CN1705744A - 具有免疫调节剂的可移植细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人或动物的非全能性细胞，其包含至少一种核酸，其通过由添加活性物质调节的基因开关分子控制来编码至少一种免疫调节剂。本发明还涉及其生产和在移植中的用途，为了抑制移植排斥以及用于预防和/或治疗由移植引起的疾病和/或自体免疫疾病。

Description

具有免疫调节剂的可移植细胞

本发明涉及人或动物的非全能性细胞，其包含至少一种核酸，在由加入活性物质调控的基因开关分子控制下编码至少一种免疫调节剂。本发明还涉及所述细胞的生产和其用于移植、用于抑制移植排斥以及还用于预防和/或治疗由移植引起的疾病和/或自体免疫疾病的用途。

人疾病的多重性是基于特定细胞、组织或器官的死亡或机能失调，通常只是用药物药物不充分地治疗。先前的常规治疗由通过移植已经从健康人捐赠者获得的健康细胞、组织或器官如心脏、肺、肾脏、胰腺，或来自所述器官的细胞或组织来替代受损的组织或器官组成。然而，由于目前器官捐赠者的短缺，满足对捐赠组织的需求是不够的。通过移植来自特定繁殖的非人捐赠哺乳动物的组织或细胞可以消除所述的短缺。或者，从细胞系也可以获得替代细胞。这些细胞同样可以是人或非人来源的。

然而，每个非人细胞、组织或器官移植入人生物体(异种移植)或遗传上不同的人捐赠者细胞、捐赠者组织或捐赠者器官移植入人接受者(同种异体移植)具有免疫为介的移植排斥问题。所述排斥是基于存在于捐赠细胞上作为外源蛋白识别的组织相容性抗原，因此导致直接对抗移植的免疫反应。对抗同种异源或异种细胞、组织或器官的免疫反应是基于免疫系统不同细胞(例如，B细胞，T细胞，抗原提呈细胞)之间的多种复杂相互作用，因此最终导致移植细胞、组织或器官的排斥。为了抑制所述免疫反应，因此接受者必须用药物即“免疫调节剂”治疗，其抑制了免疫系统或带来了所述接受者对移植的耐受力，并因此抑制了这样的排斥。

所用免疫调节剂的实例是类固醇(强的松龙及衍生物)、calcineurine抑制剂(环孢菌素A，他克莫司)、雷帕霉素(雷伯霉素sirolimus)、mycophenolate mofetil(MMF)、硝基咪唑硫嘌呤(硫唑嘌呤)、淋巴细胞抗血清(ALG-抗白细胞球蛋白，ATG-抗胸腺细胞球蛋白)或单克隆抗体(抗CD25：ZENAPAX，SIMULECT)

而在移植后开始几周和几个月内抗体治疗是作为支援性治疗给药的(诱导治疗)，通常calcineurine抑制剂、类固醇常常和MMF或硫唑嘌呤给药于从移植开始至患者携带移植物的整个阶段，即有时候是其一生。然而，与常用的免疫调节物质的类型、作用模式及其结合无关，药物通常是静脉内或口服给药，因此分配至患者的整个体内。因此它们不只是达到它们的作用位点，即，移植的器官或组织，或已经获得移植细胞的位点，而且达到生命体所有的其它组织和器官。这导致了免疫防御的总抑制，不是限制于移植物。在非靶向组织和器官中，它们损伤了免疫系统的功能并因此防碍了许多器官的生理机能，这可能导致多种副作用。

就此而论，常规免疫调节治疗最重要的副作用是和高血压、对肾脏和肝脏的损伤、增大了条件性病原微生物感染的发生和增加了各种恶性退变如癌症和淋巴组织增生失调的比例。因此，例如，通常只有轻微症状进行的细胞肥大病毒感染可以导致免疫抑制患者肝炎、肺炎和脑膜炎的发展，且因此是移植接受者增加死亡率的主要原因(Transplantation Clinical Management(医治临床管理)，Vol.5，2000Medscape，Inc.，Web MD Health Network，NY，USA)。其他研究证实免疫抑制的同种异体移植接受者，在常规治疗后，会有高出三倍至四倍的癌症风险，其对于特定类型的癌症，甚至可增加20-500倍。此外，免疫调节剂，尤其是抑制免疫的，通常具有毒性特征，与它们对免疫系统的作用无关。因此，calcineurine抑制剂常常导致肾衰竭、高血压、高血脂和糖尿病的发展。此外药物的常规治疗极大地削弱了生命的质量并因此患者常常未进行至医学上需要的程度。

进一步的缺点是为了使整个循环分配后在移植部位仍然达到治疗活性浓度，需要给药相对高剂量的所述药物。这进一步促进或增加了所述副作用的发生。

为了对抗这些事实，近几年多种新的免疫治疗和伴随的诊断方法得到了发展。

例如，减少免疫调节副作用的经临床验证的方法由结合低浓度的新发展的免疫活性药物并与此替代标准治疗(例如，类固醇、环孢菌素A)组成。例如，这已经成功实现了移植同种异体胰岛细胞用于治疗糖尿病，其中结合使用daclizumab、雷伯霉素和低剂量血流谱阻遏了糖皮质激素的致糖尿病作用(Shapiro J.，The New England Journal ofMedicine(新英国医学杂志)，Vol.343，N.4，230-238，2000)。然而，即使通过这种治疗，也不可能避免所述组合中单个免疫调节剂的副作用，如，白细胞水平的降低、口溃疡和消化不良的发生。

另一个可能的治疗方法是通过给药新的免疫调节物质在患者中获得对外源组织的免疫耐受性。就此而论，耐受性表征为不存在对移植排斥的免疫反应不需要连续的免疫抑制。这种免疫调节物质根据本领域技术人员公知的常规方法给药(参见，例如，WO00/12138；WO97/41232；WO96/26274；WO01/8733；Ferrari-Lacraz等，The Journalof Immunology(免疫杂志)，2001，Vol.167pp.3478-3485；Kim等，TheJournal of Immunology(免疫杂志)，1998，160：5742-5748；Penn，Transplant Proc(移植会刊)，1991，23：1101；Beveridge等，Lancet，1984，1：788)。

常规治疗方法的一个缺点是免疫调节剂诱导的耐受性通常还全身给药(例如，心室内)的事实。另一个缺点是为了随后从外部给药于患者免疫调节剂必须作为治疗产物从天然来源分离或作为重组分子从生物技术制得的事实。然而，由于生产方面可以导致免疫调节剂不能以天然形式或重组分子分离得到或制得足够量或具有足够活性。此外，免疫调节剂的离体生产需要添加可能引起患者进一步健康风险的物质(例如，已经从动物生物体分离的物质并因此可能潜在地转移动物寄生物病)。作为该情况的结果，不可能以适当的方式对所用患者使用免疫调节剂来治疗或治疗可能与另外的健康风险相关联。

本发明范围内的目的是发展避免或减少了上述缺点的免疫治疗，尤其是，其显示了其免疫调节剂，尤其是抑制免疫剂，精确地作用于生命体中已经或可以激活免疫反应的位置，即，在移植细胞或器官的位置，并且同时使时间和数量可以调控的免疫调节作用成为可能。

根据本发明，通过可调控基因表达系统来控制免疫调节剂在细胞中的表达是可能的。

通过所述可调控的基因表达系统来局部(例如，在细胞移植体)和剂量生产免疫调节剂是可能的。先前还没有证明过这样的免疫调节剂的可调控生产。因此，在瞬时细胞培养实验中获得免疫调节剂MutIL-15/mFc可调控生产的发现是更加令人惊讶的(参见实施例1和Kim等，J.Immunology 1998，160，5742-5748)。

所述可调控表达系统使不再需要连续和全身或仅在低浓度给药免疫调节剂成为可能。

本发明另一个重要优势的事实是甚至在移植的位置，不需要产生免疫反应的连续抑制，如果从医学观点看这是不需要的，但是所述抑制只在需要时激活。这减少了副作用还有身体的变形，尤其是在移植区域。还意味着对患者物理和生理的缓解，由于他不需要连续地依赖免疫调节剂尤其是免疫抑制剂的给药。在本文中免疫抑制剂意思是完全或部分抑制生物体内特别是由细胞、组织和/或器官移植引起的免疫反应的物质。

此外，本发明提供了免疫调节剂不再需要从天然来源分离或重组制得和纯化的优势。以治疗活性的量和形式在接受者生物体内和/或在体内作用位点制得免疫调节剂，并因此保持其全部天然活性。

因此本发明的一方面涉及可移植的人或动物非全能性细胞，包括至少一种核酸，其在通过添加活性物质调控的基因表达系统控制下编码至少一种免疫调节剂。

根据本发明的核酸意思是RNA或DNA，尤其是基因组DNA、重组制得DNA、cDNA或例如在磷酰胺作用水平上合成的合成DNA。同样包括所述核酸的核苷酸组合和/或修饰。所述术语进一步包括单链和双链核酸。

还包括的是含有功能上连接成分例如编码一个或多个免疫调节剂的一个或多个基因或其活性部分的核酸，以及还有至少一种可调控基因表达系统，其活化状态是通过添加活性物质来调控的，以及还有可调控序列如启动子和调控核苷酸序列以及还有聚腺苷作用信号，例如SV40聚腺苷作用信号。如果它们以这样的方式连接所述成分是功能上连接的使基因或所含基因的序列将在转录调控影响下得到转录。

本发明的术语免疫调节剂基本上包括具有免疫调节作用的任何类型分子，尤其是抑制免疫的，例如蛋白质、融合蛋白和可溶配体，融合蛋白意思是通过两个或多个基因或基因片段连接产生的融合基因的表达产物。

例如如果通过改变或抑制受体结合的方式使生物体、细胞和/或组织的免疫反应基本上得到抑制的免疫调节作用是存在的。如果引起了对移植细胞、组织或器官的免疫耐受性的免疫调节作用同样存在。

例如，所述免疫调节剂的作用包括以下一个或多个的活性：

·抑制T细胞为介的抗原识别，

·抑制通过T细胞上受体为介的信号，

·激活通过T细胞上受体为介的信号，

·抑制T细胞的生长，

·抑制支持T细胞存活的分子，

·抑制T细胞的效应物分子(如TNF-α，IFN-γ)，

·抑制T细胞的粘着，

·抑制T细胞的协同刺激相互作用(通过两个信号产生淋巴细胞的激活：首先，进行通过抗原受体的刺激，其次，发生非标记淋巴细胞克隆扩增和分化的另一个信号；该协同刺激相互作用可以通过免疫调节剂抑制)，

·抑制更多参与免疫反应细胞如普通和特异性抗原提呈细胞，尤其，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞的活化、增殖、存活、抗原呈现、信号，和/或效应物功能，通过表面受体或通过分泌分子如细胞因子、趋化因子或生长因子抑制参与免疫反应的不同细胞如，普通和特异性抗原提呈细胞，尤其，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞的细胞相互作用，

·抑制参与免疫反应的细胞如特异性抗原提呈细胞，尤其是，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞，T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞的转移，

·抑制补体系统的成分，

·与外源或自体免疫抗原呈现结合或通过将抗体结合至抗原抑制

吞噬细胞的活性，和/或

·抑制炎症反应。

合适免疫调节剂的实例是抗体。尤其优选的抗体使IL-15、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、干扰素γ、TNF-α，CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD40、CD80、CD86或CD154或其受体。

