相应的骨架载体。
进一步的，上述骨架载体为pFastBacTM-Dual载体、pESC URA载体、pVIVO2-mcs载体或pBudCE4.1载体。
进一步的，上述优化的 P1基因序列为：
若脊髓灰质炎病毒为I 型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：1所示；
若脊髓灰质炎病毒为II 型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：2所示；
若脊髓灰质炎病毒为III型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：3所示。
一种脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1）将上述所述的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体转染相应的宿主细胞，培养后可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒或者重组脊髓灰质炎杆状病毒；
2）若步骤1）中获得的是重组脊髓灰质炎杆状病毒，再将重组脊髓灰质炎杆状病毒感染宿主细胞，经培养后即可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒。
进一步的，上述一种脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1）将表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，培养后提取重组大肠杆菌DH10 Bac的质粒，获得重组杆状病毒载体；
2）将上一步获得的重组杆状病毒载体转染宿主细胞，培养后得到包含编码病毒样颗粒蛋白基因的重组杆状病毒；
3）将上一步获得的重组杆状病毒感染宿主细胞，培养后获得病毒样颗粒，即为脊髓灰质炎病毒样颗粒；
其中，所述的宿主细胞为昆虫细胞Sf9；
在上述步骤3）中将重组杆状病毒感染宿主细胞后，在宿主细胞中表达病毒样颗粒蛋白，所表达的病毒样颗粒蛋白组装成病毒样颗粒，并分泌到宿主细胞外，然后将细胞培养上清初步离心去除细胞碎片，再将上清液经pellicon膜包进行浓缩，再经蔗糖纯化，即可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒，可作为免疫样品。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的技术方案采用一个载体表达多个基因，避免由于3C/3CD切割P1效率不高导致病毒样颗粒VLPs组装效率不高，避免上游启动子影响下游启动子的表达效率导致的各个蛋白表达不平衡，从而影响VLPs组装。
2、本发明实现了单一启动子下多个基因的串联表达，并成功包装出病毒样颗粒。
3、本发明制备病毒样颗粒能够诱导高水平的抗体免疫反应和保护效果，同时具有操作简单、表达量高、免疫原性好等优点，因此本发明在疫苗开发领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为各类表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的构建示意图；
图2为I、II、III型重组脊髓灰质炎杆状病毒表达免疫荧光分析；1为Bac-I-V3， 2为Bac-II-V3，3为Bac-III-V3，4为阴性对照；
图3为I、II、III型重组脊髓灰质炎杆状病毒表达样品细胞和上清Western blot分析；1、Bac-I-V3上清，2、Bac-I-V3细胞，3、Bac-II-V3上清，4、Bac-II-V3细胞，5、Bac-III-V3上清，6、Bac-III-V3细胞；
图4为I型重组病毒表达样品蔗糖梯度Western blot分析；1-10为在10-50%的蔗糖梯度超离后，从上到下收集的10个组分进行分析；其中6、7组分处的蔗糖浓度分别为33.2%和38%；
图5为脊髓灰质炎病毒样颗粒VLPs负染电镜图；A、B、C分别为脊髓灰质炎 I 型、II型、III型病毒样颗粒，
图6为脊髓灰质炎 I 型、II型、III型病毒样颗粒诱导中和抗体的分析图；I VLPs-Sabin I：脊髓灰质炎I型VLPs免疫血清中和Sabin I的曲线；II VLPs-Sabin II：脊髓灰质炎II型VLPs免疫血清中和Sabin II的曲线；III VLPs-Sabin III：脊髓灰质炎III型VLPs免疫血清中和Sabin III的曲线；IPV-Sabin I：IPV免疫血清中和Sabin I的曲线；IPV-Sabin II：IPV免疫血清中和Sabin II的曲线；IPV-Sabin III：IPV免疫血清中和Sabin III的曲线。
具体实施方式
一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3三个基因中任一个基因位于启动子1下游；另外两个基因之间通过2A序列连接位于启动子2下游；2个启动子启动表达的方向相反；其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I 型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列。
优选的，上述一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP1基因位于启动子1下游，构成“启动子1-VP1”的结构；脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0和VP3基因通过2A序列连接位于启动子2下游，构成“启动子2-VP3-2A-VP0”的结构；上述2个启动子启动表达的方向相反；其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I 型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列。
一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，包括以下步骤：
1）根据脊髓灰质炎病毒的P1基因序列，根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化，合成优化的 P1基因序列；
2）根据优化的 P1基因序列，设计引物将VP0、VP1、VP3中任一个基因先克隆至骨架载体中，位于骨架载体的一个启动子的下游，再将另2个基因通过2A序列进行连接，并将连接好的片段克隆至同一骨架载体的另一个启动子的下游；所得重组载体即为表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体。
优选的，上述宿主细胞为Spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞Sf9、酿酒酵母或哺乳细胞。
优选的，上述骨架载体根据宿主细胞的类型选择相应的骨架载体。
优选的，上述骨架载体为pFastBacTM-Dual载体、pESC URA载体、pVIVO2-mcs载体或pBudCE4.1载体。
优选的，上述优化的 P1基因序列为：
若脊髓灰质炎病毒为I 型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：1所示；
若脊髓灰质炎病毒为II 型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：2所示；
若脊髓灰质炎病毒为III型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：3所示。
一种脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1）将上述所述的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体转染相应的宿主细胞，培养后可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒或者重组脊髓灰质炎杆状病毒；
2）若步骤1）中获得的是重组脊髓灰质炎杆状病毒，再将重组脊髓灰质炎杆状病毒感染宿主细胞，经培养后即可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒；
其中，若以酵母或哺乳细胞等为宿主时，获得的相应载体转染到宿主细胞后，可直接获得脊髓灰质炎病毒样颗粒；当以昆虫细胞为宿主时，获得的相应载体转染到宿主细胞后，获得的是重组脊髓灰质炎杆状病毒，需用该病毒再去感染宿主细胞，经培养后才可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒。
