CN1278299A - 用于具有降低的抗体介导的排斥的异种移植的转基因动物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了异种移植器官、组织、细胞或非活组分的方法,该方法降低或阻止抗体介导的排斥,包括超急性排斥,其中产生转基因动物,这些转基因动物表达至少一种掩蔽或降低抗原性Galα(1,3)Gal或gal表位水平的酶以及至少一种补体抑制剂,如CD59、DAF和/或MCP。表达gal表位－降低酶和补体抑制剂两者的所说转基因动物将具有掩蔽的或降低的gal表位水平,并且在移植后很少有产生抗体介导的排斥的可能性。同时补体抑制剂的表达也将抑制补体活化,并且甚至进一步在从如此产生的转基因动物移植供体器官、组织、细胞或非活组分后降低严重的免疫反应。此外,本发明提供了从一个单一整合位点表达多种补体抑制剂或其它蛋白质的转基因动物。这样,本发明的有利之处在于,它可以提供能够安全并有效地(降低或消移抗体介导的排斥至以前不可能达到的程度)移植到人体中的异种器官、组织、细胞以及非活组分,并且会明显降低对从人或灵长类供体获得供体器官、组织、细胞或非活组分的需要。

Description

用于具有降低的抗体介导的排斥的异种移植的转基因动物
本申请要求临时美国专利申请60/004461(1995年9月27日提交)和美国专利申请08/675,773(1996年7月3日提交)的优先权。
发明所属技术领域
本发明总的来说涉及制备和使用转基因动物和重组异种细胞，以便降低或阻止异种移植后的抗体介导的和补体介导的排斥，包括超急性排斥。更具体地说，本发明涉及用于降低或阻止异种移植后的抗体介导的和补体介导的排斥的方法，该方法包括制备转基因动物，其细胞和组织表达编码掩蔽或降低抗原性gal表位水平之酶(如α(1，2)岩藻糖基转移酶、α(2，6)唾液酸转移酶、β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶或其它合适的糖基转移酶)的基因以及能够表达补体抑制蛋白(如CD59、DAF和/或MCP或其它补体抑制剂)的基因，以便产生降低或消除异种移植后的抗体介导的和补体介导的排斥的器官、组织、细胞或非活组分。本发明也涉及由这一方法产生的表达多种补体抑制蛋白质的转基因器官、组织、细胞或非活组分，并涉及采用来源于按照本发明制备的转基因动物的器官、组织、细胞或非活组分进行异种移植的方法。
发明背景
尽管在过去几年中有关器官和组织移植取得一些改进，但在这一领域的进展继续受到可用的人供体器官和组织严重短缺的限制。在过去几年中，利用同种异体移植组织(即与受体相同的物种的供体动物的组织)已完成了成千上万的移植过程。然而，对任何给定的年份而言，由于缺乏合适的供体组织未能获得这种操作的患者的数量大大地超过了接收移植的患者的数量。例如，在1993年，虽然18,164个患者接收了供体器官，但总共33.394个患者到那一年年底仍然在供体器官等待者名单上。在许多情况下，例如对心脏病患者，不幸地是患者更有可能在等待可用的合适的供体器官而死亡，而不是作为移植过程并发症的结果而死亡。
此外，由于器官的无法预言的可用性，移植外科通常有能如常规操作进行预期安排。十分常见的是，找到合适的供体器官时外科组和医院管理人员就得立即作出反应，这造成管理和其它方面的困难。例如，在心，肝和肺移植的情况下，如果遇到排斥，再移植通常是不可能的，除非在一段短的时间内找到另一个合适的供体器官，而这是极不可能出现的。
由于合适的供体组织短缺，许多年来科学和医学界一直在考虑异种移植(其是一种物种的组织向不同物种个体的移植)的可行性。虽然已有从某些密切相关物种(如黑猩猩和狒狒)成功地移植器官或组织到人体的许多尝试，但那些操作还不是没有问题的，包括不同水平的排斥和需要广泛的免疫治疗，而这些免疫治疗是严格的和昂贵的，并且常常伴随有不希望的副作用。此外，潜在地合适的供体灵长目的供给也受到其它因素的限制，这些因素包括可供使用的灵长类群体的相对较小数量，许多潜在地可接受的物种在濒危物种之列的事实，以及其它伦理上的考虑。
因此，对合适的动物供体的寻找曾集中于非濒危但相对充足供给的动物，如猪。遗憾地是，由于在异种器官或组织移植后在人中迅速发生的严重的抗体介导的排斥，人类和最可能的供体动物(猪)之间的异种移植受到严格的限制。这一抗体介导的排斥在其迅速的起始期被称为超急性排斥(或HAR)，其被认为通过抗体介导的补体活化发生，至少就猪和灵长类之间的移植而言是如此，如，在例如Dalmasso等，Amer.J.Pathol.140：1157-1166(1992)中所描述的。虽然至少一篇论文曾提出补体调节蛋白质可能是物种特异性的，对其它物种的组合，补体旁路途径以这一方式被活化也是可能的。参见Miyagawa等，移植46：825-830(1988)。
就猪向人或其它灵长类的器官移植中的超急性排斥而言，起始期的这一抗体介导的排斥通常以血栓形成，出血以及水肿为特征，并且在移植后几分钟和几小时期限内几乎常常导致移植物功能下降和不可逆排斥。一般观察到这一过程通过异种反应性天然抗体(或XNAs)结合到存在于移植物内皮细胞上的糖结构上启动，这一结合事件导致补体活化级联。参见，例如，Platt等，移植50：817-822(1990)。
流行的科学的观点是，在由XNAs启动后，抗体介导的排斥(如HAR)最终导致由宿主补体防卫系统产生的附加的排斥。补体以及它的活化现在是已知的，参见Roitt，自发免疫学(第五版)，1994，Blackwell科学出版社，牛津大学，归因于补体(C’)的活化取决于协同作用的九种蛋白质组分(C1到C9)的作用，其中的第一种组分由称为Clq，Clr和Cls的三种主要的亚组分组成。补体可以由经典或旁路途径活化，现在将简要描述这两者。
在经典途径中，C1结合到抗体上。Cls亚单位获得酯酶活性，并且首先引起C4然后引起C2的活化并转移到膜或免疫复合物上的位点。这一复合物有″C3-转化酶″活性，并且在溶液中裂解C3产生一个小的肽片段C3a和一个残余分子C3b，其具有十分不同的功能。由于补体介导的损坏，C3a有过敏毒素活性，但是否则在补体放大级联中不以其它方式进一步起作用。C3b是膜结合的，并且可以造成抗原-抗体-C3b复合物的免疫粘着，因此有利于尔后的吞噬作用。
在旁路途径中，C3转化酶活性是由C3bB完成的，C3bB的活化可以由不依赖于抗体作用的外部因子触发，转化酶由因子D作用在C3b和因子B的复合物上形成。这形成阳性反馈环，其中C3断裂产物(C3b)帮助形成更多的切割酶。
在经典和旁路途径两者中，C3b水平由C3b失活剂(因子I)的作用保持。C3b易于与因子H结合形成复合物，该复合物被因子I裂解并失去其溶血性质和免疫粘着性质。经典和旁路途径在C3阶段后是共同的。C5裂解给出C5a和C5b片段。C5a有过敏毒素活性，并且引起多形核白细胞的趋化性。C5b作为复合物与C6与C7结合形成膜上的热稳定位点，其募集最终组分C8和C9以产生膜攻击复合物(MAC)。这是插入到膜中的环形结构，并且从该膜突出，形成对电解质和水充分渗透的跨膜通道。由于高的内部胶体渗透压，出现钠离子和水的净流入，导致细胞裂解。
已鉴别了补体抑制和限制因子，其以降低或阻止补体级联的裂解活性的方式干扰补体级联的作用；它们经常物种特异性的，因为它们对从其它物种来源的补体有效性相对较差。这些因子可以是细胞膜结合的，或在血清中游离的。最常见的是，它们干扰对两种补体途径所共有步骤中的一个，然而，一些因子对经典或旁路途径两者可以是特异性的。
在猪向灵长类的移植中，宿主补体(C’)主要通过经典的补体途径活化。在宿主血流中循环的预先形成的异种反应性天然抗体(XNAs)识别和结合供体器官，特别是在脉管内皮腔表面上的。结合XNAs用于触发宿主的补体系统。在移植后几分钟到几小时内，这一进攻导致内皮细胞活化，血小板和白细胞的粘着，异种移植器官的血栓形成和最后坏死。移植器官的毛细血管床似乎是宿主补体活性进攻的最敏感的位点。
已长期已知补体活化在抗体介导的排斥(如HAR)中起着重要的作用如例如在在Gerwurz等，移植5：1296(1967)中所证明的。最近，在抗体介导的排斥过程中涉及补体已戏剧性地由移植前的宿主补体活性的外源抑制所说明。例如，几个小组已开发了通过耗尽宿主中的异种天然抗体水平来抑制补体的实验方法。通过用宿主血液灌注供体器官(如猪肾)或者通过使所说的血液流过除去免疫球蛋白分子的免疫亲和柱来除去异种天然抗体。参见，例如，Moberg等，Trans.Proc，3：538-541(1971)；Fischel等，Trans，Proc.24：574-575(1992)；Ye等，Trans.Proc.24：563-565(1992)；Agashi等，Trans.Proc.24：557-558(1992)。遗憾地是，这些方法不容易转变成在临床移植情况中日常使用的。
此外，眼镜蛇毒因子(参见Gerwurz等，1967，以上引用的)或可溶性补体受体(参见，例如，Pruitt等，Trans.Proc.24：477-478，1992)的大量施用显示出在降低补体活性上有效，利用这些方法，至少两个独立的小组已显示在移植之前的宿主补体的抑制作用导致延长的异种移植物存活。参见，例如，Platt等，当今免疫学11：450-456(1990)；Lexer等，Trans.Proc.19：1153-1154(1987)。如果宿主补体连续不断地被抑制，则通常在几小时内受到排斥的异种移植物被保持几天和几周。此外，在Miyagawa等，移植46：825-830(1988)中，利用天竺鼠到大鼠心脏模式的不一致的异种移植排斥的机理被观察到主要由经旁路途径的补体活化发生，尽管作者提出补体调节蛋白可以是物种特性的。以前已描述了补体调节蛋白质或同源补体限制因子，例如，Imutran Limited的PCT申请WO91/05855。
Platt等(1990，以上引用的)进行了这一领域的其它研究，他们推测产生在猪的内皮细胞膜中直接表达人衰变加速因子(DAF)以及可能的其它补体调节蛋白质的转基因猪是可能的。他们认为，如果这样的动物用作供体动物，那么人补体抑制剂将用于保护移植物免遭人补体。Platt等没有描述用于完成这一目的任何特异性的遗传构建体。
Dalmasso等(移植52：530-533，1991)提出了工程转基因供体动物，如猪，这些动物具有人膜相关C-抑制基因，以在异种移植物内皮细胞中获得相应的蛋白质的高水平表达。
与这一策略一致，White等(WO 91/05855)制备了携带编码人膜辅因子蛋白质(MCP)(也称为CD46)或人衰变加速因子(DAF)的转基因的小鼠。所说的转基因由形成连接到编码补体抑制剂的cDNA上的病毒5’长末端重复序列Friend脾灶(focus)组成。然而，他们没有确定这些基因是否表达，并且，如果表达，在哪一组织中表达，或者转基因动物的移植物在不同的动物中是否会引发HAR。
同样地，Yannoutsos等，First Int’l Congr.Xenotr.，Abstracts，第7页(1991)描述了表达人DAF和MCP的转基因小鼠的开发。在这研究中，使用了一系列广谱启动子，以便使在内皮细胞中发生一些总补体抑制剂表达成为可能。他们的动物的大多数显示出具有十分低水平的补体-抑制剂表达。此外，他们没有确认那种表达在内皮细胞中已经完成，也没有说明转基因表达的CRP的生物功能。
采用部分基因组DNA片段已产生了含有人DAF基因的转基因小鼠和猪(Cary等，Trans.Proc.25：400-401，1993：Cozzi等，Trans.Proc.27：319-320，1995)。这些动物被断言表现出DAF的广泛表达，尽管在造血组织中表现出差的表达。最一致的表达在脉管平滑肌中观察到，在内皮中具有可变的表达。应该注意，转基因器官不在移植条件下试验，而PBMC细胞采用ELISA和RIA分析。因此，没有数据提供来说明这些转基因器官能在移植情形下阻止HAR。
Oldham等，1993年在异种移植的第二次国际会议上进行了一次演讲，其中宣布了人CD59小基因的产生以及这一小基因的修饰使得两种cDNA序列可以插入到小基因中。仅包含CD59cDNA的小基因在转基因小鼠中的表达显示CD59蛋白质表达的细胞类型分布类似于在人组织中所见到的。然而，就这一小基因而言存在严重限制其有效性的问题。
Foder等，美国科学院院报，91：11153-57(1994)致力于产生转基因小鼠和猪，这些转基因小鼠和猪通过在小鼠主要组织相容性复合物(MHC)I类基因H2Kd启动子控制下表达CD59产生补体抑制剂CD59。后一基因编码抗原(其为优势内皮细胞表面抗原)。CD59cDNA被克隆进MHC基因的9.0kb EcoRI基因组限制片段的外显子I中。这一片段包括大5’序列，所有8个外显子(和间插序列)以及更小的3’序列。作者指出CD59在小鼠心脏中以及小鼠和猪尾两者中的存在，没有讨论在其它地方的表达。在内皮和内皮细胞两者上观察到表达。
用DNA狭线印迹分析分析了十八只仔猪，发现一只具有所说基因的10-20个拷贝，而其他两只仅含有所说基因的1个拷贝，并显示出在外周血单核细胞(PBMCs)中不表达或者表达的非常低和不一致的水平。在各种组织和细胞类型(包括成纤维细胞，上皮细胞，脉管内皮细胞以及平滑肌细胞)上发现CD59的低水平。当受到细胞因子(已知其诱导MHC I类启动子)的刺激时，CD59的表达增加。另外，因为转基因器官不在移植情形下试验，所以不被知道器官对补体介导的排斥是否敏感。除以上指出的启动子之外，几种其它的启动子已用于在转基因动物的内皮细胞中完成转基因的表达。然而，在这些现有的例子中，转基因不是补体抑制剂。
Aird等(美国国家科学院院报，92：4567-71(1995))已产生了携带嵌合构建体的转基因小鼠，所述构建体包括符合读框地融合进大肠杆菌lacZ基因的487bp 5’侧翼序列和人von Willebrand因子基因的第一外显子。对成年人组织的组织化学分析显示在人脑血管的内皮细胞中存在LacZ表达，而在脾，肺，肝，肾，睾丸，心脏和主动脉的脉管床中缺乏活性。某些后面的床含有高水平的内源性von Willebrand因子。这提示被克隆序列之外的序列对von Willebrand因子的真实表达是必需的。一个系在人脑组织中不显示LacZ活性，对这一发现的一种解释是在或靠近转基因整合位点的基因组序列可以影响表达的形式。
Aird的VWF启动子对于指导内皮细胞的表达具有有限的价值，因为它的表达对脑组织是有限的。为了比较，Aird等通过同源重组将大肠杆菌lacZ基因融合到内源性凝血调节蛋白基因的启动子上。所形成的转基因小鼠在所有器官的内皮细胞中显示出LacZ活性，包括脑，脾，肺，肝，心脏，肾和主动脉。
Harats等，J.Clin.Invest.，95：1335(1995)采用利用鼠前内皮素原-1启动子将基因表达定向在转基因小鼠的脉管壁上。他们的构建体包括5.9kb的5’侧翼区，第一外显子(具有克隆进非编码区中Bg1II位点的萤光素酶报道基因)以及0.9kb的第一内含子。在所有小鼠中，最高水平的表达在主动脉中，高水平也在其它大动脉上出现，在小的肌动脉上，在毛细管中达到更低的程度。在静脉中的表达水平更低。与肝和脾中相比，在心脏，肾和肺中的血管表达较高。即使在相同的器官中，在血管表达上也有基本上的差异。也观察到某些非血管表达。
Dumont等(基因和发展，8：1897-1909(1994))创造了转基因小鼠，这些小鼠在内皮受体酪氨酸激酶启动子(tek)的控制下表达lacZ报道基因。这一启动子以限制使用的方式受到调节，即，启动子在胚胎发育期间起作用，而随后在成年者中不起作用(Dumont等，1994)。
如果不受到细胞因子刺激，鼠H2Kb1类启动子允许在内皮细胞中表达，细胞因子刺激可以引起高水平的表达(Foder等，1994，以上引用的)。
除以上指出的启动子之外，还有许多与编码在内皮细胞表面上表达的蛋白质的基因有关的启动子。本领域中没有这样的共有序列，为获得兴趣基因的内皮表达启动子对其是最合适的，尤其是在转基因动物中。
目前，另一种将C-抑制剂送递至可移植的器官的方法由Byrne等开发(PCT/US 93/08889)。补体抑制剂在转基因动物的红细胞中特异性地表达，然后该蛋白质被转移到它们的器官与组织的血管内皮上。一旦兴趣器官被″涂上″在预期的受体中有活性的补体抑制剂，该器官就可用安全地移植。
虽然这一方法是有前途的，但完成血管内皮的充分覆盖需要花费时间，在器官可以用于移植之前要延迟一段时间。另外，一旦供体组织从转基因动物收获，在供体组织的表面上的蛋白质置换就不发生，这是因为器官自身不产生这种蛋白质。不得不经常用转基因动物的血液再灌注器官，以保持高的表达。因此，尽管这一方法有前途，但它有一定的局限性。例如，这种探索在该蛋白质在内皮组织中不可能表达。或者是用于补足表达水平(这可能被证明在移植后最初几周是有益的)的情形之下是有益的。
Thorley等(移植进展，27：2177-78(1995))报告了CD46(膜辅因子蛋白质，MCP)小基因的构建。CD46基因长度超过45kb，妨碍使用质粒载体中的全长插入。小基因来源于基因组和cDNA源。它由7,5kb基因组的序列(从450第1外显子5’到第3内含子)以及与外显子3-14对应的cDNA序列组成。该小基因用于制备转基因小鼠。然而，在那些小鼠中的基因表达模式不确定。
因此，还没有开发任何令人满意的产生转基因动物的方法，所说的转基因动物以合适的水平表达补体抑制蛋白质基因，以便所述转基因动物的器官与组织在具有降低或消除的超急性排斥的异种移植中有用。此外，还没有制造这样一种DNA构建体，其在相同的基因座中含有若干补体抑制剂基因，它们可以用来消除在从远相关物种异种移植(如从猪至人)后出现的超急性排斥的问题。
此外，如上所述，其它最近的研究已表明抗体介导的排斥(包括超急性排斥)由异种反应性天然抗体(或XNAs)结合到存在于移植物内皮细胞上的糖结构上启动，其导致补体级联激活。参见，例如，Platt等，移植50：817-822(1990)。这样，已显示在异种移植物上的优势糖表位(其被XNAs识别，因此对抗体介导的排斥首先起作用)是半乳糖(α1，3)半乳糖，也称为gal表位或Galα(1，3)Gla。参见，例如，Sandrin等，P.N.A.S.90：11391-11395(1993)和移植回顾，8：134-149(1994)。这一表位在灵长类，Old World猴和人类中不存在。参见Good等，移植进展，24：559-562(1992)和Galili等，P.N.A.S.84：1369-1373(1987)。人们相信，gal表位通过催化半乳糖添加至N-乙酰乳糖胺(N-lac)核上的酶Galβl，4GlcNAc3-α-D-半乳糖基转移酶(或″α(1，3)GT″；EC2.4.1.51)。在高尔基体外侧合成，参见Blanken等，生物化学杂志，260：12927-12934(1985)。人类与猩猩和其它Old World猴一样，没有gal表位，这是由于缺乏功能性α(1，3)GT基因，如在例如Galili等，生物化学杂志263：17755-17762(1988)和Larsen等，生物化学杂志265：7055-7061(1990)中所显示的。
由于XNAs的特异性和以前的研究说明了某些方面的抗体介导的排斥(如HAR)可由这些抗体的耗竭所延迟，因此，这一领域的研究曾试图开发获得非人供体组织的方法，这一组织缺乏gal表位，或已明显降低了这一表位水平，以便这一组织被移植进人患者后不产生HAR。然而，达到gal表位的降低以便可用产生适于异种移植的组织的充分和有效的方法的开发被证明是一项困难的任务，因为有关酶促途径的复杂性导致在异种移植组织中产生糖表位。
例如，Galβ2-α-L-岩藻糖基转移酶(也被称为α1，2岩藻糖基转移酶或″α(1，2)FT″；EC 2.4.1.69)牵涉到Fucαl，2Galβ-表位(也被称为H抗原)的形成，在人患者中普遍接受和是人ABO血型系统中的前体分子的血型″O″的特征结构。α(1，2)FT的底物分子之一是N-lac，其作为半乳糖受体也被α(1，3)GT利用，参见Lowe，Semin.Cell Biol.2：289-307(1991)和Paulson等，生物化学杂志264：17615-17618(1989)。体外底物特异性研究已显示岩藻糖化(或唾液酸化)N-lac对α(1，3)GT是一种差的底物。参见Blanken等，生物化学杂志260：12927-12934(1985)。然而，虽然已知几种岩藻糖基转移酶，但每一种酶的酶促途径上的区别使得在每种程度上不可预测具体的酶在异种组织中表达时怎样进行。
另一个也用N-lac为受体的糖基转移酶是β-半乳糖苷α(2，6)唾液酸转移酶(也被称为α(2，6)唾液酸转移酶或″α(2，6)ST″；EC 2.4.99.1)，其将唾液酸残基转移到糖蛋白的N-联糖基团上，参见，例如，Lowe，Semin.Cell Biol.2：289-307(1991)。酶α(2，6)ST在人内皮细胞，B细胞等中表达，并且因此不应该是抗原性的。参见Dorken等，白细胞分型，白细胞分化抗原，Knapp等，编者，牛津大学出版社，109-110页(1989)和Hanasaki等，生物化学杂志269：10637-10643(1994)。事实上，因为它的负电荷，唾液酸有时显示出抑制人补体旁路途径的活性。参见Fearon，P.N.A.S.75：1971-1975(1978)。然而，唾液酸转移酶有巨大差异，并且任何具体的唾液酸转移酶的效能亦各不相同。
在可以与α(1，3)GT酶促途径竞争的途径中的其它糖基转移酶是β1，3 N-乙酰葡糖胺基转移酶(或“β(1，3)NAGT”)，Kornfield等，生物化学年评54：631-664(1985)中描述了该酶。然而，与β(1，3)NAGT相联系的复合酶促途径是很不清楚的，尚未公开和提议这样的酶在异种移植有用的异种供体组织，器官，细胞或非活组分中降低gal表位水平的方法中是有用的。
此外，以前也未显示任何其它糖基转移酶(例如人α(1，2)FT或α(2，6)ST)在转基因动物(例如猪和小鼠)中的表达可以在多种器官的内皮细胞上产生合适的抗原，以便达到XNA结合的降低(和随后的补体活化)，并使得可以大规模地从转基因动物产生可用的供体组织和器官，这些组织和器官在移植进人患者时具有降低的或消除的抗体介导的排斥。另外，以前的研究者已认为，所涉及的使用糖结构(例如α(2，6)唾液酸转移酶或α(1，2)岩藻糖基转移酶)的技术产生在异种移植中有用的具有改变的gal表达的转基因动物是不可能的，参见，Cooper等，免疫学回顾141：31-57(1994)。再者，因为唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶的复杂性和这些组的个体成员之间的基本上区别(参见，例如，Kitagawa等，生物化学杂志，269：17872-17878，(1994)，所以这些组的任何特定成员潜在的有用性仍然是不确定的和不可预测的，并且事实上，许多这样的酶对异种移植可能是不合乎需要的。
此外，还没有表明可以制备这样的转基因动物，其表达多种类型的能够在异种移植后有效地掩蔽或降低抗原性Gal表位水平并同时降低激活补体级联的可能性的基因。同样地，以前也没有表明补体抑制剂基因可以用于与掩蔽或降低gal表位水平的基因组合，以产生适用于移植转基因动物。最后，以前没有完成将多种基因置于单一DNA构建体上，该构建体可以转染进供体动物并表达，以便在供体动物的器官、组织、细胞或非活组分移植进人患者时，给出对抗体介导的排斥的增加的保护水平。
发明概要
因此，本发明的一个目的是开发这样的转基因动物(如猪或小鼠)，它们能够表达掩蔽或降低gal表位水平的酶和补体抑制剂两者，并且因此能够获得降低的抗原性Gal表位水平和随后的由移植来源于这些转基因动物的器官、组织、细胞或非活组分引起的补体活化作用。
本发明的另一个目的是提供这样的转基因动物，由于它们在移植后达到XNA结合和随后的补体活化两者基本上降低的能力和由此当移植进人患者时降低或阻止抗体介导的排斥(如超急性排斥)以及补体介导的排斥的能力，它们在异种移植中有用。
本发明的另一个目的是提供获得表达至少一种酶和至少一种补体抑制剂的转基因动物的方法，所述的酶包括但不限于α(1，2)岩藻糖基转移酶，α(2，6)唾液酸转移酶，β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶，或能够掩蔽或降低gal表位水平的其它合适的糖基转移酶，所述的补体抑制剂包括但不限于CD59，DAF和/或MCP。本发明的另一个目的是提供利用来源于由本发明产生的转基因动物的供体器官、组织、细胞或非活组分进行异种移植，以便在人受体中降低或除去抗体介导的或补体介导的排斥的方法。
本发明的另一个目的是提供通过产生可以表达能够在内皮细胞中掩蔽或降低gal表位水平的糖基转移酶或其它合适的酶，的转基因动物，获得合适的具有掩蔽的或降低的gal表位水平，并且在被移植进人患者时不太可能产生抗体介导的排斥的供体器官、组织、细胞或非活组分的充分供给的方法。
本发明的另一个目的是提供异种器官、组织、细胞或非活组分，它们表达能够掩蔽或降低gal表位水平的至少一种酶，其包括但不限于α(1，2)FT，α(2，6)ST，β(1，3)NAGT，和至少一种编码补体抑制剂，其包括但不限于CD59，DAF和/或MCP的基因，因而具有掩蔽的或降低的Galα(1，3)Gal表位水平和在移植进人患者后引起抗体介导的或补体介导的排斥的极大降低的可能性。
本发明的另一个目的是产生转基因猪，其表达编码多基因座的构建体，该基因座编码两种或多种补体抑制剂蛋白质并且其优先表达高水平的所有这些补体抑制剂。
本发明的还一个目的是提供单一DNA构建体核酸以及产生转基因动物的方法，所说的核酸编码能够掩蔽或降低gal表位水平的至少一种酶，其包括但不限于α(1，2)岩藻糖基转移酶，α(2，6)唾液酸转移酶，或β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶，和至少一种补体抑制剂，其包括但不限于CD59，DAF和/或MCP，所说的转基因动物表达这一构建体，该转基因动物在提供移植进人的器官、组织、细胞或非活组分上是有用的。
通过产生表达至少一种能够掩蔽或降低抗原性Galα(1，3)Gal或gal表位水平的酶，其包括但不限于糖基转移酶，例如α(1，2)岩藻糖基转移酶(“α(1，2)FT”)，α(2，6)唾液酸转移酶(“α(2，6)ST”)和/或β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶(“β(1，3)NAGT”)，和至少一种补体抑制剂蛋白质，包括但不限于CD59，DAF和/或MCP的转基因动物，在本发明中达到了本发明的这些目的和其它目的。这样，按照本发明所产生的转基因动物表达至少一种与α(1，3)半乳糖基-转移酶竞争的酶，由此掩蔽或降低gal表位的产生，否则，所述表位在人中被异种反应性天然抗体(XNAs)识别，由此导致抗体介导的排斥。
此外，按照本发明，本发明提供了表达编码多种补体抑制剂的核酸构建体(例如补体抑制剂蛋白质的三种基因座位)的转基因动物，该转基因动物优先表达高水平的所有三种这些补体抑制剂。通过按照本发明的这一方面构建转基因动物，可以从这些转基因动物(其表达补体调节蛋白质，这些蛋白质起作用以抑制在外源组织被XNAs识别后出现的补体活化)获得供体器官、组织、细胞以及非活组分，在它们移植进人体后所形成的免疫排斥将被极大地降低或消除。
因此，本发明的方法由此在提供可以安全和有效地移植进人类的异种器官、组织、细胞以及非活组分中是有用的，这样将降低或消除对从人或灵长类供体获得器官、组织、细胞以及非活组分的需要。此外，本发明提供了在单一DNA构建体中的补体-抑制蛋白质的多个基因座，其也可以制备得还包括编码能够掩蔽或降低gal表位水平的酶的核酸，这一点将在以下提供的本发明的详细说明中描述，或者是从其中可以明显看到的。
附图简要描述
现在参照其优选的实施方案以及附图详细描述本发明，在附图中：
