CN1486365B - 异种(人类)免疫球蛋白在克隆转基因有蹄类动物中的表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转基因牛的产生，所述转基因牛包含导致其内源抗体表达失活和损失并且表达异种抗体(优选人抗体)的遗传修饰。这通过使IgM重链表达失活和任选地通过使所述Ig轻链表达失活，并且进一步导入导致非牛抗体(优选人抗体)表达的人工染色体而得以实现。

Description

异种(人类)免疫球蛋白在克隆转基因有蹄类动物中的表达

发明领域

本发明为带有或者部分或者整个异种抗体基因座的遗传修饰有蹄类动物，所述基因座经历了重排并且表达一个趋异抗体分子群体。特别是，所述异种抗体基因可以来源于人类。另外，本发明提供其中所述内源抗体基因的表达或者被减少或者被消除的有蹄类动物。运用核转移和分子技术的组合，制备所述有蹄类动物(例如牛)中的遗传修饰。这些克隆转基因有蹄类动物提供了一种可更新的、理论上无限的异种多克隆抗体(特别是人抗体)的供应，所述异种多克隆抗体可具有例如作为治疗药、诊断药的用途和可用于纯化目的。

发明背景

1890年，Shibasaburo Kitazato和Emil Behring报道了一个有着特别结果的实验；特别是，他们证明，通过从免疫动物取出血清，并将其注射到未免疫动物体内，可以使免疫从一只动物转移至另一只动物。这一里程碑性的实验成为将被动免疫引入临床实践的基础。今天，人免疫球蛋白(Ig)的制备及其在被动免疫方面的应用是标准的医学实践。仅在美国，人Ig每年的销售额为$1,400,000,000，每年有16公制吨的人抗体用于抗体静脉治疗。在工业最发达国家的经济中有相当水平的消耗，可以预期在发展中国家中其需求将快速增长。目前，用于被动免疫的人抗体得自人类供体的混合血清。这意味着在可用于治疗和预防的人抗体的量存在固有的限制。其需求已经超过了供应，并且通常是严重短缺。

为了解决与人Ig供应不足相关的一些问题，已经开发了各种技术。例如，通过重组方法在组织培养物中生产人Ig是常规技术。特别是，人Ig在CHO表达系统中的重组表达是众所周知的，目前用来生产现在用于治疗的几种人免疫球蛋白(Ig)和嵌合抗体。

已经产生供生产人抗体(例如单克隆抗体)用的保留未经重排的人免疫球蛋白基因的小鼠(参见例如WO98/24893；WO96/33735；WO97/13852；WO98/24884；WO97/07671(EP 0843961)；美国专利5,877,397；美国专利5,874,299；美国专利5,814,318；美国专利5,789,650；美国专利5,770,429；美国专利5,661,016；美国专利5,633,425；美国专利5,625,126；美国专利5,569,825；和美国专利5,545,806)。

另外，WO00/10383(EP 1106061)描述了通过微细胞融合修饰人染色体片段并且将所述片段转移到某些细胞中。

此外，WO01/35735描述了牛IgM重链敲除。

1998年12月15日授予Meade等的美国专利5,849,992以及1998年10月27日授予Meade等的美国专利5,827,690描述了在包括小鼠、绵羊、猪、牛和山羊在内的转基因动物的乳中生产单克隆抗体，其中所述转基因动物在保证人抗体在乳房上皮细胞中表达的启动子控制之下表达所述人Ig基因。从本质上讲，这导致所述抗体在这类动物(例如牛)的乳中表达。

然而，虽然先前已经报道了这些，但非常需要在血流中产生所需物种的抗体(特别是多克隆抗体)、尤其是人Ig并且产生一系列不同的对所需抗原特异性的抗体的改进方法和增强的转基因动物，尤其是牛.更尤其是在有蹄类动物中生产人Ig将特别有益，因为(1)牛可以产生大量的抗体，(2)牛可以用人类病原体或其它病原体免疫，并且(3)牛可以用来制备抗人类抗原的人抗体.大量多克隆抗体的可得性对于传染病的治疗和预防、免疫系统的调节、人细胞例如癌细胞的清除以及特定人类分子的调节有利.虽然已经在小鼠中表达了人Ig，但人Ig在牛中或是在其它有蹄类动物中是否部分重排和表达是不可预测的，因为在抗体基因结构、抗体产生机制和B细胞功能方面存在差异.特别是，与小鼠不同，牛和羊在其免疫生理学方面与人类有所不同(Lucier等，J.Immunol.161：5438，1998；Parng等，J.Immunol.157：5478，1996；和Butler，Rev Sci.Tech.17：43，2000)。例如，与抗体基因的多样化在人类和小鼠中依赖于基因重排相比，抗体基因的多样化在牛和羊中更多地依赖于基因转变。此外，在人类和小鼠中B细胞的主要位置是在骨髓中，而在牛和羊中B细胞位于回肠淋巴集结中。因此，预测在牛(或其它有蹄类动物)的B细胞谱系中是否发生人免疫球蛋白基因座的免疫球蛋白重排和多样化，在本发明之前即使并非是不可能的，也是困难的。另外，也一直难以预测牛在无其内源Ig的情况下或者在人抗体的干扰下是否能够生存，即诱发其正常的免疫功能。例如，不能确定表达人Ig的牛B细胞是否正确地迁移至牛的回肠淋巴集结中，因为这在人类中是不发生的。也不清楚介导补体激活、细胞因子释放的诱导以及抗原清除的人Fc受体功能在牛系统中是否正常。

发明简述

本发明的一个目的是产生重排并表达人类或其它物种Ig基因座的转基因有蹄类动物(例如转基因牛)。优选通过稳定地导入含有人Ig基因的人染色体片段以产生除内源Ig之外或者代替内源Ig而具有人Ig或另一种物种Ig的B细胞的转基因有蹄类动物(例如牛)来实现这一点。这也可以通过将编码异种免疫球蛋白链或异种抗体的核酸整合到有蹄类动物的染色体中来实现。本发明的另一个目的是产生其内源Ig的表达已被减少或敲除的转基因有蹄类动物(例如转基因牛)。例如，可以将无义突变或缺失突变引入编码内源免疫球蛋白链或抗体的核酸中。

本发明的一个更具体的目的是产生转基因有蹄类动物(例如转基因牛)，其中轻链基因座的恒定区外显子和/或μ恒定区外显子已被敲除，并且已经稳定地掺入了含有编码另一物种(优选人类)免疫球蛋白的基因座的人工染色体。

本发明的一个更具体的目的是利用核转移和同源重组方法产生克隆有蹄类动物(例如克隆牛)，其中轻链基因座的内源恒定区外显子和/或重链基因座的μ恒定区外显子已被敲除，并且稳定地导入了包含异种重链和轻链Ig基因的人工染色体，优选含有人重链和轻链Ig基因座的人类人工染色体，产生了产生另一种物种(优选人类)的Ig、而不产生其内源Ig的转基因有蹄类动物。

本发明的另一目的是产生有蹄类动物(例如牛)的体细胞或胚胎干(ES)细胞，优选成纤维细胞或B细胞，更优选雄性体细胞，其中内源IgM重链基因中的一个或两个等位基因已被突变，例如通过同源重组被破坏。本发明的一个相关目的是产生克隆有蹄类动物(例如牛)胎儿和后代，其中所述IgM重链基因座中的一个或两个等位基因已被突变，例如通过同源重组被破坏。

本发明的再一目的是产生有蹄类动物(例如牛)的体细胞或ES细胞，优选成纤维细胞或B细胞，例如雌性或雄性体细胞，其中所述IgM重链基因中的一个等位基因已被突变，例如通过同源重组被破坏.

本发明的一个相关目的是产生克隆有蹄类动物(例如牛)胎儿或后代，其中所述内源重链IgM基因中的一个等位基因已被突变，例如通过同源重组被破坏。

本发明的又一目的是通过让分别带有突变例如内源IgM中的一个等位基因被破坏或Ig轻链中的一个等位基因被破坏的雄性和雌性有蹄类动物(例如牛)交配，或者通过连续同源重组，产生雄性和雌性重链和轻链半合敲除(M和F Hemi H/L)胎儿和有蹄类动物幼仔。

本发明的另一目的是产生纯合敲除(Homo(同)H/L)胎儿，其中IgM基因的两个重链等位基因以及所述Ig轻链的两个等位基因都通过连续同源重组或者通过让上述雄性和雌性重链和轻链半合敲除者(M和F Hemi H/L)交配而被破坏。

本发明的另一具体目的是插入含有非有蹄类动物Ig或其重链或轻链的功能表达所必需的基因的核酸(例如人工染色体)。这些Ig最好是通过将编码这些Ig或Ig链的核酸导入Homo或Hemi H/L有蹄类动物(例如牛)体细胞(优选成纤维细胞)并且产生克隆有蹄类动物(例如克隆牛)而产生的人Ig，其中所述核酸(例如人类人工染色体DNA)被传递至种系中。

本发明的再一目的是通过核转移将含有保证Ig表达的基因的人工染色体(优选人类人工染色体(HAC))导入上述纯合敲除者(Homo H/L)细胞中，并且产生对免疫应答而表达非有蹄类动物Ig(优选人Ig)并且经历亲和性成熟的有蹄类动物(例如牛)。

本文所用的“人工染色体”是指具有人工修饰诸如加入选择标记、加入克隆位点、缺失一个或多个核苷酸、取代一个或多个核苷酸等的哺乳动物染色体或其片段。“人类人工染色体(HAC)”是指由一个或多个人染色体产生的人工染色体。人工染色体可以独立于宿主细胞的内源染色体而在宿主细胞中保持。在这种情况下，HAC可以与内源染色体一道稳定地复制和分离。或者，它可能被易位或插入到宿主细胞的内源染色体中。可以同时或顺序将两个或两个以上的人工染色体导入宿主细胞中。例如，可以导入来源于人类14号染色体(包含所述Ig重链基因)、人类2号染色体(包含所述Igκ链基因)和人类22号染色体(包含所述Igλ链基因)的人工染色体。或者，可以导入既包含异种Ig重链基因又包含Ig轻链基因的人工染色体，例如ΔHAC或ΔΔHAC。所述重链基因座和轻链基因座最好位于不同的染色体臂(即位于中心粒的不同侧)。在再一优选实施方案中，所述HAC的总大小小于或等于大约10、9、8或7兆碱基。

本发明的又一目的是提供来源于转基因有蹄类动物(例如转基因牛)的供被动免疫用的人Ig或其它Ig源，所述转基因有蹄类动物含有并表达在所导入的含有人Ig重链和轻链基因的核酸(例如人工染色体，优选人类人工染色体(HAC))上携带的Ig基因。在本发明中，这些核酸(例如HAC)包括人染色体(人染色体片段)的天然排列的区段或者包含人工工程化人染色体片段(即它们相对于人类基因组而言可以是重排的)的人工染色体。

本发明的另一目的是用来源于上述转基因有蹄类动物(例如转基因牛)的B细胞生产杂交瘤和单克隆抗体。

本发明的再一目的是生产包含多克隆人Ig的有蹄类动物抗血清或乳。这类人Ig、优选人IgG可以用作静脉免疫球蛋白(IVIG)以治疗或预防人类疾病。所述多克隆人Ig最好对感兴趣的抗原具有反应性。

本发明的又一目的是产生在一个或多个内源基因中具有一个或多个突变的转基因有蹄类动物。所述转基因有蹄类动物通过将细胞、得自细胞的染色质或得自细胞的细胞核插入到卵母细胞中而产生。所述细胞在内源基因中具有一个所述细胞天然不表达的第一突变。将所述卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎在允许所述卵母细胞或所述胚胎发育成胎儿的条件下，转移到宿主有蹄类动物的子宫中。最好让所述胎儿发育成有活力的后代。在其它优选实施方案中，通过将包含一个盒的核酸插入到所述细胞中，所述盒包含与编码选择标记的核酸操作上连接并且与一种或多种与待突变内源基因有显著序列同一性的核酸操作上连接的启动子，从而将所述盒整合到所述基因的一个内源等位基因中，而导入所述第一突变。在其它优选实施方案中，通过将包含第一盒的核酸插入到所述细胞中，所述第一盒包含与编码第一选择标记的核酸操作上连接并且与一个与待突变内源基因有显著序列同一性的第一核酸操作上连接的第一启动子，从而将所述第一盒整合到所述基因的第一内源等位基因中，而导入所述突变，产生第一转基因细胞。将包含第二盒的核酸插入到所述第一转基因细胞中，所述第二盒包括与编码第二选择标记的核酸操作上连接并且与一个与所述基因有显著序列同一性的第二核酸操作上连接的第二启动子。第二选择标记不同于第一选择标记，将所述第二盒整合到所述基因的第二内源等位基因中，产生第二转基因细胞。在另外的优选实施方案中，从所述胚胎、胎儿或者从所述胎儿产生的后代分离出细胞，并且将另一突变引入所述细胞的基因中。然后用所得的细胞、得自所述细胞的染色质或者得自所述细胞的细胞核，进行第二轮核转移，产生具有两个或两个以上突变的转基因有蹄类动物。所述突变位于基因的相同或不同等位基因中，或者位于不同基因中。在优选实施方案中，被突变的细胞为成纤维细胞(例如胎成纤维细胞)。被突变的内源基因最好与在成纤维细胞中无活性的内源启动子操作上连接。在其它优选实施方案中，与所述被突变的内源基因操作上连接的内源启动子的活性比与内源管家基因例如GAPDH操作上连接的内源启动子活性低80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％。启动子活性可以用任何标准测定来测量，所述测定例如测量所述基因所编码的mRNA或蛋白的水平(参见例如Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology，volume 2，第11.13.1-11.13.3页，JohnWiley & Sons，1995)。这种产生转基因有蹄类动物的方法的优点是使得在供体细胞(即作为核转移所用的遗传材料来源的细胞)中不表达的基因可以被突变。

因此，要求保护的本发明的特征在于具有一种或多种编码整个或部分异种免疫球蛋白(Ig)基因的核酸的转基因有蹄类动物，所述基因经历重排并且表达不止一种异种Ig分子。在一个优选实施方案中，所述编码整个或部分异种Ig基因的核酸基本上是人类核酸。所述核酸最好编码异种抗体，例如人抗体或多克隆抗体。在各种实施方案中，所述Ig链或抗体在血清和/或乳中表达。在其它实施方案中，所述核酸包含在染色体片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的实施方案中，所述核酸独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持。

在另外的实施方案中，所述核酸整合到所述有蹄类动物的染色体中.在其它实施方案中，所述核酸包括未经重排的抗体轻链核酸区段，其中编码V基因区段的所有核酸区段与编码J基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸.在另外的实施方案中，所述核酸包括未经重排的抗体重链核酸区段，其中或者(i)编码V基因区段的所有核酸区段与编码D基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸，和/或(ii)编码D基因区段的所有核酸区段与编码J基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸.在另一优选实施方案中，所述有蹄类动物在内源Ig基因、α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因、朊病毒基因和/或J链基因中的一个或两个等位基因中有突变.在其它优选实施方案中，所述有蹄类动物具有编码外源J链例如人J链的核酸.所述有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或山羊.

另一方面，本发明的特征在于具有减少内源抗体表达的突变的转基因有蹄类动物。所述突变最好减少功能性IgM重链的表达，或者基本上消除功能性IgM重链的表达。在其它优选实施方案中，所述突变减少功能性Ig轻链的表达，或者基本上消除功能性Ig轻链的表达。在另外的优选实施方案中，所述突变减少功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达，或者所述突变基本上消除功能性IgM重链和功能性IgM轻链的表达。所述有蹄类动物最好在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白和/或J链的内源核酸中的一个或两个等位基因中也有突变。在其它优选实施方案中，所述有蹄类动物具有编码外源J链例如人J链的核酸。在另一优选实施方案中，所述有蹄类动物具有一种或多种编码整个或部分异种Ig基因的核酸，所述基因经历重排并且表达不止一种异种Ig分子。所述编码整个或部分异种Ig基因的核酸基本上是人类核酸。在其它优选实施方案中，所述核酸编码异种抗体，例如得自另一属的抗体(例如人抗体)或者多克隆抗体。在各种实施方案中，所述Ig链或抗体在血清中表达。在其它实施方案中，所述核酸包含在染色体片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的实施方案中，所述核酸独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持。在其它实施方案中，所述核酸整合到所述有蹄类动物的染色体中。所述有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或山羊。

本发明也提供得自任何本发明有蹄类动物的细胞或者可用于产生任何本发明有蹄类动物的细胞。

因此，另一方面，本发明的特征在于具有一种或多种编码整个或部分异种Ig基因的核酸的有蹄类动物体细胞，所述基因能够在B细胞中经历重排并且表达一种或多种异种Ig分子。所述编码整个或部分异种Ig基因的核酸编码一种异种抗体。在各种实施方案中，所述核酸包含在染色体片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的实施方案中，所述核酸独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持。在其它实施方案中，所述核酸整合到所述细胞的染色体中。在另一实施方案中，所述核酸基本上是人类核酸。所述异种抗体优选为得自另一属的抗体，例如人抗体。所述细胞最好在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白和/或J链的内源核酸中的一个或两个等位基因中有突变。在其它优选实施方案中，所述细胞具有编码外源J链例如人J链的核酸。示例性的有蹄类动物细胞包括胎成纤维细胞和B细胞。所述有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或山羊。

另一方面，本发明的特征在于在编码Ig重链和/或轻链的核酸中有突变的有蹄类动物体细胞.在优选实施方案中，所述细胞在IgM重链或所述Ig轻链中的一个或两个等位基因中有突变.示例性的突变包括无义突变和缺失突变.所述细胞最好在在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白和/或J链的内源核酸中的一个或两个等位基因中有突变.在其它优选实施方案中，所述细胞具有编码外源J链例如人J链的核酸.在优选实施方案中，所述细胞也具有一种或多种编码整个或部分异种Ig基因的核酸，所述基因能够在B细胞中经历重排并且表达一种或多种异种Ig分子.所述编码整个或部分异种Ig基因的核酸优选基本上为人类核酸和/或编码异种抗体，例如得自另一属的抗体(例如人抗体).在各种实施方案中，所述核酸包含在染色体片段中，从而使所述核酸独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持.优选的染色体片段包括ΔHAC和ΔΔHAC.在另外的实施方案中，所述核酸独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持.在其它实施方案中，所述核酸整合到所述细胞的染色体中.示例性的有蹄类动物细胞包括胎成纤维细胞和B细胞.所述有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或山羊.

