MXPA03004313A

MXPA03004313A - Expresion de inmunoglobulinas xenogenas (humanas) en ungulados transgenicos, clonados.

Info

Publication number: MXPA03004313A
Application number: MXPA03004313A
Authority: MX
Inventors: James M Robl; Richard A Goldsby; Stacy E Ferguson; Yoshimi Kuroiwa; Kazuma Tomizuka; Isao Ishida; Barbara A Osborne
Original assignee: Hematech Llc
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2007-02-27
Also published as: WO2002070648A3; EP1343880A4; CA2428053A1; JP2005224250A; EP2042594A1; NZ525664A; KR100882030B1; EP1343880A2; CN1486365B; KR20080005616A; WO2002070648A2; KR20030059260A; CN1486365A; AU2001297523B2; EP1343880B1; AU2007201700A1; EP2042594B1; CA2428053C; ATE432343T1; DE60138832D1

Abstract

La presente invencion se refiere a la produccion de un bovino transgenico que comprende una modificacion genetica que da como resultado inactivacion y perdida de expresion de sus anti-cuerpos endogenos, y la expresion de anti-cuerpos xenogenos, de preferencia anti-cuerpos humanos. Esto es efectuado por inactivacion de la expresion de la cadena pesada IgM y, opcionalmente, por inactivacion de la expresion de la cadena ligera Ig, y por la introduccion adicional de un cromosoma artificial que da como resultado la expresion de anti-cuerpos no de bovino, de preferencia anti-cuerpos humanos.

Description

EXPRESIÓN DE INMUNOGLOBULINAS XENÓGENAS (HUMANAS) EN UNGULADOS TRANSGÉNICOS, CLONADOS Campo de la Invención La presente invención es un ungulado genéticamente modificado que contiene ya sea parte o todo el lugar de un gel de anti-cuerpo xenógeno, que sufre re-arreglo y expresa una población diversa de moléculas de anti-cuerpos . En particular, el gen de anti-cuerpo xenógeno puede ser de origen humano. En adición, la presente invención provee un ungulado en el cual la expresión de los genes de anti-cuerpo endógenos es ya sea reducida o ha sido eliminada. Las modificaciones genéticas en el ungulado (por ejemplo, bovino) son hechas usando una combinación de técnicas de transferencia nuclear y moleculares. Estos ungulados transgénicos, clonados, proveen un suministro teóricamente infinito, renovable, de anti-cuerpos policlonales xenóge-nos, particularmente anti-cuerpos humanos, que tienen uso, v.gr., como agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico, y para fines de purificación. Antecedentes de la Invención En 1890, Shibasaburo Kitazato y Emil Behring reportaron un experimento con resultados extraordinarios; particularmente, demostraron que se puede transferir inmunidad de un animal a otro tomando suero de un animal inmune e inyectándolo en el no inmune.

Este experimento de referencia estableció los fundamentos de la introducción de la inmunización pasiva en la práctica clínica. Hoy en dia, la preparación y uso de inmunoglobulina humana (Ig) para la inmunización pasiva es una práctica médica normal. Tan sólo en los Estados Unidos, existe un mercado anual de $1,400,000,000 (dólares) para la inmunoglobulina humana, y cada año más de 16 toneladas métricas de anti-cuerpo humano se usa para terapia intravenosa de anti-cuerpo. Niveles comparables de consumo existen en las economías de los países más altamente industrializados, y se puede esperar que crezca rápidamente la demanda en los países en vias de desarrollo. Actualmente, el anti-cuerpo humano para la inmunización pasiva se obtiene de suero depositado en donantes humanos. Esto significa que hay una limitación inherente en la cantidad de anti-cuerpo humano disponible para suero terapéutico y profiláctico. Actualmente, la demanda excede al suministro y ha sido rutina la carencia severa en disponibilidad. Como un esfuerzo para superar algunos de los problemas asociados con el suministro inadecuado de inmunoglobulina humana, se han desarrollado varias tecnologías. Por ejemplo, la producción de inmunoglobulina humana por métodos recombinantes en cultivo de tejido es rutina. Particularmente, la expresión recombinante de la inmunoglobulina humana en los sistemas de expresión CHO es muy conocida, y actualmente se utiliza para la producción de varias inmunoglobulinas humanas (Igs) y ahora están en uso terapéutico los anti-cuerpos quiméricos. Se han desarrollado ratones que retienen un gen de inmunoglobulina humana no arreglado para la producción de anticuerpos humanos (por ejemplo, anti-cuerpos monoclonales) (véase, por ejemplo WO 98/24893; WO 96/33735; WO 97/13852; WO 97/07671 (EP 0843961); patente US 5,877,397; patente US 5,874,299; patente US 5,814,318; patente US 5,789,650; patente US 5,770,429; patente US 5,661,016; patente US 5,633,425; patente US 5,625,126; patente US 5,569,825; y patente US 5,545,806) . Adicionalmente, WO 00/10383 (EP 1106061) describe la modificación de un fragmento de cromosoma humano y la transferencia del fragmento a ciertas células via la fusión micro-célula . Además, WO 01/35735 describe un nockout de cadena pesada de inmunoglobulina IgM de bovino. La patente US 5,849,992, emitida el 15 de diciembre de 1998 a Meade y colaboradores, asi como la patente US 5,827,690, emitida el 27 de octubre de 1998 a Meade y colaboradores, describen la producción de anti-cuerpos monoclonales en la leche de animales transgénicos incluyendo ratones, ovejas, cerdos, vacas y cabras en donde los animales transgénicos expresaron genes de inmunoglobulina humana bajo el control de promotores que proporcionan la expresión de anti-cuerpos en las células epiteliales mamarias. Esencialmente, esto da como resultado la expresión de anti-cuerpos en la leche de estos animales, por ej emplo una vaca. Sin embargo, independientemente de lo que se reportó previamente, los métodos mejorados y los animales transgénicos mejorados, especialmente vacas, que producen anti-cuerpos (particularmente, anti-cuerpos policlonales) de especies deseadas, particularmente inmunoglobulinas humanas, en la corriente sanguínea y los cuales producirán un arreglo de diferentes anti-cuerpos que son específicos para un antigeno deseado seria muy deseable. Más especialmente, la producción de inmunoglobulinas humanas en ungulados, tales como las vacas, seria particularmente benéfico dado que (1) las vacas podrían producir grandes cantidades de anti-cuerpos, (2) las vacas podrían ser inmunizadas con patógenos humanos o de otro tipo y (3) las vacas podrían ser usadas para hacer anti-cuerpos humanos contra antigenos humanos. La disponibilidad de grandes cantidades de anti-cuerpos policlonales seria de importancia para el tratamiento y profilaxis de enfermedad infecciosa, modulación del sistema inmune, remoción de células humanas, tales como células de cáncer, y modulación de moléculas humanas especificas. Aunque la inmunoglobulina humana ha sido expresada en ratones, es impredecible si la inmunoglobulina humana se re-acomodará fraccionalmente y se expresará en bovinos, o en otros ungulados, debido a las diferencias en la estructura de los genes de anticuerpos, el mecanismo de producción de anti-cuerpos, y la función de las células B. En particular, a diferencia de los ratones, el ganado y las ovejas difieren de los humanos en su inmunofisiologia (Lucier y colaboradores, J. Immunol . 