CN1441675A - 免疫抑制组合物及方法 - Google Patents

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沃齐米日·马思林斯基
郑鑫晓
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Abstract

一种包含靶向作用于白介素－15受体(IL－15R)的第一作用剂和抑制T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间所传送的共刺激信号的第二作用剂的组合物。所述组合物可用于诊断和治疗免疫性疾病，尤其是自身免疫性疾病。

Description

免疫抑制组合物及方法
发明领域
本发明属于免疫抑制领域。
发明背景
当抗原或者有丝分裂原触发T细胞的活化时，则启动有效的免疫反应。在T细胞活化的过程中，产生大量的细胞变化，其中包括细胞因子和细胞因子受体的表达。与免疫反应相关的一种细胞因子是白介素-15(IL-15)，它是T细胞生长因子，可在体外促进B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞以及淋巴细胞活化杀伤(LAK)细胞等增殖和分化。在体内，这些种类细胞的增殖将促进免疫反应。
在很多情况下，需要对患者的免疫反应进行抑制，例如，在需要进行器官移植、或者患有免疫系统疾病、尤其是自身免疫系统疾病的情况下。在其他情况下，例如当某些(select)免疫细胞转化为恶性细胞、或者具有自身攻击性时，则主动消灭这些细胞对机体是有利的。
发明概述
本发明是基于对抑制免疫反应新方法的发现。在每一情况下，通过靶向作用于白介素-15受体(IL-15R)的第一作用剂及阻断一般由抗原呈递细胞(APCs)传递至T细胞的共同刺激信号(costimulatory signal)的第二作用剂而达到免疫抑制的目的。相应地，本发明方法的特点在于，给予需要进行免疫抑制治疗的病人(例如，已经接受或者预定接受器官移植的病人，或者有免疫性疾病、尤其是有自身免疫性疾病的病人)一种或者多种靶向作用于白介素-15受体的作用剂以及一种或多种可阻断共同刺激信号(costimulatorysignal)的作用剂。而且本发明的治疗用组合物的特点在于，其分别包含上述第一及第二作用剂中的一种或者多种。尽管这类组合物可能需要包含一种以上的作用剂，但本发明的方法并不限于必须同时给药。下面对本发明的作用剂及其使用的方法进行描述。
本发明中所用的许多作用剂具有有益的治疗特性。例如，靶向作用于IL-15R的作用剂可以是包含突变型IL-15(mutant IL-15，m IL-15)多肽的融合蛋白。这些作用剂不象是具有免疫原性的，因为融合蛋白中突变型IL-15部分可能仅通过几个残基的取代而区别于野生型IL-15。另外，由于突变型IL-15(mIL-15)多肽具有与野生型IL-15同样高的对Il-15Rα的亲和力，因此它们可以有效地竞争受体。更进一步地，本发明所述作用剂可活化宿主免疫系统的成分，例如补体成分和吞噬细胞，最终介导带有与作用剂结合的受体的细胞(cells bearing the receptor)的清除(elimination)、即耗竭(depletion)过程(例如，通过对靶细胞的溶解或者吞噬作用)。由于活化或恶性的免疫细胞可以表达IL-15受体的α亚基(Il-15Rα)，而静息状态的免疫细胞则不表达Il-15Rα，因此本发明的作用剂可特别用来靶向作用于已经活化的细胞(例如，抗原-活化的T细胞)或者已经恶变的细胞。本发明进一步的优点是，当靶向作用于IL-15R的作用剂与阻断共同刺激信号的作用剂一起应用时，将诱导耐受性。结果是可中止免疫抑制作用、而不会产生对移植物的排斥，或在无需进一步免疫抑制的情况下二次(secondary)移植物可被机体接受。
本发明的特性还在于：本发明的组合物抑制免疫反应或制备治疗免疫性疾病的药物上的应用。
本发明的其他特性和优点可从下面的详细描述以及权利要求中清楚地表现出来。尽管与本发明相似或者等效的物质或者方法可被用于或者检验本发明，但下面描述的为最佳的物质和方法。
附图说明
图1表示野生型IL-15核酸序列(SEQ ID NO：1)以及预期氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；
图2表示突变型IL-15核酸序列(SEQ ID NO：3)以及预期氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。其中，编码149位谷氨酰胺的野生型密码CAG、以及编码156位谷氨酰胺的野生型密码CAA都突变为编码天冬氨酸的GAC(由于成熟的IL-15多肽缺少一段48个氨基酸的信号序列，因此成熟的IL-15多肽中，这些位置(149和156位)相应为101和108位)。
图3是从供体DBA2小鼠移植小岛细胞到受体B6AF1小鼠中后，移植物存活百分率的线性描述图，受体动物分为未经处理组、及分别用mIL-15/Ig，CTLA4/Ig处理组，或者用mIL-15/Ig及CTLA4/Ig联合处理组。
本发明详细描述
当抗原或者有丝分裂原触发T细胞的活化时，则启动有效的免疫反应。抗原片段在抗原呈递细胞(APC)表面与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合并被呈递。APC也传递共同刺激信号，例如，通过CD40/CD154以及通过CD28/B7-1或B7-2介导的信号(“T-细胞共同刺激信号”或者“共同刺激信号”)。在T细胞活化的过程中，细胞中产生大量的变化，其中包括细胞因子和细胞因子受体的表达。参与免疫反应的一类细胞因子是白介素-15(IL-15)。IL-15与异源三聚体受体结合，所述异源三聚体受体是由其它白介素受体的β和γ亚单位以及单一的IL-15Rα亚单位所组成的。如上所述，IL-15是T细胞生长因子，可在体外促进B细胞、T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)以及淋巴细胞活化杀伤细胞(LAK细胞)等增殖和分化。在体内，这类细胞的增殖将促进免疫反应。
本发明是基于对抑制免疫反应新方法的发现。这种抑制可通过联合给予作用剂的方法来实现，其中的一种作用剂靶向作用于IL-15R。术语“作用剂”是指包括可被用作治疗剂的任意种类的分子。蛋白质，诸如抗体、融合蛋白、以及可溶性配基，这些分子中的任一种或者与野生型蛋白完全相同，或者包含有突变部分(即，一个或多个氨基酸残基的缺失、添加或取代)，以及编码它们的核酸分子，都是本文所指的“作用剂(agent)”。本发明所述的作用剂可通过全身的、或者局部的、或者基于细胞治疗的(即，本发明所述的作用剂可通过给予患者表达该作用剂的细胞的方式作为用药方式)方式给药。所述细胞可以单独给予患者，用于表达所需的治疗作用剂。细胞也可以是源于细胞、器官或者组织移植的细胞，在移植之前、或者在活体外、或者移植后将所述移植物用一种作用剂处理，或者用编码治疗用作用剂的核酸进行转导。这样，所移植的细胞可产生其自身的免疫抑制因子。例如，可产生胰岛素的细胞作为有用的表型可以被修饰以使其包含可产生本发明所述的免疫抑制因子的基因。这种、以及其它给药方法是本领域普通技术人员常规使用的，并且下面将进一步讨论。靶向作用于IL-15R的作用剂
靶向作用于IL-15R的作用剂包括与IL-15R结合的作用剂，还包括可与IL-15R结合、并随后破坏带有IL-15R细胞(比如活化的T细胞)的作用剂。因此，有效的可达到免疫抑制效果的作用剂可包含两个功能部分：一个靶向作用的部分，其可使作用剂靶向作用于带有IL-15R的细胞，以及一个耗竭(例如，溶解)靶细胞的部分，其可清除带有IL-15R的细胞。在一个实施例中，靶向作用的部分可与IL-15R结合、但却并不通过该受体有效地进行信号传导。例如，靶向作用的部分可包括突变型IL-15多肽，靶细胞耗竭部分可包括免疫球蛋白分子的Fc区域，该Fc区域源自于IgG，例如人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或者哺乳动物IgG类似物，或者源自于IgM，例如人的IgM或者哺乳动物IgM类似物。在一个优选的实施例中，Fc区域包括铰链区、以及人源IgG1或者鼠源IgG2a的CH2和CH3结构域。尽管本发明并不限于仅通过特殊机制发挥作用的作用剂，但可以确信，所述Fc区域在补体成分及巨噬细胞对带有IL-15R的细胞的清除过程中起着介导作用。
已经制备出突变型IL-15多肽，其具有与野生型IL-15类似的、与IL-15受体复合物结合的亲和力，但并不能完全活化信号传导过程。这些突变型多肽与野生型IL-15多肽有力竞争，可抑制一种或者多种通常对IL-15信号应答而产生的结果，例如细胞增殖。所述“野生型IL-15多肽”在这里是指与天然存在的IL-15(例如，如图1所示的野生型IL-15多肽)完全相同的多肽。相反，“突变型IL-15多肽”是指相对于野生型IL-15多肽至少有一个突变位点的多肽，这种突变型IL-15多肽至少抑制通常由野生型IL-15所促发的体内活性或体外活性中的一种。
