CN102174111A

CN102174111A - 人白介素2-Fc融合蛋白

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Publication number: CN102174111A
Application number: CN2011100259192A
Authority: CN
Inventors: 郑心校; 田燕; 卞春东; 查长春; 刘智
Original assignee: JIANGSU FUTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shanghai Baiying Biotechnology Co ltd
Priority date: 2011-01-25
Filing date: 2011-01-25
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2031-01-25
Also published as: CN102174111B

Abstract

本发明提供了一种人白介素2-Fc融合蛋白，所说的融合蛋白的人白介素2包括人白介素2胞外区的全部序列，Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，人白介素2与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型。本发明的可以消除ADCC与CDC效应因子作用。另外，本发明的人白介素-2与Fc融合蛋白具有与重组IL-2受体结合的亲和性，使半衰期明显延长，且具有IL-2的全部生物活性；IL-2/Fc显著增强了乙肝疫苗激发的体液免疫反应，IL-2/Fc显著增强针对乙肝病毒的CD8+T细胞的细胞免疫。此外，通过和环孢素A的联合应用，可以调节效应性T细胞和调节性的T细胞的平衡趋向免疫调节（抑制），从而诱导胰岛移植免疫耐受的产生。

Description

人白介素2-Fc融合蛋白

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，具体地说，涉及一种人白介素2-Fc融合蛋白，属于DNA重组技术领域。

背景技术

乙型肝炎是一种全球性感染性疾病，在我国尤为多发，据世界卫生组织之资料，全世界约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿为慢性HBV感染者，每年有100万人死于HBV感染。我国人口中乙肝感染率为57%，HBsAg阳性率为9.09%，每年死于HBV相关疾病约30万人。因而，乙型肝炎是一种对人民健康危害很大的疾病。然而，对于慢性乙型肝炎的治疗迄今仍是很困难的，尤其是以下几种情况：

1. 对于乙肝控制来说，无疑新生儿乙肝疫苗预防注射很重要，但是目前应用疫苗阻断母婴传播的保护率为87.8%，也就是说12.2%的注射疫苗不发生免疫应答（即免疫逃逸），不产生保护性乙肝抗体，他们仍会受感染乃至传染他人，这是必须设法解决的。

2. 我国乙肝的传染主要是经母婴传播，在15-20岁以前，患者基本上属于免疫耐受期，即体内虽有病毒复制，但不发生免疫反应，治疗往往无效，因而其中90%发展为慢性肝炎；

3. 慢性乙肝发展至第三期即非活动性病毒携带状态期，这一时期由于机体免疫能力低下，病毒呈低复制，而难以清除，若干年后病毒可能又再度活跃导致病情恶化，也难治疗；

4. 现有的抗病毒治疗效果有限，干扰素对乙肝的清除率不过30%。近年来出现的核苷类似物如拉米呋定，阿德福韦，LdT等等，均只能抑制病毒复制，而不能消除乙肝病毒复制的模版cccDNA，病毒最终仍将因此而再度复制。

白介素2(Interleukin-2,IL-2)主要是由T淋巴细胞产生的一种细胞因子，能激活T细胞，促进B细胞分化及分泌抗体,在机体的免疫反应中具有十分重要的调节作用,是一种天然的免疫增强剂。同时具有抗感染、抗肿瘤等多种作用。重组人白介素2是FDA批准的用于治疗转移到肾癌和黑色素癌的药物（参见公布专利PCT/US/10643）。因而使用白介素2细胞因子以增强免疫接种所诱发的免疫反应，已引起极大的重视，并获得很有希望的实验结果。然而，使用白介素2细胞因子以增强免疫应答，并应用于临床，至今并没有取得实质性的、突破性的进展，而且很多体外实验的明显结果往往在体内难以得到重复与验证。

