CN1914324A - 利用同源重组的牛β－酪蛋白基因靶向载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种牛β－酪蛋白基因靶向的载体，包括(1)具有5至12kb长度的第一区域，该区域和牛β－酪蛋白基因的启动子和侧翼核酸序列同源，并包含牛β－酪蛋白基因的外显子1、内含子1和外显子2；(2)用于克隆编码目的蛋白质的核酸的区域；(3)编码正选择标记的区域；(4)具有2.8至3.5kb长度的第二区域，该区域和牛β－酪蛋白基因的核酸序列同源，并包含牛β－酪蛋白基因外显子5、6、7和8，以及内含子5、6和7；其中，按照牛β－酪蛋白基因5’－3’的排列方向，和第一区域相应的核酸序列位于和第二区域相应的核酸序列的上游。本发明还涉及生产转基因牛的方法，所述的转基因牛使用上述携带编码目的蛋白基因的载体进行牛β－酪蛋白基因靶向，并从上述转基因牛的牛奶中获得大量的目的蛋白质。

Description

利用同源重组的牛β-酪蛋白基因靶向载体
技术领域
本发明涉及通过同源重组而实现其功能的牛β-酪蛋白基因靶向载体、利用该载体基因靶向的牛体细胞和用该牛体细胞进行核移植的胚胎。本发明还涉及到，从植入上述胚胎而制备的转基因牛的牛奶中生产大量目标蛋白的方法。
背景技术
我们在鉴定动物基因组的基因和其功能方面的不断努力，使得产生转基因动物成为可能。转基因动物已经在工业生产中创造了巨大的市场价值，比如在生物医学和农业等方面。还发展了各种制备转基因动物或者所谓的遗传改良动物的技术，例如显微注射、病毒转染、精子载体、胚胎干细胞(ES)应用和体细胞核移植(SNCT)。
显微注射方法就是将一段DNA分子注射到雄性或者雌性受精卵原核(Harbers等人，Nature.，293(5833)；540-2，1981；Brinster等人，Cell.，27；223-231，1981；Gordon等人，Proc Natl Acad Sci USA.，77(12)；7380-7384；Costantini等人，Nature.，294(5836)；92-94)，该方法已经被广泛应用于生产转基因动物。(Hammer等人，Nature.，315(6021)；680-683，1985；van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002；Damak等人，Biotechnology(NY)，14(2)；185-186，1996)。然而，该技术生产转基因动物的效率却很低，只有2-3％的被注射的卵细胞能够产生转基因后代(Clark等人，Transgenic Res.，9；263-275，2000)。使用显微注射方法生产转基因动物也是一种非常消耗劳力并且昂贵的生产程序，需要大量的实验动物和生产设备(Brink等人，Theriogenology，53；139-148，2000)。该技术另一不足之处是，它不能控制转入基因的整合位点和拷贝数目，这种随机的整合有时会导致转基因的低效或者非特异性表达。甚至有报道说某些转基因的这种非调控式表达有时会导致胚胎发育中致死现象(Wei等人，Annu Rev Pharmacol Toxicol.，37；119-141，1997)。
逆转录病毒介导方法也广泛应用于动物的遗传操作(Soriano等人，Genes Dev.，1(4)；366-375，1987；Hirata等人，Cloning Stem Cells.，6(1)；31-36，2004)。基于该技术，目标基因序列通过病毒介导载体引进动物的基因组。虽然病毒转化比原核注射的效率高，但是由于多重整合会导致外源基因的随机插入和镶嵌插入(Piedrahita等人，Theriogenology，53(1)；105-116，2000)。另外，转入基因的最大长度通常限制在约7kb，还存在病毒编码的蛋白引起的潜在干扰因素(Wei等人，Annu Rev Pharmacol Toxicol.，37；119-141，1997；Yanez等人，Gene Ther.，5(2)；149-159，1998)。
为了解决上面提到的问题，我们研发了一种基因靶向技术，该技术能够在特异位点插入或者去除一段DNA片段。基因靶向技术首先应用于老鼠的胚胎干细胞基因功能研究。老鼠胚胎干细胞目前正被用于进行胚胎预定遗传修饰。通过使用这种技术操作鼠胚胎干细胞，产生了很多特异基因靶向的老鼠(Brandon等人，Curr Biol.，5(6)；625-634，1995；Capecchi等人，Science，244(4910)；1288-1292，1989；Thompson等人，Cell，56(2)；313-321，1989；Hamanaka等人，Hum Mol Genet.，9(3)；353-361，2000；Thomas et al，Cell，51(3)；503-512，1987；te Riele等人，Proc Natl Acad Sci USA，89(11)；5182-5132，1992；Mansour等人，Nature，336(6197)，348-352，1988；Luo等人，Oncogene，20(3)；320-328，2001)。将这种基因靶向技术推广到其它的哺乳动物，尤其是牲畜，可能带来巨大的生物医学效益，例如大规模生产药用蛋白质和动物疾病模型。
至今，大部分重组治疗性蛋白质是利用细胞，例如酵母、细菌和动物细胞，通过细胞培养系统产生的。然而，由于生产量和高成本限制，很难用细胞培养系统大规模的生产这些蛋白质。而且，对于某些蛋白质还需要额外的步骤进行适当的翻译后的修饰，例如糖基化、γ-羧基化作用、羟基化作用等等(Houdebine等人，Transgenic Res.，9(4-5)；305-320，2000；Lubo等人，Transgenic Res.，9(4-5)；301-304，2000)。
能生产有价值的或治疗性的蛋白质的动物生物反应器已经被认为是一种有效的、成本效益高的表达系统。尤其是从转基因动物体内大规模生产治疗性重组蛋白质，要比从细胞培养系统生产更划算(van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。大家公认，在动物乳液中产生的重组蛋白经过了类似于人体内相应蛋白质的翻译后的修饰作用(Edmunds等人，Blood，91(12)；4561-4571，1998；Velander等人，Proc Natl Acad SciUSA.，89(24)；12003-12007，1992；van Berkel et al，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。
牛奶包含约88％的水、3.3％蛋白质、其余为碳水化合物和脂肪。酪蛋白构成了80％的牛奶蛋白质，酪蛋白分成四类：αS1、αS2、β和κ酪蛋白。牛奶中β-酪蛋白含量最高，用浓度表达，在牛奶中的含量达到10mg/ml(Brophy等人，Nat Biotechnology.，21(2)；157-162，2003)。
体细胞核移植技术(SCNT)生产转基因动物比显微注射方法更为有效，因为几乎所有的源于转化体细胞的克隆动物都是转基因动物(Brink等人，Theriogenology，53；139-148，2000)。该技术还能够预先确定动物的性别并且形成遗传纯合的牧群来生产相同产物。(Lubo等人，Transgenic Res.，9(4-5)；301-304，2000；van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。
至今，胚胎干细胞(ES细胞)和用于靶向特异基因的载体构建体被认识是产生基因靶向动物的先决条件。尽管有些研究表明在猪和牛体内能够生成ES类似细胞，但是，来源于大的牲畜ES细胞的使用还是受到了限制(Doetschman等人，Dev Biol.，127(1)；224-227，1988；Stice等人，Biol Reprod.，54(1)；100-110，1996；Sukoyan等人，MolReprod Dev.，36(2)；148-158，1993；Iannaccone等人，Dev Biol.，163(1)；288-292，1994；Pain等人，Development，122(8)；2339-2348，1996；Thomson等人，Proc Natl Acad Sci USA.，92(17)；7844-7848，1995；Wheeler等人，Reprod Fertil Dev.，6(5)；563-568，1994)。
作为替代，利用正常体细胞作为核供体细胞被认为是一种生产转基因牛的有效的、可行的方法(Brophy等人，Nat Biotechnol.，21(2)；157-162，2003；Cibelli等人，Science，280(5367)；1256-1258，1998；Campbell等人，Nature，380(6569)；64-66，1996；Wilmut等人，Experientia，47(9)；905-912，1997；Denning等人，Cloning stem cells，3(4)；221-231，2001)，这就暗示了体细胞取代胚胎干细胞被用于靶向特异基因的可能性。
运用体细胞核移植(SCNT)技术，使用乳蛋白基因启动子区指导重组蛋白在转基因大型动物乳液中进行表达(Schnieke等人Science，278(5346)；2130-2133，1997；Baguisi等人，Nat Biotechnol.，17(5)；456-461，1999；Brophy等人，Nat Biotechnol.，21(2)；157-162，2003)。然而，将该技术应用于农场动物仍然不可行除非因基因随机插入而导致的低表达和(或)异常表达问题得到了解决。外源基因的异常表达引起早期胚胎致死，这种情况在神经系统尤其严重，因为大多数神经系统结构在胚胎晚期和出生后早期阶段进行发育(Gao等人，Neurochem Res.，24(9)；1181-1188，1999)。为了消除或者减少这些副效应，发明了一种允许外源基因只在泌乳期并且严格控制在乳腺中表达的新方法(Houdebine等人，Transgenic Res.，9(4-5)；305-320，2000)。通过同源重组事件向基因组导入特异位点修饰的基因靶向是用于组织特异性表达重组蛋白的高效工具(Muller等人，Mech Dev.，82(1-2)；3-21，1999；Clark等人，J Mammary Gland Biol Neoplasia.，3(3)；337-350，1998)。
