DE10014690A1

DE10014690A1 - Verfahren zur Isolierung in vito differenzierter Körperzellen

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Publication number: DE10014690A1
Application number: DE10014690A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang-M Franz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2001-10-18
Also published as: EP1218526A2; US20030003533A1; WO2001071006A3; AU5622201A; WO2001071006A2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Expressionskassette, die unter der genetischen Kontrolle eines organ- oder gewebespezifischen Promotors sowie gegebenenfalls eines oder mehrerer weiterer regulatorischer Elemente 3'-stromabwärts vom Promotor die kodierende Nucleotidsequenz wenigstens eines nicht-immunogenen, an der Zelloberfläche lokalisierenden Rezeptors umfasst, die daraus hergestellten Vektoren, die diese Vektoren enthaltenden Wirtszellen, Verfahen zur Reinigung differenzierter Körperzellen unter Verwendung dieser Konstrukte und die therapeutische Anwendung dieser Körperzellen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Verfahren zur Her stellung und selektiven Isolierung differenzierter, transgener, somatischer Körperzellen, wie z. B. ventrikulärer Kardiomyocy ten, die dazu erforderlichen genetischen Konstrukte und die damit hergestellten Vektoren, diese Vektoren enthaltende Wirts zellen und die therapeutische Verwendung der transgenen diffe renzierten Körperzellen.

Es besteht auf verschiedensten Gebieten der Medizin, wie z. B. der Neurologie, der Dermatologie, der Osteologie oder der Kar diologie ein Bedarf an allogenem oder syngenem Ersatzgewebe oder Ersatzzellmaterial. Man befaßt sich deshalb intensiv mit der Gewinnung differenzierter somatischer Körperzellen aus plu ripotenten Progenitorzellen, wie z. B. embryonalen Stammzellen. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind der Wissenschaft schon seit geraumer Zeit bekannt. Am Modell der Maus würden sie cha rakterisiert. Sie besitzen die außerordentliche Fähigkeit, sich im wesentlichen in jede der 210 verschiedenen Zelltypen des menschlichen Körpers zu differenzieren.

Thomson et al (1998), Science 282, 1145-1147 ist es kürzlich gelungen, menschliche ES-Zellen aus menschlichen Blastozysten zu isolieren. In ihren physiologischen Eigenschaften gleichen sie denen der Maus. Mit der Isolierung menschlicher ES-Zellen rückt eine erfolgreiche zellvermittelte Gentherapie am Menschen in greifbare Nähe. Die Bedeutung dieser Entwicklung soll am Beispiel der Kardiologie kurz veranschaulicht werden.

Herzinsuffizienz beschreibt die Unfähigkeit des Herzens, Blut und Sauerstoff in einem Maße, das den Bedürfnissen des Körpers gerecht wird, zu den Organen zu transportieren. 1996 starben in Deutschland mehr Menschen an chronischer Herzinsuffizienz als an akutem Herzinfarkt. Hauptursache dafür ist, daß zu wenig Spenderherzen für eine lebensrettende Herztransplantation zur Verfügung stehen und die Wartezeit derzeit bei etwa neun bis zwölf Monaten liegt.

Die derzeit zur Verfügung stehenden Alternativmethoden zur Herztransplantation sind nur begrenzt erfolgreich bzw. nicht weit genug entwickelt. Zur Myokardentlastung und Kontraktions unterstützung wird im klinischen Alltag in einem ersten Schritt vor allem die medikamentöse Therapie der chronischen Herzinsuf fizienz angewandt. Es folgen operative Maßnahmen, wie die Myo kardresektion nach Batista, nach welcher geschädigtes Gewebe mechanisch entfernt wird, die Kardiomyoplastie, d. h. der Unter stützung der Herzfunktion durch körpereigene Skelettmuskulatur sowie die Implantation eines Kunstherzes. In der experimentel len Phase befindet sich immer noch die umstrittene Xenotrans plantation, also die Verpflanzung eines Spenderherzens aus dem Schwein oder dem Affen in den Menschen. Letztere trifft nicht nur auf ethische Einwände, sondern auch auf medizinische Risi ken, die mit einer Xenotransplantation verbunden sind. Zum ei nen kann ein Überspringen artfremder Krankheitserreger auf den Menschen nicht ausgeschlossen werden. Andererseits setzt eine Xenotransplantation immer noch die Verwendung immunsupprimie render Medikamente voraus, die zwar das transplantierte Herz vor einer Immunreaktion schützen, den Gesamtorganismus aber gegenüber alltäglichen Keimen und der Entstehung von Krebs ver wundbar machen.

Die wohl erfolgversprechendste Alternative zur Herztransplan tation wäre die autologe Zelltransplantation. In der Kardiolo gie versteht man darunter die Injektion von gesunden Zellen direkt in das geschädigte Herzareal.

Kardiomyozyten verlieren im Gegensatz zur quergestreiften Ske lettmuskulatur kurz nach der Geburt die Fähigkeit sich zu tei len, so daß bei einer Verletzung oder Schädigung des Myokards irreversible Zell- und Funktionsverluste auftreten. Im Falle eines Herzinfarktes bedeutet dies den Ersatz von Herzmuskulatur durch Bindegewebe mit Bildung einer Narbe. Dem könnte durch die Transplantation von Ersatz-Muskelzellen entgegengewirkt werden.