另一方面，本发明的特征在于通过本发明的有蹄类动物B细胞与骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤。所述杂交瘤最好分泌外源抗体，例如人抗体。

本发明也提供用本发明的有蹄类动物生产抗体的方法。一种这样的方法涉及给予具有一种或多种编码异种抗体基因座的核酸的有蹄类动物一种或多种感兴趣的抗原。所述基因座中的所述核酸区段经历重排，导致产生对所述抗原特异性的抗体，然后从所述有蹄类动物回收所述抗体。在各种实施方案中，编码所述异种抗体基因座的核酸包含在染色体片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。所述染色体片段优选独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持。在其它实施方案中，所述核酸整合到所述有蹄类动物的染色体中。所述核酸优选基本上为人类核酸。在其它优选实施方案中，所述抗体的轻链和/或所述抗体的重链由人类核酸编码。所述抗体可以为单克隆抗体或者为多克隆抗体。针对特定抗原的单克隆抗体和多克隆抗体有各种各样的用途；例如，它们可以用作针对致病微生物例如细菌或病毒感染的预防或治疗组合物中的组分。在各种实施方案中，从所述有蹄类动物的血清或乳中回收所述抗体。在优选实施方案中，所述有蹄类动物具有减少内源抗体表达、减少功能性IgM重链表达、或者减少功能性Ig轻链表达的突变。所述有蹄类动物优选在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白和/或J链的内源核酸中的一个或两个等位基因中有突变。在其它优选实施方案中，所述有蹄类动物具有编码外源J链例如人J链的核酸。所述有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或山羊。

在一个相关方面，本发明的特征在于另一种生产抗体的方法。该方法涉及从具有编码异种抗体基因座的核酸的有蹄类动物回收异种抗体。所述基因座中的所述核酸区段经历重排，导致产生异种抗体。在各种实施方案中，所述编码异种抗体基因座的核酸包含在染色体片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。在特定实施方案中，所述核酸独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持。在其它实施方案中，所述核酸整合到所述有蹄类动物的染色体中。所述核酸优选基本上为人类核酸。在特定实施方案中，所述抗体的轻链和/或所述抗体的重链由人类核酸编码。所述抗体可以为单克隆抗体或者为多克隆抗体。在特定实施方案中，无需用特定抗原免疫所述有蹄类动物而产生的多克隆抗体例如IgG抗体，用作用人血清生产的IVIG(静脉免疫球蛋白)的治疗代用品。在各种实施方案中，从所述有蹄类动物的血清或乳中回收所述抗体。所述有蹄类动物优选具有减少内源抗体表达、减少功能性IgM重链表达、或者减少功能性Ig轻链表达的突变。所述有蹄类动物优选在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白和/或J链的内源核酸中的一个或两个等位基因中有突变。在其它优选实施方案中，所述有蹄类动物具有编码外源J链例如人J链的核酸。所述有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或山羊。

本发明也提供用于产生转基因有蹄类动物的方法。这些方法可以用来产生具有所需突变或者具有所需异种核酸的转基因有蹄类动物。

在一个这样的方面，本发明的特征在于一种产生转基因有蹄类动物的方法，所述方法涉及将细胞、得自细胞的染色质或者得自细胞的细胞核插入到卵母细胞中.所述细胞在内源抗体重链和/或轻链核酸中包括一个第一突变.将所述卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎在允许所述卵母细胞或所述胚胎发育成胎儿的条件下，转移到宿主有蹄类动物的子宫中.最好让所述胎儿发育成有活力的后代.用于产生所述转基因有蹄类动物的细胞在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白和/或J链的内源核酸中的一个或两个等位基因中有突变.在其它优选实施方案中，所述细胞具有编码外源J链例如人J链的核酸.在其它实施方案中，所述细胞包括一种或多种编码整个或部分异种Ig基因的核酸，所述基因能够在B细胞中经历重排并且表达一种或多种异种Ig分子.所述编码整个或部分异种Ig基因的核酸编码异种抗体.在其它实施方案中，所述核酸整合到所述细胞的染色体中.所述异种抗体优选为得自另一属的抗体，例如人抗体.在特定实施方案中，所述核酸包含在染色体片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中.在其它特定实施方案中，所述染色体片段独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持.所述有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或山羊.

在上述方面的各种实施方案中，所述方法也包括从所述胚胎、所述胎儿或者由所述胎儿产生的后代分离细胞，并且在所述细胞的内源抗体重链和/或轻链核酸中引入第二突变。将所述细胞、得自所述细胞的染色质、或者得自所述细胞的细胞核插入到卵母细胞中，并且将所述卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎在允许所述卵母细胞或者所述胚胎发育成胎儿的条件下转移到宿主有蹄类动物的子宫中。

在上述方面的其它实施方案中，用来产生所述转基因有蹄类动物的细胞通过包括下述步骤的方法制备：将具有一个盒的核酸插入所述细胞中，所述盒包括与编码选择标记的核酸操作上连接并且与一种或多种与所述抗体重链或轻链核酸具有显著序列同一性的核酸操作上连接的启动子。将所述盒整合到所述抗体重链或轻链核酸中的一个内源等位基因中。

在其它实施方案中，所述细胞通过将具有第一盒的核酸插入到所述细胞中而产生，所述第一盒包括与编码第一选择标记的核酸操作上连接并且与一种与所述抗体重链或轻链核酸具有显著序列同一性的第一核酸操作上连接的第一启动子。将所述第一盒整合到所述抗体重链或轻链核酸的第一内源等位基因中，产生第一转基因细胞。

向所述第一转基因细胞中插入具有第二盒的核酸，所述第二盒包括与编码第二选择标记的核酸操作上连接并且与一种与所述抗体重链或轻链核酸具有显著序列同一性的第二核酸操作上连接的第二启动子。所述第二选择标记不同于所述第一选择标记。将所述第二盒整合到所述抗体重链或轻链核酸的第二内源等位基因中，产生第二转基因细胞。

再一方面，本发明的特征在于另一种产生转基因有蹄类动物的方法.该方法涉及将具有一种或多种异种核酸的细胞插入到卵母细胞中.所述异种核酸编码整个或部分异种Ig基因，并且所述基因能够在B细胞中经历重排并且表达不止一种异种Ig分子.将所述卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎在允许所述卵母细胞或所述胚胎发育成胎儿的条件下，转移到宿主有蹄类动物的子宫中.最好让所述胎儿发育成有活力的后代.所述编码整个或部分异种Ig基因的核酸优选编码异种抗体.在其它优选实施方案中，所述抗体为多克隆抗体.在另外的优选实施方案中，所述免疫球蛋白链或抗体在血清和/或乳中表达.在各种实施方案中，所述核酸包含在染色体片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中.所述核酸可以独立于宿主染色体而在有蹄类动物细胞中保持或者整合到所述细胞的染色体中.所述核酸优选基本上为人类核酸.在其它实施方案中，所述异种抗体为得自另一属的抗体，例如人抗体.所述有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或山羊.

在再一相关方面，本发明的特征在于另一种产生转基因有蹄类动物的方法。该方法涉及将细胞、得自细胞的染色质或得自细胞的细胞核插入到卵母细胞中。所述细胞在所述细胞天然不表达的内源基因中包括一个第一突变。将所述卵母细胞或者由所述卵母细胞形成的胚胎在允许所述卵母细胞或所述胚胎发育成胎儿的条件下，转移到宿主有蹄类动物的子宫中。最好让所述胎儿发育成有活力的后代。被突变的基因最好编码抗体、α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒蛋白或J链。在另一优选实施方案中，用于产生所述转基因有蹄类动物的细胞为成纤维细胞，例如胎成纤维细胞。

在上述方法的各种实施方案中，所述细胞通过下述步骤制备：将具有一个盒的核酸插入到所述细胞中，所述盒包括与编码选择标记的核酸操作上连接并且与一种或多种与所述基因具有显著序列同一性的核酸操作上连接的启动子；从而将所述盒整合到所述基因的一个内源等位基因中。在其它实施方案中，所述细胞通过将具有第一盒的核酸插入到所述细胞中而产生，所述第一盒包括与编码第一选择标记的核酸操作上连接并且与一种与所述基因具有显著序列同一性的第一核酸操作上连接的第一启动子。将所述第一盒整合到所述基因的第一内源等位基因中，产生第一转基因细胞。向所述第一转基因细胞中插入具有第二盒的核酸，所述第二盒包括与编码第二选择标记的核酸操作上连接并且与一种与所述基因具有显著序列同一性的第二核酸操作上连接的第二启动子。所述第二选择标记不同于所述第一选择标记。将所述第二盒整合到所述基因的第二内源等位基因中，产生第二转基因细胞。

在上述方面的其它实施方案中，所述方法也包括将第二突变引入到所述转基因有蹄类动物中。在这些实施方案中，从所述胚胎、所述胎儿或者由所述胎儿产生的后代分离细胞，并且将第二突变引入到所述细胞的内源基因中。将所述细胞、得自所述细胞的染色质或者得自所述细胞的细胞核插入到卵母细胞中，并且将所述卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎在允许所述卵母细胞或所述胚胎发育成胎儿的条件下，转移到宿主有蹄类动物的子宫中。

本发明的有蹄类动物可以用来生产含有感兴趣抗体的抗血清或乳。在一个这样的方面，本发明的特征在于具有多克隆人免疫球蛋白的有蹄类动物抗血清。所述抗血清优选得自牛、绵羊、猪或山羊。在另一优选实施方案中，所述Ig针对所需抗原。

再一方面，本发明的特征在于具有多克隆人Ig的有蹄类动物乳。所述乳优选得自牛、绵羊、猪或山羊。在另一优选实施方案中，所述Ig针对所需抗原。

在本发明各个方面的优选实施方案中，所述重链是μ重链，而所述轻链是λ或κ轻链。在其它优选实施方案中，所述编码异种免疫球蛋白链或抗体的核酸为其未经重排形式。最好将感兴趣的抗原给予具有异种免疫球蛋白基因座的转基因有蹄类动物，从而产生与所述感兴趣抗原具有反应性的抗体。在其它优选实施方案中，所述有蹄类动物产生不止一类异种抗体。在各种实施方案中，所述有蹄类动物产生不止一种不同的异种Ig或抗体。优选的核转移方法包括将本发明的细胞、得自所述细胞的染色质或者得自所述细胞的细胞核插入到去核或有核卵母细胞中，并且将所述卵母细胞或者由所述卵母细胞形成的胚胎在允许所述卵母细胞或者所述胚胎发育成胎儿的条件下，转移到宿主有蹄类动物的子宫中。

在本发明各个方面的其它优选实施方案中，所述有蹄类动物在内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸中的一个或两个等位基因中有突变。所述突变优选减少或消除所述内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶、半乳糖基(α1，3)半乳糖表位、朊病毒蛋白和/或J链的表达。在另外的优选实施方案中，所述有蹄类动物含有异种J链核酸，例如人J链核酸。所述有蹄类动物优选产生含人J链的人IgA或IgM分子。在本发明的各种实施方案中，用来使内源有蹄类动物核酸突变的核酸(例如敲除盒，所述敲除盒包括与编码选择标记的核酸操作上连接并且与一种与待突变基因有显著序列同一性的核酸操作上连接的启动子)不包含在病毒载体例如腺病毒载体或腺相关病毒载体中。例如，所述核酸可以包含在质粒或人工染色体中，用不涉及细胞的病毒感染的标准方法例如转染或者脂转染法，将所述核酸插入到有蹄类动物细胞中。在再一实施方案中，用来使内源有蹄类动物核酸突变的核酸(例如敲除盒，所述敲除盒包括与编码选择标记的核酸操作上连接并且与一种与待突变基因有显著序列同一性的核酸操作上连接的启动子)包含在病毒载体例如腺病毒载体或腺相关病毒载体中。按照该实施方案，用含有所述病毒载体的病毒来感染有蹄类动物细胞，导致所述病毒载体的一部分或者整个病毒载体插入到所述有蹄类动物细胞中。

示例性有蹄类动物包括奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄目(Artiodactyla)的成员，例如牛属(Bos)的任何成员。其它优选的有蹄类动物包括绵羊、大角羊、山羊、美洲野牛、羚羊、牛、马、驴子、骡、鹿、驼鹿、北美驯鹿、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼、猪和象。优选所述转基因有蹄类动物表达得自另一属的免疫球蛋白链或抗体，例如得自任何其它哺乳动物的抗体。

本文所用的“排列前(pre-aHanged)或未经重排形式的核酸”是指尚未经历V(D)J重组的核酸。在优选实施方案中，编码抗体轻链V基因区段的所有核酸区段与编码J基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸。编码抗体重链V基因区段的所有核酸区段最好与编码D基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸，和/或编码抗体重链D基因区段的所有核酸区段与编码J基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸。未经重排形式的核酸优选基本上为人类核酸。在其它优选实施方案中，所述核酸与得自人类的天然存在的核酸的对应区有至少70％、80％、90％、95％或99％相同。

附图简述

图1A包括用来产生含有Ig敲除和人类人工染色体的母牛的方法的概述。图1A中的时间列基于以下的估计：制备所述Ig敲除载体和产生敲除细胞需18个月，从所述敲除细胞产生胎儿需2个月，进行后续的敲除需9个月，妊娠产出幼仔需9个月，在可以从幼仔产生胚胎之前需12个月，而进行HAC转移需6个月。

图1B包括用来产生在内源Ig基因中有突变并且含有ΔHAC或ΔΔHAC的母牛的方法的概述。对于图1B中的时间列，估计每周筛选250个集落，在3个月内总共筛选3,000个集落，以便分离雄性和雌性敲除细胞。假设每1,500个集落产生一个或多个敲除集落。纯合敲除有蹄类动物可以通过下述方法产生：(1)在核转移之前，将第二Ig突变引入分离的敲除细胞中，(2)在得自胚胎、胎儿(例如妊娠约60天的胎儿)或者由第一轮核转移产生的后代的细胞中引入第二Ig突变，并且用所得的纯合细胞作为第二轮核转移中的供体细胞，或者(3)让半合型有蹄类动物交配。在图1A和1B中，“同”表示纯合的；“半”表示半合子的；“H”表示重链；“L”表示轻链；“HAC”表示人类人工染色体；“HAC 1”表示任一种HAC；而“HAC 2”表示第二种HAC。

图2A包括按照本发明的μ(IgM重链)敲除构建体。图2B为得自Holstein牛(荷兰牛)的免疫球蛋白基因座的限制性图谱。

图3A和3B包括构建体“pSTneoB”和“pLoxP-STneoB”的示意图，所述构建体用来产生图3C中所示的μ敲除DNA构建体。图3D为在所述μ敲除构建体中用作第一同源区的基因组牛μ重链基因座的1.5kb区的多核苷酸序列(SEQ ID NO：47)。图3E为在所述μ敲除构建体中用作第二同源区的基因组牛μ重链基因座的3.1kb区的多核苷酸序列(SEQ ID NO：48)。在该序列中，每个“n”代表任何核苷酸或者无核苷酸。连续“n”核苷酸区代表其多核苷酸序列尚未测定的大约0.9-10kb的区。图3F为嘌呤霉素抗性牛μ重链敲除构建体的示意图。图3G为牛κ轻链cDNA的多核苷酸序列(SEQ ID NO：60)。在κ轻链敲除构建体中可以使用完整的该序列或该序列的一部分。另外，这种κ轻链可以用来分离用于κ轻链敲除构建体中的基因组κ轻链序列。

图4是构建ΔHAC和ΔΔHAC的示意图。

图5是琼脂糖凝胶的照片，表明在ΔHAC胎儿中存在编码人重链和轻链的基因组DNA。

图6是琼脂糖凝胶的照片，表明人Cμ外显子3和4在妊娠77天的ΔHAC胎儿(胎儿#5996)中的表达。

图7是琼脂糖凝胶的照片，表明内源牛重链在ΔHAC胎儿#5996中的重排。

图8是琼脂糖凝胶的照片，表明重排的人重链在ΔHAC胎儿#5996中的表达。

图9是琼脂糖凝胶的照片，表明由所述人重链基因座剪接的恒定区在ΔHAC胎儿#5996中的表达。

图10是琼脂糖凝胶的照片，表明重排的人重链在ΔHAC胎儿#5996中的表达。

图11A是得自ΔHAC胎儿#5996的重排人重链转录物的多核苷酸序列(SEQ ID NO：49)。图11B是该序列(“查询序列”)与人抗肺炎球菌抗体(“待测序列”)(分别为SEQ ID NO：50和51)的一个区的序列比对。对于得自ΔHAC胎儿#5996的查询序列而言，仅显示了不同于所述人抗肺炎球菌抗体序列的对应核苷酸的那些核苷酸。

图12A和12B是得自ΔHAC胎儿#5996的重排人重链转录物的另外两个多核苷酸序列(SEQ ID NO：52和54)及其导出氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：53和55)。

图13是琼脂糖凝胶的照片，证明ΔΔHAC胎儿#5580既含有人重链免疫球蛋白基因座，又含有人轻链免疫球蛋白基因座。

图14是琼脂糖凝胶的照片，证明ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B既含有人重链免疫球蛋白基因座，又含有人轻链基因座。

图15是琼脂糖凝胶的照片，表明从人重链基因座剪接的μ恒定区在ΔΔHAC胎儿#5542A中的表达。

图16是琼脂糖凝胶的照片，表明所述人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达。

图17是琼脂糖凝胶的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中的重排和表达。

图18是琼脂糖凝胶的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A中的重排和表达.

图19是琼脂糖凝胶的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达。

图20是得自ΔΔHAC胎儿#5442A的重排人轻链转录物的多核苷酸序列和相应的导出氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：56和57)。

图21是得自ΔΔHAC胎儿#5442A的重排人轻链转录物的另外一个多核苷酸序列和相应的导出氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：58和59)。

图22A-22H是ΔΔHAC胎儿#5442A(图22A-22D)和5442B(图22E-22H)表达人λ轻链和牛重链蛋白的FACS分析图。让得自这些胎儿的脾的淋巴细胞与藻红蛋白标记的抗人λ抗体(图22C和22D)、FITC标记的抗牛IgM抗体(图22D和22H)或无抗体(图22A、22B、(22E和22F)反应，然后在FASCalibur细胞分类器上分析。用其中一种所述抗体标记的细胞的百分率显示在每条频率曲线的下方。

图23为α-(1，3)-半乳糖基转移酶敲除载体的示意图，所述载体用来将嘌呤霉素抗性基因和转录终止序列插入到牛细胞中的内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因中。

图24是含有外显子2、3和4、用作所述AAV打靶载体骨架的BamHI-XhoI片段的示意图。新霉素抗性标记用于通过插入到外显子4中而对所述基因座进行插入诱变。指示了用来随后证实正确打靶的PCR引物的退火位点的位置。

图25是构建设计用以除去牛内源IgH序列的腺相关病毒构建体的示意图。

图26是琼脂糖凝胶的照片，显示正确打靶事件的各个转导克隆的PCR分析。在该实验中使用的载体示于图24。指示正确打靶的PCR产物以星号标注。

图27是列出携带HAC的胚胎妊娠率的表。

发明详述

如上所述，本发明涉及产生转基因有蹄类动物，优选转基因牛，其中内源Ig的表达任选地被敲除，并且稳定地导入了包含产生另一物种(优选人类)的功能性抗体所必需的基因的核酸(优选人工染色体)。因而，可以获得不产生其内源抗体、而产生另一物种抗体的转基因动物。可以产生任何非内源抗体，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、狗、猫、小鼠、大鼠或豚鼠的抗体。虽然先前已经报道了在山羊中产生人单克隆抗体，但这并未在牛中、在血清中或在不表达其内源抗体的任何有蹄类动物中实现。此外，在转基因有蹄类动物中尚未进行种系(未经重排的)重链或轻链基因的插入、这些基因的重排以及多样化抗体的表达。不可预测这类有蹄类动物是否能够生存，因为不能确定人Ig是否被功能表达，或者以足以保证适当免疫应答的量表达。此外，人染色体是否稳定地保持在转基因有蹄类动物中是不确定的。再者，该有蹄类动物(例如牛)的B细胞是否能够表达或者正确地重排人Ig或其它非内源Ig也是不确定的。

在本方法的一个优选实施方案中，异种免疫球蛋白的生产基本上通过联合应用核转移、同源重组技术和携带完整异种Ig基因座的人工染色体的导入来实现.更具体地讲，所述方法优选包括定向破坏所述IgM重链基因中的一个或两个等位基因，并且任选地定向破坏所述Ig轻链基因中的一个或两个等位基因，虽然异种抗体的生产也可以在野生型动物(即无Ig敲除的动物)中实现.基因敲除可以通过连续同源重组、然后通过另一个交配步骤来实现.在一个优选实施方案中，这通过最初用合适的同源重组载体实现定向破坏组织培养物中雄性或雌性有蹄类动物(例如牛)胎成纤维细胞的IgM重链基因的一个等位基因来实现.胎成纤维细胞的应用优于某些其它体细胞，因为这些细胞容易在组织培养物中繁殖和遗传操作.然而，胎成纤维细胞的应用并不是本发明所必需的，实际上可以用其它细胞系替代，并且获得等同的结果.

