CN115707777B

CN115707777B - 重组肠道病毒a71病毒样颗粒及其用途

Info

Publication number: CN115707777B
Application number: CN202110962240.XA
Authority: CN
Inventors: 刘庆伟; 王晓黎; 刘艳; 石娜; 张玺; 边金; 王欣; 王佳敏
Original assignee: Huasong Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Huasong Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN115707777A

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒由基因组中整合有编码肠道病毒A71的VP0、VP3和VP1衣壳蛋白的细胞系产生。本发明还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。所述预防手足口病产品为药物组合物，例如为疫苗组合物。在免疫原性研究中发现本发明的肠道病毒A71VLP可在小鼠体内诱导良好的免疫反应，提示该VLP可作为肠道病毒A71的候选疫苗。

Description

重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途。

背景技术

手足口病是一种5岁以下儿童常见的婴幼儿传染病，主要临床表现为手、足和口等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎、心肌炎等一系列并发症甚至导致死亡。手足口病是由人肠道病毒属的柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10和B组2、5型以及肠道病毒71型和埃可病毒30感染引起的，其中肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16是导致手足口病暴发的主要病原体。疫苗是预防肠道病毒A71感染的最有效的方法，目前已有针对肠道病毒A71的灭活疫苗。

肠道病毒71属于小RNA病毒科肠道病毒属，是无包膜的二十面立体对称球形颗粒，直径约30nm，其基因组是单股正链RNA，两端为保守的非编码区，中间为含有1个开放阅读框的编码区，此编码区又分为P1、P2、P3区。P1的翻译产物可以被病毒蛋白酶3CD加工产生衣壳蛋白亚基VP1、VP0和VP3，并进一步组装成病毒的衣壳。据报道，肠道病毒A71灭活病毒可以诱导小鼠产生良好的免疫反应，不过灭活疫苗存在表位破坏、灭活不充分以及成本高等问题。病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)与病毒在形态与组成上相似，可诱导较好的免疫反应，同时具有安全性好和成本低的优点，因此VLP为肠道病毒A71疫苗的开发提供了一种方案。研究表明，共表达肠道病毒A71结构蛋白P1和非结构蛋白3CD后可切割为VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，并进一步组装成肠道病毒A71 VLP，且该VLP可以保护小鼠免受肠道病毒A71致死性攻击。但通过共表达P1和3CD获取的VLP，可能存在P1的不完全切割及病毒蛋白酶3CD潜在的残留风险；此外，VP1衣壳蛋白易发生降解，这些均会影响VLP组成的一致性，这对产品的质量控制造成较大的潜在风险。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供多核苷酸，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码肠道病毒A71其他衣壳蛋白的核苷酸。

本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述多核苷酸。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。

本发明还提供一种重组肠道病毒A71病毒样颗粒，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒包括VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括肠道病毒A71其他衣壳蛋白。

本发明还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

本发明还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

如上所述，本发明的重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，具有以下有益效果：病毒样颗粒与病毒在形态与组成上相似，免疫原性研究发现肠道病毒A71 VLP可在小鼠体内诱导良好的中和抗体水平，即可诱导较好的免疫反应，为肠道病毒A71疫苗的开发提供了解决方案，该VLP可作为肠道病毒A71的候选疫苗，为预防肠道病毒A71感染提供有效方法。

附图说明

图1显示为本发明的pPink/HC-A71 VP031表达质粒的表达框示意图，PAOX1为AOX1启动子，CYC1 TT为CYC1终止子，VP0、VP3和VP1为肠道病毒A71衣壳蛋白序列。

图2显示为SDS-PAGE分析肠道病毒A71 VLP，其中(A)为A71 VLP^-full的SDS-PAGE分析，(B)为A71 VLP^-N50的SDS-PAGE分析，(C)为A71 VLP^-N72的SDS-PAGE分析。

图3显示为肠道病毒A71 VLP的粒径分析图，其中(A)为A71 VLP^-full的动态光散射分析，(B)为A71 VLP^-N50的动态光散射分析，(C)为A71 VLP^-N72的动态光散射分析。

图4显示肠道病毒A71 VLP免疫血清特异抗体滴度，其中(A)第二次免疫后血清滴度(A71 VLP^-full、A71 VLP^-N50及A71 VLP^-N72免疫原性比较)；(B)为第三次免疫后血清滴度(A71 VLP^-full、A71 VLP^-N50及A71 VLP^-N72免疫原性比较)。为了方便统计，将OD450nm吸光值大于0.15的最高稀释倍数的倒数定位该样品的特异抗体滴度，横线显示为几何平均值。

具体实施方式

为避免结构蛋白P1的不完全切割，本发明构建了含有肠道病毒A71 VP0、VP3和VP1三个串联表达框的毕赤酵母表达菌株，并成功纯化了VLP^-full。为了解决VP1的降解问题，本发明在串联表达肠道病毒A71 VP0、VP3和VP1的基础上，对VP1 N端进行50个和72个氨基酸的截短，并获得了毕赤酵母表达菌株和纯化后的VLP^-N50和VLP^-N72。SDS-PAGE显示VLP^-N50和VLP^-N72的VP1均无明显降解，且免疫小鼠发现不论VLP^-N50还是VLP^-N72诱导的免疫水平均与VLP^-full相当。因此，经串联表达衣壳蛋白VP0、VP3和截短VP1获得的肠道病毒A71 VLP不仅解决了P1不完全切割和VP1降解的组成均一性问题，同时兼具良好的免疫原性，为肠道疫病毒A71疫苗的研发提供了新思路。

基于以上，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的VP0、VP3和VP1衣壳蛋白的核苷酸，不包括RBS序列和编码肠道病毒A71其他衣壳蛋白的核苷酸。

如图1所示，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的VP0、VP3和VP1衣壳蛋白的的核苷酸排列顺序为：VP0-VP3-VP1。

所述多核苷酸中表达各衣壳蛋白的表达框在所述多核苷酸中串联。

在如图1所示的实施例中，具体的串联方式为启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子。当然，在其他实施方式中，三个表达框的串联方式也可以是以下中的任一种：启动子-VP0-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP0-终止子-启动子-VP1-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP0-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP0-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子。在一种实施方式中，所述启动子为AOX1启动子，所述终止子为CYC1终止子。由于各蛋白均为独立的开放阅读框，因此不同的串联方式均能达到与实施例相同的效果。

所述编码肠道病毒A71的VP0衣壳蛋白的核苷酸为VP0全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码肠道病毒VP1衣壳蛋白的核苷酸为VP1全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码肠道病毒VP3衣壳蛋白的核苷酸为编码肠道病毒A71的VP3衣壳蛋白的全长核苷酸序列或截短的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述截短的核苷酸可以是VP1截短0-216个核苷酸，VP0截短0-243个核苷酸，VP3截短0-171个核苷酸。

在一种实施方式中，所述多核苷酸编码的肠道病毒A71的VP1衣壳蛋白为截短45-75个氨基酸的VP1衣壳蛋白。优选的，为截短50～72个氨基酸。具体的，例如为以下中的任一：截短45～50个氨基酸、截短50～55个氨基酸、截短55～60个氨基酸、截短60～65个氨基酸、截短65～70个氨基酸、截短70～72个氨基酸、截短72～75个氨基酸。

在一种实施方式中，编码肠道病毒A71的VP0衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。编码肠道病毒A71的VP3衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。编码肠道病毒A71的VP1衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。

在一种实施方式中，与SEQ ID NO.8～12所示序列的同源性在95％以上的序列，或与SEQ ID NO.8～12所示序列互补的序列也能达到与本发明实施例相同的效果。

所述多核苷酸中不包括编码P1、3CD蛋白的核苷酸。

所述多核苷酸的序列为经过密码子优化后得到的序列。

在一种实施方式中，所述编码肠道病毒A71的VP0衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VP0衣壳蛋白；所述编码肠道病毒A71的VP3衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VP3衣壳蛋白；所述编码肠道病毒A71的VP1衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的VP1衣壳蛋白。

在一种实施方式中，所述肠道病毒A71的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列选自以下任一项：1)如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列；2)与SEQ ID NO:5或SEQID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列的同源性在95％、96％、97％、98％或99％以上的序列；3)与前两项任一所述的序列互补的序列。

术语“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段，所述核酸构建体包括载体骨架即表达载体与表达框，所述核酸构建体可以为质粒。

所述核酸构建体中VP0、VP3和VP1表达框可以是各自独立的单拷贝或多拷贝。较佳的，所述核酸构建体中VP0、VP3和VP1表达框均为单拷贝。

所述核酸构建体中除包括所述多核苷酸中所含的肠道病毒A71的衣壳蛋白核苷酸外，不包括编码肠道病毒A71其他衣壳蛋白的核苷酸。

在一种实施方式中，所述核酸构建体还包括表达载体。所述表达载体可以是现有技术中任意适于表达肠道病毒的表达载体，例如为酵母表达载体。较佳的为毕赤酵母表达载体pPink-HC(厂家：Invitrogen)。

在一种实施方式中，所述核酸构建体核苷酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。

所述细胞系为真核细胞。在一种实施方式中，所述细胞系为将所述核酸构建体转导入毕赤酵母细胞得到。

所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒由所述细胞系产生。

重组肠道病毒A71病毒样颗粒的水合直径为35nm～45nm。所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒的大小均一。

本发明还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)培养所述细胞系，使其表达重组肠道病毒A71病毒样颗粒；

2)分离出所述细胞系表达的重组肠道病毒A71病毒样颗粒。

在一种实施方式中，培养所述细胞系的条件为28℃-30℃，250-300rpm。

在一种实施方式中，所述细胞系通过将所述核酸构建体转导入宿主细胞得到。在一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

在一种实施方式中，所述核酸构建体的制备方法包括如下步骤：

1)将密码子优化后的表达肠道病毒A71衣壳蛋白的核苷酸分别克隆入不同的表达载体中，获得中间构建体；

2)将步骤1)获得的中间构建体重组后获得所述核酸构建体。

在一种实施方式中，所述手足口病为肠道病毒A71感染的手足口病。

所述预防手足口病产品为药物组合物。所述药物组合物例如为疫苗组合物。

所述药物组合物可以是单价的(仅含有一种病毒样颗粒)，也可以是多价的(含有多种病毒样颗粒)。

所述药物组合物可制备成各种常规剂型，例如：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

所述药物组合物包括预防或治疗有效量的本发明病毒样颗粒或多核苷酸。

术语“预防或治疗有效量”指药物组合物治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

在一种实施方式中，为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于药物组合物(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