Die technische Durchführbarkeit der zellulären Transplantation in Versuchstiere, wie Maus, Ratte und Hund, konnte nicht nur durch die Transplantation von fetalen, neonatalen und adulten Kardiomyozyten, sondern auch durch die Injektion organfremder Zellen wie, Myoblasten, Skelettmuskel-Satellitenzellen und kar dialen Tumorzellen bewiesen werden (Klug et al., (1996) J. Clin. Invest. 98, 216); Koh et al., (1995) J. Clin. Invest, 96, 2034; Schwarz et al., (1998) Z. Kardiol, 87, 1). Histologisch-morpho logische Studien belegen, daß sowohl Myoblasten, als auch feta le Kardiomyozyten myokardiale Transplantate mit interzellulären Verbindungen, wie "Gap Junctions" und Desmosomen, ausbilden und 8 bis 10 Wochen überleben (Koh et al., a. a. O; Soonpaa et al., (1994) Science, 264, 98). Koh und Mitarbeiter konnten zeigen, daß genetisch modifizierte, transplantierte Myoblasten im Emp fängermyokard rekombinante Wachstumsfaktoren langfristig expri mieren und dadurch im Grenzbereich zwischen Transplantat und Empfängermyokard die endotheliale DNA-Synthese mit nachfolgen der Angiogenese induzieren können (Koh et al., (1995) J. Clin. Invest. 95, 114). Teilweise ungeklärt ist, ob die Zelltrans plantate wirklich positive Effekte auf das Myokard ausüben oder nicht längerfristig etwa elektrische und strukturelle Instabi litäten verursachen. Problematisch bei der Gewinnung von Kar diomyozyten ist die Manipulation der Zellen. Zwar gelingt es, Kardiomyozyten zurück in den Zellzyklus zu zwingen, z. B. durch das Einfügen von Tumorgenen, jedoch auf Kosten der physiologi schen Zelleigenschaften. Die für ventrikuläre Kardiomyozyten typischen elektrophysiologischen, pharmakologischen und immun histologischen Charaktersitika gehen dadurch verloren.

Grundvoraussetzung für den Erfolg eines Zelltransplantations ansatzes ist das Vorhandensein einer homogenen Zellpopulation. ES-Zellen besitzen neben ihrer Fähigkeit sich in jedweden Zell typ zu differenzieren, auch einen besonderen Nachteil. Werden sie in undifferenziertem Zustand in Mäuse injiziert, so kommt es zur Entstehung von Tumoren, sogenannten Teratokarzinomen. Bevor ES-Zellen therapeutisch genutzt werden können, muß daher sichergestellt sein, daß alle Zellen so ausdifferenziert sind, daß keine Gefahr vor einer ungehemmten Vermehrung der Zellen oder der Bildung ungewollter Gewebstypen besteht. Eine strin gente Aufreinigung des gewünschten Zelltyps, im Falle der Kar diologie, von Herzmuskelzellen, ist daher zur Sicherheit des Empfängers eine absolute Notwendigkeit.

Loren J. Field (J. Clin. Invest. (1996), 98, 216) gelang es, spontan differenzierende Kardiomyozyten mit einem Reinheitsgrad von über 99% anzureichern. Um dieses Ziel zu erreichen, führten sie zunächst ein Antibiotika-Resistenzgen in die murinen ES- Zellen ein. Dieses war so ausgelegt, daß es ausschließlich in Kardiomyozyten exprimiert wird. Nachdem den ES-Zellen Zeit ge geben wurde, sich zu differenzieren und nachdem durch den Zu satz von genügend Antibiotikum alle Zellen ohne Resistenzgen abgetötet waren, gelang es, eine im wesentlichen reine Popula tion von Kardiomyozyten zu erhalten. Nach der Transplantation dieser Zellen in Mäusemyokardien, konnten sie bis zu einem Zeitraum von mehr als 7 Wochen nachgewiesen werden. Die Haupt nachteile dieser Methode bestehen vor allem in der Toxizität des verwendeten G418-enthaltenden Mediums, der geringen Ausbeu te der so erhaltenen Zellen und der Tatsache, daß es sich bei den beschriebenen Zellen nicht um humane sondern murine Zellen handelt.

Obwohl Kardiomyozytentransplantation am Tiermodell mehrfach erfolgreich durchgeführt wurden, ist eine erfolgsversprechende Durchführung am Menschen aus obigen Gründen und vor allem auf grund der Nichtverfügbarkeit menschlicher ventrikulärer Kardio myozyten nicht möglich. Mit ähnlichen Problemen ist bei der Gewinnung und Transplantation anderer Körperzellen zu rechnen.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein verbes sertes Verfahren zur Gewinnung von differenzierter Körperzellen zur Verfügung zu stellen. Insbesondere war es Aufgabe, ein Ver fahren zur Gewinnung differenzierter ventrikulärer Kardiomyocy ten bereitzustellen.

Obige Aufgabe wurde überraschenderweise durch Bereitstellung einer Expressionskassette für die genetische Modifikation der zu isolierenden Körperzellen, bzw. pluripotenter Vorläuferzel len der Körperzellen gelöst. Diese Expressionskassette ist da durch gekennzeichnet, dass sie unter der genetischen Kontrolle eines organ- oder gewebespezifischen Promotors sowie gegebenen falls eines oder mehrerer weiterer regulatorischer Elemente 3'- stromabwärts vom Promotor, funktional bzw. operativ verknüpft, die kodierende Nucleotidsequenz wenigstens eines nicht-immuno genen, an der Zelloberfläche lokalisierenden Rezeptors umfasst.

Durch die Kombination von spezifischem Promotor und an der Zel loberfläche lokalisierenden Rezeptor wird eine schnelle, scho nende und selektive Isolierung einer spezifischen Zellpopula tion unter Ausnutzung der Bindungsaffinität des Rezeptors zu einem korrespondierenden Bindungspartner bzw. Liganden ermög licht.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung

Je nach zu isolieren gewünschter Zellpopulation kann der Fach mann den jeweils geeignetsten zell- oder organspezifischen Pro motor und einen passenden Rezeptor auswählen.

Als nichtlimitierende Beispiele für geeignete Promotoren sind zu nennen:

Auf die Offenbarung obiger Fundstellen wird hiermit ausdrück lich Bezug genommen.

Entscheidend für die Auswahl des Rezeptors ist, daß dieser nach Expression auf der Zelloberfläche Bindungsaffinität zu einem Liganden besitzt und geringe Immunogenität in einem späteren Empfängerorganismus aufweist. Vorzugsweise sollte der Rezeptor vom Immunsystem des Empfängerorganismus nicht als "körperfremd" erkannt werden.

Beispiele für geeignete Ligand/Rezeptorpaare sind:

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Expres sionskassette ist dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende Nucleotidsequenz in einem polycistronischen, vorzugsweise bi cistronischen, Gen enthalten ist, welches außerdem die kodie rende Sequenz für wenigstens ein weiteres Genprodukt, ausge wählt unter einem Markergen und einem ersten therapeutisches Gen, umfasst. Vorzugsweise umfasst das bi-cistronische Gen die regulatorische Sequenz einer Internal Ribosome Entry Side (IRES) (z. B. kommerziell erhältlich von der Firma Clontech).