同样优选的免疫调节剂是FasL、PD-L1或PD-L2。

进一步优选的免疫调节剂是IL-15、IL-10、IL-4、IL-2、干扰素γ或TGF-β，尤其是以融合蛋白的形式。融合蛋白尤其优选包括，首先，野生型IL-15、野生型IL-10、野生型IL-4、野生型干扰素γ或野生型TGF-β，以及其次，Fc片段。所述融合蛋白进一步尤其优选包括，首先，突变IL-15，优选位置101和108的Q”已经由“D”替代的那些，或突变IL-2，以及其次，例如通过铰链区融合至突变IL-15C末端的Fc片段(参见，例如，WO97/41232；Kim等，J.Immuno.(1998)，160(12)，5742-5748；WO01/87330)。

进一步优选的免疫调节剂是融合蛋白，首先，TNF-α受体(类型1或2)、ICOS、CTLA-4、PSGL-1、ICAM-1或VCAM-1，以及其次，Fc片段如EP417,563中公开的关于TNF受体融合蛋白的那些。

进一步优选的免疫调节剂是细胞因子受体或生长因子受体的分泌变体，如，IL-15Ralpha、IL-6、IL-7、IL-12、IL-17、IL-18受体，例如无跨膜结构域和细胞质粒尾部的变体，优选如含有Fc片段的融合蛋白。

Fc(片段，可结晶的)片段意思是抗体的片段，其不结合任何抗原，例如包括全部恒定结构域或除第一个恒定(部分或全部)结构域外全部恒定结构域的片段，如，包括铰链区、重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域的。Fc片段可以源自天然来源，重组/或合成制得。相应的方法是本领域技术人员公知的。就此而论，Fc片段与天然序列相比还可以具有一个或多个突变，例如包括构建融合蛋白合适切割位点的那些(参见Kim等，上文)。

本发明进一步的实施方案中，Fc片段是免疫球蛋白(Ig)G之一，尤其是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和/或类似哺乳动物IgG/或IgGM，尤其是人IgM或类似哺乳动物IgM和/或小鼠IgG2a。

免疫调节剂可以具有野生型序列或突变序列。优选，免疫调节剂已经以功能上活性的形式存在，例如功能上活性的可溶形式或功能上活性的病毒形式。可溶形式意思是未与细胞膜结合的分子，如，可溶受体分子。病毒形式意思是通过病毒基因组内源编码的同工型蛋白质，如病毒IL-10。

根据本发明的突变序列意思是含有偏离野生型序列的核苷酸或氨基酸序列，如由于一个或多个核苷酸或氨基酸的删除、添加、插入或取代，但是没有完全失去免疫调节作用。

因此根据本发明的突变免疫调节剂是与野生型序列具有序列同源性的分子，优选至少约80％，优选至少约90％，尤其优选至少约95％，最优选至少约99％。

根据本发明的序列同源性意思是两个序列相似性(阳性％)的程度，在多核苷酸的情况下，例如通过BLASTN 2.0.14测定，将滤器设定为“关“且BLOSUM＝62(Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，25：3389-3402)。可以使用普通序列同源性程序来检测序列同源性，例如互联网上 http：//www.hgsc.bcm.tmc.edu/SearchLauncher/。

根据本发明的术语可调控基因表达系统意思是编码基因开关分子的序列和基因开关结合序列的组合，通过添加活性物质来调控所述基因开关分子和所述基因开关结合序列的结合，因此控制靶基因的表达，在这种情况下靶基因编码免疫调节剂(也参见Burcin等，1998，Frontiersin Bioscience 3：c1-7)。

通常，通过结合合适的基因开关结合序列来激活或抑制基因开关分子靶基因的转录是可能的。激活可以基于提供了例如RNA聚合酶和/或有关转录因子接触位点的基因开关分子。可以通过将其和DNA结合的方式使基因开关分子阻塞转录复合体所需的DNA结合位点来导致抑制，因此例如使所述结合位点对RNA聚合酶和/或有关转录因子是隐蔽的。

活性物质的添加可以正性(激活)或负性(抑制)影响靶基因的转录。例如，在活性物质不存在的情况下靶基因是不表达的。添加活性物质后，后者结合至基因开关分子并因此引起活化并使所述基因开关分子和基因开关结合序列结合，借此随后启动了靶基因的转录。另一个实施例是在活性物质不存在的情况下基因开关分子和DNA结合并激活转录。活性物质添加和结合后，钝化了基因开关分子且停止了靶基因的转录。

术语基因开关分子意思是含有活性物质和转录激活结构域结合位点的分子，优选蛋白质，尤其融合蛋白，在活性物质结合后该分子改变了其激活状态。

根据本发明的术语基因开关结合序列意思是定位于优选为基因翻译起点(+1)5’上游的核酸序列或其活性部分，编码免疫调节剂，其核酸序列控制靶基因的转录，尤其对于转录率和/或组织特异性，或控制翻译。将具有启动子活性的调控核酸序列，同样优选具有增强子活性，和所述基因开关结合序列间接或直接结合。

本发明可调控基因表达系统的功能可以如下描述，例如：

如果没有基因开关分子和基因开关结合序列结合，就不会表达成对的靶基因，且在这种情况下，不会产生免疫调节剂。

例如，当加入活性物质时，后者和基因开关分子的二聚结构域结合。该结合在二聚结构域中产生了构象改变，其导致了两个基因开关分子的二聚作用并随后和基因开关结合序列结合。该结合使基因开关分子的活化结构域接近最小的TATA启动子并因此启动了编码免疫调节剂的成对靶基因的转录。活性物质已经加入后，解除了基因开关分子和基因开关结合序列的结合，因此，停止靶基因的表达。

因此，通过添加活性物质并然后和基因开关结合位点结合，本发明的基因开关分子是可以调控的，例如抑制或激活，优选激活。

优选的活性物质意思是通过其基因开关导致一个基因或多个基因直接或间接调控表达的药物学上相容的物质，例如米非司酮、四环素、强力霉素或雷帕霉素。

本发明的调控基因表达系统尤其是含有表示人工合成转录因子的基因开关的黄体酮基因表达系统，由GAL4-DNA结合结构域(Gal4-DBD)、源自具有平端配体结合位点的突变黄体酮受体的二聚结构域(hPR-LBD)，和人NF-κB蛋白质p65亚基的活化结构域(p65-AD)组成。基因开关结合序列是例如由17个核苷酸GAL4结合序列跟随最小的TATA启动子组成的核苷酸序列，相应靶基因是成对的。这种具有基因开关组成Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD的可调控基因表达系统得到了描述，例如，Wang等，1994，PNAS 91：8180-8184或Wang等，1997，Gene Therapy(基因治疗)4：432-441。适于该系统的活性物质实例是米非司酮，在哺乳动物中不产生的人造激素类似分子且其特异性地和基因开关分子的二聚结构域结合并通过因此导致的二聚作用激活后者。

本发明进一步的可调控基因表达系统是四环素基因表达系统，其表示了通过四环素(Tet)或衍生的强力霉素(Dox)诱导的系统，在该系统中基因开关分子由Tet反式激活蛋白组成。所述反式激活蛋白(tTA)是VP16活化结构域和Escherichia coli(大肠杆菌)Tet阻遏物(TetR)的融合蛋白。在四环素不存在的情况下，tTA对于其基因开关结合位点、Tet应答序列(TRE)具有高度亲和性，并激活靶基因的表达。活性物质四环素的添加抑制了DNA结合并因此激活靶基因。该可调控基因表达系统得到了描述，例如，Gossen 1995，Science 268：1766-1769；Fruh 1995，Nature 375：415-418；Chao等，1998，Mol.Cell.Biol.18(8)：4883-4898；Halappnavar等，1999，J.Biol.Chem.274(52)：37097-37104或Van der Vlag等，2000，J.Biol.Chem.275(1)：697-704。

该调控Tet系统的改进是反向反式激活蛋白(rtTA)。在该系统中，野生型TetR已经由突变TetR(rTetR)取代，结果，只在强力霉素存在下融合蛋白结合至DNA的基因开关结合位点，并因此诱导成对的靶基因，如所述的，例如，Gossen 1995，Science 268：1766-1769；Gossen等，PNAS 89：5547-5551；Linstedt等，1997，Mol.Biol.Cell 8：1073-1087；Mehlen等，1998，Nature 395：801-804或Joosse等，2000，Hum.Mol.Genet.9：3075-3082。

本发明进一步的可调控基因表达系统是雷帕霉素基因表达系统。这包括蛋白质FKBP12和FRAP的可诱导二聚作用，其是通过活性物质雷帕霉素为介的。这两个蛋白质的二聚作用导致结合至FRAP的活化结构域的DNA结合并因此接通了成对的靶基因。这种可调控基因表达系统得到了描述，例如，Rivera等，1996，Nature Med 2：1028-1032。

可以通过本领域技术人员熟知的方法给药所述的活性物质，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、颅内、眶内、囊内、脊柱内、透过肌肉、局部地、口服或通过粘膜，例如鼻腔或口腔。给药方法的进一步实施例是全身或局部注射、灌注或基于导管的给药。合适的口服剂型是片剂或胶囊。通过肺进行给药，例如，通过喷雾和在皮肤下植入dispositories形式通过皮肤。公开了透皮治疗系统(TTS)，例如，EP 0944 398-A1、EP 0 916 336-A1、EP 0 889 723-A1或EP 0 852 493A1。

细胞优选是可移植的。根据本发明可移植的意思是可以移植至相同生命体不同位点或不同(接受者)生命体的活细胞，所述细胞优选是无肿瘤发生细胞，或者如果细胞是源自肿瘤细胞，为了抑制其增生在移植前适当地处理所述细胞(例如，通过钝化有丝分裂)(参见，例如，WO00/64459和US5,175,103；Pleasure等，(1992)，The Journal ofNeuroscience(神经科学杂志)，12(5)：1802-1815)。

本发明的可移植人或动物非全能性细胞尤其是哺乳动物细胞，包括人细胞，和源自例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选来自人。

本发明的细胞实例是上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、心脏细胞、皮肤细胞、肌细胞、神经细胞、骨髓细胞、骨细胞、软骨细胞、血细胞、结缔组织细胞和胰腺、肾脏、眼睛或肺细胞。

非全能性细胞意思是不能独立发展成其完整生物体的细胞。

进一步的实施方案中，细胞是干细胞、前体细胞和/或永生化细胞。优选是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人的干细胞。尤其优选源自成人组织的干细胞但不限制于此，此外包括新生儿干细胞、骨髓干细胞、间叶细胞干细胞、造血干细胞、上皮干细胞以及还有消化道、皮肤、脂肪组织、肠、胎盘和胰管的干细胞。

