CN1306568A - 可得自转基因羊的胆汁盐活化的人脂肪酶(bssl) - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可得自基因组羊的胆汁盐活化的人脂肪酶(BSSL)。本发明还涉及其生殖细胞和体细胞含有重组核苷酸分子的转基因羊,其中所述重组核苷酸分子包含人BSSL的核苷酸序列。本发明也涉及生产所述转基因动物的方法以及得自转基因动物的人BSSL的生产方法。另外,本发明提供包含BSSL的组合物的用途,即用于治疗涉及外分泌性胰腺机能不全相关的疾病以及改善早产新生儿饮食中脂质的利用。

Description

可得自转基因羊的胆汁盐活化的人脂肪酶(BSSL)
技术领域
本发明涉及从转基因羊中可获取的胆汁盐活化的人脂肪酶(BSSL)。本发明还涉及生殖细胞和体细胞含有重组核苷酸分子的转基因羊，所述重组核苷酸分子包含编码人BSSL的一段核苷酸序列。本发明还涉及产生所述转基因动物的方法，以及生产得自转基因动物的人BSSL的方法。另外，本发明提供包含BSSL的组合物的用途，即在涉及外分泌胰腺机能不全的疾病的治疗方面、以及改善早产新生儿对饮食中脂质的利用方面的用途。
背景技术胆汁盐活化的人脂肪酶
胆汁盐活化的脂肪酶(BSSL)是存在于人乳中主要的脂解活性(Wang和Johnson,1983年；Wang和Hartsuck,1993)。正如它的名称所指出的，该酶在乳汁中本是无活性的，但是在肠中由胆汁盐活化的。在哺乳动物中，一种类似的酶活性也由胰脏分泌到肠中。乳房及胰脏两器官内该酶的cDNA序列的相同的，表明该酶是单基因产物(Reue等人，1991；Lidberg等人，1992)。BSSL同其它胰腺脂肪酶共同具有三酰甘油水解酶活性，但BSSL是唯一水解胆固醇酯和其它脂肪酸脂(例如维生素A酯)的肠内脂肪酶。该蛋白质在婴儿胃中，在蛋白酶和酸性环境下都是稳定的。在人乳中，BSSL的这些独特的活性和大量存在说明了所述酶在生理学方面的重要性。
BSSL的cDNA序列(SEQ ID NO:2)和推断的氨基酸序列(SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4)已经由Nilsson等人(1990)在美国专利第5,200,183号(俄克拉河马医学研究基金)和WO91/18923(Astra AB)中公开。人BSSL是一种由722个氨基酸组成的糖蛋白。C-端部分是由16个重复单位组成，每一重复单位又是由具有共有序列PVPPTGDSGAP的11个氨基酸组成。编码人BSSL的基因组DNA序列(SEQ ID NO:1)已由Lidberg等人(1992)和在美国专利第5,616,483号(Astra AB)中公开。
BSSL以大量的糖基化形式存在，每一重复单位具有一个潜在的N-糖基化位点(Aspl87)和两个潜在的O-糖基化位点(Baba等人，1991)。虽然在体外，所述酶的糖基化状态对于活性而言不重要(Hansson等人，1993)，然而O-糖基化看来对于BSSL的生物学功能是重要性。Loomes等人(1997)已经指出，所述C-端重复区对防止非特异性的疏水作用是重要的，并能消除BSSL自聚集的倾向。Wang等人(1995)已经指出，所述重复区含有不同的Lewis抗原，说明在BSSL生理功能方面也可能增加它的粘附活性。Spilburg等人(1995)和Bosner等人(1988)指出，C-端结构域可能对肝素的结合和与细胞表面的蛋白聚糖的相互作用是重要的。用小鼠、大鼠和人类组织做的免疫组织化学实验表明，BSSL蛋白结合到肠细胞膜上。因此，O-糖基化作用对这种BSSL结合到肠内的“BSSL受体”是重要的，对酶本身正常的生理学功能也是重要的。
已经公开了在转基因鼠的乳汁中由鼠乳清酸性蛋白(WAP)启动子表达BSSL的cDNA和基因组构成物(Stromqvist等人，1995)。在体外，所述蛋白质在乳汁中的水平达到1mg/ml，且所述蛋白质是100％具有活性的。但是，当把天然酶与细胞培养物中产生的酶进行比较时，所述酶的转基因形式表现出明显的糖基化状态减少。从转基因鼠中获取的重组人BSSL明显地缺乏天然人类酶的O-糖基化型式。转基因动物乳汁中异源蛋白质的表达
绵羊β-乳球蛋白(BLG)基因的克隆和特征由Ali和Clark于1988年公开。已证实，在含有BLG完整基因的转基因小鼠的乳汁中，所述BLG得到了稳定的高水平的表达(Simons等人，1987年；Harris等人，1991)。进一步的实验证实，BLG启动子区可以指导将异源人类蛋白质高水平地表达到转基因鼠的乳汁中(Archibald等人，1990)。产生了，利用BLG基因驱动表达，产生了人类蛋白质在其乳汁中得到表达的转基因羊，表明这项技术作为商业生产途径是可行的(Simons等人，1988年；Clark等人，1989)。应用该项技术去改变家畜乳汁的可行性已经证实，证明在转基因羊的乳汁中高水平表达人类α-1-抗胰蛋白酶(Wright等人，1991年；Carver等人，1992年；Carver等人，1993年；Cooper和Dalrymple,1994)。在家畜乳汁中这种高水平表达异源蛋白质是利用所述BLG启动区融合到人类基因组序列的融合体的结果(Wright等人，1991)。公开于US5,639,940的载体pMAD6已经设计用于由BLG启动子表达基因。
附图简述
图1，质粒pS452的结构。
图2，克隆pBSSLII构建的图解式说明。
图3，pBSSLII结构的图解式说明。
图4，转基因羊中BSSL的活性。
本发明的公开
我们惊奇地发现，在转基因羊的乳腺中产生的胆汁盐活化的人脂肪酶(BSSL)有一个特殊的O-糖基化型式，它和先前在转基因动物中产生的BSSL形式形成对比，该O-糖基化型式可能对BSSL的生物学功能是重要的。
胆汁盐活化的人脂肪酶基因被置于绵羊β-乳球蛋白启动子的转录控制下，然后引入到羊中。这导致从296活产中产生13只转基因动物，其中4只转基因动物是雌性的。在诱导母羔羊产乳后，在乳腺中检测到转基因的表达，并且不同水平的BSSL蛋白分泌到乳汁中。检测到的表达水平超过3g/l，该水平能够成为人BSSL商业化生产的基础。该蛋白质具有完全的活性，携带糖基化，并显示出与天然蛋白质和哺乳动物细胞培养物产生的变异体相同的酶特征。
因此，在第一方面，本发明提供了由转基因非人类哺乳动物产生的重组的胆汁盐活化的人脂肪酶(BSSL)，所述脂肪酶至少5％被糖基化。所述转基因非人类哺乳动物可以是一个有蹄的、有胎盘哺乳动物。
在本发明的第二方面，所述重组人BSSL的总单糖含量为10％以上。再一方面，所述重组人BSSL包含至少1％N-乙酰半乳糖胺。
在本发明的一个实施方案中，所述重组人BSSL的特征在于基本上包含下列单糖组成：0-6％岩藻糖、3-12％半乳糖、0.1-2％甘露糖、1-7％N-乙酰半乳糖胺、0.5-15％N-乙酰葡萄糖胺和1.5-10％5-Ac-神经氨酸。
在本发明该实施方案的另一方面，所述重组人BSSL的特征在于基本上包含下列单糖组成：0-1％岩藻糖、6.5-8.5％半乳糖、1-2％甘露糖、5.5-7％N-乙酰半乳糖胺、3.5-5％N-乙酰葡萄糖胺和2.5-4％5-Ac-神经氨酸。最好是，所述人BSSL基本上包含如表Ⅳ第1列所示的单糖组成。根据本发明的重组胆汁盐活化的脂肪酶基本上具有公布于序列表中SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列；或者包含有功能上由序列表中SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4组成的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种转基因羊，其生殖细胞和体细胞含有在胚胎阶段引入到所述羊或者所述羊的祖先中的一种重组核苷酸分子，，所述重组核苷酸分子包含：(ⅰ)一段编码人BSSL的核苷酸序列；(ⅱ)一个启动子，其有效地连接到编码人BSSL的所述核苷酸序列。
在根据本发明的转基因羊中，编码人BSSL的核苷酸序列可以作为包括内含子的基因组序列(SEQ ID NO:1)或作为cDNA(SEQ ID NO:2)引入。据报道包含内含子的序列对转基因动物中受调节的基因表达是最好的(Brinster等人，1988年；Whitelaw等人，1991)。质粒pS452(已保藏，保藏号为DSM7499)具有一个插入鼠WAP基因的第一外显子中的BSSL基因组片段(SEQ ID NO:1)。
因此，编码人BSSL的核苷酸序列可以来源于基因组，或是来源于合成，或是其组合。具体地讲，所述核苷酸序列可以选自：
(a)由质粒pS452携带的一段核苷酸序列，该质粒由保藏号DSM7499来鉴别；
(b)序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中公布的一段核苷酸序列；
(c)编码序列表中SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中公布的多肽的一段核苷酸序列；
(d)在严格杂交条件下同上述(a)、(b)、或(c)中限定的任一序列杂交的一段核苷酸序列。
在本领域中人们从标准方案(例Ausubel等人，Supra)中得知术语“严格杂交条件”。该术语可以理解为例如下列条件，即在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中，于+65℃下杂交到滤膜结合的DNA，然后在0.1×SSC/0.1％SDS中，于+68℃下进行漂洗。
熟练的技术人员将会明白，为了在根据本发明的转基因羊的乳腺中表达BSSL基因，应将编码人BSSL的核苷酸序列连接到编码能够介导BSSL基因表达并将其表达导向乳腺中的乳汁蛋白质的基因或其亚序列上。特别是应该有有效地连接到编码胆汁盐活化的脂肪酶的所述核苷酸序列上的启动子。所述启动子可以例如是BSSL启动子、乳清酸性蛋白启动子或是乳汁蛋白启动子，例如酪蛋白启动子、α-乳白蛋白启动子，或者最好是β-乳球蛋白启动子。
所用的乳汁蛋白基因可以得自与表达系统待插入的物种相同的物种中获取，也可以得自另一物种。已经表明，将基因表达导向乳腺的调节元件在不同种间是有功能的(Hennighausen等人，1990)。
由于乳汁蛋白质通常在乳腺中高水平产生，作为表达组织的乳腺以及编码乳汁蛋白质的基因的应用普遍被认为特别适用于在转基因非人类哺乳动物生产异源蛋白质。另外，乳汁很容易大量地收集和得到。在本发明中，在人BSSL生产中应用乳汁蛋白质基因还有更进一步的优点，那就是就表达调节和生产部位(乳腺)而论，在相似于天然生产条件下产生BSSL。BSSL分泌到乳汁中必需的信号肽在SEQ IDNO:3显示为位点-23至-1。
因此，本发明再一方面是雌性转基因羊，其中编码胆汁盐活化的脂肪酶的核苷酸序列在所述雌性转基因羊的乳腺中表达，且胆汁盐活化的脂肪酶存在于所述雌性转基因羊的乳汁中。
在本发明中包括产生雌性转基因羊的方法，所述方法包括：
(a)提供了一个有效地连接到在羊中有功能的启动子的、编码胆汁盐活化的人脂肪酶的基因；
(b)将所述基因引入到羊的胚胎或受精卵内，以便将所述基因整合到所述羊的生殖系中；
(c)将所述胚胎或受精卵移植到一只拟妊娠的受体羊内；
(d)使所述受体羊繁殖后代；
(e)选择在乳汁中产生可回收量的胆汁盐活化的脂肪酶的雌性后代羊。
步骤(a)中提到的启动子可以是BSSL启动子、乳清酸性蛋白启动子或者是乳汁蛋白质启动子，例如酪蛋白启动子、α-乳白蛋白启动子或者最好是β-乳球蛋白启动子。
可以用几种方法将外源基因DNA引入正在发育的哺乳动物胚胎中，其引入途径使得外源基因DNA最终可以被稳定地整合到所产生的动物的染色体上(Hogan等人，1994年；Umland等人，1996)。
(a)用一根显微水平的小孔径玻璃针，采用机械注射的方法，将所述基因直接注射到羊的受精卵中，例如注射到羊的受精的单个卵细胞或其原核或者胚胎中。微注射后的卵子接着被转移到拟妊娠的代孕母羊的输卵管内，并使其发育。通常讲，并不是所有注射过的卵子均发育成表达人BSSL的成年雌性动物。因此，从统计学的观点来看，有约一半的哺乳动物将是雄性哺乳动物，然而，由这些雄性哺乳动物可以在下一代中繁育雌性哺乳动物。编码人BSSL的基因一旦整合到所述生殖系，就能在所述哺乳动物的稳定系中，高水平地表达产生正确加工的有功能的人BSSL。
直接微注射工作量大且技术上要求严格，但它看来在可以导入的DNA类型或大小方面几乎没有限制。最近三年，有几篇学术论文描述了将酵母人工染色体形式的数百个碱基对的连续DNA引入到小鼠生殖系中(Schedl等人，1993年；Fujiwara等人，1997年；Manson等人，1997)。
(b)可以对逆转录病毒进行遗传修饰以起到载体的作用，使得可以用外源DNA感染胚胎(Jaenisch等人，1975年；Gilboa等人，1986)。
(c)精子被认为是一种有效的将外源基因转移到哺乳动物胚胎中的中介体(Lavitrano等人，1989)。
(d)在胚胎干细胞中，同源的或非特异性DNA重组也能用于永久性地修饰生殖系。干细胞是从哺乳动物胚胎中得到的多能或全能的细胞，能在培养物中生长，且能提供发育的胚胎(Evans和Kaufman等人，1981年；Robertson,1987)。所产生的动物具有从所述胚胎干细胞中衍生的一些细胞，其中有些普遍存在于生殖系，且能导致基因物质传递到后代(Robertson,1987)。也可以在培养时对胚胎干细胞进行遗传操作。用多种技术(例如电穿孔、脂质转染法、微注射法、逆转病毒感染法和磷酸钙沉淀法)，可以将DNA导入所述细胞内。通过采用抗生素G418，或利用所述酶即胸苷激酶的生物化学，可以对用特异性或非特异性的方式已整合了外源DNA的转化细胞进行正选择和负选择(Bradley,1991年；Hopper,1992)。基因组非常微小的改变是可能的,例如点突变、以及产生特定缺失(即所谓的“失效”，Stacey等人，1994)或者是置换(Stacey等人，1994年；Stacey等人，1995)。但是，该方法迄今为止仅在小鼠中获得成功。胚胎干细胞只是证实性的从小鼠胚胎中分离到，其它种类的研究正在进行(McWhir等人，1996)。
(e)对体细胞或其它细胞进行体外操作(例如用上述同源重组)，然后通过核转移产生动物。Wilmut和同事(Wilmut等人，1997)描述了通过核转移成功地从胎儿和成体细胞克隆羊。上述的成体细胞是从已在体外培养了许多代的细胞株系中得到的。这项新技术采用去核的、未受精的卵，将另一细胞置于透明带和细胞膜之间的空间。两细胞的膜用电脉冲使其融合。让重建的胚胎在在一只临时羊受体中发育一个短暂的发育期，然后进行最终的评价并导入一只同步母羊体内。
因此，可以想象可采用与用于改变小鼠胚胎干细胞的技术相同的技术，对成体的或是胎儿的家畜细胞进行体外操作，然后用于产生转基因动物。事实上，在核转移之前，将一个在BLG控制下的人类基因体外导入细胞，现在有一些转基因羊就是用这样的一种方法产生的(Schnieke等人，1997)。
另一方面，本发明提供了一个胆汁盐活化的人脂肪酶的生产方法，包括：
(a)使上述阐明的雌性转基因羊产生乳汁；
(b)收集步骤(a)的乳汁；以及可选地
(c)分离胆汁盐活化的脂肪酶。
更具体地讲，所述胆汁盐活化的人脂肪酶的生产方法可以包括：
(a)提供一个编码胆汁盐活化的人脂肪酶、有效地连接到一个在羊中有功能的启动子上的基因；
(b)将所述基因导入羊的胚胎或受精卵，以便将所述基因整合到所述羊的生殖系；
(c)将所述胚胎或受精卵移植到一个拟妊娠的受体羊中；
(d)让所述受体羊繁殖后代；
(e)选择一只在乳汁中产生可回收量的胆汁盐活化的脂肪酶的雌性后代羊；
(f)收集在步骤(e)中选择的雌性羊产的乳汁；以及可选地
(g)分离胆汁盐活化的脂肪酶。
在步骤(a)所提到的启动子可以是例如BSSL启动子、乳清酸性蛋白启动子，或是乳汁蛋白质启动子，例如酪蛋白启动子、α-乳白蛋白启动子或者最好是β-乳球蛋白启动子。
在上述所提到的雌性转基因羊的产生方法或人BSSL生产的方法中，编码胆汁盐活化的脂肪酶的所述基因最好具有选自以下的一种核苷酸序列：
(a)由质粒pS452携带的一段核苷酸序列，该质粒由保藏号DSM7499鉴定；
(b)在序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中公布的一段核苷酸序列；
(c)在序列表中SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中公布的编码多肽的一段核苷酸序列；
(d)在严格杂交条件下同(a)、(b)或(c)中限定的任一段序列杂交的一段核苷酸序列。
本发明包括按上面所提到的生产人BSSL的方法获得的重组人BSSL、由转基因非人类哺乳动物产生的重组胆汁盐活化的人脂肪酶(BSSL)，所述的脂肪酶至少5％被糖基化。所述重组人BSSL的单糖总含量可以在10％以上，和/或可以包含至少1％N-乙酰半乳糖胺。所述重组人BSSL的特征在于基本上包含下列单糖组成：0-6％岩藻糖、3-12％半乳糖，0.1-2％甘露糖、1-7％N-乙酰半乳糖胺、0.5-15％N-乙酰葡萄糖胺和1.5-10％5-Ac-神经氨酸。在另一方面，所述重组人BSSL的特征在于基本上包含下列单糖组成：0-1％岩藻糖、6.8-8.5％半乳糖、1-2％甘露糖、5.5-7％N-乙酰半乳糖胺、3.5-5％N-乙酰葡萄糖胺和2.5-4％5-Ac-神经氨酸。更优选的是，所述人BSSL基本上包含下列单糖组成：0-1％岩藻糖、6.5-8.5％半乳糖、1-2％甘露糖、5.5-7％N-乙酰半乳糖胺、3.5-5％N-乙酰葡萄糖酰胺和2.5-4％5-Ac-神经氨酸。最优选的是，所述人BSSL基本上包含按表Ⅳ第1列所示的单糖组成。最好是，根据本发明的重组胆汁盐活化的脂肪酶的氨基酸序列基本上如在序列表中SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所公布的。
在另一方面，本发明提供了一种药物制剂，该制剂包含从上述转基因动物中获取的人BSSL。该制剂可以通过添加纯化或部分纯化的重组人BSSL到药物制剂的标准成分中去而制成，所述标准成分例如为药学上可接受的载体。
再一方面，本发明提供了如上所述的胆汁盐活化的脂肪酶的用途，即用于生产治疗与外分泌性胰腺机能不全(例如在囊性纤维化中)相关的病征的药物。在本发明中还包括了应用如上所述的胆汁盐活化的脂肪酶早产新生儿饮食中脂质的利用。
本发明还提供了一个与外分泌性胰腺机能不全(例如在囊性纤维化中)相关病征的治疗方法，该方法包括给予需这种治疗的哺乳动物包括人类有效量的如上所述的胆汁盐活化的脂肪酶。术语“有效量”，在本文中应理解为恢复脂肪消化和修复生理缺陷所需的量。在本发明中还包括改善对早产新生儿饮食中脂质利用的方法，该方法包括需要这种增加的新生儿有效量的如上所述的胆汁盐活化的脂肪酶。
在本说明书全文，术语“标准流程”和“标准步骤”，当用于分子克隆技术方面时，应被理解为在普通实验手册中找到的流程和步骤，所述普通实验手册诸如Current Protocols in Molecular Biology,F.Ansubel等人编辑，John Wiley & Sons有限公司，1994年；或SambrookJ.,Fritsch,E.F.和Manlatis,T.,《分子克隆-实验手册》，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor,NY,1989。