Ein derartiges Konstrukt bietet den zusätzlichen überraschenden Torteil, daß unter der genetischen Kontrolle des vorgeschalte ten Promotors eine gleichzeitige Expression des Rezeptors und des weiteren Gens erfolgt. Ist das weitere Gen ein Markergen, wie z. B. EGFP (grün fluoreszierendes Protein), so erleichtert dies die Charakterisierung der mit Hilfe des Rezeptors isolier ten Zellen. Ist das weitere Gen ein therapeutisches Gen, so wird dessen gewebe- oder organspezifische Expression gewährlei stet und dadurch das Risiko unerwünschter Nebenwirkungen durch unkontrollierte Expression in anderen Geweben oder Organen praktisch ausgeschlossen.

Neben dem Promotor können in der Expressionskassette gewünsch tenfalls weitere regulatorische Elemente enthalten sein, wie Amplifikationssignale, Enhancer, Polyadenylierungssequenzen, Replikationsursprünge, Reportergene, Markergene und derglei chen.

Bevorzugt verwendet man in den erfindungsgemäßen Konstrukten als Rezeptormolekül ein Oberflächenantigen, das immunologische. Affinität zu einem Immunglobulin-Molekül besitzt. Das Immunglo bulinmolekül ist dabei vorzugsweise ein monklonaler Anti-Rezep tor-Antikörper oder ein Rezeptor-bindendes Fragment, wie z. B. ein Fab oder F(ab')₂ oder Fv Fragment, davon.

Zur leichteren Isolierung der Rezeptor-exprimierenden Zellen kann der Ligand, wie z. B. der Antikörper, in immobilisierter Form, z. B. gebunden an einen festen Träger, oder verknüpft mit paramagnetischen Mikrokügelchen, sogenannte "Mikrobeads", vor liegen.

Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet man als Oberflächenantigen das CD4-Antigen oder ein verkürztes Fragment davon, vorzugswei se ein um die intrazelluläre Domäne verkürztes Molekül, das somit weiterhin die Transmembran- und extrazelluläre Domäne umfasst.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Expressionskas sette einen selektierbaren Marker, wie z. B. ein Resistenzgen enthalten. Grundsätzlich sind beliebige an sich bekannte Resi stenzgene einsetzbar. Als Beispiele können insbesondere Anti biotika-Resistenzgene, wie das Neomycin- und das Hygromycin- Resistenzgen, genannt werden.

Vorzugsweise liegt das Resistenzgen und dessen zugeordneter Promotor in einer reversibel integrierten Form vor und kann somit zu einem geeigneten Zeitpunkt, jedenfalls vor der thera peutischen Anwendung der Zellen, wieder entfernt werden. Die reversible Einbindung von Resistenzgen und dessen Promotor erreicht man beispielsweise, indem man diese durch LoxP-Sequen zen flankiert (LoxP-Promotor-Resistenzgen-LoxP). Durch trans iente Transfektion der Resistenzgen-haltigen Zellen und Expres sion von PKG-Cre (z. B. beschrieben in Cellemand et al., (1998) Transg. Res. 7, 105) kann damit das Fremdgen spezifisch ent fernt werden.

Als Beispiel für eine erfindungsgemäß brauchbare Gruppe erster therapeutischer Gene sind Gene für Angiogenense-Faktoren zu nennen. Bevorzugte Vertreter dieser Gruppe sind das vascular endothelial growth factor (VEGF) Gen, das basic fibroblast growth factor (bFGF) Gen, das acidic fibroblast growth factor (aFGF) Gen, das Angiopoietin-, Activin- sowie das Follicosta tin-Gen. Diese sind vorzugsweise Bestandteil des oben erwähnten bicistronischen Gens.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kon strukt außerdem ein zweites therapeutisches Gen, insbesondere ein Immunsuppressionsgen.

Vorzugsweise ist dieses Gen in eigenständiger Form, d. h. mit eine eigenen Promotor, enthalten. Derartige Konstrukte bieten den Vorteil, daß eine lokale immunsuppressive Wirkung genthera peutisch vermittelt werden kann. Das immunsupprimierende Gen produkt kann dabei membranständig oder, vorzugsweise, in sezernierter Form vorliegen. Ein geeignetes sezerniertes immunsup primierendes Genprodukt ist das CTLA4-Ig-Fusionsprotein.

Aufgrund der bevorzugten therapeutischen Verwendung der erfin dungsgemäßen Zellisolate beim Menschen sind insbesondere solche Konstrukte vorteilhaft, deren kodierenden Sequenzen im wesent lichen für humane oder humanisierte Genprodukte kodieren. "Humanisierte" Genprodukte sind dabei solche, bei denen zur Verringerung ihrer Immunogenität nicht-menschliche Teilsequenz bereiche durch entsprechenden mensch-typische Sequenzbereiche ersetzt wurden.

Eine besonders bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäßen Expres sionskassetten ist dadurch gekennzeichnet, dass als organ- oder gewebespezifischer Promotor der ventrikelspezifische Myosin- Leichte-Kette-2 (MLC-2v) Promotor verwendet wird. Dieser Promo tor und geeignete Varianten davon sind in der PCT/DE 96/2181 beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Beispiele für spezielle Formen bevorzugter Expressionskassetten sind Konstrukte, welche in 5'-3'-Richtung wenigstens eine der folgenden Teilsequenzenfolgen umfassen:

a) MLC-2v-Promotor, CD4-extrazelluläre und transmembrane Do mäne, IRES, Angiogenesefaktor;
b) CMV-Enhancer, MLC-2v-Promotor, CD4-extrazelluläre und tra nsmembrane Domäne, IRES, Angiogenesefaktor;
c) CMV-Enhancer, MLC-2v-Promotor, CD4-extrazelluläre und transmembrane Domäne, IRES, Angiogenesefaktor, PGK-Promo tor, CTLA4-Ig Fusionsprotein; und
d) CMV-Enhancer, MLC-2v-Promotor, CD4-extrazelluläre und transmembrane Domäne, IRES, Angiogenesefaktor, LoxP, PGK- Promotor, Resistenzgen, LoxP, PGK-Promotor, CTLA4-Ig Fu sionsprotein;