究其原因，细胞因子自身短暂的血浆循环半衰期是关键性的障碍。大多数细胞因子应免疫刺激而分泌并发挥其调节作用。但它们的血浆半衰期都很短暂，从生理角度这是一种机体避免过度的免疫反应的保护机制。其中以白介素2（IL-2）为例，其体内循环半衰期仅仅为6.9分钟。因而使用生物白介素2，或重组合成白介素2于体内，难以达到稳定的有效的血浆浓度，也达不到预期的白介素2所能介导的免疫增强及调节的效果。

虽然目前应用的乙肝疫苗接种已取得明显的预防乙肝传播的效果。然而仍有10~20%的经免疫接种的人群，未能产生有效的免疫应答反应，称为“免疫逃逸”。目前尚未有一种有效的方法能使“免疫逃逸”的人群产生有效的免疫反应，从而使这些易感人群得不到免疫保护。同时我们还面临着更严峻的挑战，即占我国及部分亚洲国家的总人口5~10%的人群为乙型肝炎病毒携带者。这些患者为乙型肝炎的携带者，也是传播者，因其乙肝病毒表面抗原检测为阳性，又称“澳抗阳性”患者。大多数“澳抗阳性”患者，虽携带乙肝病毒，但体内未产生保护性的免疫应答反应，病毒与患者处于一种“和平共处”的状态，也称免疫耐受状态。乙肝病毒携带者即是乙肝病毒的潜在传染源，同时长期病毒在体内复制，也引起慢性肝脏细胞炎症坏死、纤维化，而导致肝硬变乃至肝癌。目前尚无有效的广泛使用的方法能打破“免疫耐受”，激活机体保护性的针对乙肝病毒的免疫应答，同时保护肝脏细胞及功能，因而也不能达到清除病毒，使患者痊愈的目的。

基于上述，可见当前国内外对乙肝的预防和治疗，主要难题在于如何解决乙肝感染者的免疫应答低下或免疫耐受。

器官移植的免疫反应结果与否取决于T细胞及调节性T细胞二者的平衡关系。为了达到外周移植免疫耐受的效果，必须保持效应T细胞的减少，同时增加调节性T细胞数量和功能。迄今为止人们研究标准的免疫抑制类药物作用于攻击型T细胞的影响效果要远胜于调节性T细胞。环孢霉素为目前应用较为广泛的器官移植免疫抵制药，主要通过抑制IL-2分泌以及其他机理抑制效应性T细胞从而达到抑制免疫排斥的目的。由于IL-2是调节性T细胞的生存、生长因子，所以在动物模型中，环孢素不能诱导免疫耐受（即不能停用免疫抑制剂），这与其抑制内源性IL-2分泌，从而抑制调节性T细胞造成的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种人白介素2-Fc融合蛋白。

本发明的人白介素2-Fc融合蛋白中，人白介素2包括人白介素2胞外区的全部序列，Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，人白介素2与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型。

优选地，所说Fc片段选自天然型Fc。

更优选地，所说的融合蛋白具有SEQ ID.1 所示的氨基酸序列，其中第1-133位氨基酸残基为人白介素的胞外区序列，与非特异二硫键形成有关的第125个氨基酸Cys取代为Ser，第134-135位氨基酸残基Gly-Asp为连接肽段，第136-336位氨基酸残基为人IgG1序列。

同样优选地，所说的融合蛋白中的Fc片段为Fc变体，所说的Fc变体是天然型Fc中补体结合相关氨基酸与受体结合相关的氨基酸改变的Fc。

同样更优选地，所说的融合蛋白具有SEQ ID.2 所示的氨基酸序列，其中第1-133位氨基酸残基为人白介素的胞外区序列，与非特异二硫键形成有关的第125个氨基酸Cys取代为Ser，第134-135位氨基酸残基Gly-Asp为连接肽段，第136-336位氨基酸残基为人IgG1序列的变体，其中第154位Leu取代为Glu，第237位Glu、第239位 Lys、第241位Lys取代为Ala。

本发明提供了人白介素2-Fc融合蛋白的DNA。

本发明提供了包含DNA序列的载体，所说的载体为真核载体。由于原核表达体系所表达的产物，缺乏糖基化修饰功能，蛋白功能不能保证，因此在此发明中，优选哺乳动物表达载体，如pRc-CMV( Invitrogen公司) 。