实施例1．基因材料的准备
使用质粒pS452(根据布达佩斯条约进行了保藏，保藏号为DSM7499)。所述构成物有一个插入到鼠WAP基因(Strmqvist等人，1996)的第一外显子中的BSSL的基因组片段(SEQ ID NO:1)。pS452的特征进一步示于图1和表Ⅰ。
用标准转化方法，将质粒DNA导入大肠杆菌DH52株。根据pS452的存在筛选到12个克隆，且所有克隆均含有该质粒。将克隆5-8的DNA合并在一起，并且重新命名为pBSSLI。这个少量制备DNA用于后来的操作。1．1将BSSL序列亚克隆到pMAD6中
为了切下BSSL基因组序列，用KpnⅠ和SalⅠ进行限制性切割pBSSLI。所述DNA用苯酚抽提，乙醇沉淀，然后重新悬浮于水中。用T4DNA聚合酶处理消化物产生平端。在0.5％琼脂糖凝胶电泳上对所述DNA进行大小分离，切下对应于BSSL的条带，用Prepagene系统(Biorad)进行纯化。将纯化的BSSL片段连接到BLG载体pMAD6的EcoRV位点(参见图2)，然后用标准技术转化到大肠杆菌DH5a中。用标准碱裂解小量制备方法，筛选细菌菌落。首先用HindⅢ筛选菌落，以便显现BSSL的插入和定向。1．2质粒DNA的制备
对应于BLG/BSSL杂种的克隆的正确定向和完整性，用酶BamHⅠ、HindⅢ、MluⅠ、NcoⅠ、SphⅠ、StuⅠ和XbaⅠ进行限制性消化来证实。筛选到一个克隆，命名为pBSSLII。用标准碱裂解法，接着用CsCl梯度超速离心法，制备pBSSLII DNA。1．3 pBSSLII结构的证实
采用越过pMAD6的EcoRV位点的引物阅读法，进行双链DNA序列分析，首先证实新的连接点的序列。接着，为了证实BSSLII的结构，对pBSSLII整个外显子编码部分进行了全部的序列分析。用一台ABI377自动序列测定仪和相关的双链序列测定技术得到序列。用AutoassemblerTM(ABI)程序将序列数据编辑为最终形式，且与预期的DNA进行序列对比。与预期的DNA序列没有变化。为了证实所有的BSSL重复结构是存在于该质粒中，从双端对所述区域进行序列分析，证实33个碱基对重复序列(对应于11个氨基酸重复序列)中的所有16个在该构成物中是存在的。1．4用于注射的DNA的制备
用MluⅠ进行限制性酶切，将所述BSSLII转基因从其细菌载体主链中切下。在20-40％线性蔗糖梯度中，用差速区超带离心法，将用于微注射的DNA从载体主链中分离出来。从所述梯度得到的部分用琼脂糖凝胶电泳进行分析，且合并无载体的插入片段部分。对DNA进行乙醇沉淀，然后重新悬浮于水中。为了使细菌载体污染减小到最小值，将合并的BSSLII DNA进行第二轮庶糖密度梯度超速离心。用GeneQuan Ⅱ(Pharmacia)，通过紫外分光光度法测定终产物的浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检查所述DNA。2．转基因羊的产生2．1所述动物的来源和组构
本研究只用Poil Dorset品种的成年母羊和成年公羊，所述羊自从从新西兰引进后就一直生长在PPL Therapeutics,East Mains,Ormiston，或者出生在East Mains。所有的母羊在开始研究均为12月龄以上。所有的公羊在1994年期间全部证明有生育力。
Poll Dorset品种或Poll Dorset杂种的母羊和育成母羊自从新西兰引进后就一直生长在PPL Therapeutics,East Mains,Ormiston，或者出生在East Mains或是从新西兰引进的Poll Dorset的母羊和育成母羊。
本研究首先按星期(1-5)分组。然后再进一步分成4个注射组。每一组有7个供体和25个受体羊。2．2方法2．2．1供体
所有母羊在开始当天、第-13天、第-14天、第-15天或第-16天，都用阴道内黄体酮浸渍的海绵(Chronogest山羊海绵体-Intervet)处理。这些海绵留在原位12至15天，然后在第-1天移走。
供体用总量为1.0单位的绵羊卵泡刺激素(OFSH)(Ovagen,IMMuno-Chemical Productis Ltd)处理，给药4天，开始于第-4天，完成于当天。供体还在第-3天用400 IU卵泡刺激素替代物(PMSG-Intervet)处理，提供另外的卵泡刺激和黄体溶解活性。
于第0天给供体肌内注射2ml合成的释放激素类似物(Receptal-Hoescht Animal Health)。
供体用子宫内人工受精(AI)法受精。对用于AI的所有公羊的精液在开始研究之前进行评定。所有供体在AI之前，要禁食禁水至少12小时，然后第1天在全身麻醉(GA)下通过子宫内腹腔镜检查进行人工受精。
采用静脉注射5％硫喷妥钠(Intraval Sodium,RBM Animal Health)诱导GA，在插管之后通过吸入1-2％Halothane/O2/N2O维持GA。用新鲜收集到的Poll Dorset公羊精液进行AI。精液用等份的无菌磷酸缓冲液或超高温灭菌处理的乳汁(来自新西兰的Anchor标准乳)稀释，然后在每个子宫角(uterine horn)注射0.2ml稀释精液。
第二天后从供体回收胚胎。从第1天供体禁食禁水。在GA(如2．2．1．所述)下回收胚胎。供体在转移到外科手术前，在肌注射Temgestic(Reckitt和Colman)和肌注射Amoxypen LA(Mycofarm UK Ltd)之后，让供体恢复健康，注射剂量按制造商建议剂量注射。
进行剖腹术切开，露出子宫。用Ovum培养基(Immuno-ChemicalProducts Ltd)逆向冲洗输卵管回收胚胎。冲洗后，子宫重新放回腹部内，然后将切口缝合。2．2．2胚胎微注射
给所有有可见原核的单细胞胚胎在一个原核内注射到一个来自6μg/mlTE(10mM Tris,pH7.5/0.1mM EDTA)溶液的约2pl DNA。制备所述DNA并稀释到大约6μg/ml，以40μl等份冰冻贮存在-20℃。在等分样品和随后的微注射前，对DNA制备物的质量进行照相记录。
在每次微注射当天，从冰箱取出一等分所述DNA，在室温下解冻。等份样品按组做记号，仅用于当天的微注射。微注射后剩余的DNA再次冰冻于-20℃，贮藏用于随后的分析。在每个周末，这些“用过”的DNA冰冻等份样品通过电泳法分析，并照相。2．2．3．受体
(a)海绵擦法
所有受体都于开始日，第-13天、第-14天、第-15天、第-16天，插入阴道内黄体酮受精海绵。这些海绵体留在原位12至15天，然后在第-1天后移走。
受体在第-1天去除海绵时接受2.0ml(400IU)卵泡刺激素替代物(PMSG-Intervet)肌注射。假如海绵遗失，则母羊接受0.5ml Estrumate而不是PMSG。
受体用raddled结扎输精管的公羊进行发情试验，试验时间为第0天和第1天0800至1700时。在整个此试验期间，输精管结扎的公羊不停地或间歇地同母羊交配。至少每天检查两次以检查母羊发情情况。
(b)受体移植
经受住微注射的胚胎于第2天移植到受体。受体从第1天禁食，在全身麻醉和止痛(按2．2．1．所述)下进行胚胎移植。经剖腹术切开从腹内取出子宫将胚胎移植到具有至少一个合适黄体的母羊的一个或两个输卵管。将子宫复位后，缝合腹部，让受体恢复健康。
为检查妊娠情况的胎儿的数目，所有移植受体均于妊娠第50至90天之间进行超声波扫描。
给妊娠受体进行疫苗注射，用注射Erysorb ST(Hoechst AnimalHealth)预防丹毒，用Heptavac P(Hoechst Animal Health)预防梭菌疾病和巴斯德菌病。受体或者节水每种疫苗的一次加强接种，或者根据受体以前的疫苗接种史进行初次过程的二次注射。所有疫苗剂量按制造商的说明书进行。
(c)产羔
假如母羊尚未产羔，则在妊娠第145天1400时通过肌内注射8mlSoludex(Mycofarm)诱导产羔。
提供24小时的产羔监护。产羔后受体母羊尽可能早的同它们的小羔羊放在一个单圈内，并且至少产羔后24小时保持在单圈中。胞衣在母羊排出体外后尽可能快地从单圈中拿走。
所有羔羊均根据在每个耳朵上的记载它们的个体编号的耳标以及左腹股沟中的一个讯答机来鉴别。在羔羊离开单圈前制作耳标。
所有羔羊与它们的母亲在一起进行饲养。母羊和羔羊可以保持舍内饲养，饲喂完全饮食、浓缩物、其它补充物和/或没有限制的麦杆，或者可以出去到草地。如果需要，所述羔羊在去草地前用适当的杀虫泼淋制品进行处理。
(d)羔羊-尾部取样
对所有羔羊在生命的第一个星期内取一尾部组织样品，除非采样损害羔羊健康，在这种情况下，取样推迟到认为羔羊足够健康时进行。
将一个burdizzo(Ritchey牌夹子，Ritchey Tagg Ltd)夹到尾巴下面，但尽可能接近所述环(ring)。将burdizzo的夹片夹紧，然后打开夹片，拿走burdizzo。用剪刀或解剖刀片从burdizzo压进尾巴留下标记的地方剪下尾巴剪下尾巴后立即刮掉尾巴上的毛，剪下1cm长的尾尖。将这1cm长的尾尖放入到一个塑料螺帽小玻瓶中。收集到的尾部样品，尽可能快地分析转基因的存在。
在取了羔羊尾部样品后，按制造商推荐的剂量，立刻给羔羊注射Duphapen LA(Solvay Duphar)，尾部的伤口端用抗菌素喷雾剂或粉剂处理。
对出生时死亡或在尾部取样之前死亡的所有羔羊进行尾部取样，并且死亡后尽可能快地进行冰冻。也从已死亡的受体母羊子宫内的羔羊进行尾部取样品。样品采取后尽可能快地冰冻于-20℃或更低温度。
(e)羔羊-取血样
所有羔羊于14日龄或更大时从颈静脉采取血样，放入一个有EDTA的容器(vacutainer)中，除非采样损害羔羊健康，在这种情况下，采样推迟到认为羔羊恢复到足够健康时进行。
2．3泌乳的诱导和G0母羊的产奶
于第1-7天皮下注射雌二醇苯甲酸酯(5mg/ml-Intervet)和黄体酮(25mg/ml-Intervet)。于第18至20天，每天一次肌内注射地塞米松(Soludex Injection-Mycofarm)。
于第21天检查每一母羔羊的乳房，观察它的乳腺发育和乳汁分泌情况。第21天应该开始泌乳。假如乳汁产生了，则通过将乳汁挤入50ml Falcon管中，从每半个乳房收集其所有乳汁。可以将两半的乳汁散装在一起。记录每次挤奶体积。然后继续每天两次挤奶。
从散装乳汁样品中去每次挤出的乳汁样品(0.5-1.0ml)，放入到塑料螺帽小玻瓶中。所有乳汁均贮存在-20℃冷冻室中，直到需要分析为止。3．分析羊样品以证明转基因存在
对两个组织即血液和尾部进行常规采样，并分析转基因的存在。一般来讲，尾样先于血样采集，因而尾样分析在先。两个样品的间隔时间为一周左右，所以尾样和血样从来没有在同一试样中测定。这样提供了一定程度的安全性和减少将阳性动物当作阴性动物弃去的可能性。
3．1处理羔羊尾样
将大致10mm3的羊尾放到塑料螺帽小玻瓶中的1 ml尾样缓冲液(0.3M乙酸钠/50mM KCl/1.5mM MgCl2/10Mm Tris(pH8.5)/0.5％NP40/0.5％吐温-20)中。将蛋白酶K(Boehringer Mannheim)加到终浓度0.5mg/ml。样品在+55℃剧烈振荡下温育过夜。
大约1ml消化的尾样，先用苯酚抽提，后用CHCl3/异戊醇(24∶1)抽提，然后进行异丙醇沉淀，乙醇洗涤，真空干燥。将沉淀的DNA重新悬浮于50-200μl的水中。
3．2处理羔羊血样
按照制造商的说明书，用NucleonTM试剂盒(Scotlab)纯化全血中白细胞的DNA。基本的方法是，用高氯酸钠去溶解蛋白质，用二氧化硅基质去捕获所述DNA。抽提大约1.5ml全血，将所述DNA重新悬浮于50μl TE(10mM Tris，pH8.0/1mM EDTA)中。
3．3通过DNA印迹法分析DNA
按制造商说明书，15μl每种样品用限制酶BamHⅠ切割。限制性酶切后的DNA样品用GeneQuant Ⅱ(Pharmacia)做定量分析，将相当于10μl材料的等份样品在1％琼脂糖凝胶上电泳。通过毛细管转移将DNA片段转移到一尼龙薄膜支持物(Dutalon-UV,Strategene)上，并用UV-灯使其交联。
用随机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim)，用[α-32p]dCTP放射性标记大约20ng 1.8kbp BamHⅠ/EcoRⅤ片段，该片段编码BLG启动子的前1.8kbp。使探针和膜在一滚瓶中杂交，在缓冲液7％SDS/0.5MNaPi/lm MEDTA(pH7.2)中于+65℃杂交12-16小时。过量的探针通过严格洗涤去掉，信号通过放射自显影测定。4．分析乳汁样品中重组BSSL的存在
将1μl和0.μl每一乳汁样品放入10μl 2倍的还原样品缓冲液中，上样到Novex 4-12％线性梯度凝胶(SDS-PAGE)上。对照羊乳和天然BSSL以同样方式上样。按照Hansson等人(1993)和Blckberg等人(1995)的方法，制备的天然BSSL作标准，上样浓度为0.2mg/ml。凝胶在150V下电泳，然后用考马斯亮蓝染色。脱色后蛋白质清晰可见。与已知分子量的天然BSSL相比较，大约可得到大致定量数据。5．所述羊研究的结果
5．1胚胎学
产羔结果概述见表Ⅱ。
5．2筛选
所述构成物的示意图示于图3。以“r”标记的条带代表已标记的探针，它是对BLG启动子有特异性。这个探针退火到内源性BLG基因和所述转基因(如果有的话)。杂交转基因片段的大小是6.4kbp。B代表BamHⅠ。
用含有两种组织样品的单一DNA印迹，对根据尾样DNA、血样DNA或者是两者已鉴定为转基因的动物，进行第二轮分析。显示出4个雌性动物含有相对低的转基因拷贝数。有些雄性动物，特别是60232和60364的拷贝数可能明显大于10。所有动物的尾样和血样都是阳性。
转基因数据概述示于表2。总共13只转基因动物，其中4只是雌性的，9只是雄性的。作为活产函数的本研究中观察到的基因转移水平，与已经在羊中获得的最高基因转移水平相当。没有任何数据显示基因转移有向雄性动物偏斜的倾向。6．乳汁分析
6．1诱导泌乳
诱导含有ABSSL转基因的4只母羔羊泌乳，其编号和年龄概述于表Ⅲ。另外，一只相同年龄的非转因母羔羊也被诱导作为阴性对照。所有羔羊产了几百毫升诱导的乳汁(在产乳的26天中总体积在190至2100毫升之间)。
6．2乳汁中ABSSL的水平
羊乳中hBSSL表达的分析表明，相应于人BSSL标准的一种107kDa的蛋白质存在于全部4只转基因羊的乳汁中，但是阴性对照没有。60276号乳汁中该蛋白质水平在整个泌乳期没有明显地变化。7．生物化学特征
7．1使用的蛋白质
按照Hansson等人(1993)和Blckberg等人(1995)所述的方法，分离并纯化人乳中的天然BSSL以及产生于CHO、C127和大肠杆菌中的重组BSSL。
7．2从羊乳中纯化BSSL
从发现携带人BSSL基因的4只羊(参见6．1节)和非转基因羊中收集羊乳样品。乳汁以大约速度为10,000xg离心2小时，将上清液倾注通过一张Kleenex wipe以除去表面的脂肪絮片和脂肪滴。测量上清液体积，加入CaCl2到终浓度为60mM,pH通过加入HCl调到4.3，在低温下搅拌样品过夜。加入Na2HPO4到终浓度为50mM，将pH升到7.4，样品在速度为15,000xg下离心45分种，收集上清液。
合并来自其中一只母羊的上清液(乳清)以进行纯化，然后用2倍体积的5mM巴比妥盐、5mMNaCl稀释，上样到Heparin-Sepharose，按照Blckberg和Hernell(1981)描述的方法纯化BSSL。为了进一步纯化，从Heparin琼脂糖凝胶上收集的合并的蛋白质上Superdex 200大小排阻层析柱。
在Heparin-Sepharose上获得的分布型类似用天然BSSL以及在哺乳动物细胞中产生的重组全长BSSL的获得的分布型。将含有BSSL的部分收集在一起，在Superdex 200柱进行第二次层析。根据这次层析，鉴定出含有BSSL活性的两个主峰来，当这些峰用SDS-PAGE进行分析时，洗脱于约40分钟的峰作为一种蛋白质移动，该蛋白质与在哺乳动物细胞培养物中产生的重组BSSL有大约相同的表观分子量；而洗脱于50分钟的另一组分以一种相当小分子量蛋白质(大约80Kda)迁移，可能相应于内源性羊BSSL。与标准相比较两个条带都是模糊的，说明存在糖基化。
7．3 SDS-PAGE和蛋白质印迹
在Laemmli系统中用预制凝胶进行SDS-PAGE。用与抗完整蛋白质、氨基酸40-56、1-535和712-722的抗体以及抗该蛋白质重复部分的抗体进行蛋白质印迹分析。
用针对天然(全长)BSSL蛋白质的抗体进行蛋白质印迹分析，来分析乳汁样品。所有阳性乳汁样品可以观察到C-127产生的BSSL的分子量的位置显示出一条强带，而对照组缺乏此带。可得出结论，所述转基因羊在乳汁中以可容易检测到的水平表达人BSSL蛋白。
7．4羊乳中BSSL活性分析
所述乳清用H2O稀释50倍，活性检测按Blckberg等人(1995)所述方法进行。从泌乳第1周开始，每天对所有乳汁样品进行分析，而在泌乳期的其它时期每周仅分析1个乳汁样品(图4)。来自命名为60254的羊的9月9目的样品确实过高估计了，因为在该样品中难以测量体积。全部样品中用从60276号羊收集的样品获得最高值。
7．5 BSSL的功能特性
如Blackberg等人(1995)所描述的方法，进行蛋白酶抗性、pH稳定性、温度抗性和由胆汁盐活化的分析。对重组BSSL分析时，可以通常到在pH依赖性、温度稳定性、由胆汁盐活化和蛋白酶抗性方面没有差异。
7．6单糖组成
样品在SDS-凝胶电泳，并转移分离的蛋白质到PVDF膜上之后，膜用H2O洗涤，与浓度大约为500U/ml的神经氨酸酶(Sigma N-2133)一起在0.1M Tris,pH6.5中温育，目的是去掉末端唾液酸。为证实O-糖基化，分析与洋地黄毒苷标记花生凝集素(PNA)的反应(参见Strmqvist等人，1996)。
按照本领域已知的方法(Landberg等人，1997)，用气相色谱法和唾液酸测定法来研究单糖组成。
表Ⅳ显示了与在细胞培养物(CHO和C-127细胞)中产生的BSSL和在不同哺乳期的3个不同母亲提供的乳汁中分离的人类天然BSSL的3个不同样品(Landberg等人，1997)相比的、在转基因羊中产生的BSSL的单糖组成。所有天然BSSL的样品均含有岩藻糖，总单糖含量从19％-34％不等。相比之下，细胞培养物和从羊分离的重组BSSL不含岩藻糖，而唾液酸含量高。可以得出结论，得自转基因羊的人BSSL看来在单糖总含量(23％)和单糖组成方面均非常相似于细胞培养物产生的蛋白质。
生物材料的保藏
根据布达佩斯条约，已经将质粒pS452于1993年2月26日保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM7499。参考资料
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表Ⅰ
质粒pS452的特征
成分 片段的大小 位点 遗传标记
pUC 19  2.7 NotⅠ  ampR
鼠WAP,5’侧翼和5’非翻译区  4.1 NotⅠ/KpnⅠ
人BSSL结构基因  9.9 KpnⅠ/SalⅠ