161:5438, 1998; Parng y colaboradores, J. Immunol. 157:5478, 1996; y Butler, Rev. Sci. Tech. 17:43, 2000). Por ejemplo, la diversificación de genes de anti-cuerpos en bovinos y ovinos depende mucho más de la conversión de los genes que del rearreglo de genes como en los humanos y en los ratones. También, la localización primaria de células B en humanos y ratones está en la médula ósea, mientras que en los bovinos y ovinos las células B se localizan en el parche de Peyer íleal. En consecuencia, habría sido difícil, si no imposible, antes de la presente invención predecir si el re-arreglo y la diversificación de mmunoglobulma de lugares de una inmunoglobulina humana tendría lugar dentro del linaje de células B bovinas (o de otro ungulado) . Además, también habría sido impredecible si un bovino sería capaz de sobrevivir, es decir, provocar sus funciones inmunes normales, en ausencia de su inmunoglobulma endógena o con interferencia de anti-cuerpos humanos. Por ejemplo, no hay certeza de si las células B bovinas que expresan inmunoglobulma humana correctamente migrarian al parche de Peyer ideal en bovinos porque esto no sucede en humanos. Tampoco está claro si la función receptora Fe humana, que media la activación del complemento, la inducción de la liberación de citosma y la remoción de antigeno, sería normal en el sistema bovino. Breve Descripción de la Invención Es un objeto de la invención producir un ungulado transgénico (por ejemplo, un bovino transgénico) que re-arregle y exprese un lugar de gen de inmunoglobulina humana, o de otras especies. Preferiblemente, esto se lleva introduciendo establemente un fragmento de cromosoma humano que contiene genes de inmunoglobulina humana, con el fin de producir un ungulado transgénico (por ejemplo, bovino) que tenga células B que producen inmunoglobulina humana o de otras especies, además de o en lugar de inmunoglobulinas endógenas. Esto también se puede llevar a cabo integrando un ácido nucleico que codifique una cadena de inmunoglobulina xenógena o un anti-cuerpo xenógeno en un cromosoma de un ungulado. Es otro objeto de la presente invención producir ungulados transgénicos (por ejemplo, bovinos transgénicos) en donde la expresión de la inmunoglobulina endógena se ha reducido o se ha recortado. Por ejemplo, una mutación sin sentido o una supresión se puede introducir en el ácido nucleico que codifica una cadena o anti-cuerpo de inmunoglobulina endógena. Es un objetivo más especifico de la invención producir un ungulado transgénico (por ejemplo, un bovino transgénico) en donde el exón de la región constante de los lugares de cadena ligera y/o los exones de regiones constantes mu han sido recortados, y un cromosoma artificial que contiene un lugar de gen que codifica la inmunoglobulina de otras especies, preferiblemente humana, se ha incorporado establemente.

Es un objetivo más especifico de la invención producir un ungulado clonado (por ejemplo, un bovino clonado) mediante el uso de transferencia nuclear y procedimientos de recombinación homologa donde el exón de región constante endógeno de los lugares de cadena ligera y/o los exones de región constante mu del lugar de cadena pesada han sido recortados, y un cromosoma artificial que comprende un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera xenógenos, preferiblemente un cromosoma artificial humano que contiene lugares de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana, se ha introducido establemente, dando como resultado un ungulado transgénico que produce inmunoglobulina de otras especies, preferiblemente humanas, y que no produce su inmunoglobulina endógena. Es otro objetivo de la invención producir una célula de tallo embriónico (ES) o célula somática ungulada (por ejemplo, un bovino) , preferiblemente una célula B o un fibroblasto, y más preferiblemente una célula somática masculina, en donde uno o ambos alelos del gen de cadena pesada de IgM endógeno ha sido mutado, por ejemplo, interrumpido por la recombinación homologa. Es un aspecto relacionado de la invención producir un feto ungulado clonado (por ejemplo, bovino) y descendientes en donde uno o ambos alelos del lugar del gen de cadena pesada IgM ha sido mutado, por ejemplo, interrumpido por la recombinación homologa. Es todavía otro objetivo de la invención producir una célula de tallo embriónico o célula somática ungulada (por ejemplo, un bovino), preferiblemente un fibroblasto o célula B, por ejemplo, una célula somática femenina o masculina en donde el alelo del gen de cadena pesada IgM ha sido mutada, por ejemplo, interrumpido por la recombinación homologa. Es un objetivo relacionado de la invención producir un feto o descendientes clonados (ungulado, por ejemplo, bovino) en donde un alelo del gen IgM de cadena pesada endógeno ha sido mutado, por ejemplo, interrumpido por la recombinación homologa. Es todavía otro objetivo de la invención producir fetos y becerros ungulados knockout homocigotos de cadena pesada y ligera, apareando ungulados machos y hembras (por ejemplo, bovinos) que respectivamente contienen una mutación, por ejemplo, una interrupción de un alelo de inmunoglobulina IgM endógena o una interrupción de un alelo de una cadena ligera de inmunoglobulina o mediante la recombinación homologa secuencial. Es todavía otro objetivo de la invención producir un feto knockout ho ocigótico (Homo H/L) en donde ambos alelos de cadena pesada del gen de IgM han sido interrumpidos y ambos alelos de la cadena ligera de inmunoglobulina han sido interrumpidos mediante la recombinación homologa secuencial o apareando los knockouts homocigotos de cadena pesada y ligera masculino y femenino antes mencionados (M y F Hemi H/L) . Es otro objetivo específico de la invención insertar un ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma artificial) que contiene genes necesarios para la expresión funcional de inmunoglobulinas no unguladas o sus cadenas pesadas o ligeras. Preferiblemente, estas inmunoglobulinas son inmunoglobulinas humanas producidas mediante la