本发明提供了包含有载体的宿主细胞，所说的细胞选自真核细胞或原核细胞。

优选地，所说的细胞选自CHO细胞。

本发明提供了融合蛋白的用途，具有用于制备免疫调节剂药物中的用途，所述免疫调节剂包括增强乙肝疫苗免疫应答及打破乙肝病毒免疫耐受的免疫增强剂以及联合现有免疫抑制剂，诱导移植免疫耐受。

本发明提供了一种药物组合物，含有药学上有效剂量的权利要求1-5中任一项融合蛋白。

本发明的所用术语“免疫球蛋白Fc片段”指免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fc片段可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。已知免疫球蛋白有很多类别，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG（包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，从特定免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区，是在本领域技术人员所掌握的范围之内。免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天。已经报道和公布的专利将免疫球蛋白的Fc区域与其他蛋白质（如各种细胞因子和可溶性受体）的区域融合，创制出融合蛋白。这类融合蛋白是通过IgG Fc铰链区中的Cys残基连接的同源二聚体蛋白，结构类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。这类融合蛋白维持有原功能蛋白质的生物活性，同时大大延长了体内半衰期(参见,如Nature,337:525-531.1989;如Trends Biotechnol.,14:52-60,1996;如美国专利No.5349053与6224867及中国专利200510084233.5）。在该方面一个优选的实施方案中，免疫球蛋白Fc片段选自人IgG1，包括其铰链区、CH2、CH3区。

白介素2与免疫球蛋白Fc融合，可选择多种连接序列，例如可以选择一系列的甘氨酸和丝氨酸的组合，长度约为20个氨基酸残基（参见美国专利NO 00/13827），也可选择白介素2与免疫球蛋白Fc的铰链区直接融合。在该方面的另一个优选实施方式中，人白介素2与Fc序列之间通过Gly-Asp连接序列融合。

人免疫球蛋白的Fc区域中消灭病原体的免疫防御中起重要作用。IgG的效应功能由Fc介导通过两种主要机制，即（1）与细胞表面Fc受体的结合，吞噬作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性途径（ADCC)消化病原体；（2）与第一补体成分C1的C1q部分结果，引发依赖于补体的细胞毒性途径（CDC），从而裂解病原体，但对应用于人的治疗而言，白介素2融合蛋白应不含有这些效应功能。由于IL2/Fc融合蛋白Fc功能区的存在，所以其具有ADCC和CDC效应。在某些应用方面，这两种效应是正向的，但在另一些应用领域，这两种效应可能是反向的。因此，本发明通过对Fc中与受体和（或）补体结合相关的氨基酸改变，提供了白介素2与Fc融合蛋白的另一种形式，即Fc变体融合蛋白。

通过比较人和鼠的IgG同种型氨基酸序列，CH2区域氨基末端附近的Fc部分显示在IgG Fc与Fc受体结合中起作用。已用基因工程抗体证明在234位到237位基序的重要性（参见，Nature，332：563-564，1988）。对Fcγ R与C1q结合非常重要的第二部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近（参见，Nature，332：738-740，1988）。按Kabat等人（Seguences of Proteins of Immunological Interest，第五版，United States Department of Health and Human Services，1991）所述的EU编号体系将氨基酸残基编号。优选将与补体结合有关的Glu³¹⁸, Lys³²⁰, Lys ³²²功能氨基酸更改为Ala，与受体结合有关的Leu²³⁵功能氨基酸更改为Glu，在本发明中，在IL2/Fc融合蛋白的SEQ ID.2氨基酸序列中， Glu²³⁷, Lys²³⁹, Lys²⁴¹功能氨基酸更改为Ala，Leu¹⁵⁴功能氨基酸更改为Glu。经实验确定，达到了消除ADCC与CDC效应因子作用。