图1.涉及按照本发明的CD59小基因的构建。人CD59基因座位的基因组结构在顶端图中显示。下面是所构建的两种CD59小基因(CD59小基因1和CD59小基因2)以及基于CD59小基因2的CD59小基因盒。虚线代表从各小基因构建体省略的人基因中的序列。在每一个小基因构建体下注明了各CD59基因部分的多少个千碱基存在于小基因的各部分中；
图2.涉及转基因小鼠RBC补体介导的裂解。如在图中所观察的，人CD59的表达给予暴露于人血清下时细胞免于补体介导裂解的保护作用。人们可以通过在与不同稀度的人血清一起温育后测定基于RBCs裂解的血红蛋白的吸收检测这一活性。虽然50％的非转基因C57BL/6小鼠RBCs在约3％的人血清中裂解，但CD59小基因2小鼠的RBCs的50％裂解在约27％的人血清下观察到。图中将其与在约9％人血清下裂解的CD59P1小鼠RBCs的50％裂解比较。这样，CD59小基因2小鼠RBCs比非转基因小鼠RBCs对补体介导的裂解的抗性高约10倍，并且比CD59pI小鼠RBCs高约3倍；
图3.代表按照本发明产生的CD59转基因小鼠的Northern分析。所表明的人组织，转基因CD59 p1小鼠组织，CD59小基因#2小鼠组织，以及CD59小基因#1小鼠组织的RNA由Northern印迹进行分析。与可能基于在小基因构建体中可供聚腺苷酸化的0.7，1.3，1.9和2.1KbmRNA比较，所分析的所有CD59小基因#2小鼠组织更多地编码3.1KbCD59mRNA。我们已显示所说的mRNA包含一个完整的编码区，并且利用已知的聚腺苷酸化位点。看起来，转录物的大小的变化是由于内含子1内的异常间距。然而，从这一转录物产生了一种功能性人CD59蛋白质；
图4.涉及P1装配的新YAC克隆载体，并且代表YAC，具有用来创造含MCP，CD59和DAF(按此种顺序)的构建体的所有相关限制酶切位点。
图5.涉及P1-克隆，并且是用来将三种补体调节蛋白质整合进YAC的可替策略的图解。利用这一策略，用同源重组和选择适当的重组体的营养缺陷标记来依次装配三种基因克隆(具体细节参见实施例V)；
图6.是按照本发明所利用的cDNA表达构建体#876的示意性图解；
图7.是按照本发明所利用的cDNA表达构建体#881的示意性图解；
图8.是按照本发明所利用的cDNA表达构建体#882的示意性图解；
图9.是在经凝集素结合测定法测定时，UEA-I或GS-1-B4凝集素结合到未转染的CHO细胞(或CHO-N细胞，用■表示)，由α(1，3)GT基因转染的CHO细胞(或CHO/GT细胞，用o表示)，由α(1，2)FT基因转染的CHO/GT细胞(CHO/GTFT细胞，用□表示)上的示意性图解；
图10.是在经SDS-PAGE(8％凝胶)分离并转移到膜上时，UEA-I和GS-1-B4凝集素结合到CHO-N细胞，CHO/GT细胞和CHO/GTFT细胞的膜糖蛋白上的SDS-PAGE图解；
图11.是在按照本发明在转基因小鼠中产生的α(1，2)FT mRNA的Northern分析图解；
图12A-D是转基因和非转基因鼠心脏切片的显微镜下荧光分析(其利用按照本发明的α(1，2)基因表达证实gal表位减少)的显微照片，所说切片由FITC缀合凝集素染色，其中A和B分别是用UEA-I染色的非转基因心脏和转基因心脏，其中C和D分别是用CS-1-B4染色的非转基因心脏和转基因心脏；
图13A是与非转基因小鼠相比，异种反应性天然抗体结合到按照本发明产生的α(1，2)FT转基因小鼠的内皮细胞上降低的流式细胞计数分析；
图13B是与非转基因小鼠相比，在兔血清与按照本发明产生的α(1，2)FT转基因小鼠的内皮细胞一起温育后，补体介导的裂解水平降低的图示。
图14A-D是α(1，2)FT转基因和非转基因猪尾切片的显微镜下荧光分析(其利用按照本发明的α(1，2)基因表达证实gal表位减少)的显微照片，其中A和B分别是以UEA-I染色的非转基因猪尾和转基因猪尾，其中C和D分别是以GS-1-B4染色非转基因猪尾和转基因猪尾。
优选实施方案的详细描述
按照本发明，本发明提供了一种将器官、组织、细胞或非活组分移植进人患者的方法，该方法降低或阻止抗体介导的排斥(如急性排斥)以及补体介导的排斥。这一方法优选地包括产生表达至少一种能够降低异种反应性抗原水平的酶与至少一种补体抑制剂的转基因动物，所说的酶包括但不限于糖基转移酶，例如α(1，2)岩藻糖基转移酶(“α(1，2)FT”)，α(2，6)唾液酸转移酶(“α(2，6)ST”)和/或β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶(“β(1，3)NAGT”)，所说的补体抑制剂蛋白质包括但不限于CD59，DAF和/或MCP。此外，本发明包括利用如此产生的转基因动物以提供充分供给的合适的供体器官、组织、细胞以及非活组分的方法，该方法可用于在具有宿主中降低的或消除的免疫系统排斥的异种移植方法中。
本发明已经得到完成，使得克服了以前与异种移植有关的问题(这些问题由异种反应性天然的抗体(XNAs)结合供体组织受体和随后的补体活化引起)，并提供了充分供给的在具有降低的或消除的抗体介导的排斥的异种移植方法中有用的合适的供体器官、组织、细胞以及非活组分。尤其是，本发明发明人已确定，与α(1，3)GT酶竞争的特定酶包括α(1，2)FT，α(2，6)ST和/或β(1，3)NAGT，它们在表达这些特定酶的的器官、组织、细胞以及非活组分中掩蔽和降低gal表位水平上可以是有用的。此外，尽管以前认为在试图降低和避免异种移植后严重的免疫反应中使用补体抑制蛋白质是合乎需要的，但是现有的方法以前没有有效地提供能够在内皮细胞中表达足够水平的补体抑制剂，以获得补体活化水平明显降低并在组织移植后降低抗体-和补体-介导的排斥的模式。具体说来，以前的在内皮细胞上施加C-抑制剂的尝试不能保持在供体器官内皮细胞中的一致的高水平的补体抑制剂的表达。
在本发明中，现在申请人首次制备了这样的转基因动物和DNA构建体，其在相同的整合位点包含编码至少一种能够在内皮细胞中降低抗原性Gal表位水平的酶和至少一种补体抑制剂蛋白质或补体调节蛋白质的核酸。尤其是，借助酵母人工染色体(或YAC)可以达到这一目的，在优选的实施方案中，所说的染色体可以构成大片段的DNA，该DNA含有多个编码能够降低gal表位水平之酶的基因和编码多个补体抑制蛋白质的基因。通过使用本发明的YACs，获得了一个明显的优点，因为编码所需酶的多个基因与编码所需补体抑制蛋白质的多个基因组合在一起，可以获得编码所有所需酶和蛋白质的单一DNA构建体。
这样优选地是工程化YACs，使其包含多个抑制剂基因。通过把所有基因放在一单一YAC上，可以保证所有基因在相同的位点以以前不能获得的方式整合，并且在繁殖时这些基因不相互分离。使用YACs是由于它们的相对于其它常规克隆载体而言的高的插入容量。利用按照本发明的这些大的YACs将大大改进获得合适的转基因动物的效率，由于为了获得两种所需类型的蛋白质(特别是以上讨论所所需的酶与补体抑制蛋白质)的表达，仅需要将这一单一YAC构建体转染进一种所需的动物中以及产生远比以前获得的任何转基因动物更适于异种移植的转基因动物。
在另一个本发明的优选的实施方案中，所需的基因以小基因的形式制备，其可以在一个构建体上包含所有的所需基因，或者其中构建多种小基因，它们中的至少某些含有编码至少一种特定的能够降低或掩蔽gal表位水平的所需酶的核酸，它们中的至少某些含有编码至少一种所需补体抑制性蛋白质的核酸。在后一种情况下，至少一种编码至少一种能够降低gal表位水平之酶的小基因与至少一种编码至少一种补体抑制剂的小基因一起转染，以便所形成的转基因动物表达按照本发明的所需的酶和所需的补体抑制剂两者。
在另一种本发明的方法中，也使用了以噬菌体P1克隆形式的构建体。在优选的实施方案中，可以产生CD59 P1克隆(和其它补体调节蛋白质P1克隆)，其理想地是含有CD59，MCP和DAF的完整基因组调节系统，并且可被证明直接和作为基因材料的来源是有用的。由于构建体的大小，在P1构建体中的CD59基因的表达不太可能受整合位点，作为缓冲物的插入部分远侧的影响。
在以上描述的适用于产生按照本发明的转基因动物的优选的方法中，在所有时间在供体器官的内皮细胞中获得了一种或多种人类补体调节蛋白质(包括但不限于CD59，DAF和/或MCP)的高表达，以及降低gal表位水平的酶的表达，其可以降低或阻止抗体-或补体-介导的排斥，包括超急性排斥。优选的是，这些表达载体含有至少一种补体抑制蛋白质，例如CD59，MCP或DAF，但在特别优选的构建体中，多种补体抑制剂被用于一单一克隆中。这些动物在内皮细胞中具有高的补体抑制剂组成型表达水平，并且因此达到所观察到的超急性排斥的降低。此外，如同以下将要提出的，在转基因小鼠和转基因猪两者的内皮细胞中按照本发明形成的表达一种或多种补体抑制蛋白质的核酸构建体可以与表达能够降低gal表位水平的酶的核酸构建体组合。
这样，本发明涉及在转基因动物上皮细胞表面上蛋白质，包括但不限于能够掩蔽或降低抗原性Galα(1，3)Gal或gal表位水平的糖基转移酶，例如α(1，2)FT，α(2，6)ST，β(1，3)NAGT)的表达以及补体抑制蛋白质，包括但不限于CD59，DAF，MCP和/或本文描述的其它补体抑制剂的表达其中所述转基因动物已经遗传工程化或源育种含有产生这些蛋白质和酶的基因。
如上所述，本发明的一个优选的方面是制备和利用表达至少一种补体抑制蛋白质(包括但不限于CD59、DAF和/或MCP)以及降低内皮细胞表面抗原性Gal表位水平的酶的小基因。在本发明的转基因动物的制备中，优选的是编码降低或掩蔽抗原性Galα(1，3)Gal或gal表位水平的核酸(如DNA)掺入单一核酸构建体(例如以小基因的形式)中，所说的构建体也包括编码至少一种补体抑制剂蛋白质(如CD59和/或其它补体抑制剂，包括DAF和MCP)的核酸，如以下所要描述的。另外，以本发明的这种模式，也可以制备一方面编码能够降低gal表位水平的酶，另一方面编码一种或多种补体抑制蛋白质的分离的小基因，可以将这两种类型的小基因共注射进转基因动物，以获得具有按照本发明的两种所需类型的基因的子代。以下将详细描述本发明的小基因的构建方法。
A.CD59小基因
编码序列是这样的序列，在适当的条件下，其被转录成信使RNA，并且被翻译成多肽。由于遗传密码的简并性，许多不同的RNA序列编码相同的多肽，因此所有这些序列都被认为是编码序列。在作必要的修改后术语″编码序列″也用于指被转录成″反义RNA″的DNA序列，所述“反义RNA”仅仅是信使RNA转录物，该转录物预期与靶信使用范围RNA杂交，由此阻止靶mRNA翻译成多肽。“反义RNA”翻译成多肽是不需要的。
人们也可以定义影响编码序列的转录和翻译的″调节序列″。启动子是位于编码序列上游5’的调节区，含有DNA-指导的RNA聚合酶结合位点，由此起始转录。术语″启动子″经常用来不仅指那一结合位点，而且指编码序列5’调节元件的复合体，通常包括决定编码序列表达环境的元件。调节DNA也可以包括位于编码序列3’的序列，如″终止子″。
在哺乳动物基因组中，某些基因的编码序列被称为″间插序列″或“内含子”的非编码序列中断。此时，该编码序列被说成是被划分成许多“外显子”。这样一种基因的基因组DNA被转录成前信使RNA，然后，其被加工，除去内含子，产生成熟的RNA转录物。后者接着被翻译成多肽。在某些基因中，内含子含有可以影响该基因转录或翻译的调节元件。参见，例如，Laherty等，生物化学杂志.，264：11222-27(1989)，该文献报道了人血小板反应蛋白基因的第一内含子除去导致转录活性的4倍丧失。
如果一个完整的基因是从基因组直接分离的，则它将包含内含子(如果有任何内含子的话)。然而，编码序列可以通过从细胞分离成熟mRNARNA，然后合成互补DNA(cDNA)获得。cDNA的编码序列将不被内含子中断。
小基因是这样的基因，其不同于真实基因组序列之处在于一个或多个内含子的至少一部分被缺失，但不同于相应的cDNA之处在于其具有一个或多个内含子的至少一部分。小基因可以通过从基因组片段缺失遗传物质，通过把遗传物质插入到cDNA中，或通过直接合成来构建。
在Petranka等，美国国家科学院院报89：7876-79(1992)和90：5878(1393)，以及Imutran有限公司的PCT申请WO96/12804中描述了CD59基因的结构。它包含跨度约20kb的四个外显子。第一外显子45bp长，并且是完全非翻译的。它通过内含子(原来指出为5.4kb，但后来确定为19kl)与外显子2分离。外显子2长度为85bp，并含有18bp非翻译区，随后是编码大多数蛋白质疏水信号序列的序列。外显子2和3被大约5kb的内含子分离。外显子3长度为102bp，编码前导序列的其余部分和成熟蛋白质的头31个氨基酸。外显子4在7kb的内含子之后开始。外显子4包括翻译序列的其余部分以及UT序列的至少1438bp。
进行CD59小基因的构建以阐明在转基因动物中利用由异源启动子驱动的cDNA所固有的缺陷。对这样的构建体的总的观察结果是在衍生的转基因动物品系中转基因的不一致的表达以及不一致的组织和细胞类型表达(其与用内源性基因所观察到的不匹配)。此外，转基因表达水平常常不是最佳。推定对同源启动子的利用将克服这些问题。就水平和组织/细胞类型特异性而言，对指导各自的基因合适的表达必需和足够的CRPs区尚未公开地公开过。另外，迄今所定位的每一基因都地非常大的，至少40Kb。因此，进行CD59小基因的构建。选择CD59为原型有几个理由。CD59是最简单的C-抑制剂基因，因为它仅有4个外显子(与DAF中11个外显子以及MCP中的14个外显子比较)。CD59利用可替的聚腺苷酸化位点但是似乎不采用有差别的剪接。因为有差别的剪接，MCP和DAF基因的转录产生几个RNA同等型，使得难于选择哪些外显子包括在最终的构建体中。此外，CD59在所有我们感兴趣的相关的细胞类型中高水平地表达，而MCP(例如)不是如此。
对CD59小基因的设计要考虑几个事项。为了使用两个或更多小基因或小基因盒的可能性，限制CD59小基因的大小是重要的。确定的是内含子序列的大多数可以被删除(be dispenseed of)，保持完整的内含子1的部分(4.5kb)，使得可以剪接。对有效的转基因表达来说，通常至少一个剪接位点是重要的。选择内含子1，因为外显子1是非编码外显子，而内含子1是。内含子1被认为是对基因表达的调节来说重要的最可能的内含子，这是由于其这样一种大的保守性，可以选择基因的非编码区，因为在某方面(即，基因调节)它是功能性的。
还没有限定在基因表达中起作用的启动子序列，除了就在转录起始位点上游的两个Spl位点外，转录起始位点的基因5’区的分析没有揭示出任何转录因子结合位点，基于经验6.5Kb区选择来用作启动子序列，一般来说，那种大小的区应该大得足以包括基因调节区，但不至于大得也含有存在于CD59的5’并可以与CD59头-对-头取向构型的基因的调节区。如果出现这样的情况，人们可以干扰基因表达的调节作用。
约4.7Kb的3’非翻译序列被包括进CD59小基因1中，以保证存在五个聚腺苷酸化位点的四个。以相对较低的频率被使用的第五个位点未被定位，但是其比最常使用的位点在更下游至少3Kb。在一些基因中已显示，3’非翻译区含有赋予mRNA稳定性的序列，如果对CD59是这种情况，人们会感觉到4.7Kb应该包含这样一种区。
将CD59的编码区作为具有添加到外显子25’的合成的剪接接纳位点的cDNA插入到构建体中。这是最简单的方法，因为事先没有确定哪一(如果有任何的话)余下的内含子可以发挥影响基因表达调节的作用。
在小基因2中，为了给出CD59基因转录的低水平，将内源性内含子的部分添加至各外显子的周围。这将保证对剪接来说重要的RNA的分支点被包括在各剪接接纳位点以及对保持剪接所需的蛋白质结合位点的二级结构是必需的周围序列中。为了掺入这些区，推定各外显子5’和3’的最小200bp内含子应当包括进新的基因中。然而，在本说明书的教导下，技术人员可以用包含较少量或较大量的内含子的近侧部分进行实验。保持在每一内含子3’和5’末端的量可以相同或者不同，并且可以随不同的内含子变化。
CD59小基因2的3’非翻译区从4.7Kb降低至1.7Kb。如以前所提及的，我们对保持小基因的大小至最小感兴趣，1,7Kb包括四个最常利用的聚腺苷酸化位点。此外，虽然较大的3’区用于CD59小基因1以包括可能的稳定化序列，但也存在位于所述基因3’端的稳定化序列的可能性。然而，在本说明书的指导下，本领域技术人员可以试验包括较大的或较小的3’区，或缺失3’区的选择的中性的或去稳定化的序列，然后连接那个区的以前不邻接的序列的效果。
几种观察结果说明CD59小基因2的5’从6.5Kb降低至4.6Kb。来自同事的通讯揭示出存在于CD59 5’区的DNase I超敏位点相当接近转录起始位点，表明对于转录调节区其是必要的，并且附加序列是不必要的。象以前所论及的，把小基因修整为最小大小以便共注射多种基因是我们最大的兴趣。其次，观察到用于小基因1的6.5Kb 5’区的克隆经常导致5’最末区的重排和缺失。存在这一区不稳定的可能性，因而作为转基因的不合乎需要的。最后，来源于2种不同的基因组F1克隆的分析的初步的和较后的非证实性数据表明CD59的较小的5’区基本上引起较高水平的基因表达。当然，由于本说明书的指导，读者可以用包含的更大或更小量的5’区和用其中性或去稳定化区的选择性缺失进行实验。
为了利用CD59小基因2作为表达盒，进行许多变化。首先，发现通过将cDNA插入非翻译外显子中的Xho I位点将CD59小基因1转换成表达盒的尝试是不成功的，因为插入的cDNA的表达是罕见的，如果存在的话也是非常低的。此外，对启动子区的进一步研究使得我们相信这是因为CD59启动子(无TATA框启动子)很可能利用起始元件(典型地称为Inr)作为结合转录元件。Inr’s通常十分靠近转录起始位点。用作为插入位点的Xho I位点也十分靠近转录起始位点，并且因此破坏这一区可能危害转录起始。另外，CD59小基因1构建体在表达盒中使用的方式使CD59编码区完整。这可能引起CD59与所插入的cDNA的表达的竞争。
为了阐明上述现象，突变表明外显子2中起始甲硫氨酸的ATG，在其位点插入两个单一的限制酶位点，Kpn I和Xho I。这些位点用作克隆位点以引入任何兴趣基因。对CD59小基因2的修饰基于从同事收到的其它信件，揭示出第二DNase I超敏位点位于外显子2上游约0.9Kb。DNase I超敏位点经常与在基因调节中重要的区相关联。为了将这一潜在地重要的DNA的区包括进CD59小基因2盒，把附加的0.83Kb DNA添加至现有的0.5Kb内含子1(其直接是外显子2的5’)上。以给出总共1.3Kb的内含子序列。
对小基因2盒的几种改变是可能的，以下描述其中一些。
不同的启动子
构建各种DNA片段的顺序需要作为最后步骤的启动子元件的添加。这使得不同的启动子能够与CD59的相互交换。其原因如下。在某些情况下，例如在胎儿发育期间，表达的时机对特定的基因来说是至关紧要的，如果不适当，可以引起致死。因此，为了在转基因动物的发育期间控制它们的表达对某些基因使用不同的启动子可能是重要的。在相同的品系中，CD59在RBCs中以高水平表达。动物具有在RBCs中表达的某些其它基因可能是有害的，因此人们将创造一种致死的构建体。并且因此在盒中具有启动子可能是重要的，这种启动子具有细胞的稍微不同的所有组成成分和组织类型特异性。优选的替代启动子包括DAF与MCP启动子。
可诱导的元件
为了控制在不同水平上的表达时机，添加可诱导的元件转录起始位点的5’业可能是有益的。例如对移植物存活至关紧要的紧接着异种移植的再灌流后的时间段，人们可以″超诱导″CRP表达。这样的例子包括例如对γ干扰素作出反应的元件。此外，人们可以抑制元件添加物″应答″元件，其受控于抑制或元件，以便转录在所有的时间都处于关闭状态，直到抑制基因离开。这种情况的一个例子是使用tet阻抑物元件，由此表达被使用四环素所阻抑，阻抑作用由撤走四环素解除。
非编码序列的切除
最大可能地切除附加的内含子序列而不影响小基因2的表达水平及组织和细胞型特异性是可能的。这一点可以通过系统地切除每个内含子，保持至少一个内含子完整(以满足为了实现有效的转录大多数转基因显示的所要具有的一般性要求)经验性地试验。假定CD59启动子能在多数小鼠成纤维细胞系中发挥作用，那么所产生的构建体便能在组织培养中进行分析；如果不能，则可以交换属启动子，如SV40启动子/增强子元件，以试验各内含子的必要性。此外，各构建体可以作为小鼠中转基因进行试验。使用上述读出系统，系统启动子缺失分析也是可能的。3’区的进一步缺失很可能冲击到明显在使用中的聚腺苷酸化位点(这些位点比文献中描述的位点出现在更远的3’区)，与预期的1.9/2.1kbmRNA比较给出约3.1kb的mRNA。为了提高小基因盒共整合的可能性，减少小基因和/或盒的大小到最低限度而仍保持生物学活性和适当的表达是合乎需要的。另一方面，为了掺入改善表达的附加序列，增加小基因的大小也是合乎需要的。优选地，这些小基因是大小约6-15kb的。
信号序列的添加
CD59小基因2盒的另外一种可能的修饰是信号序列的添加，以便插入的CDNA具有分泌性，而不是作为膜蛋白被表达。另外，如果需要，在DNA编码非GPI蛋白时，可以加上GPI附着信号(参见Byrne，PCT/US93/08889)。
下列文献公开了构建按照本发明的重组DNA和DNA分子的基本方法：Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港出版社，冷泉港，NY(1999)；和Ausubel等，分子生物学的现代方案，WileyIntescience(19995)，也参见Coligan等，蛋白质科学的现代方案(1995))。
补体抑制剂
对于异种移植来说，最感兴趣的蛋白质通常是“补体抑制剂”，在所有具有补体裂解系统的物种中，它们都有各种在抑制补体上正常起作用的分子，这些补体抑制剂表现出对限制宿主中的自身细胞裂解是必需的。某些补体抑制剂是物种特异性的，例如，象DAF这一类人类补体抑制剂抑制人类补体和某些灵长类的近亲种的补体，但是对具有较远亲缘关系的物种(如小鼠和猪)的补体则无效。实际上，这种形式的物种特异性补体抑制作用在决定异体移植是否协调中被认为是主要的决定因素之
因此，任何被确定为具有补体抑制活性的蛋白质都适合于使用本发明的小基因中。更具体地说，至少有三种人类补体抑制剂，DAF、MCF和CD59令人感兴趣，因为它们被认为能只行使保护宿主细胞免受补体介导的细胞裂解的功能(见Kinoshita，当代免疫学12：291-295，(1991))。这些分子通过干扰C3和C5转化酶(MCP和DAF)或通过阻止端膜攻击复合物(CD59)的形成来抑制补体。然而如上所述，本发明现不限于DAF、MCP和CD59，而是扩展到任何补体抑制蛋白，包括但不限于因子I、因子H、C4结合蛋白(或C4bp)、CR1、CR2、C8结合蛋白、HRF、MIP、P-18、HRF-20和MIRL。
大部分或所有的这些分子在红细胞和内皮细胞上发现，并且通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)键锚定在细胞表面，在蛋白质水平上，所有三种补体抑制剂广泛地分布并普遍地发现于任何与补体活性相关的区域。
相应于CR1、CR2、DAF、MCP、C4bp和因子H的互补DNA已经被克隆和测序。其结果是已知蛋白质主要由长度大约60-70个氨基酸的串联重复基元(称作“短共有重复序列”)组成。几种病原体携带编码结构相关蛋白质的基因，35k痘苗蛋白质有一段跟随4个SCR的信号序列，并且在氨基酸水平上与一半的C4bp氨基末端有38％的同源性。HSV的糖蛋白C-1缺少典型的SCR结构，但是却包含了基本上同源于各种C-抑制剂的短骨架，并显示出类DAF活性。
关于DAF序列，参见Medof等，美国国家科学院院报，84：2007-11(1987)：Caras等，自然325：545-9(1987)。关于MCP序列参见Purcell等，免疫遗传学33：335-344(1991)。以前讨论过CD59序列。
本发明也可以用于表达各种蛋白质，这些蛋白在遗传工程动物内皮细胞中表达是有利的。因而，采用CD59小基因盒表达补体抑制剂之外的其它蛋白质和编码降低或掩蔽前面描述的gal表位的酶的基因可能是合意的。在本发明优选的模式中，如以下将进一步描述的，小基因(其已经包含了编码补体抑制剂的基因)上表达的其它蛋白是一种酶，它能够掩蔽或降低在表达这一小基因的转基因动物细胞中的gal表位水平。然而，一般来说，任何在转基因动物内皮细胞中有利地表达的合适的蛋白质在本发明的范围内。采用以上描述的那些技术之类的技术将这些蛋白质掺入到上述小基因中。
在本发明中有用的一类这样的蛋白质统称为免疫调节剂，可以包括转化生长因子-β(TGF-β)、核因子κb(NFκb)抑制剂、白介素-4(IL-4)、IL-10和IL-12。这些分子影响免疫细胞的发育。另一类被称为血栓形成调节剂或抗凝剂的蛋白质包括抗凝血酶III、组织血纤蛋白溶酶原激活物(TPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(UPA)。凝血调节蛋白或组织因子抑制剂。第三类人们对表达感兴趣的蛋白质是一组所描述的抗炎蛋白质，一种人们想诱导的这样的蛋白质的例子前列腺素E2和在其合成中起作用的酶(前列腺素合成酶)会局部地经CD59小基因盒表达。许多蛋白质不是膜结合性的而是分泌性的。因为分泌信号能够作为兴趣插入基因的一部分掺入，所以采用CD59小基因盒将不限于膜结合蛋白。
突变体
在本发明中使用的如在按照本发明构建的小基因中的蛋白质可以是天然产生的蛋白质，包括各种等位基因形式的这样的蛋白质，或者可以是具有所需生物学活性，尽管不需要达到与天然蛋白质相同的程度的突变体。
对兴趣蛋白质的氨基酸序列可以进行修饰，例如通过定点或相应基因的半随机诱变，以获得具有“基本上相应的”氨基酸序列的突变蛋白质。
当确定序列是否应当被认为是“基本上对应”时，人们应当考虑以下因素：当序列按照标准算法最大配匹地进行对比时的序列相似性的程度；任何交联键(如二硫键)连接方式的相似性；通过X射线衍射分析或NMR确定的蛋白质三维结构的相似程度和测序蛋白具有的生物活性的相似程度。在这一方面，应当注意在丝氨酸蛋白酶抑制剂中，存在被认为同源的蛋白质家族，其中许多对成员具有低至30％的序列同源性。
优选地，成熟蛋白质序列与其天然产生的相关物至少50％是相同的。优选地，至少80％相同。
三维结构可以用来鉴定内部的和表面的残基。一般来说，在受体结合位点之外的表面残基上突变的蛋白质更可能保持其功能，然而Creighton等，自然339：14(1989)讨论了隐蔽残基突变的耐受性。这种结构也用来确定柔性表面环和域间边界。蛋白质在这些区更具有对缺失和插入的耐受性。一般来讲，用NMR更难解析的蛋白质片段可能是更容易移动的片段，因而更具有突变耐受性。
插入或缺失优选地在氨基酸或羧基末端和环上(连接螺旋与螺旋，螺旋与片层，片层与片层的序列以及域间边界上的序列)。在末端，内部的插入或缺失优选地不超过三个连续的氨基酸，更优选地仅有一个氨基酸。
突变优选地是取代，就可以进行的取代类型而言，人们可以留意分析在不同有机体的同源蛋白质之间的氨基酸变化频率。以这些分析为基础，我们定义保守取代是以下提出的组内的交换：
I.小脂肪族非极性或极性很弱的残基-Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)
II.带负电荷的残基和它们的酰胺-Asn、Asp、Glu、Gln
III.带正电荷的残基-His、Arg、Lys
IV.大脂肪族非极性残基-Met、Leu、Ile、Val(Cys)
V.大芳香族残基-Phe、Tyr、Trp
由于它们在蛋白质结构中的特别的作用，三个残基被放于括号中。Gly是唯一没有支链的残基，于是它便赋予了链的灵活性；Pro有紧密限制链的不寻常的几何构型；Cys能够掺入到二硫键中，这些三硫键盘使蛋白质形成特别的折叠；bGH的4个Cys是高度保守的，一些权威将上述I、II项合并在一起，也要注意由于Tyr的氢键合电势，Tyr与Ser、Thr等有某些亲缘关系。