introducción de ácido nucleico que codifica estas inmunoglobulinas o cadenas de inmunoglobulina en una célula somática Homo o Hemi H/L ungulada, preferiblemente un fibroblasto, y que produce ungulados clonados (por ejemplo, bovinos clonados) en donde el ácido nucleico (por ejemplo, el ADN de cromosoma artificial humano) se transmite en la linea germen. Es todavía otro objetivo de la invención introducir un cromosoma artificial, preferiblemente un cromosoma artificial humano (HAC) , que contiene genes que proporcionan expresión de inmunoglobulina en las células knockout homocigotas antes mencionadas (Homo H/L) y generan ungulados (por ejemplo, ganado) mediante la transferencia nuclear que expresa inmunoglobulinas no unguladas, preferiblemente inmunoglobulinas humanas, como respuesta a la inmunización y que sufren maduración por afinidad. Como se usa en la presente, mediante "cromosoma artificial" entendemos un cromosoma de mamífero o fragmento del mismo que tiene una modificación artificial tal como acción de un marcador seleccionable, la adición de un sitio de clonación, la supresión de uno o más nucleótidos, la sustitución de uno o más nucleótidos, y similares. Por "cromosoma artificial humano (HAC) " entendemos un cromosoma artificial generado de uno o más cromosomas humanos. Un cromosoma artificial se puede mantener en la célula anfitriona independientemente de los cromosomas endógenos de la célula anfitriona. En este caso, el cromosoma artificial humano puede establemente replicarse y segregar a los lados cromosomas endógenos. Alternativamente, se puede translocar en, o insertar en, un cromosoma endógeno de una célula anfitriona. Dos o más cromosomas artificiales se pueden introducir a la célula anfitriona simultáneamente o secuencialmente. Por ejemplo, se pueden introducir los cromosomas artificiales derivados del cromosoma humano #14 (que comprende el gen de cadena pesada de inmunoglobulina) , el cromosoma humano #2 (que comprende el gen de cadena kapa de inmunoglobulina) , y el cromosoma humanos #22 (que comprende el gen de cadena lambda de inmunoglobulina) . Alternativamente, se pueden introducir un cromosoma o unos cromosomas artificiales que comprenden tanto un gen de cadena pesada de inmunoglobulina como un gen de cadena ligera de inmunoglobulina tal como ?HAC o ??HAC . Preferiblemente, los lugares de cadena pesada y los lugares de cadena ligera están en diferentes brazos del cromosoma (es decir, a diferentes lados del centrómetro) . En todavía otras modalidades preferidas, el tamaño total del cromosoma artificial humano es menor o igual a aproximadamente 10, 9, 8, o 7 megabases . Es todavía otro objetivo de la invención proporcionar una fuente de inmunoglobulina humana o de otra para la inmunización pasiva derivada de un ungulado transgénico (por ejemplo, un bovino transgénico) que contenga y exprese genes de inmunoglobulina llevados e introducidos en ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma artificial, y preferiblemente un cromosoma artificial humano (HAC) ) que contiene genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. En la presente invención, estos ácidos nucleicos (por ejemplo, cromosomas artificiales humanos) incluyen fragmentos naturalmente arreglados de cromosomas humanos (fragmentos cromosomales humanos) o cromosomas artificiales que comprenden fragmentos de cromosomas humanos técnicamente diseñados artificialmente, es decir, pueden ser re-acomodados en relación con el genoma humano. Es todavía otro objetivo de la invención producir hibridomas y anti-cuerpos monoclonales usando células B derivadas de los ungulados transgénicos descritos anteriormente (por ejemplo, bovinos transgénicos) . Es todavía otro objetivo de la invención producir antisuero o leche de ungulado que incluya inmunoglobulina humana policlonal. Esta inmunoglobulina humana, preferiblemente IgG humana, se puede usar como inmunoglobulina intravenosa (IVIG) para el tratamiento o prevención de enfermedades en humanos. La inmunoglobulina humana policlonal preferiblemente reacciona contra un antigeno de interés. Es todavía otro objetivo de la invención producir un ungulado transgénico con una o más mutaciones en un gen o genes endógenos. El ungulado transgénico se produce insertando una célula, una masa de cromatina de una célula, o un núcleo de una célula en un oocito. La célula tiene una primera mutación en un gen endógeno que no es expresado en forma natural por la célula. El oocito o un embrión formado a partir del oocito se transfieren al útero de un ungulado anfitrión bajo condiciones que permiten que el oocito o el embrión se desarrollen como un feto. Preferiblemente, el feto se desarrolla como un descendiente viable. En otras modalidades preferidas, la primera mutación se introduce en la célula insertando un ácido nucleico que comprende un cassette que incluye un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y operablemente enlazado a uno o más ácidos nucleicos que tienen identidad de secuencia sustancial al gen endógeno que se va a mutar, mediante lo cual el cassette se integra a un alelo endógeno del gen. En otras modalidades preferidas, la mutación se introduce en la célula insertando en la célula un ácido nucleico que comprende un primer cassette que incluye un primer promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un primer marcador seleccionable y operablemente enlazado a un primer ácido nucleico que tiene identidad de secuencia sustancial con el gen endógeno que se va a mutar, mediante lo cual el primer cassette se integra en un primer alelo endógeno del gen produciendo una primera célula transgénica. En la primera célula transgénica se inserta un ácido nucleico que comprende un segundo cassette que incluye un segundo promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un segundo marcador seleccionable y operablemente enlazado a un segundo ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia sustancial con el gen. El segundo marcador seleccionable difiere del primer marcador seleccionable, y el segundo cassette se integra al segundo alelo endógeno de gen produciendo una segunda célula transgénica. En todavía otras modalidades preferidas, se aisla una célula del embrión, el feto, o un descendiente producido del feto, y otra mutación se introduce en un gen de la célula. Una segunda ronda de transferencia nuclear se realiza entonces usando la célula resultante, una masa de cromatina de la célula, o un núcleo de la célula para producir un ungulado transgénico con dos o más mutaciones. Las mutaciones están en los mismos o diferentes alelos de un