CN1946739A - 纯化的白细胞介素－15/Fc融合蛋白及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从组合物中提纯白细胞介素－15/Fc融合蛋白的方法，该方法包括a)将该组合物施加于亲和色谱柱并从柱中洗脱第一IL－15/Fc洗脱液和b)将步骤a)的洗脱液用于离子交换色谱柱并从柱中洗脱第二IL－15/Fc洗脱液；还涉及纯化的白细胞介素－15/Fc融合蛋白和包含这种融合蛋白的组合物，特别是药学组合物。

Description

纯化的白细胞介素-15/Fc融合蛋白及其制备
技术领域
本发明涉及从组合物中提纯白细胞介素-15/Fc融合蛋白的方法，该方法包括a)将该组合物用于亲和色谱柱并从柱中洗脱第一IL-15/Fc洗脱液和b)将步骤a)的洗脱液用于离子交换色谱柱并从柱中洗脱第二IL-15/Fc洗脱液；还涉及纯化的白细胞介素-15/Fc融合蛋白和包含这种融合蛋白的组合物，特别是药学组合物。
发明背景
器官或组织移植已经成为标准方法，并且在许多情况下，是许多威胁生命的疾病的唯一救生治疗法。然而，在受体器官的排异反应方面常常产生困难，排异反应是由对移植物的外源细胞表面抗原的免疫响应造成的。抑制排异反应的一种治疗途径是通过免疫抑制物，特别是通过拮抗性白细胞介素-15(IL-15)或白细胞介素-2(IL-2)抗体或激动剂来抑制体液或细胞免疫响应。之前已经描述了使用IL-15或IL-2分子的抗体的各种治疗法。有效的IL-15拮抗剂的一个例子是由N-末端突变或未突变的IL-15片段和C-末端的Fc片段组成的融合蛋白(WO97/41232；Kim等(1998)J.Immunol.160：5742-5748)。
为了能够成功地使用融合蛋白作为药物，必须能够以非常高的纯度大规模制备它们并以稳定的方式储存。通常，通过基因工程法制备非天然生成的蛋白质。为此，在细胞培养中制备所述蛋白质，在该培养中，已经对哺乳动物或细菌细胞系进行基因改造以使得含有的所需肽的基因的重组质粒引入细菌系中，从而制备蛋白质。然后在存在含有例如糖、氨基酸、生长因子、盐、来自不同动物的血清等的复合培养基的情况下在合适的条件下培养这些细胞株。随后需要将所需要蛋白质与培养基的组分、细胞代谢产物和其它污染物分离，直至获得足以用作治疗剂的纯度。
从细胞培养基中提纯蛋白质的方法是技术人员公知的。一些蛋白质被细胞系直接释放到周围介质中，其它的保留在细胞内。后者要求首先使细胞裂解，这可以通过诸如机械剪切、渗压冲击或酶处理之类的多种方法进行。在这种情况下，均浆包括所有细胞内容物，并且需要追加的工艺过程以去除亚细胞片段。这种追加的工艺过程包括，例如，差速离心或过滤。如果蛋白质直接由上清液获得，还必须使用这些步骤去除部分死细胞或类似物。此后，通常通过多种色谱分离技术的结合来进一步提纯蛋白质。这些技术根据大小、电荷、疏水性或对特定物质的亲合力分离蛋白质混合物。对于这些技术的每一种，可以利用许多柱材料，它们根据所需的蛋白质进行使用。任何色谱法的目标是使所需的蛋白质在柱上表现出与污染物不同的迁移性能，并因此在与污染物不同的时间洗出。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可储存形式的尽可能纯净的IL-15/Fc融合蛋白。
通过一种从组合物中提纯IL-15/Fc的方法实现该目的，该方法包括下列步骤：
a)将该组合物施加于亲和色谱柱并从柱中洗脱第一IL-15/Fc洗脱液和
b)将步骤a)的洗脱液施加于阴离子交换色谱柱并从柱中洗脱第二IL-15/Fc洗脱液。
此处使用的IL-15/Fc融合蛋白(IL-15/Fc)是包含两个融合部分，也就是IL-15组分和Fc组分的融合蛋白。在例如Capon等(US5,428,130)中描述了除功能蛋白外还包含免疫球蛋白融合部分的重组蛋白。
优选由N-末端突变或未突变的IL-15部分与C-末端Fc部分构成的融合蛋白。在WO 97/41232和Kim等(1998，J.Immunol，160：5742-5748)中公开了这样的蛋白质。
融合蛋白的IL-15部分介导了例如与活化T细胞上表达的IL-15受体(IL-15R)的选择性结合。IL-15部分因此可以是天然生成的IL-15及其突变体。
在更优选的具体实施方式中，IL-15组分是野生型IL-15。在这个连接体，IL-15可以是任何物种的IL-15，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选人类。还包括不同的剪接变体和天然生成的变体。在此特别优选哺乳动物的核酸，特别是人类或鼠科形式的核酸。
IL-15突变体包括IL-15组分，其与天然生成的IL-15相比，具有突变，例如一个或多个缺失、插入或取代或它们的组合。然而，所用IL-15变体必须能够使IL-15/Fc融合蛋白结合到IL-15R上。这可以例如在使用标记IL-15和含有IL-15受体的膜或细胞的放射配体结合测定法中检验(Carson WE等，1994，J Exp Med.，180(4)：1395-1403)。
在优选具体实施方式中，突变体可以具有与IL-15(具有激动剂作用的IL-15组分)类似的作用，并且其活性与IL-15相比，可以处于相同、降低或甚至提高的水平。对于含有具有激动剂作用的IL-15组分的IL-15/Fc融合蛋白，可用的试验系统是通过所述IL-15组分刺激鼠科CTLL-2细胞增殖。
如果IL-15组分具有至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，再优选100％，再更优选150％，最优选至少200％的活性，则该组分具有按照本发明的激动剂作用。具有激动剂作用的IL-15组分的活性是指该IL-15组分对响应的刺激与野生型IL-15的刺激相比的百分比(野生型IL-15相当于100％活性)。在这些测定中可以单独使用IL-15组分或使用融合蛋白。
对于具有激动剂作用的IL-15组分，优选使用保守性氨基酸取代，即一个残基被具有类似性质的另一个取代。典型的取代是在脂肪族氨基酸组中、在含有脂族羟基侧链的氨基酸组中、在含有酸性基团的氨基酸组中、在含有酰胺衍生物的氨基酸组中，在含有碱性基团的氨基酸组中或在含有芳族基团的氨基酸之间的取代。典型的保守和半保守取代如下：
  氨基酸   保守取代   半保守取代
  ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY   G；S；TA；V；LE；N；QD；Q；NW；Y；L；M；HAY；F；K；RV；L；M；AR；HM；I；V；AL；I；V；AQV；INK；HA；T；G；NA；S；G；N；VA；L；IF；Y；HF；W；H   N；V；CM；I；F；GA；S；T；K；R；HA；S；T；K；R；HI；V；AS；N；T；D；E；N；QL；M；AF；Y；W；GD；E；N；Q；S；T；AF；Y；W；H；CF；Y；W；CD；E；S；T；A；G；K；RL；A；M；W；Y；S；T；C；FD；E；A；S；T；L；M；K；RN；Q；S；T；D；E；AD；E；R；KD；E；R；K；IM；T；C；NL；M；I；V；CL；M；I；V；C
在本发明的另一具体实施方式中，使用具有拮抗剂作用的IL-15组分。这种组分抑制了IL-15的活动或抑制了IL-15与IL-15R的结合，其可以完全或仅部分实现这种抑制。对于含有具有拮抗剂作用的IL-15组分的IL-15/Fc融合蛋白，可用的试验体系是WO 97/41232中所述的试验体系(BAF-BO3细胞增殖测定法)。IL-15组分如果抑制了至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，最优选至少95％的IL-15-介导的活动或IL-15与IL-15R的结合，该组分就具有按照本发明的拮抗剂作用。可以在这些测定中单独使用IL-15组分或使用融合蛋白。
对于具有拮抗剂作用的IL-15组分，优选使用非保守性氨基酸取代，其中一个残基被具有不同性质的另一个取代。进一步优选在负责与IL-15-R相互作用或负责信号转导的分子区域产生的取代。
在优选具体实施方式中，所用具有拮抗剂作用的IL-15组分是WO97/41232中所述的IL-15突变体或在氨基酸位置56具有突变的IL-15组分(天冬氨酸盐；AAA21551)。最优选的是在白细胞介素-15的氨基酸位置149和/或156引入点突变的突变体，特别是用天冬氨酸盐取代谷氨酰胺(参看WO 97/41232)。
在一个具体实施方式中，还可以结合上述突变。
在一个具体实施方式中，融合蛋白的突变IL-15部分与野生型IL-15，优选与人类野生型IL-15(例如National Center for BiotechnologyInformation的数据库，接受号AAA21551)，或者其它天然生成的变体(例如National Center for Biotechnology Information的数据库的接受号为CAA63914和CAA71044的变体)至少65％，优选至少70％，更优选至少85％，再优选至少95％，最优选至少99％相同。
IL-15/Fc融合蛋白的第二功能单元是Fc组分。Fc部分是指免疫球蛋白的恒定(c＝恒定)片段，其可以通过木瓜蛋白酶裂解制备而且其氨基酸序列高度保守。Fc片段是通常不与任何抗原结合的抗体片段。本发明的Fc部分优选还指除铰链区外还包含恒定结构域CH2和CH3的上述免疫球蛋白片段。
Fc组分源自任何抗体，例如IgA、IgD、IgG、IgE或IgM，优选IgM或IgG的Fc部分，更优选源自亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc部分。
在本发明的特定具体实施方式中，融合蛋白的Fc部分是免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段，其不含IgG-可变区的轻链和重链。
可用的IgGs的例子是IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。优选人类或鼠科IgG1。
对本发明可以使用抗体的完整Fc部分或仅使用其一部分。然而，Fc部分的所述部分应该优选设计成使得IL-15/Fc融合蛋白在血液循环中的半衰期长于不含免疫球蛋白组分的IL-15组分。这可以通过对一个或多个实验动物施用(例如注射入它们的血流中)融合蛋白和IL-15组分并比较在血液循环中的半衰期来进行测试。较长的半衰期表现为半衰期的提高，优选提高至少10％，更优选至少20％，再优选至少50％，最优选至少100％，
Fc部分还可以是具有至少一个突变的Fc部分。可以以上文对IL-15部分所述的方式使变异的Fc产生突变。
在一个具体实施方式中，融合蛋白的突变Fc部分与鼠科或人类野生型免疫球蛋白的Fc部分，优选与人类IgG1-Fc或天然生成的变体至少65％，优选至少70％，更优选至少85％，再优选至少95％，最优选至少99％同一性。
在本发明的一个优选具体实施方式中，融合蛋白的Fc部分是天然形式或具有保守性氨基酸取代并含有完整的FcR-和/或补体结合位点。融合蛋白的Fc部分可以介导补体系统的活化和与表达Fc受体细胞的结合，并由此导致融合蛋白的IL-15部分所识别的细胞的损耗。在介导补体活化和Fc-受体结合的氨基酸位置引入突变，特别是非保守性氨基酸取代，可以中断这些功能。这些突变的例子是与Fc受体(FcR)的结合位点的突变，或补体结合位点的突变(在天然人类IgG1中的氨基酸位置214、356、358和/或435或在天然鼠科IgG2A的Leu 235、Glu318、Lys 320和/或Lys 322)。在这些位置的氨基酸取代通常导致Fc部分的裂解功能和补体活化功能的缺失(WO 97/41232)。
进一步优选下述具体实施方式——其中在人类Fc部分的铰链区的，更优选人类IgG1(人类IgG1的位置167)的位置4的氨基酸半胱氨酸已经被丙氨酸取代，例如以防止分子间桥接，并由此防止表达的IL-15/Fc融合蛋白聚集。
在另一优选具体实施方式中，Fc是人类免疫球蛋白IgG1或鼠科免疫球蛋白IgG2A的Fc部分，其除了铰链区外，还包含重链区CH2和CH3。
在IL-15/Fc融合蛋白中，IL-15组分直接或经由连接子(linker)融合到免疫球蛋白组分上。连接子优选包括不超过25个氨基酸，更优选不超过15个氨基酸，再优选不超过10个氨基酸，最优选1、2、3、4或5个氨基酸。
在本发明的优选具体实施方式中，通过SEQ ID NO.1的位置905至2014、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的位置1911至3020的核酸序列编码融合蛋白，在每种情况下用最先的74个核苷酸编码信号序列(CD5)。然而，其也可以是SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的蛋白质。也包括其序列与上述任何序列至少大约60％，优选大约75％，特别优选大约90％且特别是大约95％同一性的蛋白质，其中相应的IL-15/Fc融合蛋白结合到IL-15R上并且与相应的不含免疫球蛋白组分的IL-15/Fc融合蛋白相比，具有提高的在血液中的半衰期(试验系统见上)。
可以通过在细胞中引入融合蛋白的核酸编码并随后在合适的条件下在细胞中表达该核酸，从而制备融合蛋白。然后使用本发明的方法从上清液或从细胞本身中回收由此制成的融合蛋白。这包括将含有IL-15/Fc融合蛋白的组合物施加于亲和色谱柱并洗脱第一IL-15/Fc洗脱液。
亲和色谱法是指吸附色谱的一种特殊形式，其中在载体上存在对待去除的物质具有高亲合力并因此具有与该物质的高结合强度的基团，这样可以优先吸附所述物质并由此从其它物质中分离。
载体可以是，例如，固相提纯柱，不连续相或离散粒子。固相的一种可能的例子是多孔玻璃柱或二氧化硅柱。在本发明的一个具体实施方式中，可以用试剂(例如甘油)包被固相以抑制污染物非特异性附着到固相上。在优选具体实施方式中，用于色谱法的载体材料是Sepharose(琼脂糖)，特别是如果使用蛋白质A和/或蛋白质G作为配体时。
如下回收待分离的结合配偶体(partner)：a)在合适的条件下使配体与待回收的结合配偶体结合，b)如果合适，洗除未结合的物质，c)通过产生使两个分子不再结合的条件，例如改变缓冲溶液的pH值或离子强度，将结合配偶体与配体分离。
在优选具体实施方式中，亲和色谱法是使用蛋白质A(特别优选重组蛋白A)作为配体的蛋白质-A色谱法。蛋白质A是金黄色葡萄球菌的细菌细胞壁蛋白质，其对于G类免疫球蛋白(IgG)的Fc区域具有特异性亲合力。蛋白质A具有42kDa的分子量(重组蛋白A：大约32至45kDa)和pH 2至10的高pH稳定性。使蛋白质A固定于固相(载体材料)。对Fc部分的结合亲合力随pH值而变化，并且在存在中性或略碱性缓冲剂的情况下结合后，可以用递减的pH梯度洗脱免疫球蛋白。
蛋白质-A色谱材料的一个例子是Prosep-A(BioProducing Ltd.，UK)，其包含结合到具有孔结构的玻璃上的蛋白质A。其它合适的蛋白质-A配方是蛋白质A琼脂糖(Sepharose)，例如Protein A SepharoseFast Flow(Pharmacia)和Toyopearl 650 Protein A(TosoHaas)。
或者，亲和色谱法还可以是蛋白质-G色谱法，其中所用配体为蛋白质G。蛋白质G是来自G类链球菌属的表面蛋白并具有与蛋白质A不同的亲和谱。IgG抗体对蛋白质A的亲合力与其对蛋白质G的不同，因此技术人员可以根据所用Fc部分选择合适的亲和色谱法。
还可以使用不同物种的抗血清，其与融合蛋白的Fc部分或IL-15部分结合。