当然，这一方法需要构建具有与靶IgM重链等位基因具有同源性的区的DNA构建体，使得所述构建体在整合到所述有蹄类动物基因组的IgM重链等位基因中破坏所述等位基因的表达。用于实现IgM等位基因的这种定向破坏的一种示例性载体在以下实施例中有描述。在这一方面，保证在靶位点同源重组的载体的构建方法是本领域技术人员众所周知的。此外，在这种情况下，合适载体的构建在本领域的技术范围内，尤其是已知牛IgM重链和Igλ轻链基因的序列、也已知得自其它有蹄类动物的免疫球蛋白基因的序列(参见下文)的条件下。为了便于同源重组，用以实现同源重组和所述IgM基因失活的载体分别包含表现出与所述有蹄类动物IgM重链和Ig轻链基因有显著序列同一性的DNA部分。这些序列优选具有至少98％的序列同一性，更优选至少99％的序列同一性，再更优选这些序列与靶基因座等基因，以有助于同源重组以及定向缺失或失活。

通常并且优选所述构建体将包含一个标记基因，所述标记基因保证选择出其中所述IgM重链基因和/或Ig轻链基因已被有效破坏的所需同源重组子，例如成纤维细胞。示例性标记基因其中包括抗生素抗性标记、抗药性标记和绿色荧光蛋白。一种优选的构建体示于图2A，用来制备该构建体的起始材料示于图3A和3B。用标准分子生物学技术可以产生含有与内源免疫球蛋白基因同源的两个区的其它构建体，所述同源区邻接与启动子操作上连接的正选择标记(例如抗生素抗性基因)，并且将所述构建体用于本发明的方法中。

图2A和3C中所示的μ敲除构建体，设计用以除去编码牛免疫球蛋白重链恒定区的外显子(命名为“C-μ外显子1-4”)和编码跨膜结构域的两个外显子(命名为“TM外显子”)。

为了构建这种载体，将来自基因组μ重链牛序列的名为“1”的区-Xbal-Xhol片段，亚克隆到预先用酶XbaI和XhoI切割的商业DNA载体pBluescript(Stratagene，LaJolla，California)中。一旦克隆了该片段，则邻近XbaI位点有一个NotI限制性酶识别序列，用该序列插入一个约3.5Kb的NotI片段。这一片段含有新霉素抗性标记，在下文有进一步的描述。需要时，可以用得自另一有蹄类动物品种、物种或属的基因组μ重链序列(例如得自Swiss Bull/Holstein杂种、Genbank登录号U63637的μ重链序列)，来构建其它μ敲除构建体。

将片段“1”和新霉素抗性标记一起连接到pBluescript中后，SacI位点保持邻近新霉素抗性标记。用SacI将所述新构建体线性化，通过用DNA聚合酶补平SacI消化留下的粘性末端将其转变为平端。

分离作为XhoI-BstI1071片段的名为“2”的片段，通过用DNA聚合酶补平XhoI和BstI1071酶留下的粘性末端将其转变为平端片段。

一旦完成所述构建，则最终的构建体分别含有区2、新霉素抗性标记和区1。

关于牛成纤维细胞的转染，所述构建体用限制性酶KpnI(在该图中显示了两个KpnI位点)消化，用所述DNA片段进行同源重组。

新霉素抗性构建体如下装配。名为“pSTneoB”的构建体(Katoh等，Cell Struct.Funct.12：575，1987；日本研究生物制品保藏中心(Japanese Collection of Research Biologicals)(JCRB)保藏号：VE039)设计含有处于编码区上游的SV40启动子和TK增强子控制之下的新霉素抗性基因。所述编码区下游是SV40终止序列。将neo盒作为XhoI片段从“pSTneoB”切下。在使用标准分子生物学技术将该片段的末端转变为平端后，将平端片段克隆到载体pBS246(Gibco/LifeTechnologies)的EcoRV位点中。该位点邻接loxP位点。用命名为“pLoxP-STNeoR”的新构建体来产生所述μ敲除DNA构建体。该构建体的所需片段邻接pBS246克隆载体中原有的loxP位点和NotI位点。用含有loxP-neo-loxP的所需NotI片段来取代所述免疫球蛋白μ恒定区外显子。与新霉素抗性基因操作上连接的SV40启动子激活新霉素抗性基因的转录，使得其中所需NotI片段已经取代了所述μ恒定区外显子的细胞根据其所产生的抗生素抗性而被选择出来。

在获得其中IgM重链等位基因已被有效破坏的细胞系后，将其用作核转移供体，来产生克隆有蹄类动物胎儿(例如克隆牛胎儿)，并且最终产生其中一个IgM重链等位基因被破坏的胎儿或动物。此后，可以用从中得到的体细胞，例如成纤维细胞，实现第二轮的基因定向破坏，以便使用相似但含有一种不同选择标记的载体，产生其中第二IgM重链等位基因被失活的细胞。

最好在所述第一定向基因破坏的同时，也对第二有蹄类动物(例如牛)体细胞系进行遗传修饰，所述细胞系同样可以来源于雄性或雌性。如果操作的第一细胞系是雄性的，则最好修饰雌性细胞系；反之，如果操作的第一细胞系是雌性的，则最好选择雄性细胞系。再者，所操作的细胞最好包含有蹄类动物(例如牛)胎成纤维细胞。

在一个优选实施方案中，对所述雌性胎成纤维细胞进行遗传修饰，以便引入Igλ轻链基因中一个等位基因的定向破坏。这一方法同样采用具有与所述有蹄类动物(例如牛)Igλ轻链同源的区以及选择标记的载体来进行，设计所述DNA构建体，使得在整合和与所述内源Ig轻链同源重组时，导致靶Igλ轻链基因的破坏(失活)。

一旦选择出具有所需定向破坏的雌性成纤维细胞系，则同样将其用作核转移的供体细胞，或者将得自这类细胞系的DNA用作核转移的供体。

另一方面，这种细胞可以经过第二轮同源重组，从而用与破坏第一等位基因相似但含有不同选择标记的DNA构建体来失活所述第二Igλ轻链。

正如在发明背景中所论述的，用于实现核转移、特别是用于产生克隆牛和克隆转基因牛的方法已有报道，描述于授予Stice等并且转让给University of Massachusetts的美国专利5995577。再者，另一方面，可以使用在WO 95/16670；WO 96/07732；WO 97/0669；或WO 97/0668中公开的核转移技术(统称Roslin法)。Roslin法不同于University ofMassachusetts的技术，因为它们使用静息供体细胞，而不是增殖中的供体细胞。所有这些专利通过引用全部结合到本文中。这些核转移方法将产生转基因克隆胎儿，所述胎儿可以用来产生克隆转基因牛后代，例如包含Ig轻链基因和/或IgM基因的至少一个等位基因定向破坏的后代。在创建了这样的细胞系后，可以用它们来产生雄性和雌性重链和轻链半合敲除(M和F Hemi H/L)胎儿和后代。此外，这些技术并不限于用来产生转基因牛；上述技术也可以用于其它有蹄类动物的核转移。

在核转移之后，或者通过让所述有蹄类动物交配，或者通过使用先前描述的同源打靶载体进行第二次基因打靶，可以实现所需动物的产生。

如前所述，本发明的再一目的涉及创建雄性和雌性重链和轻链半合敲除者，其中这类半合敲除者使用已经描述的细胞系来产生。通过让按照上述方法产生的后代交配，其中让包含所述IgM重链基因的已破坏等位基因的后代与包含所述Ig轻链的已破坏等位基因的另一后代交配，可以实现这一点。或者，通过操作从按照上述方法产生的后代获得的细胞进行第二次基因打靶，可以实现这一点。这将包括通过同源重组定向破坏IgM重链基因的等位基因或所述Ig轻链的等位基因的实现。在产生包含雄性和雌性重链和轻链半合敲除(M和F Hemi H/L)的细胞系后，用所述细胞系产生包含这样一种敲除的胎儿或幼仔。如上所述，这或者通过交配或者通过第二次基因打靶来实现。

一旦获得雄性和雌性重链和轻链半合敲除者，则可以用得自这些动物的细胞来创建纯合敲除(Homo H/L)胎儿。这又或者通过顺序基因打靶或者通过交配来实现。从本质上讲，如果通过交配来实现，则这将包括让雄性重链和轻链半合敲除者与雌性重链和轻链半合敲除者交配，并且选择包含纯合敲除的后代。另一方面，可以在组织培养物中对得自上述半合敲除者的细胞进行操作，以便敲除所述IgM或Ig轻链(λ链)基因的另一等位基因。优选进行第二次基因打靶，而不是交配，因为这可以获得更为快速的结果，尤其是在有蹄类动物例如牛的妊娠期相对长的条件下。

一旦获得了纯合敲除者(Homo H/L)，则利用它们来导入含有用来产生特定物种(例如人类)抗体的基因(优选整个基因座)的所需核酸。优选使用人类人工染色体，例如在WO 97/07671(EP 0843961)和WO00/10383(EP 1106061)中公开的那些人类人工染色体。这些人类人工染色体在相应的已授予的日本专利JP 30300092中也有描述。这两个申请都通过引用全部结合到本文中。此外，含有并表达人免疫球蛋白基因的人工人类染色体的构建公开于Shen等，Hum.Mol.Genet.6(8)：1375-1382(1997)；Kuroiwa等，Nature Biotechnol.18(10)：1086-1090(2000)；和Loupert等，Chromosome 107(4)：255-259(1998)，所有这些文献通过引用全部结合到本文中。人类人工染色体也可以用来将异种抗体基因导入野生型动物细胞中；这采用上述方法来完成。将人工染色体导入到动物细胞中，尤其是胎成纤维细胞中，可以通过本文所述的微细胞融合来进行。

在应用人类人工染色体的一个替代方法中，使用YAC载体、BAC载体或粘粒载体，可以将编码免疫球蛋白基因的核酸整合到染色体中。可以用已知方法，例如电穿孔、脂转染、与包含YAC载体的酵母原生质球融合等，将包含异种Ig基因的载体(WO98/24893，WO96/33735，WO 97/13852，WO98/24884)导入胎成纤维细胞中。此外，可以将包含异种Ig基因的载体打靶至所述胎成纤维细胞的内源Ig基因座中，导致同时导入所述异种Ig基因和破坏所述内源Ig基因。

也可以如Lonberg等(参见上文)的专利中所述，实现编码异种免疫球蛋白基因的核酸的整合.在用以将异种免疫球蛋白基因插入到宿主有蹄类动物染色体中的“敲入”构建体中，可以将一种或多种免疫球蛋白基因和抗生素抗性基因与在被所述构建体转染的细胞类型中有活性的启动子操作上连接.例如可以使用组成型活性、诱导型或组织特异性启动子来激活所整合抗生素抗性基因的转录，使得转染细胞可以根据其所产生的抗生素抗性而被选择出来.另一方面，可以使用其中含有所述Ig基因和所述抗生素抗性基因的敲入盒不与启动子操作上连接的敲入构建体.在这种情况下，根据所产生的在所述内源启动子控制之下所述抗生素抗性标记的表达，可以选择出其中敲入盒整合到内源启动子下游的细胞.这些被选出的细胞可以用于本文所述的核转移方法中，以产生含有整合到宿主染色体中的异种免疫球蛋白基因的转基因有蹄类动物.

采用相似的方法，有可能产生和插入含有供不同物种(其中例如狗、猫、其它有蹄类动物、非人类灵长类动物)Ig表达用的基因的人工染色体。如上所述并且如本领域已知的，众所周知不同物种的免疫球蛋白基因在不同物种之间表现出大致的序列同源性。

一旦确定了所插入的人工染色体(例如人类人工染色体)已经稳定地导入细胞系(例如牛胎成纤维细胞)，则它可以用作核转移的供体。这可以通过PCR法来确定。同样，获得包含纯合敲除、并且还包含稳定导入的核酸(例如人类人工染色体)的动物。在得到包括稳定掺入的核酸(例如人类人工染色体)的幼仔后，检验所述动物，以确定它们是否对免疫和亲和性成熟应答而表达人Ig基因。

也可以进行以上概述方法的改进方法。例如，可以首先导入异种Ig基因，然后可以将内源Ig基因失活。此外，可以让保留异种Ig基因的动物与其中内源Ig基因被失活的动物交配。虽然上文已经描述了将在本本发明中使用的方法，但是所使用的技术在下文有更详细的描述。提供这些实施例是为了说明本发明，不应解释为是限制性的。特别是，虽然这些实施例集中于转基因牛，但是可以使用所述方法来产生和检验任何转基因有蹄类动物。

产生表达人Ig的转基因有蹄类动物的敲除法

如上所述，本发明涉及Homo H/L胎儿或幼仔的产生。该方法概述于图1。其中概述了三个流程。第一个流程依靠再生的胎儿细胞系中的连续敲除。该方法在技术上最难，且危险水平最高，但是如上所述，潜在地比育种法更快地得到结果。其它两个流程依靠将动物配种。在第二个流程中，在雄性和雌性细胞系中仅分别需要重链基因和轻链基因的一次敲除。这一流程不依靠细胞系的再生，是最简单的技术，但需要最长的时间来完成。流程3介于流程1和流程2之间。在所有流程中，仅产生Homo H/L胎儿，因为在Homo H/L敲除幼仔的生存和维持方面有潜在的困难。如有必要，可以用被动免疫疗法来提高HomoH/L敲除幼仔的存活率。

实验设计本发明优选涉及雄性半合重链敲除者(M Hemi H)和半合子雌性轻链敲除者(F Hemi L)的产生、以及由这些定向缺失产生40天的胎儿。收获得自所述胚胎的细胞，在M Hemi H细胞中所述轻链基因座中的一个等位基因被打中，而在F Hemi L细胞中所述重链基因座中的一个等位基因被打中，产生在H和L基因座中都有半合子缺失的细胞(Hemi H/L)。用这些细胞来得到40天的胎儿，从所述胎儿分离成纤维细胞。

用其它H链等位基因对M Hemi H/L成纤维细胞打靶，以创建MHomo H/Hemi L，而用其它L链等位基因对F Hemi H/L打靶，以创建F Homo L/Hemi H。为了创建纯合缺失，使用较高的药物浓度来驱动纯合打靶。然而，有可能这种方法不会成功，并且育种可能是必不可少的。一种依靠选择盒的cre/lox打靶的示例性策略，使得可以将相同的选择性系统用于不止一个靶缺失。克隆这些成纤维细胞，收获40天的胎儿，然后分离成纤维细胞。对得自这种克隆的胎儿细胞打靶，产生或者H基因座或者L基因座的纯合缺失，产生M Homo H/L和F HomoH/L胎成纤维细胞。克隆这些成纤维细胞，得到40天的胎儿，然后分离成纤维细胞。然后用Homo H/L胎成纤维细胞，任选地利用育种法来掺入所述HAC。

文库构建用胎成纤维细胞构建基因组文库.尽管已报道重要的是打靶构建体与用于克隆的细胞等基因，但它对于本发明而言并非是必需的.例如，可以用等基因、基本等基因或非等基因构建体来产生内源免疫球蛋白基因中的突变.在一个可能的方法中，使用与其它牛品种相比遗传上有高水平近交的Holstein牛.我们在不同动物中没有检测到免疫球蛋白基因的任何多态性.这提示，序列同源性应该高，并且用非等基因构建体打靶应该能成功.

由一个雄性细胞系和一个雌性细胞系构建文库，同时进行“克隆性”检验。设想了在该方法结束时，将产生一个文库，并且将检验众多不同的胎儿细胞系，选择一个细胞系作为供克隆用的最佳细胞系。用从所述胎成纤维细胞分离的高分子量DNA构建基因组文库。将DNA进行大小分级分离，将20-23Kb的高分子量DNA插入到λ噬菌体载体λZap或λFiix中。本发明人用Stratagene制备的文库取出了很大成功。因此，分离DNA，将经大小选择的DNA送至Stratagene用于文库制备。为了分离含有牛重链和轻链的克隆，使用放射性标记IgMcDNA和放射性标记轻链cDNA。另外，在必需缺失轻链基因座时，分离轻链基因组克隆。对每个胎细胞文库筛选含有牛重链和轻链的克隆。考虑了筛选大约10⁵-10⁶噬斑应该导致分离出含有或者重链或者轻链基因座的克隆。一旦分离出，则将两个基因座亚克隆到pBluescript中，制作限制性图谱。Holstein牛中这些基因座的限制性图谱于图2B中提供(Knight等J Immunol 140(10)：3654-9，1988)。另外，制作得自所获克隆的图谱，用来装配所述打靶构建体。

打靶构建体的产生一旦分离出重链和轻链基因，则制备构建体。通过缺失IgM恒定区膜结构域，制备IgM构建体。正如Rajewsky及其同事用小鼠所表明的，IgM膜结构域的缺失导致B细胞发育的阻断，因为表面IgM是B细胞继续发育所需的信号(Kitamura等，Nature350：423-6)。因此，纯合IgM牛缺乏B细胞。这不应该成为问题，因为在本发明的策略中，缺乏功能性Ig的动物活着出生并非必需。然而，如有必要，可以用被动免疫疗法来改进动物的存活率，直至导入人Ig基因座的最后一个步骤。

用以实现IgM重链等位基因敲除的一种示例性打靶构建体示于以下图2A中。对于重链，所述膜IgM结构域用邻接lox P位点的新霉素盒取代。将所连接的膜结构域与新霉素盒剪接在一起，使得所述膜结构域具有一个紧接lox P位点5’插入的TAG终止密码子，从而确保所述膜结构域被失活。将其与大约5-6千碱基3’染色体DNA一起置于所述打靶构建体的5’端。

如果提高药物浓度并未达到或者IgM重链或者轻链的第二等位基因缺失，则使用cre/lox系统(在Sauer，1998，Methods 14：381-392中有综述)来缺失所述选择标记。如下所述，cre/lox系统允许定向缺失所述选择标记。使所有选择标记邻接loxP序列，以便于必要时缺失这些标记。

轻链构建体含有牛λ链恒定区(例如在Genbank登录号AF396698中发现的λ轻链恒定区或任何其它有蹄类动物λ轻链恒定区)和邻接loxP位点的嘌呤霉素抗性基因盒，并且将用邻接lox P位点的嘌呤霉素盒取代所述牛基因。λ恒定区基因3’的约5-6千碱基DNA将被嘌呤霉素抗性基因3’的DNA取代。所述嘌呤霉素抗性基因将在5’端和3’端都带有lox P位点，以便于必要时进行缺失.由于在有蹄类动物抗体基因之间有高度的同源性，故此预计在Genbank登录号AF396698中的牛λ轻链序列将与得自种类繁多的有蹄类动物的基因组λ轻链序列杂交，因而可以用于标准方法中，以分离各种有蹄类动物λ轻链基因组序列.这些基因组序列可以用于标准方法例如本文所述的方法中，来产生用以失活任何有蹄类动物中的内源λ轻链的敲除构建体.