gen o están en diferentes genes. En las modalidades preferidas, la célula que es mutada es un fibroblasto (por ejemplo, un fibroblasto fetal) . Preferiblemente, el gen endógeno que se muta está operablemente enlazado a un promotor endógeno que no está activo en un fibroblasto. En otras modalidades preferidas, el promotor endógeno operablemente enlazado al gen endógeno que es mutado es menos que 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10?. de activo que un promotor endógeno operablemente enlazado a un gen doméstico endógeno tal como GAPDH. La actividad promotora se puede medir usando cualquier ensayo estándar tal como los ensayos que miden el nivel de ARNm o proteina codificada por el gen (véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13.1, John Wiley & Sons, 1995). Este método para generar un ungulado transgénico tiene la ventaja de permitir que un gen que no es expresado en la célula donante (es decir, la célula que es la fuente del material genético usado para la transferencia nuclear) sea mutado. De conformidad con lo anterior, la invención como se reclama presenta un ungulado transgénico que tiene uno o más ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen de inmunoglobulina (Ig) xenógeno que sufre re-acomodo y expresa más de una molécula de inmunoglobulina xenógena. En una modalidad preferida, el ácido nucleico que codifica todo o parte de un gen de inmunoglobulina xenógena es sustancialmente humano. Preferiblemente, el ácido nucleico codifica un anti-cuerpo xenógeno, tal como un anti-cuerpo humano o un anti-cuerpo policlonal. En varias modalidades la cadena o anti-cuerpo de inmunoglobulina se expresa en suero y/o leche. En otras modalidades, el ácido nucleico está contenido dentro de un fragmento de cromosoma, tal como un ?HAC o un ??HAC . En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se mantiene en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se integra en un cromosoma del ungulado. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico incluye segmentos de ácido nucleico de cadena ligera de anti-cuerpo no acomodado en los cuales todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen V están separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen J por uno o más nucleótidos. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico incluye segmentos de ácido nucleico de cadena pesada de anti-cuerpo no arreglado en los cuales ya sea (i) todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen V están separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen D por uno o más nucleótidos y/o (ii) todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen D están separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen J por uno más nucleótidos. En todavía otra modalidad preferida, el ungulado tiene una mutación en uno o ambos alelos de un gen de inmunoglobulina endógeno, el gen alfa- ( 1, 3) -galactosiltransferasa, el gen prión, y/o el gen de cadena J. En otras modalidades preferidas, el ungulado tiene un ácido nucleico que codifica una cadena J exógena, tal como una cadena J humana. Preferiblemente el ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino. En otro aspecto, la invención presenta un ungulado transgénico que tiene una mutación que reduce la expresión de un anti-cuerpo endógeno. Preferiblemente, la mutación reduce la expresión de cadena pesada de IgM funcional o sustancialmente elimina la expresión de la cadena pesada IgM funcional. En otras modalidades preferidas, la mutación reduce la expresión de la cadena ligera de inmunoglobulina funcional o sustancialmente elimina la expresión de la cadena ligera de inmunoglobulina funcional. En todavía otras modalidades preferidas, la mutación reduce la expresión de la cadena pesada de IgM funcional y la cadena ligera de inmunoglobulina funcional, o la mutación sustancialmente elimina la expresión de la cadena pesada de IgM funcional y la cadena ligera de inmunoglobulina funcional. Preferiblemente, el ungulado también tiene una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica la alfa- (1, 3) -galactosiltransferasa, la proteína prión, y/o la cadena J. En otras modalidades preferidas, el ungulado tiene un ácido nucleico que codifica una cadena J exógena, tal como una cadena J humana. En otra modalidad preferida, el ungulado tiene uno o más ácidos nucleicos y codifican todo o parte de un gen de inmunoglobulina xenógeno, que sufre re-arreglo y expresa más de una molécula de inmunoglobulina xenógena. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica todo o parte de un gen de inmunoglobulina xenógena es sustancialmente humano. En otras modalidades preferidas, el ácido nucleico codifica un anti-cuerpo xenógeno, tal como un anti-cuerpo de otro gen (por ejemplo, un anti-cuerpo humano) o un anti-cuerpo policlonal. En varias modalidades, la cadena de inmunoglobulina o el anti-cuerpo se expresa en el suero. En otras modalidades, el ácido nucleico está contenido dentro de un fragmento de cromosoma, tal como un ?HAC o un ??HAC. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se mantiene en una célula ungulada independientemente del cromosoma anfitrión. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se integra en un cromosoma del ungulado. Preferiblemente, el ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino . La invención también proporciona células obtenidas de cualquiera de los ungulados de la invención o células que son útiles en la producción de cualquiera de los ungulados de la invención . De conformidad con lo anterior, en otro aspecto, la invención presenta una célula somática ungulada que tienen uno o más ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen de inmunoglobulina xenógena que es capaz de sufrir re-arreglo y expresar una o más moléculas de inmunoglobulina xenógena en las células B. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica todo o parte del gen de inmunoglobulina xenógena codifica un anticuerpo xenógeno. En varias modalidades, el ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma, tal como un ?HAC o un ??HAC . En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se mantiene en la célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se integra en un cromosoma de la célula. En otra modalidad, el ácido nucleico es sustancialmente humano. Preferiblemente, el anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género, tal como un anti-cuerpo humano. Preferiblemente, la célula tiene una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno gue codifica la alfa- (1,3)-galactositransferasa, la proteína prión, y/o la cadena J. En otras modalidades preferidas, la célula tiene un ácido nucleico que codifica una cadena J exógena, tal como una cadena J humana, Las células de ungulados de ejemplo incluyen fibroblastos fetales y células B. Preferiblemente, el ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino. En otro aspecto, la invención presenta una célula somática de ungulado que tiene una mutación en un ácido nucleico que codifica una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina. En las modalidades preferidas, la célula tiene una mutación en uno o ambos alelos de la cadena pesada de IgM o la cadena ligera de inmunoglobulina. Las mutaciones de ejemplo incluyen mutaciones sin sentido y de supresión. Preferiblemente, la célula tiene una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica la alfa- (1, 3) -galactosiltransferasa, la proteína prión y/o la cadena J. En otras modalidades preferidas, la célula tiene un ácido nucleico gue codifica una cadena J exógena, tal como una cadena J humana. En modalidades preferidas, la célula también tiene uno o más ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen de inmunoglobulma xenógena que es capaz de sufrir re-arreglo y expresar una o más moléculas de inmunoglobulina xenógenas en células B. Preferiblemente, los ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen de inmunoglobulina xenógena es sustancialmente humano y/o codifica un anti-cuerpo xenógeno, tal como un anti-cuerpo de otros orígenes (por ejemplo, un anti-cuerpo humano). En varias modalidades, el ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma, mediante lo cual el ácido nucleico se mantiene en la célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión. Los fragmentos de cromosomas preferidos incluyen ?HAC y ??HAC . En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se mantiene en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se integra en un cromosoma de la célula. Las células de ungulado de ejemplo incluyen fibroblastos fetales y células B. Preferiblemente, el ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino . En otro aspecto, la invención presenta un hibridoma formado a partir de la fusión de una célula B de ungulado de la invención con una célula de mieloma. Preferiblemente, el hibridoma secreta un anti-cuerpo exógeno, tal como un anti-cuerpo humano . La invención también proporciona métodos para producir anti-cuerpos usando un ungulado de la invención. Uno de estos métodos incluye administrar uno o más antigenos de interés a un ungulado que tiene uno o más ácidos nucleicos que codifican un lugar de gen de anti-cuerpo xenógeno. Los segmentos de ácido nucleico en el lugar del gen sufren de arreglo resultante en la producción de anti-cuerpos específicos para el antigeno, y los anti-cuerpos son recuperados a partir del ungulado. En varias modalidades el ácido nucleico que codifica el lugar del gen de anti-cuerpo xenógeno está contenido en un fragmento de cromosoma, tal como un ?HAC o un ??HAC . Preferiblemente, el fragmento de cromosoma se mantiene en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión. En otras modalidades, el ácido nucleico se integra en un cromosoma del ungulado. Preferiblemente, el ácido nucleico es sustancialmente humano. En otras modalidades preferidas, la cadena ligera de los anti-cuerpos y/o la cadena pesada de los anti-cuerpos es codificada por un ácido nucleico humano. Los anti-cuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anti-cuerpos monoclonales y policlonales contra un antigeno particular tienen una variedad de usos; por ejemplo, pueden ser usados como ingredientes en composiciones profilácticas o terapéuticas para la infección de microorganismos patógenos tales como bacterias y virus. En varias modalidades, los anti-cuerpos son recuperados del suero o leche del ungulado. En modalidades preferidas, el ungulado tiene una mutación que reduce la expresión de un anti-cuerpo endógeno, que reduce la expresión de la cadena pesada de IgM funcional, o que reduce la expresión de la cadena ligera de inmunoglobulina funcional. Preferiblemente, el ungulado tiene una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica la alfa- (1, 3) -galactosiltransferasa, la proteína prión, y/o la cadena J. En otras modalidades preferidas, El ungulado tiene un ácido nucleico que codifica una cadena J exógena, tal como una cadena J humana. Preferiblemente, el ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino. En un aspecto relacionado, la invención presenta un método de producir anti-cuerpos . Este método incluye recuperar anti-cuerpos xenógenos de un ungulado que tiene un ácido nucleico que codifica un lugar de gen de anti-cuerpo xenógeno. Los segmentos de ácido nucleico en el lugar del gen sufren de un rearreglo gue da como resultado la producción de anti-cuerpos xenógenos. En varias modalidades, el ácido nucleico que codifica un lugar de gen de anti-cuerpo xenógeno está contenido en un fragmento de cromosoma, tal como un ?HAC o ??HAC . En modalidades particulares, el ácido nucleico se mantiene en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se integra en un cromosoma del ungulado. Preferiblemente, el ácido nucleico es sustancialmente humano. En modalidades particulares, la cadena ligera de los anti-cuerpos y/o la cadena pesada de los anticuerpos son codificadas por un ácido nucleico humano. Los anti-cuerpos pueden ser monoclonales o policlonales . En modalidades particulares, los anti-cuerpos policlonales, tales como anticuerpos IgG generados sin inmunización del ungulado con un antigeno especifico, se usan como sustituto terapéutico para inmunoglobulina intravenosa (IVIG) producida a partir de suero humano. En varias modalidades, los anti-cuerpos se recuperan a partir de suero o leche del ungulado. Preferiblemente, el ungulado tiene una mutación que reduce la expresión de un anticuerpo endógeno, reduce la expresión de cadena pesada de IgM funcional, o reduce la expresión de cadena ligera de inmunoglobulina funcional. Preferiblemente, el ungulado tiene una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico que codifica la alfa- ( 1, 3) -galactosiltransferasa, la proteína prión, y/o la cadena J. En otras modalidades preferidas, el ungulado tiene un ácido nucleico que codifica una cadena J exógena, tal como una cadena J humana. Preferiblemente, el ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino. La invención también proporciona métodos para producir ungulados transgénicos . Estos métodos se pueden usar para producir ungulados transgénicos que tienen una mutación deseada