本发明的细胞还包括含有上述本发明的细胞并在所述组织或器官移植入相同或不同人或动物生物体之前/或之后将其引入人或动物生物体的组织或器官中。

优选实施方案涉及以细胞系形式的本发明的细胞。

例如可以通过本领域技术人员熟知方法，例如转染、转化或感染使用上述本发明的核酸转化或感染细胞系制得本发明的细胞系。

本发明进一步的实施方案中，核酸还编码了选择盒，尤其是合适的转染标记基因和/或分化标记基因。

根据本发明的选择盒是编码至少一种基因的核酸序列，该基因导致特定细胞的特异性选择，例如转染的或分化的细胞。

例如，这种分化标记基因、转染标记基因和受体基因用于选择是可能的。用作这样的基因是主要基因其介导了对特定毒性物质的抗性，例如抗生素。就此而论最常用的抗生素是新霉素、潮霉素(hph)、zeocin(SH ble)和嘌呤霉素(pacA)。例如这种基因的其它实例尤其对于选择干细胞的基因是调控荧光标记例如GFP的基因，通过其经荧光辅助细胞分选(FACS)可以纯化所选择的细胞。选择标记的其它实例是表面分子，例如生长因子受体，通过其经磁性免疫珠子可以富集细胞(Bonini C.，Science Vol 276，1719-1724，1997)。其它实例是编码酶活性的基因(例如，胸苷激酶)，其将毒性物质的前体“前体药物”(例如，鸟嘌呤)转变至毒性物质。在这种情况下，可能发生负选择，即，只有不表达基因启动子上游的细胞存活。

本发明选择盒的进一步可能基因是lacZ(编码β-内酰胺酶)、β-内酰胺酶、氯霉素转乙酰酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(XGPRT)。本领域技术人员熟知确保或增强所述基因功能所用的合适试剂，例如另外的核酸序列。

优选实施方案中，核酸另外编码了抑制NK细胞和/或杀伤细胞的分子，优选人MHC I型分子、嵌合的MHC I型分子或病毒MHC I型同系物。

杀伤细胞作为带有自发或后天细胞毒素潜能单核细胞的异质群体是本领域技术人员公知的。NK细胞(天然杀伤细胞)意思是天然存在的杀伤细胞，即，其不是免疫反应的结果且因此不是抗原特异性诱导的。

本发明进一步涉及编码至少一种免疫调节剂的核酸和至少一种通过添加活性物质调控的基因表达系统，如以上已经更详细地描述。

同样优选核酸编码至少一种控制基因表达的序列。例如，这些序列意思是启动子或调控核酸序列。这些以及表达载体(以下将更详细说明)可以给核酸表达创造合适的条件。表达载体通常包括所有情况下适于特定细胞或转录基因的启动子。

启动真核生物中组成型表达的可调控序列的实例是通过RNA聚合酶III识别的启动子。例如用于所有细胞和组织类型组成型表达的这种启动子是pGK(磷酸甘油酸激酶)启动子、CMV(细胞肥大病毒)启动子、TK(胸苷激酶)启动子、EF1α(延伸因子1-α)启动子、SV40(猿猴病毒)启动子、RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子和pUB(泛素)启动子。

启动真核生物中细胞或组织特异性表达的可调控序列实例是启动子或启动子激活剂序列或编码只在特定细胞类型中表达的蛋白质的那些基因的增强子。这样的启动子实例是用于胰腺β细胞的胰岛素启动子、用于神经细胞的Sox-2启动子、用于肌细胞的肌球蛋白重链启动子、用于内皮细胞的VE-钙粘着蛋白启动子和用于上皮细胞的角蛋白启动子。

启动真核生物中可调控表达的可调控序列的进一步实例是结合对应阻遏物的四环素操纵基因(Gossen M等，(1994)Curr.Opin.Biotechnol.5，516-20)。

同样可以通过涉及影响数量和/或以时间函数表达的调控核苷酸序列来控制表达。它们包括，例如，增强子序列、前导序列、聚腺苷酸化序列、IRES序列、内含子、绝缘体序列和阻遏物序列。

本发明的核酸可以定位于一个或多个核酸分子上。然而根据本发明，在多个核酸分子的情况中，这些必须功能上协作。根据本发明，例如(i)基因开关分子的序列，(ii)在基因开关结合位点调控下的免疫调节剂序列和(iii)选择标记的序列定位于三个不同的核酸分子上是可能的。由于基因开关分子在核内的转录，翻译后在细胞质中产生的基因开关蛋白质可能在核内依次和免疫调节剂序列的基因开关结合位点结合并调控其表达。

因此本发明进一步还涉及包括至少一种本发明核酸的载体。

根据本发明可能的载体是质粒、穿梭载体、噬菌体、装配型质粒、腺病毒载体、逆转录病毒载体、表达载体和基因治疗中活性的载体。

根据本发明的表达载体包括至少一种本发明的核酸、至少一种翻译启动信号、一个翻译终止信号和/或一个用于在真核生物中表达的聚腺苷酸化信号。

这种表达载体，尤其用于哺乳动物细胞中表达的，其中是可购得的，例如pIRES(Clontech，Heidelberg，DE)、pCI-neo载体(Promega，Mannheim，DE)、pCMV-Script(Stratagene，La Jolla，USA)和pcDNA3载体(Invitrogen，Karlsruhe，DE)或从各个序列可以单独装配的。

根据本发明的在基因治疗中是活性的载体实例是质粒载体、病毒载体，例如腺病毒载体、逆转录病毒载体或基于RNA病毒复制子的病毒(参见，例如，Lindemann等，1997，Mol.Med.3：466-76；Springer等，1998，Mol.Cell.2：549-58；Khromykh，2000，Crrr.Opin.Mol.Ther.2：555-69)。

基因治疗中活性的载体还可以通过将本发明的核酸载体片段和脂质体复合获得。脂质转染法包括通过超声波降解脂质体悬浮液来自阳离子脂质的小单层脂质体的制备。将DNA通过离子键结合至脂质体表面，并以保留净正电荷和使质粒DNA100％与脂质体符合的比例。除了脂质体混合物DOTMA(1，2-二油酰氧丙基-3-三甲基溴化铵)和DPOE(二油酰氧磷脂酰乙醇胺)，同时已经合成了多种新的脂质制剂并测试了它们在各种细胞系中的转染效能(Behr等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6982-6986；Gao和Huang，1991，Biochem.Biophys.Acta 1189，195-203；Felgner等，1994，J.Biol.Chem.269，2550-2561)。所述新脂质制剂的实例是DOTAP，(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N，-三甲铵硫酸乙酯)和DOGS(TRANSFECTAM；二十八烷基氨基甘氨酰精胺)。提高核酸转移进入细胞的赋形剂的可能实例是结合DNA的蛋白质或肽或合成的肽DNA分子，其能够使核酸转移进核内(Schwartz等，1999，Gene Therapy 6：282；Branden等，1999，Nature Biotechs.17：784)。赋形剂还可以包括使核酸释放进入细胞细胞质的分子(Planck等，1994，J.Biol.Chem.269，12918；Kichler等，1997，Bioconj.Chem.8，213)或，例如，脂质体(Uhlmann和Peimann，1990，Chem.Rev.90，544)。本发明的细胞还可以用于表达异种基因。

可以通过转染(例如，电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀)或传染将基因治疗载体引入细胞中。

本发明进一步涉及药物，其包括至少一种本发明的细胞和合适的赋形剂和/或添加剂。

本发明的药物可以用于预防和/或治疗疾病，例如

(a)风湿性失调，例如风湿性关节炎、斯耶格伦综合症、硬皮病、皮肌炎、多肌炎、赖特综合症或贝赫切特病，

(b)I型糖尿病或LADA，

(c)甲状腺的自体免疫疾病，例如格雷夫斯病，

(d)中心神经系统的自体免疫疾病，例如多发性脑脊髓硬化症，

(f)皮肤疾病，例如牛皮癣或神经性皮炎，

(g)炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或节段性回肠炎，

(h)免疫失调，

(j)血管病和

(j)由移植引起的疾病，例如移植排斥。

例如用于稳定和/或保护药物的合适赋形剂和添加剂通常是本领域技术人员熟知的。它们包括，例如，生理盐水、林格葡萄糖、林格乳酸盐、威斯康星大学溶液/ViaSpan(Belzer UW)、EuroCollins溶液、DMSO、乙二醇、蔗糖、海藻糖、Ficoll、全氟化碳、软化水、稳定剂、抗氧化剂、复合试剂、抗微生物化合物、蛋白酶抑制剂和/或惰性气体。

根据适于特定类型细胞、组织或器官的方法将本发明的药物给药于其通常给药的。这种方法是本领域技术人员熟知的。根据此，可以给药药物，例如，

·静脉内给药于肝脏细胞

·肌内或通过基于导管给药于心肌细胞，和

·皮下、静脉内、腹膜内、胶囊封装的或肌内给药于β细胞。

药物可以通过离体方法引入器官，其中细胞从患者取出，遗传修饰，例如通过DNA转染，然后再引入所述患者中，或者通过本发明载体的体内方法，载体在基因治疗中是活化的，以裸露DNA的形式引入患者体内，或通过使用本发明的病毒或非病毒载体或本发明的细胞。

已知药物的剂量依赖于多个因素，例如患者的体重、健康的常规状态、体表的大小、年龄以及和其他药物的相互作用。剂量也依赖于给药的类型。因此，通过本领域技术人员决定对每个患者单个情况的剂量。药物可以每天或数天给药一次或数次；这也可以由本领域技术人员来决定。

本发明进一步涉及人或动物器官特异性组织和/或人或动物哺乳动物器官，其包括至少一种本发明的细胞。

根据本发明的术语器官特异性组织和哺乳动物器官包括，例如，哺乳动物器官心脏、皮肤、胰腺、肾脏、肝脏、肌肉、神经、眼睛、肺、骨髓、软骨、骨、导管、结缔组织和所述器官各自的组织。

本发明还涉及包括至少一种本发明细胞的转基因非人哺乳动物。

例如，转基因动物通常显示了核酸组织特异性增强的表达并因此非常适于分析免疫反应。优选使用转基因小鼠。

本发明的非人哺乳动物的实例是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、猫或猴子。

本发明进一步涉及本发明细胞、本发明人或动物器官特异性组织和/或本发明人或哺乳动物器官用于移植至人或哺乳动物的用途。本发明的移植优选是自体移植、同种异体移植或异种移植。

本领域技术人员可以理解移植为将活材料，例如细胞、组织或器官转移或移植至相同生物体的不同位点(自体移植)或从一个生物体(捐赠者)至另一个生物体(接受者)。在移植至不同生物体的情况中，区别在于

·同种移植，其中捐赠者和接受者属于相同种并通常全部或基本上是相同的，

·同种异体移植，其中捐赠者和接受者属于相同种但是免疫遗传上是不同的，和

·异种移植，其中捐赠者和接受者不属于相同种且因此免疫遗传完全不同。

本发明进一步涉及本发明细胞、本发明人或动物器官特异性组织和/或本发明人或哺乳动物器官用于抑制哺乳动物或人移植排斥的用途。

根据本发明的哺乳动物意思是例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、猫或猴子。

本领域技术人员可以理解移植排斥是接受者生物体排斥移植的材料，例如细胞、组织或器官的过程。所述排斥是细胞和体液免疫引起的。所述排斥的原因是移植的材料和接受者之间蛋白质结构的不同。转移组织的蛋白质结构通过接受者免疫系统识别如致免疫的，因此引起免疫反应。

本发明进一步涉及本发明细胞、本发明人或动物器官特异性组织和/或本发明人或哺乳动物器官用于预防和/或治疗由移植引起的疾病和/或自体免疫疾病的用途。这样疾病的实例已经在上文本发明药物应用字段中得到了描述。