所述药物组合物例如为疫苗组合物。疫苗组合物可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物的途径包括：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例中利用毕赤酵母串联表达肠道病毒A71的VP0、VP3和不同程度N端氨基酸截短的VP1(N50和N72)衣壳蛋白，获得了成功组装的肠道病毒A71 VLP^-N50和A71 VLP^-N72，这两种VLP不存在P1不完全切割的问题且VP1无明显降解，解决了肠道病毒A71 VLP组成均一性及可能潜在的安全性问题；进一步的免疫原性研究发现A71 VLP^-N50和A71 VLP^-N72均可在小鼠体内诱导良好的抗体水平，提示这两种VLP可作为肠道病毒A71的候选疫苗。

实施例1肠道病毒A71表达质粒构建

为了使表达达到最优，将肠道病毒A71结构蛋白P1氨基酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化合成。利用EcoRⅠ和KpnⅠ位点连入pPinK-HC质粒中，得到质粒pPink/HC-A71P1。肠道病毒A71结构蛋白P1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中1-323为VP0氨基酸序列(SEQ ID NO:3)，326-565为VP3氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，566-862为VP1氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，即SEQ ID NO:2中的1-969。VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，即SEQ ID NO:2中的970-1695。VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，即SEQ ID NO:2中的1696-2586。VP1^-N50的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。VP1^-N72的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。VP1^-N50的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。VP1^-N72的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

表达质粒的制备：根据优化后VP0、VP1、VP3的核苷酸序列及表达载体pPink-HC(购自Invitrogen)多克隆位点处序列设计合成重组引物(表1，其中HS71VP1^-N50-R和HS71VP1^-N72-R与HS71VP1-R序列相同，表1中未重复列出)，使用同源重组试剂盒(购自诺唯赞)将VP0、VP3、VP1、VP1^-N50和VP1^-N72通过重组的方式分别连接到载体pPinK-HC中分别得到中间质粒pPink/HC-A71 VP0、pPink/HC-A71 VP3、pPink/HC-A71 VP1、pPink/HC-A71 VP1^-N50和pPink/HC-A71 VP1^-N72；利用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ以酶切连接的方法依次将中间质粒中A71VP3表达框和A71 VP0表达框连入pPink/HC-A71 VP1、pPink/HC-A71 VP1^-N50或pPink/HC-A71 VP1^-N72中，分别得到终质粒pPink/HC-A71 VPN^-full(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)、pPink/HC-A71 VPN^-N50(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)和pPink/HC-A71 VPN^-N72(核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示)，示意图如图1所示。

表1同源重组引物序列

引物名称	序列号	引物序列
			HS71 VP0-F	SEQ ID NO:16	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggcagccaggtgtccac-3’
HS71VP0-R	SEQ ID NO:17	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattactgggtcacggcctgtctc-3’
			HS71VP3-F	SEQ ID NO:18	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggcttccccaccgagc-3’
HS71VP3-R	SEQ ID NO:19	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattactggatggtgccggtctgcag-3’
			HS71VP1-F	SEQ ID NO:20	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggcgaccgggtggccg-3’
HS71VP1-R	SEQ ID NO:21	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattacagtgtggtgatggcggtc-3’
			HS71VP1^-N50-F	SEQ ID NO:22	5’-acaactaattattcgaaacggaattcaccatggaaattggagcttcttcc-3’
HS71VP1^-N72-F	SEQ ID NO:23	5’-aactaattattcgaaacggaattcaccatgcacagcacggctgagactac-3’

实施例2肠道病毒A71高表达菌株的筛选、表达与纯化

高表达菌株的筛选

将实施例1制备的三个终质粒pPink/HC-A71 VPN^-full、pPink/HC-A71 VPN^-N50或pPink/HC-A71 VPN^-N72分别使用内切酶AflⅡ进行线性化，并用乙醇沉淀法进行纯化回收；利用电转的方法将线性化质粒分别导入不同的毕赤酵母中进行基因重组，涂布PAD平板与30℃进行培养；3天后，挑取大的白色菌落与24孔深孔板中进行甲醇诱导表达，诱导表达48h后收取诱导菌体使用营养筛选法和夹心ELISA的方法进行表达检测，表达量高的作为高表达株A71 VLP^-full、A71 VLP^-N50和A71 VLP^-N72，各高表达菌株目的基因序列经测序分析与理论核苷酸序列一致。

夹心ELISA方法所用的兔抗肠道病毒A71多抗血清和肠道病毒A71特异的鼠单抗均为本公司自制，制备步骤如下：(1)兔抗肠道病毒A71多抗血清：将纯化后的肠道病毒A71VLP(500μg/只)与弗氏佐剂1:1混合乳化后皮下多点注射成年的新西兰大白兔(1ml/只)，两次免疫间隔4周共免疫4次，第4次免疫2周后采取兔血清备用；(2)肠道病毒A71特异的鼠单抗：将纯化后的肠道病毒A71 VLP(5μg/只)与铝佐剂(500μg/只)充分混合后，腹腔注射小鼠，两次免疫间隔2周共免疫4次，第4次免疫后2周取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后筛选得到肠道病毒A71特异的鼠单抗细胞株，将该细胞株腹腔注射小鼠后获得腹水，经protein G填料纯化后获得A71特异的鼠单抗备用。

夹心ELISA方法操作步骤如下：将兔抗肠道病毒A71多抗血清按1:2000进行稀释包被于96孔酶标板中，50μl/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将菌体用PBS重悬，加入等体积玻璃珠后70HZ破碎120s，离心后取上清备用；破菌上清和肠道病毒A71 VLP自制标品用2％脱脂奶粉进行适当的稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入肠道病毒A71特异的鼠单抗，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值，并根据标曲计算VLP含量。

表达与纯化

将筛选得到的高表达株A71 VLP^-full、A71 VLP^-N50和A71 VLP^-N72分别接种于BMGY培养基，培养24h后更换为BMMY培养基进行诱导表达，诱导48h离心收获菌体。将菌体用PBS重悬后使用高压匀浆机1200bar进行破菌，离心后收集上清进行PEG沉降，复溶后的上清使用DEAE填料进行纯化，最终获得目的VLPs，分别命名为A71 VLP^-full、A71 VLP^-N50和A71 VLP^-N72。

实施例3肠道病毒A71 VLP聚丙烯酰胺凝胶电泳

将纯化后的样品与上样缓冲液混合，100℃加热5-10min后上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色。蔗糖梯度样品SDS-PAGE结果显示各VLP均由VP0、VP1和VP3组成，A71 VLP^-full(图2A)的VP1出现降解，而A71 VLP^-N50(图2B)和A71VLP^-N72(图2C)无明显降解。此外，由于是串联表达VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，故A71 VLP^-full、A71 VLP^-N50和A71 VLP^-N72不存在切割不完全的问题，也不存在3CD残留问题。

实施例4肠道病毒A71 VLP的粒径研究

将纯化后的肠道病毒A71 VLP用PBS稀释至50-200ng/μl，取1ml加入样品池中，避免产生气泡，将样品池放入Zetasizer设备中采用动态光散射的方法测定其水合直径并进行数据分析。结果如图3所示，A71 VLP^-full、A71 VLP^-N50和A71 VLP^-N72的水合直径相似均为40nm左右，故A71 VLP^-full、A71 VLP^-N50和A71 VLP^-N72均组装良好。

实施例5肠道病毒A71 VLP的免疫原性

为了确定VP1 N端的截短是否影响肠道病毒A71 VLP的免疫原性，将A71 VLP^-full、A71VLP^-N50和A71 VLP^-N72分别免疫小鼠，具体步骤如下：6-8周龄雌性ICR小鼠，共分为2组，每组5-6只。将VLP^-full(5μg/只)、VLP^-N50(5μg/只)或VLP^-N72(5μg/只)与铝佐剂(80μg/只)室温振荡吸附1-2h，然后进行腹腔注射，共免疫3次，每两次免疫之间间隔2周。分别于第二次免疫后和第三次免疫后2周采取小鼠血清测定特异抗体滴度。

肠道病毒A71 VLP特异抗体滴度测定

将兔抗肠道病毒A71 VLP包被于96孔酶标板中，20ng/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将血清样品用2％脱脂奶粉进行倍比稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值。如图4A-B所示，不论免疫2次(图4A)还是3次(图4B)VLP^-N50和VLP^-N72均可诱导与VLP^-full相当水平的特异性抗体。

使用GraphPad Prism 8.3.0进行数据处理，使用t检验进行差异分析，P＜0.05，*，P＜0.01，**，P＜0.001，***。

本发明将含肠道病毒A71 VP0、VP1与VP3串联表达框的表达载体导入毕赤酵母，以达到同时表达肠道病毒A71 VP0、VP1与VP3衣壳蛋白的目的，经检测发现VP0、VP1与VP3衣壳蛋白可成功表达且可自发组装VLP。VLP^-full不存在P1切割不完全的问题，可在小鼠体内诱导较高特异抗体反应，但VLP^-full仍存在VP1不同程度降解的问题。为解决该问题，本发明在衣壳蛋白串联表达的基础上对VP1 N端进行不同程度的截短，SDS-PAGE结果显示VLP^-N50和VLP^-N72的VP1均无明显的降解；此外，VLP^-N50和VLP^-N72，亦可诱导良好的免疫反应，且抗体水平与VLP^-full相当。

综上，VLP^-N50和VLP^-N72组成均一且免疫原性良好，可用于肠道病毒A71进一步的疫苗研发。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 华淞（上海）生物医药科技有限公司

<120> 重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Thr Ala Gly Lys Gln Ser Leu Lys Gln

35 40 45

Asp Pro Asp Lys Phe Ala Asn Pro Val Lys Asp Ile Phe Thr Glu Met

50 55 60

Ala Ala Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Ile Val Gly Tyr Gly Glu Trp Pro Ser Tyr Cys Ser

100 105 110

Asp Ser Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Lys Leu Trp Glu Lys Ser Ser

130 135 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Ile Gly Thr Val Ala Gly Gly Thr

195 200 205

Gly Thr Glu Asp Ser His Pro Pro Tyr Met Gln Thr Gln Pro Gly Ala

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Leu Gln His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

225 230 235 240

Ile Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr

245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro Ile

275 280 285

Ser Pro Leu Asp Tyr Asp Gln Gly Ala Thr Pro Val Ile Pro Ile Thr

290 295 300

Ile Thr Leu Ala Pro Met Cys Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

305 310 315 320

Val Thr Gln Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe

325 330 335

Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Asn Phe His

340 345 350

Pro Thr Pro Cys Ile His Ile Pro Gly Glu Val Arg Asn Leu Leu Glu

355 360 365

Leu Cys Gln Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Val Pro Thr Asn

370 375 380

Ala Thr Ser Leu Met Glu Arg Leu Arg Phe Pro Val Ser Ala Gln Ala

385 390 395 400

Gly Lys Gly Glu Leu Cys Ala Val Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asn