为了进行本发明的方法的步骤a)，还可以用合适的缓冲溶液使提纯柱达到平衡。缓冲液是由于其酸-碱配对而使pH值稳定的缓冲溶液。用于使该柱平衡的缓冲液优选为pH值通常为大约6-8的等渗缓冲液。平衡缓冲液的一个可能的例子是20毫摩尔/升Tris、25毫摩尔/升NaCl、25毫摩尔/升EDTA，pH 7.5。
然后将在合适缓冲液中含有IL-15/Fc融合蛋白的组合物在上样缓冲液(loading buffer)中施加到柱上。在一个具体实施方式中，平衡缓冲液与上样缓冲液的组成相同。随后在适当的情况下用合适的洗涤缓冲液洗涤该柱，此后用所选洗脱缓冲液洗脱IL-15/Fc融合蛋白。
可以在柱的装载(施用组合物)与洗脱之间进行任选的洗涤步骤用以去除非特异性结合在固相上的污染物。目的是从固相中尽可能少地洗脱融合蛋白。洗涤步骤通常用等渗溶液进行，例如20毫摩尔/升Tris、150毫摩尔/升NaCl，pH 7.4，或者通过将pH值降至较低的值来进行，但是在该pH值下融合蛋白仍然结合，例如pH 5.5。
使用洗脱缓冲液以从柱中洗脱IL-15-Fc融合蛋白。洗脱缓冲液的pH值优选较低，由此破坏配体(特别是蛋白质A)与融合蛋白之间的相互作用。洗脱缓冲液的pH值优选为2-5，更优选为3-4。pH值控制在该范围内的缓冲液的例子是磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和铵缓冲液和它们的混合物。优选的缓冲液是柠檬酸盐和乙酸盐缓冲液，进一步优选柠檬酸钠或乙酸钠缓冲液，最优选0.1摩尔/升柠檬酸盐，pH 3.4。然而，还可以使用具有高pH值(例如pH 9和更高)的洗脱缓冲液或妨碍配体(特别是蛋白质A)与融合蛋白之间的相互作用的其它缓冲液。
在合适的情况下，将步骤a)的洗脱液稀释，在步骤b)中用于离子交换色谱柱、阳离子交换色谱柱或优选用于阴离子交换色谱柱，并从该柱中洗脱第二IL-15/Fc洗脱液。
在本发明的优选具体实施方式中，通过加入碱或缓冲剂，提高步骤a)的洗脱液的pH值。这优选在洗脱之后立即进行以防止融合蛋白可能的失活。这可以通过添加1/10体积的1摩尔/升Tris(pH 8.0)来实现。
在离子交换色谱法中，根据它们的电荷分离蛋白质。蛋白质包含各种氨基酸，它们的侧链除不带电基团外，通常还携带酸性和碱性基团并因此构成蛋白质总电荷。在低pH值下，在蛋白质的等电点以下，由于带电侧链的质子化，总电荷为正，在较高pH值下，由于脱质子化，总电荷为负。由于蛋白质携带多种带电荷基团，(它们的实际电荷取决于pH值，还取决于各个氨基酸的环境)，按照电荷进行分离是有效的分离蛋白质的方法。在离子交换色谱法中，选择pH值以使所选蛋白质能够结合到基质上。在阴离子交换剂的情况下，这种pH值通常比蛋白质的等电点(蛋白质具有0的净电荷时的pH值)高至少一个pH单位，在阳离子交换剂的情况下，其低于等电点。经由静电相互作用结合到基质上。用缓冲液洗除没有结合到基质上的蛋白质。通过加入盐来洗脱结合蛋白质，优选使用NaCl。带电钠和氯化物离子的存在终止了蛋白质与基质的静电相互作用，从而使蛋白质与基质分离。
阴离子交换剂或碱性离子交换剂是下述离子交换剂——其中阳离子基团共价键合到固体不溶基质上，而中和阴离子仅离子结合并因此可以被其它阴离子取代。通常使用阴离子交换剂色谱法提纯带负电的分子。阴离子交换剂的例子是偶联到聚丙烯酰胺凝胶树脂上或偶联到烃聚合树脂(例如纤维素或葡聚糖)上的氨基乙基、二乙基氨基乙基、季氨基乙基和季铵基团。
阳离子交换色谱法也按照类似的原理进行。此外，使待提纯的带正电的分子结合到含有带负电的基团(例如羧甲基或磺酸基团)的支承基质上。所用抗衡离子通常是被带正电的样品分子取代的钠或钾离子。阳离子交换剂的例子是偶联到聚丙烯酰胺凝胶树脂上或偶联到烃聚合树脂(例如纤维素或葡聚糖)上的羧甲基、磺乙基、磺丙基、磷酸盐或磺酸盐基团。
柱构造可以是，例如，具有垂直流的常规柱，或具有径向流的柱。
在施加步骤a)的洗脱液之前，通常适当地用pH值为5-10，优选6-9，更优选7-8的缓冲液使树脂达到平衡。多种缓冲液能够使pH值保持在该范围内。这些缓冲液都适用，但是目前优选Tris缓冲液，更优选含有20毫摩尔/升Tris，pH 8.0的缓冲液。
在平衡之后，将步骤a)的洗脱液施加到离子交换树脂，优选阴离子交换树脂上。然后在适当的情况下，洗涤该柱，随后通过提高离子强度和/或改变pH值洗脱IL-15-Fc融合蛋白。任选的洗涤步骤通常使用与平衡阶段相同的缓冲液。然而，还可以使用具有不同(例如更高)摩尔浓度的洗涤缓冲液，例如20毫摩尔/升Tris、200毫摩尔/升NaCl，pH 8.0。用于色谱分离的缓冲液浓度通常为，例如，至少10毫摩尔/升以确保充分的缓冲能力。通常使缓冲液的离子强度保持较低(＜5mS/cm)以便不会影响蛋白质与基质的结合。然而，离子强度不应该低到使蛋白质变性或沉淀。缓冲离子应该具有与基质相同的电荷，因为相反电荷影响了分离过程并导致局部pH失调。可以使用线性梯度(电解质浓度的逐步提高)进行洗脱，或进行等度(isocratically)洗脱。通常，获得最多0.5摩尔/升，优选最多0.4摩尔/升，更优选最多0.35摩尔/升的最终摩尔浓度，所用电解质例如是氯化钠或具有相同作用的另一电解质。
将具有10-200毫摩尔/升的优选缓冲液浓度的步骤a)的洗脱液施加到平衡柱上。将洗脱液的pH值调节至5-9，优选至7.5-8.5。可以使用合适的试剂，例如通过添加NaOH或另一合适的碱调节pH值。接着，可以用缓冲液，优选用平衡缓冲液或洗涤缓冲液洗涤该柱。缓冲液浓度优选为10至300毫摩尔/升。PH值优选为7.0至9.0，更优选7.75至8.25。
在离子交换色谱法的优选具体实施方式中，所用柱优选为DEA-琼脂糖柱或Q-琼脂糖柱，更优选Q-琼脂糖柱。
在优选具体实施方式中，通过FPLC(快速蛋白质液相色谱法)设备或kta纯化器(例如kta Pilot or BioPilot，Amersham，UK)进行阴离子交换色谱法。在FPLC设备的情况下，首先使离子交换柱在初始缓冲液中达到平衡，然后将待分离的蛋白质混合物(其在进样环管中)施加到该柱上。立即洗脱不与该柱结合的蛋白质。通过混合物缓冲液缓慢提高缓冲液的离子强度，从而使蛋白质逐一从柱中洗脱并收集在馏分收集器中。
在本发明的优选具体实施方式中，本发明的提纯方法还包括步骤c)：
c)将步骤b)的洗脱液施加于凝胶过滤柱或用于疏水作用色谱柱并从柱中洗脱第三IL-15/Fc洗脱液。
在此通过凝胶过滤或疏水作用色谱法提纯步骤b)的洗脱液。
凝胶过滤特别适合通过色谱法分离蛋白质，其固定相包含溶胀凝胶珠并且根据颗粒大小进行分离：大粒子与液体一起迁移通过凝胶珠，较小的粒子保留在孔隙中并最后一个出现在洗脱液中。洗脱通常同溶剂(isocratically)进行，也就是仅用一种缓冲液无梯度地进行。缓冲液的组成通常对分离没有影响，并且取决于蛋白质的要求。可以使用孔隙率取决于交联程度的球形聚合物作为凝胶基质。其例子是交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、Biogel A、丙烯葡聚糖凝胶和Biogel P。具有合适尺寸的较小蛋白质可以扩散到这些基质的孔隙中。这减缓了它们通过凝胶的流速。如果蛋白质太大，它们就会通过孔隙并以更高的穿过凝胶的流速洗脱。高分子量蛋白质因此在低分子量蛋白质之前洗脱。按照不同的分子半径(Stokes’radii)分离物质混合物，这种半径在球状蛋白质的情况下，通常与分子的分子量成比例。为了获得充分分离，所用体积优选不超过柱体积的5％，更优选不超过1％。浓度优选最多为50毫克/毫升，更优选25毫克/毫升，再优选为10毫克/毫升。
凝胶过滤色谱柱的固定相包括优选在5000-600000kDa的范围内分馏的柱材料。优选使用Superdex 200、Superdex 75、Superose 6、Superose 12、交联葡聚糖凝胶G75、丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR、丙烯葡聚糖凝胶S-300 HR或丙烯葡聚糖凝胶S-400 HR，更优选使用Superdex 200作为柱材料。
通常在施加步骤b)的洗脱液之前，用平衡缓冲液，例如50毫摩尔/升磷酸钠，pH 7.0、150毫摩尔/升氯化钠使该柱达到平衡。然后将步骤b)的洗脱液施加到该柱上。由于非常低的盐浓度可能对该柱的色谱分离性能产生负面影响，离子强度预计＞20mS/cm。
作为凝胶过滤的一种替代方法，还可以进行疏水作用色谱法(HIC)。疏水作用具有极大的生化重要性。它们充分参与了蛋白质三维三级结构的稳定化。疏水作用是指2个疏水分子自发地在极性环境(例如水)中聚集的现象。溶解一种盐并提高介质的离子强度也提高了两种非极性分子的疏水相互作用。蛋白质具有程度不同的高比例疏水表面结构。它们因此能够以适当的高离子强度附着到疏水吸附剂上。可以通过盐含量以及通过吸附剂的选择控制这种相互作用的强度。所用官能团的例子是乙基、丁基、丙基、辛基或苯基。在存在高盐浓度的情况下进行吸附；相应地，使用递减的盐梯度进行洗脱。所用盐通常是硫酸铵。
在本发明的特别具体实施方式中，在步骤a)至c)的至少一个步骤之前或之后过滤和/或浓缩组合物或洗脱液。
为了浓缩溶液中的蛋白质，可以使用各种方法。这可以例如通过超滤进行。在此，将蛋白质溶液在压力下压过膜，仅有小分子(盐、溶剂)可以通过该膜，同时保留较大的例如蛋白质的分子。这降低了溶液体积，由此提高蛋白质浓度。可以使用切向流过滤系统进行过滤。对此适合的膜是保留蛋白质的膜。可以通过加压过滤进行过滤，其中将进料垂直压向该膜。或者，可以使用横向流过(cross-flow)滤法，其中进料切向穿过该膜。渗透液以垂直于流向的方式通过该膜。该膜的连续切向撇过(skimming)实现了提纯效果，这减少了覆盖层的形成。为了进一步改进，还可以在两层平行膜之间设置织物层，这导致附加的涡流。
除浓缩外或代替浓缩，可以将组合物或洗脱液过滤。可用过滤材料是硝酸纤维素、乙酸纤维素、PVC、特氟龙(Teflon)或陶瓷膜，例如由氧化锆制成的陶瓷膜。过滤器可以是单独的膜或组装在膜系统(例如组件)中。组件可以是管式组件、螺旋型组件或盘绕组件或中空纤维组件。
在本发明的优选具体实施方式中，在提纯方法的步骤a)之前通过过滤净化组合物。用于净化滤液的过滤器具有最高大约5微米，优选4微米，更优选3微米，最优选1微米的孔径大小。
用于超滤的过滤器的孔径大小优选不超过100000NMGT，更优选不超过75000NMGT，再优选不超过50000NMGT，最优选不超过30000NMGT。
用于无菌过滤的过滤器的孔径大小优选不超过0.8微米，更优选不超过0.6微米，再优选不超过0.4微米，最优选不超过0.22微米。
在本发明的优选具体实施方式中，在步骤b)之前使步骤a)的洗脱液的pH值呈酸性。酸性pH值是小于7.0，优选小于5.5，更优选小于4.0，最优选小于3.5的pH值。小于3.5的pH值适合病毒灭活。在病毒灭活后，再添加碱，例如1/10体积的1摩尔/升Tris pH 8.0来提高pH值。除降低pH值外，可以使用合适的过滤器过滤组合物或任何洗脱液以除去病毒。合适的过滤器是技术人员已知的。
在本发明的特别优选的具体实施方式中，提纯方法中使用的亲和色谱柱是蛋白质-A色谱柱，提纯方法中使用的阴离子交换色谱法是Q-琼脂糖柱，且提纯方法中使用的凝胶过滤柱是Superdex-200柱。
进一步特别优选的是使用上述步骤a)至c)的提纯方法，在合适的情况下，结合上述具体实施方式，其中在提纯后具有至少90％纯度，优选至少95％纯度，最优选具有至少99％纯度的IL-15/Fc融合蛋白。可以如实施例中所述通过HPLC-SEC检验纯度。
本发明进一步涉及具有至少90％的纯度，优选至少95％的纯度，最优选至少99％的纯度的纯化IL-15/Fc融合蛋白，可以如实施例中所述通过HPLC-SEC检验纯度。
在进一步优选的具体实施方式中，每N-聚糖的平均唾液酸化水平(sialylation)，也就是纯化的IL-15/Fc融合蛋白中被唾液酸占据的N-聚糖的比例为至少70％，更优选至少80％，再优选至少90％，最优选至少95％。
在再一优选具体实施方式中，每个分支(antenna)的平均唾液酸化水平(sialylation)，也就是纯化的IL-15/Fc融合蛋白中被唾液酸占据的分支的比例为至少50％，更优选至少70％，再优选至少80％，最优选至少90％，分支的数量相当于N-聚糖中分支的数量。
还可以通过HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱法和脉冲电流检测法)测定平均唾液酸化水平(sialylation)，通过HPLC测定分支的数量。唾液酸是N-和O-酰化神经氨酸衍生物的组名。由于它们的作为糖复合物(glycoconjugates)的多个低聚糖链的端基的暴露位置，唾液酸对前者的生物性能产生明显影响。由于在糖蛋白中的唾液酸酶促裂解明显缩短了它们的血浆半衰期，唾液酸化水平(sialylation)尽可能高是有利的。这能够使IL-15/Fc以较低剂量和/或较长时间间隔施用。本发明的提纯方法提供了可用于制备IL-15/Fc融合蛋白的温和方法，该IL-15/Fc融合蛋白具有上示值的平均唾液酸化水平(sialylation)。
N-乙酰基神经氨酸是最常见的唾液酸，并且是糖蛋白的重要组分。与其它唾液酸类似，其防止灭活，并且这是高比例的N-乙酰基神经氨酸有利的原因。
在本发明的进一步具体实施方式中，在纯化的IL-15/Fc融合蛋白中，在N-乙酰基神经氨酸、N-乙醇酰基神经氨酸和唾液酸(asialo)-N-聚糖总量中，N-乙醇酰基神经氨酸的比例不超过20％，优选不超过15％，更优选不超过10％。N-乙醇酰基神经氨酸是人体内通常不存在的神经氨酸，这意味着其可以具有抗原作用。其比例因此应该尽可能地低。
可以通过测定N-乙酰基神经氨酸、N-乙醇酰基神经氨酸和唾液酸(asialo)-N-聚糖总面积中N-乙醇酰基神经氨酸的面积百分比，依靠例如HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱和脉冲电流检测法)测定作为N-乙酰基神经氨酸、N-乙醇酰基神经氨酸和唾液酸-N-聚糖总量的一部分的N-乙醇酰基神经氨酸的量。
原则上，描述了蛋白糖基化的多种生物功能。因此，低聚糖可以通过防止蛋白酶、微生物和抗体对蛋白质的识别来发挥保护性或掩蔽功能。在许多情况下，糖基化通过在粗面内质网中辅助多肽的正确折叠并保持蛋白质的构象来发挥结构化和稳定化作用。此外，蛋白质的糖基化可以调节与配体或受体的相互作用并起到细胞-细胞和细胞-基质识别的作用。
因此，提供具有尽可能多的天然生成或细胞产生的糖基化的IL-15/Fc融合蛋白是合意的。糖基化位点的数量、糖分子的数量和/或分支的数量可作为这一点的测量标准。
本发明进一步涉及包含纯化IL-15/Fc蛋白以及赋形剂和添加剂的组合物。
可以使蛋白质稳定的合适的赋形剂和添加剂是技术人员公知的(例如Sucker H.等，(1991)Pharmazeutische Technologie，第2版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany)。它们包括，例如，生理盐水、Ringer右旋糖、Ringer乳酸盐、软化水、稳定剂、抗氧化剂、络合剂、抗菌化合物、蛋白酶抑制剂和/或惰性气体。在优选具体实施方式中，赋形剂和添加剂是甘露醇、蔗糖和/或甘氨酸。
在优选具体实施方式中，组合物具有7.4至8.0的pH值，因为含有IL-15/Fc并具有这种pH值的液体组合物已经证实是特别稳定的。