按照本发明，使用突变型IL-15多肽一般阻断野生型IL-15分子一种或多种活性的至少40％、优选至少70％、最优选至少90％。突变型IL-15多肽对野生型IL-15多肽活性的阻断能力可通过很多种方法测定，包括本文描述的BAF-BO3细胞增殖测定法(其中细胞用编码IL-2Rβ的构建物转染)。进一步地，本发明所述的突变型多肽可根据它们与野生型IL-15相比呈现出的特定的百分同一性(percent identity)来定义。在检测两种多肽之间的百分同一性时，进行比较的序列的长度通常至少为16个氨基酸，优选至少为20个氨基酸，更优选至少25个氨基酸，最优选至少35个氨基酸。术语“同一性(identity)”，用于多肽或者DNA序列之间的比较，是指在进行比较的两个多肽或DNA序列中不同的亚单位(蛋白质的氨基酸残基或者DNA分子的核苷酸)之间的同一性。当两分子中的亚单位的位置上具有同样的单体亚单位(即，同样的氨基酸残基或者核苷酸)时，分子的那一位置具有同一性。两个氨基酸序列或者两个核苷酸序列的相似性是具有同一性位置数目的直接函数。因此，如果一个多肽与具有100个氨基酸长度的参比多肽有50％的同一性，其可以是一个具有50个氨基酸的多肽，这50个氨基酸可以与参比多肽的50个氨基酸长度部分完全相同。该多肽也可以是具有100个氨基酸长度的多肽，与长度大于该多肽全长的参比多肽具有50％的同一性。当然，许多其它的多肽要符合同样的标准。当使用序列分析软件时，同一性的测定很典型、而且很方便，例如使用威斯康辛大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group atthe University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)，其内设缺省参数。
与野生型IL-15相比，突变型IL-15多肽可以有至少65％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％(例如，96％、97％、98％、或者99％)的同一性。突变可包括发生在氨基酸残基的数量或种类上的变化。例如，突变型IL-15可以比野生型IL-15具有更多的、或者更少的氨基酸残基。作为选择、或者另外地，突变型多肽可以在野生型IL-15的一个或者多个氨基酸残基的位置发生取代。突变型IL-15多肽可通过单个氨基酸残基的插入、缺失、或者取代而与野生型IL-15之间产生差别，例如156位氨基酸残基的插入、缺失、或者取代。相似地，突变型IL-15多肽可通过两个氨基酸残基的插入、缺失、或者取代而与野生型IL-15之间产生差别，例如156位和149位氨基酸残基的插入、缺失、或者取代。举例来说，突变型IL-15多肽可以将野生型IL-15多肽156位和149位的谷氨酰胺取代为天冬氨酸残基(如图2所示)。突变型多肽可作为有用的靶向剂，像野生型IL-15一样，其可以识别并能结合IL-15R成分。在一个实施例中，IL-15的突变发生在细胞因子的羧基末端结构域，该位置被认为是IL-2Rγ(IL-2受体亚单位)的结合位点。作为选择、或者另外地，突变型IL-15多肽可以在IL-2Rβ(IL-2受体β亚单位)的结合域内进行单点或者多点突变。
如果突变型IL-15多肽包含将一个氨基酸残基置换为另一个氨基酸残基，那么该置换可以、但不必须是下述残基组内的保守置换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、以及苯丙氨酸和酪氨酸。
不使用、或者除使用IL-15R多肽(例如，突变型IL-15多肽)外，结合IL-15R成分(例如，IL-15Rα亚单位)的抗体也可靶向作用于与IL-15R。制备抗IL-15R抗体包括人源化抗体的方法是本领域公知的。抗体应以能活化补体和巨噬细胞为佳，例如，活化人的IgG3和IgG1(优选后者)亚类，或者鼠源的IgG2a亚类。
如上文所述，可用于达到免疫抑制目的的作用剂可包括两部分：一个靶向作用的部分，其可使作用剂靶向作用于带有IL-15R的细胞(例如上述突变的IL-15分子)，以及一个可耗竭靶细胞、例如通过溶解或者其它方式清除带有IL-15R的细胞的部分。因此，该作用剂可以是嵌合多肽(chimericpolypeptide)，该嵌合多肽包括突变型IL-15多肽和诸如IgG及IgM亚类抗体的Fc区域的异源多肽。所述Fc区域可以包括在抑制补体固定和与Fc受体结合部位的突变，或者可以清除靶细胞(即，能够通过与补体结合或者另外的机制、诸如抗体-依赖性补体溶解机制来破坏细胞)。
Fc区域可以从自然生成资源、重组产品、或者合成产品中分离出来(正如可以分离具有本发明特性的任何多肽一样)。例如，与IgG的C-末端结构域同源的Fc区域可通过用木瓜蛋白酶消化IgG的方法来制备。IgG的Fc区域的分子量大约为50kDa。本发明的多肽可以包括全部的Fc区域、或者保留了溶解细胞能力的较小的部分。另外，全部长度的或者部分的Fc区域可以是野生型分子的变体。也就是说，它们可以包括影响或者不影响多肽功能的突变。
Fc区域可以是“靶细胞耗竭”或者“非靶细胞耗竭”的。一个非靶细胞耗竭的Fc区域具有缺少高亲和力Fc受体结合位点以及C’1q结合位点的典型特征。鼠源IgG的Fc区域的高亲和力Fc受体结合位点包括在IgG Fc 235位的Leu残基。因此，对Leu 235的突变或者缺失可破坏鼠源Fc受体结合位点。例如，用Glu(谷氨酸)取代Leu 235可抑制Fc区域与高亲和力Fc受体结合的能力。鼠源C’1q结合位点功能的破坏可通过IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基的突变或者缺失而达到。例如，用Ala残基取代Glu 318、Lys320、以及Lys 322将使IgG1 Fc不能引导抗体-依赖性的补体的溶解。相反，靶细胞耗竭型IgG Fc区域具有高亲和力的Fc受体结合位点和C’1q结合位点。高亲和力的Fc受体结合位点包括IgG Fc 235位的Leu残基，C’1q结合位点包括IgG1的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。靶细胞耗竭型IgG Fc区域具有野生型残基或在这些位点的保守氨基酸替换。靶细胞耗竭型IgG Fc区域可靶向作用于细胞用以启动抗体依赖性细胞毒作用或者补体定向细胞溶解(complement directed cytolysis，CDC)作用。人源IgG的适当突变也是已知的(例如，可参见Morrison et al.，The Immunologist  2：119-124，1994；以及Brekke et al.，The Immunologist  2：125，1994)。
靶向作用于IL-15R的作用剂也可以包括突变型IL-15多肽以及作为抗原标记的多肽，例如FLAG序列。如本文所描述，FLAG序列可以被生物素标记的、高亲和力的抗-FLAG抗体所识别(也可参见Blanar et al.，Science  256：1014，1992；LeClair et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 89：8145，1992)。抑制共同刺激信号的作用剂
为抑制免疫反应，如上所述，靶向作用于带有IL-15R的细胞的作用剂可以和抑制通常由APC传递到T细胞的共同刺激信号的作用剂一起给药。一个作用剂与另一作用剂“一起”给药可以(但并不必须)在同一时间给药。例如，在本发明的叙述中，靶向作用于IL-15R的作用剂可以在抑制共同刺激信号的作用剂之前或者之后给药。为抑制共同刺激信号，可给予机体任意可结合并阻断T细胞或APC上一个或多个分子的作用剂，已知这些作用剂可参与上述两种细胞之间的共同刺激信号。例如，给予机体可与APC上的B7分子(包括，但不限于：B7-1或者B7-2)或者CD28(可由诸如T细胞表达，并被B7所结合)结合的任一作用剂。这些作用剂包括与B7分子结合的抗体(例如，抗B7抗体)、CTLA4/Ig、以及与CD28结合的抗体。作为选择、或者另外地，可给予机体任一可与APC上的CD40或者CD40L(亦可称做CD154)结合的作用剂，其可由诸如T细胞表达并可与CD40结合。这些作用剂包括与CD40或者CD40L结合的抗体。筛选抑制免疫反应的作用剂的过程
除可采用下面例子中描述的体外检测法检测候选作用剂(例如，突变型IL-15多肽)外，还可用下面的体内测定法来检测本文所描述的最有效引发免疫抑制的作用剂的特别联合作用。例如，可检测一种或者多种靶向作用于IL-15R的作用剂与一种或多种其它作用剂的联合作用，所述的“其它作用剂”可阻断通常由APCs传递到T细胞的共同刺激信号、拮抗TCR、抑制神经钙蛋白、抑制细胞增殖，或者结合抗原-活化的T细胞并使之失活。这些体内检测法仅代表了一些常规的方法，采用这些方法可使本领域的技术人员进一步检测本发明作用剂的有效性。在此选出这些方法是由于它们与许多种可采用靶向作用于IL-15R的作用剂进行治疗的临床情况相关。例如，这些检测法与器官移植、免疫性疾病、特别是自身免疫性疾病、以及免疫系统的肿瘤(例如，T细胞恶变发生的肿瘤)相关。移植示例