405 410 415

Gly Pro Trp Gln Ser Thr Leu Leu Gly Gln Leu Cys Gly Tyr Tyr Thr

420 425 430

Gln Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe

435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro

450 455 460

Leu Pro Lys Asp Arg Ala Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp

465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser

485 490 495

Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Asp Gly Val Phe Asp Tyr Tyr

500 505 510

Thr Thr Gly Leu Val Ser Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro

515 520 525

Ile Gly Ala Pro Asn Thr Ala Tyr Ile Ile Ala Leu Ala Ala Ala Gln

530 535 540

Lys Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Ala Ser Asp Ile Leu Gln

545 550 555 560

Thr Gly Thr Ile Gln Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser

565 570 575

Ile Gly Asp Ser Val Ser Arg Ala Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ala Pro

580 585 590

Thr Gly Gln Asn Thr Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys

595 600 605

Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser

610 615 620

Asp Glu Ser Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr

625 630 635 640

Ala Glu Thr Thr Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly

645 650 655

Glu Ile Asp Leu Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Ser Gly Tyr Ala

660 665 670

Asn Trp Asp Ile Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val

675 680 685

Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala

690 695 700

Cys Thr Pro Thr Gly Gln Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe

705 710 715 720

Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp

725 730 735

Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro

740 745 750

Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp

755 760 765

Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp

770 775 780

Leu Glu Tyr Gly Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val

785 790 795 800

Arg Thr Val Gly Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile

805 810 815

Tyr Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg

820 825 830

Asn Gln Asn Tyr Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser

835 840 845

Ile Lys Pro Thr Gly Thr Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu

850 855 860

<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggggtctc aggtcagcac gcagcgaagc gggtcgcacg aaaacagcaa ttccgctacc 60

gagggatcaa ccatcaatta tacgactatc aactactata aggattcgta cgcggcgact 120

gccggcaagc aaagtttaaa gcaagatccc gacaagtttg caaatccggt taaggatatc 180

ttcacggaga tggcagcccc attaaagtcg ccatctgcag aggcttgtgg ttacagtgat 240

cgtgtagctc agctcaccat aggaaactca accattacaa ctcaagaggc cgcgaacatt 300

atagtagggt acggcgagtg gccaagttat tgctccgact cggacgctac cgcagtggat 360

aaaccaactc gtcctgacgt ttcagtcaac cgtttttata ctctggatac gaagttgtgg 420

gaaaagtcca gcaaggggtg gtattggaag tttcctgacg tactgaccga gactggagtt 480

ttcggacaga atgcccaatt ccattatcta tatcggagtg gcttctgtat acatgtacag 540

tgcaacgcat ctaaattcca ccagggagct ctactcgttg cagtcctgcc ggaatacgtg 600

ataggaacag ttgcaggggg aactggaact gaagactccc atccgccata tatgcaaaca 660

cagccagggg ccgacgggtt cgaattgcag cacccgtacg tactagacgc cggcataccg 720

atatctcagc taacagtatg cccccaccaa tggatcaatc tccgcacaaa caattgtgct 780

acaattattg tcccctatat caatgcctta ccctttgact cagcacttaa tcattgtaat 840

ttcggtcttt tggtggttcc catttccccg ctagactatg atcagggcgc aacccccgtt 900

atacctataa caattacatt agcgcccatg tgttcggagt tcgcgggtct gcgccaagca 960

gtcacgcagg gctttccgac ggaactgaaa cctggtacta atcaatttct aaccactgac 1020

gacggggtga gtgcgccaat cctacccaat ttccatccga cgccatgtat tcatatccct 1080

ggcgaagtga ggaatctgct cgagctctgc caagttgaga ccatcttgga ggttaacaac 1140

gtgccaacta acgccacttc gttaatggag cggcttcgtt ttcccgtgag tgcacaagca 1200

ggtaaaggcg aattatgcgc agtgttccgg gcagatccag gccgaaatgg cccttggcag 1260

agcacccttc ttggacagtt gtgcggttat tatacccagt ggtctggtag cctcgaagtg 1320

acattcatgt tcacagggtc ctttatggct accggtaaaa tgctgatcgc ctatactcct 1380

ccagggggtc ctctcccaaa agaccgcgcc acggcgatgt tgggtactca cgtgatctgg 1440

gatttcggct tgcaatcctc agtaacgcta gtcatccctt ggatttcaaa tacgcattat 1500

agagcacatg cgcgagatgg ggtatttgac tactatacta cggggcttgt ctctatatgg 1560

tatcaaacga attatgtcgt acccattggc gccccgaata cggcgtacat aatcgccctg 1620

gctgcggctc agaaaaactt cacgatgaag ttgtgtaaag acgcgtcgga tatacttcag 1680

acaggaacga tccagggtga tcgggtagct gacgtgatcg agtctagtat cggggactca 1740

gtttcgaggg ccctcactca agccctccca gccccaacag gccaaaacac acaagtaagt 1800

tctcatagac tcgataccgg taaagtacca gcgttgcaag ccgctgaaat tggagcttct 1860

tccaacgcgt ctgatgaatc aatgattgag acgagatgcg tattaaactc gcacagcacg 1920

gctgagacta ccttagattc tttcttttca agggccggac tagtgggaga aattgacctg 1980

cctctcgagg ggactacaaa cccgagcggc tatgcgaact gggacattga tatcacaggt 2040

tacgcgcaaa tgagacggaa agtcgaacta ttcacataca tgcgttttga tgcagaattt 2100

accttcgttg cttgcacacc gaccgggcag gtagttccgc aacttttgca atacatgttc 2160

gtcccgcccg gagctccaaa accggattcg agagagtctc ttgcatggca gacagccacg 2220

aatccatccg tttttgtcaa actgtcagac ccgcccgctc aagtcagtgt cccctttatg 2280

tcccccgcaa gcgcttacca gtggttttac gatggttatc ctacgtttgg tgagcacaaa 2340

caggaaaaag atttagaata cggagcctgt cctaataata tgatgggcac gtttagtgta 2400

aggacagtgg gaaccagcaa gtcgaagtac cctcttgtcg tccgcatata catgagaatg 2460

aagcacgttc gagcatggat accgaggcct atgcgaaacc aaaactatct gtttaaagcg 2520

aatcctaact atgcgggtaa tagtattaag cctaccggta cttctcgcac agccataacc 2580

acttta 2586

<210> 3

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Thr Ala Gly Lys Gln Ser Leu Lys Gln

35 40 45

Asp Pro Asp Lys Phe Ala Asn Pro Val Lys Asp Ile Phe Thr Glu Met

50 55 60

Ala Ala Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Ile Val Gly Tyr Gly Glu Trp Pro Ser Tyr Cys Ser

100 105 110

Asp Ser Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Lys Leu Trp Glu Lys Ser Ser

130 135 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Ile Gly Thr Val Ala Gly Gly Thr

195 200 205

Gly Thr Glu Asp Ser His Pro Pro Tyr Met Gln Thr Gln Pro Gly Ala

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Leu Gln His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

225 230 235 240

Ile Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr

245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro Ile

275 280 285

Ser Pro Leu Asp Tyr Asp Gln Gly Ala Thr Pro Val Ile Pro Ile Thr

290 295 300

Ile Thr Leu Ala Pro Met Cys Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

305 310 315 320

Val Thr Gln

<210> 4

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr

1 5 10 15

Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Asn Phe His Pro Thr

20 25 30

Pro Cys Ile His Ile Pro Gly Glu Val Arg Asn Leu Leu Glu Leu Cys

35 40 45

Gln Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Val Pro Thr Asn Ala Thr

50 55 60

Ser Leu Met Glu Arg Leu Arg Phe Pro Val Ser Ala Gln Ala Gly Lys

65 70 75 80

Gly Glu Leu Cys Ala Val Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asn Gly Pro

85 90 95

Trp Gln Ser Thr Leu Leu Gly Gln Leu Cys Gly Tyr Tyr Thr Gln Trp

100 105 110

Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala

115 120 125

Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro Leu Pro

130 135 140

Lys Asp Arg Ala Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp Phe

145 150 155 160

Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr

165 170 175

His Tyr Arg Ala His Ala Arg Asp Gly Val Phe Asp Tyr Tyr Thr Thr

180 185 190

Gly Leu Val Ser Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Ile Gly

195 200 205

Ala Pro Asn Thr Ala Tyr Ile Ile Ala Leu Ala Ala Ala Gln Lys Asn

210 215 220

Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Ala Ser Asp Ile Leu Gln Thr Gly

225 230 235 240

Thr Ile Gln

<210> 5

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser

1 5 10 15

Val Ser Arg Ala Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn

20 25 30

Thr Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro Ala Leu

35 40 45

Gln Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met

50 55 60

Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr

65 70 75 80

Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu

85 90 95

Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Ser Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile

100 105 110

Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr

115 120 125

Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr

130 135 140

Gly Gln Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly

145 150 155 160

Ala Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr

165 170 175

Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser

180 185 190

Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly

195 200 205

Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly

210 215 220

Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly

225 230 235 240

Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met

245 250 255

Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr

260 265 270

Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr

275 280 285

Gly Thr Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu

290 295

<210> 6

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met Ile Glu

1 5 10 15

Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu Asp

20 25 30

Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro Leu

35 40 45

Glu Gly Thr Thr Asn Pro Ser Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp Ile

50 55 60

Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr Met

65 70 75 80

Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly Gln

85 90 95

Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro

100 105 110

Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro

115 120 125

Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro

130 135 140

Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro

145 150 155 160

Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala Cys

165 170 175

Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr Ser

180 185 190

Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys His

195 200 205

Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu Phe

210 215 220

Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly Thr

225 230 235 240

Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu

245

<210> 7

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala

1 5 10 15

Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met

35 40 45

Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe

50 55 60

Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly Gln Val Val Pro Gln Leu Leu

65 70 75 80

Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu

85 90 95

Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu

100 105 110

Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser

115 120 125

Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys

130 135 140

Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly

145 150 155 160

Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu

165 170 175

Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro

180 185 190

Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr

195 200 205

Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly Thr Ser Arg Thr Ala Ile Thr