κ轻链敲除构建体可以同样使用图3G中的牛κ轻链序列或任何其它的有蹄类动物κ轻链序列来构建。这种牛κ轻链可以用作杂交探针，来从各种各样的有蹄类动物中分离基因组κ轻链序列。这些基因组序列可以用于标准方法例如本文所述的方法中，来产生用以失活任何有蹄类动物中内源κ轻链的敲除构建体。

可以任选地使另外的有蹄类动物基因突变或失活。例如，可以敲除有蹄类动物内源Ig J链基因，从而防止给予人类的本发明抗体中所述有蹄类动物Ig J链的潜在抗原性。为了构建所述打靶载体，可以使用在Genbank登录号U02301中发现的牛Ig J链区的cDNA序列。这一cDNA序列可以用作探针，来从BAC文库例如RPC1-42(BACPAC inOakland，CA)分离牛IgJ链的基因组序列，或者从任何其它有蹄类动物中分离所述J链的基因组序列。另外，可以将人J链编码序列导入本发明的有蹄类动物中，以进行人IgA和IgM分子的功能性表达。人J链的cDNA序列可从Genbank登录号AH002836、M12759和M12378中获得。可以用标准方法，例如本文所述的方法，将这种序列插入到有蹄类动物胎成纤维细胞中。例如，可以将HAC、YAC载体、BAC载体、粘粒载体或敲入构建体中的人J链核酸整合到有蹄类动物内源染色体中，或者独立于有蹄类动物内源染色体而保持。所得的转基因有蹄类动物细胞可以用于本文所述的核转移法中，以产生具有减少或消除有蹄类动物功能性J链表达的突变并且含有表达人J链的异种核酸的所需有蹄类动物。

另外，可以使有蹄类动物α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因突变，以减少或消除由α-(1，3)-半乳糖基转移酶产生的半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表达。如果本发明的有蹄类动物所产生的人抗体被这种糖表位修饰，则这些糖基化抗体在作为治疗药给予人类时，被接受者体内与所述糖表位反应的抗体失活或消除。为了消除这种对所述糖表位的可能的免疫应答，可以用牛α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因的序列来设计用以失活有蹄类动物中该基因的敲除构建体(Genbank登录号J04989；Joziasse等，J.Biol.Chem.264(24)：14290-7，1989)。在美国专利6,153,428和5,821,117中公开的这种牛序列或者猪α-(1，3)-半乳糖基转移酶序列，可以用来从各种各样有蹄类动物中获得基因组α-(1，3)-半乳糖基转移酶序列，以产生半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表达减少或消除的其它有蹄类动物。

必要时，可以使有蹄类动物朊病毒基因突变或失活，从而降低诸如牛海绵状脑病(BSE)的感染的潜在危险。为了构建所述打靶载体，可以使用牛朊病毒基因的基因组DNA序列(Genbank登录号AJ298878)。或者，可以用这种基因组朊病毒序列，从其它有蹄类动物中分离基因组朊病毒序列。可以使用标准方法，例如本文所述的方法或者提示用于敲除绵羊α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因或者朊病毒基因的方法(Denning等，Nature Biothech.，19：559-562，2001)，使朊病毒基因失活。

为了对每个基因座的第二等位基因打靶，如果第一选择标记留在所述细胞中，则可能必需装配含有不同选择标记的一种新的打靶构建体。如表1所述，可获得各种各样的选择策略，将其进行比较，选择出合适的选择系统。最初，通过提高药物浓度(例如使药物浓度加倍)，靶向第二等位基因。如果不成功，则可以使用一种新的打靶构建体。

可以采用各种方法，将上述其它的突变或基因失活掺入到本发明的有蹄类动物中.一旦对于每个所需突变产生了转基因有蹄类动物细胞系，则可以使用杂交育种，将这些另外的突变掺入到本发明的有蹄类动物中.或者，具有这些另外的突变的胎成纤维细胞可以用作起始材料，来敲除内源Ig基因和/或导入异种Ig基因.此外，在内源Ig基因中具有一个敲除突变和/或含有异种Ig基因的胎成纤维细胞，可以用作这些另外的突变或失活的起始材料.

Ig基因座的定向缺失例如通过电穿孔，将打靶构建体导入胚胎成纤维细胞中。利用合适的抗生素，选择掺入了所述打靶载体的细胞。将根据生长选择出抗所选药物的克隆。然后这些克隆用更昔洛韦进行负选择，这将选择出已经适当整合的那些克隆。或者，通过PCR选择经得住所述药物选择的克隆。估计必需筛选至少500-1000个克隆，以便发现被适当打中的克隆。本发明人的估计基于Kitamura(Kitamura等，Nature 350：423-6，1991)的论文，Kitamura发现，当对IgM重链恒定区的膜结构域打靶时，大约1/300的neo抗性克隆被正确打中。因此，建议在96孔板中，以10个克隆一组将克隆混合，并且对10个克隆的库筛选所选择的被打中的克隆。一旦鉴定出阳性克隆，则对从混合克隆分离出的单个克隆进行筛选。这种策略应该能够鉴定出被打中的克隆。

因为成纤维细胞在培养物中迁移，所以当每个培养皿有超过大约10个克隆时，难以鉴别单个克隆。此外，可以开发用于以高效转染克隆繁殖的策略。可以使用几种合理的策略，例如稀释克隆法。

抗药性标记的Cre/Lox切除如上所述，示例性打靶构建体含有邻接loxP位点的选择标记，以便于用cre/lox系统有效地缺失所述标记。通过电穿孔，用含Cre的质粒转染带有所述打靶载体的胎成纤维细胞。可以使用最近描述的含有GFPcre融合基因的Cre质粒[GagnetenS.等，Nucleic Acids Res 25：3326-31(1997)]。这使得可以快速选择含有Cre蛋白的所有克隆。或者通过FACS分选，或者通过经显微操作人工收获发绿色荧光的细胞，选择这些细胞。预计绿色的细胞携带活性转录的Cre重组酶，因此缺失抗药性标记。将根据Cre表达选择的细胞克隆，并且通过PCR分析，分析克隆的抗药性标记的缺失情况。让经测定经历了切除的那些细胞生长为小克隆，将其分瓶，并且在选择培养基中检验一个等份样品，从而肯定地确定抗药性基因已经缺失。用其它等份样品进行下一轮的定向缺失。

表1：选择标记和供选择用的药物

基因                药物

Neo^r                G418¹

Hph                 潮霉素B²

Puro                嘌呤霉素³

Ecogpt              霉酚酸⁴

Bsr                 杀稻瘟素S⁵

HisD                组氨醇⁶

DT-A                白喉毒素⁷

¹Southern PJ，Berg P.1982.Transformation of mammalian cells toantibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40earlyregion promoter(用SV40早期区启动子控制下的细菌基因将哺乳动物细胞转化为抗生素抗性).J Mol AppI Genet 1：327-41。

²Santerre RF，Allen NE，Hobbs JN Jr，Rao RN，Schmidt RJ.1984.Expression of prokaryotic genes for hygromycin B and G418resistance asdominant-selection markers in mouse L cells(作为显性选择标记的潮霉素B和G418抗性的原核基因在小鼠L细胞中的表达).Gene 30：147-56。

³Wirth M，Bode J，Zettlmeissl G，Hauser H.1988.Isolation ofoverproducing recombinant mammaliancell lines by a fast and simpleselection procedure(通过一种快速而简单的选择法分离过量生产的重组哺乳动物细胞系).Gene 73：419-26。

⁴Drews RE，Kolker MT，Sachar DS，Moran GP，Schnipper LE.1996.Passage to nonselective media transiently alters growth of mycophenolicacid-resistant mammalian cells expressing the escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene：implications for sequentialselection strategies(在非选择培养基上传代瞬时改变了表达大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的霉酚酸抗性哺乳动物细胞的生长：顺序选择策略的意义).Anal Biochem 235：215-26。

⁵Karreman C.1998.New positive/negative selectable markers formammalian cells on the basis of Blasticidin deaminase-thymidine kinasefusions(基于杀稻瘟素脱氨酶-胸苷激酶融合的供哺乳动物细胞用的新型正/负选择标记).Nucleic Acids Res 26：2508-10。

⁶Hartman SC，Mulligan RG.1988.Two dominant-acting selectablemarkers for gene transfer studies in mammalian cells(在哺乳动物细胞中基因转移研究用的两种显性开放选择标记).Proc Natl Acad Sci U S A85：8047-51。

⁷Yagi T，Nada S.，Watanabe N，Tamemoto H，Kohmura N，Ikawa Y，Aizawa S.1993.A novel negative selection for homologous recombinantsusing diphtheria toxin A fragment gene(一种使用白喉毒素A片段基因的同源重组子的新型负选择).Ahal Biochem 214：77-86。

应用打靶策略改变其它有蹄类动物的免疫球蛋白基因

为了改变其它有蹄类动物的免疫球蛋白基因，设计打靶载体，使其含有三个主要区域。第一区与靶基因座同源。第二区为特异性取代靶基因座的一部分的药物选择标记。第三区同第一区一样，与靶基因座同源，但是不与野生型基因组中的第一区相邻。打靶载体与所需野生型基因座之间的同源重组，导致打靶载体中提供的两个同源区之间的基因座序列缺失并且该序列被抗药性标记所取代。在优选实施方案中，这两个同源区的总大小大约为6千碱基，取代靶基因座一部分的第二区的大小约为2千碱基。这种打靶策略可广泛地用于从原核细胞至人细胞的种类繁多的物种。所用的每种载体的唯一性在基因打靶法所选择的基因座和该策略中所使用的序列中。这一方法可用于所有有蹄类动物，包括但不限于山羊(Capra hircus)、绵羊(Ovis aries)和猪(Susscrufa)以及牛(Bos taurus)。

应用电穿孔对有蹄类动物细胞中的特定基因打靶，也可以广泛用于有蹄类动物.本文所述的通用方法适用于将靶突变引入其它有蹄类动物的基因组中.电穿孔条件(电压和电容)的改进条件可以用来对从其它有蹄类动物获得的转染子数目进行优化.另外，在此用来对牛中重链基因座打靶(即使用含与紧接被除去外显子侧翼区同源的区的载体除去所有编码外显子和间插序列)的策略在其它有蹄类动物也可以同样好地应用.例如，已经对绵羊(Ovis aries)的免疫球蛋白重链基因座进行了广泛的序列分析，所述绵羊基因座与牛基因座在结构和序列方面非常相似(Genbank登录号Z71572、Z49180-Z49188、M60441、M60440、AF172659-AF172703)。除了已报道的关于重排的Ovis aries免疫球蛋白链的大量cDNA序列之外，还报道了关于所述重链基因座、包括重链5’增强子(Genbank登录号Z98207)、3’μ转换区(Z98680)和5’μ转换区(Z98681)的基因组序列信息。绵羊分泌形式重链的完整mRNA序列已经以登录号X59994录入。这一录入的序列含有四个编码外显子的全序列，它们与相应的牛序列高度同源。

关于所述绵羊基因座的信息从Genbank获得，用来确定与牛序列高度同源的区域，以供设计用于PCR分析的引物。因为使用非等基因DNA对牛细胞打靶，发现与绵羊序列高度同源的区用作牛品种之间序列可能相似保守的指标。已知牛和绵羊免疫球蛋白基因座的序列和结构之间有相似性，则可以预期，用以除去牛免疫球蛋白基因座的打靶策略可以成功地应用于所述绵羊系统。另外，关于猪(Sus scrofa，登录号S42881)和山羊(Capra hircus，登录号AF140603)的现有信息表明，这两个物种的免疫球蛋白基因座也与所述牛基因座足够相似，因此可以利用本发明的打靶策略。

插入HAC的方法

重要的是，获得含有人类人工染色体序列(#14fg.、#2fg.和#22fg.)的雄性和雌性牛胎成纤维细胞系并且对其进行选择，用来从这些细胞系产生克隆幼仔。

例如，可以同时或者顺序导入得自人类14号染色体的HAC(″#14fg″，包含Ig重链基因)、人类2号染色体(″#2fg″，包含Ig κ链基因)和人类22号染色体(″#22fg″，包含Igλ链基因)。

通过让雄性#14fg.动物与雌性#2fg.和#22fg.动物交配，并且评估后代，检验这些染色体片段的遗传。如果遗传成功，则让这两个系交配，以产生含有所有三种染色体片段的系。

也可以将#14fg.、#2fg.和#22fg.染色体片段插入到Homo H/L胎儿细胞中，用来产生克隆幼仔，或者让转基因HAC幼仔与Homo H/L幼仔杂交。另一方面，可以如实施例2所述，导入其它HAC，例如ΔHAC或ΔΔHAC，或者用任何其它染色体转移法将其导入。

原理HAC的种系遗传应该可用来将所述HAC导入Ig敲除动物以及在生产畜群中繁殖动物。对通过种系繁殖HAC的担忧是在减数分裂期间染色体物质不完全配对。然而，如Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：722，2000)所指明的，种系遗传在小鼠中已经获得成功。

图1A中概述的策略包括将#14fg.插入到雄性细胞系中，而将#2fg.和#22fg.分别插入到雌性细胞系中。产生保留HAC的幼仔，可以通过雌性和雄性检验种系遗传。一部分所得后代(～25％)应该既含有重链HAC，又含有轻链HAC。进一步的杂交应该产生含有所有三种染色体片段的幼仔系。用这些动物与如先前所述从胎儿细胞中产生的HomoH/L动物杂交。

实验设计从细胞系的初次筛选获得细胞.这些细胞可以是Holstein牛细胞或者是与上述所用的不同的系.这允许杂交，同时尽可能地在畜群中保持大量的遗传变异.然后将HAC导入细胞系中并且选择阳性细胞系.选出的细胞系用于核转移，并且产生幼仔.从12月龄开始，收集精子和卵，让其受精，然后转移到受体动物中.取细胞样品进行DNA标记分析和核型分析.在分娩之前，取血样，分析人Ig蛋白的存在.

如上所述，也可以用在上述实验中开发的方法，将HAC转移到Homo H/L细胞系中。

人Ig表达的检验

本实验的目的是产生雄性Homo H细胞和克隆胎儿，以便将一种或多种同时含有人IgH和人IgL基因座的HAC  (例如HAC#14fg.和#22fg.)插入到Homo H细胞中并且产生幼仔，然后检验对免疫应答的人Ig表达和亲和性成熟。这可如下进行。

实验设计从如前所述产生的Hemi H细胞，产生Homo H细胞。或者通过抗生素选择，或者通过第二次插入，产生双敲除者。如前所述将HAC转移到这些细胞中。通过核转移产生幼仔。对保留HAC的幼仔的检验在出生后不久开始，并且包括(1)评价人Ig表达，(2)对免疫的应答，(3)亲和性成熟，和(4)所述HAC遗传至后代的情况。

通过让动物配种，并且通过ELISA、RT-PCR或FACS分析人重链和轻链表达的存在，监测人Ig的表达。一旦确定了所述动物产生人Ig，则用加有佐剂的破伤风类毒素免疫动物。在免疫后，每周给动物放血一次，通过ELISA或FACS测定对抗原的应答，并且与在免疫前收集的原放血样品进行比较。初次免疫后一个月，用含水形式的所述抗原给动物加强免疫。加强免疫后一周，给动物放血，通过ELISA或FACS测量对抗原的应答，并且将其与原放血样品进行比较。ELISA或FACS分析提供对大多数应答的效价以及所产生的重链同种型的测量。这一数据提供对抗体效价的增加以及类别转换发生的测量。也测量平均亲和力的估计量，以确定在对抗原应答期间是否发生亲和性成熟。

在如上所述获得转基因牛之后，用它们来生产转基因Ig，优选人Ig，但有可能生产其它物种(例如狗、猫、非人类灵长类动物、其它有蹄类动物诸如绵羊、猪、山羊、鼠类例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等)的Ig。正如所知的，已知Ig基因在物种间是保守的。

含有异种抗体的转基因抗血清和乳

所述牛(或其它有蹄类动物)产生针对内源性暴露的任何抗原的转基因抗血清，或者针对外源给予的抗原的转基因抗血清。例如，可以将抗原给予所述有蹄类动物，以生产与所述抗原反应的所需抗体，所述抗原包括例如病原体(例如细菌、病毒、原生动物、酵母或真菌)的抗原、肿瘤抗原、受体、酶、细胞因子等。用于抗体生产的示例性病原体包括但不限于肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、免疫缺陷病毒(例如HIV)、疱疹病毒、细小病毒、肠道病毒、埃博拉病毒(ebola virus)、狂犬病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、链球菌属(Streptococcus)(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、嗜血菌属(Haemaphilus)(例如流感嗜血菌(Haemophilus influenza))、奈瑟氏球菌属(Neisseria)(例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitis))、白喉棒杆菌(Coryunebacteriumdiptheriae)、嗜血菌属(Haemophilus)(例如百日咳嗜血菌(Haemophiluspertussis))、梭菌属(Clostridium)(例如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinium))、葡萄球菌属(Staphlococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))和呼吸道合胞病毒(RSV)。

可以将一种或多种病原体给予转基因有蹄类动物，以产生可用于预防、稳定或治疗特定疾病的超免疫血清.例如，可以将与儿童呼吸道感染相关的病原体给予转基因有蹄类动物，以产生与这些病原体(例如肺炎链球菌、流感嗜血菌和/或脑膜炎奈瑟氏球菌)反应的抗血清.在给予所述有蹄类动物之前，可以任选地处理这些病原体，以降低其毒性(例如通过暴露于热或化学药品例如甲醛).

为了产生广谱Ig，可以将各种各样的病原体(例如多种细菌和/或病毒病原体)给予转基因有蹄类动物。这种超免疫血清可以用来预防、稳定或治疗哺乳动物(例如人类)的感染，尤其可用来治疗具有遗传性或获得性免疫缺陷的哺乳动物。

另外，通过本发明的方法产生的抗体可以用来抑制免疫系统，例如以治疗神经病，以及消除特定的人细胞和调节特定的分子。例如，抗独特型抗体(即抑制其它抗体的抗体)和与T细胞、B细胞或细胞因子反应的抗体，可以用来治疗自身免疫病或神经病(例如由于炎症引起的神经病)。这些抗体可以从尚未给予抗原的转基因有蹄类动物中获得，或者它们可以从已经给予了抗原例如B细胞、T细胞或者细胞因子(例如TNFα)的转基因有蹄类动物中获得。

从尚未给予抗原的转基因有蹄类动物产生的转基因抗血清，可以用来生产包含人多克隆抗体、优选人IgG分子的药物。这些人抗体可以用来替代从人类中分离的抗体，例如静脉免疫球蛋白(IVIG)治疗药。

可以任选地对转基因抗血清进行与一种或多种感兴趣抗原反应的抗体的富集。例如，可以用标准技术，例如Ausubel等所述的技术(Current Protocols in Molecular Biology，volume 2，p.11.13.1-11.13.3，John Wiley & Sons，1995)，纯化所述抗血清。优选的纯化方法包括用抗原或抗体包被的微珠沉淀、柱层析例如亲和层析、磁珠亲和纯化和用板结合抗原进行淘选。另外，可以让所述转基因抗血清与一种或多种感兴趣抗原接触，根据抗体/抗原复合物的增加的大小，可以从未结合抗体中分离出结合抗原的抗体。也可以用蛋白A和/或蛋白G来纯化IgG分子。如果内源抗体的表达未被消除，则可以用蛋白A和/或抗人Ig轻链λ的抗体(Pharmingen)，从内源有蹄类动物抗体或有蹄类动物/人类嵌合抗体中分离出所需的人抗体。蛋白A对人Ig重链的亲和力大于对牛Ig重链的亲和力，因而可以用来从含有一条或两条有蹄类动物重链的其它抗体中分离含有两条人重链的所需Ig分子。抗人Ig轻链λ的抗体可以用来从具有一条或两条有蹄类动物Ig轻链的抗体中分离具有两条人Igλ链的所需Ig分子。另外或者另一方面，可以在一个负选择步骤中使用一种或多种对有蹄类动物Ig重链或轻链特异性的抗体，以除去含有一条或两条有蹄类动物重链和/或轻链的Ig分子。