鼠WAP，结构基因和3’侧翼  4.3 SalⅠ/NotⅠ
表Ⅱ
羊研究概述
周      活羔羊数 转基因羔羊数 ％转基因羔羊/活产羔羊
雄性 雌性   总计 雄性 雌性 总计
 1  16  18  34  2  0  2   5.9
 2  23  31  54  2  0  2   3.7
 3  17  23  40  3  2  5   12.5
 4  13  21  34  1  2  3   8.8
 5  12  17  29  1  0  1   3.4
总计  81  110  191  9  4  13   6.8
表Ⅲ
母羊-羔羊数据
羔羊   出生日期 诱导时的年龄 首次泌乳时的年龄
60276    11/4/1996  131天 151天
60284    13/4/1996  129天 149天
60254    2/4/1996  140天 160天
60257    5/4/1996  137天 157天
表Ⅳ
单糖组成
数值以根据氨基酸序列的BBSL总质量的％(质量)表示。
    Fuc     Gal    Man   GalNac   GlcNac  Neu5Ac    总计
  1      -     7.5   1.5     6.3     4.2     3.1     23
  2      -     5.4   0.55     3.5     1.8     8.9     20
  3      -     4.2   0.64     4.2     0.84     4.3     14
  4     5.5     11   0.36     1.7     7.8     1.8     29
  5     3.5     6.5   0.22     1.2     5.2     2.0     19
  6     3.7     12   0.48     1.7     12     3.2     34
  7 检测不到
列1：得自转基因羊的人BSSL2：在培养的C127细胞中产生的人BSSL3：在培养的CHO细胞中产生的人BSSL4：天然的人BSSL(个体1)5：天然的人BSSL(个体2)6：天然的人BSSL(个体3)7：在转基因小鼠中产生的人BSSL(参见Strmqvist等，1996)缩写：Fuc，岩藻糖；Gal，半乳糖；Man，甘露糖；GalNac,N-乙酰半乳糖胺；GlcNac,N-乙酰葡萄糖胺；Neu5Ac,5-Ac-神经氨酸
                                     序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人：
(A)姓名：ASTRA AB
(B)街道：vstra Mlarehamnen 9
(C)城市：Sdertlje
(D)国家：瑞典
(F)邮政编码(ZIP):s-15185
(G)电话：+46-8-55326000
(H)传真：+46-8-55328820(ⅱ)发明名称：表达方法(ⅲ)序列数目：4(2)SEQ ID NO:1信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：11531个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅵ)来源：
(A)生物体：Homo Sapiens
(F)组织类型：乳腺(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：连接点(1653...1727,4701...4221,4307...4429,4707...4904,6193...6323,
6501...6608,6751...6868,8335...8521,8719...8922,10124...10321,10650...11394)(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：成熟肽
(B)位置：连接点(1722...1727,4071...4221,4307...4429,4707...4904,6193...6323,
6501...6608,6751...6868,8335...8521,8719...8922,10124...10321,10650...11391)
(D)其它信息：/Ec-数=3.1.1.1
   /产物=“胆汁盐活化的脂肪酶”(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：5’UTR
(B)位置：1...1640(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：TATA-信号
(B)位置：1611...1617(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1641...1727(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：4071...4221(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：4307...4429(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：4707...4904(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：6139...6323(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：6501...6608(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：6751...6868(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：8335...8521(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：8719...8922(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：10124...10321(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：10650...11490(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：3’UTR
(B)位置：11491...11531(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GGATCCCTCG AACCCAGGAG TTCAAGACTG CAGTGAGCTA TGATTGTGCC ACTGCACTCT 60AGCCTGGGTG ACAGAGACCC TGTCTCAAAA AAACAAACAA ACAAAAAACC TCTGTGGACT 120CCGGGTGATA ATGACATGTC AATGTGGATT CATCAGGTGT TAACAGCTGT ACCCCCTGGT 180GGGGGATGTT GATAACGGGG GAGACTGGAG TGGGGCGAGG ACATACGGGA AATCTCTGTA 240ATCTTCCTCT AATTTTGCTG TGAACCTAAA GCTGCTCTAA AAATGTACAT AGATATAAAC 300TGGGGCCTTC CTTTCCCTCT GCCCTGCCCC AGCCCTCCCC CACCTCCTTC CTCTCCCTGC 360TGCCTCCCCT CTGCCCTCCC CTTTCCTCCT TAGCCACTGT AAATGACACT GCAGCAAAGG 420TCTGAGGCAA ATGCCTTTGC CCTGGGGCGC CCCAGCCACC TGCAGGCCCC TTATTTCCTG 480TGGCCGAGCT CCTCCTCCCA CCCTCCAGTC CTTTCCCCAG CCTCCCTCGC CCACTAGGCC 540TCCTGAATTG CTGGCACCGG CTGTGGTCGA CAGACAGAGG GACAGACGTG GCTCTGCAGG 600TCCACTCGGT CCCTGGCACC GGCCGCAGGG GTGGCAGAAC GGGAGTGTGG TTGGTGTGGG 660AAGCACAGGC CCCAGTGTCT CCTGGGGGAC TGTTGGGTGG GAAGGCTCTG GCTGCCCTCA 720CCCTGTTCCC ATCACTGCAG AGGGCTGTGC GGTGGCTGGA GCTGCCACTG AGTGTCTCGG 780TGAGGGTGAC CTCACACTGG CTGAGCTTAA AGGCCCCATC TGAAGACTTT GTTCGTGGTG                840TTCTTTCACT TCTCAGAGCC TTTCCTGGCT CCAGGATTAA TACCTGTTCA CAGAAAATAC                900GAGTCGCCTC CTCCTCCACA ACCTCACACG ACCTTCTCCC TTCCCTCCCG CTGGCCTCTT                960TCCCTCCCCT TCTGTCACTC TGCCTGGGCA TGCCCCAGGG CCTCGGCTGG GCCCTTTGTT                1020TCCACAGGGA AACCTACATG GTTGGGCTAG ATGCCTCCGC ACCCCCCCAC CCACACCCCC                1080TGAGCCTCTA GTCCTCCCTC CCAGGACACA TCAGGCTGGA TGGTGACACT TCCACACCCT                1140TGAGTGGGAC TGCCTTGTGC TGCTCTGGGA TTCGCACCCA GCTTGGACTA CCCGCTCCAC                1200GGGCCCCAGG AAAAGCTCGT ACAGATAAGG TCAGCCACAT GAGTGGAGGG CCTGCAGCAT                1260GCTGCCCTTT CTGTCCCAGA AGTCACGTGC TCGGTCCCCT CTGAAGCCCC TTTGGGGACC                1320TAGGGGACAA GCAGGGCATG GAGACATGGA GACAAAGTAT GCCCTTTTCT CTGACAGTGA                1380CACCAAGCCC TGTGAACAAA CCAGAAGGCA GGGCACTGTG CACCCTGCCC GGCCCCACCA                1440TCCCCCTTAC CACCCGCCAC CTTGCCACCT GCCTCTGCTC CCAGGTAAGT GGTAACCTGC                1500ACAGGTGCAC TGTGGGTTTG GGGAAAACTG GATCTCCCTG CACCTGAGGG GGTAGAGGGG                1560AGGGAGTGCC TGAGAGCTCA TGAACAAGCA TGTGACCTTG GATCCAGCTC CATAAATACC                1620CGAGGCCCAG GGGGAGGGCC ACCCAGAGGC TG ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG                  1673
                                Met Leu Thr Met Gly Arg Leu
                                -23         -20CAA CTG GTT GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC                  1721Gln Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala
-15                 -10                  -5GCG AAG GTAAGAGCCC AGCAGAGGGG CAGGTCCTGC TGCTCTCTCG CTCAATCAGA                   1777Ala Lys1TCTGGAAACT TCGGGCCAGG CTGAGAAAGA GCCCAGCACA GCCCCGCAGC AGATCCCGGG                1837CACTCACGCT CATTTCTATG GGGACAGGTG CCAGGTAGAA CACAGGATGC CCAATTCCAT                1897TTGAATTTCA GATAAACTGC CAAGAACTGC TGTGTAAGTA TGTCCCATGC AATATTTGAA                1957ACAAATTTCT ATGGGCCGGG CGCAGTGGCT CACACCTGCA ATCCCACCAG TTTGGGAGGC                2017CGAGGTGGGT GGATCACTTG AGGTCAGGAG TTGGAGACCA GCCTGGCCAA CATGGTGAAA                2077CCCCGTCTCT ACTAAAAATA CAAATATTAA TCGGGCGTGG TGGTGGGTGC CTGTAATCCC                2137AGCTACTCGG GAGGCTGAGG CAGGAGAACC GCTTGAAGCT GGGAGGTGGA GATTGCGGTG                2197AGCTGAGATC ACGCTACTGC ACTCCAGCCT GGGTGACAGG GCGAGACTCT GTCTCAAAAA                2257ATAGAAAAAG AAAAAAATGA AACATACTAA AAAACAATTC ACTGTTTACC TGAAATTCAA                2317ATGTAACTGG GCCTCTTGAA TTTACATTTG CTAATCCTGG TGATTCCACC TACCAACCTC                2377TCTGTTGTTC CCATTTTACA GAAGGGGAAA CGGGCCCAGG GGCAGGGAGT GTGGAGAGCA                2437GGCAGACGGG TGGAGAGAAG CAGGCAGGCA GTTTGCCCAG CATGGCACAG CTGCTGCCTC                2497CTATTCCTGT GCAGGAAGCT GAAAGCCGGG CTACTCCACA CCCGGCTCCC GGTCCCTCCA                2557GAAAGAGAGC CGGCAGGCAG GAGCTCTCTC GAGGCATCCA TAAATTCTAC CCTCTCTGCC            2617TGTGAAGGAG AAGCCACAGA AACCCCAAGC CCCACAGGAA GCCGGTGTCG GTGCCCGGCC            2677CAGTCCCTGC CCCCAGCAGG AGTCACACAG GGGACCCCAG ATCCCAACCA CGCTGTTCTG            2737CTGCCTGCGG TGTCTCAGGC CCTGGGGACT CCTGTCTCCA CCTCTGCTGC CTGCTCTCCA            2797CACTCCCTGG CCCTGGGACC GGGAGGTTTG GGCAGTGGTC TTGGGCTCCT GACTCAAAGG            2857AGAGGTCACC TTCTTCTTGG GCGAGCTCTT CTTGGGGTGC TGAGAGGCCT TCGGCAGGTC            2917ATCACGACCC CTCCCCATTT CCCCACCCTG AGGCCCTCTG GCCAGTCTCA ATTGCACAGG            2977GATCACGCCA CTGGCACAAG GAGACACAGA TGCCTCGCAG GGGATGCCCA CGATGCCTGC            3037ATGTGTTGCT TCTGGTTCCT TTCCTCCAGT TCCAACCGCC GCACTCTCCC ACACCAGTGT            3097GACAGGGGGC CCATCACCCT AGACTTCAGA GGGCTGCTGG GACCCTGGCT GGGCCTGGGG            3157GTGTAGGGCC ACCCTGCCCT TCCCCACCTG GAACCTGGCA CAGGTGACAG CCAGCAAGCA            3217ATGACCTGGT CCCACCATGC ACCACGGGAA GAGGGAGCTG CTGCCCAAGA TGGACAGGAG            3277GTGGCACTGG GGCAGACAGC TGCTTCTCAA CAGGGTGACT TCAAGCCCAA AAGCTGCCCA            3337GCCTCAGTTC CGTCAGGGAC AGAGGGTGGA TGAGCACCAA CCTCCAGGCC CCTCGTGGGG            3397GTGGACAGCT TGGTGCACAG AGGCCATTTT CATGGCACAG GGAAGCGTGG CGGGGGTGGG            3457AGGTGTGGTC CCTAGGGGGT TCTTTACCAG CAGGGGGCTC AGGAACTGTG GGGACTTGGG            3517CATGGGGCCA TCGACTTTGT GCCCAGCCAG CTAGGCCCTG TGCAGGGAGA TGGGAGGAGG            3577GAAAAGCAGG CCCCACCCCT CAGAAAGGAG GAAGGTTGGT GTGAAACATC CCGGGTACAC            3637TGAGCATTGG GTACACTCCT CCCGGGAGCT GGACAGGCCT CCCATGTGAT GGCAAACAGG            3697CCGACAGGAG ACACGGCTGT TGCTCGTCTT CCACATGGGG AAACTGAGGA TCGGAGTCAA            3757AGCTGGGCGG CCATAGCCAG AACCCAAACC TCCATCCCAC CTCTTGGCCG GCTTCCCTAG            3817TGGGAACACT GGTTGAACCA GTTTCCTCTA AGATTCTGGG AGCAGGACAC CCCCAGGGAT            3877AAGGAGAGGA ACAGGAATCC TAAAGCCCTG AGCATTGCAG GGCAGGGGGT GCTGCCTGGG            3937TCTCCTGTGC AGAGCTGTCC TGCTTTGAAG CTGTCTTTGC CTCTGGGCAC GCGGAGTCGG            3997CTTGCCTTGC CCCCTCCGGA TTCAGGCCGA TGGGGCTTGA GCCCCCCTGA CCCTGCCCGT            4057GTCTCCCTCG CAG CTG GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA               4106
           Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu
                     5                  10GGC GTC AAT AAG AAG CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC              4154Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe15                   20                  25                  30AAG GGC ATC CCC TTC GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG              4202Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln
             35                  40                  45CCA CAT CCT GGC TGG CAA   G GTGGGAGTGG GTGGTGCCGG ACTGGCCCTG                 4251Pro His  Pro Gly Trp Gln
          50CGGCGGGGCG GGTGAGGGCG GCTGCCTTCC TCATGCCAAC TCCTGCCACC TGCAG GG             4308
                                                         GlyACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC ACC ATC             4356Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala Thr Ile
 55                  60                  65ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC AAC ATT             4404Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile70                   75                  80                  85TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA  G GTCTGCCTCC CCTCTACTCC                    4449Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln
             90CCAAGGGACC CTCCCATGCA GCCACTGCCC CGGGTCTACT CCTGGCTTGA GTCTGGGGGC           4209TGCAAAGCTG AACTTCCATG AAATCCCACA GAGGCGGGGA GGGGAGCGCC CACTGCCGTT           4569GCCCAGCCTG GGGCAGGGCA GCGCCTTGGA GCACCTCCCT GTCTTGGCCC CAGGCACCTG           4629CTGCACAGGG ACAGGGGACC GGCTGGAGAC AGGGCCAGGC GGGGCGTCTG GGGTCACCAG           4689CCGCTCCCCC ATCTCAG  TC TCC CGG GAC CTG CCC GTT ATG ATC TGG ATC              4738
               Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile
                    95                 100TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT GGG GCC AAC TTC CTC             4786Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu105                 110                 115                 120AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC ACA CGC GGA AAC GTC             4834Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val
    125                         130                 135ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC CTT GGG TTC CTC AGC              4882Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser
        140                 145                 150ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA  G GTGCGTGGGT GCCTTCGGCC CTGAGGTGGG              4934Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro
    155GCGACCAGCA TGCTGAGCCC AGCAGGGAGA TTTTCCTCAG CACCCCTCAC CCCAAACAAC            4994CAGTGGCGGT TCACAGAAAG ACCCGGAAGC TGGAGTAGAA TCATGAGATG CAGGAGGCCC            5054TTGGTAGCTG TAGTAAAATA AAAGATGCTG CAGAGGCCGG GAGAGATGGC TCACGCCTGT            5114AATCCCAGCA CTTTAGGAGG CCCACACAGG TGGGTCACTT GAGCGCAGAA GTTCAAGACC            5174AGCCTGAAAA TCACTGGGAG ACCCCCATCT CTACACAAAA ATTAAAAATT AGCTGGGGAC            5234TGGGCGCGGC GGCTCACCTC TGTAATCCCA GCACGTTGGG AGCCCAAGGT GGGTAGATCA            5294CCTGAGGTCA GGAGTTTGAG ACCAGCCTGA CTAAAATGGA GAAACCTCTT CTCTACTAAA            5354AATACAAAAT TAGCCAGGCG TGGTGGCGCT TGCCTGTAAT CCCAGCTACT CGGGAGGCTG            5414AGGCAGGAGA ATCGCTTGAA CTCAGGAGGC GGAGGTTGCG GTGAGCCGAG ATCATGCCAC            5474TGCACTCCAG CCTGGAGAAC AAGAGTAAAA CTCTGTCTCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA            5534ATAGCCAGGC GTGGTATCTC ATGCCTCTGT CCTCAGCTAC CTGGGAGGCA GAGGTGGAAG            5594GATCGCTTGA GCCCAGGGGT TCAAAGCTGC AGTGAGCCGT GGTCGTGCCA CTGCACTCCA       5654GCCTGGGCGA CAGAGTGAGG CCCCATCTCA AAAATAAGAG GCTGTGGGAC AGACAGACAG       5714GCAGACAGGC TGAGGCTCAG AGAGAAACCA GGAGAGCAGA GCTGAGTGAG AGACAGAGAA       5774CAATACCTTG AGGCAGAGAC AGCTGTGGAC ACAGAAGTGG CAGGACACAG ACAGGAGGGA       5834CTGGGGCAGG GGCAGGAGAG GTGCATGGGC CTGACCATCC TGCCCCCGAC AAACACCACC       5894CCCTCCAGCA CCACACCAAC CCAACCTCCT GGGGACCCAC CCCATACAGC ACCGCACCCG       5954ACTCAGCCTC CTGGGACCCA CCCACTCCAG CAACCAACGT GACCTAGTCT CCTGGGACCC       6014ACCCCCTCCA GCACCCTACC CGACCCAGCT TCTTAGGGAC CCACCATTTG CCAACTGGGC       6074TCTGCCATGG CCCCAACTCT GTTGAGGGCA TTTCCACCCC ACCTATGCTG ATCTCCCCTC       6134CTGGAGGCCA GGCCTGGGCC ACTGGTCTCT AGCACCCCCT CCCCTGCCCT GCCCCCAG  GT     6l94
                                                             Gly
                                                             160AAC TAT GGC CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG         6242Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln his Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
            165                 170                 175AAT ATC GCG GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG         6290Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                  190GAG TCT GCT GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG GTCTCGGGAT CCCTGTGGGG       6343Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln
    195                 200AGGGCCTGCC CCACAGGTTG AGAGGAAGCT CAAACGGGAA  GGGGAGGGTG GGAGGAGGAG      6403CGTGGAGCTG GGGCTGTGGT GCTGGGGTGT CCTTGTCCCA  GCGTGGGGTG GGCAGAGTGG      6463GGAGCGGCCT TGGTGACGGG ATTTCTGGGT CCCGTAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC        6518
                                     Thr Leu Ser Pro Tyr Asn
                                         205AAG GGC CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT         6566Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser210                 215                 220                 225CCC TGG GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG                 6608Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys
            230                 235GTAAACGGAG GAGGGCAGGG CTGGGCGGGG TGGGGGCTGT CCACATTTCC GTTCTTTATC       6668CTGGACCCCA TCCTTGCCTT CAAATGGTTC TGAGCCCTGA GCTCCGGCCT CACCTACCTG       6728CTGGCCTTGG TTCTGCCCCC AG GTG GCT GAG AAG GTG GGT TGC CCT GTG GGT        6780
                     Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly
                     240                 245GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG GTT ACT GAT CCC CGA GCC         6828Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala250                 255                  260                265CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA GGC CTG GAG   T GTGAGTAGCT      6878Leu Thr Leu Ala Tyr LVs Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu
            270                 275GCTCGGGTTG GCCCATGGGG TCTCGAGGTG GGGGTTGAGG GGGGTACTGC CAGGGAGTAC      6938TCCGGAGGAG AGAGGAAGGT GCCAGAGCTG CGGTCTTGTC CTGTCACCAA CTAGCTGGTG      6998TCTCCCCTCG AAGGCCCCAG CTGTAAGGGA GAGGGGGTGC CGTTTCTTCT TTTTTTTTGA      7058GATGGAGTCT CACTGTTGCC CAGGCTGGAG TGCAGTGTCA CGATCTCAGC TCACTGCAAC      7118CTCCACCTCC TGGGTTCAAG TGATTCTCTG ACTCAACCTC CCATGTAGCT GGGACTACAG      7178GCACATGCCA CCATGCCCAG ATAATTTTTC TGTGTGTTTA GTAGGGATGG AGTTTCATCG      7238TGTTAGCTAG GATGATCTCG GTCTTGGGAC CTCATGATCT GCCCACCTCG GCCTCCCAAA      7298GTGCTGGAAT TACAGGCGTG AGCCACTGTG CCCGGCCCCT TCTTTATTCT TATCTCCCAT      7358GAGTTACAGA CTCCCCTTTG AGAAGCTGAT GAACATTTGG GGCCCCCTCC CCCACCTCAT      7418GCATTCATAT GCAGTCATTT GCATATAATT TTAGGGAGAC TCATAGACCT CAGACCAAGA      7478GCCTTTGTGC TAGATGACCG TTCATTCATT CGTTCATTCA TTCAGCAAAC ATTTACTGAA      7538CCGTAGCACT GGGGCCCAGC CTCCAGCTCC ACTATTCTGT ACCCCGGGAA GGCCTGGGGA      7598CCCATTCCAC AAACACCTCT GCATGTCAGC CTTACCAGCT TGCTACGCTA AGGCTGTCCC      7558TCACTCATTC TTCTATGGCA ACATGCCATG AAGCCAAGTC ATCTGCACGT TTACCTGACA      7718TGAGCTCAAC TGCACGGGCT GGACAAGCCC AAACAAAGCA ACCCCCACGG CCCCGCTAGA      7778AGCAAAACCT GCTGTGCTGG GCCCAGTGAC AGCCAGGCCC CGccTGCCTC AGCAGCCACT      7838GGGTCCTCTA GGGGCCCGTC CAGGGGTCTG GAGTACAATG CAGACCTCCC ACCATTTTTG      7898GCTGATGGAC TGGAACCCAG CCCTGAGAGA GGGAGCTCCT TCTCCATCAG TTCCCTCAGT      7958GGCTTCTAAG TTTCCTCCTT CCTGCTTCAG GCCCAGCAAA GAGAGAGAGG AGAGGGAGGG      8018GCTGCCGCTG AAGAGGACAG ATCTGGCCCT AGACAGTGAC TCTCAGCCTG GGGACGTGTG      8078GCAGGGCCTG GAGACATCTG TGATTGTCAC AGCTGGGGAG GGGGTGCTCC TGGCACCTCG      8138TGGGTCGAGG CCGGGGATGC TCTAAACATC CTACAGGGCA CAGGATGCCC CTGATGGTGC      8198AGAATCAACC CTGCCCCAAG TGTCCATAGA TCAGAGAAGG GAGGACATAG CCAATTCCAG      8258CCCTGAGAGG CAAGGGGCGG CTCAGGGGAA ACTGGGAGGT ACAAGAACCT GCTAACCTGC      8318TGGCTCTCCC ACCCAG  AC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT          8366
              Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro
                  280                 285GTC ATT GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC        8414Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala290                 295                 300                 305AAC GCC GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC        8462Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly
            310                 315                 320CAC ATC TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG        8510His IlePhe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys
       325                 330                 335AAA GTC ACG  GA  GTAAGCAGGG GGCACAGGAC TCAGGGGCGA CCCGTGCGGG           8561Lys Val Thr  Glu
    340AGGGCCGCCG GGAAAGCACT GGCGAGGGGG CCAGCCTGGA GGAGGAAGGC ATTGAGTGGA     8621GGACTGGGAG TGAGGAAGTT AGCACCGGTC GGGGTGAGTA TGCACACACC TTCCTGTTGG     8681CACAGGCTGA GTGTCAGTGC CTACTTGATT CCCCCAG G GAG GAC TTC TAC AAG        8734
                                       Glu Asp phe Tyr Lys
                                                   345CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG       8782Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr
        350                 355                 360ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG       8830Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu
    365                 370                 375AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG       8878Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu
380                 385                 390GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG CAC AGA GCC AAT GCC  AA           8922Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala  Lys395                 400                 405GTGAGGATCT GGGCAGCGGG TGGCTCCTGG GGGCCTTCCT GGGGTGCTGC ACCTTCCAGC     8982CGAGGCCTCG CTGTGGGTGG CTCTCAGGTG TCTGGGTTGT CTGGGAAAGT GGTGCTTGAG     9042TCCCCACCTG TGCCTGCCTG ATCCACTTTG CTGAGGCCTG GCAAGACTTG AGGGCCTCTT     9102TTTACCTCCC AGCCTACAGG GCTTTACAAA CCCTATGATC CTCTGCCCTG CTCAGCCCTG     9162CACCCCATGG TCCTTCCCAC TGGAGAGTTC TTGAGCTACC TTCCATCCCC CATGCTGTGT     9222GCACTGAGAG AACACTGGAC AATAGTTTCT ATCCACTGAC TCTTATGGGC CTCAACTTTG     9282CCCATAATTT CAGCCCACCA CCACATTAAA AATCTTCATG TAATAATAGC CAATTATAAT     9342AAAAAATAAG GCCAGACACA GTAGCTCATG CCTGTAATCC CAGCACATTG GGAGGTCAAG     9402GTGGGAGGAT CACTTGAGGT CAGGAGTCTG AGACTAGTCT GGCCAACATG GCAAAACCCC     9462ATCTCTACTA AAAATACAAA AATTATCCAG GCATGGTGGT GCATGCCTAT AATCCTAGCT     9522ACTCAGGAGG CTGAGGTAGC AGAATTGATT GACCCAGGGA GGTGGAGGTT GCAGTGAGCC     9582GAGATTACGC CACTGCACTC CAGCAGGGGC AACAGAGTGA GACTGTGTCT CGAATAAATA     9642AGTAAATAAA TAATAAAAAT AAAAAATAAG TTAGGAATAC GAAAAAGATA GGAAGATAAA     9702AGTATACCTA GAAGTCTAGG ATGAAAGCTT TGCAGCAACT AAGCAGTACA TTTAGCTGTG     9762AGCCTCCTTT CAGTCAAGGC AAAAAGGGAA ACAGTTGAGG GCCTATACCT TGTCCAATCT     9822AATTGAAGAA TGCACATTCA CTTGGAGAGC AAAATATTTC TTGATACTGA ATTCTAGAAG     9882GAAGGTGCCT CACAATGTTT TGTGGAGGTG AAGTATAAAT TCAGCTGAAA TTGTGGAACC     9942CATGAATCCA TGAATTTGGT TCTCAGCTTT CCCTTCCCTG GGTGTAAGAA GCCCCATCTC    10002TTCATGTGAA TTCCCCAGAC ACTTCCCTGC CCACTGCCCG GGACCTCCCT CCAAGTCCGG    10062TCTCTGGGCT GATCGGTCCC CAGTGAGCAC CCTGCCTACT TGGGTGGTCT CTCCCCTCCA    10122G G AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC CAT CCC TCT CGG ATG      10169
Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met
410                 415                 420CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT GCA GAT GAC ATT CAG      10217Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln425                 430                 435                 440TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG GGC TAC CGG CCC CAA      10265Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln
            445                 450                 455GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC TGG ACC AAC TTT GCC      10313Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr TrP Thr Asn Phe Ala
        460                 465                 470AAA ACA  GG  GTAAGACGTG GGTTGAGTGC AGGGCGGAGG GCCACAGGCG             10361Lys Thr  Gly
     475AGAAGGGCCT CCCACCACGA GGCCTTGTTC CCTCATTTGC CAGTGGAGGG ACTTTGGGCA    10421AGTCACTTAA CCTCCCCCTG CATCGGAATC CATGTGTGTT TGAGGATGAG AGTTACTGGC    10481AGAGCCCCAA GCCCATGCAC GTGCACAGCC AGTGCCCAGT ATGCAGTGAG GGGCATGGTG    10541CCCAGGGCCA GCTCAGAGGG CGGGGATGGC TCAGGCGTGC AGGTGGAGAG CAGGGCTTCA    10601GCCCCCTGGG AGTCCCCAGC CCCTGCACAG CCTCTTCTCA CTCTGCAG G GAC CCC       10656
                                                   Asp  ProAAC ATG GGC GAC TCG GCT GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG      10704Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr
    480                 485                 490GAA AAC AGC GGC TAC CTG GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC      10752Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Mer Gly Ser Ser Ser
495                 500                 505ATG AAG CGG AGC CTG AGA ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC      10800Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr5l0                 515                 520                 525TAT CTG GCG CTG CCC ACA GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC      10848Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro
            530                 535                 540CCC ACA GGG GAC TCC GAG GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC     10896Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
         545                550                 555GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG     10944Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
    560                 565                 570CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC     10992Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
575                 580                 585TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC     11040Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro590                 595                 600                 605GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT     11088Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
            6l0                     615             620GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC              11136Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro
        625                 630                  635CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG              11184Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr
    640                 645                 650GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC              11232Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
655                 660                 665CCC CCC GTG ACC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC              11280Pro Pro Val Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro670                 675                 680                 685ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG              11328Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu
            690                 695                 700GCT GCC CCT GTG CCC CCC ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT              11376Ala Ala Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro
        705                 710                 715GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT              11431Ala Val Ile Arg Phe