例如可以通过将本发明的细胞、组织和/或器官引入人或哺乳动物来进行根据本发明的用于抑制移植排斥和用于预防和/或治疗由移植引起的疾病和/或自体免疫疾病的用途。本发明免疫调节剂的表达是通过本发明的可调控基因表达系统来控制的。所述控制是通过给药或停止给药本发明的活性物质来进行的，因此激活或钝化基因开关分子。在激活的情况中，基因开关激活了编码免疫调节剂的靶基因转录。作为结果表达的所述免疫调节剂基本上抑制了免疫系统对移植细胞、组织或器官的防御反应，尤其是在人或哺乳动物生物体的移植区域。

可以通过从上皮细胞、内皮细胞、肝脏细胞、非全能性胚胎干细胞和非全能性胚胎胚细胞的衍生物或来自成人组织的干细胞中选择本发明的细胞来获得基于使用细胞的治疗。源自成人组织的干细胞优选包括神经元干细胞、骨髓干细胞、间叶细胞干细胞、造血干细胞、上皮干细胞，消化道、皮肤、脂肪组织、肠、胎盘和胰管的干细胞，将其引入人或哺乳动物。

本发明还涉及制备本发明细胞的方法，该方法包括以下步骤：

a.将至少一种本发明的核酸和/或至少一种本发明的载体引入可移植人或动物非全能性细胞中，和

b.添加至少一种合适的调控基因开关分子的活性物质来表达所述核酸。

为了将根据本发明的核酸、载体、分化标记基因或转染标记基因或细胞引入本发明的细胞中，使用本领域技术人员熟知的转染、转化、电穿孔或注射的标准方法。

之前已经描述了引起或增强所述核酸表达的合适条件。这些包括，例如，表达载体、启动子和可调控核酸序列如增强子、聚腺苷酸化序列。

本发明还涉及本发明人或动物器官特异性组织和/或本发明人或哺乳动物器官的体外制备方法，所述方法包括以下步骤：

a.将至少一种本发明的核酸和/或至少一种本发明的载体和至少一种分化标记基因引入至少一种非全能性干细胞、非全能性前体细胞和/或非全能性永生化细胞中，

b.分化步骤a的细胞，

c.选择步骤b的分化细胞，和

d.将步骤c所选的细胞引入人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官中。

进一步的实施方案中，本发明的所述体外方法优选在步骤a之后、之前或同时将至少一种合适的转染标记基因引入非全能性干细胞、非全能性前体细胞和/或非全能性永生化细胞中，并优选在步骤a之后选择步骤a的转化细胞。

例如可以通过胚胎体形式，优选通过在溶液中培养细胞，通过高密度培养细胞，通过细胞集合，通过去除喂养细胞上培养物，去除分化抑制物质(例如，LIF或喂养细胞调节的培养基)，通过添加细胞因子、生长因子、激素、维生素(例如烟酰胺)、视黄酸、丁酸钠或DMSO至培养细胞中或通过添加公知的起始分化的其它物质来诱导含有本发明核酸细胞的分化。

选择细胞的多种方法是已知的。

从分化的胚胎干细胞中选择细胞的方法得到了描述，例如，Kiug等(J.Clin.Invest.1996Jul 1；98(1)：216-24)和Soria等(Diabetes.2000Feb.；49(2)：157-62)。

一个优选的选择方法中，本发明的选择盒包括标记基因，那是对抗生素抗性的基因。在分化步骤之中或之后添加合适的抗生素后通过浓缩分化细胞来选择或分离细胞。只有表达标记基因的分化细胞是对抗生素抗性的。未分化的细胞死亡。还可以通过相同方法进行转化细胞的选择。

本发明抗生素的意思是通过用作本发明选择盒的抗生素抗性基因产生抗性的抗生素。将抗生素添加至培养的干细胞后，基本上只有含有报告基因表达载体的那些干细胞存活并分化。

同样可能使用的选择方法是其中本发明选择盒的基因编码荧光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和/或黄色荧光蛋白。通过荧光激活细胞分选(FACS)的方式分离或通过亲和纯化选择来选择细胞。

进一步可能是通过磁性免疫珠子的方式借助表面分子例如生长因子受体来浓缩细胞(Bonini C.，Science Vol.276，1719-1724，1997)

优选，可以将第二个标记基因引入细胞，因此使进行根据本发明体外方法步骤a将核酸和/或载体已经成功引入其中的细胞的选择成为可能。该双选择使获得所需细胞约90％、优选约95-100％、纯制剂成为可能。

本发明进一步涉及本发明转基因非人哺乳动物的生产方法，该方法包括以下步骤：

a.将至少一种本发明的核酸和/或至少一种本发明的载体和至少一种合适的转染标记基因引入至少一种的非人哺乳动物卵母细胞、干细胞、前体细胞和或永生化细胞中，

b.选择步骤a的转染细胞，

c.将根据步骤b所选的细胞引入至少一种非人哺乳动物胚细胞中，

d.将步骤c的胚细胞或步骤d的胚胎引入非人哺乳动物代母中，和

e.鉴定从所述胚胎发展而来的转基因非人哺乳动物。

优选实施方案中，干细胞是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。

本发明进一步涉及本发明转基因非人哺乳动物的生产方法，该方法包括以下步骤：

a.将至少一种本发明的核酸和/或至少一种本发明的载体和至少一种合适的转染标记基因引入非人哺乳动物受精卵母细胞两个原核中的一个，

b.将步骤a的哺乳动物卵母细胞引入非人哺乳动物代母中，和

c.鉴定从所述胚胎发展而来的转基因非人哺乳动物。

优选已经和接受血管切片的雄性交配而呈现假孕的非人哺乳动物代母。

将胚胎/或卵母细胞引入代母的方法是本领域技术人员公知的。例如可以通过注射入输卵管或子宫的方式来进行所述的引入(参见，例如，Hogan，B.，Beddington，R.，Constantini，F和Lacy，E.，A LaboratoryManual(1994)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，173-181页)。

例如可以通过从所述转基因非人哺乳动物中如从小鼠尾部提取基因组DNA来鉴定转基因非人哺乳动物。子序列PCR(聚合酶链式反应)分析中，使用的引物是特异性识别本发明转基因核酸的。通过该方式可以来检测所述转基因进入基因组的整合性。

还可能的是通过Southern印迹的方式来进行鉴定。在这种情况中，基因组DNA转移至膜并通过DNA探针的方式来检测，例如放射性同位素示踪的DNA探针，其对所寻找的转基因是特异性的。

通过再生非人干细胞、卵母细胞、前体细胞或永生化细胞来获得转基因非人动物尤其是转基因小鼠的本发明转基因非人哺乳动物的生产方法是本领域技术人员公知的，例如DE19625049和US4,736,866；US5,625,122；US5,698,765；US5,583,278和US5,750,825，并包括可以通过例如将本发明的表达载体直接注射入胚胎或精母细胞或通过将表达载体转染入胚胎干细胞而产生的转基因动物(参见，例如，Polites和Pinkert：DNA Microinjection and Transgenic Animal Production(DNA微注射和转基因动物生产)，15-68页，Pinkert，1994：Transgenic AnimalTechnology：A Laboratory Handbook(转基因动物：实验室手册)，Academic Press，London，UK(学术出版社，英国伦敦)；Houdebine1997，Harwood  Academic Publishers，Amsterdam，The Netherlands(Harwood学术出版社，荷兰阿姆斯特丹)；Doetschman：Gene Transferin Embryonic Stem Cells(胚胎干细胞的基因转移)，115-146页，Pinkert，1994，上文；Wood：Retrovirus-Mediated Gene Transfer(逆转录病毒介导的基因转移)，147-176页，Pinkert，1994，上文；Monastersky：GeneTransfer Technology：Alternative Technique and Application(基因转移技术：选择性的技术和应用)，177-220页，Pinkert，1994，上文)。

同样制备转基因动物尤其是转基因小鼠的多种方法是本领域技术人员公知的，特别是WO98/36052，WO01/32855，DE19625049，US4,736,866，US5,625,122，US5,689,765，US5,583,278和US5,750,825，并包括例如通过将本发明载体直接注射入胚胎或精母细胞或通过将载体或核酸转染入胚胎干细胞而产生的转基因动物(也参见Polites和Pinkert，Pinkert，(1994)Transgenic Animal Technology：A LaboratoryHandbook(转基因动物：实验室手册)，Academic Press，London，UK(学术出版社，英国伦敦)，15至68页；Doetschman，Pinkert，1994，上文，115至146页)。

进一步实施方案中，用于制备本发明人或动物器官特异性组织和/或本发明人或哺乳动物器官的本发明所述体外方法中和本发明产生转基因非人哺乳动物方法中的干细胞是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。

本发明还涉及已经通过上述本发明方法产生的转基因非人哺乳动物和所述哺乳动物的后代。

本发明进一步涉及使用本发明转基因非人哺乳动物来获得用于同种异体移植和/或异种移植的人或动物细胞、人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官。

例如，可以通过植入方法的方式或通过导管注射方法的方式通过血管壁来进行细胞移植。

根据本发明的获得意思是从本发明转基因非人哺乳动物的生物体中获取所述细胞、组织和/或器官。

本发明进一步涉及本发明转基因非人哺乳动物、本发明细胞、本发明人或动物器官特异性组织和/或本发明人或哺乳动物器官用于发现药物学上有效物质和/或用于鉴定毒性物质的用途。

例如，这种方法可以包括将本发明细胞接种于例如96孔微滴定平板上，接着加入要研究的药物学活性或毒性物质，然后通过细胞计数的方式来分析，是否所述物质已经导致死亡细胞数量的增加。

根据本发明的术语药物学有效物质和毒性物质意思是在合适的条件下对人或哺乳动物的单个细胞、单个组织、单个器官或整个生物体产生药物学或毒性影响的所有那些分子、化合物和/或组合物和物质混合物。可能的药物学有效物质和毒性物质可以是简单化学(有机或无机)分子或化合物、核酸或核酸类似物、核酸反义序列、肽、蛋白质或复合物和抗体。实例是源自物质库的有机分子并研究了其药物学或毒性活性。

例如，药物学活性物质是影响以下的物质：

·细胞分裂和/或存活能力，

·蛋白质分泌，例如来自胰腺β细胞的胰岛素，来自神经细胞的多巴胺，

·肌细胞收缩和/或，

·细胞迁移行为，

·细胞代谢活性，

·细胞电生理活性，

·细胞产物的酶活性，

·细胞分化，

·细胞成组织或器官的机体组成。

运用至人或哺乳动物整个有机体，这意思是影响，例如，

·心血管系统，

·内分泌系统，

·肠胃系统，

·神经系统和

·代谢活性。毒性物质是有效物质的实例，其

·跟随特定的信号例如应力，刺激细胞进入凋亡，

·影响心血管系统，

·影响神经系统和/或，

·影响代谢活性。

鉴定的药物学有效物质和毒性物质可以适当地和合适的添加剂和/或赋形剂结合或一起使用来制备诊断试剂或预防和/或治疗由移植引起的疾病和/或自体免疫疾病的药物，如通过之前实施例中的方式来进行。