所得的抗血清本身可以用于针对抗原的被动免疫。或者，所述抗血清具有诊断、预防或纯化用途，例如用于达到纯化抗原。

另一方面，在给予抗血清后，可以从所述转基因牛中分离出B细胞，将其用于杂交瘤的制备。例如，可以用标准技术，将得自转基因有蹄类动物的B细胞与骨髓瘤融合，产生分泌感兴趣的单克隆抗体的杂交瘤(Mocikat，J.Immunol.Methods 225：185-189，1999；Jonak等，Hum.Antibodies Hybridomas 3：177-185，1992；Srikumaran等，Science 220：522，1983)。优选的杂交瘤包括通过B细胞与得自与所述转基因有蹄类动物同一属或同一物种的哺乳动物的骨髓瘤融合所产生的杂交瘤。其它优选的骨髓瘤得自Balb/C小鼠或人类。在这种情况下，提供生产抗特定抗原的异种单克隆抗体的杂交瘤。例如，这一技术可以用来生产对病原体特异性的人类、猫、狗等(取决于特定的人工染色体)的单克隆抗体。用来选择生产具有所需特性(即增强的结合亲和性、亲合力)的抗体的杂交瘤的方法是众所周知的。

或者，可以对得自转基因有蹄类动物的B细胞进行遗传修饰，以表达癌基因，例如ras、myc、abl、bcl2或neu，或者用转化DNA或RNA病毒如EB病毒或SV40病毒感染所述B细胞(Kumar等，Immunol.Lett.65：153-159，1999；Knight等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：3130-3134，1988；Shammah等，J.Immunol.Methods 160-19-25，1993；Gustafsson和Hinkula，Hum.Antibodies Hybridomas 5：98-104，1994；Kataoka等，Differentiation 62：201-211，1997；Chatelut等，Scand.J.Immunol.48：659-666，1998)。所得的无限增殖化B细胞也可以用来生产理论上无限量的抗体。因为Ig也分泌到有蹄类动物的乳中，所以有蹄类动物的乳也可以用作异种抗体的来源。

虽然在上文已经适当地描述了本发明，但另外提供以下实施例作为本发明的进一步例证。

实施例1：牛IgM的敲除

以下方法用来产生其中免疫球蛋白重链(μ)基因座的一个等位基因已经通过同源重组而被破坏的牛成纤维细胞系。通过除去μ基因座(对应于IgM重链基因)的外显子1-4，并用一个拷贝的新霉素抗性基因取代，产生用于实施IgM敲除的DNA构建体。使用这种构建体，获得了成功用于核转移法的新霉素抗性细胞系，并且将得自这些细胞系的胚泡植入到受体母牛中。另外，测试这些胚泡的一些胚泡，以便用PCR法证实在μ基因座中恰当地发生了定向插入。从所获得的几个细胞系通过核转移法产生的胚泡表明，在妊娠时为杂合IgM-KO胎儿。另外，已经产生了包含IgM重链(μ)单敲除的雄性和雌性细胞系。预期从这些细胞系克隆的动物的配种，将产生其中μ的两个拷贝都被失活的后代。这些方法在下文有更为详细的论述。

DNA构建体在本文件中所述的所有转染中所使用的DNA如下产生。四个主要的外显子(除了跨膜结构域外显子)-CH1-4下游(CH4)端的侧翼为一个XhoI限制位点，上游(CH1)端的侧翼为一个XbaI位点。供转染法用的构建体由XhoI位点下游的1.5kb基因组序列和XbaI位点上游的3.1Kb基因组序列组成(图3D和3E)。这些序列如本文所述从来自Massachusetts乳牛群的Holstein牛中分离。将一个位于3.5Kb片段上的新霉素抗性标记插入到这两个片段之间，取代原来含有CH1-4、得自原始基因组序列的2.4Kb DNA。所述载体的骨架为pBluescriptII SK+(Stratagene)，纯化8.1Kb的插入片段，用其转染牛胎成纤维细胞。该构建体示于图3A-3C。使用标准方法，也可以构建含有其它同源区和/或含有另一种抗生素抗性基因的其它μ敲除构建体，用来使内源μ重链基因突变。

转染/敲除方法胎牛的转染用市售试剂Superfect TransfectionReagent(Qiagen，Valencia，CA，USA)，Catalog Number 301305来进行。

牛成纤维细胞产自Hematech′s Kansas facility的经病害检验的雄性Charlais牛，并且送至Hematech′s Worcester Molecular Biology Labs，用于所述的所有实验。任何其它有蹄类动物品种、属或物种都可以用作供体细胞(例如体细胞，如胎成纤维细胞)来源。对所述供体细胞进行遗传修饰，使其含有减少或消除功能性内源Ig表达的突变。

用于培养牛胎成纤维细胞的培养基由下述成分组成：500mlαMEM(Bio-Whittaker#12-169F)；50ml胎牛血清(Hy-Clone#A-1111-D)；2ml抗生素/抗真菌剂(Gibco/BRL#15245-012)；1.4ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)；5.0ml L-谷氨酰胺(Sigma Chemical#G-3126)；和0.5ml酒石酸酪氨酸(Sigma Chemical#T-6134)。

在转染操作前一天，将细胞接种到60mm组织培养皿中，通过显微镜检查测定达到40-80％的目标汇合度。

转染当天，将总体积为150μl无血清无抗生素培养基中的5μgDNA与20μl Superfect转染试剂混合，让其于室温静置5-10分钟，以便形成DNA-Superfect复合物。当发生所述复合物形成时，从含有待转染的牛成纤维细胞的60mm组织培养皿中取出培养基，细胞用4ml磷酸缓冲盐溶液冲洗一次。将1ml生长培养基加入到170μlDNA/Superfect混合物中，立即将其转移到60mm培养皿中的细胞上。将细胞于38.5℃、50％二氧化碳下孵育2.5小时。在细胞与DNA/Superfect复合物一起孵育后，吸出培养基，细胞用4ml PBS洗涤4次。加入5ml完全培养基，将培养物于38.5℃、5％CO₂下孵育过夜。然后细胞用PBS洗涤一次，然后与1ml含0.3％胰蛋白酶的PBS一起于37℃孵育，直至通过显微镜观察确定细胞与板分离。将得自每个60mm培养皿的细胞分装到24孔组织培养板的24个孔中(41.7μl/孔)。向各孔加入1ml组织培养基，让板于38.5℃和5％CO₂下孵育24小时。

在所有转染操作期间，用不含DNA的Superfect/PBS混合物进行假转染，因为可以预期那些细胞中都不含新霉素抗性基因，并且可以预期所有细胞在将G418加入到组织培养基后都死亡。这用作接受DNA的细胞正选择的阴性对照。

孵育24小时后，再将1ml含有400μg G418的组织培养基加入到各孔中，使G418的终浓度为200μg/ml。将细胞放回到培养箱中，进行7天的G418选择。在此期间，监测转染板和假转染板的细胞死亡情况，并且在7天内，来自假转染的大多数孔含有很少或不含活细胞，而含有接受所述DNA的细胞的板则显示出很好的细胞生长。

在7天的选择期之后，来自90-100％汇合的孔的细胞用0.2ml含0.3％胰蛋白酶的PBS解离，并且将其转移到35mm组织培养板中以进行扩大培养和孵育，直至它们至少50％汇合，此时，细胞用0.6ml含0.3％胰蛋白酶的PBS进行胰蛋白酶处理。从每个35mm组织培养板，将0.6ml细胞悬浮液中的0.3ml转移至12.5cm²组织培养瓶中，进行进一步扩大培养。将剩余的0.3ml再接种到35mm培养皿中并孵育，直至它们最低达到大约50％汇合，此时，对来自那些板的细胞进行加工，以供提取用于PCR分析的DNA。来自每个系的烧瓶保留在培养箱中，直至它们经过这些分析，如果它们不含所需的DNA整合，则终止培养，或者保持在培养箱中，以供将来的核转移和深低温保藏用。

定向整合的筛选如上所述，供筛选含所述DNA构建体的转染子用的DNA源为一个含有一次传代的待分析细胞的35mm组织培养皿。按照Laird等(Laird等，″Simplified mammalian DNA isolationprocedure″，Nucleic Acids Research，19：4293)公开的方法并且对其进行改进，制备DNA。简而言之，如下制备DNA。用以下成分制备细胞裂解缓冲液：100mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5；5mM EDTA，pH 8.0；0.2％十二烷基硫酸钠；200mM NaCl；和100μg/ml蛋白酶K。

从每个35mm组织培养皿中吸取培养基，用0.6ml上述缓冲液取代.将培养皿放回培养箱中达3小时，在此期间让细胞发生裂解和蛋白消化.在该孵育之后，将裂解液转移至1.5ml微量离心管中，加入0.6ml异丙醇以沉淀DNA.通过颠倒离心管，将离心管充分振摇，然后让其于室温静置3小时，此后将DNA沉淀在微量离心机中以13,000rpm离心10分钟.弃去得自每个管的上清液，沉淀用70％乙醇冲洗一次.吸出70％乙醇，让DNA沉淀风干.干燥后，将每种沉淀重悬于30-50μl Tris(10mM)-EDTA(1mM)缓冲液，pH 7.4中，让其过夜水合和溶解。每个聚合酶链式反应(PCR)方法使用5-7μl的每种DNA溶液。

用两个独立的PCR方法来分析转染子。第一个方法使用两种引物，所述引物预期退火至都位于供转染用的DNA内的位点上。第一种引物序列与所述DNA构建体的新霉素抗性盒同源，而第二种引物序列距其大约0.5Kb，产生0.5Kb的短PCR产物。具体地说，使用引物Neol(5′-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3′，SEQID NO：42)和IN2521(5′-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAGGCA CCG-3′，SEQ ID NO：43)。使用Qiagen PCR试剂盒进行这一PCR反应。所述PCR反应混合物含有每种引物各1pmole、5μl 10×反应缓冲液、10μl Q溶液、5μl DNA和1μl dNTP溶液。用水使反应混合物的总体积为50μl。采用最初于94℃变性保温2分钟，进行这一PCR扩增。然后通过于94℃保温45秒、于60℃保温45秒和于72℃保温2分钟，进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，让反应混合物于72℃保温5分钟，于4℃保温直至从PCR仪中取出混合物。或者，在适当反应条件下进行的一个标准PCR反应中，可以使用与所述敲除构建体中整合到所述细胞基因组中的区同源的任何其它引物，以证实经得住G418选择的细胞由于所述DNA构建体的整合而成为抗性细胞。

因为可以预期，仅一小部分的转染子在所需位置(μ基因座)中含有DNA整合，所以使用另一对引物，来确定不仅所导入的DNA存在于所述转染子的基因组中，而且整合到所需的位置中。使用位于所述DNA构建体中新霉素抗性盒内的一种引物和可以预期仅当所述DNA整合在IgM基因座的适当位点时才退火在1.8Kb之外(因为同源区位于转染用的DNA构建体中所包含的区之外)的一种引物，进行用来测定恰当整合的PCR方法。设计所述引物退火到紧邻所述DNA构建体中提供的将整合到所需位置(所述基因座的DNA序列(都在所述DNA中存在的区内并且与之相邻)先前已经测定)的那些序列的DNA序列上。具体地说，使用引物Neol和OUT3570(5′-CGA TGA ATG CCC CATTTC ACC CAA GTC TGT C-3′，SEQ ID NO：44)进行该分析。这一PCR反应用Qiagen PCR试剂盒如上用于第一个PCR反应所述的方法进行，以证实所述打靶构建体整合到所述细胞中。或者，可以用任何合适的反应条件以及与所述敲除构建体中整合到所述细胞基因组中的区同源的任何其它引物、以及与所述细胞基因组中所述整合位点上游或下游的区同源的任何其它引物，进行这一PCR分析。

采用这些方法，在所述DNA构建体定向整合到合适的基因座方面，筛选135个独立的35mm平板。从中确定了得自8个平板的DNA含有恰当定向的DNA构建体，然后从中选出三种DNA供核转移方法用。那些细胞系命名为“8-1C”、“5-3C”和“10-1C”。未用于转移到受体母牛的剩余的胚泡，用来提取DNA，对所述DNA进行另外的PCR分析。该分析用嵌套PCR法，使用也用于转染系的初次筛选的引物是有效的。

如上所述，用设计用以除去μ基因座的外显子1-4的基因打靶构建体，产生三个细胞系。用基于PCR的试验，检验出这些系在定向插入方面都为阳性，将其用于核转移。通过PCR测试已恰当打靶的构建体，筛选从那些核转移产生的剩余的胚泡。获得以下频率的阳性胚泡：

细胞系8-1C：6/8

细胞系10-1C：2/16

细胞系5-3C：0/16

虽然在妊娠第40天，通过超声波检测到总共11次妊娠，到第60天，7个胎儿死亡。剩余4个胎儿经处理以再生新胎成纤维细胞，剩余的器官用来产生小组织样品以进行PCR分析。分析结果如下：

系8-1C：2个胎儿，1个胎儿经PCR检查为定向插入阳性

系10-1C：1个胎儿，经PCR检查为定向插入阳性

系5-3C：1个胎儿，经PCR检查为定向插入阴性

令人惊讶的是，虽然10-1C胚泡中检验为定向插入阳性的频率仅为2/16，但从该细胞系获得的一个有活力的60天胎儿经PCR检测为阳性。也获得了得自8-1C的一个阳性胎儿。对所有组织样品的DNA进行DNA印迹分析，以证实所述构建体不仅在一个末端正确地打中(这通过对原始构建体中存在的较短同源区进行PCR来测定)，而且在另一个末端也正确地打中。根据迄今获得的结果，认为已经产生了得自两个独立整合事件的两个重链敲除胎儿。此外，由于这些胎儿得自两个不同的系，所以至少一个胎儿可能在两个末端正确整合了构建体。一旦DNA印迹分析证实了打靶载体在两个末端恰当打靶，则进行进一步的核转移，以产生另外的胎儿，让其发育至足月。

核转移和胚胎转移用K/O细胞系(8-1-C(18))进行核转移，产生8个胚胎。将得自这一批的总共6个胚胎在Trans Ova Genetics(″TOG″；Iowa)转移到3个无病受体中。

已经将冷冻胚胎转移到10个无病受体中，获得无病雌性成纤维细胞系。在35-40天证实妊娠后，制订胎儿回收时间表。

妊娠诊断和胎儿回收转移了得自敲除胎儿细胞的克隆胚胎的18个受体的妊娠情况，通过超声波检查法检查。结果概述如下。

表2.使用μ重链敲除供体细胞的40天时的妊娠

克隆ID	转移受体编号	40天时妊娠(％)
			8-1-OC	5	4(80)
10-1-C	6	4(67)
			5-3-C	5	3(60)
总计	16	11(69)

妊娠诊断检查了从敲除细胞(8-1C)转移了克隆胚胎的3个受体的妊娠情况；一个已打开(open)，而另外两个需要在1个月后再加以证实。

胎儿回收和细胞系的建立获得了40天时怀有K/O胚胎的11头妊娠牛。第60天，从这些牛取出4个活胎儿。从所有4个胎儿建立了细胞系，并将细胞系冷藏待用。此外，我们收集得自所述胎儿的组织样品并将其快速冷冻，送至Hematech molecular biology laboratory进行PCR/DNA印迹分析。

所有4个细胞系都是雄性细胞系。为了获得雌性细胞系，从在Trans Ova Genetics用无病受体所建立妊娠的妊娠55天时所收集的胎儿(6个)建立细胞系并且将其冷藏，以供将来建立K/O细胞.最近，证实了存在含一个μ敲除的雌性细胞系.可以用这一雌性细胞系产生克隆动物，可以让所述克隆动物与从雄性细胞系产生的动物交配，并且在后代中筛选含有双μ敲除的后代.

实施例2：HAC的导入

进行另外的实验，以证明牛宿主可以或者单独产生或者联合产生免疫球蛋白重链(μ)和λ轻链。另外，这些实验证明，所述免疫球蛋白链被重排，并且获得了多克隆血清。在这些方法中，用人类人工染色体将表达免疫球蛋白的基因导入牛成纤维细胞中。然后用成纤维细胞进行核转移，获得胎儿，并且分析胎儿抗体产生的情况。这些方法和结果在下文有更详细的描述。

HAC构建体用先前描述的染色体克隆系统(Kuroiwa等，Nature Biotech.18：1086-1090，2000)，构建人类人工染色体(HAC)。简而言之，为了构建ΔHAC，用端粒定向染色体截短法(Kuroiwa等，Nucleic Acid Res.，26：3447-3448，1998)，使先前报道的含有在HCF2基因座整合的loxP序列的人类22号染色体片段(hChr22)在AP000344基因座截短。接着，通过将含有在AP000344基因座截短的上述hChr22片段(hCF22)的DT40细胞克隆与含有稳定的且种系可遗传的人类微型染色体SC20载体的DT40细胞克隆(称为“R克隆”)融合，形成细胞杂种。SC20载体通过在S20片段的RNR2基因座插入一个loxP序列而产生。SC20片段是天然存在的来源于人类14号染色体的片段，该片段包含完整的人Ig重链基因区(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722，2000)。所得的DT40细胞杂种含有两种hChr片段。所述DT40杂种用Cre重组酶表达载体转染，以诱导hCF22和SC20载体之间的Cre/loxP介导的染色体易位。稳定转染子用嵌套PCR分析，以证实由HCF2和AP000344基因座限定的2.5兆碱基hChr22区克隆到SC20载体的loxP克隆位点中。然后通过FACS分选，根据所编码的绿色荧光蛋白的荧光，分离预期含有ΔHAC的PCR阳性细胞。经分选细胞的荧光原位杂交(FISH)分析，也用来证实含有所述2.5兆碱基hChr22插入片段的ΔHAC的存在。

同样采用这种染色体克隆系统，也构建了ΔΔHAC。将hChr22片段在AP000344基因座截短，然后通过在DT40细胞中同源重组，将loxP序列整合到AP000553基因座中。然后将所得细胞与含有SC20微型染色体载体的R克隆融合。所述细胞杂种用Cre表达载体转染，以达到Cre/loxP介导的染色体易位。通过PCR和FISH分析，证实了含有由AP000553和AP000344基因座限定的1.5兆碱基hChr22插入片段的ΔΔHAC的产生。

ΔHAC和ΔΔHAC的体内功能性通过产生含有这些HAC的嵌合小鼠来评价。采用标准方法，将这些HAC各自导入小鼠胚胎干(ES)细胞，然后用所述胚胎干细胞产生嵌合小鼠(日本专利号2001-142371；2000年5月11日申请)。所得的小鼠具有高度嵌合状态(85-100％的毛色)，证明含有这些HAC的ES细胞高水平的多能性和这些HAC在体内的有丝分裂稳定性。此外，ΔHAC通过所述ΔHAC嵌合小鼠的种系，遗传给下一代，证明这种HAC的减数分裂稳定性。

保留这些HAC的鸡DT40细胞已经根据布达佩斯条约，于2001年5月9日提交独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent Organism Depository，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566Japan)保藏.保藏号如下：ΔHAC(FERM BP-7582)、ΔΔHAC(FERM BP-7581)和SC20片段(FERMBP-7583)。保留这些HAC的鸡DT40细胞也已经保藏在台湾的食品工业研究和发育研究所(Food Industry Research and Development Institute)(FIRDI)。保藏号和保藏日期如下：ΔHAC(CCRC 960144；2001年11月9日)，ΔΔHAC(CCRC 960145；2001年11月9日)和SC20片段(该细胞系以名称SC20(D)提交保藏；CCRC 960099；1999年8月18日)。

ΔHAC中的2.5兆碱基(Mb)hChr22插入片段由以下BAC毗连群构成，所述毗连群由以下Genbank登录号列出：AC002470、AC002472、AP000550、AP000551、AP000552、AP000556、AP000557、AP000558、AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344。ΔΔHAC中的1.5MbhChr22插入片段由以下BAC毗连群构成：AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344(Dunham等，Nature 402：489-499，1999)。