优选的，上述一种脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1）将表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，培养后提取重组大肠杆菌DH10 Bac的质粒，获得重组杆状病毒载体；
2）将上一步获得的重组杆状病毒载体转染宿主细胞，培养后得到包含编码病毒样颗粒蛋白基因的重组杆状病毒；
3）将上一步获得的重组杆状病毒感染宿主细胞，培养后获得病毒样颗粒，即为脊髓灰质炎病毒样颗粒；
其中，所述的宿主细胞为昆虫细胞Sf9；
在上述步骤3）中将重组杆状病毒感染宿主细胞后，在宿主细胞中表达病毒样颗粒蛋白，所表达的病毒样颗粒蛋白组装成病毒样颗粒，并分泌到宿主细胞外，然后将细胞培养上清初步离心去除细胞碎片，再将上清液经pellicon膜包进行浓缩，再经蔗糖纯化，即可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒，可作为免疫样品。
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明。
本发明提供的技术方案所使用的材料和试剂：
1主要材料
病毒：Sabin I、Sabin II、Sabin III；
细胞：昆虫细胞Sf9。
2 主要试剂
PremerStar DNA聚合酶（大连宝生物）；
Bac重组杆状质粒提取试剂盒（Omiga生物）；
卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal、IPTG（北京鼎国）；
LB培养基（Sigma）；
Grace's培养基、FBS（Gibco)；
Cellfectinll脂质体（Sigma）；
IPV 兔抗（本公司制备，利用巴斯德的IPV疫苗免疫兔子获得的抗体）；
HRP羊抗兔二抗（Invitrogen）。
Donkey Anti- Rabbit Alexa Fluor 488(Invitrogen)
实施例1一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体
将脊髓灰质炎I型病毒 的VP1序列置于pFastBac Dual质粒的P10启动子下，将小核糖核酸病毒科的2A序列基因（即编码之氨基酸序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP的碱基序列）一端连接脊髓灰质炎I型病毒的VP3基因，另一端连接至脊髓灰质炎I型病毒的VP0基因，置于pFastBac Dual质粒的Ppolh启动子下，获得穿梭载体pFBD-I VP1-VP3-2A-VP0，即表达脊髓灰质炎I型病毒样颗粒蛋白的载体。
实施例2一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体
将脊髓灰质炎II型病毒 的VP1序列置于pFastBac Dual质粒的P10启动子下，将小核糖核酸病毒科的2A序列基因（即编码之氨基酸序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP的碱基序列）一端连接脊髓灰质炎II型病毒的VP3基因，另一端连接至脊髓灰质炎II型病毒的VP0基因，置于pFastBac Dual质粒的Ppolh启动子下，获得穿梭载体pFBD-II VP1-VP3-2A-VP0，即表达脊髓灰质炎II型病毒样颗粒蛋白的载体。
实施例3一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体
将脊髓灰质炎III型病毒的VP1序列置于pFastBac Dual质粒的P10启动子下，将小核糖核酸病毒科的2A序列基因（即编码之氨基酸序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP的碱基序列）一端连接脊髓灰质炎III型病毒的VP3基因，另一端连接至脊髓灰质炎III型病毒的VP0基因，置于pFastBac Dual质粒的Ppolh启动子下，获得穿梭载体pFBD-III VP1-VP3-2A-VP0，即表达脊髓灰质炎III型病毒样颗粒蛋白的载体。
实施例4表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法
实施例1中所述的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，包括以下步骤：
1）基因优化合成
根据脊髓灰质炎I 型病毒（PV I 型）的P1序列，根据宿主细胞Spodoptera frugiperda草地夜蛾（Sf9）细胞系的偏爱性进行密码子虫源优化，PUC57为载体，以XhoI, KpnI为酶切位点合成PV I 型P1序列（SEQ ID NO：1），并将其克隆至PUC57载体中，得重组载体PUC57-I-P1。
2）引物设计
以pFastBacTM-Dual为骨架载体，对骨架载体中Pph和P10启动子分析，根据优化后的脊髓灰质炎 I型（Mahoney株）P1序列（SEQ ID NO：1）中VP0（SEQ ID NO：4）、VP1（SEQ ID NO：5）、VP3（SEQ ID NO：6）的基因序列，设计引相应引物，如表1所示。
表1 引物设计表
3）表达脊髓灰质炎I型病毒样颗粒蛋白载体的制备
根据设计方案，以PUC57-I-P1为模板，用引物I VP1-Xho I F和I VP1-Kpn I R（见表1）扩增得VP1片段，并将其连接到pFastBacTM-Dual骨架载体中，得重组载体pFBD-I-VP1，其中I VP1位于启动子Pp10下游。
将VP3和VP0通过2A序列进行连接，即：以PUC57-I-P1为模板，利用引物I VP3-2A-VP0-XbaI F和I VP3-2A-VP0 R（见表1）扩增得到I VP3-2A1，用引物I VP3-2A-VP0 F1 、II VP3-2A-VP0 F2、II VP3-2A-VP0 F3和I VP3-2A-VP0-Hind III R（见表1）扩增得到I 2A2-VP0，将I VP3-2A1和I 2A2-VP0作为模板，再以引物I VP3-2A-VP0-Xba I F和I VP3-2A-VP0-Hind III R（见表1）进行PCR扩增得I VP3-2A-VP0片段。
将I VP3-2A-VP0片段连接至重组载体pFBD-I-VP1中，得重组载体pFBD-I-VP1- VP3-2A-VP0，即表达脊髓灰质炎I型病毒样颗粒蛋白的载体，其中，VP3-2A-VP0位于启动子Pph的下游。相关载体构建情况如表2所示，构建示意图见图1。
表2重组载体pFBD-I-VP1- VP3-2A-VP0的构建情况
实施例5 表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法
实施例2中所述的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，包括以下步骤：
1）基因优化合成
根据脊髓灰质炎II 型病毒（PV II 型）的P1序列，根据宿主细胞Spodoptera frugiperda草地夜蛾（Sf9）细胞系的偏爱性进行密码子虫源优化，PUC57为载体，以XhoI, KpnI为酶切位点合成PV II 型P1序列（SEQ ID NO：2），并将其克隆至PUC57载体中，得重组载体PUC57-II-P1。
2）引物设计
以pFastBacTM-Dual为骨架载体，对骨架载体中Pph和P10启动子分析，根据优化后的脊髓灰质炎 II型（MEF-1株）P1序列（SEQ ID NO：2）中VP0（SEQ ID NO：7）、VP1（SEQ ID NO：8）、VP3（SEQ ID NO：9）序列，设计引相应引物，如表3所示。
表3 引物设计表
3）表达脊髓灰质炎II型病毒样颗粒蛋白载体的制备
根据设计方案，以PUC57-II-P1为模板，用引物II VP1-Xho I F和II VP1-Kpn I R（见表3）扩增得VP1片段，并将其连接到pFastBacTM-Dual骨架载体中，得重组载体pFBD-II-VP1，其中VP1位于启动子Pp10下游。
将VP3和VP0通过2A序列进行连接，即：以PUC57-II-P1为模板，利用引物II VP3-2A-VP0-XbaI F和II VP3-2A-VP0 R（见表3）扩增得到II VP3-2A1、用引物II VP3-2A-VP0 F1 、II VP3-2A-VP0 F2、II VP3-2A-VP0 F3和II VP3-2A-VP0-Hind III R（见表3）扩增得到II 2A2-VP0，再将II VP3-2A1和II 2A2-VP0作为模板，再以引物II VP3-2A-VP0-Xba I F和
II VP3-2A-VP0-Hind III R进行PCR扩增得II VP3-2A-VP0片段。