210 215 220

Thr Leu

225

<210> 8

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggggtctc aggtcagcac gcagcgaagc gggtcgcacg aaaacagcaa ttccgctacc 60

gagggatcaa ccatcaatta tacgactatc aactactata aggattcgta cgcggcgact 120

gccggcaagc aaagtttaaa gcaagatccc gacaagtttg caaatccggt taaggatatc 180

ttcacggaga tggcagcccc attaaagtcg ccatctgcag aggcttgtgg ttacagtgat 240

cgtgtagctc agctcaccat aggaaactca accattacaa ctcaagaggc cgcgaacatt 300

atagtagggt acggcgagtg gccaagttat tgctccgact cggacgctac cgcagtggat 360

aaaccaactc gtcctgacgt ttcagtcaac cgtttttata ctctggatac gaagttgtgg 420

gaaaagtcca gcaaggggtg gtattggaag tttcctgacg tactgaccga gactggagtt 480

ttcggacaga atgcccaatt ccattatcta tatcggagtg gcttctgtat acatgtacag 540

tgcaacgcat ctaaattcca ccagggagct ctactcgttg cagtcctgcc ggaatacgtg 600

ataggaacag ttgcaggggg aactggaact gaagactccc atccgccata tatgcaaaca 660

cagccagggg ccgacgggtt cgaattgcag cacccgtacg tactagacgc cggcataccg 720

atatctcagc taacagtatg cccccaccaa tggatcaatc tccgcacaaa caattgtgct 780

acaattattg tcccctatat caatgcctta ccctttgact cagcacttaa tcattgtaat 840

ttcggtcttt tggtggttcc catttccccg ctagactatg atcagggcgc aacccccgtt 900

atacctataa caattacatt agcgcccatg tgttcggagt tcgcgggtct gcgccaagca 960

gtcacgcag 969

<210> 9

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgggctttc cgacggaact gaaacctggt actaatcaat ttctaaccac tgacgacggg 60

gtgagtgcgc caatcctacc caatttccat ccgacgccat gtattcatat ccctggcgaa 120

gtgaggaatc tgctcgagct ctgccaagtt gagaccatct tggaggttaa caacgtgcca 180

actaacgcca cttcgttaat ggagcggctt cgttttcccg tgagtgcaca agcaggtaaa 240

ggcgaattat gcgcagtgtt ccgggcagat ccaggccgaa atggcccttg gcagagcacc 300

cttcttggac agttgtgcgg ttattatacc cagtggtctg gtagcctcga agtgacattc 360

atgttcacag ggtcctttat ggctaccggt aaaatgctga tcgcctatac tcctccaggg 420

ggtcctctcc caaaagaccg cgccacggcg atgttgggta ctcacgtgat ctgggatttc 480

ggcttgcaat cctcagtaac gctagtcatc ccttggattt caaatacgca ttatagagca 540

catgcgcgag atggggtatt tgactactat actacggggc ttgtctctat atggtatcaa 600

acgaattatg tcgtacccat tggcgccccg aatacggcgt acataatcgc cctggctgcg 660

gctcagaaaa acttcacgat gaagttgtgt aaagacgcgt cggatatact tcagacagga 720

acgatccag 729

<210> 10

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggtgatc gggtagctga cgtgatcgag tctagtatcg gggactcagt ttcgagggcc 60

ctcactcaag ccctcccagc cccaacaggc caaaacacac aagtaagttc tcatagactc 120

gataccggta aagtaccagc gttgcaagcc gctgaaattg gagcttcttc caacgcgtct 180

gatgaatcaa tgattgagac gagatgcgta ttaaactcgc acagcacggc tgagactacc 240

ttagattctt tcttttcaag ggccggacta gtgggagaaa ttgacctgcc tctcgagggg 300

actacaaacc cgagcggcta tgcgaactgg gacattgata tcacaggtta cgcgcaaatg 360

agacggaaag tcgaactatt cacatacatg cgttttgatg cagaatttac cttcgttgct 420

tgcacaccga ccgggcaggt agttccgcaa cttttgcaat acatgttcgt cccgcccgga 480

gctccaaaac cggattcgag agagtctctt gcatggcaga cagccacgaa tccatccgtt 540

tttgtcaaac tgtcagaccc gcccgctcaa gtcagtgtcc cctttatgtc ccccgcaagc 600

gcttaccagt ggttttacga tggttatcct acgtttggtg agcacaaaca ggaaaaagat 660

ttagaatacg gagcctgtcc taataatatg atgggcacgt ttagtgtaag gacagtggga 720

accagcaagt cgaagtaccc tcttgtcgtc cgcatataca tgagaatgaa gcacgttcga 780

gcatggatac cgaggcctat gcgaaaccaa aactatctgt ttaaagcgaa tcctaactat 840

gcgggtaata gtattaagcc taccggtact tctcgcacag ccataaccac ttta 894

<210> 11

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggaaattg gagcttcttc caacgcgtct gatgaatcaa tgattgagac gagatgcgta 60

ttaaactcgc acagcacggc tgagactacc ttagattctt tcttttcaag ggccggacta 120

gtgggagaaa ttgacctgcc tctcgagggg actacaaacc cgagcggcta tgcgaactgg 180

gacattgata tcacaggtta cgcgcaaatg agacggaaag tcgaactatt cacatacatg 240

cgttttgatg cagaatttac cttcgttgct tgcacaccga ccgggcaggt agttccgcaa 300

cttttgcaat acatgttcgt cccgcccgga gctccaaaac cggattcgag agagtctctt 360

gcatggcaga cagccacgaa tccatccgtt tttgtcaaac tgtcagaccc gcccgctcaa 420

gtcagtgtcc cctttatgtc ccccgcaagc gcttaccagt ggttttacga tggttatcct 480

acgtttggtg agcacaaaca ggaaaaagat ttagaatacg gagcctgtcc taataatatg 540

atgggcacgt ttagtgtaag gacagtggga accagcaagt cgaagtaccc tcttgtcgtc 600

cgcatataca tgagaatgaa gcacgttcga gcatggatac cgaggcctat gcgaaaccaa 660

aactatctgt ttaaagcgaa tcctaactat gcgggtaata gtattaagcc taccggtact 720

tctcgcacag ccataaccac ttta 744

<210> 12

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgcacagca cggctgagac taccttagat tctttctttt caagggccgg actagtggga 60

gaaattgacc tgcctctcga ggggactaca aacccgagcg gctatgcgaa ctgggacatt 120

gatatcacag gttacgcgca aatgagacgg aaagtcgaac tattcacata catgcgtttt 180

gatgcagaat ttaccttcgt tgcttgcaca ccgaccgggc aggtagttcc gcaacttttg 240

caatacatgt tcgtcccgcc cggagctcca aaaccggatt cgagagagtc tcttgcatgg 300

cagacagcca cgaatccatc cgtttttgtc aaactgtcag acccgcccgc tcaagtcagt 360

gtccccttta tgtcccccgc aagcgcttac cagtggtttt acgatggtta tcctacgttt 420

ggtgagcaca aacaggaaaa agatttagaa tacggagcct gtcctaataa tatgatgggc 480

acgtttagtg taaggacagt gggaaccagc aagtcgaagt accctcttgt cgtccgcata 540

tacatgagaa tgaagcacgt tcgagcatgg ataccgaggc ctatgcgaaa ccaaaactat 600

ctgtttaaag cgaatcctaa ctatgcgggt aatagtatta agcctaccgg tacttctcgc 660

acagccataa ccacttta 678

<210> 13

<211> 12759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tggggtctca 960

ggtcagcacg cagcgaagcg ggtcgcacga aaacagcaat tccgctaccg agggatcaac 1020

catcaattat acgactatca actactataa ggattcgtac gcggcgactg ccggcaagca 1080

aagtttaaag caagatcccg acaagtttgc aaatccggtt aaggatatct tcacggagat 1140

ggcagcccca ttaaagtcgc catctgcaga ggcttgtggt tacagtgatc gtgtagctca 1200

gctcaccata ggaaactcaa ccattacaac tcaagaggcc gcgaacatta tagtagggta 1260

cggcgagtgg ccaagttatt gctccgactc ggacgctacc gcagtggata aaccaactcg 1320

tcctgacgtt tcagtcaacc gtttttatac tctggatacg aagttgtggg aaaagtccag 1380

caaggggtgg tattggaagt ttcctgacgt actgaccgag actggagttt tcggacagaa 1440

tgcccaattc cattatctat atcggagtgg cttctgtata catgtacagt gcaacgcatc 1500

taaattccac cagggagctc tactcgttgc agtcctgccg gaatacgtga taggaacagt 1560

tgcaggggga actggaactg aagactccca tccgccatat atgcaaacac agccaggggc 1620

cgacgggttc gaattgcagc acccgtacgt actagacgcc ggcataccga tatctcagct 1680

aacagtatgc ccccaccaat ggatcaatct ccgcacaaac aattgtgcta caattattgt 1740

cccctatatc aatgccttac cctttgactc agcacttaat cattgtaatt tcggtctttt 1800

ggtggttccc atttccccgc tagactatga tcagggcgca acccccgtta tacctataac 1860

aattacatta gcgcccatgt gttcggagtt cgcgggtctg cgccaagcag tcacgcagta 1920

atgaggtacc ggccggccat ttaaatacag gccccttttc ctttgtcgat atcatgtaat 1980

tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc ctcccacatc cgctctaacc gaaaaggaag 2040

gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt ttaatagtta tgttagtatt 2100

aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg tacaaacgcg tgtacgcatg 2160

taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgaagg ctttaatttg 2220

caagctggat ctaacatcca aagacgaaag gttgaatgaa acctttttgc catccgacat 2280

ccacaggtcc attctcacac ataagtgcca aacgcaacag gaggggatac actagcagca 2340

gaccgttgca aacgcaggac ctccactcct cttctcctca acacccactt ttgccatcga 2400

aaaaccagcc cagttattgg gcttgattgg agctcgctca ttccaattcc ttctattagg 2460

ctactaacac catgacttta ttagcctgtc tatcctggcc cccctggcga ggttcatgtt 2520

tgtttatttc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc 2580

tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 2640

aacgctgtct tggaacctaa tatgacaaaa gcgtgatctc atccaagatg aactaagttt 2700

ggttcgttga aatgctaacg gccagttggt caaaaagaaa cttccaaaag tcggcatacc 2760

gtttgtcttg tttggtattg attgacgaat gctcaaaaat aatctcatta atgcttagcg 2820

cagtctctct atcgcttctg aaccccggtg cacctgtgcc gaaacgcaaa tggggaaaca 2880

cccgcttttt ggatgattat gcattgtctc cacattgtat gcttccaaga ttctggtggg 2940

aatactgctg atagcctaac gttcatgatc aaaatttaac tgttctaacc cctacttgac 3000

agcaatatat aaacagaagg aagctgccct gtcttaaacc ttttttttta tcatcattat 3060

tagcttactt tcataattgc gactggttcc aattgacaag cttttgattt taacgacttt 3120

taacgacaac ttgagaagat caaaaaacaa ctaattattc gaaacggaat tcaccatggg 3180

ctttccgacg gaactgaaac ctggtactaa tcaatttcta accactgacg acggggtgag 3240

tgcgccaatc ctacccaatt tccatccgac gccatgtatt catatccctg gcgaagtgag 3300

gaatctgctc gagctctgcc aagttgagac catcttggag gttaacaacg tgccaactaa 3360

cgccacttcg ttaatggagc ggcttcgttt tcccgtgagt gcacaagcag gtaaaggcga 3420

attatgcgca gtgttccggg cagatccagg ccgaaatggc ccttggcaga gcacccttct 3480

tggacagttg tgcggttatt atacccagtg gtctggtagc ctcgaagtga cattcatgtt 3540

cacagggtcc tttatggcta ccggtaaaat gctgatcgcc tatactcctc cagggggtcc 3600

tctcccaaaa gaccgcgcca cggcgatgtt gggtactcac gtgatctggg atttcggctt 3660

gcaatcctca gtaacgctag tcatcccttg gatttcaaat acgcattata gagcacatgc 3720

gcgagatggg gtatttgact actatactac ggggcttgtc tctatatggt atcaaacgaa 3780

ttatgtcgta cccattggcg ccccgaatac ggcgtacata atcgccctgg ctgcggctca 3840

gaaaaacttc acgatgaagt tgtgtaaaga cgcgtcggat atacttcaga caggaacgat 3900

ccagtaatga ggtaccggcc ggccatttaa atacaggccc cttttccttt gtcgatatca 3960

tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctcctcc cacatccgct ctaaccgaaa 4020

aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta ttttttttaa tagttatgtt 4080

agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca aacgcgtgta 4140

cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt 4200

aatttgcaag ctggatctaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct ttttgccatc 4260

cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg ggatacacta 4320

gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac ccacttttgc 4380

catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc aattccttct 4440

attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc tggcgaggtt 4500

catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat cactccagat 4560

gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc caaaactgac 4620

agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc aagatgaact 4680

aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc caaaagtcgg 4740

cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc tcattaatgc 4800

ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa cgcaaatggg 4860

gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt ccaagattct 4920

ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt ctaaccccta 4980

cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt tttttatcat 5040

cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt tgattttaac 5100

gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa cggaattcac 5160

catgggtgat cgggtagctg acgtgatcga gtctagtatc ggggactcag tttcgagggc 5220

cctcactcaa gccctcccag ccccaacagg ccaaaacaca caagtaagtt ctcatagact 5280

cgataccggt aaagtaccag cgttgcaagc cgctgaaatt ggagcttctt ccaacgcgtc 5340

tgatgaatca atgattgaga cgagatgcgt attaaactcg cacagcacgg ctgagactac 5400

cttagattct ttcttttcaa gggccggact agtgggagaa attgacctgc ctctcgaggg 5460

gactacaaac ccgagcggct atgcgaactg ggacattgat atcacaggtt acgcgcaaat 5520

gagacggaaa gtcgaactat tcacatacat gcgttttgat gcagaattta ccttcgttgc 5580

ttgcacaccg accgggcagg tagttccgca acttttgcaa tacatgttcg tcccgcccgg 5640

agctccaaaa ccggattcga gagagtctct tgcatggcag acagccacga atccatccgt 5700

ttttgtcaaa ctgtcagacc cgcccgctca agtcagtgtc ccctttatgt cccccgcaag 5760

cgcttaccag tggttttacg atggttatcc tacgtttggt gagcacaaac aggaaaaaga 5820

tttagaatac ggagcctgtc ctaataatat gatgggcacg tttagtgtaa ggacagtggg 5880

aaccagcaag tcgaagtacc ctcttgtcgt ccgcatatac atgagaatga agcacgttcg 5940

agcatggata ccgaggccta tgcgaaacca aaactatctg tttaaagcga atcctaacta 6000

tgcgggtaat agtattaagc ctaccggtac ttctcgcaca gccataacca ctttataatg 6060

aggtaccggc cggccattta aatacaggcc ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag 6120

ttatgtcacg cttacattca cgccctcctc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag 6180

ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttta atagttatgt tagtattaag 6240

aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac aaacgcgtgt acgcatgtaa 6300

cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa 6360

gctggatccg cggccgcctt ccaaactctc atggattctc aggtaatagg tattctagga 6420

ggaggccagc taggccgaat gattgttgag gccgctagca ggctcaatat caagaccgtg 6480

attcttgatg atggtttttc acctgctaag cacattaatg ctgcgcaaga ccacatcgac 6540

ggatcattca aagatgagga ggctatcgcc aagttagctg ccaaatgtga tgttctcact 6600

gtagagattg agcatgtcaa cacagatgct ctaaagagag ttcaagacag aactggaatc 6660

aagatatatc ctttaccaga gacaatcgaa ctaatcaagg ataagtactt gcaaaaggaa 6720

catttgatca agcacaacat ttcggtgaca aagtctcagg gtatagaatc taatgaaaag 6780

gcgctgcttt tgtttggaga agagaatgga tttccatatc tgttgaagtc ccggactatg 6840

gcttatgatg gaagaggcaa ttttgtagtg gagtctaaag aggacatcag taaggcatta 6900

gagttcttga aagatcgtcc attgtatgcc gagaagtttg ctccttttgt taaagaatta 6960

gcggtaatgg ttgtgagatc actggaaggc gaagtattct cctacccaac cgtagaaact 7020

gtgcacaagg acaatatctg tcatattgtg tatgctccgg ccagagttaa tgacaccatc 7080

caaaagaaag ctcaaatatt agctgaaaac actgtgaaga ctttcccagg cgctggaatc 7140

ttcggagttg agatgttcct attgtctgat ggagaacttc ttgtaaatga gattgctcca 7200

aggccccaca attctggtca ctatacaatc gatgcatgtg taacatctca gttcgaagca 7260

catgtaagag ccataactgg tctgccaatg ccactagatt tcaccaaact atctacttcc 7320

aacaccaacg ctattatgct caatgttttg ggtgctgaaa aatctcacgg ggaattagag 7380

ttttgtagaa gagccttaga aacacccggt gcttctgtat atctgtacgg aaagaccacc 7440

cgattggctc gtaagatggg tcatatcaac ataataggat cttccatgtt ggaagcagaa 7500

caaaagttag agtacattct agaagaatca acccacttac catccagtac tgtatcagct 7560

gacactaaac cgttggttgg agttatcatg ggttcagact ctgatctacc tgtgatttcg 7620

aaaggttgcg atattttaaa acagtttggt gttccattcg aagttactat tgtctctgct 7680

catagaacac cacagagaat gaccagatat gcctttgaag ccgctagtag aggtatcaag 7740

gctatcattg caggtgctgg tggtgctgct catcttccag gaatggttgc tgccatgact 7800

ccgttgccag tcattggtgt tcctgtcaag ggctctacgt tggatggtgt agactcgcta 7860

cactcgattg tccaaatgcc tagaggtgtt cctgtggcta cggttgctat caacaacgcc 7920

accaatgccg ctctgttggc catcaggatt ttaggtacaa ttgaccacaa atggcaaaag 7980

gaaatgtcca agtatatgaa tgcaatggag accgaagtgt tggggaaggc atccaacttg 8040

gaatctgaag ggtatgaatc ctatttgaag aatcgtcttt gaatttagta ttgtttttta 8100

atagatgtat atataatagt acacgtaact tatctattcc attcataatt ttattttaaa 8160

ggttcggtag aaatttgtcc tccaaaaagt tggttagagc ctggcagttt tgataggcat 8220

tattatagat tgggtaatat ttaccctgca cctggaggaa ctttgcaaag agcctcatgt 8280

gcggcgcgcc aggccataat ggccaaacgg tttctcaatt actatatact actaaccatt 8340

tacctgtagc gtatttcttt tccctcttcg cgaaagctca agggcatctt cttgactcat 8400

gaaaaatatc tggatttctt ctgacagatc atcacccttg agcccaactc tctagcctat 8460

gagtgtaagt gatagtcatc ttgcaacaga ttattttgga acgcaactaa caaagcagat 8520

acacccttca gcagaatcct ttctggatat tgtgaagaat gatcgccaaa gtcacagtcc 8580

tgagacagtt cctaatcttt accccattta caagttcatc caatcagact tcttaacgcc 8640

tcatctggct tatatcaagc ttaccaacag ttcagaaact cccagtccaa gtttcttgct 8700

tgaaagtgcg aagaatggtg acaccgttga caggtacacc tttatgggac attcccccag 8760

aaaaataatc aagactgggc ctttagaggg tgctgaagtt gaccccttgg tgcttctgga 8820

aaaagaactg aagggcacca gacaagcgca acttcctggt attcctcgtc taagtggtgg 8880

tgccatagga tacatctcgt acgattgtat taagtacttt gaaccaaaaa ctgaaagaaa 8940

actgaaagat gttttgcaac ttccggaagc agctttgatg ttgttcgaca cgatcgtggc 9000

ttttgacaat gtttatcaaa gattccaggt aattggaaac gtttctctat ccgttgatga 9060

ctcggacgaa gctattcttg agaaatatta taagacaaga gaagaagtgg aaaagatcag 9120

taaagtggta tttgacaata aaactgttcc ctactatgaa cagaaagata ttattcaagg 9180

ccaaacgttc acctctaata ttggtcagga agggtatgaa aaccatgttc gcaagctgaa 9240

agaacatatt ctgaaaggag acatcttcca agctgttccc tctcaaaggg tagccaggcc 9300

gacctcattg caccctttca acatctatcg tcatttgaga actgtcaatc cttctccata 9360

catgttctat attgactatc tagacttcca agttgttggt gcttcacctg aattactagt 9420

taaatccgac aacaacaaca aaatcatcac acatcctatt gctggaactc ttcccagagg 9480

taaaactatc gaagaggacg acaattatgc taagcaattg aagtcgtctt tgaaagacag 9540

ggccgagcac gtcatgctgg tagatttggc cagaaatgat attaaccgtg tgtgtgagcc 9600

caccagtacc acggttgatc gtttattgac tgtggagaga ttttctcatg tgatgcatct 9660

tgtgtcagaa gtcagtggaa cattgagacc aaacaagact cgcttcgatg ctttcagatc 9720

cattttccca gcaggaaccg tctccggtgc tccgaaggta agagcaatgc aactcatagg 9780

agaattggaa ggagaaaaga gaggtgttta tgcgggggcc gtaggacact ggtcgtacga 9840

tggaaaatcg atggacacat gtattgcctt aagaacaatg gtcgtcaagg acggtgtcgc 9900

ttaccttcaa gccggaggtg gaattgtcta cgattctgac ccctatgacg agtacatcga 9960

aaccatgaac aaaatgagat ccaacaataa caccatcttg gaggctgaga aaatctggac 10020

cgataggttg gccagagacg agaatcaaag tgaatccgaa gaaaacgatc aatgaacgga 10080

ggacgtaagt aggaatttat ggtttggcca taatggccta gcttggcgta atcatggtca 10140

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 10200

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 10260

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 10320

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 10380

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 10440

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 10500

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 10560

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 10620

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 10680

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 10740

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 10800

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 10860

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 10920

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 10980

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 11040

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 11100

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 11160

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 11220

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 11280

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 11340

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 11400

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 11460

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 11520

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 11580

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 11640

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 11700

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 11760

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 11820

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 11880

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 11940

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 12000

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 12060

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 12120

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 12180

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 12240

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 12300

accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc 12360

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 12420

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 12480

ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 12540

catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat 12600

tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 12660

cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 12720

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattg 12759

<210> 14

<211> 12609

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tggggtctca 960

ggtcagcacg cagcgaagcg ggtcgcacga aaacagcaat tccgctaccg agggatcaac 1020

catcaattat acgactatca actactataa ggattcgtac gcggcgactg ccggcaagca 1080

aagtttaaag caagatcccg acaagtttgc aaatccggtt aaggatatct tcacggagat 1140

ggcagcccca ttaaagtcgc catctgcaga ggcttgtggt tacagtgatc gtgtagctca 1200

gctcaccata ggaaactcaa ccattacaac tcaagaggcc gcgaacatta tagtagggta 1260

cggcgagtgg ccaagttatt gctccgactc ggacgctacc gcagtggata aaccaactcg 1320

tcctgacgtt tcagtcaacc gtttttatac tctggatacg aagttgtggg aaaagtccag 1380

caaggggtgg tattggaagt ttcctgacgt actgaccgag actggagttt tcggacagaa 1440

tgcccaattc cattatctat atcggagtgg cttctgtata catgtacagt gcaacgcatc 1500

taaattccac cagggagctc tactcgttgc agtcctgccg gaatacgtga taggaacagt 1560

tgcaggggga actggaactg aagactccca tccgccatat atgcaaacac agccaggggc 1620

cgacgggttc gaattgcagc acccgtacgt actagacgcc ggcataccga tatctcagct 1680

aacagtatgc ccccaccaat ggatcaatct ccgcacaaac aattgtgcta caattattgt 1740

cccctatatc aatgccttac cctttgactc agcacttaat cattgtaatt tcggtctttt 1800

ggtggttccc atttccccgc tagactatga tcagggcgca acccccgtta tacctataac 1860

aattacatta gcgcccatgt gttcggagtt cgcgggtctg cgccaagcag tcacgcagta 1920

atgaggtacc ggccggccat ttaaatacag gccccttttc ctttgtcgat atcatgtaat 1980

tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc ctcccacatc cgctctaacc gaaaaggaag 2040

gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt ttaatagtta tgttagtatt 2100

aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg tacaaacgcg tgtacgcatg 2160

taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgaagg ctttaatttg 2220

caagctggat ctaacatcca aagacgaaag gttgaatgaa acctttttgc catccgacat 2280

ccacaggtcc attctcacac ataagtgcca aacgcaacag gaggggatac actagcagca 2340

gaccgttgca aacgcaggac ctccactcct cttctcctca acacccactt ttgccatcga 2400

aaaaccagcc cagttattgg gcttgattgg agctcgctca ttccaattcc ttctattagg 2460

ctactaacac catgacttta ttagcctgtc tatcctggcc cccctggcga ggttcatgtt 2520

tgtttatttc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc 2580

tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 2640

aacgctgtct tggaacctaa tatgacaaaa gcgtgatctc atccaagatg aactaagttt 2700

ggttcgttga aatgctaacg gccagttggt caaaaagaaa cttccaaaag tcggcatacc 2760

gtttgtcttg tttggtattg attgacgaat gctcaaaaat aatctcatta atgcttagcg 2820

cagtctctct atcgcttctg aaccccggtg cacctgtgcc gaaacgcaaa tggggaaaca 2880

cccgcttttt ggatgattat gcattgtctc cacattgtat gcttccaaga ttctggtggg 2940

aatactgctg atagcctaac gttcatgatc aaaatttaac tgttctaacc cctacttgac 3000

agcaatatat aaacagaagg aagctgccct gtcttaaacc ttttttttta tcatcattat 3060

tagcttactt tcataattgc gactggttcc aattgacaag cttttgattt taacgacttt 3120

taacgacaac ttgagaagat caaaaaacaa ctaattattc gaaacggaat tcaccatggg 3180

ctttccgacg gaactgaaac ctggtactaa tcaatttcta accactgacg acggggtgag 3240

tgcgccaatc ctacccaatt tccatccgac gccatgtatt catatccctg gcgaagtgag 3300

gaatctgctc gagctctgcc aagttgagac catcttggag gttaacaacg tgccaactaa 3360

cgccacttcg ttaatggagc ggcttcgttt tcccgtgagt gcacaagcag gtaaaggcga 3420

attatgcgca gtgttccggg cagatccagg ccgaaatggc ccttggcaga gcacccttct 3480

tggacagttg tgcggttatt atacccagtg gtctggtagc ctcgaagtga cattcatgtt 3540

cacagggtcc tttatggcta ccggtaaaat gctgatcgcc tatactcctc cagggggtcc 3600

tctcccaaaa gaccgcgcca cggcgatgtt gggtactcac gtgatctggg atttcggctt 3660

gcaatcctca gtaacgctag tcatcccttg gatttcaaat acgcattata gagcacatgc 3720

gcgagatggg gtatttgact actatactac ggggcttgtc tctatatggt atcaaacgaa 3780

ttatgtcgta cccattggcg ccccgaatac ggcgtacata atcgccctgg ctgcggctca 3840

gaaaaacttc acgatgaagt tgtgtaaaga cgcgtcggat atacttcaga caggaacgat 3900

ccagtaatga ggtaccggcc ggccatttaa atacaggccc cttttccttt gtcgatatca 3960

tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctcctcc cacatccgct ctaaccgaaa 4020

aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta ttttttttaa tagttatgtt 4080

agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca aacgcgtgta 4140

cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt 4200

aatttgcaag ctggatctaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct ttttgccatc 4260

cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg ggatacacta 4320

gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac ccacttttgc 4380

catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc aattccttct 4440

attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc tggcgaggtt 4500

catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat cactccagat 4560

gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc caaaactgac 4620

agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc aagatgaact 4680

aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc caaaagtcgg 4740

cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc tcattaatgc 4800

ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa cgcaaatggg 4860

gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt ccaagattct 4920

ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt ctaaccccta 4980

cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt tttttatcat 5040

cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt tgattttaac 5100

gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa cggaattcac 5160

catggaaatt ggagcttctt ccaacgcgtc tgatgaatca atgattgaga cgagatgcgt 5220

attaaactcg cacagcacgg ctgagactac cttagattct ttcttttcaa gggccggact 5280

agtgggagaa attgacctgc ctctcgaggg gactacaaac ccgagcggct atgcgaactg 5340

ggacattgat atcacaggtt acgcgcaaat gagacggaaa gtcgaactat tcacatacat 5400

gcgttttgat gcagaattta ccttcgttgc ttgcacaccg accgggcagg tagttccgca 5460

acttttgcaa tacatgttcg tcccgcccgg agctccaaaa ccggattcga gagagtctct 5520

tgcatggcag acagccacga atccatccgt ttttgtcaaa ctgtcagacc cgcccgctca 5580

agtcagtgtc ccctttatgt cccccgcaag cgcttaccag tggttttacg atggttatcc 5640

tacgtttggt gagcacaaac aggaaaaaga tttagaatac ggagcctgtc ctaataatat 5700

gatgggcacg tttagtgtaa ggacagtggg aaccagcaag tcgaagtacc ctcttgtcgt 5760

ccgcatatac atgagaatga agcacgttcg agcatggata ccgaggccta tgcgaaacca 5820

aaactatctg tttaaagcga atcctaacta tgcgggtaat agtattaagc ctaccggtac 5880

ttctcgcaca gccataacca ctttataatg aggtaccggc cggccattta aatacaggcc 5940

ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcctc 6000

ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt 6060

atttttttta atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt 6120

ttttctgtac aaacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt 6180

tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa gctggatccg cggccgcctt ccaaactctc 6240