为确定本发明的作用剂或者所述作用剂的联合是否具有免疫抑制作用，可在确定的移植示例中给予机体所述作用剂(可通过定向、或者基因治疗、或者细胞治疗的方法给予)。
本发明所述的作用剂、或者编码它们的核酸分子可通过标准手段采用全身的或者局部的给药方法、在同种异体或者异种动物之间的皮肤移植、器官移植或细胞植入之前给予任何常规的实验室动物，例如大鼠、小鼠、家兔、豚鼠或狗。C57B1-10、B10.BR、以及B10.AKM(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)等种系的小鼠具有相同的遗传背景，但是在H-2基因座有错配现象，因此非常适用于对多种器官移植进行评测。心脏移植
借助供体心脏—宿主腹部大血管吻合术实行心脏移植的方法最先由Onoet al.公开发表(J.Thorac.Cardiovasc.Surg. 57：225，1969；还可参见Corry etal.，Transplantation  16：343，1973)。通过这种外科手术步骤，采用标准的微血管技术，将供体心脏的主动脉吻合于宿主的腹主动脉，供体心脏的肺动脉吻合于毗连的腔静脉。一旦心脏被移植到位并用37℃的林格氏乳酸溶液(Ringer’s lactate solution)保温，将恢复正常的窦性心律。移植心脏的功能可通过腹壁采用心室收缩触诊的方法经常测定。排斥反应定义为心肌收缩停止。与未经处理的宿主相比，若本发明的作用剂(例如，突变的IL-15/Fc和CTLA4/Ig的联合应用)可使供体心脏在使用这些作用剂的宿主中可存活的时间更长，则可认为其可有效降低器官移植所产生的排斥反应。皮肤移植
本发明作用剂的各种联合应用的有效性也可通过皮肤移植的方法来进行评估。为在啮齿类动物上进行皮肤移植，要先将供体动物麻醉，从尾部的一部分取下厚度完全的皮肤。受体动物也要麻醉，从剃净毛的胁腹部移去一小块皮肤，用以制成一接受移植部位。所述小块皮肤的大小通常约为0.5×0.5cm。修剪来自供体的皮肤使之与接受移植的部位形状相适配，将其置于接受移植部位，用纱布覆盖，并用绷带包扎。在手术后的第六天开始每天检查移植物，当多于一半的移植上皮表现出无活性时，可认为发生了排斥反应。与未经处理的宿主相比，若本发明的作用剂(例如，突变的IL-15/Fc和CTLA4/Ig的联合应用)可使供体的皮肤在使用这些作用剂的宿主中可存活的时间更长，则可认为其可有效降低皮肤移植所产生的排斥反应。胰岛同种异体移植模型
DBA/2J胰岛细胞同种异体移植物可被移植到啮齿类动物中，例如可移植到通过单次腹腔内注射链脲霉素(225mg/kg；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)而患有糖尿病的6-8周龄的B6 AF1小鼠体内。作为对照，同源小岛细胞可被移植到糖尿病小鼠体内。胰岛细胞的移植可根据如下已公开的方案(例如，可参考Gotoh et al.，Transplantation  42：387，1986)来进行。简要地说，供体的胰腺用IV型胶原酶(2mg/ml；Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)作原位灌流，在37℃消化40分钟以后，用不连续的Ficoll梯度来分离小岛。随后，将300-400个小岛细胞(islets)移植入每一受体的肾被囊下(under the renal capsule)。同种异体移植物的功能可通过血液中葡萄糖水平的一系列测量(Accu-Check IIITM；Boehringer，Mannheim，Germany)来监测。初期的移植功能可以移植后第三天的血中葡萄糖水平低于11.1mmol/l作为指标，初期移植功能的阶段过后，移植物的排斥反应可以血中葡萄糖水平高于16.5mmol/l(在每一至少两个连续昼夜)作为指标。自身免疫疾病模型
自身免疫疾病的模型为采用体内试验方法评定本发明作用剂的联合效果提供了另一种手段。这些模型对本领域技术人员来说是公知的，可用于测定经基因治疗或细胞治疗定向给予包含靶向作用于IL-15R的作用剂的某种联合作用剂后对治疗特定的自身免疫性疾病是否具有有效的治疗作用。
已经建成动物模型的自身免疫性疾病包括类风湿疾病，例如类风湿性关节炎以及系统性红斑狼疮(SLE)，I型糖尿病，以及甲状腺、肠道和中枢神经系统的自身免疫性疾病。例如，SLE的动物模型包括MRL小鼠、BXSB小鼠、NZB小鼠以及它们的F1杂交品种。为研究类风湿疾病过程中的特定方面，可以将这些动物进行杂交。NZB种系与NZW小鼠杂交后，其后代患有严重的红斑狼疮(参见Bielschowsky et al.，Proc.Univ.Otago Med.Sch. 37：9，l959；也可参见Fundamental Immunology，Paul，Ed.，Raven Press，New York，NY，1989)。类似地，NBZ×SWR交配产生的后代则转而产生致死性的肾炎(Data et al.，Nature  263：412，1976)。SNF1小鼠肾损害的组织学外观已经被很好地描述(Eastcott et al.，J Immunol. 131：2232，1983；也可参见Fundamental Immunology，supra)。因此，动物的常规健康状况以及肾组织的组织学外观可被用来确定给予靶向作用于IL-15R的作用剂和诸如抑制共刺激的作用剂是否能够有效抑制SLE动物模型的免疫反应。
MRL种系小鼠中的一种可产生SLE，MRL-lpr/lpr，也可产生一种与人的类风湿性关节炎相似的关节炎(Theofilopoulos et al.，Adv.Immunol. 37：269，1985)。可选择地，可通过给大鼠尾根部(base of the tail)注射II型胶原(2mg/ml)与弗氏完全佐剂1∶1的混合物(总共100μl)而在啮齿类动物上产生实验性关节炎。免疫2-3周后，产生关节炎。核酸分子编码本发明的作用剂(例如，靶向作用于IL-15的作用剂以及抑制共刺激或者与抗原-活化的T细胞结合并使之失活的作用剂)从而抑制免疫反应的能力可通过核酸分子对T淋巴细胞的靶向作用来评定。一种对T淋巴细胞靶向作用的方法如下文所述。在关节炎发作2-3天后，制备脾细胞悬液并使之与胶原(100μg/ml)一同温育48小时用以诱导胶原活化的T细胞的增生。在此期间内，将细胞用编码目的多肽作用剂的载体进行转导。作为对照的平行培养为同样生长但不转导或者用一个“空的”载体进行转导的细胞。然后将细胞腹腔注射入动物体内(5×107细胞/每只动物)。治疗的有效性如Chernajovsky et al所述(Gene Therapy  2：731-735，1995)，可通过接下来的2周内所出现的疾病症状来评定。与对照组相比，疾病症状越轻微，显示本发明的联合作用剂、以及编码它们的核酸分子所具有的免疫抑作用剂的功能就越强，因此在治疗免疫性疾病中、尤其是自身免疫性疾病中就越有用处。
在I型糖尿病中，各种联合应用反应剂抑制免疫反应的能力可在BB种系大鼠上进行检验，该种系的大鼠是在渥太华的生物饲养实验室(Bio-Breeding Laboratories in Ottawa)由市售Wistar大鼠品种发展而来的。这类大鼠可自发性地发展出抗小岛细胞和胰岛素的自身抗体，就像在人类I型糖尿病人中发生的一样。作为选择地，NOD(非肥胖性糖尿病，non-obesediabetic)小鼠也可用作模型系统。
甲状腺的自身免疫性疾病已经利用鸡建立了模型。肥胖种系(obese strain，OS)鸡一致地发展出与桥本病(Hashimoto′s disease，参见Cole et al.，Science160：1357，1968)类似的自发性的自身免疫性甲状腺炎。大约15％的这种禽类可产生对于胃侧壁细胞的自身抗体，就像在人的自身免疫性甲状腺炎中发生的一样。OS种系鸡中该疾病可在治疗方案进程中监测的症状包括：身体大小、脂肪沉积、血清脂质、寒冷敏感性、以及不孕症等。
中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病的模型也可通过实验的方式诱导出来。可能导致瘫痪的中枢神经系统的炎症可在多种不同的实验室动物(包括啮齿类动物和灵长类)上通过给脑或者脊髓组织单次注射佐剂的方法诱导出来。这一称作实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的模型是通过T细胞介导产生的。类似地，实验诱导性重症肌无力可通过单次注射乙酰胆碱受体和佐剂的方法诱导产生(参见Lennon et al.，Ann.N.Y. Acad Sci. 274：283，1976)。