将II VP3-2A-VP0片段连接至重组载体pFBD-II-VP1中，得重组载体pFBD-II-VP1- VP3-2A-VP0，即表达脊髓灰质炎II型病毒样颗粒蛋白的载体，其中，II VP3-2A-VP0位于启动子Pph的下游。相关载体构建情况如表4所示，构建示意图见图1。
表4重组载体pFBD-II-VP1- VP3-2A-VP0的构建情况
实施例6 表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法
实施例3中所述的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，包括以下步骤：
1）基因优化合成
根据脊髓灰质炎III 型病毒（PV III 型）的P1序列，根据宿主细胞Spodoptera frugiperda草地夜蛾（Sf9）细胞系的偏爱性进行密码子虫源优化，PUC57为载体，以XhoI, KpnI为酶切位点合成PV III 型P1序列（SEQ ID NO：3），并将其克隆至PUC57载体中，得重组载体PUC57-III-P1。
2）引物设计
以pFastBacTM-Dual为骨架载体，对其Pph和P10启动子分析，根据优化后的脊髓灰质炎 III型（Saukett株）P1序列（SEQ ID NO：3）中VP0（SEQ ID NO：10）、VP1（SEQ ID NO：11）、VP3（SEQ ID NO：12）序列，设计引相应引物，如表5所示。
表5 引物设计表
3）表达脊髓灰质炎III型病毒样颗粒蛋白载体的制备
根据设计方案，以PUC57-I-P1为模板，用引物III VP1-Xho I F和III VP1-Kpn I R（见表5）扩增得III VP1片段，并将其连接到pFastBacTM-Dual骨架载体中，得重组载体pFBD-III-VP1，其中VP1位于启动子Pp10下游。
将VP3和VP0通过2A序列进行连接，即：以PUC57-I-P1为模板，利用引物III VP3-2A-VP0-XbaI F和III VP3-2A-VP0 R（见表5）扩增得到III VP3-2A1、用引物III VP3-2A-VP0 F1 、II VP3-2A-VP0 F2、II VP3-2A-VP0 F3和III VP3-2A-VP0-Hind III R（见表5）扩增得到III 2A2-VP0，再将III VP3-2A1和III 2A2-VP0作为模板，再以引物III VP3-2A-VP0-Xba I F和III VP3-2A-VP0-Hind III R进行PCR扩增得III VP3-2A-VP0片段。
将III VP3-2A-VP0片段连接至重组载体pFBD-III-VP1中，得重组载体pFBD-III-VP1- VP3-2A-VP0，即表达脊髓灰质炎III型病毒样颗粒蛋白的载体，其中，III VP3-2A-VP0位于启动子Pph的下游。相关载体构建情况如表6所示，构建示意图见图1。
表6重组载体pFBD-III-VP1- VP3-2A-VP0的构建情况
实施例7重组脊髓灰质炎杆状病毒的制备方法
1）将实施例1～6中所述的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体pFBD-I-VP1-VP3-2A-VP0、pFBD-II-VP1-VP3-2A-VP0和pFBD-III-VP1-VP3-2A-VP0分别通过Invitrogen的Bac-to-Bac 系统，转化大肠杆菌DH10 Bac，培养后，筛选提取阳性重组大肠杆菌DH10 Bac的质粒，获得重组杆状病毒载体；
2）将上一步获得的重组杆状病毒载体转染Sf9细胞获得相应的第一代重组杆状病毒，即重组脊髓灰质炎杆状病毒，分别命名为Bac-I-VP1-VP3-2A-VP0-V1(简称Bac-I)、Bac-II-VP1-VP3-2A-VP0-V1（简称Bac-II）和Bac-III-VP1-VP3-2A-VP0-V1（简称Bac-III），用0.1 MOI对各病毒进行连续扩增，获得的第三代病毒Bac-I-V3、Bac-II-V3和Bac-III-V3。
并对上述制得的重组脊髓灰质炎杆状病毒进行以下相关指标检测。
一、重组杆状病毒蛋白表达免疫荧光分析
按照Invitrogen说明书，将上述获得的Bac-I-V3、Bac-II-V3和Bac-III-V3以1 MOI感染Sf9贴壁细胞，3天后，弃上清，用甲醛固定，以IPV（灭活脊髓灰质炎疫苗） 兔抗为一抗，Donkey Anti- Rabbit Alexa Fluor 488为二抗进行免疫荧光分析，结果如图2所示，Bac-I 、Bac-II 和Bac-III感染的SF9细胞都有明亮绿色荧光，空白组未检测到明亮绿色荧光。说明它们都能在Sf9细胞中表达相应的目的蛋白（即VP0、VP1和VP3蛋白）。
二、重组杆状病毒蛋白表达Western blot分析
按照Invitrogen说明书，将上述制得的Bac-I-V3、Bac-II-V3和Bac-III-V3重组杆状病毒以1MOI感染sf9悬浮细胞，以Excell-420为悬浮培养基，培养6天，待细胞全部裂解后，收集细胞和上清，取细胞和上清样品进行12%的SDS-PAGE电泳，转印PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭过夜，PBST漂洗5次，以1:4000稀释一抗IPV兔抗，室温孵育2h，PBST稀释5次，HRP标记的二抗羊抗兔室温孵育1.5h，PBST漂洗5次，利用超敏发光液（A液25ml、B液25ml）进行压片显色。检测结果如图3所示，所有重组杆状病毒表达7天后的细胞内基本检测到不到VP1（35KDa），而上清中都能检测到大量的VP1（35KDa）蛋白，推测在该表达系统下，释放的VP1蛋白可能形成了成熟的病毒样颗粒，或者单独分泌到胞外。
实施例8 脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法
脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1）表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的构建：如实施例4～6所述；
2）重组脊髓灰质炎杆状病毒的制备：如实施例7所述；
3）脊髓灰质炎病毒样颗粒的表达和组装：将实施例7制得的重组脊髓灰质炎杆状病毒Bac-I-V3、Bac-II-V3和Bac-III-V3分别以1 MOI感染sf9悬浮细胞，每个样品表达2L，培养6天待细胞完全裂解后收获病毒上清；
4）脊髓灰质炎病毒样颗粒的纯化：将收获的病毒上清装入250ml的离心杯中，配平。使用JA-14转子（Beckman）高速离心收集上清，上清过0.22um的pellicon膜包浓缩10倍得到浓缩液。离心管的底部加入4 ml的25%（W/W）蔗糖溶液，上层加入浓缩液。用离心机超高速离心4 h。用PBS溶解沉淀得到重悬液。重悬液加到10%-50%蔗糖梯度上层，离心机超高速离心4h，收集8个蔗糖梯度（1ml/每梯度），进行Western blot检测分析，根据Western blot结果（见图4），收集富集的梯度，脱糖浓缩样品。
上述Western blot检测结果如图4所示， Western Blot检测Bac-I-V3蔗糖梯度结果表明在组份6、7中有大小为38、36、26和12KDa的条带，其大小分别同脊髓灰质炎 I 型VP0、VP1、VP2（VP3）和VP4蛋白大小吻合（4中只检测到VP1，可能与上清经过浓缩，其他蛋白得以呈现有关），组份6、7的蔗糖浓度分别为33.2%和38%；Bac-II-V3和Bac-III-V3型蔗糖梯度样品的Western Blot结果与Bac-I-V3相似，说明病毒样颗粒（VLPs）富集中在这两个组份；即收集蔗糖浓度分别为33.2%和38%处的样品，进行超高速离心脱糖浓缩，PBS溶解沉淀并过0.22um滤膜，分别得到纯化的脊髓灰质炎 I 型、II型、III型病毒样颗粒。
下面对实施例8中制得的脊髓灰质炎病毒样颗粒进行以下相关检测。
一、脊髓灰质炎病毒样颗粒VLPs的电镜检测
将实施例8中纯化后得到的脊髓灰质炎 I 型、II型、III型病毒样颗粒分别进行电镜观察。电镜负染结果表明视野中出现高浓度、结构完整的病毒样颗粒，其直径大小为25-30nm（图5），图5A和图5C为脊髓灰质炎 I 型、III型病毒样颗粒，与其他报道的脊髓灰质炎 I 型、III型病毒样颗粒大小和结构相似，图5B为脊髓灰质炎II型病毒样颗粒（目前未见有关脊髓灰质炎II型病毒样颗粒的报道）。表明本发明方法能够高效产生结构完整的脊髓灰质炎病毒样颗粒。
二、脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗效力分析
1）疫苗的制备和免疫程序
稀释实施例8中制备的脊髓灰质炎 I 型、II型、III型病毒样颗粒，并分别加入1/10体积的AL(OH)3佐剂（1000mg/ml）混合，使得蛋白浓度为20μg/ml，利用以上10μg纯化的VLP对六周龄的BALB/c母鼠分别在0，2，4周进行免疫三次，每次每只免疫10μg。同时设置从巴斯德购买的IPV灭活疫苗为阳性对照和同样处理的未感染病毒的Sf9细胞作为阴性对照。5周后小鼠眼球采血，收集血清，-80分装保存。