由于与兴趣蛋白质生物学活性和序列的类似性，可接受的取代也包括可能被耐受的已经的取代。例如，如果兴趣蛋白质将具有超氧化物歧化酶活性，而不使用与天然产生的SOD相同的蛋白质，那么它可能是天然产生SOD的嵌合体。
在天然地与GPI相连的蛋白的情况下，应当避免阻止了与GPI锚相连的突变以及降低所需活性的突变。通过有条理地试验片段的活性(正如chung和Reid(1985)就C4bp所做的)或通过系统化试验突变可以确定活化位点残基(如果还不知道的话)。
编码兴趣蛋白的核苷酸序列可以但不需与天然产生的序列相同，“沉默”突变可用来提高转录或转运效率，引入或消除限制位点，或者降低重组的可能性。此外，可能按以前的讨论实施导致编码氨基酸序列变化的突变。
突变(特别是保守突变)很可能被耐受的位点可以通过理论和实验方法组合来确定。
一般地，残基可以分成表面的或内部的残基，通过如X射线衍射或亲和标记之类的技术可以实验性地对残基进行定位。若同源蛋白质具有已知的三维结构，利用同源蛋白质作指导构建兴趣蛋白质的模型是可能的。假如所有这些都失败的话，还可以基于残基的疏水性预测位置，因为带电荷的残基极有可能位于表面。
绝大部分蛋白质残基能够耐受一定程度的突变，蛋白质也可以进行修饰。所述修饰可以在内部残基上，在远离兴趣结合位点的表面残基上，或者在为兴趣结合位点的一部分或足够靠近并影响位点的表面残基上。
内部残基的修饰不可能影响其结合活性，除非它干扰蛋白质正确折叠，专一性并因此非直接干扰结合表面的正确呈递。一般来说，内部Gly的突变是不合乎需要的，因为它们对赋予多肽链的局部灵活性可能是需要的。胱氨酸的突变通常是不利的，因为它们经常参与到使蛋白质保持特定构型所需的二硫键中。一般地，最好避免用基本上比原来的残基更大或更亲水的残基取代内部残基。
一般来说，蛋白质的稳定性受内部残基突变的影响比受表面残基突变的影响更大。
一些表面残基属于结合位点，这些残基的突变更可能有利地或不利地影响结合活性。结合位点可通过许多进行鉴定，包括通过片段的系统试验或者单个取代突变的系统试验鉴定其结合活性，也可以通过形成复合物，然后和标记不被复合物包藏的残基来鉴定。
当同源蛋白质已知时，很可能耐受突变的位置可以通过确定同源蛋白质家族中哪个位点残基位置表现出最大的变化来鉴定(同源蛋白质可以通过参考序列与序列数据库中的其它序列的计算机比较来鉴定)。
在GPI连接蛋白的情况下，应当选择突变，以避免灭活GPI附着信号。一种蛋白质的附着信号可以代替另一种蛋白质的附着信号，也可以构建嵌合体信号。
就前面讨论的补体抑制蛋白而言，例如，在BAF和MCP的情况下，很可能SCR对活性是重要的。并且对非SCR区的突变更安全，假如使SCR发生突变，那么使在兴趣蛋白中发现的SCR中显示出最大的变异的那些残基突变和较好地进行相应于所观察到的变异的取代则更安全。
就CD59而言，人类CD59可比于其在其它哺乳动物物种中的同源物，更加高度可变的密码子突变是优选的。然而，CD59在一定程度上具有物种特异性，这种突变将会导致突变蛋白的物种特异性改变，因此应当小心进行。这种警告必须限定在CD59的物种特异性不确定并且可能是可变的时，按照Van Den Berg等，免疫学杂志152：4095(1994)，来源于人、鼠、绵羊和猪的CD59具有某些交叉物种活性。
CD59与被称作Ly-6的鼠源蛋白家族具有24-30％的相似性。这种相似性在氨基-和羧基-端区最强。成熟CD59和LY-6的10个半胱氨酸容易进行序列对比。CD59的优选的突变是不影响这些保守半胱氨酸的那些，也能进行直接定位，在这些位置上产生的变异在LY-6家族中发现，其引入在一个或几个Ly-6家族成员的相应位置上发现的残基，参照其它同源蛋白质序列(如人类尿激酶型纤溶酶激活物受体)也可能是有利的。
B.包含许多补体抑制剂的YAC的产生
在本发明的一个优选的方法中，如本文详细描述的，制备酵母人工染色体(或YAC)，其在单个座位上包含许多补体抑制剂。
多基因YAC的产生
类似有关P1基因组CD46 CD55和CD59基因所描述的那些，大DNA片段常常产生具有合适的组织特异性的高水平的基因表达。在一些应用(如异种移植)中，应用多个转基因可能是重要的。然而，采用大DNA片段，使用简单的共注射策略产生具有一种以上的基因的转基因动物可能是困难的。不同于较小的DNA片段(＞50kb)(其以高的频率共整合进转基因胚胎基因组的单个位点)，较大基因组基因的共注射常常导致多个独立的整合位点并增加基因重排的频率。
通过这种方法产生的转基因动物含有多个转基因整合位点。繁育后，这些转基因动物独立地分离转基因给它们的子代，以至绝大多数子代仅仅继承了共注射的转基因总量的一部分。此外，每个整合位点代表对正常基因组结构一种破坏，它增加了产生有害突变的可能性。潜在的突变在应用(例如异种移植，其中转基因器官预期在人类受体中存活一段较长的时间)中是要特别关心的问题。
为了解决这些问题并创造可以加入与异种移植有关的附加基因的框架，我们已经设计出了装配唯一的人类补体调节基因座(由三种大的编码CD46、CD55和CD59的人类基因组DNA片段组成)的方案，由CD46、CD55和CD59的基因组成的起始基因座将超过200kb。
最近已清楚高达到几百kb的大DNA片段能够成功地注射到受精卵中，并且这些很大的DNA片段以适当的频率保持完整性和功能性，参见Schedl等，核酸研究20：3073-3077(1992)；Gaensler等，国家科学院院报90：11381-85(1993)；Schedl等，自然362：258-261(1993)；和Gnirke等基因组15：659-667(1993)。这表明一系列P1大小的基因组片段能够组合到单一的一段DNA中，然后用于微注射。这种策略保证转基因座位(包括多个P1大小的DNA片段)由限定的结构组成，并且在所述基因座上的所有P1基因整合进单一的基因组位点。因为这些基因是自然相连的，这种策略也保证了构成转基因座位的多个基因的每一个都忠实地作为一个单位遗传给子代。
人CRP基因座的装配
因为F1克隆系统可以仅包装DNA至100Kb，利用酵母(YAC)克隆系统(Burke等，科学236：806-812，1987)装配超过这一大小的基因座是必要的。这里我们描述了编码CD59，CD46和CD55的P1基因组片段。三个P1基因总共达DNA的200Kb。这一大小可以容易地由YAC克隆系统容纳。每一P1基因组片段的末端由一对单一限制酶位点限定(表10)。为了有利于这三个基因的装配，我们修饰pYAC4克隆载体以包含若干含有这些限制酶切位点克隆位点(图4)。在若干克隆位点内的限制酶位点的顺序使得可以顺序装配由三个P1基因组成的基因座。初始步骤将Mlu1侧翼的60Kb CD46 P1基因克隆到pSRY-1的Mlu1位点。这产生包含MCP基因的YAC。优选的是，P1插入物的取向使得MCP的转录发生在TRP臂侧面。同样地，将70Kb SfiI CD59 P1基因克隆进SnaB1位点，以产生包含CD59基因的第二YAC。最后，可以将Not1消化的MCP-YAC和SfiI消化的CD59-YAC基因与Not1，SflI CD55 P1基因连接在一起。
YAC-MCP的产生
通过碱裂解和其后在Qiagen-500柱(Chatsworth，CA)上纯化分离由F1 MCP克隆组成的高分子量质粒DNA。以限制酶Mlu1将DNA消化完全，用苯酚/氯仿抽提(Riley等，复合基因组分析技术，59-39页，1992)，并对TE(10mM Tris(pH7.5，1mM EDTA)进行点透析。以Mlu1和BamH1消化质粒pSRY-1，用牛小肠碱性磷酸酶脱磷酸化，经凝胶纯化6.0kb Trp臂和3.4kb Ura臂。将消化的P1 DNA与10M过量的pSRY-1臂连接一夜，并如Burgers等，分析生物化学，163：391-397(1987)的描述转化进AB1380原生质球，然后在ura-平板上，接着在ura-，trp-进行转化体的初始选择。其后从ura+，trp+集落制备基因组DNA块，并经PFGE以及Southern印迹杂交分析包含YAC的MCP的存在。利用质粒拯救可以进一步确定在克隆位点的MCP DNA的完整性和插入物的取向。
YAC-CD59的产生
因为SfiI限制酶切位点含有5个随机碱基，限定CD59 P1基因的SfiI消化物产生不相容的3碱基对突出端，其不能直接克隆进SRY-1质粒的SfiI位点。为此，我们描述了用于将CD59 P1基因克隆进pSRY-1 YAC的两种方法。第一种方法只是将70Kb CD59插入物以平端连接进pSRY-1的SnaB1位点。通过碱裂解和其后在Qiagen-500柱(Chatsworth，CA)上纯化分离由P1 CD59克隆组成的高分子量质粒DNA，以限制酶将DNA消化完全，用T4 DNA聚合酶填补，用苯酚/氯仿抽提(Riley等，1992，参见上述)，并对TE(10mM Tris(pH7.5，1mM EDTA)进行点透析。以SnaB1和BamH1消化质粒pSRY-1，用牛小肠碱性磷酸酶脱磷酸化，经凝胶纯化6.0kb Trp臂和3.4kb Ura臂。将消化的P1 DNA与10M过量的pSRY-1臂连接一夜，并如Burgers等(1987，参见上述)的描述转化进AB1380原生质球，然后在ura-平板上，接着在ura-，trp-进行转化体的初始选择。其后从ura+，trp+集落制备基因组DNA块，并经PFGE以及Southern印迹杂交分析包含YAC的MCP的存在。利用质粒拯救可以进一步确定在克隆位点的CD59 DNA的完整性和插入物的取向。这一方法被证明在这种例子中是困难，由于它需要平头连接。另外，特殊的克隆生长很差，使得难于分离足够量的CD59 P1插入物。由于这些问题的存在，我们已开发了以下概述的另一种策略。
YAC-DAF的产生
通过碱裂解和其后在Qiagen-500柱(Chatsworth，CA)上纯化分离由F1 DAF克隆组成的高分子量质粒DNA。以限制酶Not1和SfiI将DNA消化完全，用苯酚/氯仿抽提(Riley等，1992参见上述)，并对TE(10mMTris(pH7.5，1mM EDTA)进行点透析。以Not1，SfiI和BamH1消化质粒pSRY-1，用牛小肠碱性磷酸酶脱磷酸化，经凝胶纯化6.0kb Trp臂和3.4kb Ura臂。将消化的P1 DNA与10M过量的pSRY-1臂连接一夜，并如Burgers等(1987，参见上述)的描述转化进AB1380原生质球，然后在ura-平板上，接着在ura-，trp-进行转化体的初始选择。其后从ura+，trp+集落制备基因组DNA块，并经PFGE以及Southern印迹杂交分析包含YAC的DAF的存在。利用质粒拯救可以进一步确定在克隆位点的DAF DNA的完整性和插入物的取向。
三基因座位的装配
为了装配三基因座位，用PFGE从酵母细胞凝胶纯化YAC-MCP染色体，以Not1消化分离的带。同样地，用PFGE从酵母的凝胶纯化YAC-CD59染色体，以SfiI消化分离的带。然后，将这些消化的染色体片段与凝胶纯化的等摩尔量的70kd Not1，SfiI DAF P1插入物连接，并转变进AB1380原生质球。然后在ura-平板上，接着在ura-，trp-进行转化体的初始选择。从ura+，trp+集落制备基因组DNA块，并经PFGE以及Southern印迹杂交分析包含所有三种基因的200kd YAC的存在。
可替的克隆方案
CD59-YAC的形成特别困难，这一步骤包括平头连接，其是非常无效的方法。此外，特殊的CD59 P1克隆生长很差，使得难于分离足够量的供平头连接的CD59插入物。由于这些问题的存在，我们已开发了产生包含CD59的YACs的另一种策略，如在Ketner等，1994，国家科学院院报91：6186-90中所公开的那些。这一方法依赖于出现在酵母中的高频同源重组。扼要地讲，用3种DNA片段转化酵母原生质球：完整的CD59插入物，包含CD59插入物极端5’区部分的YAC-Trp臂和包含CD59插入物极端3’区部分的YAC-Ura臂。CD59-YAC产生两个同源重组事件，一个在Trp-YAC臂中的5’CD59序列与CD59 P1基因的同源的5’区之间，第二个在Ura-YAC臂中的3’CD59序列与CD59 P1基因的同源的3’区之间(图5)。利用这一方法，我们已采用质粒拯救分离了CD59 P1插入物的5’和3’末端部分，并部分测序了这些亚克隆。从这一分析产生了一系列用于PCR的寡核苷酸引物(表12)。引物对CH-1和CH-2含有Not1，SfiI(CH-1)和BamHI限制酶切位点，并且从CD59 P1基因的5’末端扩增1.4kb片段。将这一片段作为Not1，BamH1片段克隆进pSRY-I。所形成的质粒含有6kb Trp-CEN-ARS YAC臂以及1.4kb 5’CD59插入物。对于CD59 P1插入物的3’末端，用引物ED-1和ED-2扩增具有SnaB1和HincII的1.2kb PCR产物。将这一PCR产物平端切割成SRY-1的SnaB1位点。通过测序与插入物的接合物证实1.2kb 3’片段的取向。为了装配最后的CD59 YAC，将3种DNA片段转染进AB 1380。将以Not1线性化的CD59 P1 DNA与等摩尔量的BamHI消化的5’CD59-Trp-YAC臂和SnaB1，BamHI消化的3’CD59-Ura-YAC臂共转染。然后在ura-平板上，接着在ura-，trp-进行转化体的初始选择。从ura+，trp+集落制备基因组DNA块，并经PFGE以及Southern印迹杂交分析包含YAC的CD59的存在。在YAC中的CD59 DNA的完整性和取向可以进一步由Southern印迹分析，质粒拯救或PCR扩增(跨越5’和3’接合结构域)来确定。以高的频率分离到具有正确结构的转化体(表11)。
经同源重组装配
使用同源重组将P1基因亚克隆进YAC载体是能够用于产生包含MCP和DAF的YAC和用于促进顺序装配包含所有三种补体调节基因的三基因YAC或者其它附加基因的一般性方法。图5概括了如何依次装配三基因YAC。对这一方法，必须分离(例如经质粒拯救，亚克隆，PCR扩增或任何数量的标准技术)P1基因组CRP基因的极端5’和3’片段(图5A)。为了在酵母中有利于同源重组，这些片段应该是唯一序列(没有重复元件)，长度大约500-2000碱基对。表13给出了CD59，MCP和DAF末端片段的特征。三基因YAC的顺序装配也需要利用三个可选择的营养缺陷型酵母标记基因。对于我们的目的，我们已利用营养缺陷型标记Ura3，Trp1和Lys2，但是标记的其它组合是可能的，这取决于所利用的酵母菌株的基因型。Ura3与Trp1标记臂源于pSRY1。Lys2标记是pDP6的4.5kb Hind3亚克隆(Fleig等，基因46：237-245，1986)，我们将其添加至pSRY-1的700bpHind3，BamHI端粒种子序列上，以产生功能性Lys2-YAC臂。
含有所有三种补体调节基因组基因的YAC染色体的顺序装配由将MCP基因的5’末端片段添加到以上描述的CD59-YAC上开始。为了进行这一添加，将CD59的3’末端片段和MCP的5’末端片段相互连接，并插入到Lys2 YAC臂中。在这一3’CD59-5’MCP-Lys2 YAC中，3’CD59-YAC序列用于导向同源重组位点，以便在这一DNA转染进含有CD59-YAC的酵母菌株中时，在3’CD59序列之间的同源重组事件有效地缺失掉Ura3标记，并且以Lys2-YAC臂代替它(图5B)。使用lye-培养基首先就功能性Lys2基因选择转化体。然后将克隆置于使用含有5’-乳清酸(FQA)的lys-，trp-培养基的三选择下。这一培养基同时选择功能性Trp1和Lys3基因的存在，FOA的添加针对功能性Ura3标记选择。通过PFGE和示差Southern印迹杂交分析采用Trp1，Lys2，CD59和5’MCP的探针进一步确定酵母克隆的特征。虽然仅分析了一些克隆，但以高频分离到具有正确的结构和遗传行为的转化体(表11)。
为了添加其余的MCP基因组的DNA至新的CD59-5’MCP-Lys2-YAC上，将MCP基因的1.3kb Nco1，Mlu13末端平头连接Ura3-YAC臂上。使这一构建体由限制酶切消化线性化，将其与Mlu11消化的MCP-P1 DNA共转染进包含CD59-5’MCP-Lys2-YAC的酵母菌株中(图5C)。使用ura-培养基首先就功能性ura3基因选择转化体。然后将克隆置于使用含有α-氨基己二酸盐(α-Ap)的ura-，trp-培养基的三选择下。这一培养基同时选择功能性Trp1和Ura3基因的存在，α-AP的添加针对功能性Lys2标记选择。在5’和3’MCP序列内的同源重组事件产生新的染色体，其含有CD59和侧翼于Trp1和Ura3营养缺陷型标记的MCP补体调节基因两者。通过PFGE和示差Southern印迹杂交分析采用Trp1，Lys2，CD59和5’MCP的探针进一步确定酵母克隆的特征。以高频分离到具有正确的结构的转化体(表11)。
第三基因DAF的添加是以类似方式完成的(图5D)。将MCP基因组基因的1.3kb 3’部分以EcoR1片段添加至含有基因组的DAF基因的2.2kb5’部分的质粒上。然后将这两个基因片段添加至Lys2-YAC臂上并转染进CD59-MCP-YAC双基因YAC。通过lys-选择和尔后的lys-，trp-，FOA三选择，我们获得了CD59-MCP-5’DAF-Lys-YAC克隆。通过共转染70KbNot1-Sfil DAF基因组DNA与连接到Ura3 YAC臂上的0.8kb 3’DAF片段整合DAF基因组基因的其余部分，以产生三基因YAC。在适当的选择步骤之后，由PFGE和示差Southern印迹杂交分析酵母克隆。
这一三基因座位可以用来产生转基因猪，该转基因猪高水平地表达三种人补体调节基因。这一新基因座比个别注射的P1基因有利，因为现在在注射之前所有三个基因实际上连接在一起，并且因此预期作为单一基因座整合。此外，因为这一唯一基因座作为YAC被传送，所以以上描述的同源重组技术用于进行对所述基因座的进一步添加。例如可以添加降低或掩蔽gal表位作用的基因(包括但不限于α(1，2)FT，α(2，6)ST，β(1，3)NAGT)，产生能降低主要的异种抗原水平以及控制人补体活化的基因座。随着猪异种器官供体的进一步发展，可以进行对基因座的进一步添加。例如，采用以上描述的方法，也可以将下列基因添加到这一基因座上：影响血管排斥附加人基因(例如，凝血调节蛋白，蛋白质C，因子H，组织因子，尿激酶纤溶酶原激活物，ectoATPase，NFkb抑制剂)，或可以影响细胞排斥的人基因(例如，IL-4，IL-10，TGF-β，阻断共刺激分子CD28和CD40的因子，阻断细胞因子行动的可溶性受体，如可溶性的IL-2或IFNg受体)，或可以用于消除猪抗原呈递细胞的基因(例如编码单纯疱疹胸苷激酶的CD2或CD45调节基因)。所有这些基因不必是大的基因组DNA，但可以是完全确定特征的小基因或任何其它的遗传构建体。
转基因动物的产生
使用熟知的方法制备供注射的YAC构建体，利用设计来展开非常大的DNA分子的脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离包含YAC构建体的酵母染色体。为了分离160kb YAC，使用1％SeaPlaque GTG低熔点琼脂糖(FMC Corp.)脉冲场凝胶，在14℃，6volts/cm2下运行20小时，用120°开关角和2-10开关时间。从凝胶上切下分离的YAC染色体，在注射缓冲液(10mM Tris(pH7.5，0.1mM EDTA，100mM NaCl，30μM精胺以及70μM亚精胺)中平衡琼脂糖凝胶块。将琼脂糖凝胶块在65℃熔化，并且在37℃下用琼脂酶(Epicenter Technology)消化3小时。用宽口径移液管尖端将消化的琼脂糖转移到Micron 10浓缩器(Amicon)中，通过在5,000g下重复离心15分钟直到原来的凝胶块总含量降低至20-50μl在所说的浓缩器中浓缩DNA。在微注射之前，可以在脉冲场上检查YAC DNA的完整性。
然后如本中请中以上的描述进行DNA构建体的微注射。按照本申请以上所描述的方法对转基因动物和它们的子代进行分析。
C.利用P1克隆产生转基因动物
在另一个按照本发明的优选的方法中，可以通过构建和转染噬菌体P1克隆产生转基因动物，如以下详细描述的。
一般来说，由以前出版的序列数据设计的并相应于CD59和CD46 5’和3’区寡核苷酸对(表7)可以用于经聚合酶链反应筛选在噬菌体P1中构建的人基因组文库(Genome Systems.St.Louis，MO)。使用两套引物，可以鉴定克隆。高分子量质粒DNA可以通过碱裂解和其后的在Qiagen-500柱(Chatsworth，CA)上的纯化从大肠杆菌NS3529菌株分离。经限制酶消化，脉冲场凝胶电泳(PFGE)以及Southern印迹分析定位插入物。
基于存在于各克隆中的5’和3’侧翼区的量选择共微注射的候选片段。所有探针都是经随机引发(Pharmacia Biotech，密尔沃基，WI)用[α-32P]脱氧-CTP放射性标记的凝胶分离的片段。
为了制备供微注射的片段，用SfiI或MluI限制消化克隆，经PFGE大小分级分离消化混合物。在通过溴化乙锭染色可视化后，从凝胶上切下包含克隆的片段，纯化，浓缩并分析完整性。
转基因小鼠的产生
纯化后，可以将以上所获得的片段单独的地微注射进受精的鼠卵母细胞中。经Southern印迹分析鉴别起始(founder)出生率动物(C57BL/6XSJL F2)，并经回交建立动物品系。通过子代杂交获得具有两种转基因的动物(例如，CD59和CD46 F1动物)。在实际的例子中，27个潜在的起始动物中有5个(19％)是CD59阳性的。MCP基因组克隆(60kb和80kb两者)各产生13个转基因起始动物，分别代表了29％和15％的转基因比率。DAF的90kb构建体从19个G0代小鼠产生6个转基因阳性的。而70kb DAF构建体从18个转基因起始动物产生3个(17％)。CD59，60kb MCP以及80kb MCP片段对G1代的基因传递分别是50％(2/4)，83％(10/12)和69％(9/13)(表8)。6个DAF起始动物中的5个也有基因传递到G1子代中。这些数据表明，通过微量注射大基因组片段的方法能够成功地构建转基因小鼠，而且这些基因可以传递至子代中。
转基因小鼠的表达分析
用Northern分析，免疫化学和FACS分析分析G1代杂合动物的表达。
FACS分析和定量
由间接免疫荧光法评估鼠外周血细胞(红细胞和白细胞)表面上的蛋白质表达。用于这一检测的第一抗体是大鼠mAb，CD59的YTH 53.1(来自英国牛津大学Merman Waldman的赠品)和CD46的小鼠mAb695(Serotec，华盛顿D.C.)。异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的小鼠抗-大鼠IgG2b(ICN，Costa Mesa，CA)或者FITC-偶联的绵羊抗小鼠(Bindingsite，伯明翰，UK)分别用来检测与CD59和CD46结合的特异性抗体。用从Biodesign购得的小鼠单克隆抗体检测DAF。用标准技术经流式细胞计量法测定细胞表面的表达情况。按照制造商的方案，用Quantum Simply细胞试剂盒(细胞计量标准公司，San Juan，PR)测定每个细胞中CD59和CD46分子的相对数目。
Northern分析
从组织，血液，或从这两者中分离总细胞RNA，并进行Northern印迹。所有探针是通过随机引发用[-32P]脱氧-CTP放射性标记的片段。将人类RNA样品用作阳性对照，其是从Clontech(Palo Alto，CA)购得的。
免疫组织学分析
用于免疫荧光研究的组织在O.C.T(Lab Tak，Elkhart，IN)中包埋，在异戊烷中骤冻，并存储在-800℃下直到进行处理。在低温恒温器(Leica，Heidelberg，德国)中制备冻结的组织样品。通风干燥组分，以丙酮固定，并且以磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。将每一组分与单克隆抗体(mAb)一起温育，用双荧光染料层(由FITC-缀合亲和性分离的F(ab)’2第二和第三抗体组成)检测mAb。在温育后用PBS洗涤组织组分，以对苯二胺与甘油溶液封固。通过如上所述并省去原初抗体制备组分来估价背景免疫荧光。将大鼠mAb，YTH 53.1以及小鼠mAb，M695(Serotec，华盛顿D.C.)分别用于检测CD59和CD46。另外，罗丹明缀合抗体(由明尼苏达大学A.F.Michaels提供)用来说明基础结构。用Leitz DMRB落社荧光显微镜(Wetzlar，德国)和照片(40x)检查组织。
五个转基因系被鉴别为表达CD59 mRNA以及蛋白质。在肝，心和肾部组织中的mRNA水平的范围在具有70kb基因组片段的品系中观察到，其基本上类似于在人中观察到的(在实施例I和II中详细描述)。转基因小鼠在肝，心和肾的内皮细胞表面上(如由免疫细胞化学所估价的)和在RBCs上(如FAGS分析所估价的)表达CD59。这些结果说明，通过利用大基因组CD59克隆，可以获得组织特异性表达。
携带60kb MCP基因组片段的八个独立的转基因品系为RNA和蛋白质转基因表达阳性。RNA表达在心和肝中最高，在肾中稍低。在三种转基因品系中，RNA水平与在各自的人组织中所发现的内源性水平是可比较的。蛋白质肝心与肾的内皮细胞上表达，在肝中发现最高的表达。另外，FAGS分析显示在白血细胞表面上MCP的存在。与CD59和DAF相反，在人循环的血液细胞中的MCP蛋白质表达在RBC上不存在。行为上类似于小鼠RBC的MCP转基因对人MCP表达为阴性。类似的情况在80kb MCP基因组片段下观察到，在中所分析的五个品系为人MCP RNA和蛋白质表达阳性。两种构建体的组织分类似。这些结果表明，通过利用这些特殊的MCP基因组克隆，可以以可与人中内源检测的哪些相比的水平获得细胞类型与组织特异性表达(参见，有关在两种转基因小鼠品系各种组织上的蛋白质表达的详细情况的表9)。
功能分析
转基因人类CD59蛋白质的功能通过测定暴露于人血清下时使血细胞免受补体介导的裂解的保护作用估价。
具有多种人补体调节基因组克隆的转基因小鼠
产生转基因小鼠，这些转基因小鼠具有若干人补体调节的基因组克隆。这靠杂交表达不同的补体调节蛋白质的个体品系以及通过共注射下列克隆完成：a)70Kb CD59+60Kb MCP，b)70Kb CD59+90Kb DAF，c)60Kb MCP+90Kb DAF，和d)70Kb CD59+60Kb MCP+90Kb DAF(三注射)。双和三注射P1克隆的动物分析表明没有发生P1基因的共整合。携带CD59和MCP P1基因两者的小鼠由杂交两个单独的P1品系获得。进行这些小鼠的分析以便阐述两种补体调节蛋白的表达在转基因动物中的加合或协同作用。这样的转基因小鼠在以下方面是有用的，即确定何种大小的编码补体抑制剂的核酸片段在最终的编码基因座位的DNA构建体(如以上所述的YAC构建体)中最有用。
含有P1克隆的转基因猪品系的产生
用与产生转基因小鼠品系大体相同的方式产生转基因猪品系。进行CD59、DAF和MCP的双或三微注射。从1994年3月到1995年3月产生了七百九十(790)个潜在的起始猪。在单一转基因阳性的猪中，9头是MCP阳性的，2头是CD59阳性的；7头是DAF阳性的。三头猪是CD59和DAF阳性的，一头猪是MCP和CD59阳性的，一头猪是MCP和DAF阳性的。利用血液样品，肌肉活组织检查或这两者分析起始猪的亚群。