另外，本发明的人白介素-2与Fc融合蛋白具有与重组IL-2受体结合的亲和性，使半衰期明显延长，且具有IL-2的全部生物活性；IL-2/Fc显著增强了乙肝疫苗激发的体液免疫反应，其抗乙肝病毒抗体滴度均在1000~1200倍；IL-2/Fc显著增强针对乙肝病毒的CD8+T细胞的细胞免疫。因而可应用于乙肝病毒携带状态，包括免疫清除期及非活动性HBV携带状态期的患者；此外，通过和环孢素A的联合应用，可以调节效应性T细胞和调节性的T细胞的平衡趋向免疫调节（抑制），从而诱导胰岛移植免疫耐受的产生。

附图说明

图1为人白介素2、人IgG1 Fc及人IgG1 Fc变体的PCR电泳检测图；

图2为人白介素2与Fc融合蛋白检测图；

图3为人白介素2与Fc融合蛋白的结构图；

图4为CTLL-2细胞增殖分析图；

图5为重组人白介素2和人白介素2与Fc融合蛋白与IL-2受体结合的竞争性实验分析图；

图6为人白介素2与Fc融合蛋白循环半衰期图；

图7为补体介导的细胞毒实验（ADCC）结果图；

图8为与Fc受体结合实验（CDC) 结果图；

图9为人白介素2与Fc融合蛋白与乙肝疫苗联合使用的接种方案示意图；

图10为人白介素2与Fc融合蛋白与乙肝疫苗联合使用的抗体滴度对照图；

图11为CD8+T细胞的增殖结果对照图；

图12为CD4和CD8针对抗原的增殖反应对照图；

图13为细胞凋亡的诱导作用对照图；

图14为调节性T细胞特异性的FoxP3表达的作用对照图；

图15为小鼠胰岛移植物耐受的诱导效果对照图，纵坐标为移植物存活百分比。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 人白介素2与Fc融合蛋白表达质粒的构建

1、人白介素2功能基因的克隆

从正常人的外周血中分离粘附的单核细胞，加入LPS刺激4小时后，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，MMLV逆转录酶合成cDNA第一条链，再以其为模板扩增人白介素2胞外区全部序列（GeneBank：NM_000586.3），包含分泌信号肽序列，并利用下游引物将第145氨基酸Cys更改为Ser，上、下游引物分别引入NotI和BamHI位点。所用引物序列如下：

上游引物:

P1:5'ATATGGCGGCCGCTAACCTCAACTCCTGCCACA3'

下游引物:

P2:5'CTCTGGGATCCGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAGAAAAGGTAATCCATCTG3'

反应总体积50ul，其中浓度为25pM/ul引物各加1ul，浓度为200mM的dNTP加0.5ul，所用DNA聚合酶为江苏省弗泰生物科技有限公司生产的Taq DNA polymerase，5U/ul，加0.5ul。反应条件为94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 45秒，25个循环后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小（492bp）一致，如图1中泳道 1所示。将得到的基因产物用江苏省弗泰生物科技有限公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用NotI和BamHI(Fermentas公司)酶切克隆实验室保存的pRc-CMV载体(Invitrogen公司，多克隆位点已做优化)。将筛选、抽提得到的pRc-CMV-IL2质粒测序（Genscript公司），比对，与预期序列完全一致。

2、人IgG1 Fc基因的克隆

从正常人外周血白细胞中提取mRNA，反转录获得cDNA第一链，再以其为模板扩增IgG1 Fc基因（GeneBank：AK304469.1），上、下游引物分别引入BamHI和XbaI位点。所用引物序列如下：

上游引物：

P3：5'ATATGGGATCCCAAATCTGCTGACAAAACTCACACA3'

下游引物：

P4：5'CTCTGTCTAGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG3'

反应总体积50ul，其中浓度为25pM/ul引物各加1ul，浓度为200mM的dNTP加0.5ul，所用DNA聚合酶为江苏省弗泰生物科技有限公司生产的Taq DNA polymerase，5U/ul，加0.5ul。反应条件为94℃ 30秒、54℃ 35秒、72℃ 1分钟，25个循环后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小（717bp）一致，结果如图1中泳道 2所示。将得到的基因产物用江苏省弗泰生物科技有限公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用BamHI和XbaI(Fermentas公司)酶切克隆pRc-CMV-IL2质粒，将筛选、抽提得到的质粒测序（Genscript公司），比对，与预期序列完全一致，即得到白介素2与FC融合蛋白一种形式的表达质粒，记为IL2/Fc。