肠道的自身免疫性疾病可在IL-2或者IL-10“剔除”小鼠或接受牛血清白蛋白灌肠的小鼠上建立模型。编码本发明作用剂的核酸分子
本发明的多肽作用剂，包括那些为融合蛋白的多肽作用剂(例如，突变的IL-15/Fc和CTLA4/Ig分子)，可通过核酸分子在合适的真核或原核表达系统进行体外表达，然后纯化得到所需的多肽作用剂，也可通过给患者注射可编码核酸分子的合适的基因治疗表达载体的方法来使用。而且，在移植物被移植之前，可将核酸引入移植物的细胞之中。因此，编码上述作用剂的核酸分子也属于本发明的范畴之内。就像本发明的多肽(例如，突变的IL-15/Fc多肽)可根据它们与野生型多肽(例如，野生型IL-15多肽)的同一性来进行描述一样，编码它们的核酸分子与编码相应的野生型多肽的核酸分子也必然具有某种同一性。例如，与编码野生型IL-15多肽的核酸分子相比，编码突变型IL-15多肽的核酸分子可以至少具有65％、优选至少75％、更优选至少85％、最优选至少95％(例如，96％、97％、98％、或者99％)的同一性。对核酸来说，相比较的序列的长度通常至少要有50个核苷酸、优选至少60个核苷酸、更优选至少75个核苷酸、最优选至少110个核苷酸。
编码本发明作用剂的核酸分子可以是天然存在的序列，或者与天然存在的序列有所区别的序列，但是，由于遗传密码的简并性，它们都编码同样的多肽。这些核酸分子可包括RNA或DNA(例如，基因组DNA，cDNA，或者合成的、诸如通过基于亚磷酸胺合成制备的DNA)，或者是通过对上述这些类型核酸分子中的核苷酸进行组合及修饰得到的核酸分子。另外，所述核酸分子可以是双链或者是单链的(即，可以为有义、或者反义链)。
本发明的核酸分子被称作“分离的(isolated)”，这是由于它们从编码序列的5’端或者3’端分离出来，这样它们可以立即与有机体中天然存在的基因组相结合。因此，核酸分子并不限于编码多肽的序列；位于编码序列的上游或者下游的部分或者全部非编码序列也可包含于其中。分子生物学领域中普通技术人员都熟悉分离核酸分子的常规步骤。例如，它们可通过利用限制性核酸内切酶作用于基因组DNA的方法来产生，或者通过聚合酶链反应(PCR)来制得。当核酸分子是核糖核酸(RNA)时，核酸分子可通过体外转录的方法制备。
本发明的分离的核酸分子可以包括在天然状态中未发现的片段。因此，本发明包括重组分子，在这些重组分子中，核酸序列(例如，编码突变的IL-15的序列)可被掺入到载体(例如，质粒或者病毒载体)中，或者掺入到异种细胞的基因组(或者同种细胞的基因组，但在不同于天然染色体的位置)中。
如上所述，本发明的作用剂可以是融合蛋白。添加或者置换上文所描述的异种多肽，编码本发明作用剂的核酸分子可以包含编码“标记部分(marker)”或者“报告部分(reporter)”的序列。标记或者报告基因可以包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖甙磷酸转移酶(neor，G418r)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)、以及黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。由于本发明的实施与许多标准程序相关联，因此本领域中的普通技术人员将清楚额外试剂的使用，例如，具有标记或者报告功能的额外序列的使用在本发明中是有益的。
本发明的核酸分子可通过将突变引入本发明作用剂(例如，IL-15分子或者CTLA4分子)中的方法获得，所述本发明的作用剂可由诸如哺乳动物的细胞等生物细胞中获得、或者通过常规的克隆方法得到。因此，本发明的核酸可以是下述种类动物的核酸：小鼠、大鼠、豚鼠、母牛、绵羊、马、猪、家兔、猴、狒狒、狗、或者猫。优选地，核酸分子为人的核酸分子。
上述核酸分子可通过能够定向表达的载体、在诸如已经被转导了该载体的细胞内定向表达。相应地，除了多肽作用剂之外，含有编码所述作用剂的核酸分子的表达载体、以及采用这些载体转染的细胞都是本发明的优选实施例。
可用于本发明的合适的载体包括可用于细菌的T7-依赖性载体(例如，参考Rosenberg et al.，Gene 56：125，1987)、用于哺乳类细胞的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J.Biol.Chem. 263：3521，1988)、酵母表达系统，例如Pichia pastoris(例如，来自于Invitrogen的PICZ族表达载体，PICZ familyof expression vectors from Invitrogen，Carlsbad，CA)、用于昆虫细胞的来源于杆状病毒的载体(例如，来自于Clontech，Palo Alto，CA的pBacPAK9表达载体)。所述载体中编码目的多肽的核酸插入片段可操作地与启动子相连，该启动子可基于诸如准备在其中进行表达的细胞类型来选择。例如，T7启动子可用于细菌，多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞，而巨细胞病毒或者金属硫蛋白启动子可用于哺乳动物细胞。而且，对于高等真核生物，还可广泛使用组织特异性和细胞类型特异性启动子。这些启动子根据在机体内给定的组织或者细胞类型内对核酸分子的定向表达能力来命名。本领域的普通技术人员都知道可用于核酸定向表达的数目众多的启动子以及其他调节元件。
在载体中，除了包括能促进所插入核酸分子转录的序列外，还可包括复制的起始点以及编码选择性标记物的其他基因。例如，新霉素抗性(neomycin-resistance，neor)基因可将G418抗性传给表达该基因的细胞，由此允许转染细胞对表型的选择。允许细胞表型选择的其它适宜的选择性标记物基因包括多种荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)及其变异体。本领域的普通技术人员很容易确定给定的调节元件或者选择性标记物是否适用于特定的实验内容。
可用于本发明的病毒载体包括诸如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)、以及牛乳头瘤病毒载体(例如，参见Gluzman(Ed.)，Eukaryotic Viral Vectors，CSH Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)。
含有可编码本发明作用剂的核酸分子、以及可在体外表达该核酸分子所编码的蛋白的原核或真核细胞也在本发明的特征之内。本发明的细胞可以是被转染的细胞，即，核酸分子已经转染进该细胞，例如编码突变型IL-15多肽的核酸分子已经通过重组DNA技术被引入该细胞。该细胞的后代也被认为在本发明的范畴之内。表达系统的精确成分不是决定性的因素。例如，突变型IL-15多肽可在原核宿主例如大肠杆菌内制造出来，也可在真核宿主例如昆虫细胞(例如Sf21细胞)内或者哺乳动物细胞(例如，COS细胞，CHO细胞，293细胞，NIH 3T3细胞，或者Hela细胞)内制造出来。这些细胞可通过多种途径得到，其中包括美国典型培养物中心(American Type CultureCollection，Manassas，VA)。在选择表达系统时，只有各成分之间的相容性是最要紧的。本领域的普通技术人员可以做出这样的判断。而且，如果在选择表达系统中需要指导，可查阅Ausubel et al.(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，New York，NY，1993)和Pouwels et al.(CloningVectors：A Laboratory Manual，1985 Supl.1987)。
含有可编码本发明作用剂的核酸分子、以及可在体内表达该核酸分子所编码的蛋白的真核细胞也在本发明的特征之内。
此外，本发明的真核细胞可以是细胞移植物、组织或器官移植物中的一部分细胞。所述移植物可包括取自供体生物体的原代细胞或培养细胞，在移植入受体生物体例如真核细胞系(包括干细胞或祖细胞)之前，在体外进行修饰和/或选择。由于在移植入受体生物体之后可出现细胞增殖，因此该类细胞的后代也被认为属于本发明的范畴之内。细胞，作为细胞、组织或器官移植物的一部分，可用编码突变型IL-15多肽的核酸进行转染，然后可移植入受体的生物体内，在受体的生物体内开始表达突变型IL-15多肽。而且，这类细胞可包括一个或者多个可应用于选择性操作的附加的核酸构建体(constructs)，例如，在移植入受体生物体之前可用于特定的细胞谱系或者细胞类型的选择操作。
表达的多肽可采用常规的生物化学操作自表达系统中纯化出来，如下文所述，可用作诊断工具或者治疗剂(本发明的治疗用组合物可被理解为药物)。相应地，含有与IL-15R亚单位结合的突变型IL-15多肽以及与B7分子结合的多肽的治疗用组合物的制备方法也是本发明的特征。该方法可通过诸如下面的步骤来实行：(a)自表达系统中纯化突变型IL-15多肽；(b)自表达系统中纯化与B7结合的多肽；以及(c)将IL-15多肽和可与B7结合的多肽混合(combine)。治疗用组合物可被配制(如本文所述，以及可采用本领域普通技术人员公知的方法)用以治疗患有任何类型免疫性疾病的病人(例如，本文所述的任何类型的自身免疫性疾病)。靶向作用于IL-15R的作用剂在进行诊断时有益
