CN1668187A - 能够产生人抗体的转基因有蹄动物 - Google Patents

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E·沙利文
P·卡西纳坦
R·A·戈德斯比
义巳黑岩
一磨富塚
功石田
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Abstract

本发明涉及用于生产大量异种抗体，如人抗体的新方法。优选地，该结果是通过使IgM重链表达失活和任选地通过使I g轻链表达失活，并且通过进一步导入导致异种抗体(如非牛抗体)，优选人抗体表达的人工染色体而得以实现。

Description

                            目录
发明背景........................................................................4
发明概述........................................................................5
附图说明.....................................................................45
发明详述.....................................................................55
实施例1：HAC的导入和重排.....................................................62
    插入HAC的程序的概述.......................................................62
    插入HAC的示例性程序.......................................................64
    人重链基因座在ΔHAC牛胎儿中重排和
    表达的证明................................................................72
    人重链和轻链基因座在ΔΔHAC胎儿
    中的重排和表达............................................................77
    在HAC牛崽中表达人抗体蛋白..................................................82
    在HAC牛崽中产生的人抗体的表征..............................................86
实施例2：传统的牛核移植胚胎中核重新编程缺陷的
证据.........................................................................88
实施例3：传统的牛核移植胚胎中示例性的核重新编程
缺陷.........................................................................95
实施例4：传统的牛核移植胚胎中额外的示例性核重新编程
缺陷.........................................................................98
实施例5：应用重新编程的供体染色质克隆哺乳
动物.......................................................................102
实施例6：应用重新编程的透化处理细胞克隆哺乳
动物.........................................................................114
实施例7：应用两种新克隆方法进行更完全的核重新编程
的证据：染色质转移(CT)和链球菌溶血素O
转移(SLOT)...................................................................121
实施例8：应用染色质转移(CT)进行更完全的核重新编程的
证据......................................................................127
实施例9：应用链球菌溶血素O转移(SLOT)进行更完全的
核重新编程的证据............................................132
实施例10：应用链球菌溶血素O转移(SLOT)进行更完全核重新
编程的示例性证据............................................133
实施例11：应用链球菌溶血素O转移(SLOT)进行更完全核重新
编程的进一步证据............................................139
实施例12：生成嵌合哺乳动物的方法.............................145
任选地从非转基因胚胎中去除细胞..............................150
实施例13：在一种或多种内源抗体中具有突变的
产生异种抗体的转基因有蹄动物................................152
实施例14：用于使内源免疫球蛋白基因突变的方法...............159
产生表达人Ig的转基因有蹄动物的敲除法........................164
应用导向策略改变其它有蹄动物的免疫球蛋白基因...............172
实施例15：牛IgM敲除........................................173
除去μ重链基因座的外显子1-4................................173
将转录终止序列插入μ重链基因座..............................181
实施例16：任选免疫耗尽内源抗体.............................188
    产生与内源有蹄动物抗体反应的抗体.......................188
    产生与牛抗体反应的马抗体的示例性方法...................191
    用于免疫耗尽内源有蹄动物抗体的示例性方法...............192
    抑制胎儿中的B细胞发育.................................193
    用于使有蹄动物耐受的胎儿细胞移植程序和随后施用
    抗体抑制内源抗体的产生.................................194
实施例17：α-1，3-半乳糖基转移酶活性降低的转基因有蹄动物...195
实施例18：使用腺伴随病毒使内源基因突变的产生转基因
有蹄动物的替代方法.........................................198
实施例19：人Ig表达的检验...................................202
含有异种抗体的转基因抗血清和乳汁...........................203
实施例20：任选评估有蹄动物的疼痛、不适和总体健康...........207
权利要求书.................................................209
摘要.......................................................226
                    能够产生人抗体的转基因有蹄动物
发明背景
概言之，本发明提供了带有或者部分或者全部异种抗体基因座的遗传修饰有蹄动物，所述基因座经历了重排并且表达抗体分子的多样化群体。特别是，所述异种抗体基因可以来源于人类。另外，本发明提供其中所述内源抗体基因的表达或者被减少或者被去除的有蹄动物。运用核转移和分子技术的组合，产生所述有蹄动物(例如牛)中的遗传修饰。这些克隆转基因有蹄动物(如牛)提供了一种可更新的、理论上无限的异种多克隆抗体(特别是人抗体)的供应，所述异种多克隆抗体可具有例如作为治疗剂、诊断剂的用途和可用于纯化目的。本发明还涉及用于减少表达内源和异种抗体的非人哺乳动物，如有蹄动物中的内源性抗体量的方法。这些方法增加了异种B细胞和哺乳动物表达的异种抗体的百分比。
1890年，Shibasaburo Kitazato和Emil Behring报道了一个有着特别结果的实验；特别是，他们证明，通过从免疫动物取出血清，并将其注射到未免疫动物体内，可以使免疫从一只动物转移至另一只动物。这一里程碑性的实验成为将被动免疫引入临床实践的基础。今天，人免疫球蛋白(Ig)的制备及其在被动免疫方面的应用是标准的医学实践。仅在美国，人Ig每年的销售额为$1,400,000,000，每年有16公制吨的人抗体用于抗体静脉治疗。在工业最发达国家的经济中有相当水平的消耗，可以预期在发展中国家中其需求将快速增长。目前，用于被动免疫的人抗体得自人类供体的混合血清。这意味着在可用于治疗和预防的人抗体的量存在固有的限制。其需求已经超过了供应，并且通常是严重短缺。因此，需要改进的方法来产生不含非人抗体的人抗体，用于临床应用。
例如，将非常需要在血流中产生所需物种的多克隆抗体(尤其是人Ig)并且产生一系列不同的对所需抗原具有特异性的抗体的改进方法和增强的转基因动物。更尤其是在有蹄动物，如牛中生产人Ig将特别有益，因为(1)牛可以产生大量的抗体，(2)牛可以用人类病原体或其它病原体免疫，并且(3)牛可以用来制备抗人类抗原的人抗体。大量多克隆抗体的可得性对于传染病的治疗和预防、免疫系统的调节、人细胞例如癌细胞的清除以及特定人类分子的调节有利。
发明概述
表达异种抗体和/或表达水平降低的功能性内源抗体的转基因有 蹄动物
第一方面，本发明提供了具有一种或多种编码全部或部分异种免疫球蛋白(Ig)基因的核酸的转基因有蹄动物(如牛)，所述基因经历重排并且表达一种以上的异种Ig蛋白。在一种优选实施方案中，编码全部或部分异种Ig基因的核酸是人类的。优选地，所述核酸编码异种抗体，如人抗体或多克隆抗体。在多种实施方案中，Ig链或抗体在血清和/或乳汁中表达。
另一方面，本发明涉及具有减少内源性抗体表达的突变的转基因有蹄动物(如牛)。优选地，所述突变减少了功能性IgM重链表达或基本上去除了功能性IgM重链表达。在一些实施方案中，将转录终止序列插入内源性μ重链核酸中(如插入外显子2的起始ATG密码子的下游)。在其它优选实施方案中，所述突变减少了功能性Ig轻链表达或基本上去除了功能性Ig轻链表达。在其它优选实施方案中，所述突变减少了功能性IgM重链和功能性Ig轻链表达或基本上去除了IgM重链和功能性Ig轻链表达。在另一优选实施方案中，所述有蹄动物具有一种或多种编码全部或部分异种Ig基因的核酸，所述基因经历重排并且表达一种以上异种Ig分子，如异种抗体蛋白。
来自表达异种抗体和/或表达水平降低的功能性内源抗体的转基 因有蹄动物的细胞
本发明还提供了获得自本发明的任意一种有蹄动物(如牛)的细胞或用于产生本发明的任意一种有蹄动物的细胞。
因此，在另一方面，本发明涉及具有一种或多种编码全部或部分异种Ig基因的核酸的有蹄动物体细胞(如牛体细胞)，所述基因能够经历重排并且在B细胞中表达一种或多种异种Ig分子。优选地，编码全部或部分异种Ig基因的核酸表达异种抗体蛋白。示例性的有蹄动物细胞包括胎儿成纤维细胞和B细胞。
在另一方面，本发明涉及在编码Ig重和/或轻链的核酸中具有突变的有蹄动物体细胞(如牛的体细胞)。在优选实施方案中，所述细胞在IgM重链或Ig轻链的一个或两个等位基因中具有突变。在一些实施方案中，将转录终止序列插入内源性μ重链核酸(如插入外显子2的起始ATG密码子下游)或Ig轻链核酸。在一些实施方案中，将转录终止序列插入内源性μ重链核酸(如插入外显子2的起始ATG密码子下游)或Ig轻链核酸。在优选实施方案中，所述细胞也具有一种或多种编码全部或部分异种Ig基因的核酸，所述基因能够经历重排并且在B细胞中表达一种或多种异种Ig分子。优选地，编码全部或部分异种Ig基因的核酸表达异种抗体，如来自于其它属的抗体蛋白(如人抗体)。示例性的有蹄动物细胞包括胎儿成纤维细胞和B细胞。
在另一方面，本发明涉及由本发明的有蹄动物B细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤。优选地，所述杂交瘤分泌外源抗体，如人抗体。
用于在转基因有蹄动物中产生异种抗体的方法
本发明还提供了用本发明的有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)产生抗体的方法。一种所述方法包括给具有一种或多种编码异种抗体基因座的有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)施用一种或多种感兴趣的抗原。基因座中的核酸片段经历了重排，导致抗原的特异性抗体的产生，并且从有蹄动物回收抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。特定抗原的单克隆和多克隆抗体具有多种用途，例如，它们可以用作病原微生物如细菌或病毒感染的预防性或治疗性组合物中的成分。在多种实施方案中，从有蹄动物的血清或乳汁中回收抗体。在优选实施方案中，有蹄动物具有减少内源性抗体表达，减少功能性IgM重链表达，或减少功能性Ig轻链表达的突变。在一些实施方案中，将转录终止序列插入内源性μ重链核酸(如插入外显子2的起始ATG密码子下游)或Ig轻链核酸。
在相关方面，本发明涉及另一种产生抗体的方法。该方法包括从具有编码异种抗体基因座的核酸的有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)回收异种抗体。基因座中的核酸片段经历重排，导致异种抗体蛋白的产生。在特定实施方案中，抗体的轻链和/或抗体的重链由人核酸编码。抗体可以是单克隆或多克隆的。在特定实施方案中，在没有用特异性抗原免疫有蹄动物的情况下产生的多克隆抗体，如IgG抗体被用作由人血清产生的IVIG(静脉内免疫球蛋白)的治疗替代物。在多种实施方案中，从有蹄动物的血清或乳汁中回收抗体。优选地，有蹄动物具有减少内源性抗体表达，减少功能性IgM重链表达，或减少功能性Ig轻链表达的突变。优选地，将转录终止序列插入内源性μ重链核酸(如插入外显子2的起始ATG密码子下游)或Ig轻链核酸。
产生转基因有蹄动物的方法
本发明还涉及产生转基因有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)的方法。这些方法可以用于产生具有需要的突变或具有需要的异种核酸的转基因有蹄动物。
在一个这样的方面，本发明涉及产生转基因有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)的方法，包括将细胞、细胞的染色质团、或细胞核插入卵母细胞。所述细胞包括内源抗体重链和/或轻链核酸中的第一种突变。优选在允许卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将卵母细胞或由卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫。优选地，所述胎儿发育成可存活的后代。在一些实施方案中，细胞包括一种或多种编码全部或部分异种Ig基因的核酸，所述基因能够经历重排并且在B细胞中表达一种或多种异种Ig分子。优选地，将转录终止序列插入细胞的内源性μ重链核酸(如插入外显子2的起始ATG密码子下游)或Ig轻链核酸。
在上述方面的多种实施方案中，该方法也包括从胚胎、胎儿或由胎儿产生的后代分离细胞，并且在细胞内的内源抗体重链和/或轻链核酸中导入第二种突变。将细胞的染色质团或细胞核插入卵母细胞，在允许卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将卵母细胞或由卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫。
在另一方面，本发明涉及产生转基因有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)的另一种方法。该方法包括将具有一种或多种异种核酸的细胞、细胞的染色质团、或细胞核插入卵母细胞。所述异种核酸编码全部或部分异种Ig基因，所述基因能够经历重排并且在B细胞中表达一种以上的异种Ig分子。优选在允许卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将卵母细胞或由卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫。优选地，所述胎儿发育成可存活的后代。优选地，编码全部或部分异种Ig基因的核酸编码异种抗体。在另一优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在另一优选实施方案中，免疫球蛋白链或抗体在血清和/或乳汁中表达。在一些实施方案中，供体细胞具有在内源抗体重链和/或轻链核酸中的突变，如插入转录终止序列。
用于减少表达内源和异种抗体的有蹄动物中的不需要的内源抗体 量的方法以及用于在有蹄动物中产生异种抗体的方法
本发明也涉及用于在非人哺乳动物，如有蹄动物(如牛)中主要产生异种抗体，或仅仅产生异种抗体的改进的方法。具体地，这些方法包括给表达内源和异种抗体的哺乳动物施用抑制内源性B细胞活性或破坏内源性B细胞的化合物，如抗IgM或抗Ig抗体，施用量足以减少内源性B细胞或抗体的活性或量。这些化合物可以在哺乳动物免疫系统发育的正常阶段(即胚胎、胎儿或出生后阶段)施用，或者在免疫系统发育的该阶段之后施用。优选地，抑制内源性B细胞或抗体的抗体不显著抑制异种B细胞或完全异种的抗体。得到的单克隆或多克隆异种抗体具有多种用途，例如，它们可以用作致病性微生物如细菌或病毒感染的预防或治疗性组合物中的成分。
因此，一方面，本发明提供了减少非人哺乳动物(如有蹄动物)中内源抗体的量或活性的方法。该方法包括给表达内源抗体和异种抗体的有蹄动物(如牛)施用与完全或部分内源的抗体反应的抗体，施用量足以减少完全或部分内源的抗体的量和/或活性。在一种优选实施方案中，所述抗体在初乳前施用。
在一个相关方面，本发明提供了在非人哺乳动物(如有蹄动物)中产生异种抗体的方法。该方法包括给表达内源抗体和异种抗体的有蹄动物(如牛)施用与完全或部分内源的抗体反应的抗体，施用量足以减少完全或部分内源的抗体的量或活性。从有蹄动物回收异种抗体。在一种优选实施方案中，从有蹄动物的血清或乳汁回收异种抗体。在其它优选实施方案中，异种抗体的一些或全部是完全异种的抗体。在一种优选实施方案中，所述抗体在初乳前施用。
在另一个相关方面，本发明提供了在非人哺乳动物(如有蹄动物)中产生异种抗体的另一种方法。该方法包括将细胞、细胞核或染色质团插入去核卵母细胞，从而形成核转移卵母细胞。所述细胞、细胞核或染色质团具有编码第一种异种抗体的核酸和编码与内源抗体反应的第二种抗体的核酸，在允许核转移卵母细胞或由核转移卵母细胞形成的胚胎发育成胎儿或存活后代的条件下将其转移到宿主有蹄动物的子宫中。所述胎儿或后代表达异种的第一种抗体和第二种抗体，所述第二种抗体减少内源抗体的量和/或活性。优选地，在肝特异性启动子的控制下表达第二种抗体。一些优选的第二种抗体与内源性IgM或内源性免疫球蛋白分子反应。优选从有蹄动物回收异种抗体。在优选实施方案中，从有蹄动物的血清或乳汁回收异种抗体。在其它优选实施方案中，异种抗体的一些或全部是完全异种的抗体。
用于采用来自两个胚胎的细胞克隆非人哺乳动物的方法，其中优 选将来自核转移胚胎的细胞掺入得到的胎儿组织，并且优选将来自另 一胚胎的细胞掺入得到的胎儿组织以促进胎儿存活
本发明还提供了用于克隆非人哺乳动物的改进的方法。这些哺乳动物是通过将来自核转移第一胚胎(如通过将细胞、细胞核或染色质插入去核卵母细胞而形成的胚胎)与来自体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的第二胚胎的细胞合并而形成的。将得到的嵌合胚胎在允许其发育成胎儿或存活后代的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫。至少一些来自于第二胚胎的细胞优选被掺入胎盘组织并且促进得到的嵌合胚胎的存活。优选地，来自核转移第一胚胎而不是第二胚胎的大多数细胞及其后代被掺入得到的嵌合胚胎的胎儿组织。这样，来自于该嵌合胚胎的胎儿或后代中的大多数细胞优选具有与核转移第一胚胎而不是第二胚胎的基因组基本同一或相同的基因组。为了减少掺入胎儿组织或后代中的来自第二胚胎的细胞及其后代的数目，给嵌合胚胎、胎儿或后代施用与来自第二胚胎的抗原反应的抗体，施用量足以减少掺入胎儿组织或后代中的来自第二胚胎的细胞的量和/或活性。
因此，在本发明的一方面，提供了一种克隆非人哺乳动物的方法。该方法包括将细胞、细胞核或染色质团插入卵母细胞，从而形成第一胚胎。使来自第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎(如体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎)的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎。将第三胚胎在允许其发育成胎儿或存活后代的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。将与来自于第二胚胎的抗原(如B细胞或生殖细胞抗原)反应的抗体施用于第三胚胎、胎儿或后代，施用量足以减少掺入第三胚胎、胎儿或后代中的来自第二胚胎的细胞的量和/或活性。
在一个相关方面，本发明提供了另一种克隆非人哺乳动物的方法。该方法包括在允许从透化细胞的细胞核、染色质团或染色体去除因子或向细胞核、染色质团或染色体加入来自重新编程(reprogramming)培养基的因子的条件下在重新编程培养基中孵育透化细胞，从而形成重新编程的(reprogrammed)细胞。将重新编程的细胞插入卵母细胞，从而形成第一胚胎。使来自第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎(如体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎)的一个或多个细胞接触，从而形成第三胚胎。在允许第三胚胎发育成胎儿或存活后代的条件下将第三胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。将与来自于第二胚胎的抗原反应的抗体施用于第三胚胎、胎儿或后代，施用量足以减少掺入第三胚胎、胎儿或后代中的来自第二胚胎的细胞的量和/或活性。
本发明也提供了生产嵌合胎儿或后代的方法，其中来自用于产生嵌合胎儿或后代的起始胚胎之一的细胞具有编码异种抗体(如人抗体)的核酸。此外，来自前述起始胚胎或另一起始胚胎的细胞具有编码与内源抗体(如由来自任一用于产生嵌合胎儿或后代的起始胚胎的细胞天然产生的抗体)反应的抗体的核酸，所述与内源抗体反应的抗体减少得到的胎儿或后代中内源抗体的量或活性。
在一个这样的方面，本发明涉及克隆非人哺乳动物的方法。该方法包括将细胞、细胞核或染色质团插入卵母细胞，从而形成第一胚胎。所述细胞、细胞核或染色质团具有编码异种的第一种抗体的核酸和编码与内源抗体反应的第二种抗体的核酸。使来自第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎(如体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎)的一个或多个细胞接触，从而形成第三胚胎。在允许第三胚胎发育成胎儿或存活后代的条件下将第三胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。得到的胎儿或后代表达异种的第一种抗体和第二种抗体，所述第二种抗体减少内源抗体的量和/或活性。优选地，在肝特异性启动子的控制下表达第二种抗体。一些优选的第二种抗体与内源性IgM或内源性免疫球蛋白分子反应。
在一个相关方面，本发明提供了另一种克隆非人哺乳动物的方法。该方法包括在允许从透化细胞的细胞核、染色质团或染色体去除因子或从重新编程培养基向细胞核、染色质团或染色体加入因子的条件下在重新编程培养基中孵育透化细胞，从而形成重新编程的细胞。所述细胞具有编码异种的第一种抗体的核酸和编码与内源抗体反应的第二种抗体的核酸。将重新编程的细胞插入卵母细胞，从而形成第一胚胎。使来自第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎(如体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎)的一个或多个细胞接触，从而形成第三胚胎。在允许第三胚胎发育成胎儿或存活后代的条件下将第三胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。得到的胎儿或后代表达异种的第一种抗体和第二种抗体，所述第二种抗体减少内源抗体的量和/或活性。优选地，在肝特异性启动子的控制下表达第二种抗体。一些优选的第二种抗体与内源性IgM或内源性免疫球蛋白分子反应。
在上述任意一种克隆方法的优选实施方案中，第一胚胎包括一种或多种编码全部或部分异种免疫球蛋白(Ig)基因的核酸，所述基因经历重排并且在B细胞中表达至少一种异种Ig分子。在其它优选实施方案中，第一胚胎包含编码全部或部分重排的异种免疫球蛋白基因的核酸，所述基因在B细胞中表达至少一种异种Ig分子。在一些实施方案中，第一胚胎或第二胚胎包含减少内源抗体表达的突变。在其它优选实施方案中，所述抗体与在B细胞或生殖细胞表面表达的抗原反应，如抗体或细胞表面蛋白或受体。在一些实施方案中，施用的抗体是抗IgM或抗免疫球蛋白抗体。在优选实施方案中，所述抗体在初乳前施用。
用于上述方法的优选有蹄动物
示例性的有蹄动物包括奇蹄目和偶蹄目的成员，如牛属的成员。其它优选的有蹄动物包括绵羊、大角绵羊、山羊、水牛、羚羊、牛、马、驴、骡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼、猪和象。在一种优选实施方案中，受体有蹄动物小于50，40，30，20，10，7，5，4，3，2，或1周龄。在多种实施方案中，在第一、第二或第三个三月期将抗体施用于胎儿。在另一个优选实施方案中，允许胎儿在怀孕的或宿主有蹄动物中发育至选定的时间，然后手术取出胎儿或采用标准方法诱导分娩。例如，可以通过剖腹产取出存活的胎儿，或可以在胎儿足月之前1，2，3，5，10，15，20，或更多天前人工诱导分娩。这些年幼的受体有蹄动物可以具有天然抑制的免疫系统，从而使得施用减少内源抗体的抗体引起的不利免疫应答最小或防止该不利免疫应答。其它优选的有蹄动物天然或自发具有比正常动物反应性更低的免疫系统。
表达异种抗体的优选有蹄动物包含天然排列的人染色体的区段(如人染色体片段)或包含人工工程化的人染色体片段(即所述片段可以相关于人基因组重排)。优选的有蹄动物具有一种或多种具有异种抗体基因座的核酸(如编码全部或部分异种免疫球蛋白(Ig)基因的核酸，所述基因经历重排并且表达至少一种异种Ig分子)。优选地，所述核酸具有未重排的抗体轻链核酸区段，其中所有编码V基因区段的核酸区段与所有编码J基因区段的核酸区段隔开一个或多个核苷酸。其它优选的核酸具有未重排抗体重链核酸区段，其中(i)所有编码V基因区段的核酸区段与所有编码D基因区段的核酸区段隔开一个或多个核苷酸，和/或(ii)所有编码D基因区段的核酸区段与所有编码J基因区段的核酸区段隔开一个或多个核苷酸。
其它优选的有蹄动物具有一个或多个编码全部或部分表达至少一种异种Ig分子的重排的异种免疫球蛋白(Ig)基因。在一些实施方案中，该核酸包含在染色体片段中。所述核酸可以整合到有蹄动物的染色体中或维持在有蹄动物细胞中，独立于宿主染色体。
在本发明任何方法的其它优选的实施方案中，抗体的轻链和/或异种抗体的重链是由人核酸编码。在优选实施方案中，重链是μ重链，轻链是λ或κ轻链。在其它优选实施方案中，编码异种免疫球蛋白链或抗体的核酸处于其未重排的形式。在其它优选实施方案中，有蹄动物产生一类以上的异种抗体。在多种实施方案中，有蹄动物产生一种以上不同的异种Ig或抗体。异种抗体可以是多克隆或单克隆抗体。
产生用于上述方法的有蹄动物的优选方法
在产生表达异种抗体的转基因有蹄动物的特定实施方案中，有蹄动物是通过将具有一种或多种异种核酸的细胞插入卵母细胞中而产生的。异种核酸编码全部或部分异种Ig基因，该基因能够经历重排并且在B细胞中表达一种以上异种Ig分子。在允许卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将卵母细胞或卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。优选地，该胎儿发育成存活的后代。优选地，编码全部或部分异种Ig基因的核酸编码异种抗体。在其它优选实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。在其它优选实施方案中，在血清和/或乳汁中表达免疫球蛋白链或抗体。在多种实施方案中，核酸包含在染色体片段，如ΔHAC或ΔΔHAC。核酸可以维持在有蹄动物细胞中，独立于宿主染色体或者整合到细胞的染色体中。优选地，所述核酸基本是人类的。在其它实施方案中，异种抗体是来自于其它属的抗体，如人抗体。优选地，所述有蹄动物是牛、绵羊、猪或山羊。
我们以前已经公开了多种用于克隆哺乳动物的改进的方法，它们可以用于克隆哺乳动物，以用于本发明的方法中(U.S.S.N.10/032,191，2001年12月21日提交，和PCT/US01/50406，2001年12月21日提交)。具体地，这些方法包括将供体核浓缩成染色质团，以允许细胞核成分，如可能促进不利于核转移胚胎发育成存活后代的基因转录的转录因子的释放。在相关方法中，用重新编程培养基(如细胞提取物)孵育透化细胞，以便允许将因子加入细胞或从细胞去除，然后将透化细胞的质膜释放，以包裹需要的因子并且恢复细胞的膜完整性。如果需要，可以重复这些方法的步骤一次或多次，或者可以序贯进行不同的重新编程方法，以便增加重新编程的程度，导致克隆胎儿的更大存活力。
在包括使用这些改进的克隆方法的优选实施方案中，采用包括以下步骤的方法产生有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)：(a)在允许形成染色质团而不导致DNA复制的条件下孵育优选具有少于四组同源染色体(即，具有少于两对的完整的染色单体)的供体细胞核(如具有编码异种抗体的核酸的细胞核)，(b)将染色质团插入去核卵母细胞，从而形成核转移卵母细胞和(c)优选在允许核转移卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将核转移卵母细胞或由核转移卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。在一种优选的实施方案中，在允许细胞核或细胞质成分，如转录因子、阻抑蛋白、或染色质重塑蛋白加入细胞核或得到的染色质团，或从其中去除的条件下用重新编程培养基(如细胞提取物)孵育供体细胞核。优选地，使供体细胞核与在允许形成染色质团的条件下与以下一种或多种物质接触：在抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、去污剂和/或盐溶液、或蛋白激酶溶液。在其它优选实施方案中，重构的卵母细胞或得到的胚胎表达核纤层蛋白A、核纤层蛋白C或NuMA蛋白，其表达水平比具有相同数目的细胞和来自于相同物种的对照卵母细胞或对照胚胎表达的相应水平高不到5倍。
在其它优选实施方案中，产生有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)的方法包括在允许从透化细胞的细胞核、染色质团或染色体去除因子(如细胞核或细胞质成分，如转录因子)或向细胞核、染色质团或染色体加入因子的条件下用重新编程培养基(如细胞提取物)孵育透化细胞(如具有编码异种抗体的核酸的细胞)，从而形成重新编程的细胞。将重新编程的细胞插入去核卵母细胞，优选在允许卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将得到的卵母细胞或由卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。在优选实施方案中，使透化细胞在允许形成染色质团的条件下与以下一种或多种物质接触：在抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、去污剂和/或盐溶液、或蛋白激酶溶液。在另一种优选实施方案中，用分裂间期重新编程培养基(如分裂间期细胞提取物)孵育透化细胞。在另一优选实施方案中，透化细胞中的细胞核保持由膜围绕，并且在用该分裂间期重新编程培养基孵育过程中，细胞核中的染色质不浓缩。在某些实施方案中，在重新编程培养基中孵育透化细胞不导致DNA复制，或仅仅导致少于50，40，30，20，10或5％的细胞中的DNA复制。在其它实施方案中，在重新编程培养基中孵育透化细胞导致至少60，70，80，90，95或100％的细胞中的DNA复制。在多种实施方案中，透化细胞是通过用蛋白酶，如胰蛋白酶、去污剂，如洋地黄毒苷、或细菌毒素，如链球菌溶菌素孵育完整细胞而形成的。在一种优选实施方案中，在允许重新编程的细胞的细胞膜在插入卵母细胞前重新封闭的条件下孵育重新编程的细胞。在其它优选实施方案中，重构的卵母细胞或得到的胚胎表达核纤层蛋白A、核纤层蛋白C或NuMA蛋白，其表达水平比具有相同数目的细胞和来自于相同物种的对照卵母细胞或对照胚胎表达的相应水平高不到5倍。
产生用于上述方法的嵌合有蹄动物的优选方法
其它优选的有蹄动物是嵌合有蹄动物或用来自于两个或多个胚胎的细胞产生的有蹄动物。例如，来自于核转移胚胎(如通过将细胞、细胞核或染色质团插入去核卵母细胞形成的胚胎)的细胞可以与来自于体外受精、天然存在或孤雌生殖活化的胚胎的细胞组合。优选地，将大多数细胞和来自于核转移胚胎的它们的后代插入得到的嵌合胚胎的胎儿组织。来自于第二胚胎的至少一些细胞和它们的后代优选被掺入胎盘组织并且促进得到的嵌合胚胎的存活力。
在优选实施方案中，核转移胚胎具有编码异种抗体的核酸。优选地，将抗体施用于得到的胚胎、胎儿或后代，所述抗体抑制内源B细胞或来源于任一起始胚胎产生的细胞，但不显著抑制异种B细胞或抗体。
因此，在多种优选实施方案中，通过将细胞、细胞核或染色质团(如具有一种或多种编码异种抗体的核酸的细胞、细胞核或染色质团)插入卵母细胞，从而形成第一胚胎而产生有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)。使来自第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎。第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎。将第三胚胎在允许其发育成胎儿或存活后代的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
在一种实施方案中，第一胚胎和第二胚胎中至少一个是紧密胚胎。在另一实施方案中，第一胚胎和第二胚胎处于不同的细胞期。第一胚胎和用于产生第二胚胎的供体细胞可以来自于相同的物种或来自于不同的属或种。优选地，胎儿的滋养外胚层或胎盘组织中的至少1 0，20，30，40，50，60，70，80，90，95，或100％细胞来源于第二胚胎，或胎儿的内细胞团或胎儿组织中的至少30，40，50，60，70，80，90，95，或100％细胞来源于第一胚胎。在其它优选实施方案中，第一胚胎或第三胚胎表达核纤层蛋白A、核纤层蛋白C或NuMA蛋白，其表达水平比具有相同数目的细胞和来自于相同物种的对照胚胎表达的相应水平高不到5倍。
在其它优选实施方案中，通过在允许形成染色质团的条件下使供体细胞核(如编码异种抗体的细胞核)接触重新编程培养基(如细胞提取物)，并且将染色质团插入去核卵母细胞，从而形成第一胚胎而产生有蹄动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)。使来自第一胚胎的一个或多个细胞与来自体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎。在一种优选实施方案中，染色质团是在允许形成染色质团而不导致DNA复制的条件下使具有少于四组同源染色体的供体细胞核与重新编程培养基接触而形成的。在优选实施方案中，使供体细胞核在允许形成染色质团的条件下与以下一种或多种物质接触：在抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、去污剂和/或盐溶液、或蛋白激酶溶液。
在多种实施方案中，第一胚胎和第二胚胎都是紧密胚胎；第一胚胎和第二胚胎都是紧密化前(precompaction)胚胎；或者一个胚胎是紧密胚胎，另一个胚胎是紧密化前胚胎。第一胚胎和第二胚胎处于不同的细胞期或相同的细胞期。第一胚胎和用于产生第二胚胎的供体细胞可以来自于相同的物种或来自于不同的属或种。优选地，胎儿的滋养外胚层或胎盘组织中的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，95，或100％细胞来源于第二胚胎，或胎儿的内细胞团或胎儿组织中的至少30，40，50，60，70，80，90，95，或100％细胞来源于第一胚胎。在其它优选实施方案中，第一胚胎或第三胚胎表达核纤层蛋白A、核纤层蛋白C或NuMA蛋白，其表达水平比具有相同数目的细胞和来自于相同物种的对照胚胎表达的相应水平高不到5倍。
在其它优选实施方案中，本发明涉及克隆哺乳动物(如牛胚胎、胎儿、小牛或成年牛)的另一种方法。该方法包括在允许从透化细胞的细胞核、染色质团或染色体去除因子或从重新编程培养基向细胞核、染色质团或染色体加入因子的条件下在重新编程培养基(如细胞提取物)中孵育透化细胞(如具有编码异种抗体的核酸的细胞)，从而形成重新编程的细胞。将重新编程的细胞插入去核卵母细胞，从而形成第一胚胎。使来自第一胚胎的一个或多个细胞与来自体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎。在允许第三胚胎发育成胎儿的条件下将第三胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。在优选实施方案中，在允许细胞核或细胞质成分，如转录因子加入细胞核或得到的染色质团，或从其中去除的条件下用重新编程培养基(如细胞提取物)孵育透化细胞。在其它优选实施方案中，使透化细胞与在允许形成染色质团的条件下与以下一种或多种物质接触：在抗NuMA抗体存在或不存在下的有丝分裂提取物、去污剂和/或盐溶液、或蛋白激酶溶液。在另一种优选实施方案中，用分裂间期重新编程培养基(如分裂间期细胞提取物)孵育透化细胞。在另一优选实施方案中，透化细胞中的细胞核保持由膜围绕，并且在用该分裂间期重新编程培养基孵育过程中，细胞核中的染色质不浓缩。在某些实施方案中，在重新编程培养基中孵育透化细胞不导致DNA复制，或仅仅导致少于50，40，30，20，10或5％的细胞中的DNA复制。在其它实施方案中，在重新编程培养基中孵育透化细胞导致至少60，70，80，90，95或100％的细胞中的DNA复制。在多种实施方案中，透化细胞是通过用蛋白酶，如胰蛋白酶、去污剂，如洋地黄毒苷、或细菌毒素，如链球菌溶菌素孵育完整细胞而形成的。在另一种优选实施方案中，在允许重新编程的细胞的细胞膜在插入卵母细胞前重新封闭的条件下孵育重新编程的细胞。在多种实施方案中，第一胚胎和第二胚胎都是紧密胚胎；第一胚胎和第二胚胎都是紧密化前胚胎；或者一个胚胎是紧密胚胎，另一个胚胎是紧密化前胚胎。第一胚胎和第二胚胎处于不同的细胞期或相同的细胞期。第一胚胎和用于产生第二胚胎的供体细胞可以来自于相同的物种或来自于不同的属或种。优选地，胎儿的滋养外胚层或胎盘组织中的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，95，或100％细胞来源于第二胚胎，或胎儿的内细胞团或胎儿组织中的至少30，40，50，60，70，80，90，95，或100％细胞来源于第一胚胎。在其它优选实施方案中，第一胚胎或第三胚胎表达核纤层蛋白A、核纤层蛋白C或NuMA蛋白，其表达水平比具有相同数目的细胞和来自于相同物种的对照胚胎表达的相应水平高不到5倍。
在上述包括用来自于两个胚胎的细胞产生有蹄动物的任一方面的优选实施方案中，在接触来自于每个胚胎的细胞前除去第一胚胎或第二胚胎的透明带的部分或全部。在一个实施方案中，通过将第一和第二胚胎在溶液或固体支持物上置于彼此相邻的位置而使其接触。在另一实施方案中，用标准技术将来自于第一胚胎的细胞注射到第二胚胎。可以将细胞注射到第二胚胎的任意区域，如胚胎外周透明带和胚胎自身之间。示例性的天然存在的胚胎包括采用标准方法从怀孕的哺乳动物(如牛)手术或非手术取出的胚胎。示例性的体外受精的胚胎包括采用标准方法产生的细胞质内精子注射胚胎。也考虑了可以组合自于两个以上胚胎(如来自于3，4，5，6，或更多胚胎的细胞)以形成用于产生克隆哺乳动物的嵌合胚胎。
产生用于上述方法的有蹄动物的优选实施方案
在上述任意方面的优选实施方案中，通过富集或排除因子，如DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、活化物或阻抑物而修饰重新编程培养基(如细胞提取物)。在其它优选实施方案中，卵母细胞或嵌合胚胎中NuMA或AKAP95蛋白的表达水平在细胞核中比在细胞质中高至少2，5，10或20倍。在其它实施方案中，用0.1％Triton X-100，1mg/ml DnaseI和100mM或300mM NaCl的溶液提取卵母细胞或嵌合胚胎中的至少30，40，50，60，70，80，90，或100％AKAP95蛋白。优选地，在插入去核卵母细胞前从重新编程培养基(如提取物)纯化染色质团。在另一优选实施方案中，将染色质团插入去核卵母细胞包括在允许染色质团进入卵母细胞的条件下使染色质团和卵母细胞与致融合的化合物接触。在另一优选实施方案中，胎儿发育成存活后代。优选地，至少1，3，5，10，20，30，40，50，60，70，80，或90％的核转移卵母细胞或胚胎发育成存活后代。在该方法中，可以在允许细胞分裂的条件下培养含有染色质团的卵母细胞或重新编程的细胞，得到的细胞之一可以重新克隆一次或多次。用于该方法的供体细胞核、供体染色质团或供体细胞和卵母细胞可以来自于相同物种，或可以来自于不同的种或属。所述哺乳动物可以是人或非人哺乳动物，卵母细胞可以是受精的或未受精的。供体细胞核、染色质团或透化细胞优选是来自于G1或G0期细胞。此外，克隆胚胎、胎儿或哺乳动物的基因组DNA优选与供体细胞基本相同。也考虑可以将染色质团或重新编程的细胞插入胚胎，用于产生含有细胞混合物的嵌合胚胎、胎儿或哺乳动物，所述细胞混合物的DNA基本相同于染色质团或重新编程的细胞和具有与胚胎中天然存在的细胞基本相同的DNA的细胞的DNA。也考虑可以将去核卵母细胞用于本发明的方法中。
用于本发明的任意方面的重新编程培养基可以含有或不含有外源核苷酸。在其它优选实施方案中，在允许载体中的核酸和染色质团的基因组中的相应核酸随机整合或同源重组的条件下使重新编程培养基中的染色质团或在透化细胞中形成的染色质团与具有编码目的基因的核酸的载体接触，导致染色质团的基因组改变。由于缺少完整的质膜和缺少核膜，透化细胞或溶液中的染色质团可以比天然存在的细胞更容易进行遗传修饰。可以用于产生重新编程提取物的细胞的例子包括胚胎干细胞和来自于脑、血液、骨髓、胰腺、肝、皮肤或任何其它器官或组织的成人干细胞。其它示例性的重新编程细胞提取物包括卵母细胞提取物(如牛或海胆卵母细胞提取物)和雄性生殖细胞提取物(如脊椎动物、无脊椎动物或哺乳动物如牛的精原细胞、精母细胞、精子细胞或精子提取物)。供体或透化细胞可以是未永生化的或天然、自发或遗传工程永生化的。供体细胞、透化细胞、受体细胞或细胞质可以来源于任何年龄的来源，如胚胎、胎儿、幼年或成年哺乳动物。来自于幼年来源的细胞可以获得了更少的自发突变，因此在插入卵母细胞后可以具有更长的寿命。
用于上述方法的具有降低水平的内源抗体的优选有蹄动物
本发明的方法也可以用于具有减少内源抗体表达的突变的有蹄动物(如牛)。因此，去除该较低初始水平的内源抗体需要施用较少的抗体。优选地，所述突变减少功能性IgM重链的表达或基本去除功能性IgM重链的表达。在其它优选实施方案中，所述突变减少功能性Ig轻链的表达或基本去除功能性Ig轻链的表达。在其它优选实施方案中，所述突变减少功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达，或所述突变基本去除功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达。在一些实施方案中，将转录终止序列插入内源性μ重链核酸(如插入外显子2的起始ATG密码子的下游)或Ig轻链核酸中。优选地，所述有蹄动物也在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白和/或J链的内源核酸的一个或两个等位基因中具有突变。在其它优选实施方案中，所述有蹄动物具有编码外源J链，如人J链的核酸。优选地，所述突变减少或去除内源性α-(1，3)-半乳糖基转移酶、半乳糖基(α1，3)半乳糖表位、朊病毒蛋白和/或J链的表达。优选地，所述有蹄动物产生含有人J链的人IgA或IgM分子。
优选地，在内源性基因中具有一个或多个突变的转基因有蹄动物是通过将细胞、细胞的染色质团、或细胞核插入卵母细胞而产生的。所述细胞具有不被细胞天然表达的内源基因中的第一种突变。在允许卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将卵母细胞或由卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫。优选地，所述胎儿发育成存活后代。
产生用于上述方法中的，具有突变，如导致内源抗体水平降低的 突变的有蹄动物的优选方法
在其它优选实施方案中，通过插入包含一个盒的核酸，所述盒包含与编码选择标记的核酸可操作连接并且与一种或多种与待突变内源基因有显著序列同一性的核酸可操作连接的启动子，从而将所述盒整合到所述基因的一个内源等位基因中，而将第一突变导入细胞。在其它优选实施方案中，通过将包含第一盒的核酸插入到所述细胞中，所述第一盒包含与编码第一选择标记的核酸可操作连接并且与一个与待突变内源基因有显著序列同一性的第一核酸可操作连接的第一启动子，从而将所述第一盒整合到所述基因的第一内源等位基因中，而导入所述突变，产生第一转基因细胞。将包含第二盒的核酸插入到所述第一转基因细胞中，所述第二盒包括与编码第二选择标记的核酸可操作连接并且与一个与所述基因有显著序列同一性的第二核酸可操作连接的第二启动子。第二选择标记不同于第一选择标记，将所述第二盒整合到所述基因的第二内源等位基因中，产生第二转基因细胞。在其它优选实施方案中，从胚胎、胎儿或者胎儿产生的后代分离出细胞，并且将另一突变导入所述细胞的基因中。然后用所得的细胞、来自于所述细胞的染色质或者来自于所述细胞的细胞核，进行第二轮核转移，产生具有两个或两个以上突变的转基因有蹄动物。所述突变位于基因的相同或不同等位基因中，或者位于不同基因中。用于第一或任选第二轮核转移的细胞编码异种抗体。在特定实施方案中，所述细胞包含一种或多种编码全部或部分异种Ig基因的核酸，所述基因能够经历重排并且在B细胞中表达一种或多种异种Ig分子。在优选实施方案中，突变的细胞为成纤维细胞(例如胎儿成纤维细胞)。优选地，突变的内源基因与在成纤维细胞中无活性的内源启动子可操作连接。在其它优选实施方案中，与所述被突变的内源基因可操作连接的内源启动子的活性比与内源管家基因例如GAPDH可操作连接的内源启动子活性低80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％。启动子活性可以用任何标准测定来测量，所述测定例如测量所述基因所编码的mRNA或蛋白的水平(参见例如Ausubel等Current Protocols in MolecularBiology，volume 2，第11.13.1-11.13.3页，JohnWiley & Sons，1995)。这种产生转基因有蹄动物的方法的优点是使得在供体细胞(即作为核转移所用的遗传材料来源的细胞)中不表达的基因可以被突变。
优选地，在内源性抗体基因中具有突变的转基因有蹄动物是通过将细胞、细胞的染色质团、或细胞的细胞核插入卵母细胞而产生的。所述细胞包含内源抗体重链和/或轻链核酸中的第一种突变。在允许卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将卵母细胞或由卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫。优选地，所述胎儿发育成存活后代。优选地，用于产生转基因有蹄动物的细胞在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白和/或J链的内源核酸的一个或两个等位基因中具有突变。在其它优选实施方案中，所述细胞具有编码外源J链，如人J链的核酸。优选地，用于产生转基因有蹄动物的方法也包括分离来自于胚胎、胎儿或由胎儿产生的后代的细胞，并且将内源抗体重链和/或轻链核酸中的第二种突变(如插入转录终止序列)导入细胞。将细胞、细胞的染色质团或细胞的细胞核插入卵母细胞，在允许卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下将卵母细胞或由卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。用于第一或任选第二轮核转移的细胞编码异种抗体。
在产生上述转基因有蹄动物的其它实施方案中，通过以下方法制备用于产生转基因有蹄动物的细胞，该方法包括将具有一个盒的核酸插入细胞，所述盒包含与编码选择标记的核酸可操作连接并且与一种或多种与抗体重链或轻链核酸有显著序列同一性的核酸可操作连接的启动子。从而将所述盒整合到抗体重链或轻链核酸的一个内源等位基因中。
其它实施方案中，通过将具有第一盒的核酸插入到细胞中而产生细胞，所述第一盒包含与编码第一选择标记的核酸可操作连接并且与一个与抗体重链或轻链核酸有显著序列同一性的第一核酸可操作连接的第一启动子。将第一盒整合到抗体重链或轻链核酸的第一内源等位基因中，产生第一转基因细胞。将具有第二盒的核酸插入到所述第一转基因细胞中，所述第二盒包括与编码第二选择标记的核酸可操作连接并且与一个与抗体重链或轻链核酸有显著序列同一性的第二核酸可操作连接的第二启动子。第二选择标记不同于第一选择标记，将所述第二盒整合到抗体重链或轻链核酸的第二内源等位基因中，产生第二转基因细胞。
本发明的多种实施方案中，用来使内源有蹄动物核酸突变的核酸(例如敲除盒，所述敲除盒包括与编码选择标记的核酸可操作连接并且与一种与待突变基因有显著序列同一性的核酸可操作连接的启动子)不包含在病毒载体例如腺病毒载体或腺伴随病毒载体中。例如，所述核酸可以包含在质粒或人工染色体中，用不涉及细胞的病毒感染的标准方法例如转染或者脂转染法，将所述核酸插入到有蹄动物细胞中。在另一实施方案中，用来使内源有蹄动物核酸突变的核酸(例如敲除盒，所述敲除盒包括与编码选择标记的核酸可操作性连接并且与一种与待突变基因有显著序列同一性的核酸可操作性连接的启动子)包含在病毒载体例如腺病毒载体或腺伴随病毒载体中。按照该实施方案，用含有所述病毒载体的病毒来感染有蹄动物细胞，导致所述病毒载体的一部分或者整个病毒载体插入到所述有蹄动物细胞中。
用于上述去除不需要的内源抗体的方法中的优选施用的抗体
优选施用的抗体包括抗IgM抗体盒与内源有蹄动物抗体的多克隆混合物反应的抗体。施用的抗体可以单克隆或多克隆的。在一些实施方案中，施用的抗体是双功能抗体、抗体片段或修饰的抗体。在某些实施方案中，施用的抗体与毒素(如白喉毒素、美登木素生物碱、CC-1065、蒽环霉素、或紫杉烷)或放射性标记共价连接。在某些实施方案中，将抗体静脉内施用于有蹄动物。优选地，在一或多剂中将至少0.25，0.5，1.0，1.5，2，10，20，或50克的抗体施用于有蹄动物。在其它实施方案中，在一或多剂中将1-10mg，10-25mg，25-50mg，10-100mg，50-100mg或100-500mg抗体适用于有蹄动物胎儿。如果需要，可以在可药用稀释剂、载体或赋形剂，如盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇或其组合中施用抗体。
在优选实施方案中，所施用的抗体来源于与受体有蹄动物不同属或种的有蹄动物。在其它优选实施方案中，所述抗体是双功能抗体。其它优选的抗体包括具有ScFv，Fab，或F(ab′)2片段，或由其组成的那些。优选抗体的其它例子包括由通过基因融合技术修饰，使得编码抗体或抗体片段的核酸可操作连接于编码毒素或亲和标记的核酸的融合核酸编码的衍生化抗体。衍生化抗体中的共价连接的基团可以连接于抗体或抗体片段的氨基末端、羧基末端或氨基和羧基末端之间。“亲和标记”是指结合于另一种肽、蛋白或化合物的肽、蛋白或化合物。在优选实施方案中，亲和标记用于纯化或固定衍生化抗体。在另一优选实施方案中，用亲和标记或毒素将抗体体内导向于特定细胞、组织或器官系统。
上述方面的优选实施方案
优选地，本发明的转基因细胞或有蹄动物具有阳性选择标记(如抗生素抗性基因)在编码免疫球蛋白、α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白或J链的内源核酸中的插入。理想地，阳性选择标记与异种启动子可操作连接。在一些实施方案中，每种等位基因具有相同抗生素抗性基因或不同抗生素抗性基因的插入。优选地，将转录终止序列插入编码免疫球蛋白、α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白或J链的内源核酸。例如，可以将转录终止序列插入内源μ重链核酸的外显子2中的起始ATG密码子下游。在优选实施方案中，细胞或有蹄动物具有一种或多种包含一种或多种转基因并且表达由转基因编码的mRNA或蛋白的核酸。
优选地，有蹄动物抗血清或乳汁具有多克隆人免疫球蛋白。优选地，所述抗血清或乳汁来自于牛、绵羊、猪或山羊。在另一优选实施方案中，免疫球蛋白是针对需要的抗原。在优选实施方案中，将抗血清用作治疗或预防人类疾病的静脉内免疫球蛋白(IVIG)。在另一优选实施方案中，将目的抗原施用于有蹄动物，并且由有蹄动物产生针对抗原的免疫球蛋白。优选地，异种免疫球蛋白基因座中的核酸区段重排，产生与目的抗原反应的异种抗体。优选地，抗血清和/或乳汁含有比完全或部分内源的抗体多至少2，5，10，20或50倍的异种抗体，或不含完全或部分内源的抗体。如果需要，可以用来源于上述转基因有蹄动物(例如，转基因牛)的异种B细胞产生杂交瘤和单克隆抗体。也考虑可以随后对分离自有蹄动物的异种抗体(如人抗体)进行化学修饰，从而使它们共价连接于毒素、治疗活性化合物、酶、细胞因子、放射性标记、荧光标记或亲和标记。如果需要，可以用荧光或放射性标记对抗体进行体外或体内成像。
在本发明的任意方法的优选实施方案中，用于该方法中的有蹄动物具有表达完全异种的抗体(即，表达具有完全的异种重链和轻链的抗体)的B细胞亚群。优选地，内源的功能性抗体减少至少10，25，50，75，90，95或100％，和/或异种的功能性抗体减少75，50，25，或10％以下。在其它优选实施方案中，内源的功能性抗体量的减少比异种的功能性抗体量的减少多至少2，5，10，20，30或50倍。在另一种优选实施方案中，基本从有蹄动物中去除内源抗体。优选地，基本从有蹄动物中去除仅表达内源抗体或表达内源和异种抗体分子(如重链和轻链)的B细胞。在其它优选实施方案中，表达内源抗体的内源B细胞的数目和/或活性被抑制至少25，50，75，90或95％。优选地，在有蹄动物免疫系统发育的正常阶段期间或之后给有蹄动物施用抗体。例如可以在受体有蹄动物的胚胎、胎儿或出生后阶段施用抗体。
产生用于上述方法的有蹄动物的优选供体细胞
优选供体细胞的例子包括分化的细胞，如上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌肉细胞；以及未分化细胞，如胚胎细胞(如干细胞和胚胎生殖细胞)。在另一种优选实施方案中，所述细胞来自于雌性生殖系统，如乳腺、卵丘、颗粒层细胞或输卵管细胞。其它优选细胞包括胎儿细胞和胎盘细胞。优选的细胞也包括来自于任何器官，如膀胱、脑、食道、输卵管、心脏、肠、胆囊、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道和子宫的细胞。在另一种优选实施方案中，细胞核、透化细胞或染色体来自于转基因细胞或哺乳动物，或含有不存在于供体细胞或不存在于天然存在的细胞中的突变。
优选的转基因供体细胞核和供体细胞编码赋予对克隆的哺乳动物中的疾病或寄生虫的改进的抗性的蛋白。或者，可以对供体细胞核或供体细胞进行工程化，使得克隆的哺乳动物产生重组产物，如在牛的尿、血或乳汁中产生人类蛋白。例如，通过在uroplakin启动子控制下插入编码人蛋白的多核苷酸序列，可以在牛的尿中表达蛋白。可以在克隆的牛的乳汁中产生的治疗性蛋白的例子包括人凝血因子，如因子I-XIII的任意一种(Voet and Voet，Biochemistry，John Wiley& Sons，New York，1990)。这些异源蛋白可以在促乳素启动子或任何适于在牛乳汁中表达的其它启动子的控制下表达。可以采用标准纯化方法纯化来自于这些或其它组织或体液的重组蛋白(见，例如，Ausubel等，同上)。