在进一步优选具体实施方式中，本发明的组合物是药学组合物。药学组合物是预定并适合用作药物的组合物。其因此包含适合药用的赋形剂和添加剂。这些的例子是无菌水(消毒水)、影响pH值的物质(例如有机和无机酸和碱和它们的盐)、调节pH值的缓冲物质、等渗剂(例如氯化钠、碳酸氢钠、蔗糖和果糖)、表面活性剂或表面活性物质和乳化剂(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐的部分脂肪酸酯(Tween)或，例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(Cremophor))、脂油(例如花生油、大豆油和蓖麻油)、合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和中性油(Miglyol))、以及聚合赋形剂(例如明胶、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、提高溶度的有机溶剂添加剂(例如丙二醇、乙醇、N，N-二甲基乙酰胺、丙二醇)或络合剂(例如柠檬酸盐和尿素)、防腐剂(例如苯甲酸羟丙酯和苯甲酸甲酯、苄醇)、抗氧化剂(例如亚硫酸钠)和稳定剂(例如EDTA、PVP、作为成粒剂或缓释剂的纤维素酯，例如基于Eudragit、纤维素或Cremophor的蜡状和/或聚合物质)、抗氧化剂、增甜剂(例如蔗糖、木糖醇或甘露醇)、调味剂、芳香剂、防腐剂、色料、缓冲物质、直接压片剂(例如微晶纤维素、淀粉和淀粉水解产物(例如Celutab)、乳糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和磷酸二钙)、润滑剂、填料(例如乳糖或淀粉、乳糖形式的粘合剂、淀粉类型(例如小麦或玉米或大米淀粉)、纤维素衍生物(例如甲基纤维素、羟丙基纤维素或硅藻土)、滑石、硬脂酸酯(例如硬脂酸镁、硬脂酸钙)、滑石、硅化滑石、硬脂酸、十六烷醇或氢化脂。
下面通过实施例和附图阐述本发明，它们不能被视为是限制性的。
附图说明
图1描绘了pcDNA3.1hCD5.6Ala7表达构建体的图谱。
图2-3描绘了pcDNA3.1hCD5.6Ala7表达构建体的序列(SEQ IDNO.1)。
图4描绘了pMG10Ala7表达构建体的图谱。
图5-6描绘了pMG10Ala7表达构建体的序列(SEQ ID NO.2)。
图7A描绘了带有CD5前导肽的人类突变IL-15/Fc的核酸序列(SEQ ID NO.3)。
图7B描绘了带有CD5前导肽的人类突变IL-15/Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。
图7C描绘了带有CD5前导肽的鼠科的突变IL-15/Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)。
图8描绘了用含有每种情况中所示的前导肽序列的pcDNA3.1hCD5.6Ala7质粒转染CHO-K1细胞之后的细胞培养基上清液中的IL-15/Fc含量。
图9描绘了用各种表达构建体转染CHO-K1细胞之后的细胞培养基上清液中的IL-15/Fc含量。每个条代表在每种情况下2个独立实验的重复测定的平均+SEM。
PcDNA3.1相当于pcDNA3.1hCD5.6Ala7载体。
PVS8-Ala7相当于具有IL-15/Fc构建体的pSwitch质粒(Valentis)。
pMG-Ala7相当于具有IL-15/Fc构建体的pMG质粒(Invivogen)。
pCINeo-Ala7相当于具有IL-15/Fc构建体的pCI-Neo质粒(Promega)。
具体实施方式
实施例1：在CHO-K1细胞中制备IL-15/Fc
为了制备生产IL-15/Fc的CHO-K1细胞株，应该形成IL-15/Fc的表达构建体并在其分泌性能，其所包含的片段的同一性/完整性和合适的抗性基因方面进行优化
a)原材料
人类IL-15/Fc表达构建体(突变IL-15/人类Fc)是由Department ofImmunology of the“Beth Israel Deaconness Medical Center”(HarvardMedical School，Boston，USA)提供的。
寡核苷酸获自NMG-Biotech(Ebersberg，Germany)。相关信号肽的序列获自基因库。
限制酶(BgIII、XbaI、BamHT、SmaT、BstXI、ApaI)、Lipfectamin2000、其它分子生物试剂(T4-DNA连接酶、T4-多核苷酸激酶)和质粒pSecTagA、pcDNA3.1获自Invitrogen(Karlsruhe，Germany)或Amersham-Pharmacia(NheI，Protein A Sepharose Uppsala，Sweden)。
感受态大肠杆菌XL 10-Gold细胞获自Stratagene(La Jolla，USA)。BCA试剂盒(Pierce)购自KMF Laborchemie(Sankt Augustin，Germany)。
质粒-DNA纯化试剂盒(Endofree-Maxi试剂盒、Endofree-Giga试剂盒)来自Qiagen(Hilden，Germany)。
抗体获自BD-Pharmingen(鼠-抗-hIL-15；目录号554712；Heidelberg，Germany)和Dianova(羊-抗-鼠-POD；目录号15-036-003；羊-抗-人-POD；目录号109-036-088；Hamburg，Germany)。
B)方法/结果
初始质粒在pSecTagA载体骨架内含有融合蛋白的cDNA，该融合蛋白含有融合到人类IgG1的Fc部分(铰链区和CH2、CH3区)上的突变人类IL-15。质粒结构相当于Kim等描述的(J.Immunol.，160：5742-5748；1998)，只是该公开中所述的Fc部分是鼠科Igγ2a。
已存在于pSecTagA载体中的Igk前导肽通过符合阅读框架的方式克隆入IL-15/Fc部分以用于进行融合蛋白的分泌。为此，从天然IL-15序列中去除固有信号序列。然而由于克隆，在Igk前导肽序列的3’端和IL-15克隆序列的5’端之间引入10个附加氨基酸，它们在蛋白质加工之后保留在分泌蛋白质中。为了去除这些非特异性氨基酸和改进蛋白质的分泌特性，测试其它分泌的或细胞表面蛋白质的各种前导肽序列：鼠科动物Igk(Cloma等，J.Immun.Methods 152：89-104；1992；接受号X91670)、人类CD5(Jones等，Nature 323：346-349；1986；接受号X04391)、CD4(Hodge等，Hum.Immunol.30：99-104；1991；接受号M35160)、MCP-1(Yoshimura等，Je.FEBS Lett.244：487-493；1989；接受号M24545)和IL-2(Taniguchi等，Nature 302：305-310；1983；接受号K02056)(接受号是National Center for BiotechnologyInformation的)。在去除Igk前导肽和附加的氨基酸后，通过克隆双链寡核苷酸来将前导肽取代成所述信号肽序列。通过序列测定检测身份(identity)。随后，使用lipfectamine2000通过瞬时转染HEK-293细胞，测试所得构建体。在按照Moll和Vestweber的方法进行蛋白质-A-琼脂糖提纯(Methods in Molecular Biology，96：77-84，1999)后，通过BCA测定法测量用各种构建体转染过的细胞的细胞培养基上清液的蛋白质含量。通过SDS凝胶的银染色和蛋白质印迹法对Fc或IL-15部分验证蛋白质的身份，以确保融合蛋白的这两种组分都存在。当使用CD5前导时，在所述实验中获得最佳结果。选择后者进行进一步载体优化，其中在分泌的融合蛋白中不再存在前导肽本身。
进一步测试，用含外显子/内含子的基因组DNA取代Fc部分的cDNA是否也有助于改进蛋白质表达。必须通过细胞核剪接装置去除的内含子的存在可以改进细胞核的RNA输出以及RNA稳定性。因此，通过插入剪接供体和受体位点，将基因组Fc部分结合到IL-15 cDNA序列上。还通过各种前导肽序列修饰所得质粒，并如上所述进行测试。然而，通过蛋白质印迹法进行的蛋白质分析表明，存在各种不需要的剪接变体，这样决定使用Fc部分的cDNA形式继续。
因此，所得质粒包含人类CD5前导肽和Fc部分的cDNA。
突变IL-15/Fc表达构建体的序列测定表明，Fc部分含有在原始构建体中已经存在的3个突变。这些突变中的两个与高度保守位置的氨基酸有关。第三个突变是在铰链区的位置4的Cys-Ala突变，其是有意插入的以终止分子内和分子间半胱氨酸桥的形成。
为了在保留Cys-Ala突变的同时去除两个不需要的突变，用RT-PCR亚克隆Fc的cDNA。所用RNA源自用编码VCAM-1-Fc融合蛋白的建构体转染的CHL-K1细胞株。将扩增的Fc的cDNA片段克隆到CD5-mutIL-15质粒中，并通过BamHI/XbaI限制酶去除Fc部分。
再根据清晰的限制性酶切(restriction)图谱并使用随后的序列测定分析所得质粒并指作CD5-6Ala7。由于使用Zeocin作为DNA插入剂可以造成突变，从原始pSecTagA骨架中取出编码IL-15/Fc的表达框并克隆到含有在SV40启动子控制下的新霉素抗性基因的pcDNA3.1中。对所得质粒的两条链都进行序列测定并表明与IL-15/Fc表达框完全一致。
再通过CHO-K1细胞的瞬时转染和细胞培养基上清液的蛋白质印迹分析测试该构建体的蛋白质表达。作为阳性对照，在平行实验中用CD5-6Ala7质粒进行转染。
为此，在转染之前的一天，在含有6个孔的细胞培养板中以5×105细胞/孔的密度一式三份地将细胞接种。使用2微克质粒和4微升阳离子脂质体2000(Lipofectramin2000)进行转染，它们各自用250微升的Optimeml培养基稀释。将这两种溶液混合，并在室温下培养30分钟后，将混合物用移液管加入细胞培养板的培养基中。
在转染后2天，去除培养基并通过蛋白质印迹法对人类IL-15部分分析其IL-15/Fc含量：将20微升细胞培养上清液与5微升5×Laemmli缓冲液混合并在85℃孵育5分钟。然后使样品通过12％聚丙烯酰胺凝胶。然后使用半干的印迹室印迹凝胶。用在PBS中含有5％奶粉、0.1％Tween 20的封闭液处理印迹过夜。然后在封闭液中以1∶1000的稀释度用单克隆鼠-抗-人-IL-15抗体将印迹孵育4小时。在3个洗涤步骤(10分钟，PBS，0.1％Tween20)后，在室温下用第二抗体羊-抗-鼠过氧化物酶(稀释度1∶5000)将印迹再孵育2小时。再将印迹洗涤3次，然后在印迹表面上逐滴施加Lumilight溶液并将X-射线胶片暴露于印迹。
在用CD5-6Ala7转染后获得的信号范围内，特定的蛋白质印迹信号表明，所有3个平行转染的细胞培养上清液含有IL-15/Fc蛋白质。因此表明，可以使用pcDNA3.1hCD5.6Ala7质粒(图1至3)在CHO-K1细胞中进行蛋白质表达。
c)结论
制备IL-15/Fc质粒，pcDNA3.1hCD5.6Ala7，其含有表达框，该表达框含有CD5前导肽，其中突变的人类IL-15融合到在CMV启动子的控制下人类IgG1-Fc的cDNA上。为了选择稳定的真核生物细胞克隆，引入新霉素抗性基因。对质粒进行序列测定并在相关编码区域中表现出100％一致性，其中仅有在载体骨架中没有任何相关性的略微差异(重复的3个碱基对)。通过CHO-K1细胞的瞬时转染检验构建体的功能。
实施例2
用含有所需产品的DNA的质粒转染真核生物细胞株(例如，CHO-K1细胞)是制备治疗性蛋白质的标准方法。然而，由此制成的稳定细胞克隆的低生产率水平是公知的问题。因此，存在各种提高现有细胞株生产率的方法。除了提高细胞中质粒拷贝数量的尝试(例如经由氨甲喋呤/DHFR系统)，还可以修饰表达构建体本身。除了强启动子(例如CMV启动子)外，加入内含子可以产生更好的RNA稳定性和更好的来自细胞核的RNA输出，这可以通过细胞的剪接装置进行。然而，必须进行实验以确定哪种内含子/转基因组合是合适的。为此，将各种内含子与人类IL-15-Fc结合以找出通过CHO-K1细胞提高IL-15-Fc产量的组合方式。
a)材料
用作初始质粒的质粒是pcDNA3.1hCD5.6Ala7质粒。其以示意图形式显示在图1中。作为SEQ ID NO.1公开其序列。
所用测试系统是CHO-K1细胞(DSM，Brunswick，Germany，接受号ACC110)或HEK-293细胞(Qbiogene，Grünberg，Germany，AE80503，ABI-293A)。还使用大肠杆菌细胞(XL10-Gold，Strategene，La Jolla，USA)。在标准培养条件(5％CO2、37℃、湿润空气)下培养细胞。将CHO-K1细胞以1∶20的比率每周传代培养两次，而HEK-293细胞以1∶6的比率传代培养。所用培养基对于CHO-K1细胞是DMEM-F12+10％ FKS+1％ PEN/Strep，对于HEK-293细胞是DMEM+Glutamax+10％ FKS+1％ PEN/Strep。使用Optimeml培养基进行转染。使用Invitrogen，Karlsruhe，Germany(目录号31331-028；32430-027；51985-018)的培养基。所用质粒是含有CMV启动子和嵌合内含子、人类β-球蛋白基因的5’剪接给体位点和可变区域的IgG重链的3’剪接受体位点的pCl-Neo(Promega)。PMG(Invivogen)是含有来自CMV的IntronA的延长的CMV启动子。pSwitch(Valentis)是合成内含子，IVS8。此外，使用下列酶和限制酶：ApaI、EcoRV、XbaI、NruI、PacI、SmaI、XhoI、T4-DNA连接酶、T4-DNA聚合酶、来自牛肠的碱性磷酸酶。这些和其它分子生物试剂(阳离子脂质体2000)获自Invitrogen。NheI获自Amersham-Pharmacia(Uppsala，Sweden)，且质粒纯化试剂盒获自Qiagen，Hilden，Germany。高保真扩增PCR系统(Expand High Fidelity PCR System)(目录号1732641)获自Roche，Mannheim，Germany。
b)方法
i)通过NheI/ApaI消化pcDNA3.1hCD5.6Ala7质粒而分离IL-15/Fc插入片段。首先通过ApaI限制消化使质粒线性化，并通过T4-聚合酶处理来使5’-突出端钝化。然后通过随后的NheI消化分离IL-15/Fc插入片段。将该片段与已经用NheI和SmaI消化的pcI Neo连接。
ii)去除pcDNA3.1hCD5.6Ala7的CMV启动子并取代成源自pMG的扩增的CMV启动子和内含子A：用PacI切割pMG质粒并通过T4-聚合酶处理来使5’-突出端钝化。在第二XbaI处理之后，将由此获得的1.7kb片段(其含有CMV启动子+内含子A)通过琼脂糖凝胶电泳提纯。通过NheI和随后的NruI限制性酶切(restriction digestions)从pcDNA3.1hCD5.6Ala7中去除CMV启动子。将所得片段与pMG启动子内含子在4℃连接过夜。
iii)用PCR扩增IVS8内含子并克隆在pcDNA3.1hCD5.6Ala7中的CMV启动子的3’末端和IL-15插入片段的5末端之间。通过NheI限制酶切使质粒线性化，并随后用来自牛肠的碱性磷酸酶处理。使用含有XbaI限制酶切位点的引物并在下列条件下使用高保真扩增PCR系统通过PCR扩增内含子：所用反应混合物包括2微升dNTPs(Qiagen，Taq core kit，2毫摩尔/升)、25pmol的引物、5微升的10×缓冲液、0.75微升的高保真Taq聚合酶、1微升(大约15纳克)的pSwitch-XhoI/EcoRV片段、和补齐50微升体积的水。PCR程序(25个循环)如下：在95℃5分钟，在94℃15秒，在55℃30秒，在72℃30秒，在72℃5分钟。用XbaI裂解PCR产物，从0.8％琼脂糖凝胶中洗脱并与线性化质粒连接。