dabei ist der CMV-Enhancer ein regulatorisches Element aus dem Cytomegalovirus und der PGK-Promotor die Promotorsequenz für das Enzym Phosphoglycerinkinase. Auch diese bevorzugten Kon strukte umfassen zweckmäßig kodierende Sequenzen, welche im wesentlichen für humane oder humanisierte Genprodukte kodieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Vektoren, wie z. B. Plasmide oder virale Konstrukte, Phagen, Phasmide, Phage mide, Transposons, Cosmide, oder Liposome, umfassend wenigstens eine der oben beschriebenen Expressionskassetten. Bevorzugt verwendet man virale, insbesondere adenovirale, Konstrukte oder Liposomenpräparate. Bevorzugte MLC-2-haltige Vektoren sind in der oben bezeichneten PCT/DE 96/02181 beschrieben.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Iso lierung in vitro differenzierter organ- oder gewebespezifischen Körperzellen eines Säugers, wobei man

a) in pluripotente Vorläuferzellen, ausgewählt unter embryo nalen Stammzellen, Primordialzellen und Knochenmarks-Stro mazellen eines Säugers, einen organ- oder gewebespezifi schen Expressionsvektor gemäß obiger Definition einbringt;
b) transgenpositive Zellen selektioniert;
c) aus den selektionierten Zellen gegebenenfalls vorhandene Resistenzgene entfernt;
d) in den so erhaltenen Zellen die Differenzierung zu einer die gewünschten organ- oder gewebespezifischen Körperzel len umfassenden Zellpopulation induziert und erforderli chenfalls eine Einzelzellpräparation herstellt; und
e) die Rezeptor-exprimierenden differenzierten Körperzellen mit Hilfe Rezeptor-spezifischer Liganden affinitätsrei nigt.

Gegenstand ist insbesondere auch ein Verfahren zur Herstellung von ventrikulären Kardiomyozyten, wobei man

a) in pluripotente Vorläuferzellen, ausgewählt unter embryo nalen Stammzellen, Primordialzellen und Knochenmarks-Stro mazellen eines Säugers, einen oben beschriebenen ventri kelspezifischen Expressionsvektor einbringt;
b) transgenpositive Zellen selektioniert;
c) aus den selektionierten Zellen gegebenenfalls vorhandene reversibel integrierte Resistenzgene entfernt;
d) in den so erhaltenen Zellen die Differenzierung zu einer Kardiomyocyten umfassenden Zellpopulation induziert und erforderlichenfalls eine Einzelzellpräparation herstellt; und
e) die Rezeptor-exprimierenden differenzierten ventrikulären Kardiomyozyten mit Hilfe Rezeptor-spezifischer Liganden affinitätsreinigt.

Eine Variante obiger Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als reversibel integrierte Resistenzgene LoxP-flankierte Resistenzgene verwendet, und zur Entfernung dieser die Zellen mit einem Cre-Rekombinase kodierenden Expressionsvektor tran sient transfiziert.

In einer weiteren Variante obigen Verfahrens werden embryonale Stammzellen eingesetzt, die in an sich bekannter Weise gewonnen wurden aus

a) Blastozysten oder
b) enukleierten Oocyten, in welche der Kern einer differen zierten adulten somatischen Körperzelle transferiert wur de.

Vorzugsweise sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Re zeptor-spezifischen Liganden an paramagnetische Mikrobeads ge koppelt, so daß die Ligand-markierten Zellen in einem Magnet feld von nichtmarkierten Zellen getrennt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich mit pluripo tenten Stammzellen beliebiger Säuger, wie z. B. Mensch, Maus, Ratte, Schwein, Rind, Hund, Kaninchen, Hamster, durchführbar.

Obige Verfahren finden insbesondere Anwendung zur Herstellung körpereigener (autologer) humaner Körperzellen, wobei man die pluripotenten Vorläuferzellen aus einem autologen menschlichen Spender gewinnt.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere transgene somatische Körperzellen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfah ren. Diese finden insbesondere Verwendung zur, vorzugsweise autologen, Zelltransplantation oder zur Gentherapie, wie ins besondere zur zellvermittelten Gentransplantation, bei ver schiedensten Krankheitszuständen. Nichtlimitierende Beispiele für mögliche Indikationen sind die ischämische und dilatative Kardiomyopathie.

Gegenstand sind insbesondere Kardiomyocyten mit einem elektro physiologisch vetrikulären Eigenschaftsspektrum, d. h. einem für ventrikuläre Kardiomyocyten typischen Membranpotential von ca. -70 mV, einer Potentiallänge von ca. 118 ms und einem Overshoot von ca. 34 mV, wobei Carbachol als Agonist des Muscarinischen Rezeptors keinen Effekt auf das Membranpotential und die Länge des Aktionspotentials hat. Typisch für ventrikuläre Kardiomyo zyten ist außerdem ein Andauern des Aktionspotentials nach Be handlung der Zellen mit dem beta-adrenergen Agonisten Isoprena lin (vgl. auch Fig. 2).

Die Herstellung und Gewinnung von Herzmuskelzellen aus ver schiedenen pluripotenten Progenitorzellen wird nun im folgenden Abschnitt eingehender beschrieben.

a) Herstellung aus ES-Zellen

Das derzeitige Wissen über die Gewinnung und Handhabung von ES- Zellen stammt zum größten Teil aus dem Studien muriner ES-Zel len. Sie wurden erstmals 1981 aus einem Maus-Embryo im 100- Zellstadium gewonnen. Der Embryo in diesem Entwicklungszeit punkt wird als Blastozyste bezeichnet. Er mißt wenige Millime ter und besteht aus einer Hohlkugel, die an einer Stelle nach innen zur inneren Zellmasse verdickt ist. Unter natürlichen Verhältnissen bildet sich im Uterus daraus der Fötus. Wird die Blastozyste allerdings in einer Petrischale angewachsen, so kollabiert die äußere Membran und die innere Zellmasse fängt an sich zu teilen. In diesem Stadium können die Zellen über einen unbegrenzten Zeitraum gehalten werden. Ihre Pluripotenz, d. h. ihre Fähigkeit sich in nahezu jeden Zelltyp zu differenzieren bleibt weiterhin erhalten.