本发明还涉及：

(i)人或动物非全能性细胞，包括至少一种核酸，在通过添加活性物质调控的基因表达系统控制下编码至少一种免疫调节剂。

(ii)根据(i)的细胞，特征在于细胞是干细胞、前体细胞和/或永生化细胞。

(iii)根据(i)或(ii)的细胞，特征在于是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。

(iv)根据(i)至(iii)至少一种的细胞是细胞系形式的。

(v)根据(i)至(iv)至少一种的细胞，特征在于可调控的基因表达系统是黄体酮基因表达系统、四环素表达系统和/或雷帕霉素基因表达系统。

(vi)根据(i)至(v)至少一种的细胞，特征在于免疫调节剂具有至少一种以下的功能特征：

a.抑制T细胞介导的抗原识别，

b.抑制通过T细胞上受体介导的信号，

c.激活通过T细胞上受体介导的信号，

d.抑制T细胞生长，

e.抑制支持T细胞存活的分子，

f.抑制T细胞的效应物(如TNF-α、IFN-γ)，

g.抑制T细胞的粘着，

h.抑制T细胞的协同刺激相互作用(通过两个信号进行淋巴细胞的激活：首先，进行通过抗原受体的刺激，其次，产生非标记淋巴细胞克隆扩增和分化的另一个信号；该协同刺激相互作用可以通过免疫调节剂来抑制)，

i.抑制参与免疫反应的更多细胞的活化、增殖、存活、抗原提呈、信号，和/或效应物功能，如普通和特异性抗原提呈细胞，尤其，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞，通过表面受体或通过分泌分子如细胞因子、趋化因子或生长因子抑制参与免疫反应的不同细胞的细胞相互作用，如，普通和特异性抗原提呈细胞，尤其，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞，

j.抑制参与免疫反应细胞的转移，如特异性抗原提呈细胞，尤其是，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞，T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞，

k.抑制补体系统的成分

l.结合外源或自体免疫抗原呈现或通过将抗体结合至抗原来抑制吞噬细胞活性，和/或

m.抑制炎症反应。

(vii)根据(i)至(vi)至少一种的细胞，特征在于免疫调节剂是抗体。

(viii)根据(i)至(vi)至少一种的细胞，特征在于免疫调节剂是

a.受体，

b.可溶分泌受体，

c.分泌蛋白质或肽。

(ix)根据(viii)的细胞，特征在于免疫调节剂是突变IL 15和Fc片段的融合蛋白，将所述Fc片段融合至突变IL 15分子的C末端，优选通过铰链区。

(x)根据(ix)的细胞，特征在于抗体的Fc片段是IgG的Fc片段，尤其是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或类似哺乳动物IgG或IgM，尤其是人IgM或类似哺乳动物IgM。

(xi)根据(i)至(x)中至少一种的细胞，特征在于核酸另外编码了选择盒，尤其是合适的转染标记基因和/或分化标记基因。

(xii)根据(i)至(xi)中至少一种的细胞，特征在于核酸另外编码了抑制NK细胞和/或杀伤细胞的分子。

(xiii)根据(i)至(xii)中至少一种的细胞，特征在于核酸另外编码了抑制以下细胞的分子

a.树状细胞，

b.单核细胞和/或巨噬细胞，

c.B细胞，

d.多形核细胞，例如嗜中性粒细胞。

(xiv)根据(xiii)的细胞，特征在于所述抑制分子是人MHC I型分子、嵌合的MHC I型分子或病毒MHC I型同系物。

(xv)核酸，编码至少一种免疫调节剂和至少一种通过添加活性物质来调控的基因表达系统。

(xvi)载体，包括至少一种根据(xv)的核酸。

(xvii)药物，包括根据(i)至(xiv)任一的至少一种细胞和合适的赋形剂和/或添加剂。

(xviii)人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官，包括根据(i)至(xiv)任一的至少一种细胞。

(xix)转基因非人哺乳动物，包括根据(i)至(xiv)任一的至少一种细胞。

(xx)根据(i)至(xiv)任一的细胞和/或根据(xviii)的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官用于移植入人或哺乳动物的用途。

(xxi)根据(xx)的用途，特征在于其是同体移植、同种异体移植或异种移植。

(xxii)根据(i)至(xiv)任一的细胞、根据(xv)的核酸、根据(xviii)的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官用于制备抑制人或哺乳动物移植排斥药物的用途，其中适合在至少一种免疫调节剂的存在下。

(xxiii)根据(i)至(xiv)任一的细胞、根据(xv)的核酸、根据(xviii)的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官用于制备预防和/或治疗由移植引起的疾病和/或自体免疫疾病药物的用途。

(xxiv)根据(i)至(xiv)任一细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：

c.将至少一种根据(xv)的核酸和/或至少一种根据(xvi)的载体引入可移植人或动物非全能性细胞中，和

d.添加至少一种合适的调控基因开关的活性物质来表达所述核酸。

(xxv)根据(xviii)的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官的体外制备方法，该方法包括以下步骤：

e.将至少一种根据(xv)的核酸和/或至少一种(xvi)的载体以及至少一种分化标记基因引入至少一种非全能性干细胞、非全能性前体细胞和/或非全能性永生化细胞中，

f.分化步骤a的细胞，

g.选择步骤b的分化细胞，和

h.将步骤c所选的细胞引入人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官中。

(xxvi)根据(xxv)的方法，特征在于步骤a之后、之前或同时将至少一种合适的转染标记基因引入至少一种非全能性干细胞、非全能性前体细胞和/或非全能性永生化细胞中，并择优在步骤a之后选择步骤a的转化细胞。

(xxvii)根据(xxv)和(xxvi)之一的方法，特征在于干细胞是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。

(xxviii)根据(xix)的转基因非人哺乳动物的生产方法，该方法包括以下步骤：

f.将至少一种根据(xv)的核酸和/或至少一种根据(xvi)的载体和至少一种合适的转染标记基因引入非人哺乳动物的至少一种卵母细胞、干细胞、前体细胞和或永生化细胞中，

g.选择步骤a的转染细胞，

h.将根据步骤b所选的细胞引入至少一种非人哺乳动物胚细胞中，

i.将步骤c的胚细胞引入非人哺乳动物代母中，和

j.鉴定从所述胚胎发展而来的转基因非人哺乳动物。

(xxix)根据(xxviii)的方法，特征在于干细胞是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。

(xxx)根据(xix)的转基因非人哺乳动物的生产方法，该方法包括以下步骤：

d.将至少一种根据(xv)的核酸和/或至少一种根据(xvi)的载体和至少一种合适的转染标记基因引入非人哺乳动物两个受精卵母细胞原核中的一个，

e.将步骤a的哺乳动物卵母细胞引入非人哺乳动物代母中，和

f.鉴定从所述胚胎发展而来的转基因非人哺乳动物。

(xxxi)转基因非人哺乳动物，特征在于是通过根据(xxviii)和(xxix)之一的方法来生产的。

(xxxii)转基因非人哺乳动物，特征在于是根据(xxx)哺乳动物的后代。

(xxxiii)根据(xix)、(xxx)和(xxxi)任一的转基因非人哺乳动物用于获得同种异体移植和/或异种移植的非人细胞、非人器官特异性组织和/或非人哺乳动物器官的用途。

(xxxiv)根据(xix)、(xxx)和(xxxi)任一的转基因非人哺乳动物、根据(xviii)的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官用于寻找药物学上有效物质和/或用于鉴定毒性物质的用途。

以下的图和实施例用来说明本发明但并非是对其的限制：

图1描绘了转染17×4/IL 15/寡+pcDNA3开关+/-米非司酮的培养基上清液的免疫印迹分析(实施例3)；

图2描绘了本发明基因表达系统作用机理的原理图，其可以通过添加活性物质来调控。

本发明的基因开关是由以下三个功能单位组成的嵌合蛋白：

i)Gal4DNA结合结构域(Gal4-DBD)，其识别基因开关结合结构域UAS。本发明的UAS序列包括17个核苷酸序列基元的四个拷贝，每个基元可以作为两个Gal4-DBD分子的结合位点。

ii)人黄体酮受体的平端配体结合结构域(PR-LBD)，其介导了活性物质米非司酮和基因开关的结合，并通过二聚作用导致基因开关蛋白转化成活性构象。

iii)p65活化结构域(p65-AD)，其通过基因开关激活了靶基因的转录。

在不存在米非司酮的情况下，通过上游普遍存在的弱碱性的最小胸苷激酶启动子(pTK)转录少量的基因开关。然而，这些基因开关分子是作为单体存在的并因此还不能结合任何DNA区域或启动转录。添加活性物质米非司酮后，激活了基因开关系统。配体结合基因开关的同型二聚体结合任何含有UAS序列的DNA区域(如，用于MutIL15-mFc的TATA启动子调控基因的可调控区域上游)并因此激活了免疫调节蛋白质的转录。因此，此外，带有UAS序列的DNA区域定位于基因开关蛋白质基因的TK启动子的上游，同时在自调控反馈机理下激活了所述基因开关蛋白质自身的转录，因此增加了活性基因开关的数量。

从细胞系制得的本发明的可移植细胞可以进一步包括标记基因，例如对抗生素新霉素(Neo-R)和潮霉素(Hygro-R)抗性的。通过普遍存在的启动子如磷酸甘油酸激酶启动子(pGK)调控的标记基因来选择用于DNA构建体摄取的细胞。通过细胞类型特异性启动子如大鼠胰岛素启动子(RIP)控制的标记基因来选择特异性细胞类型的转基因细胞。

为了产生本发明的转基因动物，细胞必须至少含有序列1和2。为了从细胞系制备转基因细胞，细胞还可以含有序列3。

实施例

为了研究和证明免疫调节蛋白MutIL-15/mFc调控表达的作用方式，发展了两个实验模型：

a)用于移植的转基因细胞系

在该模型中，用载体构建体转染干细胞，除了用于MutIL-15/mFc免疫调节剂可调控表达的序列，该载体构建体还包含能够制备特异细胞类型(例如，胰岛素产生细胞)的选择盒(参见US5,733,727)。这样从未分化的转基因干细胞制备和分离特异细胞类型的分化细胞是可能的。这些转基因分化细胞可以移植入合适的受体小鼠中(例如，糖尿病小鼠)。如果用米非司酮处理移植的小鼠，移植细胞自身产生MutIL-15/mFc并因此防止了它们自己的排斥。

b)转基因小鼠模型

产生的转基因小鼠其基因组含有通过添加米非司酮导致MutIL-15/mFc可调控表达的构建体。由于MutIL-15/mFc表达是通过普遍存在的启动子来调控的，当通过添加米非司酮刺激后小鼠产生了MutIL-15/mFc。可以从转基因动物中取出器官(例如，心脏、肾脏)或细胞(小岛细胞、神经元细胞)并移植进另一个非转基因小鼠中。当用米非司酮处理移植小鼠时，移植器官/细胞自身产生了MutIL-15/mFc并因此防止了它们自己的排斥。