将所得质粒转化大肠杆菌XL10 Gold并用Miniprep分析质粒。可以使用表现出合适的内切酶图谱的任何质粒的一个克隆进行随后的无内毒素质粒制备。
在瞬时转染HEK-293或CHO-K1细胞之后分析IL-15/Fc表达。在转染之前的一天，在含有6个孔的细胞培养板中以5×105细胞/孔的密度一式两份地将细胞接种。在每种情况下将2微克质粒和4微升阳离子脂质体2000在250微升Optimeml培养基中稀释，由此进行按照Felgner等的转染(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84-7413-7417；1987)。将这两种溶液混合，并在室温下培养30分钟后，将混合物用移液管加入细胞培养板中的细胞培养基中。转染后两天，去除培养基并使用针对IL-15/Fc的Fc部分的ELISA试验测定IL-15/Fc含量。
c)结果
用各种表达构建体转染的HEK-293细胞的IL-15/Fc分泌几乎不受其它载体组分的影响。相反，在已经在IL-15/Fc构建体中插入内含子后，CHO-K1细胞产生的IL-15/Fc表达提高了200-300倍。初始构建体，pcDNA3.1hCD5.6Ala7，分泌的蛋白质水平几乎不可检测(低于10纳克/毫升)，在内含子插入的情况下，在用pMG10Ala7(图4至6；SEQID NO.2)转染后，产生大约300纳克/毫升的IL-15Fc水平。表明CHO-K1细胞中IL-15/Fc-表达水平的ELISA数据显示在图4中。由于用pMG构建体转染后的表达水平最高，选择后者制备稳定的CHO-K1-表达细胞株。
为此，首先对质粒进行单链序列测定。在包含IL-15/Fc框、新插入的CMV启动子和内含子片段的区域中测定构建体两条链的序列。质粒含有在CMV启动子控制下的IL-15/Fc框。源自CMV(MG质粒)的内含子A位于启动子和翻译起始位点之间。质粒含有在IL-15/Fc片段下游的BGHpolyA位点；新霉素抗性基因受到SV40启动子的控制并且也含有SV40polyA位点。质粒含有用于大肠杆菌中的选择和扩增的氨苄青霉素抗性基因。
d)论述和结论
为了提高稳定的CHO-K1-IL-15/Fc转染子的蛋白质收率，通过在启动子与IL-15/Fc框之间加入内含子来修饰表达质粒。组合的内含子-转基因-宿主细胞强烈地影响蛋白质表达，并因此不能预测哪种内含子在提高被分析的两种细胞类型中的IL-15/Fc表达方面是最有效的。
HEK-293细胞几乎不受内含子引入的影响，而在CHO-K1细胞中检测出IL-15/Fc分泌的大量提高。在使用含有CMV启动子和来自pMG的内含子A的质粒的情况下，CHO-K1细胞中IL-15/Fc蛋白质的表达与原始IL-15/Fc表达载体相比提高了多于一个数量级。可以使用该质粒制备IL-15/Fc生产细胞株，该细胞株可用于制备用于临床前和临床研究或用于工业IL-15/Fc制备的IL-15/Fc。
实施例3：IL-15/Fc融合蛋白的提纯
a)净化和浓缩
将大约3100升来自实施例2的上清液(pMG10Ala7质粒)在6次操作中净化、浓缩并无菌过滤。这包括使用Profile Star过滤器(3微米，20英寸，Pall Corporation，East Hills，NY，USA)净化上清液。随后，通过使用2.0平方米的Biomax-30膜的切向流过滤系统(Millipore，Billerica，MA，USA)将上清液一共浓缩10至15倍。入口压力为2-2.5巴，出口压力为1.5巴。在浓缩之后，通过包含预滤器(Polysep II(0.2微米，10英寸，Millipore，Billerica，MA，USA))和终滤器(Durapore(0.22微米，10英寸，Millipore，Billerica，MA，USA))的过滤器系统将浓缩物无菌过滤。六个不同的操作花费4.5至8小时。
b)r蛋白质-A色谱法
将大约240升净化和浓缩步骤的汇集产物施加于r蛋白质-A柱(2.6升)。装载过程中的流速为10至15.4升/小时(65-100厘米/小时)。随后，用10倍于柱体积的20毫摩尔/升Tris、150毫摩尔/升NaCl，pH 7.5洗涤该柱，然后用10倍于柱体积的0.1摩尔/升柠檬酸盐，pH 5.0洗涤该柱。在5倍于柱体积的0.1摩尔/升柠檬酸盐，pH 3.4中洗脱IL-15/Fc，并用5倍于柱体积的0.1摩尔/升柠檬酸盐，pH 3.0汽提该柱。以单个锐峰洗脱IL-15/Fc。洗脱液是黄色的并含有微粒组分。立即用1摩尔/升柠檬酸盐将洗脱液调节至pH 3.5。在室温下连续搅拌1小时，由此进行低pH值下的病毒灭活。添加1摩尔/升Tris并将pH值调节至8.0，由此停止该处理。使用Millipak-20过滤器无菌过滤洗脱液(8.6升)并在2-8℃储存在10升Schott瓶中。
c)Q-琼脂糖色谱法
将Q-琼脂糖-FF柱装填至12.7厘米的高度，这相当于1.9升的柱体积。在平衡之后，HETP(理论塔板高度)为0.041且不对称度为1.1。
在50升Stedim bag中将r蛋白质-A色谱法的洗脱液以1∶5的稀释度用20毫摩尔/升Tris，pH 8.0稀释。将42.2千克稀释r蛋白质-A洗脱液施加于1.9升Q-琼脂糖柱。用5倍于柱体积的20毫摩尔/升Tris、0.1摩尔/升NaCl，pH 8.0，然后用5倍于柱体积的20毫摩尔/升Tris、0.2摩尔/升NaCl，pH 8.0洗涤该柱。用5倍于柱体积的20毫摩尔/升Tris、0.35摩尔/升NaCl，pH 8.0洗脱IL-15/Fc。用5倍于柱体积的20毫摩尔/升Tris、1.0摩尔/升NaCl，pH 8.0汽提该柱。使用Millipak-20过滤器将Q-琼脂糖色谱法的洗脱液(5.0升)无菌过滤到10升Schott瓶中，并储存在2-8℃。洗脱液仍然略黄，尽管已经去除了大部分黄色污染物。
监测在280纳米的光密度，表明以接近洗脱结束时的单个锐峰洗脱IL-15/Fc。
d)通过超滤浓缩来自Q-琼脂糖色谱法的洗脱液
根据OD280(在280纳米测得的光密度)，将Q-琼脂糖色谱法洗脱液浓缩至8.85克/升的最终浓度。这包括使用0.1平方米的Biomax10-kD膜。将入口压力调节至1.0巴，并将出口压力调节至0.5巴。将浓缩物(1.9升)以5等分无菌过滤到0.5升PETG瓶中。
e)Superdex-200色谱法
在3巴的压力下在柱中填充柱材料。所用柱具有0.013厘米的HETP和3.0的不对称度。
通过5次连续操作经13.5升Superdex-200柱提纯浓缩物的5个等分试样。色谱图描绘了高分子量下的小峰和在单体型IL-15/Fc下的主峰。收集馏分，产生下列馏分。
  馏分   在以下CV处收集
  1   0.32-0.41
  2   0.41-0.42
  3   0.42-0.43
  4   0.43-0.44
  5   0.44-0.45
  6   0.45-0.46
  7   0.46-0.48
  8   0.48-0.50
  9   0.50-0.52
  10   0.52-0.54
  11   0.54-0.56
  12   0.56-0.58
  13   0.58-0.60
CV：柱体积
f)Superdex馏分的汇集
根据HP-SEC分析中测定的纯度，使用来自Superdex-200提纯的馏分进行进一步制备法。通常，为此汇集馏分5至11。根据HP-SEC分析的峰面积计算IL-15/Fc的量。
g)病毒过滤
将所有5次操作汇集的Superdex馏分转移到Stedim bag中，汇集并用PBS(pH 7.4)稀释至0.88克/升的最终IL-15/Fc浓度。将稀释的汇集的Superdex馏分依次经1-m2 Planova-35N和1-m2 Planova-15N过滤器过滤。在Planova-35N过滤器的情况下，操作压力为0.5巴。在过滤后，用3升PBS(pH 7.4)漂洗过滤器。在0.5巴下装载的过程中，通过病毒过滤器的流速为12至15升/小时。在洗涤过程中，流速降至大约10升/小时，因为洗涤在0.4巴下进行。
h)无菌过滤
使用0.22微米Millipak过滤器对16.4千克最终产品进行无菌过滤，并加入1升PETG瓶中。在进一步使用之前，将这些瓶储存在2-8℃。
实施例4：IL-15/Fc融合蛋白的规格(specification)
a)SDS-PAGE/蛋白质印迹分析
在还原的SDS-PAGE及随后的银染色分析，表明在Q-洗脱液中、在汇集的Superdex馏分中和在最终产物中的IL-15/Fc具有与对照物的IL-15/Fc类似的迁移性能。在一些凝胶中，在Q-洗脱液中可以看出在较低和较高分子量下的附加条带，它们也存在于对照物中。在一些汇集的Superdex馏分中可以看出具有较高分子量的两个条带。在对照物中也可检测出这些条带。具有高分子量的附加条带可能是由样品在装载凝胶之前的还原不足引起的，这种还原不足可能是由较长的停留时间引起的。
在IL-15/Fc最终产物的情况下，除主要的IL-15/Fc条带外，用随后的硝酸银染色在未还原的SDS-PAGE上检测不出任何附加条带。随后检测Fc的未还原的蛋白质印迹法还仅表现出IL-15/Fc主带。这证明下述事实——IL-15/Fc的质量在所有工艺步骤中都相似。
b)IL-15/Fc的N-糖基化
测定在提纯中间物和最终产物的粗萃取物、净化和提纯步骤中的IL-15/Fc的N-糖基化性能。使用HPAEC-PAD分析法(HPLC：BioLC，检测器PAD，柱：CarboPacPA 100 Analytical(2×250毫米)，为测定天然N-聚糖，缓冲液A：0.1摩尔/升NaOH；缓冲液B：0.1摩尔/升NaOH、0.6摩尔/升乙酸钠，或者为测定唾液酸-N-聚糖，缓冲液A：0.2摩尔/升NaOH；缓冲液B：0.2摩尔/升NaOH、0.6摩尔/升乙酸钠)测定每个天然N-聚糖的平均唾液酸化水平和N-乙酰基神经氨酸的面积相对于N-乙酰基神经氨酸、N-糖基神经氨酸和唾液酸N-聚糖的总面积的百分比。结果概括在下表中：
提纯步骤   每个N-聚糖的平均唾液酸化水平 ％N-乙酰基-神经氨酸
  产量   2.16   60
  净化及浓缩   2.17   61
  r蛋白质-A洗脱液   1.90   48
  Q-琼脂糖洗脱液   2.01   50
  浓缩液   1.95   49
  Superdex 200   2.04   51
  最终产物   2.00   44
当样品放置较长时间时，在提纯和浓缩以及r蛋白质-A色谱法之间观察到平均唾液酸化水平和N-乙酰基神经酰胺百分比的降低。所有其它提纯步骤的糖基化都相似。
c)宿主细胞蛋白质
使用传统ILA试验在不同的两天在NewLab AG上进行宿主细胞蛋白质的试验。从而发现2.1×103和3.9×103纳克/毫升宿主细胞蛋白质，分别相当于2.9×103ppm和5.3×103ppm。使用Cygnus试验(文章号F015)对最终产物中的宿主细胞蛋白质进行补充试验，得到240纳克/毫升异种蛋白，相当于3.3×102ppm。在较短的停留时间下，还测量到较低的值。
d)N-末端序列
在最终产品种测定IL-15/Fc末端序列。该试验显示出(Asn/Asp)1-Trp2-Val3-Asn4-Val5-Ile6-Ser7-Asp8-Leu9-Lys10的N-末端序列。在该试验中测得的氨基酸序列相当于预期N-末端IL-15/Fc序列，只是将N-末端ASN脱酰氨基大约10％(有时也包括更高的值，但不超过20％)，由于Edman法引起的10％的标准脱酰氨基程度已经考虑在内。较长的停留时间导致大约45％的脱酰氨基化。
e)效能
使用生物活性试验测定最终产品中IL-15/Fc的效能。该试验通过研究对IL-15-激发鼠科CTLL-2细胞的增殖抑制作用与剂量的函数关系，从而检测IL-15拮抗剂IL-15/Fc的生物活性。ED50是1.65纳克/孔。
f)蛋白质-A残余
使用r蛋白质-A-特异性ELISA在最终产物中测定已经从r蛋白质-A柱中洗出的r蛋白质-A。这种残余物在此被发现＜0.001％。
g)DNA
使用Q-One测定最终产物中残余DNA的含量。发现小于5pg/0.5ml的残余DNA，相当于每毫克IL-15/Fc小于14pg的残余DNA。
h)G-418(Geneticin)
在发酵工艺的预培养过程中加入G-418。因此研究是否已经充分去除了G-418。测定IL-15/Fc最终产物中的G-418浓度小于30纳克/毫升。
i)规格
使用上述方法获得的IL-15/Fc产物具有下列规格：
产品浓度                0.70毫克/毫升
产物纯度                99％
pH                      7.4
ED50                   ＜0.1微克/孔
通过检测IL-15部分和Fc部分，确认产物同一性(identity)。还原和未还原的SDS-PAGE中的条带也与对照条带相符。
实施例5：制剂的制备
a)pH的影响
如表中所示，用各种缓冲物质和添加剂将IL-15/Fc稀释至1毫克/毫升。在它们的制备之后，在此使用0.2微米过滤器(Acrodisc SyringeFilter，Pall)过滤缓冲液。将最终制品在40℃和75％相对湿度下储存在10毫升玻璃容器(4毫升/容器)中。
  制剂   缓冲液   PBS
  1   35.7毫摩尔/升柠檬酸盐pH 4   2.73毫摩尔/升
  2   35.7毫摩尔/升柠檬酸盐pH 5.5   2.73毫摩尔/升
  3   35.7毫摩尔/升柠檬酸盐pH 6   2.73毫摩尔/升
  4   12.6毫摩尔/升PBS pH 7.4
  5   35.7毫摩尔/升Tris pH 8   2.73毫摩尔/升
使用HP-SEC测定IL-15/Fc制剂的纯度。为此使用TSK-GELG3000SWXL柱(300×7.8毫米)并使用TSK-GELSWXL柱(40×6毫米)作为保护柱。它们在25℃和1毫升/分钟的流速下运行。注射量为50微升。使用检测器在214纳米进行检测。在时间0，纯度仅为85％，因为所用IL-15/Fc含有大约15％聚集产物。因此，85％的原材料是活性二聚物形式的。在pH 4下，在7天后，IL-15/Fc二聚物的峰面积从大约85％降至大约40％。在pH 5.5和pH 6下也观察到纯度降低。这些制剂在pH 8和pH 7.4下证明在40℃经过7天是稳定的。这表明，随着pH值降低，IL-15/Fc的稳定性降低。
在储存7天之后，在40℃进一步对这些制剂进行未还原SDS-PAGE。pH 4的制剂含有在大约70和50kD的由降解产物引起的两个条带。pH 6和pH 5.5制剂也含有两个由降解产物引起的条带，但是这两个条带具有大约60至80kD的表观分子量。在pH 4、5.5和6的降解产物的表观分子量差异表明在不同pH值下的不同降解过程。
在pH 7.4和8下的制剂在主带以下没有显示出任何其它条带。在这些制剂中都没有观察到高于主带的条带提高，这表明在40℃储存7天期间，在未还原SDS-PAGE中，聚集没有增加。
b)pH和添加剂的影响
如a)所述制备并储存各种制剂。此处使用下列pH值和添加剂：
  制剂   缓冲液   添加剂   PBS
  6   35.7毫摩尔/升柠檬酸盐，pH 6   2.5％甘露醇   2.73毫摩尔/升
  7   35.7毫摩尔/升柠檬酸盐，pH 6   43％蔗糖   2.73毫摩尔/升
  8   35.7毫摩尔/升柠檬酸盐，pH 6   0.71％甘氨酸   2.73毫摩尔/升
  9   35.7毫摩尔/升柠檬酸盐，pH 6   2.2％左旋精氨酸   2.73毫摩尔/升
  10   3.2毫摩尔/升磷酸盐，pH 7.4   3.9％甘露醇   2.73毫摩尔/升
  11   3.2毫摩尔/升磷酸盐，pH 7.4   7.1％蔗糖   2.73毫摩尔/升
  12   3.2毫摩尔/升磷酸盐，pH 7.4   1.1％甘氨酸   2.73毫摩尔/升