3、Fc变体融合蛋白表达质粒的构建

为获得Leu235Glu, Glu318Ala, Lys320Ala, Lys 322Ala的Fc变体，设计突变引物，产生的三个片段通过Over-Lap PCR的方法进行拼接，模板均为IL2/Fc质粒。

第一个片段:

上游引物：

P3：5'ATATGGGATCCCAAATCTGCTGACAAAACTCACACA3'

下游引物：

P5：5'ATCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTC3'

第二个片段:

上游引物：

P6：5'GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA3'

下游引物：

P7：5'CAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCAGCTCATC3'

第三个片段:

上游引物：

P8：5'ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG3'

下游引物：

P4：5'CTCTGTCTAGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG3'

三基因片段经过Over-Lap PCR得到Fc变体（Fc-/-)的PCR产物，结果如图1中泳道 3所示。凝胶回收后使用BamHI/XbaI酶切克隆IL2/Fc质粒(即对Fc进行替换），经质粒测序、比对，与预期序列完全一致，即得到白介素2与FC融合蛋白的另一种形式的表达质粒，记为IL2/Fc-/-。

实施例2. 人白介素2与Fc融合蛋白的生产

1、稳定的高表达细胞株的筛选

用冷的1×PBS将对数生长期的CHO细胞稀释至8 x10⁶/ml后，

取0.4ml悬液，加入电击杯，再加入15ug线性化表达质粒，混合后冰上静置10-15min。设定电穿孔仪电压800V，电容25uF，点穿后电击杯在冰上静置10min，用移液管转移细胞至含5%1× FBS培养液的10cm 培养皿中培养。两天后待细胞生长状态恢复，用400 ug/ml的G418对阴性细胞进行筛选。观察细胞状态，每4天换液一次，培养两周后，采用极限稀释法，用96孔培养板进行高表达细胞株筛选。最终通过ELISA检测和比较筛选，得到稳定的高表达细胞株。

2、高表达细胞株的培养

根据需要，按每毫升培养液加5mg微载体计算，称取微载体，并在磷酸缓冲液（PBS）的液体模式下高压灭菌。将灭菌好的微载体移入搅瓶，待微载体沉淀后，弃去PBS，加入培养液。

取出细胞培养皿中的处于对数生长期的IL2-Fc高表达细胞，去上清液，加适量胰蛋白酶37℃消化2-3min(显微镜下可见细胞漂浮并分散)后，加适量含血清的培养基终止消化并细胞计数。根据细胞计数结果和培养体积，将细胞和培养液混合并使细胞分散均匀，得到细胞悬液，悬液细胞密度为1-5x10⁵/ml。

待搅瓶中的微载体沉淀，弃去培养液，并将细胞悬液加入搅瓶。将搅瓶放入二氧化碳培养箱（5%二氧化碳、37℃），调整搅瓶转速至50-70rpm ，进行连续悬浮培养。

3、人白介素2与Fc融合蛋白的纯化

发酵培养物经高速冷冻离心后收集培养上清，培养上清经离子截留分子量为10KD Pellicon（购自Millipore公司）超浓缩15倍，然后用Protein A亲合层析柱分离提纯，提纯的蛋白经1×PBS的透析最终得到白介素2与Fc融合蛋白，其检测结果如图2所示，白介素2与Fc融合蛋白的结构如图3所示。

实施例3. 人白介素2与Fc融合蛋白的生物功能检测

1、人白介素2与Fc融合蛋白中IL-2的生物活性的检测

检测方法如下（参考文献，Nature, 1977：268，154-156）：IL-2受体阳性CTLL-2细胞为受体组合靶细胞，CTLL-2细胞经PH 3 RPMI处理20秒，以去除结合受体上的IL-2。细胞经RPMI（PH 7）洗两遍后与¹²⁵I（Dupont, Boston, MA）共同培养60分钟于37℃温箱，放射标志的CTLL-2细胞经洗两遍后，与不同浓度的rIL-2或IL-2/Fc在冰上培养60分钟，上清液转至玻璃试管中进行放射性测定。