实施例1：用于转基因小鼠模型的载体克隆

17×4/pGL3碱性载体中的荧光素酶基因(来自Promega的修饰pGL3碱性载体，带有TATA盒和作为基因开关结合位点的17个寡聚物的4个拷贝)用突变IL-15蛋白质和小鼠Fc部分的融合蛋白(相当于以下的MutIL-15/mFc：Kim等，The Journal of Immunology(免疫杂志)，1998，160：5742-5748)的基因替代，其另外含有CD5前导序列(Jones H.，Nature 323(6086)，346-349，1986)。作为结果，CD5-MutIL-15/mFc基因通过SV40polyA序列终止(载体名称：174×/IL 15)。随后，将含有SbfI和Pme I切割位点的寡核苷酸引入17寡聚物的上游(载体名称：17×4/IL15/寡)。所述切割位点用于将基因开关分子基因引入(GS＝Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD)，包括上游调控区域(Gal4UAS-PTK-IVS8)，其是从pswitch载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)分离的(载体名称：17×4/IL 15/寡/GS)。或者和另外地，制备载体，其中IVS8内含子(同样来自pswitch)插入TATA盒和CD5-MutIL-15/mFc基因起始密码子之间(载体名称：17×4/IL 15/寡/IVS8/GS)。所有克隆产物片段之间的翻译通过测序来检测。

实施例2：用于来自胰岛素生成细胞转基因体外移植的载体克隆

制备这些载体和用于转基因小鼠模型的载体相似。然而，这些质粒另外还含有包括大鼠胰岛素启动子(RIP)调控的新霉素抗性基因(neo)和小鼠磷酸甘油酸激酶(pGK)调控的潮霉素抗性基因(hygro)的片段。将这些序列插入CD5-MutIL-15/mFc基因下的5’并以两个转录方向交替克隆(载体名称：17×4/IL 15/寡/RIPnh/GS和17×4/IL15/寡/RIPnh/GS)。或者和另外，制备载体，其中IVS8内含子(同样来自pswitch)插入TATA盒和CD5-MutIL-15/mFc基因起始密码子之间(载体名称：17×4/IL15/寡/RIPnh/IVS8/GS和17×4/IL15/寡/RIPnh/IVS8/GS)。所有克隆产物片段之间的翻译通过测序来检测。

实施例3：实施例1和2提及载体中的CD5-mutIL15-mFc可调控表达 和分泌的检测

进行cos-7细胞(DSMZ，Brunswick，Germany)和A293细胞(Quantum，Montreal，Canada)的瞬时转染。为了该目的，在转染前一天将5-7.5×10⁵个细胞/孔接种于6孔平板上。在所有情况下通过将10ng/ml浓度的10-20μl的DNA和250μl OptiMEM-I培养基(LifeTechnologies，Karlsmhe，Germany)混合以1-2μg DNA/孔进行转染。平行试验中，在所有情况下将2μl Lipofectamine2000(Life Technologies，Karlsruhe#11668-019)/μgDNA和250μl OptiMEM-I培养基(LifeTechnologies，Karlsmhe#31985-062)混合。两个混合物等体积混合，并在室温下放置20分钟。同时，将含有50-70％融合细胞的6孔平板用PBS洗涤一次然后在所有情况下加入1.5ml生长培养基/孔(DMEM+10％FCS)。所有情况下将DNA/Lipofectamine混合物每孔逐滴加至所述细胞。所有情况下用米非司酮刺激的细胞另外接受了2μl的80％乙醇(Invitrogen，Karlsmhe，Germany)中的10-5M米非司酮溶液(Sigma，Deisenhofen，Germany；终浓度10-8M)。第二天，除去培养基并加入2ml新鲜培养基(DMEM+10％FCS)。在此所有情况下用米非司酮刺激的细胞再次另外接受了2μl米非司酮。转染3天后，从细胞除去培养基，离心除去细胞残余物，随后在-80℃冷冻保存。细胞用PBS洗涤一次，刮至PBS中，转移至1.5ml的Eppendorf管中，并在所有情况下用50μl RIPA缓冲液(含有1％IGEPAL的PBS/Sigma，DeisenhofenI-3021，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，4mM EDTA和完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物/Roche，Mannheim，Germany，#1873580)在4℃溶解30-60分钟。离心的溶解产物在液氮中速冻并保存于-80℃。

通过识别融合蛋白小鼠Fc部分的ELISA分析CD5-mutIL15-mFc分泌。为此，所有情况下96孔平板(Nunc，Wiesbaden，Germany#439454)用100μl抗小鼠IgG2a抗体(R11-89克隆，BD PharMingen，Heidelberg，Germany#02251D-553446)在37℃覆盖一小时。为了饱和非特异性结合位点，随后将平板用PBS洗涤三次并用DMEM+10％FCS在37℃培养一小时。所有情况下将100μl未稀释的培养基上清液运用于覆盖的平板，然后将其在室温下培养1小时，随后用200μl PBS/0.1Tween20洗涤5次和用200μl PBS洗涤一次。为了检测小鼠Fc部分，酶联合的HRP抗小鼠IgG2a抗体，R11-89克隆(BD PharMingen，Heidelberg#02017E-553391)同样再次和平板在室温下培养1小时，然后如上所述再次将平板洗涤。添加含有OPD底物溶液(25ml的0.1M柠檬酸，25ml的0.1M磷酸氢二钾，加至100ml的H₂O+1OPD片剂(Sigma Deisenhofen#P8412)+40μlH₂O₂，30％)后通过颜色反应来观察结合的融合蛋白的数量，通过添加3M HCl停止反应后，在ELISA阅读490nm处测量(μQuant，BIO-TEK Instrument Inc.)。

进一步，通过免疫印迹分析未稀释的培养基上清液。为了该目的，将培养基上清液和Lammli样品缓冲液混合，加热至92℃5分钟，然后运用至12.5％强聚丙烯酰胺凝胶并在150V下分级电泳。随后将蛋白质转移至硝化纤维素膜(Schleicher u.Schuell，Dassel，GermanyCD0564-1)。用5％的奶粉/PBS/0.1％Tween20处理膜来饱和非特异性结合位点。然后用1∶500稀释的小鼠抗人IL 15抗体(Becton-Dickinson，Heidelberg#554712)在4℃培养16小时，用PBS/0.1％Tween20大面积洗涤，然后用1∶3000稀释的过氧化物酶联合的绵羊抗小鼠抗体(Amersham，Freiburg.Germany#NA9310)在室温下处理一小时。大面积洗涤后，用检测试剂(NEN：Bad Homburg，Germany#NE103E)在室温下处理膜5分钟，通过使用X射线涂膜检测颜色反应。

添加或未添加米非司酮转染细胞的培养基上清液分析显示了以下结果：

进行了以下转染：

1.mCD5.6(MutIL-15/mFc分泌的正向控制，在CMV启动子控制下含有CD5-MutIL-15/mFc的载体)

2.17×4/IL 15/寡+/-米非司酮(无基因开关的负向控制)

3.17×4/IL 15/寡+pcDNA3开关+/-米非司酮

4.17×4/IL 15/寡/GS+/-米非司酮

5.17×4/IL 15/寡/GS+pcDNA3开关+/-米非司酮

6.17×4/IL 15/寡/IVS8/GS+/-米非司酮

7.17×4/IL 15/寡/IVS8/GS+pcDNA3开关+/-米非司酮

用无基因开关分子的对照载体(2.)转染的细胞中和没有用米非司酮刺激的细胞中没有观察到MutIL-15/mFc的显著表达。用仅仅含有自体调控基因开关分子(4.+6.)的构建体转染后，通过ELISA检测米非司酮刺激后MutIL-15/mFc只有轻微增加。这可能是由于在瞬时转染过程中通过自体调控基因激活的活性基因开关分子的形成不够。因此，通过一贯促进高基因开关产生的pcDNA3开关载体(在CMV启动子控制下的基因开关)共转染外部地增加了基因开关的数量。这些共转染中，用同时含有无基因开关(3.)和含有基因开关构建体(5.+7.)转染的细胞培养基上清液，用米非司酮处理后，通过ELISA检测MutIL-15/mFc的增加量。

表1：测量瞬时转染的A293细胞培养基上清液中的MutIL-15/mFc(复制的平均数)

	构建体	pcDNA3开关	米非司酮	M490Corr.
					1	mCD5.6	-	-	1.750
2	17×4/IL 15/寡	-	+	0.006
					3	17×4/IL 15/寡	+	-	＜0.000
	17×4/IL 15/寡	+	+	0.067
					4	17×4/IL 15/寡/GS	-	-	＜0.000
	17×4/IL 15/寡/GS	-	+	0.006
					5	17×4/IL 15/寡/GS	+	-	0.004
	17×4/IL 15/寡/GS	+	+	0.019
					6	17×4/IL 15/寡/IVS8/GS	-	-	0.006
	17×4/IL 15/寡/IVS8/GS	-	+	0.009
					7	17×4/IL 15/寡/IVS8/GS	+	-	0.010
	17×4/IL 15/寡/IVS8/GS	+	+	0.022

转染3.(图1)培养基上清液的免疫印迹分析同样证明了在米非司酮刺激后MutIL-15/mFc(50kDa条带)增加量的产生(泳道1)，与未刺激细胞(泳道2)相比较。

这些结果证明了可以通过将米非司酮添加进上述载体(例如，17×4/IL 15/寡/IVS8/GS)转染的细胞中来诱导MutIL-15/mFc融合蛋白的转录和分泌。这证明了调控MutIL-15/mFc表达的功能。

实施例4：实施例1和2提及的载体中基因开关蛋白质(Gal4UAS- PTK-IVS8-Gal4-DBD/hPR-LBD/p65-AD)的调控表达和功能的检测

如上所述，在只产生自体调控基因开关的瞬时转染细胞中的活性基因开关分子的数量(用17×4/IL 15/寡/GS和17×4/IL 15/寡/IVS8/GS转染)是低的。

由于ELISA不够敏感，为了检测单个细胞水平的MutIL-15/mFc表达，进行pGene/V5-His/lacZ质粒(Invitrogen，Karlsruhe)共转染。该载体含有lacZ基因，其转录同样通过基因结合位点来调控，意味着只在由于米非司酮刺激而刺激性地含有活性基因开关的那些细胞中产生β半乳糖苷酶。所述基因开关通过第二个载体提供(在这种情况下，构建体带有自体调控基因开关)。通过单个细胞中蓝色沉淀的底物反应成来检测β半乳糖苷酶。因此在实质上较高的灵敏度下检测载体构建体的功能是可能的。

如实施例3所述，用以下构建体转染A293细胞然后部分用米非司酮刺激：

1.pCMVβ(正向控制lacZ，在CMV启动子控制下含有lacZ基因的载体)

2.17×4/IL 15/寡+pGene/V5-His/lacZ+/-米非司酮(无基因开关的负向控制)

3.17×4/IL 15/寡/GS+pGene/V5-His/lacZ+/-米非司酮

4.17×4/IL 15/寡/IVS8/GS+pGene/V5-His/lacZ+/-米非司酮

5.pcDNA3开关+pGene/V5-His/lacZ+/-米非司酮(组成型高基因开关的正向控制)

6.pGene/V5-His/lacZ-米非司酮(无基因开关的负向控制)

转染后第三天，用-20℃冰冷甲醇混合细胞，用PBS洗涤3次，然后用lacZ染色溶液(60μl的400mM铁氰化钾，60μl的400mM铁氰化钾，60μl的200mM MgCl₂，300μl的20mg/ml X-Gal，5.52ml的PBS)在37℃处理2.5小时。