Die ES-Zellen behalten solange ihren undifferenzierten Zustand bei, solange sie in ihrem Nährmedium das von sogenannten "Feeder"-Zellen sezernierte Cytokin LIF (Leukemia Inhibitory Factor) vorfinden. Werden die "Feeder"-Zellen bzw. LIF entfernt und wird verhindert, daß sich die ES-Zellen am Substrat anhef ten, z. B. durch Kultur der ES-Zellen auf Bakterienplatten oder in sogenannten "hängenden Tropfen", so beginnen sie sich zu differenzieren. Während der Differenzierung kommt es zur Aus bildung sogenannter "Embryoid Bodies". Die Richtung der Diffe renzierung bleibt zunächst unvorhersehbar, jedoch ist das Re pertoire sich in vitro differenzierender Zellen deutlich gerin ger, als nach Injektion in eine Blastozyste; vermutlich hervor gerufen durch die unterschiedlich chemisch definierte Umgebung der Zellen. Werden die ES-Zellen in Gegenwart von Stromazellen angewachsen, so kommt es zu einer verstärkten Ausbildung hema topoetischer Zellen. Das gleiche tritt ein, wenn dem Kulturme dium Methylcellulose beigefügt wird. Die Zugabe von Retinsäure (RA) führt je nach Konzentration und Zeitpunkt der Stimulation zur Anhäufung kardialer oder neuronaler Zellen. Entsprechende Methoden sind z. B. in der DE 44 41 327 oder der WO 96/16163 beschrieben.

Von kleineren Abweichungen im Arbeitsprotokoll abgesehen, ist die obige für murine ES-Zellen beschriebene Handhabungs- und Differenzierungsprozedur auch für humane ES-Zellen anwendbar. Während bei murinen Blastozysten nach Beginn der in vitro Dif ferenzierung die äußere Zellschicht (Trophoblast) relativ schnell abgebaut wird, ist dies bei humanen Blastozysten nicht der Fall. Um die innere Zellmasse vor einem Absterben zu bewah ren, muß daher der Trophoblast bei der in vitro Differenzierung menschlicher Blastozyzten mechanisch entfernt werden (beschrie ben von Thomson a. a. O.).

b) Alternative Herstellungsmöglichkeiten

Die in vitro Differenzierung von ES-Zellen ist nicht der ein zige Weg, um menschliche Kardiomyozyten zu gewinnen. Kardiomyozyten sind ebenfalls zugänglich durch in vitro Differenzierung von Primordialzellen, Vorläuferzellen von Ei- und Samenzellen, die aus humanen fetalen Ovarien oder Testes gewonnen werden. Die Etablierung humaner pluripotenter Primordialzellen ist z. B. beschrieben bei Shamblott et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 13726.

Außerdem sind Kardiomyozyten zugänglich aus in vitro differen zierten Oozyten, welche mittels Kern-Transfer-Technik manipu liert wurden. Geeignte Methoden sind z. B. beschrieben von Wa kayama, T. et al., (1998) Nature, 394, 369; sowie Wilmut, I. et al., (1997), Nature, 385, 810. Dieser Ansatz ermöglicht ins besondere eine autologe Zelltransplantation, d. h. die Möglich keit zur Gewinnung und Transplantation körpereigener Kardiomyo zyten.

Weiterhin sind Kardiomyocyten zugänglich durch Differenzierung von Knochenmarksstromazellen. Ein Verfahren zur Herstellung muriner Kardiomyocyten wird beschrieben von Makino et al., (19-99) J. Clin. Invest. 103, 697.

Ein wesentlicher Punkt, der bisher noch nicht eingehend be trachtet wurde, ist die Tatsache, daß jede der zuvor erwähnten in vitro Differenzierungsmethoden zu einem Gemisch verschieden ster Zelltypen führt. So liegt beispielsweise bei in vitro dif ferenzierten murinen ES-Zellen der Prozentsatz an myokardialen Zellen nur bei 5%. Für die in vitro Differenzierung humaner Primordial- oder ES-Zellen muß mit ähnlichen Zahlen gerechnet werden. Dies bedeutet, daß immer nur ein Bruchteil der gesamten in vitro differenzierten Zellpopulation dem gewünschten Zelltyp entspricht. Dieser Prozentsatz kann zwar durch geeignete Wachs tumsbedingungen, wie der Zugabe chemischer Induktoren, eventu ell verdoppelt werden, dennoch kann mit einem derartigen Zell gemisch zunächst keine erfolgversprechende Zelltransplantation unternommen werden. Konventionelle Aufreinigungsmethoden sind sehr aufwendig und zeitraubend und bewirken die eingangs be schriebenen unerwünschten Veränderungen der physiologischen Zelleigenschaften. Erst mit Hilfe des erfindungsgemäßen Ansat zes zur Markierung und Reinigung differenzierter Kardiomyozyten kann diese Problem in zufriedenstellender Weise umgangen wer den.

Die Erfindung wird nun anhand folgender Ausführungsbeispiele und unter Bezugnahme auf beiliegende Figuren näher erläutert. Dabei zeigt

Fig. 1 die Markierung und Reinigung ventrikulärer Kardiomyocy ten. Das für die Transfektion pluripotenter Zellen (murine bzw. humane ES- bzw. Knochenmarks-Stromazellen bzw. Pri mordialzellen) verwendete Expressionsplasmid enthält fol gende Untereinheiten: (1) ein bi-cistronisches Gen beste hend aus einem für ventrikuläre Kardiomyozyten spezifi schen CMV-MLC2v-Promotor, welcher ein verkürztes CD4-Ober flächenprotein und das therapeutisch wirksame VEGF-Gen reguliert; (2) ein durch LoxP-Sequenzen flankiertes eigen ständiges PGK-Neo-Gen, welches für die Selektion dei posi tiv transformierten Zellen verwendet wird und durch tran siente Expression eines Cre-Expressionsvektor vor der Transplantation entfernt wird; und (3) ein PGK-CTLA4-Ig- Fusionsprotein-Gen, welches als eigenständige Einheit dazu beitragen soll, dem Zelltransplantat gegenüber einer vom Empfängergewebe ausgehenden Abstoßungsreaktion Immunität zu verleihen.