细胞透化方法
在另一方面，本发明涉及透化细胞或细胞群的方法。该方法包括在允许细胞透化(如质膜透化)的条件下用一种或多种蛋白酶(如胰蛋白酶)孵育一个或多个细胞。蛋白酶的优选浓度包括0.1-10mg/ml蛋白酶，如0.1-1mg/ml，1-5mg/ml，和5-10mg/ml蛋白酶。在一些实施方案中，使用电穿孔、洋地黄毒苷、皂苷和/或机械剪切。可以采用该方法透化细胞的例子包括生殖细胞、体细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、成人细胞、分化细胞和未分化细胞。其它示例性的细胞包括列于上文的作为优选供体细胞的任意细胞。在一些实施方案中，用蛋白酶孵育细胞至少1，5，10，30或60分钟或1-60分钟(如1-10分钟)。在一些实施方案中，在透化后将细胞置于重新编程培养基中(如有丝分裂或分裂间期提取物)。在优选实施方案中，在提取物中孵育后重新封闭细胞，用于此处描述的克隆方法之一。
定义
此处用到的“人工染色体”表示具有如添加选择标记、添加克隆位点、缺失一个或多个核苷酸、取代一个或多个核苷酸等人工修饰的哺乳动物染色体或其片段。“人类人工染色体(HAC)”是指由一个或多个人染色体产生的人工染色体。人工染色体可以独立于宿主细胞的内源染色体而在宿主细胞中保持。在这种情况下，HAC可以稳定地复制并且与内源染色体分开。或者，它可能被易位或插入到宿主细胞的内源染色体中。可以同时或顺序将两个或两个以上的人工染色体导入宿主细胞中。例如，可以导入来源于人类14号染色体(包含Ig重链基因)、人类2号染色体(包含Igκ链基因)和人类22号染色体(包含Igλ链基因)的人工染色体。或者，可以导入既包含异种Ig重链基因又包含Ig轻链基因的人工染色体，例如ΔHAC或ΔΔHAC。所述重链基因座和轻链基因座优选位于不同的染色体臂(即位于中心粒的不同侧)。在再一优选实施方案中，所述HAC的总大小小于或等于大约10、9、8或7兆碱基。
“排列前或未重排形式的核酸”表示没有进行V(D)J重组的核酸。在优选实施方案中，所有编码抗体轻链的V基因区段的核酸区段与所有编码J基因区段的核酸区段隔开一个或多个核苷酸。优选地，所有编码抗体重链的V基因区段的核酸区段与所有编码D基因区段的核酸区段隔开一个或多个核苷酸，和/或所有编码抗体重链的D基因区段的核酸区段与所有编码J基因区段的核酸区段隔开一个或多个核苷酸。优选地，未重排形式的核酸基本是人类的。在其它优选实施方案中，所述核酸与来自于人类的天然存在的核酸的相应区域具有至少70，80，90，95，或99％的同一性。
“染色质团”表示没有被膜包围的一个以上染色体。优选地，染色质团含有细胞的所有染色体。可以按照此处的描述将细胞核暴露于有丝分裂重新编程培养基(如有丝分裂提取物)而形成含有浓缩的染色体的人工诱导的染色质团。或者，可以按照此处的描述通过将细胞核暴露于以下物质之一而产生含有解浓缩或部分浓缩的染色体的人工诱导的染色质团：含抗NuMA抗体的有丝分裂提取物、去污剂和/或盐溶液、或蛋白激酶溶液。染色质团可以含有物理上彼此不接触的分散的染色体，或者可以含有物理上接触的两个或多个染色体。
如果需要，可以采用标准方法，通过测量用DNA染料DAPI进行的染色的强度而确定染色体浓缩的水平。随着染色体浓缩，该染色强度增加。因此，可以将染色体的染色强度与分裂间期的解浓缩的染色体(指定为0％浓缩)和有丝分裂中的最大浓缩的染色体(指定为100％浓缩)的染色强度相比。根据该比较，可以确定占最大浓缩的百分比。优选的浓缩的染色质团是至少50，60，70，80，90或100％浓缩的。优选的解浓缩或部分浓缩的染色质团是低于50，40，30，20，或10％浓缩的。
“细胞核”表示膜围绕的细胞器，它含有细胞的大多数或所有DNA。将DNA包装进入解浓缩形式的染色体中。优选地，包封DNA的膜包括一或两层脂双层，或具有核孔蛋白。
“具有少于四组同源染色体的细胞核”表示DNA含量少于4n的细胞核，其中“n”是特定属或种的哺乳动物的正常单倍体染色体组中的染色体数。所述细胞核不具有4个拷贝的每种基因或基因座。优选地，所述细胞核是二倍体，因此具有两组同源染色体，但具有少于完整的两对的染色单体。
“原核”表示从减数分裂或核转移原核得到的单倍体细胞核。雌性原核是与雄性原核融合前的卵母细胞或卵的细胞核。雄性原核是在受精时进入卵母细胞或卵后但与雌性原核融合前的精子核。核转移原核是将供体细胞、细胞核或染色质团导入卵母细胞后形成的原核(如二倍体原核)。核转移原核具有少于四组的同源染色体。
“供体细胞”表示细胞核或染色质团所来源的细胞或透化细胞。
“透化”表示在质膜上形成孔，或部分或完全除去质膜。
“重新编程培养基”表示允许从细胞、细胞核、染色质团或染色体去除因子或从溶液向细胞、细胞核、染色质团或染色体加入因子的溶液。优选地，因子的加入或去除增加或减少了供体细胞、染色质团、细胞核或含有重新编程的染色质团或细胞核的细胞中mRNA或蛋白的表达水平。在另一种实施方案中，在重新编程培养基中孵育透化细胞、染色质团或细胞核，相对于供体细胞的表型，改变了透化细胞或含有重新编程的染色质团或细胞核的细胞的表型。在另一实施方案中，在重新编程培养基中孵育透化细胞、染色质团或细胞核，相对于供体细胞，导致了透化细胞或含有重新编程的染色质团或细胞核的细胞得到或失去活性。
示例性的重新编程培养基包括不含生物分子如蛋白或核酸的溶液，如缓冲液。所述溶液用于从细胞核、染色质团或染色体去除一种或多种因子。其它优选的重新编程培养基是提取物，如细胞核、细胞质的细胞提取物或其组合。示例性的细胞提取物包括卵母细胞(如哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物卵母细胞)、雄性生殖细胞(哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物生殖细胞，如精原细胞、精母细胞、精子细胞或精子)和干细胞(如成人或胚胎干细胞)的提取物。其它重新编程培养基是其中加入了一种或多种天然存在的或重组因子(如核酸或蛋白，如DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、活化物、阻抑物、染色质重塑蛋白、生长因子、白介素、细胞因子或其它激素)的溶液或提取物，或去除了一种或多种因子的提取物。其它重新编程培养基包括以下物质的溶液：去污剂(如0.01％-0.1％，0.1％-0.5％，或0.5％-2％离子型或非离子型去污剂，如以下去污剂的一种或多种：SDS，Triton X-100，Triton X-114，CHAPS，Na-脱氧胆酸，正辛基葡糖苷，Nonidet P40，IGEPAL，Tween20，Tween 40，或Tween 80)、盐(如约0.1，0.15，0.25，0.5，0.75，1，1.5或2M NaCl或KCl)、多胺(如约1μM，10μM，100μM，1mM或10mM精胺、亚精胺、鱼精蛋白或聚-L-赖氨酸)、蛋白激酶(如细胞周期蛋白依赖性激酶1、蛋白激酶C、蛋白激酶A、MAP激酶、钙/钙调蛋白依赖性激酶、CK1酪蛋白激酶或CK2酪蛋白激酶)和/或磷酸酶抑制剂(如约10μM，100μM，1mM，10mM，50mM，100mM以下一种或多种抑制剂：原钒酸钠、焦磷酸钠、氟化钠、NIPP1、抑制剂2、PNUTS、SDS22、AKAP149或ocadaic acid)。在一些实施方案中，重新编程培养基包含抗NuMA抗体。如果需要，可以同时或序贯使用多种重新编程培养基以对供体细胞、细胞核或染色质团进行重新编程。
“分裂间期重新编程培养基”表示诱导染色质解浓缩和核被膜形成的培养基(如分裂间期细胞提取物)。
“有丝分裂重新编程培养基”表示诱导染色质浓缩和核被膜破裂的培养基(如有丝分裂细胞提取物)。
“重新编程的细胞”表示暴露于重新编程培养基的细胞。优选地，至少1，5，10，15，20，25，50，75，100，150，200，300或更多mRNA或蛋白分子在重新编程的细胞中表达，而不在供体或透化细胞中表达。在另一种实施方案中，在重新编程的细胞中表达，而不在供体或透化细胞中表达的mRNA或蛋白分子数是1-5，5-10，10-25，25-50，50-75，75-100，100-150，150-200，或200-300，包括其中的数目。优选地，至少1，5，10，15，20，25，50，75，100，150，200，300或更多mRNA或蛋白分子在供体或透化细胞中表达而不在重新编程的细胞中表达。在另一种优选实施方案中，在供体或透化细胞中表达，而不在重新的编程细胞中表达的mRNA或蛋白分子数是1-5，5-10，10-25，25-50，50-75，75-100，100-150，150-200，或200-300，包括其中的数目。在另一优选实施方案中，这些mRNA或蛋白分子既在供体细胞(即，供体或透化起始细胞)也在重新编程的细胞中表达，但用标准测定方法测量的这些细胞中的表达水平相差至少2，5，10或20倍(参见，例如，Ausubel et al.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，2000)。
“加入一种因子”表示一种因子与染色质、染色体或细胞核被膜的成分，如核膜或或核基质的结合。或者，将该因子运输到细胞核中，以便它被核被膜围绕或包封。优选地，结合于染色体或位于细胞核中的因子的量增加至少25，50，75，100，200或500％。
“去除一种因子”表示一种因子从染色质、染色体或细胞核被膜的成分，如核膜或或核基质的解离。或者，将该因子运输到细胞核外，以便它不再被核被膜围绕或包封。优选地，结合于染色体或位于细胞核中的因子的量减少至少25，50，75，100，200或500％。
“富集或排除一种因子”表示加入或去除一种天然存在的或重组因子，其量为原始存在于重新编程培养基(如细胞提取物)中的因子量的至少20，40，60，80，或100％。或者，可以加入不是天然存在于重新编程培养基中的天然存在的或重组因子。优选的因子包括蛋白，如DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、活化物和阻抑物；膜囊泡和细胞器。在一种优选实施方案中，所述因子如下文的描述在加入重新编程培养基之前纯化。
“重新克隆的”表示用于第二轮克隆。具体地，可以按上文所述在有丝分裂重新编程培养基(如有丝分裂细胞提取物)中孵育来自本发明的方法所产生的胚胎、胎儿或成人的细胞，以便形成用于插入去核卵母细胞的染色质团。或者，可以按上文所述，将细胞透化，在重新编程培养基中孵育，并且插入去核卵母细胞。进行两轮或多轮克隆可以导致供体染色质或供体细胞的额外重新编程，从而增加在最后一轮克隆之后产生存活后代的机会。
“核转移”表示将细胞核或含有细胞核的细胞插入卵母细胞。任何合适的方法可以用于向卵母细胞的这种插入，如微量注射、电穿孔或细胞融合。在一些实施方案中，如此处描述，所述核由染色质团或含有染色质团的细胞形成。
“染色质转移”表示将染色质团或含有染色质团的细胞插入卵母细胞。任何合适的方法可以用于向卵母细胞的这种插入，如微量注射、电穿孔或细胞融合。在一些实施方案中，如此处描述，通过在重新编程培养基中孵育细胞核或含有细胞核的细胞而形成所述染色质团。
“存活后代”表示在子宫外存活的哺乳动物。优选地，所述动物从离开母体宿主起，存活至少1秒，1分钟，1小时，1天，1周，1个月，6个月或1年。所述哺乳动物的存活不要求子宫内环境的循环系统。
“核转移卵母细胞”或“核移植卵母细胞”表示其中插入或融合了供体细胞、细胞核或染色质团的卵母细胞。由卵母细胞形成的胚胎称作“核转移”或“核移植”胚胎。
“胚胎”或“胚胎的”表示没有植入母体宿主的子宫膜的发育中的细胞团。因此，术语“胚胎”可以指受精的卵母细胞；含有供体染色质团、细胞核或重新编程的细胞的卵母细胞；胚泡前期的发育中的细胞团；或在植入母体宿主的子宫膜之前和在形成生殖嵴前的发育阶段的任何其它发育中的细胞团。例如，一个细胞的胚胎可以称作合子，从分裂的胚胎得到的固体球形团可以称作桑葚胚，具有囊胚腔的胚胎可以称作胚泡。“胚胎细胞”是从胚胎分离或包含在胚胎中的细胞。
“来源于胚胎的细胞”表示从胚胎中的细胞的细胞分裂得到的细胞。
“嵌合胚胎”表示由来自于两个或多个胚胎的细胞形成的胚胎。得到的胎儿或后代可以具有来源于仅仅一个初始胚胎的细胞或来源于一个以上初始胚胎的细胞。如果需要，掺入胎盘组织和胎儿组织中的来源于每一个胚胎的细胞的百分比可以采用标准FISH分析或加入一个胚胎的膜染料的分析进行确定。
“嵌合有蹄动物”表示由来自于两个或多个胚胎的细胞形成的有蹄动物。所述有蹄动物可以具有来源于仅仅一个初始胚胎的细胞或来源于一个以上初始胚胎的细胞。如果需要，掺入胎盘组织和胎儿组织中的来源于每一个胚胎的细胞的百分比可以采用标准FISH分析或加入一个胚胎的膜染料的分析进行确定。
“紧密化前胚胎”表示在进行紧密化之前的胚胎。紧密化前胚胎在其卵裂球的表面上基本不表达E-钙粘着蛋白。优选的紧密化前胚胎比相同种的完全紧密的胚胎表达少至少3，5，10，20，30或40倍的E-钙粘着蛋白，或不表达E-钙粘着蛋白。
“紧密化胚胎”表示进行紧密化或紧密化之后的胚胎。紧密化胚的卵裂球在其表面上表达E-钙粘着蛋白。可以采用标准方法，使用抗E-钙粘着蛋白抗体测量E-钙粘着蛋白。E-钙粘着蛋白增加卵裂球之间的粘附。优选的紧密化胚胎包括其中的紧密化过程已经完成的胚胎。其它优选的紧密化胚胎比相同种的紧密化前胚胎表达多至少3，5，10，20，30或40倍的E-钙粘着蛋白。
“胎儿”表示移植进入母体宿主的子宫膜内的发育中的细胞团。具有如生殖嵴的确定特征的胎儿容易由本领域技术人员确定。“胎儿细胞”是从胎儿分离或包含在胎儿中的任何细胞。
“孤雌生殖”或“孤雌生殖活化”表示细胞核没有与雌性原核融合形成合子的卵母细胞或卵的发育。例如，可以在不受精的条件下诱导卵母细胞分裂。
“透明带”表示围绕许多哺乳动物的卵母细胞或卵的透明的、有弹性的非细胞层。
“滋养外胚层”表示在哺乳动物胚胎发育的胚泡期围绕囊胚腔的最外层细胞。滋养外胚层在进一步发育时产生大多数或全部胎盘组织。
“内细胞团”表示由滋养外胚层围绕的细胞。内细胞团在进一步发育时产生大多数胎儿组织。
“一种细胞类型的特异性mRNA或蛋白”表示以比所有其它细胞类型中的表达水平高至少10，20，50，75，或100倍的水平在一种细胞类型中表达的mRNA或蛋白。优选地，所述mRNA或蛋白仅仅在一种细胞类型中表达。
“突变”表示天然存在的或参考核酸序列中的改变，如插入、缺失、移码突变、沉默突变、无义突变、或错义突变。优选地，由核酸序列编码的氨基酸序列具有天然存在的序列的至少一个氨基酸改变。用于改变细胞、胚胎、胎儿或哺乳动物的基因组序列的重组DNA技术的例子包括将来自于另一种生物(如人)的DNA序列插入基因组、缺失一个或多个DNA序列、以及将一个或多个碱基的突变(如定点或随机突变)导入靶DNA序列。用于产生这些修饰的方法的例子包括逆转录病毒插入、人工染色体技术、基因插入、用组织特异性启动子进行的随机插入、同源重组、基因导向、可转座元件、以及任何其它用于导入外源DNA的方法。所有这些技术都是分子生物学领域的技术人员公知的(参见，例如，Ausubel et al.，同上)。含有修饰的DNA的来自于转基因细胞的染色质团、染色体和细胞核或供体转基因细胞可以用于本发明的方法中。
“永生化的”表示能够进行比与永生化细胞相同的细胞类型、属和种的天然存在对照细胞或比衍生永生化细胞的供体细胞多至少25，50，75，90或95％的细胞分裂。优选地，永生化细胞能够进行比对照细胞多至少2，5，10或20倍的细胞分裂。更优选地，永生化细胞能够进行无限次的细胞分裂。永生化细胞的例子包括天然获得了改变它们的正常生长-调节过程的体内或体外突变的细胞。其它优选的永生化细胞包括经过遗传修饰以表达癌基因，如ras，myc，ab1，bc12，或neu的细胞，或感染了转化DNA或RNA病毒，如EB病毒或SV40病毒的细胞(Kumar et al.，Immunol.Lett.65：153-159，1999；Knight et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：3130-3134，1988；Shammah et al.，J.Immunol.Methods 160-19-25，1993；Gustafsson and Hinkula，Hum.Antibodies Hybridomas 5：98-104，1994；Kataoka et al.，Differentiation 62：201-211，1997；Chatelut et al.，Scand.J.Immunol.48：659-666，1998).也可以对细胞进行遗传修饰以表达端粒酶基因(Roques et al.，CancerRes.61：8405-8507，2001)。
“未永生化的”表示没有按照上文所述进行永生化。
“致融合的化合物”表示增加染色质团或细胞核位于细胞邻近位置时插入受体细胞的可能性的化合物。例如，致融合的化合物可以增加染色质团或细胞核对细胞质膜的亲和力。致融合的化合物也可以促进细胞核的核膜与细胞质膜的连接。
“基本同一的”表示具有与另一序列至少60，70，80，90或100％同一的序列。序列同一性一般是采用具有指定的缺省参数的序列分析软件(如Genetics Computer Group的序列分析软件包，Universityof Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)测量的。该软件程序通过给各种取代、缺失和其它修饰赋予同源度而匹配相似的序列。
“减少内源抗体的量和/或活性”表示减少B细胞或B细胞群产生的内源抗体量。内源抗体量的这种减少可以是由于每个B细胞产生的内源抗体量的减少、功能性内源B细胞的数目减少，或其组合。优选地，由B细胞分泌的内源抗体量或在表达或分泌内源抗体的B细胞表面表达的内源抗体量减少至少25，50，75，90，或95％。在另一种优选实施方案中，来自于受体哺乳动物的样品，如血液样品中的内源B细胞数目减少至少25，50，75，90，或95％。
“基本去除的”表示减少至少75，80，95或100％。在优选实施方案中，其中表达完全或部分内源的抗体的B细胞被基本去除的有蹄动物具有不可检测量的所述B细胞。在其它优选实施方案中，其中完全或部分内源的抗体被基本去除的有蹄动物具有不可检测量的所述抗体。
“具有低于正常反应性的免疫系统的哺乳动物”表示活性低于正常的天然或自发具有天然或获得性免疫的受体哺乳动物。例如，受体哺乳动物可以具有更少的B细胞、更少的在B细胞表面表达的Ig分子、更少的B细胞分泌的抗体分子、更少的T细胞、更少的由暴露于抗原或有丝分裂原的T细胞产生的细胞因子、更少的反应于抗原或有丝分裂原的T细胞的细胞毒活性或增殖、更少的反应于抗原给药而产生的抗体或细胞因子分子，基于如此处描述的标准方法。优选地，受体哺乳动物中上述任何细胞或免疫球蛋白的数目或上述任何活性的水平低于相同属、种和年龄的哺乳动物的细胞或免疫球蛋白平均数目或平均活性水平。在其它优选实施方案中，受体哺乳动物中上述任何细胞或免疫球蛋白的数目或上述任何活性的水平是相同属、种和年龄的另一种哺乳动物的相应细胞或免疫球蛋白数目或相应活性水平的90，80，70，60，50，40，30或20％。上述任何测定方法可以用于鉴定可能的受体哺乳动物群体中具有最小活性的免疫系统的哺乳动物。
“完全内源的抗体”表示具有完全由宿主生物的内源序列组成的氨基酸序列的抗体。如果需要，可以通过确定样品中(i)与内源抗体的反应性抗体(如抗牛免疫球蛋白)反应但(ii)不与异种抗体的反应性抗体(如抗人免疫球蛋白抗体)反应的抗体量而测定转基因有蹄动物的样品中完全内源的抗体量。如果需要，用于该测定的内源抗体的反应性抗体(如抗牛免疫球蛋白)预吸附异种(如人)免疫球蛋白，以确保去除与异种抗体交叉反应的抗体。类似地，用于该测定的异种抗体的反应性抗体(如抗人免疫球蛋白抗体)预吸附内源(如牛)免疫球蛋白，以确保去除与内源抗体交叉反应的抗体。
“完全异种的抗体”表示具有完全由宿主生物的异种序列(如人序列)组成的氨基酸序列的抗体。如果需要，可以通过确定样品中(i)与异种抗体的反应性抗体(如抗人免疫球蛋白)反应但(ii)不与内源抗体的反应性抗体(如抗牛免疫球蛋白抗体)反应的抗体量而测定转基因有蹄动物的样品中完全异种的抗体量。
“部分内源的抗体”或“部分异种的抗体”表示具有由内源抗体序列组成的区段(如抗体重链或轻链的一个区域或完整的重链或轻链)和由异种抗体序列组成的区段(如抗体重链或轻链的一个区域或完整的重链或轻链)的抗体。如果需要，可以通过确定样品中(i)与异种抗体的反应性抗体(如抗人免疫球蛋白)反应和(ii)与内源抗体的反应性抗体(如抗牛免疫球蛋白抗体)反应的抗体量而测定转基因有蹄动物的样品中部分异种或部分内源的抗体量。
“修饰的抗体”表示具有改变的氨基酸序列，以便当给予有蹄动物时修饰的抗体引发较少的抗体和/或免疫应答的抗体。例如，可以用牛抗体的恒定区取代抗的恒定区。对于将抗体用于牛以外的哺乳动物，可以将抗体转化为该物种的形式。
“双功能抗体”表示包括共价连接于不同抗体或不同抗体片段的抗体或抗体片段的抗体。在一种优选实施方案中，抗体或片段都结合于相同抗原上表达的不同表位。其它优选的双功能抗体结合于两种不同的抗原，如结合于抗体轻链和抗体重链。如此处描述的标准分子生物学技术可以用于可操作性连接两个核酸，以便融合核酸编码双功能抗体。
“片段”表示具有与本发明抗体的相应区域相同，但比全长序列少的连续氨基酸区域的多肽。基于如此处描述的标准测定，所述片段具有与相应抗体结合相同抗原的能力。优选地，所述片段与抗原的结合是相应抗体的至少20，40，60，80，或90％。
“纯化的”表示与天然伴随的成分分离。一般地，当所述因子为至少50重量％不含与其天然相关的蛋白、抗体和天然存在的有机分子时，该因子就是基本纯的。优选地，所述因子至少75重量％纯，更优选至少90重量％纯，最优选至少99重量％。基本纯的因子可以通过化学合成、来自天然来源的因子的分离、或天然不产生因子的重组宿主细胞中因子的产生而获得。本领域技术人员采用标准技术，如Aus ubelet al.(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，2000)描述的那些，可以纯化蛋白、液泡和细胞器。根据聚丙烯酰氨凝胶电泳、柱层析、光密度、HPLC分析或western分析的测量(Ausubel et al.，同上)，该因子的纯度优选至少是起始材料的至少2，5或10倍。优选的纯化方法包括免疫沉淀、柱层析，如免疫亲和层析、磁珠免疫亲和纯化以及用平板结合抗体进行淘选。
“特异性结合一种蛋白”表示结合于一种蛋白(如内源性有蹄动物抗体)，但基本不结合样品，如天然包括蛋白的生物样品中的其它分子(如抗体以外的内源抗体或异种抗体)。优选地，结合于内源抗体的抗体量比在相同条件下结合于异种抗体的抗体量高至少50％，100％，200％，500％，或1,000％。
“特异性结合μ重链”表示结合μ重链比样品中的其它分子显著更多。优选地，结合于内源μ重链的抗体量比在相同条件下结合于任何其它免疫球蛋白分子的抗体量高至少50％，100％，200％，500％，或1,000％。在其它优选实施方案中，抗体对含有μ重链的IgM分子的结合亲和力比对不含μ重链的IgG分子的结合亲和力高至少2，5，10，20，或30倍。
“特异性结合λ链”表示结合λ轻链比样品中的其它分子显著更多。优选地，结合于内源λ轻链的抗体量比在相同条件下结合于任何其它免疫球蛋白分子的抗体量高至少50％，100％，200％，500％，或1,000％。在其它优选实施方案中，抗体结合IgG和IgM分子，它们都含有λ轻链。
优点
本发明提供了许多与在转基因有蹄动物中制备异种抗体相关的优点。例如，此处描述的方法已经用于在转基因牛中表达人抗体蛋白。也制备了与施用于转基因牛的特异性抗原反应的多克隆人抗体。由于这些有前景的结果，本领域技术人员将理解，此处描述的方法可以用于产生其它表达需要的人抗体(如用作IVIG的治疗替代物的与特异性抗原反应的抗体或抗体混合物)的转基因有蹄动物。
本发明的方法也提供了用于去除也表达需要的异种抗体(如人抗体)的转基因有蹄动物中的不需要的抗体的简单技术。通过减少异种抗体的量，这些步骤显著简化了从转基因有蹄动物的血液或乳汁中纯化异种抗体。
在有蹄动物中，前体细胞仅仅在前一半发育过程中分化形成B细胞。这样，在发育的该阶段之后去除存在于有蹄动物中的所有内源B细胞，将阻止任何其它内源B细胞形成，因为前体细胞不再分化成B细胞。因此，施用的单剂抗体对于去除有蹄动物中的所有内源B细胞可以是足够的。如果没有去除所有的B细胞，可以施用其它剂抗体。
从下面的详述和权利要求，可以明显看出本发明的其它特征和优点。
附图说明
图1A包括用来产生含有Ig敲除和人类人工染色体的母牛的方法的概述。图1A中的时间列基于以下的估计：制备所述Ig敲除载体和产生敲除细胞需18个月，从所述敲除细胞产生胎儿需2个月，进行后续的敲除需9个月，妊娠产出牛崽需9个月，在可以从牛崽产生胚胎之前需12个月，而进行HAC转移需6个月。
图1B包括用来产生在内源Ig基因中有突变并且含有ΔHAC或ΔΔHAC的母牛的方法的概述。对于图1B中的时间列，估计每周筛选250个集落，在3个月内总共筛选3,000个集落，以便分离雄性和雌性敲除细胞。假设每1,500个集落产生一个或多个敲除集落。纯合敲除有蹄动物可以通过下述方法产生：(1)在核转移之前，将第二Ig突变导入分离的敲除细胞中，(2)在得自胚胎、胎儿(例如妊娠约60天的胎儿)或者由第一轮核转移产生的后代的细胞中导入第二Ig突变，并且用所得的纯合细胞作为第二轮核转移中的供体细胞，或者(3)让半合型有蹄动物交配。在图1A和1B中，“Homo”表示纯合型；“Hemi”表示半合型；“H”表示重链；“L”表示轻链；“HAC”表示人类人工染色体；“HAC 1”表示任一种HAC；而“HAC 2”表示第二种HAC。
图2A包括本发明的μ(IgM重链)敲除构建体。图2B为得自Holstein牛的免疫球蛋白基因座的限制性图谱。
图3A和3B包括构建体“pSTneoB”和“pLoxP-STneoB”的示意图，所述构建体用来产生图3C中所示的μ敲除DNA构建体。图3D为在所述μ敲除构建体中用作第一同源区的基因组牛μ重链基因座的1.5kb区的多核苷酸序列(SEQ ID NO：47)。图3E为在所述μ敲除构建体中用作第二同源区的基因组牛μ重链基因座的3.1kb区的多核苷酸序列(SEQ ID NO：48)。在该序列中，每个“n”代表任何核苷酸或者无核苷酸。连续“n”个核苷酸的区域代表其多核苷酸序列尚未测定的大约0.9-1.0kb的区域。图3F为噪呤霉素抗性牛μ重链敲除构建体的示意图。图3G为牛κ轻链cDNA的多核苷酸序列(SEQ ID NO：60)。在κ轻链敲除构建体中可以使用全部或部分该序列。另外，这种κ轻链可以用来分离用于κ轻链敲除构建体中的基因组κ轻链序列。
图4是构建ΔHAC和ΔΔHAC的示意图。
图5是琼脂糖凝胶的照片，表明在ΔHAC胎儿中存在编码人重链和轻链的基因组DNA。
图6是琼脂糖凝胶的照片，表明人Cμ外显子3和4在妊娠77天的ΔHAC胎儿(胎儿#5996)中的表达。
图7是琼脂糖凝胶的照片，表明内源牛重链在ΔHAC胎儿#5996中的重排。
图8是琼脂糖凝胶的照片，表明重排的人重链在ΔHAC胎儿#5996中的表达。
图9是琼脂糖凝胶的照片，表明由来自人重链基因座的剪接的恒定区在ΔHAC胎儿#5996中的表达。
图10是琼脂糖凝胶的照片，表明重排的人重链在ΔHAC胎儿#5996中的表达。
图11 A是得自ΔHAC胎儿#5996的重排人重链转录物的多核苷酸序列(SEQ ID NO：49)。图11B是该序列(“查询序列”)的一个区与人抗肺炎球菌抗体(“Sbjct”)(分别为SEQ ID NO：50和51)的序列比对。对于得自ΔHAC胎儿#5996的查询序列而言，仅显示了不同于所述人抗肺炎球菌抗体序列的对应核苷酸的那些核苷酸。
图12A和12B是得自ΔHAC胎儿#5996的重排人重链转录物的另外两个多核苷酸序列(SEQ ID NO：52和54)及其推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID N0：53和55)。
图13是琼脂糖凝胶的照片，证明ΔΔHAC胎儿#5580既含有人重链免疫球蛋白基因座，又含有人轻链免疫球蛋白基因座。
图14是琼脂糖凝胶的照片，证明ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B既含有人重链免疫球蛋白基因座，又含有人轻链基因座。
图15是琼脂糖凝胶的照片，表明来自于人重链基因座的剪接的μ恒定区在ΔΔHAC胎儿#5542A中的表达。
图16是琼脂糖凝胶的照片，表明所述人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达。
图17是琼脂糖凝胶的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中的重排和表达。
图18是琼脂糖凝胶的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A中的重排和表达。
图19是琼脂糖凝胶的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达。
图20是得自ΔΔHAC胎儿#5442A的重排人轻链转录物的多核苷酸序列和相应的推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：56和57)。
图21是得自ΔΔHAC胎儿#5442A的重排人轻链转录物的另外一种多核苷酸序列和相应的推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：58和59)。
图22A-22H是ΔΔHAC胎儿#5442A(图22A-22D)和5442B(图22E-22H)表达人λ轻链和牛重链蛋白的FACS分析图。让得自这些胎儿的脾的淋巴细胞与藻红蛋白标记的抗人λ抗体(图22C和22D)、FITC标记的抗牛IgM抗体(图22D和22H)反应，或无抗体(图22A、22B、(22E和22F)，然后在FASCalibur细胞分选器上分析。用其中一种所述抗体标记的细胞的百分比显示在个直方图的下方。
图23为α-(1，3)-半乳糖基转移酶敲除载体的示意图，所述载体用来将嘌呤霉素抗性基因和转录终止序列插入到牛细胞中的内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因中。
图24是含有外显子2、3和4、用作所述AAV导向载体骨架的BamHI-XhoI片段的示意图。新霉素抗性标记用于通过插入到外显子4中而对所述基因座进行插入诱变。指示了用来随后证实正确导向的PCR引物的退火位点的位置。
图25是构建设计用以除去内源牛IgH序列的腺伴随病毒构建体的示意图。
图26是琼脂糖凝胶的照片，显示正确导向事件的各个转导克隆的PCR分析。在该实验中使用的载体示于图24。指示正确导向的PCR产物以星号标注。
图27是列出携带HAC的胚胎妊娠率的表。
图28A-28J是注射了抗牛IgM抗体(das6)以抑制B细胞发育的实验胎儿或对照胎儿的外周血淋巴细胞的FACS分析的照片。图28A-28E是用抗牛IgM抗体检测在B细胞表面表达的IgM分子的FACS分析的照片。如图28A和图2B所示，来自于对照胎儿的大约19.82-26.61％外周血淋巴细胞表达IgM。与之相比，来自三个注射了抗牛IgM抗体的胎儿的7.78，11.80，或3.95％外周血淋巴细胞表达IgM(分别见图28C-28E)。图28F-28J是用抗牛轻链抗体(das10)检测在B细胞表面表达的抗体轻链分子的FACS分析的照片。如图28F和28G所示，来自于对照胎儿的12.43-29.47％外周血淋巴细胞表达抗体轻链分子。与之相比，来自三个注射了抗牛IgM抗体的胎儿的2.54，13.77，或3.99％外周血淋巴细胞表达抗体轻链分子(分别见图28H-28J)。
图29A和29B说明了牛移植前胚胎中核被膜和核基质蛋白的免疫检测。图29A是用相同抗体检验的原核和8细胞期的体外受精的牛胚胎的照片。图29A的箭头指向原核期胚胎的雌性原核中的抗NuMA和抗AKAP95标记。图29A的插图是用0.1μg/ml Hoechst 33342(柱，20μm)标记的DNA的照片。图29B是牛成纤维细胞(上排)和原核期胚胎(下排)的免疫印迹分析。分子量标记在图29B右侧以kDa表示。
图30说明染色质超前浓缩期间核被膜、NuMA和AKAP95的动力学以及核移植胚胎中的原核组装。图30是牛供体成纤维细胞(供体细胞)、染色质超前浓缩期的核移植胚胎(融合后3小时)和原核期(融合后19小时)的核移植胚胎，以及按此处描述活化的孤雌生殖原核期胚胎。在染色质超前浓缩期注射后3小时″hpi″(“PCC”)和注射后7小时(“NT PN”)，采用抗核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、NuMA和AKAP95抗体监测供体核的分解和新原核的组装。在活化处理开始后5小时也分析了用10mM SrCl2孤雌生殖活化MII卵母细胞后的雌性原核形成(“Parth.PN”)。核纤层蛋白A/C在牛原核期核移植胚胎的原核中组装。用0.1μg/ml Hoechst 33342对DNA进行复染。TRITC是指用TRITC偶联的第二抗体标记(柱，20μm)。
图31证明，与孤雌生殖胚胎相比，AKAP95更强地固着在核移植胚胎的原核中。该图表示在用3％低聚甲醛固定前，室温下用0.1％Triton X-100和1mg/ml DNAse I以及100或300mM NaCl原位提取30分钟后，单性体、核移植胚胎和体细胞供体核中未提取的核纤层蛋白B、AKAP95和DNA标记的相对百分比。通过双免疫荧光检验B型核纤层蛋白(红色)和AKAP95(绿色)的定位。定量了每个通道中的荧光标记强度-红色(核纤层蛋白B)、蓝色(DNA)和绿色(AKAP95)。参考值(100％未提取的)代表在固定前仅仅用0.1％Triton X-100透化的胚胎或细胞中B型核纤层蛋白、DNA和AKAP95染色的相对量。在每组中检验大约30个胚胎。
图32证明了当原核在核移植胚胎中重构时，核纤层蛋白是从头转录的。图32是通过成纤维细胞融合产生的牛原核核移植胚胎和用5μM离子霉素处理4分钟，然后用10μg/ml环己酰亚胺/2.5μg/ml松胞菌素D处理4小时(b’，-)，如(b’)中用离子霉素/环己酰亚胺/松胞菌素D，然后用10μg/ml环己酰亚胺额外培养9小时(b”，CHX)，或如(b’)中孵育，并且在整个活化处理中同时用1μg/ml放线菌素D(b)活化的卵母细胞的照片。在相同的制备物上使用抗核纤层蛋白B(兔多克隆)和抗核纤层蛋白A/C(mAb)抗体。插图是用0.1μg/ml Hoechst33342进行的DNA标记的照片(柱，20μm)。
图33是有丝分裂细胞质提取物(M-S15)、有丝分裂胞质溶胶提取物(M-S200)和卵母细胞提取物(MII-S15)中染色体浓缩和核被膜破裂的图片(在3-5个复制物中检验n＝300-400个细胞核)。
图34A-34C是几组照片，表示纯化的输入的牛成纤维细胞核(图34A)和在有丝分裂胞质溶胶提取物(图634)和卵母细胞提取物(图34C)中产生的浓缩染色质的免疫荧光分析。检验了所指示的核标记。用碘化丙锭对DNA进行复染(红色)(柱，10μm)。
图35是一组照片，表示在常规的核移植(NT)或核注射(NI)法之后以及采用本发明的方法将染色质团注射到卵母细胞(CT)之后，在卵母细胞中获得的浓缩染色质的免疫荧光分析。可检测的核纤层蛋白B和A/C表现为溶解的(柱，10μm)。
图36A和36B是几组照片，表示得自染色质转移、核移植或核注射的原核的免疫荧光分析。在核移植、核注射或染色质转移和标记后19小时固定胚胎。也检验了对照孤雌生殖原核(Part.)。图3 6表示核纤层蛋白A/C和B的分析。图36B显示了AKAP95和NuMA的分析。核纤层蛋白A/C(绿色标记)仅仅在核移植和核注射原核中出现(柱，30μm)。
图37是表示生产克隆的Tc牛崽的程序的图表。示出了HAC的构建，它具有含Igλ和IgH基因的hChr22和hChr14区，并且示出了neo选择标记的位置。通过MMCT技术，将HAC从CHO克隆转移到胎牛成纤维细胞中。Tc成纤维细胞与用于核转移的去核卵母细胞融合。体外培养重构的Tc胚胎至胚泡期，然后植入受体母牛。大约在妊娠60天回收Tc胎儿；重建成纤维细胞系，评估并且用于进一步的核转移。将重新克隆的Tc胚胎转移到受体中以产生Tc牛崽。
图38A-38D说明Tc胎儿的分析。再生的Tc成纤维细胞系和对照非转基因的成纤维细胞的G418选择(图38A)。Tc胎儿和对照中IgH和Ig1基因座的基因组PCR。3个胎儿，#5968(泳道1)，#6032(泳道2)和#6045(泳道3)来源于ΔHAC成纤维细胞，胎儿#5580(泳道4)来源于ΔΔHAC成纤维细胞。作为对照，回收和评估非转基因胎儿(泳道N)(图38B)。在所有Tc胎儿和阳性对照人肝DNA样品(泳道P)中，人IgH和Ig1基因座都是通过PCR检测的，但在阴性对照中则不是(泳道N)。通过RT-PCR从阴性对照非转基因牛脾(泳道N)、克隆的Tc胎儿的脑(泳道1)、肝(泳道2)和脾(泳道3)，以及阳性对照人脾(泳道P)(图38C)扩增重排和表达的人Igμ和Igλ转录物。在第91天通过RT-PCR从克隆的Tc胎儿扩增的人Igμ和Igλ转录物的代表性核苷酸序列和推导的氨基酸序列(图38D)。按照描述进行RT-PCR(Kuroiwa et al.，Nature Biotech 18：1086-1090，2000)。对于人Igμ转录物，将VH1/5 BACK，VH3 BACK，和VH4BACK用作5’引物，将Cμ-2用作3’引物。对于人Igλ转录物，将Vλ1LEA1，Vλ2MIX和Vλ3MIX用作5’引物，将CλMIX用作3’引物。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)对扩增的cDNA进行亚克隆，并且采用DNA自动测序仪(ABI3700 system)进行测序。
图39A-39C是说明对克隆的Tc牛崽进行分析的照片。4只克隆的Tc牛崽；来自细胞系#6045的雄性牛崽(#50)和来自细胞系#5968的雌性牛崽(#1064，#1065，#1066)(图39A)。来自克隆的Tc牛崽和对照的PBLs的IgH和Igλ基因座的基因组PCR；牛崽#1064(泳道1)，#1065(泳道2)，#1066(泳道3)，#50(泳道4)，#1067(泳道5)和#1068(泳道6)(图39B)。在所有Tc牛崽和阳性对照人肝DNA样品(泳道P)中，人IgH和Ig1基因座都是通过基因组PCR检测的，但在阴性对照-非转基因牛崽中则不是(泳道N)。中期染色体中的FISH分析在表现单信号的细胞和表现双信号的细胞中伸展(图39C)。箭头表示HAC在周围的牛染色体中的定位。用洋地黄毒苷标记的人COT-1DNA作为探针进行HAC着色，并且用抗洋地黄毒苷-罗丹明进行检测。
图40A和40B分别是具有嘌呤霉素抗性基因的IgM敲除载体和用于采用该载体鉴定正确导向的细胞的策略的示意图。图40和40D分别是具有新霉素抗性基因的IgM敲除载体和用于采用该载体鉴定正确导向的细胞的策略的示意图。
图40A和40B分别是具有嘌呤霉素抗性基因的IgM敲除载体和用于采用该载体鉴定正确导向的细胞的策略的示意图。图40和40D分别是具有新霉素抗性基因的IgM敲除载体和用于采用该载体鉴定正确导向的细胞的策略的示意图。
图41是柱形图，说了用DNP-KLH免疫ΔHAC转基因动物的效果。具体地，佐剂刺激的HAC-转染色体牛的免疫，产生了对免疫抗原的多克隆抗原特异性反应。抗体对免疫抗原的不同表位的反应证明了HAC转染色体动物能够识别复合抗原的多个表位。用400ug示例性抗原DNP-KLH、2，4二硝基苯基化匙孔血蓝蛋白和完全弗氏佐剂皮下免疫ΔHAC1066牛。然后用不含任何佐剂的400ug DNP-KLH对动物进行第二次免疫。从免疫的动物采集血清，并且分别分析与示例性抗原DNP-BSA和KLH的半抗原和载体成分的反应性。所述反应性模式是由识别复合抗原的多个和不同表位的抗体混合物制成的多克隆抗体的特征。采用牛抗人Ig柱从采集的血清亲和纯化人免疫球蛋白。用固相ELISA检验等摩尔浓度的从ΔHAC1066亲和纯化的人Ig与DNP-BSA，KLH或BSA(阴性对照)的反应性。将物种特异性的牛抗人生物素化的多克隆抗体用作检测试剂。作为阴性对照平行分析等摩尔浓度的商业上制备的人Ig和牛Ig。对于所有样品，采用405nm的光密度并且作图。仅有来自于用DNP-KLH(1066)免疫的ΔHAC动物的人Ig证明了对抗原的特异性反应。商业上制备的牛Ig和人Ig不与DNP-KLH反应，并且类似于背景水平。也采用PBS-BSA板作为阴性对照并且没有显示反应性。
图42是说明从HAC血清纯化人抗体的凝胶的照片。具体地，可以从HAC转染色体牛的血清纯化完全的人抗体。此外，μ和γ重链的存在证明了HAC经历了类转换，并且克隆的转染色体宿主支持人重链基因座上的类转换。
采用牛抗人Ig柱亲和纯化来自ΔHAC82的人抗体，并且加样于变性蛋白蛋白凝胶上进行western分析。平行分析了所有样品的等量的(1ug)双份印迹。用两种检测试剂在独立的双份印迹中进行Western印迹分析。所使用的两种多克隆物种特异性试剂为(i)生物素化的牛抗人Ig和(ii)生物素化的马抗牛Ig。将以下对照加样于每个凝胶：人IgG，IgM和来自商业来源的牛Ig混合物。当用牛抗人Ig探测时，来自ΔHAC动物的纯化的人Ig产生了在与两条人重链μ和γ以及人轻链匹配的分子量处迁移的带。该牛抗人检测试剂与人Ig特异性反应，而不与牛Ig交叉反应。在制备来自于ΔHAC动物的人Ig时，没有采用马抗牛试剂(该试剂的检测限大于或等于50ng牛Ig)检测牛Ig。该马抗牛检测试剂与牛Ig特异性反应，而不与人Ig交叉反应。HAC人Ig制备物中观察到了人IgM和IgG，证明了Ig类转换能力。在1ug HAC人Ig中，没有观察到高于该试剂的检测限的显著水平的牛Ig决定簇。
图43说明了HAC编码的人轻链(λ)与人μ链和人γ链结合。该结果证明了HAC-转染色体动物的异种B细胞能够组装人重链和轻链。具体地，来自ΔHAC 82的纯化的人Ig表现出了与人λ链直接连接的人γ和μ链。用牛抗人Ig柱亲和纯化来自ΔHAC 82的人抗体。在两个固相ELISA板上检验等摩尔浓度(100ng/ml)的纯化的HAC人Ig。平板A的捕获试剂是纯化的单克隆小鼠抗人μIg，平板B的捕获试剂是小鼠抗人γIg，两者都是以10ug/ml的浓度包被的。作为每个测定的对照，平行分析等摩尔浓度的商业上生产的纯化的牛Ig和人Ig(100ng/ml)。两个测定的检测试剂是生物素化的单克隆小鼠抗人λ。在每个测定中，来自于ΔHAC 82的人Ig展示高于背景的水平(如高于牛IgG/M和BSA平板C)的水平。两种单克隆试剂都对它们识别的人重链类型具有特异性，并且不与牛Ig交叉反应。
图44说明人μ，γ和轻链存在于从HAC转染色体牛崽纯化的人Ig中，在该牛崽中诱导了抗原特异性人抗体反应。具体地，表征了由DNP-KLH免疫的HAC血清纯化的人抗体。用牛抗人Ig柱亲和纯化来自于ΔHAC 1066的人抗体，然后通过western分析人Ig。在PAGE凝胶上分离来自于DNP-KLH免疫的动物的大约1ug(1X)和5ug(5X)人Ig。在平行分析中分析商业上生产的人IgG和IgM(各1ug)。用多克隆的物种特异性试剂-生物素化的牛抗人Ig检测人Ig。来自于ΔHAC1066动物的人Ig产生了在与两条人重链μ和γ以及人轻链匹配的分子量处迁移的带。μ和γ的存在证明了位于HAC的人重链基因座经历类转换的能力，以及HAC转染色体牛实现该人Ig基因座的类转换的能力。这种检测试剂与人Ig特异性反应，而不与牛Ig交叉反应。
图45说明SLOT程序。在步骤1中，用500ng/ml SLO对供体成纤维细胞可逆透化30分钟。在步骤2中，洗涤透化细胞，并且在含有ATP再生系统的有丝分裂提取物中孵育，以引起染色体浓缩并促进核成分的去除(箭头)。在步骤3，去除提取物，任选在含有2mM CaCl2的培养物中重新封闭细胞。在步骤4，将细胞与去核的受体卵母细胞融合，在步骤5，对NT卵母细胞进行活化，以引起原核形成和发育。
发明详述
用于产生表达异种抗体的有蹄动物的方法
可以使用多种方法产生表达异种(如人)抗体的有蹄动物。这些方法包括，例如，在胎儿期或出生后将含有重链和轻链免疫球蛋白基因的人类人工染色体(HAC)插入有蹄动物，或者将人类B细胞或B细胞前体插入有蹄动物(如免疫缺陷或免疫抑制的有蹄动物)(参见，例如2000年11月17日提交的WO 01/35735，2002年3月20日提交的US 02/08645)。在任意情况下，产生B细胞的人抗体或产生有蹄动物抗体的B细胞可以存在于有蹄动物中。在含有HAC的有蹄动物中，单个B细胞可以产生含有有蹄动物和人重链和轻链蛋白的组合的抗体。
可以采用标准方法将含有用于产生特定物种(例如人类)抗体的基因(优选整个基因座)的所需核酸导入供体细胞，所述供体细胞用于产生表达异种和内源抗体的转基因有蹄动物。优选使用人类人工染色体，例如在WO 97/07671(EP 0843961)和WO00/10383(EP 1106061)中公开的那些人类人工染色体。这些人类人工染色体在相应的已授予的日本专利JP 30300092中也有描述。在此引入这两个申请的完整内容作为参考。此外，含有并表达人免疫球蛋白基因的人工人类染色体的构建公开于Shen等，Hum.Mol.Genet.6(8)：1375-1382(1997)；Kuroiwa等，Nature Biotechnol.18(10)：1086-1090(2000)；Loupert等，Chromosome 107(4)：255-259(1998)；WO00/10383(EP1106061)；WO98/24893；WO96/33735；WO 97/13852；WO98/24884；WO97/07671(EP 0843961)；美国专利5,877,397；美国专利5,874,299；美国专利5,814,318；美国专利5,789,650；美国专利5,770,429；美国专利5,661,016；美国专利5,633,425；美国专利5,625,126；美国专利5,569,825；和美国专利5,545,806)；在此全文引入所有这些文献作为参考。人类人工染色体也可以用来将异种抗体基因导入野生型动物细胞中；这采用上述方法来完成。将人工染色体导入到动物细胞中，尤其是胎儿成纤维细胞中，可以通过本文所述的微细胞融合来进行。
在应用人类人工染色体的一个替代方法中，使用YAC载体、BAC载体或粘粒载体，可以将编码免疫球蛋白基因的核酸整合到染色体中。可以用已知方法，例如电穿孔、脂转染、与包含YAC载体的酵母原生质球融合等，将包含异种Ig基因的载体(WO98/24893，WO96/33735，WO 97/13852，WO98/24884；1998年12月15日授予Meade等的美国专利5,849,992以及1998年10月27日授予Meade等的美国专利5,827,690)导入胎儿成纤维细胞中。此外，可以将包含异种Ig基因的载体导向至所述胎儿成纤维细胞的内源Ig基因座中，导致同时导入所述异种Ig基因和破坏所述内源Ig基因。
也可以如Lonberg等(同上)的专利中所述，实现编码异种免疫球蛋白基因的核酸的整合。在用以将异种免疫球蛋白基因插入到宿主有蹄动物染色体中的“敲入”构建体中，可以将一种或多种免疫球蛋白基因和抗生素抗性基因与在被所述构建体转染的细胞类型中有活性的启动子可操作性连接。例如可以使用组成型活性、诱导型或组织特异性启动子来活化所整合抗生素抗性基因的转录，使得转染细胞可以根据其所产生的抗生素抗性而被选择出来。另一方面，可以使用其中含有所述Ig基因和所述抗生素抗性基因的敲入盒不与启动子可操作性连接的敲入构建体。在这种情况下，根据所产生的在内源启动子控制之下所述抗生素抗性标记的表达，可以选择出其中敲入盒整合到内源启动子下游的细胞。这些被选出的细胞可以用于本文所述的核转移方法中，以产生含有整合到宿主染色体中的异种免疫球蛋白基因的转基因有蹄动物。
采用相似的方法，有可能产生和插入含有供不同物种(其中例如狗、猫、其它有蹄动物、非人灵长类动物)Ig表达用的基因的人工染色体。如上所述并且如本领域已知的，众所周知不同物种的免疫球蛋白基因在不同物种之间表现出基本的序列同源性。
一旦确定了所插入的人工染色体(例如人类人工染色体)已经稳定地导入细胞系(例如牛胎儿成纤维细胞)，则它可以用作核转移的供体。这可以通过PCR法来确定。得到的转基因牛崽包含稳定导入的核酸，例如人类人工染色体。在得到包括稳定掺入的核酸(例如人类人工染色体)的牛崽后，检验所述动物，以确定它们是否反应于免疫和亲和性成熟而表达人Ig基因。
也可以进行上述总体方法的改进方法。例如，为了降低得到的转基因有蹄动物表达的内源抗体量，可以在插入异种核酸之前或之后在供体细胞中灭活一种或多种内源Ig。此外，可以让保留异种Ig基因的动物与其中内源Ig基因被灭活的动物交配。
用于产生表达内源和异种抗体的有蹄动物的其它方法包括在将供体遗传物质插入受体卵细胞之前对其进行重塑，以形成转基因有蹄动物。重塑是指相对于源自将完整细胞或完整细胞核转移至受体卵母细胞的卵母细胞，改进了得到的核移植卵母细胞的发育的任何形态改变。重新编程是通过在导致核被膜溶解和可能导致染色质浓缩的重新编程培养基(如有丝分裂提取物、去污剂和/或盐溶液、或蛋白激酶溶液)中孵育含有异种免疫球蛋白核酸的供体细胞核而完成的。这种核被膜破裂和染色质浓缩使得连接于染色体和原本促进对卵母细胞、胚胎或胎儿发育不利的基因转录的转录调节蛋白释放。通过在将染色质团转移到受体卵母细胞中之前将其纯化，可以去除其它调节蛋白。或者，可以将从染色体释放的特异性调节蛋白免疫耗尽或从重新编程培养基(如细胞提取物)去除，以防止它们重新结合染色体。核转移之后，来自于卵母细胞细胞质的新蛋白可以在卵母细胞中染色质解浓缩和形成核被膜期间结合于染色体。这些蛋白促进允许卵母细胞发育成存活后代的基因的转录。
可以用于产生转基因有蹄动物的另一种克隆方法包括在允许将因子加入细胞或从细胞去除的重新编程培养基(如细胞提取物)中孵育透化细胞(即，含有异种免疫球蛋白核酸的细胞)而对其进行重新编程。优选重新封闭透化细胞的质膜，以便包封需要的因子并且恢复细胞的膜完整性。然后将重新编程的细胞转移到受体卵母细胞中，以便产生克隆的哺乳动物。已经将该克隆方法用于产生没有异种免疫球蛋白核酸的胎儿，它存活了60天以上。初步的结果表明，40-60天的胎儿存活在采用该方法形成的胎儿中(7/10；70％)高于常规核转移胎儿(8/16；50％)。预计具有异种免疫球蛋白核酸的胎儿也具有相似结果。
本发明的方法也可以用于减少来源于具有异种和内源抗体的基因的嵌合胚胎的有蹄动物产生的内源抗体量。可以产生其中的大多数胎盘组织来源于一种遗传来源并且大多数胎儿组织来源于另一种遗传来源的嵌合胚胎。这些嵌合胚胎可以具有更少的胎盘异常并因此可以具有增加的存活率。在一种这样的方法中，使来源于体外受精或天然存在的胚胎的细胞与来源于具有编码异种抗体的核酸和采用常规核转移方法或此处描述的任何克隆方法产生的胚胎的细胞接触。例如，可以将来源于体外受精胚胎的细胞注射到核转移胚胎的外周(如位于透明带和胚胎自身之间)。采用该方法产生没有异种抗体基因的嵌合胚胎，该胚胎在第40天具有67％的存活率，而对照核转移胚胎具有25％的存活率。预计采用来自于具有异种抗体基因的核转移胚胎得到相似的结果。在一种可选择的方法中，在允许来自于每个胚胎的细胞重新组织以产生单个嵌合胚胎的条件下，与来自于紧密化前的核转移胚胎的细胞一起孵育来自于紧密化前的体外受精或天然存在的胚胎的细胞(Wells and Powell，Cloning 2：9-22，2000)。在这两种方法中，优选将来自于体外受精或天然存在的胚胎的细胞掺入胚胎中，优选将来自于核转移方法的细胞掺入胎儿组织。
供体细胞(如牛胎儿成纤维细胞)的序贯操作可用于产生人抗体产生性牛，它具有或不具有交配后代。供体细胞的序贯操作包括以下过程(i)操作供体细胞，(ii)核转移或染色质转移，(iii)产生胎儿，和(iv)从胎儿分离供体细胞，如胎儿成纤维细胞。
在一种特定实施方案中，将重链半合型KO胎儿成纤维细胞用作细胞核或染色质转移克隆方法中的供体细胞。对来自于得到的胎儿的细胞进行修饰，以产生重链纯合型KO胎儿成纤维细胞。该成纤维细胞用作细胞核或染色质转移克隆方法中的供体细胞，并且对来自于得到的胎儿的成纤维细胞进行遗传修饰，以产生轻链半合型KO胎儿成纤维细胞。在细胞核或染色质转移后，对成纤维细胞进行遗传修饰以产生轻链纯合型KO胎儿成纤维细胞，该成纤维细胞然后用作细胞核或染色质转移中的供体细胞。将HAC导入来自于得到的胎儿的成纤维细胞，并且将该含有HAC的成纤维细胞用于细胞核或染色质转移，以便产生牛崽，该牛崽产生人抗体。
至于人抗体的实际产生，一般不需要灭活牛轻链核酸，因为可以采用牛抗人IgL亲和柱从具有牛轻链的不需要的抗体分离需要的完全的人抗体。而且，我们最近的数据表明，嵌合分子(如同时具有牛和人序列的抗体)的量可以比完全的人抗体的量低得多。如果需要灭活牛轻链核酸，可以采用此处描述的方法对牛λ轻链进行突变。
用于在有蹄动物中产生异种抗体和去除不需要的内源抗体的方法
如上文所述，本发明还涉及产生转基因有蹄动物，优选转基因牛，其中(i)通过施用抑制内源B细胞或抗体降低了内源Ig表达，并且(ii)已经稳定导入了包含产生另一物种(如人)的功能性抗体所必须的基因的核酸。因此，可以获得不产生其内源抗体，但产生另一物种的抗体的转基因动物。可以产生任何非内源抗体，包括，但不限于人、非人灵长类动物、狗、猫、小鼠、大鼠或豚鼠抗体。
具体地，可以将任何减少B细胞产生内源抗体或减少功能性内源B细胞数目的化合物施用于非人哺乳动物(如有蹄动物)。可以通过给有蹄动物注射抗内源IgM重链和/或内源轻链(如λ和/或κ轻链)的单克隆或多克隆抗体而进行免疫耗尽。在其表面上表达内源重链或轻链蛋白的B细胞易感于体液或细胞介导的去除、凋亡或抗体介导的细胞毒素摄取。然后可以扩增表达完全的异种(如人)抗体的B细胞群以维持抗体水平。例如，我们证明了将抗牛IgM抗体注射到胎儿中减少了外周血B细胞的数目。可以在哺乳动物免疫系统的正常发育阶段(如在胎儿、胚胎或出生后阶段)或在该阶段之后施用这些化合物，以便抑制内源有蹄动物中内源B细胞的发育。
优选将该方法用于表达内源和异种抗体这两者的有蹄动物，以增加该有蹄动物产生的异种抗体百分比。降低产生的有蹄动物和有蹄动物/异种嵌合抗体分子的量，增加了人抗体的产生量并且简化了从有蹄动物血液或乳汁纯化完全的人抗体。例如，可以将抗牛抗体的多克隆抗体注射到表达一些完全的牛抗体分子、一些完全的人抗体分子和一些牛/人嵌合抗体分子的牛中，以便耗尽产生牛和牛/人嵌合抗体的B细胞。然后可以富集该牛中完全的人抗体的产生。
本发明前本领域的状况
虽然已经在小鼠中表达了人Ig，但人Ig在牛中或是在其它有蹄动物中是否部分重排和表达是不可预测的，因为在抗体基因结构、抗体产生机制和B细胞功能方面存在差异。特别是，与小鼠不同，牛和羊在其免疫生理学方面与人类有所不同(Lucier等，J.Immunol.161：5438，1998；Parng等，J.Immunol.157：5478，1996；和Butler，Rev.Sci.Tech.17：43，2000)。例如，与抗体基因的多样化在人类和小鼠中依赖于基因重排相比，抗体基因的多样化在牛和羊中更多地依赖于基因转变。此外，在人类和小鼠中B细胞的主要位置是在骨髓中，而在牛和羊中B细胞位于回肠淋巴集结中。因此，预测在牛(或其它有蹄动物)的B细胞系中是否发生人免疫球蛋白基因座的免疫球蛋白重排和多样化，在本发明之前即使并非是不可能的，也是困难的。另外，也一直难以预测牛在无其内源Ig的情况下或者在人抗体的干扰下是否能够生存，即诱发其正常的免疫功能。例如，不能确定表达人Ig的牛B细胞是否正确地迁移至牛的回肠淋巴集结中，因为这在人类中是不发生的。也不清楚介导补体活化、细胞因子释放的诱导以及抗原清除的人Fc受体功能在牛系统中是否正常。不能预测所述有蹄动物是否将存活，因为不确定人Igs是否被功能性表达，或以足量表达以提供足够的免疫应答。同样，也不确定人染色体是否将在转基因有蹄动物中稳定维持。
此外，不确定有蹄动物(如牛)B细胞是否能够表达或适当重排人或其它非内源Igs。也不能预测转基因有蹄动物中的等位基因排除是否将产生需要的表达完全异种的抗体的B细胞。当此处描述的方法用于施用抗体以去除不要的内源抗体时，这种需要的完全异种的抗体不从有蹄动物中被去除。相反，如果不发生排除，有蹄动物将仅仅表达部分异种或完全内源的抗体。在后一种情况下，给有蹄动物抗体以去除内源抗体，可能去除部分内源的抗体以及完全内源的抗体。
虽然上文已经描述了将在本发明中使用的方法，但是所使用的技术在下文有更详细的描述。提供这些实施例是为了说明本发明，不应解释为是限制性的。特别是，虽然这些实施例集中于转基因牛，但是可以使用所述方法来产生和检验任何转基因有蹄动物。
实施例1：HAC的导入和重排
插入HAC的程序的概述
为了产生表达异种抗体和任选具有内源抗体基因突变的有蹄动物，可以采用标准方法将编码异种抗体(如HAC)的核酸插入细胞。如果需要，可以对细胞中的一种或多种内源抗体基因进行突变。然后将细胞用于标准核转移程序以产生需要的转基因有蹄动物，如下文更详细的描述。
重要的是，获得含有人类人工染色体序列(如#14fg.、#2fg.和#22fg.)的雄性和雌性牛胎儿成纤维细胞系并且对其进行选择，用来从这些细胞系产生克隆牛崽。
例如，可以同时或者连续导入来源于人类14号染色体(″#14fg″，包含Ig重链基因)、人类2号染色体(″#2fg″，包含Igκ链基因)和人类22号染色体(″#22fg″，包含Igλ链基因)的HAC。
通过让雄性#14fg.动物与雌性#2fg.和#22fg.动物交配，并且评估后代，检验这些染色体片段的传递。如果传递成功，则让这两个系交配，以产生含有所有三种染色体片段的系。
也可以将#14fg.、#2fg.和#22fg.染色体片段插入到Homo H/L胎儿细胞中，用来产生克隆牛崽，或者让转基因HAC幼仔与其它转基因牛崽(如Homo H/L牛崽)杂交。另一方面，可以如下文所述，导入其它HAC，例如ΔHAC或ΔΔHAC，或者用任何其它染色体转移法将其导入。