  13   3.2毫摩尔/升磷酸盐，pH 7.4   3.6％左旋精氨酸   2.73毫摩尔/升
  14   97.3毫摩尔/升Tris，pH 8   1.3％甘露醇   2.73毫摩尔/升
  15   97.3毫摩尔/升Tris，pH 8   2.1％蔗糖   2.73毫摩尔/升
  16   97.3毫摩尔/升Tris，pH 8   0.35％甘氨酸   2.73毫摩尔/升
  17   97.3毫摩尔/升Tris，pH 8   1.1％左旋精氨   2.73毫摩尔/升
  酸
对于每一制剂，在时间t＝0测量重量克分子渗透浓度，并在时间t＝4周时测量40℃下的pH值：
  制剂   重量克分子渗透浓度(Osmol/kg)   pH
  6   0.320   6.20
  7   0.321   6.12
  8   0.281   6.12
  9   0.296   10.14*
  10   0.321   7.36
  11   0.323   7.11
  12   0.241   7.34
  13   0.292   10.54*
  14   0.293   8.08
  15   0.298   8.21
  16   0.279   8.10
  17   0.290   8.99
*在加入精氨酸前调节的pH值
在所有制剂中，除了含有L-精氨酸的制剂外，制剂的pH值相当于预计值。L-精氨酸制剂具有与预计pH值相比高得多的pH值，并且这是由非常碱性的氨基酸L-精氨酸的作用引起的。在分析制剂的稳定性结果时，必须考虑L-精氨酸制剂的极高pH值。
除了在pH 7.4下含有甘氨酸的制剂外，所有制剂都是等渗的(＝0.270至0.330osmol/kg的重量克分子渗透浓度)。pH 7.4的甘氨酸制剂是弱低渗性的。
如上所述对各种制剂进行HP-SEC色谱法。样品中的一些表现出峰形的改变(峰的增宽或拖尾)。尽管峰形不同，但将整体峰面积解释为二聚物的峰面积并用于测定纯度。因此，这些峰的纯度可能是过高的估计。在表中用星号(*)标记相关样品。
结果表明，在柠檬酸盐缓冲液中的制剂(pH 6)，在40℃都不稳定。观察到至少20％的IL-15/Fc二聚物损耗。在含有柠檬酸盐缓冲液的制剂(pH 6)中，没有添加剂具有保护活性。同样地，含有L-精氨酸的制剂(高pH值)在40℃都不稳定。含有蔗糖和甘氨酸的pH 7.4的制剂在40℃稳定3周。pH 7.4的含有磷酸盐缓冲液和甘露醇的制剂在4周后明显降低的纯度是由微生物污染引起的。在含有Tris缓冲液的制剂(pH 8)中观察到轻微但连续的纯度降低(从85％至70％)。在含有Tris缓冲液的制剂(pH 8)中观察到赋形剂蔗糖、甘露醇或甘氨酸之间没有差别。对于含有柠檬酸缓冲剂(pH 7.4)的制剂也观察到相同的情况。
  制剂   t＝0   t＝1周   t＝2周   t＝3周   t＝4周
  6   85.97   79.48   72.24*   58.65*   nt
  7   85.74   81.05   69.54*   61.01*   nt
  8   85.75   77.86   69.74*   57.21*   nt
  9   88.51   70.93   73.29*   80.37*   nt
  10   85.57   85.37   86.88   88.71*   67.05*
  11   85.58   84.98   84.74   85.82   81.64
  12   85.68   85.25   85.17   86.41   82.50
  13   90.77   86.95*   90.03*   75.01*   nt
  14   86.11   83.64   81.84   81.41   74.87
  15   86.11   83.62   81.82   81.82   75.40
  16   86.38   84.04   82.39   82.29   75.65
  17   87.00   81.14   73.07   72.32*   nt
*＝IL-15/Fc主峰形状已经改变
nt＝未测试
也通过RP-HPLC检测每种制剂的纯度。为此，使用Vydac-214TP54(250×4.6毫米，5微米)，其在25℃和1毫升/分钟的流速下运行。所用洗脱剂是含0.1％TFA的100％水至含0.1％TFA的100％乙腈的线性梯度。在214纳米进行检测。如Hp-SEC色谱法中那样，峰形也改变了。在表中再用星号(*)标记样品。一般而言，RP-HPLC结果表明，pH 6的制剂和含有L-精氨酸的制剂在40℃不稳定。含有蔗糖和甘氨酸的pH 7.4和8的制剂和含有甘露醇的pH 8的制剂在40℃稳定至少3周。pH 7.4的含甘露醇的制剂纯度的明显降低可以归因于微生物污染。
  制剂   t＝0   t＝1周   t＝2周   t＝3周   t＝4周
  6   99.97   89.86*   78.52*   nt   nt
  7   100   90.07*   97.78*   nt   nt
  8   nt   nt   nt   nt   nt
  9   99.26   99.94*   97.97*   nt   nt
  10   99.53   99.22   100   94.23*   62.03*
  11   99.31   99.48   100   99.47   96.85
  12   99.97   100   99.95   99.94   96.52
  13   99.84   91.69*   73.37*   88.74*   nt
  14   99.26   99.15   99.96   99.04   94.72
  15   99.34   99.28   99.95   99.39   96.36
  16   nt   100   nt   99.13   96.89
  17   nt   78.22*   nt   98.14*   nt
*＝IL-15/Fc主峰形状已经改变
nt＝未测试
通过SDS-PAGE(还原和未还原的)进一步研究样品。对此使用含3-8％Tris乙酸盐的凝胶。在每种情况下在已经将0.5微克/20微升蛋白质用于凝胶后，在130V、110mA、23W下进行凝胶电泳80分钟。通过银染色使条带显现。高于IL-15/Fc主带的条带表明聚集，低于主带的频率表明降解。在储存在pH 6下的样品中，在40℃一周后产生降解，而在pH 8时，在2周后观察到增加的聚集。在pH 7.4下2周后的制剂表现出降解，并在3周后，表现出降解和聚集。pH 7.4或8的含有蔗糖或甘氨酸的IL-15/Fc制剂，和pH 8的含有甘露醇的制剂在40℃稳定2周。还是由于微生物污染引起pH 7.4的含甘露醇的制剂的降解。
在4周后检验六种制剂(相当于在每种情况下含有蔗糖和甘氨酸的具有pH 6、7.4和8的样品)的稳定性，并在T-细胞增殖试验中与不含IL-15/Fc的缓冲液进行比较研究。为此，通过研究对IL-15-激发鼠科CTLL-2细胞的增殖抑制作用与剂量的函数关系，从而检测IL-15/Fc的生物活性。为此，用恒定浓度的IL-15至半最大量(half-maximum)刺激CTLL-2细胞并用递增的IL-15/Fc浓度进行培养。通过比色测定法(来自Roche的XTT试验)检测T-细胞增殖。通过线性级数在有效剂量范围内计算半最大量抑制(ED50)。重复测量每一样品。结果如下：
  制剂   ED50
  IL-15/Fc在柠檬酸盐缓冲液中pH6+蔗糖   51±13纳克/3×104接种细胞
  IL-15/Fc在柠檬酸盐缓冲液中pH6+甘氨酸(cycline)   21.9±10.2纳克/3×104接种细胞
  IL-15/Fc在磷酸盐缓冲液中pH7.4+蔗糖   2.5±1.7纳克/3×104接种细胞
  IL-15/Fc在磷酸盐缓冲液中pH7.4+甘氨酸   4.2±0.8纳克/3×104接种细胞
  IL-15/Fc在Tris缓冲液中pH 8+蔗糖   7.0±0.5纳克/3×104接种细胞
  IL-15/Fc在Tris缓冲液中pH 8+甘氨酸   9.2±3.8纳克/3×104接种细胞
  磷酸盐缓冲液pH 7.4+蔗糖   无影响
  磷酸盐缓冲液pH 7.4+甘氨酸   无影响
  Tris缓冲液pH 8+蔗糖   无影响
  Tris缓冲液pH 8+甘氨酸   无影响
  柠檬酸盐缓冲液pH 6+蔗糖   无影响
  柠檬酸盐缓冲液pH 6+甘氨酸   无影响
  对照物：IL-15/Fc在PBS中pH 7.4   12±0.5纳克/3×104接种细胞
这些结果表明，IL-15/Fc在所有制剂中都有生物活性，在含有蔗糖或甘氨酸的pH 7.4的磷酸盐缓冲剂中表现出最高活性。在pH 8下观察到略低的活性，但是没有明显不同。对此相比，储存在pH 6下的制剂产生明显更低的IL-15/Fc生物活性。缓冲液配方本身对生物测定没有影响。
还通过HPAEC-PAD糖基化分析测试一些制剂的稳定性。在这种情况下，在40℃储存4周后，研究二唾液酸(disialo)、三唾液酸(trisialo)和四唾液酸(tetrasialo)结构在各种制剂中的比例。
  制剂   二唾液酸(％)   三唾液酸(％)   四唾液酸(％)
  7   35.87   40.52   23.61
  811   35.3036.18   39.8538.09   24.8625.72
  12   34.61   41.34   27.54
  15   32.51   40.89   26.60
  16   34.10   40.18   25.71
  对照物   33.93   41.12   27.59
如上表所示，测试的所有制剂在二-、三-和四唾液酸结构的相对比例方面类似。各种制剂之间的唾液酸(asialo)和单唾液酸(monosialo)结构不同。与不含蔗糖的制剂和与IL-15/Fc对照物相比，含有蔗糖的制剂在这些特定保留时间含有多个峰。甘氨酸制剂和IL-15/Fc对照物在唾液酸和单唾液酸结构的相对量方面相似。蔗糖制剂和甘氨酸制剂之间的差别可能是由于制剂中蔗糖的存在引起的，因为对照制剂的缓冲液(不含IL-15/Fc，其含有蔗糖)在特定保留时间包括这种附加峰。通常可以推定，在存在甘氨酸或蔗糖的pH 6、7.4或8的IL-15/Fc制剂对IL-15/Fc的糖基化性能没有影响。即使在40℃储存4周后，也没有观察到糖基化图谱的任何改变。
c)结论
IL-15/Fc的稳定性研究表明，制剂的稳定性在pH 4-8范围内使高度pH-依赖性的。在该范围内，随着pH值的降低，稳定性降低。PH大约10的制剂不如pH大约8的制剂稳定。在pH 7.4和pH 8下观察到最好的稳定性。在含有蔗糖、甘露醇或甘氨酸作为添加剂的IL-15/Fc制剂之间没有发现明确的稳定性差异。
实施例6：各种克隆系的糖基化图谱
在进一步实验中，研究具有不同表达水平的IL-15/Fc融合蛋白的糖基化图谱。使用含CMV启动子但不含内含子的pcDNA3.1制备克隆系K 146，使用含有CMV启动子和内含子A的pMG10Ala7制备其它所有克隆系。克隆系K 146中的表达水平为大约3至5pg蛋白质/(细胞*天)，克隆系KN 10和KN 13中的表达水平为大约9至13pg蛋白质/(细胞*天)，最后，克隆系KN 110和KN 120的表达水平为大约30至50pg蛋白质/(细胞*天)。糖基化数据概括在下表中：
  方法   比例(％)   K 146   KN 10   KN13   KN110   KN120
  HPAEC-PAD；唾液酸基   NANA/∑(NANA，NGNA，唾液酸N-聚糖)   53   57   50   55   50
  NANA/NGNA   100∶0   100∶0   100∶0   100∶0   100∶0
  HPAEC-PAD；天然   唾液酸   24   31   32   26   27
  单唾液酸   4   7   11   12   10
  二唾液酸   11   14   18   20   22
  三唾液酸   27   22   21   25   22
  四唾液酸   34   26   18   18   18
  用凝集素进行生物芯片-结合糖蛋白的示踪   双支(Biantennary)   25-30   25-30   25-30
  三/四支(Tri/tetra-antennary)   70-75   70-75   70-75
  唾液酸化/分支(Sialylation/antenna)   70-80   60   60
  唾液酸化/N-聚糖   ＞90   ＞90   ＞90
  Galα1-3 Gal   5-10   ＜5   15-20
序列表
<110>豪夫迈-罗氏公司
<120>纯化的白细胞介素-15/Fc融合蛋白及其制备
<130>C62388PC
<150>EP 04008906.2
<151>2004-04-14
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>6458
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pcDNA3.1hCD5.6Ala7
<400>1
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg     60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc    180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt    240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata    300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc    360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc    420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt    480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt    540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca    600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg    660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc     720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg     780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca     840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc     900
caccatgccc atggggtctc tgcaaccgct ggccaccttg tacctgctgg ggatgctggt     960
cgcttcctgc ctcggaaact gggtgaatgt aataagtgat ttgaaaaaaa ttgaagatct    1020