Nach der Transfektion der Zellen, z. B. mittels Elektropo ration, findet eine Selektion positiv rekombinierter Zel len in G418-haltigem Medium statt. G418-resistente Zell klone werden transient mit einem PGK-Cre-Expressionsplas mid tranisfiziert, wodurch LoxP-flankierte artfremde Gen bereiche aus dem Genom der Zelle entfernt werden, d. h. das in die Zellen eingeschleuste Genkonstrukt enthält bereits zu diesem Zeitpunkt keine dem Patienten fremden Gene mehr. Nach Herstellung von Embroid Bodies (EBs) folgt die Diffe renzierung der pluripotenten Zellen, u. a. zu Herzmuskelzellen. Das sich bildende heterogene Zellgemisch wird anschließend einer Einzelzellpräparation unterzogen. CD4- positive Zellen können daraufhin mittels anti-CD4-Antikör per markiert und über die Auftrennung in einem Magnetfeld aufgereinigt werden. Die so gewonnene Zellpopulation be steht aus ventrikulären Kardiomyozyten, welche direkt für Transplantationsstudien verwendet werden können;

Fig. 2 die elektrophysiologische Charakterisierung von ventri kulären Kardiomyocyten. (A) EGFP-negative Kardiomyozyten zeigen das typische Aktionspotential früher Zellen mit einem depolarisierten Membranpotential von ca. -56 mV und einem nur kurz anhaltendem Aktionspotential über ca. 86 ms. Außerdem zeigen sie einen negativen chronotropischen Effekt gegenüber Behandlung mit dem muscarinischen Agoni sten Carbachol (CCh). (B) EGFP-positive Kardiomyozyten hingegen zeigen typische Eigenschaften des ventrikulären Typs: negatives Membranpotential von ca. -70 mV und eine Dauer des Aktionspotentials von ca. 118 ms. Sie zeigen eine klar erkennbare Plateauphase, welche durch einen langanhaltenden Calcium-Einstrom durch Calcium-Kanäle des L-Typs hervorgerufen wird. CCh zeigt keinen Effekt auf ventrikuläre Kardiomyozyten. Eine Behandlung mit dem beta- adrenergen Agonisten Isoprenalin (Iso) führt jedoch, wie in (C) gezeigt, zu einer Verlängerung des Aktionspotenti als, wiederum typisch für Kardiomyozyten des ventrikulären Typs.

Soweit keine gesonderten Angaben gemacht werden, erfolgt die Durchführung der Experimente unter Anwendung molekular- und zellbiologischer Standardmethoden (vgl. z. B. Shambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory).

Beispiel 1

Herstellung eines Expressionsvektors umfassend folgende Teilsequenzfolge

1. Zunächst wird ein CMV-MCL-2v-EGFP-Plasmid hergestellt. Das aus 590 Basenpaaren bestehende CMV-Enhancer Element (Bos hart et al. (1985) Cell 41, 521) wurde mittels PCR aus dem von Clontech erhältlichen Plasmid CMV-EGFP hergestellt und an schließend über die Schnittstellen SacI, BamHI in den Expres sionsvektors pEGFP-1 (Clontech) kioniert (pCMV-EGFP). Um den MLC2v-Promotor einfügen zu können wurde dieser zunächst als 2.1 kb Kpnl-EcoR1 DNA-Fragment aus dem Genom der Ratte isoliert (Henderson et al., (1989) JBC. 2641 18142), in die EcoRI, XhoI Schnittstellen des pEGFP-1 inseriert (MLC2v-EGFP), anschließend mittels XbaI, XhoI-Verdau aus diesem herausgeschnitten und in die BamHI, XhoI-Schnittstellen von pCMV-EGFP eingefügt (CMV- MLC2v-EGFP).

Ein CD4-Expressionsplasmid ist von der Firma Miltenyi Biotec (Deutschland) erhältlich. Die kodierenden Bereiche des um den intrazellulären Teil verkürzten CD4-Moleküls werden an das 3'- Ende des CMV-MLC2v-Enhancer/Promotor-Konstrukts ligiert und, die in 3'-Richtung folgende IRES-EGFP-Kassette wird aus einem von der Firma Clontech bezogenen Expressionsvektor umkloniert. Das so erhaltene bi-cistronische Gen soll die gleichzeitige ventrikelspezifische Expression der Markergene CD4 und EGFP garantieren. CD4 dient später der eigentlichen Aufreinigung der Kardiomyozyten. EGFP dient zur Charakterisierung der durch die Reinigung erhaltenen Zellen. Der oben dargestellte Vektor ent hält außerdem ein eigenständiges PGK-Neo-Gen, sowie ein von der Arbeitsgruppe Gainer et al., (1997) Transpl. 63, 1071 beschrie benes CTLA4-Ig-Fusionsgen.

Als Kontrollvektor, um später in der Maus bzw. der Ratte die biologische Wirkung von CTLA4-Ig, zu bestimmen, kommt zusätz lich ein identischer Vektor ohne PGK-CTLA4-Ig-Kassette zum Einsatz.

2. Der oben abgebildete, aus 3 Genen zusammengesetzte Vektor wird linearisiert und mittels Elektroporation in murine ES-Zel len und Knochenmarks-Stromazellen des Menschen bzw. der Ratte transfiziert. Über Perkollgradienten aufgereinigte humane mono nukleäre Knochenmarkszellen können von der Firma CellSytems bezogen werden. Knochenmarks-Stromazellen der Ratte werden in an sich bekannter Weise aus den Oberschenkelknochen von Wistar- Ratten isoliert und über einen Perkollgradienten gereinigt.

Die Zellen werden in gelatinisierten Petrischalen gehalten, wobei die ES-Zellen bei 37°C, die Knochenmarks-Stromazellen bei 33°C kultiviert werden. Über die Neomycin-Resistenzkassette lassen sich transformierte Zellen selektionieren. Bei Geneti cin (G418)- resistenten ES-Zellklonen wird daraufhin entspre chend der Angaben in der WO 96/16163 durch den Entzug von LIF die Differenzierung induziert. Circa 25 Tage nach Beginn der Differenzierung erfolgt die Reinigung CD4-exprimierender Kar diomyozyten aus den gebildeten Embryoid Bodies.