牛胎成纤维细胞的产生为了产生牛胎成纤维细胞，从在TransOva(Iowa)家畜舍内饲养的经过疾病检验的Holstein牛或Jersey牛中收集45-60天的胎儿，其中记录父本和母本连续三代的系谱。所收集的胎儿在湿冰上运送到Hematech′s Worcester Molecular BiologyDivision，以产生原代胎成纤维细胞。达到后，将胎儿转移到组织培养橱中的非组织培养级的100mm塑料培养皿中。使用无菌镊子和剪刀，从所述胎儿除去胚外膜和脐带。在将胎儿转移到新的塑料培养皿后，除去头部、肢体和内脏。将已取出内脏的胎儿转移到含有约10ml胎儿冲洗液的第三个培养皿中，所述胎儿冲洗液由以下物质组成：125ml1×Dulbecco′s-PBS(D-PBS)，含有Ca²⁺和Mg²⁺(Gibco-BRL，cat#.14040)；0.5ml酒石酸泰乐菌素(Tylosine Tartrate)(8mg/ml，Sigma，cat#.T-3397)；2ml青霉素-链霉素(Sigma，cat#.P-3539)；和1ml两性霉素(Fungizone)(Gibco-BRL，cat#.15295-017)(混合并通过0.2μm尼龙过滤装置(Nalgene，cat#.150-0020)过滤)。

所述胎儿用胎儿冲洗液再洗涤3次，以除去痕量的血液，将其转移到50ml锥形组织培养管中，用无菌手术刀将其切碎成小块。组织小块用无Ca²⁺和Mg²⁺的1×D-PBS(Gibco-BRL，cat#.14190)洗涤1次。在组织小块沉降至管底部后，除去上清液，更换为约30ml细胞解离缓冲液(Gibco-BRL，cat#.13151-014)。将管倒置数次，以便让其混合，然后在组织培养箱中于38.5℃/5％CO₂孵育20分钟。在组织沉降至管底部后，除去上清液，更换为等体积的新鲜细胞解离缓冲液。将组织和细胞解离缓冲液的混合物转移到一个带有24mm圆端旋转棒的75ml无菌玻璃胰蛋白酶处理瓶(Wheaton Science Products，cat#.355393)中。将瓶转移到38.5℃/5％CO₂组织培养箱，置于磁力搅拌板上，以足以允许有效混合的速度搅拌大约20分钟.将瓶转移到组织培养橱中；让组织小块沉降，然后除去上清液，通过以1,200rpm离心5分钟收集解离的细胞.将细胞沉淀重悬于小体积的成纤维细胞完全培养基中，所述培养基的组成如下：440ml αMEM(BioWhittaker，cat#.12-169F)；50ml经照射的胎牛血清；5ml GLUTAMAX-I增补剂(Gibco-BRL，cat#.25050-061)；5ml青霉素-链霉素(Sigma，cat#.P-3539)；1.4ml2-巯基乙醇(Gibco-BRL，cat#.21985-023)(将除胎牛血清之外的所有组分混合，然后通过0.2μm尼龙过滤装置[Nalgene，cat#.151-4020]过滤)，并且在冰上贮存。所述解离过程再重复3次，在每个步骤期间使用另外30ml细胞解离溶液。将细胞合并，用成纤维细胞完全培养基洗涤；顺序通过23号和26号针头，最后通过70μm细胞滤过器(B-DFalcon，cat#.352350)，产生单细胞悬浮液。通过在血细胞计数器中，在存在锥虫蓝(0.4％溶液，Sigma，cat#.T-8154)的情况下计数，测定细胞密度和活力。

原代成纤维细胞在成纤维细胞完全培养基中，以1×10⁶活细胞/T75cm²组织培养瓶的细胞密度于38.5℃/5％CO₂扩大培养。在培养3天后，或者在细胞达到汇合之前，通过用1×D-PBS(无Ca²⁺和Mg²⁺)冲洗培养瓶1次，并且与10ml细胞解离缓冲液一起于室温孵育5-10分钟，收获成纤维细胞。用倒置显微镜目测监测细胞的解离。在这一步，小心确保通过用吸管反复吹打使细胞块消散。在洗涤和定量后，解离的成纤维细胞随时可用于基因打靶实验。这些细胞也可以冷藏，以供长期贮藏。

将HAC导入牛胎成纤维细胞采用微细胞介导的染色体转移(MMCT)(Kuroiwa等Nature Biotech.18：1086-1090，2000)，将ΔHAC和ΔΔHAC从所述DT40细胞杂种转移到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。在补充10％FBS(Gibco)、1mg/ml G418和0.2mg/ml潮霉素B的F12(Gibco)培养基中，于37℃和5％CO₂培养含有ΔHAC的CHO克隆(“D15克隆”)。将D15克隆在12个T25瓶中扩大培养。当汇合度达到80-90％时，以0.1μg/ml的终浓度加入秋水仙酰胺(Sigma)至培养基中。3天后，将培养基更换为补充10μg/ml细胞松弛素B(Sigma)的DMEM(Gibco)。将培养瓶以8,000rpm离心60分钟，收集微细胞。微细胞通过8、5和3μm滤器(Costar)纯化，然后重悬于DMEM培养基中。用所述微细胞如下所述与牛成纤维细胞融合。

牛胎成纤维细胞在补充10％FBS(Gibco)的α-MEM(Gibco)培养基中于37℃和5％CO₂下培养。将成纤维细胞在T175瓶中扩大培养。当达到70-80％汇合时，用0.05％胰蛋白酶使细胞与培养瓶解离。成纤维细胞用DMEM培养基洗涤2次，然后铺在所述微细胞悬浮液上。在微细胞-成纤维细胞悬浮液以1,500rpm离心5分钟后，按照生产商的方案，将PEG1500(Roche)加入到沉淀中，使微细胞能够与所述牛成纤维细胞融合。融合后，将融合的细胞接种到6个24孔板中，在补充10％FBS的α-MDM培养基中培养24小时。然后将培养基更换为含有0.7mg/ml G418的培养基。在G418抗生素存在下生长大约2周后，选择G418抗性融合细胞。用这些G418抗性克隆如下所述进行核转移。

同样借助MMCT，将ΔΔHAC从CHO克隆ΔΔC13转移到牛胎成纤维细胞中。经选择的G418抗性克隆用于核转移。

核转移、激活和胚胎培养基本上如先前已描述的方法(Cibelli等，Science 1998：280：1256-1258)，进行所述核转移法。在成熟后约18-20小时(hpm)，将体外成熟的卵母细胞去核，通过bisBenzimide(Hoechst 33342，Sigma)标记，在紫外线下证实染色体的除去。通过应用2.4kV/cm达20μsec的单个电脉冲(Electrocell manipulator 200，Genetronics，San Diego，CA)，使这些胞质供体细胞双联体融合.3-4小时后，取出总转移双链体的25％的一个随机亚组，通过bisBenzimide标记转移的细胞核，证实融合.30hpm时，重新构建的卵母细胞和对照如先前已描述的方法(Lin等，Mol.Reprod.Dev.1998：49：298-307；Presicce等，Mol.Reprod.Dev.1994：38：380-385)，用钙离子载体(5μM)活化4分钟(Cal Biochem，San Diego，CA)以及用含10μg放线菌酮和2.5μg细胞松弛素D(Sigma)的ACM培养基活化6小时。在活化后，卵在HEPES缓冲的仓鼠胚胎培养基(HECM-Hepes)中洗涤5次，然后置于4孔组织培养板中培养，所述培养板含有经照射小鼠胎成纤维细胞和0.5ml胚胎培养基并覆盖0.2ml经过胚胎试验的(embryo tested)矿物油(Sigma)。每个孔放置25-50个胚胎，在空气环境下于38.5℃、5％CO₂下培养。第4天，向培养基中加入10％FCS。

胚胎转移第7天和第8天，将核转移胚泡分别转移到第6天和第7天同步化的受体小母牛中。受体动物采用一次注射Lutalyse(Pharmacia&Upjohn，Kalamazoo，MI)、然后检查发情进行同步化。在胚胎转移后第30天和第60天，通过超声波检查法，检查受体孕体的存在，此后，每30天通过直肠触诊进行检查，直至270天。HAC在这些牛胎儿中的保留情况概述于表3，并且在以下的小节中更详细地描述。

表3：牛胎儿中的HCA保留概述

含人14号染色体的片段的HAC的导入将SC20片段-人14号染色体片段(“hchr.14fg”，含有Ig重链基因)以与上述方法基本相同的方法，导入到胎成纤维细胞中.也可以使用任何其它的标准染色体转移法，将该HAC或含有人Ig基因的另一种HAC插入到供体细胞中.所得的供体细胞可以用于标准核转移技术，例如上述的那些技术，以产生具有所述HAC的转基因有蹄类动物.

通过超声波检查法，检查从含hchr.14fg的细胞转移了克隆胚胎的28个受体的妊娠情况。结果概述于表4。

表4：使用含hchr.14fg的供体细胞于40天的妊娠

克隆ID	转移受体编号	40天时妊娠(％)
			2-1	08	03(38)
4-2	10	00(00)
			4-1	05	00(00)
4-1	03	01(33)
			2-1	02	01(50)
总计	28	05(18)

妊娠率低于预期。认为这可归因于胚胎转移期间极其异常的炎热气候。

如图27中所示，携带HAC的胚胎的妊娠率看来与非转基因克隆妊娠率相当。一个携带ΔΔHAC幼仔的受体最近产出一个活的健康幼仔。其它受体将在接下来的数月内生产。

人重链基因座在ΔHAC牛胎儿中重排和表达的证明

在各种妊娠天数时取出克隆ΔHAC转基因牛胎儿，分析其人免疫球蛋白基因座的存在、重排和表达。对通过RT-PCR从这些胎儿之一的脾和非淋巴组织(肝和脑)获得的基因组DNA和cDNA的分析，显示出所述ΔHAC的存在、重排和表达。

在ΔHAC胎儿中存在人重链和/或轻链为了确定人重链和轻链是否保留在ΔHAC胎儿中，从ΔHAC胎儿中分离肝DNA，通过PCR分析编码人重链和轻链的基因组DNA的存在情况。

为了检测基因组重链DNA，使用以下引物：VH3-F 5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′(SEQ ID NO：1)和VH3-R 5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3′(SEQ ID NO：2)。用于检测λ轻链DNA的引物是IgL-F 5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′(SEQ IDNO：3)和IgL-R 5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3′(SEQ ID NO：4)。PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl Ex Taq。通过将反应混合物在以下条件下保温：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒，进行38个循环的PCR。

如图5所示，胎儿#5968、6032和6045都含有人重链(μ)和轻链(λ)两个基因座.胎儿#5996仅含有人重链基因座.胎儿#5983不含人重链，也可能不含人轻链.胎儿#5846不含任一种人序列.因此，胎儿#5983和5846可能没有保留所述HAC.这些结果提示，ΔHAC可以在牛中稳定地保留直至妊娠第58天.

在ΔHAC胎儿#5996中存在人Cμ外显子用对包括Cμ3和Cμ4的部分的mRNA转录物特异性的引物，来测定在胎儿#5996中ΔHAC是否存在以及是否表达编码人μ基因座恒定区的转录物。

关于人μ重链的基因组恒定区的这种RT-PCR分析，使用引物“CH3-F1”(5′-accacctatgacagcgtgac-3′，SEQ ID NO：5)和“CH4-R2”(5′-gtggcagcaagtagacatcg-3′，SEQ ID NO：6)，产生一种350碱基对的RT-PCR产物。这种PCR扩增通过最初于95℃变性保温5分钟来进行。然后，通过于95℃保温1分钟、于59℃保温1分钟和于72℃保温2分钟，进行35个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物于72℃保温10分钟。如下所述用引物I7L和P9，检测重排的牛重链(图7)。作为内部对照，用引物“GAPDH正向”(5′-gtcatcatctctgccccttctg3′，SEQID NO：7)和“GAPDH反向”(5′-aacaacttcttgatgtcatcat-3′，SEQ ID NO：8)，检测GAPDH RNA的水平。对于这一GAPDH RNA的扩增，将样品于95℃保温5分钟，然后于95℃1分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，进行35个循环的保温。然后将混合物于72℃保温7分钟。

该分析表明，胎儿#5996脾的RT-PCR分析，产生与使用对照人脾cDNA(第4泳道)和得自ΔHAC嵌合小鼠的cDNA(第5泳道)产生的扩增产物匹配的一个条带(第3泳道)(图6)。在非淋巴组织中没有检测到这样的条带：牛肝(第1泳道)或牛脑(第2泳道)。在肝(图6的第10泳道)和脑(图7的第6泳道)中成功地扩增管家基因GADPH，表明这些组织支持RT-PCR的能力。

到妊娠77天时牛重链基因座的重排测试ΔHAC胎儿#5996，以确定它是否经历了免疫球蛋白重链基因座重排所需的重组系统表达和激活所必需的发育过程。关于该分析，进行标准RT-PCR分析，来检测编码μ-VH重排的mRNA转录物的存在。使用引物“17L”(5′-ccctcctctttgtgctgtca-3′，SEQ ID NO：9)和“P9”(5′-caccgtgctctcatcggatg-3′，SEQ ID NO：10)，通过RT-PCR分析从胎儿#5996脾、肝和脑分离的RNA。PCR反应混合物于95℃保温3分钟，然后采用以下条件：95℃1分钟、58℃1分钟和72℃2分钟，进行35个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物于72℃保温10分钟。

图7的第5泳道表明，获得了预期大小的重排牛重链(450碱基对)扩增产物。该产物迁移到与对照牛Cμ重链cDNA扩增产物的相同位置(第7泳道)，已知所述对照含有对应于重排牛重链转录物的序列。正如所预期的，所述重排重链在脾(第5泳道)中表达，但在发育的这一时间点在脑(第2泳道)和肝(第3泳道)中没有表达。

人重链基因座在ΔHAC胎儿#5996中的重排和表达通过扩增包括Cμ和VH区的部分的DNA区段，证明人重链基因座的重排和表达。用对包括Cμ(Cμl)和VH(VH3-30)的部分的RNA转录物特异性的引物，来测定含有重排人Cμ-VDJ序列的RNA转录物是否存在(图8)。

对于这种RT-PCR分析，使用引物“Cμl”(5′-caggtgcagctggtggagtctgg-3′，SEQ ID NO：11)和“VH3-30”(5′-caggagaaagtgatggagtc-3′，SEQ ID NO：12)，产生450碱基对的RT-PCR产物.这种RT-PCR如下进行：将反应混合物于95℃保温3分钟，然后进行以下40个保温循环：95℃30分钟、69℃30分钟和72℃45分钟，再进行72℃10分钟的一个保温循环.这种RT-PCR产物用相同的引物如下进行再扩增：95℃3分钟的一个保温循环；95℃1分钟、59℃1分钟、72℃1分钟，40个保温循环；和72℃10分钟，一个保温循环.作为内部对照，如上所述进行GAPDH的RT-PCR扩增.

图8中的凝胶表明，对胎儿#5996脾的RT-PCR分析，产生与使用人脾cDNA(第4泳道)或ΔHAC嵌合小鼠脾cDNA(第1泳道)产生的扩增产物匹配的一个条带(第5泳道)。在牛肝(第2泳道)或牛脑(第3泳道)中没有检测到这样的条带。作为阳性对照，GADPH RNA的扩增(第8泳道和第9泳道)表明这些组织支持RT-PCR的能力。

也使用引物CH3-F3(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQ ID NO：13)和CH4-R2(5′-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3′，SEQID NO：14)，通过RT-PCR分析，证实了人重链区在胎儿#5996中的重排和表达。这些PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μl Ex Taq。通过将反应混合物在以下条件下保温：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒，进行40个循环的PCR。

如图9的第6泳道和第7泳道所示，得自胎儿#5996脾的扩增序列的大小与得自两个阳性对照的剪接恒定区片段的大小相同，所述阳性对照为：得自人脾(第8泳道)和ΔHAC嵌合小鼠脾(第9泳道)的样品。正如所预期的，得自正常小鼠脾和牛脾的阴性对照不含扩增序列(第1泳道和第2泳道)。得自胎儿#5996肝和脑的样品不含与经剪接的人μ重链恒定区片段一样大小的扩增剪接序列，但含有来源于污染所述RNA样品的基因组DNA的未剪接基因组片段的扩增序列(第3、4和5泳道)。

人重链基因座在ΔHAC胎儿中的VDJ重排也进行了RT-PCR分析，以进一步证实所述重链基因座在ΔHAC胎儿#5996中的VDJ重排。进行嵌套RT-PCR，第一个反应使用引物Cμ-l(5′-CAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3′，SEQ ID NO：15)，第二个反应使用引物Cμ-2(5′-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3′，SEQ ID NO：16)，两个反应都使用引物VH3-30.3(5′-CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′，SEQ ID NO：17)。所述RT-PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。所述RT-PCR如下进行，第一个反应使用以下条件进行38个循环：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、65℃30秒和72℃30秒。对于第二个反应，使用引物VH3-30.3和Cμ-2(5′-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3′，SEQ ID NO：16)，在以下条件下进行38个循环：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、65℃30秒和72℃30秒。

如图10的第6泳道和第7泳道所示，对胎儿#5996脾的RT-PCR分析，产生其大小与第8泳道和第9泳道中的阳性对照一样的一条重链条带。得自胎儿#5996肝和脑的样品含有某些污染性重排DNA(第3泳道和第5泳道)。第1泳道和第2泳道中的阴性对照产生大小不正确的条带。

通过测序证实ΔHAC重排通过从ΔHAC胎儿#5996脾的RNA反转录所得到的cDNA，用对重排人μ特异性的引物扩增，并且在琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶切取通过用Cμl-VH3-30引物对扩增所产生的条带。从该条带回收所扩增的cDNA并将其克隆。纯化得自经PCR检测为重排人μ阳性的所得克隆的DNA，并对其测序(图11A)。

得自该ΔHAC胎儿的序列与20种以上的已知人重链序列的同源性超过95％.例如，人抗肺炎球菌抗体的μ链与该序列的一个区有97％同源(图11B).

通过用引物Cμ-l和VH3-30.3对胎儿#5996的脾进行RT-PCR分析，然后用引物Cμ-2和VH3-30.3进行再扩增，也获得了得自重排人重链的另外的序列。用CHROMA SPIN柱(CLONETECH)纯化所述RT-PCR产物，并且按照生产商的方案，将其克隆到pCR2.1TA克隆载体(Invitrogen)中。在由BigDye Terminator反应混合物(3μl)、模板质粒(200ng)和Cμ-2引物(1.6pmol)组成的10μl体积的反应混合物中，进行染料终止序列反应(ABI Applied System)。测序反应用ABI 3700测序仪进行。对于该分析，在以下条件下进行25个循环：96℃1分钟、96℃10秒、55℃5秒和60℃4分钟。

鉴定出至少两种重排人重链转录物，它们是VH3-11/D7-27/JH3/Cμ和VH3-33/D6-19/JH2/Cμ(图12A和12B)。这些结果证明，在胎儿#5996脾中的所述ΔHAC中发生人μ重链基因座的VDJ重排。从同一个胎儿鉴定出不止一种重排重链序列，也证明了ΔHAC胎儿产生多样化人免疫球蛋白序列的能力。

人重链和轻链基因座在ΔΔHAC胎儿中的重排和表达

从不同妊娠日期的受体母牛，取出得自牛胎成纤维细胞ΔΔHAC染色体转移的克隆胎儿。分析所述胎儿的带有HAC的人免疫球蛋白重链和λ轻链基因座的存在和重排。对得自这些组织的基因组DNA的研究表明，在其中某些胎儿中存在人免疫球蛋白重链和轻链。对得自这些胎儿脾的cDNA的检查表明，所述免疫球蛋白重链和轻链基因座在其中某些胎儿中重排和表达。FACS分析也证明了人λ轻链蛋白在其中两个胎儿的脾淋巴细胞表面表达。

在ΔΔHAC胎儿中存在人重链和轻链基因座为了确定ΔΔHAC胎儿是否保留有人重链和轻链基因座，对得自58天胎儿#5580、57天胎儿#5848以及91天胎儿#5442A和5442B的肝的基因组DNA进行PCR分析。用于检测所述重链基因座的PCR引物是VH3-F(5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′，SEQ ID NO：18)和VH3-R(5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3′，SEQ ID NO：19)，而用于检测所述轻链的引物是IgL-F(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQ IDNO：20)和IgL-R(5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3′，SEQ IDNO：21)。所述PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl Ex Taq。如下进行38个PCR循环：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒(图13和14)。

如图13和14所示，阳性对照58天胎儿#5580含有人重链和轻链免疫球蛋白两个基因座。另外，91天的胎儿#5442A和5442B也含有重链和轻链两个基因座(图14)。相反，胎儿#5848不含任一种人基因座，因此可能不含有ΔΔHAC。这些结果提示，ΔΔHAC可以在牛中稳定保留直至妊娠第91天。

人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A中的重排和表达用RT-PCR来检测重排人重链RNA转录物在ΔHAC胎儿#5542A中的表达。所用的RT-PCR引物是CH3-F3(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQ ID NO：22)和CH4-R2(5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3′，SEQ ID NO：23)。所述RT-PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。如下进行40个循环的RT-PCR循环：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒。

图15的第4泳道和第5泳道含有来自胎儿#5442A脾的扩增的剪接μ重链恒定区序列，其大小与所述阳性对照样品的大小相似.这些结果表明，胎儿#5442A在其脾中表达一种重排的μ重链转录物.在未经剪接的基因组序列的区中也观察到模糊条带，它们是从所述RNA样品中污染的基因组DNA扩增的.得自胎儿#5442A肝和脑的对照样品不产生扩增重排重链序列所预期大小的条带.