靶向作用于IL-15R的作用剂可被用于确定病人是否患有可用本文所述作用剂的联合应用来进行治疗的疾病(例如，免疫性疾病，尤其是自身免疫性疾病)。诊断方法可采用诸如下述步骤进行：从可能患有免疫性疾病的病人、尤其是自身免疫性疾病或者显示为恶性免疫细胞肿瘤病人取得组织样品，并将组织样品暴露于靶向作用于IL-15R的抗原标记多肽。所述样品可以是任何生物样品，诸如血液、尿、血清或者血浆样品。而且，样品也可以是组织样品(例如，活检组织)，或者来自于关节(例如，滑膜液)、腹腔(例如，腹水液)、胸部(例如，胸膜液)、或中枢神经系统(例如，脑脊液)等的渗出物。样品也可包括取自病人的培养细胞(例如，外周血单核细胞)。样品可取自哺乳动物，例如人类患者。如果样品中含有可与其所暴露于其中的作用剂结合的细胞，则所述样品很有可能在体内与所述作用剂(例如，靶向作用于IL-15R的作用剂)结合，因此可能在体内其增殖被抑制或者被破坏。采用这种检测方法的候选病人所出现的症状以及被取样的相关组织所出现的特定的症状都是本领域普通技术人员所公知的。可进行治疗的病人
本发明作用剂的联合可被用于治疗患有免疫性疾病、尤其是自身免疫性疾病的病人，可包括但不限于下述病人：(1)风湿性疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、混合性结缔组织病、皮肌炎、多肌炎、Reiter氏综合征、或者Behcet氏病；(2)I型或者II型糖尿病；(3)甲状腺的自身免疫性疾病，例如桥本氏甲状腺炎或者Graves氏病；(4)中枢神经系统的自身免疫性疾病，例如多发性硬化症、重症肌无力、或者脑脊髓炎；(5)多种天疱疮(phemphigus)，例如寻常天疱疮(phemphigusvulgaris)、增殖性天疱疮(phemphigus vegetans)、落叶状天疱疮(phemphigusfoliaceus)、塞-厄综合征(Senear-Usher syndrome，红斑性天疱疮)、或者巴西天疱疮(Brazilian phemphigus)；(6)皮肤疾病，例如银屑病或者神经性皮肤炎；以及(7)炎症性肠疾病(例如，溃疡性结肠炎或者节段性肠炎)。本发明的作用剂的联合也可被用来治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。类似地，给予这些作用剂的方法可用来治疗接受人造或者生物材料移植物、或者接受二者的病人。这些移植物可以是器官、组织或者细胞移植物，或者用于在其上种入生长细胞的合成移植物，例如，种入血管细胞的合成血管移植物。另外，血管损伤的病人可从这种方法中受益。
由于本发明包括给予机体可靶向作用于IL-15R的耗竭靶细胞型的作用剂，因此，在不大量损伤正常T细胞的情况下，将有可能选择性消灭自身反应性或者“移植物毁坏型(transplant destructive)”免疫细胞。因此，在体内消灭表达IL-15R的细胞的方法也包含于本发明的特征之内，这些细胞包括活化的、或有自身反应性的、或“抑制物毁坏型”的免疫细胞，或者恶性细胞。这类方法可通过对病人联合应用下述作用剂来进行：该作用剂的联合包括可靶向作用于IL-15R的作用剂以及可活化补体系统、通过ADCC机制溶解细胞、或消灭表达野生型IL-15受体复合物的细胞的作用剂。这类方法可用于治疗IL-15R+白血病、淋巴瘤，或者其他IL-15R+的恶性疾病，例如结肠癌。使用的制剂以及给药途径
本发明的方法及用于实施本发明方法的治疗用组合物包括“实质纯(substantially pure)”的作用剂。例如，当所用作用剂为多肽时，多肽中至少要含有60％(重量％，干重)的目的多肽，例如，可结合并破坏带有IL-15R的细胞的多肽。优选地，所述作用剂(例如，多肽)至少含有75％、优选至少含有90％、更有选至少含有99％(重量)的目的作用剂。纯度可通过任何合适的标准方法进行测定，例如柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、或者HPLC分析法。
虽然可用于本发明方法的作用剂可从天然存在的资源中获得，它们也可合成或用其它方法制造(例如，可结合并破坏带有IL-15R的细胞的多肽可通过表达重组核酸分子的方法而制得)。来源于真核生物、或由大肠杆菌或其它原核生物合成的多肽，以及化学合成的多肽实质上将不含有天然相关的成分。当多肽是嵌合体时，它可由包含有编码全部或部分所述作用剂的序列(例如，编码突变型IL-15多肽的序列和编码IgG Fc区域的序列)的杂交核酸分子编码而得到。本发明的作用剂(例如，多肽)可与六-组氨酸标记物融合，以促进细菌表达的蛋白质的纯化，或者与血细胞凝集素标记物融合，以促进真核细胞表达的蛋白质的纯化。
制备本发明作用剂所需的技术是本领域的常规技术，本领域的普通技术人员无需采取过多的实验就能完成。例如，采用此处描述的用于构建149和156位的谷氨酰胺残基变为天冬氨酸残基的突变型IL-15多肽的PCR-辅助诱变技术，可进行包括IL-15上一个或多个氨基酸置换的突变。含有缺失或插入氨基酸残基的突变(发生在IL-15多肽或者本文描写的任何其它有用多肽，例如，抑制共刺激的多肽或者可与活化的T细胞结合的多肽)也可用标准的重组技术来进行。在治疗应用中，本发明的作用剂可与生理学上可接受的载体(例如生理盐水)一同给药。本发明的治疗用组合物也可包含载体或者赋形剂，其中许多都是本领域所公知的。可用的赋形剂包括缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、以及碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、脲、醇类、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇、以及甘油。根据相应的给药途径，本发明的作用剂可以各种方式配制。例如，可制成摄取或注射用的液体溶液；可制成摄食、吸入、或者局部给药用的凝胶或者粉剂。制备这些制剂的方法是公知的，可在诸如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”等中找到。
对于药理学家以及医生来说，给药途径也是公知的，其可包括：腹腔、肌内、皮下、以及静脉内给药。其它给药途径包括：颅内(例如，脑池内或脑室内)、框内、眼内、囊内、脊柱内、腹腔内、经粘膜给药、局部、皮下、以及口服给药。可以预计，在给予靶向作用于IL-15受体的作用剂时，将优选通过静脉内以及动脉内给药的途径。由于皮下组织为多肽提供了稳定的、可缓慢释放的环境，因此皮下给药途径也经常使用。
当采用细胞治疗(基因治疗)时，细胞/组织/器官可在移植前通过孵育、输注、或灌注等方式转染核酸组合物，这样，在受体生物体中，治疗用蛋白可从移植的细胞/组织/器官中进行表达、释放。所述细胞/组织/器官也可在移植前预先灌注治疗用蛋白质、或者仅与治疗用蛋白质孵育，使之能够消除附着于供体细胞/组织/器官的与移植相关的免疫细胞(尽管这只是一个侧面，可能与临床无关)。在进行细胞移植时，可通过移植过程、或者用导管介导的穿过血管壁的注射过程来植入细胞。在某些情况下，可通过将细胞释放入脉管系统来完成，随后从脉管系统中分布到血流中和/或移入周围组织中(在小岛细胞的移植中，通过这种方式来完成，其中小岛细胞释放入门静脉，随后移至肝组织中)。
在医药领域中公知，病人的用药剂量取决于多种因素，包括一般健康状况、性别、体重、体表面积、以及病人的年龄，还与准备给予的特定化合物、用药的时间和途径、以及其它同时服用的药物等等。本发明的多肽的剂量也会有所变化，但是当通过静脉内给药时，其剂量可在1μg～10mg/Kg体重范围内、或者在0.01mg/L～100mg/L血容量的范围内变化。如果需要，所述剂量可每天给予1次或多次，且可连续给药一段时间。对于某种应用方式，确定正确的给药剂量是在本领域普通技术人员能力范围内的。
                               实施例 试剂