Analog dem von Makino et al. a. a. O, für murine Stromazellen optimierten Protokoll wird auch bei Stromazellen der Ratte und des Menschen die Differenzierung durch die Gabe von 5'-Azacyti din angeregt.

3. Für die Reinigung CD4-exprimierender Kardiomyozyten muß zunächst eine Einzelzellpräparation aus den Embryoid Bodies hergestellt werden. Die typischerweise dafür eingesetzten En zyme Kollagenase bzw. Trypsin können nicht verwendet werden, da sie das verwendete CD4-Oberflächenmolekül abbauen würden, Abhilfe schafft eine nicht-enzymatische Zelldissoziationslö sung, die z. B. von Sigma erhältlich ist. Einzelzellen werden anschließend mit anti-CD4-Antikörpern inkubiert. Die Antikör per binden an ihr entsprechendes Antigen und markieren somit alle CD4-exprimierenden Zellen. Da die Antikörper ihrerseits an paramagnetische "Mikrobeads" gekoppelt sind, ist es möglich, den Komplex bestehend aus CD4-exprimierendem Kardiomyozyt, an ti-CD4-Antikörper und "Mikrobead" in an sich bekannter Weise über ein externes Magnetfeld zu isolieren.

Die durch paramagnetische "Mikrobeads" markierten Zellen werden in einer von der Firma Miltenyi Biotec gelieferten Säule dem Feld eines starken Magneten ausgesetzt. Das Säulenmaterial be steht aus ferromagnetischen Partikeln, welche mit einer zell freundlichen hydrophilen Beschichtung versehen sind. Die durch "Mikrobeads" markierten Zellen verbleiben zunächst auf der Trennsäule, während nicht markierte Zellen ausgewaschen werden. Das Abschalten des Magneten führt schließlich zur Elution der markierten Zellen. Die gesamte Reinigung dauert ca. 1-2 Stun den. Ein Ablösen der paramagnetischen "Beads" von der Zello berfläche ist auf Grund ihrer geringen Größe und ihrer Zusam mensetzung (Eisenoxid und Polysaccharid) nicht nötig. Die Auf trennung ist daher deutlich schneller und zellschonender als die Auftrennung über den Zellsorter.

4. Die Ausbeute und Beschaffenheit der gereinigten Zellen wird anschließend über die Expression der EGFP-Kassette durch FACS- Analyse bzw. Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Die Expression von CTLA4-Ig läßt sich mittels monoklonaler anti-CTLA4-Ig-Anti körper und indirekter Immunfluoreszenz ebenfalls in der FACS- Analyse bzw. im ELISA nachweisen.

Beispiel 2 Herstellung eines Expressionsvektors umfassend folgende Teilse quenzfolge

-//CMV-MLC-2v/CD4/IRES/VEGF//PGK-Neo//PGK-CTLA4-Ig//-

In analoger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wird ein Kon strukt hergestellt, das anstelle der EGFP-Kassette das thera peutische VEGF-Gen (Carmeliet, P., et al. (1999) Nature Med. 5, 495) umfasst. Die auf diese Weise genetisch veränderten Kardiomyozyten fungieren dann als "Carrier", um den Angiogenesefaktor lokal im Myokard zu applizieren.

Bei der therapeutischen Verwendung VEGF-exprimierender Plasmide sollen, um eine Immunreaktion des Körpers zu minimieren, alle im transgenen Expressionsvektor vorhandenen Gene humanen Ur sprungs sein. Dies wiederum bedeutet, daß neben dem bereits ersetzten EGFP-Gen auch das noch vorhandene bakterielle Neo- Resistenzgen entfernt werden muß. Die für die Entfernung frem der Gene verwendete Strategie wird in Fig. 1 verdeutlicht. Im dargestellten, für therapeutische Ansätze verwertbaren Expres sionsvektor, ist die Neo-Kassette durch nicht kopierende soge nannte LoxP-Signalsequenzen flankiert. Werden Transgen-positi ve ES- bzw. Stromazellen noch vor der Differenzierung in Kar diomyozyten transient mit einem Cre-Expressionsverktor (PGK- Cre) transfiziert, so werden durch die Aktivität der Cre-Rekom binase LoxP-flankierte Genbereiche aus dem Genom entfernt, wo bei eine der LoxP-Sequenzen im Genom verbleibt (Selbert, S. (1999) BIUZ, 29, 70).

Claims

1. Expressionskassette dadurch gekennzeichnet, dass sie unter der genetischen Kontrolle eines organ- oder gewebespezifi schen Promotors sowie gegebenenfalls eines oder mehrerer weiterer regulatorischer Elemente 3'-stromabwärts vom Pro motor die kodierende Nucleotidsequenz wenigstens eines nicht-immunogenen, an der Zelloberfläche lokalisierenden Rezeptors umfasst.

2. Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß die kodierende Nucleotidsequenz des Rezeptors in einem polycistronischen Gen enthalten ist, welches außer dem die kodierende Sequenz für wenigstens ein Markergen oder wenigstens ein erstes therapeutisches Gen umfasst.

3. Expressionskassette nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich net, daß das poly-cistronische Gen ein bi-cistronisches Gen ist und die regulatorische Sequenz einer Internal Ri bosome Entry Side (IRES) umfasst.

4. Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor Affinität zu einem Liganden besitzt.

5. Expressionskassette nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich net, daß der Rezeptor ein Oberflächenantigen ist, das im munologische Affinität zu einem gegebenenfalls immobili sierten Immunglobulin-Molekül besitzt.

6. Expressionskassette nach Anspruch 5, dadurch gekennzeich net, daß das Oberflächenantigen das CD4-Antigen oder ein verkürztes Fragment davon, vorzugsweise dessen extrazel luläre und Transmembran-Domäne, ist.

7. Expressionskassette nach einem der Ansprüche vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem ein reversibel integriertes Resistenzgen umfasst.

8. Expressionskassette nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich net, daß das Resistenzgen durch LoxP-Sequenzen flankiert wird.

9. Expressionskassette nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich net, dass das Markergen das EGFP-Gen ist.

10. Expressionskasette nach einem der vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet daß sie außerdem ein zweites therapeutisches Gen umfaßt.