2）免疫小鼠血清中和抗体滴度
取各组小鼠血清样品，56灭活30min，用无血清的M199培养基成倍比稀释。
I型VLPs免疫血清中和Sabin I，II型VLPs免疫血清中和SabinII，III型VLPs中和Sabin III，IPV免疫血清和阴性对照血清都分别中和SabinI、SabinII和Sabin III（SabinI、SabinII和SabinIII，脊髓灰质炎标准减毒株，来自于广东省疾控中心），将SabinI、SabinII、Sabin III 减毒株用M199培养基稀释到100 pfu/100μl。稀释后的病毒液、样品各取100μl，混合均匀，在37℃细胞培养箱放置2小时。吸去Vero细胞培养上清，取200μl混合液加入到6孔板Vero细胞中，加入阳性和阴性对照，放入37℃继续培养2h。每孔加入4 ml 1%的甲基纤维素，放置于CO2培养箱中4天，去培养基，结晶紫染色，统计出斑情况，能使空斑数减少50%的血清稀释度判定为血清的中和滴度，空斑减少率计算公式为：[（阴性对照空斑数-样品空斑数）/ 阴性对照空斑数 ]×100%。
实验结果如图6所示，和阴性对照相比，本发明制备的脊髓灰质炎I型病毒样颗粒免疫小鼠可以诱导1：128以上的中和效价，IPV灭活疫苗中和Sabin I效价大约为1:512；脊髓灰质炎II型病毒样颗粒免疫小鼠可以诱导1: 256的中和效价，IPV灭活疫苗中和效价稍高于1:512；脊髓灰质炎III型病毒样颗粒免疫小鼠可以诱导高于1: 512的中和效价；IPV灭活疫苗中和效价为1：1024-2048之间，虽然本发明制备的病毒样颗粒比巴斯德的IPV灭活疫苗中和效价要低，但是本发明制备的病毒样颗粒具有与天然病毒颗粒相似的结构而没有病毒核酸，不能自主复制，安全性更好，而野毒株的培养需要严格的实验条件，减毒株存在毒力恢复的可能性。且本发明制备的病毒样颗粒目前还只是初步的纯化，与市售的IPV灭活疫苗相比纯度存在差异，可能也会导致中和效价的差异。
上述结果说明，本发明制备的脊髓灰质炎I型、 II 型和III型VLPs诱导产生的抗体分别对Sabin I型、SabinII型和 SabinIII有较强的中和作用，因此本发明制备的脊髓灰质炎病毒样颗粒可作为预防脊髓灰质炎病毒引起的小儿麻痹症的疫苗。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内，如将上述实施例中的宿主细胞改为酵母细胞或哺乳细胞等等，从而根据宿主细胞选择相应的骨架载体，进行同以上实验例类似的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白载体的构建，以及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备等，均落在本发明要求的保护范围之内。
<110> 广东华南联合疫苗开发院有限公司
<120> 一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备
方法
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎I 型病毒
<400> 1
ggagctcagg tctcctccca aaaggtgggt gctcacgaga actccaatcg cgcctacggt 60
ggttccacaa ttaactatac cactatcaac tactaccgcg actccgcttc caacgctgct 120
tccaaacagg acttctccca agacccatcc aagttcaccg agcctatcaa ggacgtgctg 180
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gtggcttacg gtcgttggcc tgagtacctg cgtgattccg aggctaaccc agtggaccag 360
cctaccgaac ctgacgtcgc cgcttgccgt ttttacactc tggacaccgt gtcctggacc 420
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ggtcagaaca tgtattacca ttatctgggt cgctccggtt acactgtcca cgtgcagtgc 540
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aaggagtcca agggttggtg gtggaaactg ccagacgctc tgcgcgacat gggtctgttc 480
ggtcagaaca tgtactacca ctacctgggt cgctccggtt acaccgtcca cgtgcagtgc 540
aatgcctcca agtttcacca aggtgctctg ggtgtgttcg ctattccaga atactgcctg 600
gctggtgact ccgacaagca acgctacacc tcctacgcta acgctaatcc tggagaaaag 660
ggtggtaagt tctattccca gtttaatcgc gacaccgctg tgacttcccc caagcgcgag 720
ttctgccctg tcgattacct gctgggctgt ggtgtgctgc tgggaaacgc ttttgtgtac 780
cctcaccaga tcatcaacct gcgcaccaac aattccgcta ccatcgtgct gccttacgtg 840
aacgccctgg ctatcgactc catggtgaag cacaacaact ggggtatcgc tatcctgcct 900
ctgtcccctc tggacttcgc tcaagactcc tccgtggaga tccctatcac cgtgacaatc 960
gctcctatgt gctccgagtt caacggtctg cgcaacgtga ccgctcccaa attccagggt 1020
ctgcctgtgc tgaacacccc tggttccaac cagtacctga cctccgataa ccaccagtcc 1080
ccttgcgcca tccctgagtt cgacgtgaca cctcctatcg acatcccagg cgaggtcaag 1140
aatatgatgg agctggctga gatcgacact atgattcccc tgaacctgga gaataccaag 1200
cgcaacacca tggatatgta ccgcgtcact ctgtccgatt ccgctgatct gtcccaacct 1260
atcctgtgcc tgtccctgtc cccagcttcc gaccctcgtc tgtcccacac aatgctggga 1320
gaggtgctga actactacac ccactgggct ggctccctga agttcacttt cctgttctgc 1380
ggttccatga tggccactgg taagatcctg gtggcttacg ctcctcccgg tgcccaacca 1440
cctacatccc gcaaagaggc tatgctgggc acacacgtga tttgggatct gggactgcaa 1500
tcctcctgca ctatggtcgt gccctggatt tccaacgtga cctaccgcca gaccactcag 1560
gattccttca ccgagggtgg ttacatttcc atgttctacc agacccgtat tgtggtgcca 1620
ctgtccacac ctaagtccat gtccatgctg ggctttgtct ccgcttgcaa cgacttttcc 1680
gtgcgtctgc tgcgtgacac aacacacatc tcccaatccg ctctgccaca gggtatcgag 1740
gacctgatta ccgaagtggc ccagggtgct ctgacactgt ccctgccaaa gcaacaagat 1800
tccctgcctg atacaaaggc ctccggaccc gcccactcca aggaggtgcc tgccctgact 1860
gctgtggaga ctggagctac caaccccctg gtcccctccg atactgtgca aacccgccac 1920
gtcatccagc gccgctcccg ctccgagtcc accatcgagt cctttttcgc tcgcggtgct 1980
tgcgtggcta tcatcgaggt cgacaacgag gagcctacca cccgcgctca gaagctgttc 2040