原理HAC的种系传递应该可用来将所述HAC导入动物(如Ig敲除动物)以及在生产畜群中繁殖动物。对通过种系繁殖HAC的担忧是在减数分裂期间染色体物质不完全配对。然而，如Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：722，2000)所指明的，种系传递在小鼠中已经获得成功。
图1A中概述的策略包括将#14fg.插入到雄性细胞系中，而将#2fg.和#22fg.分别插入到雌性细胞系中。产生保留HAC的牛崽，可以通过雌性和雄性检验种系传递。一部分所得后代(约25％)应该既含有重链HAC，又含有轻链HAC。进一步的杂交应该产生含有所有三种染色体片段的牛崽系。任选用这些动物与如先前所述从胎儿细胞产生的转基因动物(如Homo H/L动物)杂交。
实验设计
从细胞系的初次筛选获得细胞。这些细胞可以是Holstein或者是与上述所用的不同的细胞系。这允许杂交，同时尽可能地在畜群中保持大量的遗传变异。然后将HAC导入细胞系中并且选择阳性细胞系。选出的细胞系用于核转移，并且产生牛崽。从12月龄开始，收集精子和卵，让其受精，然后转移到受体动物中。取细胞样品进行DNA标记分析和核型分析。从分娩时开始，取血样，分析人Ig蛋白的存在。
如上所述，也可以用在上述实验中开发的程序，任选将HAC转移到Homo H/L细胞系中。
另外提供以下实施例作为本发明的进一步例证。
插入HAC的示例性程序
进行另外的实验，以证明牛宿主可以或者单独产生或者联合产生免疫球蛋白重链(μ)和λ轻链。另外，这些实验证明，所述人免疫球蛋白链被重排，并且获得了多克隆血清。在这些方法中，用人类人工染色体将表达免疫球蛋白的基因导入牛成纤维细胞中。然后用成纤维细胞进行核转移，获得胎儿，并且分析抗体产生的情况。这些程序和结果在下文有更详细的描述。
HAC构建体  用先前描述的染色体克隆系统(Kuroiwa等，Nature Biotech.18：1086-1090，2000)，构建人类人工染色体(HAC)。简而言之，为了构建ΔHAC，用端粒定向染色体截短法(Kuroiwa等，Nucleic Acid Res.，26：3447-3448，1998)，使先前报道的含有在HCF2基因座整合的loxP序列的人类22号染色体片段(hChr22)在AP000344基因座截短。接着，通过将含有在AP000344基因座截短的上述hChr22片段(hCF22)的DT40细胞克隆与含有稳定的且种系可传递的人类微型染色体SC20载体的DT40细胞克隆(称为“R克隆”)融合，形成细胞杂交体。通过在S20片段的RNR2基因座插入一个loxP序列而产生SC20载体。SC20片段是天然存在的来源于人类14号染色体的片段，该片段包含完整的人Ig重链基因区(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722，2000)。所得的DT40细胞杂交体含有两种hChr片段。所述DT40杂交体用Cre重组酶表达载体转染，以诱导hCF22和SC20载体之间的Cre/loxP介导的染色体易位。稳定转染物用嵌套PCR分析，以证实由HCF2和AP000344基因座限定的2.5兆碱基hChr22区克隆到SC20载体的loxP克隆位点中。然后通过FACS分选，根据所编码的绿色荧光蛋白的荧光，分离预期含有ΔHAC的PCR阳性细胞。经分选细胞的荧光原位杂交(FISH)分析，也用来证实含有所述2.5兆碱基hChr22插入片段的ΔHAC的存在。
同样采用这种染色体克隆系统，也构建了ΔΔHAC。将hChr22片段在AP000344基因座截短，然后通过在DT40细胞中同源重组，将loxP序列整合到AP000553基因座中。然后将所得细胞与含有SC20微型染色体载体的R克隆融合。所述细胞杂交体用Cre表达载体转染，以达到Cre/loxP介导的染色体易位。通过PCR和FISH分析，证实了含有由AP000553和AP000344基因座限定的1.5兆碱基hChr22插入片段的ΔΔHAC的产生。
ΔHAC和ΔΔHAC的体内功能性通过产生含有这些HAC的嵌合小鼠来评价。采用标准方法，将这些HAC各自导入小鼠胚胎干(ES)细胞，然后用所述胚胎干细胞产生嵌合小鼠(日本专利号2001-142371；2000年5月11日提交)。所得的小鼠具有高度嵌合状态(85-100％的毛色)，证明含有这些HAC的ES细胞高水平的多能性和这些HAC在体内的有丝分裂稳定性。此外，ΔHAC通过所述ΔHAC嵌合小鼠的种系，传递给下一代，证明这种HAC的减数分裂稳定性。
保留这些HAC的鸡DT40细胞已经根据布达佩斯条约，于2001年5月9日独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent Organism Depository，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan)保藏。保藏号如下：ΔHAC(FERMBP-7582)、ΔΔHAC(FERM BP-7581)和SC20片段(FERM BP-7583)。保留这些HAC的鸡DT40细胞也已经保藏在台湾的食品工业研究和开发研究所(Food Industry Research and Development Institute)(FIRDI)。保藏号和保藏日期如下：ΔHAC(CCRC 960144；2001年11月9日)，ΔΔHAC(CCRC 960145；2001年11月9日)和SC20片段(该细胞系以名称SC20(D)提交保藏；CCRC 960099；1999年8月18日)。
ΔHAC中的2.5兆碱基(Mb)hChr22插入片段由以下BAC毗连群构成，所述毗连群由以下Genbank登录号列出：AC002470、AC002472、AP000550、AP000551、AP000552、AP000556、AP000557、AP000558、AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344。ΔΔHAC中的1.5Mb hChr22插入片段由以下BAC毗连群构成：AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344(Dunham等，Nature 402：489-499，1999)。
牛胎儿成纤维细胞的产生
为了产生牛胎儿成纤维细胞，从在Trans Ova(Iowa)家畜舍内饲养的经过疾病检验的Holstein牛或Jersey牛中收集45-60天的胎儿，其中记录父本和母本连续三代的系谱。所收集的胎儿在湿冰上运送到Hematech′s Worcester Molecular Biology Division，以产生原代胎儿成纤维细胞。到达后，将胎儿转移到组织培养橱中的非组织培养级的100mm塑料培养皿中。使用无菌镊子和剪刀，从所述胎儿除去胚外膜和脐带。在将胎儿转移到新的塑料培养皿后，除去头部、肢体和内脏。将已取出内脏的胎儿转移到含有约10ml胎儿冲洗液的第三个培养皿中，所述胎儿冲洗液由以下物质组成：125ml 1×Dulbecco′s-PBS(D-PBS)，含有Ca2+和Mg2+(Gibco-BRL，cat#.14040)；0.5ml酒石酸泰乐菌素(Tylosine Tartrate)(8mg/ml，Sigma，cat#.T-3397)；2ml青霉素-链霉素(Sigma，cat#.P-3539)；和1ml两性霉素(Fungizone)(Gibco-BRL，cat#.15295-017)(混合并通过0.2μm尼龙过滤装置(Nalgene，cat#.150-0020)过滤)。
所述胎儿用胎儿冲洗液再洗涤3次，以除去痕量的血液，将其转移到50ml锥形组织培养管中，用无菌手术刀将其切碎成小块。组织小块用无Ca2+和Mg2+的1×D-PBS(Gibco-BRL，cat#.14190)洗涤1次。在组织小块沉降至管底部后，除去上清液，更换为约30ml细胞解离缓冲液(Gibco-BRL，cat#.13151-014)。将管倒置数次，以便让其混合，然后在组织培养箱中于38.5℃/5％CO2孵育20分钟。在组织沉降至管底部后，除去上清液，更换为等体积的新鲜细胞解离缓冲液。将组织和细胞解离缓冲液的混合物转移到一个带有24mm圆端旋转棒的75ml无菌玻璃胰蛋白酶处理烧瓶(Wheaton Science Products，cat#.355393)中。将烧瓶转移到38.5℃/5％ CO2组织培养箱，置于磁力搅拌板上，以足以允许有效混合的速度搅拌大约20分钟。将烧瓶转移到组织培养橱中；让组织小块沉降，然后除去上清液，通过以1,200rpm离心5分钟收集解离的细胞。将细胞沉淀重悬于小体积的成纤维细胞完全培养基中，所述培养基的组成如下：440ml αMEM(BioWhittaker，cat#.12-169F)；50ml经辐射的胎牛血清；5mlGLUTAMAX-I补充物(Gibco-BRL，cat#.25050-061)；5ml青霉素-链霉素(Sigma，cat#.P-3539)；1.4ml 2-巯基乙醇(Gibco-BRL，cat#.21985-023)(将除胎牛血清之外的所有组分混合，然后通过0.2μm尼龙过滤装置[Nalgene，cat#.151-4020]过滤)，并且在冰上贮存。所述解离过程再重复3次，在每个步骤期间使用另外30ml细胞解离溶液。将细胞合并，用成纤维细胞完全培养基洗涤；顺序通过23号和26号针头，最后通过70μm细胞滤过器(B-D Falcon，cat#.352350)，产生单细胞悬浮液。通过在血细胞计数器中，在存在锥虫蓝(0.4％溶液，Sigma，cat#.T-8154)的情况下计数，测定细胞密度和活力。
原代成纤维细胞在成纤维细胞完全培养基中，以1×106活细胞/T75cm2组织培养瓶的细胞密度于38.5℃/5％ CO2扩增。在培养3天后，或者在细胞达到汇合之前，通过用1×D-PBS(无Ca2+和Mg2+)冲洗培养瓶1次，并且用10ml细胞解离缓冲液于室温孵育5-10分钟，收获成纤维细胞。用倒置显微镜目测监测细胞的解离。在这一步，小心确保通过用吸管反复吹吸使细胞块消散。在洗涤和定量后，解离的成纤维细胞随时可用于基因导向实验。这些细胞也可以冷冻保存，以供长期贮藏。
将HAC导入牛胎儿成纤维细胞
采用微细胞介导的染色体转移(MMCT)(Kuroiwa等NatureBiotech.18：1086-1090，2000)，将ΔHAC和ΔΔHAC从所述DT40细胞杂交体转移到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。在补充10％FBS(Gibco)、1mg/ml G418和0.2mg/ml潮霉素B的F12(Gibco)培养基中，于37℃和5％CO2培养含有ΔHAC的CHO克隆(“D15克隆”)。将D15克隆在12个T25烧瓶中扩增。当汇合度达到80-90％时，以0.1μg/ml的终浓度加入秋水仙酰胺(Sigma)至培养基中。3天后，将培养基更换为补充10μg/ml细胞松弛素B(Sigma)的DMEM(Gibco)。将培养瓶以8,000rpm离心60分钟，收集微细胞。微细胞通过8、5和3μm滤器(Costar)纯化，然后重悬于DMEM培养基中。用所述微细胞如下所述与牛成纤维细胞融合。
牛胎儿成纤维细胞在补充10％FBS(Gibco)的α-MEM(Gibco)培养基中于37℃和5％ CO2下培养。将成纤维细胞在T175烧瓶中扩增。当达到70-80％汇合时，用0.05％胰蛋白酶使细胞与培养瓶脱离。成纤维细胞用DMEM培养基洗涤2次，然后铺在所述微细胞悬浮液上。在微细胞-成纤维细胞悬浮液以1,500rpm离心5分钟后，按照生产商的方案，将PEG1500(Roche)加入到沉淀中，使微细胞能够与所述牛成纤维细胞融合。融合后，将融合的细胞接种到6个24孔板中，在补充10％FBS的α-MDM培养基中培养24小时。然后将培养基更换为含有0.7mg/ml G418的培养基。在G418抗生素存在下生长大约2周后，选择G418抗性融合细胞。用这些G418抗性克隆如下所述进行核转移。
同样借助MMCT，将来自于CHO克隆C13的ΔΔHAC转移到牛胎儿成纤维细胞中。经选择的G418抗性克隆用于核转移。
核转移、活化和胚胎培养  基本上如先前已描述的方法(Cibelli等，Science 1998：280：1256-1258)，进行所述核转移法。在成熟后(hpm)约18-20小时，将体外成熟的卵母细胞去核，通过bisBenzimide(Hoechst 33342，Sigma)标记，在紫外线下证实染色体的除去。通过应用2.4kV/cm达20μsec的单个电脉冲(Electrocellmanipulator 200，Genetronics，San Diego，CA)，使这些胞质供体细胞双联体融合。3-4小时后，取出总转移双链体的25％的一个随机亚组，通过bisBenzimide标记转移的细胞核，证实融合。30hpm时，重新构建的卵母细胞和对照如先前已描述的方法(Lin等，Mol.Reprod.Dev.1998：49：298-307；Presicce等，Mol.Reprod.Dev.1994：38：380-385)，用钙离子载体(5μM)活化4分钟(Cal Biochem，San Diego，CA)以及用含10μg放线菌酮和2.5μg细胞松弛素D(Sigma)的ACM培养基活化6小时。在活化后，卵在HEPES缓冲的仓鼠胚胎培养基(HECM-Hepes)中洗涤5次，然后置于4孔组织培养板中培养，所述培养板含有经辐射的小鼠胎儿成纤维细胞和0.5ml胚胎培养基并覆盖0.2ml经过胚胎检验的(embryo tested)矿物油(Sigma)。每个孔放置25-50个胚胎，在空气环境下于38.5℃、5％CO2下孵育。第4天，向培养基中加入10％FCS。
胚胎转移  第7天和第8天，将核转移胚泡分别转移到第6天和第7天同步化的受体小母牛中。受体动物采用一次注射Lutalyse(Pharmacia & Upjohn，Kalamazoo，MI)、然后检查动情期进行同步化。在胚胎转移后第30天和第60天，通过超声波检查法，检查受体孕体的存在，此后，每30天通过直肠触诊进行检查，直至270天。HAC在这些牛胎儿中的保留情况概述于表1，并且在以下的小节中更详细地描述。
                             表1：牛胎儿中的HCA保留概述
  HAC   细胞克隆   受体/胎儿编号     NT日期     回收日期     胎儿年龄      HAC保留HL
  ΔΔ   4-12     5580   2/14   4/13     58     +    +
  ΔΔ   2-14     5848   2/15   4/13     57     -    -
  ΔΔ   4-12     5868A   2/14   6/13     119     +    +
  ΔΔ   4-12     5868B   2/14   6/13     119     +    +
  ΔΔ   4-12     5542A   2/14   5/16     91     +    +
  ΔΔ   4-12     5542B   2/14   5/16     91     +    +
  ΔΔ   4-12     5174   2/14   5/16     91(异常)     nd    nd
  ΔΔ   4-12     6097   2/14   保持     160(7/24)     nd    nd
  Δ   4-8     6032   1/31   3/30     58     +    +
  Δ   2-13     5983   2/2   3/30     56     -    -
  Δ   4-2     5968   2/2   3/30     56     +    +
  Δ   2-22     6045   2/2   3/30     56     +    +
  Δ   4-8     5846   1/31   4/20     79     -    -
  Δ   2-13     6053   2/2   4/27     84     +    -
  Δ   4-2     5996   2/1   4/20     77     +    -
含人14号染色体的片段的HAC的导入  将SC20片段，即人14号染色体片段(“hchr.14fg”，含有Ig重链基因)以与上述方法基本相同的方法，导入到胎儿成纤维细胞中。也可以使用任何其它的标准染色体转移法，将该HAC或含有人Ig基因的另一种HAC插入到供体细胞中。所得的供体细胞可以用于标准核转移技术，例如上述的那些技术，以产生具有所述HAC的转基因有蹄动物。
通过超声波检查法，检查从含hchr.14fg的细胞转移了克隆胚胎的28个受体的妊娠情况。结果概述于表2。
如果需要，可以将来自于得到的HAC胎儿或HAC后代的细胞用于第二轮核转移，以产生其它的克隆后代。来自于起始HAC胎儿或HAC后代的细胞也可以冷冻，以形成用作供体细胞来源的细胞系，用于产生其它的HAC有蹄动物。
表2：使用含hchr.14fg的供体细胞于40天的妊娠
  克隆ID   转移受体编号    40天时妊娠(％)
    2-1     08     03 (38)
    4-2     10     00 (00)
    4-1     05     00 (00)
    4-1     03     01 (33)
    2-1     02     01 (50)
    总计     28     05 (18)
妊娠率低于预期。认为这可归因于胚胎转移期间极其异常的炎热气候。
如图27中所示，携带HAC的胚胎的妊娠率看来与非转基因克隆妊娠率相当。一个携带ΔΔHAC牛崽的受体最近产出一个活的健康牛。其它受体将在接下来的数月内出生。
人重链基因座在ΔHAC牛胎儿中重排和表达的证明
在各种妊娠天数时取出克隆的ΔHAC转基因牛胎儿，分析其人免疫球蛋白基因座的存在、重排和表达。对通过RT-PCR从这些胎儿之一的脾和非淋巴组织(肝和脑)获得的基因组DNA和cDNA的分析，显示出所述ΔHAC的存在、重排和表达。
在ΔHAC胎儿中存在人重链和/或轻链
为了确定人重链和轻链是否保留在ΔHAC胎儿中，从ΔHAC胎儿中分离肝DNA，通过PCR分析编码人重链和轻链的基因组DNA的存在情况。
为了检测基因组重链DNA，使用以下引物：VH3-F 5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′(SEQ ID NO：1)和VH3-R 5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3′(SEQ ID NO：2)。用于检测λ轻链DNA的引物是IgL-F 5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′(SEQ ID NO：3)和IgL-R 5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3′(SEQ ID NO：4)。PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl Ex Taq。通过将反应混合物在以下条件下孵育：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒，进行38个循环的PCR。
如图5所示，胎儿#5968、6032和6045都含有人重链(μ)和轻链(λ)两个基因座。胎儿#5996仅含有人重链基因座。胎儿#5983不含人重链，也可以不含人轻链。胎儿#5846不含任一种人序列。因此，胎儿#5983和5846可能没有保留所述HAC。这些结果提示，ΔHAC可以在牛中稳定地保留直至妊娠第58天。
在ΔHAC胎儿#5996中存在人Cμ外显子
用对包括Cμ3和Cμ4的部分的mRNA转录物特异性的引物，来测定在胎儿#5996中ΔHAC是否存在以及是否表达编码人μ基因座恒定区的转录物。
关于人μ重链的基因组恒定区的这种RT-PCR分析，使用引物“CH3-F1”(5′-accacctatgacagcgtgac-3′，SEQ ID NO：5)和“CH4-R2”(5′-gtggcagcaagtagacatcg-3′，SEQ ID NO：6)，产生一种350碱基对的RT-PCR产物。这种PCR扩增通过最初于95℃变性孵育5分钟来进行。然后，通过于95℃孵育1分钟、于59℃孵育1分钟和于72℃孵育2分钟，进行35个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物于72℃孵育10分钟。如下所述用引物I7L和P9，检测重排的牛重链(图7)。作为内部对照，用引物“GAPDH正向”(5′-gtcatcatctctgccccttctg3′，SEQ ID NO：7)和“GAPDH反向”(5′-aacaacttcttgatgtcatcat-3′，SEQ ID NO：8)，检测GAPDH RNA的水平。对于这一GAPDH RNA的扩增，将样品于95℃孵育5分钟，然后于95℃1分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，进行35个循环的孵育。然后将混合物于72℃孵育7分钟。
该分析表明，胎儿#5996脾的RT-PCR分析，产生与使用对照人脾cDNA(第4泳道)和得自ΔHAC嵌合小鼠的cDNA(第5泳道)产生的扩增产物匹配的一个条带(第3泳道)(图6)。在非淋巴组织中没有检测到这样的条带：牛肝(第1泳道)或牛脑(第2泳道)。在肝(图6的第10泳道)和脑(图7的第6泳道)中成功地扩增管家基因GADPH，表明这些组织支持RT-PCR的能力。
到妊娠77天时牛重链基因座的重排
测试ΔHAC胎儿#5996，以确定它是否经历了免疫球蛋白重链基因座重排所需的重组系统表达和活化所必需的发育过程。关于该分析，进行标准RT-PCR分析，来检测编码μ-VH重排的mRNA转录物的存在。使用引物“17L”(5′-ccctcctctttgtgctgtca-3′，SEQ ID NO：9)和“P9”(5′-caccgtgctctcatcggatg-3′，SEQ ID NO：10)，通过RT-PCR分析从胎儿#5996脾、肝和脑分离的RNA。PCR反应混合物于95℃孵育3分钟，然后采用以下条件：95℃1分钟、58℃1分钟和72℃2分钟，进行35个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物于72℃孵育10分钟。
图7的第5泳道表明，获得了预期大小的重排牛重链(450碱基对)扩增产物。该产物迁移到与对照牛Cμ重链cDNA扩增产物的相同位置(第7泳道)，已知所述对照含有对应于重排牛重链转录物的序列。正如所预期的，所述重排重链在脾(第5泳道)中表达，但在发育的这一时间点在脑(第2泳道)和肝(第3泳道)中没有表达。
人重链基因座在ΔHAC胎儿#5996中的重排和表达
通过扩增包括Cμ和VH区的部分的DNA区段，证明人重链基因座的重排和表达。用对包括Cμ(Cμl)和VH(VH3-30)的部分的RNA转录物特异性的引物，来测定含有重排人Cμ-VDJ序列的RNA转录物是否存在(图8)。
对于这种RT-PCR分析，使用引物“Cμl”(5′-caggtgcagctggtggagtctgg-3′，SEQ ID NO：11)和“VH3-30”(5′-caggagaaagtgatggagtc-3′，SEQ ID NO：12)，产生450碱基对的RT-PCR产物。这种RT-PCR如下进行：将反应混合物于95℃孵育3分钟，然后进行以下40个孵育循环：95℃30分钟、69℃30分钟和72℃45分钟，再进行72℃10分钟的一个孵育循环。这种RT-PCR产物用相同的引物如下进行再扩增：95℃3分钟的一个孵育循环；95℃1分钟、59℃1分钟、72℃1分钟，40个孵育循环；和72℃10分钟，一个孵育循环。作为内部对照，如上所述进行GAPDH的RT-PCR扩增。
图8中的凝胶表明，对胎儿#5996脾的RT-PCR分析，产生与使用人脾cDNA(第4泳道)或ΔHAC嵌合小鼠脾cDNA(第1泳道)产生的扩增产物匹配的一个条带(第5泳道)。在牛肝(第2泳道)或牛脑(第3泳道)中没有检测到这样的条带。作为阳性对照，GADPH RNA的扩增(第8泳道和第9泳道)表明这些组织支持RT-PCR的能力。
也使用引物CH3-F3(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQ IDNO：13)和CH4-R2(5′-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3′，SEQ ID NO：14)，通过RT-PCR分析，证实了人重链区在胎儿#5996中的重排和表达。这些PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。通过将反应混合物在以下条件下孵育：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒，进行40个循环的PCR。
如图9的第6泳道和第7泳道所示，得自胎儿#5996脾的扩增序列的大小与得自两个阳性对照的剪接恒定区片段的大小相同，所述阳性对照为：得自人脾(第8泳道)和ΔHAC嵌合小鼠脾(第9泳道)的样品。正如所预期的，得自正常小鼠脾和牛脾的阴性对照不含扩增序列(第1泳道和第2泳道)。得自胎儿#5996肝和脑的样品不含与经剪接的人μ重链恒定区片段一样大小的扩增剪接序列，但含有来源于污染所述RNA样品的基因组DNA的未剪接基因组片段的扩增序列(第3、4和5泳道)。
人重链基因座在ΔHAC胎儿中的VDJ重排
也进行了RT-PCR分析，以进一步证实所述重链基因座在ΔHAC胎儿#5996中的VDJ重排。进行嵌套RT-PCR，第一个反应使用引物Cμ-1(5′-CAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3′，SEQ ID NO：15)，第二个反应使用引物Cμ-2(5′-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3′，SEQ ID NO：16)，两个反应都使用引物VH3-30.3(5′-CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′，SEQ ID NO：17)。所述RT-PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。所述RT-PCR如下进行，第一个反应使用以下条件进行38个循环：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、65℃30秒和72℃30秒。对于第二个反应，使用引物VH3-30.3和Cμ-2(5′-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3′，SEQ ID NO：16)，在以下条件下进行38个循环：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、65℃30秒和72℃30秒。
如图10的第6泳道和第7泳道所示，对胎儿#5996脾的RT-PCR分析，产生其大小与第8泳道和第9泳道中的阳性对照一样的一条重链条带。得自胎儿#5996肝和脑的样品含有某些污染性重排DNA(第3泳道和第5泳道)。第1泳道和第2泳道中的阴性对照产生大小不正确的条带。
通过测序证实ΔHAC重排
通过从ΔHAC胎儿#5996脾的RNA反转录所得到的cDNA，用对重排人μ特异性的引物扩增，并且在琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶切取通过用Cμ1-VH3-30引物对扩增所产生的条带。从该条带回收所扩增的cDNA并将其克隆。纯化得自经PCR检测为重排人μ阳性的所得克隆的DNA，并对其测序(图11A)。
得自该ΔHAC胎儿的序列与20种以上的已知人重链序列的同源性超过95％。例如，人抗肺炎球菌抗体的μ链与该序列的一个区有97％同源(图11B)。
通过用引物Cμ-1和VH3-30.3对胎儿#5996的脾进行RT-PCR分析，然后用引物Cμ-2和VH3-30.3进行再扩增，也获得了得自重排人重链的另外的序列。用CHROMA SPIN柱(CLONETECH)纯化所述RT-PCR产物，并且按照生产商的方案，将其克隆到pCR2.1 TA克隆载体(Invitrogen)中。在由BigDye Terminator反应混合物(3μl)、模板质粒(200ng)和Cμ-2引物(1.6pmol)组成的10μl体积的反应混合物中，进行染料终止序列反应(ABI Applied System)。测序反应用ABI3700测序仪进行。对于该分析，在以下条件下进行25个循环：96℃1分钟、96℃10秒、55℃5秒和60℃4分钟。
鉴定出至少两种重排人重链转录物，它们是VH3-11/D7-27/JH3/Cμ和VH3-33/D6-19/JH2/Cμ(图12A和1 2B)。这些结果证明，在胎儿#5996脾中的所述ΔHAC中发生人μ重链基因座的VDJ重排。从同一个胎儿鉴定出不止一种重排重链序列，也证明了ΔHAC胎儿产生多样化人免疫球蛋白序列的能力。
人重链和轻链基因座在ΔΔHAC胎儿中的重排和表达
从不同妊娠日期的受体母牛，取出得自牛胎儿成纤维细胞ΔΔHAC染色体转移的克隆胎儿。分析所述胎儿的带有HAC的人免疫球蛋白重链和λ轻链基因座的存在和重排。对得自这些组织的基因组DNA的研究表明，在其中某些胎儿中存在人免疫球蛋白重链和轻链。对得自这些胎儿脾的cDNA的检查表明，所述免疫球蛋白重链和轻链基因座在其中某些胎儿中重排和表达。FACS分析也证明了人λ轻链蛋白在其中两个胎儿的脾淋巴细胞表面表达。
在ΔΔHAC胎儿中存在人重链和轻链基因座
为了确定ΔΔHAC胎儿是否保留有人重链和轻链基因座，对得自58天胎儿#5580、57天胎儿#5848以及91天胎儿#5442A和5442B的肝的基因组DNA进行PCR分析。用于检测所述重链基因座的PCR引物是VH3-F(5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′，SEQ ID NO：18)和VH3-R(5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3′，SEQ ID NO：19)，而用于检测所述轻链的引物是IgL-F(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQ ID NO：20)和IgL-R(5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3′，SEQ ID NO：21)。所述PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl Ex Taq。如下进行38个PCR循环：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒(图13和14)。
如图13和14所示，阳性对照58天胎儿#5580含有人重链和轻链免疫球蛋白两个基因座。另外，91天的胎儿#5442A和5442B也含有重链和轻链两个基因座(图14)。相反，胎儿#5848不含任一种人基因座，因此可能不含有ΔΔHAC。这些结果提示，ΔΔHAC可以在牛中稳定保留直至妊娠第91天。
人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A中的重排和表达
用RT-PCR来检测重排人重链RNA转录物在ΔHAC胎儿#5542A中的表达。所用的RT-PCR引物是CH3-F3(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQ ID NO：22)和CH4-R2(5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3′，SEQ ID NO：23)。所述RT-PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μ1 Ex Taq。如下进行40个循环的RT-PCR循环：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒。
图15的第4泳道和第5泳道含有来自胎儿#5442A脾的扩增的剪接μ重链恒定区序列，其大小与所述阳性对照样品的大小相似。这些结果表明，胎儿#5442A在其脾中表达一种重排的μ重链转录物。在未经剪接的基因组序列的区中也观察到模糊条带，它们是从所述RNA样品中污染的基因组DNA扩增的。得自胎儿#5442A肝和脑的对照样品不产生扩增重排重链序列所预期大小的条带。
人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达
用RT-PCR来检测重排人重链RNA转录物在一个妊娠119天的ΔΔHAC胎儿(胎儿#5868A)的脾中的表达。用于该分析的引物是VH30-3(5′-caggtgcagctggtggagtctgg-3′，SEQ ID NO：24)和CM-1(5′-caggagaaagtgatggagtc-3′，SEQ ID NO：25)。另外，使用引物“GAPDHup”(5′-gtcatcatctctgccccttctg-3′，SEQ ID NO：26)和“GAPDHdown”(5′-aacaacttcttgatgtcatcat-3′，SEQ ID NO：27)来扩增GAPDH对照转录物。对于该PCR分析，将反应混合物于95℃孵育5分钟，然后通过于95℃孵育1分钟、58℃孵育1分钟和72℃孵育2分钟，进行多个循环的变性、退火和扩增。然后，将混合物于72℃孵育10分钟。
图16的第3泳道含有通过对ΔΔHAC胎儿#5868A进行该分析而产生的RT-PCR产物。这种RT-PCR产物为扩增重排人重链所预期的大小(470碱基对)，并且在凝胶中迁移到与已知含有对应于重排人重链转录物的序列的对照cDNA相同的位置。作为对照，ΔΔHAC胎儿#5868A的胎脾cDNA和正常牛cDNA样品当用GAPDH引物扩增时，都产生一种产物，证明所述cDNA支持扩增的能力(第7泳道和第8泳道)。
人λ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中的重排和表达  使用对扩增包括人λ的部分的转录物特异性的引物，来检测得自重排人λ轻链基因座的RNA转录物。
对于图17中所示的RT-PCR分析，使用引物Cλ1(.5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3′，SEQ ID NO：28)、Cλ2-3(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3′，SEQ ID NO：29)和Cλ7(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3′，SEQ ID NO：30)的等摩尔混合物和引物Vλ1 LEA1(5′-CCCCCAAGCTTRCCKGSTYYCCTCTCCTC-3′，SEQ ID NO：31)。所述RT-PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。所述RT-PCR的条件如下：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒，进行40个循环。
如图18所示，该RT-PCR分析也使用下述引物进行：引物Vλ3LEA1(5′-CCCCCAAGCTTGCCTGGACCCCTCTCTGG-3′；SEQ ID NO：32)、Vλ3JLEAD(5′-ATCGGCAAAGCTTGGACCCCTCTCTGGCTCAC-3′，SEQ ID NO：33)，VλBACK4(5′-CCCCCAAGCTTCTCGGCGTCCTTGCTTAC-3′，SEQ IDNO：34)的等摩尔混合物以及引物Cλ1(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3′，SEQ ID NO：35)、Cλ2-3(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3′，SEQ ID NO：36)和Cλ7(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3′，SEQ ID NO：37)的等摩尔混合物。所述RT-PCR的反应条件与以上关于图7所述的条件相同。
图17的第6泳道和第7泳道以及图18的第4泳道和第5泳道含有得自胎儿#5442A脾、大小与所述阳性对照条带相似的RT-PCR产物，表明在该胎儿中存在重排的轻链RNA转录物。得自胎儿#5442B的脾样品产生在该照片中肉眼不可见的非常弱的大小合适的条带。这种RT-PCR产物表明，胎儿#5442B也在其脾中表达重排的轻链免疫球蛋白转录物。正如所预期的，得自胎儿#5442A和5442B脑的样品不表达人重排λ轻链转录物。
人λ基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达
在ΔΔHAC胎儿#5868A中也检测到重排人λ轻链基因座的RNA转录物。关于这一分析，使用对扩增包括人λ的部分的转录物特异性的引物，来检测编码重排人λ基因座部分的转录物的ΔΔHAC编码的表达。该分析使用引物VL1 LEAI(5′-cccccaagcttRccKgStYYcctctcctc-3′；SEQ ID NO：38)以及引物CL1(5′-gggaattcgggtagaagtcactgatcag-3′；；SEQ ID NO：39)、CL2-3(5′-gggaattcgggtagaagtcacttatgag-3′；SEQ ID NO：40)和CL7(5′-gggaattcgggtagaagtcacttacgag-3′；SEQ ID NO：41)的等摩尔混合物。对于该RT-PCR反应，将反应混合物于95℃孵育5分钟，然后通过于95℃孵育1分钟、60℃孵育1分钟和72℃孵育2分钟进行多个变性、退火和扩增循环。然后将混合物于72℃孵育10分钟。
该分析证明，得自ΔΔHAC#5868A的脾cDNA(图19的第4泳道)产生一种大小与TC小鼠脾cDNA(第6泳道)阳性对照相同的RT-PCR产物。使用得自ΔΔHAC#5868A脑或肝cDNA(分别为第2泳道和第3泳道)，检测不到这样的RT-PCR产物。用引物“GAPDH up”和“GAPDHdown”成功地扩增管家基因GAPDH(第8泳道和第10泳道)，表明这些组织中的每种组织支持RT-PCR的能力。
通过测序证实ΔΔHAC重排
使用引物Cμl、Cλ2-3和Cλ7的等摩尔混合物和引物Vλ1LEA1，或者使用引物Vλ3LEA1、Vλ3JLEAD和VλBACK4的等摩尔混合物和引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩尔混合物，对胎儿#5442A脾样品进行RT-PCR分析。所述PCR产物用CHROMA SPIN柱(CLONETECH)纯化，并且按照生产商的方案，克隆到pCR2.1 TA克隆载体(Invitrogen)中。使用Cλ1、Cκ2-3和Cλ7引物的等摩尔混合物进行Dye Terminator sequence反应(ABI Applied System)。于96℃1分钟、96℃10秒、55℃5秒和60℃4分钟，进行25个循环。10μl反应混合物含有BigDye Terminator反应混合物(3μl)、模板质粒(200ng)以及Cλ1、Cλ2-3和Cλ7引物(1.6pmol)。用ABI 3700测序仪分析反应混合物。
鉴定出至少两种重排人λ轻链转录物(V1-17/JL3/Cλ和V2-13/JL2/Cλ)。这些结果证明人λ轻链基因在胎儿#5442A脾的ΔΔHAC中发生VJ重排(图20和21)。
人λ轻链和牛重链在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中表达的FACS 分析
分析得自ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B的脾淋巴细胞中人λ轻链和牛重链蛋白的表达。让这些细胞与藻红蛋白标记的抗人Δ抗体(图22C和22D)、FITC标记的抗牛IgM抗体(图22D和22H)或无抗体(图22A、22B、22E和22F)于4℃反应20分钟。然后细胞用PBS加上2％FCS洗涤2次，然后在FASCalibur细胞分类器上分析。用无抗体对照来电子设定门控(electronically sethegates)，计算与所述抗体反应的细胞的百分率。这些百分率显示在每条频率曲线的下方。胎儿#5442A(图22A-22D)和胎儿#5442B(图22E-22H)既表达人λ轻链蛋白，又表达牛重链蛋白。
在HAC牛崽中表达人抗体蛋白
如上文所述，开发了新程序，用于产生转染色体(Tc)牛崽(图37)。该方法克服了由于原代牛成纤维细胞的有限生命周期(仅仅约35群体加倍)和对要导入并且维持在供体细胞中的大DNA插入片段的要求导致的限制。具体地，将人类人工染色体(HAC)载体用于将完整的未重排人Ig重(IgH)链和λ轻链(Igλ)基因座导入牛原代成纤维细胞。使选定的成纤维细胞克隆重新恢复活力，并且通过产生克隆的胎儿而扩增。选择克隆的胎儿细胞，并且重新克隆以产生4个健康的Tc牛崽，它们功能性重排重链和轻链人Ig基因座并且产生人多克隆抗体。这些结果证明了采用HAC载体生产转基因家畜的可行性。更重要的是，可以采用含有人Ig基因的Tc家畜生产人多克隆疗法，其应用从防止抗生素抗性感染至抵抗生物恐怖主义。该方法在下文更详细描述。
采用此处描述的MMCT技术将HAC导入来自于CHO克隆的牛胎儿成纤维细胞。将成纤维细胞至于用G418(700μg/ml)在HAC载体上选择neo基因的条件下，直到开始出现集落。在该步骤避免完全的抗生素选择和基于DNA的筛选，以便在核转移之前使细胞分裂最少。根据生长和形态学挑选集落，并且按照前面所述进行核转移(Lucieretal.，J.Immunol 161：5438-5444，1998)。由于细胞仅仅可以在几天内用于核转移，在恢复活力后进行最后的选择，并且通过产生克隆的胎儿扩增细胞。
17-21％发育至胚泡期，第40日的妊娠率为22-50％，在细胞系之间没有差异。在56-58天，回收了4个ΔHAC和2个ΔΔHAC胎儿并且再生了成纤维细胞系并且冷冻保存进行进一步分析和核转移。通过G418抗性(图38A)和IgH和Igλ基因座的基因组PCR(图38B)评估了来源于在56-58收集的胎儿和7个额外的在77-119天收集的胎儿的成纤维细胞系中HAC的保留。13个胎儿中的9个抗G418，其中的8个表现出存在人IgH和Igλ基因座。将3个ΔHAC(#5968，#6032和#6045)和1个ΔΔHAC(#5580)阳性的56-58天胎儿用于后代的重新克隆和产生。通过RT-PCR分析以及随后通过扩增产物的测序评估5个阳性的77-119天胎儿中人Ig基因座的表达和重排。在所有胎儿中表达了人IgH和Igλ基因(图38C)，并且表现出正确V(D)J重组的证据(图38D)。
重新克隆的ΔHAC细胞系从37个受体产生了1个雄性(来自细胞系#6045)和5个雌性(来自细胞系#5968和#6032)牛崽(16％，图39A)。两个来源于细胞系#6032的牛崽在出生后48小时内死亡。从非再生的ΔΔHAC细胞出生了一个牛崽。所有5个存活的牛崽是健康的并且是表型正常的。在所有牛崽中通过G418选择、基因组PCR和荧光原位杂交(FISH)分析证明了HAC的保留(图39B和39C)。FISH分析的结果表明，HAC作为独立的染色体保留，并且保留HAC的细胞比例是78-100％。在外周血淋巴细胞(PBLs，91％)和成纤维细胞(87％)之间的保留率没有观察到显著差异。但是，供体细胞系#6045可以具有比供体细胞系#5968更高的保留率(分别是97％和86％)。有趣的是，Tc牛中的保留率可以比我们以前在小鼠中观察到的保留率高。为了确定人Ig基因座是否重排以及是否在牛崽和胎儿中表达，我们在PBLs上进行了RT-PCR。我们在PBLs中观察了人IgH和Igλ基因的表达，并且通过序列分析确定了人IgH和Igλ所有组成成分的多样性(表3)。一系列代表性的序列表现出在基因座上分布的VH/Vλ，DH和JH/Jλ区段的广泛利用。在Igλ转录物中，观察到了VH1和VH3的V区段的频繁利用，这与VH区段在人类中的使用相似。在IgH和Igλ转录物中都观察到了非种系核苷酸的添加(N添加)以及核苷酸缺失。这在重链和轻链的第三互补决定区(CDR3s)中都产生了高度多样化。此外，通过固相ELISA测定，在7个牛崽中的5个牛崽哺初乳前采集的血样中检测到了13-258ng/ml水平的人Ig蛋白(在新生牛崽中Ig表达通常非常低，甚至检测不到)。这些数据表明，采用重新克隆策略可以在原代细胞中有效完成HAC转移，并且由HAC携带的人Ig基因可以正确加工并且在Tc牛崽中以高度多样性表达。
该研究的结果证明，可以采用染色体克隆、染色体转移和体细胞重新克隆技术的组合生产保留了携带Mb大小的基因组转基因的HAC载体的健康牛崽。此外，采用这些技术证明了牛崽中整个基因座对人I gH和Igλ基因的保留。有趣的是，证明了这两个基因座都进行了正确的加工，并且在与人或小鼠具有显著不同的免疫生理的物种中表达了功能性重排的人免疫球蛋白基因。该HAC系统可以用于表达多种复杂人蛋白(如血红蛋白)或用于制药应用的蛋白的大的集合。例如，在该研究中生产的Tc牛崽，保留了人IgH和Igλ基因座，它们可以用于生产人多克隆抗体。人类多克隆抗体目前仅仅可以从人血液或血浆供体获得。因此，存在人类多克隆产品的供应和应用上的限制。可以对Tc母牛进行超免疫以产生用于治疗多种人类疾病的大量新的多克隆疗法。
表3.克隆的Tc牛崽中人免疫球蛋白重链和λ链转录物的所有组成成分分析
通过RT-PCR扩增人μ和λ特异性mRNA，克隆并且测序。示出了10个独立的μ和λ克隆的每一个中的V(D)J连接的核苷酸序列，分为VH/Vλ，DH，JH/Jλ和N区段，通过与公开的种系序列的同源性进行鉴定(Ig-BLAST)。
                                                          人μ核苷酸序列
  VH   N   DH   N   JH
  6-1TACTGTGCA——   0   D5-24AGAGATG   3AGA   JH3-ATGCTTTTGATGTC
  3-33ATTACTGTGCGA——   8 AGAACAAA   D6-13ATAGCAGCAGCTGGTAC   3GAT   JH4——CTTTGACTACT
  3-15ACTGTACCACAGA   4TCTG   D6-19ATAGCAGTGGCTGGTAC   4TGGG   JH1——TACTTCCAGCA
  3-66TACTGTGCGAG——   2TC   D2-2GTAGTACCAGCTGCTAT   0   JH3GATGCTTTTGATGTCT
  3-21TTACTGTGCGAG——   6TTTTGG   D2-21GTGGTGGT   8CACATTTA   JH4——GACTACTGGGG
  4-39ACTGTGCGAGACA   8 TGAAAAAC   D3-10TTCGGGGAGTTAT   3AAT   JH4——CTACTGGGGCC
  1-69TTACTGTGCGAG——   7 GGGGATG   D6-13GCAGCAGCTGGTAC   1C   JH4——GACTACTGGGGC
  1-8ACTGTGCGAGAG-   0   D2-2ATTGTAGTAGTACCAGCTGC   12CAAGATCGTAAG   JH2——TGGTACTTCGAT
  1-18TTACTGTGC——   0   D5-24GAGATGG   15GTTTTTGATCCCCAG   JH4——TTTGACTACTGG
  3-20TCACTGTGCGAGAA   4TTTT   D7-27ACTGGGGA   1T   JH3GATGCTTTTGATGTCT
                              人λ核苷酸序列
             Vλ    N                 Jλ
 1-17 AGCCTGAGTGGTC-- 2  (TT) Jλ3  --------TTCGGCGGAGGG
 2-13 CAGTGGTAACCATCT 0 Jλ2  ---GGTATTCGGCGGAGG
 1-19 CAGCCTGAGTGCTG- 0 Jλ1  -----TCTTCGGAACTGGG
 5-2  AGCAACTTCGTGTA- 2  (TA) Jλ3  ------GTTCGGCGGAGAG
 1-7  GGTAGTAGCACTT-- 1  (C) J3    ---------TCGGCGGAGGGA
 2-13 CAGTGGTAACCAT-- 0 Jλ1  -TATGTCTTCGGAACTG
 2-1  GACAGCAGCACT--- 0 Jλ1  -TATGTCTTCGGAACTG
 1-2  GGCAGCAACAATTTC 1  (G) Jλ1  --ATGTCTTCGGAACTG
 1-4  AGCAGCAGCACTC-- 2  (GT) Jλ3  -------TTCGGCGGAGG
 1-4  AGCAGCAGCACTC--- 0 Jλ1  ----------GGAACTGGGA
在HAC牛崽中产生的人抗体的表征
采用固相ELISA测定法检验按上述方法产生的HAC转基因牛崽对人抗体的产生(图41-44)。在检验的42个牛崽中，所有42个牛崽都具有高于背景的抗体效价。表4中所示的最高的人Ig水平是10000ng/ml。由于Ig水平是波动的，在发育的其它日或更晚检测到的Ig水平可以产生高得多的值。7个牛崽具有至少2000ng/ml的水平。这些结果证明，可以从HAC转染色体牛崽的血清纯化完全的人抗体(图42)。此外，μ和λ重链的存在证明HAC在转染色体有蹄动物(如牛)的人重链基因座经历了类转换。HAC编码的人轻链(λ)结合于人μ链和人链(图43)。该结果证明，HAC转染色体动物的异种B细胞能够组装人类重链和轻链。
佐剂刺激的HAC转染色体牛的免疫产生了对免疫抗原的多克隆抗原特异性反应(图41)。抗体对免疫抗原的不同表位的反应证明了HAC转染色体动物能够识别复合抗原的多个表位。从HAC转染色体牛纯化的人Ig中发现了人μ，γ和轻链，其中诱导了抗原特异性人抗体(图44)。
        表4.HAC转基因动物中的人Ig水平
  编号    动物鉴定号   以ng/ml表示的人Ig水平
    1     100     10000
    2     104     4000
    3     1098     4000
    4     1075     3000
    5     1163     3000
    6     82     2556
    7     1076     2000
    8     68     497
    9     1098     403
    10     1064     258
    11     1093     253
    12     1065     210
    13     71     160
    14     80     141
    15     1075     134
    16     1076     100
    17     73     98
    18     72     93
    19     1066     70
    20     67     69
    21     50     55
    22     86     48
    23     1094     33
    24     77     30
    25     89     30
    26     88     30
    27     1077     29
    28     74     25
    29     1098     25
    30     1079     24
    31     91     22
    32     1081     21
    33     76     20
    34     66     17
    35     90     17
    36     1076     16
    37     1088     15
    38     87     15
    39     95     15
    40     1092     13
    41     1068     13
    42     1090     12
表4含有对由HAC动物产生的人Ig水平的测量值(ng/ml)。测量应用固相ELISA测定进行，其中应用高特异性多克隆牛抗人抗体作为捕捉试剂，而应用与生物素偶联的多克隆牛抗人抗体作为探测试剂。
实施例2：传统的牛核移植胚胎中核重新编程缺陷的证据
传统的核移植技术通常产生低百分率的活产。如下文所述，该低效率至少部分可能归因于重构的卵母细胞不能对供体细胞或供体核进行重新编程，以促进卵母细胞发育所需基因的转录和抑制发育不需要的基因的转录。下面的实施例描述了改进的克隆方法，所述方法可用于产生表达本发明方法中的异种抗体的转基因有蹄动物。
在牛植入前发育中核被膜、核基质和染色质-基质界面成分的分布
为了确定植入前胚胎中核被膜(B-型和A/C-型核纤层蛋白)、核基质(NuMA)和染色质-基质界面(AKAP95)成分的分布，通过体外受精(IVF)产生牛胚胎并通过免疫荧光分析进行确定。如以前所述进行牛体外受精(Collas等人，Mol.Reprod.Devel.34：212-223，1993)。简言之，将来自单个公牛的冰冻融化的牛精子铺层在45-90％Percoll梯度顶部，并于700xg离心30分钟。确定沉淀中的精子浓度，将精子稀释，从而受精时的终浓度为106个精子/ml。在成熟后22个小时，将卵母细胞在TL HEPES中洗涤3次，并置于480μl受精培养基中。对50个卵母细胞添加20μl的106个精子/ml的精子悬浮液。将胚胎置于4-孔组织培养板中的培养物中，所属培养物在用0.3ml胚胎检验的矿物油覆盖的0.5ml胚胎培养基(Sigma)中含有单层小鼠成纤维细胞。将25～50个胚胎置于每个孔中，并于38.5℃在5％的CO2空气气氛中孵育。受精率为大于90％，如由原核发育所确定的。
对于这些体外受精牛胚胎的免疫荧光分析，从法国巴黎CNRS的Jean-Claude Courvalin博士获得了抗人核纤层蛋白B的抗体。抗-核纤层蛋白A/C的单克隆抗体购自Santa-Cruz Biotechnology，且抗-NuMA抗体从Transduction Laboratories获得。抗-大鼠AKAP95亲和纯化的兔多克隆抗体从Upstate Biotechnologies获得。将体外受精的牛胚胎置于聚-L-赖氨酸覆盖的玻璃盖玻片上，用3％低聚甲醛固定15分钟，并用0.1％Triton-X透化处理15分钟(Collas等人，J.Cell Biol.135：1715-1725，1996)。将蛋白用PBS中的2％BSA/0.01％Tween 20(PBST)封闭15分钟。将一级抗体(抗-AKAP95、抗-核纤层蛋白B、抗-LBR、抗-NuMA和抗-核纤层蛋白A/C)和二级抗体各孵育30分钟，并以1∶100在PBST-BSA中稀释后应用。DNA用0.1μg/ml掺入抗衰减封固剂中的Hoechst 33342复染。将样品封固在载玻片和盖玻片上，用指甲油封闭。用Olympus BX60落射荧光显微镜(epifluorescence microscope)进行免疫荧光观察，并用JVC CCD照相机和AnalySIS软件获取照片。应用AnalySIS定量程序进行荧光信号的相对定量。数据表示为平均相对荧光强度。
牛胚胎的免疫荧光分析显示在核周边探测到B-型核纤层蛋白(图29A)。然而，在原核或8-细胞期探测不到核纤层蛋白A/C。预期在这些早期细胞阶段不能探测到核纤层蛋白A/C是分化细胞的一个标记(Guilli等人，EMBO J.6：3795-3799，1987)。在检查的所有阶段均探测到核基质结构蛋白NuMA(图29A)。然而，牛原核期胚胎中，NuMA标记局限于雌性原核(FPN)，即两个原核中最小的(图29A箭标)。最近在早期小鼠胚胎中表征(Bomar等人，2002已提交)并用亲和纯化的抗-大鼠AKAP95抗体探测的AKAP95也局限于雌性原核(图29A)。然而，在随后发育阶段中在所有卵裂球的核中均观察到AKAP95的核内分布(图29A)。
免疫荧光标记的特异性通过牛原代胎儿成纤维细胞的蛋白印迹分析和体外受精胚胎的原核期进行证实(图29B)。为进行该分析，将蛋白于每凝胶40mA通过10％ SDS-PAGE进行分离。将蛋白于100V在转移缓冲液(25mM TrisHCl，pH 8.3，192mM甘氨酸，20％甲醇和0.1％ SDS)中电泳转移1小时到硝酸纤维素膜上。将膜用Tris-缓冲的盐水(TBS，即，140mM NaCl，2.7mM KCl，和25mM Tris-HCl，pH8.0)洗涤10分钟，用含有5％牛奶的TBST(具有0.05％Tween-20的TBS)封闭1小时，并与如下一级抗体孵育1.5小时：抗-AKAP95(1∶250稀释)，抗-核纤层蛋白B(1∶1000稀释)，抗-LBR(1∶500稀释)，抗-NuMA(1∶500稀释)和抗-核纤层蛋白A/C(1∶500稀释)。将印迹在TBST中洗涤2次，达10分钟，并与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二级抗体孵育1小时。将印迹在TBS中洗涤10分钟，并用增强的化学发光(ECL，Amersham)来显影。