第一只基因敲入的绵羊的诞生，已经打开了可能生产药用外源蛋白靶向的大型动物的大门(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。开发了具有COL1A1基因同源区域的COLT-2靶向载体以富集基因靶向事件中的启动子-陷阱，其中COL1A1基因在纤维原细胞中高度表达。。在绵羊β乳球蛋白(BLG)表达载体中包含有与人类α1-胰蛋白酶(AAT)互补DNA的AATC2转基因，被设计为在乳腺中直接表达，该转基因具有独自的转录单位。从靶向小羊体内分泌出的AAT量比从用多重和随机整合该基因的绵羊体内分泌量的37倍还多(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。所以，现在基因靶向技术被视为生产大量药用蛋白的最有效方法。然而，应用启动子-捕获靶向载体限于体细胞中具有转录活性的基因。通常，转录活性基因比沉默基因更易于修正基因靶向作用，因为，转录活性基因具有更高的同源重组频率(Kuroiwa等人，NatGenet.，36(7)；775-780，2004)。
乳蛋白质在乳腺中以组织特异方式进行表达。通过操作乳蛋白编码基因，使得在不引起胚胎期或者出生后的发育致死情况下过量表达外源基因成为可能。在这些蛋白中，β-酪蛋白由于其丰富的表达而成为最佳候选者之一。牛β-酪蛋白在整个基因组中以单拷贝形式存在，而且不知道在除了乳腺细胞的体细胞中表达。通过利用启动子-陷阱载体，还不能成功将外源基因靶向进入不能在正常体细胞表达的β-酪蛋白基因中。
基于这种背景技术，本发明人发明了牛β-酪蛋白基因特异的靶向载体盒，利用该盒插入外源基因的载体，导入所述载体的牛体细胞，以及用所述的牛体细胞进行核移植的胚胎。本发明人发现外源基因正确地靶向牛基因组DNA的β-酪蛋白基因中，并且确认了利用所述的载体靶向事件是高效的。所以，利用所述的牛β-酪蛋白基因靶向载体盒，本发明人完成了可以产生大规模目的药用蛋白的转基因牛。
发明概述
本发明的目的是提供一种牛β-酪蛋白质基因靶向载体，该载体包括：(1)具有5至12kb长度的第一区域，该区域和牛β-酪蛋白质基因的启动子和侧翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白质基因的外显子1、内含子1和外显子2；(2)用于克隆编码目的蛋白质的核酸的区域；(3)编码正选择标记的区域；(4)具有2.8至3.5kb长度的第二区域，该区域和牛β-酪蛋白质基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外显子5、6、7和8，以及内含子5、6和7；其中，按照β-酪蛋白质基因5’-3’的排列方向，和第一区域相应的核酸片段位于和第二区域相应的核酸片段的上游。
本发明的另一目的是提供了一种利用上述靶向载体牛β-酪蛋白基因靶向的牛体细胞。
本发明的另一目的是提供了一种利用上述体细胞进行核移植的胚胎。
本发明的另一目的是提供了一种制备牛β-酪蛋白质基因靶向的体细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)将上述载体导入牛体细胞；(2)在牛体细胞中发生同源重组事件；(3)筛选牛β-酪蛋白基因靶向的体细胞。
本发明的另一目的是提供一种制备转基因牛的方法，该方法包括以下步骤：(1)将上述载体导入牛体细胞；(2)在牛体细胞内发生同源重组事件；(3)筛选牛β-酪蛋白基因靶向的体细胞；(4)将上述基因靶向细胞导入去核的卵母细胞，产生核移植的胚胎；和(5)将上述胚胎植入一个代孕体以产生克隆的转基因牛。
本发明还有另一目的是提供一种从上述方法产生的克隆牛的牛奶中制备大规模的目的药用蛋白质的方法。
附图说明
图1描述了源于质粒pBluescriptII SK(+)靶向牛β-酪蛋白基因的18.8kbpBCKII载体盒。该载体还包括neo基因上游的SacII、NotI、和BamHI限制性酶切位点，以及短臂区下游的BamHI位点。
图2描述了源于质粒pGEM-7Zf(+)(Promega公司)的靶向牛β-酪蛋白基因的14.8kbpBCKIII载体。
图3描述了源于质粒pGEM-7Zf(+)的靶向牛β-酪蛋白基因的16.1kb pBCKIDTII载体。该载体也还包括neo基因上游的SacII、NotI、和BamHI限制性酶切位点，以及短臂区下游的BamHI位点。而且，还插入了1.3kb的白喉毒素(DT)基因作为负选择标记物。
图4显示了pBCKII载体和基因组中的β-酪蛋白基因之间的同源重组。双交换导致内源β-酪蛋白基因被载体盒中的序列取代。
图5显示了pBCKIII载体和基因组中的β-酪蛋白基因之间的同源重组。双交换事件导致基因组中β-酪蛋白基因基因座部分序列被载体盒中的部分序列取代。
图6显示了pBCKIDTII载体和基因组中的β-酪蛋白基因之间的同源重组。双交换导致内源β-酪蛋白基因被载体盒中的序列取代。同源重组事件的结果是DT基因被删除。
图7显示了用于鉴定发生在牛β-酪蛋白基因座、和跨越靶向β-酪蛋白基因座与pBCKII、pBCKIII靶向载体盒中限制性酶切位点连接的DNA序列的基因靶向事件的PCR筛选策略。上面部分显示两条引物的大概位置，这两条引物是用于扩增从β-酪蛋白基因靶向载体中特有的neo基因区域至载体盒中没有使用的内源性β-酪蛋白基因座之间的4kb片段。序列A显示跨越长臂区和neo基因连接的部分DNA序列。序列B显示跨越neo基因和短臂区连接的部分DNA序列。显示了5’PCR引物的位置和方向。序列C显示跨越短臂区和内源性β-酪蛋白基因基因座之间连接的部分DNA序列，内源性β-酪蛋白基因基因座不包括在BCKII和BCKIII载体中。显示了3’PCR引物的位置和方向。
图8显示了用于鉴定发生在牛β-酪蛋白基因座、和跨越靶向β-酪蛋白基因座和pBCKIDTII靶向载体盒中限制性酶切位点连接DNA序列的基因靶向事件的PCR筛选策略。上面部分显示两对引物的大概位置，这两对引物用于扩增从β-酪蛋白基因靶向载体中特有的neo基因区至载体盒中没有使用的内源性β-酪蛋白基因座区之间的4kb和3.4kb片段。这里，使用第一对引物扩增4kb PCR片段后，再用第二对引物扩增3.4kbPCR片段以得到少量DNA样品。序列A显示跨越长臂区和neo基因之间连接的部分DNA序列。序列B显示跨越neo基因和短臂区之间连接的部分DNA序列。显示了5’PCR引物的位置和方向。序列C显示跨越短臂区和内源性β-酪蛋白基因基因座之间连接的部分DNA序列，内源性β-酪蛋白基因基因座不包括在BCKII和BCKIII载体中。显示了3’PCR引物的位置和方向。
图9显示了我们以前研究中构建的pBC10载体(Kim等人，J Biochem(Tokyo).，126(2)；320-5，1999)。pBC10载体基于pBluescriptII SK载体骨架包括10kb长的牛β-酪蛋白启动子区。这个启动子区包括8kb的基因5’侧翼序列、非翻译的外显子1和2(垂直空白框)、和2kb的牛β-酪蛋白基因内含子1。启动子包含SacI、AatII和SacII限制性酶切位点，但是没有其它诸如SmaI、BamHI、SalI、SpeI和ClaI限制性内切酶的识别序列。
图10显示了用SacI和SacII限制性内切酶消化的pBC10载体中分离的10kbDNA片段。该分离的10kbDNA片段用于构建pBCKII载体盒的长臂。
图11显示了用AatII和SacII限制性内切酶消化的pBC10载体中分离的6kbDNA片段。该分离的6kb DNA片段用于构建pBCKIII载体盒的长臂。
图12显示了用于pBCKII和pBCKIII载体盒短臂的pBC3.1载体构建过程。使用含有XhoI和SalI位点(黑体字母)的引物对从牛染色体DNA中通过PCR扩增制备含有牛β-酪蛋白基因的5、6、7和8外显子的3.2kb DNA片段。用限制性内切酶XhoI和SalI消化所扩增的PCR片段，然后连接到载体pGEM-T(Promega公司)的限制性内切酶SalI位点。用限制性内切酶HincII和SalI消化pGEM-T载体中的3.2kbDNA片段，然后连接到载体pBluescriptII SK(+)中的SalI位点。
图13显示了获得neo基因的过程，neo基因包括来源于载体pMAMneo(CLONTECH公司)的SV40复制起始点、早期启动子、抗新霉素基因、SV40早期剪接区和多聚腺苷酸化位点。用限制性内切酶BamHI消化的2.7kb neo基因片段，连接到载体pBluescriptII SK(+)的BamHI位点。用限制性内切酶BglII和BamHI消化载体pBluescriptIISK(+)中neo基因的2kbDNA片段，连接到载体pSP73(Promega公司)中的BglII位点。用限制性内切酶BglII和EcoRV消化载体pSP73中的2kb片段，然后再次连接到包含0.7kb neo基因的载体pBluescriptII SK(+)中的BglII和EcoRV酶切位点，产生pneo2.7载体构建体。
图14显示了pBCKII和pBCKIII载体盒构建过程。用各自的限制性内切酶消化pBluescript II SK(+)中的相当于正选择标记和短臂区的DNA片段，然后连接到含有pBC10DNA片段的载体pBluescriptII SK(+)中的BamHI、EcoRV和SalI位点。所得到的pBCKII载体包括10kb的长臂区、选择标记基因和短臂区。为了缩短pBCKII的长臂长度，将用限制性内切酶AatII和SalI消化的DNA片段连接到载体pGEM7Zf(+)的AatII和XhoI位点。所得到的载体pBCKIII包括6kb的长臂区、neo基因和短臂区。
图15显示了获得DT基因的过程，将来源于pKO SelectDT(Lexicon Genetics公司)的DT基因插入pBCKIDTII载体。用限制性内切酶RsrII分离包含SV40多聚腺苷酸和RNA聚合酶II启动子的白喉毒素A(DT)基因。使用klenow片段补平被分离的DT基因后，将其插进载体pBluescriptII SK(+)(Stratagene公司)中的HindII位点，生成pSKDT载体。用限制性内切酶XhoI和EcoRV消化pSKDT载体中的DT基因，然后连接到pSP73载体(Promega公司)中的XhoI和PvuII位点，生成pSP73DT载体构建体。