利用检测mRNA最敏感的方法(即，RT-PCR)，所分析的3/3 MCP阳性猪是MCP mRNA阳性的，所分析的1/1 CD59阳性猪是CD59mRNA阳性的，以及所分析的5/5 DAF阳性猪是DAF mRNA阳性的。动物血液的Northern分析(检测的一种不太敏感的方法)不能检测各自的mRNA。MCP+CD59阳性动物基因可以由RT-PCR检测的MCP和CD59mRNA，以及仅可由Northern分析检测的mRNA。两只CD59+DAF阳性动物可由RT-PCR检测的水平的两种详细，其中一种动物具有也可由Northern分析检测的DAF mRNA和CD59 mRNA。第三CD59+DAF动物不具有可由两种方法检测的mRNA。MCP+DAF起始猪具有仅可由RT-PCR检测的MCP mRNA。参照以下的概要：
以上提出的所获得的数据需要通过观察(起始动物常常是嵌合式的)来限定。虽然常常在起始动物中不可检测，转基因特异性的RNA在转基因被送递至子代后通常是可检测的。我们的经验是，对P1转基因小鼠，特别真实的是血液样品。收集供分析的血液代表可用于潜在的有价值的起始动物的破坏性最小的方法，因此这一方法是当前所使用的分析方法。除以上列出的猪之外，已产生了31头以上的猪，等待着检验。
C.编码能够掩蔽或降低GAL表位水平之酶的核酸的表达
在另一个本发明的优选的方面，将编码能够掩蔽或降低gal表位水平之酶(包括但不限于糖基转移酶，例如α(1，2)岩藻糖基转移酶(“α(1，2)FT”)，α(2，6)唾液酸转移酶(“α(2，6)ST”)和/或β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶(“β(1，3)NAGT”))的核酸优先掺入到本发明的转基因动物中，以便至少一种这样的酶与至少一种补体抑制剂在转基因动物的器官、组织、细胞或非活组分中产生，并且因此在使这些动物更加适合于异种移植中有用。在一个优选的实施方案中，编码酶(如α(1，2)FT、α(2，6)ST或β(1，3)NAGT)的cDNA以表达载体的形式制备，并用于制备本发明的转基因动物中，所述的动物表达一种或多种这样的酶，适用于具有降低的或消除的抗体介导的超急性排斥的异种移植中。在本发明特别优选的实施方案中，将编码能够掩蔽或降低gal表位水平之酶的核酸直接掺入到以上制备的核酸构建体中，以便表达补体抑制蛋白质，这一点以下还要讨论，或者也可以使用其它方式，以获得表达能够降低gal表位水平的酶和补体抑制蛋白质两者的转基因动物。
在本发明的优选的方式之一中，制备表达载体，该表达载体含有编码一种或多种降低或掩蔽gal表位之酶(如α(1，2)FT、α(2，6)ST或β(1，3)NAGT)的核酸，其可以用于制备本发明的转基因动物或异种器官、组织、细胞以及非活组分。优选地，利用合适的表达载体(如质粒)用所需的人的酶形式制备核酸构建体，这一载体将最终地用来制备转基因动物，如通过将所说的载体注射进猪或小鼠(其将最终表达所需的酶)的卵母细胞前核中，或者这一载体将最终地用于制备按照本发明的转染的异种器官、组织、细胞或非活组分。虽然将所需的核酸克隆进表达载体的许多方法是本领域技术人员熟知的，在本发明中有用，但是在优选的方法中，经RT-PCR技术利用来源于适当细胞系的总RNA克隆人α(1，2)FT、α(2，6)ST或β(1，3)NAGT)cDNA，所说的细胞系例如在Larsen等，P.N.A.S.87：6674-6678(1990)中所公开的A431细胞系。
在优选的构建体中，经RT-PCR技术利用来源于适当细胞系(例如A431)的总RNA克隆人α(1，2)FT、α(2，6)ST或β(1，3)NAGT)cDNA。在克隆的cDNA中，制备有意引物，其优选地具有序列
TTTGGATCCTCGGCCATGTGGCTCCGGAGCCATCG(SEQ ID NO：1)，侧翼于ATG起始密码子并包括BamHI位点。制备反义引物，其具有序列
AAAGTCGACTCAAGGCTTAGCCAATC(SEQ ID NO：2)，侧翼于TGA终止密码子并包括Sal I位点。将这一1.1kb cDNA克隆进质粒pRex 10(pRex10/FT)，以便在转染的组织培养细胞中表达α(1，2)FT。
对于在按照本发明的转基因动物中的表达，优选的是合适的启动子(如，鸡β-肌动蛋白启动子或H2kb启动子)被包括在表达载体中，这些表达载体将包括编码适当的酶的cDNA。增强子也可以添加至DNA构建体。在特别优选的方法中，编码酶(例如α(1，2)FT、α(2，6)ST或β(1，3)NAGT)的cDNA最终注射进转基因动物并别它们表达，将其克隆进含有500bp鸡β-肌动蛋白启动子(#876)(SEQ ID NO：3)或4.3kb H2kb启动子(#881)(SEQ ID NO：4)的载体中。此外，剪接和聚腺苷酸化序列可以以人的含有第二外显子下游序列的α珠蛋白基因的900bp HindIII/KpnI片段提供给载体。
此外，如以下将要详细描述的，对有关表达α(1，3)GT基因的试验而言，经RT-PCR利用从猪主动脉内皮细胞获得的总RNA和和第一链cDNA合成试剂盒获得含有α(1，3)GT cDNA的猪构建体。
在本发明的优选的方式中，制备表达编码一种或多种糖基转移酶(包括但不限于α(1，2)FT，α(2，6)ST，β(1，3)NAGT)的DNA的转基因动物，所述的酶具有掩蔽的或降低的Galα(1，3)Gal表位水平，并且在来源于所说的转基因动物的组织或器官移植进人患者时其可以降低或消除抗体介导的排斥。优选地，cDNA构建体(如以上制备的)用于以目前本领域普通技术人员已知的各种合适的方法的任何一种制备所需的转基因动物。在本发明的特别优选的方法中，转基因动物通过将编码所需的gal表位-降低酶的DNA注射进供体动物的受精卵母细胞前核中获得，如同以下将要进一步描述的。在注射步骤之后，将受精卵转移到假孕雌性动物中携带至足月。在动物从怀孕的雌性动物出生后，可以进行常规的筛选试验，以便确定子代的哪一个含有编码所需的酶(例如α(1，2)FT，α(2，6)ST，β(1，3)NAGT)的基因。在优选的方法中，从子代动物获得细胞，并且用PCR技术分析，以确定哪一个动物含有所引入的基因，这些试验结果可以用其它合适的方法(如Southern DNA分析)证实。
在本发明的方法中，常表达Galα(1，3)Gal表位的任何异种动物都可以用来制备本发明的转基因动物或异种细胞。特别适用于本发明的是猪，当按照本发明进行操作以表达所需的gal表位-降低酶时，其可以用来制备可以移植进人患者而不产生抗体介导的反应的器官和组织。此外，按照本发明的已制备了转基因小鼠(例如C57BL/6小鼠)，如以下所提出的，其含有表达α(1，2)FT基因并获得伴随的掩蔽或降低由人异种反应性抗体识别的gal表位水平的器官、组织、细胞以及非活组分。
本发明也涉及在本发明产生用于异种移植的组织或器官中有用的其它动物，这一领域的进一步的研究将包括标准的商业来源的哪些动物，例如实验大鼠或其它合适的动物。此外，包括母牛，绵羊以及山羊在内的可以用本领域技术人员已知的技术经遗传工程改造的其它驯养动物在本发明中也可以有用。
按照本发明所产生的转染的异种器官、组织、细胞以及非活组分除了用于具有降低的或消除的抗体介导的排斥的移植(如超急性排斥)中外，也可以进一步地用于有关异种移植的实验中。在这些方法中，所涉及的是按照本发明所产生的转基因动物将用来创造可接受的异种细胞或组织的表面掩蔽或包膜，它们可被直接置于或完全包覆于天然或人工供体组织或器官上，后者具有被异种反应性抗体识别的表位并且否则的话会在人患者中受到排斥。在这一方式中，本发明在按照本发明制备的异种细胞(其表达可以降低或掩蔽抗原性gal表位水平的一种或多种酶)中可以有用，可以用于通过阻断或降低通常发生的超急性反应与其它抗体介导的排斥进一步增加潜在的有用供体组织和器官的供给。
如以下说明的，本发明涉及将表达载体(其含有编码能够降低gal表位水平之酶的核酸)用于产生转基因动物(其也含有编码补体抑制剂的核酸)。这些酶和补体两者在如此产生的转基因动物中的表达将特别适合于异种移植，并且会进一步降低来源于这些转基因动物的器官、组织、细胞或非活组分在移植进人患者时产生超急性排斥的可能性。
D.获得表达编码能够降低gal表位水平的酶和补体抑制剂两者的DNA的动物
在本发明的特别优选的方法中，提供了一种将组织或器官异种移植进人患者的方法，其降低或消除抗体和补体补体介导的排斥(包括超急性反应)，其中产生转基因动物，该动物表达一种或多种能够在其细胞中掩蔽或降低gal表位水平的酶(如α(1，2)FT，α(2，6)ST或β(1，3)NAGT)以及一种或多种补体抑制蛋白质(包括但不限于CD59，DAF，MCP和/或以上指出的其它补体抑制剂)；以极大地降低或消除抗体或补体介导的排斥将来源于所说转基因动物的所需组织器官移植进人患者。在优选的方式中，可以首先以以上所描述的方式制备核酸构建体，如YAC，以掺入至少一种补体补体抑制剂基因，优选地是在相同的基因座上添加核酸，如编码掩蔽或降低gal表位水平之酶的cDNA，以便在这一构建体转染进转基因动物时，所说的酶和补体抑制剂两者同时得到表达。此外，也可以制备单独构建体，最终用来经由共注射，繁育或以下提出的其它合适的技术制备转基因动物，所说的单独的构建体例如编码一种或多种补体抑制剂和编码一种或多种gal表位一降低酶的单独的小基因。理想地，如果使用单独的构建体，则可以通过共注射编码至少一种能够降低gal表位水平的酶的小基因与编码至少一种补体抑制剂的小基因获得合适的转基因动物。
多个基因成功地共注射经受精的猪卵母细胞中取决于几种可变因素，例如DNA的浓度和DNA构建体的长度。因为在大构建体与小构建体一起注射时，前者会干扰后者成功地掺入，所以必须考虑各构建体的长度。这种操作是微注射领域技术人员熟知的。一旦产生子代，就可以对它们的组织和/或血液进行免疫组织化学分析及功能性分析，以鉴定双重转基因动物。然后，按照本领域熟知的方法繁育这些起始动物，以建立能够正常表达两种转基因的猪品系。
此外，按照本发明，用以下方法产生按照本发明的最终的转基因动物(如猪(或小鼠))是可能的，所述的方法是先产生一代表达编码至少一种能够掩蔽或降低gal表位水平之酶(包括但不限于α(1，2)FT、α(2，6)ST、β(1，3)NAGT)的核酸的转基因动物，同时产生一代能够表达编码至少一种补体抑制剂(包括但不限于CD59、DAF、MCP和/或其它补体抑制剂)的核酸的转基因动物。在本发明的这一模式中，可以通过杂交繁育两种类型的转基因动物获得最终所需的转基因动物。这可以由那些熟知的繁育方法完成，所述的方法例如将表达一种所需基因的雄性动物与表达另一种所需基因的雌性动物置于一起，让它们自然交配。并且以这种方式可以获得含有编码所需酶和补体抑制剂两者之核酸的第二代转基因动物。在通常的情况下，可以对所形成的第二代子代的组织和/或血液样品进行免疫组织化学分析和功能性分析，以鉴别表达两种所需基因的那些子代。一旦被鉴别为表达两种特征，就可将这些转基因动物用于建立正常表达能够降低gal表位的酶和补体抑制剂两者的动物品系(如猪)。
在本发明的另一个实施方案中，按照本发明的转基因动物可以通过以下方法获得，所述方法即共注射编码降低gal表位水平之酶的基因或DNA与编码补体抑制蛋白的基因或DNA。如下面将要进一步讨论的。在本发明的方法的这一方面，通过将所需的DNA注射到供体动物的受精的卵母细胞核内获得转基因动物，在这种情况下，所需的DNA包括编码能够降低动物内皮细胞中gal表位存在量之酶(例如α(1，2)FT、α(2，6)ST、β(1，3)NAGT)的DNA与编码补体抑制剂蛋白)和至少一种编码补体抑制剂(包括但不限于CD59、DAF和/或MCP)的DNA。在注射步骤完成后，将受精卵移植到假孕的雌性动物体内携带至足月。在怀孕雌性动物产下动物后，可以进行常规的筛选试验，以确定哪些子代含有编码所需酶和所需补体抑制剂蛋白两者的基因。在优选的方法中，从子代动物身上取得细胞，然后用PCR技术分析，以鉴别哪些动物含有两种引入的基因，同时还可以用其它合适的方法(如Southern DNA分析)进一步验证这些检验的结果。
在按照本发明的优选的实施方案中，上述方法的任何一种都可以用来产生转基因动物，该转基因动物编码至少一种补体抑制剂和至少一种能够降低或掩蔽gal表位水平的酶。然而，一般而言，优选的是构建表达载体，其含有编码一种以上的补体抑制剂和一种以上的能够降低抗原性Gal表位水平的酶的核酸。
以下将进一步地描述用于获得按照本发明的转基因动物的技术。
靶动物
本发明的兴趣蛋白质表达的靶动物优选地是脊椎动物，即，哺乳类动物，鸟，爬虫类动物，鱼或两栖动物。在哺乳动物中(本发明优选的靶动物)，靶动物优选地属于Artidactyla目(例如，母牛，猪，绵羊，山羊，马)，啮齿目或兔类动物(例如，兔，小鼠，大鼠)或食肉目(例如，猫，狗)。如果考虑其它动物用于本发明的方法中，则在鸟中，优选的靶动物是Anseriformes目(例如，鸭，鹅，天鹅)或鹑鸡目(例如，鹌鹑，松鸡，野鸡，火鸡以及鸡)，在鱼中，优选的靶动物是Clupeiformes(例如，沙丁鱼，鲱鱼，anchovies，鲑鱼，大麻哈鱼和红鲑鱼)。各种转基因脊椎动物的制备在下列文章中讨论过：
哺乳动物：Hammer等，J.Anim.Sci.，63：269-78(1986)；Hammer等，自然，315：680-683(1985)；Simons，生物/技术，6：179-183(1988)；Murray等，Reprod.Fertil.Dev.，1：147-55(1989)；Rexroad等，Molec.Reprod，Dev，，1：164-69(1989)；Vize等，细胞科学杂志，90：295-300(1988)；Wieghart等，J.Reprod.Fertil，(增刊41)89-96(1990)；Oren等，美国国家科学院院报87：5061-65(1990)；Brinster等，美国国家科学院院报92：4438-42(1985)。
鸟：Salter等，病毒学，157：236-40(1987)；Bosselman等，科学，243：533-35(1989)；Bosselman等，病毒学杂志，63：2 680-89(1989)；Crittenden等，Theor.Appl.Genet.，77：505-15(1989)。
两栖动物：Rusconi等，美国国家科学院院报78：5051-55(1981)。
鱼：Zuoyan等，Kexye Tonabau，31：988-90(1986)；Maclean等，生物/技术，5：257-61(1987)。
在一实施方案中，靶动物是非人类哺乳动物，器官或组织将从中移植到人类受治疗者中，靶动物是转基因的，优选地在位于预期的器官和组织移植物(一起称为″靶组织″)的红细胞和内皮细胞上表达以上所述的蛋白质和酶，所述的靶组织随后被移植进受治疗者。如上所述，在优选的方式中，这些蛋白质包括至少一种掩蔽或降低gal表位水平的酶和补体调节蛋白质。
饲养特异性地用于器官移植供体的非人哺乳动物具有许多优点，只要受体接受所说的器官或组织。首先，细心饲养的非人动物不太可能是破坏性的，比人供体携带较少的病原性病毒或瘤。请注意，人供体常常是死亡者的，由于来源于死亡者，使得捐献的器官不太理想。其次，与人器官供体的随机选择相比，异种移植时大小和年龄可以细心地被控制。第三，潜在的接收者往往不能等待直到捐献的器官可供使用的长的时间。非人哺乳动物器官很可能可以以较大的数量获得，并且比相关的人类器官有更一致的基础。如果移植物不合乎需要，则后备器官也应该是容易获得的。最后，器官和接收者现在是主要MHC相容性匹配的。如果排斥是不太值得关注的问题，则可以对其它事项给予更多的注意，如大小匹配。
按照本发明，各种不同的动物都可以用作人类和其它哺乳动物中器官和组织移植的供体。对动物的选择将取决于所需的特定的器官或组织，大小和受体的性别。对于人接受者，猪一般是优选的，这是因为其大小，类似的生理特征，容易进行遗传操作，生殖速率和方便性。其它动物，如绵羊，山羊，牛等也可以利用。如果受体不是人，对动物的选择可以变化，但是采用相同的选择标准，本领域技术人员可以选择一种适当的供体动物。
由于有许多株系可供使用，实验小鼠已是在转基因动物的开发中利用的最普遍的宿主动物。由此小鼠是最广泛地可供使用的实验动物，有许多株系可供使用，参见实验小鼠的遗传变体和株系(Gustav FischerVerlag，1981)。然而，在这种工作中，对使用其它实验室或家畜物种没有任何基本上的限制。在高等哺乳动物中，猪是优选的。
产生转基因动物的技术是熟知的，并且包括那些在许多期刊文章中所描述的技术，包括Gordon等，酶学方法，101：411(1983)；Brinster等，美国国家科学院院报，82：4438-42(1985)；Palmiter等，遗传学年评.20：465(1996)；Brinster等，The Harvey Lectures.Series80，1-38(1986)；Scangos等，遗传学进展，24：285(1987)；Cuthbertson等，实验室研究，58：484(1988)；和Camper，生物技术，5：638(1987)。此外，这样的技术在Hogan等，操作小鼠胚：实验室手册(冷泉港实验室.1986)和Levine等，″基因转移进种系，″Kucherpati(编者)，基因转移(Plenum出版社1986)；Palmiter等，细胞，41：343-45(1985)中也有描述。
在制备按照本发明的转基因动物的方法中，原核生物载体(更具体地说是任何原核复制子)在转基因引入到将要培养成转基因动物的宿主细胞中之前除去。例如，在早期β-glob#n转基因构建体包含的λDNA的大侧翼序列明显抑制转基因在转基因小鼠中的表达。参见Wagner等，再生的分子和细胞方面，319-349(1996)。
转基因嵌合遗传工程动物
在转基因动物中，转基因必需包含在所有动物的细胞(包括生殖细胞)中，这样它可以遗传到动物的子代。在嵌合动物中，至少一些对动物内源性的细胞携带转基因，但是种系遗传不是必然可能的。转基因可以限制在具体的体组织。术语″遗传工程动物″包括转基因和嵌合动物两者。它旨在扩展到不仅限于原来产生的动物，而是包括那些保持和表达转基因的它们的子代的。
然而，因为转基因的种系遗传通常是有利的，所以转基因动物的产生通常是优选的。因此，以下的讨论指″转基因″动物，然而，这样的阐述在细节上进行必要的修改后也可以用于嵌合动物。
许多技术可以用来把转基因引入动物的遗传物质中，包括但不限于，逆转录病毒感染，电穿孔法，将转基因微注射进受精卵的前核中以及胚胎干细胞的操作，如在Wagner和Hoppe的美国专利4,873,191(本文一并参考)中所描述的。此外，所述的技术还包括其它合适的技术，包括在Palmiter等，遗传学年评20：465-499(1986)和法国专利申请2593827(1987年8月7日出版)中报道的。
迄今产生的绝大多数转基因动物(和所有的转基因家畜)由DNA的前核微注射产生。该技术涉及在溶液中将DNA送递至受精卵的一个前核中。在200X微分干涉相差显微镜下可以观察到受精卵的前核。在从猪，牛和绵羊卵的情况下，卵子应该首先离心，以对沉淀胞质脂质(其使得前核显现困难)，参见Hammer等，自然315：680-683(1985)。
用于微注射法的夹持和微注射吸移管由(1mm O.D.，0.78mm I.D)硼硅玻璃毛细管制成。毛细管优选的是在显微拉制中加热，拉出微注射或夹持端。在微注射之后，存活的卵子在适当的动情期被转移到受体雌性动物中。
有可替的微注射方法，例如，用遗传工程逆转录病毒感染预移植的胚(一个细胞对八个细胞)，如Jaenisch，美国国家科学院院报73：1260-1264(1976)中所描述的。在这种情况下，除去透明带，在感染过程中将胚与成纤维细胞一起培养。然后可以将感染的胚置回透明带，并且转染进合适的受体中。
另一种产生转基因动物的方法包括电穿孔法。在这一技术中，将一个细胞卵置于具有DNA溶液的电穿孔室中。通过室产生脉冲电场，以驱使DNA进入卵子中。
从哺乳动物(例如，小鼠和仓鼠)胚细胞内部细胞群体的细胞产生胚茎干(ES)细胞系。通过在饲养层上的生长例如原胚成纤维细胞或胚成纤维细胞细胞系STO将ES细胞保持在干细胞状态。ES细胞可以经任何适于体外哺乳动物细胞培养的技术遗传修饰，然后注射进胚细胞。然后它们分化和建群大多数(如果不是动物的所有组织，包括种系的话)。参见Deutschman，″在胚干细胞中的基因导向″，第4章，89-100页，First和Haseltine，转基因动物(Butterworth-Heinemann：1988)。
虽然大多数研究已涉及转基因小鼠，转基因动物的其它物种也已产生，如兔，绵羊和猪(Hammer等，1985，如上)，鸡(Salter等，病毒学，157：236-240，1987)，大鼠(Mullins等，自然，334：541-544，1990)，山羊(Denman等，生物/技术，9：839-843(1991)和母牛(Krimpenfort等，生物/技术，9：844-847，1991)。
E.从按照本发明产生的转基因动物获得的组织和器官的移植
对本领域技术人员显而易见的是，一旦产生按照本发明的转基因动物，就可以用本领域熟知的目前本领域使用的许多技术的任何一种将所说动物的器官、组织、细胞以及非活组分移植进适当的人接收者中。可被移植的器官的表单非常长，并且仅限于对移植这样的器官有可用的外科技术的程度。某些组织，细胞或部分器官也可以移植。为了解释所附权利要求，术语″器官″包括整个器官，部分器官和各种各样的组织。例子包括肾，眼睛，心脏，心脏瓣膜，皮肤，肝，骨髓，肠，血管，关节或其部分，胰腺或包含胰岛的部分，肺，支气管，人脑组织，肌肉和任何其它形成血管的组织。然而，血液或血液组分的输注不构成器官移植。
可以进行移植来纠正由于伤害，遗传缺损，疾病，毒性反应等产生的功能不正常的器官。受体可以接收移植的器官，以补充现有的组织，例如利用皮肤组织治疗烧伤，用胰岛治疗糖尿病或用脑组织治疗帕金森氏病。此外，可以完全除去受体缺损器官，并用移植物替代，例如在肾，心脏，肝，肺或关节中的移植。对于某器官移植，使用任一技术是可能的，例如用潜伏移植物治疗肝硬化和肝的肿瘤和感染。
这样，本发明能够提供合适的供体器官、组织、细胞以及非活组分，它们表达至少一种能够在转基因动物的细胞中掩蔽或降低抗原性gal表位水平的酶(如α(1，2)FT，α(2，6)ST或β(1，3)NAGT)以及至少一种补体抑制蛋白质(例如CD59，DAF，MCP和/或以上讨论的许多补体抑制蛋白质的任何一种)，并且这些组织，器官以及细胞可以用于人移植中，极大地降低产生抗体介导的或补体介导的免疫反应的可能性。在本发明的优选的方式中，可用按照以上描述的步骤制备转基因动物，如猪或小鼠，优选地，可以从转基因动物分离移取所需的器官与组织，并用于采用目前已知的常规移植方法移植到人患者中。通过采用表达以上讨论的蛋白质或酶的DNA的器官和组织，将极大地降低严重的抗体介导的或补体介导的排斥(如超急性排斥)的危险性。达到没有广泛的或严重的免疫抑制(这类方法通常伴随的)的异种移植是可能的。当然，对于每一种特定的情形，适当的医护人员在移植时和移植后的回复期间将确定是否需要免疫抑制治疗，但是，经由以上详细描述的本发明的方法，免疫排斥将得到极大地降低。
这样，本发明非常有利之处在于，它提供了与当前可供使用的异种组织和器官相比更适用于异种移植的供体器官，组织以及细胞，因此，本发明非常有助于降低严重限制移植治疗的范围和效能的供体器官和组织可怕的后遗症(backlog)。
本发明的优选的实施方案与其它特征在以下实施例中给出，或者显然可以从这些实施例看出，给出这些实施例是为了例证或说明本发明，但不是用来限制本发明。以上描述的特定的实施方案揭示了本发明的一般特征，使得其它人可以利用现有的知识，为了各种用途容易地修改和/或改变这些特定的实施方案，而不背离其总的原理，因此，这样的修改和/或改变应当理解为在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解，本文所使用的措词或术语用于描述目的而不是用于限制目的。
实施例
实施例I：CD59小基因No.1的构建
1.1 CD59小基因No.1的构建
在预定的条件下，使用引物     5′(5′-ACCGGGAATTC-
             TTCCTTCCAGGTTCTGTGGACAATCACAATGGG-3′)和3’(5’-CACGGGAGCTCGCTATTACACTTTTCCAGTGG-3′)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增含有外显子2、外显子3、外显子4序列和667bp 3’非翻译(UT)序列的人CD59 cDNA的一部分。所说的5’引物的侧翼是EcoR1位点(黑体)，包含相当于内含子1(斜体)3’末端的10个碱基，并延伸到起始甲硫氨酸(下划线)下游的2个碱基。所说的3’引物的侧翼是Sac1位点(黑体)。所得的PCR产物包含CD59 cDNA 1072bp，其包含在5’和3’末端分别引入EcoR1和Sac1位点的外显子2的5’剪接受体位点。
分别使用引物(5′-CACGGGAGCTCATACATCAATGGTGTGTTAAAGC-3′)和(5′-CACGCTCGAGGCTCCTGGCTTTCTGGAGTTGG-3′)通过在5’和3’末端引入Sacl和Xhol的位点的PCR扩增此基因的3’侧翼区的1033bp序列。连接这些PCR产物得到2105bp EcoR1/Xhol片段。从λ克隆中分离3.0Kb包含CD59邻接的3’UT区的Sal1/BamH1片段，并将其连接到上述PCR产物的Xhol位点。将所得的片段导入到包含CD59 5’侧翼区、外显子1和4kb外显子1的3’侧翼序列的10.5Kb Sal1片段的下游。序列分析表明所说的cDNA编码在76位氨基酸上具有Thr-至-Ala取代的各种蛋白质。所得的片段长度是15.5Kb(参见图1)。
1.2转基因小鼠的产生
构建15.5Kb DNA片段，所说的片段以包含6.5Kb的人CD59基因的5’非翻译部分、外显子1、4.0Kb的内含子1的5’末端、外显子2、3和4的片段作为cDNA，还包含4.7Kb含有所有5’端特有的聚腺苷酸化信号的3’非翻译区。在载体的多接头上使用Not I位点切割所说的小基因，并将其微注射到受精卵中以获得转基因小鼠。起始的小鼠为C57BL/6×SJL F2杂交种。在63个起始的小鼠中有19个(30％)为CD59小基因构建体的转基因小鼠。通过与C57BL/6小鼠回交，由所得的阳性小鼠获得品系。在13个转基因小鼠品系中有5个(38％)在它们的肝、心脏和肾中表达CD59mRNA。选择CD59mRNA表达水平最高的品系5-2进行详细分析。
1.3转基因小鼠的表达分析
1.3.1 Northern印迹分析
从肝、心脏、肾、肺脏、脑、肌肉、血液和脾中提取RNA，并通过Northern印迹分析进行分析。在除了血液和脾以外的所有组织中都检测到了两个转录物(1.9和2.1Kb)，据估计其水平较在人类组织中所观察到的水平低10倍。
1.3.2免疫组织学分析
使用对人CD59特异的单克隆抗体通过免疫组织学分析5-2品系的各种组织，以确定人CD59小基因在转基因动物中的组织和细胞类型特异性。将对CD59、人C5b、人C3d和膜攻击复合体特异性的抗体用于免疫染色。通过使用mu-链特异性的偶联FITC的山羊抗人IgM单克隆抗体在各种组织上检测人IgM。制作宽度为4μm的冰冻切片，并在优选的条件下使用所说的抗体染色。此分析结果表明所说的转基因小鼠品系在心脏的内皮细胞衬料小动脉和毛细管上表达蛋白，此结果与CD59在人类中的表达一致。当通过染色来检测人CD59时，非转基因littermates的心脏是阴性的。在转基因小鼠胎盘、肺脏上皮的和内皮细胞以及皮肤上皮中观察到CD59的高水平表达。同时检测到CD59蛋白在转基因小鼠肝门三联内皮细胞衬料、骨胳肌、胰内皮和上皮中的表达水平较低。CD59蛋白质在转基因小鼠的肾、脾和脑组织中的表达是阴性的。
1.3.3 FACS分析