o tienen un ácido nucleico xenógeno deseado. En un aspecto de estos, la invención presenta un método para producir un ungulado transgénico que incluye insertar una célula, una masa de cromosoma de una célula, o un núcleo de una célula en un oocito. La célula incluye una primera mutación en un ácido nucleico de cadena ligera y/o de cadena pesada de anticuerpo endógeno. El oocito o un embrión formado a partir del oocito se transfiere al útero de un ungulado anfitrión en condiciones que permiten que el oocito o el embrión se desarrollen como un feto. Preferiblemente, el feto se desarrolla como un descendiente viable. Preferiblemente, la célula usada en la producción del ungulado transgénico tiene una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica la alfa- (1, 3) -galactosiltransferasa, la proteína prión, y/o la cadena J. En otras modalidades preferidas, la célula tiene un ácido nucleico que codifica una cadena J exógena, tal como una cadena J humana. En otras modalidades, la célula incluye uno o más ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen de inmunoglobulina xenógena que es capaz de sufrir re-arreglo y expresar una o más molécula de inmunoglobulina xenógenas en células B. Preferiblemente, El ácido nucleico que codifica todo o parte de un gen de inmunoglobulina xenógena codifica un anticuerpo xenógeno. En todavía otras modalidades, el ácido nucleico se integra en un cromosoma de la célula. Preferiblemente, el anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género, tal como un anti-cuerpo humano. En modalidades particulares, el ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma, tal como un ?HAC o un ??HAC. En otras modalidades particulares, el fragmento de cromosoma se mantiene en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión. Preferiblemente, el ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino. En varias modalidades del aspecto anterior, el método también incluye aislar una célula del embrión, el feto, o un descendiente producido a partir del feto e introducir una segunda mutación en un ácido nucleico de cadena pesada y/o cadena ligera de anti-cuerpo endógeno en la célula. La célula, una masa de cromatina de la célula, o un núcleo de la célula se inserta en un oocito, y el oocito o un embrión formado a partir del oocito se transfiere al útero de un ungulado anfitrión en condiciones que permitan que el oocito o el embrión se desarrollen como un feto. En otras modalidades del aspecto anterior, la célula usada para la generación del ungulado transgénico se prepara mediante un método que incluye insertar en la célula un ácido nucleico que tiene un cassette que incluye un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y operablemente enlazado con uno o más ácidos nucleicos que tiene identidad de secuencia sustancial con el ácido nucleico de cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo. El cassette se integra en un alelo endógeno del ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera del anti-cuerpo. En otras modalidades, la célula es producida insertando en la célula un ácido nucleico que tiene un primer cassette que incluye un primer promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un primer marcador seleccionable y operablemente enlazado a un primer ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia sustancial con el ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera del anti-cuerpo. El primer cassette se integra en un primer alelo endógeno del ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera del anti-cuerpo que produce una primera célula transgénica. En la primera célula transgénica se inserta un ácido nucleico que tiene un segundo cassette que incluye un segundo promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un segundo marcador seleccionable y operablemente enlazado a un segundo ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia sustancial al ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera del anti-cuerpo. El segundo marcador seleccionable difiere del primer marcador seleccionable . El segundo cassette se integra en un segundo alelo endógeno de ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera del anti-cuerpo produciendo una segunda célula transgénica. En todavía otro aspecto, la invención presenta otro método para producir un ungulado transgénico. Este método incluye insertar una célula que tiene uno o más ácidos nucleicos xenógenos en un oocito. El ácido nucleico xenógeno codifica todo o parte de un gen de inmunoglobulina endógena, y el gen es capaz de sufrir re-arreglo y expresar más de una molécula de inmunoglobulina xenógena en células B. El oocito o un embrión formado a partir del oocito se transfieren al útero de un ungulado anfitrión en condiciones que permiten que el oocito o el embrión ee desarrollen como un feto. Preferiblemente, el feto se desarrolla como un descendiente viable. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica todo o parte de un gen de inmunoglobulina xenógena codifica un anti-cuerpo xenógeno. En otras modalidades preferidas, el anti-cuerpo es un anti-cuerpo policlonal. En todavía otras modalidades preferidas, la cadena de inmunoglobulina o anti-cuerpo se expresa en suero y/o leche. En varias modalidades el ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma, tal como un ?HAC o un ??HAC . El ácido nucleico se puede mantener en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión o integrarse en un cromosoma de la célula. Preferiblemente, el ácido nucleico es sustancialmente humano. En otras modalidades, el anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género, tal como un anticuerpo humano. Preferiblemente, el ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino. En todavía otro aspecto relacionado, la invención presenta un método para producir un ungulado transgénico. Este método incluye insertar una célula, una masa de cromatina de una célula, o un núcleo de una célula en un oocito. La célula incluye una primera mutación en un gen endógeno que no es expresado naturalmente por la célula. El oocito o un embrión formado a partir del oocito se transfieren al útero de un ungulado anfitrión en condiciones que permiten que el oocito o el embrión se desarrollen como un feto. Preferiblemente, el feto se desarrolla como un descendiente viable. Preferiblemente, el gen que se muta codifica un anti-cuerpo, alfa- (1,3)-galactosiltransferasa, proteína prión, o cadena J. En otra modalidad preferida, la célula usada en la producción del ungulado transgénico es un fibroblasto, tal como un fibroblasto fetal.