gctacttggc gcatcactta taaagatacc gtccagctgc gccgcaagct ggagtttttt 2100
acctactccc gtttcgatat ggagttcacc tttgtcgtga cagctaactt caccaacaca 2160
aacaacggtc acgctctgaa ccaggtgtac cagattatgt atatcccccc aggtgctcct 2220
accccaaagt cctgggacga ctatacctgg cagacctcct ccaacccttc catcttctac 2280
acttacggtg ctgctcctgc tcgcatctcc gtcccttacg tcggactggc taacgcttac 2340
tcccacttct acgacggttt tgctaaggtc cctctgaaga ccgacgctaa cgatcagatc 2400
ggtgactccc tgtactccgc catgaccgtg gatgatttcg gtgtgctggc tattcgcgtg 2460
gtgaacgacc acaaccccac caaggtcaca tccaaggtgc gcatctacat gaaacctaaa 2520
catgtccgcg tgtggtgtcc tcgcccacct cgcgccgtgc cttattacgg tcccggagtg 2580
gactacaaag acaacctgaa tcctctgtcc gaaaagggtc tgactaccta c 2631
<210> 4
<211> 1017
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎I 型病毒
<400> 4
ggagctcagg tctcctccca aaaggtgggt gctcacgaga actccaatcg cgcctacggt 60
ggttccacaa ttaactatac cactatcaac tactaccgcg actccgcttc caacgctgct 120
tccaaacagg acttctccca agacccatcc aagttcaccg agcctatcaa ggacgtgctg 180
atcaagaccg ctcccatgct gaactcccct aacattgagg cctgcggcta ttccgatcgc 240
gtgctgcaac tgaccctggg taactccacc atcaccacac aggaggctgc taactccgtg 300
gtggcttacg gtcgttggcc tgagtacctg cgtgattccg aggctaaccc agtggaccag 360
cctaccgaac ctgacgtcgc cgcttgccgt ttttacactc tggacaccgt gtcctggacc 420
aaagaatccc gcggttggtg gtggaagctg ccagacgctc tgcgcgatat gggcctgttc 480
ggtcagaaca tgtattacca ttatctgggt cgctccggtt acactgtcca cgtgcagtgc 540
aatgcctcca aattccatca aggcgctctg ggtgtcttcg ctgtgcctga aatgtgtctg 600
gctggtgact ccaacaccac taccatgcac acatcctacc aaaacgctaa tcctggtgag 660
aagggtggca ccttcactgg tacattcacc cctgacaata accagacatc cccagctcgt 720
tcctccgccc gttggattac ttccctggaa atggctcgtt gttggggtat gcccctgtgt 780
tccgctcaaa ttatcaacct gcgcactaat aactgcgcta cactggtcct gccttacgtc 840
aactccctgt ccctggattc catggtgaag cacaacaact ggggaatcgc tatcctgcca 900
ctggctccac tgaactttgt gtccgagtcc tcccctgaga ttcctattac cctgaccatc 960
gcccctatgt gttgcgagtt caacggtctg cgcaacatta cactgcctcg cctgcaa 1017
<210> 5
<211> 900
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎I 型病毒
<400> 5
ggtatcgagg acctgattac cgaagtggcc cagggtgctc tgacactgtc cctgccaaag 60
caacaagatt ccctgcctga tacaaaggcc tccggacccg cccactccaa ggaggtgcct 120
gccctgactg ctgtggagac tggagctacc aaccccctgg tcccctccga tactgtgcaa 180
acccgccacg tcatccagcg ccgctcccgc tccgagtcca ccatcgagtc ctttttcgct 240
cgcggtgctt gcgtggctat catcgaggtc gacaacgagg agcctaccac ccgcgctcag 300
aagctgttcg ctacttggcg catcacttat aaagataccg tccagctgcg ccgcaagctg 360
gagtttttta cctactcccg tttcgatatg gagttcacct ttgtcgtgac agctaacttc 420
accaacacaa acaacggtca cgctctgaac caggtgtacc agattatgta tatcccccca 480
ggtgctccta ccccaaagtc ctgggacgac tatacctggc agacctcctc caacccttcc 540
atcttctaca cttacggtgc tgctcctgct cgcatctccg tcccttacgt cggactggct 600
aacgcttact cccacttcta cgacggtttt gctaaggtcc ctctgaagac cgacgctaac 660
gatcagatcg gtgactccct gtactccgcc atgaccgtgg atgatttcgg tgtgctggct 720
attcgcgtgg tgaacgacca caaccccacc aaggtcacat ccaaggtgcg catctacatg 780
aaacctaaac atgtccgcgt gtggtgtcct cgcccacctc gcgccgtgcc ttattacggt 840
cccggagtgg actacaaaga caacctgaat cctctgtccg aaaagggtct gactacctac 900
<210> 6
<211> 714
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎I 型病毒
<400> 6
ggtctgcctg tgctgaacac ccctggttcc aaccagtacc tgacctccga taaccaccag 60
tccccttgcg ccatccctga gttcgacgtg acacctccta tcgacatccc aggcgaggtc 120
aagaatatga tggagctggc tgagatcgac actatgattc ccctgaacct ggagaatacc 180
aagcgcaaca ccatggatat gtaccgcgtc actctgtccg attccgctga tctgtcccaa 240
cctatcctgt gcctgtccct gtccccagct tccgaccctc gtctgtccca cacaatgctg 300
ggagaggtgc tgaactacta cacccactgg gctggctccc tgaagttcac tttcctgttc 360
tgcggttcca tgatggccac tggtaagatc ctggtggctt acgctcctcc cggtgcccaa 420
ccacctacat cccgcaaaga ggctatgctg ggcacacacg tgatttggga tctgggactg 480
caatcctcct gcactatggt cgtgccctgg atttccaacg tgacctaccg ccagaccact 540