    720GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTG            11491TCGGTGTCTT TCTTTGCTCC CAAGGCTAAG CTGCAGGATC                                  11531(2)SEQ ID NO:2信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：2428个碱基对(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性（ⅱ)分子类型：cDNA(ⅵ)来源：
(A)生物体：Homo sapiens
(B)组织类型：乳腺(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：82...2319
(D)其它信息：/产物=“胆汁盐活化的脂肪酶”(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：985...1173(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1174...1377(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1378...1575(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1576...2415(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：成熟肽
(B)位置：151...2316(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：polyA-信号
(B)位置：2397...2402(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复区域
(B)位置：1756...2283(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：5’UTR
(B)位置：1...81(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：1756...1788(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：1789...1821(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：1822...1854(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：1855...1887(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：1888...1920(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：1921...1953(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：重复单位
      (B)位置：1954...1986(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：1987...2019(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：2020...2052(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：2053...2085(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：2086...2118(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：2119...2151(ⅰⅹ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：2152...2184(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：2185...2217(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：2218...2250(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：重复单位
(B)位置：2251...2283(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO:2:ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG       60AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT        111
                    Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val
                    -23         -20                 -15GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG        l59Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu
        -10                  -5                   1GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG        207Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly GLy Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys
  5                  10                  15CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC        255Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe20                   25                  30              35GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG        303Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu ASn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp
             40                  45                  50CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC        351Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala
         55                  60                  65ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC        399Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu
     70                  75                  80AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC        457Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys G1n Val Ser Arg Asp Leu gro
 85                  90                  95GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT        495Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His100                 105                 110                 115GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC        543Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly G1u Glu Ile Ala
            120                 125                 130ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC        591Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro
        135                 140                 145CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC       639Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly
    150                 155                 160CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG       687Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala
165                 170                 175GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT       735Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala180                 185                 190                 195GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC       783Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly
            200                 205                 210CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG       831Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp
        215                 220                 225GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG       879Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys
    230                 235                 240GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG       927Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys
245                 250                 255GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA       975Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala260                     265             270                 275GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT      1023Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile
            280                 285                 290GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC      1071Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala
        295                 300                 305GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC      1119Ala Asp Ile Asp Tyr lle Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile
    310                 315                 320TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC      1167Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val
325                 330                 335ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG      1215Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys340                 345                 350                 355GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG      1263Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp
            360                 365                 370GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT      131lAla Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe
        375                 380                 385GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG      1359Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln
    390                 395                         400CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC       1407Mis Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser
405                 410                 415CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT       1455His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His420                 425                 430                 435GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG       1503Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr
            440                 445                 450GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC       1551Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr
        455                 460                 465TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT       1599Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala
    470                 475                 480GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG       1647Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu
485                 490                 495GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA       1695Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg500                 505                 510                 515ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA       1743Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr
            520                 525                 530GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG       1791Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu
        535                 540                 545GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG       1839Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro
    550                 555                 560CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC       1887Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
565                 570                 575GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG       1935Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val580                 585                 590                 595CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC       1983Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
            600                 605                 610TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC       2031Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr GlY Asp Ser Gly Ala Pro Pro
        615                 620                 625GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT       2079Val Pro Pro Thr Gly Asp Sar Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
    630                 635                 640GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC       2127Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro
645                 650                 655CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG ACC CCC ACG       2175Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Thr Pro Thr660                 665                 670                 675GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC       2223Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
            680                 685                 690CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG GCT GCC CCT GTG CCC CCC       2271Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro Val Pro Pro
        695                 700                 705ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA2326Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe
    710                 715                 720TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA     2386GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTA AAAAAAAAAA AA                        2428(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：745个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys-23         -20                 -15                 -10Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu
     -5                   1               5Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp10                  15                  20                   25Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala
             30                  35                  40Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala
        45                  50                  55Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser
    60                  65                  70Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln
75                  80                   85Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr90                  95                  100                 l05Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn
            110                 115                 120Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile
        125                 130                 135Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu GlY Phe Leu Ser Thr
    140                 145                 150Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met
155                 160                 165Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro170                 175                 180                 185Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser
            190                 195                 200Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile
        205                210                  215Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro
    220                 225                 230Leu Phe Trlp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly
235                  240                 245Asp AIa Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala250                 255                 260                 265Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met
            270                 275                 280Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro
        285                 290                 295Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile
    300                 305                 310Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met
315                 320                 325Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr330                 335                 340                 345Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys
            350                 355                 360Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln
        365                 370                 375Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val AsP Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe
    380                 385                 390Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys
395                 400                 405Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro410                 415                 420                 425Val Tyr Pro Lys Trp Val GIy Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr
            430                 435                 440Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp
        445                 450                 455Arg Thr Val Ser Gys Ala Met Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys
    460                 465                 470Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu
475                 480                 485Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly TYr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met490                 495                 500                 505Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Ash Phe Leu Arg Tyr
            510                 515                 520Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala
            525             530                 535Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro
    540                 545                 550Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
555                 560                 565Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro570                 575                 580                 585Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
            590                 595                 600Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
        605                 610                 615Pro Pro Thr Gly AsP Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
    620                 625                  630Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro
635                 640                 645Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly650                 655                 660                 665Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala
            670                 675                 680Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
        685                 690                 695Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu
    700                 705                 710Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe
715                 720(2)SEQ ID NO:4信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：722个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1               5                   10                  15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
        20                  25                  30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