通过光学显微镜测定转染细胞给出了以下结果(表2)：

表2：瞬时转染的A293细胞的β半乳糖苷酶染色的强度

	构建体	用pGene/V5-His/lacZ共转染	添加米非司酮	结果
					1	pCMVβ	-	-	***
2	17×4/IL 15/寡	+	-	(*)
						17×4/IL 15/寡	+	+	*
3	17×4/IL 15/寡/GS	+	-	(*)
						17×4/IL 15/寡/GS	+	+	***
4	17×4/IL 15/寡/IVS8/GS	+	-	-
						17×4/IL 15/寡/IVS8/GS	+	+	***
5	pcDNA3开关	+	-	***
						pcDNA3开关	+	+	*****
6	pGene/V5-His/lacZ	-	-	-

*：染色强度的程度

观察到无基因开关(2.)细胞没有明显蓝色染色。自体调控基因开关(3.+4.)转染的细胞中，用米非司酮刺激导致3-5％细胞明显的蓝色染色。

由于这低量细胞只产生极小量的MutIL-15/mFc，所述量低于ELISA检测极限。然而，在单个细胞中用lacZ染色来记录和检测基因开关活性还是可能的。

这些实验证明通过17×4/IL 15/寡/GS和17×4/IL 15/寡/IVS8/GS构建体提供的活化基因开关的能力在用米非司酮刺激后对lacZ转录的作用。因此这些数据证明了上述构建体自体调控基因开关的功能。

实施例5：转基因小鼠的制备和表征

用限制性内切酶Eco47III和NotI切割50μg构建体17×4/IL 15/寡/GS和17×4/IL 15/寡/IVS8/GS的DNA，然后各自纯化所需的4800bp和4924bp片段。然后将所述片段注入C3HeB/FeJ小鼠的原核中，随后将胚胎植入假孕雌性体中。从获得的小鼠中提取基因组DNA，并通过PCR分析检测转基因的整合性。以下是所述PCR分析中所用的引物：GS-IL 15FW.2(5’-TAT GGC TTC TGA GGC GGA AAG AAC CAG C-3’)和GS-IL15RV.3(5’-G CAG AGA CCC CAT GGG CAT GGT GGCTAG-3’)。因此，获得的PCR产物长度各自是211bp(无内含子)和335bp(带有IVS8内含子)。

从注射17×4/IL 15/寡/GS构建体卵母细胞获得的44只小鼠中，16只动物(36％)是转基因的。

起始动物(F0代)和野生型DBA/2小鼠交配，获得的F1后代再次检测转基因的基因组存在。随后将转基因F1动物检测MutIL-15/mFc的调控表达。约8-16周大小时，每隔一天给小鼠腹膜内注射250μg/kg溶解于芝麻油的米非司酮(Sigma，Deisenhofen M 8046)，总共三次。最后一次注射后的一天将动物处死，从组织中提取RNA和蛋白质。然后通过ELISA和蛋白质印迹分析组织中基因开关蛋白质和免疫调节剂的表达。为了测定转录的基因开关和免疫调节剂的量，通过定量反转录PCR(RT-PCR)来检测RNA的量。

在所有情况下，根据制造者的说明通过扩展反转录酶(ExpandReverse Transcriptase)(Roche，Mannheim)将1μg RNA转录进cDNA。随后通过光循环快速启动DNA程序SYBR绿色试剂盒(Light Cycle FastStart DNA Master SYBR Green Kit)(Roche，Mannheim)研究基因开关和免疫调节剂MutIL-15/mFc的定量表达。检测免疫调节剂的PCR条件如下：

变性：95℃，600秒

循环：95℃15秒，60℃5秒，72℃10秒。

引物CD5.6-FW：5’-CCTGCTGGGGATGCTGGTC

引物CD5.6-RV：5’-TTTTCCTCCAGTTCCTCACATTC

MgCl₂：3mM

检测基因开关的PCR条件如下：

变性：95℃，600秒

循环：95℃15秒，53℃5秒，72℃10秒。

引物GS-FW：5’-GACTTAAAAAGCTCAAGTCAAGTGCTCCAAAG

引物GS-RV：5’-TATATCCTGTAAAGAATCCAT

MgCl₂：3mM

此外，在米非司酮处理之前和之中定时间隔地从动物取血，并通过ELISA测定其中所含的MutIL-15/mFc量。

相同大小和相同转基因系而先前没有用米非司酮处理的小鼠作为对照。

或者，用两步法来制备转基因小鼠。首先，产生两个不同系的转基因小鼠，其只表达基因开关分子(系“A”)或只表达通过基因开关位点调控的免疫调节剂(系“B”)。获得的A系转基因小鼠品系中，选择那些表达合适量基因开关分子的动物并在第二步骤中和B系转基因动物交配。然后将获得的后代检测两个转基因的同时表达。在这种方式中，获得了双转基因系“A/B”，其表达免疫调节剂受到基因开关分子的调控。

用合适的限制性内切酶切割50μg pswitch构建体(用于系“A”)或17×4/IL 15/寡和17×4/IL 15/寡/IVS8/GS构建体(用于系“B”)的DNA，并纯化所需的片段。然后将所述片段注入C3HeB/FeJ小鼠的原核中，随后将胚胎植入假孕雌性体中。从获得的小鼠中提取基因组DNA，并通过PCR分析检测转基因的整合性。

实施例6：来自转基因小鼠捐赠者器官的小岛移植

小岛移植包括将从小鼠胰腺分离的小岛注入糖尿病小鼠的肾囊下(Ferrari-Lacraz等，The Journal of Immunology(免疫杂志)，2001，Vol.167pp.3478-3485)。捐赠小岛是从DBA/2J品系转基因小鼠中分离的，其在基因开关控制下表达MutIL-15/mFc。为了在器官切除那天可检测产生的MutIL-15/mFc，用米非司酮(250μg/kg)预处理捐赠小鼠。为了制备小岛，捐赠者胰腺原地灌注了IV型胶原酶(2mg/ml；Worthington Biochemical Corp.)。37℃消化30分钟后，通过不连续Ficoll梯度纯化小岛并随后在含有5.6mM葡萄糖的RPMI1640培养基(Gibco，Karlsruhe)中培养。然后在接受者肾囊下移植300-400个小岛。

接受者是6-10周大的非转基因B6AFl小鼠，其中通过腹膜内注射β-细胞毒素链脲菌素(225mg/kg；Sigma，Deisenhofen)已经诱导了糖尿病。作为对照将同源小岛(即，B6AFl小鼠的小岛)移植入糖尿病小鼠中。

将胰腺小岛无菌移植至左肾囊下。为了该目的，将小鼠麻醉并在左肋弓下进行切口。将左肾移出腹腔并在肾囊较低的顶点形成短切口。使用无菌钝头套管，在肾囊下形成口袋。然后通过无菌吸管尖端将小岛注入该空腔内。随后，将肾脏放回腹腔内并将腹部关闭。从移植那天往前，接受者小鼠每隔一天用米非司酮(250μg/kg)处理以致它们连续产生MutIL-15/mFc。

通过常规血糖测量(Accu-Check III；Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)来监控同种异体移植机能。在糖尿病诱导之前和之后以及小岛移植之后，定时间隔地从动物尾部静脉或眼球后静脉丛取血并测定血糖含量。在取血之间使用尿素测试条带进行另外的控制。主要移植机能定义为移植后3-5天血糖含量低于11.1mmol/l(200mg/dl)。在观察主要移植机能后，如果至少连续两天血糖水平已经增加至高于500mg/dl，就认为是移植排斥。

作为对照，进行小岛移植，其中动物没有接受任何米非司酮并因此也没有表达任何基因开关调控的MutIL-15/mFc，或其中动物用外部添加MutIL-15/mFc进行了处理。

从转基因捐赠小鼠获得的小岛细胞移植后，用所述方式处理的小鼠可以更好地调控它们的血糖水平并显示了米非司酮处理后细胞移植排斥的降低。

实施例7：异位心脏移植

异位心脏移植包括将捐赠心脏和接受者腹部内大血管连接(Ono等，J.Cardiovasc.Surg.1969，Corry等，Transplantation 1973)。从基因开关控制下表达MutIL-15/mFc的DBA/2J品系转基因小鼠分离捐赠心脏。为了在器官切除那天可检测产生的MutIL-15/mFc，用米非司酮(250μg/kg)预处理捐赠小鼠。分离麻醉小鼠的腔静脉并注射肝素(400U/kg)使其分配至整个循环。随后通过割开腹部血管使动物出血并通过胸骨正中切开术使心脏暴露。分离主动脉和肺管并割开，用4-10个Tevdek(Deknatal，Queens Village)将肺静脉和腔静脉全部绑扎。取出后立即将心脏保存于4℃生理盐水中(Physiolosol，Abbot Laboratories，Illinois，USA)。将接受者(6-8周大的非转基因B6AFl小鼠)的下腔静脉和腹部主动脉暴露，给血管提供松散配合的血管夹。捐赠者主动脉的末端和接受者腹主动脉一侧相连接，通过8-0个Prolene缝合。以相同的方式将捐赠者的肺动脉融合至接受者的主动脉。除去血管夹并用林格乳酸盐溶液在37℃加热捐赠者心脏以致心脏开始自发地收缩。从移植那天往前，接受者小鼠每隔一天用米非司酮(250μg/kg)处理以致它们连续产生MutIL-15/mFc。每隔一天通过腹壁触摸跳动的心脏来检查移植存活并在脉搏强度和频率的基础上以1+至4+的等级来评价。当心肌收缩不再可触知时就认为心脏排斥。如果捐赠者心脏跳动时间比未处理对照动物心脏长，排斥就得到了防止。作为对照，进行心脏移植，其中动物没有接受任何米非司酮并因此也没有表达任何基因开关调控的MutIL-15/mFc，或者其中动物用外部添加MutIL-15/mFc进行了处理。

这个实施例显示了那些用米非司酮处理的动物异位心脏移植保持了较长时间的机能，与未处理动物比较。

实施例8：转基因ES细胞系的制备

用限制性内切酶Eco47III和NotI切割100μg构建体17×4/IL15/寡/RIPnh/GS、17×4/IL 15/寡/RIPnh/GS、17×4/IL 15/寡/RIPnh/IVS8/GS和17×4/IL 15/寡/RIPnh/IVS8/GS的DNA，纯化片段并重悬浮于至少100μl无菌PBS中。然后通过电穿孔的方式将构建体17×4/IL15/寡/RIPnh/GS和17×4/IL15/寡/RIPnh/IVS8/GS引入SVJ129或R1系的小鼠ES细胞中。为了该目的，将按指数规律生长的ES细胞胰蛋白酶化、分离并计数。用5-10ml冷PBS洗涤约3×10⁷个细胞两次，然后取出冷PBS中的细胞球以致最终体积，包括DNA，是800μl。随后将消化的DNA加入细胞中，混合溶液并在冰上培养至少10分钟。在无菌操作台上将细胞/DNA混合物装入0.4cm电极裂缝的预冷电穿孔小管中(BioRad，Munich，Germany)。使用Genepulser 2装置(BioRad，Munich)在0.8kV和3μF进行电穿孔。然后将细胞和ES细胞培养基(DMEM含有20mM Hepes，15％热灭活FCS，50U/ml青霉素，50U/ml链霉素，0.1mM非必需氨基酸，0.1mM巯基乙醇，10³U/ml白血病抑制因子)混合并平均分配到覆盖0.1％明胶的10个10cm的细胞培养皿中。第二天，通过添加200μg/ml潮霉素(Sigma，Deisenhofen H 3274)至ES细胞培养基中开始选择。选择细胞用于吸收构建体约5-9天，在无菌操作台上人工分离单个转基因克隆并转移至96孔平板上。在到达合生之前将细胞排出并接连放置在48孔平板、24孔平板、6孔平板和10cm培养皿中。