所有蛋白均在其预期的表现Mr探测到：68kDa(B-型核纤层蛋白)、70和60kDa(分别为核纤层蛋白A和C)、约180kDa(NuMA)和95kDa(AKAP95)。总之，这些结果显示植入前牛胚胎表达可以用交叉反应抗体探测的核结构蛋白。引人注意的是，在牛植入前胚胎中免疫学探测不到核纤层蛋白A/C。因为核纤层蛋白A/C在体细胞中表达(图29B)，所以它们潜在地构成核移植胚胎中核重新编程的分子标记。
核移植牛胚胎中核被膜、NuMA和AKAP95的动力学在牛中传统的核移植程序中检查了核被膜和核基质结构的动力学。这些结构分别应用抗核纤层蛋白A/C和B、NuMA和AKAP95的抗体进行研究。为了确定这些标记在核改变中的动力学，应用原代胎儿成纤维细胞作为供体细胞生产了牛核移植胚胎，所属成纤维细胞如以前所述进行分离(Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。简言之，通过用PBS中的0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA(胰蛋白酶-EDTA)进行胰蛋白酶消化而从牛胎儿中收获细胞。将细胞接种于T75培养瓶(Corning)中的α-MEM(Gibco)中，其中补充了10％胎牛血清(FBS；Hyclone)、0.15g/ml谷氨酰胺(Sigma)、0.003％β-巯基乙醇(Gibco)和一种抗生素-抗真菌剂(Gibco)。在接种后第3日，用胰蛋白酶-EDTA收获细胞并在α-MEM/DMSO中冷冻。如以前所述分离G1细胞(Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。简言之，在分离前24小时，将5.0×105细胞铺平板于含有10mlMEM/FBS的T75烧瓶中。后1日，用PBS洗涤平板，将培养基放回原处1-2小时，并在Vortex上中速摇动平板30-60秒。取出培养基，于500xg离心5分钟，并将沉淀重悬于250μl MEM/FBS中。应用微量移液管选择通过细胞质桥连接的细胞对，并将其用于核转移。
如以前所述进行牛核转移(Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。在成熟后18-20小时将体外成熟的卵母细胞去核。在将G1供体细胞转移到卵周隙之后，应用20微秒的2.4kV/cm单电脉冲使其融合(Electrocell Manipulator 200，Genetronics)。成熟后28-30小时(即，在将卵母细胞从卵巢获取收集后置于成熟培养基之后28-30小时，且与供体细胞融合后至少2小时)，用钙离子载体(5μM)活化重构的卵母细胞和孤雌生殖对照4分钟(CalBiochem)，随后用ACM培养基(100mM NaCl，3mM KCl，0.27mM CaCl2，25mM NaHCO3，1mM乳酸钠，0.4mM丙酮酸，1mM L-谷氨酰胺，3mg/mlBSA，1％BME氨基酸和1％MEM非必需氨基酸)中的10μg环己酰亚胺和2.5μg松胞菌素D(Sigma)活化5小时(Liu等人，Mol.Reprod.Dev.49：298-307，1998)。活化后，将核移植胚胎或卵母细胞卵洗涤5次，并于38.5℃在5％ CO2气氛中与小鼠胎儿成纤维细胞共培养。
重构的胚胎用标准方法活化，且在融合后3小时，将处于染色质超前浓缩(PCC)阶段的胚胎用低聚甲醛固定，并通过应用抗核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白B、NuMA和AKAP95的抗体的免疫荧光进行分析(图30，PCC)。此外，对能够发展到原核(PN)阶段的核移植胚胎组(即，融合后15小时的牛胚胎)进行类似的分析(图30，核移植-PN)。作为对照，也检查原核期的如此处所述进行活化的孤雌生殖卵母细胞(图30，孤雌生殖PN)。
如所预期的，供体体细胞(牛胎儿成纤维细胞，图30)以文献中预期的分布表达所有标记。在染色质超前浓缩阶段，不同的浓缩染色体物质由应用Hoechst 33342进行的DNA染色证实。在浓缩的染色体上或靠近浓缩的染色体未探测到核纤层蛋白A/C和B(图30，PCC)，可能是由于它们在卵细胞质中的扩散。探测到了一些标记的NuMA；该NuMA可能与维持浓缩的染色体的纺锤极结合。相反，AKAP95与浓缩的(PCC)染色体结合。该结果使人联想到在有丝分裂的人细胞中AKAP95的标记(Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999；Steen等人，J.Ce11 Biol.150：1251-1262，2000)。在原核期，探测到了所有标记。核纤层蛋白A/C存在于原核被膜上(图2，核移植-PN)。这与它们不存在于对照单性原核(图30)的被膜和受精的原核被膜(图29A)上形成对照。与在对照原核中相同，在核移植原核中探测到了核纤层蛋白B。同样，NuMA和AKAP95点缀在除核仁之外的核内部。在核移植原核中的NuMA标记始终比在对照孤雌生殖的原核中的亮(比较核移植PN和孤雌生殖PN，图30)。总之，这些观察显示核移植胚胎的原核类似体细胞核标记核纤层蛋白A和C，并显示强的NuMA染色。
AKAP95在孤雌生殖胚胎和核移植胚胎的原核中的差异固着  A-激酶固着蛋白AKAP95是参与有丝分裂染色体浓缩的核蛋白。为了用作核移植后影响体细胞核重新编程的另一个分子标记，在从胎儿成纤维细胞中形成的牛核移植原核期胚胎中表征了AKAP95的核内固着性质。也检查了AKAP95在来自孤雌生殖胚胎原核和供体体细胞核中的固着。
通过如下方法原位检查了AKAP95在原核胚胎中的核内固着，即于室温用0.1％Triton X-100、1mg/ml DNAse I和100或300mM NaCl提取胚胎30分钟。如上文所指出的，雄性原核不结合任何AKAP95。相反，在牛中，在核移植胚胎和供体核中有显著量的AKAP95和DNA对DNAse I和300mM NaCl有抗性(图31)。在单性或核移植原核中，B-型核纤层蛋白不能由DNAse I和300mM NaCl提取(图31)，提示AKAP95和DNA分布的改变不是由核结构中的总体改变引起的。这些数据显示，在牛中，与在体细胞核中相同，AKAP95在核移植原核上的固着比在孤雌生殖原核上的固着更紧密。该结合是对DNA组织产生限制还是由核移植胚胎中改变的基因组组织引起仍需进行确定。由于DNAse I-抗性的DNA在转录上是沉默的，所以核移植后AKAP95固着的不完全重构可能消弱发育中重要基因的表达。
核移植牛胚胎中核纤层蛋白A/C转录水平的错误调节  惊人的发现是核纤层蛋白A/C在牛核移植胚胎周边重新组装，而该体细胞特异性标记不存在于体外受精的和孤雌生殖的原核中。因而，我们研究了核纤层蛋白A/C的重新组装是否由以下过程引起(i)在染色质超前浓缩阶段分解的体细胞核纤层蛋白的重新导向(图30)，(ii)来自母本核纤层蛋白A/C mRNA库的核纤层蛋白的翻译和组装，或(iii)核移植原核中体细胞核纤层蛋白A(LMNA)基因的从头转录。
为区别这些可能，通过此处所述的“传统”核移植方法，即核移植后用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)活化重构的胚胎，或者通过核移植后在RNA聚合酶II(PolII)抑制剂放线菌素D(ActD)存在下活化以抑制从头转录来产生牛核移植胚胎。为了在环己酰亚胺中培养牛核移植胚胎，如上文所述在核转移后活化卵母细胞，只除了将卵母细胞在环己酰亚胺(CHX)中孵育14小时。活化后14小时，将卵母细胞洗涤5次，并在含有15μg/ml Hoechst 33342(Sigma)的ACM培养基中放置1小时。孵育后，通过落射荧光显微镜观察原核发育。然后将原核胚胎固定在PBS中的3％低聚甲醛中，洗涤并封固在载玻片上。为了在松胞菌素D中培养牛核移植胚胎，如上文所述在核转移后活化卵母细胞，只除了将5μg/ml松胞菌素D添加于环己酰亚胺孵育步骤中。5小时后，将卵母细胞洗涤5次，并置于含有5μg/ml松胞菌素D的ACM培养基中。活化后14小时，将卵母细胞洗涤5次，并在含有15μg/ml Hoechst 33342(Sigma)的ACM培养基中放置1小时。孵育后，通过落射荧光显微镜观察原核发育。然后将原核期胚胎固定在PBS中的3％低聚甲醛中，洗涤并封固在载玻片上。
核移植原核周围的核纤层蛋白B组装未受到蛋白或RNA合成抑制的影响。该结果显示核纤层蛋白B从以前分解的体细胞库和/或从卵母细胞细胞质中大的核纤层蛋白B库中重新组装。在核移植原核中探测到的核纤层蛋白A/C(图30)不存在于用环己酰亚胺活化后重新形成的核中。该结果显示核纤层蛋白A/C组装需要从头的蛋白合成，且这些核纤层蛋白不是从通过供体核注射或细胞融合带入到卵母细胞中的分解的体细胞库中重新导向的。此外，当在放线菌素D存在下活化胚胎时，核纤层蛋白A/C不重新组装。该结果显示核移植原核中的核纤层蛋白A/C重新组装是由重构的原核中LMNA基因的从头转录引起的。在核移植原核中探测到的NuMA在用环己酰亚胺活化的核移植胚胎的原核中不重新组装，但在放线菌素D-处理的核移植胚胎中可以探测到少许。该发现强有力地提示核移植原核中NuMA的重新组装需要至少部分在母本NuMA mRNA库中发生的从头翻译。关于放线菌素D-处理的核移植胚胎中抗-NuMA标记比对照未处理的核移植胚胎中的标记弱的一致观察(比较图32中的b’和b)提示，核移植原核中部分的NuMA组装是由原核期中NuMA基因的从头转录引起的。
总之，这些结果显示在核移植后的核重构中LMNA基因未关闭。类似地，NuMA基因在原核核移植胚胎中显然保持活性。可能在染色质超前浓缩过程中这些基因发生了短暂的失活，如从染色质的高度浓缩状态所预期的(图30)。这些结果清楚地阐明了在此处所述条件下产生的核移植胚胎中不完全的核重新编程。如前文对AKAP95所描述的，我们提出核移植原核中核纤层蛋白A/C的持续影响基因表达，如发育中重要基因的表达。以前报道的核纤层蛋白A和C与染色质蛋白和DNA的相互作用，以及这些核纤层蛋白与转录因子的结合也支持该假设。
实施例3：传统的牛核移植胚胎中示例性的核重新编程缺陷
在下文中也描述了天然存在的胚胎和传统核转移胚胎之间的示例性差异。这些差异包括分化的细胞特异性A-型核纤层蛋白在原核中装中的差异，增高的原核NuMA和TATA结合蛋白浓度，以及核基质-染色质界面成分AKAP95和DNA对用去污剂、DNAse和盐提取增加的敏感性。
对于这些研究，如以前所述建立牛胎儿成纤维细胞系(Kasinathan等人，Nat.Biotechnol.19：1176-1178，2001和Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。应用以前描述的抖落法从培养物中分离G1期成纤维细胞对(Kasinathan等人，Nat.Biotechnol.19：1176-1178，2001)。如以前所述进行与体外成熟的卵母细胞的体外受精(Collas等人，Mol.Reprod.Dev.34：224-231，1993)。对于核移植(NT)和卵母细胞活化，如以前所报道的在成熟后约20小时(hpm)进行应用G1期供体细胞的核移植(Kasinathan等人，Nat.Biotechnol.19：1176-1178，2001和Kas inathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。重构的胚胎在28-30 hpm(T＝0)用5μM钙离子载体活化4分钟，然后用10μg/ml CHX和2.5μg/ml松胞菌素D活化5小时。将胚胎洗涤并与小鼠胎儿成纤维细胞共培养(Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。当重构的胚胎在CHX中培养时，如上文所述活化卵母细胞，并用2.5μg/mlCHX再培养9小时(总共在CHX中14小时)。根据描述将胚胎充分洗涤和培养(Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。当重构的胚胎暴露于ActD时，如上文所述活化卵母细胞，只除了在5小时的CHX孵育步骤中添加5μg/ml ActD。
对于免疫学分析，将细胞、卵母细胞、胚胎、核和染色质置于聚-L-赖氨酸覆盖的盖玻片上，用3％低聚甲醛固定15分钟，并用0.1％Triton X-100透化处理15分钟。将蛋白用PBS/2％ BSA/0.01％Tween 20封闭。将一级和二级抗体(1∶100稀释)各孵育30分钟。具体而言，应用抗人核纤层蛋白B肽的兔多克隆抗体(Chaudhary等人，J.Cell Biol.122：295-306，1993)。也应用购自Santa-CruzBiotechnology的山羊抗核纤层蛋白B多克隆抗体、抗核纤层蛋白A/C单克隆抗体和抗-TBP抗体。抗-NuMA单克隆抗体购自TransductionLaboratories，而抗大鼠AKAP95亲和纯化多克隆抗体购自UpstateBiotechnologies。DNA用0.1μg/ml Hoechst 33342复染。用JVC CCD照相机拍摄照片，并应用AnalySIS软件进行免疫荧光强度的定量。数据表示为在至少3次重复中相对于对照的平均数±SD荧光强度。对于原位提取，在进行免疫荧光分析之前，将置于盖玻片上的胚胎和细胞与Tris-HCl中的0.1％Triton X-100、1mg/ml DNAse I和300mM NaCl(pH7.2)孵育15分钟。对于免疫印迹，将100个胚胎溶解于20μlSDS样品缓冲液中，用10％SDS-PAGE分离蛋白，并用如下抗体进行分析：抗核纤层蛋白B，1∶1,000；抗核纤层蛋白A/C，1∶250；抗-NuMA，1∶500；抗-AKAP95，1∶250。
基于上述免疫学分析，在通常用作NT的牛成纤维细胞中表征了A/C-和B-型核纤层蛋白、NuMA和AKAP95的分布。在体外产生的牛植入前胚胎中，早在原核(PN)阶段就在核周边探测到了核纤层蛋白B。不存在核纤层蛋白A/C，如从分化细胞的标记所预期的。NuMA和AKAP95在原核期限制于雌性原核，但在随后阶段中点缀于所有核中。免疫荧光数据的特异性在免疫印迹上证实。
在形态学核重构过程中检查了核纤层蛋白A/C和B、NuMA和AKAP95的动力学，所述形态学重构与通过电融合将牛成纤维细胞移植入去核卵母细胞相关(Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。供体核在融合的3小时内进行染色质超前浓缩(PCC)。核的核纤层蛋白和NuMA在卵母细胞细胞质中重新分布，并不存在于PCC染色体中。AKAP95与PCC染色体结合，是提示有丝分裂细胞的一个性质。开始对受体卵母细胞进行活化处理后14小时，NT胚胎显示发育的原核。然而，与孤雌生殖的或受精的胚胎的原核相比，基本上所有NT原核均表达强的核纤层蛋白A/C和NuMA免疫反应性，这是供体体细胞的两个特征。
在均与原核形成相容的10μg/ml蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)或5μg/ml RNA聚合酶(Pol)II抑制剂放线菌素D(ActD)存在时的受体卵母细胞活化抑制原核核纤层蛋白A/C的组装。该结果显示这些体细胞核纤层蛋白的组装是由体细胞核纤层蛋白A(LMNA)基因转录引起的。核纤层蛋白B的组装未受到CHX或ActD的干扰，显示它是从分解的体细胞库和/或从母本B-型核纤层蛋白库重新导向的。在CHX暴露后基本上探测不到NuMA；然而，在ActD处理后在NT原核中探测到了40％的NuMA免疫反应性。该结果提示NuMA组装是由母本mRNA翻译和从头转录引起的。由于核纤层蛋白A/C和NuMA在NT原核中异常转录，所以这些蛋白可用作标记，以确定核转移方法对供体遗传材料进行重新编程的能力。
如上文所讨论的，AKAP95的核内固着性质也可用作对供体遗传材料进行重新编程的标记，该AKAP95是核基质-染色质界面的结构多价蛋白(Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1179，1999)且富集于低乙酰化的染色质中。AKAP95是研究的唯一一个在供体体细胞核中PCC染色体上且在NT原核中可探测到的具有与单性体(parthenote)和PN胚胎相似标记强度的标记。通过抑制蛋白或RNA合成来维持AKAP95与NT原核的结合。因而，NT胚胎中主要部分的PN AKAP95具有体细胞来源。固着的AKAP95通过用0.1％Triton X-100、1mg/mlDNAse I和300mM NaCl提取NT胚胎、单性体和供体成纤维细胞而检查。在单性体中，提取了约90％AKAP95和DNA；然而，NT原核中35％的AKAP95不能提取。AKAP95和DNA对DNAse I的NaCl的敏感性与成纤维细胞核类似。在这些条件下未提取到核纤层蛋白B，显示AKAP95和DNA可提取性中的差异不是由核结构的总体改变引起的。这些结果提示NT原核的特征在于AKAP95的紧密固着和DNA与DNAse I的有限制的接近。因而，由体细胞NT产生的原核由于供体核不完全的形态学重构和/或体细胞基因转录的错误调节而显示结构上的异常。
实施例4：传统的牛核移植胚胎中额外的示例性核重新编程缺陷
如上文所述，将核移植(NT)胚胎中的表达模式与体外产生的(IVP)植入前胚胎中的表达模式进行比较。为了进行该比较，如以前所描述的进行了体外受精，并培养胚胎(Collas等人，Mol.Reprod.Dev.34：224-231，1993和Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。NT通过将供体牛成纤维细胞与去核的卵母细胞融合而实施(Kasinathan等人，Nat.Biotechnol.19：1176-1178，2001和Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。在成熟后28-30小时(hpm)用5μM钙离子载体活化4分钟，然后用10μg/ml CHX和2.5μg/ml松胞菌素D活化5小时，并进行洗涤。将胚胎与小鼠胎儿成纤维细胞共培养(Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。对于CHX处理，如上文所述活化卵母细胞，并在培养前用2.5μg/ml CHX再培养9小时。对于ActD处理，如上文所述活化卵母细胞，只除了向5小时的CHX孵育步骤中添加5μg/mlActD，并在培养前在5μg/ml ActD中再维持9小时。将NT胚胎在体外培养到胚泡期，且每个受体雌性转移2个胚胎。妊娠通过超声波扫描术监控，并进行C-截面。牛崽由兽医在出生的24小时内记录。
对于NT和IVP胚胎中蛋白水平的分析，应用购自Santa-CruzBiotechnology的抗核纤层蛋白B多克隆抗体、抗核纤层蛋白A/C单克隆抗体和抗-TBP多克隆或单克隆抗体。抗-AKAP95抗体购自UpstateBiotechnologies。如以前所述进行免疫荧光分析(Bomar等人，J.Cell Sci.115：2931-2940，2002)。简言之，将细胞和胚胎置于聚-L-赖氨酸覆盖的盖玻片上，用3％低聚甲醛固定15分钟，用0.1％Triton-X透化处理15分钟，并将蛋白用PBS/2％BSA/0.01％Tween 20封闭。将样品与一级抗体和二级抗体各孵育30分钟。DNA用0.1μg/mlHoechst 33342复染。用JVC CCD照相机拍摄照片，并应用AnalySIS软件进行免疫荧光强度的定量。当需要时，在免疫荧光分析之前，将样品在盖玻片上用Tris-HCl中的1％ Triton X-100、1mg/ml DNAseI和300mM NaCl(pH 7.2)混合物提取15分钟。对于免疫印迹，将蛋白样品(30μg)通过10％SDS-PAGE分离，印迹在硝酸纤维素上，并用显示的抗体进行探测。
核移植胚胎中供体核的动力学  为了研究在牛核移植(NT)过程中体细胞核的动力学，检查了核被膜的2个结构成分的分布，即遍在表达的B-型核纤层蛋白(成为核纤层蛋白B)和分化的细胞特异性A-型核纤层蛋白(Gruenbaum等人，J.Struct.Biol.129：313-323，2000)。核的核纤层蛋白将核膜固着于染色质，并提示其可促进体外(原)核重构后核的扩展。也已显示核纤层蛋白对于细胞存活是必需的，这是因为B-型核纤层蛋白组装的失败导致细胞死亡。作为转录机的标记，分析了实际上所有基因的TATA-结合蛋白TBP(即一种转录因子)的动力学。牛胎儿成纤维细胞和体外产生的(IVP)植入前胚胎中核纤层蛋白B的原核分布和TBP与DNA的共定位与在其他物种中的观察一致(Holy等人，Dev.Biol.168：464-478，1995；Houliston等人，Development 102：271-278，1988；和Worrad等人，Development 120：2347-2357，1994)。在植入前发育过程中没有探测到核纤层蛋白A/C，如从分化细胞的标记所预期的。免疫荧光标记的特异性在免疫印迹上进行证实。
在成纤维细胞核移植到去核的卵母细胞中之后，核纤层蛋白A/C和B均从超前浓缩的染色体中分离，而TBP仍然与染色体结合。开始活化受体卵母细胞后14小时，所有NT胚胎含有完全发育的具有原核核纤层蛋白B标记的原核，且TBP与DNA共定位。然而，与IVP胚胎相反，95-99％的NT胚胎早在原核期就显示核纤层蛋白A/C表达，且表达在早期发育中持续(见下文)。NT和IVP胚胎原核中免疫标记的核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C和TBP的相对量通过测量二级抗体荧光强度与说明检查的核中DNA含量(单倍体对二倍体)的DNA的荧光强度(Hoechst 33342)的比例来定量。虽然NT和IVP胚胎原核中核纤层蛋白B的相对量相似，但NT原核中核纤层蛋白A/C和TBP的相对量高于IVP胚胎中雄性(MPN)或雌性(FPN)原核中的相对量。
NT胚胎原核中的TBP、DNA和A-型核纤层蛋白NT原核中较高量的TBP以对用去污剂(1％Triton X-100)、核酸酶(1mg/ml DNAseI)和盐(0.3M NaCl)组合的原位提取的更大抗性结合。提取的胚胎中相对于未提取的对照中免疫荧光标记强度的定量显示在IVP胚胎的雄性(MPN)或雌性(FPN)原核中约35％的TBP未被提取。然而，NT原核的TBP与成纤维细胞核中的一样显示对提取的强抗性。类似地，NT原核的DNA与IVP胚胎原核相比，在对这些条件下的提取的抗性中显示4.5倍的增加，提示更紧密的染色质组织。
为了确定NT胚胎原核中核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C和TBP的来源，如此处所描述的，将受体卵母细胞在存在RNA聚合酶(Pol)II抑制剂松胞菌素D(ActD；5μg/ml)时或用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX；10μg/ml)活化(Knott等人，Biol.Reprod.66：1095-1103，2002)。通过免疫荧光标记的原核胚胎的光密度分析检查核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白B和TBP的组装。两种抑制剂均阻止原核核纤层蛋白A/C组装，提示这些体细胞核纤层蛋白在NT胚胎中的组装是由原核期核纤层蛋白A基因的转录引起的。核纤层蛋白B的组装未受到CHX或ActD处理的干扰，提示核纤层蛋白B是从NT后溶解于卵母细胞细胞质中的体细胞核纤层蛋白和/或从母本核纤层蛋白库组装的。在未处理的胚胎中或在RNA或蛋白合成抑制后探测到了相似量的TBP。由于TBP与PCC过程中浓缩的染色体结合，且由于中期II卵母细胞细胞质不存在可探测的TBP，所以体细胞来源的TBP可能仍然与NT过程中的供体基因组结合。因而，除表达A-型核纤层蛋白之外，NT胚胎的原核显示较高量的TBP和增强的核内TBP固着。
实施例5：应用重新编程的供体染色质克隆哺乳动物
为了克服上文中证实的在传统核转移胚胎中不完全重新编程的问题，开发了新方法，以更有效地在核转移前对供体染色质进行重新编程(PCT/US01/50406，2001年12月21日提交)。这些方法涉及在重新编程培养基(如细胞提取物)中孵育来自供体细胞的核(如编码异种抗体的核)，这导致核被膜溶解和可能的染色质浓缩。该核被膜分解与染色质浓缩使得转录调节蛋白释放，所述转录调节蛋白结合在染色体上且可促进卵母细胞、胚胎或胎儿发育不需要的基因的转录。此外，来自重新编程培养基的调节蛋白可结合染色质并促进发育所需基因的转录。
为了生成表达异种抗体的有蹄动物，可以在重新编程之前、其间或之后通过插入一种或多种编码异种抗体的核酸来修饰供体核或染色质。如果需要，可将来自克隆的胎儿或克隆的后代的细胞用于第二轮核转移，以生成额外的克隆后代。来自起始克隆胎儿或克隆后代的细胞也可冷冻以形成细胞系，以用作生成额外的克隆有蹄动物的供体细胞来源。
用于克隆中的供体核的大量制备  可以从培养物中同步化或非同步化的细胞群体中分离多达几百万个核。细胞群体可以天然地或化学地进行同步化。优选地，群体中至少40、60、80、90或100％的细胞停滞在G0期或G1期。为了实现该目的，将细胞在例如低血清中(例如5％、2％或0％血清)孵育1、2、3或更多日以增加G0期中细胞的百分数。为了将细胞同步化在G1期，如以前所述，可以使细胞作为贴壁细胞生长到汇合，然后在0.5-1μg/ml洛可达唑(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)中孵育17-20小时(参见如Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999及其中引用的参考文献)。通过用一只手重复轻敲培养瓶而有力地摇动含有贴壁细胞的培养瓶，导致有丝分裂细胞和G1期细胞对的脱附。G1期细胞对是在分裂过程结束时伸长的仍然通过细桥连接的细胞对。可基于该特征性的细胞对结构从培养基中分离脱附的G1期细胞对。G1期细胞对仍然贴壁或者在分离后可分为2个独立的细胞。
应用标准方法在磷酸缓冲盐水(PBS)中收获同步化或非同步化的细胞，并进行几个洗涤步骤以将细胞从其起始培养基中转移到低渗缓冲液中(10mM HEPES，pH 7.5，2mM MgCl2，25mM KCl，1mM DTT，10μM抑酶肽，10μM亮抑蛋白酶肽，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM大豆胰蛋白酶抑制剂和100μM PMSF)。例如，可将细胞用50ml PBS洗涤，并通过于4℃在500xg离心10分钟而沉淀。轻轻倒出PBS上清液，将沉淀的细胞重悬于50ml PBS中，并如上文所述进行离心。该离心后，将沉淀的细胞重悬于20-50倍体积的冰冷低渗缓冲液中，并于4℃在500xg离心10分钟。再次弃去上清液，并向细胞沉淀添加约20倍体积的低渗缓冲液。小心地将细胞重悬于该缓冲液中，并在冰上孵育至少1小时，导致细胞的逐渐膨胀。
为了从细胞分离核，应用标准方法将细胞裂解。例如，将2-5ml细胞悬浮液转移到玻璃匀浆器中，并应用紧密配合的研杵的起始10-20次敲击进行Dounce匀浆。可选择地，应用电动混合器(如Ultraturrax)对细胞悬浮液进行匀浆。如果需要，可应用相差显微镜在40-倍放大倍数监控细胞裂解。在该匀浆过程中，核应该保持完整，且大多数，优选所有最初附着的细胞质成分如小泡、细胞器和蛋白应该从核中释放。如果需要，可将1-20μg/ml细胞骨架抑制剂，松胞菌素B或松胞菌素D添加到前述低渗缓冲液中以促进该过程。匀浆持续所需的时间长度，以裂解细胞和从核中释放细胞质成分。对于一些细胞类型，可能需要多达100、150或更多次敲击。然后将裂解物转移到冰上的15ml锥形管中，并用剩余的膨胀细胞悬浮液重复细胞裂解过程。将来自在低渗缓冲液中制备的2M贮存液的蔗糖添加到细胞裂解物中(如将1/8体积的2M贮存液添加到裂解物中)，导致蔗糖终浓度为250mM。通过颠倒混合该溶液，并通过用甩平式转头于4℃在400xg离心10-40分钟而进行沉淀。然后弃去上清液，并将沉淀的核重悬于10-20倍体积的核缓冲液中(10mM HEPES，pH7.5，2mM MgCl2，250mM蔗糖，25mM KCl，1mM DTT，10μM抑酶肽，10μM亮抑蛋白酶肽，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM大豆胰蛋白酶抑制剂和100μMPMSF)。如上文所述，将核沉淀并重悬于1-2倍体积的核缓冲液中。新鲜分离的核可如下文所述立即用于体外重新编程和核转移，或者可以贮存以备以后应用。对于贮存，将核在核缓冲液中稀释到约106/ml的浓度。添加甘油(2.4倍体积的100％甘油)，并通过轻轻吹吸来充分混合。将悬浮液在冰上于1.5-ml管中等分为100-500μl体积，立即在甲醇-干冰浴中冷冻，并贮存于-80℃。在应用前，将核等分试样在冰上或在室温融化。添加1倍体积冰冷的核缓冲液，并将溶液用甩平式转头于1,400xg离心15分钟。将沉淀的核在100-500μl核缓冲液中重悬，并如上文所述进行离心。然后将沉淀的核重悬于最小体积的核缓冲液中，并在应用前于冰上贮存。
用于对供体材料进行重新编程的有丝分裂提取物或培养基的制备
为了制备有丝分裂提取物，通过在0.5-1μg/ml洛可达唑中孵育17-20小时而将体细胞细胞系(如成纤维细胞)同步化在有丝分裂中(如Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999及其中引用的参考文献)，并通过有力地摇动使有丝分裂细胞脱附，如上文所述。脱附的G1期细胞对可以弃去，或者可使其保持在有丝分裂细胞中，构成脱附细胞中的大部分(一般至少80％)。将收获的脱附细胞在10ml锥形管中于4℃在500xg离心10分钟。汇集几次的细胞沉淀，重悬于总体积为50ml的冷PBS中，并于4℃在500xg离心10分钟。重复该PBS洗涤步骤。将细胞沉淀重悬于约20倍体积的冰冷细胞裂解缓冲液中(20mM HEPES，pH 8.2，5mM MgCl2，10mM EDTA，1mM DTT，10μM抑酶肽，10μM亮抑蛋白酶肽，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM大豆胰蛋白酶抑制剂，100μM PMSF和任选20μg/ml松胞菌素B)，并通过于4℃在800xg离心10分钟而沉淀细胞。弃去上清液，小心将细胞沉淀重悬于不超过1倍体积的细胞裂解缓冲液中。将该细胞在冰上孵育1小时，以使得细胞膨胀。通过应用尖超声波仪器的超声处理或应用玻璃研钵和研杵的Dounce匀浆来裂解细胞。将细胞裂解进行到裂解了至少90％的细胞和核，这可应用相差显微镜进行估计。裂解至少90％的细胞和核所需的超声处理时间可依赖于用于制备提取物的细胞类型而变化。
将细胞裂解物置于1.5-ml离心管中，并应用台式离心机于4℃在15,000xg离心15分钟。从离心机中取出离心管并立即置于冰上。用200μl的移液管顶端小心收集上清液，汇集来自几个管的上清液并将其置于冰上。该上清液是“有丝分裂细胞质的”或“MS15”提取物。可在冰上将该细胞提取物等分为每管50μl或10μl体积，这取决于将应用生成染色质的正常方法还是微量法。将提取物立即在液氮中瞬间冻结并在应用前贮存于-80℃。可选择地，可将细胞提取物置于冰上的超速离心管中(如适合于SW55 Ti转子；Beckman)。如果需要，可用矿物油在顶部覆盖该管。将提取物于4℃在200,000xg离心3小时，以沉淀包含于MS15提取物中的膜小泡。在离心结束时，弃去油。小心收集上清液，如果需要则汇集，并置于冰上冷的1.5ml管中。该上清液称为“MS200”或“有丝分裂胞质溶胶”提取物。如对MS15提取物所描述的，将该提取物等分试样并冷冻。
如果需要，可以使提取物富含额外的核因子。例如，可从产生重新编程提取物的细胞类型中的细胞或从任何其他细胞类型中的细胞纯化核，并通过上述超声处理进行裂解。核因子通过在搅动中于含有浓度为0.15-800mM的NaCl或KCl的核缓冲液中孵育10-60分钟来提取。将裂解物离心以沉淀未提取的成分。将含有目标提取因子的上清液进行透析，以去除NaCl或KCl。将透析的核提取物等分试样并冷冻贮存。在添加核以进行重新编程之前，将该核提取物以各种浓度添加到上述全细胞提取物中。
有丝分裂提取物也可从生殖细胞制备，如卵母细胞或雄性生殖细胞。例如，可以如上文所述将天然停滞在该期的中期II卵母细胞收获、洗涤并裂解，以生成卵母细胞提取物。为了制备雄性生殖细胞提取物，通过切碎器官和通过在蔗糖和percoll梯度上离心收获的细胞而从获自屠宰场的睾丸分离生殖细胞。将生殖细胞与体细胞(莱迪希氏细胞和支持细胞)分离，用悬浮液洗涤，并在PBS中沉淀。然后如上文所述将细胞在冰冷的细胞裂解缓冲液中洗涤1次，并通过超声处理进行裂解。通过于4℃在15,000xg离心15分钟使裂解物澄清，并将上清液(即生殖细胞提取物)等分试样和在液氮中速冻。
作为细胞提取物的备选方案，也可通过向溶液如缓冲液中添加一种或多种天然存在的或重组因子(如，核酸或蛋白，如DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、活化剂、阻抑物、染色质重构蛋白、生长因子、白细胞介素、细胞因子或其他激素)而形成重新编程培养基。优选地，一种或多种因子对于卵母细胞或干细胞是特异性的。
通过将核暴露于有丝分裂提取物或培养基而形成浓缩的染色质在冰上融化等分试样的MS15或MS200提取物或有丝分裂培养基。将生成ATP的系统(0.6μl)添加到20μl提取物或培养基中，并通过旋涡混合。对于生成ATP的系统的制备，将等比例的100mM ATP贮存液，1M磷酸肌酸和2.5mg/ml在H2O中制备的肌酸激酶贮存液(100x)混合，并在应用前贮存于冰上。在向提取物中添加生成ATP的系统后，终浓度为1mM ATP，10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌酸激酶。
将核悬浮液以每10μl提取物或培养基1μl核的浓度添加到提取物或培养基中，通过吹吸充分混合，并于30、33、35、37或39℃水浴中孵育。定期轻轻敲打含有混合物的管，以防止染色体在管底成块。定期(如每15分钟)用显微镜监控核被膜分解和染色体浓缩。当核被膜已分解且染色体开始浓缩时，开始从提取物或培养基中回收染色质的程序。
通过将核暴露于有丝分裂提取物或培养基和抗-NuMA抗体而形成 浓缩的染色质  可选择地，通过在预先加载具有抗核基质蛋白NuMA的抗体的分离的核之后进行上述程序，可以形成未浓缩的或仅仅部分浓缩的染色质(Steen等人，J.Cell Biol.149，531-536，2000)。该程序使得可以通过溶解供体核周围的核膜而从染色质中去除核成分；然而，可通过添加抗-NuMA抗体抑制浓缩步骤。防止核浓缩可在将染色体于有丝分裂提取物中孵育时降低染色体断裂或损失的危险。
对于该程序，于室温将纯化的细胞核(2,000个核/μl)在500μl含有0.75μg/ml溶血卵磷脂的核缓冲液中透化处理15分钟。通过添加在核缓冲液中制备的3％BSA并在冰上孵育5分钟而使多余的溶血卵磷脂猝灭。然后将核沉淀，并在核缓冲液中洗涤1次。将核于2,000个核/μl重悬于100μl含有抗-NuMA抗体的核缓冲液中(1∶40稀释；Transduction Laboratories)。在轻轻搅动中于冰上孵育1小时后，将核经过1M蔗糖于500xg沉淀20分钟。然后将核重悬于核缓冲液中，并添加到含有生成ATP的系统的提取物或培养基中，如前面部分所描述的。任选地，可将抗-NuMA抗体添加到提取物或培养基中以进一步防止染色体浓缩。
通过将核暴露于去污剂和/或盐溶液或A蛋白激酶溶液而形成浓缩 的染色质 也可以通过暴露于去污剂或蛋白激酶而形成不浓缩或仅仅部分浓缩的染色质。去污剂可用于使与核内染色体未结合或松散结合的核成分增溶，从而导致核被膜的去除。对于该方法，将纯化的细胞核(2,000-10,000个核/μl)在补充了去污剂如0.5％Triton X-100或NP-40的核缓冲液中孵育。为了促进核被膜的去除，可将额外的盐，如NaCl以约0.1、0.15、0.25、0.5、0.75或1M的浓度添加到缓冲液中。在轻轻摇动中于冰上孵育30-60分钟后，通过使用甩平式转头于1,000xg取决于总体积离心10-30分钟而使核沉淀。将沉淀的核重悬于0.5-1ml核缓冲液中，并如上文所述进行沉淀。重复该洗涤步骤2次，以确保去污剂和额外的盐的完全去除。
可选择地，核被膜可通过单独或组合应用重组或天然存在的蛋白激酶来去除。优选地，蛋白激酶通过标准方法纯化，或以纯化形式购自商业来源。这些激酶可以使核膜、核基质或染色质的成分磷酸化，从而导致核被膜的去除(参见如，Collas和Courvalin，Trends CellBiol.10：5-8，2000)。优选的激酶包括依赖细胞周期蛋白的激酶1(CDK1)、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、MAP激酶、依赖于钙-钙调蛋白(CamKII)和CK1酪蛋白激酶或CK2酪蛋白激酶。对于该方法，在室温将约20,000个纯化的核在1.5ml离心管中的20μl磷酸化缓冲液中孵育。CDK1的优选磷酸化缓冲液(UpstateBiotechnology)含有200mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.2-7.6)、10mM MgSO4、80mM β-磷酸甘油、5mM EGTA100μM ATP和1mM DTT。对于PKC，优选的缓冲液含有200mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.2-7.6)、10mM MgSO4、100μM CaCl2、40μg/ml磷脂酰丝氨酸、20μM二酰甘油、100μM ATP和1mM DTT。如果同时应用PKC和CDK1，则应用补充了40μg/ml磷脂酰丝氨酸和20μM二酰甘油的CDK1磷酸化缓冲液。PKA的优选磷酸化缓冲液包括200mM NaCl、10mM MgSO4、10mM Tris，pH 7.0、1mM EDTA和100μM ATP。对于MAP激酶，可应用补充了10mM CaCl2和1mM DTT的PKA磷酸化缓冲液。对于CamKII应用补充了1mM DTT的PK S磷酸化缓冲液或购自UpstateBiotechnology的Cam激酶测定试剂盒(Venema等人，J.Biol.Chem272：28187-90，1997)。
磷酸化反应通过添加蛋白激酶至最终的量为25-100ng来起始。将反应物于室温孵育高达1小时。在该过程中可通过显微镜监控核被膜分解，如以15分钟的时间间隔。核被膜分解后，如上文所述将核洗涤3次，以去除去污剂溶液。
从培养基、提取物、去污剂和/或盐溶液或蛋白激酶溶液中回收染 色质  将含有浓缩的、部分浓缩的或未浓缩的染色质的提取物或溶液置于在核缓冲液中制备的等体积1 M蔗糖溶液中。通过使用甩平式转头于4℃在1,000xg取决于样品体积离心10-30分钟而使染色质沉淀。去除上清液，通过吹吸将沉淀的染色质小心重悬于0.1-1.0ml核缓冲液或脂融合(lipofusion)缓冲液中(150mM NaCl、10μM抑酶肽，10μM亮抑蛋白酶肽，10μM胃蛋白酶抑制剂和在20mM约为pH 7.0或pH 7.5的HEPES中或20mM约为pH 6.2的MES中的100μMPMSF)，并于1,000xg离心10-30分钟。去除上清液，将沉淀的核重悬于核缓冲液或脂融合缓冲液中并在应用前贮存于冰上。将各种染色质转移到显微操作皿中油下面的20μl HEPES缓冲的培养基小滴中。如下文所述将一种染色质插入到每一个去核的卵母细胞中。
制备染色质的微量法 将如上文所述的10-20μl MS15或MS200提取物或含有生成ATP的系统的有丝分裂培养基、去污剂和/或盐溶液或蛋白激酶溶液小滴置于培养皿中。然后添加50-μl分离的培养基中的G1期细胞对或G0期细胞小滴，单独的50μl用于促进细胞裂解的HEPES-或碳酸氢盐缓冲的含0.1％ Triton X-100或NP-40的培养基“裂解”小滴，和50-μl卵母细胞注射培养基小滴。这些小滴的每一种均用CO2平衡的矿物油覆盖。也将50μl培养基的“洗涤小滴”添加到培养皿中，以用于洗涤裂解的细胞或核。
应用微量移液管将细胞转移到裂解小滴中。通过轻轻的重复吸气使细胞膜在移液管中裂解。当细胞裂解时，将裂解物轻轻排出到洗涤小滴中，立即再次抽吸核以去除去污剂。任选地，在加入到有丝分裂提取物或培养基中之前，可用抗-NuMA抗体对核进行透化处理和孵育。然后，将核排出到MS15、MS200或培养基、去污剂和/或盐溶液或蛋白激酶溶液小滴中。如上文所述监控核分解和染色体浓缩。一旦核被膜分解，且如果应用不含抗-NuMA抗体的有丝分裂提取物，染色体开始浓缩，那么用微量移液管分离单一的完整染色质并转移到去核的受体卵母细胞中，如下文所述。
卵母细胞的去核 优选地，受体卵母细胞是中期II卵母细胞。在该期时，卵母细胞可被活化或已经被充分活化，以如对受精精子一样处理引入的染色质。对于卵母细胞的去核，将卵母细胞中部分或优选全部DNA去除或失活。受体卵母细胞中DNA的这种破坏或去除阻止了卵母细胞的遗传材料对克隆的哺乳动物的生长和发育起作用。破坏卵母细胞原核的一种方法是暴露于紫外线中(Gurdon，in Methods inCell Biology，Xenopus Laevis：-Practical Uses in cell andMolecular Biology，Kay和Peng编著，Academic Press，California，第36卷：第299-309页，1991)。可选择地，可应用任何标准技术手术去除卵母细胞原核(参见如McGrath和Solter，Science220：1300-1319，1983)。在一个可能的方法中，将针伸入卵母细胞中，并将核吸入到针的内隙中。然后将针从卵母细胞中取出，而不使质膜破裂(美国专利号4,994,384和5,057,420)。
用于将染色质插入卵母细胞中的脂融合 可通过如下文所述的脂融合或通过标准的显微注射或电融合技术将染色质引入到受体卵母细胞中(参见如美国专利号4,994,384和5,945,577)。下面的脂融合方法也可用于其他将染色体插入其他受体细胞中的应用中。
如上文所述，通过离心，然后用脂融合缓冲液洗涤，而从有丝分裂提取物、去污剂和/或盐溶液或蛋白激酶溶液中分离染色质。在应用前可将染色质贮存于冰冷的脂融合缓冲液中。可选择地，可将染色质等分试样，在液氮或在甲醇-干冰浴中冷冻，并贮存于-80℃。脂融合溶液通过将一种或多种致融合试剂与脂融合缓冲液以大约5∶1-1∶10的各个比例混合而制备。致融合试剂由以下成分组成，但不限于这些成分：聚乙二醇(PEG)和亲脂化合物，如Lipofectin、Lipofectamin、DOTAP{N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲铵硫酸二甲酯；C43H83NO8S}、DOSPA{2，3-二油基氧基-N-[2(精胺酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵}和DOPE(二油基氧基磷脂酰乙醇胺)。
其他优选的脂类包括中性和单价或多价阳离子脂类，如那些含有季铵基团的脂类。额外优选的脂类具有胆固醇部分，如通过胆固醇的羟基与脂类中的基团反应形成的胆固醇部分。另外优选的脂类具有饱和或不饱和的脂肪酸，所述脂肪酸优选含有5-10、10-15、15-20或20-30个碳原子，包括端值。这些脂类可应用标准化学合成技术合成，从天然存在的来源获得，或购自商业来源(Summers等人，Biophys J.71(6)：3199-206，1996；Nabekura等人，Pharm Res.13(7)：1069-72，1996；Walter等人，Biophys J.66(2 Pt 1)：366-376，1994；Yang等人，Biosci Rep.13(3)：143-157，1993；Walter和Siegel，Biochemistry.6：32(13)：3271-3281，1993)。其他优选的致融合化合物是磷脂，如来自海胆卵或任何其他来源的膜小泡组分(Collas和Poccia，J.of Cell Science 109，1275：1283，1996)。优选地，使染色体与膜小泡组分接触不形成由完整膜被囊化的染色体。
例如，可以以脂融合缓冲液中约0.1-30μg/ml的浓度应用阳离子脂类，如DOTAP。可选择地，可以应用由阳离子脂类和中性脂类如DOPE的混合物组成的脂质体制剂。
将新鲜制备的或冰冻融化的染色质与脂融合溶液混合，以使得化合物包被染色质。孵育于20-30℃的温度进行大约10-30分钟。将脂融合溶液中含有染色质的微滴置于CO2平衡的矿物油中。也制备含有去核受体卵母细胞的小滴。将用脂融合试剂包被的染色质挑取在微量移液管中，并插入到卵母细胞胞质和透明带之间的卵周隙中。将染色质置于靠近卵母细胞膜之处，以确保与卵母细胞接触。染色质-卵母细胞复合物维持于20-30℃的温度，并在显微镜下监控融合。一旦发生融合，则如下文所述活化重构的卵母细胞。
重构的卵母细胞的活化、培养和移植 为了防止极体挤出和染色体丧失，可在松胞菌素B存在下活化卵母细胞，或在活化后立即加入松胞菌素B(Wakayama等人，PNAS 96：14984-14989，1999；Wakayama等人，Nature Genetics 24：108-109，2000)。可将电的和非电的方法用于活化重构的卵母细胞。用于活化细胞的电的技术是本领域中众所周知的(参见如美国专利号4,994,384和5,057,420)。用于活化细胞的非电的方法可包括本领域中公知的任何增加细胞分裂概率的方法。用于活化卵母细胞的非电的方法包括在乙醇；肌醇三磷酸；Ca++离子载体和蛋白激酶抑制剂；蛋白合成抑制剂；佛波酯；毒胡萝卜素或任何精子成分存在下孵育卵母细胞。用于活化的其他非电的方法包括使卵母细胞经受冷激或机械压力。可选择地，在核转移后1-3小时，可将卵母细胞在含有用于活化卵母细胞的Sr2+和用于防止胞质分裂和极体挤出的松胞菌素B的培养基中孵育大约6小时(Wakayama等人，PNAS 96：14984-14989，1999；Wakayama等人，Nature Genetics24：108-109，2000)。依赖于克隆的哺乳动物类型，活化的优选长度可有变化。例如，在家养动物，如家养牲畜中，卵母细胞活化时间通常为16-52小时，或优选为约28-42小时。
活化后，将卵母细胞在培养基中放置适当长的时间，以使得所得的胚胎发育。在二细胞期或较晚期，将胚胎转移到代孕受体雌性中，以发育到分娩期。对于牛物种，在转移到母本宿主之前，一般将胚胎培养到胚泡期(如约6-8日)。对于其他克隆的动物，适当的体外培养时间长度是本领域技术人员公知的，或可通过常规试验确定。
用于将胚胎植入哺乳动物子宫的方法也是本领域中公知的。优选地，胚胎的发育阶段与宿主有蹄动物的动情周期相关。一旦将胚胎置于哺乳动物的子宫中，胚胎即可能发育到分娩期。可选择地，使胚胎在子宫中发育，直到一个选定的时间，然后应用标准外科手术方法取出胚胎(或胎儿)以确定其健康和生存力。来自一个物种的胚胎可以置于来自另一个物种的动物子宫环境中。例如，牛胚胎可以在绵羊的输卵管中发育(Stice和Keefer，Biology of Reproduction 48：715-719，1993)。在本发明的方法中可以应用胚胎和物种之间的任何交叉物种关系。
核与卵母细胞或其他受体细胞的脂融合  脂融合溶液通过将一种或多种致融合试剂以约5∶1-1∶10的各个比例与脂融合缓冲液混合而制备，如上文所描述的。将如上文所述新鲜制备的或冰冻融化的核与脂融合溶液混合，以使得化合物包被核。孵育于20-30℃的温度进行大约10-30分钟。将脂融合溶液中含有核的微滴置于CO2平衡的矿物油中。也制备含有受体细胞，优选为去核细胞的小滴。去核的受体细胞通过显微操作物理地去除染色体或核，或者通过暴露于紫外线破坏遗传材料来制备，如上文所述的。为了插入卵母细胞，将用脂融合试剂包被的核挑取在微量移液管中，并插入到卵母细胞胞质和透明带之间的卵周隙中。为了插入其他受体细胞中，优选将包被的核置于靠近细胞膜之处，以确保与细胞接触。核-细胞复合物维持于20-30℃的温度，并在显微镜下监控融合。一旦发生融合，则如下文所述活化重构的卵母细胞。
实施例6：应用重新编程的透化处理细胞克隆哺乳动物
也可以在无需从细胞中分离核或染色质的情况下对细胞进行重新编程。在该方法中，将细胞进行透化处理，然后在使得在培养基(如细胞提取物)和细胞之间交换因子的条件下，在分裂间期或有丝分裂重新编程培养基中进行孵育。如果应用分裂间期培养基，则细胞中的核仍然是膜结合的；如果应用有丝分裂培养基，则可发生核被膜分解和染色质浓缩。通过在该培养基中孵育而对核进行重新编程后，优选将质膜再次封闭，从而形成含有来自培养基的所需因子的完整重新编程细胞。如果需要，培养基可富含如此处所述的额外核因子。然后使重新编程的细胞与受体卵母细胞融合，并将从重构的卵母细胞形成的胚胎插入到母本受体哺乳动物中，以生成克隆的哺乳动物。为了产生表达异种抗体的有蹄动物，可以在插入编码异种抗体的核酸之前、其间或之后对供体细胞进行修饰。如果需要，来自起始克隆胎儿或克隆后代的细胞也可冷冻以形成细胞系，以用作生成额外的克隆有蹄动物的供体细胞来源。
细胞的透化处理  可应用本方法进行重新编程的细胞包括非同步化细胞和同步化在G0、G1、S、G2或M期或这些期的组合的细胞。细胞应用任何标准方法进行透化处理，如应用毛地黄皂苷或链球菌溶血素O进行的透化处理。简言之，应用标准方法收获细胞并用PBS进行洗涤。对于毛地黄皂苷透化处理，将细胞重悬于含有浓度为约0.001-0.1％的毛地黄皂苷的培养基中并在冰上孵育10分钟。对于应用链球菌溶血素O进行的透化处理，于室温将细胞在链球菌溶血素O溶液(参见如，Maghazachi等人，FASEB J.11：765-74，1997及其中引用的参考文献)中孵育约15、30或60分钟。在每一孵育之后，将细胞通过于400xg离心10进行洗涤。通过在PBS中重悬和沉淀而重复洗涤步骤2次。将细胞在应用前于室温保存于PBS中。优选地，如下文所述，可将透化处理的细胞立即添加到分裂间期或有丝分裂培养基中进行重新编程。
重新编程培养基的制备  为了制备分裂间期重新编程提取物，应用标准方法收获分裂间期培养的细胞，并通过于4℃在10ml锥形管中于500xg离心10分钟而进行洗涤。去除上清液，并将细胞沉淀重悬于总体积50ml的冷PBS中。将细胞于4℃在500xg离心10分钟。重复该洗涤步骤，并将细胞重悬于约20倍体积的冰冷分裂间期细胞裂解缓冲液中(20mM HEPES，pH 8.2、5mM MgCl2、1mM DTT、10μM抑酶肽，10μM亮抑蛋白酶肽，10μM胃蛋白酶抑制剂A，10μM大豆胰蛋白酶抑制剂、100μM PMSF和任选20μg/ml松胞菌素B)。通过于4℃在800xg离心10分钟沉淀细胞。去除上清液，并将细胞沉淀小心重悬于不超过一倍体积的分裂间期细胞裂解缓冲液中。使细胞在冰上孵育1小时，以使得细胞膨胀。通过应用尖超声波仪器的超声处理或应用玻璃研钵和研杵的Dounce匀浆来裂解细胞。将细胞裂解进行到裂解了至少90％的细胞和核，这可应用相差显微镜进行估计。裂解至少90％的细胞和核所需的超声处理时间可依赖于用于制备提取物的细胞类型而变化。
将细胞裂解物置于1.5-ml离心管中，并应用台式离心机于4℃在15,000xg离心15分钟。从离心机中取出离心管并立即置于冰上。用200μl的移液管顶端小心收集上清液，汇集来自几个管的上清液并将其置于冰上。该上清液是“分裂间期细胞质的”或“IS15”提取物。可在冰上将该细胞提取物等分为每管20μl体积，立即在液氮中瞬间冻结并在应用前贮存于-80℃。可选择地，可将细胞提取物置于冰上的超速离心管中(如适合于SW55 Ti转子；Beckman)。如果需要，可用矿物油在顶部覆盖该管。将提取物于4℃在200,000xg离心3小时，以沉淀包含于IS15提取物中的膜小泡。在离心结束时，弃去油。小心收集上清液，如果需要则汇集，并置于冰上冷的1.5ml管中。该上清液称为“IS200”或“分裂间期胞质”提取物。如对IS15提取物所描述的，将该提取物等分试样并冷冻。
如果需要，可以使提取物富含额外的核因子。例如，可从产生重新编程提取物的细胞类型中的细胞或从任何其他细胞类型中的细胞纯化核，并通过上述超声处理进行裂解。核因子通过在搅动中于含有浓度为0.15-800mM的NaCl或KCl的核缓冲液中孵育10-60分钟来提取。将裂解物离心以沉淀未提取的成分。将含有目标提取因子的上清液进行透析，以去除NaCl或KCl。将透析的核提取物等分试样并冷冻贮存。在添加细胞以进重新编程之前，将该核提取物以各种浓度添加到上述全细胞提取物中。
分裂间期提取物也可从生殖细胞制备，如卵母细胞或雄性生殖细胞。例如，可以如上文所述活化卵母细胞并培养5小时以使其进入分裂间期。然后如此处对中期II卵母细胞所描述的，对卵母细胞进行处理，只除了从裂解缓冲液中省去EDTA。雄性生殖细胞提取物如此处所述进行制备。
作为细胞提取物的备选方案，也可通过向溶液如缓冲液中添加一种或多种天然存在的或重组因子(如，核酸或蛋白，如DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、活化剂、阻抑物、染色质重构蛋白、生长因子、白细胞介素、细胞因子或其他激素)而形成重新编程培养基。优选地，一种或多种因子对于卵母细胞或干细胞是特异性的。
培养基中细胞的重新编程  将透化处理的细胞以100-1,000个细胞/μl的浓度重悬于上述分裂间期重新编程培养基或一种此处所述的有丝分裂重新编程培养基中。如上文所述将生成ATP的系统添加到提取物中，使反应于30-37℃孵育高达2小时，以促进因子从提取物移位到细胞，并活化因子的核摄取或染色体结合。将重新编程的细胞于800xg离心，通过重悬进行洗涤，并在PBS中于400xg进行离心。如果需要，将细胞重悬于含有20-30％胎牛血清(FCS)、含有2mM CaCl2(从H2O中的1M贮存液添加)的RPMI1640或含有2mM CaCl2的α-MEM培养基中，并在普通的细胞培养箱中于37℃孵育1-3小时，以使细胞膜重新封闭。然后将细胞在普通的温暖培养基(10％ FCS)中洗涤，并应用标准培养条件进一步培养。可选择地，重新编程的透化处理细胞可用于向卵母细胞进行基因转移，而不需重新封闭细胞膜。
在盖玻片而不是溶液中对透化处理细胞进行重新编程的可选方法
可选择地，细胞可以在置于盖玻片上时进行透化处理，以使得对细胞的处理最小化，并除去对细胞的离心，从而使细胞的生存力最大化。在12-孔平板中使细胞(如成纤维细胞)在RPMI1640中的16-mm聚-L-赖氨酸覆盖的盖玻片上生长到50,000-100,000个细胞/盖玻片。将细胞在普通气氛中于37℃在无Ca2+的Hank氏平衡盐溶液(Gibco-BRL)中的200ng/ml链球菌溶血素O透化处理50分钟。如果需要，可基于碘化丙锭摄取来测量在这些条件下透化处理的细胞百分数。吸出链球菌溶血素O；用80-100μl重新编程培养基覆盖盖玻片；并将细胞在CO2气氛中于37℃孵育30分钟-1小时。重新编程的培养基优选含有生成ATP的系统和各自1mM的ATP、CTP、GTP和UTP。为了最适地重新封闭质膜，将含有2mM CaCl2的α-MEM培养基、含有20-30％胎牛血清的培养基或含有2mM CaCl2的RPMI1640添加到孔中，并将细胞于37℃孵育2小时。可选择地，质膜不进行重新封闭。
各种链球菌溶血素O处理对透化处理和重新封闭的细胞的作用为了估计透化处理和重新封闭的细胞的百分数，进行了链球菌溶血素O孵育的剂量和时间滴定(表5)。细胞的透化处理通过在链球菌溶血素O处理结束时0.1μg/ml的DNA染色剂碘化丙锭的摄取来估计。重新封闭类似地在分开的细胞组中重新封闭处理结束时进行估计。
        表5.链球菌溶血素O(SLO)处理的牛成纤维细胞的
                    透化处理和重新封闭
           透化处理                      重新封闭
ng/ml SLO    N    透化的+/-标准差    N  ％重新封闭的+/-标准差
    0        563      1+/-2.8       560        89.9+/-4.9
    100      404      48.6+/-4.2    810        86.1+/-8.3
    200      548      79.2+/-1.4    478        84.9+/-1.5
    500      495      88.7+/-1.6    526        87.6+/-0.5
    1000     425      84.9+/-0.7    544        86.4+/-1.4
    2000     315      96.6+/-2.2    425        10.7+/-1
    4000     200      99+/-1.4      200        11.2+/-5.3
用链球菌溶血素O进行透化处理并暴露于有丝分裂提取物的牛成 纤维细胞生存力的估计  进行了TUNEL分析以估计用0或500ng/ml链球菌溶血素O透化处理并重新封闭的细胞中的细胞凋亡，或估计用链球菌溶血素O透化处理，在有丝分裂提取物中暴露30或60分钟，然后重新封闭的细胞中的细胞凋亡。TUNEL-阳性细胞是进行细胞凋亡(即，细胞死亡)的细胞。数据显示链球菌溶血素O自身不诱导细胞凋亡(表6)。基于TUNEL分析，将链球菌溶血素O处理的细胞在有丝分裂提取物中暴露60分钟而不是30分钟可诱导细胞凋亡率中10％的增加(表6)。基于这些数据，供体细胞在提取物中30分钟的孵育比60分钟的孵育更优选。通过细胞的免疫荧光分析显示30分钟的孵育可诱导大多数检查的核中核被膜的分解(约90％，n＞100)。