下述试剂用于本文所描述的研究中：重组人IL-2购自Hoffman-La Roche(Nutley，NJ)；雷帕霉素购自Wyeth-Ayerst(Princeton，NJ)；环孢霉素A(CsA)购自Sandoz(East Hanover，NJ)；RPMI-1640和胎牛血清(FCS)购自Bio Wittaker(walkersville，MD)；青霉素、链霉素、G418和链霉素抗生物素蛋白(strepavidin-RED670)  购自Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)；地塞米松、PHA、溶菌酶、NP-40、NaCl、HEPES和PMSF购自Sigma(St.Louis，MO)；Ficoll-泛影葡胺购自Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)；重组人IL-15以及抗人IL-15抗体购自Pepro Tech(Rocky Hill，NJ)；抗-FLAG抗体、以及抗-FLAG亲和珠(anti-FLAG-affinity beads)购自International Biotechnologies，Inc.(Kodak，New Haven，CT)；pRcCMV购自InVitrogen Corporation(San Diego，CA)；染料木黄酮购自ICN Biomedicals(Irvine，CA)；辛二酸二琥珀酰亚胺(disuccinimidyl suberate，DSS)购自Pierce(Rockford，IL)；限制性核酸内切酶购自New England Biolabs(Beverly，MA)；[3H]TdR购自New EnglandNuclear(Boston，MA)；荧光染料结合抗体CD25-PE3、CD14-PE、CD16-PE、CD122-PE、CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-PE、或IgG1-FITC购自Beckton/Dickinson(San Jose，CA)。FLAG肽在Peptide Synthesis Facility atHarward Medical School合成。FLAG-HMK-IL-15融合蛋白的制备
为研究人IL-15受体表达的细胞模型，构建了可用于表达IL-15融合蛋白的质粒。该质粒用于编码N-末端可与18个氨基酸的FLAG-HMK-序列共价结合的IL-15多肽(FLAG-HMK-IL-15)。FLAG序列可被生物素化的高特异性抗-FLAG抗体所识别(Blanar et al.，Science  256：1014，1992；LeClair etal.，Proc.Natl.Acad Sci.USA  89：8145，1992)，而HMK(心肌激酶识别位点)序列将[32P]同位素标记引入分子(Blanar et al.，supra，LeClair et al.，supra)。
为构建FLAG-HMK-IL-15质粒，须将编码成熟的IL-15蛋白的、322bp的cDNA片段利用合成的寡核苷酸通过PCR反应进行扩增[有义链5，-G GAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3’(SEQ ID NO：5；EcoRI位点[下划线]加上碱基145-162；反义链5’-CG GGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAA-3’(SEQ ID NO：5；BamHI位点[下划线]加上碱基472-489)]。模板DNA来自于PHA-活化的人PBMCs。将PCR产物纯化，用EcoRI和BamHI消化，将其克隆入经EcoRI-BamHI消化后的pAR(DRI)59/60质粒中(Blanaret al.，Science  256：1014，1992；LeClair et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  89：8145，1992)。pAR(DRI)59/60质粒的主链包含编码FLAG和HMK识别多肽序列的框架序列(Blanar et al.，Science  256：1014，1992；LeClair et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  89：8145，1992)。FLAG-HMK-IL-15融合蛋白的表达和纯化
将IL-15相关的融合构建体，FLAG-HMK-IL-15，在BL-21系E.coli中表达，并用抗-FLAG包被的小块进行亲和纯化(Blanar et al.，Science  256：1014，1992；LeClair et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8145，1992)。将融合蛋白用0.1M甘氨酸(pH3.0)充分洗涤，然后从亲和柱上洗脱下来。将内含FLAG-HMK-IL-15的洗脱液在4℃ 用含有50mM Tris(pH7.4)和0.1M NaCl的缓冲液透析18小时，用0.2μm薄膜过滤，储存于-20℃。FLAG-HMK-IL-15与IL-15Rα亚单位的结合
检测了纯化的FLAG-HMK-IL-15融合蛋白是否与细胞表面的IL-15受体相互作用。如前所述，将[32P]-FLAG-HMK-IL-15加入到被促分裂原PHA活化的PBMC培养物中。为获得活性蛋白之间持久的相互结合，加入化学交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)。将细胞洗涤、溶解、离心，用SDS-PAGE分离洗涤剂可溶性蛋白质。对SDS-PAGE分离蛋白进行放射自显影，显示相应于FLAG-HMK-IL-15(15kDa)和人IL-15Rα亚单位(60-65kDa)结合分子量的75-80kDa的单一条带。该条带鉴定为IL-15Rα亚单位，是用过量摩尔数hIL-15存在下的交联反应来确证的。在这些条件下，我们检测不到放射标记的15kDa的条带。因此，[32P]-FLAG-HMK-IL-15融合蛋白与在促分裂原活化的PBMC细胞表面所表达的60-65kDa的IL-15Rα亚单位具有位点特异的结合活性。FLAG-HMK-IL-15是需要IL-2Rβ表达的生物活性生长因子
在下面的一系列试验中，检测FLAG-HMK-IL-15融合蛋白是否为具有生物活性的生长因子。对FLAG-HMK-IL-15或者人重组IL-2应答而发生的PHA-活化的人PBMC细胞的增殖，可通过[3H]-TdR掺入试验来检测。缺少IL-15序列的FLAG肽不刺激细胞的增殖。如IL-2一样，FLAG-HMK-IL-15融合蛋白可刺激表达IL-2Rβ亚单位的IL-2Rγ+BAF-BO3细胞转染体的增殖。然而，FLAG-HMK-IL-15不能刺激用缺失IL-2Rβ链序列的载体所转染的母体BAF-BO3细胞的增殖。因此，FLAG-HMK-IL-15是一个具有生物活性的生长因子，为刺激细胞增殖，其需要靶细胞上IL-2Rβ链的表达。促分裂原活化的、而非静息的PBMC细胞表达IL-15Rα亚单位
采用FLAG-HMK-IL-15融合蛋白、生物素标记的抗-FLAG抗体、以及链霉抗生物素蛋白-RED670，用细胞荧光测定法检测人PBMC细胞上IL-15结合位点的表达，受试的PBMC细胞为新鲜分离的、或者是经PHA-活化的。将所述细胞洗涤，但用培养基，或者用FLAG-HMK-IL-15再用生物素标记的抗-FLAG抗体和链霉抗生物素蛋白-RED670进行温孵。染色的细胞用流式细胞测定进行分析。以PHA活化的PBMC细胞表达IL-15Rα，而静息态的PBMC细胞却不表达。与上述交联反应的结果一致，FLAG-HMK-IL-15与PHA活化的PBMC细胞之间的结合可被过量摩尔数的rIL-15所阻断，由此可以证明FLAG-HMK-IL-15可特异性地与IL-15的结合位点结合。活化的CD4+和CD8+细胞可表达IL-15α链。活化诱导的IL-15Rα链也可在CD14+(单核/巨噬)细胞和CD16+(自然杀伤)细胞上检测出来。IL-15结合不需要IL-2Rα和IL-2Rβ亚单位
将用FLAG-HMK-IL-15蛋白和抗-CD25的单克隆抗体(Mab)(抗IL-2Rα亚单位)染色(stain)的经PHA-活化的PBMC细胞通过荧光激活细胞分类分析的方法进行检测，结果显示，有些细胞可表达IL-15Rα和IL-2Rα亚单位，另一些细胞可表达上述二种亚单位中的一种，而不是都表达。可发现不与FLAG-HMK-IL-15结合的IL-2Rα+的细胞。几乎所有的仅以PHA刺激1天的PBMC细胞均可表达IL-15Rα或IL-2Rβ链中的一种，而不是将两种蛋白都表达出来。相反地，PHA刺激3天后，更多的细胞为IL-15Rα+及IL-2Rβ+细胞(双阳性)，而IL-15Rα+，IL-2Rβ-细胞(单阳性)的数目则减少。有趣的是，其中有不能与IL-15结合的IL-2Rβ+细胞。因此，IL-2Rβ链的表达对结合IL-15来说是不够的。
总体来说，上述的资料表明IL-15可与IL-15Rα+、IL-2Rα-、以及IL-2Rβ-细胞结合。探查IL-15与转染了IL-15Rα亚单位的IL-2Rα-、β-细胞之间相互反应的实验可得出类似的结论(Anderson et al.，J Biol.Chem. 270：29862，1995；Giri et al.，EMBO J. 14：3654，1995)。为增加细胞对IL-15触发的细胞生长的敏感性，除需要IL-15Rα亚单位的表达外，还需要IL-2Rβ和IL-2Rγ亚单位。