检测结果：

1）如图4所示，在经典的检测IL-2活性的分析中，IL-2/Fc与重组IL-2 （注射用重组人白介素-2(125Ser)/白介素-2；山东泉港药业有限公司；批准文号：国药准字S20020004）一样，支持IL-2依赖性的CTLL-2细胞（ATCC T1B214）的增殖；

2）如图5所示，在放射性的¹²⁵I释放的分析中，IL-2/Fc具有与重组IL-2一样的与IL-2受体结合的亲和性。

结论：人白介素2与Fc融合蛋白兼具有IL-2的全部生物活性。

2. 人白介素2与Fc融合蛋白的半衰期检测

检测原理和方法：为检测融合蛋白的血清半衰期特殊设计了一种酶联免疫检测方法（ELISA），使用鼠抗人白介素-2单克隆抗体为检测第二抗体，这种ELISA是特异性的针对人白介素2与Fc融合蛋白，IL-2和IgG1，不会产生假阳性反应。可以对血清中的IL-2/Fc浓度进行定量的分析，从而测出IL-2/Fc的循环半衰期。

检测结果和结论：

如图6所示，与重组IL-2相比较，其体内循环半衰期延长近700倍。人白介素2与Fc融合蛋白具有类似于免疫球蛋白的长体内应用半衰期。

3、人白介素2与Fc融合蛋白的ADCC与CDC效应的测定

检测原理和方法：

1）抗体依赖性细胞毒性途径（ADCC)是经⁵¹Cr释放而测定的，实验使用IL-2受体阳性的CTLL-2细胞为靶细胞，CTLL-2细胞经低PH（PH 3）RPM1处理20秒钟。以去除结合在细胞表面的IL-2。细胞经PRM1培养液洗后与⁵¹Cr共同培养60分钟于37℃培养箱中（DuPont, Boston, MA）,⁵¹Cr放射标记CTLL-2细胞经RPM1培养液清洗两遍后，加入96孔平板培养板中，密度为5×10⁴细胞孔，加入不同浓度的IL-2/Fc，非溶细胞性IL-2/Fc（IL-2/Fc^-/-）或hIgG1 (Cappel)于冰上60分钟。然后以1：15稀释的低毒性兔补体或1% Nonider P-40加入培养板中，经37℃培养60分钟并经缓慢的摇动。经10分钟200rpm离心，140 ul的上清液从每个培养孔中吸出并转至玻璃试管中进行γ测定。特异性的细胞溶性百分比经由下列公式进行计算：%特异溶细胞=（加补体的实验组 - 加补体的对照）/NP-40组 - 只加补体的对照）×100%。

2）为测定IL-2/Fc与FcrR1受体结合的能力（CDC效应），FcrR1 cDNA（GeneBank：AK304469.1）经转染进入CHO-K1细胞，CHO细胞是FcrRI和FcrRⅡ以及IL-2R阴性细胞。FcrR1表达阳性CHO细胞经FCM缓冲液（PBS，0.1% FCS及0.1% Sodium azide）清洗后, 与10 ug/ml IgG2a, IL-2/Fc或IL-2/Fc^-/- 混合置冰上60分钟,经FCM缓冲液洗两次, 再与荧光标记的羊抗IgGFc抗体混合置冰上60分钟,细胞洗两次后加入1% Formalin/PBS进行FACS分析 (Becton Dickinson Sam Jose,CA)。