此外，在提取物中孵育并在用于染色质转移方法的此处所述缓冲液N或TL-HEPES和蔗糖中洗涤的纯化核不进行细胞凋亡(分别为2/34和3/47 TUNEL阳性)。
         表6.链球菌溶血素O和链球菌溶血素O+提取物-处理的
                    牛成纤维细胞的TUNEL分析
        ng/ml SLO            N             ％TUNEL pos.+/-sd
        0-输入细胞            400            7.7+/-1.7
        0                     800            6.5+/-0.17
        500                   892            7.3+/-3.41
        0+提取物30′          400            5.5+/-1.12
        500+提取物30′        400            8.2+/-1.1
        0+提取物60′          784            6.5+/-4.0
        500+提取物60′        691            16.9+/-1.9
选择用于这些克隆方法的透化处理方法是于38℃在500ng/mlSLO中进行30分钟。选择用于形成完整的围绕重新编程细胞的膜的重新封闭方法是在含有2mM CaCl2的α-MEM培养基中孵育2小时。
应用蛋白酶如胰蛋白酶的可选细胞透化处理方法  在应用蛋白酶的示例性细胞透化处理方法中，使细胞(如成纤维细胞)在35mm平板中过夜生长到汇合。应用正常的胰蛋白酶-EDTA(0.5％-5.3mM)方法5分钟，以从平板获取成纤维细胞。将该成纤维细胞在PBS中洗涤，然后重悬于1ml TL Hepes中。将1ml TL Hepes中3mg/ml的蛋白酶添加到1ml细胞悬浮液中(最终蛋白酶浓度为1.5mg/ml)，并于室温孵育1分钟。将细胞在10ml PBS中洗涤，并重悬于1ml HBSS中并进行计数。将最小体积中约105个细胞用于有丝分裂提取物孵育。将40μl MS-15有丝分裂提取物在细胞上于37℃放置30分钟。然后将细胞在TL Hepes中洗涤，并用于此处所述的一个核转移方法中。
这些细胞显示了透化处理的迹象，因为在有丝分裂提取物中孵育后，70-80％的细胞进行核被膜分解和染色体超前浓缩，从而显示来自提取物的MPF(促成熟因子)或MPF的一些成分穿过了膜。可以就多种蛋白酶如胰蛋白酶和多种生殖细胞、体细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、成体细胞、分化细胞和未分化细胞应用该细胞透化处理方法。
重构的卵母细胞的形成、活化、培养和移植应用标准显微注射或电融合技术将重新编程的细胞插入到受体卵母细胞中或与受体卵母细胞融合(参见如美国专利号4,994,384和5,945,577)。例如，可在存在或不存在蔗糖(如2.5％蔗糖)时将细胞在标准细胞培养基中置于靠近卵母细胞处，且细胞可以被吸进注射移液管中。然后将移液管抽吸几次，以裂解细胞并从核中去除胞质成分，然后将核注射入卵母细胞中。然后应用如那些在此处描述的标准方法将重构的卵母细胞活化、培养并移植到母本受体哺乳动物中，以生成克隆哺乳动物。
实施例7：应用两种新克隆方法进行更完全的核重新编程的证据：染色质转移(CT)和链球菌溶血素O转移(SLOT)
如上文所述，在传统的核移植原核期胚胎中发生不完全的核重构和重新编程。该发现得到了原核核移植胚胎的核被膜中核纤层蛋白A/C的组装和过量的NuMA免疫荧光标记的证实。应用此处所描述的染色质转移方法和细胞透化处理和重新编程方法(也称为SLOT)实现了更完全的核重新编程。
具体而言，本发明的克隆方法产生的胚胎的蛋白表达模式比用传统克隆方法产生的克隆胚胎更紧密类似于体外受精胚胎的蛋白表达模式。如此处所述的，染色质转移胚胎比传统的核转移胚胎表达更少的核纤层蛋白A/C。核纤层蛋白A/C是核纤层蛋白的体细胞特异性成分，其在分化细胞中天然地表达，但不表达于胚胎中。由于核纤层蛋白与转录因子、染色质蛋白和DNA之间有报道的相互作用，所以传统的核转移胚胎中核纤层蛋白A/C的表达可能促进对胚胎发育不利的体细胞特异性蛋白的表达。因而，本发明的染色质转移胚胎可比传统的核转移胚胎表达更少不利的体细胞特异性蛋白。此外，染色质转移胚胎对NuMA的表达模式比传统的核移植胚胎更紧密类似于体外受精的胚胎，所述NuMA是参与转录调节的核基质中的主要成分。该结果也显示，染色质转移胚胎比传统的核移植胚胎更有效地进行重新编程。
对在有丝分裂提取物中孵育的牛成纤维细胞的核分解的估计和对 结果所得的染色质的表征从有丝分裂的牛成纤维细胞制备的提取物一致地支持约80％输入的纯化成纤维细胞核的分解(图33)。来自中期II卵母细胞的提取物(即，来自在受精前天然停滞在中期II的卵母细胞的提取物)也成功地支持核分解(在30分钟内75％的核)。
对输入的分裂间期核(图34A)、从在MS15有丝分裂提取物中孵育的核中获得的染色质(图34B)和从在卵母细胞提取物中孵育的核中获得的染色质(图34C)进行了表达以下标记的检查：核纤层蛋白B受体(LBR)，即一种内核膜的膜内在蛋白(膜标记)；核纤层蛋白B，即一种核纤层蛋白的遍在成分；核纤层蛋白A/C，即一种仅在分化细胞中存在而不存在于胚胎中的核纤层蛋白的体细胞特异性成分；NuMA，即一种核基质的主要成分；AKAP95，即一种核的PKA-固着蛋白；和DNA。体细胞胞质MS15和卵母细胞MS15提取物在检查的约100％染色质单位中均诱导核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、LBR和NuMA的增溶(图34B和34C)。如所预期的，AKAP95保持与染色体结合，如以前在人类有丝分裂细胞中观察到的(Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999)。在此处也描述了在染色质超前浓缩阶段的牛核移植胚胎的结果。不论应用什么方法，即传统的核移植、核注射(NI)或染色质转移，有丝分裂提取物和卵母细胞提取物在促进核被膜增溶中均与完整的卵母细胞一样有效(图35)。
由染色质转移产生的原核胚胎和来自核移植和核注射胚胎的原核 的比较  为了生成染色质转移胚胎，在成熟后18-20小时使体外成熟的卵母细胞去核。使来自牛胎儿成纤维细胞分裂间期的核在如此处所述从牛胎儿细胞制备的MS15有丝分裂提取物中孵育。在核被膜发生分解后和染色质浓缩完成前，从提取物中分离染色质。具体而言，与分裂间期中染色体的浓缩水平(称为0％浓缩的)和有丝分裂中染色体的最大浓缩水平(称为100％浓缩的)相比，当染色质约50-60％浓缩时分离染色质。在该阶段，不能区别染色质中单个的染色体，且染色质的边缘具有不规则性状。将已经从有丝分裂提取物中分离的染色质与去核的卵母细胞一起置于具有2.5％蔗糖的TL HEPES微滴中。蔗糖加入到缓冲液中是为了使在随后的注射程序中对细胞的伤害最小化。应用Burleigh Piezo Drill(Fishers，NY)用成斜角的显微注射移液管将染色质注射入卵母细胞中(频率2Hz，75微秒，振幅电压70V)。一般进行多个脉冲，如2、3、4或5个脉冲，从而针可充分穿透卵母细胞以进行注射。注射后，将卵母细胞在蔗糖中TL HEPES的系列稀释物中进行洗涤，以使渗压震扰最小化。成熟后28-30小时(即在从卵巢收集后置于成熟培养基中之后28-30小时，且也是在染色质注射后至少2小时)，如以前所述将重构的卵母细胞和孤雌生殖发育的对照用钙离子载体(5μM)活化4分钟(Cal Biochem，San Diego，CA)，然后在ACM培养基[100mM NaCl、3mM KCl、0.27mM CaCl2、25mMNaHCO3、1mM乳酸钠、0.4mM丙酮酸、1mML-谷氨酰胺、3mg/ml BSA(不含脂肪酸)、1％BME氨基酸和1％MEM非必需氨基酸(Sigma)]中用10μg/ml环己酰亚胺2.5μg/ml松胞菌素D(Sigma)活化5小时(Liu等人，Mol.Reprod.Dev.49：298-307，1998)。活化后，将卵洗涤5次，并置于4-孔组织培养平板中的培养物中，所述培养物含有小鼠胎儿成纤维细胞和0.5ml用0.3ml胚胎检验矿物油(Sigma)覆盖的胚胎培养基。在每一个孔中放置25-50个胚胎，并于38.5℃在5％CO2气氛中进行孵育。如果需要，可将钙(如约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、5mM或更多CaCl2)在培养基中添加约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或更多小时，以促进注射后卵母细胞的重新封闭。该重新封闭的卵母细胞当应用此处所述的标准方法移植入受体哺乳动物中时，可能由于围绕卵母细胞的完整层而具有增加的生存率。
如上文对染色质转移胚胎所述的形成核注射胚胎，只除了将未在提取物中孵育的分裂间期牛胎儿成纤维细胞核代替染色质注射入卵母细胞。应用此处所述的常规方法生成核移植胚胎。
核移植、核注射和染色质转移原核如所预期的进行核纤层蛋白B(图36A，红色标记)和AKAP95(图36B，红色标记)的重新组装。核移植和核注射原核也重新组装核纤层蛋白A/C，即一种体细胞特异性成分(图36A，绿色标记)，这与上文对核移植胚胎报道的结果一致。然而，染色质转移原核和对照单性原核不重新组装核纤层蛋白A/C(图36A)。与大多数染色质转移或单性原核(图36B，绿色标记)不同，核移植原核也含有NuMA(绿色标记)。单性原核和染色质转移原核的一部分重新组装低水平的NuMA，如上文所报道的。
核的体外分解和伴随的染色质转移产生在形态学上类似于对照单性原核的原核。相反，核移植和核注射原核容纳了体细胞特异性成分(核纤层蛋白A/C和大量的NuMA标记)。该结果显示了传统的核移植或核注射程序之后不完全的核重构。如上文所述，在核移植和核注射原核中探测到的核纤层蛋白A/C来源于在原核期从头转录的核纤层蛋白。因为核纤层蛋白和可能的NuMA参与转录调节和人类疾病，所以常规的核移植原核中持续存在核纤层蛋白A/C显示了不正确发挥功能的重新编程。我们得出结论认为，体外核分解和染色质转移比传统的核移植或核注射产生更正常的原核。
应用重新编程的染色质或透化处理的细胞作为供体来源的克隆效 率 如在此处所述的，开发了称为“SLOT”的新克隆程序，该程序包括原代胎牛成纤维细胞的链球菌溶血素O(SLO)-诱导的透化处理，透化处理的细胞向重新编程培养基(如有丝分裂提取物)暴露30分钟，任选在培养物中用2mM钙重新封闭成纤维细胞，和应用标准细胞融合方法将染色质转移入卵母细胞中。
对于该克隆方法，将一小瓶链球菌溶血素O(Sigma S-5265；25,000单位，以干粉形式贮存于4℃)溶于400μl H2O中并充分混合。将所有内容物转移到15-ml锥形管中，然后添加3.6mlH2O并通过涡旋混合。将10μl的等分试样以0.062 U/μl的贮存液浓度贮存于-20℃。将细胞(约100,000)于室温悬浮于100μl HBSS(Gibco BRL，cat.No.14170-120)中。这些细胞是汇合的，因而约80-85％的细胞处于G1期，而大多数其他细胞处于S期。添加链球菌溶血素O贮存液(5μl)(即，500ng/ml或0.3U/μl终浓度)，并将混合物在水浴中于38℃孵育25分钟。在孵育中轻轻敲打管2-3次，以确保细胞保持在悬浮液中。添加室温的PBS(200μl)并通过轻轻吹吸而充分混合。将细胞在台式离心机中于室温在5,000rpm离心4分钟。弃去所有上清液。在该阶段，沉淀小而且不清楚可见。添加含有生成ATP的系统的有丝分裂提取物(40μl，“MS15”)，并充分混合。该提取物是在细胞离心过程中通过融化一小瓶40μl提取物并添加1.2μl生成ATP的系统，充分混合并于室温孵育而制备的。该有丝分裂提取物与上述部分中用于生成染色质的提取物相同。将混合物在水浴中于38℃孵育30分钟，并偶尔轻轻敲打试管。添加室温重新封闭培养基(RM，500μL)(从1M贮存液中补加CaCl2至2mM的α-MEM[Bio-Whittaker]培养基)。使试管敞口并在CO2培养箱中孵育2小时，期间偶尔轻敲试管以确保细胞保持在悬浮液中。将细胞在台式离心机上于室温在5,000rpm离心5分钟。细胞沉淀重悬于100μl室温的TL HEPES(Bio-Whittakercat.No.04-616F)中，并添加另外900μl TL HEPES。应用标准方法进行核转移。如在前面部分中对染色质转移的描述将卵母细胞活化并转移到受体哺乳动物中。
应用本发明的该SLOT方法和染色质转移方法形成的胚胎的发育总结于表7中。SLOT胚胎中到胚泡期的发育比常规的核转移胚胎略低。在胚泡期的SLOT和核转移发育的差异是由于在核转移中应用比SLOT中更大百分比的细胞周期中G1期的细胞。染色质转移胚胎的生存率较低，这是从侵入性方法所预期的。
核转移和SLOT胚胎在妊娠的40日中的妊娠率相当(表7)。SLOT胚胎中妊娠40日-60日的存活数倾向于高于应用常规方法产生的核转移胚胎。
                表7.染色质转移(CT)、核移植和SLOT-产生的
                          牛胚胎克隆的发育
      转移的    存活的    PN期的     卵裂的     胚泡数目      第40日
       数目      数目      数目       数目        (％)       妊娠(％)
                 (％)      (％)       (％)
CT     1503      736       355         81          3           0
                 (49)      (23.5)     (5.3)
SLOT   1884      1802      ND          575         156         24/65
                 (97)                 (30.5)      (8.3)       (37)
核移植 1821      1682      ND          764         235         39/103
                 (92)                 (41.9)      (12.9)      (36)
                    40-60日存活的数目/总数
                             (％)
           CT                 ND
           SLOT            7/10(70)
           核移植          8/16(50)
如上文所述，通过在插入到受体哺乳动物中之前，将重构的卵母细胞在钙中孵育几小时以使得卵母细胞重新封闭，可以增加染色质转移胚胎的生存率。通过缩短将细胞从培养物中取出时和将它们与卵母细胞融合时之间的时间量，也可以增加SLOT胚胎的生存率。例如，可以降低在链球菌溶血素O中孵育、在重新编程培养基中孵育和/或在重新封闭培养基中孵育的时间长度。具体而言，可将在重新封闭培养基中的孵育降低到大约1小时或更短。该缩短的重新封闭处理可以在如上文所述存在2mM钙时进行，或可以在较高浓度的钙(如约2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0或6.0mM钙)存在时进行，以增加重新封闭率。通过减少在与卵母细胞融合前处理细胞的时间量，细胞较不可能进入S期并开始DNA复制，这降低了重构的卵母细胞的生存率。
实施例8：应用染色质转移(CT)进行更完全的核重新编程的证据
如上文所述，开发了一种策略以增强供体核的重构，促进体细胞基因的表达和产生具有与受精卵相似原核结构的胚胎。在该普通的染色质转移方法的具体例子中，使分离的完整牛成纤维细胞核在存在生成ATP的系统时在有丝分裂的牛成纤维细胞胞质提取物中孵育，其中生成ATP的系统是驱动核分解所必需的。
为了生成用于将供体核转变为染色质的有丝分裂重新编程提取物，将成纤维细胞用0.5μg/ml洛可达唑同步化在有丝分裂中约18小时，通过有丝分裂抖落法收获，并在冰冷的PBS中洗涤2次，且在冰冷的细胞裂解缓冲液(20mM Hepes，pH8.2、5mM MgCl2、10mM EDTA、1mM DTT和蛋白酶抑制剂)中洗涤1次(Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1179，1999)。将压紧细胞重悬于一倍体积的细胞裂解缓冲液中，使其在冰上膨胀1小时，并在冰上用紧密配合的研杵进行Dounce匀浆，直到所有细胞都裂解了。将裂解物于4℃在15,000xg离心15分钟，收集上清液(有丝分裂提取物)，等分试样，在液氮中骤冻，并贮存于-80℃。
为了生成供体染色质，将非同步化的汇合成纤维细胞收获，洗涤，并重悬于约20倍体积的冰冷低渗核分离缓冲液(10mM Hepes，pH7.5、2mm MgCl2、25mM KCl、1mm DTT和蛋白酶抑制剂的混合物)中(Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1179，1999)。在冰上1小时后，用紧密配合的研杵对细胞进行Dounce匀浆。从2M贮存液添加蔗糖至浓度为250mM，并将核于4℃在400xg离心10分钟以进行沉淀。将核在核分离缓冲液(除具有250mM蔗糖之外与上述相同的缓冲液)，并将核新鲜应用或者冷冻于核分离缓冲液/70％甘油中(Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1179，1999)。
对于重新编程，在38℃的H2O浴中将分离的成纤维细胞核以4,000个核/μl在40μl含有生成ATP的系统的有丝分裂提取物(1mM ATP、10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌酸激酶)中孵育30分钟。通过相差显微镜监控核被膜分解和染色质浓缩。在孵育结束时，将反应混合物用500μl含有2.5％蔗糖的TL Hepes稀释，并通过在2,000xg沉淀5分钟来回收染色质。将染色质重悬于TL Hepes/蔗糖中，并与去核的卵母细胞一起转移到矿物油下面的TL Hepes/蔗糖中。应用BurleighPiezo Drill(Fishers，NY)(2Hz，2μs，70V)以成斜角的显微注射移液管将单独的染色质注射入体外成熟的在20hpm去核的卵母细胞中。注射后，在TL Hepes中蔗糖的系列稀释物中洗涤卵母细胞以使得渗压震扰最小化，并进行培养。在28hpm时，如对NT所述的活化重构的卵母细胞和孤雌生殖对照，并进行培养(Kasinathan等人，Nat.Biotechnol.19：1176-1178，2001和Kasinathan等人，Biol.Reprod.64：1487-1493，2001)。对于核注射(NI)，与CT相同，使纯化的成纤维细胞核暴露于细胞裂解提取物而不是有丝分裂提取物，并注射入去核的卵母细胞。
作为重新编程的结果，核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白B和NuMA易于分解，而AKAP95保持与浓缩的染色体结合。TUNEL分析显示在提取物中未发生细胞凋亡。应用人类HeLa核和有丝分裂提取物的类似核分解研究显示浓缩的染色质能够支持核重构(Steen等人，J.Cell Biol.150：1251-1562，2000)和在分裂间期胞质中的转录。因而，体外核分解产生了能够重新形成有功能的核的浓缩染色质。通过沉淀回收浓缩的成纤维细胞染色质，并将单独的染色质注射入去核的受体卵母细胞中。在培养物中回收后，如此处对NT卵母细胞所描述的活化卵母细胞。为了对照由核处理生成的人为构造，也注射仅暴露于提取物缓冲液的完整核。
与NT原核一样，NI产生的原核含有核纤层蛋白A/C和B、NuMA和AKAP95。CT导致在超过80％的注射和活化后存活的胚胎中形成PN(注射了约50％卵母细胞，n＞2,000)。然而，CT原核与NT和NI原核相比，不显示任何可探测的核纤层蛋白A/C，并显示抗-NuMA免疫标记的3-倍降低。该模式与孤雌生殖原核类似。与NT原核相比，AKAP95和DNA应用上述Triton X-100/DNAse I/NaCl的可提取性在CT原核中增强了8-倍，反映了CT对原核的AKAP95固着和DNAse I可接近性的有利作用。由于染色质结合的AKAP95与原代转录阻遏的(低乙酰化的)染色质共同发挥功能，该结果提示CT增强了关于PN组装的常染色质的形成。
在通过同时实施的NT和CT程序进行的成纤维细胞供体核重构过程中检查了TATA结合蛋白TBP的动力学。TBP促进事实上所有基因的通用转录机的组装(Sharp等人，Cell 68：819-821，1992)。TBP在供体成纤维细胞核中与AKAP95和DNA共定位。NT后获得的PCC染色体含有比在有丝分裂提取物中浓缩的染色体多5倍的TBP，如由TBP/AKAP95和TBP/DNA荧光强度比例所示的。体外浓缩的染色体的TBP标记强度类似于有丝分裂成纤维细胞。在PN期，TBP几乎不能在CT胚胎中探测到，但在NT和N I胚胎中显示强的免疫反应性。NT胚胎中的原核TBP具有体细胞来源，因为抑制转录或翻译仍保持强的TBP标记。已显示小鼠中原核TBP浓度在经过分裂间期的进程中增加(Worrad等人，Development 120：2347-2357，1994)。然而，重构的NT和CT胚胎之间从PCC-或体外浓缩的染色质形成PN的动力学中的相似性显示，NT原核中增强的TBP浓度不是由于更晚的细胞周期阶段。因而供体核的体外分解促进了TBP从染色质的解离，从而在相同的重构阶段所得的CT原核含有比NT原核少约10倍的TBP。
因而，通过NT进行不完全重新编程的5个结构和功能标记包括核纤层蛋白A/C的原核组装，增强的原核NuMA和TBP浓度，以及AKAP95和DNA对用去污剂、DNAse和盐提取的增加的敏感性。相反，正确的核重新形成和细胞存活必需的B-型核纤层蛋白(Steen等人，J.CellBiol.153：621-626，2001)在NT原核中正常组装，尽管我们不能确定组装的B-型核纤层蛋白库具有体细胞来源(并因此是重新导向的)还是具有母本来源。LMNA基因在NT原核中仍然具有活性，从而导致分化细胞特异性的A-型核纤层蛋白的组装。已提示核纤层蛋白可通过与染色质和转录机的相互作用而参与转录调节(Cohen等人，TrendsBiochem.Sci.26：41-47，2001)；因而，正确的核纤层蛋白组的组装极可能对于NT胚胎中正确的原核功能是关键的。
在本方法中，体细胞核成分分散在提取物中，且一般不与卵母细胞胞质接触。这阻止了体细胞特异性分子向发育中的核的重新导向，如组成可能与母本核纤层蛋白不同的B-型核纤层蛋白(Cohen等人，Trends Biochem.Sci.26：41-47，2001)。体外染色质浓缩也可促进DNA结合的因子的释放，如染色质重构酶(Sif等人，Genes Devel.12：2842-2851，1998)和转录因子，因此“剥去”了供体基因组中潜在的抑制性体细胞成分。具体而言，TBP去除可导致重构的CT原核中体细胞特异性基因的失活，并使受精后雄性原核的低转录活性加倍(Poccia等人，Trends Biochem.Sci.17：223-227，1992)。
从供体原核中去除因子的一种含意是可促进将母本成分加载于染色质上和重构成生理学的原核。CT增加了AKAP95和DNA对核酸酶和盐的敏感性。DNAseI-抗性DNA大多数是转录沉默的；因而，由NT固着AKAP95的不完全重构可破坏发育中重要基因如参与胎盘发育的基因的表达，以及克隆动物晚妊娠和出生后存活的维持。
CT卵母细胞的下述特征显示在有丝分裂提取物中孵育的染色质的核转移显著改进了所得的重构卵母细胞的功能特征。CT原核(即，将染色质引入到卵母细胞中后形成的原核)中由供体体细胞高水平表达的核基质蛋白NuMA的表达比NT原核低3-倍。该结果显示CT卵母细胞中NuMA的水平比NT卵母细胞更类似于天然存在的卵母细胞中的NuMA水平。CT原核也比NT原核表达低10-倍的通用转录因子TBP。通过在有丝分裂提取物中孵育从供体染色质中去除TBP可导致所得的CT卵母细胞中不利的体细胞特异性基因的失活。在CT原核中也未探测到核纤层蛋白A/C，而在NT原核中探测到了核纤层蛋白A/C，该核纤层蛋白A/C是分化细胞特异性的且不可在体外受精或孤雌生殖活化的卵母细胞中探测到核被膜蛋白。因为核纤层蛋白可以调节转录，所以CT原核中缺乏可探测的核纤层蛋白A/C可导致CT卵母细胞中比NT卵母细胞中更适当的转录调节。在原核中对AKAP95和DNA对用去污剂、DNase和盐提取的敏感性进行测量，以表征AKAP95与DNA的固着和表征原核中DNA的可接近性，其中AKAP95是在转录阻遏的(低乙酰化的)染色质中富含的核基质染色质界面的结构蛋白。与NT原核相比，CT原核中的可提取性增强了8-倍，反映了供体染色质在有丝分裂提取物中的孵育对AKAP95固着和供体DNA的形态学重构的有利作用。因为AKAP95和DNase I-抗性DNA与转录阻遏的或沉默的DNA结合，所以AKAP95和DNA对核酸酶、盐和去污剂增加的敏感性提示，CT卵母细胞可能具有发育中重要基因增加的表达。
在来自在内源免疫球蛋白或朊病毒基因中具有一个或多个突变的细胞的供体核中预期有相似的结果。
实施例9：应用链球菌溶血素O转移(SLOT)进行更完全的核重新编程的证据
也证实了在透化处理细胞在有丝分裂提取物中孵育过程中用SLOT对染色质的重新编程。在该研究中，对用SLOT产生的卵母细胞和应用含有未在提取物中孵育的核的细胞进行传统的核转移(“NT”)产生的卵母细胞中NuMA和核纤层蛋白A/C的表达进行了比较，其中NuMA是由供体体细胞高水平表达的核基质蛋白，核纤层蛋白A/C是分化细胞特异性的核被膜蛋白。活化后14小时，SLOT原核(即，将含有染色质的供体细胞引入到卵母细胞中后形成的原核)比NT原核表达显著少的NuMA和核纤层蛋白A/C(在3次重复实验在n＝15-20个胚胎/标记)。这些结果证实重构的SLOT卵母细胞比NT卵母细胞更有效地重新编程，且更密切类似于天然存在的受精的卵母细胞。因为核纤层蛋白可以调节转录，所以SLOT原核中显著低水平的核纤层蛋白A/C可导致SLOT卵母细胞中比NT卵母细胞中更适当的转录调节。
除在所得的卵母细胞中减少不利因子的表达之外，SLOT与传统的核转移方法相比增加了所得的胎儿的生存力(表8)。因而，SLOT供体细胞的许多结构和功能差异充分地改进重构的卵母细胞形成非人类胚胎和非人类哺乳动物的能力。
表8. 用具有染色质的透化处理供体细胞产生的牛胚胎(“SLOT”)和用具有核的供体细胞产生的牛胚胎(“NT”)的发育比较
      转移的     受体的数      第40日妊娠      第90日妊娠
       数目         目            (％)             (％)SLOT     1955         59          29/59(49)        14/59(24)NT      1885         95          44/95(46)        16/95(17)
在内源免疫球蛋白或朊病毒基因中具有一个或多个突变的供体细胞中预期有相似的结果。
实施例10：应用链球菌溶血素O转移(SLOT)进行更完全核重新编程的示例性证据
如上文所述，开发了一种新型的体外核重构系统。该系统包括供体细胞的透化处理，有丝分裂细胞提取物中染色质浓缩的诱导，以及洗涤透化处理的细胞，以去除在染色质浓缩过程中溶解的核因子。牛染色质移植胚胎的原核显示与正常胚胎密切类似的几个标记的表达模式，这与核移植胚胎相反，后者类似于体细胞。应用染色质转移系统产生了8头健康的牛崽。染色质转移显示如下倾向，即到分娩期增加的存活、较大牛崽的低发病率和显著增强的出生后存活。这些结果证实了在移植前对体细胞供体核成功的操作。如在下文中进一步讨论的，有丝分裂提取物中体细胞核的分解和随后浓缩的染色质向卵母细胞中的转移增强了核重构，且显示克隆改善的发育和生存力的证据。如果需要，该方法可用于进一步表征核重新编程的机制。
染色质转移策略  为了减轻在原核NT胚胎中鉴定的缺陷，在转移入受体卵母细胞中之前，在体外对成纤维细胞核进行了处理。该SLOT系统在图45中略述。对于有丝分裂提取物的生成，将成纤维细胞用1μg/ml洛可达唑同步化在有丝分裂中约18小时，通过有丝分裂抖落法收获，并在磷酸缓冲盐水中洗涤2次，且在细胞裂解缓冲液(20mMHepes，pH 8.2、5mM MgCl2、10mM EDTA、1mM DTT和蛋白酶抑制剂)中洗涤1次。将沉淀细胞重悬于一倍体积的冰冷细胞裂解缓冲液中，使其在冰上膨胀1小时，并用紧密配合的研杵进行Dounce匀浆。将裂解物于4℃在15,000xg离心15分钟，将上清液(有丝分裂提取物)等分试样，在液氮中冷冻，并贮存于-80℃。新鲜和冷冻的提取物在应用中对核分解效率没有显著的差别。
将来自汇合培养物的牛胎儿成纤维细胞在不含Ca2+/Mg2+的Hank氏平衡盐溶液(HBBS)中洗涤，并通过在大约38.5℃的H2O浴中将100,000个细胞与31.2U的链球菌溶血素O(SLO；Sigma)在100μl HBSS中孵育30分钟而进行透化处理。透化处理通过摄入不透过膜的DNA染料碘化丙锭(0.1μg/ml)来估计。将透化处理的成纤维细胞沉淀，洗涤，并于大约38.5℃在含有生成ATP的系统的40μl有丝分裂提取物(1mM ATP、10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌酸激酶)中孵育30-45分钟，以促进核分解和去除核成分。将等分试样用0.1μg/ml Hoechst33342进行标记，以监控染色质浓缩。孵育后，通过沉淀从提取物中获取成纤维细胞，并进行洗涤。将反应混合物用500μl含有2mM CaCl2的α-MEM/10％胎牛血清(Gibco-BRL)稀释，以进行膜重新封闭，并于38.5℃将细胞培养2小时(Hkelien等人，Nat.Biotechnol.20：460-466，2002)。重新封闭通过碘化丙锭摄入来监控。使重新封闭的细胞与已在20hpm去核的体外成熟的卵母细胞融合；将卵母细胞在28hpm活化，并如此处对NT所述培养卵母细胞。
将SLOT胚胎在体外培养到胚泡期，且每个受体雌性转移2个胚胎。妊娠通过超声波扫描术监控，并进行C-截面。牛崽由兽医在出生的24小时内记录。
有丝分裂提取物中成纤维细胞的分解 有丝分裂提取物由来自有丝分裂牛成纤维细胞裂解物的15,000xg上清液组成，且含有生成ATP的系统。提取物不诱导细胞凋亡，如通过缺乏多腺苷二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的蛋白酶解和细胞凋亡成纤维细胞的DNA片段化特征所鉴定的。因而，提取物适合于促进体细胞核的重构。
提取物引起了ATP依赖性染色体浓缩，由核纤层蛋白标记所鉴定的A/C和B-型核纤层蛋白从染色质的分解，以及TBP从染色质的去除。这些事件得到了在从有丝分裂提取物回收后从成纤维细胞纯化的浓缩染色质的免疫印迹分析的证实。在该实验中，将A-激酶固着蛋白AKAP9 5用作保持与浓缩染色体结合的核成分的标记，如在有丝分裂中正常发生的(Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999)。将组蛋白H4用作凝胶中的蛋白加载对照。在有丝分裂提取物中核纤层蛋白和TBP从染色质的分解依赖于生成ATP的系统，且使人联想到在有丝分裂细胞中所发生的。此外，完全透化处理的成纤维细胞(与分离的染色质相反)在暴露于有丝分裂提取物之后的免疫印迹分析显示，一部分核纤层蛋白A/C和所有可探测的TBP均从细胞中去除和/或被蛋白酶解。最后，来自分裂间期成纤维细胞或仅仅来自细胞裂解缓冲液的均含有生成ATP的系统的对照提取物不能促进核分解，显示核分解是ATP依赖性的，且对体细胞提取物是特异性的。暴露于有丝分裂提取物并用CaCl2重新封闭的透化处理成纤维细胞可以培养几个世代，显示膜的透化处理、透化处理细胞在提取物中的孵育和膜的重新封闭是能生存的程序。
由染色质转移产生的胚胎中核的表征 重新封闭的成纤维细胞与受体卵母细胞的融合与非透化处理的细胞一样有效地发生(超过70％)。供体染色质在引入卵母细胞时是浓缩形式。相反，用于NT的成纤维细胞染色质在融合的30分钟内仍然是解浓缩的。因而，在转移入卵母细胞之前用CaCl2重新封闭提取物处理的成纤维细胞不促进供体细胞中的核重新形成。该观察得到了紧接在融合后SLOT胚胎中浓缩染色质周围没有核被膜的支持，如由几个核纤层蛋白和内核膜蛋白的免疫荧光分析所鉴定的。
对SLOT和NT胚胎核中的核纤层蛋白和TBP进行了免疫标记，并研究了相对于DNA荧光强度的这些标记的免疫标记强度。原核核纤层蛋白B标记强度类似于SLOT和NT原核。然而，令人惊讶的是，与NT原核相反，在SLOT胚胎中的原核和一直到至少8-16-细胞期均未探测到核纤层蛋白A/C。SLOT原核与NT原核相比也显示TBP标记中4-倍的降低。已显示小鼠中原核TBP浓度在经过分裂间期的进程中增加(Worrad等人，Development 120：2347-2357，1994)。然而，由于从PCC-或体外浓缩的染色质形成原核的动力学与NT和SLOT胚胎中的相似，所以NT原核中增强的TBP浓度不大可能是由于更晚的细胞周期阶段，尽管不能完全排除这种可能。TBP对用1％Triton X-100、1mg/mlDNAse I和0.3M NaCl提取的抗性降低了超过2倍，显示TBP与核内配体的较弱结合。同样，SLOT原核中DNA对DNAse I的抗性降低了近4倍，提示SLOT倾向于在原核中确立较松散的染色质构型。因而，有丝分裂提取物中成纤维细胞核的分解和随后浓缩的染色质向卵母细胞中的转移增强了供体核的形态学重构，且减轻了NT胚胎原核中探测到的缺陷。
染色质转移产生健康的克隆SLOT 导致克隆的胚胎发育到分娩期。将胚泡转移到受体雌性之后在40日SLOT胚胎的妊娠率显著高于NT胚胎(P＝0.02；Fisher氏检验)，且该趋势一直保持到发育至分娩期(分别为12/59和23/211出生的牛崽；P＝0.05)。此外，SLOT增强了产后24小时以上的克隆的生存率(分别为10/59和17/211；P＝0.04)。
出生的NT和SLOT克隆的健康通过将动物和胎盘以1(正常)-5(非常不正常)的等级记分来进行估计。胎盘分数包括以下参数，如胎盘水肿、绒毛叶数目、大小和形态、羊膜液的颜色、子宫的形态和脐。动物分数包括呼吸、心血管、消化、泌尿、肌肉、骨骼和神经系统的功能估计和总体外观。Box plot分析显示源自NT的动物和胎盘分数比由SLOT产生的更分散。SLOT和NT克隆的平均出生重量没有显著差异；然而，出生时超过45kg的SLOT牛崽的比例比NT动物的低(P＝0.02；Fisher)。总而言之，这些结果显示改进的发育和生存力的证据。
与NT相比，且不管产生的SLOT后代的有限数目(n＝8)，SLOT显著增强了40日的妊娠率(P＝0.02)和出生24小时以上的牛崽的存活(P＝0.04)。由SLOT产生的动物健康改善的趋势也反映在box plot分析中。此外，由SLOT产生的较大(超过45kg)的牛崽的较低发病率对于动物管理具有实践和经济意义。
在NT胚胎中已经鉴定了几个核缺陷，包括核纤层蛋白A/C的组装，增强的原核TBP含量和增加的DNA对DNAse I的抗性。这些缺陷可能由成纤维细胞核和不完全重构和/或分化细胞特异性(如核纤层蛋白A)基因表达的错误调节引起。体外核重构将浓缩染色质移植入卵母细胞中减轻了这些缺陷。
通过SLOT重构的核增加了DNA对DNAse I的敏感性，且可能促进转录活性(或潜在活性)染色质的形成。该作用反过来可促进发育中重要基因如参与胎盘发育的基因的表达，晚妊娠的维持和出生后的存活。SLOT也诱导克隆的胚胎中核纤层蛋白A基因表达的阻遏。对核纤层蛋白组合物的体外和体内操作已显示，不能组装正确的核纤层蛋白组总是导致细胞凋亡(Steen等人，J.Cell Biol.153：621-626，2001)。此外，由于核纤层蛋白与DNA、染色质和转录机相互作用，所以正确的核纤层蛋白重构可能对于克隆的胚胎中正常的核功能是必需的(Gruenbaum等人，J.Struct.Biol.129：313-323，2000和Cohen等人，Trends Biochem.Sci.26：41-47，2001)。
有丝分裂或体外的染色质浓缩与DNA-结合的成分相关，如染色质重构酶、转录因子(如TBP)或其他潜在的抑制性体细胞成分。从供体体细胞染色质中去除TBP可促进SLOT胚胎中体细胞特异性基因的阻遏或减量调节，这可损害发育。从供体核中去除因子的一个含意是可以促进将母本成分加载入染色质中及随后重构为生理学的原核。
总之，可能直接在细胞提取物中重构体细胞核并产生活的后代。为克隆或转分化的目的进行体外核处理(Landsverk等人，EMBO Rep.3：384-389，2002和Hkelien等人，Nat.Biotechnol.20：460-466，2002)是任选的进一步对核重新编程机制进行研究的有用工具。染色质转移显示了克隆改进的发育到分娩期和生存力的证据。对该系统的额外操作可导致哺乳动物克隆效率中的进一步改进。
实施例11：应用链球菌溶血素O转移(SLOT)进行更完全核重新编程的进一步证据
当供体透化处理细胞在基因转移前未重新封闭时，上述SLOT方法产生了改进的结果。此外，在G1期应用供体细胞代替汇合细胞可导致重构的卵母细胞和所得的胚胎的增加的生存力。这些实验在下文中进一步进行描述。
用于下面实验的缓冲液的制备 1摩尔DTT溶液通过将1ml H2O置于eppendorf管中，添加154mg冷冻的DTT并通过涡旋充分混合而制备。将溶液等分为10μl体积并贮存于-20℃。等分试样可融化和再次冷冻几次。用于制备核组装/分解测定的细胞提取物的100ml体积的细胞裂解缓冲液含有NaCl(50mM，1ml 5M贮存液)、MgCl2(5mM，0.5ml 1M贮存液)、Hepes，pH8.2(20mM，2ml 1M贮存液，pH8.2)和H2O(96.5ml)。将缓冲液等分试样并贮存于4℃。在裂解物制剂中有约1pH单位的降低。为了制备有丝分裂提取物，添加10mM EDTA(1ml 1M贮存液)，并添加95.5ml H2O而不是96.5ml H2O。在应用前，加入下述成分：DTT(1μl/ml溶液，-20℃的1M贮存液，1mM终浓度)、PMSF(10μl/ml溶液，100mM贮存液，1mM终浓度)、CAL混合液(每ml溶液中10μl CAL混合物，即各自终浓度为10μg/ml的胰凝乳蛋白酶抑制剂、抑酶肽和亮抑蛋白酶肽)、胃蛋白酶抑制剂A(每ml溶液中10μl-20℃的贮存液，10μg/ml终浓度)和松胞菌素D(1μl/ml来自-20℃的1mg/ml贮存液，1μg/ml终浓度)。对于洛可达唑1000X贮存液，制备DMSO中1mg/ml的洛可达唑并以160μl等分试样贮存。
为了制备链球菌溶血素O贮存液(SLO)，将一小瓶SLO(SigmaS-5265；以粉末形式贮存于4℃的25,000单位)溶于400μl H2O中并充分混合。将整个内含物转移到1.5-ml锥形管中，分为10μl的等分试样，并在-20℃冷冻。贮存液浓度为“10X”。为了制备蛋白酶溶液，将3ml TL Hepes和9mg蛋白酶(Sigma P-8811)添加入15ml锥形管中并通过涡旋混合。将溶液通过0.22μm的针筒式滤器直接过滤到TL Hepes中。因为细胞的体积加倍，所以终浓度为1.5mg/ml。对于HECM Hepes，组合了NaCl(114mM，6.662g)、KCl(3.2mM，0.239g)、CaCl2 2H2O(2.0mM，0.294g)、MgCl26H2O(0.5mM，0.102g)、Pen/Strep(10ml，Sigma P3539 Pen/Strep，100U/ml和100ug/ml终浓度)、酚红(5ug/ml，1ml和H2O(足够量以使总体积增加到990ml)。然后，添加100X A.A.(10ml)、乳酸钠(10mM，1.44ml)、丙酮酸钠(0.1mM，0.011g)、NaHCO3(2mM，0.168g)和HEPES(10mM，2.38g)。终溶液具有260-270 mOsM的摩尔渗透压浓度。然后，添加3g牛血清清蛋白(组分V)，并将pH调节至7.4。将溶液通过0.2 2μM滤器过滤并贮存于4℃。
为了制备ATP贮存液(Sigma A3377：100mM贮存液，100x)，组合H2O(1ml)和ATP(0.055g)，并将10μl等分试样于-20℃贮存。为了制备磷酸肌酸(Sigma P7936：1M贮存液，100x)，组合H2O(1ml)和磷酸肌酸(0.255g)，并将10μl等分试样于-20℃贮存。为了制备肌酸激酶(Sigma C3755：2.5mg/ml贮存液，100x)，组合H2O(1ml)和肌酸激酶(0.0025g)，并将10μl等分试样于-20℃贮存。为了制备生成ATP的系统，用H2O制备等比例的100mM ATP贮存液、1M磷酸肌酸和2.5mg/ml肌酸激酶贮存液(100x)，混合，并作为冷冻溶液贮存。将生成ATP的系统在应用前置于冰上。将生成ATP的系统(1.2μl)添加到提取物中(40μl)，并通过涡旋混合溶液。提取物中生成ATP的系统的终浓度为1mM ATP、10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌酸激酶。
有丝分裂提取物的制备 融化一小瓶150-200万个细胞。将细胞分到两个T75烧瓶中，并生长2日，或直到它们汇合。使细胞在6-8个T75烧瓶中传代并生长到汇合。将细胞用胰蛋白酶消化并应用血细胞计数器计数，将300万个细胞添加到可得到的细胞数目所可用的T150烧瓶的每一个中。应用标准方法，用0.5-1μg/ml洛可达唑将70-80％汇合的细胞系(如，成纤维细胞如原代成纤维细胞、上皮细胞或无限增殖化和无疾病的细胞如MDBK细胞)同步化在有丝分裂中17-20小时(如，Collas等人，J.Cell Biol.147：1167-1180，1999及其中引用的参考文献)。通过有丝分裂抖落法收获同步化细胞。通过用一只手重复轻敲而有力地摇动含有细胞的培养瓶。有丝分裂细胞脱附并漂浮于培养基中。将收获的细胞于4℃在50ml锥形管中在500xg离心10分钟。去除上清液，并将细胞沉淀重悬于总共50ml冷的不含Ca/Mg的磷酸缓冲盐水(PBS)中。如果需要，可将几个细胞沉淀汇集到单个50ml试管中。将细胞于4℃在500xg离心10分钟，并重复上述洗涤步骤。确定细胞沉淀的体积，并将细胞沉淀重悬于约20倍体积的含有蛋白酶抑制剂(即DTT和PMSF)的冰冷细胞裂解缓冲液中。
然后，将细胞于4℃在500xg沉淀5分钟。去除上清液，确定细胞沉淀体积。将细胞沉淀重悬于超过1倍体积的含有所有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液中。使细胞在冰上孵育1小时以使细胞膨胀。应用尖超声波仪器，将细胞悬浮液进行超声波处理，直到所有细胞破裂。在相差显微镜下监控细胞裂解。理想地，在进行下一个步骤之前90％的细胞被裂解。超声波处理可以延长到需要的时间长度；超声波处理时间随用于制备提取物的细胞类型变化。可选择地，通过应用玻璃研钵和研杵(匀浆器)进行Dounce匀浆来裂解细胞，理想地直到至少90％的细胞被裂解。将细胞裂解物置于1.5-ml离心管中并应用台式冷冻离心机于4℃在约15,000xg离心15分钟。将离心机置于冷室或冰箱中以使其能够平衡。从离心机中取出试管并立即置于冰上。小心地应用200μl移液管顶端收集上清液。该上清液是有丝分裂胞质提取物。将提取物在冰上置于另一个试管中。将从几个试管中收集的提取物汇集。
在该阶段存在两种替代方案。将细胞提取物在冰上等分到试管中，每管40μl提取物。将提取物立即在液氮中骤冻，并在应用前贮存于-80℃冷冻机中。将从15,000xg离心制备的这种提取物称为MS15(或有丝分裂胞质提取物)。可选择地，将MS15提取物置于冰上的超速离心管中(如适合于SW55 Ti转子；Beckman)。如果需要，可用矿物油在顶部覆盖该管，以防止在离心中管的塌陷。将提取物于4℃在200,000xg离心3小时，以沉淀包含于MS15中的膜小泡。在离心结束时，弃去油。小心收集上清液并置于冰上冷的1.5-ml管中。如果需要则应用几组上清液。该上清液称为MS200(或有丝分裂胞质溶胶提取物)。如对MS15提取物所描述的，将MS200提取物等分试样并冷冻。
染色质转移在克隆程序的前一天，制备一个具有1百万成纤维细胞的35mm Nunc，或者制备6个含有500,000个细胞的T75烧瓶用于抖落法。在进行克隆程序的早晨，将所有烧瓶中扩散了具有15％FBS的α-MEM的完全培养基进行更换，以去除碎片和死细胞。在进行细胞透化处理和有丝分裂反应之前，通过如下方法确定透化处理80-90％细胞所需的SLO的最低浓度，即，连续稀释SLO贮存液(如1X、0.5X、0.3X和0.1X的稀释)，在大约38.5℃的水浴中孵育30分钟，然后用碘化丙锭染色。
应用胰蛋白酶或细胞解离缓冲液从汇合培养物或新转染的细胞培养物中解离细胞，将其置于15ml锥形管中，通过应用不含Ca/Mg的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)离心来洗涤一次。将细胞沉淀重悬于1mlHBSS中，并对细胞进行计数以确定浓度。将约50,000-100,000个细胞于室温重悬于100μl HBSS(Gibco BRL，cat.No.14170-120)中。加入前面确定了浓度的5μl SLO贮存液。将混合物在大约38.5℃的水浴中孵育30分钟。在孵育中轻轻敲打试管2-3差，以确保细胞保持在悬浮液中。加入200μl体积的室温PBS(不含Ca/Mg)，并通过轻轻吹吸充分混合。在台式离心机上于室温将细胞在500xg离心5分钟。去除所有上清液。沉淀小且而且不清楚可见。
添加40μl体积的含有生成ATP的系统的有丝分裂提取物，并将溶液充分混合。该提取物是在上述30分钟孵育过程中制备的。融化一小瓶40μl提取物并添加到1.2μl生成ATP的系统中。将溶液充分混合并置于室温。将混合物在38.5℃水浴中孵育30分钟，并偶尔轻轻敲打试管。添加500μl体积的室温完全培养基(α-MFM+15％胎牛血清)，并在应用前敞口放置在约38.5℃的培养箱中。在台式离心机上于室温将细胞在500xg离心5分钟。细胞沉淀重悬于1ml室温的TLHepes，并转移到15ml锥形管中。添加1ml体积的3mg/ml TL Hepes中的蛋白酶(过滤的)，至细胞上的蛋白酶终浓度为1.5mg/ml，并将混合物孵育30秒。添加TL Hepes以充满15ml的锥形管，将管加盖并于2300rpm离心5分钟。从细胞去除TL Hepes，并向细胞添加150μl TL Hepes。将管对于适当的细胞系进行标记并置于加温阶段。
在制备细胞的时间中，应用适当大小的细胞转移移液管准备了用于细胞转移的操作站。将约50个去核的卵母细胞置于100mm皿中50μl重矿物油下的TL Hepes滴中。将洗涤的细胞置于具有去核卵母细胞的滴中。将足够细胞用于对所有卵母细胞的基因转移。要当心以避免应用太多的细胞，以致于它们空间阻断操作工具。将一个去核卵母细胞置于固定器上，将一个细胞置于带下的卵周隙中，从而细胞接触卵母细胞的质膜。为了促进融合，将细胞靠近或背对极体放置。在所有去核卵母细胞均有转移到其中的细胞之后，从微滴中获取卵母细胞并置于预加温的35mmHECM Hepes皿中进行融合。
结果下面表10中对于在基因转移前膜没有重新封闭的供体细胞的结果与对于在基因转移前膜进行重新封闭的供体细胞的结果的比较显示，通过不重新封闭透化处理的细胞膜可获得增加的克隆效率。此外，表10证明，在G1期应用供体细胞而不是汇合细胞可导致重构卵母细胞和所得胚胎增加的生存力。表9中的数据是应用来自牛原代成纤维细胞和供体牛胎儿成纤维细胞的提取物获得的。MDBK细胞也成功用于生成重新编程的提取物。
表9.应用HAC细胞系的胚胎发育：应用重新封闭的
           供体细胞的NT对SLOT
     处理     总数      胚细胞(％)    受体                                      妊娠时间
    40d(％)     60d(％)      90d(％)     120d(％)     150d(％)
   HAC NTs     8872     1124(18)     508     170  (34)     89  (18)      82  (16)     76  (15)     72  (14)
  HAC SLOTs     2709     223(12)     91     42   (46)     22  (24)      19  (21)     18  (20)     17  (19)
     总计     11581     1347(17)     599     212  (35)     111 (19)      101 (17)     94  (16)     89  (15)
表10.  应用ΔHAC和ΔΔHAC细胞系的胚胎发育：不具有供体细胞膜的
      汇合供体细胞(CTC)对G1供体细胞(CTD)
处理 总数 胚细胞(％) 受体 第40日妊娠(％) 第60日妊娠(％)
ΔHAC CTC 1729 185(15) 68 14/39(36) 5/13(38)
ΔHAC CTD 1177 181(22) 68 25/44(56) 5/22(33)
ΔΔHACCTC 1230 147(17) 60
ΔΔHACCTD 521 95(26) 29
总计 4657 608(19) 225
实施例12：生成嵌合哺乳动物的方法
应用传统方法克隆动物时发生的许多自发流产被认为是由胎盘的畸形而不是胎儿问题引起的。因而，已开发了产生嵌合胚胎的方法，该嵌合胚胎具有主要来自于一个来源(如体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎)的胎盘组织和主要来自于另一个来源(如编码异种抗体的核转移胚胎)的胎儿组织。具有主要源于来自体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎细胞的胎盘组织的胚胎更类似于天然存在的胎盘组织，并导致有生活力后代生产的增加。优选地，后代的大多数细胞源于来自核转移胚胎的细胞，因而具有基本与用于生成核转移胚胎的供体细胞相同的基因组。
在一种这样的方法中，将来自体外受精胚胎的细胞注射入编码异种抗体的紧密化胚胎的周边(如在透明带和胚胎自身之间)，该紧密胚胎应用传统的核转移方法或任何其他此处所述的克隆方法生产。在可选择的方法中，使来自紧密化前体外受精胚胎的细胞与来自编码异种抗体的紧密化前胚胎的细胞孵育，条件为使来自每一胚胎的细胞可以重新组织以产生单个嵌合胚胎，所述编码异种抗体的紧密化前胚胎应用本发明的一种克隆方法制备(如应用重新编程的染色质或透化处理细胞作为供体)(Wells和Powell，Cloning 2：9-22，2000)。在两种方法中，来自体外受精胚胎的细胞优选掺入胎盘，而来自核转移方法的细胞优选掺入胎儿组织。这些方法在下文中进一步进行描述。这些结果是通过应用不含有异种抗体基因的核转移胚胎生成的；然而，对于含有异种抗体基因的核转移胚胎预期有相似的结果。
G 1 成纤维细胞的分离 对于作为供体细胞以产生核转移胚胎的G1成纤维细胞的分离，应用以前描述的“抖落法”(Kasinathan等人，Naturebiotech.19：1176-1178，2001)。简言之，在分离前24小时，将5.0×105细胞置于含有10ml α-MEM+FCS的100mm组织培养平板上。下一天，将平板用PBS洗涤，并在分离前将培养基放回原处1-2小时。然后在Vortex--Genie 2(Fisher Scientific，Houston，TX，中速)上摇动平板30-60秒。获取培养基，于500xg旋转5分钟，并将沉淀重悬于250μl MEM+FCS中。该细胞悬浮液由通过胞质桥连接的新分裂的细胞对、一些单独的细胞和中期或后期细胞组成。将通过胞质桥连接的细胞毒用作核转移的供体细胞。
核移植、活化和胚胎培养  基本如以前所述地进行应用分离的G1成纤维细胞的核转移程序(Cibelli等人，Nature Biotech.16(7)：642-646，1998；Kasinathan 等人，Biol.Reprod.64(5)：1487-1493，2000)。将体外成熟的细胞在成熟后约18-20小时去核，且通过在紫外光下的bisBenzimide(Hoechst 33342，Sigma)标记来证实染色体的去除。这些胞质体-供体细胞对应用20微秒的单个2.4kV/cm电脉冲进行融合(Electrocell manipulator 200，Genetronics，San Diego，CA)。在成熟后30小时，如以前所述，用钙离子载体(5μM)活化4分钟(Cal Biochem，San Diego，CA)，然后用ACM培养基(100mM NaCl，3mM KCl，0.27mM CaCl2，25mMNaHCO3，1mM乳酸钠，0.4mM丙酮酸，1mM L-谷氨酰胺，3mg/ml BSA(不含脂肪酸)，1％BME氨基酸和1％MEM非必需氨基酸；均购自Sigma)中的10μg环己酰亚胺和2.5μg松胞菌素D(Sigma)活化6小时(Liu等人，Mol.Reprod.Dev.49：298-307，1998；Presicce等人，Mol.Reprod.Dev.38：380-385，1994)。活化后，将卵在HEPES缓冲的仓鼠胚胎培养基(HECM-HEPES，114mM NaCl，3.2mM KCl，2mM CaCl2，10mM乳酸钠，0.1mM丙酮酸钠，2mM NaHCO3，10mM HEPES和1％BME氨基酸；Sigma)中洗涤5次，并置于4-孔组织培养平板中的培养物中，该培养物含有小鼠胎儿成纤维细胞和0.5ml用0.2ml胚胎检验矿物油(Sigma)覆盖的胚胎培养基。在每一个孔中放置25-50个胚胎，并于38.5℃在5％CO2的空气气氛中孵育。在第4日，向培养基添加10％FCS。在第7和8日，记录到发育至胚泡期。
牛体外受精如以前所述进行体外受精，以产生牛体外受精的胚胎(Collas等人，Mol.Reprod.Dev.34：224-231，1993)。应用精子TL贮存液制备45％和90％的等渗Percoll梯度(Parrish等人，Theriogenology 24：537-549，1985)。将冰冻融化的来自单个公牛的牛精子置于梯度的顶部，并在700xg离心30分钟(2000rpm，应用6.37英寸的末端半径)。确定沉淀中精子的浓度，将精子在精子TL(精子TL贮存液，1mM丙酮酸，6mg/ml BSA和1％PS)中稀释，从而受精时终浓度为106个精子/ml。成熟后22小时时，将卵母细胞在TL HEPES中，并置于Nunc孔中的480μl受精TL中(Bavister等人，Biol.Reprod.28：235-247，1983)，该受精TL含有6mg/ml BSA，0.2mM丙酮酸，20μM青霉胺，10μM亚牛磺酸，1mM肾上腺素(Leibfried等人，J.Reprod.Fertil.66：87-93，1982)和0.004μg/ml肝素。向50个卵母细胞添加20微升精子，以生成106个精子/ml的终浓度。培养条件与上文对核转移所描述的相同。基于原核发育，确定受精率大于90％。
嵌合的核转移胚胎  在受精后约96小时、紧密前收获8-细胞期(6-12卵裂球)的体外受精胚胎。用蛋白酶(TL-HEPES中3mg/ml)去除透明带。应用解剖显微镜仔细监控带的溶解。当带开始表现出溶解时(约2分钟)，获取胚胎并在TL-HEPES中洗涤，转移到含有Hank氏平衡盐溶液的30mm培养皿中于37.5℃孵育30分钟。将来自这些紧密化前胚胎的卵裂球转移入100mm培养皿中矿物油下的TL-HEPES微滴(50μl)中。选择第4日8-细胞期的核转移胚胎，并转移入相同的含有卵裂球的微滴中。这些核转移胚胎包括紧密化前胚胎(如8细胞期胚胎)和紧密胚胎(如16细胞期胚胎)。然后应用标准显微操作技术用成斜角的微量移液管(35μm直径)将4-6个卵裂球转移入核转移胚胎中。转移卵裂球之后，如对核转移胚胎所述培养胚胎。
在第7和8日，评价了嵌合胚胎到胚泡的发育。也分析了胚泡中是否存在膜染料DiI，该染料是在注射入核转移胚胎中之前加入到来自体外受精胚胎的细胞中的。细胞在第4日进行标记，而在第7日进行观察。该染料在最初染色的细胞后代的几次细胞分裂中维持，从而使得在几次细胞分裂后可以分析嵌合胚胎。基于该分析，将来自体外受精胚胎的细胞掺入嵌合胚胎中。如果需要，可应用标准方法用对体外受精胚胎或核转移胚胎特异性的探针进行荧光原位杂交进行(FISH)(参见如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，pp.14.7.1-14.7.12，1995)。该FISH分析可用于当在体外培养或在由胚胎生成的胎儿或后代中时，确定源自每一个胚胎的细胞在嵌合胚胎中的分布(如，用于确定多少百分比的细胞掺入内细胞团，且多少百分比的细胞掺入滋养外胚层)。可选择地，可将报道基因如绿色荧光蛋白加入到来自胚胎之一的细胞中，并用于监控细胞掺入嵌合胚胎的胎盘和各种胎儿组织中。