总而言之，本试验已经证明：(i)活化的巨噬细胞、T细胞以及NK细胞可快速表达IL-15α亚单位；以及(ii)IL-15Rα亚单位的诱导可被地塞米松所阻断，但不能被CsA或雷帕霉素所阻断。而且试验已经证实，IL-15Rα亚单位对于IL-15的结合是必要的和充分的，FLAG-HMK-IL-15融合蛋白对研究IL-15受体来说是一个非常有用的工具。IL-2与IL-15诱导的酪氨酸磷酸化蛋白具有相同的模式(pattern) IL-2Rβ亚单位对于IL-2和IL-15的信号传导都很关键
降低活化的T细胞的存活力以耗竭活化的T细胞，为减少可导致加速动脉粥样硬化、同种异体移植排斥反应、某些白血病、以及其它免疫介导的疾病的淋巴因子和促分裂原的产生提供了新的途径。而且，阻断IL-15活化的信号传导通路也为减少可导致加速性动脉粥样硬化、同种异体移植排斥反应、某些白血病、以及其它免疫介导的疾病的淋巴因子和促分裂原的产生提供了新的途径。T细胞被活化后即增殖，并在其细胞表面表达白细胞介素类受体。而且，活化的T细胞可释放至少3种淋巴因子：γ干扰素、B细胞分化因子II、以及IL-3。这些淋巴因子可产生各种不希望出现的症状，例如同种异体移植排斥反应。相反，静息态的T细胞和长时记忆T细胞却不表达淋巴因子受体。受体表达的这种差别提供了一种靶向作用于活化的免疫细胞而不妨碍静息态细胞的手段。被设计用于识别IL-15R某些亚单位的分子可识别活化的单核/巨噬细胞以及活化的T细胞，并可能用来选择性地抑制或者破坏这些细胞。与IL-15R亚单位结合但缺少IL-15活性的IL-15的衍生物，由于它们阻断真正的IL-15的结合和/或摄取，因此在本发明的方法中是有益的。下述突变的IL-15分子为这类衍生物提供了工作实施例。靶向作用于IL-15R的突变型IL-15多肽 突变型IL-15的基因构建
设计出带有双点突变(Q149D；Q156D)的人IL-15蛋白用以靶向作用于在与IL-2Rγ亚单位的结合中非常关键的推定位点。采用PCR-辅助突变的方法，将149位和156位的带有极性、但不带电荷的谷氨酰胺残基突变为酸性的天冬氨酸残基。将编码双点突变的IL-15的cDNA采用PCR进行扩增，扩增中采用合成的有义寡核苷酸[5’-G GAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3’(SEQ ID NO：＿)；EcoRI位点(带下划线的六个相连碱基)加上碱基145-162]以及合成的反义寡核苷酸[5’-CG GGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAACAT GT CGACAATATGTACAAAACT GT CCAAAAAT-3’(SEQID NO：_)；BamHI位点(带下划线的六个相连碱基)加上碱基438-489；突变的碱基被单独划线]。模板是含有可编码人FLAG-HMK-IL-15的cDNA的质粒。扩增的片段用EcoRI/BamHI消化，如前所述，克隆入经EcoRI-BamHI消化后的pAR(DRI)59/60质粒中(LeClair et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8145，1989)。在156位残基处出现的突变通过用SalI消化来确认；该突变引入了一个新的SalI限制性位点。另外，突变可根据标准技术通过DNA序列分析来进行验证。FLAG-HMK-IL-15(Q149D；Q156D)双点突变蛋白被制造、纯化、并采用上面关于FLAG-HMK-IL-15野生型蛋白所述的DNA序列分析方法来进行验证。
采用这种策略，制备了在149位或156位含有单个氨基酸取代的突变体。如上所述，这些位点(149和156)分别与成熟IL-15多肽的101和108位相对应，该成熟IL-15多肽缺少一段48个氨基酸残基的信号序列。
类似地，本策略可被用于在149或156位谷氨酰胺残基的位置掺入任何其它氨基酸、也可用于在149或156位以外的其他位置引入氨基酸置换。在IL-15相关蛋白质存在下BAF-BO3细胞的增殖
双点突变型IL-15多肽可以剂量-依赖性的方式抑制BAF-BO3细胞的增殖：加入30μl(大约50μg/ml)的双点突变IL-15多肽要比加入20μl同样浓度的双点突变的IL-15更完全地抑制增殖。PHA-刺激的人PBMC细胞的增殖
FLAG-HMK-IL-15双点突变多肽与PHA活化的人PBMC细胞结合的能力验证如下。将PHA-活化的PBMC细胞洗涤，单独与培养基温育、或者与FLAG-HMK-IL-15双点突变体温育。然后将细胞与生物素标记的抗-FLAG抗体温育，用偶连RED670的链霉抗生物素蛋白染色。染色细胞用流式细胞计数法进行分析。荧光激活细胞分类方法(FACS)分析野生型FLAG-HMK-IL-15染色的白血 病细胞系
一系列与上面类似的实验显示了野生型FLAG-HMK-IL-15多肽与白血病细胞的结合能力。受试细胞取自白血病细胞系MOLT-14、YT、HuT-102，以及目前在Beth Isreal Hospital(Boston，MA)建立的、命名为2A和2B的细胞系。将培养的细胞洗涤，单独与培养基温育、或者与含有FLAG-HMK-IL-15野生型多肽的培养基温育。然后将细胞与生物素标记的抗-FLAG抗体温育，用偶连RED670的链霉抗生物素蛋白染色。染色细胞用流式细胞计数法进行分析。另外的突变IL-15嵌合多肽的遗传构建
除可提供带有抗原标记的突变型IL-15的FLAG-HMK-IL-15嵌合体外，还有其它大量的多肽可与任意突变的IL-15连接。例如，按照下述方法，突变的IL-15可以与抗体IgG亚类的Fc片段连接。突变型IL-15/Fc的基因构建
利用逆转录酶(MMLV-RT；Gibco-BRL，Grand Island，NY)和合成的寡-dT(12-18)寡核苷酸(Gibco BRL)通过常规技术可从IgG2a分泌杂交瘤中提取的mRNA中产生Fcγ2a的cDNA。用IL-15特异性合成寡核苷酸采用PCR技术可从质粒模板中扩增突变的IL-15cDNA。
将5’寡核苷酸设计成插入一个独特的NotI限制位点，该位点位于距离5’端翻译起始密码子40个核苷酸处，而3’端寡核苷酸消除终止密码子并将C-末端Ser残基密码子选择从AGC改为TCG以适应在突变IL-15/Fc接头上建立独特的BamHI位点。用于扩增Fcγ2a区域cDNA的合成寡核苷酸将铰链区的第一密码子从Glu改变为Asp以便建立跨越铰链区第一密码子的独特BamHI位点，并在终止密码子的3’端引入独特的XbaI位点。可修饰Fc片段使之成为非-靶细胞耗竭性，即，使之不能活化补体系统。为构建非-靶细胞耗竭性的突变型IL-15构建物(mIL-15/Fc)，用定向诱变的寡核苷酸位点以Ala替换C’1q结合基序Glu318、Lys320、Lys322。类似地，用Glu替换Leu235以使FcγRI结合位点失活。细胞因子和正确的翻译读框Fc-成分在独特的BamHI位点的连接产生1,236个碱基对的开放读框，所述开放读框编码共有13个半胱氨酸残基的411个氨基酸的单纯多肽(包括18个氨基酸的IL-15信号肽)。成熟的分泌出的同源二聚体IL-15/Fc预计含有8个分子内的、以及3个重链间的二硫化物连接位点，不包括糖基化作用，其分子量约为85kDa。MIL-15 Fc融合蛋白的表达和纯化
mIL-15 Fc基因构建的正确性可通过下述方法检测：将融合基因作为NotI-XbaI弹夹(DNA序列组件)克隆入真核表达质粒pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)中然后进行DNA序列分析。所述质粒携带有CMV启动子/增强子、牛生长激素多聚腺苷酸化信号和以G418选择用的新霉素抗性基因。携带mIl-15/Fc融合基因的质粒通过电穿孔(1.5kV/3μF/0.4cm/PBS)被转染进中国仓鼠卵细胞(CHO-K1，可在American Type Culture Collection得到)，然后在含有1.5mg/ml G418(Geneticin，Gibco BRL)的无血清Ultra-CHO培养基中进行选择。亚克隆后，用ELISA法(PharMingen，San Diego，CA)从IL-15的上清液中筛选可产生高水平的融合蛋白的克隆系。用A蛋白琼脂糖亲和色谱法从培养上清液中提纯MIL-15/Fc融合蛋白，然后用PBS进行透析以及用0.22μm滤膜过滤除菌。纯化的蛋白在使用前可被储存于-20℃。
在SDS-PAGE后，在还原(有DTT)以及非还原(无DTT)条件下利用抗-mIL-15或抗Fcγ的单克隆或多克隆初级抗体(primary antibody)进行Western印迹分析以评价融合蛋白的大小以及同种型特异性。突变型IL-15/Fc的功能活性可通过上面所述的标准的T细胞增殖检测法来进行评定。MIL-15和CTLA4/Ig的用药