caggattcct tcaccgaggg tggttacatt tccatgttct accagacccg tattgtggtg 600
ccactgtcca cacctaagtc catgtccatg ctgggctttg tctccgcttg caacgacttt 660
tccgtgcgtc tgctgcgtga cacaacacac atctcccaat ccgctctgcc acag 714
<210> 7
<211> 1017
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎II型病毒
<400> 7
ggtgctcaag tctcctccca gaaggtgggt gcccacgaga actccaaccg tgcttacggt 60
ggctccacca tcaactacac tactatcaat tactaccgcg actccgcctc caatgccgct 120
tccaaacaag actttgctca ggacccatcc aagtttaccg agcctatcaa ggacgtgctg 180
atcaagaccg ctcccaccct gaactcccct aacatcgagg cttgcggtta ttccgatcgc 240
gtgatgcagc tgacactggg taactccact atcacaaccc aagaggctgc taactccgtg 300
gtggcttatg gtcgctggcc cgagtacatt aaggactccg aggctaaccc agtcgaccaa 360
cccactgagc ctgacgtggc cgcctgtcgc ttctatacac tggatactgt gacctggcgt 420
aaagagtccc gcggttggtg gtggaagctg cctgatgctc tgaaggacat gggtctgttc 480
ggtcaaaata tgttctacca ttatctgggt cgcgctggct acacagtgca tgtgcagtgc 540
aatgcctcca aatttcatca aggtgctctg ggcgtgttcg ctgtcccaga gatgtgtctg 600
gctggtgatt ccactactca catgttcacc aagtatgaga acgccaatcc aggagagaag 660
ggtggtgagt tcaaaggttc cttcaccctg gacacaaacg ctactaaccc tgctcgcaac 720
ttctgtcctg tggactacct gtttggttcc ggtgtgctgg ccggtaacgc tttcgtgtac 780
cctcaccaga tcatcaacct gcgtaccaac aattgcgcta ccctggtcct gccatacgtg 840
aactccctgt ccatcgactc catgaccaag cataacaact ggggtatcgc tatcctgcct 900
ctggctcctc tggacttcgc tactgaatcc tccaccgaaa tccctattac cctgaccatc 960
gctcctatgt gctgcgagtt caacggtctg cgcaacatta ccgtccctcg cacccaa 1017
<210> 8
<211> 903
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎II型病毒
<400> 8
ggtctgggcg acctgatcga aggcgtggtg gagggtgtga cccgtaacgc cctgacccct 60
ctgactccag ctaacaatct gcctgatacc cagtcctccg gtccagctca ttccaaggag 120
acaccagctc tgaccgctgt ggagaccggt gctaccaacc ctctggtgcc ttccgataca 180
gtgcaaaccc gtcatgtcat ccagaagcgc acccgctccg agtccaccgt ggagtccttc 240
ttcgctcgcg gtgcttgcgt ggctattatc gaagtggaca acgacgctcc taccaagcgt 300
gcttccaagc tgttctccgt ctggaagatc acctacaagg ataccgtgca actgcgccgc 360
aagctggaat ttttcacata ctcccgcttc gacatggagt tcaccttcgt ggtcacatcc 420
aattataccg acgccaacaa tggtcatgct ctgaaccaag tctatcagat catgtatatc 480
ccacctggag ccccaatccc tggtaagtgg aacgattaca cctggcagac ttcctccaac 540
ccctccgtgt tctataccta cggcgctcca cctgctcgca tttccgtccc ttacgtcgga 600
attgccaacg cttactccca cttctacgac ggtttcgcta aggtgcctct ggctggtcag 660
gcttccaccg agggcgactc cctgtacggt gccgcttccc tgaatgattt cggttccctg 720
gctgtgcgtg tcgtcaatga tcacaatcct actaaactga cctccaagat ccgtgtctac 780
atgaagccta agcatgtgcg cgtgtggtgc ccccgtcctc ctcgtgctgt gccatattat 840
ggccctggcg tggattataa ggatggactg gctcctctgc ccgaaaaggg tctgactaca 900
tac 903
<210> 9
<211> 714
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎II型病毒
<400> 9
ggtctgcctg tgctgaacac ccctggttcc aaccagtacc tgaccgctga caactaccag 60
tccccttgcg ccattcctga gtttgatgtc acccccccta tcgacatccc tggagaggtg 120
cgcaatatga tggagctggc tgaaatcgat acaatgatcc ctctgaacct gactaaccag 180
cgcaagaata ccatggacat gtaccgcgtc gagctgaacg atgctgctca ctccgacacc 240
cctatcctgt gtctgtccct gtccccagcc tccgatcctc gcctggctca caccatgctg 300
ggtgagatcc tgaactacta cacccactgg gctggatccc tgaagtttac cttcctgttc 360
tgtggctcca tgatggctac aggtaagctg ctggtctcct atgctccccc aggcgctgag 420
gctcccaagt cccgcaagga ggctatgctg ggaactcacg tcatctggga catcggtctg 480
caatcctcct gtactatggt cgtcccctgg atctccaata ccacctaccg ccaaaccatc 540
aatgactcct tcacagaagg tggttacatc tccatgtttt accagacccg cgtggtcgtg 600
ccactgtcca cccctcgcaa gatggacatc ctgggtttcg tgtccgcctg caacgatttt 660
tccgtgcgtc tgctgcgcga caccacccat atttcccagg aagctatgcc tcaa 714
<210> 10
<211> 1017
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎III型病毒
<400> 10
ggtgcccagg tgtcctccca gaaggtgggt gctcacgaga actccaaccg cgcttatggc 60
ggatccacta ttaactatac aactatcaac tactacaagg actccgcttc caacgctgct 120
tccaagcagg actactccca ggacccttcc aaatttaccg agcctctgaa ggacgtgctg 180
atcaaaaccg ccccttcact gaactcccct aacgtcgagg cttgcggtta ttccgaccgc 240