胚胎转移  第7和8日，将源自核转移胚胎和嵌合核转移胚胎的1和2级核转移胚泡转移入第6和7日同步化的受体小母牛中。用于单次注射Lutalyse(Parmacia & Upjohn，Kalamazoo，MI)和伴随的动情期探测时受体同步化。在胚胎转移后30-60日通过超声波扫描术检查受体是否存在孕体，然后每30日进行直肠触诊，直到240日。嵌合胚胎和通过使转基因牛成纤维细胞与卵母细胞融合形成的对照胚胎在第40日的妊娠结果在表11中进行比较。这些结果显示较大数目的嵌合胚胎在第40日前存活。
                      表11.  核转移和妊娠
   植入          对照核转移           嵌合核转移
 受体数目    第40日妊娠  受体数目    第40日妊娠
  第一次     2         1     2         1
  第二次     6         1     4         3
   总数     8      2(25％)     6       4(67％)
产生嵌合胚胎的替代方法  可应用标准方法来修改上述产生嵌合胚胎的方法。例如，可从哺乳动物(如牛)中手术分离天然存在的胚胎并替代体外受精的胚胎应用，或者可以应用标准技术孤雌生殖活化卵母细胞。如果需要，可将少量来自体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎的细胞(如1、2、3、4或5个细胞)注射入核转移胚胎中，以降低注射的细胞及其掺入胎盘组织中的后代的百分比。可选择地，可注射更多细胞(如6、7、8、9、10、11或更对细胞)，以增加注射的细胞及其掺入胎盘组织中的后代的百分比。此外，可以应用来自其他细胞期的胚胎细胞。例如，可将4、8、16、32、64、128、256、512或更晚细胞期的体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎注射入4、8、16、32、64、128、256、512或更晚细胞期的核转移胚胎中。注射的细胞和核转移胚胎可在相同细胞期或不同细胞期。在一个实施方案中，体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎相对于核转移胚胎而言具有增加的倍性(如4n的DNA含量)，这进一步使注射的细胞偏向于进入滋养外胚层(即，主要形成胚胎组织的胚胎细胞的最外层)。如果需要，可以使所有或部分的透明带包围注射的细胞，而不是在注射前去除。
在其他可选择的方法中，使来自紧密化前或紧密体外受精的、天然存在的或单性胚胎的细胞与来自紧密化前核转移胚胎的细胞孵育，条件为使来自每一胚胎的细胞可以重新组织以产生单个嵌合胚胎(Wells和Powell，Cloning 2：9-22，2000)。预期来自体外受精的、天然存在的或单性胚胎的细胞主要对滋养外胚层有贡献，并最终形成胎盘组织，而预期来自核转移胚胎的细胞主要对内细胞团有贡献，并最终形成胎儿组织。来自两个胚胎的细胞可在相同细胞期或不同细胞期，且来自每一胚胎的相同或不同数目的细胞可以组合形成聚集胚胎。
如果需要，来自所得克隆胎儿或克隆后代的细胞可用于第二轮核转移，以生成额外的克隆后代。来自最初的克隆胎儿或克隆后代的细胞也可冷冻以形成细胞系，以用作生成额外的克隆有蹄动物的供体细胞来源。
任选地从非转基因胚胎中去除细胞
如果需要，为了进一步减少掺入胎儿组织或后代中的来自体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎的细胞及其后代的数目，将与来自体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎的抗原(如B-细胞或生殖细胞抗原、细胞表面抗原或存在于来自受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎的细胞之中或之上但不存在于来自核转移胚胎的细胞之中或之上的任何抗原)具有反应性的抗体施用于嵌合胚胎、胎儿或后代，其量足以降低掺入胎儿或后代中的来自体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎的细胞的量和/或活性。在优选实施方案中，以一剂或多剂向胎儿施用1-10mg、10-25mg、25-50mg、10-100mg、50-100mg或100-500mg抗体。优选地，以一剂或多剂向后代施用至少0.25、0.5、1.0、1.5或2克抗体。优选地，在初乳前施用抗体。
在用于生成嵌合胎儿或后代的另一个方法中，来自用于产生嵌合胎儿或后代的一个初始胚胎的细胞具有编码异种抗体(如人抗体)的核酸。此外，来自前述初始胚胎或另一个初始胚胎的细胞具有编码抗体的核酸，该抗体与内源抗体(如由来自用于生成嵌合胎儿或后代的任何初始胚胎的细胞天然产生的抗体)具有反应性，且降低了所得胎儿或后代中内源抗体的量或活性。
可以应用标准分子生物学技术获得编码与内源抗体具有反应性的抗体的核酸。例如，可以将来自产生与有蹄动物抗体具有反应性的抗体的B-细胞的mRNA反转录，并将所得cDNA插入到用于形成一个初始胚胎的供体细胞、核或染色质中。在一些实施方案中，应用此处所述的方法，将cDNA插入到含有异种免疫球蛋白核酸的HAC中，并将HAC插入到供体细胞、核或染色质中。如果需要，可将cDNA置于细胞特异性启动子如肝特异性启动子的控制之下。
在一种这样的方法中，将细胞、核或染色质插入到卵母细胞中，从而形成第一个胚胎。该细胞、核或染色质具有编码异种第一抗体的核酸和编码与内源抗体具有反应性的第二抗体的核酸。来自第一个胚胎的一个或多个细胞与来自第二个胚胎(如体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎)的一个或多个细胞接触，从而形成第三个胚胎。在使得第三个胚胎能够发育成胎儿或活的后代的条件下，将该第三个胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。所得的胎儿或后代表达异种第一抗体和第二抗体，且第二抗体降低了内源抗体的量和/或活性。
在相关的方法中，将透化处理的细胞在重新编程培养基中孵育，条件为使得能够从透化处理细胞的核、染色质或染色体中去除因子，或能够从重新编程培养基向核、染色质或染色体添加因子，从而形成重新编程细胞。该细胞具有编码异种第一抗体的核酸和编码与内源抗体具有反应性的第二抗体的核酸。将重新编程的细胞插入到卵母细胞中，从而形成第一个胚胎。来自第一个胚胎的一个或多个细胞与来自第二个胚胎(如体外受精的、天然存在的或孤雌生殖活化的胚胎)的一个或多个细胞接触，从而形成第三个胚胎。在使得第三个胚胎能够发育成胎儿或活的后代的条件下，将该第三个胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。所得的胎儿或后代表达异种第一抗体和第二抗体，且第二抗体降低了内源抗体的量和/或活性。
实施例13：在一种或多种内源抗体中具有突变的产生异种抗体的转基因有蹄动物
也可以通过使一种或多种内源抗体基因突变而进一步减少内源抗体的表达。通过相对于功能性内源重链基因或轻链基因的数目而言增加功能性异种免疫球蛋白重链基因或轻链基因的数目，应该提高表达异种抗体的B细胞的百分率。如果需要，可以按照下文所述施用抗体以去除残留的内源B细胞和抗体。
为了产生这些转基因有蹄动物，可以让ΔHAC或ΔΔHAC转基因有蹄动物与在内源免疫球蛋白链(例如μ重链或者λ或κ轻链)的一个或两个等位基因中含有突变的转基因有蹄动物交配。如有必要，可以让所得的转基因有蹄动物(i)与在内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸的一个或两个等位基因中有突变的转基因有蹄动物交配，或者(ii)与含有外源J链核酸(例如人J链)的转基因有蹄动物交配。或者，可以通过使一种或多种内源免疫球蛋白基因突变，对得自ΔHAC或ΔΔHAC转基因胎儿的细胞(例如胎儿成纤维细胞)进行遗传修饰。在另一种可能的方法中，将ΔHAC或ΔΔHAC导入到其中内源免疫球蛋白(μ重链和/或λ轻链)被半合失活或纯合失活的细胞(例如胎儿成纤维细胞)中。在任一上述方法中，也可以通过(i)将突变(优选敲除突变)导入内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸的一个或两个等位基因中，或者(ii)导入内源J链核酸，对所述细胞进行遗传修饰。然后，可以将所得的转基因细胞用于核转移方法中，以产生所需的转基因有蹄动物。以下描述示例性的方法。
DNA构建体  可以使用以上所述的μ重链(图2A)、λ轻链、κ轻链、α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链敲除构建体。另一方面，可以使用以下所述的嘌呤霉素抗性μ重链构建体(图3F)。这种敲除构建体设计用以除去牛μ重链基因座的4个主要编码外显子，而留下完整的跨膜结构域，导致所述μ重链基因座失活。
嘌呤霉素抗性构建体如下组装。将含有紧邻编码外显子1的区的4.4千碱基XhoI片段插入到pBluescript II SK+的XhoI位点。含有嘌呤霉素抗性基因的质粒pPGKPuro得自Peter W.Laird博士，Whitehead Institute，USA。将含有嘌呤霉素抗性基因的1.7Kb XhoI片段邻近插入到多接头区中存在的SalI位点中的所述4.4Kb片段亚克隆，或者在其下游亚克隆。这一1.7Kb嘌呤霉素标记取代了牛免疫球蛋白重链基因座的编码外显子CH1、CH2、CH3和CH4。将含有位于野生型基因组序列中这四个外显子下游的μ基因座的4.6Kb区的XbaI片段，加入到该构建体中，用作第二同源区。
为了产生最终的导向构建体，通过用NotI和MluI切割这三种组装好的片段，产生该构建体的亚克隆。MluI限制性消化将所述4.6Kb片段截短至1.4Kb。NotI位点位于多接头中，并且不可切割成为亚克隆DNA本身。MluI位点用Klenow片段补平，产生平端，然后利用pBluescript II SK+载体中存在的NotI和SmaI位点，将NotI/补平MluI片段亚克隆到新的所述pBluescript载体中。为了进行基因导向，最终的载体用NotI线性化。
通过电穿孔进行基因导向和转染成纤维细胞的药物选择  对于电穿孔，将经历了有限次数群体倍增的1×107牛胎儿成纤维细胞(例如按照实施例2所述从ΔHAC或ΔΔHAC转基因胎儿获得的成纤维细胞)的单细胞悬浮液以1200rpm离心5分钟，然后重悬于0.8ml无血清α-MEM培养基中。将重悬浮的细胞移至0.4cm电穿孔样品池(Invitrogen，cat#.P460-50)中。接着，加入30μg限制性酶线性化的基因导向载体DNA，用1ml移液管将样品池中的内容物混合，然后进行一个室温下2分钟的孵育步骤。将样品池插入Gene Pulser II电穿孔系统(Biorad)的振荡(shocking)室中，然后以1000伏特和50μF进行电穿孔。迅速将样品池转移到组织培养橱中，用吸管将电穿孔细胞加入到大约30ml成纤维细胞完全培养基中。将细胞同等地分配到30个100mm组织培养皿(Corning，cat#.431079)中，温和旋转，以使细胞均匀分布，然后于38.5℃/5％ CO2下孵育16-24小时。吸出培养基，更换为含有所选的选择药物的成纤维细胞完全培养基。培养基每两天进行更换，持续总共7-14天。在所述药物选择过程中，目测监测代表性板，以检查细胞死亡和集落形成。设定阴性对照板，阴性对照板含有在无基因导向载体时电穿孔的成纤维细胞，在所述药物选择过程中应该不产生集落。
抗药性成纤维细胞集落的挑出和细胞的扩增  在完成药物选择步骤(通常7-14天)之后，抗药性集落用肉眼可见，随时可供转移到48孔组织培养板中以进行扩增。为了有助于转移过程，在用彩色标记笔(Sharpie)在组织培养板底部圈出各个集落。含有集落的组织培养板用1×D-PBS(无Ca2+和Mg2+)洗涤2次，然后每个板加入5ml细胞解离缓冲液的1∶5稀释液。在室温3-5分钟的孵育步骤之后，单集落开始与组织培养皿底部分离。在集落分离之前，用P200自动移液器和气溶胶阻挡吸头(aerosol barrier pipette tip)(200或250μl)，将它们分别转移到48孔组织培养板的一个孔中。转移后，用吸管反复吹吸，使集落完全解离，然后加入1ml成纤维细胞完全培养基。为了确保所述细胞是抗药性的，在整个所述48孔期继续进行药物选择。转移的集落在38.5℃/5％CO2下培养，并且用倒置显微镜目测监视。2-7天后，达到汇合的孔用1×D-PBS(无Ca2+和Mg2+)洗涤2次，通过加入0.2ml细胞解离缓冲液，后接一个于室温孵育5分钟的步骤，使其与孔底部分离。在解离后，通过用P1000自动移液器和气溶胶吸头(1000μl)反复吹吸使细胞进一步解离。将大约75％的解离成纤维细胞转移到24孔组织培养板的各孔中进行进一步扩增，以供后续的PCR分析用，将剩余的25％转移到第二个24孔板的一个孔中进行扩增，并且最终用于体细胞核转移实验。当在含有75％原始细胞的板中的细胞增殖至接近汇合时，从该克隆分离DNA进行遗传分析。
DNA制备  用来分离供遗传分析用的DNA的方法是Laird等，Nucleic Acids Research，1991，Volume 19，No.15的方法的改进方法。特别是，一旦特定克隆在24孔板的一个孔中已经达到接近汇合，则从该孔中吸出培养基，贴壁细胞用PBS洗涤2次。吸出PBS，更换为0.2ml缓冲液，以裂解所述细胞和从待分离DNA消化过量蛋白。该缓冲液的组成为：100mM Tris-HCl(pH 8.5)、5mM EDTA、0.2％SDS、200mM NaCl和100μg/ml蛋白酶K。将24孔板放回组织培养箱中达最少3小时，从而让所述DNA释放和蛋白消化。将该操作的粘性产物转移到1.5ml微量离心管中，加入0.2ml异丙醇以沉淀DNA。通过离心回收沉淀，DNA沉淀用70％乙醇漂洗，风干后，将沉淀重悬于含有10mM Tris，pH8和1mM EDTA的25-50μl缓冲液中。该DNA用于克隆的PCR分析。
克隆的筛选  用两种不同的方法筛选克隆，两种方法都使用聚合酶链式反应(PCR)。该小节中所述的所有方法可适用于任何其它基因的导向，不同之处仅为遗传分析所用引物的序列。
按照第一种方法，用不同的两对引物，独立扩增稳定转染的产物。用一对引物来检测克隆基因组中导向载体的存在，而与整合位点无关。所述引物设计用以全都退火至导向载体中存在的DNA序列上。该PCR反应的PCR产物的强度可能与已经整合到基因组中的导向载体的拷贝数相关。因此，仅含有一个拷贝导向载体的细胞通过所述PCR反应往往产生强度较弱的条带。另一对引物设计用以仅检测整合到所需基因座中的载体的拷贝。在这种情况下，一种引物设计退火到导向载体内，而另一种引物设计用以退火至在导向载体中不存在的、对靶基因座特异性的序列上。在这种情况下，只有当导向载体紧邻导向载体中不存在的所述位点整合时，才可检测到PCR产物，指示所需的导向事件。如果检测到产物，则用所述克隆进行核转移。
对于新霉素抗性重链敲除构建体，使用引物Neol(5′-CTT GAA GACGAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3′，SEQ ID NO：42)和IN2521(5′-CTGAGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3′，SEQ ID NO：43)来检测细胞中导向载体的存在，而与整合位置无关。使用引物Neol和OUT3570(5′-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAA GTC TGT C-3′，SEQID NO：44)来特异性地仅扩增整合到μ重链基因座的导向构建体的那些拷贝。
对于用来分析所述新霉素抗性重链敲除构建体整合的这些PCR反应，使用Qiagen PCR试剂盒。所述PCR反应混合物含有每种引物各1pmole、5μl 10×反应缓冲液、10μl Q溶液、5μl DNA和1μl ofdNTP溶液。用水使反应混合物的总体积达到50μl。使用最初于94℃变性孵育2分钟，进行该PCR扩增。然后通过于94℃孵育45秒、60℃孵育45秒和72℃孵育2分钟，进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物于72℃孵育5分钟，然后于4℃温育直至从PCR仪中取出混合物。
在替代的方法中，用一个引物组来扩增靶基因座，并且所述PCR产物的大小是正确导向的鉴别特征。一种引物设计退火到导向载体中不存在的所述基因座的一个区上，而另一种引物设计退火至导向载体中存在、但在野生型基因座中也存在的位点上。在这种情况下，不能检测到已经在基因组中不想要的位点整合的导向载体。因为导向载体所缺失的区域在大小上与其位置中插入的药物选择标记不同，所以所述产物的大小取决于所扩增的基因座是野生型基因型还是靶基因型。含不正确插入的导向载体或者根本没有插入导向载体的克隆的DNA的扩增，产生预期大小的、野生型基因座的一种PCR产物。得自含被正确导向的(“敲除的”)等位基因的克隆的DNA的扩增，产生两种PCR产物，一种代表野生型等位基因的扩增，一种代表由于抗药性标记取代野生型等位基因中某些序列所致的、其长度不同于所取代序列的、被改变的大小可预测的等位基因的扩增。
对于嘌呤霉素抗性重链敲除构建体，使用引物Shortend(5′-CTGAGC CAA GCA GTG GCC CCG AG-3′，SEQ ID NO：45)和Longend(5′-GGGCTG AGA CTG GGT GAA CAG AAG GG-3′，SEQ ID NO：46)。这对引物既扩增野生型重链基因座，又扩增已经被所述嘌呤霉素构建体正确导向的基因座。这两条带的大小之差为0.7Kb。存在较短的条带指示正确导向。
对于用以分析嘌呤霉素抗性重链敲除构建体整合的这种PCR反应，使用Promega Master Mix试剂盒。所述PCR反应混合物含有每种引物各1pmole、2.5μl DNA和25μl 2×Promega Master Mix。用水使反应混合物的总体积达到50μl。使用最初于94℃变性孵育2分钟，进行该PCR扩增。然后通过于94℃孵育45秒、60℃孵育45秒和72℃孵育2分钟，进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物于72℃孵育5分钟，然后于4℃温育直至从PCR仪中取出混合物。
第一轮核转移  使用其中一个免疫球蛋白基因已被灭活的经过选择的成纤维细胞，按照实施例1中所述进行核转移，产生在内源免疫球蛋白基因中有突变并且含有编码异种免疫球蛋白基因的HAC的转基因有蹄动物。另一方面，可以使用标准方法进行核转移，从而将得自经选择的转基因成纤维细胞的细胞核或染色质(即无膜包围的一个或多个染色体)插入到去核卵母细胞中(U.S.S.N.60,258,151；于2000年12月22日提交)。这些方法也可以用于其中内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸已被突变的细胞。
第二轮诱变和核转移  如有需要，可以由从第一轮核转移产生的转基因有蹄动物获得细胞(例如胎儿成纤维细胞)。可以如上所述再进行一轮基因导向，以灭活在第一轮导向中被灭活基因的第二个等位基因。或者，可以在该轮导向中，使另一免疫球蛋白(例如μ重链、λ轻链、κ轻链或J链)、α-(1，3)-半乳糖基转移酶或朊病毒基因失活。对于这第二轮导向，或者可以使用更高浓度的抗生素，或者可以使用具有不同抗生素抗性标记的敲除构建体。抗生素抗性细胞可以如上所述进行选择。经选择的细胞可以如上所述用于第二轮核转移，以产生例如在内源免疫球蛋白基因中含有两个突变并且含有编码异种免疫球蛋白基因的HAC的转基因有蹄动物。另一方面，可以首先处理经选择的抗生素抗性细胞，以便如下所述分离G1期细胞，将其用于第二轮核转移。
为了分离用于核转移的G1细胞，在分离之前24小时，将5.0×105细胞接种到含有10ml α-MEM+FCS的100mm组织培养平板上。第二天，平板用PBS洗涤，在分离前更换培养基达1-2小时。将平板在Vortex-Genie 2(Fisher Scientific，Houston，TX，中速)上振摇30-60秒，取出培养基，以1000G离心5分钟，将沉淀重悬于250μlMEM+FCS中。然后选择以胞质桥连接的新分裂的细胞双联体，因为这些细胞处于G1早期。这种分离方法称为“摇出(shake off)”法。
实施例14：用于使内源免疫球蛋白基因突变的方法
在本方法的一些实施方案中，异种免疫球蛋白的生产基本上通过联合应用同源重组技术和携带完整异种Ig基因座的人工染色体的导入、核转移和施用去除内源抗体的抗体来实现。更具体地讲，所述方法优选包括定向破坏所述IgM重链基因中的一个或两个等位基因，并且任选地定向破坏所述Ig轻链基因中的一个或两个等位基因，虽然异种抗体的生产也可以在野生型动物(即无Ig敲除的动物)中实现。基因敲除可以通过连续同源重组、然后通过另一个交配步骤来实现。在一个优选实施方案中，这通过最初用合适的同源重组载体实现定向破坏组织培养物中雄性或雌性有蹄动物(例如牛)胎儿成纤维细胞的IgM重链基因的一个等位基因来实现。胎儿成纤维细胞的应用优于某些其它体细胞，因为这些细胞容易在组织培养物中繁殖和遗传操作。然而，胎儿成纤维细胞的应用并不是本发明所必需的，实际上可以用其它细胞系替代，并且获得等同的结果。
当然，这一方法需要构建具有与靶IgM重链等位基因具有同源性的区的DNA构建体，使得所述构建体在整合到所述有蹄动物基因组的IgM重链等位基因中破坏所述等位基因的表达。用于实现IgM等位基因的这种定向破坏的一种示例性载体在以下实施例中有描述。在这一方面，保证在靶位点同源重组的载体的构建方法是本领域技术人员众所周知的。此外，在这种情况下，合适载体的构建在本领域的技术范围内，尤其是已知牛IgM重链和Igλ轻链基因的序列、也已知得自其它有蹄动物的免疫球蛋白基因的序列(参见下文)的条件下。为了便于同源重组，用以实现同源重组和所述IgM基因失活的载体分别包含表现出与所述有蹄动物IgM重链和Ig轻链基因有显著序列同一性的DNA部分。这些序列优选具有至少98％的序列同一性，更优选至少99％的序列同一性，再更优选这些序列与靶基因座等基因，以有助于同源重组以及定向缺失或失活。
通常并且优选所述构建体将包含一个标记基因，所述标记基因保证选择出其中所述IgM重链基因和/或Ig轻链基因已被有效破坏的所需同源重组子，例如成纤维细胞。示例性标记基因其中包括抗生素抗性标记、抗药性标记和绿色荧光蛋白。一种优选的构建体示于图2A，用来制备该构建体的起始材料示于图3A和3B。用标准分子生物学技术可以产生含有与内源免疫球蛋白基因同源的两个区的其它构建体，所述同源区邻接与启动子可操作性连接的阳性选择标记(例如抗生素抗性基因)，并且将所述构建体用于本发明的方法中。
图2A和3C中所示的μ敲除构建体，设计用以除去编码牛免疫球蛋白重链恒定区的外显子(命名为“C-μ外显子1-4”)和编码跨膜结构域的两个外显子(命名为“TM外显子”)。
为了构建这种载体，将来自基因组μ重链牛序列的名为“1”的区-Xba1-Xho1片段，亚克隆到预先用酶XbaI和XhoI切割的商业DNA载体pBluescript(Stratagene，LaJolla，California)中。一旦克隆了该片段，则邻近Xba I位点有一个NotI限制性酶识别序列，用该序列插入一个约3.5Kb的NotI片段。这一片段含有新霉素抗性标记，在下文有进一步的描述。需要时，可以用得自另一有蹄动物品种、物种或属的基因组μ重链序列(例如得自Swiss Bull/Holstein杂种、Genbank登录号U63637的μ重链序列)，来构建其它μ敲除构建体。
将片段“1”和新霉素抗性标记一起连接到pBluescript中后，SacI位点保持邻近新霉素抗性标记。用SacI将所述新构建体线性化，通过用DNA聚合酶补平SacI消化留下的粘性末端将其转变为平端。
分离作为XhoI-BstI1071片段的名为“2”的片段，通过用DNA聚合酶补平XhoI和BstI1071酶留下的粘性末端将其转变为平端片段。
一旦完成所述构建，则最终的构建体分别含有区2、新霉素抗性标记和区1。
关于牛成纤维细胞的转染，所述构建体用限制性酶KpnI(在该图中显示了两个KpnI位点)消化，用所述DNA片段进行同源重组。
新霉素抗性构建体如下组装。名为“pSTneoB”的构建体(Katoh等，Cell Struct.Funct.12：575，1987；日本研究生物制品保藏中心(Japanese Collection of Research Biologicals)(JCRB)保藏号：VE039)设计含有处于编码区上游的SV40启动子和TK增强子控制之下的新霉素抗性基因。所述编码区下游是SV40终止序列。将neo盒作为XhoI片段从“pSTneoB”切下。在使用标准分子生物学技术将该片段的末端转变为平端后，将平端片段克隆到载体pBS246(Gibco/Life Technologies)的EcoRV位点中。该位点邻接loxP位点。用命名为“pLoxP-STNeoR”的新构建体来产生所述μ敲除DNA构建体。该构建体的所需片段邻接pBS246克隆载体中原有的loxP位点和NotI位点。用含有loxP-neo-loxP的所需NotI片段来取代所述免疫球蛋白μ恒定区外显子。与新霉素抗性基因可操作性连接的SV40启动子活化新霉素抗性基因的转录，使得其中所需NotI片段已经取代了所述μ恒定区外显子的细胞根据其所产生的抗生素抗性而被选择出来。
在获得其中IgM重链等位基因已被有效破坏的细胞系后，将其用作核转移供体，来产生克隆有蹄动物胎儿(例如克隆牛胎儿)，并且最终产生其中一个IgM重链等位基因被破坏的胎儿或动物。此后，可以用从中得到的体细胞，例如成纤维细胞，实现第二轮的基因定向破坏，以便使用相似但含有一种不同选择标记的载体，产生其中第二IgM重链等位基因被灭活的细胞。
优选地，在所述第一定向基因破坏的同时，也对第二有蹄动物(例如牛)体细胞系进行遗传修饰，所述细胞系同样可以来源于雄性或雌性。如果操作的第一细胞系是雄性的，则优选修饰雌性细胞系；反之，如果操作的第一细胞系是雌性的，则优选选择雄性细胞系。再者，所操作的细胞优选包含有蹄动物(例如牛)胎儿成纤维细胞。
在一个优选实施方案中，对所述雌性胎儿成纤维细胞进行遗传修饰，以便引入Igλ轻链基因中一个等位基因的定向破坏。这一方法同样采用具有与所述有蹄动物(例如牛)Igλ轻链同源的区以及选择标记的载体来进行，设计所述DNA构建体，使得在整合和与所述内源Ig轻链同源重组时，导致靶Igλ轻链基因的破坏(灭活)。
一旦选择出具有所需定向破坏的雌性成纤维细胞系，则同样将其用作核转移的供体细胞，或者将得自这类细胞系的DNA用作核转移的供体。
另一方面，这种细胞可以经过第二轮同源重组，从而用与破坏第一等位基因相似但含有不同选择标记的DNA构建体来失活所述第二Igλ轻链。
正如在发明背景中所论述的，用于实现核转移、特别是用于产生克隆牛和克隆转基因牛的方法已有报道，描述于授予Stice等并且转让给University of Massachusetts的美国专利5995577。再者，另一方面，可以使用在WO 95/16670；WO 96/07732；WO 97/0669；或WO 97/0668中公开的核转移技术(统称Roslin法)。Roslin法不同于University of Massachusetts的技术，因为它们使用静息供体细胞，而不是增殖中的供体细胞。所有这些专利通过引用全部结合到本文中。这些核转移方法将产生转基因克隆胎儿，所述胎儿可以用来产生克隆转基因牛后代，例如包含Ig轻链基因和/或IgM基因的至少一个等位基因定向破坏的后代。在创建了这样的细胞系后，可以用它们来产生雄性和雌性重链和轻链半合型敲除(M和F Hemi H/L)胎儿和后代。此外，这些技术并不限于用来产生转基因牛；上述技术也可以用于其它有蹄动物的核转移。
在核转移之后，或者通过让所述有蹄动物交配，或者通过使用先前描述的同源导向载体进行第二次基因导向，可以实现所需动物的产生。
如前所述，本发明的再一目的涉及创建雄性和雌性重链和轻链半合型敲除者，其中这类半合型敲除者使用已经描述的细胞系来产生。通过让按照上述方法产生的后代交配，其中让包含所述IgM重链基因的已破坏等位基因的后代与包含所述Ig轻链的已破坏等位基因的另一后代交配，可以实现这一点。或者，通过操作从按照上述方法产生的后代获得的细胞进行第二次基因导向，可以实现这一点。这将包括通过同源重组定向破坏IgM重链基因的等位基因或所述Ig轻链的等位基因的实现。在产生包含雄性和雌性重链和轻链半合型敲除(M和F HemiH/L)的细胞系后，用所述细胞系产生包含这样一种敲除的胎儿或牛崽。如上所述，这或者通过交配或者通过第二次基因导向来实现。
一旦获得雄性和雌性重链和轻链半合型敲除者，则可以用得自这些动物的细胞来创建纯合敲除(Homo H/L)胎儿。这又或者通过顺序基因导向或者通过交配来实现。从本质上讲，如果通过交配来实现，则这将包括让雄性重链和轻链半合型敲除者与雌性重链和轻链半合型敲除者交配，并且选择包含纯合敲除的后代。另一方面，可以在组织培养物中对得自上述半合型敲除者的细胞进行操作，以便敲除所述IgM或Ig轻链(λ链)基因的另一等位基因。优选进行第二次基因导向，而不是交配，因为这可以获得更为快速的结果，尤其是在有蹄动物例如牛的妊娠期相对长的条件下。
产生表达人Ig的转基因有蹄动物的敲除法
如上所述，本发明涉及Homo H/L胎儿或牛崽的产生。该方法概述于图1。其中概述了三个流程。第一个流程依靠再生的胎儿细胞系中的连续敲除。该方法在技术上最难，且危险水平最高，但是如上所述，潜在地比育种法更快地得到结果。其它两个流程依靠将动物育种。在第二个流程中，在雄性和雌性细胞系中仅分别需要重链基因和轻链基因的一次敲除。这一流程不依靠细胞系的再生，是最简单的技术，但需要最长的时间来完成。流程3介于流程1和流程2之间。在所有流程中，仅产生Homo H/L胎儿，因为在Homo H/L敲除牛崽的生存和维持方面有潜在的困难。如有必要，可以用被动免疫疗法来提高Homo H/L敲除牛崽的存活率。
实验设计  本发明优选涉及雄性半合重链敲除者(M Hemi H)和半合子雌性轻链敲除者(F Hemi L)的产生、以及由这些定向缺失产生40天的胎儿。收获得自所述胚胎的细胞，在M Hemi H细胞中所述轻链基因座中的一个等位基因被导向，而在F Hemi L细胞中所述重链基因座中的一个等位基因被导向，产生在H和L基因座中都有半合子缺失的细胞(Hemi H/L)。用这些细胞来得到40天的胎儿，从所述胎儿分离成纤维细胞。
用其它H链等位基因对M Hemi H/L成纤维细胞导向，以创建M HomoH/Hemi L，而用其它L链等位基因对F Hemi H/L导向，以创建F HomoL/Hemi H。为了创建纯合缺失，使用较高的药物浓度来驱动纯合导向。然而，有可能这种方法不会成功，并且育种可能是必不可少的。一种依靠选择盒的cre/lox导向的示例性策略，使得可以将相同的选择性系统用于不止一个靶缺失。克隆这些成纤维细胞，收获40天的胎儿，然后分离成纤维细胞。对得自这种克隆的胎儿细胞导向，产生或者H基因座或者L基因座的纯合缺失，产生M Homo H/L和F Homo H/L胎儿成纤维细胞。克隆这些成纤维细胞，得到40天的胎儿，然后分离成纤维细胞。然后用Homo H/L胎儿成纤维细胞，任选地利用育种法来掺入所述HAC。
文库构建  用胎儿成纤维细胞构建基因组文库。尽管已报道重要的是导向构建体与用于克隆的细胞等基因，但它对于本发明而言并非是必需的。例如，可以用等基因、基本等基因或非等基因构建体来产生内源免疫球蛋白基因中的突变。在一个可能的方法中，使用与其它牛群相比遗传上有高水平近交的Holstein牛。我们在不同动物中没有检测到免疫球蛋白基因的任何多态性。这提示，序列同源性应该高，并且用非等基因构建体导向应该能成功。
由一个雄性细胞系和一个雌性细胞系构建文库，同时进行“可克隆性”检验。设想了在该方法结束时，将产生一个文库，并且将检验众多不同的胎儿细胞系，选择一个细胞系作为供克隆用的最佳细胞系。用从所述胎儿成纤维细胞分离的高分子量DNA构建基因组文库。将DNA进行大小分级分离，将20-23Kb的高分子量DNA插入到λ噬菌体载体λZap或λFix中。本发明人用Stratagene制备的文库取出了很大成功。因此，分离DNA，将经大小选择的DNA送至Stratagene用于文库制备。为了分离含有牛重链和轻链的克隆，使用放射性标记IgMcDNA和放射性标记轻链cDNA。另外，在必需缺失轻链基因座时，分离轻链基因组克隆。对每个胎细胞文库筛选含有牛重链和轻链的克隆。考虑了筛选大约105-106噬斑应该导致分离出含有或者重链或者轻链基因座的克隆。一旦分离出，则将两个基因座亚克隆到pBluescript中，制作限制性图谱。Holstein牛中这些基因座的限制性图谱于图2B中提供(Knight等J Immunol 140(10)：3654-9，1988)。另外，制作得自所获克隆的图谱，用来组装所述导向构建体。
导向构建体的产生  一旦分离出重链和轻链基因，则制备构建体。通过缺失IgM恒定区膜结构域，制备IgM构建体。正如Rajewsky及其同事用小鼠所表明的，IgM膜结构域的缺失导致B细胞发育的阻断，因为表面IgM是B细胞继续发育所需的信号(Kitamura等，Nature350：423-6)。因此，纯合IgM牛缺乏B细胞。这不应该成为问题，因为在本发明的策略中，缺乏功能性Ig的动物活着出生并非必需。然而，如有必要，可以用被动免疫疗法来改进动物的存活率，直至导入人Ig基因座的最后一个步骤。
用以实现IgM重链等位基因敲除的一种示例性导向构建体示于以下图2A中。对于重链，所述膜IgM结构域用邻接lox P位点的新霉素盒取代。将所连接的膜结构域与新霉素盒剪接在一起，使得所述膜结构域具有一个紧接lox P位点5’插入的TAG终止密码子，从而确保所述膜结构域被灭活。将其与大约5-6千碱基3’染色体DNA一起置于所述导向构建体的5’端。
如果提高药物浓度并未达到或者IgM重链或者轻链的第二等位基因缺失，则使用cre/lox系统(在Sauer，1998，Methods 14：381-392中有综述)来缺失所述选择标记。如下所述，cre/lox系统允许定向缺失所述选择标记。使所有选择标记邻接loxP序列，以便于必要时缺失这些标记。
轻链构建体含有牛λ链恒定区(例如在Genbank登录号AF396698中发现的λ轻链恒定区或任何其它有蹄动物λ轻链恒定区)和邻接lox P位点的嘌呤霉素抗性基因盒，并且将用邻接lox P位点的嘌呤霉素盒取代所述牛基因。λ恒定区基因3’的约5-6千碱基DNA将被嘌呤霉素抗性基因3’的DNA取代。所述嘌呤霉素抗性基因将在5’端和3’端都带有lox P位点，以便于必要时进行缺失。由于在有蹄动物抗体基因之间有高度的同源性，故此预计在Genbank登录号AF396698中的牛λ轻链序列将与得自种类繁多的有蹄动物的基因组λ轻链序列杂交，因而可以用于标准方法中，以分离各种有蹄动物λ轻链基因组序列。这些基因组序列可以用于标准方法例如本文所述的方法中，来产生用以灭活任何有蹄动物中的内源λ轻链的敲除构建体。
κ轻链敲除构建体可以同样使用图3G中的牛κ轻链序列或任何其它的有蹄动物κ轻链序列来构建。这种牛κ轻链可以用作杂交探针，来从各种各样的有蹄动物中分离基因组κ轻链序列。这些基因组序列可以用于标准方法例如本文所述的方法中，来产生用以灭活任何有蹄动物中内源κ轻链的敲除构建体。
可以任选地使另外的有蹄动物基因突变或灭活。例如，可以敲除有蹄动物内源Ig J链基因，从而防止给予人类的本发明抗体中所述有蹄动物Ig J链的潜在抗原性。为了构建所述导向载体，可以使用在Genbank登录号U02301中发现的牛Ig J链区的cDNA序列。这一cDNA序列可以用作探针，来从BAC文库例如RPC1-42(BACPAC in Oakland，CA)分离牛Ig J链的基因组序列，或者从任何其它有蹄动物中分离所述J链的基因组序列。另外，可以将人J链编码序列导入本发明的有蹄动物中，以进行人IgA和IgM分子的功能性表达。人J链的cDNA序列可从Genbank登录号AH002836、M12759和M12378中获得。可以用标准方法，例如本文所述的方法，将这种序列插入到有蹄动物胎儿成纤维细胞中。例如，可以将HAC、YAC载体、BAC载体、粘粒载体或敲入构建体中的人J链核酸整合到有蹄动物内源染色体中，或者独立于有蹄动物内源染色体而保持。所得的转基因有蹄动物细胞可以用于本文所述的核转移法中，以产生具有减少或去除有蹄动物功能性J链表达的突变并且含有表达人J链的异种核酸的所需有蹄动物。
另外，可以使有蹄动物α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因突变，以减少或去除由α-(1，3)-半乳糖基转移酶产生的半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表达。如果本发明的有蹄动物所产生的人抗体被这种糖表位修饰，则这些糖基化抗体在作为治疗药给予人类时，被接受者体内与所述糖表位反应的抗体灭活或去除。为了去除这种对所述糖表位的可能的免疫应答，可以用牛α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因的序列来设计用以灭活有蹄动物中该基因的敲除构建体(Genbank登录号J04989；Joziasse等，J.Biol.Chem.264(24)：14290-7，1989)。在美国专利6,153,428和5,821,117中公开的这种牛序列或者猪α-(1，3)-半乳糖基转移酶序列，可以用来从各种各样有蹄动物中获得基因组α-(1，3)-半乳糖基转移酶序列，以产生半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表达减少或去除的其它有蹄动物。
必要时，可以使有蹄动物朊病毒基因突变或灭活，从而降低诸如牛海绵状脑病(BSE)的感染的潜在危险。为了构建所述导向载体，可以使用牛朊病毒基因的基因组DNA序列(Genbank登录号AJ298878)。或者，可以用这种基因组朊病毒序列，从其它有蹄动物中分离基因组朊病毒序列。可以使用标准方法，例如本文所述的方法或者提示用于敲除绵羊α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因或者朊病毒基因的方法(Denning等，Nature Biothech.，19：559-562，2001)，使朊病毒基因灭活。
为了对每个基因座的第二等位基因导向，如果第一选择标记留在所述细胞中，则可能必需组装含有不同选择标记的一种新的导向构建体。如表12所述，可获得各种各样的选择策略，将其进行比较，选择出合适的选择系统。最初，通过提高药物浓度(例如使药物浓度加倍)，靶向第二等位基因。如果不成功，则可以使用一种新的导向构建体。
可以采用各种方法，将上述其它的突变或基因灭活掺入到本发明的有蹄动物中。一旦对于每个所需突变产生了转基因有蹄动物细胞系，则可以使用杂交育种，将这些另外的突变掺入到本发明的有蹄动物中。或者，具有这些另外的突变的胎儿成纤维细胞可以用作起始材料，来敲除内源Ig基因和/或导入异种Ig基因。此外，在内源Ig基因中具有一个敲除突变和/或含有异种Ig基因的胎儿成纤维细胞，可以用作这些另外的突变或灭活的起始材料。
Ig基因座的定向缺失例如通过电穿孔，将导向构建体导入胚胎儿成纤维细胞中。利用合适的抗生素，选择掺入了所述导向载体的细胞。将根据生长选择出抗所选药物的克隆。然后这些克隆用更昔洛韦进行阴性选择，这将选择出已经适当整合的那些克隆。或者，通过PCR选择经得住所述药物选择的克隆。估计必需筛选至少500-1000个克隆，以便发现被适当导向的克隆。本发明人的估计基于Kitamura(Kitamura等，Nature 350：423-6，1991)的论文，Kitamura发现，当对IgM重链恒定区的膜结构域导向时，大约1/300的neo抗性克隆被正确导向。因此，建议在96孔板中，以10个克隆一组将克隆混合，并且对10个克隆的库筛选所选择的被导向的克隆。一旦鉴定出阳性克隆，则对从混合克隆分离出的单个克隆进行筛选。这种策略应该能够鉴定出被导向的克隆。
因为成纤维细胞在培养物中迁移，所以当每个培养皿有超过大约10个克隆时，难以鉴别单个克隆。此外，可以开发用于以高效转染克隆繁殖的策略。可以使用几种合理的策略，例如稀释克隆法。
抗药性标记的Cre/Lox切除  如上所述，示例性导向构建体含有邻接loxP位点的选择标记，以便于用cre/lox系统有效地缺失所述标记。通过电穿孔，用含Cre的质粒转染带有所述导向载体的胎儿成纤维细胞。可以使用最近描述的含有GFPcre融合基因的Cre质粒[Gagneten S.等，Nucleic Acids Res 25：3326-31(1997)]。这使得可以快速选择含有Cre蛋白的所有克隆。或者通过FACS分选，或者通过经显微操作人工收获发绿色荧光的细胞，选择这些细胞。预计绿色的细胞携带活性转录的Cre重组酶，因此缺失抗药性标记。将根据Cre表达选择的细胞克隆，并且通过PCR分析，分析克隆的抗药性标记的缺失情况。让经测定经历了切除的那些细胞生长为小克隆，将其分瓶，并且在选择培养基中检验一个等份样品，从而肯定地确定抗药性基因已经缺失。用其它等份样品进行下一轮的定向缺失。
        表12：选择标记和供选择用的药物
    基因                        药物
    Neor                       G4181
    Hph                         潮霉素B2
    Puro                        噪呤霉素3
    Ecogpt                      霉酚酸4
    Bsr                         杀稻瘟素S5
    HisD                        组氨醇6
    DT-A                        白喉毒素7
1Southern PJ，Berg P.1982.Transformation of mammaliancells to antibiotic resistance with a bacterial gene undercontrol of the SV40 early region promoter(用SV40早期区启动子控制下的细菌基因将哺乳动物细胞转化为抗生素抗性).J MolAppI Genet 1：327-41。
2Santerre RF，Allen NE，Hobbs JN Jr，Rao RN，Schmidt RJ.1984.Expression of prokaryotic genes for hygromycin B andG418 resistance as dominant-selection markers in mouse Lceils(作为显性选择标记的潮霉素B和G418抗性的原核基因在小鼠L细胞中的表达).Gene 30：147-56。
3Wirth M，Bode J，Zettlmeissl G，Hauser H.1988.Isolationof overproducing recombinant mammaliancell lines by a fast andsimple selection procedure(通过一种快速而简单的选择法分离过量生产的重组哺乳动物细胞系).Gene 73：419-26。
4Drews RE，Kolker MT，Sachar DS，Moran GP，Schnipper LE.1996.Passage to nonselective media transiently alters growthof mycophenolic acid-resistant mammalian cells expressing theescherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferasegene：implications for sequential selection strategies(在非选择培养基上传代瞬时改变了表达大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的霉酚酸抗性哺乳动物细胞的生长：顺序选择策略的意义).Anal Biochem 235：215-26。
5Karreman C.1998.New positive/negative selectablemarkers for mammalian cells on the basis of Blasticidindeaminase-thymidine kinase fusions(基于杀稻瘟素脱氨酶-胸苷激酶融合的供哺乳动物细胞用的新型正/阴性选择标记).NucleicAcids Res 26：2508-10。
6Hartman SC，Mulligan RG. 1988.Two dominant-actingselectable markers for gene transfer studies in mammaliancells(在哺乳动物细胞中基因转移研究用的两种显性开放选择标记).Proc Natl Acad Sci USA 85：8047-51。
7Yagi T，Nada S.，Watanabe N，Tamemoto H，Kohmura N，IkawaY，Aizawa S.1993.A novel negative selection for homologousrecombinants using diphtheria toxin A fragment gene(一种使用白喉毒素A片段基因的同源重组子的新型阴性选择).Anal Biochem214：77-86。
应用导向策略改变其它有蹄动物的免疫球蛋白基因
为了改变其它有蹄动物的免疫球蛋白基因，设计导向载体，使其含有三个主要区域。第一区与靶基因座同源。第二区为特异性取代靶基因座的一部分的药物选择标记。第三区同第一区一样，与靶基因座同源，但是不与野生型基因组中的第一区相邻。导向载体与所需野生型基因座之间的同源重组，导致导向载体中提供的两个同源区之间的基因座序列缺失并且该序列被抗药性标记所取代。在优选实施方案中，这两个同源区的总大小大约为6千碱基，取代靶基因座一部分的第二区的大小约为2千碱基。这种导向策略可广泛地用于从原核细胞至人细胞的种类繁多的物种。所用的每种载体的唯一性在基因导向法所选择的基因座和该策略中所使用的序列中。这一方法可用于所有有蹄动物，包括但不限于山羊(Capra hircus)、绵羊(Ovis aries)和猪(Sus scrufa)以及牛(Bos taurus)。
应用电穿孔对有蹄动物细胞中的特定基因导向，也可以广泛用于有蹄动物。本文所述的通用方法适用于将靶突变引入其它有蹄动物的基因组中。电穿孔条件(电压和电容)的改进条件可以用来对从其它有蹄动物获得的转染子数目进行优化。
另外，在此用来对牛中重链基因座导向(即使用含与紧接被除去外显子侧翼区同源的区的载体除去所有编码外显子和间插序列)的策略在其它有蹄动物也可以同样好地应用。例如，已经对绵羊(Ovisaries)的免疫球蛋白重链基因座进行了广泛的序列分析，所述绵羊基因座与牛基因座在结构和序列方面非常相似(Genbank登录号Z71572、Z49180-Z49188、M60441、M60440、AF172659-AF172703)。除了已报道的关于重排的Ovis aries免疫球蛋白链的大量cDNA序列之外，还报道了关于所述重链基因座、包括重链5’增强子(Genbank登录号Z98207)、3’μ转换区(Z98680)和5’μ转换区(Z98681)的基因组序列信息。绵羊分泌形式重链的完整mRNA序列已经以登录号X59994录入。这一录入的序列含有四个编码外显子的全序列，它们与相应的牛序列高度同源。
关于所述绵羊基因座的信息从Genbank获得，用来确定与牛序列高度同源的区域，以供设计用于PCR分析的引物。因为使用非等基因DNA对牛细胞导向，发现与绵羊序列高度同源的区用作牛品种之间序列可能相似保守的指标。已知牛和绵羊免疫球蛋白基因座的序列和结构之间有相似性，则可以预期，用以除去牛免疫球蛋白基因座的导向策略可以成功地应用于所述绵羊系统。另外，关于猪(Sus scrofa，登录号S42881)和山羊(Capra hircus，登录号AF140603)的现有信息表明，这两个物种的免疫球蛋白基因座也与所述牛基因座足够相似，因此可以利用本发明的导向策略。
实施例15：牛IgM敲除
除去μ重链基因座的外显子1-4
以下方法用来产生其中免疫球蛋白重链(μ)基因座的一个等位基因已经通过同源重组而被破坏的牛成纤维细胞系。通过除去μ基因座(对应于IgM重链基因)的外显子1-4，并用一个拷贝的新霉素抗性基因取代，产生用于实施IgM敲除的DNA构建体。使用这种构建体，获得了成功用于核转移法的新霉素抗性细胞系，并且将得自这些细胞系的胚泡植入到受体母牛中。另外，测试这些胚泡的一些胚泡，以便用PCR法证实在μ基因座中恰当地发生了定向插入。从所获得的几个细胞系通过核转移法产生的胚泡表明，在妊娠时为杂合IgM-KO胎儿。另外，已经产生了包含IgM重链(μ)单敲除的雄性和雌性细胞系。预期从这些细胞系克隆的动物的配种，将产生其中μ的两个拷贝都被灭活的后代。这些方法在下文有更为详细的论述。
DNA构建体  在本文件中所述的所有转染中所使用的DNA如下产生。四个主要的外显子(除了跨膜结构域外显子)-CH1-4下游(CH4)端的侧翼为一个XhoI限制位点，上游(CH1)端的侧翼为一个XbaI位点。供转染法用的构建体由XhoI位点下游的1.5kb基因组序列和XbaI位点上游的3.1Kb基因组序列组成(图3D和3E)。这些序列如本文所述从来自Massachusetts乳牛群的Holstein牛中分离。将一个位于3.5Kb片段上的新霉素抗性标记插入到这两个片段之间，取代原来含有CH1-4、得自原始基因组序列的2.4Kb DNA。所述载体的骨架为pBluescriptII SK+(Stratagene)，纯化8.1Kb的插入片段，用其转染牛胎儿成纤维细胞。该构建体示于图3A-3C。使用标准方法，也可以构建含有其它同源区和/或含有另一种抗生素抗性基因的其它μ敲除构建体，用来使内源μ重链基因突变。
转染/敲除方法  胎牛的转染用市售试剂  SuperfectTransfection Reagent(Qiagen，Valencia，CA，USA)，CatalogNumber 301305来进行。
牛成纤维细胞产自Hematech′s Kansas facility的经病害检验的雄性Charlais牛，并且送至Hematech′s Worcester MolecularBiology Labs，用于所述的所有实验。任何其它有蹄动物品种、属或物种都可以用作供体细胞(例如体细胞，如胎儿成纤维细胞)来源。对所述供体细胞进行遗传修饰，使其含有减少或去除功能性内源Ig表达的突变。
用于培养牛胎儿成纤维细胞的培养基由下述成分组成：500mlαMEM (Bio-Whittaker # 12-169F)；50ml胎牛血清(Hy-C1one#A-1111-D)；2ml抗生素/抗真菌剂(Gibco/BRL#15245-012)；1.4ml2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)；5.0ml L-谷氨酰胺(SigmaChemica1 #G-3126)；和0.5ml酒石酸酪氨酸(Sigma Chemica1#T-6134)。
在转染操作前一天，将细胞接种到60mm组织培养皿中，通过显微镜检查测定达到40-80％的目标汇合度。
转染当天，将总体积为150μl无血清无抗生素培养基中的5μgDNA与20μl Superfect转染试剂混合，让其于室温静置5-10分钟，以便形成DNA-Superfect复合物。当发生所述复合物形成时，从含有待转染的牛成纤维细胞的60mm组织培养皿中取出培养基，细胞用4ml磷酸缓冲盐溶液冲洗一次。将1ml生长培养基加入到170μlDNA/Superfect混合物中，立即将其转移到60mm培养皿中的细胞上。将细胞于38.5℃、50％二氧化碳下孵育2.5小时。在细胞与DNA/Superfect复合物一起孵育后，吸出培养基，细胞用4ml PBS洗涤4次。加入5ml完全培养基，将培养物于38.5℃、5％CO2下孵育过夜。然后细胞用PBS洗涤一次，然后与1ml含0.3％胰蛋白酶的PBS一起于37℃孵育，直至通过显微镜观察确定细胞与板分离。将得自每个60mm培养皿的细胞分装到24孔组织培养板的24个孔中(41.7μl/孔)。向各孔加入1ml组织培养基，让板于38.5℃和5％CO2下孵育24小时。
在所有转染操作期间，用不含DNA的Superfect/PBS混合物进行假转染，因为可以预期那些细胞中都不含新霉素抗性基因，并且可以预期所有细胞在将G418加入到组织培养基后都死亡。这用作接受DNA的细胞阳性选择的阴性对照。
孵育24小时后，再将1ml含有400μg G418的组织培养基加入到各孔中，使G418的终浓度为200μg/ml。将细胞放回到培养箱中，进行7天的G418选择。在此期间，监测转染板和假转染板的细胞死亡情况，并且在7天内，来自假转染的大多数孔含有很少或不含活细胞，而含有接受所述DNA的细胞的板则显示出很好的细胞生长。
在7天的选择期之后，来自90-100％汇合的孔的细胞用0.2ml含0.3％胰蛋白酶的PBS解离，并且将其转移到35mm组织培养板中以进行扩大培养和孵育，直至它们至少50％汇合，此时，细胞用0.6ml含0.3％胰蛋白酶的PBS进行胰蛋白酶处理。从每个35mm组织培养板，将0.6ml细胞悬浮液中的0.3ml转移至12.5cm2组织培养瓶中，进行进一步扩大培养。将剩余的0.3ml再接种到35mm培养皿中并孵育，直至它们最低达到大约50％汇合，此时，对来自那些板的细胞进行加工，以供提取用于PCR分析的DNA。来自每个系的烧瓶保留在培养箱中，直至它们经过这些分析，如果它们不含所需的DNA整合，则终止培养，或者保持在培养箱中，以供将来的核转移和深低温保藏用。
定向整合的筛选  如上所述，供筛选含所述DNA构建体的转染子用的DNA源为一个含有一次传代的待分析细胞的35mm组织培养皿。按照Laird等(Laird等，″Simp1ified mammalian DNA iso1ationprocedure″，Nucleic Acids Research，19：4293)公开的方法并且对其进行改进，制备DNA。简而言之，如下制备DNA。用以下成分制备细胞裂解缓冲液：100mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5；5mM EDTA，pH8.0；0.2％十二烷基硫酸钠；200mM NaC1；和100μg/ml蛋白酶K。
从每个35mm组织培养皿中吸取培养基，用0.6ml上述缓冲液取代。将培养皿放回培养箱中达3小时，在此期间让细胞发生裂解和蛋白消化。在该孵育之后，将裂解液转移至1.5ml微量离心管中，加入0.6m1异丙醇以沉淀DNA。通过颠倒离心管，将离心管充分振摇，然后让其于室温静置3小时，此后将DNA沉淀在微量离心机中以13,000rpm离心10分钟。弃去得自每个管的上清液，沉淀用70％乙醇冲洗一次。吸出70％乙醇，让DNA沉淀风干。干燥后，将每种沉淀重悬于30-50μl Tris(10mM)-EDTA(1mM)缓冲液，pH7.4中，让其过夜水合和溶解。每个聚合酶链式反应(PCR)方法使用5-7μl的每种DNA溶液。
用两个独立的PCR方法来分析转染子。第一个方法使用两种引物，所述引物预期退火至都位于供转染用的DNA内的位点上。第一种引物序列与所述DNA构建体的新霉素抗性盒同源，而第二种引物序列距其大约0.5Kb，产生0.5Kb的短PCR产物。具体地说，使用引物Neol(5′-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3′，SEQ ID NO：42)和IN2521(5′-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3′，SEQID NO：43)。使用Qiagen PCR试剂盒进行这一PCR反应。所述PCR反应混合物含有每种引物各1pmole、5μl 10×反应缓冲液、10μl Q溶液、5μl DNA和1μl dNTP溶液。用水使反应混合物的总体积为50μl。采用最初于94℃变性孵育2分钟，进行这一PCR扩增。然后通过于94℃孵育45秒、于60℃孵育45秒和于72℃孵育2分钟，进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，让反应混合物于72℃孵育5分钟，于4℃孵育直至从PCR仪中取出混合物。或者，在适当反应条件下进行的一个标准PCR反应中，可以使用与所述敲除构建体中整合到所述细胞基因组中的区同源的任何其它引物，以证实经得住G418选择的细胞由于所述DNA构建体的整合而成为抗性细胞。
因为可以预期，仅一小部分的转染子在所需位置(μ基因座)中含有DNA整合，所以使用另一对引物，来确定不仅所导入的DNA存在于所述转染子的基因组中，而且整合到所需的位置中。使用位于所述DNA构建体中新霉素抗性盒内的一种引物和可以预期仅当所述DNA整合在IgM基因座的适当位点时才退火在1.8Kb之外(因为同源区位于转染用的DNA构建体中所包含的区之外)的一种引物，进行用来测定恰当整合的PCR方法。设计所述引物退火到紧邻所述DNA构建体中提供的将整合到所需位置(所述基因座的DNA序列(都在所述DNA中存在的区内并且与之相邻)先前已经测定)的那些序列的DNA序列上。具体地说，使用引物Neol和OUT3570(5′-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAA GTCTGT C-3′，SEQ ID NO：44)进行该分析。这一PCR反应用Qiagen PCR试剂盒如上用于第一个PCR反应所述的方法进行，以证实所述导向构建体整合到所述细胞中。或者，可以用任何合适的反应条件以及与所述敲除构建体中整合到所述细胞基因组中的区同源的任何其它引物、以及与所述细胞基因组中所述整合位点上游或下游的区同源的任何其它引物，进行这一PCR分析。