atggattctc aggtaatagg tattctagga ggaggccagc taggccgaat gattgttgag 6300

gccgctagca ggctcaatat caagaccgtg attcttgatg atggtttttc acctgctaag 6360

cacattaatg ctgcgcaaga ccacatcgac ggatcattca aagatgagga ggctatcgcc 6420

aagttagctg ccaaatgtga tgttctcact gtagagattg agcatgtcaa cacagatgct 6480

ctaaagagag ttcaagacag aactggaatc aagatatatc ctttaccaga gacaatcgaa 6540

ctaatcaagg ataagtactt gcaaaaggaa catttgatca agcacaacat ttcggtgaca 6600

aagtctcagg gtatagaatc taatgaaaag gcgctgcttt tgtttggaga agagaatgga 6660

tttccatatc tgttgaagtc ccggactatg gcttatgatg gaagaggcaa ttttgtagtg 6720

gagtctaaag aggacatcag taaggcatta gagttcttga aagatcgtcc attgtatgcc 6780

gagaagtttg ctccttttgt taaagaatta gcggtaatgg ttgtgagatc actggaaggc 6840

gaagtattct cctacccaac cgtagaaact gtgcacaagg acaatatctg tcatattgtg 6900

tatgctccgg ccagagttaa tgacaccatc caaaagaaag ctcaaatatt agctgaaaac 6960

actgtgaaga ctttcccagg cgctggaatc ttcggagttg agatgttcct attgtctgat 7020

ggagaacttc ttgtaaatga gattgctcca aggccccaca attctggtca ctatacaatc 7080

gatgcatgtg taacatctca gttcgaagca catgtaagag ccataactgg tctgccaatg 7140

ccactagatt tcaccaaact atctacttcc aacaccaacg ctattatgct caatgttttg 7200

ggtgctgaaa aatctcacgg ggaattagag ttttgtagaa gagccttaga aacacccggt 7260

gcttctgtat atctgtacgg aaagaccacc cgattggctc gtaagatggg tcatatcaac 7320

ataataggat cttccatgtt ggaagcagaa caaaagttag agtacattct agaagaatca 7380

acccacttac catccagtac tgtatcagct gacactaaac cgttggttgg agttatcatg 7440

ggttcagact ctgatctacc tgtgatttcg aaaggttgcg atattttaaa acagtttggt 7500

gttccattcg aagttactat tgtctctgct catagaacac cacagagaat gaccagatat 7560

gcctttgaag ccgctagtag aggtatcaag gctatcattg caggtgctgg tggtgctgct 7620

catcttccag gaatggttgc tgccatgact ccgttgccag tcattggtgt tcctgtcaag 7680

ggctctacgt tggatggtgt agactcgcta cactcgattg tccaaatgcc tagaggtgtt 7740

cctgtggcta cggttgctat caacaacgcc accaatgccg ctctgttggc catcaggatt 7800

ttaggtacaa ttgaccacaa atggcaaaag gaaatgtcca agtatatgaa tgcaatggag 7860

accgaagtgt tggggaaggc atccaacttg gaatctgaag ggtatgaatc ctatttgaag 7920

aatcgtcttt gaatttagta ttgtttttta atagatgtat atataatagt acacgtaact 7980

tatctattcc attcataatt ttattttaaa ggttcggtag aaatttgtcc tccaaaaagt 8040

tggttagagc ctggcagttt tgataggcat tattatagat tgggtaatat ttaccctgca 8100

cctggaggaa ctttgcaaag agcctcatgt gcggcgcgcc aggccataat ggccaaacgg 8160

tttctcaatt actatatact actaaccatt tacctgtagc gtatttcttt tccctcttcg 8220

cgaaagctca agggcatctt cttgactcat gaaaaatatc tggatttctt ctgacagatc 8280

atcacccttg agcccaactc tctagcctat gagtgtaagt gatagtcatc ttgcaacaga 8340

ttattttgga acgcaactaa caaagcagat acacccttca gcagaatcct ttctggatat 8400

tgtgaagaat gatcgccaaa gtcacagtcc tgagacagtt cctaatcttt accccattta 8460

caagttcatc caatcagact tcttaacgcc tcatctggct tatatcaagc ttaccaacag 8520

ttcagaaact cccagtccaa gtttcttgct tgaaagtgcg aagaatggtg acaccgttga 8580

caggtacacc tttatgggac attcccccag aaaaataatc aagactgggc ctttagaggg 8640

tgctgaagtt gaccccttgg tgcttctgga aaaagaactg aagggcacca gacaagcgca 8700

acttcctggt attcctcgtc taagtggtgg tgccatagga tacatctcgt acgattgtat 8760

taagtacttt gaaccaaaaa ctgaaagaaa actgaaagat gttttgcaac ttccggaagc 8820

agctttgatg ttgttcgaca cgatcgtggc ttttgacaat gtttatcaaa gattccaggt 8880

aattggaaac gtttctctat ccgttgatga ctcggacgaa gctattcttg agaaatatta 8940

taagacaaga gaagaagtgg aaaagatcag taaagtggta tttgacaata aaactgttcc 9000

ctactatgaa cagaaagata ttattcaagg ccaaacgttc acctctaata ttggtcagga 9060

agggtatgaa aaccatgttc gcaagctgaa agaacatatt ctgaaaggag acatcttcca 9120

agctgttccc tctcaaaggg tagccaggcc gacctcattg caccctttca acatctatcg 9180

tcatttgaga actgtcaatc cttctccata catgttctat attgactatc tagacttcca 9240

agttgttggt gcttcacctg aattactagt taaatccgac aacaacaaca aaatcatcac 9300

acatcctatt gctggaactc ttcccagagg taaaactatc gaagaggacg acaattatgc 9360

taagcaattg aagtcgtctt tgaaagacag ggccgagcac gtcatgctgg tagatttggc 9420

cagaaatgat attaaccgtg tgtgtgagcc caccagtacc acggttgatc gtttattgac 9480

tgtggagaga ttttctcatg tgatgcatct tgtgtcagaa gtcagtggaa cattgagacc 9540

aaacaagact cgcttcgatg ctttcagatc cattttccca gcaggaaccg tctccggtgc 9600

tccgaaggta agagcaatgc aactcatagg agaattggaa ggagaaaaga gaggtgttta 9660

tgcgggggcc gtaggacact ggtcgtacga tggaaaatcg atggacacat gtattgcctt 9720

aagaacaatg gtcgtcaagg acggtgtcgc ttaccttcaa gccggaggtg gaattgtcta 9780

cgattctgac ccctatgacg agtacatcga aaccatgaac aaaatgagat ccaacaataa 9840

caccatcttg gaggctgaga aaatctggac cgataggttg gccagagacg agaatcaaag 9900

tgaatccgaa gaaaacgatc aatgaacgga ggacgtaagt aggaatttat ggtttggcca 9960

taatggccta gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 10020

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 10080

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 10140

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 10200

gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 10260

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 10320

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 10380

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 10440

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 10500

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 10560

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 10620

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 10680

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 10740

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 10800

tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 10860

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 10920

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 10980

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 11040

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 11100

agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 11160

atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 11220

cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 11280

ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 11340

agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 11400

tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 11460

gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 11520

caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 11580

ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 11640

gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 11700

tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 11760

tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 11820

cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 11880

cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 11940

gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 12000

atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 12060

agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 12120

ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 12180

aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 12240

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 12300

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg 12360

gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc 12420

gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 12480

gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca 12540

aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc 12600

agtgaattg 12609

<210> 15

<211> 12543

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tggggtctca 960

ggtcagcacg cagcgaagcg ggtcgcacga aaacagcaat tccgctaccg agggatcaac 1020

catcaattat acgactatca actactataa ggattcgtac gcggcgactg ccggcaagca 1080

aagtttaaag caagatcccg acaagtttgc aaatccggtt aaggatatct tcacggagat 1140

ggcagcccca ttaaagtcgc catctgcaga ggcttgtggt tacagtgatc gtgtagctca 1200

gctcaccata ggaaactcaa ccattacaac tcaagaggcc gcgaacatta tagtagggta 1260

cggcgagtgg ccaagttatt gctccgactc ggacgctacc gcagtggata aaccaactcg 1320

tcctgacgtt tcagtcaacc gtttttatac tctggatacg aagttgtggg aaaagtccag 1380

caaggggtgg tattggaagt ttcctgacgt actgaccgag actggagttt tcggacagaa 1440

tgcccaattc cattatctat atcggagtgg cttctgtata catgtacagt gcaacgcatc 1500

taaattccac cagggagctc tactcgttgc agtcctgccg gaatacgtga taggaacagt 1560

tgcaggggga actggaactg aagactccca tccgccatat atgcaaacac agccaggggc 1620

cgacgggttc gaattgcagc acccgtacgt actagacgcc ggcataccga tatctcagct 1680

aacagtatgc ccccaccaat ggatcaatct ccgcacaaac aattgtgcta caattattgt 1740

cccctatatc aatgccttac cctttgactc agcacttaat cattgtaatt tcggtctttt 1800

ggtggttccc atttccccgc tagactatga tcagggcgca acccccgtta tacctataac 1860

aattacatta gcgcccatgt gttcggagtt cgcgggtctg cgccaagcag tcacgcagta 1920

atgaggtacc ggccggccat ttaaatacag gccccttttc ctttgtcgat atcatgtaat 1980

tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc ctcccacatc cgctctaacc gaaaaggaag 2040

gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt ttaatagtta tgttagtatt 2100

aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg tacaaacgcg tgtacgcatg 2160

taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgaagg ctttaatttg 2220

caagctggat ctaacatcca aagacgaaag gttgaatgaa acctttttgc catccgacat 2280

ccacaggtcc attctcacac ataagtgcca aacgcaacag gaggggatac actagcagca 2340

gaccgttgca aacgcaggac ctccactcct cttctcctca acacccactt ttgccatcga 2400

aaaaccagcc cagttattgg gcttgattgg agctcgctca ttccaattcc ttctattagg 2460

ctactaacac catgacttta ttagcctgtc tatcctggcc cccctggcga ggttcatgtt 2520

tgtttatttc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc 2580

tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 2640

aacgctgtct tggaacctaa tatgacaaaa gcgtgatctc atccaagatg aactaagttt 2700

ggttcgttga aatgctaacg gccagttggt caaaaagaaa cttccaaaag tcggcatacc 2760

gtttgtcttg tttggtattg attgacgaat gctcaaaaat aatctcatta atgcttagcg 2820

cagtctctct atcgcttctg aaccccggtg cacctgtgcc gaaacgcaaa tggggaaaca 2880

cccgcttttt ggatgattat gcattgtctc cacattgtat gcttccaaga ttctggtggg 2940

aatactgctg atagcctaac gttcatgatc aaaatttaac tgttctaacc cctacttgac 3000

agcaatatat aaacagaagg aagctgccct gtcttaaacc ttttttttta tcatcattat 3060

tagcttactt tcataattgc gactggttcc aattgacaag cttttgattt taacgacttt 3120

taacgacaac ttgagaagat caaaaaacaa ctaattattc gaaacggaat tcaccatggg 3180

ctttccgacg gaactgaaac ctggtactaa tcaatttcta accactgacg acggggtgag 3240

tgcgccaatc ctacccaatt tccatccgac gccatgtatt catatccctg gcgaagtgag 3300

gaatctgctc gagctctgcc aagttgagac catcttggag gttaacaacg tgccaactaa 3360

cgccacttcg ttaatggagc ggcttcgttt tcccgtgagt gcacaagcag gtaaaggcga 3420

attatgcgca gtgttccggg cagatccagg ccgaaatggc ccttggcaga gcacccttct 3480

tggacagttg tgcggttatt atacccagtg gtctggtagc ctcgaagtga cattcatgtt 3540

cacagggtcc tttatggcta ccggtaaaat gctgatcgcc tatactcctc cagggggtcc 3600

tctcccaaaa gaccgcgcca cggcgatgtt gggtactcac gtgatctggg atttcggctt 3660

gcaatcctca gtaacgctag tcatcccttg gatttcaaat acgcattata gagcacatgc 3720

gcgagatggg gtatttgact actatactac ggggcttgtc tctatatggt atcaaacgaa 3780

ttatgtcgta cccattggcg ccccgaatac ggcgtacata atcgccctgg ctgcggctca 3840

gaaaaacttc acgatgaagt tgtgtaaaga cgcgtcggat atacttcaga caggaacgat 3900

ccagtaatga ggtaccggcc ggccatttaa atacaggccc cttttccttt gtcgatatca 3960

tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctcctcc cacatccgct ctaaccgaaa 4020

aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta ttttttttaa tagttatgtt 4080

agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca aacgcgtgta 4140

cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt 4200

aatttgcaag ctggatctaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct ttttgccatc 4260

cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg ggatacacta 4320

gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac ccacttttgc 4380

catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc aattccttct 4440

attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc tggcgaggtt 4500

catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat cactccagat 4560

gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc caaaactgac 4620

agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc aagatgaact 4680

aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc caaaagtcgg 4740

cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc tcattaatgc 4800

ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa cgcaaatggg 4860

gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt ccaagattct 4920

ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt ctaaccccta 4980

cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt tttttatcat 5040

cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt tgattttaac 5100

gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa cggaattcac 5160

catgcacagc acggctgaga ctaccttaga ttctttcttt tcaagggccg gactagtggg 5220

agaaattgac ctgcctctcg aggggactac aaacccgagc ggctatgcga actgggacat 5280

tgatatcaca ggttacgcgc aaatgagacg gaaagtcgaa ctattcacat acatgcgttt 5340

tgatgcagaa tttaccttcg ttgcttgcac accgaccggg caggtagttc cgcaactttt 5400

gcaatacatg ttcgtcccgc ccggagctcc aaaaccggat tcgagagagt ctcttgcatg 5460

gcagacagcc acgaatccat ccgtttttgt caaactgtca gacccgcccg ctcaagtcag 5520

tgtccccttt atgtcccccg caagcgctta ccagtggttt tacgatggtt atcctacgtt 5580

tggtgagcac aaacaggaaa aagatttaga atacggagcc tgtcctaata atatgatggg 5640

cacgtttagt gtaaggacag tgggaaccag caagtcgaag taccctcttg tcgtccgcat 5700

atacatgaga atgaagcacg ttcgagcatg gataccgagg cctatgcgaa accaaaacta 5760

tctgtttaaa gcgaatccta actatgcggg taatagtatt aagcctaccg gtacttctcg 5820

cacagccata accactttat aatgaggtac cggccggcca tttaaataca ggcccctttt 5880

cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct cctcccacat 5940

ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct atttattttt 6000

tttaatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 6060

gtacaaacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 6120

acgctcgaag gctttaattt gcaagctgga tccgcggccg ccttccaaac tctcatggat 6180

tctcaggtaa taggtattct aggaggaggc cagctaggcc gaatgattgt tgaggccgct 6240

agcaggctca atatcaagac cgtgattctt gatgatggtt tttcacctgc taagcacatt 6300

aatgctgcgc aagaccacat cgacggatca ttcaaagatg aggaggctat cgccaagtta 6360

gctgccaaat gtgatgttct cactgtagag attgagcatg tcaacacaga tgctctaaag 6420

agagttcaag acagaactgg aatcaagata tatcctttac cagagacaat cgaactaatc 6480

aaggataagt acttgcaaaa ggaacatttg atcaagcaca acatttcggt gacaaagtct 6540

cagggtatag aatctaatga aaaggcgctg cttttgtttg gagaagagaa tggatttcca 6600

tatctgttga agtcccggac tatggcttat gatggaagag gcaattttgt agtggagtct 6660

aaagaggaca tcagtaaggc attagagttc ttgaaagatc gtccattgta tgccgagaag 6720

tttgctcctt ttgttaaaga attagcggta atggttgtga gatcactgga aggcgaagta 6780

ttctcctacc caaccgtaga aactgtgcac aaggacaata tctgtcatat tgtgtatgct 6840

ccggccagag ttaatgacac catccaaaag aaagctcaaa tattagctga aaacactgtg 6900

aagactttcc caggcgctgg aatcttcgga gttgagatgt tcctattgtc tgatggagaa 6960

cttcttgtaa atgagattgc tccaaggccc cacaattctg gtcactatac aatcgatgca 7020

tgtgtaacat ctcagttcga agcacatgta agagccataa ctggtctgcc aatgccacta 7080

gatttcacca aactatctac ttccaacacc aacgctatta tgctcaatgt tttgggtgct 7140

gaaaaatctc acggggaatt agagttttgt agaagagcct tagaaacacc cggtgcttct 7200

gtatatctgt acggaaagac cacccgattg gctcgtaaga tgggtcatat caacataata 7260

ggatcttcca tgttggaagc agaacaaaag ttagagtaca ttctagaaga atcaacccac 7320

ttaccatcca gtactgtatc agctgacact aaaccgttgg ttggagttat catgggttca 7380

gactctgatc tacctgtgat ttcgaaaggt tgcgatattt taaaacagtt tggtgttcca 7440

ttcgaagtta ctattgtctc tgctcataga acaccacaga gaatgaccag atatgccttt 7500

gaagccgcta gtagaggtat caaggctatc attgcaggtg ctggtggtgc tgctcatctt 7560

ccaggaatgg ttgctgccat gactccgttg ccagtcattg gtgttcctgt caagggctct 7620

acgttggatg gtgtagactc gctacactcg attgtccaaa tgcctagagg tgttcctgtg 7680

gctacggttg ctatcaacaa cgccaccaat gccgctctgt tggccatcag gattttaggt 7740

acaattgacc acaaatggca aaaggaaatg tccaagtata tgaatgcaat ggagaccgaa 7800

gtgttgggga aggcatccaa cttggaatct gaagggtatg aatcctattt gaagaatcgt 7860

ctttgaattt agtattgttt tttaatagat gtatatataa tagtacacgt aacttatcta 7920

ttccattcat aattttattt taaaggttcg gtagaaattt gtcctccaaa aagttggtta 7980

gagcctggca gttttgatag gcattattat agattgggta atatttaccc tgcacctgga 8040

ggaactttgc aaagagcctc atgtgcggcg cgccaggcca taatggccaa acggtttctc 8100

aattactata tactactaac catttacctg tagcgtattt cttttccctc ttcgcgaaag 8160

ctcaagggca tcttcttgac tcatgaaaaa tatctggatt tcttctgaca gatcatcacc 8220

cttgagccca actctctagc ctatgagtgt aagtgatagt catcttgcaa cagattattt 8280

tggaacgcaa ctaacaaagc agatacaccc ttcagcagaa tcctttctgg atattgtgaa 8340

gaatgatcgc caaagtcaca gtcctgagac agttcctaat ctttacccca tttacaagtt 8400

catccaatca gacttcttaa cgcctcatct ggcttatatc aagcttacca acagttcaga 8460

aactcccagt ccaagtttct tgcttgaaag tgcgaagaat ggtgacaccg ttgacaggta 8520

cacctttatg ggacattccc ccagaaaaat aatcaagact gggcctttag agggtgctga 8580

agttgacccc ttggtgcttc tggaaaaaga actgaagggc accagacaag cgcaacttcc 8640

tggtattcct cgtctaagtg gtggtgccat aggatacatc tcgtacgatt gtattaagta 8700

ctttgaacca aaaactgaaa gaaaactgaa agatgttttg caacttccgg aagcagcttt 8760

gatgttgttc gacacgatcg tggcttttga caatgtttat caaagattcc aggtaattgg 8820

aaacgtttct ctatccgttg atgactcgga cgaagctatt cttgagaaat attataagac 8880

aagagaagaa gtggaaaaga tcagtaaagt ggtatttgac aataaaactg ttccctacta 8940

tgaacagaaa gatattattc aaggccaaac gttcacctct aatattggtc aggaagggta 9000

tgaaaaccat gttcgcaagc tgaaagaaca tattctgaaa ggagacatct tccaagctgt 9060

tccctctcaa agggtagcca ggccgacctc attgcaccct ttcaacatct atcgtcattt 9120

gagaactgtc aatccttctc catacatgtt ctatattgac tatctagact tccaagttgt 9180

tggtgcttca cctgaattac tagttaaatc cgacaacaac aacaaaatca tcacacatcc 9240

tattgctgga actcttccca gaggtaaaac tatcgaagag gacgacaatt atgctaagca 9300

attgaagtcg tctttgaaag acagggccga gcacgtcatg ctggtagatt tggccagaaa 9360

tgatattaac cgtgtgtgtg agcccaccag taccacggtt gatcgtttat tgactgtgga 9420

gagattttct catgtgatgc atcttgtgtc agaagtcagt ggaacattga gaccaaacaa 9480

gactcgcttc gatgctttca gatccatttt cccagcagga accgtctccg gtgctccgaa 9540

ggtaagagca atgcaactca taggagaatt ggaaggagaa aagagaggtg tttatgcggg 9600

ggccgtagga cactggtcgt acgatggaaa atcgatggac acatgtattg ccttaagaac 9660

aatggtcgtc aaggacggtg tcgcttacct tcaagccgga ggtggaattg tctacgattc 9720

tgacccctat gacgagtaca tcgaaaccat gaacaaaatg agatccaaca ataacaccat 9780

cttggaggct gagaaaatct ggaccgatag gttggccaga gacgagaatc aaagtgaatc 9840

cgaagaaaac gatcaatgaa cggaggacgt aagtaggaat ttatggtttg gccataatgg 9900

cctagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 9960

attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 10020

agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 10080

tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 10140

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 10200

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 10260

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 10320

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 10380

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 10440

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 10500

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 10560

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 10620

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 10680

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 10740

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 10800

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 10860

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 10920

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 10980

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 11040

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 11100

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 11160

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 11220

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 11280

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 11340

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 11400

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 11460

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 11520

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 11580

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 11640

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 11700

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 11760

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 11820

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 11880

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 11940

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 12000

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 12060

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 12120

cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 12180

atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 12240

cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 12300

gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 12360

agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 12420

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 12480

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 12540

ttg 12543

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggcagccag gtgtccac 48

<210> 17

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tactgggtca cggcctgtct c 51

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggcttcccc accgagc 47

<210> 19

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tactggatgg tgccggtctg cag 53

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggcgaccgg gtggccg 47

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tacagtgtgg tgatggcggt c 51

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tggaaattgg agcttcttcc 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aactaattat tcgaaacgga attcaccatg cacagcacgg ctgagactac 50

Claims

1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸片段，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码肠道病毒A71其他衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸中各核苷酸片段的排列顺序为：启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子，所述编码肠道病毒A71的VP0衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VP0衣壳蛋白；所述编码肠道病毒A71的VP3衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VP3衣壳蛋白，所述多核苷酸编码的肠道病毒A71的VP1衣壳蛋白为在如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的N端第二位开始截短50-72个氨基酸后得到的VP1衣壳蛋白。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于：

编码肠道病毒A71的VP0衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:8所示；和/或，

编码肠道病毒A71的VP3衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:9所示；和/或，

编码肠道病毒A71的VP1衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码肠道病毒A71的VP1衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的VP1衣壳蛋白。

4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括权利要求1-3任一所述的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的表达载体为酵母表达载体。

6.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。

7.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系中包括权利要求4-6任一所述的核酸构建体，或基因组中整合有权利要求1-3任一所述的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为毕赤酵母细胞系。

9.一种重组肠道病毒A71病毒样颗粒，其特征在于，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒包括VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括肠道病毒A71其他衣壳蛋白，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒由权利要求7或8所述的细胞系产生。

10.权利要求9所述的重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

11.一种用于预防手足口病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求9所述的重组肠道病毒A71病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，所述药物组合物为疫苗组合物。