gtcctgcagc tgacactggg caactccacc atcaccaccc aggaggctgc taactccgtc 300
gtggcttacg gtcgctggcc tgagttcatc cgcgacgacg aggctaaccc tgtggaccag 360
cctaccgaac cagacgtggc tacctgccgc ttctacacac tggataccgt gatgtggggt 420
aaggagtcca agggttggtg gtggaaactg ccagacgctc tgcgcgacat gggtctgttc 480
ggtcagaaca tgtactacca ctacctgggt cgctccggtt acaccgtcca cgtgcagtgc 540
aatgcctcca agtttcacca aggtgctctg ggtgtgttcg ctattccaga atactgcctg 600
gctggtgact ccgacaagca acgctacacc tcctacgcta acgctaatcc tggagaaaag 660
ggtggtaagt tctattccca gtttaatcgc gacaccgctg tgacttcccc caagcgcgag 720
ttctgccctg tcgattacct gctgggctgt ggtgtgctgc tgggaaacgc ttttgtgtac 780
cctcaccaga tcatcaacct gcgcaccaac aattccgcta ccatcgtgct gccttacgtg 840
aacgccctgg ctatcgactc catggtgaag cacaacaact ggggtatcgc tatcctgcct 900
ctgtcccctc tggacttcgc tcaagactcc tccgtggaga tccctatcac cgtgacaatc 960
gctcctatgt gctccgagtt caacggtctg cgcaacgtga ccgctcccaa attccag 1017
<210> 11
<211> 900
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎III型病毒
<400> 11
ggtatcgagg acctgattac cgaagtggcc cagggtgctc tgacactgtc cctgccaaag 60
caacaagatt ccctgcctga tacaaaggcc tccggacccg cccactccaa ggaggtgcct 120
gccctgactg ctgtggagac tggagctacc aaccccctgg tcccctccga tactgtgcaa 180
acccgccacg tcatccagcg ccgctcccgc tccgagtcca ccatcgagtc ctttttcgct 240
cgcggtgctt gcgtggctat catcgaggtc gacaacgagg agcctaccac ccgcgctcag 300
aagctgttcg ctacttggcg catcacttat aaagataccg tccagctgcg ccgcaagctg 360
gagtttttta cctactcccg tttcgatatg gagttcacct ttgtcgtgac agctaacttc 420
accaacacaa acaacggtca cgctctgaac caggtgtacc agattatgta tatcccccca 480
ggtgctccta ccccaaagtc ctgggacgac tatacctggc agacctcctc caacccttcc 540
atcttctaca cttacggtgc tgctcctgct cgcatctccg tcccttacgt cggactggct 600
aacgcttact cccacttcta cgacggtttt gctaaggtcc ctctgaagac cgacgctaac 660
gatcagatcg gtgactccct gtactccgcc atgaccgtgg atgatttcgg tgtgctggct 720
attcgcgtgg tgaacgacca caaccccacc aaggtcacat ccaaggtgcg catctacatg 780
aaacctaaac atgtccgcgt gtggtgtcct cgcccacctc gcgccgtgcc ttattacggt 840
cccggagtgg actacaaaga caacctgaat cctctgtccg aaaagggtct gactacctac 900
<210> 12
<211> 714
<212> DNA
<213> 脊髓灰质炎III型病毒
<400> 12
ggtctgcctg tgctgaacac ccctggttcc aaccagtacc tgacctccga taaccaccag 60
tccccttgcg ccatccctga gttcgacgtg acacctccta tcgacatccc aggcgaggtc 120
aagaatatga tggagctggc tgagatcgac actatgattc ccctgaacct ggagaatacc 180
aagcgcaaca ccatggatat gtaccgcgtc actctgtccg attccgctga tctgtcccaa 240
cctatcctgt gcctgtccct gtccccagct tccgaccctc gtctgtccca cacaatgctg 300
ggagaggtgc tgaactacta cacccactgg gctggctccc tgaagttcac tttcctgttc 360
tgcggttcca tgatggccac tggtaagatc ctggtggctt acgctcctcc cggtgcccaa 420
ccacctacat cccgcaaaga ggctatgctg ggcacacacg tgatttggga tctgggactg 480
caatcctcct gcactatggt cgtgccctgg atttccaacg tgacctaccg ccagaccact 540
caggattcct tcaccgaggg tggttacatt tccatgttct accagacccg tattgtggtg 600
ccactgtcca cacctaagtc catgtccatg ctgggctttg tctccgcttg caacgacttt 660
tccgtgcgtc tgctgcgtga cacaacacac atctcccaat ccgctctgcc acag 714
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 13
atctcgagat gggtctgggt cagatgctgg a 31
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 14
gccggtacct tagtaggttg tcagatcttt ggtg 34
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 15
attctagaat gggtctgcct gtgatgaaca c 31
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 16
aagttagtag ctccgcttcc ctgagccaga gccttctgct c 41
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 17
tggaggagaa ccctggacct ggagctcagg tctcctccca 40
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 18
ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ct 42
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 19
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacg 46
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 20
gggaagcttt tattgcaggc gaggcagtgt a 31
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 21
atctcgagat gggtctgggc gacctgatcg aagg 34