人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达用RT-PCR来检测重排人重链RNA转录物在一个妊娠119天的ΔΔHAC胎儿(胎儿#5868A)的脾中的表达。用于该分析的引物是VH30-3(5′-caggtgcagctggtggagtctgg-3′，SEQ ID NO：24)和CM-1(5′-caggagaaagtgatggagtc-3′，SEQ ID NO：25)。另外，使用引物“GAPDH up”(5′-gtcatcatctctgccccttctg-3′，SEQ ID NO：26)和“GAPDH down”(5′-aacaacttcttgatgtcatcat-3′，SEQ ID NO：27)来扩增GAPDH对照转录物。对于该PCR分析，将反应混合物于95℃保温5分钟，然后通过于95℃保温1分钟、58℃保温1分钟和72℃保温2分钟，进行多个循环的变性、退火和扩增。然后，将混合物于72℃保温10分钟。

图16的第3泳道含有通过对ΔΔHAC胎儿#5868A进行该分析而产生的RT-PCR产物。这种RT-PCR产物为扩增重排人重链所预期的大小(470碱基对)，并且在凝胶中迁移到与已知含有对应于重排人重链转录物的序列的对照cDNA相同的位置。作为对照，ΔΔHAC胎儿#5868A的胎脾cDNA和正常牛cDNA样品当用GAPDH引物扩增时，都产生一种产物，证明所述cDNA支持扩增的能力(第7泳道和第8泳道)。

人λ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中的重排和表达使用对扩增包括人λ的部分的转录物特异性的引物，来检测得自重排人λ轻链基因座的RNA转录物。

对于图17中所示的RT-PCR分析，使用引物Cλ1(.5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3′，SEQ ID NO：28)、Cλ2-3(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3′，SEQ ID NO：29)和Cλ7(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3′，SEQ IDNO：30)的等摩尔混合物和引物Vλ1 LEA1(5′-CCCCCAAGCTTRCCKGSTYYCCTCTCCTC-3′，SEQ ID NO：31)。所述RT-PCR反应混合物含有189μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。所述RT-PCR的条件如下：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒，进行40个循环。

如图18所示，该RT-PCR分析也使用下述引物进行：引物Vλ3LEA1(5′-CCCCCAAGCTTGCCTGGACCCCTCTCTGG-3′；SEQ IDNO：32)、Vλ3JLEAD(5′-ATCGGCAAAGCTTGGACCCCTCTCTGGCTCAC-3′，SEQ ID NO：33)，VλBACK4(5′-CCCCCAAGCTTCTCGGCGTCCTTGCTTAC-3′，SEQ IDNO：34)的等摩尔混合物以及引物Cλ1(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3′，SEQ ID NO：35)、Cλ2-3(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3′，SEQ ID NO：36)和Cλ7(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3′，SEQ IDNO：37)的等摩尔混合物。所述RT-PCR的反应条件与以上关于图7所述的条件相同。

图17的第6泳道和第7泳道以及图18的第4泳道和第5泳道含有得自胎儿#5442A脾、大小与所述阳性对照条带相似的RT-PCR产物，表明在该胎儿中存在重排的轻链RNA转录物。得自胎儿#5442B的脾样品产生在该照片中肉眼不可见的非常弱的大小合适的条带。这种RT-PCR产物表明，胎儿#5442B也在其脾中表达重排的轻链免疫球蛋白转录物。正如所预期的，得自胎儿#5442A和5442B脑的样品不表达人重排λ轻链转录物。

人λ基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达在ΔΔHAC胎儿#5868A中也检测到重排人λ轻链基因座的RNA转录物.关于这一分析，使用对扩增包括人λ的部分的转录物特异性的引物，来检测编码重排人λ基因座部分的转录物的ΔΔHAC编码的表达.该分析使用引物VL1 LEAI(5′-cccccaagcttRccKgStYYcctctcctc-3′；SEQ ID NO：38)以及引物CL1(5′-gggaattcgggtagaagtcactgatcag-3′；；SEQ ID NO：39)、CL2-3(5′-gggaattcgggtagaagtcacttatgag-3′；SEQ ID NO：40)和CL7(5′-gggaattcgggtagaagtcacttacgag-3′；SEQ ID NO：41)的等摩尔混合物。对于该RT-PCR反应，将反应混合物于95℃保温5分钟，然后通过于95℃保温1分钟、60℃保温1分钟和72℃保温2分钟进行多个变性、退火和扩增循环。然后将混合物于72℃保温10分钟。

该分析证明，得自ΔΔHAC#5868A的脾cDNA(图19的第4泳道)产生一种大小与TC小鼠脾cDNA(第6泳道)阳性对照相同的RT-PCR产物。使用得自ΔΔHAC#5868A脑或肝cDNA(分别为第2泳道和第3泳道)，检测不到这样的RT-PCR产物。用引物“GAPDH up”和“GAPDHdown”成功地扩增管家基因GAPDH(第8泳道和第10泳道)，表明这些组织中的每种组织支持RT-PCR的能力。

通过测序证实ΔΔHAC重排使用引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩尔混合物和引物Vλ1LEA1，或者使用引物Vλ3LEA1、Vλ3JLEAD和VλBACK4的等摩尔混合物和引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩尔混合物，对胎儿#5442A脾样品进行RT-PCR分析。所述PCR产物用CHROMA SPIN柱(CLONETECH)纯化，并且按照生产商的方案，克隆到pCR2.1TA克隆载体(Invitrogen)中。使用Cλ1、Cλ2-3和Cλ7引物的等摩尔混合物进行Dye Terminator sequence反应(ABI AppliedSystem)。于96℃1分钟、96℃10秒、55℃5秒和60℃4分钟，进行25个循环。10μl反应混合物含有BigDye Terminator反应混合物(3μl)、模板质粒(200ng)以及Cλ1、Cλ2-3和Cλ7引物(1.6pmol)。用ABI 3700测序仪分析反应混合物。

鉴定出至少两种重排人λ轻链转录物(V1-17/JL3/Cλ和V2-13/JL2/Cλ)。这些结果证明人λ轻链基因在胎儿#5442A脾的ΔΔHAC中发生VJ重排(图20和21)。

人λ轻链和牛重链在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中表达的FACS 分析分析得自ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B的脾淋巴细胞中人λ轻链和牛重链蛋白的表达。让这些细胞与藻红蛋白标记的抗人λ抗体(图22C和22D)、FITC标记的抗牛IgM抗体(图22D和22H)或无抗体(图22A、22B、22E和22F)于4℃反应20分钟。然后细胞用PBS加上2％FCS洗涤2次，然后在FASCalibur细胞分类器上分析。用无抗体对照来电子设定门控(electronically se the gates)，计算与所述抗体反应的细胞的百分率。这些百分率显示在每条频率曲线的下方。胎儿#5442A(图22A-22D)和胎儿#5442B(图22E-22H)既表达人λ轻链蛋白，又表达牛重链蛋白。

实施例3：产生异种抗体和减少量的内源抗体的转基因有蹄类动物

也可以产生表达异种抗体并且具有内源抗体表达水平降低的转基因有蹄类动物。通过相对于功能性内源重链基因或轻链基因的数目而言增加功能性异种免疫球蛋白重链基因或轻链基因的数目，应该提高表达异种抗体的B细胞的百分率。

为了产生这些转基因有蹄类动物，可以让ΔHAC或ΔΔHAC转基因有蹄类动物与在内源免疫球蛋白链(例如μ重链或者λ或κ轻链)的一个或两个等位基因中含有突变的转基因有蹄类动物交配.如有必要，可以让所得的转基因有蹄类动物(i)与在内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸的一个或两个等位基因中有突变的转基因有蹄类动物交配，或者(ii)与含有外源J链核酸(例如人J链)的转基因有蹄类动物交配.或者，可以通过使一种或多种内源免疫球蛋白基因突变，对得自ΔHAC或ΔΔHAC转基因胎儿的细胞(例如胎成纤维细胞)进行遗传修饰.在另一种可能的方法中，将ΔHAC或ΔΔHAC导入到其中内源免疫球蛋白(μ重链和/或λ轻链)被半合失活或纯合失活的细胞(例如胎成纤维细胞)中.在任一上述方法中，也可以通过(i)将突变(优选敲除突变)导入内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸的一个或两个等位基因中，或者(ii)导入内源J链核酸，对所述细胞进行遗传修饰.然后，可以将所得的转基因细胞用于核转移方法中，以产生所需的转基因有蹄类动物.以下描述示例性的方法

DNA构建体可以使用以上所述的μ重链(图2A)、λ轻链、κ轻链、α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链敲除构建体。另一方面，可以使用以下所述的嘌呤霉素抗性μ重链构建体(图3F)。这种敲除构建体设计用以除去牛μ重链基因座的4个主要编码外显子，而留下完整的跨膜结构域，导致所述μ重链基因座失活。

嘌呤霉素抗性构建体如下装配。将含有紧邻编码外显子1的区的4.4千碱基XhoI片段插入到pBluescript II SK+的XhoI位点。含有嘌呤霉素抗性基因的质粒pPGKPuro得自Peter W.Laird博士，WhiteheadInstitute，USA。将含有嘌呤霉素抗性基因的1.7Kb XhoI片段邻近插入到多接头区中存在的SalI位点中的所述4.4Kb片段亚克隆，或者在其下游亚克隆。这一1.7Kb嘌呤霉素标记取代了牛免疫球蛋白重链基因座的编码外显子CH1、CH2、CH3和CH4。将含有位于野生型基因组序列中这四个外显子下游的μ基因座的4.6Kb区的XbaI片段，加入到该构建体中，用作第二同源区。

为了产生最终的打靶构建体，通过用NotI和MluI切割这三种装配好的片段，产生该构建体的亚克隆。MluI限制性消化将所述4.6Kb片段截短至1.4Kb。NotI位点位于多接头中，并且不可切割成为亚克隆DNA本身。MluI位点用Klenow片段补平，产生平端，然后利用pBluescript II SK+载体中存在的NotI和SmaI位点，将NotI/补平MluI片段亚克隆到新的所述pBluescript载体中。为了进行基因打靶，最终的载体用NotI线性化。

通过电穿孔进行基因打靶和转染成纤维细胞的药物选择对于电穿孔，将经历了有限次数群体倍增的1×10⁷牛胎成纤维细胞(例如按照实施例2所述从ΔHAC或ΔΔHAC转基因胎儿获得的成纤维细胞)的单细胞悬浮液以1200rpm离心5分钟，然后重悬于0.8ml无血清α-MEM培养基中。将重悬浮的细胞移至0.4cm电穿孔样品池(Invitrogen，cat#.P460-50)中。接着，加入30μg限制性酶线性化的基因打靶载体DNA，用1ml移液管将样品池中的内容物混合，然后进行一个室温下2分钟的孵育步骤。将样品池插入Gene Pulser II电穿孔系统(Biorad)的振荡(shocking)室中，然后以1000伏特和50μF进行电穿孔。迅速将样品池转移到组织培养橱中，用吸管将电穿孔细胞加入到大约30ml成纤维细胞完全培养基中。将细胞同等地分配到30个100mm组织培养皿(Corning，cat#.431079)中，温和旋转，以使细胞均匀分布，然后于38.5℃/5％CO₂下孵育16-24小时。吸出培养基，更换为含有所选的选择药物的成纤维细胞完全培养基。培养基每两天进行更换，持续总共7-14天。在所述药物选择过程中，目测监测代表性板，以检查细胞死亡和集落形成。设定阴性对照板，阴性对照板含有在无基因打靶载体时电穿孔的成纤维细胞，在所述药物选择过程中应该不产生集落。

抗药性成纤维细胞集落的挑出和细胞的扩大培养在完成药物选择步骤(通常7-14天)之后，抗药性集落用肉眼可见，随时可供转移到48孔组织培养板中以进行扩大培养.为了有助于转移过程，在用彩色标记笔(Sharpie)在组织培养板底部圈出单个集落.含有集落的组织培养板用1×D-PBS(无Ca²⁺和Mg²⁺)洗涤2次，然后每个板加入5ml细胞解离缓冲液的1∶5稀释液。在室温3-5分钟的孵育步骤之后，单集落开始与组织培养皿底部分离。在集落分离之前，用P200自动移液器和气溶胶阻挡吸头(aerosol barrier pipette tip)(200或250μl)，将它们分别转移到48孔组织培养板的一个孔中。转移后，用吸管反复吸打，使集落完全解离，然后加入1ml成纤维细胞完全培养基。为了确保所述细胞是抗药性的，在整个所述48孔期继续进行药物选择。转移的集落在38.5℃/5％CO₂下培养，并且用倒置显微镜目测监视。2-7天后，达到汇合的孔用1×D-PBS(无Ca²⁺和Mg²⁺)洗涤2次，通过加入0.2ml细胞解离缓冲液，后接一个于室温孵育5分钟的步骤，使其与孔底部分离。在解离后，通过用P1000自动移液器和气溶胶吸头(1000μl)反复吸打使细胞进一步解离。将大约75％的解离成纤维细胞转移到24孔组织培养板的各孔中进行进一步扩大培养，以供后续的PCR分析用，将剩余的25％转移到第二个24孔板的一个孔中进行扩大培养，并且最终用于体细胞核转移实验。当在含有75％原始细胞的板中的细胞增殖至接近汇合时，从该克隆分离DNA进行遗传分析。

DNA制备用来分离供遗传分析用的DNA的方法是Laird等，Nucleic Acids Research，1991，Volume 19，No.15的方法的改进方法。特别是，一旦特定克隆在24孔板的一个孔中已经达到接近汇合，则从该孔中吸出培养基，贴壁细胞用PBS洗涤2次。吸出PBS，更换为0.2ml缓冲液，以裂解所述细胞和从待分离DNA消化过量蛋白。该缓冲液的组成为：100mM Tris-HCl(pH 8.5)、5mM EDTA、0.2％SDS、200mMNaCl和100μg/ml蛋白酶K。将24孔板放回组织培养箱中达最少3小时，从而让所述DNA释放和蛋白消化。将该操作的粘性产物转移到1.5ml微量离心管中，加入0.2ml异丙醇以沉淀DNA。通过离心回收沉淀，DNA沉淀用70％乙醇漂洗，风干后，将沉淀重悬于含有10mMTris，pH 8和1mM EDTA的25-50μl缓冲液中。该DNA用于克隆的PCR分析。

克隆的筛选用两种不同的方法筛选克隆，两种方法都使用聚合酶链式反应(PCR)。该小节中所述的所有方法可适用于任何其它基因的打靶，不同之处仅为遗传分析所用引物的序列。

按照第一种方法，用不同的两对引物，独立扩增稳定转染的产物。用一对引物来检测克隆基因组中打靶载体的存在，而与整合位点无关。所述引物设计用以全都退火至打靶载体中存在的DNA序列上。该PCR反应的PCR产物的强度可能与已经整合到基因组中的打靶载体的拷贝数相关。因此，仅含有一个拷贝打靶载体的细胞通过所述PCR反应往往产生强度较弱的条带。另一对引物设计用以仅检测整合到所需基因座中的载体的拷贝。在这种情况下，一种引物设计退火到打靶载体内，而另一种引物设计用以退火至在打靶载体中不存在的、对靶基因座特异性的序列上。在这种情况下，只有当打靶载体紧邻打靶载体中不存在的所述位点整合时，才可检测到PCR产物，指示所需的打靶事件。如果检测到产物，则用所述克隆进行核转移。

对于新霉素抗性重链敲除构建体，使用引物Neo1(5′-CTT GAAGAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3′，SEQ ID NO：42)和IN2521(5′-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3′，SEQ ID NO：43)来检测细胞中打靶载体的存在，而与整合位置无关.使用引物Neo1和OUT3570(5′-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACCCAA GTC TGT C-3′，SEQ ID NO：44)来特异性地仅扩增整合到μ重链基因座的打靶构建体的那些拷贝。

对于用来分析所述新霉素抗性重链敲除构建体整合的这些PCR反应，使用Qiagen PCR试剂盒。所述PCR反应混合物含有每种引物各1pmole、5μl10×反应缓冲液、10μl Q溶液、5μl DNA和1μl of dNTP溶液。用水使反应混合物的总体积达到50μl。使用最初于94℃变性保温2分钟，进行该PCR扩增。然后通过于94℃保温45秒、60℃保温45秒和72℃保温2分钟，进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物于72℃保温5分钟，然后于4℃温育直至从PCR仪中取出混合物。

在替代的方法中，用一个引物组来扩增靶基因座，并且所述PCR产物的大小是正确打靶的鉴别特征。一种引物设计退火到打靶载体中不存在的所述基因座的一个区上，而另一种引物设计退火至打靶载体中存在、但在野生型基因座中也存在的位点上。在这种情况下，不能检测到已经在基因组中不想要的位点整合的打靶载体。因为打靶载体所缺失的区域在大小上与其位置中插入的药物选择标记不同，所以所述产物的大小取决于所扩增的基因座是野生型基因型还是靶基因型。含不正确插入的打靶载体或者根本没有插入打靶载体的克隆的DNA的扩增，产生预期大小的、野生型基因座的一种PCR产物。得自含被正确打中的(“敲除的”)等位基因的克隆的DNA的扩增，产生两种PCR产物，一种代表野生型等位基因的扩增，一种代表由于抗药性标记取代野生型等位基因中某些序列所致的、其长度不同于所取代序列的、被改变的大小可预测的等位基因的扩增。

对于嘌呤霉素抗性重链敲除构建体，使用引物Shortend(5′-CTGAGC CAA GCA GTG GCC CCG AG-3′，SEQ ID NO：45)和Longend(5′-GGG CTG AGA CTG GGT GAA CAG AAG GG-3′，SEQ ID NO：46)。这对引物既扩增野生型重链基因座，又扩增已经被所述嘌呤霉素构建体正确打中的基因座。这两条带的大小之差为0.7Kb。存在较短的条带指示正确打靶。

对于用以分析嘌呤霉素抗性重链敲除构建体整合的这种PCR反应，使用Promega Master Mix试剂盒。所述PCR反应混合物含有每种引物各1pmole、2.5μl DNA和25μl 2×Promega Master Mix。用水使反应混合物的总体积达到50μl。使用最初于94℃变性保温2分钟，进行该PCR扩增。然后通过于94℃保温45秒、60℃保温45秒和72℃保温2分钟，进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物于72℃保温5分钟，然后于4℃温育直至从PCR仪中取出混合物。

第一轮核转移使用其中一个免疫球蛋白基因已被失活的经过选择的成纤维细胞，按照实施例2中所述进行核转移，产生在内源免疫球蛋白基因中有突变并且含有编码异种免疫球蛋白基因的HAC的转基因有蹄类动物。另一方面，可以使用标准方法进行核转移，从而将得自经选择的转基因成纤维细胞的细胞核或染色质(即无膜包围的一个或多个染色体)插入到去核卵母细胞中(U.S.S.N.60,258,151；于2000年12月22日申请)。这些方法也可以用于其中内源α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸已被突变的细胞。

第二轮诱变和核转移如有需要，可以由从第一轮核转移产生的转基因有蹄类动物获得细胞(例如胎成纤维细胞).可以如上所述再进行一轮基因打靶，以失活在第一轮打靶中被失活基因的第二个等位基因.或者，可以在该轮打靶中，使另一免疫球蛋白(例如μ重链、λ轻链、κ轻链或J链)、α-(1，3)-半乳糖基转移酶或朊病毒基因失活.对于这第二轮打靶，或者可以使用更高浓度的抗生素，或者可以使用具有不同抗生素抗性标记的敲除构建体.抗生素抗性细胞可以如上所述进行选择.经选择的细胞可以如上所述用于第二轮核转移，以产生例如在内源免疫球蛋白基因中含有两个突变并且含有编码异种免疫球蛋白基因的HAC的转基因有蹄类动物.另一方面，可以首先处理经选择的抗生素抗性细胞，以便如下所述分离G1期细胞，将其用于第二轮核转移.