图16描述了pBCKIDTII载体盒的构建过程。用限制性内切酶XhoI和SalI消化pSP73DT载体中的DT基因，然后连接到pBCKII载体盒的SalI位点，生成pBCKIDTI载体。用AatII和SalI酶切所得到的pBCKIDTI载体，然后连接到pGEM-7Zf(+)载体(Promega公司)中的AatII和XhoI位点，生成pBCKIDTII载体盒。
图17显示了把一个有价值的基因导入pBCKII载体。以药用蛋白质基因示例，将人类促血小板生成素(hTPO)cDNA插入本发明的pBCKII载体盒中。在我们先前实验中，以全长形式编码的1.0kb的hTPO cDNA用PCR扩增，和将300bp长的牛生长素(bGH)基因的多聚腺苷酸附加信号序列连接到hTPO cDNA片段下游的KpnI位点(Sohn，DNA Cell Biol.，18(11)；845-852，1999)。将包含hTPO cDNA和bGH基因的1.3kbDNA片段插入pBCKII载体中的SacII和NotI位点，生成20.1kb的pBCTPOKII载体构建体。
图18显示了将hTPO cDNA导入pBCKIII载体盒。生成了16.1kb的pBCTPOKIII构建体并且其构建过程同图17描述的一样。
图19显示了将hTPO cDNA导入pBCKIDTII载体盒。结果，生成了17.4kb的pBCTPOKIDTII构建体，并且其构建过程同图17描述的一样
图20显示了用SalI消化后，用于转染的线性化pBCTPOKII载体。
图21显示了用AatII消化后，用于转染的线性化pBCTPOKIII载体。
图22显示了用AatII和ClaI消化删除质粒载体后，用于转染的线性化pBCTPOKIDTII载体。
图23显示了用AatII和ClaI消化删除质粒载体后，用于转染的线性化pBCTPOKIII载体。然而，图21描述的pBCTPOKIII载体仅仅是被线性化并利用质粒载体转染细胞，这里描述的是用两种限制性内切酶消化删除质粒载体后的pBCTPOKIII载体转染细胞。
图24显示了牛胚胎纤维原细胞(bEF)和牛耳皮纤维原细胞(bESF)的形态学照片。A和B分别是非转染的(正常)bEF和bESF细胞，培养至汇合。C和D分别显示了靶向载体转染到bEF和bESF后形成的克隆。使用LipofectamineTM 2000试剂(Invitrogen公司)方法，将具有neo耐抗生素基因的靶向载体导入bEF和bES后，用G418(Gibco，Invitrogen corporation公司)处理被转染的细胞，然后，仅对存活的克隆细胞进行关于插入外源基因的分析。
图25显示了pBCKIII转染后存活的克隆细胞的PCR分析。箭头所指的500bp PCR片段的阳性信号代表转染的细胞克隆，被表示为“+”，阴性信号被表示为“-”。将本发明的pBCTPOKIII载体用作阳性对照，并使用hTPO基因特异的引物进行PCR扩增。
图26和图27描述了pneoBC3.7载体构建过程，pneoBC3.7载体将被用作长链PCR分析的对照。使用一对引物从牛染色体DNA中通过PCR扩增单独制备相当于牛β-酪蛋白基因的从7888位至8479位碱基的包含内含子8和外显子9的591bp DNA片段。3’引物含有XhoI位点，用粗体符号(boldcharacter)描述。将扩增的PCR片段连接到pGEM-T载体，生成pBC591载体构建体。用限制性内切酶SalI和XhoI消化pBC591载体，然后将生成的DNA片段连接到pBC3.1载体的SalI位点。同时，用限制性内切酶BamHI和EcoRV消化pneo2.7载体，然后将生成的DNA片段连接到用限制性内切酶BamHI和EcoRV消化的pBC3.1载体，生成pneoBC3.7载体。箭头显示了用于4kb长链PCR分析的引物对。
图28显示了用pBCTPOKIII.转染的bESF细胞克隆的长链PCR分析结果。箭头所示的4kb阳性信号代表靶向细胞克隆，在“81”和“89”两个克隆中被检测到，其他的克隆显示阴性信号(-)。将pneoBC3.7载体用作阳性对照。
图29显示了用pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII转染的bESF细胞克隆的长链PCR分析结果。箭头所示3.4kb阳性信号代表靶向细胞克隆。第一次是对约五个细胞进行PCR分析，然后第二次对第一次的PCR产物进行PCR分析，显示了得到了3.4kb的阳性信号(图8)。A是用pBCTPOKIDTII载体转染的细胞克隆的长链PCR分析结果，编号5、30、17、18、20、21、和26细胞克隆确定为被基因靶向。B是用pBCTPOKIII载体转染的细胞克隆的长链PCR分析结果，编号16细胞克隆确定为被基因靶向。C是作为阴性对照(-)的野生型牛基因组DNA的长链PCR结果，pneoBC3.7载体作为阳性对照(+)。
图30显示了确定靶向核酸序列的Southern印迹分析策略。用EcoRI消化BCTPOKIII载体和从转染细胞克隆中纯化的基因组DNA。用EcoRI限制性内切酶消化后的BCTPOKIII载体(A)和基因组(B)的DNA片段长分别是9.2kb和9.9kb。hTPO基因下面的带代表用于Southern分析的探针位点。PCR扩增hTPO cDNA的500bp片段用作探针。
图31显示了通过Southern印迹分析来确定靶向克隆。81和89号两个克隆确定为本发明的pBCTPOKIII载体靶向的内源性牛β-酪蛋白基因基因座。靶向克隆显示出9.9kb片段，其它克隆97、47、43和34没有显示任何信号。不同浓度的牛基因组DNA作为阴性对照，不同浓度的来自于pBCTPOKIII载体的9.2kb片段作为阳性对照。
图32显示了对81号细胞克隆的核移植胚胎的PCR分析。356bp长度的阳性(+)信号暗示克隆胚胎来自于本发明pBCTPOKIII载体靶向的体细胞。pBCTPOKIII载体作为阳性对照。用嵌套PCR重新确定阳性信号。
图33照片显示了在怀孕36天收集的由89号细胞克隆(A)发育的胚胎膜包裹的胎儿(A)、除去胚胎膜的胎儿(B)、和从胚胎膜上得到的细胞(C)和对来自胚胎膜的细胞的长链PCR结果(D)。4kb的阳性信号说明本发明的pBCTPOKIII载体靶向与克隆的胚胎遗传相同的细胞，。pneoBC3.7载体用作阳性对照。
发明详述
本发明涉及制备牛β-酪蛋白基因靶向载体以用于生产β-酪蛋白基因靶向牛，该靶向牛可从牛奶中产生大量的目的治疗性蛋白质。牛一年最多产奶6,300升，而山羊和绵羊一年分别产奶300和200升。牛是被用作动物生物反应器的最佳物种，然而，还没有关于把目的基因靶向牛体内的牛奶蛋白质基因的报告。本发明涉及能够靶向牛奶蛋白质基因中的牛β-酪蛋白基因的载体构建体和制备β-酪蛋白基因靶向牛的方法，该靶向牛使用本发明的载体构建体产生大量的治疗性蛋白质。
一方面，本发明涉及的牛β-酪蛋白基因靶向载体，该载体包括：(1)具有5至12kb长度的第一区域，该区域和牛β-酪蛋白质基因的启动子和其侧翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白质基因的外显子1、内含子1和外显子2；(2)克隆编码目的蛋白质的核酸的区域；(3)编码阳性选择标记物的区域；(4)具有2.8至3.5kb长度的的第二区域，该区域和牛β-酪蛋白质基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外显子5、6、7和8，以及内含子5、6和7；其中，按照β-酪蛋白质基因5’-3’的排列方向，与第一区域相应的核酸片段位于与第二区域相应的核酸片段的上游。
这里所用的“基因靶向载体”术语，是指一种能够将一个目的基因去除或者插入到一个特异基因基因座的载体，它包括一段与用于同源重组的特定基因同源的核酸序列。本发明的基因靶向载体是β-酪蛋白靶向载体，它将编码目的蛋白质的核酸序列按5’-3’排列插入基因组中的β-酪蛋白基因。术语载体和载体盒在此可以交替使用，载体可以是环形或者线性的。本发明的基因靶向载体是牛β-酪蛋白基因靶向载体。
本发明的β-酪蛋白靶向载体包括与β-酪蛋白基因序列同源的第一区域和第二区域，它们位于克隆位点的前后位置。第一区域对应于长臂，第二区域对应于短臂。
在发明的牛β-酪蛋白基因靶向载体组件中，特别是，“第一区域”和“第二区域”是决定基因靶向效率的重要参数。
这里的“第一区域”，特征是具有5至12kb的长度，该区域具有与牛β-酪蛋白基因启动子及其侧翼序列同源的DNA序列，包括牛β-酪蛋白基因的外显子1-2和内含子1。牛β-酪蛋白基因启动子是已知的诱导外源蛋白质高效表达的理想启动子(Kim等人，J Biochem(Tokyo).，126(2)；320-325，1999)，并且是用来表达大量目的外源蛋白质的理想候选者。尤其是，5.5kb至10kb是优选的长度。
这里的“第二区域”，特征是具有2.8至3.5kb长度的与牛β-酪蛋白基因DNA序列同源的序列，并且包括牛β-酪蛋白基因的外显子5-8和内含子5-7。3.0kb至3.2kb是优选长度。
按牛β-酪蛋白基因5’-3’排列，所述第一区域位于所述第二区域的上游。
这里所用的“同源性”术语，是指第一区域或第二区域的核酸序列与对应于这些第一和第二区域的内源β-酪蛋白基因序列之间的相似程度。当序列显示至少90％的，优选至少95％的序列相同性时，序列彼此同源。
这里所用的“(多)克隆位点”(MCS)术语，是指包含至少两个能被限制性内切酶特异识别并消化的不同核苷序列的核酸序列以允许插入编码目的蛋白质的核酸序列。
能够插入本发明载体上的MCS的目的蛋白质，可以包括所有应用于医药的或者工业的蛋白质，例如：激素、细胞因子、酶、凝血因子、载体蛋白质、受体、调控蛋白质、结构蛋白质、转录因子、抗体、抗原等。