11. Expressionskassette nach Anspruch 2 oder 10, dadurch ge kennzeichnet, dass das erste und zweite therapeutische Gen unabhängig voneinander ausgewählt sind unter Genen für Angiogenense-Faktoren, wie insbesondere dem vascular endo thelial growth factor (VEGF) Gen, dem basic fibroblast growth factor (bFGF) Gen, dem acidic fibroblast growth factor (aFGF) Gen, dem Angiopoietin-, Activin- oder Folli costatin-Gen, und Immunsuppressionsgenen, wie insbesondere dem CTLA4-Ig Fusionsgen.

12. Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprü che, deren kodierenden Sequenzen im wesentlichen für hu mane oder humanisierte Genprodukte kodieren.

13. Expressionskassette nach einem der vorherigen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass als organ- oder gewebespezi fischer Promotor der ventrikelspezifische Myosin-Leichte- Kette-2 (MLC-2v) Promotor verwendet wird.

14. Expressionskassette nach Anspruch 13, dadurch gekennzeich net, dass sie in 5'-3'-Richtung wenigstens eine der fol genden Teilsequenzenfolgen umfasst:

a) MLC-2v-Promotor, CD4-extrazelluläre und transmembrane Domäne, IRES, Angiogenesefaktor;
b) CMV-Enhancer, MLC-2v-Promotor, CD4-extrazelluläre und transmembrane Domäne, IRES, Angiogenesefaktor;
c) CMV-Enhancer, MLC-2v-Promotor, CD4-extrazelluläre und transmembrane Domäne, IRES, Angiogenesefaktor, PGK- Promotor, CTLA4-Ig Fusionsprotein; und
d) CMV-Enhancer, MLC-2v-Promotor, CD4-extrazelluläre und transmembrane Domäne, IRES, Angiogenesefaktor, LoxP, PGK-Promotor, Resistenzgen, LoxP, PGK-Promotor, CTLA4-Ig Fusionsprotein.

15. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 13 bis 14, deren kodierenden Sequenzen im wesentlichen für humane oder humanisierte Genprodukte kodieren.

16. Vektor, umfassend einen Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

17. Vektor, umfassend einen Expressionskassette nach einem der Ansprüche 13 bis 15.

18. Verfahren zur Isolierung in vitro differenzierter organ- oder gewebespezifischen Körperzellen eines Säugers, wobei man

a) in pluripotente Vorläuferzellen, ausgewählt unter embryonalen Stammzellen, Primordialzellen und Knochenmarks-Stromazellen eines Säugers, einen organ- oder gewebespezifischen Expressionsvektor nach Anspr uch 16 einbringt;
b) transgenpositive Zellen selektioniert;
c) aus den selektionierten Zellen gegebenenfalls vorhan dene Resistenzgene entfernt;
d) in den so erhaltenen Zellen die Differenzierung zu einer die gewünschten organ- oder gewebespezifischen Körperzellen umfassenden Zellpopulation induziert und erforderlichenfalls eine Einzelzellpräparation her stellt; und
e) die Rezeptor-exprimierenden differenzierten Körper zellen mit Hilfe Rezeptor-spezifischer Liganden affi nitätsreinigt.

19. Verfahren zur Herstellung von ventrikulären Kardiomyozy ten, wobei man

a) in pluripotente Vorläuferzellen, ausgewählt unter embryonalen Stammzellen, Primordialzellen und Kno chenmarks-Stromazellen eines Säugers, einen ventri kelspezifischen Expressionsvektor nach Anspruch 17 einbringt;
b) transgenpositive Zellen selektioniert;
c) aus den selektionierten Zellen gegebenenfalls vorhan dene reversibel integrierte Resistenzgene entfernt;
d) in den so erhaltenen Zellen die Differenzierung zu einer Kardiomyocyten umfassenden Zellpopulation indu ziert und erforderlichenfalls eine Einzelzellpräpara tion herstellt; und
e) die Rezeptor-exprimierenden differenzierten ventriku lären Kardiomyozyten mit Hilfe Rezeptor-spezifischer Liganden affinitätsreinigt.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeich net, daß man als reversibel integrierte Resistenzgene LoxP-flankierte Resistenzgene verwendet, und zur Entfer nung dieser die Zellen mit einem Cre-Rekombinase kodieren den Expressionsvektor transient transfiziert.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch ge kennzeichnet, daß die embryonalen Stammzellen gewonnen wurden aus

a) Blastozysten oder
b) enukleierten Oocyten, in welche der Kern einer differenzierten adulten somatischen Körperzelle transfe riert wurde.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch ge kennzeichnet, dass die Rezeptor-spezifischen Liganden an paramagnetische Mikrobeads gekoppelt sind und die Ligan den-markierten Zellen in einem Magnetfeld von nichtmar kierten Zellen getrennt werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22 zur Herstel lung körpereigener (autologer) humaner Körperzellen, wobei man die pluripotenten Vorläuferzellen aus einem autologen menschlichen Spender gewinnt.

24. Transgene Kardiomyocyten mit einem elektrophysiologisch vetrikulären Eigenschaftsspektrum.

25. Transgene Kardiomyocyten nach Anspruch 24, mit einem, meh reren oder allen der folgenden elektrophysiologischen Merkmalen:

a) Membranpotential im Bereich von etwa -68,6 ± 2,8 mV;
b) Membranpotentiallänge im Bereich von etwa 118,3 ± 15,2 ms;
c) Overshoot im Bereich von etwa 34 ± 3,9 mV;
d) kein Ansprechen des Membranpotentials und der Ak tionspotentiallänge auf 1 µm Carbachol; und
e) Verlängerung des Aktionspotentials durch Gabe von 0,1 µm Isoprenalin.

26. Transgene Kardiomyocyten nach Anspruch 25, enthaltend we nigsten einen Vektor nach Anspruch 17.

27. Transgene Kardiomyocyten erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 23.

28. Transgene Körperzellen erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 20 bis 23.

29. Verwendung transgener Zellen nach einem der Ansprüche 24 bis 28 zur, vorzugsweise autologen, Zelltransplantation oder zur Gentherapie, wie insbesondere zur zellvermittel ten Gentransplantation.