与在人类循环血液细胞中观察到的CD59的高水平表达相反，转基因小鼠在红细胞以及白细胞中都没有表达所说的蛋白质，这是通过血流血细胞计数分析的。在转基因小鼠脾中不含CD59蛋白质以及在转基因小鼠血液和脾中没有检测到CD59 mRNA的事实证明了这一点。因此所说的小基因能够指导人CD59在所说的组织(这些组织在人体中表达CD59)内部表达人CD59。
1.4在转基因小鼠中的功能分析
为了确定在转基因小鼠中表达的人CD59是否能够抑制膜攻击复合体的形成，在六只小鼠上进行了心脏灌流实验。使用人类血浆对三只转基因小鼠和三只非转基因littermates的心脏进行体外灌注(参见Langendorff，Pfluaers Arch.61：291-332，1995)。已知在一定的实验条件下，人IgM与小鼠内皮细胞结合，并且通过传统的途径部分激活补体，这一点由C4的共沉积证明。灌注后，在6只小鼠心脏上通过心脏活组织检查方法进行的人IgM的免疫病理学检测表明在对照和转基因心脏组织有相似的分布和染色强度。这表明所有的心脏都可以用人类血液进行同样好的灌注，并且人IgM抗体能够识别并且与小鼠内皮细胞结合。
比较表达人CD59的小鼠心脏和阴性littermates的膜攻击复合体的沉积情况表明在转基因心脏中MAC的沉积基本上减少了。令人感兴趣的是，和对照相比转基因小鼠心脏灌注后，人C3d和C5b的沉积基本上也减少了。很清楚，在这种异移植排斥的模型中在转基因小鼠心脏中表达的人CD59能够抑制人补体的活化。
1.5转基因猪的产生
以与转基因小鼠品系大体相同的方式产生转基因猪品系。将CD59小基因微注射猪受精卵中已获得起始猪。使用每一头猪的尾作为样品进行分析。将尾样品进行Southern印迹分析以便确定转基因动物。在49头起始的小猪中，有2头(4％)被确定为人小基因的转基因猪。将这两个起始的动物进行杂交以便产生用于组织分析的杂合的G1转基因品系。
1.6转基因猪的表达分析
1.6.1 Northern印迹分析
从肝、心脏、肾、肺脏、脑、肌肉、血液和脾中提取RNA，并通过Northern印迹分析进行分析。在除了血液和脾以外的所有组织中都检测到了两个转录物(1.9和2.1Kb)，据估计其水平较在人类组织中所观察到的水平低10倍。
1.6.2.免疫组织学分析
使用对人CD59特异的单克隆抗体进行免疫组织学分析以确定人CD59小基因在转基因动物中的组织和细胞类型特异性。制作宽度为4μm的冰冻切片，并在优选的条件下使用所说的抗体染色。此分析结果表明CD59蛋白在转基因猪心脏大血管内皮细胞衬料上表达，但在此器官的毛细血管上没有检测到CD59的表达。这一点与在人类心脏组织中观察到的内源表达相反，在人心脏组织中此蛋白以高水平存在，并且在所有血管的细胞衬料中检测到的结果一致。将转基因猪的RBCs与人CD59的特异性单克隆抗体温育并经FACS分析表明人CD59在猪红细胞中表达，但是没有达到在人RBCs中的表达水平。当在人类组织中蛋白质表达水平低于内源水平时，转基因蛋白质表达阳性组织的分布与人类中所见的相同。这一点在转基因小鼠中不成立，在转基因小鼠中肾和血液细胞中CD59转基因的表达始终为阴性。
1.7在转基因猪中的功能分析
1.7.1使用PAECs进行分析
为了定性表达的人CD59转基因蛋白并测定其功能活性，从转基因和非转基因猪心脏中分离猪主动脉内皮细胞(PAECs)，并在FACS上分析。转基因猪心脏的PAECs表达人CD59。在转基因猪的PAECs上检测到每个细胞共有5670个人CD59分子，而每个HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)上则有41,515个CD59分子，因此说表达的差异大约为5倍。
1.7.2 GPI连接的分析
为了确认CD59小基因蛋白质是否经适当的加工后带有GPI尾，将PAECs和HWECs与PIPLC温育(磷脂酰肌醇磷脂酶C)；使用PIPLC可以证明连接有GPI的尾的特异性切割。在与PIPIC温育前后，使用用于因子VIII(跨膜内皮细胞-特异性标记物)和人CD59的双重染色经FACS分析转基因PAECs和HUVECs。如所预料的在用PIPLC处理前后阳性PAECs或者HUVECs对因子VIII的百分比没有发生变化。然而，直接定量表明在与PIPLC温育后，表达CD59蛋白质的PAECs基本上减少(81％)，这表明人CD59转基因蛋白质通过正确的加工添加了GPI-连接。当用PIPLC处理HUVECs时，79％的此细胞不再表达CD59蛋白质，这一点是通过FACS分析确认的。另外，非转基因PAECs对因子VIII是阳性的，对人CD59为阴性，这与在PIPLC处理前后的分布一致。
1.7.3功能性CD59的分析
通过检测PAECs对补体介导的暴露在人血清上的细胞毒性的敏感性来检验人CD59在猪主动脉内皮细胞中的功能。将转基因和非转基因littermates的PAECs与系列稀释的人血清温育，通过碘化丙锭吸收检测细胞毒性。与非转基因littermates相比，转基因猪(表达人CD59的猪)的PAECs能够保护其免受补体介导的细胞毒性的毒害。与溶解非转基因PAECs所必需的量相比，溶解40％的转基因PAECs需要4倍于人血清的浓度。已经证明赋予转基因PAECs的保护作为对人CD59蛋白质是特异性的，这是因为将PAECs与人CD59特异的单克隆抗体的F(ab’)片段预温育可以破坏转基因PAECs的保护作用，但对非转基因PAECs没有任何影响。
为了评价在整个器官内皮细胞中表达的人CD59蛋白质的生物功能和检测所说的转基因蛋白质的低水平对内源CRPs的贡献，使用每一种转基因品系的一头G1猪，将转基因猪心脏异位移植到狒狒体内。在再灌注后，移植的心脏分别继续跳动2.25和3小时，这比非转基因猪的心脏跳动稍长一些(0.5-1.5小时)。尽管移植物生存时间只是稍微延长，但转基因异种移植显示出对补体介导的伤害具有抗性的证据。非转基因猪心脏在再灌注1小时后显示出明显的内皮细胞破坏、心肌结构的损失、水肿、出血以及一致出现的血栓。然而，转基因猪心脏在移植再灌注2小时后还表现为相对正常。内皮细胞没有损害(接合仍然完整)，几乎没有证据表明肌细胞发生损害，只有很少的几处血小板血栓。当在再灌注3小时后2取出转基因心脏时，此组织仍然有一些区域似乎没有损害，尽管大多数显示出超急性排斥的典型结果。这一结果与在取出的正常猪的心脏中所观察的典型一致的组化变化相反。
对转基因与非转基因心脏进行免疫组织化学染色以便检验IgM和补体的沉积作用，结果表明用狒狒血清灌注的程度与抗体在所有猪心脏中的沉积程度相似，这表明发生了补体的活化作用。与在移植到狒狒体内的转基因猪心脏中所通常观察到的情况相比(再灌注后1小时)，转基因猪心脏的组织在2小时活组织检查样品中显示出膜攻击复合体(MAC)的沉积明显减少。因此，尽管在猪组织中人CD59水平较人组织中所见到的水平低很多倍，并且能够检测到的表达集中在转基因心脏，但是存在的蛋白足以证明以抑制MAC形成的能力而测定的功能活性，并且能够赋予其在异体环境中对所受到的组织损伤的保护作用。由于在假定的高水平的内源猪CRP表达的背景上检测到了低水平的人CD59抑制MAX形成的能力，所以所观察到的活性支持这一观点，即这些蛋白质确实是种特异性的。
表达CD59小基因(CD59小基因No.1)的转基因小鼠和猪的分析表明人CD59蛋白质在所说的细胞的内部表达，在这些部位观察到了内源人类CD59，并且表达水平基本上低于(至少10倍)内源人类水平。然而，我们证明可以将所说的蛋白质进行适当地加工，更重要的是保留了它的生物学功能，这一点由其对膜攻击复合体装备的抑制作用而证明。为了改进CD59小基因1的一些缺陷，构建了另一种小基因(小基因2)。
实施例II：CD59小基因No.2
2.1 CD59小基因No.2的构建
CD59小基因的构建过程如下。首先，使用引物EX2-5(5’-TACCCCGGGCATGTCCCCAAAGAGAGC-3’)和EX2-3C(5’-CCGCTCGAGGCTGCTGTCACTATGACC-3’)通过PCR扩增CD59外显子2，以便产生1048bp包含外显子2的5’端的0.52Kb的外显子2的3’端的0.43Kb的PCR产物。由序列分析确认外显子2和其周围的碱基(85bp外显子2的5’端的125bp和3’端的125bp)。为了进一步克隆，PCR扩增在PCR产物的5’端引入了SmaI位点和在PCR产物的3’端引入了XhoI位点。接下来使用引物EX3-5(5’-CACAGGAGCTCCAGTTGCAGGTTAGGAGG-3’)和EX3-3C(5’-CGCAGGAATTCAGCTTGAGTCTCCTCAGG-3’)通过PCR扩增CD59外显子3，以便产生913bp包含外显子3的5’端的0.27Kb和外显子3的3’端的0.53Kb的PCR产物。由序列分析确认外显子3和其周围的碱基(98bp编码序列5’端的50bp和3’端的50bp)。为了进一步克隆，PCR扩增在PCR产物的5’端引入了SstI位点和在PCR产物的3’端引入了EcoRI位点。然后从λ克隆中分离CD59外显子4，即将13.11bL(Tone等，分子生物学杂志227：971-976，1992)命名为包含外显子4的5’端的0.61Kb和外显子4的3’端的1.7Kb的2.5 EcoRI片段。最后，从CD59小基因No.1(最初是从λ克隆13.11bL中分离出来的)中分离CD59外显子1(为8.5Kb的XbaI/SalI片段)，其包含外显子1的5’端的4.5Kb和外显子1的3’端的4.0Kb。
使用由寡核苷酸产生的特异设计的多接头构建载体，因此按下列顺序产生下列位点：KpNI、NotI、XbaI、SmaI、XhoI、SstI、EcoRI、SalI，NotI。将多接头引入到pGem(Promega)主链中。按如下过程克隆上述的基因组片段。首先，将913bp的SstI/EcoRI外显子3的PCR产物克隆到所说载体的SstI/EcoRI位点中上。然后将1048bp的SmaI/XhoI外显子2的PCR产物克隆到上述的SmaI/XhoI位点。接下来将2.5Kb含有外显子4的EcoRI片段克隆到上述的EcoRI位点。然后在SaLI位点补平8.5Kb含有外显子1的XbaI/SalI片段，以便产生平端，并将其克隆到上述的XbaI/SmaI位点。最后，通过多种限制酶消化所有的连接产物以便确认方向和单拷贝插入物。通过NotI消化分离到最后的13Kb产物(参见图1)。
2.2.转基因小鼠的产生
将13Kb的片段微注射到受精卵中以便获得转基因小鼠。起始的小鼠为CS7BL/6 SJL F2杂交种。有7个起始的小鼠，所有的都在各种组织的内皮细胞上表达人CD59。然后对所有品系的子代进一步的分析。
2.3在转基因小鼠中的表达
2.3.1 FACS分析
通过FACS分析，5-99％的品系9-18 RBCs都表达人CD59蛋白质。这一发现在所有分析的小鼠品系(除了1个)中都是一致的。相反使用第一个CD59小基因构建体(CD59个小基因No.1)衍生的转基因动物在RBCs上不表达人CD59。在9-1 CD59转基因小鼠品系的RBCs上表达的人CD59的平均峰值与在人RBCs上所见到的相同或者更大。FACS分析表明其水平与在人RBCs上的见到的相当。
2.3.2.Northern印迹分析
转基因小鼠品系9-1子代组织(肝、心脏、肾、肌肉、皮肤、脾和胸腺)的RNA分析表明CD59 RNA表达水平比在CD59小基因No.1所见到的高至少15-20倍，接近在人组织中所见到的水平(参见图1和表4)。
2.3.3.免疫组织学分析
为了检测肝、心脏和肾上的人CD59蛋白质的免疫组织学表明其表达水平以及细胞和组织类型特异性相当于在人组织中所见到情况。这与使用CD59小基因No.1所观察到的情况(即在肾和循环血液细胞中没有表达，而在肝中也是非常有限的)相反。
2.4.转基因动物中的功能分析
通过测定赋予RBCs的保护作用使其当暴露在人血清上时免受补体介导的裂解作用的伤害，来评价转基因人CD59蛋白质的功能。检测到了明显的与CD59小基因号No.1不能相提并论的保护作用，因为在这些RBCs上没有检测到任何表达。然而，使用品系9-1检测到的保护作用超过使用实验室得到的CD59P1阳性小鼠检测到的保护作用(参见图2)。
对5个其它起始的小鼠子代的RNA和免疫组织学分析得出的结果与在转基因小鼠品系9-1中所见到的结果相当。一个品系RNA和蛋白质的表达水平都增加了，另一个品系人CD59的表达水平略微降低。
小鼠CD59小基因No.2转基因品系的分析表明第二个小基因大大优于CD59小基因No.1，同时也优于CD59P1。与P1构建体相比，小基因构建体的转基因率较高，可能是由于各个构建体的大小不同。各个基因向子代的传递是相似的，但是CD59小基因No.2较CD59小基因No.1或者CD59P1表现出更好的透入度。使用CD59小基因No.2产生的所有品系(6/6)都以致的方式表达转基因。
在CD59小基因No.2小鼠中CD59表达水平一直明显高于CD59小基因No.1转基因小鼠，并且组织和细胞特异性反映出其是内源的。当使用CD59小基因No.1产生的5个转基因小鼠品系以可检测的水平表达人CD59时，有4个品系的RNA和蛋白质的水平极其低。进一步分析表达水平最高的小鼠品系，这是与使用CD59小基因No.2产生的小鼠品系所有比较中的代表品系。通过Northern分析(图3)和数据的比重扫描(表4)表明CD59小基因No.2小鼠组织中的mRNA水平比CD59小基因No.1小鼠组织中所见到的高出15-20倍。比较CD59小基因No.2小鼠组织mRNA水平与CD59P1小鼠或者在人组织中所见到的水平表明表达水平相当相似。然而，应该记住，表达水平最高的P1小鼠品系和表达水平最高的CD59小基因No.1小鼠品系相当于表达水平中等的CD59小基因No.2小鼠品系。
比较人CD59蛋白质在不同的转基因小鼠品系(P1、CD59小基因No.1和CD59小基因No.2)以及在人组织中所见到的水平(表5)表明在CD59小基因No.2小鼠组织中检测到的蛋白质水平远远高于在CD59小基因No.1小鼠同一组织中所见到的水平，相当于在P1小鼠和人中所见到的水平。
可以将人CD59的生物活性测定为其暴露在人血清时所赋予细胞(如RBCs)的保护作用的功能。在这种情况下，将细胞裂解测定为血红蛋白释放。在CD59小基因No.2转基因小鼠和CD59P1转基因小鼠的RBCs上表达的人CD59的一功能分析如图2所示。CD59小基因No.2 RBCs对补体介导的裂解的抗性较C57BL/6小鼠的非转基因RBCs高大约10倍，较CD59P1转基因小鼠的RBCs的抗性高大约3倍。这些图是以裂解50％RBCs需要的人血清的百分数为基础的。
由构建体共注射到小鼠和猪而搜集到的数据的概括如表6所示。试图使用CD59小基因No.1构建体作为表达MCP和DAF的盒(作为cDNA插入到外显子1的唯一XhoI位点)。然而，在小鼠中没有进行CD59小基因No.1/CD59小基因No.1(作为盒)的共注射。使用由异源启动子驱动的cDNAs将补体调节蛋白(CRP)构建体共注射到小鼠体内相当于CD59P1克隆与MCP和DAF P1克隆的共注射。各种P1克隆共注射到小鼠体内，结果两个不同转基因都为阳性的频率为3.4％。然而，在所有杂交情况下，分离的转基因表明不同的转基因已经整合到了不同的染色体上。然而，更小的构建体共注射到小鼠体内的分析表明当获得预料的双转基因频率时，在所有的情况下整合的更小转基因都能可靠地传递给下一代，这表明已经发生了共整合。
各种P1克隆共注射到猪中的频率只为2种不同P1基因转基因获得的动物的0.64％。这样，4个新起始的小猪只有1个能够将2个P1基因构建体作为一个单元可靠地传递给子代。CD59小基因No.1和GD59小基因No.1(作为盒)共注射到猪中得到2/49(4.1％)的转基因动物。这两个动物转有所说的两个基因，并且将这两个基因都传递给子代。因此可以得出结论，两个CD59小基因构建体在这两个动物中都发生了共整合。
总之，CD59小基因No.2构建体指导功能性人CD59蛋白质在转基因动物中高水平地，组织和细胞类型特异性地表达，这种表达水平远远优于使用CD59小基因No.1所见到的表达。CD59小基因No.2构建体的所有数据都比得上使用CD59P1基因组克隆所观察到的数据，如果不好于使用CD59P1基因组克隆所观察到的数据。此外，共注射数据分析表明CD59小基因构建体为了表达其它基因(其它CRP)作为盒是有用的，并且为了获得带有2或者3个不同转基因的动物，依次将这些构建体共注射到动物体内，所说的基因将都传递给子代。目前，已经显示出有四头猪表达了人CD59。RBCs上的FACS分析和肌肉活组织检查的免疫组织
化学分析表明CD59的表达为阳性。
实施例III：CD59小基因盒
3.1 CD59小基因盒的构建
使用基因组DNA作为模板(大约包括外显子25’端的1.34Kb和外显子2的ATG之3’端的16bp)通过PCR扩增1.3Kb产物。将3’因为进行基因工程操作，以便通过引入XbaI位点而剔除外显子2的ATG。分别在5’和3’端引入SmaI位点和RpNI位点。所用的引物为：
5′AGGTGCACGGCCCACCGTGGCCACTAGTACTTACCCGGGGACCTCAGACCAC-3′，SmaI
位点用黑体表示(斜体表示的SfiI位点可能用于下面的克隆步骤)；5’-CGGGGTACCCGTTAGTCTAGAAATGTGATTGTCCACAGAAC-3′，黑体表示KpNI位点，斜体
表示XbaI位点，下划线的序列相当于CD59的互补序列。
使用CD59小基因No.2作为模板通过PCR扩增0.512Kb产物。所说的产物从G开始(其恰恰在外显子2 ATG的3’端)，通过外显子2末端进入内含子2，向3’端扩展了0.43Kb。将KpNI和XhoI位点作为引物的一部分分别加入到5’和3’末端。所用的引物为5’-GGGCTACCAAGGAGGGTCTGTCCTGTTCG3′(KpNI位点为黑体)
和5-CCGCTCGAGGCTGCTGTCACTATGACC-3‘(XhoI位点为黑体)。
第三个产物是从CD59小基因No.2中分离出来的3.5Kb XhoI/NotI片段，其包含外显子3的5’0.27Kb、外显子3、内含子3的5’的0.53Kb、内含子3的3’的0.61Kb、外显子4和1.7Kb 3’非翻译序列。
将上述的三个片段按照下列顺序连接：1.35Kb SmaI/KpNI---0.512Kb KpNI/XhoI---3.5Kb XhoI/NotI，以便产生5.5Kb包含KpNI和XbaI位点的Smal/NotI产物，将此产物插入到外显子2的ATG处，结果破坏了起始甲硫氨酸。这一位点作为克隆位点以便引入在内皮细胞上表达的cDNAs。一旦插入cDNA，加入含有CD59外显子1的5’，其为8.5KbXbaI/SalI片段，并将SalI位点补平以便产生与SmaI位点连接的平端。
3.2转基因小鼠的产生
将DAF(或者MCP)的cDNA插入到CD59小基因盒的KpNI XbaI位点，将所得的构建体微注射到小鼠受精卵中以便获得转基因小鼠。通过Southern印迹分析鉴定的起始的转基因小鼠为C57BL/6×SJL F2杂交种。然后对起始小鼠的子代进一步分析。
3.3转基因小鼠的表达分析
3.3.1使用小基因盒表达DAF
使用DAF表达盒产生的所有5个初始转基因小鼠都在RBCs上表达DAF，FACS测定表明两个的表达水平相当于人类的表达水平。通过测量DAF蛋白质保护转基因小鼠RBCs免受补体介导的裂解作用，证明其是有功能的。与人DAF的RNA和蛋白质在人类中的内源水平相比，其在转基因小鼠组织中的水平要低几倍。
3.3.2使用小基因盒表达MCP
MCP表达盒的微注射得到50个潜在的起始小鼠。在这50个小鼠中有8个(16％)被鉴定为转基因小鼠。心脏mRNA的Northern印迹分析表明这8个新建立的品系中有5个表达了大小合适的转录物；在这5个品系中，1个品系表达MCPmRNA的水平相当于在人心脏样品中所观察到的内源水平。
实施例IV：使用P1克隆产生的转基因动物
4.1.P1克隆的鉴定和纯化
使用根据原来出版的序列设计的寡核苷酸对(表7)(相当于CD59和CD46的5’和3’区)经聚合酶链式反应筛选在噬菌体P1(基因组系统，St.Lnuis，MO)中构建的人基因组文库。使用两套引物鉴定克隆。从大肠杆菌的NS3529菌株中经碱裂解法分离高分子量质粒DNA，接下来在Qiagen-500柱上(Chatsworth，CA)纯化。通过限制酶消化、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)和Southern印迹分析对插入物进行作图。
以存在于每个克隆中的5’和3’侧翼区量为基础选择用于微注射的候选片段。
为了制备用于微注射的片段，用SfiI或者MluI消化所说的克隆，将消化混合物通过PFGE进行大小分级分离。溴化乙锭染色后，从凝胶中切割克隆的片段，纯化、浓缩并分析其完整性。
4.2.转基因小鼠的产生
纯化后，将所说的片段分别微注射到可育的卵母细胞中。由Southern印迹分析鉴定新起始的动物(C57BL/6×SJL F2)，通过回交建立品系。通过将子代(例如CD59和CD46 F1动物)杂交产生含有两种转基因的动物。在27个潜在的起始的小鼠中有5个(19％)是CD59阳性。每个MCP基因组克隆(60kb和80kb)产生13个转基因新起始的小鼠，转基因率分别为29％和15％。DAF的90kb构建体在19个G0小鼠中产生6个阳性转基因小鼠。70kb DAF构建体在18个转基因新起始的小鼠中产生3个转基因小鼠(17％)。CD59、60kbMCP、80kb MCP片段传递给G1代的比率分别为50％(2/4)、83％(10/12)和69％(9/13)(表8)。6个DAF新起始的小鼠中有5个也将所说的基因传递给G1子代。这些数据表明可以通过微注射大的基因组片段成功地产生转基因小鼠，并且这种基因可以传递给后代。
4.3转基因小鼠中的表达分析
通过Northern分析、免疫化学和FACS分析，分析杂合体G1动物的表达情况。
4.3.1 FACS分析和定量
通过间接免疫荧光评价蛋白质在鼠外周血细胞(红细胞和白细胞)表面的表达。使用标准技术通过流式细胞术测定细胞表面表达。
4.3.2 Northern分析
从组织、血液或者二者中分离总细胞RNA，并进行Northern印迹。所有探针都是用[-32P]脱氧-CTP通过随机引导标记的片段。人总RNA样品用作阳性对照，从Clontech(Palo Alto，CA)购买。
4.3.3.免疫组织学分析
将用于免疫荧光研究的组织包埋在O.C.T(Lab Tak，Elkhart，IN)中，在异戊烷中冷冻断裂，处理前一直储存在-80℃下。在低温控制器(Leica，Heidelberg，德国)中制备冷冻组织样品。将切片在空气中干燥，用丙酮固定，并且磷酸缓冲的盐水(PBS)中洗涤。将每个切片和单克隆抗体(mAbs)一起温育，并用具有结合FITC亲和性的分离的F(ab)’2二级和三级抗体的双层荧光色素层检测mAbs。在温育后用PBS洗涤组织切片，并用对苯二胺与甘油溶液封固。通过如上所述的方法制备切片并除去一级抗体来评价背景免疫荧光。使用大鼠mAb(YTH 53.1)和小鼠mAb(MCA 695)(Serotec，华盛顿)分别检测CD59和CD46。另外，使用A.F.Michaels(明尼苏达大学)提供的罗丹明结合抗体来具体说明底部结构。使用Leitz DMRB落射荧光(Wetzlar，德国)显微镜检查组织并在40倍下照相。
鉴定了5个表达CD59mRNA和蛋白质的转基因品系。在含有70kb基因组片段的品系中观察了mRNA水平在肝、心和肾组织中的分布，这种分布基本上与人类中所见到的相似(实施例I和II中详细描述了)。转基因小鼠在肝、心脏和肾内皮细胞的表面(这一点是通过免疫细胞化学测定的)和在RBCs上(这一点是通过FACS分析测定的)表达CD59。这些结果表面使用大的基因组CD59克隆可以获得组织特异性表达。
携带60kb MCP基因组片段的八个独立的转基因品系在RNA和蛋白质转基因表达上是阳性的。RNA的表达在肾中最高，在心脏和肝稍低。在三个转基因品系中，RNA水平相当于在各个人组织中所发现的内源水平。蛋白质在肝、心脏和肾的内皮细胞中表达，肝中的表达水平最高。此外，FACS分析表明MCP存在于血液白细胞表面。与CD59和DAF相反，RBCs中缺乏在人循环血细胞中表达的MCP蛋白。在小鼠RBCs中具有相似表现的MCP转基因动物不表达人MCP。80kb MCP基因组片段的情况与之相似，五个分析的品系表达了人MCPRNA和蛋白质。这两个构建体的组织分布是相似的。这些结果表明通过使用这些特殊的MCP基因组克隆，可以获得表达水平与在人类中检测到的内源水平相当的细胞类型和组织特异性表达(参见表9两个转基因小鼠品系各种组织中蛋白质表达细节)。
4.4功能分析
通过测定赋予血细胞的保护作用使其当暴露在人血清上时免受补体介导的裂解作用的伤害来评价转基因人CD59蛋白质的功能。
4.5含有多个人补体调节基因组克隆的转基因小鼠
产生含有多人补体调节基因组克隆的转基因小鼠。通过将表达不同补体调节蛋白质的各个品系杂交，同时通过连接下列克隆：a)70Kb CD59+60Kb MCP，b)70Kb CD59+90Kb DAF，c)60Kb YCP+90Kb DAF，和d)70Mb CD59+60Kb MCP+90Kb DAF(三重注射)获得转基因小鼠。对双重和三重注射的P1克隆动物的分析表明没有发生P1基因的共整合。通过将两个独立的P1品系杂交获得了携带CD59和MCPP1基因的小鼠。正在对这些小鼠进行分析以便提出两补体调节蛋白质在转基因动物中具有加性或协同表达效应。
4.6含由P1克隆的转基因猪品系的产生
以与转基因小鼠品系基本上相同的方式产生转基因猪品系。实行CD59、DAF和MCP的双重或三重微注射。从1994年3月到1995年3月得到790头潜在新起始的小猪。在所有的单基因阳性猪中，9头为MCP阳性；2头为CD59阳性；7头为DAF阳性。有三头猪为CD59和DAF阳性，一头猪为MCP和CD59阳性，一头猪为MCP和DAF阳性。使用血液样品、肌肉活组织检查或者二者同时使用，分析了新起始小猪的组织。
使用最敏感的检测mRNA的方法(即RT-PCR)，分析的3/3 MCP阳性猪为MCPmRNA阳性，分析的1/1 CD59阳性猪为CD59mRNA阳性，分析的5/5 DAF阳性猪为DAF mRNA阳性。动物血液的Northern分析(异种不太敏感的检测方法)没有检测到相应的mRNA。MCP+CD59阳性动物具有可通过RT-PCR检测到的MCP和CD59mRNA，这是唯一可通过Northern分析检测到的mRNA。两个CD59+DAF阳性动物具有的mRNA即可通过RT-PCR检测(一个动物具有DAF mRNA和CD59mRNA)，又可通过Northern分析检测。第三个DAF+CD59动物具有的mRNA通过这两种方法都检测不到。MCP+DAF新起始小猪只有RT-PCR可检测的MCPmRNA。总结如下：
    DNA     PCR阳性   Northern分析阳性
    MCP     +++
    CD59     +
    DAF     ++++++
  MCP+CD59(1头猪)     +MCP；+CD59     +MCP
  CD59+DAF(2头猪)     +CD59；+DAF     +CD59；+DAF
    +CD59；+DAF
  MCP+DAF(1头猪)     +MCP
有必要通过观察来确定上面的数据，因为通常起始动物是嵌和型。通常在起始动物中不能检测到，而当转基因传递给子代时可以检测到该转基因特定RNA。我们的实验是十分确切地存在于血液样品中的P1转基因的小鼠。收集血液进行分析是攻击性最小的方法，可以用于潜在的有价值的起始动物，因此这是当前所使用的分析方法。除了上述提到的小猪外，出生的小猪还有31头有待于进一步实验。必需在这些出生的小猪的所有子代进行扩展分析以便确定表达水平和组织特异性。
实施例V：使用YACs产生人CRP基因座及其用途
5.1多基因YACs的产生