目的蛋白质具体的实例包括，但不限于，血小板生成素、人生长素、生长素释放激素、生长素释放多肽、干扰素、干扰素受体、集落刺激因子、胰高血糖素类多肽、G蛋白偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、酶、白细胞介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞多肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转化生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、红细胞蛋白、高糖基化红细胞蛋白、血管生成素、血色素、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX，因子X III、纤溶酶原激活物、纤维结合蛋白、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生生长素、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑制素、血管紧张素、成骨生长因子、生骨刺激蛋白、降血钙素、胰岛素、心房肽激素、软骨诱导因子、elcatonin、结缔组织活化蛋白、组织因子通路抑制剂、促卵泡刺激素、促黄体素、促卵泡激素释放激素、神经生长素、甲状腺激素、松弛肽、促胰液素、生长调节素、类胰岛素生长因子、促肾上腺皮质激素、胰高血糖素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放多肽、促肾上腺皮质激素释放因子、甲状腺刺激激素、生育酚(autotaxin)、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、受体、受体拮抗剂、细胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体等等。
这里所用的“选择标记”术语，是筛选载体转化的细胞所必需的。选择标记基因赋予了对药物、营养需要和细胞毒素药物的抗性，或者诱导了诸如荧光和色彩储存等可选择的表现型。有”阳性选择标记”和”阴性选择标记”。“阳性选择标记”使得细胞表达阳性选择标记以抵抗所选试剂而存活，所以，能够赋予了表达那个标记的细胞阳性选择特征。阳性选择标记包括，但并不限于，新霉素、潮霉素、组氨醇脱氢酶、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶等等。
本发明的载体包含了阴性选择标记作为附加组件。“阴性选择标记”去除随机整合的细胞，从而使表达那个标记的细胞具有阴性选择特征。阴性选择标记包括，但并不限于，胸苷激酶(tk)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素(DT)等等。阴性选择标记位于第一DNA序列的5’末端或者第二DNA序列的3’末端。在这些阴性选择标记中，tk和DT用得普遍。在本发明中，DT基因用作阴性选择标记。Tk要求丙氧鸟苷处理，然而，DT不需要任何其他的处理。据报道，用丙氧鸟苷处理携带tk的细胞，对共培养的非修饰细胞显示了有效的“旁观者效应”，并且丙氧鸟苷抑制细胞生长(Yoshiyasu Kaneko等人，Cancer Letters，96；105-110，1995)。在那些方面，DT比tk更优选。
本发明的阳性和阴性选择标记具有独立的启动子和多聚腺苷酸(poly A)区域。启动子包括，但并不限于，猿病毒40(SV40)启动子、老鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复序列(HIV-LTR)启动子、莫洛尼氏病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、埃-巴二氏病毒(EBV)启动子、呼吸合胞体病毒(RSV)启动子、RNA聚合酶II启动子、β-肌动蛋白启动子、人血色素启动子、人肌肉肌氨酸启动子等等。
编码目的蛋白质的核酸，通过同源重组被整合进宿主细胞内细胞基因组DNA中的β-酪蛋白基因基因座，并且取代内源性β-酪蛋白在细胞内被表达。
为了提高同源重组事件效率，本发明的牛β-酪蛋白基因靶向载体具有以下特征。
将编码目的蛋白质的核酸基因整合进细胞基因组DNA的β-酪蛋白基因基因座的效率，显示出与靶向载体系统，特别是与同源区域核酸序列的相似程度和长度有关(Scheerer等人，Mol Cell Biol.，14(10)6663-6673，1994；Thomas等人，Cell，51(3)；503-512，1987；Hasty等人，Mol Cell Biol.，11(11)；5586-5591，1991；Lu等人，Blood，102(4)；1531-1533，2003)。本发明通过优化第一和第二区域的同源区位置和长度，使效率最大化。另外，为了使同源重组事件发生时位置干涉最小化，将本发明载体的阳性选择标记插入相应于牛β-酪蛋白基因的外显子3-4和内含子2-4的区域基因座。另外，在本发明中，在“第一区域”后部设计多克隆位点(MCS)，以便于插入外源蛋白质基因。另外，本发明最终载体设计有别于先前的载体(SHEN Wei等人，Chinese Journal ofBiotechnology，20(3)；361-365，2004)，本发明最终载体包含用于基因靶向的编码目的蛋白质的基因的。在先前报道的载体中存在3个用于同源重组事件的同源区域，是因为编码目的蛋白质的基因被随机插入载体的第一区域(SHEN Wei等人，Chinese Journal ofBiotechnology，20(3)；361-365，2004)。然而，在本发明的载体中只存在两段用于重组事件的同源区域，因为，编码目的蛋白质的基因被插进载体的MCS中。因此，当使用本发明的载体盒时，基因靶向载体结构简单，且载体靶向效率比先前的载体高很多(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)。
事实上，本发明载体系统甚至在转录沉默的体细胞中诱导同源重组事件发生，导致外源蛋白质基因稳定地整合到β-酪蛋白基因的基因座。
在本发明的一个优先实施方案中，制备pBCKII和pBCKIII载体、和携带阴性选择标记的pBCKIDTI和pBCKIDTII载体用作靶向载体。
pBCKII载体，约18.8kb长，起源于pBluescriptII SK(+)质粒。pBCKI I载体的第一区域大约10kb长，它包括8kb的携带牛β-酪蛋白启动子和牛β-酪蛋白基因的外显子1、内含子1和外显子2的序列。pBCKII载体的第二区域大约3.1kb长，且它包括外显子5-8、内含子5-7和内含子4和8的一部分，如图2所示。pBCKII载体包括作为选择标记物的neo基因、SV40早期启动子和多聚腺苷酸序列。pBCKII载体包括3个限制性内切酶位点(SacII、NotI和BamHI)，用于插入编码目的蛋白质的核酸，如图1所示。
pBCKII载体，约14.8kb长，源于pGEM7Zf(+)质粒。pBCKIII载体的第一区域大约6kb长，它包括约4kb长的牛β-酪蛋白启动子和牛β-酪蛋白的外显子1、内含子1和外显子2。pBCKIII载体的第二区域大约3.1kb长，它包括外显子5-8、内含子4-7和内含子4和8的一部分，如图2所示。pBCKIII载体包括作为选择标记的neo基因、SV40早期启动子和多聚腺苷酸序列。pBCKIII载体包括3个限制性内切酶位点(SacII、NotI和BamHI)，用于插入编码目的蛋白质的核酸，如图2所示。
在pBCKII和pBCKIII载体的XhoI和SalI位点插入DT基因，产生pBCKIDTI和pBCKIDTII载体。
应用普通的DNA重组技术能够制备本发明的靶向载体。应用本领域公知的酶能够完成特殊位点的剪切和连接。
在一个具体实施方案中，将人血小板生成素(TPO)基因插入BCKII和BCKIII(图17、18和19)。构建侧翼为0.3kb牛生长素(bGH)基因片段的1kb人TPO cDNA片段(Sohn等人，DNA Cell Biol.，18(11)；845-852，1999)。被插入的bGH基因用于编码稳定的信使RNA。
人血小板生成素是主要的造血调控子之一，它参与一系列的巨核细胞生成过程，即诱导血小板生成的巨核细胞增殖和分化。作为血小板生成的主要生理调控子，它在促进巨核细胞的增殖和成熟中扮演关键角色。对血液系统癌症和实体肿瘤患者进行侵袭性化疗和骨髓移植时，可以观察到严重的中性粒细胞减少症和血小板减少症(Lok等人，StemCells，12(6)；586-598，1994；Kaushansky等人，Stem Cells，15(1)；97-102，102-103，1997；Kaushansky等人，Ann Intern Med.，126(9)；731-733，1997；Kaushansky等人，Leukemia，11(3)；426-427，1997；Kaushansky等人，Annu Rev Med.，48；1-11，1997)。已确认，在动物模型中，重组的TPO能够改善血小板减少症，因此显示了潜在的治疗用途。TPO的安全和功效在第一阶段临床试验中得到验证(Fanucchi等人，N Engl J Med.，336(6)；404-409，1997；Basser等人，Lancet.，348(9037)；1279-1281，1996；O′Malley等人，Blood，88(9)；3288-3298，1996)。还显示，TPO能够增强接受癌症化疗的骨髓抑制患者恢复血小板生成。
特别提到，在2005年10月17日，被pBCTPOKIDTII载体转化的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞由国际保藏机构以编号KCTC 10864BP保存在韩国典型菌种保藏中心(KCTC，韩国大田宇松区欧洞#52，(#52Oun-dong Yuseong-gu，Daejeon，SouthKorea))。
在上述两个载体中，在靶向基因组中的β-酪蛋白基因时携带具有长6kb的第一区域的pBCKIII载体比pBCKII载体更为有效。而携带阴性选择标记DT基因的pBCKIDTII载体，显示出比pBCKIII载体靶向效率要高4至5倍。在本发明中，36.6％的bEF和41.4％bESF细胞均被pBCKITPOKIDTII载体靶向，其靶向效率比先前靶向载体高3.3倍(41.4％/12.7％)，12.7％山羊胎儿成纤维细胞被先前的载体靶向(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)。因此，我们确信本发明的载体是高效的牛β-酪蛋白基因靶向载体。
在另一方面，本发明涉及用上述载体基因靶向的牛体细胞。
用本发明的载体靶向的细胞来自于真核细胞，并是原代细胞、次生或永久细胞。优选地，这些细胞来自于牛、绵羊、山羊、猪、马、兔、狗、猴等等，但不限于这些。能够分离或者激活细胞的有用组织是肝、肾、脾、骨、骨髓、胸腺、心脏、肌肉、肺、脑、生殖腺、卵巢、胰岛、肠、耳、皮肤、胰腺组织、前列腺、膀胱、胚胎、免疫系统、造血细胞等等，但不止这些。细胞类型有纤维原细胞、上皮细胞、神经细胞、胚胎细胞、肝细胞、卵泡细胞等等，但不限于这些。