En varias modalidades del método anterior la célula se prepara insertando en la célula un ácido nucleico que tiene un cassette que incluye un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y operablemente enlazado a uno o más ácidos nucleicos que tienen sustancial identidad de secuencia con el gen; mediante lo cual el cassette se integra en un alelo endógeno del gen. En otras modalidades, las células se producen insertando en la célula un ácido nucleico que tiene un primer cassette que incluye un primer promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un primer marcador seleccionable y operablemente enlazado a un primer ácido nucleico que tiene una sustancial identidad de secuencia sustancial con el gen. El primer cassette se integra en un primer alelo endógeno del gen produciendo una primera célula transgénica. En la primera célula transgénica se inserta un ácido nucleico que tiene un segundo cassette que incluye un segundo promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un segundo marcador seleccionable y operablemente enlazado a un segundo ácido nucleico que tiene una sustancial identidad de secuencia con el gen. El segundo marcador seleccionable difiere del primer marcador seleccionable . El segundo cassette se integra en un segundo alelo endógeno del gen que produce una segunda célula transgénica. En otras modalidades del aspecto anterior, el método también incluye introducir una segunda mutación en el ungulado transgénico. En estas modalidades, una célula es aislada del embrión, feto, o un descendiente producido a partir del feto, y se introduce una segunda mutación en el gen endógeno en la célula. La célula, una masa de cromatina de la célula, o un núcleo de la célula se inserta en un oocito, y el oocito o un embrión formado a partir del oocito se transfiere al útero de un ungulado anfitrión en condiciones que permiten que el oocito o el embrión se desarrollen como un feto. Los ungulados de la invención se pueden usar para producir anti-suero o leche que contenga un anti-cuerpo de interés. En un aspecto de estos, la invención presenta antisuero de ungulado que tiene inmunoglobulinas humanas policlonales . Preferiblemente, el anti-suero es de un bovino, ovino, porcino o caprino. En otra modalidad preferida, las inmunoglobulinas se dirigen contra un antigeno deseado. En todavía otro aspecto, la invención presenta leche de ungulado que tiene inmunoglobulinas humanas policlonales. Preferiblemente, la leche es de un bovino, ovino, porcino o caprino. En otra modalidad preferida, las inmunoglobulinas se dirigen contra un antígeno deseado. En las modalidades preferidas de varios aspectos de la invención, la cadena pesada es una cadena pesada mu y la cadena ligera es una cadena ligera lambda o kapa . En otras modalidades preferidas, el ácido nucleico que codifica la cadena o anti-cuerpo de inmunoglobulina xenógena está en su forma no arreglada.

Preferiblemente, la administración de un antigeno de interés a un ungulado transgénico es seguida por el re-arreglo de los segmentos de ácido nucleico en el lugar del gen de inmunoglobulina xenógena y la producción de anti-cuerpos reactivos con el antígeno de interés. En otras modalidades preferidas, más de una clase de anti-cuerpo xenógeno es producido por el ungulado. En varias modalidades, más de una inmunoglobulina o anti-cuerpo xenógeno diferente es producido por el ungulado. Los métodos preferidos de transferencia nuclear incluyen insertar una célula de la invención, una masa de cromatina de la célula, o un núcleo de la célula en un oocito enucleado o nucleado, y transferir el oocito o un embrión formado a partir del oocito al útero de un ungulado anfitrión en condiciones que permiten que el oocito o el embrión se desarrollen como un feto. En otras modalidades preferidas de varios aspectos de la invención, el ungulado tiene una mutación en uno o ambos alelos del ácido nucleico endógeno de alfa- (1,3)-galactosiltransferasa, proteina prión, y/o cadena J. Preferiblemente, la mutación reduce o elimina la expresión de la enzima endógena alfa- ( 1, 3) -galactosiltransferasa, el epítope galactosill (al, 3) galactosa, la proteína prión, y/o la cadena J. En todavía otras modalidades preferidas, el ungulado contiene un ácido nucleico de cadena J xenógeno, tal como un ácido nucleico de cadena J humano. Preferiblemente, el ungulado produce moléculas de IgA o IgM humana que contienen cadena J humana. En varias modalidades de la invención, el ácido nucleico usado para mutar un ácido nucleico ungulado endógeno (es decir, un cassette knockout que incluye un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y operablemente enlazado a un ácido nucleico que tiene una sustancial identidad de secuencia con el gen que se va a mutar) no está contenido en un vector viral, tal como un vector adenoviral, o un vector viral adeno-asociado. Por ejemplo, el ácido nucleico puede estar contenido en un plásmido o un cromosoma artificial que se inserta en una célula de ungulado usando un método estándar tal como transfección o lipofección que no implica infección viral de la célula. En todavía otra modalidad, el ácido nucleico usado para mutar un ácido nucleico de ungulado endógeno (por ejemplo, un cassette knockout que incluye un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y operablemente enlazado a un ácido nucleico que tiene una sustancial identidad de secuencia con el gen que se va a mutar) está contenido en un vector viral, tal como un vector adeno viral o un vector viral adeno-asociado . De acuerdo con esta modalidad, un virus que contiene el vector viral se usa para infectar una célula de ungulado, dando como resultado la inserción de una porción del vector viral entero en la célula de ungulado. Ungulados de ejemplo incluyen miembros de las órdenes de Peri ssodactyla y Arti odactyla, tales como cualquier miembro del género Bos. Otros ungulados preferidos incluyen ovejas, carneros, cabras, búfalos, antílopes, bueyes, caballos, burros, muías, venados, alces, caribú, búfalo de agua, camellos, llama, alpaca, cerdos, y elefantes. Preferiblemente, el ungulado transgénico expresa una cadena o anti-cuerpo de inmunoglobulina a partir de otro género, tal como un anti-cuerpo de