大DNA片段(如上面描述的P1基因组CD46、CD55和CD59基因)通常产生具有适当组织特异性的高水平基因表达。在一些应用中(如异物移植)，使用多个转基因是至关重要的。然而，对于大的DNA片段使用简单的共注射策略产生几个基因的转基因动物比较困难。较小的DNA片段(＞50kb)通常在转基因胚的基因组的单一位点发生高频率的共整合，与此不同，较大基因组基因的共注射经常产生多个独立的整合位点，并增加基因重排频率。通过这种方法产生的转基因动物含有多个转基因整合位点。在繁殖时，这些转基因动物独立地将转基因分配给它们的子代，因此大部分子代只遗传了所有共注射转基因的一部分。而且，每一个整合位点代表正常基因组结构的破裂，这增加了产生有害突变的可能性。特别值得关注的是潜在突变的应用，如异种移植，其中期望转基因器官能够在受体人中生存时间延长。
为克服这些问题，以及产生可以加入与异物移植相关的额外基因的框架，我们设计装备唯一人补体调节基因座(包含编码CD46、CD55和CD59三个较大的人基因组DNA片段)的方案。含有CD46、CD55和CD59基因的起始基因座将超过200kb。
最近已经能够使多达几百千碱基的较大DNA片段成功的注射到受精卵中，并且这些很大的DNA片段以合理的频率保持完整和功能。参见Sched1等，核酸研究，20：3073-3077(1992)；Gaensler等，美国科学院学报，90：11381-85(1993)；Sched1等，自然362：258-261(1993)；Gnirke等，基因组15：659-667(1993)。这表明可以将一系列大小不等的P1基因组片段连接成一段DNA，然后进行微注射。这一方法能保证含有多个大小不等的P1 DNA片段的转基因座位由确定的结构组成，并且此基因座上的所有P1基因都整合到单一的基因组位点上。因为这些基因是通过物理方法连接的，所以此方法也能确保组成转基因座位的多基因中的每一个都将作为一个单位可靠地遗传给后代。
5.1.1人CRP基因座的装配
由于P1克隆系统只能包装多至100Kb的DNA，因此必需使用酵母(YAC)克隆系统(Burke等，科学236：806-812，1987)来装备一个大于100Kb的基因座。我们已经描述了编码CD59、CD46和CD55的P1基因组的片段。这三个基因的DNA总共为200Kb。YAC克隆系统很容易包装这种大小的DNA。通过一对唯一的限制酶位点来确定每一个P1基因组片段的末端(表10)。为了方便这三个基因的装配，我们修饰了pYACQ克隆载体，使这含有包含这些限制酶切位点的多克隆位点(图4)。这些限制酶位点在多克隆位点之内的顺序使得由所说的3个P1基因组成的基因座能够依次装配。第一步是将侧翼为Mlu1的60Kb CD46 P1基因克隆到pSRY-1的Mlu1位点。这样就产生一个含有MCP基因的YAC。更为理想的是，将P1插入物定向插入，这样MCP的转录就从TRP侧臂开始。与此类似，将70Kb SfiI CD59P1基因克隆到SnaB1位点，以便产生第二个包含CD59基因的YAC。最后，用Not1、SfiI CD55 P1基因将Not1消化的MCP-YAC与SfiI消化的CD59-YAC连接在一起。
5.1.2  YAC-MCP的产生
通过碱裂解法分离含有P1 MCP克隆的高分子量质粒DNA，然后在Qiagen-500柱上纯化(Chatsworth，CA)。用限制酶Mlu1将DNA消化至完全，用酚/氯仿抽提(Riley等，复杂基因组分析技术，p59-79，1992)，将少量的DNA对TE(10mM Tris(pH7.5)，1mM EDTA)进行透析。用Mlu1和BamH1消化质粒pSRY-1，用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化，将6.0kb Trp臂和3.4kb Ura臂进行凝胶纯化。然后将消化的P1 DNA与10molar过量的pSRY-1臂过夜连接，并如Burgers等(分析化学，163：391-397(1987))的描述转化到AB1380原生质球中。最初在ura-平板上选择转化体，然后在ura-、trp-平板上选择。接下来由ura+、trp+克隆产生基因组DNA填料(plug)，通过PFGE和Southern印迹杂交来分析含有MCP的YAC是否存在。使用质粒拯救进一步确定MCP DNA在所说的克隆位点的完整性以及插入物的方向。
5.1.3 YAC-CD59的产生
因为SfiI限制酶切位点含有5个随机的碱基，所以限定CD59 P1基因的SfiI消化能够产生不相容的3个碱基对突出端，这些突出端不能直接克隆SRY-I质粒的SfiI位点。因此，我们描述了两种将CD59 P1基因克隆到pSRY-1 YAC中的方法。第一种方法较简单，其将70Kb CD59插入物作为平端连接物克隆到pSRY-1的SnaB1位点。通过碱裂解法分离含有P1 CD59克隆的高分子量质粒DNA，接下来在Qiagen-500柱(Chatsworth，CA)上纯化。用限制酶end将DNA消化至完全，用酚/氯仿抽提(Riley等，1992，参见上文)，将少量的DNA对TE(10mM Tris(pH7.5)，1mM EDTA)进行透析。用SnaB1和BamH1消化质粒pSRY-1，用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化，将6.0kb Trp臂和3.4kb Ura臂进行凝胶纯化。然后将消化的P1 DNA与10molar过量的pSRY-1臂过夜连接，并如Burgers等(1987，参见上文))的描述转化到AB1380原生质球中。最初在ura-平板上选择转化体，然后在ura-、trp-平板上选择。接下来由ura+、trp+克隆产生基因组DNA填料，通过PFGE和Southern印迹杂交来分析含有MCP的YAC是否存在。使用质粒拯救进一步确定MCP DNA在所说的克隆位点的完整性以及插入物的方向。因为这种研究需要平端连接，所以在这一例子中是较困难的。此外，某些克隆生长情况不好，使得分离足够量的CD59 P1插入物也是很困难的。由于这些问题，我们发展了另外一种方法，如下所述。
5.1.4 YAC-DAF的产生
通过碱裂解法分离含有P1 DAF克隆的高分子量质粒DNA，接下来在Qiagen-500柱(Chatsworth，CA)上纯化。用限制酶Not1和SfiI将DNA消化至完全，用酚/氯仿抽提(Riley等，1992，参见上文)，将少量的DNA对TE(10mM Tris(pH7.5)，1mM EDTA)进行透析。用Not1、SfiI和BamH1消化质粒pSRY-1，用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化，将6.0kb Trp臂和3.4kbUra臂进行凝胶纯化。然后将消化的P1 DNA与10molar过量的pSRY-1臂过夜连接，并如Burgers等(1987，参见上文)的描述转化到AB1380原生质球中。最初在ura-平板上选择转化体，然后在ura-、trp-平板上选择。接下来由ura+、trp+克隆产生基因组DNA填料，通过PFGE和Southern印迹杂交来分析含有DAF的YAC是否存在。使用质粒拯救进一步确定DAF DNA在所说的克隆位点的完整性以及插入物的方向。
5.1.5三基因座位的装配
为了装备YAC-MCP，使用PFGE将酵母细胞的染色体进行凝胶纯化，用Not1消化分离的带。与此相似，使用PFGE将酵母的YAC-CD59染色体进行凝胶纯化，以SfiI消化分离的带。将这些消化的染色体片段与等摩尔量的70kd Not1、SfiI DAF P1插入物连接，并转化AB1380原生质球。最初在ura-平板上选择转化体，然后在ura-、trp-平板上选择。接下来由ura+、trp+克隆产生基因组DNA填料，通过PFGE和Southern印迹杂交来分析含有所有3个基因的200kd YAC是否存在。
5.2另外的克隆方案
形成CD5 9-YAC是十分困难的。这一步骤包括效率很低的平端连接过程。此外，某些CD59 P1克隆生长状况不好，使得很难纯化足够数量的CD59插入物用于平端连接。因为这些问题，我们也使用了另外一种产生包含CD59的YAC的方法(Ketner等，1994，美国科学院学报91：6186-90)这一方法依赖酵母中存在的高频率同源重组。扼要地讲，用3段DNA转染酵母原生质球：整个CD59插入物、含有YAC-Trp臂的CD59插入物远5’区部分、含有YAC-Ura臂的CD59插入物原3’区部分。两个同源重组过程产生CD59-YAC，一个发生在Trp-YAC臂的5’CD59序列和同源的CD59 P1基因的5’区之间，另一个发生在Ura-YAC臂的3’CD59序列和同源的CD59 P1基因的3’区(图5)。为此，我们通过质粒拯救分离了CDSS P1插入物的5’和3’末端部分，并对这些亚克隆进行了部分测序。从这一分析中，产生了一系列用于PCR的寡核苷酸引物(表12)。引物对CH-1和CH-2含有Not1、SfiI(CH-1)和BamHI限制酶切位点，并从CD59 P1基因的5’末端扩增了一个1.4kb片段。将此片段作为Not1、BamH1片段克隆到pSRY-I中。所得的质粒包含6kb Trp-CEN-ARS YAC臂以及1.4kb 5’CD59插入物。对于CD59 P1插入物的3’末端，使用引物ED-1和ED-2扩增带有SnaB1和HincII的1.2kb PCR产物。将此PCR产物切成平端，克隆到SRY-1的SnaB1位点。通过对此插入物的连接处进行测序确认1.2kb 3’片段的方向。为了装备最后的CD59 YAC，将这3段DNA转染到AB 1380中。将用Not1线性化的CD59 P1 DNA与等摩尔量的BamHI消化的5’CD59-Trp-YAC臂及Snab1、BamHI消化的3’CD59-Ura-YAC臂共转染。最初在ura-平板上选择转化体，然后在ura-、trp-平板上选择。接下来由ura+、trp+克隆产生基因组DNA填料，通过PFGE和Southern印迹杂交来分析含有CD59的YAC是否存在。使用Southern印迹杂交、质粒拯救或者覆盖5’和3’连接区的PCR扩增进一步确定YAC中的CD59 DNA的完整性和方向。以很高的频率分离带有正确结构的转化体(表11)。
5.2.1经同源重组的装配
使用同源重组将P1基因亚克隆到YAC载体是常用的方法，可以使用这种方法产生包含MCP和DAF的YACs，并有利于包含所有3个补体调节基因或者任何其它附加的基因的三个基因YAC的依次装备。图5概括了如何依次装备三基因YAC。为此，必须分离P1基因组CRP基因的5’和3’片段(图5A)。可以通过质粒拯救、亚克隆、PCR扩增或者任何一种标准技术分离这些片段。为了有利于在酵母中进行同源重组，这些片段应该是唯一序列，没有重复元件，长大约为500-2000碱基对。表13列出了CD59、MCP和DAF的末端片段的特征。三基因YAC的依次装配也要求使用三个可选择的营养缺陷型酵母标记基因。为此，我们使用了营养缺陷型标记基因Ura3、Trp1和Lys2，但是标记的其它组合可能依赖于所用酵母菌株的基因型。Ura3和Trp1标记臂衍生于pSRY1。Lys1标记是pDP6的4.5kb Hind3亚克隆(Fleig等，1986，基因46：237-245)，我们将其加入到pSRY-1的700bp Hind3、BamHI端粒子序列(telomere seed sequence)中以便产生功能Lys2-YAC臂。
含有所有三种人补体调节基因组基因的YAC染色体的依次装备以将MCP基因的5’末端片段加入到上述的CD59-YAC中开始。为了完成这种加入，将CD59的3’末端片段和MCP的5’末端片段相互接触，并插入到Lys2 YAC臂中。在这种3’CD59-5’MCP-Lys2 YAC臂中，3’CD59序列的作用是靶定同源重组位点，这样当此DNA转染含有CD59-YAC的酵母菌株时，在3’CD59序列之间发生的同源重组能够有效地除去Ura3标记并用Lys2-YAC臂代替它(图5B)。使用lys-培养基最初选择具有功能Lys2基因的转化体。然后使用含有5-氟乳清酸(FOA)的lys-、trp-培养基对克隆进行三重选择。此培养基同时选择功能Trp1和Lys3基因的存在，FOA的加入是针对功能Ura3标记进行选择的。可以使用针对Trp1、Lys2、CD59和5’MCP的探针通过PFGE和差示Southern印迹杂交分析进一步确定酵母克隆。尽管只分析了几个克隆，但是以很高的频率分离到了带有正确结构和遗传行为的转化体(表11)。
为了将MCP基因组DNA的剩余部分加入到新的CD59-5’MCP-Lys2-YAC中，将平端MCP基因的Mlu13’末端与Ura3-YAC臂连接。通过限制酶消化使此构建体线性化，并与Mlu11消化的MCP-P1 DNA一起转染到含有CD59-5’MCP-Lys2-YAC的酵母菌株中(图5C)。使用ura-培养基最初选择具有功能ura3基因的转化体。然后使用含有α-氨基己二酸盐(α-Ap)的ura-、trp-培养基对克隆进行三重选择。此培养基同时选择功能Trp1和Ura3基因的存在，α-Ap的加入是针对功能Lys2标记进行选择的。5’和3’MCP序列之间的同源重组产生含有CD59和MCP补体调节基因(其侧翼为Trp1和Ura3营养缺陷型标记)的性染色体。
可以使用针对Trp1、Ura3、CD59和MCP的探针通过PFGE和差示Southern印迹杂交分析进一步确定酵母克隆。以很高的频率分离到了带有正确结构的转化体(表11)。
以类似分方式完成第三基因DAF的加入(图5D)。将MCP基因组基因3’部分的1.3kb作为EcoR1片段加入到含有基因组DAF基因5’部分的2.2kb的质粒中。然后将这两个基因片段加入到Lys2-YAC臂上，并转染到CD59-MCP-YAC双基因YAC中。通过lys-选择和随后的lys-、trp-、FOA三重选择，我们得到了CD59-MCP-5’DAF-Lys-YAC克隆。通过将70Kb Not1-Sfil DAF基因组DNA与0.8kb 3’DAF片段(附着在Ura3 YAC臂上)一起转染，来整合DAF基因组基因的其余部分，以便产生三基因YAC。在适当的选择后，通过PFGE和差示Southern印迹杂交分析酵母克隆。
可以使用三基因座位产生高水平表达三种人补体调节基因的转基因猪。因为这三个基因都是在注射前通过物理方法连接在一起的，并期望它们能作为一个基因座整合，所以这一新基因座对于分别注射P1基因是有利的。此外，因为这一唯一的基因座可以作为YAC进行遗传，所以可以使用上文描述的同源重组技术向此基因座另外加入基因。例如，可以加入掩饰或减少gal表位水平的基因(包括但不限于编码α(1，2)FT、α(2，6)ST或β(1，3)NAGT的核酸)，结果使此位点既可以降低异体抗原的水平，又可以控制人补体活化。可以向此基因座加入另外的基因，以发展猪作为异体器官供者。例如，可以使用上述的方法向此基因座加入另外的影响血管排斥的人基因(如凝血调节蛋白、蛋白质C、因子H、组织因子、尿激酶纤溶酶原激活物、ectoATP酶、NFkb抑制物)、或者可能影响细胞排斥的人基因(例如IL-4、IL-10、TGF-β、阻止共同刺激分子CD28和CD40的试剂、阻止细胞因子活动的可溶性受体，如可溶性IL-2或IFNg受体)、或者可用于破坏呈递细胞的猪抗体的基因(如编码疱疹单一胸苷激酶的CD2或者CD45调节基因)。所有这些基因不必是大的基因组DNAs，但可以是特性很清楚的小基因或者任何其它的基因构建体。
5.3转基因动物的产生
使用公知的方法装备用于微注射的YAC构建体。使用用于分离十分大的DNA分子的脉冲电场凝胶电泳(PFGE)分离包含YAC构建体的酵母染色体。为了分离160kb YAC，使用1％SeaPlaque GTG低熔点琼脂糖(FMC公司)脉冲电场凝胶电泳，在14℃下以6volts/cm2、120°转换角和2-10秒的转换时间跑胶20小时。从凝胶上将YAC染色体切割下来，将琼脂糖凝胶片段用注射缓冲液(10mM Tris(pH7.5)、0.1mM EDTA，100mMNaCl，30μM精胺，和70μM亚精胺)平衡。将此琼脂糖凝胶片段在65℃下熔化，并在37℃下用琼脂酶(EPicenter技术)消化3小时。然后使用大口径移液管将消化的琼脂糖转移到Micron 10浓缩器(Amicon)中，在此通过以5,000g反复离心15分钟，直到原来凝胶片段的总量降低到体积为20-50μl时，来浓缩所说的DNA。在微注射前，可以在脉冲电场凝胶上检测YAC DNA的完整性。
然后如在前面申请部分描述的反复进行此DNA构建体的微注射。按照前面申请部分描述的反复分析转基因动物及其子代。
实施例VI：使用糖基转移酶降低Gal表位水平
最近的研究表明抗体介导的排斥作用是从异体反应天然抗体(XNAs)与Gal表位结合开始的。例如参见Sandrin等，P.N.A.S90：11391-11395(1993)。通过糖基转移酶，特别是通过α(1，3)半乳糖基转移酶或者α(1，3)GT产生Gal表位。本发明人已经发现可以通过操作导致此表位产生的途径来改变Gal表位的表达。具体地说，发明人已经克隆了其它糖基转移酶，并在动物和/或组织培养细胞中表达了它们，这样对α(1，3)GT使用的底物就产生了竞争，因此降低了Gal表位的表达。
6.1α(1，2)FT在组织培养细胞中的克隆和表达
使用猪主动脉内皮细胞的总RNA和第一条链cDNA合成试剂盒(Pharmacia)通过RT-PCR获得猪α(1，3)GT cDNA(1.1kb)。简并PCR引物以小鼠和牛GT序列为基础，关于小鼠和牛GT序列例如可以参见Larsen等，生物化学杂志265：7055-7061(1990)和Joziasse等，生物化学杂志264：14290-14297(1989)。将此cDNA克隆到真核表达载体pRex10(pRex10/GT)中，此载体含有来源于肉瘤病毒长末端重复序列(RSV-LTR)的增强子和启动子序列和新霉素抗性基因。使用A431细胞系的总RNA通过RT-PCR克隆人α(1，2)FT cDNA，如Larsen等在P.N.A.S.87：6674-6678(1990)所公开的。有义引物(TTTGGATCC-TCGGCCATGTGGCTCCGGAGCCATCG)(SEQ ID NO：1)位于ATG起始密码子侧翼，并且包含BamH I位点。反义引物(AAAGTCGACTCAAGGCTTAGCCAATC)(SEQ ID NO：2)位于TGA终止密码子的侧翼，并且包含Sal I位点。将1.1kb cDNA克隆到pRex10(pRex10/FT)中以在组织培养细胞中表达α(1，2)FT。为了产生表达α(1，2)FT的转基因动物，将α(1，2)FT cDNA克隆到含有500bp小鸡肌动蛋白启动子(#876)(参见图6)或者4.3kb H2kb启动子(#881)(参见图7)的载体中。由900bp人珠蛋白基因的HindIII/KpnI片段(含有第二个外显子的下游序列)提供剪接和聚腺苷酸化序列。
按照本发明产生含有α(1，2)岩藻糖基转移酶(或者α(1，2)FT)基因的转基因动物之前，使用中国仓鼠卵(CHO)细胞用作为模型系统来确定α(1，2)FT在修饰糖蛋白和糖脂方面是否与α(1，3)GT竞争。这些细胞不能产生α(1，3)GT和α(1，2)FT，但的确能够表达充当这两种酶受体的N-lac。用猪α(1，3)GT cDNA(pRex10/GT)转染CHO细胞。使用猪主动脉内皮细胞的总RNA和第一条链cDNA合成试剂盒(Pharmacia)通过RT-PCR获得猪α(1，3)GT cDNA(1.1kb)。
对于细胞培养和转染步骤，细胞培养和转染试剂从Gibco BRL获得。中国仓鼠卵(CHO-K1)细胞(ATCC，CCL-61)保存在添加有10％胎牛血清含有glutamax-1的F-12(HAM)培养基中。按照厂商的说明使用1-2μg超螺旋质粒DNAs(pRex10/GT或者pRex10/FT)通过细胞转染试剂进行转染。
如Collins等(异体移植1：36-46(1994))的描述进行细胞表面抗原表达的分析。简言之，在96孔平板上将所说的细胞用1％戊二醛固定，然后与不同浓度的乳糖-生物素缀合物(E.Y.实验室)在室温下温育1小时。用PBS洗涤细胞，并与以1∶1000稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(Pierce)温育1小时。每孔加入150μl HRP底物溶液，在黑暗中放置5-10分钟。加入50μl 2M H2SO4终止反应。505nm下在分子装置Vmax微量滴定板测定仪上测量平板的读数。
如Hanasaki等(生物化学杂志269：10637-10643(1994))的描述制备在这些实验中获得的总细胞蛋白质提取物。简言之，4℃下在0.8ml细胞裂解缓冲液(0.16M NaCl、1mM EDTA、1％NP40、2.5mM脱氧胆酸盐、0.1％SDS、10μg/ml抑肽酶(aprotonin)、10μg/ml亮抑蛋白酶肽和20mM Tris-HCl，pH8.0)中将5×106个细胞温育10分钟。将细胞刮到Eppendorf管中，并在12000Xg下旋转5分钟，除去上清液，测定蛋白质浓度。
使用凝集素Griffonia simplicifolia 1同工凝集素B4(GS-1-B4)(其与XNAs识别同样的末端结构Galα(1，3)Gal)通过凝集素结合测定方法评价α(1，3)GT在转染细胞中的表达。对代表克隆(CHO/GT)的分析如图8所示。当非转染的CHO细胞不与凝集素GS-1-B4结合时，CHO/GT细胞清楚地与所说的凝集素结合，并因此产生gal表位。
为了确定α(1，2)FT与α(1，3)GT竞争N-lac的程度，用pRex10/FT转染CHO/GT细胞。选择转染的细胞(CHO/GTFT)的合并物，并通过凝集素结合测定方法分析α(1，3)GT与α(1，2)FT的表达。以检测H-抗原的凝集素Ulex europaeus I(UEA-I)的结合为基础确定α(1，2)FT的表达。如图8所示，高水平表达H-抗原的CHO/GTFT细胞与CHO/GT相比，在结合GS-1-B4方面显示出多达70％的降低。在CHO/GT和CHO/GTFT细胞系之间没有观察到α(1，3)GT mRNA或者基因拷贝数的水平存在差异，这表明GS-1-B4结合水平的降低(因此α(1，3)GT的活性也降低了)是由于酶水平的竞争引起的。
接下来，通过凝集素印迹测定膜蛋白的糖基化，这一过程在异体移植中较糖脂可能更重要(参见Platt等，移植57：327-332(1994))。如Hanasaki等(生物化学杂志269：10637-10643(1994))的描述(稍微作了改变)进行凝集素印迹。在这种方法中，将蛋白质样品(10μg)悬浮在样品缓冲液(50mMTris-HCl pH6.8、100mM 2-巯基乙醇、2％SDS、0.2％溴苯、和10％甘油)中，在100℃下加热3分钟，并加样到7.5％ SDS凝胶上。电泳后，在100V下将所说的蛋白质转移到Immobilon-P膜(Millipore)上2小时。转移后，用Tris-缓冲的盐水(TBS：150mM NaCl、1mM CaCl(2)、1mM MgCl(2)、1mM MnCl(2)和20mMTris-HCl pH7.5)/0.1％Tween冲洗两次。用1％卵白蛋白/TBS封阻1小时后，4℃下将此膜与3μg/ml凝集素-生物素轭合物在1％卵白蛋白/TBS/0.1％Tween中温育1小时。用TBS/Tween将膜洗涤3此，并与1μg/ml的链霉抗生物素蛋白-HRP在1％卵白蛋白/TBS中温育1小时。洗涤后，按照厂商的说明使用化学发光检测试剂盒(ECL Western印迹检测试剂盒，Amersham公司)检测此膜。
猪α(1，3)GT在CHO细胞(CHO/GT)中的表达使大部分＞60kDa的蛋白质半乳糖基化(参见图9，GS-1-B4系列)。α(1，2)FT在CHO/GT细胞(CHO/GTFT)中的表达使GS-1-B4不能与这些蛋白质结合，结构使H抗原(岩藻糖基化的蛋白质)表达。
这些结果清楚地表明α(1，2)FT可以与猪α(1，3)GT竞争，α(1，2)FT可以用来降低转基因动物中的gal表位水平。
6.2α(2，6)ST的构建
如Weinstein等(生物化学杂志262：17735-43(1987))的描述使用大鼠肝脏的总RNA通过RT-PCR克隆α(2，6)唾液酸转移酶。人序列与大鼠序列具有80％的等同性。有义引物(AATATTAGCCAGAAGCAG)包含Sspl位点。反义引物(TCGAGTACTCAAACAACGAATGTT)位于TGA终止密码子的侧翼，并且包含Scal位点。使用与上文6.1部分描述的相似方法将1.3kb cDNA克隆到pRexl0(pRex10/RST)中，使之在组织细胞中表达。进行相对应的分析。
6.3α(1，2)FT在转基因动物中的表达
使用合适的启动子检验α(1，2)FT在大鼠中用于竞争α(1，3)GT的观点，所说的大鼠通常在内皮细胞和分泌的糖蛋白(如甲状腺球蛋白、血纤蛋白原等等)中表达gal表位。使用小鸡的α-肌动蛋白(AcFT#876)和鼠H2kb启动子(H2FT，#881)驱动α(1，2)FT cDNA在内皮细胞(如图6和7中所观察到的)中表达。在前面的实验中使用这些启动子在转基因小鼠和猪中表达人CD59和DAF，使得其在广泛的组织(包括但不限于内皮细胞)中表达。参见Byme等的“移植”60：1149-1156(1995)。
如Logan等(酶学方法231：364-373(1994))的描述，通过将合适的DNA注射到受精小鼠的卵母细胞(C57BL/6)的雄性生殖核中，来制备转基因小鼠。然后将所说的卵转移到未怀孕的雌性小鼠体内以获得转基因小鼠。
通过PCR和Southern分析表明，由此过程产生的小鼠3/29和7/30已经分别将构建体#876(AcFT)和#881(H2FT)并入到它们的基因组中。分析携带构建体#881的转基因小鼠α(1，2)FT基因的表达。此外，进行了Northern印迹分析，其中按照厂商的说明使用RNA STAT-60(TEL-TEST)制备动物组织的RNA。将RNA
(10μg)在含有甲醛的1％琼脂糖凝胶上进行分级分离，并将其转移到尼龙膜(ICN Biomedical)上。使用Ready To Go试剂盒(Pharmacia)制备探针，并进行杂交。
Northern印迹分析表明α(1，2)FT mRNA存在于所有检测的组织(包括心脏和肾)中，如图10所观察到的。在正常小鼠的任何组织中都没有检测到α(1，2)FT信号。含有截短的转基因的小鼠1-2的RNA中也不含有α(1，2)FTmRNA。
通过组织切片的凝集素染色和荧光显微镜分析转基因小鼠中H抗原的表达。在制备用于免疫组织化学染色的样品中，在预冷的异戊烷冷冻断裂后，使用前将组织样品贮存在-80℃。然后如Platt等(实验医学杂志155：17-30(1982))的描述使用FITC凝集素进行免疫组织化学染色。如图11A-D所示，转基因小鼠(1-4)表现出高水平的H抗原表达，这是通过UEA-I与心脏的肌细胞及内皮细胞结合而表明的(参见图11的C系列)，而在正常小鼠的组织中没有观察到结合(参见A系列)。转基因小鼠和在内皮细胞上天然优先表达(尽管不是专一的)H抗原的正常小鼠相比，在肾、肺脏、肝和脾中也得到相似的结果。
为了确定α(1，2)FT在转基因小鼠组织中的表达是否与gal表位的减弱相关，将α(1，2)FT转基因和对照小鼠的组织切片用凝集素GS-1-B4染色。如图11C所示，与对照小鼠(参见图11B)相比，α(1，2)FT转基因小鼠心脏中结合的GS-1-B4水平明显减低。此结果表明α(1，2)FT基因的表达使Galα(1，3)Gal水平明显降低。
6.4α(2，6)ST在转基因动物的表达
使用合适的启动子(特别是小鸡β肌动蛋白启动子)检验α(2，6)ST在小鼠中用于竞争α(1，3)GT的观点，所说的小鼠通常在内皮细胞和分泌的糖蛋白(如甲状腺球蛋白、血纤蛋白原等等)中表达gal表位。通过使用500bp小鸡β肌动蛋白启动子(#882)的构建体使α(2，6)ST在转基因动物中表达，如图8所示。