tattcaatct atgcatattg atgctacttt atatacggaa agtgatgttc accccagttg    1080
caaagtaaca gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa gttatttcac ttgagtccgg    1140
agatgcaagt attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc ctagcaaaca acagtttgtc    1200
ttctaatggg aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg aggaaaaaaa    1260
tattaaagaa tttttggaca gttttgtaca tattgtcgac atgttcatca acacttcgga    1320
tcccaaatct gctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg    1380
gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac    1440
ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa    1500
ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta    1560
caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg    1620
caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat    1680
ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga    1740
tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga    1800
catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc    1860
cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag    1920
gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta    1980
cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgatct agagggcccg tttaaacccg    2040
ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt    2100
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat    2160
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag    2220
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc    2280
ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg    2340
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc    2400
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc    2460
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct    2520
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac    2580
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac    2640
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat    2700
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg    2760
tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg    2820
caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca    2880
ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact    2940
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta    3000
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag    3060
tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc    3120
attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga    3180
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa    3240
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt    3300
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg    3360
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa    3420
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac    3480
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt    3540
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact    3600
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg    3660
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg    3720
acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc    3780
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt    3840
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc    3900
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg    3960
ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg    4020
attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct    4080
ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta    4140
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat    4200
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct    4260
gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt    4320
gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag    4380
cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt    4440
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag    4500
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg    4560
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat    4620
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta    4680
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa    4740
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc    4800
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt    4860
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca    4920
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg    4980
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat    5040
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta    5100
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct    5160
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac    5220
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa    5280
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa    5340
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt    5400
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca    5460
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca    5520
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc    5580
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa    5640
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc    5700
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca    5760
acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat    5820
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag    5880
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac    5940
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt    6000
ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt    6060
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc    6120
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat    6180
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca    6240
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga    6300
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg    6360
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg    6420
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc                            6458
<210>2
<211>7464
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pMG10Ala7
<400>2
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg     60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc    180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgta agctgcaata aacaatcatt attttcattg    240
gatctgtgtg ttggtttttt gtgtgggctt gggggagggg gaggccagaa tgactccaag    300
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aacacacaat caacagggga gtgagctgga tcgagctaga gtccgttaca taacttacgg    420
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ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg    600
acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact    660
ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt    720
ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc    780
ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc    840
gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata    900
taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg    960
acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa   1020
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ccttggcttc ttatgcatgc tatactgttt ttggcttggg gtctatacac ccccgcttcc    1140
tcatgttata ggtgatggta tagcttagcc tataggtgtg ggttattgac cattattgac    1200
cactccccta ttggtgacga tactttccat tactaatcca taacatggct ctttgccaca    1260
actctcttta ttggctatat gccaatacac tgtccttcag agactgacac ggactctgta    1320
tttttacagg atggggtctc atttattatt tacaaattca catatacaac accaccgtcc    1380
ccagtgcccg cagtttttat taaacataac gtgggatctc cacgcgaatc tcgggtacgt    1440
gttccggaca tgggctcttc tccggtagcg gcggagcttc tacatccgag ccctgctccc    1500
atgcctccag cgactcatgg tcgctcggca gctccttgct cctaacagtg gaggccagac    1560
ttaggcacag cacgatgccc accaccacca gtgtgccgca caaggccgtg gcggtagggt    1620
atgtgtctga aaatgagctc ggggagcggg cttgcaccgc tgacgcattt ggaagactta    1680
aggcagcggc agaagaagat gcaggcagct gagttgttgt gttctgataa gagtcagagg    1740
taactcccgt tgcggtgctg ttaacggtgg agggcagtgt agtctgagca gtactcgttg    1800
ctgccgcgcg cgccaccaga cataatagct gacagactaa cagactgttc ctttccatgg    1860
gtcttttctg cagtcacccg ggggatcctt cgaacgtagc tctagccacc atgcccatgg    1920
ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct tcctgcctcg    1980
gaaactgggt gaatgtaata agtgatttga aaaaaattga agatcttatt caatctatgc    2040
atattgatgc tactttatat acggaaagtg atgttcaccc cagttgcaaa gtaacagcaa    2100
tgaagtgctt tctcttggag ttacaagtta tttcacttga gtccggagat gcaagtattc    2160
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tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc    3180
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt    3240
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gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg    3360
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tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca    3660
accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt    3720
taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca    3780
gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct    3840
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cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta    4020
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tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg    4260
ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac    4320
cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc    4380
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gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg    4560
cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg    4620
tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt    4680
cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc    4740
ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg    4800
gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga    4860
gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc    4920
gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc    4980
gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc    5040
ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag    5100
cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat    5160
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat    5220
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc    5280
tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg    5340
ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa    5400
tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac    5460
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt    5520
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga    5580
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca    5640
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg    5700
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt    5760
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc    5820
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct    5880
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc    5940
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta    6000
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca    6060
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag    6120
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag    6180
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt    6240
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa    6300
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg    6360
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga    6420
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta    6480
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc    6540
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg    6600
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga    6660
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt    6720
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt    6780
gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc    6840
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc    6900
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca    6960
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag    7020
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg    7080
tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa    7140
cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa    7200
cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga    7260
gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga    7320
atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg    7380
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt    7440
ccccgaaaag tgccacctga cgtc                                           7464
<210>3
<211>1113
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码突变的IL-15/Fc和CD5引导肽的DNA
<400>3
atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct     60
tcctgcctcg gaaactgggt gaatgtaata agtgatttga aaaaaattga agatcttatt    120
caatctatgc atattgatgc tactttatat acggaaagtg atgttcaccc cagttgcaaa    180
gtaacagcaa tgaagtgctt tctcttggag ttacaagtta tttcacttga gtccggagat    240
gcaagtattc atgatacagt agaaaatctg atcatcctag caaacaacag tttgtcttct    300
aatgggaatg taacagaatc tggatgcaaa gaatgtgagg aactggagga aaaaaatatt    360
aaagaatttt tggacagttt tgtacatatt gtcgacatgt tcatcaacac ttcggatccc    420
aaatctgctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga    480
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct    540
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg    600
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac    660
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag    720