检测结果和结论：

1）如图7所示，IL-2/Fc融合蛋白具有ADCC效应，而IL-2/Fc-/-融合蛋白消除了ADCC效应。

2）如图8所示，IL-2/Fc融合蛋白具有CDC效应，而IL-2/Fc-/-融合蛋白消除了CDC效应。

实施例4 检测IL-2/Fc作为免疫增强剂在增强易感免疫激发的体液及细胞免疫反应上的作用

检测原理和方法：

由于IL-2/Fc具有IL-2的全部生物活性且具有长达20小时的循环半衰期，检测IL-2/Fc作为免疫增强剂在增强易感免疫激发的体液及细胞免疫反应上的作用。

IL-2/Fc融合蛋白腹腔接种的方法和方案：用Balb/c小鼠（北京维通利华动物有限公司提供,合格证号0060937）接受皮内乙肝免疫接种，从第二天始，接受每日一次腹腔注射IL-2/Fc共28天。第28日（从第一次免疫接种计算起），小鼠接受第二次腹腔内乙肝疫苗接种（重组酵母乙肝疫苗, 为北京天坛生物技术有限公司产品，批号20080304. 每鼠每侧腹股沟皮下注射各1ug，总剂量2ug/只）。第二次免疫接种二周之后，接种小鼠的血清抗乙肝病毒的抗体滴度及针对乙肝病毒的CD4+、CD8+T细胞的增殖反应进行了测定，接种方案如图9所示。

抗HBs抗体滴度的检测方法：小鼠眶后静脉丛采血约0.5ml，4℃冰箱放置过夜，次日离心3500rpm×5rpm，分离血清储存于-20℃，测定时将上述血清400倍稀释：5ul血清加至2ml生理盐水中，混匀后上机测定，采用美国雅培检测系统。

T细胞增殖反应分析方法：使用CFSE（Carboxy Fluorescein Diacetate Succinimidyl Easter）荧光标记的手段进行体内的T细胞增殖反应分析。

检测结果：

1）如图10所示，一般疫苗单独接种的Balb/c小鼠仅产生微弱的抗乙肝病毒IgG，而联合使用乙肝疫苗与IL-2/Fc的全部Balb/c小鼠（n=8），其抗乙肝病毒抗体滴度均在1000～1200倍。IL-2/Fc能够显著的增强乙肝疫苗激发的体液免疫反应。

2）如图11所示，乙肝病毒单独接种的Balb/c小鼠的CD4+ T与CD8+ T细胞均有明显的针对乙肝病毒刺激的增殖反应。然而，IL-2/Fc与乙肝疫苗联合使用的小鼠，其CD8+T（潜在的细胞毒性细胞）的增殖反应有更明显的进一步增强。

结论：IL-2/Fc与乙肝疫苗联合使用的确可以成百倍、千倍的增加针对乙肝病毒的体液反应，而且显著地增加CD8+T细胞（即清除细胞内病毒的潜在的细胞毒细胞）针对乙肝病毒的增殖反应。此种方法未见到副作用，的确可以进一步发展、使用在临床，以使免疫“逃逸”的人群产生抗体而得到应有的免疫保护，可应用于“澳抗阳性”患者以打破对病毒的耐受状态，提高免疫应答能力，达到清除病毒，而治疗乙肝感染的目的。

实施例5 分析IL-2/Fc联合环孢素A在CD4和CD8对抗原的反应能力、调节性T细胞的表达和胰岛移植免疫耐受中的功效

检测方法：参照文献（Hee Gyung Kang, Dong Zhang, Wei Yang, et al. Effects of Cyclosporine on Transplant Tolerance: The Role of IL-2. American Journal of Transplantation. Am J Transplant. 2007;7(8):1907-16.）

实验结果：

1）如图12、13所示，将环孢素A和人白介素2与Fc融合蛋白联用，显著地抑制了CD4和CD8对抗原的增殖反应能力，并诱导该细胞的凋亡；

2）如图14所示，单独使用环孢素A，抑制调节性T细胞特异性的FoxP3表达，当环孢素A和IL-2/Fc联用时，增强调节性T细胞特异性的FoxP3表达。每只老鼠每天注射长效IL-2 1ug保留了环孢霉素对于攻击性T细胞的增殖作用，但同时刺激了T细胞的AICD程序。环孢霉素对于免疫调节性T细胞的负面作用可以通过IL-2/Fc结合环孢霉素治疗法得以缓和，同时也可以加强调节性T细胞表达；