如Logan等(酶学方法231：364-373(1994))的描述，通过将合适的DNA注射到受精小鼠的卵母细胞(C57BL/6)的雄性生殖核中，来制备转基因小鼠。通过Southern分析确定转基因小鼠；103只小鼠中有17个含有转基因。然后将这些转基因小鼠进行相互交配，通过组织RNA的Northern分析来分析F1代(或起始动物)的α(2，6)ST mRNA。在1系中，在骨骼肌和心脏中观察到(9-8×14-8)高水平表达。为了确定α(2，6)ST的表达是否对Gal表位产生负调节并降低结合，制备正常小鼠心脏和α(2，6)ST转基因心脏的内皮细胞，并用GS-1-B4染色，进行FACS分析。用抗CD31抗体标记ECs。如实验所确定的，GS-1-B4和XNA与转基因心脏EC的结合都有所下降。此外，与正常小鼠相比，转基因EC的补体介导的裂解也有所下降。
6.5α(1，2)FT在转基因小鼠中的表达分析
为了确定α(1，2)FT的表达是否能够减少异体反应抗体的结合，分离正常和FT转基因小鼠心脏的内皮细胞(ECs)，并将它们与XNAs温育，通过流式细胞术分析。为了进行此分析，37℃下将刚刚收获的器官(心脏和肝)捣碎，并在分散酶溶液(Becton Dickinson实验室器具)中温和地震荡，消化90分钟。洗涤所得的细胞悬液，并使用Coulter Z1分析器计数。使用3步骤方法将4×106细胞的等份样品用于免疫荧光染色。首先，将所说的细胞与10μg异体天然抗体冰浴30分钟，在加入或不加入5mM半乳糖(Galactobiose)(V-Labs)的情况下，如Parker等(免疫学杂志53：785-794(1994))的描述分离细胞。将细胞洗涤两次，并与5μg生物素酰化的小鼠抗人IgM(Pharminigen)一起冰浴30分钟。另外，向所有的管中加入10μg FITC标记的绵羊抗人因子VIII(Serotec)，以标记悬液中的内皮细胞。将细胞洗涤两次，与CyChrome缀合的链霉抗生物素蛋白(Pharminigen)一起冰浴15分钟。同时进行所有的对照步骤，包括对应的品种、同型对照抗体(Pharminigen)和第二步的背景染色。最后，洗涤细胞两次，在2％低聚甲醛/PBS中固定，在Coulter EPICSElite流式细胞仪上分析。使用FL1-FITC(因子VIII)-vs-Side-Scatter的多孔层空心柱(plot)鉴定并对内皮细胞进行闸门控制。此内皮细胞流闸门用于产生FL1-vs-FL3多孔层空心柱(CyChrome)，以便进行XNA结合分析。
如图12A所示，和正常小鼠的ECs相比，转基因小鼠内皮细胞的XNA(IgM)结合水平表现出明显减少。将XNAs与半乳糖二糖、Galα(1，3)Gal一起温育可以完全破坏正常小鼠以及转基因小鼠的ECs的结合，这表明XNAs对Gal表位具有特异性。
接下来确定减少的XNA结合对转基因小鼠ECs的补体介导裂解的作用。为了测定补体介导的裂解，用20μg人XNA将上述消化的悬液中的4×106细胞等分样品预敏化，同时如上所述对因子VIII进行染色。洗涤所说的细胞，37℃下与浓度不断增加的兔血清(Sigma)温育45分钟。所有的管都含有终浓度为10μg/ml碘化丙锭(作为细胞裂解的受体)。温育后，如上所述进行流式细胞分析以便对内皮细胞进行闸门控制并构建FL1-FITC(因子VIII)-vs-FL3-碘化丙锭多孔层空心柱，以便评价FL3通道中染色的阳性裂解细胞的百分比。对照是由不含兔血清及碘化丙锭的等分样品和没有进行PNA-预敏化的等分样品组成，以评价兔血清和因子VIII抗体裂解细胞的能力。
如图12B所示，对照动物的内皮细胞与已经加入兔血清(作为补体源)的XNAs一起温育，有14％的细胞裂解。相反，FT转基因小鼠的ECs的裂解不到5％，这与和因子VIII抗体及不含XNAs兔血清一起温育的正常或转基因ECs的裂解水平相似。
6.6α(1，2)FT转基因猪的产生
以转基因小鼠获得结果为基础，通过将两个α(1，2)FT构建体(#876和#881)共注射到受精猪卵的生殖核中而产生转基因猪。将总共656个注射的卵转移到未怀孕母猪体内，生出了58头(33M，25F)小猪。通过PCR鉴定了五头为转基因猪(3M，2F)，通过尾DNA的Southern分析进行确认。一头猪含有#876构建体(AcFT)，一头猪含有#881(H2FT)，3头猪两者都含有。
6.7α(2，6)ST转基因猪的产生
以与前文申请部分描述的方法大致相同的方式产生转基因猪。通过肌肉活组织检查的总RNA的Northern分析确定转基因猪中α(2，6)STmRNA的表达。在18头猪中有7个在转录水平上表达了转基因。
6.8.α(1，2)FT转基因猪中H抗原的表达分析
作为本发明方法在抑制猪Galα(1，3)Gal合成效能的初步分析，分析含有构建体#876(AcFT)转基因猪的组织。和Hanasaki等(生物化学杂志269：10637-10643(1994))所证明的相同，已证明β-肌动蛋白启动子能够在内皮细胞和肌肉中普遍地高水平表达。如在小鼠，通过将凝集素UEA-I和转基因猪尾的切片结合测得H抗原的高水平表达(参见图13，C和A对比)(与非转基因littermate相比)。同时，通过GS-1-B4染色测得Galα(1，3)Gal的表达明显降低(参见图12，B和D对比)。这些数据很清楚地表明通过竞争糖基转移酶的表达可以降低异体Gal表位的水平。
当如以上所述的实施方案描述完本发明后，本领域的普通技术人员很快就会明白在不脱离本发明的宗旨和范围的情况下可以对以上描述的本发明进行一些修改和变化，因此，这样的一些改变将包含在所附的权利要求限定的本发明的范围内。
                       表目录
表1.CD59在人组织中的分布
表2.一些内皮基因/启动子目录
表3.用于产生转基因小鼠的基因/启动子目录
表4.CD59 Southern的光密度扫描
表5.CD59 P1基因组克隆、CD59小基因#1和CD59的比较
表6.2或者3个转基因的微注射
表7.用于筛选人基因组DNA文库的寡核苷酸
表8.小鼠中CD59、CD46(MCP)和DAF P1片段的转基因频率和外显率
表9.CD59和CD46蛋白质在转基因小鼠组织中的表达
表10.P1基因的末端结构0
表11.经同源重组的装配
表12.用于产生YAC4多接头的寡核苷酸的序列
表13.用于扩增CD5 9末端的PCR引物的序列
           表1：CD59在人组织中的分布组织              细胞                       表达胰腺              小导管上皮                  +++
              髓神经                      ++
              毛细管内皮                  ++
              朗氏岛                      -/+
              腺泡细胞                    -肾                末梢管                      +++
              汉勒氏细环                  ++
              小动脉/静脉                 ++
              内皮细胞
              血管小球内皮细胞
              Pertibular毛细管            -
              内皮细胞肺                Brinchial上皮               -/+
              肺泡细胞                    -
              小动脉                      -/+
              内皮细胞
              肺泡毛细管                  -
              内皮细胞肝                胆汁管上皮                  +++
              门静脉                      ++
              内皮细胞
              小动脉                      ++
              内皮细胞
              星形细胞                    -
              肝细胞                      -
              髓神经                      +++脑                血管内皮                    ++
              星形胶质细胞                -
              少突神经胶质细胞
              神经元胸部              管上皮                      ++
              腺泡细胞                    -
              内皮细胞                    ++皮肤              基底内皮                    ++
              汗腺管上皮                  +
              内皮细胞                    ++淋巴组织      基底内皮                  ++
          内皮细胞                  +
将冷冻组织切片在室温下与CD59mAb YTH53.1温育30分钟。用缀合兔抗大鼠过氧化物酶的抗体检测结合的抗体。
注：此表的出处为：Walsh.L.A.，Tone.M.，Thiru.S.和Waldman.H.(1992)“CD59抗原-一种多功能分子”，组织抗原40：213-220。
                                             表2：一部分内皮基因/启动子目录
            基因 转基因小鼠                       表达位点
    1 ELAM配体岩藻糖基转移酶(ELFT)     没有 血小板、间质和上皮细胞
    2 酪氨酸激酶Flk-1     没有 内皮细胞和它们的胚前体
    3 酪氨酸激酶Flt-1     没有 内皮细胞和它们的胚性前体
    4 鼠主要组织兼容性复合物(H2Kb类型1)     有 血管内皮、成纤维细胞、上皮细胞和平滑肌细胞
    5  hemonectin(人血清成分蛋白质MSE55)     没有 骨髓基质细胞和内皮细胞
    6 人胚细胞碱性磷酸酶(GCAP)     有 肠、内皮细胞和胚细胞
    7 人凝血酶致敏蛋白     没有 成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肺泡细胞、神经胶质细胞和巨噬细胞
    8 小鼠凝血酶致敏蛋白(THBS1)     没有 成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肺泡细胞、神经胶质细胞和巨噬细胞
    9 鼠早期前内皮-1     有 血管内皮
    10 内皮白细胞吸附分子1(ELAM1)     没有 内皮细胞
    11 大鼠胰岛素     有 胰岛内皮
    12 tek     有 胚内皮细胞
    13 酪氨酸激酶Tie-1和Tie-2     没有 正在生长的血管内皮细胞
    14 血管细胞吸附分子(VCAM-1)     没有 内皮细胞
    15 血管内皮细胞谱系特异性启动子     有 血管内皮细胞
    16 冯维勒布兰德氏因子     有 卵黄囊和成熟脑内皮细胞的亚群
                  表2的参考文献：
1.Coelz等(1990)“ELFT：一种指导ELAM-1配体表达的基因”，细胞63：1349-L356。
2.Shalaby等(1995)“在Flk-1-缺陷小鼠中无法形成血岛和血管”，自然376：62-66。
3.Pong，C.H.，Rossant.J.，Certsenstein.M.和Breitman，n.L.(1995)“Flt-1受体酪氨酸激酶在调节血管内皮装配方面的作用”，自然316：66-70。
4.Foder等(1994)“作为防止异体超急性器官排斥模型的功能性人抑制物在转基因猪中的表达”国家科学院学报91：11153-11157。
5.Bahou，W.F.，Campbell，A.D.和Wicha.M.S.(1992)“MSE55(一种显示出骨髓基质/内皮细胞特异性表达的新型人血清组成型蛋白质)的cDNA克隆和分子特性”生物化学杂志267：13986-13992。
续表2的参考文献：
6.Narisawa，S.，Smans，K.A.，Avis，J.，Hoylaerts，M.F.和Millan，J.L.(1993)“表达肿瘤标记胚细胞碱性磷酸酶：一种人癌症抗原的体内肿瘤模式”国家科学院学报90：5081-5085。
7.Donoviel等(1988)“人凝血酶致敏蛋白基因启动子的表达和结构分析”生物化学杂志363(35)：18590-18593。
Laherty，C.D.，Gierman，T.X.和Dixit，V.M.(1989)“人凝血酶致敏蛋白基因启动子区的特性”生物化学杂志”264(19)：11222-11227。
8.Bornstein，P.，Dalia，A.，Sreelekha，D.，Framson，P.和Li，P.(1990)“小鼠凝血酶致敏蛋白基因的特性和第一个内含子在人基因表达中作用的评价”生物化学杂志265(27)：16691-16698。
9.Harats等(1995)“使用鼠早期前内皮-1启动子将基因表达靶定在转基因小鼠的血管壁上”临床研究杂志95：1335-1344。
10.Coelz等(1990)“ELFT：一种指导ELAM-l配体表达的基因”，细胞63：1349-L356。
11.Picarella等(1993)“转基因肿瘤坏死因子(TNF)-α在胰岛的产生导致insulitis，而不是糖尿病：在TNF-α和TNF-β转基因小鼠中不同的炎症模式”免疫学杂志150(9)：4136-4150。
12.Dumont等(1994)“内皮受体酪氨酸激酶(tek)负显著和有目的无效突变显示出对胚胎血管形成具有重要的作用”Genes Dev.8：1897-1909。
13.Sato等(1995)“受体酪氨酸激酶Tie-1和Tie-2在血管形成中的显著作用”自然376：70-74。
14.Osborn等(1989)“血管细胞附着分子1(一种与淋巴细胞结合的诱导细胞因子的内皮蛋白质)的直接表达克隆”细胞59：1203-1211。
15.Schlaeger，T.M.，Quin，Y.，Fujiwara，Y.，Magram，J.和Sate.T.N.(1995)“转基因小鼠中血管内皮细胞谱系特异性启动子”发育121：1089-1098。
16.Aird等(1995)“靶定到转基因小鼠内皮细胞亚群中表达的人冯维勒布兰德氏因子具有”国家科学院学报92：4567-4571。
             表3：用于产生转基因小鼠的基因/启动子目录
                  基因/启动子 转基因小鼠
    1 人CD59/鼠主要组织兼容性复合(H2Kb类型1)     有
    2 人胚细胞碱性磷酸酶(GCAP)/人胚细胞碱性磷酸酶(GCAP)     有
    3 萤光素酶基因/鼠早期前内皮-1     有
    4 鼠TNF-α/大鼠胰岛素启动子     有
    5 LacZ报告基因/Tek     有
    6 LacZ报告基因/血管内皮细胞谱系特异性启动子     有
    7 冯维勒布兰德氏因子/冯维勒布兰德氏因子     有
表3的参考文献：
1.Foder等(1994)“作为防止异体超急性器官排斥模型的功能性人抑制物在转基因猪中的表达”国家科学院学报91：11153-11157。
2.Narisawa，S.，Smans，K.A.，Avis，J.，Hoylaerts，M.F.和Millan，J.L.(1993)“表达肿瘤标记胚细胞碱性磷酸酶：一种人癌症抗原的体内肿瘤模式”国家科学院学报90：5081-5085。
3.Harats等(1995)“使用鼠早期前内皮-1启动子将基因表达靶定在转基因小鼠的血管壁上”临床研究杂志95：1335-1344。
4.Picarella等(1993)“转基因肿瘤坏死因子(TNF)-α在胰岛的产生导致insulitis，而不是糖尿病：在TNF-α和TNF-β转基因小鼠中不同的炎症模式”免疫学杂志150(9)：4136-4150。
5.Dumont等(1994)“内皮受体酪氨酸激酶(tek)负显著和有目的无效突变显示出对胚胎血管形成具有重要的作用”Genes Dev.8：1897-1909。
6.Schlaeger，T.M.，Quin，Y.，Fujiwara，Y.，Magram，J.和Sate.T.N.(1995)“转基因小鼠中血管内皮细胞谱系特异性启动子”发育121：1089-1098。
7.Aird等(1995)“靶定到转基因小鼠内皮细胞亚群中表达的人冯维勒布兰德氏因子具有”国家科学院学报92：4567-4571。
 表4：CD59 Northern的光密度扫描1
              肾脏           心脏           肝CD59小基因1       0.96           0.41          0.01CD59小基因2       13.23          8.16          4.31CD59 P1           10.55          10.88         4.91人                16.05          3.28          1.84
1任意指定每一个样品的主要mRNA带的密度值作为比较的平均值
2与所有CD59小基因2小鼠谱系相比，Northern中描述的CD59小基因2谱系以中等水平表达CD59 mRNA
3与所有CD59 P1小鼠谱系相比，Northern中描述的CD59品谱系以最高水平表达CD59 mRNA
表5：比较CD59 P1基因组克隆、CD59小基因#1和CD59小基因#2
                 CD59 P1       CD59小基因#2     CD59小基因#1      人转基因率1           8％             23％            30％           NA传递2率             89％            86％            68％           NA表达率3             63％            100％           38％           NA#CD59                13,980/RBC      20,435/RBC      0              21,581/RBC分子/RBC4肝中的蛋白质5       +               +               +(病灶上的)    +心脏中的蛋白质       +               +/++            微量/+         ++肾脏中的蛋白质       +/++            +/++            -              ++
1活着的转基因起始动物的百分率
2将转基因传递给后代的起始动物的百分率
3产生在RNA和蛋白质水平表达转基因后代的起始动物的百分率
4对于每一个构建体，在最高表达品系中每个RBC直接定量的CD59分子的数目
             表6：2或3个转基因的微注射
                基因共注射和筛选的概述
        出生的     1或2个基因     2个基因的    3个基因的    发生基因共
        动物号     的转基因动物   转基因动物   转基因动物   整合的动物P1小鼠     145        19(13.1％)    5(3.4％)         0          0MG1小鼠2  ND            ND            ND            ND         NDCRPcNDA小鼠3       81    11(13.6％)     4(4.9％)    ND    4/4(100％)F1猪                780   21(2.7％)      5(0.64％)   0     NDMG1猪4             49    2(4.1％)       2(4.1％)    ND    2/2(100％)
1在后代分析的基础上确定共整合
2 CD59小基因1(MG 1)没有共整合到小鼠中
36.8Kb和2.2Kb的H-2K-DAF和β肌动蛋白-CD59构建体分别共整合到小鼠中
4CD59小基因1(MG 1)用作MCP cDNA插入物的表达载体。CD59小基因1和CD59/MCPcDNA小基因1在猪上发生共整合
    表7：用于筛选在噬菌体P1中构建的人基因组DNA文库的寡核苷酸基因                  寡核苷酸                                  PCR长度，扩增区的位置              产物
      (bpa)                                                                                    288CD59.212：        5′-dAAT ACC AGG ATT TGA GCA CCA CC-′3       转录起始处5’端的1602bpCD59.439c：       5′-dACA CAC TTT GAG GGT CAG GGT G-′3CD59.202：        5′-dGAG CAT TGC AAT TTC AAC GAC GTC-′3      外显子4的183bp+3’非翻译区的11bp    196CD59.437c：       5′-dTGG TGT TGA CTT AGG GAT GAA GGC-′3                                          201CD46..99：        5′-dATT GTT GTT GCG TCC CA-′3               在转录的起始位点CD46..140c：      5′-dCGG AGA AGG AGT ACA GC-′3CD46..1205：      5′-dTCC ACA ACC TGG TTT GCC AG-′3CD46..1340c：     5′-dAGG ATG CTA CCT ACA TTC AAG CCA C-′3    转录终止点3’的6bD                 135CD55¨.335：      5′-dCAA ACA GCC TTA TAT CAC TC-′3           外显子3的短一致重复序列2           112CD55¨.446c：     5′-AAG GCA AGT TAGTTT TGG TG-′3.CD46＝MCP..CD55＝DAF表8：CD59、CD46(MCP)和DAF P1片段在小鼠中的转基因频率和外显率1
CD46与MCP相同
1.外显率：表现出特定基因型(即P1转基因)的个体比例，这些个体在表型水平(即C’调节蛋白质的表达)显示出基因型。
2.所有的基因拷贝数在1-5之间。
3.N/D：没有进行此项测定
4.该数据是通过分析起始动物而不是G1S编辑的。
表9：CD59和CD46蛋白质在转基因小鼠组织中的表达1
    组织     CD59(5-2品系)   CD46(27-3品系)
    肝 +1内皮细胞 +2内皮细胞
    心脏 +1内皮细胞和肌细胞 +1内皮细胞
    肾脏 +1到+2内皮细胞；+小管 +1内皮细胞；小管
    肺 +1所有阳性细胞 1内皮细胞
    脾 痕量+脾细胞 +1内皮细胞
    肌肉 +1血管；+1肌细胞 +1内皮细胞
    胰腺 +1胰岛 +2胰岛
    脑 痕量至+内皮细胞；+毛细管 +1内皮细胞
1.非转基因littermate的组织作为对照。2.以痕量到+4的半定量指标评价结果。
表10：P1基因和片段的末端结构
            大小P1转基因        (kb)       5’末端        3’末端      *5’片段       *3’片段CD46             60         Mlu1           Mlu1         1.5kb(sc)      1.3kb(sc)
                                                    Mlu-Sal        Nco1-Mlu
                                                    Sac1-Sal       EcoR1-EcoR1CD55             70         Not1           Sfi1         2.2kb(pr，sc)  0.8kb(pr；sc)
                                                    Not1-Sac1      Xba1-Sal1CD59             70         Sfi1           Sfi1         1.4kb(pr；pcr) 1.2kb(pr；pcr)
                                                    Not1-BamH1     SnaB1-Hinc2
                                                                   Kpn1-Sal1
*表中列出了与来源于每一个P1基因远末端的末端亚克隆有关的片段大小和侧翼限制酶切位点。对于CD55和CD59，首先通过P1载体质粒的拯救(pr)鉴定这些片段。接下来，将更小的片段亚克隆(sc)或者使用PCR扩增(pcr)。由60kb Mlu1插入物直接亚克隆CD46基因的末端。将基因的方向标准化为5’至3’的转录方向。同样在5’到3’的序列上列出限定亚克隆片段的限制酶。对于一些片段，不仅列出了一对限制酶。另外的酶位点来自存在于克隆载体上的多接头限制位点。
                 表11：通过同源重组进行装配YAC染色体结构          克隆频率          克隆大小TRP-CD59-URA           18/24           100kbTRP-CD59-5’MCP-LYS     6/6            102kbTRP-CD59-MCP-URA       12/24           160kb表12：用于产生YAC4多接头的寡核苷酸序列
寡核苷酸                 序列
4.1A        5’ATG CGA ATT CGG CGC GCC ACG CGT GCG GCC
               GCA AGG CCA ATT AGG CCT ACG TAG GCG CGC