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc    780
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag    840
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc    900
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg    960
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg   1020
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg   1080
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga                                1113
<210>4
<211>370
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人CRB-15和CD5引导肽的氨基酸序列
<400>4
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp
            20                  25                  30
Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr
        35                  40                  45
Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
    50                  55                  60
Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp
65                  70                  75                  80
Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
            100                 105                 110
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val
        115                 120                 125
His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Pro Lys Ser Ala Asp
    130                 135                 140
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
145                 150                 155                 160
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                165                 170                 175
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            180                 185                 190
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        195                 200                 205
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    210                 215                 220
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
225                 230                 235                 240
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                245                 250                 255
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            260                 265                 270
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        275                 280                 285
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    290                 295                 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305                 310                 315                 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                325                 330                 335
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            340                 345                 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        355                 360                 365
Gly Lys
    370
<210>5
<211>371
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>鼠科IL-15Fc(人突变的IL-15，鼠科IgG2A)
     和CD5引导肽的氨基酸序列
<400>5
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp
            20                  25                  30
Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr
        35                  40                  45
Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
    50                  55                  60
Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp
65                  70                  75                  80
Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
            100                 105                 110
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val
        115                 120                 125
His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Pro Arg Gly Pro Thr
    130                 135                 140
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
145                 150                 155                 160
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
                165                 170                 175
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
            180                 185                 190
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
        195                 200                 205
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
    210                 215                 220
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
225                 230                 235                 240
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
                245                 250                 255
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
            260                 265                 270
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
        275                 280                 285
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
    290                 295                 300
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
305                 310                 315                 320
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
                325                 330                 335
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
            340                 345                 350
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
        355                 360                 365
Pro Gly Lys
    370

Claims (17)

1.一种从液体组合物中提纯IL-15/Fc融合蛋白的方法，该方法包括：
a)将该组合物施加于亲和色谱柱并从该柱中洗脱第一IL-15/Fc洗脱液和
b)将步骤a)的洗脱液施加于离子交换色谱柱并从该柱中洗脱第二IL-15/Fc洗脱液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中离子交换色谱柱是阴离子交换色谱柱或阳离子交换色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括附加步骤c)：
c)将步骤b)的洗脱液施加于凝胶过滤柱或施加于疏水作用色谱柱并从该柱中洗脱第三IL-15/Fc洗脱液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)和b)的至少一个步骤之前或之后过滤和/或浓缩该组合物。
5.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤a)、b)和c)的至少一个步骤之前或之后过滤和/或浓缩该组合物。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中在步骤b)之前使步骤a)的洗脱液的pH值呈酸性。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中该亲和色谱柱是蛋白质-A色谱柱或蛋白质-G色谱柱，优选蛋白质-A色谱柱。
8.根据权利要求2至6任一项所述的方法，其中该阴离子交换色谱柱是DEA-琼脂糖柱或Q-琼脂糖柱，优选Q-琼脂糖柱。
9.根据权利要求3至8任一项所述的方法，其中该凝胶过滤柱是葡聚糖凝胶、琼脂糖、Biogel-A、丙烯葡聚糖凝胶、或Biogel-P柱，优选Superdex-200柱。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中该IL-15/Fc融合蛋白在提纯后，具有至少90％的纯度，优选至少95％的纯度，最优选至少99％的纯度。
11.纯化的IL-15/Fc融合蛋白，其具有至少90％的纯度，优选至少95％的纯度，最优选至少99％的纯度。
12.根据权利要求11所述的纯化的IL-15/Fc融合蛋白，其中每N-聚糖的平均唾液酸化水平为至少70％，更优选至少80％，再优选至少90％，最优选至少95％。
13.根据权利要求11或12所述的纯化的IL-15/Fc融合蛋白，其中每个分支的平均唾液酸化水平为至少50％，更优选至少70％，再优选至少80％，最优选至少90％。
14.根据权利要求11至13任一项所述的纯化的IL-15/Fc融合蛋白，其中在N-乙酰基神经氨酸、N-乙醇酰基神经氨酸和唾液酸-N-聚糖总量中，N-乙醇酰基神经氨酸的比例不超过20％，优选不超过15％，更优选不超过10％。
15.包含如权利要求11至14任一项所述的纯化IL-15/Fc融合蛋白以及赋形剂和添加剂的组合物。
16.根据权利要求15所述的组合物，其具有7.4至8.0的pH值。
17.根据权利要求15或16所述的组合物，其是药学组合物。
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