载体的转染方法包括任何将核酸导入细胞的方法，可以应用本领域众所公知的适当技术进行转染。转染方法包括电击、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒感染、微注射、二乙胺乙基葡聚糖转染法、阳离子脂质体转染等等，但不限于这些。在转染的时候，用限制性内切酶消化线形载体比环形载体更加优选，可作为示例。
特别提到，应用LipofectamineTM 2000试剂(Invitrogen公司)，将插入了人血小板生成素(hTPO)的β-酪蛋白靶向载体引入牛胚胎纤维原细胞(bEF)和牛耳皮纤维原细胞(bESF)。阳离子脂质体与带负电的DNA有效地相互作用并且DNA脂质体复合物和细胞膜结合，因而导致DNA的共有化(internationalization)。应用长链PCR和Southern印迹分析从经过抗生素处理后存活的克隆中检测和确认基因靶向载体插入特定的基因。使用这个程序，得到了hTPO靶向β-酪蛋白基因的bESF细胞克隆。81号细胞克隆命名为BCTPOKIbESF81，由韩国典型菌种保藏中心(KCTC)保存，编号为KCTC-10720BP，保藏日期为2004年11月10日，KCTC位于韩国大田宇松区欧洞#52。
在另一方面，本发明涉及用上述牛体细胞进行核移植的胚胎。
术语“核移植”是将核供体细胞遗传物质移植到去核的卵母细胞中。因为相同供体细胞的遗传物质被移植到受体细胞质中，所以，核移植技术使产生遗传相同的动物克隆成为可能。
在另一方面，本发明涉及制备牛β-酪蛋白基因靶向体细胞的方法，该方法包括的步骤是：(1)将牛β-酪蛋白基因靶向载体导入牛体细胞；(2)在转染体细胞中发生同源重组事件；和(3)选择牛β-酪蛋白基因靶向的体细胞。
更加特别地，为了提高靶向效率，优化了本发明的牛β-酪蛋白基因靶向载体pBCKII、pBCKIII、pBCKIDTI和pBCKIDTII。因此，使用上述载体，能够提高牛β-酪蛋白基因靶向牛体细胞产生效率，牛β-酪蛋白基因携带编码目的蛋白质的基因。
而且，在步骤(1)中的载体以线性形式或者以缺失质粒载体骨架的删除形式导入细胞。
在另一方面，本发明涉及一种提供制备克隆转基因牛的方法，该方法包括的步骤是：(1)将上述载体导入牛体细胞；(2)在牛体细胞中发生同源重组事件；(3)选择通过同源重组携带目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向体细胞；(4)将上述基因靶向的细胞导入去核牛卵母细胞，产生核移植胚胎；和(5)将上述胚胎移植到代孕体，产生克隆的转基因牛。
如上所述，本发明适于生产克隆的基因靶向牛，其中本发明的载体被优化用于牛β-酪蛋白的基因靶向。
可以应用各种方法，例如物理去核、化学处理和松胞菌素B离心处理以除去卵母细胞的遗传物质(Tatham等人，Hum Reprod.，11(7)；1499-1503，1996)。在本发明中，使用了玻璃微吸液管进行物理去核的方法。
通过使用诸如细胞融合方法和卵胞浆内单细胞注射(ICCI)等技术，将基因靶向的体细胞导入去核的动物胚胎。对于大量生产胚胎，细胞融合方法简洁而有用。ICCI方法允许从供体细胞分离的细胞核最大限度地暴露在受体细胞质的胞液内。
通过电脉冲改变细胞表面的电荷，使得体细胞和去核的卵母细胞完成融合。使用脉冲长度和电压易于控制的电极细胞操作器(electro-cell manipulator)是很方便的。
在另一方面，本发明涉及一种从牛奶中生产目的蛋白质的方法，该方法包括如下步骤：将本发明的载体导入动物体细胞；选择通过同源重组目的基因靶向的细胞；将基因靶向的细胞导入去核的动物胚胎；将胚胎移植到产奶动物以产生转基因动物；及从转基因动物中产奶。
核移植的胚胎在体外激活并发育到胚泡阶段，然后移植到受体中。
克隆胚胎的活化诱导临时静止的细胞周期的再启动，由此胚胎分裂成为可能。为了激活克隆的胚胎，应该抑制细胞周期阻止因子，例如成熟促进因子(MPF)、有丝分裂活化蛋白(MAP)激酶等的激活，其中为了抑制这种因子的激活，增加克隆胚胎胞内钙离子浓度是必要的。用电刺激法或者如离子霉素、6-二甲基氨基嘌吟(6-DMAP)化学处理方法等诱导钙离子流入急剧增加，可完成细胞的激活，其中上面的方法可以单独或者共同使用。在本发明中，用离子霉素+6-二甲基氨基嘌吟同时处理重构的胚胎并在体外发育到胚泡阶段。
结果，产生了能够在泌乳期表达目的蛋白质的克隆后代。使用本发明的靶向载体系统产生的转基因动物，能够从乳液中获得大量的目的蛋白质，而在胚胎和出生之后的发育中不会引起严重的致死性。
在另一方面，本发明涉及一种从克隆转基因牛的牛奶中获得目的蛋白质的方法，所述克隆转基因牛用上述方法生产。
牛奶中表达的目的蛋白质能够用传统的方法纯化出来，例如盐析(例：硫酸铵沉淀；磷酸钠沉淀)、溶剂沉淀(例：使用丙酮，乙醇等进行蛋白质分级沉淀)、透析、凝胶过滤、离子交换、色谱柱法如反向色谱柱法、超滤或其中方法相结合等等(Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1982)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；Deutscher，M.，Guide to Protein Purification MethodsEnzymology，vol.182.Academic Press.Inc.，San Diego，CA(1990))。
在下文中，本发明将参考下面的实施例进行详细描述。然而，依照本发明的实施例可以被修改成其它形式，并且本发明的范围不受下面实施例的限制。
实施例1——牛基因靶向载体构建
1-1pBCKI I和pBCKIII载体构建
在本发明中，我们应用了牛β-酪蛋白基因的启动子基因座，它指导外源治疗性基因在牛奶中表达。
如先前所述(Sohn等人，J Biotechnol.，103(1)；11-19，2003)的pBC10载体构建体(图9)，包括了在pBluescriptII SK(+)质粒(Stratagene公司)中的牛β-酪蛋白的一个5’侧翼序列的8kb的启动子、整个外显子1、2kb的内含子1和外显子2的5’-URT。pBC10载体的β-酪蛋白基因区用作本发明的两个载体盒pBCKII和pBCKIII的长臂(第一DNA区)。如图10所示，用SacI和SacII限制性内切酶消化10kb的β-酪蛋白基因，用作pBCKI I载体盒的长臂(第一DNA序列)(图10和14)。用AatII和SacII限制性内切酶消化6kb的β-酪蛋白启动子区用作pBCKIII载体的长臂(第一DNA序列)(图11和14)，该区域包括牛β-酪蛋白基因4kb的启动子、不翻译的外显子1、2和内含子1。
构建载体pBC3.1(图12)用作本发明载体盒的短臂。牛β-酪蛋白基因序列(4676至7898)的3.2kb DNA片段包括外显子5、6、7、8和内含子5、6、7和部分内含子4与8，通过以牛基因组DNA作为模板进行PCR扩增。用于PCR反应的引物序列如下：
序列编号No1：
正向引物：5’-attcagtcgagtggaacataaactttcagcc-3’
序列编号No2：
反向引物：5’-catatgtcgactgtgagattgtattttgact-3’
引物序列的粗体字母表示为了生成XhoI和SalI限制性内切酶位点而改变的一些碱基。
用XhoI和SalI限制性内切酶消化PCR产物(图12)，并连接到pGEM-T(Promega公司)的SalI位点。为了生成插入pBC10载体的酶切位点，用HincII和SalI限制性内切酶消化pGEM-T中的3.2kb牛β-酪蛋白基因片段。将生成的3.1kb片段连接到pBluescriptII SK(+)的SalI位点，产生BC3.1载体。
用作选择性标记的neo基因片段也插进pBC10载体中。为了得到包括SV40复制起始位点、早期启动子、SV40早期剪接区和多聚腺苷酸化区的neo基因片段，用BamHI限制性内切酶消化pMAMneo载体(CLONTHECH公司)。首先，将所生成的2.7kb DNA片段连接到pBluescriptII SK(+)的BamHI位点。其次，用BglII和BamHI限制性内切酶消化已连接载体中的2kb neo基因片段，然后连接到pSP73(Promega公司)的BglII位点。最后，用BglII和EcoRV限制性内切酶消化pSP73中2kb的neo基因片段，然后，重新连接到携带0.7kb pMAMneo基因片段的pBluescriptII SK(+)中BglII和EcoRV位点。这些DNA消化和连接步骤是将2.7kb neo基因片段插入pBC10载体所必需的(图14)。
如图11所示，通过将pneo2.7和pBC3.1基因片段组装到pBC10载体，制成了pBCKII和pBCKIII载体盒。用BamHI和EcoRV限制性内切酶消化pBluescriptII SK(+)中的neo基因，然后，连接到pBC10载体的BamHI和EcoRV位点。用EcoRV和SalI限制性内切酶消化pBC3.1载体，然后，连接到包含亿连接pMAMneo基因片段的pBC10载体中的EcoRV和SalI位点，生成pBCKII载体盒。用AatII和SalI限制性内切酶消化pBCKII载体盒，并连接到pGEM-7Zf(Promega公司)的AatII和XhoI位点，生成pBCKIII载体盒。因此，构建了pBCKII和pBCKIII载体盒。
1-2pBCKIDTI和pBCKIDTII载体构建
将阴性选择标记DT基因插入上述载体中(图3和16)。当使用携带阴性选择标记的pBCKIDTI载体pBCKIDTII时，因为大部分在随机位点整合到载体的细胞克隆被DT基因毒性杀死，所以减少了非靶向细胞克隆(图3和16)。用于本发明的DT基因分离于pKO SelectDT载体(Lexicon Genetics，The Woodlands，Tex.)。用限制性内切酶RsrII将携带SV40多聚腺苷酸和RNA聚合酶II启动子的白喉毒素A链(DT)基因分离。用Klenow片段补平被分离的DT基因后，插入pBluescriptII KS(+)(Stratagene公司)的HindII限制性位点，生成pKS DT载体。用XhoI和EcoRV消化pKS DT载体中的DT基因，并连接到pSP73载体(Promega公司)的XhoI和PvuII位点，生成pSP73 DT载体(图15)。用XhoI和SalI消化pSP73DT载体中的DT基因，然后插入pBCKII载体盒的Sal I位点，生成pBCKIDTI载体。用AatII和SalI消化pBCKIDTI载体，并连接到pGEM-7Zf(+)(Promega公司)的AatII和XhoI位点，生成pBCKIDTII载体盒(图16)。