    35                  40                  45Pro GlY Trp Gln GlY Thr Leu Gya Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50                  55                  60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65                   70                  75                  80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
            85                  90                  95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala phe Leu Met G1y
        100                 105                 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
    115                 120                 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130                 135                 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145                 150                 155                 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
            165                 170                 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Sar Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
    195                 200                 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210                 2l5                 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225                 230                 235                 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
            245                 250                 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
        260                 265                 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
    275                 280                 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290                 295                 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305                 310                 315                 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
            325                 330                 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
        340                 345                 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
    355                 360                 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370                 375                 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385                 390                 395                 400Leu Ala Gln Mis Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
            405                 410                 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
        420                 425                 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
    435                 440                 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450                 455                 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465                 470                 475                 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
            485                 490                 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
        500                 505                 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
    515                 520                 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly
530                 535                 540Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala545                 550                 555                 560Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
            565                 570                 575Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
        580                 585                 590Pro Pro Val pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro
    595                 600                 605Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
610                 615                 620Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro625                 630                 635                 640Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
            645                 650                 655Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
        660                 665                 670Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
    675                 680                 685Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro
690                 695                 700Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile705                 710                 715                 720Arg Phe

Claims (41)

1．由转基因非人类哺乳动物产生的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，所述脂肪酶至少5％糖基化。
2．按照权利要求1的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，其中所述转基因非人类哺乳动物是有胎盘哺乳动物。
3．按照权利要求1的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，其中所述转基因非人类哺乳动物是有蹄类哺乳动物。
4．按照权利要求1-3中任一项的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，其总单糖含量为10％以上。
5．按照权利要求4的重组人类被子胆汁盐激活的脂肪酶，包含至少1％N-乙酰半乳糖胺。
6．按照权利要求1-5中任一项的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，包含下列单糖组成：0-6％岩藻糖，3-12％半乳糖，0.1-2％甘露糖，1-7％N-乙酰半乳糖胺，0.5-15％N-乙酰葡萄糖胺，和1.5-10％5-Ac-神经氨酸。
7．按照权利要求6的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，包含下列单糖组成：0-1％岩藻糖，6.5-8.5％半乳糖，1-2％甘露糖，5.5-7％N-乙酰半乳糖胺，3.5-5％N-乙酰葡萄糖胺，和2.5-4％5-Ac-神经氨酸。
8．按照权利要求7的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，包含下列单糖组成：7.5％半乳糖，1.5％甘露糖，6.3％N-乙酰半乳糖，4.2％N-乙酰葡萄糖胺，和3.1％5-Ac-神经氨酸。
9．按照权利要求1-8中任一项的重组胆汁盐活化的脂肪酶，其氨基酸序列基本如在序列表中SEQ ID NO:3所公布。
10．按照权利要求1-8中任一项的重组胆汁盐活化的脂肪酶，其氨基酸序列在序列表中公布于SEQ ID NO:4。
11．按照权利要求1-8中任一项的重组胆汁盐活化的脂肪酶，包含功能上由序列表中的SEQ ID NO:3构成的氨基酸序列。
12．按照权利要求1-8中任一项的重组胆汁盐活化的脂肪酶，包含功能上由序列表中的SEQ ID NO:4组成的氨基酸序列。
13．转基因羊，其生殖细胞和体细胞含有重组核苷酸分子，所述重组核苷酸分子是胚胎阶段被导入所述羊或所述羊的祖先；所述的重组核苷酸分子包含(ⅰ)一段编码胆汁盐活化的人脂肪酶的核苷酸序列和(ⅱ)一个有效地连接到编码胆汁盐活化的人脂肪酶的所述核苷酸序列上的启动子。
14．按照权利要求13的转基因羊，其中编码胆汁盐活化的脂肪酶的所述核苷酸序列来自质粒pS452携带的一段核苷酸序列，所述质粒由保藏号DSM7499鉴定。
15．按照权利要求13的转基因羊，其中编码胆汁盐活化的脂肪酶的所述核苷酸序列来自序列表的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中公布的一段核苷酸序列。
16．按照权利要求13的转基因羊，其中编码胆汁盐活化的脂肪酶的所述核苷酸序列是来自序列表的SEQ ID NO:3或4中公布的、编码多肽的一段核苷酸序列。
17．按照权利要求13的转基因羊，其中编码胆汁盐活化的脂肪酶的所述核苷酸序列是来自在严格条件下与权利要求15或16中限定的任一序列杂交的一段核苷酸序列。
18．按照权利要求13的转基羊，其中所述启动子是一种乳汁蛋白启动子。
19．按照权利要求18的转基羊，其中所述启动子是β-乳球蛋白启动子。
20．按照权利要求13-19中任一项的雌性转基因羊，其中编码被胆汁活化的脂肪酶的所述核苷酸序列是在所述雌性转基因羊的乳腺中得到表达，并且其中胆汁盐活化的脂肪酶是存在于所述雌性转基因羊的乳汁中。
21．按照权利要求20的雌性转基因羊的产生方法，包括：
(a)提供有效地连接到在羊中有功能的启动子、编码胆汁盐活化的人脂肪酶的基因；
(b)将所述基因导入到羊的胚胎或羊的受精卵中，以便整合所述基因进入到所述羊的生殖系中；
(c)将所述胚胎或受精卵移植入拟妊娠的受体羊；
(d)让所述受体羊繁殖后代；
(e)选择一只在乳汁中产生可回收量的胆汁盐活化的脂肪酶的雌性后代羊。
22．胆汁盐活化的人脂肪酶的生产方法，包括：
(a)在按照权利要求20所定义的雌性转基因羊中产生乳汁；
(b)收集步骤(a)所产生的乳汁；以及可选地
(c)分离所述胆汁盐活化的脂肪酶。
23．胆汁盐活化的人脂肪酶的生产方法，包括：
(a)提供有效地连接到在羊中有功能的启动子、编码胆汁盐活化的人脂肪酶的基因；
(b)将所述基因导入到羊的胚胎或受精卵中，以便整合所述基因到所述羊的生殖系中；
(c)将所述胚胎或受精卵移植到拟妊娠的受体羊中；
(d)让所述受体羊繁殖后代；
(e)选择一只在乳汁中产生可回收量的胆汁盐活化的脂肪酶的雌性后代羊；
(f)收集在步骤(e选择的雌性羊产生的乳汁；以及可选地
(g)分离所述胆汁盐活化的脂肪酶。
24．按照权利要求21或23的方法，其中编码胆汁盐活化的脂肪酶的所述基因的核苷酸序列选自：
(a)由质粒pS452携带的核苷酸序列，所述质粒由保藏号DSM7499鉴定；
(b)在序列表中公布于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的一段核苷酸序列；
(c)在序列表中公布于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的编码多肽的核苷酸序列；
(d)在严格杂交条件下同在(a)、(b)或(c)中定义的任一序列杂交的核苷酸序列。
25．按照权利要求21、23或24的方法，其中所述启动子是乳汁蛋白启动子。
26．按照权利要求25的方法，其中所述启动子是β-乳球蛋白启动子。
27．可用按照权利要求22-26中任一项的方法得到的重组胆汁盐活化的人脂肪酶。
28．按照权利要求27的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，所述脂肪酶至少5％被糖基化。
29．按照权利要求27的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，所述酶的总单糖含量为10％以上。
30．按照权利要求27的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，包含至少1％N-乙酰半乳糖胺。
31．按照权利要求27的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，包含下列单糖组成：0-6％岩藻糖，3-12％半乳糖，0.1-2％甘露糖，1-7％N-乙酰半乳糖胺，0.5-15％N-乙酰葡萄糖胺，和1.5-10％5-Ac-神经氨酸。
32．按照权利要求31的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，包含下列单糖组成：0-1％岩藻糖，6.5-8.5％半乳糖，1-2％甘露糖，5.5-7％N-乙酰半乳糖胺，3.5-5％N-乙酰葡萄糖胺，和2.5-4％5-Ac-神经氨酸。
33．按照权利要求32的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，包含下列单糖组成：7.5％半乳糖，1.5％甘露糖，6.3％N-乙酰半乳糖胺，4.2％N-乙酰葡萄糖胺，和3.1％5-Ac-神经氨酸。
34．按照权利要求27-33中任一项的重组胆汁盐活化的人脂肪酶，所述酶的氨基酸序列基本如序列表中SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所公布。
35．药物制剂，包含按照权利要求1-12中任一项的胆汁盐活化的脂肪酶以及一种或多种药学上可接受的载体。
36．按照权利要求1-12中任一项的胆汁盐活化的脂肪酶的用途，即用于生产与外分泌性胰腺机能不全相关病征的治疗药物。
37．按照权利要求36的用途，其中所述外分泌性胰腺机能不全是由囊性纤维化引起的结果。
38．按照权利要求1-12中的任一项的胆汁盐活化的脂肪酶的用途，即用于生产改善早产新生儿饮食中脂质利用的药物。
39．治疗与外源性胰腺机能不全相关的病征的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物包括人有效量的按照权利要求1至12中任一项的胆汁盐活化的脂肪酶。
40．按照权利要求39的方法，其中所述外分泌性胰腺机能不全是囊性纤维化的结果。
41．改善早产新生儿饮食中脂质利用的方法，所述方法包括给予需要这种改善的早产新生儿有效量的按照权利要求1-12中任一项的胆汁盐活化的脂肪酶。
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