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 22
gccggtacct tagtatgtag tcagaccctt ttcg 34
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 23
attctagaat gggtctgcct gtgctgaaca cccc 34
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 24
aagttagtag ctccgcttcc ttgaggcata gcttcctgg 39
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 25
tggaggagaa ccctggacct ggtctgcctg tgctgaacac 40
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 26
gggaagcttt tattgggtgc gagggacggt aatgttg 37
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 27
atctcgagat gggtatcgag gacctgatta ccg 33
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 28
gccggtacct tagtaggtag tcagaccctt ttcg 34
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 29
attctagaat gggtctgcct gtgctgaaca c 31
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 30
aagttagtag ctccgcttcc ctgtggcaga gcggattgg 39
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 31
tggaggagaa ccctggacct ggtgcccagg tgtcctccc 39
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 32
gggaagcttt tactggaatt tgggagcggt c 31
Claims (10)
1.一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，其特征在于：该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3三个基因中任一个基因位于启动子1下游；另外两个基因之间通过2A序列连接位于启动子2下游；2个启动子启动表达的方向相反；
其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；
所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I 型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；
所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列。
2.一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，其特征在于：该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP1基因位于启动子1下游，构成“启动子1-VP1”的结构；脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0和VP3基因通过2A序列连接位于启动子2下游，构成“启动子2-VP3-2A-VP0”的结构；上述2个启动子启动表达的方向相反；
其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；
所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I 型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；
所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列。
3.权利要求1～2任一所述的一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）根据脊髓灰质炎病毒的P1基因序列，根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化，合成优化的 P1基因序列；
2）根据优化的 P1基因序列，设计引物将VP0、VP1、VP3中任一个基因先克隆至骨架载体中，位于骨架载体的一个启动子的下游，再将另2个基因通过2A序列进行连接，并将连接好的片段克隆至同一骨架载体的另一个启动子的下游；所得重组载体即为表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体。
4.权利要求3所述的一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞为Spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞Sf9、酿酒酵母或哺乳细胞。
5.根据权利要求3所述的一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，其特征在于：所述骨架载体根据宿主细胞的类型选择相应的骨架载体。
6.根据权利要求4或5所述的一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，其特征在于：所述骨架载体为pFastBacTM-Dual载体、pESC URA载体、pVIVO2-mcs载体或pBudCE4.1载体。
7.权利要求3所述的一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，其特征在于：所述优化的 P1基因序列为：
若脊髓灰质炎病毒为I 型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：1所示；
若脊髓灰质炎病毒为II 型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：2所示；
若脊髓灰质炎病毒为III型，优化的 P1基因序列如SEQ ID NO：3所示。
8.一种脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将权利要求1～2任一所述的或权利要求3～7任一所述制备方法制备的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体转染相应的宿主细胞，培养后可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒或者重组脊髓灰质炎杆状病毒；
2）若步骤1）中获得的是重组脊髓灰质炎杆状病毒，再将重组脊髓灰质炎杆状病毒感染宿主细胞，经培养后即可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒。
9.根据权利要求8所述的一种脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将将权利要求1～2任一所述的或权利要求3～7任一所述制备方法制备的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，培养后提取重组大肠杆菌DH10 Bac的质粒，获得重组杆状病毒载体；
2）将上一步获得的重组杆状病毒载体转染宿主细胞，培养后得到包含编码病毒样颗粒蛋白基因的重组杆状病毒；
3）将上一步获得的重组杆状病毒感染宿主细胞，培养后获得病毒样颗粒，即为脊髓灰质炎病毒样颗粒；
其中，所述的宿主细胞为昆虫细胞Sf9；
在上述步骤3）中将重组杆状病毒感染宿主细胞后，在宿主细胞中表达病毒样颗粒蛋白，所表达的病毒样颗粒蛋白组装成病毒样颗粒，并分泌到宿主细胞外，然后将细胞培养上清初步离心去除细胞碎片，再将上清液经pellicon膜包进行浓缩，再经蔗糖纯化，即可获得脊髓灰质炎病毒样颗粒，可作为免疫样品。
10.权利要求8～9任一所述的制备方法制备的脊髓灰质炎病毒样颗粒在制备抗脊髓灰质炎I 型、II型或III 型病毒疫苗药物中的应用。
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