3）如图15所示，在完全不匹配MHC胰岛移植模型中，将胰岛移植入糖尿病小鼠中，观察移植物存活期，IL-2/Fc结合环孢霉素疗法可以显著延长移植物的存活期，诱导免疫耐受。这说明环孢素A和人白介素2与Fc融合蛋白联用，可以诱导小鼠胰岛移植物耐受，在胰岛移植模型中，环孢霉素对于免疫诱导的负面作用可以完全被IL-2/Fc抑制。

结论：环孢霉素协同IL-2/Fc对于异体排斥T细胞的增殖具有抑制作用，显著地抑制了CD4和CD8对抗原的反应能力，并诱导该细胞的凋亡，增强了调节性T细胞的表达，诱导胰岛移植免疫耐受的产生。

序列表

<110> OrganizationName : 江苏省弗泰生物科技有限公司

Application Project

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<120> Title : 人白介素2-Fc融合蛋白

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accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt cctgaaccgc 360

tggatcacct tctcccagag catcatcagc accctgaccg gggatcccaa atctgctgac 420

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 480

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 660

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 780

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 840

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 960

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1020

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1080

tccctgtctc cgggtaaatg a 1101

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gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 960

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SequenceName : 4

SequenceDescription :

Claims

1.人白介素2-Fc融合蛋白，其特征在于，所说的融合蛋白的人白介素2包括人白介素2胞外区的全部序列，Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，人白介素2与Fc序列之间为直接融合或通过连接序列融合，所说的Fc片段选自人或动物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它们的亚型。

2.根据权利要求1所述的人白介素2-Fc融合蛋白，其特征在于，所说Fc片段选自天然型Fc。

3.根据权利要求2所述的人白介素2-Fc融合蛋白，其特征在于，所说的融合蛋白具有SEQ ID.1 所示的氨基酸序列，其中第1-133位氨基酸残基为人白介素的胞外区序列，与非特异二硫键形成有关的第125个氨基酸Cys取代为Ser，第134-135位氨基酸残基Gly-Asp为连接肽段，第136-336位氨基酸残基为人IgG1序列。

4.根据权利要求1所述的人白介素2-Fc融合蛋白，其特征在于，所说的融合蛋白中的Fc片段为Fc变体，所说的Fc变体是天然型Fc的补体结合相关氨基酸与受体结合相关的氨基酸改变的Fc。

5.根据权利要求4的人白介素2-Fc融合蛋白，其特征在于，所说的融合蛋白具有SEQ ID.2 所示的氨基酸序列，其中第1-133位氨基酸残基为人白介素的胞外区序列，与非特异二硫键形成有关的第125个氨基酸Cys取代为Ser，第134-135位氨基酸残基Gly-Asp为连接肽段，第136-336位氨基酸残基为人IgG1变体，其中第154位Leu取代为Glu，第237位Glu、第239位 Lys、第241位Lys取代为Ala。

6.编码权利要求1-5中任一项的融合蛋白的DNA序列，其中编码权利要求3的融合蛋白的DNA序列如SEQ ID.3所示，编码权利要求5的融合蛋白的DNA序列如SEQ ID.4所示。

7.包含有权利要求6的DNA序列的载体，其特征在于，所说的载体为真核载体。

8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，所说的载体为哺乳细胞表达载体。

9.包含有权利要求7或8所述载体的宿主细胞，其特征在于，所说的细胞选自真核细胞或原核细胞。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所说的细胞选自CHO细胞。

11.权利要求1-5中任一项融合蛋白的用途，其特征在于，具有用于制备免疫调节剂药物中的用途，所述免疫调节剂包括增强乙肝疫苗免疫应答及打破乙肝病毒免疫耐受的免疫增强剂以及联合现有免疫抑制剂，诱导移植免疫耐受。

12.一种药物组合物，其特征在于，含有药学上有效剂量的权利要求1-5中任一项融合蛋白。