               CGA ATT CTC G3’
4.1B        5’CGA GAA TTC GGC GCG CCT ACG TAG GCC TAA
               TTG GCC TTG CGG CCG CAC GCG TGG CGC
               GCC GAA TTC GCA T3’
            表13：扩增CD59末端的PCR引物序列
引物                               序列
5CH-1       5’TAT AGC GGC CGC AAG GCC AAT TAG GCC ATG TGA
               AAA AGG AAT GAA ATT GAG ATA TTG
5CH-2       5’AGC ATG GAT CCG GCC CTG TAA GTA CAG TGG
ED-1        5’ATC ATA CGT ATT GGG CTT TTC TTC CAC CTG
ED-2        5’ATT TGT CGA CCC ACT TGC TTC ATC TTA ATC
                          序列表
(1)一般信息：
  (i)中请人：DIAMOND ET AL.
  (ii)发明名称：用于产生表达掩蔽或降低GAL表位水平之酶和补体抑制剂两者的供异种移植的转基因动物的方法
  (iii)序列数：24
  (iv)通讯地址：
      (A)收信人：BAXTER INTERNATIONAL INC.
              法律部，MPR-A2S
      (B)街道：1620 N.WAUKEGAN路
      (C)城市：McGAW PARK
      (D)州：伊利诺伊州
      (E)国家：美国
      (F)ZIP：60085
  (v)计算机可读形式：
      (A)介质类型：软盘
      (B)计算机：IBM PC兼容机
      (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
      (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.3
  (vi)当前申请的数据：
      (A)申请号：PCT/US96/15255
      (B)申请日：1996年9月23日
      (C)分类号：
  (viii)律师/代理机构信息：
      (A)姓名：MATTENSON，CHARLES R.
      (B)登记号：30,660
  (ix)电讯信息：
      (A)电话：847-473-6693
      (B)传真：847-473-6933
(2)SEQ ID NO：1的信息：
      (i)序列特征：
         (A)长度：35个碱基对
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线性
      (ii)分子类型：DNA(基因组)
      (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
TTTGGATCCT CGGCCATGTG GCTCCGGAGC CATCG                 35
(2)SEQ ID NO：2的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：26个碱基对
      (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：AAAGTCGACT CAAGGCTTAG CCAATC                               26(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：3791个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：AAGCTTGGCC  CACAAGGAGT  GGCAATGTTA  GGAGTGTGAC  TGTGTTAGAG  GAAGTGTGTC
                       60ACTTTGAGGT  TGGCCTTTGA  GGTCTCCTAT  GCTCATGAGC  TGCCCAGTGT  GGAATGAAAG
                       120CCTCTTCCTG  GCTGCATTTG  GATCAAGATG  TAGAAGTCTC  CCCTTCTCCA  GCACCATGCC
                       180TACCTGCACA  CTGGTACGCC  TGCCTTCCGT  CATGATGGAC  TAAATTCCTG  AAACTGTAAG
                       240CCAGACCCTA  TTAAATGTCT  CCCTTTAGAA  GGAATGCCTT  GGTCATGGTG  TTTCTTCACA
                       300GCAACAAAAC  CAAAACTAAC  ACACCCAGCA  CTTAGGATGC  AAAGGCAGAT  GTATCTCTGT
                       360GAGTTCAAGG  GCAGCCTGAT  CTACATAATG  AATTACAGAA  TAGCCAGGGC  TGTGCAGATA
                       420GACCTTGTCT  AAACAAGCAA  ACAAACAAAA  CCCATAGTAA  AATAAGAAGA  AAAGTAATGG
                       480AGACAGATCC  TTTGTGTAGC  TGCCTAACCC  CAACAGCATC  CCTAGGTTGA  TCAGGAAGAA
                       540ACCTAAGAGC  ATCAAGTCCC  CATGGAAAAT  GCTCACAACA  TCTAATAAGA  GGGGTTCAGG
                       600GAGACAGGGT  CTGCTGAATC  CTGGTGAGGC  TGGGGGGCTG  CTGTGGGGAT  CTGCATGGGG
                       660AGGTGACTGG  AGTTCACACC  TGTGGTCGCA  CGCATTCATT  GCTCTGTGTG  ATGAGTGACT
                       720CTCTTCAGGA  GTCCCCACCC  ATCTATGCTC  TTCTTTCCAC  TTCACTTCTG  TGACTGATTT
                       780GAAAAGATCC  ACAGAATCAT  GAAATGGGTA  AATTTAATCT  TTCCCCACAC  TACTGATCAG
                       840GGATGAAACC  TCACATCACA  GTGTGTGCTC  TCTGGCATGA  GAATCATCTT  TCTCCCAGTG
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                       1320CACACACACA  CACACACACA  CACACACACA  CACACACACC  TGCAGCCACA  GACTTTTCAT
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                       2340CAGTATGCCA  CGCTGCTGGC  TCTGGCCCAG  CTCAACGGCC  GCCGGGCCTT  TATCCTGCCT
                       2400GCCATGCATG  CCGCCCTGGC  CCCGGTATTC  CGCATCACCC  TGCCCGTGCT  GGCCCCAGAA
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                       2640GCGCAGAGTG  TGCTGGGTCA  GCTCCGCCTG  GGCCGCACAG  GGGACCGCCC  GCGCACCTTT
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                       3780CAGGCAGTGG  C                                                     3791(2)SEQ ID NO：4的信息：
 (i)序列特征：
    (A)长度：2268个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
 (ii)分子类型：DNA(基因组)
 (xi)序列描述：SEO ID NO：4：CCGGGAGGTG  ACTTCAAGGG  GACCGCAGGA  CCACCTCGGG  GGTGGGGGGA  GGGCTGCACA
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  (i)序列特征：
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(i)序列特征：
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(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CCGCTCGAGG CTGCTGTCAC TATGACC                              27(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
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(ii)分子类型：DNA(基因组)
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CGCAGGAATT CAGCTTGAGT CTCCTCAGG                        29
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   (A)长度：27个碱基对
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(ii)分子类型：DNA(基因组)
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(xi)序列描述：SEQ fD NO：15：TTTGGATCCT CGGCCATGTG GCTCCGGAGC CATCG                     35(2)SEQ ID NO：16的信息：
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   (A)长度：26个碱基对
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(i)序列特征：
   (A)长度：18个碱基对
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(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：AATATTAGCC AGAAGCAG                                        18(2)SEQ ID NO：18的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：23个碱基对
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TCGAGTACTC AACAACGAAT GTT                                     23
(2)SEQ ID NO：19的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：70个碱基对
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(2)SEQ ID NO：20的信息：
    (i)序列特征：
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(2)SEQ ID NO：21的信息：
   (i)序列特征：
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TATAGCGGCC GCAAGGCCAA TTAGGCCATG TGAAAAAGGA ATGAAATTGA GATATTG57
(2)SEQ ID NO：22的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：30个碱基对
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AGCATGGATC CGGCCCTGTA AGTACAGTGG                       30

Claims (70)

1.一种以降低的或消除的抗体介导的排斥将器官、组织、细胞或非活组分异种移植进人患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)产生表达至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平的酶与至少一种补体抑制剂的转基因动物；(b)从所说的转基因动物分离器官、组织、细胞或非活组分，和(c)从所说的转基因动物将所需的器官、组织、细胞或非活组分移植进人患者。
2.按照权利要求1的方法，其中由所说的转基因动物表达的酶包括能够与α(1，3)半乳糖基-转移酶竞争的糖基-转移酶。
3.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达一种或多种选自下组的酶：α(1，2)岩藻糖基转移酶、α(2，6)唾液酸转移酶、β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶和它们的组合。
4.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达α(1，2)岩藻糖基转移酶和α(2，6)唾液酸转移酶。
5.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达一种或多种选自下组的补体抑制剂：CD59、DAF、MCP和它们的组合。
6.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达CD59、DAF和MCP。
7.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达CD59和DAF。
8.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达CD59和MCP。
9.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达DAF和MCP。
10.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达一种或多种选自下组的补体抑制剂：因子I、因子H、C4结合蛋白、CR1、CR2、C8结合蛋白、HRF、MIP、P-18、HRF-20、MIRL和它们的组合。
11.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物是通过向靶动物引入编码至少一种降低异种反应性抗原水平之酶的核酸和编码至少一种补体抑制蛋白质的核酸产生的。
12.按照权利要求11的方法，其中所说的核酸以小基因的形式引入。
13.按照权利要求11的方法，其中所说的核酸以小基因盒的形式引入。
14.按照权利要求11的方法，其中所说的核酸以酵母人工染色体(YAC)的形式引入。
15.按照权利要求11的方法，其中所说的核酸以噬菌体P1克隆的形式引入。
16.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物是通过向靶动物共注射编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶的核酸以及编码至少一种补体抑制剂的核酸产生的。
17.按照权利要求16的方法，其中所说的共注射是通过以下方法进行的：将编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶的核酸以及编码至少一种补体抑制剂的核酸共注射进合适动物的受精卵母细胞的前核，并将卵母细胞转移到假孕雌性动物携带至足月，以产生表达掩蔽或降低异种反应性抗原水平的酶和补体抑制剂两者的转基因动物。
18.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物利用克隆进表达载体的核酸产生的。
19.按照权利要求18的方法，其中所说的表达载体是质粒。
20.按照权利要求18的方法，其中所说的表达载体包含真核表达载体pRex10。
21.按照权利要求18的方法，其中所说表达载体还包含启动子。
22.按照权利要求21的方法，其中所说的启动子包括鸡β-肌动蛋白启动子。
23.按照权利要求21的方法，其中所说的启动子包括H2kb启动子。
24.按照权利要求18其中所说的表达载体还包含增强子。
25.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达编码已由RT-PCR克隆的编码掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶的核酸。
26.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物表达已从A431细胞系用总RNA克隆的编码掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶的核酸。
27.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物是猪。
28.按照权利要求1的方法，其中所说的转基因动物是小鼠。
29.一种在异种移植中有用的转基因动物，该转基因动物能够表达至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平的酶和至少一种补体抑制剂。
30.按照权利要求29的转基因动物，其中所表达的酶包括能够与α(1，3)半乳糖基-转移酶竞争的糖基-转移酶。
31.按照权利要求29的转基因动物，该转基因动物表达一种或多种选自下组的酶：α(1，2)岩藻糖基转移酶、α(2，6)唾液酸转移酶、β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶和它们的组合。
32.按照权利要求29的转基因动物，其中所说的能够掩蔽或降低异种反应性抗原水平的酶和补体抑制剂在内皮细胞中表达。
33.转按照权利要求29基因动物，其中所说的转基因动物表达一种或多种选自下组的补体抑制剂：CD59、DAF、MCP和它们的组合。
34.按照权利要求29的方法，其中所说的转基因动物表达CD59、DAF和MCP。
35.按照权利要求29的方法，其中所说的转基因动物表达一种或多种选自下组的补体抑制剂：因子I、因子H、C4结合蛋白、CR1、CR2、C8结合蛋白、HRF、MIP、P-18、HRF-20、MIRL和它们的组合。
36.按照权利要求29的转基因动物，其中所说的动物是猪。
37.按照权利要求29的转基因动物，其中所说的动物是小鼠。
38.一种提供在移植进人患者时降低或消除抗体介导的排斥的供体器官、组织、细胞或非活组分的方法，该方法包括以下步骤：(a)产生表达至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平的酶与至少一种补体抑制剂的转基因动物；(b)从所说的转基因动物获得器官、组织、细胞或非活组分。
39.按照权利要求38的方法，其中从猪获得所说的供体器官、组织、细胞或非活组分。
40.一种以降低的或消除的抗体介导的排斥将器官、组织、细胞或非活组分异种移植进人患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)产生表达掩蔽或降低异种反应性抗原水平的α(2，6)唾液酸转移酶的转基因动物；(b)从所说的转基因动物分离所需的器官、组织、细胞或非活组分，和(c)从所说的转基因动物将所需的器官、组织、细胞或非活组分移植进人患者。
41.一种以降低的或消除的抗体介导的排斥将器官、组织、细胞或非活组分异种移植进人患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)产生表达掩蔽或降低异种反应性抗原水平的β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶的转基因动物；(b)从所说的转基因动物分离所需的器官、组织、细胞或非活组分，和(c)从所说的转基因动物将所需的器官、组织、细胞或非活组分移植进人患者。
42.一种产生在具有降低的或消除的抗体介导的排斥之异种移植中有用的转基因动物的方法，该方法包括向靶动物引入核酸
43.按照权利要求42的方法，其中所说的转基因动物是通过以下方法产生的：将编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶的核酸以及编码至少一种补体抑制剂的核酸共注射进所需动物的受精卵母细胞的前核，并将卵母细胞转移到假孕雌性动物携带至足月，以产生表达掩蔽或降低异种反应性抗原水平的酶和补体抑制剂两者的转基因动物。
44.按照权利要求42的方法，其中所说的转基因动物是通过以下方法产生的：分别产生表达编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶的核酸的转基因动物和表达编码至少一种补体抑制剂的核酸的转基因动物，并繁殖这两种转基因动物，以便产生表达至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶以及至少一种补体抑制剂的所繁殖动物的转基因子代。
45.按照权利要求42的方法，其中所说的转基因动物是通过以下方法产生的：制备含有编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶和至少一种补体抑制剂蛋白质的核酸的单一YAC构建体，并将该YAC构建体引入到动物中，以便所说的动物和其子代表达至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶以及至少一种补体抑制剂蛋白质。
46.按照权利要求42的方法，其中所说的转基因动物是通过以下方法产生的：制备含有编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶和至少一种补体抑制剂蛋白质的核酸的单一小基因，并将该小基因引入到动物中，以便所说的动物和其子代表达至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶以及至少一种补体抑制剂蛋白质。
47.按照权利要求42的方法，其中所说的转基因动物是通过以下方法产生的：制备一种或多种含有编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶的核酸的小基因和一种或多种含有编码至少一种补体抑制剂蛋白质的核酸的小基因，并将这两种类型的小基因引入到动物中，以便所说的动物和其子代表达至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶以及至少一种补体抑制剂蛋白质。
48.按照权利要求42的方法，其中所说的转基因动物是通过以下方法产生的：制备含有编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶和至少一种补体抑制剂蛋白质的核酸的P1克隆，并将P1克隆引入到动物中，以便所说的动物和其子代表达至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶以及至少一种补体抑制剂蛋白质。
49.一种核酸片段，该片段在单一整合位点编码至少一种掩蔽或降低异种反应性抗原水平之酶和至少一种补体抑制剂。
50.按照权利要求49的核酸片段，该片段是酵母人工染色体形式的。
51.按照权利要求49的核酸片段，该片段是小基因形式的。
52.按照权利要求49的核酸片段，该片段是噬菌体P1克隆形式的。
53.一种核酸片段，该片段编码至少两种补体抑制剂。
54.按照权利要求53的核酸片段，该片段包括编码至少CD59、DAF和MCP的核酸。
55.按照权利要求53的核酸片段，该片段是酵母人工染色体形式的。
56.按照权利要求53的核酸片段，该片段是小基因形式的。
57.按照权利要求53的核酸片段，该片段是噬菌体P1克隆形式的。
58.按照权利要求53的核酸片段，该片段包括位于单一整合位点的编码补体抑制剂的至少两个基因的基因座。
59.按照权利要求58的核酸片段，该片段包括位于单一整合位点的附加基因。
60.一种转基因动物，该动物从位于单一整合位点的基因座表达多种补体抑制剂。
61.按照权利要求60的转基因动物，其中所说的多种补体抑制剂选自下组：CD59、DAF、MCP和它们的组合。
62.按照权利要求60的转基因动物，其中所说的补体抑制剂包括CD59、DAF和MCP。
63.按照权利要求60的转基因动物，其中所说的补体抑制剂包括CD59和DAF。
64.按照权利要求60的转基因动物，其中所说的补体抑制剂包括CD59和MCP。
65.按照权利要求60的转基因动物，其中所说的补体抑制剂包括DAF和MCP。
66.按照权利要求60的转基因动物，该动物表达多种选自下组的补体抑制剂：因子I、因子H、C4结合蛋白、CR1、CR2、C8结合蛋白、HRF、MIP、P-18、HRF-20、MIRL和它们的组合。
67.按照权利要求60的转基因动物，该动物从包括编码补体抑制剂之基因座位的同一的整合位点表达附加基因。
68.按照权利要求60的转基因动物，其中所说的补体抑制剂在内皮细胞中表达。
69.一种在异种移植中有用的转基因动物，该动物表达掩蔽或降低异种反应性抗原水平的α(2，6)唾液酸转移酶。
70.一种在异种移植中有用的转基因动物，该动物表达掩蔽或降低异种反应性抗原水平的β(1，3)N-乙酰葡糖胺基转移酶。
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