通过对所有合成DNA区和所有连接DNA片段的接合处进行DNA测序和酶切图谱鉴定再次确认目标载体盒的保真度。
实施例2-pBCTPOKII和pBCTPOKIII的构建
如图17、18和19所示，将1kb的人TPO cDNA加上300bp的牛生长素插入pBCKII、pBCKIII和pBCKIDTII载体盒。携带SacII和NotI位点的1.3kb外源基因分别连接到pBCKII、pBCKIII和pBCKIDTII载体中的SacII和NotI位点，从而产生靶向载体，命名为pBCTPOKII、pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII(图17、18和19)。特别提到，用pBCTPOKIDTII载体转化的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞保存在韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，KCTC位于韩国大田305-333宇松区欧洞#52保存日期是2005年10月17日，保藏编号KCTC 10864BP。
实施例3-将pBCTPOKII、pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII载体构建体转染到牛胚胎纤维原细胞(bEF)和牛耳部皮肤纤维原细胞(bESF)
3-1导入线性载体
用“QIAfilter Plasmid Midi试剂盒”(Qiagen公司)纯化质粒DNA，pBCTPOKII和pBCTPOKIII，然后通过CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心分离闭环的DNA。通过限制性内切酶SalI(图20)和AatII(图21)消化使被分离的质粒pBCTPOKII和pBCTPOKIII分别成为线性，然后用乙醇沉淀纯化。最后，用分光光度计测定被纯化的DNA浓度。
使用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen公司)将线性的pBCTPOKII和pBCTPOKIII构建体导入2或3代的bEF和bESF中。对于bEF，我们检测了三个不同的转染试剂体积，例如2、4和10μl的，和两个不同的DNA浓度，例如2和4μg。对于bESF，检测了2、4和10μl的转染试剂体积，和1、2和4μg DNA浓度。体细胞暴露在转染试剂-DNA复合物中24小时。
在添加10％胎牛血清(Hyclone公司)、0.001％庆大霉素(Gibco，Invitrogen公司)和1％的无必需氨基酸的基本培养基(Gibco，Invitrogen公司)的Dulbecco Modified Eagle培养基(Gibco，Invitrogen公司)中培养体细胞，培养基每天更换。细胞在37℃，5％CO2空气中培养。根据下面显示的平板类型，细胞培养基体积不同。
  96孔   48孔   24孔   12孔  6孔  100毫米皿
  0.2毫升   0.5毫升   1.0毫升   1.5毫升  3毫升  10毫升
在37℃，用1x胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Invitrogen公司)溶液处理生长至汇合的细胞3分钟，然后用Dulbecco的磷酸生理缓冲液(Gibco，Invitrogen公司)清洗两次。经1x胰蛋白酶-EDTA处理分开的细胞克隆通过轻轻抽吸被解里，然后转移到更宽的平板中增殖。1x胰蛋白酶-EDTA溶液的使用体积依赖于下面显示的细胞培养平板类型
  96孔  48孔  24孔  12孔  6孔  100毫米皿
  50微升  100微升  150微升  200微升  500微升  1毫升
实验步骤显示如下：
  第一天   根据厂商推荐的步骤，使用2毫升OPTI-MEMI无血清培养基(ReducedSerum Medium)(Gibco，Invitrogen公司)稀释Lipofectamine2000试剂(Invitrogen公司)，用线性的BCTPOKII和BCTPOKIII DNA转染6孔培养板上的处于2或3代的5.5×105个bEF细胞和3.6×105个bESF细胞。
  第二天   转染的细胞分离到两个100毫米的培养皿上，进一步培养。
  第三天   在培养基中添加0.8-1.5毫克/毫升G418(Gibco，Invitrogen公司)。
  第4-14天   挑取约2-3毫米直径的克隆，分别重新涂布到96孔培养板上。
将在96孔板生长至汇合的细胞转移到48孔培养板，然后逐渐地扩展到24孔、12孔、6孔和100毫米的培养板。
在6孔板中，挑取约一半的转染细胞进行PCR反应，其他的细胞被转移到6孔培养板的两孔中。
3-2删除质粒载体后导入线性载体
用限制性内切酶AatII和ClaI消化删除pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII载体构建体中的质粒载体区域，然后参考上面(图22和23)转染bESF和bEF细胞。
实施例4-通过PCR分析鉴定转染的细胞克隆
为了筛选转基因细胞系，PCR分析G418抗性克隆细胞。使用“AccuPrep基因组DNA提取试剂盒”(Bioneer公司)从6孔板的一半细胞中纯化基因组DNA，并使用“AccuPower PCR预混合料”(Bioneer公司)进行PCR。用于人TPO cDNA的引物对和热循环条件显示如下：
SEQ ID No 3
正向引物：GGA GCT GAC TGA ATT GCT CCT CGT
SEQ ID No 4反向引物：CCT GAC GCA GAG GGT GGA CCC TCC
  1个循环   94℃   2分钟
  30个循环   94℃   1分钟
  65℃   30秒
  72℃   45秒
  1个循环   72℃   10分钟
PCR结果显示，大部分抗G418细胞克隆鉴定为转基因细胞(图17)。
实施例5-长链PCR检测靶向细胞克隆
应用长链PCR确定转基因细胞克隆中的基因靶向细胞克隆。使用“AccuPrep基因组DNA提取试剂盒”(Bioneer公司)或者通过3-4个液氮冷冻和沸水融化的循环暴露出来的方法来纯化每个转基因细胞克隆的基因组DNA。使用“AccuPower PCR预混合料”(Bioneer公司)进行长链PCR。
如图5所示，5’引物设计为与所转染的载体构建体中neo基因的3’端结合，3’引物设计为与牛β-酪蛋白基因的内含子8结合，所述的牛β-酪蛋白基因存在于内源区域中而不在载体构建体中。在1％琼脂糖凝胶中，所示的基因靶向的细胞克隆代表4kb PCR产物。引物对序列和热循环条件显示如下：
SEQ ID No 5正向引物：5’-ccacacaggcatagagtgtctgc-3’
SEQ ID No 4反向引物：5’-ccacagaattgactgcgactgg-3’
  1个循环   92℃   2分钟
  35个循环   92℃   20秒
  65℃   45秒
  68℃   3分钟
  1循环   68℃   10分钟
牛β-酪蛋白基因靶向效率在实施例3-1和3-2中进行比较。
在实施例3-1中，两个细胞克隆鉴定为被基因靶向的(图28)。
如在实施例3-1中所示，pBCTPOKII载体转染体细胞后，分离出41个单克隆细胞。在这些细胞中，38个(93％)克隆细胞确定为转基因的，但是没有检测到靶向克隆细胞(0％)。pBCTPOKIII载体转染体细胞后，分离出31个单克隆细胞。其中，29个(94％)克隆细胞确定为转基因细胞，2个克隆细胞(7％)确定为基因靶向的BCTPOKIII载体位于基因组中的内源性牛β-酪蛋白基因的基因座(表1和图28)。
表1：BCTPOKII和BCTPOKIII载体的转染和靶向效率
  细胞类型       BCTPOKII        BCTPOKIII
  所分析的克隆细胞的数目   bEF   23   41   2   31
bESF 18 29
  转基因克隆细胞的数目   bEF   22(96％) 38(93％)   1(50％) 29(94％)
  bESF   16(89％)   28(97％)
  靶向克隆细胞的数目   bEF   0(0％) 0(0％)   0 2(7％)
  bESF   0(0％)   2
如实施例3-2所示，pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII载体转染bEF和bESF细胞，靶向的细胞克隆用长链PCR分析确认。这里，对于小量的DNA样品，进行二次PCR分析(图27和29)。
二次PCR反应的热循环条件和实施例5中的一样。在1％琼脂糖凝胶中，所示的靶向细胞克隆代表3.4kbPCR产物。二次PCR反应的引物对序列显示如下：
SEQ ID No 8正向引物：5’-ttcactgcattctagttgtggtttgtcca-3’
SEQ ID No 9
反向引物：5’-tctaggaccaaacatcggcttactt-3’。
如图29A所示，pBCTPOKIDTII载体转染的编号5、30、17、18、20、21和26的bESF细胞克隆鉴定为被靶向。B显示pBCTPOKIII载体转染的编号16的bESF细胞克隆被靶向。C是用作阴性对照(-)的野生型牛基因组DNA的和用作阳性对照(+)的pneoBC3.7载体的长链PCR分析结果。
pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII载体转染bEF和bESF细胞和比较靶向效率。18.2％(10/55)的pBCTPOKIII载体转染的bEF细胞克隆和41.4％(12/29)的pBCTPOKIDTII载体转染的bEF细胞克隆为基因靶向，说明pBCTPOKIDTII载体的靶向效率比pBCTPOKIII载体的高2.3倍(41.4％/18.2％)。并且，5.7％(12/212)的pBCTPOKIII载体转染的bESF细胞克隆，36.6％(63/172)的pBCTPOKIDTII载体转染的bESF细胞克隆为基因靶向，说明pBCTPOKIDTII载体的靶向效率比pBCTPOKIII载体高6.4倍(36.6％/5.7％)。在这两种细胞类型中，pBCTPOKIDTII载体的平均靶向效率比pBCTPOKIII载体高4.5倍(37.3％/8.3％)(表2)，表明pBCKIDTII载体盒是高效的牛β-酪蛋白基因靶向载体。另外，pBCTPOKIDTII载体在bEF细胞中的靶向效率比先前在山羊胚胎纤维原细胞的靶向载体(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)靶向效率高3.3倍(41.4％/12.7％)，表明本发明的载体是高效的基因靶向载体。