添加10nM米非司酮后，通过定量RT-PCR检测细胞克隆基因开关和MutIL-15/mFc的可调控表达或通过ELISA和蛋白质印迹分析来检测MutIL-15/mFc(如以上实施例3和4中所述)。

或者，转基因ES细胞以两步法制得。首先，产生只表达可调控方式基因开关分子的转基因ES细胞。在获得的转基因细胞系中，选择表达合适量基因开关分子的那些克隆。第二步中，这些克隆用编码由基因开关结合位点调控的免疫调节剂的DNA构建体超转染。如实施例5中所述的，获得的双转基因系通过RT-PCR来检测两个转基因的同时表达。在该方式下，获得表达基因开关分子-调控免疫调节剂的双转基因ES细胞。

如上所述，用合适的限制性内切酶切割100μg基因开关构建体的DNA，纯化所需片段，重悬浮于无菌PBS中并通过电穿孔将其引入ES细胞。由于构建体给予了对抗生素zeocin的抗性，可以通过所述抗生素处理来选择成功转染的细胞。从获得的细胞分离转基因克隆，并通过定量RT-PCR研究米非司酮添加和基因开关分子表达的函数。在第二步中，这些表达合适量基因开关分子的克隆用纯化的构建体17×4/IL15/寡/RIPnh和17×4/IL15/寡/RIPnh/IVS8的Eco47III/NotI片段通过电穿孔再次超转染，并通过潮霉素处理来选择用于第二个转基因的吸收。通过基因组DNA的PCR分析来检测两个转基因的同时整合性。

如以上实施例5中已经描述的，添加10nM米非司酮后，通过定量RT-PCR来检测获得的双转基因细胞克隆的基因开关和MutIL-15/mFc的可调控表达或通过ELISA和印迹分析来检测MutIL-15/mFc。

随后，从获得的细胞系中选择那些克隆，其只在添加米非司酮后产生和分泌足够量的免疫调节剂MutIL-15/mFc。

实施例9：从转基因ES细胞制得的胰岛素生成细胞的移植

在移植之前，从未分化的潮霉素抗性ES细胞系制得在基因开关控制下表达MutIL-15/mFc的胰岛素生成细胞，Soria等(Diabetes.2000Feb.；49(2)：157-62)。

在移植前用米非司酮处理胰岛素生成细胞以致产生足够量的MutIL-15/mFc。

随后，将1百万个胰岛素生成细胞注入C57BL/6小鼠肾囊下(如实施例7中所述的)或脾脏中(Soria等Diabetes.2000Feb.；49(2)：157-62)中，小鼠由于链脲菌素处理是糖尿病的。从移植那天往前，接受者动物每隔一天用米非司酮(250μg/kg)处理以致它们连续产生MutIL-15/mFc。

通过常规血糖测量(Accu-Check III；Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)来监控同种异体移植机能。主要移植机能定义为移植后3-5天血糖含量低于11.1mmol/l(200mg/dl)。如之前观察了主要移植机能，如果至少连续两天血糖水平已经增加至高于500mg/dl，就认为是移植排斥。

作为对照，将从相同细胞系制得的但是没有用米非司酮预处理并因此也没有表达任何基因开关调控MutIL-15/mFc的胰岛素生成细胞移植入接受者动物中。或者，还可能的是使用含有MutIL-15/mFc构建体但没有基因开关的胰岛素生成细胞。

已经接受源自干细胞的胰岛素生成细胞之后用外部添加MutIL-15/mFc处理的动物作为进一步的对照。

已经接受从干细胞制得的胰岛素生成细胞动物的血糖水平的研究显示了细胞移植在用米非司酮处理的动物中的功能活性时间是相对长的。

Claims (35)

1.人或动物的非全能性细胞，包括至少一种核酸，所述核酸在由添加活性物质调控的基因表达系统控制下编码至少一种免疫调节剂。

2.如权利要求1所述的细胞，特征在于细胞是干细胞、前体细胞和/或永生化细胞。

3.如权利要求1或2所述的细胞，特征在于其是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。

4.如权利要求1至3至少一种所述的细胞，其是细胞系的形式。

5.如权利要求1至4至少一种所述的细胞，特征在于可调控的基因表达系统是黄体酮基因表达系统、四环素表达系统和/或雷帕霉素基因表达系统。

6.如权利要求1至5至少一项所述的细胞，特征在于免疫调节剂具有至少一种以下的功能特征：

a.抑制T细胞介导的抗原识别，

b.抑制通过T细胞上受体介导的信号，

c.激活通过T细胞上受体介导的信号，

d.抑制T细胞生长，

e.抑制支持T细胞存活的分子，

f.抑制T细胞的效应物(如TNF-α、IFN-γ)，

g.抑制T细胞的粘着，

h.抑制T细胞的协同刺激相互作用(通过两个信号进行淋巴细胞的激活：首先，进行通过抗原受体的刺激，其次，产生非标记淋巴细胞克隆扩增和分化的另一个信号；该协同刺激相互作用可以通过免疫调节剂来抑制)，

i.抑制参与免疫反应的更多细胞的活化、增殖、存活、抗原提呈、信号，和/或效应物功能，如普通和特异性抗原提呈细胞，尤其，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞，通过表面受体或通过分泌分子如细胞因子、趋化因子或生长因子抑制参与免疫反应的不同细胞的细胞相互作用，如，普通和特异性抗原提呈细胞，尤其，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞、T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞，

j.抑制参与免疫反应细胞的迁移，如特异性抗原提呈细胞，尤其是，例如，树状细胞和单核细胞/巨噬细胞，T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞，

k.抑制补体系统的成分，

l.结合外源或自体免疫抗原呈现或通过将抗体结合至抗原来抑制吞噬细胞活性，和/或

m.抑制炎症反应。

7.如权利要求1至6至少一种所述的细胞，特征在于免疫调节剂是抗体。

8.如权利要求1至6至少一项所述的细胞，特征在于免疫调节剂是

d.受体，

e.可溶分泌受体，

f.分泌蛋白质或肽。

9.如权利要求8所述的细胞，其中免疫调节剂是突变IL15和Fc片段的融合蛋白，所述Fc片段融合至突变IL15分子的C末端，优选通过铰链区融合。

10.如权利要求9所述的细胞，特征在于抗体的Fc片段是IgG的Fc片段，尤其是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或类似哺乳动物IgG或IgM，尤其是人IgM或类似哺乳动物IgM。

11.如权利要求1至10至少一项所述的细胞，特征在于核酸另外编码了选择盒，尤其是合适的转染标记基因和/或分化标记基因。

12.如权利要求1至11至少一项所述的细胞，特征在于核酸另外编码了抑制NK细胞和/或杀伤细胞的分子。

13.如权利要求1至11至少一项所述的细胞，特征在于核酸另外编码了抑制以下的分子：

a.树状细胞，

b.单核细胞和/或或巨噬细胞，

c.B细胞，

d.多形核细胞，例如嗜中性粒细胞。

14.如权利要求13所述的细胞，特征在于所述抑制分子是人MHC I型分子、嵌合的MHC I型分子或病毒MHC I型同系物。

15.一种核酸，编码至少一种免疫调节剂和至少一种由添加活性物质调控的基因表达系统。

16.一种载体，包括至少一项如权利要求15所述的核酸。

17.一种药物，包括至少一项如权利要求1至14任一所述的细胞和合适的赋形剂和/或添加剂。

18.人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官，包括至少一种如权利要求1至14任一项所述的细胞。

19.转基因非人哺乳动物，包括至少一种如权利要求1至14任一项所述的细胞。

20.如权利要求1至14任一项所述的细胞和/或如权利要求18所述的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官用于移植入人或哺乳动物的用途。

21.如权利要求20所述的用途，特征在于是自体、同种异体或异种移植。

22.如权利要求1至14任一项所述的细胞、如权利要求15所述的核酸、如权利要求18所述的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官用于制备抑制人或哺乳动物移植排斥药物的用途，其中合适的是至少存在一种免疫调节剂。

23.如权利要求1至14任一项所述的细胞、如权利要求15所述的核酸、如权利要求18所述的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官用于制备预防和/或治疗由移植引起的疾病和或自体免疫疾病药物的用途。

24.一种制备如权利要求1至14任一项所述细胞的方法，该方法包括以下步骤：

c.将至少一种如权利要求15所述的核酸和/或至少一种如权利要求

16所述的载体引入可移植人或动物非全能性细胞中，和

d.添加至少一种合适的调控基因开关的活性物质来表达所述核酸。

25.一种体外制备如权利要求18所述的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官的方法，该方法包括以下步骤：

e.将至少一种如权利要求15所述的核酸和/或至少一种如权利要求16所述的载体以及至少一种分化标记基因引入至少一种非全能性干细胞、非全能性前体细胞和/或非全能性永生化细胞中，

f.分化步骤a的细胞，

g.选择步骤b的分化细胞，和

h.将步骤c所选的细胞引入人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官中。

26.如权利要求25所述的方法，特征在于步骤a之后、之前或同时将至少一种合适的转染标记基因引入至少一种非全能性干细胞、非全能性前体细胞和/或非全能性永生化细胞中，并择优在步骤a之后选择步骤a的转染细胞。

27.如权利要求25和26之一所述的方法，特征在于干细胞是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。

28.如权利要求18中所述的转基因非人哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤：

f.将至少一种如权利要求15所述的核酸和/或至少一种如权利要求16所述的载体和至少一种合适的转染标记基因引入非人哺乳动物的至少一种卵母细胞、干细胞、前体细胞和/或永生化细胞中，

g.选择步骤a的转染细胞，

h.将根据步骤b所选的细胞引入至少一种非人哺乳动物胚细胞中，

i.将步骤c的胚细胞引入非人哺乳动物代母中，和

j.鉴定从所述胚胎发展而来的转基因非人哺乳动物。

29.如权利要求28所述的方法，特征在于干细胞是多能性或多效性的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。

30.一种生产如权利要求19所述的转基因非人哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤：

d.将至少一种如权利要求15所述的核酸和/或至少一种如权利要求16所述的载体和至少一种合适的转染标记基因引入非人哺乳动物两个受精卵母细胞原核中的一个，

e.将步骤a的哺乳动物卵母细胞引入非人哺乳动物代母中，和

f.鉴定从所述哺乳动物卵母细胞发育而来的转基因非人哺乳动物。

31.转基因非人哺乳动物，特征在于是通过如权利要求28和29之一所述的方法产生的。

32.转基因非人哺乳动物，特征在于是如权利要求30所述的哺乳动物的后代。

33.如权利要求19、30和31任一项所述的转基因非人哺乳动物用于获得同种异体和/或异体移植中所用的非人细胞、非人器官特异性组织和/或非人哺乳动物器官的用途。

34.如权利要求19、30和31任一项所述的转基因非人哺乳动物、如权利要求18所述的人或动物器官特异性组织和/或人或哺乳动物器官用于寻找药物学活性物质和/或鉴定毒性物质的用途。