为了分离用于核转移的G1细胞，在分离之前24小时，将5.0×10⁵细胞接种到含有10ml α-MEM+FCS的100mm组织培养平板上。第二天，平板用PBS洗涤，在分离前更换培养基达1-2小时。将平板在Vortex-Genie 2(Fisher Scientific，Houston，TX，中速)上振摇30-60秒，取出培养基，以1000G离心5分钟，将沉淀重悬于250μl MEM+FCS中。然后选择以胞质桥连接的新分裂的细胞双联体，因为这些细胞处于G1早期。这种分离方法称为“摇出(shake off)”法。

实施例4：α-1，3-半乳糖基转移酶活性降低的转基因有蹄类动物

通过同源重组，产生其中α-1，3-半乳糖基转移酶基因座中的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞系。用于产生α-半乳糖基转移酶敲除细胞的DNA构建体，用来通过将嘌呤霉素抗性基因(puro，在实施例3中描述的)和转录终止盒(STOP)两者插入到含有催化结构域的外显子9中，防止功能性全长α-半乳糖基转移酶mRNA的转录。因而，所得的未成熟α-半乳糖转移酶转录物缺乏催化结构域。将所述DNA构建体(即α-半乳糖基转移酶KO载体)经电穿孔导入三个独立的牛成纤维细胞系中，然后分离嘌呤霉素抗性集落。基于PCR分析，在某些集落中在外显子9区中发生同源重组。因而产生了其中α1，3-半乳糖基转移酶基因座中的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞系。必要时，可以使用同一种敲除载体和更高浓度的抗生素来选择纯合敲除细胞，或者使用具有一种不同抗生素抗性基因的另一种敲除构建体，使第二个等位基因突变。这种方法也可以应用于得自其它有蹄类动物的细胞，以产生可供在本文所述的核转移法中用以产生本发明的转基因有蹄类动物的转基因细胞。

以下进一步描述这些方法。

α-1，3-半乳糖基转移酶KO载体的构建如下产生α-1，3-半乳糖基转移酶KO载体(图23)。为了分离α-1，3-半乳糖基转移酶基因外显子9周围的基因组DNA，使用以下引物对5′-gatgatgtctccaggatgcc-3′(SEQ IDNO：61)和5′-gacaagcttaatatccgcagg-3′(SEQ ID NO：62)，通过PCR扩增DNA探针。使用这种探针，筛选牛基因组λ噬菌体文库，鉴定出7个阳性λ噬菌体克隆。一个克隆含有得自雄性Charolais牛成纤维细胞的DNA，通过制作限制性图谱对其进一步分析。将含有外显子9的NotI-Xho I基因组片段亚克隆到pBluescript II SK(-)中，然后将puro和STOP盒插入到Not I-Xho I基因组片段中位于催化结构域5’的Avi I位点。也将白喉毒素基因(DT-A，Gibco)加入到该载体构建体中，以杀死其中打靶盒非同源整合的细胞。

转染/敲除方法用标准电穿孔法，如下进行三个胎成纤维细胞系(两个得自雄性Jersy牛，一个得自雌性Jersy牛)的转染。用来培养所述牛胎成纤维细胞的培养基含有500mlαMEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5ml青霉素-链霉素(SIGMA)和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)。在转染前一天，将细胞接种到T175组织培养瓶中，通过显微镜检查测定达到80-100％的目标汇合度。转染当天，大约10⁷牛成纤维细胞经过胰酶处理，并用α-MEM培养基洗涤1次.在将细胞重悬于800μlα-MEM中之后，向细胞悬浮液中加入30μg DNA，通过吸打充分混合。将细胞-DNA悬浮液转移到电穿孔样品池中，以1,000V和50μF进行电穿孔。此后，将经电穿孔的细胞接种到带有补充血清的α-MEM培养基的20个24孔板中。培养48小时后，将培养基更换为含有1μg/ml嘌呤霉素的培养基，将细胞培养2-3周，以选择嘌呤霉素抗性细胞。选择后，挑出达到接近100％汇合的所有集落，从所述集落中提取基因组DNA，以通过PCR筛选所需的同源重组事件。

靶整合的筛选如上所述，用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra SYSTEMS)，按照生产商的方案，从24孔的各孔中独立地提取基因组DNA。将每种基因组DNA样品重悬于20μl 10mM Tris-Cl(pH8.0)和1mM EDTA(EDTA)中。用以下引物对5′-aagaagagaaaggtagaagaccccaaggac-3′(SEQ ID NO：63)和5′-cctgggtatagacaggtgggtattgtgc-3′(SEQ ID NO：64)，通过PCR进行筛选。一种引物的序列位于α-1，3-半乳糖基转移酶KO载体内，另一种引物的序列恰好位于靶内源基因座中整合的载体之外(图23)。因此，预期的PCR产物应该仅在所述KO载体通过同源重组整合到靶基因座中时才可检测到。

所述PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×LA PCR缓冲液II(含Mg²⁺)、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过将反应混合物在以下条件下保温：85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒和68℃15分钟，进行40个循环的PCR。在PCR后，通过电泳分析反应混合物。选择出产生预期大小PCR产物的嘌呤霉素抗性克隆(图23)。因此，成功地产生了其中α-1，3-半乳糖基转移酶基因座中的一个等位基因被KO载体突变的牛成纤维细胞系。

实施例5：使用腺相关病毒使内源基因突变的产生转基因有蹄类动物的替代方法

腺相关病毒(AAV)可以用来特异性地取代细胞基因组中存在的靶序列(Inoue等，Mol.Ther.3(4)：526-530，2001)；Hirata等，J.Virol.74(10)：16536-42，2000)；Inoue等，J.Virol.73(9)：7376-80，1999)；和Russell等，Nat.Genet.18(4)：325-30，1998))。其基因打靶率与更传统的基因打靶法相比非常有效。AAV有广宿主范围和组织特异性，包括对牛和人皮肤成纤维细胞的特异性。因此，可以用AAV来产生在内源免疫球蛋白(例如μ重链、λ轻链、κ轻链或J链)、α-1，3-半乳糖基转移酶或朊病毒基因中含有一个或多个突变的转基因有蹄类动物细胞。然后可以将这些转基因细胞用于本文所述的核转移法中，以产生本发明的转基因有蹄类动物。

应用AAV，导致牛免疫球蛋白重链基因座以高于先前用传统基因打靶策略(即电穿孔和脂转染法)所达到的频率进行同源重组。在第一轮基因打靶实验中，在含有通过AAV载体所导入DNA的73个稳定转导子中，获得5个正确打中的成纤维细胞克隆。

这些实验如下进行。

AAV敲除载体AAV构建体可以通过简单地插入外源序列或者用AAV载体中存在的新序列取代内源序列而破坏基因。图24显示了一种AAV构建体，其中牛免疫球蛋白重链μ恒定区的所有4个编码外显子存在于2822碱基对的BamHI-XhoI片段上。将含有市售载体pMClNeo中存在的新霉素抗性标记的1.16Kb片段，插入到得自Holstein牛的μ重链基因座外显子4中存在的SacII位点中。该基因座是在分离用以产生实施例1中所述敲除载体的噬菌体克隆中所含有的基因座。为了产生所述AVV载体，将μ重链基因座中的SacII位点补平，构建平端，随后将其与平端SalI接头(New England Biolabs)连接.然后，将含有新霉素抗性基因的pMClNeo的XhoI片段与通过SalI接头加入到该基因座的SalI位点连接.可以进行这种连接，是因为XhoI和SalI限制位点具有匹配末端.这种敲除载体引起新霉素抗性基因破坏性地插入到内源μ重链基因中，从而使所述μ重链基因失活.该基因失活的发生无需使所述内源μ基因座的区缺失.

设计一种替代的载体，以在打靶期间从所述内源基因座除去外显子3和4，导致这两个外显子被一个功能性拷贝的新霉素抗性基因取代(图25)。这种构建体应用从雌性Jersey牛经PCR扩增基因组DNA来产生。具体地说，使用以下引物扩增3’同源区：5′GGGGTCTAGAgcagacactacactgatgggcccttggtcc 3′(SEQ ID NO：65)，该引物加入一个XbaI限制位点；和5′GGGGAAGCTTcgtgtccctggtcctgtctgacacag 3′(SEQ ID NO：66)，该引物加入一个HindIII限制位点。用加入一个XhoI限制位点的引物5′GGGGCTCGAGgtcggcgaaggatggggggaggtg 3′(SEQ ID NO：67)和加入一个KpnI限制位点的引物5′GGGGGGTACCgctgggctgagctgggcagagtggg3′(SEQ ID NO：68)，扩增5’同源区。这些引物序列中大写的核苷酸是不可退火至所述μ重链基因座上、但包括在所述引物中以加入限制位点以便于后续亚克隆步骤的核苷酸。加入前4个鸟嘌呤，以便将所述限制位点与所述引物的真正末端分开，因为限制性酶不切割位于引物真正末端的位点以及内部位点。5’同源区长1.5Kb，含有外显子1和2。5’同源区也含有外显子3的前25个核苷酸，以保持外显子的剪接受体位点。所述剪接受体位点使得外显子3可以用于剪接，并因此防止外显子1和2可能被剪接到下游跨膜结构域，形成异常的膜结合产物。3’同源区长1.24Kb，含有紧接外显子4下游的区域。

对于图24所示的构建体，采用标准方法，将所述打靶盒插入到Ryan等(J.of Virology 70：1542-1553，1996)报道的含有病毒长末端重复(LTR)序列的AAV载体中。用TtetA2包装细胞系，如先前描述的方法(Inoue和Russell，1998，J.Virol.72：7024-7031，1998)，将所述AAV载体包装到衣壳中，并且按照先前所述的方法(Zolotukhin等，GeneTherapy，6：973-985，1999)进行纯化。对于图25所示的构建体，可以使用上述方法或者任何其它标准方法，将所述打靶盒插入到Ryan等所述的AAV载体或者任何其它AAV载体(例如得自Stratagene的市售载体)中，产生含有所述载体的病毒。

转导方法将得自雌性Jersey牛的成纤维细胞以40,000细胞/孔接种到48孔组织培养板的一个孔中，在完全培养基中于38.5℃和5％CO₂下培养，直至细胞粘附到孔的底部表面。一旦细胞贴壁，则取出培养基，更换为含有具有图24所示载体的AAV颗粒的0.2ml新鲜培养基，感染复数(MOI)为500-20,000颗粒/细胞。MOI的选择基于测定在药物选择期内所产生的集落数和集落间隔(spacing)的预实验。将板孵育过夜。在该孵育期后，转导孔用无钙和镁的PBS漂洗，如上所述用或者胰酶或者细胞解离缓冲液使细胞与孔分离。通过轻轻吸打解离的细胞，获得均一的细胞悬浮液，使得自所述孔的细胞重新分配在10个100mm组织培养皿中。各培养皿用完全培养基孵育过夜。

在该100mm培养皿孵育后，将培养基更换为含有350微克/ml浓度的G418的选择培养基。每2-3天更换选择培养基，直至在培养皿表面肉眼可见集落。此时，挑出单个集落，将其转移到其自身的容器中。

在组织培养皿的外表面，标注含有集落的区域.一旦圈出所有集落，则从平板中吸出培养基，平板用无钙和镁的PBS洗涤3次.洗涤后，用1×胰酶的1∶25稀释液漫过平板，让其于室温静置，直至可见所述集落开始与平板表面分离.保持平板固定，以防止分离的集落漂浮到平板的另一位置上.用吸头挑出50微升体积的细胞块，将吸头的内容物转移到24孔组织培养板中的一个孔.在转移了所有的集落后，立即加入含有G418的完全培养基，让分离的克隆扩大培养接近汇合.

当一个孔接近汇合时，将其用无钙和镁的PBS洗涤2次。用0.2ml细胞解离缓冲液使细胞分离。在这种细胞悬浮液中，将20μl转移到一个新的24孔板中，让剩余的细胞在加入2.0ml完全培养基后，再粘附至原始24孔板表面。将原始板孵育至100％汇合。新的板用作正确打中的细胞来源，以供将来的牛克隆法用。

当得自原始24孔板的一个孔变为100％汇合时，除去培养基，细胞用PBS洗涤1次。除去PBS，更换为根据Laird等(Nucleic Acids Res.19：4293，1991)改进的细胞裂解缓冲液。简而言之，向该孔中加入含有200mM NaCl、100mM Tris-HCl pH 8.5、5mM EDTA、0.2％SDS和100μg/ml蛋白酶K的0.2ml裂解缓冲液。将板再放回培养箱中达3小时至过夜。然后将粘性的细胞裂解液转移到微量离心管中。加入等体积的异丙醇以沉淀DNA。在微量离心机中离心10分钟后，弃去上清液，沉淀用0.5ml 70％乙醇洗涤1次。除去乙醇后，将DNA沉淀风干，重悬于35微升TE缓冲液(10mM Tris pH 8和1mM EDTA)中。将3μl的等份样品用于PCR分析。

PCR分析用PCR分析，在所述载体的正确打靶方面对得自用AAV颗粒转导的抗药性克隆的DNA样品进行筛选。这种筛选策略使用一种退火到编码所述药物抗性标记的DNA内的引物和另一种退火到靶基因座内但在所述AAV打靶颗粒中存在的序列之外的引物。仅当所述AAV打靶DNA整合到所述内源基因组的所需位置时，才可检测到PCR产物。

得自使用这些AAV颗粒的单打靶实验的结果示于图26。基于这一分析，73个独立克隆中的5个克隆含有所述正确打靶的载体DNA。

该方法也可以与图25中所示的AAV载体或者与任何其它合适的腺病毒或腺相关病毒载体一起使用。如有需要，可以通过用带有一种不同抗生素抗性基因(即除新霉素抗性基因之外的基因)的AAV载体转导，使所分离的集落中对第二μ重链等位基因突变。为了选择所得的纯合敲除细胞，在相应的抗生素存在下培养被感染的细胞。或者，可以用含有新霉素抗性基因的AAV载体转导所分离的集落，然后在存在高浓度抗生素(即杀死杂合敲除细胞但不杀死纯合敲除细胞的抗生素浓度)的情况下培养所述集落。

其它实施方案

从上述描述中，可以明显看出，可以对本文所述的发明作出各种变化和改进，以使其适合于各种用途和条件。这类实施方案也在以下权利要求书的范围内。

在本说明书中提及的所有出版物都通过引用结合到本文中，其程度与每个独立出版物或专利申请具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。

Claims (27)

1.一种制备牛卵母细胞的方法，所述卵母细胞具有一种或多种人类人工染色体，并且用于由所述卵母细胞形成胚胎和用于由所述卵母细胞或胚胎产生转基因牛，所述方法包括下述步骤：将具有一种或多种人类人工染色体的细胞、得自细胞的染色质或得自细胞的细胞核插入到牛卵母细胞中；其中所述人类人工染色体编码整个或部分人类Ig基因；所述基因能够在B细胞中经历重排并且表达不止一种人类Ig分子。

2.权利要求1的方法，其中所述人类人工染色体编码人类抗体。

3.权利要求2的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述人类人工染色体来源于人类14号染色体、人类2号染色体和人类22号染色体中的一个或多个。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述人类人工染色体是保藏号为FERM BP-7582的ΔHAC或保藏号为FERM BP-7581的ΔΔHAC。

6.权利要求1的方法，其中所述人类人工染色体包含未经重排的抗体轻链核酸区段，其中编码V基因区段的所有核酸区段与编码J基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸。

7.权利要求1的方法，其中所述人类人工染色体包括未经重排的抗体重链核酸区段，其中或者(i)编码V基因区段的所有核酸区段与编码D基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸和/或(ii)编码D基因区段的所有核酸区段与编码J基因区段的所有核酸区段隔开一个或多个核苷酸。

8.权利要求1的方法，其中所述牛包含减少内源Ig基因表达的突变。

9.权利要求8的方法，其中所述突变减少功能性IgM重链的表达。

10.权利要求9的方法，其中所述突变基本上消除功能性IgM重链的表达。

11.权利要求8的方法，其中所述突变减少功能性Ig轻链的表达。

12.权利要求11的方法，其中所述突变基本上消除功能性Ig轻链的表达。

13.权利要求8的方法，其中所述突变减少功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达。

14.权利要求13的方法，其中所述突变基本上消除功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达。

15.权利要求1的方法，其中所述牛在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶的内源核酸中的一个或两个等位基因中有突变。

16.权利要求1的方法，其中所述牛在编码朊病毒蛋白的内源核酸中的一个或两个等位基因中有突变。

17.权利要求1的方法，其中所述牛在编码J链的内源核酸中的一个或两个等位基因中有突变。

18.权利要求1的方法，其中所述牛包含编码外源J链的核酸。

19.权利要求18的方法，其中所述J链为人J链。

20.一种牛细胞，其来源于使用以权利要求1-19中任一项的方法制备的卵母细胞所产生的牛，所述细胞包含一种或多种编码整个或部分人类Ig基因的人类人工染色体，其中所述基因能够经历重排并且表达一种或多种人类Ig分子。

21.权利要求20的细胞，其中所述人类人工染色体编码人类抗体。

22.权利要求20或21的细胞，其中所述人类人工染色体来源于人类14号染色体、人类2号染色体和人类22号染色体中的一个或多个.

23.权利要求20或21的细胞，其中所述人类人工染色体是保藏号为FERM BP-7582的ΔHAC或保藏号为FERM BP-7581的ΔΔHAC。

24.权利要求20或21的细胞，其中所述细胞是胎成纤维细胞。

25.权利要求20或21的细胞，其中所述细胞是B细胞。

26.权利要求20或21的细胞，所述细胞在编码Ig重链和/或轻链的核酸中包含突变。

27.一种杂交瘤，所述杂交瘤是通过权利要求25的细胞与骨髓瘤细胞融合而形成的。

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