表2.pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII载体的转染和靶向效率
细胞类型   分析的细胞克隆数目   靶向的细胞克隆数目 ％ ％
pBCTPOKIII   bEF   55   10   18.2％ 8.3％
  bESF   212   12   5.7％
pBCTPOKIDTII   bEF   29   12   41.4％ 37.3％
  bESF   172   63   36.6％
实施例6-Southern印迹分析重新确认靶向的细胞克隆
使用实施例1描述的载体，参考实施例3方法完成牛β-酪蛋白基因靶向。结果显示，靶向效率是多变的，并依赖于载体和转染细胞的类型。
这里，使用实施例3-1方法，pBCTPOKIII载体靶向的两个细胞克隆通过Southern印迹重新分析。
通过PCR反应鉴定为基因靶向的两个克隆细胞，用Southern印迹再一次分析。将这两个细胞克隆分别转移到两个100毫米的培养皿中。从其中两者之一收集细胞，从每个克隆中提取至少10毫克DNA，用EcoRI在37℃消化16小时。通过50V电压1×TAE缓冲液0.75％琼脂糖凝胶，电泳16小时分离EcoRI消化的DNA。将DNA转移到带正电荷的尼龙膜(Boehringer Mannheim公司)，用靶向载体构建体中人TPO cDNA的探针杂交(看图30)。根据指导(Roche公司)用SEQ ID No 3和4的引物制备Southern印迹探针。使用“PCR DIG标记混合物”(Roche公司)和“Taq DNA聚合酶”(QIAGEN公司)进行PCR反应。热循环条件如下：
  1个循环   94℃   3分钟
  30个循环   94℃   45秒
  52℃   30秒
  72℃   1分钟
  1个循环   72℃   10分钟
用Southern印迹再次确认先前确定为基因靶向的两个克隆(图31)。这这两个靶向细胞克隆是编号81和89细胞系。
编号81细胞克隆命名为BCTPOKIbESF81，保藏于在韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，KCTC位于韩国大田305-333宇松区欧洞#52保藏日期为2004年11月10日，保藏编号KCTC-10720BP。
实施例7-制备牛的体细胞
根据韩国国家牲畜研究所动物安全和使用委员会指南进行实验。从荷兰斯坦因种(Holstein)母牛怀孕45天的胎儿中分离牛胚胎纤维原细胞(bEF)，Holstein母牛每年生产超过12,000公斤牛奶，制备如先前所述(Koo等人，Biol Reprod.，63(4)；986-992，2000)。用虹膜剪除去胎儿头部，用两把watchmarker镊子舀出并除去肝和肠等软组织。从每年生产超过12,000公斤牛奶的两岁大荷兰斯坦因种(Holstein)母牛耳部皮肤中分离牛耳部皮肤纤维原细胞(bESF)。用PBS(Gibco BRL公司)清洗两遍后，bEF和bESF在100毫米培养皿中用外科手术刀切碎。在室温下进行操作。切碎的组织在盛有10毫升的0.05％(w/v)胰蛋白酶的0.53mM EDTA溶液的培养器皿中于38.5℃孵育30分钟。通过添加含有10％胎牛血清的等体积的细胞培养基使胰蛋白酶失活。细胞培养基是含有10％FBS、1000单位的青霉素和1000微克每毫升的链霉素(Gibco BRL公司)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco modified Eagle medium)。剧烈抽吸后，150xg离心上清液5分钟。悬浮细胞，调节终浓度为2×106个细胞每毫升，然后在10毫升培养基37℃5％CO2空气的175-cm2的组织培养瓶中培养(Nunc，Roskilde，丹麦)，直到汇合。bEF和bESF细胞在添加20％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO)的冰Dulbecco磷酸盐缓冲液中冷却，在-70℃冷冻16小时。细胞储藏在液氮中直到转染实验。
为了得到基因靶向细胞系，DNA转染的细胞应该在体外培养中存活一长段时间，而没有形态上的改变和凋亡。在本发明中，将BCTPOKII和BCTPOKIII载体导入两种类型体细胞：bEF和bESF。据报道，牛出生后的纤维原细胞比牛胎儿纤维原细胞在培养基中能维持更长时间的相对稳定的染色体组型(Williams等人，Mol Reprod Dev.，66(2)；115-125，2003)。在本发明中，在体外培养物中bESF比bEF保持更长时间的正常的形态(表2)。
表2.4代和8代细胞存活率
  细胞类型   克隆数目   存活率
  4代   8代
  bEF   149   9   6％
  bESF   304   51   17％
4代304个bESF克隆中51个(17％)传至8代，显示正常的形态。然而，只有6％的bEF细胞克隆传至8代。在本实验中，我们从bESF细胞中得到了两个基因靶向克隆。
实施例8-冻融冷冻的基因靶向细胞
当基因靶向细胞在两个100毫米的培养皿中生长至汇合时，对一个平板上的细胞进行Southern印迹分析。另一平板的一半细胞进一步传代培养，其余的一半细胞在-70℃冷冻16小时后储藏在液氮中。为了得到大量用作供体细胞的细胞，重复细胞亚培养和储藏的过程。细胞冷冻培养基包含添加20％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO)的DMEM。
尽快融解一小瓶冷冻的基因靶向细胞后，将溶液转移到含9毫升细胞培养基的15毫升试管中，1000转每分钟离心3分钟。在3毫升培养基中重悬细胞沉淀，涂布到含有3毫升培养基的6孔培养板上，然后在细胞核转移之前在37℃5％CO2空气中培养。
实施例9-细胞核转移
从屠宰场的牛卵巢获得牛卵母细胞，在38.57℃5％CO2湿润空气的成熟培养基中培养。成熟培养基包含了添加10％(V/V)牛胎血清(FBS)(Gibco BRL，Grand Island，NY公司)的含Eagle盐和L-谷氨酸的TCM-199(Sigma Chemical公司)、1微克每毫升的雌二醇、1微克每毫升的FSH-P(Schering-Plough Animal Health Corp.，Kenilworth，NJ公司)和25mM NaHCO3。在体外成熟之后，卵母细胞转移到500微升含有0.1％透明质酸酶的TL-Hepes，然后手动吸取除去堆积的卵母细胞。使用一个精细的玻璃针部分切开裸露卵母细胞的透明带(Tsunoda等人，J Exp Zool.，240(1)；119-125，1986)。应用装备反向显微镜的显微操作器(Leitz，Ernst Leitz Wetzlar GmbH，德国)进行卵母细胞的去核和细胞注射操作。用于操作的介质是包含7.5微克每毫升细胞松弛素B的TL-Hepes。用内径20微米微移液器同时除去第一极体和部分可能包含中期II染色体的细胞质。单基因靶向细胞分别转到受体细胞质的卵周隙。在50微升细胞融合培养基中小滴中平衡细胞-细胞质复合物10-20秒，然后转移到具有间隔1毫米的两个电极的融合杯中，上盖融合培养基。细胞融合培养基包括0.3M甘露醇、0.5mM Hepes、0.01％牛血清白蛋白、0.1mM氯化钙和0.1mM氯化镁。使用Electro Cell Manipulator 2001(BTX，San Diego，CA)以1.6千伏每厘米的一次直流脉冲诱导细胞-细胞质复合物融合20毫秒。在室温下进行操作。融合脉冲1小时后没有可见体细胞的重组胚胎被确定为融合卵。电融合4小时后，用5μM离子霉素激活融合卵5分钟，再用添加10％FBS的2.5mM 6-二甲基-氨基嘌呤的CR1aa培养液(Rosenkrans等人，Biol Reprod.，49(3)；459-462，1993)在38.5℃5％CO2空气中处理3.5小时。
实施例10-重组胚胎的培养
重组胚胎在添加1mM谷氨酸和1x Eagle必需氨基酸溶液(Gibco BRL)的CR1aa培养基中培养。培养3天后，分裂的胚胎在4孔培养板的每个孔中于38.5℃和含5％CO2空气中进一步培养4天，4孔培养板中包含在老鼠胚胎纤维原细胞单层(添加10％FBS)上的750微升CR1aa(Park等人，Anim Reprod Sci.，59(1-2)；13-22，2000)。培养7天之后，观察到胚泡的形成。
实施例11-克隆胚胎的PCR分析
将每个胚胎转移到20μl的裂解缓冲液中，裂解缓冲液包含50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM pH8.5的Tris-HCl、0.5％偌乃洗涤剂P40、0.5％吐温和400微克每毫升蛋白酶K，65℃温育30分钟。95℃失活蛋白酶K 10分钟(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。使用“AccuPower PCR预混合液”(Bioneer公司)和SEQ IDNo 3、4的引物对对每个裂解的胚胎进行首次PCR，然后，用1微升的首次PCR产物进行嵌套PCR。使用SEQ ID No 3和7的引物和热循环条件如下：
嵌套PCR
SEQ ID No 7
反向引物：5’-gagacggacctgtccagaaagctg-3’
  1个循环   94℃   2分钟
  30个循环   94℃   1分钟
  65℃   30秒
  72℃   45秒
  1个循环   72℃   10分钟
对各种不同的发育阶段用PCR分析克隆的胚胎是否是转基因的(表3)。
表3.各种不同发育阶段的重组胚胎PCR分析
                                发育阶段
  1细胞   2细胞   4细胞   8细胞   16细胞 桑葚胚 胚泡 总数
  分析的胚胎数目 3 3 6 11 2 3 5 33
  转基因胚胎数目 3 3 6 11 2 3 5 33