接下来的工作证明，当采用靶向作用于IL-15R的作用剂和阻断共同刺激信号的作用剂对异体移植的接受者进行治疗时，同种异体移植的存活率明显提高。在注射链脲霉素诱发糖尿病的小鼠体内植入粗制得的胰岛异体移植物。当小鼠用CTLA4/Ig和mIL-15/Fc处理后，所有从DBA/2J(H-2d)供体移植到B6AF1(H-2b/d，k)受体的同种异体移植物都被永久地接受了。而在未经处理或者仅采用单一蛋白处理的小鼠中，从未发现移植物的永久植入。从Balb/c(H2d)到C57B1/6(H2b)的MHC完全错配小岛异体移植物所发生的排斥反应中，未经处理小鼠的平均存活时间为15天，仅用CTLA4/Ig处理的小鼠平均存活时间为30天，仅用mIL-15Fc处理的小鼠平均存活时间为30天。相反，用CTLA4/Ig和mIL-15/Fc处理的小鼠中，多于70％处理小鼠的移植物获得了永久存活(也参看图3)。而且，在不采用免疫抑制治疗的情况下，有两例在再次接受Balb/c小岛异体移植时，获得了稳定的异体移植耐受状态。对移植组织和淋巴结的定量RT-PCR分析也显示，在接受联合治疗后，T细胞受体转录物的表达以及许多淋巴因子基因的表达都有了显著的降低。组织学分析证实了联合治疗可保护移植物免受白细胞的浸润。

Claims (45)

1.一种治疗用组合物，包括靶向作用于白介素-15受体(IL-15R)的第一作用剂和抑制T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间所传递的共同刺激信号的第二作用剂。
2.如权利要求1所述的治疗用组合物，其中所述第一作用剂包括与IL-15R的一个亚单位结合的、实质纯的突变型IL-15多肽。
3.如权利要求2所述的治疗用组合物，其中所述的亚单位是IL-15Rα亚单位。
4.如权利要求3所述的治疗用组合物，其中所述的突变型IL-15多肽具有发生在SEQ ID NO：2的149位的突变。
5.如权利要求3所述的治疗用组合物，其中所述的突变型IL-15多肽具有发生在SEQ ID NO：2的156位的突变。
6.如权利要求5所述的治疗用组合物，其中所述的突变型IL-15多肽也具有发生在SEQ ID NO：2的149位的突变。
7.如权利要求5所述的治疗用组合物，其中所述的发生在SEQ ID NO：2的156位的突变是用天冬氨酸替换了谷氨酰胺。
8.如权利要求6所述的治疗用组合物，其中所述的发生在SEQ ID NO：2的149位的突变是用天冬氨酸替换了谷氨酰胺。
9.如权利要求6所述的治疗用组合物，其中所述突变型Il-15多肽在SEQID NO：2的149位和156位用天冬氨酸替换了谷氨酰胺。
10.如权利要求2所述的治疗用组合物，其中所述第一作用剂进一步包括导致带有IL-15R的细胞消除的部分。
11.如权利要求10所述的治疗用组合物，其中所述溶解带有IL-15R细胞的部分是IgG分子的Fc区域。
12.如权利要求1所述的治疗用组合物，其中所述第一作用剂包括实质纯的抗-IL15R抗体。
13.如权利要求1所述的治疗用组合物，其中所述第二作用剂包括与B7分子结合的实质纯的多肽。
14.如权利要求13所述的治疗用组合物，其中所述的B7分子是B7-1。
15.如权利要求13所述的治疗用组合物，其中所述的B7分子是B7-2。
16.如权利要求13所述的治疗用组合物，其中所述与B7结合的多肽是包括CTLA4/Ig的多肽。
17.如权利要求13所述的治疗用组合物，其中所述与B7结合的多肽包括抗-B7抗体。
18.如权利要求1所述的治疗用组合物，其中所述第二作用剂含有可与CD28结合的实质纯的多肽。
19.如权利要求18所述的治疗用组合物，其中所述的可与CD28结合的多肽包括抗-CD28抗体。
20.如权利要求1所述的治疗用组合物，其中所述第二作用剂包括可与CD40L结合的实质纯的多肽。
21.如权利要求20所述的治疗用组合物，其中所述的可与CD40L结合的多肽包括抗-CD40L抗体。
22.如权利要求1所述的治疗用组合物，其中所述第二作用剂包括可与CD40结合的实质纯的多肽。
23.根据权利要求1所述的治疗用组合物，其中所述的可与CD40结合的多肽包括抗-CD40抗体。
24.一种抑制病人免疫反应的方法，所述方法包括给予病人含有靶向作用于IL-15R的第一作用剂以及抑制T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间所传递的共同刺激信号的第二作用剂的治疗用组合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述病人患有免疫性疾病，尤其是自身免疫性疾病，或者具有罹患免疫性疾病、尤其是自身免疫性疾病的危险。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述的自身免疫性疾病是选自系统性红斑狼疮、Sjgren式综合征、硬皮病、混合性结缔组织病、皮肌炎、多肌炎、Reiter氏综合征和Behcet氏病的一种风湿性疾病。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述的自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述的自身免疫性疾病是I型糖尿病。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述的自身免疫性疾病是选自桥本氏甲状腺炎和Graves氏病的甲状腺的自身免疫性疾病。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述的自身免疫性疾病是选自多发性硬化症、重症肌无力和脑脊髓炎的中枢神经系统的自身免疫性疾病。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述的自身免疫性疾病是选自寻常天疱疮、增殖性天疱疮、落叶状天疱疮、塞-厄综合征和巴西天疱疮的天疱疮。
32.如权利要求25所述的方法，其中所述的自身免疫性疾病是银屑病。
33.如权利要求25所述的方法，其中所述的自身免疫性疾病是炎症性肠疾病。
34.如权利要求25所述的方法，其中所述的病人患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
35.如权利要求25所述的方法，其中所述的病人接受了生物器官、组织或细胞的移植物。
36.如权利要求25所述的方法，其中所述的病人患有血管损伤。
37.如权利要求25所述的方法，其中所述的病人患有II型糖尿病。
38.一种清除表达IL-15受体的细胞的方法，所述方法包括将细胞暴露于含有靶向作用于IL-15R的第一作用剂以及抑制T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间所传递的共同刺激信号的第二作用剂的治疗用组合物之中。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述的细胞是免疫系统的细胞。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述的细胞是恶性细胞。
41.一种诊断病人是否患有可采用权利要求1所述的治疗用组合物进行治疗的疾病或者是否处于可采用权利要求1所述的治疗用组合物进行处理的的状态的方法，所述方法包括取得病人的组织样品，并将样品暴露于靶向作用于IL-15R的抗原标记性多肽，若其中样品中的细胞与所述的多肽结合，则表示细胞可在体内被靶向作用于IL-15R的作用剂所结合，从而在体内抑制所述细胞对野生型IL-15应答而产生的增殖。
42.一种制备包含可与IL-15R亚单位结合的突变型IL-15多肽和可与B7分子结合的多肽的治疗用组合物的方法，所述方法包括：
(a)从表达系统中纯化突变型IL-15多肽；
(b)从表达系统中纯化与B7结合的多肽；以及
(c)将IL-15多肽和可与B7结合的多肽混合。
43.包含靶向作用于白介素-15受体(IL-15R)的第一作用剂和抑制T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间所传递的共同刺激信号的第二作用剂的治疗用组合物在抑制病人免疫反应中的应用。
44.包含靶向作用于白介素-15受体(IL-15R)的第一作用剂和抑制T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间所传递的共同刺激信号的第二作用剂的治疗用组合物在制备抑制病人免疫反应的药物中的应用。
45.如权利要求43或44所述的应用，其中所述病人为罹患风湿性疾病、类风湿性关节炎、I型糖尿病、II型糖尿病、甲状腺的自身免疫性疾病、中枢神经系统的自身免疫性疾病、各种天疱疮、银屑病、炎症性肠疾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、接受了生物器官、组织或细胞的移植物、或者患有血管损伤的病人。
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