采用这些方法，在所述DNA构建体定向整合到合适的基因座方面，筛选135个独立的35mm平板。从中确定了得自8个平板的DNA含有恰当定向的DNA构建体，然后从中选出三种DNA供核转移方法用。那些细胞系命名为“8-1C”、“5-3C”和“10-1C”。未用于转移到受体母牛的剩余的胚泡，用来提取DNA，对所述DNA进行另外的PCR分析。该分析用嵌套PCR法，使用也用于转染系的初次筛选的引物是有效的。
如上所述，用设计用以除去μ基因座的外显子1-4的基因导向构建体，产生三个细胞系。用基于PCR的试验，检验出这些系在定向插入方面都为阳性，将其用于核转移。通过PCR测试已恰当导向的构建体，筛选从那些核转移产生的剩余的胚泡。获得以下频率的阳性胚泡：
细胞系8-1C：    6/8
细胞系10-1C：   2/16
细胞系5-3C：    0/16
虽然在妊娠第40天，通过超声波检测到总共11次妊娠，到第60天，7个胎儿死亡。剩余4个胎儿经处理以再生新胎儿成纤维细胞，剩余的器官用来产生小组织样品以进行PCR分析。分析结果如下：
系8-1C：2个胎儿，1个胎儿经PCR检查为定向插入阳性
系10-1C：1个胎儿，经PCR检查为定向插入阳性
系5-3C：1个胎儿，经PCR检查为定向插入阴性
令人惊讶的是，虽然10-1C胚泡中检验为定向插入阳性的频率仅为2/16，但从该细胞系获得的一个有活力的60天胎儿经PCR检测为阳性。也获得了得自8-1C的一个阳性胎儿。对所有组织样品的DNA进行DNA印迹分析，以证实所述构建体不仅在一个末端正确地导向(这通过对原始构建体中存在的较短同源区进行PCR来测定)，而且在另一个末端也正确地导向。根据迄今获得的结果，认为已经产生了得自两个独立整合事件的两个重链敲除胎儿。此外，由于这些胎儿得自两个不同的系，所以至少一个胎儿可能在两个末端正确整合了构建体。一旦DNA印迹分析证实了导向载体在两个末端恰当导向，则进行进一步的核转移，以产生另外的胎儿，让其发育至足月。
核转移和胚胎转移  用K/Q细胞系(8-1-C(18))进行核转移，产生8个胚胎。将得自这一批的总共6个胚胎在Trans Ova Genetics(″TOG″；Iowa)转移到3个无病受体中。
已经将冷冻胚胎转移到10个无病受体中，获得无病雌性成纤维细胞系。在35-40天证实妊娠后，制订胎儿回收时间表。
妊娠诊断和胎儿回收 转移了得自敲除胎儿细胞的克隆胚胎的18个受体的妊娠情况，通过超声波检查法检查。结果概述如下。
     表13.使用μ重链敲除供体细胞的40天时的妊娠
    克隆ID  转移受体编号    40天时妊娠(％)
    8-1-OC     5     4  (80)
    10-1-C     6     4  (67)
    5-3-C     5     3  (60)
    总计     16     11  (69)
妊娠诊断  检查了从敲除细胞(8-1C)转移了克隆胚胎的3个受体的妊娠情况；一个已开始，而另外两个需要在1个月后再加以证实。
胎儿回收和细胞系的建立  获得了40天时怀有K/O胚胎的11头妊娠牛。第60天，从这些牛取出4个活胎儿。从所有4个胎儿建立了细胞系，并将细胞系冷藏待用。此外，我们收集得自所述胎儿的组织样品并将其快速冷冻，送至Hematech molecular biologylaboratory进行PCR/DNA印迹分析。
所有4个细胞系都是雄性细胞系。为了获得雌性细胞系，从在Trans Ova Genetics用无病受体所建立妊娠的妊娠55天时所收集的胎儿(6个)建立细胞系并且将其冷藏，以供将来建立K/O细胞。最近，证实了存在含一个μ敲除的雌性细胞系。可以用这一雌性细胞系产生克隆动物，可以让所述克隆动物与从雄性细胞系产生的动物交配，并且在后代中筛选含有双μ敲除的后代。
如果需要，可以将来自于得到的敲除胎儿或敲除后代的细胞用于第二轮核转移以产生其它克隆的后代。也可以冷冻来自于起始敲除胎儿或敲除后代的细胞以形成用作供体细胞源的细胞系，所述供体细胞源用于产生其它敲除有蹄动物。
将转录终止序列插入μ重链基因座
通过同源重组，产生其中Igμ基因座的一个等位基因通过插入转录终止序列而被突变的牛成纤维细胞系。具体地，通过在外显子2中插入新霉素或嘌呤霉素抗性基因(neo或puro，在此处描述)和转录终止盒(STOP)而防止功能性全长IgμmRNA的转录。因而，所得的未成熟Igμ转录物缺乏功能性结构域。为进行此方法，将含有puro基因的DNA导向构建体(即CμKopuro载体)电穿孔入牛成纤维细胞系，然后分离嘌呤霉素抗性集落。基于PCR分析，在某些集落中在外显子2中发生同源重组。因而产生了其中Igμ基因座中的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞系。从半合型突变的(hemi-IgμKO)成纤维细胞，产生了其中Igμ基因座中的一个等位基因被突变的3个胎儿，并且重建了hemi-IgμKO成纤维细胞。然后，将含有neo基因的DNA导向构建体(即CμKOneo载体)电穿孔入hemi-IgμKO成纤维细胞系，然后分离新霉素抗性集落。基于PCR分析，在某些集落中在剩余等位基因的外显子2中发生同源重组。因而产生了其中Igμ基因座中的两个等位基因均被突变的牛成纤维细胞系。从纯合型突变的(homo-IgμKO)成纤维细胞，产生了其中Igμ基因座中的两个等位基因均被突变的5个胎儿，并且重建了homo-IgμKO成纤维细胞。以此方式，产生了其中Igμ基因座的两个等位基因均被突变(homo-IgμKO)的牛成纤维细胞系。或者，可以采用与用于产生半合型敲除细胞相同的敲除载体和更高的抗生素浓度选择纯合性敲除细胞。可以采用标准核转移方法或此处描述的细胞核或染色质转移法中的任意一种，从homo-IgμKO细胞系产生homo-IgμKO牛崽。
下文进一步描述这些方法。
IgμKO载体的构建  如下产生Igμ KO载体(图40A-40D)。为了分离Igμ基因外显子9周围的基因组DNA，使用以下引物对5’-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3’(SEQ ID NO：69) 和 5’-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3’(SEQ ID NO：70)，通过PGR扩增DNA探针。使用这种探针，筛选牛(Holstein)基因组λ噬菌体文库，鉴定出4个阳性λ噬菌体克隆。通过制作限制性图谱对4个克隆中的1个克隆进一步分析。将含有所有Cμ外显子的9个碱基的XhoI-BamHI基因组片段亚克隆到pBluescript II SK(-)中，其中已经用SrfI位点替代了kpnI位点。然后，将puro和STOP盒插入到BglII位点，该位点位于Cμ的外显子中。puro和STOP盒的方向相对于Igμ基因都是有义链方向。然后将白喉毒素基因(DT-A，Gibco)加入pBluescript IISK(-)中的NotI位点。以相对于导向盒中的嘌呤霉素抗性基因为正向的方向插入DT-A，以便杀灭在基因组中随机整合了导向盒的细胞(pBCμΔKopuro载体)。类似地，构建了另一个含有neo基因的KO载体(pBCμΔNKOneo载体)。在一些实施方案中，该载体含有一段邻接于DT-A阴性选择标记的DNA，以保护阴性选择标记免受可能的核酸酶攻击。
转染/敲除方法  用以下标准电穿孔法，进行胎儿成纤维细胞系(Holstein)的转染。用来培养所述牛胎儿成纤维细胞的培养基含有500ml α MEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5ml青霉素-链霉素(SIGMA)和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)。在转染前一天，将细胞接种到T175组织培养瓶中，通过显微镜检查测定达到80-100％的目标汇合度。转染当天，大约107牛成纤维细胞经过胰蛋白酶处理，并用α-MEM培养基洗涤1次。在将细胞重悬于800μl α-MEM中之后，向细胞悬浮液中加入30μg溶于含有1mM亚精胺的Hepes缓冲盐水(HBS)的Srf I-消化的KO载体(pBCμΔKopuro载体)，通过吹吸充分混合。将细胞-DNA悬浮液转移到电穿孔样品池中，以550V和50μF进行电穿孔。此后，将经电穿孔的细胞接种到装有补充血清的α-MEM培养基的30个48孔板中。培养48小时后，将培养基更换为含有1μg/ml嘌呤霉素的培养基，将细胞培养2-3周，以选择嘌呤霉素抗性细胞。选择后，挑出达到接近100％汇合的所有集落，分到两个复制板上(24孔和48孔板)：一个用于基因组DNA提取，另一板用于核转移。从所述集落中提取基因组DNA，以通过PCR筛选所需的同源重组事件。
靶整合的筛选  如上所述，用PUREGENE DNA分离试剂盒(GentraSYSTEMS)，按照生产商的方案，从24孔的各孔中独立地提取基因组DNA。将每种基因组DNA样品重悬于20μl 10mM Tris-Cl(pH8.0)和1mM EDTA(EDTA)中。用以下引物对“F14”(5’-ccacaaaggaaaaagctgcactgctatac-3’；  SEQ ID NO：71)和“R14”(5’-tgtgggatcaggaggtcagatagacatc-3’；SEQ ID NO：72)，通过PCR进行筛选。一种引物的序列位于KO载体内，另一种引物的序列恰好位于靶内源基因座中整合的载体之外(图40A和40B)。因此，预期的PCR产物仅在所述KO载体通过同源重组整合到靶基因座中时才可检测到。所述PCR反应混合物含有17.9μl水、3μl 10×LA PCR缓冲液II(含Mg2+)、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、2μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过将反应混合物在以下条件下孵育：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒和68℃15分钟，进行40个循环的PCR。在PCR后，通过电泳分析反应混合物。在423个筛选的克隆中，两个克隆(#147和#384)产生预期的PCR产物。通过测序证实这些PCR产物的身份。基于多态性标记的存在，将KO载体整合到克隆#384和#147的Cμ外显子2的“等位基因A”和“等位基因B”中。按照下文所述，将这两个克隆用作产生胎儿的供体细胞。
染色质转移 在20hpm下对体外成熟的卵母细胞去核。对牛Igμ敲除克隆进行胰蛋白酶处理，在Ca/Mg Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中洗涤，并且通过在37℃水浴中，在100μl的31.25单位的链球菌溶血素O(SLO-Sigma，St.Louis，MO)中孵育50,000-100,000个细胞30分钟而进行透化。用碘化丙锭孵育细胞样品，并且通过荧光显微镜观察，基于染料摄取监测透化。
洗涤透化的成纤维细胞，沉淀，并且在37℃水浴中，在40μl从MDBK细胞制备的含有ATP生成系统(1mM ATP，10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌酸激酶)的有丝分裂提取物中孵育30分钟。用Hoechst 33342对细胞样品进行染色，通过荧光显微镜观察而监测染色质浓缩。孵育结束时，用500μl细胞培养基(含有10％FBS的αMEM)稀释反应混合物。沉淀这些细胞，重悬于TL Hepes中并且按照此处所述用于去核卵母细胞中的染色质转移。确定3个胎儿(#2184-1，2184-2，3287)为半合型Igμ KO胎儿，其中puroKO载体整合到Igμ基因的一个等位基因中。胎儿#2184-1和2184-2源于克隆#384，胎儿#3287源于克隆#147。这样，成功产生了其中Igμ基因座的一个等位基因通过KO载体进行了突变的3个牛成纤维细胞系。
表14.妊娠、胎儿回收和源于原代Holstein成纤维细胞系6939的具
               有半合型Igμ KO克隆的细胞系
   克隆ID    总CTs     成纤维细胞(％)   受体数    第40日妊娠(％)    第60日妊娠(％)    回收的胎儿数     Igμ半合型KO胎儿数目
    147   188    20  (15)   14   7   (50)    2  (14)    2(14)       1  (#3287)
    384   234    35  (22)   16   8   (50)    4  (25)    7*(25)       2  (#2184-1，#2184-2)
   总数   422    55  (19)   30   15  (50)    6  (20)    9(30)       3
*三组双胞胎。鉴定了3个正确导向的半合型Igμ KO胎儿(2184-1，2184-2和3287)。
第二次转染/敲除程序  采用相似方法进行hemi-IgμKO胎儿成纤维细胞系的转染。将“等位基因B”中整合了puroKO载体的克隆#3287广泛用于获得homo-IgμKO克隆。用于培养牛胎儿成纤维细胞的培养基含有500ml αMEM(Gibco，12561-049)，50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)，5ml青霉素-链霉素(SIGMA)，和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL #21985-023)。在转染前一天，将细胞接种到T175组织培养瓶中，通过显微镜检查测定达到80-100％的汇合度。转染当天，大约107个牛成纤维细胞经过胰蛋白酶处理，并用α-MEM培养基洗涤1次。在将细胞重悬于800μl α-MEM中之后，向细胞悬浮液中加入30μg溶于含有1mM亚精胺的Hepes缓冲盐水(HBS)的Srf I-消化的KO载体(pBCμΔKopuro载体)，通过吹吸充分混合。将细胞-DNA悬浮液转移到电穿孔样品池中，以550V和50μF进行电穿孔。此后，将经电穿孔的细胞接种到装有补充血清的α-MEM培养基的30个48孔板中。培养48小时后，将培养基更换为含有500μg/ml G418的培养基，将细胞培养2-3周，以选择G418抗性细胞。选择后，挑出达到接近100％汇合的所有集落，分到两个复制板上(24孔和48孔板)：一个板用于基因组DNA提取，另一板用于核转移。从所述集落中提取基因组DNA，以通过PCR筛选所需的同源重组事件。
靶整合的筛选  如上所述，用PUREGENE DNA分离试剂盒(GentraSYSTEMS)，按照生产商的方案，从24孔的各孔中独立地提取基因组DNA。将每种基因组DNA样品重悬于20μl 10mM Tris-Cl(pH8.0)和1mM EDTA(EDTA)中。用以下引物对“neoF3”(5’-TTTGGTCCTGTAGTTTGCTAACACACCC-3’；SEQ ID NO：73)和“neoR3”(5’-GGATCAGTGCCTATCACTCCAGGTTG-3’；SEQ ID NO：74)，通过PCR进行筛选。一种引物的序列位于KO载体内，另一种引物的序列恰好位于靶内源基因座中整合的载体之外(图40C和40D)。因此，预期的PCR产物仅在所述KO载体通过同源重组整合到靶基因座中时才可检测到。所述PCR反应混合物含有17.9μl水、3μl 10×LA PCR缓冲液II(含Mg2+)、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、2μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过将反应混合物在以下条件下孵育：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒和68℃15分钟，进行40个循环的PCR。在PCR后，通过电泳分析反应混合物。在569个筛选的克隆中，7个克隆(#76，91，184，442，458，496，和527)产生预期的PCR产物，这是通过测序证实的。基于多态性标记的存在，将KO载体整合到除#184外所有克隆的Cμ外显子2的“等位基因A”中。这样，puroKO载体和neoKO载体分别整合到6个纯合型Igμ KO克隆的“等位基因A”和“等位基因B”中。按照下文所述，将4个克隆(#76，91，442，458)用作产生胎儿的供体细胞。
染色质转移 在20hpm下对体外成熟的卵母细胞去核。对牛Igμ敲除克隆进行胰蛋白酶处理，在Ca/Mg Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中洗涤，并且通过在37℃水浴中，在100μl的31.25单位的链球菌溶血素O(SLO-Sigma，St.Louis，MO)中孵育50,000-100,000个细胞30分钟而进行透化。用碘化丙锭孵育细胞样品，并且通过荧光显微镜观察，基于染料摄取监测透化。
洗涤透化的成纤维细胞，沉淀，并且在37℃水浴中，在40μl从MDBK细胞制备的含有ATP生成系统(1mM ATP，10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌酸激酶)的有丝分裂提取物中孵育30分钟。用Hoechst 33342对细胞样品进行染色，通过荧光显微镜观察而监测染色质浓缩。孵育结束时，用500μl细胞培养基(含有10％FBS的αMEM)稀释反应混合物。沉淀这些细胞，重悬于TL Hepes中并且按照此处所述用于去核卵母细胞中的染色质转移。来自克隆#75的5个胎儿(#4658，3655，5109，5139，和4554)和来自clone#91的3个胎儿(#4039-2，5133-2，和5112)是纯合型Igμ KO胎儿，其中puroKO载体和neoKO载体分别整合到“等位基因A”和“等位基因B”中。这样，成功产生了其中Igμ基因座的两个等位基因通过KO载体进行了突变的8个牛成纤维细胞系。
表15.  胚胎发育和从半合型细胞系3287转移纯合型Igμ克隆
      克隆 ID      总 CTs      成纤 维细 胞(％) 植入的受 体数      第40日 妊娠 (％)     回收 的胎 儿数 IgM纯合型 KO 胎儿数
91 1019      254 (36) 53 18  (34) 14* 3
442 249      50 (29) 06 5  (83) 7* 0
496 240      70 (42) 0 0  (0) 0 0
76 141      20 (20) 09 6  (67) 5 5
      458     32      2(09)        01     1  (100)      1      0
总数 1681      396 (34) 69 30  (43) 27 8
从每个克隆产生了两组双胞胎。鉴定了8个正确导向的纯合型IgμKO胎儿(#4658，3655，5109，5139，4554，4039-2，5133-2，和5112)。
实施例16：任选免疫耗尽内源抗体
产生与内源有蹄动物抗体反应的抗体
为了制备与内源有蹄动物抗体或B细胞反应的多克隆抗体，可以从天然来源(如血清样品或有蹄动物B细胞的培养物)纯化一种或多种有蹄动物抗体(如多克隆有蹄动物免疫球蛋白，IgG或IgM)、有蹄动物抗体蛋白的片段(如μ重链、κ轻链或λ轻链)或含有有蹄动物抗体的确定部分的融合蛋白，或者通过包含在适合的克隆载体中的相应DNA序列的表达而在例如哺乳动物、昆虫或细菌细胞中合成。融合蛋白通常被用作产生抗体的抗原来源。或者，可以将有蹄动物抗体，如多克隆有蹄动物免疫球蛋白的混合物用作抗原来源。可以任选纯化有蹄动物抗体，然后与载体蛋白偶联，与弗氏佐剂混合，以增强接种的动物中的抗原性反应的刺激，并且注射到其它有蹄动物、兔、小鼠或其它实验室动物中。用弗氏完全佐剂进行初次免疫，用弗氏不完全佐剂进行后续的免疫。以双周的间隔进行加强注射后，对接种的动物取血，并且分离血清。直接使用血清，或者在使用前通过多种方法纯化，包括采用蛋白A-琼脂糖、抗原-琼脂糖和抗马-Ig-琼脂糖等试剂的亲和层析。可以通过Western印迹和使用有蹄动物抗体的免疫沉淀分析监测抗体效价。可以采用偶联于珠的有蹄动物抗体对免疫血清进行亲和纯化。可以采用一组异种抗体(如人抗体)、有蹄动物IgG和有蹄动物IgM分子确定抗血清特异性。
或者，通过从接种的动物取出脾，将脾组织匀浆，并且将脾细胞悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中而产生单克隆抗体。脾细胞作为淋巴细胞来源，其中的一些产生具有合适的特异性的抗体。然后将这些细胞与永久生长的骨髓瘤配偶体细胞融合，在选择剂，如次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的存在下将融合产物铺于许多组织培养孔中(Mocikat，J.Immunol.Methods 225：185-189，1999；Jonak et al.，Hum.Antibodies Hybridomas 3：177-185，1992；Srikumaran et al.，Science 220：522，1983)。然后可以通过ELISA筛选各个孔，以鉴定含有制备能够结合于有蹄动物抗体、其片段或突变体的抗体的细胞的孔。然后可以将这些细胞重新铺板，生长一段时间后，可以再次筛选含有这些细胞的孔，以便鉴定产生抗体的细胞。可以进行一些克隆程序，直到超过90％的孔含有对于特异性抗体产生为阳性的单克隆。由该程序可以建立产生抗体的一系列稳定的克隆。然后可以通过采用蛋白A琼脂糖的亲和层析和离子交换层析以及这些技术的变化和组合纯化单克隆抗体。一旦产生，也通过ELISA、Western印迹和/或免疫沉淀分析而检验单克隆抗体的特异性有蹄动物抗体识别(参见，例如，Kohler et al.，Nature 256：495，1975；Kohler et al.，EuropeanJournal of Immunology 6：511，1976；Kohler et al.，EuropeanJournal of Immunology 6：292，1976；Hammerling et al.，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，NewYork，NY，1981；Ausubel et al.，supra)。
作为有蹄动物抗体的替代或辅助免疫原，可以制备相当于有蹄动物抗体的相对独特的疏水区并且通过导入的C端赖氨酸偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)的肽。可以在偶联于BSA的肽上相似地亲和纯化每一种所述肽的抗血清，并且通过使用肽偶联物的ELISA和Western印迹以及通过使用异种和有蹄动物抗体的Western印迹和免疫沉淀而检验特异性。
本发明的抗体可以采用不位于高度保守区并且表现为很可能是抗原性的有蹄动物抗体氨基酸序列产生，所述抗原性是通过诸如肽结构程序提供的标准(Genetics Computer Group Sequence AnalysisPackage，Program Manual for the GCG Package，Version 7，1991)，采用Jameson et al.，CABIOS 4：181，1988的算法评估的。这些片段可以通过标准技术产生，如通过PCR，并且克隆到合适的表达载体中。例如，可以在大肠杆菌中表达GST融合蛋白并且采用谷胱甘肽-琼脂糖亲和基质纯化(Ausubel et al.，supra)。为了制备马多克隆抗体，并且使获得非特异性或表现出与有蹄动物抗体的低亲和性结合的抗血清的可能性最小，对于注射到各个动物中的每一种片段，产生两种或三种融合体。通过连续注射产生抗血清，优选包括至少三次加强注射。
除了完整的单克隆和多克隆抗有蹄动物抗体，可以采用标准方法产生多种遗传工程化的抗体和抗体片段(如F(ab′)2，Fab′，Fab，Fv，和sFv片段)。例如，可以通过重组方法产生截短形式的单克隆抗体，在该方法中制备了在合适的宿主中表达所需单克隆抗体片段的质粒。
Ladner(美国专利Nos.4,946,778和4,704,692)描述了制备单多肽链抗体的方法。Ward et al.，Nature 341：544-546，1989描述了具有高抗原结合亲和力的重链可变区的制备。McCafferty et al.，Nature 348：552-554，1990显示了完整的抗体V结构域可以展示在fd噬菌体的表面，噬菌体特异性结合于抗原，并且罕见的噬菌体(百万分之一)可以在亲和层析后分离。Boss et al.，美国专利No.4,816,397描述了用于在单个宿主细胞中产生免疫球蛋白及其免疫学功能性片段的多种方法，所述免疫学功能性片段至少包括重链和轻链的可变区。Cabilly et al.，美国专利No.4,816,567描述了制备嵌合抗体的方法。此外，抗体可以偶联于化合物，如毒素或放射性标记。以前已经描述了示例性的抗牛轻链抗体(Goldsby et al.，Vet.Immunol.Immunopath.17：25，1987)。
产生与牛抗体反应的马抗体的示例性方法
可以在许多物种，包括马、山羊、绵羊、猪、或牛中制备抗牛免疫球蛋白的抗体。在诸如明矾或弗氏佐剂的佐剂溶液中，以3份佐剂溶液与1份抗体的比例乳化牛抗体的纯化样品。在马的每个肩和颈部的每一侧皮下注射该溶液。每个注射位点接受0.25mg抗体。在第一次免疫后一个月相似地给予乳化的抗体佐剂溶液的第二次加强。可以给予额外的加强，以维持高的抗体效价。
在第一次加强后两周开始对马取血。取血是采用标准方法进行的，包括将马束缚在适当的槽，将针头经过食道任意一侧的皮肤下插入颈静脉。总血容量是大约6％体重，并且可以每两周采集15％血容量。
使血液凝集，在离心机中旋转样品，以分离血凝块。倒去液体血清级分。或者，用肝素或EDTA阻止凝血，通过离心沉淀细胞级分，并且倒去血浆。可以采用一些标准方法制备部分纯化的来自血浆或血清的抗体。示例性的方法包括标准Kohn分级分离系统，采用金黄色葡萄球菌蛋白A的亲和层析，以及离子交换层析。
可以使马抗体预先吸附人免疫球蛋白，以确保去除与人抗体交叉反应的马抗体。采用标准程序进行该步骤，例如使马抗体级分通过将人免疫球蛋白连接于固体支持物而制备的亲和柱。该步骤确保了将马抗体施用于表达人抗体的牛时，不会去除需要的表达人抗体的B细胞。
或者，如果通过马抗体去除了表达人抗体的B细胞，可以在胎儿期或出生后(参见，例如2000年11月17日提交的WO 01/35735)给牛施用其它动物(如人)的B细胞或B细胞前体。
用于免疫耗尽内源有蹄动物抗体的示例性方法
可以通过用抗牛抗体的马免疫球蛋白注射有蹄动物(如牛，如新生牛崽)而进行B细胞免疫耗尽。出生后立即给牛崽静脉输注1mg-1g(如10-100mg)抗体，或口服给予抗体。优选在看护或给予初乳前多至12小时给予抗体。附加或可选地，在看护或给予初乳后给予抗体。
可以通过几种方法监测免疫耗尽表达B细胞的牛抗体的成功。可以收集血样并且可以通过FACS分析B细胞以确定产生牛抗体、人抗体或嵌合牛/人抗体的B细胞的比例。在该测定中，用荧光标记的抗牛Ig抗体结合B细胞表面上表达的Ig分子，用FACS确定用这些抗体标记的B细胞数。采用了使用抗牛Ig抗体的标准ELISA捕获测定法确定B细胞分泌的抗体量。可以用相似的方法测量人抗体水平。可以在多个时间点，如一周1、2或3次取出血液、乳汁或淋巴样品，以测量残留的内源B细胞活性。优选地，与不存在内源B细胞或内源抗体的反应性抗体处理的情况下的相应量相比，由B细胞分泌的内源抗体量减少了至少25，50，75，或90％。取决于施用于牛崽的特定化合物的剂量和给药频率，获得该水平的抑制可以需要几天、几周或更长时间。如果需要，也可以使用比上述更大的剂量或更频繁的给药方案，以便进一步降低内源B细胞活性的水平或者导致更快达到所需的活性降低。由于耗尽了初乳中的牛抗体，人抗体的水平应该增加。
可以进行额外的免疫耗尽以进一步减少表达牛抗体的B细胞群。随着动物生长，需要显著更高量的抗体以确保成功的B细胞耗尽。
为了分离异种抗体，以多种时间间隔，如在1，3，5，7，14或更多天中每天从牛崽取出血液、乳汁或淋巴样品，并且用于纯化异种抗体的标准方法中。如果需要，也可以分析血样中牛崽产生内源抗体的连续抑制。
抑制胎儿中的B细胞发育
将抗牛IgM抗体(das6)注射到胎儿中以证明抗体抑制B细胞在胎儿中发育的能力。对于含有编码异种抗体的核酸的胎儿，预期具有相似的结果。在妊娠75天时给3个胎儿注射1.5mg的抗牛IgM抗体。对于该注射，用上述标准外科程序将抗体注射到胎儿的腹膜腔。对两个对照胎儿进行相似的注射程序，这两个对照胎儿注射了3×107个胎儿肝细胞(图28A和28F)或1.8×107个小鼠骨髓细胞(图28B和28G)，它们不应该影响胎儿中的B细胞数。大约41天后，从怀孕的母牛中取出3个实验胎儿和两个对照胎儿。用标准方法从每个胎儿的血样分离外周血淋巴细胞。
为了确定是B细胞的外周血淋巴细胞，用标准FACS分析法分析这些淋巴细胞IgM或抗体轻链分离的表达，它们都是在B细胞表面表达的。如图28A和图28B所示，对照胎儿的大约19.82-26.61％的外周血淋巴细胞表达IgM。相反，注射了抗牛IgM抗体的3个胎儿的仅仅7.78，11.80，或3.95％的外周血淋巴细胞表达IgM(分别见图28C-28E)。如图28F和图28G所示，对照胎儿的大约12.43-29.47％外周血淋巴细胞表达抗体轻链分子。对于注射了抗牛IgM抗体的3个胎儿，2.54，13.77，或3.99％的外周血淋巴细胞表达抗体轻链分子(分别见图28H-28J)。这些结果表明，注射抗牛IgM抗体减少了胎儿外周血中B细胞的数目。
用于使有蹄动物耐受的胎儿细胞移植程序和随后施用抗体抑制内源抗体的产生
如果需要，可以使有蹄动物胎儿耐受来自于相同属或种的动物的蛋白或细胞，所述相同属或种动物的用于产生随后施用以去除内源抗体的抗体。这种耐受应该减少或防止对施用的外来抗体的任何不良反应。在一种耐受技术中，在妊娠第75天(2.5个月)用马骨髓细胞(2-3ml，2×107个细胞/ml)和大约1-5mg马血清蛋白，如IgM，IgD，IgG，IgE，或IgA的组合注射妊娠母牛中的胎儿。这些细胞和蛋白可以获自商业来源或采用标准细胞纯化技术(如FACS分选)或标准蛋白纯化技术(参见例如Ausubel et al.，supra)分离。可以通过胁腹切口将妊娠母牛的妊娠子宫暴露，从而将马骨髓细胞注射到胎儿中。该程序是采用合适的麻醉和止痛完成的。或者，可以采用经阴道的超声施用小鼠细胞和蛋白，该方法是侵害性最小的。当这些细胞增殖并且整合到胎儿中时，在发育的动物中诱导了对马细胞的耐受。
如果需要，在妊娠中用标准剖腹产技术回收1个或多个胎儿，以确定胎儿的T细胞是否反应于马抗原而增殖或产生细胞因子，并且确定B细胞是否分泌抗马抗体。
或者，可以在牛崽出生后施用这些马蛋白或细胞。优选的出生后施用途径包括肠胃外、静脉内、动脉内、皮下和肌内施用。
可以立即用马抗体(如抗IgM抗体)注射活的牛崽，或维持到更晚施用，如在1，2，4，6，8，10，12，或14月龄时施用。用马抗体在一个或多个部位注射牛崽，按上文所述从牛崽的血液、乳汁、或淋巴样品纯化剩余的异种抗体。如果需要，也可以分析血样以评估血清小鼠Ig水平、牛Ig水平、白细胞水平和动物健康的其它指标。
作为上述将马细胞注射到胎儿中以诱导耐受的方法的替代方法，可以将马胚胎细胞注射到牛的移植前胚胎以形成生殖细胞系嵌合体(参见，例如Bradley et al.，Nature 309：225-256，1984)。移植前胚胎可以是妊娠母牛中的胚胎和体外培养然后转移到母体宿主的胚胎，如下文所述。
实施例17：α-1，3-半乳糖基转移酶活性降低的转基因有蹄动物
如果需要，可以生产α-1，3-半乳糖基转移酶被突变的转基因有蹄动物，以阻止具有半乳糖α(1，3)-半乳糖表位的异种抗体的不需要的糖基化。通过同源重组，产生其中基因座中α-1，3-半乳糖基转移酶的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞系。用于产生α-半乳糖基转移酶敲除细胞的DNA构建体，用来通过将嘌呤霉素抗性基因(puro，在实施例3中描述的)和转录终止盒(STOP)两者插入到含有催化结构域的外显子9中，防止功能性全长α-半乳糖基转移酶mRNA的转录。因而，所得的未成熟α-半乳糖转移酶转录物缺乏催化结构域。将所述DNA构建体(即α-半乳糖基转移酶KO载体)经电穿孔导入三个独立的牛成纤维细胞系中，然后分离嘌呤霉素抗性集落。基于PCR分析，在某些集落中在外显子9区中发生同源重组。因而产生了其中α1，3-半乳糖基转移酶基因座中的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞系。必要时，可以使用同一种敲除载体和更高浓度的抗生素来选择纯合敲除细胞，或者使用具有一种不同抗生素抗性基因的另一种敲除构建体，使第二个等位基因突变。这种方法也可以应用于得自其它有蹄动物的细胞，以产生可供在本文所述的核转移法中用以产生本发明的转基因有蹄动物的转基因细胞。
以下进一步描述这些方法。
α-1，3-半乳糖基转移酶KO载体的构建  如下产生α-1，3-半乳糖基转移酶KO载体(图23)。为了分离α-1，3-半乳糖基转移酶基因外显子9周围的基因组DNA，使用以下引物对5′-gatgatgtctccaggatgcc-3′(SEQ ID NO：61)和5′-gacaagcttaatatccgcagg-3′(SEQ ID NO：62)，通过PCR扩增DNA探针。使用这种探针，筛选牛基因组λ噬菌体文库，鉴定出7个阳性λ噬菌体克隆。一个克隆含有得自雄性Charolais牛成纤维细胞的DNA，通过制作限制性图谱对其进一步分析。将含有外显子9的Not I-Xho I基因组片段亚克隆到pBluescript II SK(-)中，然后将puro和STOP盒插入到Not I-Xho I基因组片段中位于催化结构域5’的Avi I位点。puro和STOP盒的方向相对于α-1，3-半乳糖基转移酶基因是有义链方向。也将白喉毒素基因(DT-A，Gibco)加入到载体构建体的Not I位点。DT-A是以相对于导向盒中嘌呤霉素抗性基因为正向的方向插入的，以杀死其中导向盒随机整合到基因组中的细胞。
转染/敲除方法  用标准电穿孔法，如下进行三个胎儿成纤维细胞系(两个得自雄性Jersy牛，一个得自雌性Jersy牛)的转染。用来培养所述牛胎儿成纤维细胞的培养基含有500ml αMEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5ml青霉素-链霉素(SIGMA)和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)。在转染前一天，将细胞接种到T175组织培养瓶中，通过显微镜检查测定达到80-100％的目标汇合度。转染当天，大约107牛成纤维细胞经过胰酶处理，并用α-MEM培养基洗涤1次。在将细胞重悬于800μl α-MEM中之后，向细胞悬浮液中加入30μg DNA，通过吹吸充分混合。将细胞-DNA悬浮液转移到电穿孔样品池中，以1,000V和50μF进行电穿孔。此后，将经电穿孔的细胞接种到带有补充血清的α-MEM培养基的20个24孔板中。培养48小时后，将培养基更换为含有1μg/ml嘌呤霉素的培养基，将细胞培养2-3周，以选择嘌呤霉素抗性细胞。选择后，挑出达到接近100％汇合的所有集落，从所述集落中提取基因组DNA，以通过PCR筛选所需的同源重组事件。
靶整合的筛选  如上所述，用PUREGENE DNA分离试剂盒(GentraSYSTEMS)，按照生产商的方案，从24孔的各孔中独立地提取基因组DNA。将每种基因组DNA样品重悬于20μl 10mM Tris-Cl(pH8.0)和1mM EDTA(EDTA)中。用以下引物对5′-aagaagagaaaggtagaagaccccaaggac-3′(SEQ ID NO：63)和5′-cctgggtatagacaggtgggtattgtgc-3′(SEQ ID NO：64)，通过PCR进行筛选。一种引物的序列位于α-1，3-半乳糖基转移酶KO载体内，另一种引物的序列恰好位于靶内源基因座中整合的载体之外(图23)。因此，预期的PCR产物应该仅在所述KO载体通过同源重组整合到靶基因座中时才可检测到。
所述PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×LA PCR缓冲液II(含Mg2+)、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过将反应混合物在以下条件下孵育：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒和68℃15分钟，进行40个循环的PCR。在PCR后，通过电泳分析反应混合物。选择出产生预期大小PCR产物的嘌呤霉素抗性克隆(图23)。因此，成功地产生了其中α-1，3-半乳糖基转移酶基因座中的一个等位基因被KO载体突变的牛成纤维细胞系。
实施例18：使用腺伴随病毒使内源基因突变的产生转基因有蹄动物的替代方法
腺伴随病毒(AAV)可以用来特异性地取代细胞基因组中存在的靶序列(Inoue等，Mol.Ther.3(4)：526-530，2001)；Hirata等，J.Virol.74(10)：16536-42，2000)；Inoue等，J.Virol.73(9)：7376-80，1999)；和Russell等，Nat.Genet.18(4)：325-30，1998))。其基因导向率与更传统的基因导向法相比非常有效。AAV有广宿主范围和组织特异性，包括对牛和人皮肤成纤维细胞的特异性。因此，可以用AAV来产生在内源免疫球蛋白(例如μ重链、λ轻链、κ轻链或J链)、α-1，3-半乳糖基转移酶或朊病毒基因中含有一个或多个突变的转基因有蹄动物细胞。然后可以将这些转基因细胞用于本文所述的核转移法中，以产生本发明的转基因有蹄动物。
应用AAV，导致牛免疫球蛋白重链基因座以高于先前用传统基因导向策略(即电穿孔和脂转染法)所达到的频率进行同源重组。在第一轮基因导向实验中，在含有通过AAV载体所导入DNA的73个稳定转导子中，获得5个正确导向的成纤维细胞克隆。
这些实验如下进行。
AAV敲除载体  AAV构建体可以通过简单地插入外源序列或者用AAV载体中存在的新序列取代内源序列而破坏基因。图2 4显示了一种AAV构建体，其中牛免疫球蛋白重链μ恒定区的所有4个编码外显子存在于2822碱基对的BamHI-XhoI片段上。将含有市售载体pMClNeo中存在的新霉素抗性标记的1.16Kb片段，插入到得自Holstein牛的μ重链基因座外显子4中存在的SacII位点中。该基因座是在分离用以产生实施例1中所述敲除载体的噬菌体克隆中所含有的基因座。为了产生所述AVV载体，将μ重链基因座中的SacII位点补平，构建平端，随后将其与平端SalI接头(New England Biolabs)连接。然后，将含有新霉素抗性基因的pMClNeo的XhoI片段与通过SalI接头加入到该基因座的SalI位点连接。可以进行这种连接，是因为XhoI和SalI限制位点具有匹配末端。这种敲除载体引起新霉素抗性基因破坏性地插入到内源μ重链基因中，从而使所述μ重链基因灭活。该基因灭活的发生无需使所述内源μ基因座的区缺失。
设计一种替代的载体，以在导向期间从所述内源基因座除去外显子3和4，导致这两个外显子被一个功能性拷贝的新霉素抗性基因取代(图25)。这种构建体应用从雌性Jersey牛经PCR扩增基因组DNA来产生。具体地说，使用以下引物扩增3’同源区：5′GGGGTCTAGAgcagacactacactgatgggcccttggtcc 3′(SEQ ID NO：65)，该引物加入一个XbaI限制位点；和5′GGGGAAGCTTcgtgtccctggtcctgtctgacacag 3′(SEQ ID NO：66)，该引物加入一个HindIII限制位点。用加入一个XhoI限制位点的引物5′GGGGCTCGAGgtcggcgaaggatggggggaggtg 3′(SEQ ID NO：67)和加入一个KpnI限制位点的引物5′GGGGGGTACCgctgggctgagctgggcagagtggg 3′(SEQ ID NO：68)，扩增5’同源区。这些引物序列中大写的核苷酸是不可退火至所述μ重链基因座上、但包括在所述引物中以加入限制位点以便于后续亚克隆步骤的核苷酸。加入前4个鸟嘌呤，以便将所述限制位点与所述引物的真正末端分开，因为限制性酶不切割位于引物真正末端的位点以及内部位点。5’同源区长1.5Kb，含有外显子1和2。5’同源区也含有外显子3的前25个核苷酸，以保持外显子的剪接受体位点。所述剪接受体位点使得外显子3可以用于剪接，并因此防止外显子1和2可能被剪接到下游跨膜结构域，形成异常的膜结合产物。3’同源区长1.24Kb，含有紧接外显子4下游的区域。
对于图24所示的构建体，采用标准方法，将所述导向盒插入到Ryan等(J.of Virology 70：1542-1553，1996)报道的含有病毒长末端重复(LTR)序列的AAV载体中。用Ttet A2包装细胞系，如先前描述的方法(Inoue和Russell，1998，J.Virol.72：7024-7031，1998)，将所述AAV载体包装到衣壳中，并且按照先前所述的方法(Zolotukhin等，Gene Therapy，6：973-985，1999)进行纯化。对于图25所示的构建体，可以使用上述方法或者任何其它标准方法，将所述导向盒插入到Ryan等所述的AAV载体或者任何其它AAV载体(例如得自Stratagene的市售载体)中，产生含有所述载体的病毒。
转导方法  将得自雌性Jersey牛的成纤维细胞以40.000细胞/孔接种到48孔组织培养板的一个孔中，在完全培养基中于38.5℃和5％CO2下培养，直至细胞粘附到孔的底部表面。一旦细胞贴壁，则取出培养基，更换为含有具有图24所示载体的AAV颗粒的0.2ml新鲜培养基，感染复数(MOI)为500-20,000颗粒/细胞。MOI的选择基于测定在药物选择期内所产生的集落数和集落间隔(spacing)的预实验。将板孵育过夜。在该孵育期后，转导孔用无钙和镁的PBS漂洗，如上所述用或者胰酶或者细胞解离缓冲液使细胞与孔分离。通过轻轻吹吸解离的细胞，获得均一的细胞悬浮液，使得自所述孔的细胞重新分配在10个100mm组织培养皿中。各培养皿用完全培养基孵育过夜。
在该100mm培养皿孵育后，将培养基更换为含有350微克/ml浓度的G418的选择培养基。每2-3天更换选择培养基，直至在培养皿表面肉眼可见集落。此时，挑出单个集落，将其转移到其自身的容器中。
在组织培养皿的外表面，标注含有集落的区域。一旦圈出所有集落，则从平板中吸出培养基，平板用无钙和镁的PBS洗涤3次。洗涤后，用1×胰酶的1∶25稀释液漫过平板，让其于室温静置，直至可见所述集落开始与平板表面分离。保持平板固定，以防止分离的集落漂浮到平板的另一位置上。用吸头挑出50微升体积的细胞块，将吸头的内容物转移到24孔组织培养板中的一个孔。在转移了所有的集落后，立即加入含有G418的完全培养基，让分离的克隆扩大培养接近汇合。
当一个孔接近汇合时，将其用无钙和镁的PBS洗涤2次。用0.2ml细胞解离缓冲液使细胞分离。在这种细胞悬浮液中，将20μl转移到一个新的24孔板中，让剩余的细胞在加入2.0ml完全培养基后，再粘附至原始24孔板表面。将原始板孵育至100％汇合。新的板用作正确导向的细胞来源，以供将来的牛克隆法用。
当得自原始24孔板的一个孔变为100％汇合时，除去培养基，细胞用PBS洗涤1次。除去PBS，更换为根据Laird等(Nucleic Acids Res.19：4293，1991)改进的细胞裂解缓冲液。简而言之，向该孔中加入含有200mM NaCl、100mM Tris-HCl pH8.5、5mM EDTA、0.2％ SDS和100μg/ml蛋白酶K的0.2ml裂解缓冲液。将板再放回培养箱中达3小时至过夜。然后将粘性的细胞裂解液转移到微量离心管中。加入等体积的异丙醇以沉淀DNA。在微量离心机中离心10分钟后，弃去上清液，沉淀用0.5ml 70％乙醇洗涤1次。除去乙醇后，将DNA沉淀风干，重悬于35微升TE缓冲液(10mM Tris pH 8和1mM EDTA)中。将3μl的等份样品用于PCR分析。
PCR分析    用PCR分析，在所述载体的正确导向方面对得自用AAV颗粒转导的抗药性克隆的DNA样品进行筛选。这种筛选策略使用一种退火到编码所述药物抗性标记的DNA内的引物和另一种退火到靶基因座内但在所述AAV导向颗粒中存在的序列之外的引物。仅当所述AAV导向DNA整合到所述内源基因组的所需位置时，才可检测到PCR产物。
得自使用这些AAV颗粒的单导向实验的结果示于图26。基于这一分析，73个独立克隆中的5个克隆含有所述正确导向的载体DNA。
该方法也可以与图25中所示的AAV载体或者与任何其它合适的腺病毒或腺伴随病毒载体一起使用。如有需要，可以通过用带有一种不同抗生素抗性基因(即除新霉素抗性基因之外的基因)的AAV载体转导，使所分离的集落中对第二μ重链等位基因突变。为了选择所得的纯合敲除细胞，在相应的抗生素存在下培养被感染的细胞。或者，可以用含有新霉素抗性基因的AAV载体转导所分离的集落，然后在存在高浓度抗生素(即杀死杂合敲除细胞但不杀死纯合敲除细胞的抗生素浓度)的情况下培养所述集落。
实施例19：人Ig表达的检验
对保留HAC或编码异种抗体的其它核酸的牛崽的检验可以在出生后不久开始，并且包括评价(1)人Ig表达，(2)对免疫的应答，(3)亲和性成熟，和(4)所述HAC传递至后代的情况。
通过让动物配种，并且通过ELISA、RT-PCR或FACS分析人重链和轻链表达的存在，监测人Ig的表达(参见，例如，2000年11月17日提交的WO 01/35735)。一旦确定了所述动物产生人Ig，则用加有佐剂的破伤风类毒素免疫动物。在免疫后，每周从动物取血一次，通过ELISA或FACS测定对抗原的应答，并且与在免疫前收集的取血前样品进行比较。初次免疫后一个月，用含水形式的所述抗原给动物加强免疫。加强免疫后一周，从动物取血，通过ELISA或FACS测量对抗原的应答，并且将其与取血前样品进行比较。ELISA或FACS分析提供对大多数应答的效价以及所产生的重链同种型的测量。这一数据提供对抗体效价的增加以及类别转换发生的测量。也测量平均亲和力的估计量，以确定在对抗原应答期间是否发生亲和性成熟。
在如上所述获得转基因牛之后，用它们来生产转基因Ig，优选人Ig，但有可能生产其它物种(例如狗、猫、非人类灵长类动物、其它有蹄动物诸如绵羊、猪、山羊、鼠类例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等)的Ig。正如所知的，已知Ig基因在物种间是保守的。
含有异种抗体的转基因抗血清和乳汁
牛(或其它有蹄动物)产生针对内源性暴露的任何抗原的转基因抗血清，或者针对外源给予的抗原的转基因抗血清。例如，可以将抗原给予所述有蹄动物，以生产与所述抗原反应的所需抗体，所述抗原包括例如病原体(例如细菌、病毒、原生动物、酵母或真菌)的抗原、肿瘤抗原、受体、酶、细胞因子等。用于抗体生产的示例性病原体包括但不限于肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、免疫缺陷病毒(例如HIV)、疱疹病毒、细小病毒、肠道病毒、埃博拉病毒(ebola virus)、狂犬病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、链球菌属(Streptococcus)(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、嗜血菌属(Haemaphilus)(例如流感嗜血菌(Haemophilus influenza))、奈瑟氏球菌属(Neisseria)(例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitis))、白喉棒杆菌(Coryunebacterium diptheriae)、嗜血菌属(Haemophilus)(例如百日咳嗜血菌(Haemophilus pertussis))、梭菌属(Clostridium)(例如肉毒梭菌(Clostridium botulinium))、葡萄球菌属(Staphlococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))和呼吸道合胞病毒(RSV)。
可以将一种或多种病原体给予转基因有蹄动物，以产生可用于预防、稳定或治疗特定疾病的超免疫血清。例如，可以将与儿童呼吸道感染相关的病原体给予转基因有蹄动物，以产生与这些病原体(例如肺炎链球菌、流感嗜血菌和/或脑膜炎奈瑟氏球菌)反应的抗血清。在给予所述有蹄动物之前，可以任选地处理这些病原体，以降低其毒性(例如通过暴露于热或化学药品例如甲醛)。
为了产生广谱Ig，可以将各种各样的病原体(例如多种细菌和/或病毒病原体)给予转基因有蹄动物。这种超免疫血清可以用来预防、稳定或治疗哺乳动物(例如人类)的感染，尤其可用来治疗具有遗传性或获得性免疫缺陷的哺乳动物。
另外，通过本发明的方法产生的抗体可以用来抑制免疫系统，例如以治疗神经病，以及去除特定的人细胞和调节特定的分子。例如，抗独特型抗体(即抑制其它抗体的抗体)和与T细胞、B细胞或细胞因子反应的抗体，可以用来治疗自身免疫病或神经病(例如由于炎症引起的神经病)。这些抗体可以从尚未给予抗原的转基因有蹄动物中获得，或者它们可以从已经给予了抗原例如B细胞、T细胞或者细胞因子(例如TNFα)的转基因有蹄动物中获得。
从尚未给予抗原的转基因有蹄动物产生的转基因抗血清，可以用来生产包含人多克隆抗体、优选人IgG分子的药物。这些人抗体可以用来替代从人类中分离的抗体，例如静脉免疫球蛋白(IVIG)治疗药。
可以任选地对转基因抗血清进行与一种或多种感兴趣抗原反应的抗体的富集。例如，可以用标准技术，例如Ausubel等所述的技术(Current Protocols in Molecular Biology，volume 2，p.11.13.1-11.13.3，John Wiley & Sons，1995)，纯化所述抗血清。优选的纯化方法包括用抗原或抗体包被的微珠沉淀、柱层析例如亲和层析、磁珠亲和纯化和用板结合抗原进行淘选。另外，可以让所述转基因抗血清与一种或多种感兴趣抗原接触，根据抗体/抗原复合物的增加的大小，可以从未结合抗体中分离出结合抗原的抗体。也可以用蛋白A和/或蛋白G来纯化IgG分子。如果内源抗体的表达未被去除，则可以用蛋白A和/或抗人Ig轻链λ的抗体(Pharmingen)，从内源有蹄动物抗体或有蹄动物/人类嵌合抗体中分离出所需的人抗体。蛋白A对人Ig重链的亲和力大于对牛Ig重链的亲和力，因而可以用来从含有一条或两条有蹄动物重链的其它抗体中分离含有两条人重链的所需Ig分子。抗人Ig轻链λ的抗体可以用来从具有一条或两条有蹄动物Ig轻链的抗体中分离具有两条人Igλ链的所需Ig分子。另外或者另一方面，可以在一个阴性选择步骤中使用一种或多种对有蹄动物Ig重链或轻链特异性的抗体，以除去含有一条或两条有蹄动物重链和/或轻链的Ig分子。
所得的抗血清本身可以用于针对抗原的被动免疫。或者，所述抗血清具有诊断、预防或纯化用途，例如用于达到纯化抗原。
另一方面，在给予抗血清后，可以从所述转基因牛中分离出B细胞，将其用于杂交瘤的制备。例如，可以用标准技术，将得自转基因有蹄动物的B细胞与骨髓瘤融合，产生分泌感兴趣的单克隆抗体的杂交瘤(Mocikat，J.Immunol.Methods 225：185-189，1999；Jonak等，Hum.Antibodies Hybridomas 3：177-185，1992；Srikumaran等，Science 220：522，1983)。优选的杂交瘤包括通过B细胞与得自与所述转基因有蹄动物同一属或同一物种的哺乳动物的骨髓瘤融合所产生的杂交瘤。其它优选的骨髓瘤得自Balb/C小鼠或人类。在这种情况下，提供生产抗特定抗原的异种单克隆抗体的杂交瘤。例如，这一技术可以用来生产对病原体特异性的人类、猫、狗等(取决于特定的人工染色体)的单克隆抗体。用来选择生产具有所需特性(即增强的结合亲和性、亲合力)的抗体的杂交瘤的方法是众所周知的。
或者，可以对得自转基因有蹄动物的B细胞进行遗传修饰，以表达癌基因，例如ras、myc、ab1、bc12或neu，或者用转化DNA或RNA病毒如EB病毒或SV40病毒感染所述B细胞(Kumar等，Immunol.Lett.65：153-159，1999；Knight等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：3130-3134，1988；Shammah等，J.Immunol.Methods 160-19-25，1993；Gustafsson和Hinkula，Hum.Antibodies Hybridomas 5：98-104，1994；Kataoka等，Differentiation 62：201-211，1997；Chatelut等，Scand.J.Immunol.48：659-666，1998)。所得的无限增殖化B细胞也可以用来生产理论上无限量的抗体。因为Ig也分泌到有蹄动物的乳汁中，所以有蹄动物的乳汁也可以用作异种抗体的来源。
实施例20：任选评估有蹄动物的疼痛、不适和总体健康
如果需要，可以评估用于本发明方法中的有蹄动物中由于施用抗体导致的疼痛或不适的症状。可以对哺乳动物的血样进行标准临床化学分析。也可以确定白细胞计数和红细胞计数，并且与临床标准进行比较。每周一次确定呼吸、心率和体温。测量食物和水摄取。此外，每日进行行为观察并且在评分表上记录。评分表包括活动、眼和鼻湿或干，以及腹泻症状的观察结果。可以进行异种和内源抗体量的定期估计(如每周一次)。
其它实施方案
从上述描述中，可以明显看出，可以对本文所述的发明作出各种变化和改进，以使其适合于各种用途和条件。这类实施方案也在以下权利要求书的范围内。
在本说明书中提及的所有出版物都通过引用结合到本文中，其程度与每个独立出版物或专利申请具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。
序列表
<110>Hematech，LLC et al.
<120>能够产生人抗体的转基因有蹄动物
<130>50195/012W02
<150>PCT/US03/15937
<151>2003-05-19
<150>US 60/381,531
<151>2002-05-17
<150>US 60/425,056
<151>2002-11-08
<160>94
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>1
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<210>2
<211>20
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<220>
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<210>4
<211>23
<212>DNA
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<220>
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<400>4
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>6
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<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>7
gtcatcatct ctgccccttctg                                    22
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>8
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<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>20
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<213>人工序列
<220>
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>22
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<211>20
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<213>人工序列
<220>
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<211>20
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cccccaagct tgcctggacc cctctctgg                            29
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<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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atcggcaaag cttggacccc tctctggctc ac                        32