结果显示，33个克隆胚胎中33个(100％)是转基因的。这一结果表明，本发明能够通过基因靶向的体细胞产生基因靶向的克隆动物。
图32显示了来自于细胞克隆81的核移植胚胎的PCR分析结果(图23)。
实施例12-来源于克隆胎儿的胚胎膜的长链PCR分析。
使用非外科方法将胚泡阶段的重组胚胎转移到受体。怀孕36天，用Foley导管(Agtech，Manhatan，KS)以非手术的方式从母牛子宫取出胎儿和胚胎膜。如实施例7所述在体外培养提取的胎儿和来源于胎儿的胚胎膜。长链PCR结果显示了4kb的条带，确认本发明的载体精确地靶向于来源自胚胎膜的培养细胞基因组中的β-酪蛋白基因(图33)。基因组DNA提取和长链PCR分析过程和实施例5所述相同。
工业实用性
如这里所描述的，使用由牛β-酪蛋白基因靶向载体所靶向的细胞移植核移植胚胎而制备的转基因牛能够在它们的牛奶中生产大量的具有生物医学或生物技术价值的蛋白质，并且在胚胎阶段或者出生后发育阶段外源蛋白质非调控的表达不会引起致死性。
关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约
                    国际表格
                原始保藏事项的受理
                  根据71条颁布的
致：韩龙万
韩国大田305-345宇松区星松洞汉那栋110-305
 I.微生物鉴定
 交存人给与的鉴定符号BCTPOKIbESF81(初级细胞系)   国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10720BP
 II.科学说明和/或所建议的分类学命名
 上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
 III.接收和受理
 该国际保藏单位于2004年11月10日接受并受理上述I中所命名的微生物
 IV请求转化的受理
 上述I所命名的微生物于   由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
 V.国际保藏单位
 名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52   有权代表国际保藏单位的人的签名PARK Yong-Ha，局长日期：2004年11月15日
关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约
                     国际表格
                原始保藏事项的受理
                  根据71条颁布的
致：韩龙万
韩国大田305-345宇松区星松洞汉那栋110-305
 I.微生物鉴定
 交存人给与的鉴定符号Escherichia coliDH5@/pBCTPOKIDTII   国际保藏单位给与的保藏号：KCTC 10864BP
 II.科学说明和/或所建议的分类学命名
 上述I所鉴定的微生物附有：[x]科学说明[]所建议的分类学命名(标有X是可获得的)
 III.接收和受理
 该国际保藏单位于2005年10月17日接受并受理上述I中所命名的微生物
 IV请求转化的受理
 上述I所命名的微生物于  由该国际保藏单位接收并请求将原始保存转化成由其受理的布达佩斯条约下的保存
 V.国际保藏单位
 名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国大田305-333宇松区欧洞#52   有权代表国际保藏单位的人的签名OH，Hee-Mock，局长日期：2005年10月21日
                    序列表
<110>韩国生命工学研究院
<120>使用同源重组的牛β-酪蛋白基因靶向载体
<150>PCT/KR2004003034
<151>2004-11-23
<160>9
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>牛酪蛋白基因扩增的引物
<400>1
attcagtcga gtggaacata aactttcagc c                                   31
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>牛酪蛋白基因扩增的引物
<400>2
catatgtcga ctgtgagatt gtattttgac t                                   31
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hTPO扩增的引物
<400>3
ggagctgact gaattgctcc tcgt                                          24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hTPO扩增的引物
<400>4
cctgacgcag agggtggacc ctcc                                          24
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鉴定基因靶向的引物
<400>5
ccacacaggc atagagtgtc tgc                                           23
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鉴定基因靶向的引物
<400>6
ccacagaatt gactgcgact gg                                            22
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌套式PCR引物
<400>7
gagacggacc tgtccagaaa gctg                                           24
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鉴定基因靶向的引物
<400>8
ttcactgcat tctagttgtg gtttgtcca                                      29
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鉴定基因靶向的引物
<400>9
tctaggacca aacatcggct tactt                                          25

Claims (13)

1、一种牛β-酪蛋白基因靶向载体，包括(1)具有5至12kb长度的第一区域，该区域与牛β-酪蛋白质基因的启动子和其侧翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白质基因的外显子1、内含子1和外显子2；(2)用于克隆编码目的蛋白质的核酸的区域；(3)编码正选择标记的区域；(4)具有2.8至3.5kb长度的第二区域，该区域与牛β-酪蛋白质基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外显子5、6、7和8，以及内含子5、6和7；其中，按照牛β-酪蛋白质基因5’-3’的排列方向，与第一区域相应的核酸序列位于与第二区域相应的核酸序列的上游。
2、根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第一区域长度是5.5至10kb。
3、根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第二区域的长度是3.0至3.2kb。
4、根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述阳性选择标记选自包括新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)和鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Gpt)的组。
5、根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体还包括阴性选择标记的区域。
6、根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述阴性选择标记是白喉毒素(DT)基因。
7、根据权利要求1或5所述的载体，其特征在于，所述载体是分别在图1、图2、图16或者图3中显示的pBCKI I、pBCKI II、pBCKIDT I或者pBCKIDT II。
8、一种牛体细胞，所述的牛体细胞使用权利要求1或者5所述的载体进行β-酪蛋白基因靶向。
9、一种胚胎，所述的胚胎利用权利要求8所述的牛体细胞进行核移植。
10、一种产生牛β-酪蛋白基因靶向的体细胞的方法，包括以下步骤：(1)将权利要求1或5所述的牛β-酪蛋白基因靶向载体导入牛体细胞；(2)在牛体细胞中发生同源重组事件；和(3)选择通过同源重组携带目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向的体细胞。
11、根据权利要求10的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的载体以线性或者缺失质粒载体骨架的删除形式导入细胞。
12、一种产生转基因牛的方法，包括以下步骤：(1)将权利要求1或5所述的牛β-酪蛋白基因靶向的载体导入牛体细胞；(2)在牛体细胞中发生同源重组事件；(3)选择通过同源重组携带目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向的体细胞；(4)将所述基因靶向的细胞导入去核牛胚胎以生产核移植胚胎；和(5)将胚胎移植进受体。
13、一种从转基因牛的牛奶中获得大量目的蛋白质的方法，所述的转基因牛根据权利要求12所述的方法获得。
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