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<211>29
<212>DNA
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<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>38
cccccaagct trcckgstyy cctctcctc                            29
<210>39
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>39
gggaattcgg gtagaagtca ctgatcag                             28
<210>40
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>40
gggaattcgg gtagaagtca cttatgag                             28
<210>41
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>41
gggaattcgg gtagaagtca cttacgag                             28
<210>42
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>42
cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc                           30
<210>43
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>43
ctgagacttc ctttcaccct ccaggcaccg                           30
<210>44
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>44
cgatgaatgc cccatttcac ccaagtctgt c                         31
<210>45
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>45
ctgagccaag cagtggcccc gag                                  23
<210>46
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>46
gggctgagac tgggtgaaca gaaggg                               26
<210>47
<211>1479
<212>DNA
<213>牛
<400>47
ggtaccgaaa ggcggccctg aacattctgc agtgagggag ccgcactgag aaagctgctt 60
catcgccggg agggagccag ccagctacga ttgtgagcac gctcacagtg cacacggcat 120
gtgcacggtc tcagcttaac caccttgaag gagtaactca ttaaagagcg tacgaatgca 180
ttgataaaat gcacctgaga caaattaatt tcttaaacat cgactttgaa aatgaatata 240
agtgagcagt tgataggctc tgaatgaaat accttccaac aggtgctgag aaccgccagg 300
agcagggaac ggactccccg tggagcccca gaaggagcca gccctgatga tacctcggcc 360
ctgggccctc ctcacgctgg gagagagcca gctcctgttg ttcatgcctg gcctgtggtt 420
ctttgtcgtc atggccctca aacaagccca caggtcctgg cctgagtccc tcggcctgcg 480
tgcagccgcc ccctcccctg ctggaggcac cctgcctgcc gtggagcccc tcacccaacg 540
ttcccccgcc tgatgggttg ggccgcaaag gacaccgttt aaccagaact gccttccagg 600
agcctactgc tgggaggcgg ccttctctgg gaccaggtcc actccactcc cttggatagt 660
cactgtcagg cccctggtgg ccccacaaga ggcgtcctgg gaagccccag tctccttcca 720
gcccctgaaa ttgcctccct ggagagccag atcaccctca cccagctccc tcccctggcc 780
cccagggtct cctctcccat cccaccgccc accctaccct ggcgttgccg tcacagctaa 840
cctgacctcc ctgggttcga gcgtgccgcc gcccctgtcg gcccccacct ggacccccgc 900
agcctatctc tgagggctaa tgcccctgtc ccctgccccg ctgccagctg ccccctcttt 960
ccaggccttt cctccgtgcc tctccagtcc tgcacctccc tgcagcttca cctgagactt 1020
cctttcaccc tccaggcacc gtcttctggc ctgcaggtga ggtctcgcgc tccctcaggg 1080
cacgatgtgg ctgcacacac accggccctc ctcccgagtc cctcctgcac acaccacgcg 1140
cacccgaggt tgacaagccc tgccgtggtt gggattccgg gaatggcggc agagaggggc 1200
ggggtgtcct tggggctggt ggcagggtcc tcatggatgc acacagcggc cccggctcag 1260
gccaccttgg gaaaccagtc ctgggatctg caactcggcc atgttcctgc atctggacca 1320
gccccaagac accaccccgg cgtggcgcca ctggcctggg aggagacaca tgtccctttc 1380
ccatcagcaa tgggttcagc actaggatat gcagcacaca ggagtgtggc ttgggggtaa 1440
aaaaaccttc acgaggaagc ggtttcacaa aataaagta                        1479
<210>48
<211>3120
<212>DNA
<213>牛
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(3120)
<223>n＝a，t，c，g或无核苷酸
<400>48
tctagaccca ccagcctcag ttgaggttaa atggacccaa agcatctcaa caatttgccc 60
aagtcaagcc agctcaatgg gttcccttct gttcacccag tctcagccca ccatggtaac 120
ccagcatacc ccggttaagc ccaggctagc ccagcccagc tgagcccagc tcagctcagt 180
tcagcccagt tcaatccaga tcagcccaat ccaggccagc tcatcgagct cagttcagct 240
cagctcaacc ctctcagccc agctcacctg ctcagccaag ctaagcccag ttcagcccag 300
ctcagcttaa cccagctcac ccactctgcc cagctcagcc cagccctgct caactcagcc 360
cagcacagcc caacttggct cagctcagct tagcccagct cagcccagct tacccactcc 420
gcccagctca aacagcccag gtcagcccaa cctagctcag ttcagcccag ctcagcccag 480
cccagctcag cccagctcac ccactctgcc cagctcaaca cagcccagct caacccagct 540
cagctcagtt cagcccagct cacccactct gcccagctca ggccagctca acccagccca 600
gcccagctca ctcattctgc caagctcagc ccagctcaac caggctcagc tcagctcagc 660
tcagccctgc tgaccnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 720
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 780
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 840
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 900
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 960
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1080
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1140
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1200
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1260
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1320
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1380
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1440
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1500
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1560
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1620
nnnnngctca gctcagccca gctcagccca gcccagccca gctcacacac ttggcccacc 1680
tcagccactc cattcagctc agcccagctc aacccagctc agctcagctc aacctagctc 1740
agccaagcta acccactcca cccagctcag cccagctcgc ccactctgcc cagctcaacc 1800
cagctcagct cagcccagcc cagyccagcc cagctcaccc actccatcca gcccagccca 1860
gcccagctga gcccagctca actcagccta acccagctca gcccagccta acccagctca 1920
gcccagccca accagctagc tgagcccagc tcagtgcagc tcaacccagc tcagctcagc 1980
tagcccagcc cagctcaacc tggctcaacc cggctcagcc cagctcacct gctgtaggtg 2040
gcctgaaccg cgaacacaga catgaaagcc cagtggttct gacgagaaag ggtcagatcc 2100
tggaccatgg ccacggctaa aggccctggt ctgtggacac tgcccagctg ggctcatccc 2160
tcccagcctc ttcccgcttc tcctcctggg agcccgctcg ccccttcccc tggtgcctga 2220
cacctccatc ccgacaccag gcccagctgg cccttctccc agctgtcagt caccactacc 2280
ctccactctg ggtgaaaagc ttgttggaga ctttagcttc cctagagcat ctcacaggct 2340
gagacacact tgccaccctc agagagaggc cctgtctctg ctgagcaggc agcgctgctt 2400
ctctgggaga ggagagcctg ggcacacgtc cctgggtcct ggcctcctgg gcacgtgcca 2460
tgggcctgag atcccgcccc gagtctaaaa gagtcctggt gactaactgc tctctggcaa 2520
atgtcctcat taaaaaccac aggaaatgca tcttatctga acctgctccc aattctgtct 2580
ttatcacaaa gttctgctga gaaagaggat actctctagc acagagacca tctgaacccc 2640
aaagctgcat tgaacaccta agtgtggacg caggaagtgg tccctgtggg tgtgaagcac 2700
cccggcatcg caggcagtag gtaaagacag attccctttc aagtagaaac aaaaacaact 2760
catacaaaca tccctgggca gtgagtctgg ctgcaccggc tcctggtccc tggcatgtcc 2820
cctgggctct ctgacctggg cggattcctc cgaatccctt cgctgtgtta actcgtgacc 2880
tgcctactgg cctgggggca gaggccaggc ccacacgtcc ccaggtgtgg gcagtcccag 2940
gagacccccc agccttggcg agcctgggga ctcagagcag agactgtccc tccagacggt 3000
cccaggcccc gctgactgcc gccccaccgg gcatcctctc aatcccccag ctagtagtgt 3060
agcagagtaa ctcacgacga atgcccccgt ttcacccaag tctgtcctga gatgggtacc 3120
<210>49
<211>146
<212>DNA
<213>牛
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(146)
<223>n＝a，t，c，或g
<400>49
gggaaggaag tcctgtgcga ccanccaacg gccacgctgc tcgtatccga cggggaattc 60
tcacaggaga cgagggggaa aagggttggg gcggatgcac tccctgagga gacggtgacc 120
agggttccnt ggccccagnn gtcaaa                                      146
<210>50
<211>167
<212>DNA
<213>牛
<400>50
tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct cagggagtgc atccgcccca 60
acccttttcc ccctcgtctc ctgtgagaat tccccgtcgg atacgagcag cgtggccgtt 120
ggctgcctcg cacaggactt ccttcccgac tccatcactt  tctcctg              167
<210>51
<211>147
<212>DNA
<213>牛
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(147)
<223>n＝a，t，c，或g
<400>51
tttgacnnct ggggccangg aaccctggtc accgtctcct cagggagtgc atccgcccca 60
acccttttcc ccctcgtctc ctgtgagaat tccccgtcgg atacgagcag cgtggccgtt 120
ggntgcgtcg cacaggactt ccttccc                                     147
<210>52
<211>393
<212>DNA
<213>牛
<400>52
ggaggcttgg tcaagcctgg agggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcacc 60
ttcagtgact actacatgag ctggatccgc caggctccag ggaaggggct ggagtgggtt 120
tcatacatta gtagtagtgg tagtaccata tactacgcag actctgtgaa gggccgattc 180
accatctcca gggacaacgc caagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 240
gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga ataactgggg atgcttttga tatctggggc 300
caagggacaa tggtcaccgt ctcttcaggg agtgcatccg ccccaaccct tttccccctc 360
gtctcctgtg agaattcccc gtcggatacg agc                              393
<210>53
<211>131
<212>PRT
<213>牛
<400>53
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
 1               5                   10                  15
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala
            20                  25                  30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser
        35                  40                  45
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
    50                  55                  60
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Gly Asp Ala Phe
                85                  90                  95
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala
            100                         105         110
Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser
        115                 120                 125
Asp Thr Ser
    130
<210>54
<211>411
<212>DNA
<213>牛
<400>54
gtggagtctg ggggaggctt ggtacagcct gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcg 60
tcaggattca ccttcaggaa ctttggcatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 120
ctggagtggg tgacagttat atggtatgac ggaagtaatc aatactatat agactccgtg 180
aagggccgat tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca tgttgtatct gcaaatgaac 240
agcctgagag ccgaggatac ggctgtgtat tactgtgcga gagatcgcaa tggcctgaag 300
tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg gtcactgtct catcagggag tgcatccgcc 360
ccaacccttt tccccctcgt ctcctgtgag aattccccgt cggatacgag c          411
<210>55
<211>137
<212>PRT
<213>牛
<400>55
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu
 1               5                  10                  15
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe Gly Met His Trp
            20                  25                  30
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Val Ile Trp
        35                  40                   45
Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
    50                  55                  60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg
                85                  90                  95
Asn Gly Leu Lys Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser
        115                 120                 125
Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser
    130                 135
<210>56
<211>441
<212>DNA
<213>牛
<400>56
accctcctca ctcactgtgc agggtcctgg gcccagtctg tgctgactca gccaccctca 60
gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgtt ctggaagcag ctccaacatc 120
ggaagtaatt atgtatactg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 180
tataggaata atcagcggcc ctcaggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 240
acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 300
gcagcatggg atgacagcct gagtggtctt ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 360
ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 420
gccaacaagg ccacactggt  g                                          441
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<211>147
<212>PRT
<213>牛
<400>57
Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr
 1               5                  10                  15
Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser
            20                  25                  30
Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr
         35                 40                  45
Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn
     50                 55                  60
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
65                  70                  75                  80
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala
                85                  90                  95
Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Leu Phe Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser
        115                 120                 125
Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala
    130                 135                 140
Thr Leu Val
145
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<212>DNA
<213>牛
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agttggaccc ctctctggct cactctcttc actctttgca taggttctgt ggtttcttct 60
gagctgactc aggaccctgc tgtgtctgtg gccttgggac agacagtcag gatcacatgc 120
caaggagaca gcctcagaag ctattatgca agctggtacc agcagaagcc aggacaagcc 180
cctgtacttg tcatctatgg taaaaacaac cggccctcag ggatcccaga ccgattctct 240
ggctccagct caggaaacac agcttccttg accatcactg gggctcaggc ggaggatgag 300
gctgactatt actgtaactc ccgggacagc agtggtaacc atgtggtatt cggcggaggg 360
accaagctga ccgtcctagg tcagcccaag gctgccccct cggtcactct gttcccaccc 420
tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc acactggtg                        459
<210>59
<211>153
<212>PRT
<213>牛
<400>59
Ser Trp Thr Pro Leu Trp Leu Thr Leu Phe Thr Leu Cys Ile Gly Ser
 1               5                  10                  15
Val Val Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu
            20                  25                  30
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
        35                  40                  45
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
50                  55                  60
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
65                  70                  75                  80
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
                85                  90                  95
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
        115                 120                 125
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val
145                 150
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<213>牛
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atgagattcc ctgctcagct cctggggctc ctcctgctct gggtcccagg atccagtggg 60
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atctcctgca agtctactca gagtctgaaa tatagtgatg gaaaaaccta tttgtactgg 180
cttcaacata aaccaggcca atcaccacag cttttgatct atgctgtttc cagccgttac 240
actggggtcc cagacaggtt cactggcagt gggtcagaaa cagatttcac acttacgatc 300
aacagtgtgc aggctgagga tgttggagtc tattactgtc ttcaaacaac atatgtccca 360
aatactttcg gccaaggaac caaggtagag atcaaaaggt ctgatgctga gccatccgtc 420
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gtgaatgatt tctaccccaa agatatcaat gtcaagtgga aagtggatgg ggttactcag 540
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gaggtcagcc acaagagcct gactaccacc ctcgtcaaga gcttcagtaa gaacgagtgt 720
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<213>人
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<213>人
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<213>人
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<212>DNA
<213>人
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<213>人
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<213>人
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<213>人
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<213>人
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<213>人
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<211>43
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<213>人
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<212>DNA
<213>人
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<213>人
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<212>DNA
<213>人
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<213>人
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<213>人
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<213>人
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<213>人
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ggcagcaaca atttcgatgt cttcggaact g                         31
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<213>人
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<212>DNA
<213>人
<400>94
agcagcagca ctcggaactg gga                                  23

Claims (108)

1.具有一种或多种编码全部或部分异种免疫球蛋白(Ig)基因的核酸的转基因有蹄动物，所述基因经历重排并且表达一种以上的异种Ig蛋白。
2.权利要求1的有蹄动物，其中所述异种Ig蛋白是人Ig蛋白。
3.权利要求1的有蹄动物，其中所述核酸包含在染色体片段中。
4.权利要求3的有蹄动物，其中所述染色体片段是ΔHAC或ΔΔHAC。
5.权利要求1的有蹄动物，其中所述有蹄动物是牛、绵羊、猪、或山羊。
6.具有减少功能性内源抗体表达的突变的转基因有蹄动物，其中所述突变包括将转录终止序列插入内源免疫球蛋白核酸。
7.权利要求6的有蹄动物，其中所述突变减少了功能性IgM重链的表达或减少了功能性Ig轻链的表达。
8.权利要求6的有蹄动物，其中所述突变基本去除了功能性内源抗体的表达。
9.权利要求6的有蹄动物，其中所述突变是半合型的。
10.权利要求6的有蹄动物，其中所述突变是纯合型的。
11.权利要求6的有蹄动物，其中所述突变进一步包括将阳性选择标记插入内源免疫球蛋白基因。
12.权利要求11的有蹄动物，其中所述阳性选择标记是抗生素抗性基因。
13.权利要求11的有蹄动物，其中所述阳性选择标记与异种启动子可操作性连接。
14.权利要求10的有蹄动物，其中每个等位基因包括相同的抗生素抗性基因。
15.权利要求10的有蹄动物，其中每个等位基因包括不同的抗生素抗性基因。
16.权利要求6的有蹄动物，其中所述转录终止序列插入内源μ重链核酸的外显子2的起始ATG密码子的下游。
17.权利要求6的有蹄动物，具有一种或多种包含一个或多个转基因的核酸，并且表达由所述转基因编码的mRNA或蛋白。
18.权利要求6的有蹄动物，具有一种或多种包含全部或部分异种免疫球蛋白(Ig)基因的核酸，所述基因经历重排并且表达一种以上的异种Ig分子。
19.权利要求18的有蹄动物，表达异种抗体蛋白。
20.权利要求19的有蹄动物，其中所述异种抗体蛋白是人抗体蛋白。
21.权利要求6的有蹄动物，其中所述有蹄动物是牛、绵羊、猪、或山羊。
22.一种有蹄动物体细胞，包含一种或多种编码全部或部分异种免Ig基因的核酸，其中所述基因能够在B细胞中经历重排并且表达一种或多种异种Ig蛋白。
23.权利要求22的细胞，其中所述核酸编码异种抗体。
24.权利要求22的细胞，其中所述核酸包含在染色体片段中。
25.权利要求22的细胞，其中所述细胞是胎儿成纤维细胞或B细胞。
26.权利要求22的细胞，其中所述有蹄动物是牛、绵羊、猪、或山羊。
27.一种有蹄动物体细胞，包含编码Ig重和/或轻链的核酸中的突变，其中所述突变包括将转录终止序列插入所述核酸。
28.权利要求27的细胞，包含所述IgM重链或所述轻链中的两个等位基因中的突变。
29.权利要求27的细胞，进一步包含一种或多种编码全部或部分异种Ig基因的核酸，其中所述基因能够在B细胞中经历重排并且表达一种或多种异种Ig分子。
30.权利要求27的细胞，其中所述细胞是胎儿成纤维细胞或B细胞。
31.权利要求27的细胞，其中所述有蹄动物是牛、绵羊、猪、或山羊。
32.由权利要求25或30的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤。
33.一种产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)给具有编码异种抗体基因座的有蹄动物施用一种或多种感兴趣的抗原，其中所述基因座中的核酸节段经历了重排，导致所述抗原的特异性抗体蛋白的产生；和
(b)从有蹄动物回收所述抗体。
34.权利要求33的方法，其中所述有蹄动物具有减少内源抗体表达的突变，其中所述突变包括将转录终止序列插入内源免疫球蛋白核酸。
35.权利要求34的方法，其中转录终止序列插入内源μ重链核酸的外显子2的起始ATG密码子的下游。
36.权利要求33的方法，其中所述核酸包含在染色体片段内。
37.权利要求33的方法，其中所述核酸是人类核酸。
38.权利要求33的方法，其中所述有蹄动物是牛、绵羊、猪、或山羊。
39.一种产生抗体的方法，所述方法包括从具有编码异种抗体基因座的有蹄动物回收异种抗体，其中所述基因座中的核酸节段经历了重排，导致一种或多种异种抗体蛋白的产生。
40.权利要求39的方法，其中所述有蹄动物具有减少内源抗体表达的突变，其中所述突变包括将转录终止序列插入内源免疫球蛋白核酸。
41.权利要求39的方法，其中所述核酸包含在染色体片段内。
42.权利要求39的方法，其中所述有蹄动物是牛、绵羊、猪、或山羊。
43.一种产生转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许从透化细胞的细胞核、染色质团或染色体去除因子或从重新编程培养基向细胞核、染色质团或染色体加入因子的条件下在重新编程培养基中孵育权利要求22的透化细胞，从而形成重新编程的细胞；
(b)将所述重新编程的细胞插入有核或去核的卵母细胞，从而形成核转移卵母细胞；和
(c)在允许所述核转移卵母细胞或由所述核转移卵母细胞形成的胚胎发育成胎儿的条件下将所述核转移卵母细胞或所述胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。
44.权利要求43的方法，其中所述重新编程培养基是细胞提取物。
45.权利要求43的方法，其中所述透化细胞的细胞核保持由膜围绕，并且在所述重新编程培养基孵育的过程中，所述细胞核中的染色质不浓缩。
46.权利要求43的方法，其中通过在所述重新编程培养基中孵育所述透化细胞而形成染色质团。
47.权利要求43的方法，其中在允许所述重新编程的细胞的细胞膜重新封闭的条件下孵育所述重新编程的细胞。
48.权利要求43的方法，其中在插入所述核转移卵母细胞前从所述重新编程培养基纯化所述重新编程的细胞。
49.权利要求43的方法，其中所述胎儿发育成存活的后代。
50.权利要求49的方法，进一步包括将所述后代与内源免疫球蛋白核酸中具有突变的转基因有蹄动物交配，其中所述突变包括将转录终止序列插入内源免疫球蛋白核酸。
51.权利要求43的方法，其中在允许细胞分裂的条件下培养来自于步骤(b)的所述核转移卵母细胞，并且得到的细胞之一可以重新克隆一次或多次。
52.权利要求43的方法，其中所述透化细胞和所述核转移卵母细胞来自于相同物种。
53.一种产生转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使来自于权利要求22的细胞的供体细胞核在允许形成染色质团的条件下与重新编程培养基接触；
(b)将所述染色质团插入卵母细胞，从而形成核转移卵母细胞；和
(c)在允许所述核转移卵母细胞或由所述核转移卵母细胞形成的胚胎发育成胎儿的条件下将所述核转移卵母细胞或所述胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。
54.权利要求53的方法，其中所述染色质团在没有DNA复制的条件下形成。
55.权利要求53的方法，其中所述重新编程培养基是有丝分裂提取物、去污剂和盐溶液、去污剂溶液、盐溶液、或蛋白激酶溶液。
56.权利要求53的方法，其中在插入所述核转移卵母细胞前从所述提取物纯化来自于步骤(a)的所述染色质团。
57.权利要求53的方法，其中所述胎儿发育成存活的后代。
58.权利要求53的方法，其中在允许细胞分裂的条件下培养来自于步骤(b)的所述核转移卵母细胞，并且得到的细胞之一可以重新克隆一次或多次。
59.权利要求53的方法，其中所述供体细胞核和所述核转移卵母细胞来自于相同物种。
60.权利要求53的方法，其中所述供体细胞核是二倍体。
61.权利要求43或53的方法，其中所述供体细胞核来自于成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿细胞、胎盘细胞、雌性生殖系统细胞、或胚胎细胞。
62.权利要求61的方法，其中所述细胞是胎儿成纤维细胞。
63.一种产生转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将权利要求22的细胞、所述细胞的细胞核或所述细胞的染色质团插入卵母细胞，从而形成第一胚胎；
(b)使来自所述第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎；其中所述第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎，并且其中所述第一胚胎和所述第二胚胎的至少一个是紧密胚胎；和
(c)将所述第三胚胎在允许所述第三胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
64.一种产生转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将权利要求22的细胞、所述细胞的细胞核或所述细胞的染色质团插入卵母细胞，从而形成第一胚胎；
(b)使来自所述第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎；其中所述第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎，并且其中所述第一胚胎和所述第二胚胎处于不同的细胞期；和
(c)将所述第三胚胎在允许所述第三胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
65.一种产生转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许形成染色质团的条件下使来自于权利要求22的细胞的供体细胞核与重新编程培养基接触；
(b)将所述染色质团插入卵母细胞，从而形成第一胚胎；
(c)使来自所述第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎；其中所述第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎；和
(d)将所述第三胚胎在允许所述第三胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
66.权利要求65的方法，其中步骤(a)包括在允许形成染色质团而不导致DNA复制的条件下使具有少于四组同源染色体的供体细胞核与重新编程培养基接触。
67.一种产生转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许从透化细胞的细胞核、染色质团或染色体去除因子或从重新编程培养基向细胞核、染色质团或染色体加入因子的条件下在重新编程培养基中孵育权利要求22的透化细胞，从而形成重新编程的细胞；
(b)将所述重新编程的细胞插入卵母细胞，从而形成第一胚胎；
(c)使来自所述第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎，其中所述第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎；和
(d)将所述第三胚胎在允许所述第三胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
68.权利要求67的方法，其中不在允许重新编程的细胞的细胞膜重新封闭的条件下孵育重新编程的细胞。
69.权利要求63-65和67的任意一项的方法，其中所述胎儿发育成存活后代。
70.权利要求63-65和67的任意一项的方法，其中所述胎儿的胎盘中至少10％的细胞来源于所述第二胚胎。
71.权利要求63-65和67的任意一项的方法，其中在步骤(a)之前通过微细胞融合将包含未重排的人Ig基因的染色体片段导入所述细胞。
72.权利要求71的方法，其中所述染色体片段是人工修饰的染色体片段。
73.权利要求72的方法，其中所述染色体既包含未重排的人Ig重链核酸，也包含未重排的人Ig轻链核酸。
74.权利要求73的方法，其中所述染色体片段是ΔHAC或ΔΔHAC。
75.一种产生转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将细胞、细胞的染色质团、或细胞核插入卵母细胞，其中所述细胞具有内源抗体重链和/或轻链核酸中的第一种突变；其中所述第一种突变包括将转录终止序列插入所述核酸；和
(c)在允许所述卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎发育成胎儿的条件下将所述卵母细胞或所述胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。
76.权利要求75的方法，进一步包括以下步骤：
(c)从所述胚胎、胎儿或由所述胎儿产生的后代分离细胞；
(d)在所述细胞内的内源抗体重链和/或轻链核酸中导入第二种突变；其中所述第二种突变包括将转录终止序列插入内源免疫球蛋白核酸；
(e)将所述细胞、所述细胞的染色质团或所述细胞的细胞核插入卵母细胞；和
(f)在允许所述卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎发育成胎儿的条件下将所述卵母细胞或所述胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。
77.一种产生功能性内源抗体蛋白的表达减少的转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许从透化细胞的细胞核、染色质团或染色体去除因子或从重新编程培养基向细胞核、染色质团或染色体加入因子的条件下在重新编程培养基中孵育权利要求27的透化细胞，从而形成重新编程的细胞；
(b)将所述重新编程的细胞插入有核或去核的卵母细胞，从而形成核转移卵母细胞；和
(c)在允许所述核转移卵母细胞或由所述核转移卵母细胞形成的胚胎发育成胎儿的条件下将所述核转移卵母细胞或所述胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。
78.权利要求77的方法，其中所述重新编程培养基是细胞提取物。
79.权利要求77的方法，其中所述透化细胞的细胞核保持由膜围绕，并且在所述重新编程培养基孵育的过程中，所述细胞核中的染色质不浓缩。
80.权利要求77的方法，其中通过在所述重新编程培养基中孵育所述透化细胞而形成染色质团。
81.权利要求77的方法，其中在允许所述重新编程的细胞的细胞膜重新封闭的条件下孵育所述重新编程的细胞。
82.权利要求77的方法，其中在插入所述核转移卵母细胞前从所述重新编程培养基纯化所述重新编程的细胞。
83.权利要求77的方法，其中所述胎儿发育成存活的后代。
84.权利要求83的方法，进一步包括使两个后代交配以产生在内源免疫球蛋白核酸的两个等位基因中都具有突变的转基因有蹄动物。
85.权利要求77的方法，其中在允许细胞分裂的条件下培养来自于步骤(b)的所述核转移卵母细胞，并且得到的细胞之一可以重新克隆一次或多次。
86.权利要求77的方法，其中所述透化细胞和所述核转移卵母细胞来自于相同物种。
87.一种产生功能性抗体蛋白的表达减少的转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许形成染色质团的条件下使来自于权利要求27的细胞的供体细胞核与重新编程培养基接触；
(b)将所述染色质团插入卵母细胞，从而形成核转移卵母细胞；和
(c)在允许所述核转移卵母细胞或由所述核转移卵母细胞形成的胚胎发育成胎儿的条件下将所述核转移卵母细胞或所述胚胎转移到宿主有蹄动物的子宫中。
88.权利要求87的方法，其中所述染色质团在没有DNA复制的条件下形成。
89.权利要求87的方法，其中所述重新编程培养基是有丝分裂提取物、去污剂和盐溶液、去污剂溶液、盐溶液、或蛋白激酶溶液。
90.权利要求87的方法，其中在插入所述核转移卵母细胞前从所述提取物纯化来自于步骤(a)的所述染色质团。
91.权利要求87的方法，其中所述胎儿发育成存活的后代。
92.权利要求87的方法，其中在允许细胞分裂的条件下培养来自于步骤(b)的所述核转移卵母细胞，并且得到的细胞之一可以重新克隆一次或多次。
93.权利要求87的方法，其中所述供体细胞核和所述核转移卵母细胞来自于相同物种。
94.权利要求87的方法，其中所述供体细胞核是二倍体。
95.权利要求77或87的方法，其中所述供体细胞核来自于成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿细胞、胎盘细胞、雌性生殖系统细胞、或胚胎细胞。
96.权利要求95的方法，其中所述细胞是胎儿成纤维细胞。
97.一种产生功能性内源抗体蛋白的表达减少的转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将权利要求27的细胞、所述细胞的细胞核或所述细胞的染色质团插入卵母细胞，从而形成第一胚胎；
(b)使来自所述第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎；其中所述第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎，并且其中所述第一胚胎和所述第二胚胎的至少一个是紧密胚胎；和
(c)将所述第三胚胎在允许所述第三胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
98.一种产生功能性内源抗体蛋白的表达减少的转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将权利要求27的细胞、所述细胞的细胞核或所述细胞的染色质团插入卵母细胞，从而形成第一胚胎；
(b)使来自所述第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎；其中所述第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎，并且其中所述第一胚胎和所述第二胚胎处于不同的细胞期；和
(c)将所述第三胚胎在允许所述第三胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
99.一种产生功能性内源抗体蛋白的表达减少的转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许形成染色质团的条件下使来自于权利要求27的细胞的供体细胞核与重新编程培养基接触；
(b)将所述染色质团插入卵母细胞，从而形成第一胚胎；
(c)使来自所述第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎，其中所述第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎；和
(d)将所述第三胚胎在允许所述第三胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
100.权利要求99的方法，其中步骤(a)包括在允许形成染色质团而不导致DNA复制的条件下使具有少于四组同源染色体的供体细胞核与重新编程培养基接触。
101.一种产生功能性内源抗体蛋白的表达减少的转基因有蹄动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许从透化细胞的细胞核、染色质团或染色体去除因子或从重新编程培养基向细胞核、染色质团或染色体加入因子的条件下在重新编程培养基中孵育权利要求27的透化细胞，从而形成重新编程的细胞；
(b)将所述重新编程的细胞插入去核卵母细胞，从而形成第一胚胎；
(c)使来自第一胚胎的一个或多个细胞与来自第二胚胎的一个或多个细胞相接触，从而形成第三胚胎，其中所述第二胚胎是体外受精的胚胎、天然存在的胚胎或孤雌生殖活化的胚胎；和
(d)将所述第三胚胎在允许所述第三胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄动物的子宫中。
102.权利要求101的方法，其中不在允许重新编程的细胞的细胞膜重新封闭的条件下孵育重新编程的细胞。
103.权利要求97-99和101的任意一项的方法，其中所述胎儿发育成存活后代。
104.权利要求97-99和101的任意一项的方法，其中所述胎儿的胎盘中至少10％的细胞来源于所述第二胚胎。
105.权利要求33、39、97-99和101的任意一项的方法，其中所述抗体是单克隆的。
106.权利要求33、39、97-99和101的任意一项的方法，其中所述抗体是多克隆的。
107.权利要求33、39、97-99和101的任意一项的方法，其中所述抗体是从所述有蹄动物的血清或乳汁回收的。
108.权利要求33、39、97-99和101的任意一项的方法，其中所Ig是针对需要的抗原。
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