cualquier otro mamífero. Como se usa en la presente, por "un ácido nucleico en su forma pre-arreglada o no arreglada" se entiende un ácido nucleico que no ha sufrido recombinación V(D)J. En modalidades preferidas, todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen V de una cadena ligera de anti-cuerpo están separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen J por uno o más nucleótidos. Preferiblemente, todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen V de una cadena pesada de anti-cuerpo están separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen D por uno o más nucleótidos, y/o todos elementos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen D de una cadena pesada de anti-cuerpo están separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen J por uno o más nucleótidos. Preferiblemente, un ácido nucleico en su forma no arreglada es sustancialmente humano. En otras modalidades preferidas, el ácido nucleico es cuando menos el 70, 80, 90, 95, o 99'A idéntico a la región correspondiente del ácido nucleico que se presenta naturalmente de un humano. Breve Descripción de las Figuras La Figura ÍA contiene una vista general de los procedimientos usados para producir una vaca que contiene un cromosoma artificial humano y knockout de inmunoglobulina. La línea de tiempo de la Figura ÍA se basa en una estimación de 18 meses para preparar el vector knockout de inmunoglobulina y generar células knockout, dos meses para generar fetos a partir de las células knockout, nueve meses para realizar knockout posteriores, nueve meses de gestación para que nazcan los becerros, doce meses antes de que los embriones puedan ser producidos de los becerros, y seis meses para realizar las transferencias de cromosomas artificiales humanos. La Figura IB contiene una vista general de los métodos usados para producir una vaca que contiene una mutación en un gen de inmunoglobulina endógena y contiene ?HAC O ??HAC. Para la linea de tiempo en la Figura IB, se estima que 250 colonias son analizadas a la semana para un total de 3,000 colonias en 3 meses para aislar células knockout masculinas y femeninas. Se supone que una o más colonias knockout son producidas por 1,500 colonias. Los ungulados knockout homocigotos se pueden producir mediante (1) introducir una segunda mutación de inmunoglobulina en una célula knockout aislada antes de la transferencia nuclear, (2) introducir una segunda mutación de inmunoglobulina en una célula obtenida a partir de un embrión, feto (por ejemplo, feto aproximadamente a los 60 dias de gestación) , o descendientes producidos a partir de una primera ronda de transferencia nuclear y usando la célula homocigota resultante como la célula donante en una segunda ronda de transferencia nuclear o (3) aparear ungulados homocigotos. En las Figuras ÍA y IB, "Homo" denota homocigoto; "Hemi" denota hemicigoto; "H" denota cadena pesada; "L" denota cadena ligera; "HAC" denota cromosoma artificial humano; "HAC 1" denota alguno de los dos HAC; y "HAC2" denota un segundo HAC. La Figura 2A contiene una construcción de knockout mu (cadena pesada de IgM) de acuerdo con la invención. La Figura 2B es un mapa de restricción de lugares de inmunoglobulina de un ganado Holstein. Las Figuras 3A y 3B contienen ilustraciones esquemáticas de la construcción "pSTneoB" y "pLoxP-STneoB" que se usaron para producir la construcción de ADN knockout mu, la cual se ilustra en la Figura 3C. La Figura 3D es la secuencia de polinucleótidos de la región de 1.5 kb del lugar de cadena pesada mu bovina genómica que se usó como la primera región de homología en la construcción del knockout mu (SEQ ID NO: 47) . La Figura 3E es la secuencia de polinucleótidos de la región de 3.1 kb del lugar de cadena pesada mu bovina genómica que se usó como la segunda región de homología en la construcción del knockout mu (SEQ ID NO: 48) . En esta secuencia, cada "n" representa cualquier nucleótido o no nucleótido. La región de nucleótidos "n" consecutivos representa una región de aproximadamente 0.9 hasta 1.0 kb para la cual la secuencia de polinucleótidos no ha sido determinada. La Figura 3F es una ilustración esquemática de una construcción knockout de cadena pesada mu bovina, resistente a la puromicina. La Figura 3G es la secuencia de polinucleótidos de un ADNc de cadena ligera kapa bovina (SEQ ID NO: 60) . Todo o parte de esta secuencia se puede usar en la construcción knockout de cadena ligera kapa. Adicionalmente, esta cadena ligera kapa se puede usar para aislar una secuencia de cadena ligera kapa genómica para usarla en una construcción knockout de cadena ligera kapa. La Figura 4 es una ilustración esquemática de la construcción de ?HAC y ??HAC . La Figura 5 es una imagen de un gel de agarosa que muestra la presencia de ADN genómico que codifica cadenas ligera y pesada humanas en fetos ?HAC. La Figura 6 es una imagen de un gel de agarosa que muestra la expresión de los exones Cmu humano 3 y 4 en un feto ?HAC a los 77 dias de gestación (feto #5996) . La Figura 7 es una imagen de un gel de agarosa que muestra el re-arreglo de cadena pesada bovina endógena en el feto ?HAC #5996. La Figura 8 es una imagen de un gel de agarosa que muestra la expresión de cadena pesada humana re-arreglada en el fetO ?HAC #5996. La Figura 9 es una imagen de un gel de agarosa que muestra la expresión de la región constante dividida del lugar de cadena pesada humana en el feto ?HAC #5996. La Figura 10 es una imagen de un gel de agarosa que muestra la expresión de la cadena pesada humana re-arreglada en el feto ?HAC #5996. La Figura HA es la secuencia de polinucleótidos de una transcripción de cadena pesada humana re-acomodada del feto ?HAC #5996 (SEQ ID NO: 49) . La Figura 11B es una alineación de secuencia de una región de esta secuencia ("Interrogante") con un anti-cuerpo humano anti-neumococo ("Sbjct") (?EQ ID Nos: 50 y 51, respectivamente) . Para la secuencia interrogante del feto ?HAC #5996, sólo se muestran los nucleótidos que difieren de los nucleótido correspondientes de la secuencia de anti-cuerpo humano anti-neumococo . Las Figuras 12A y 12B son dos secuencias de polinucleótidos adicionales (SEQ ID NOS: 52 y 54) y sus secuencias de aminoácido deducidas (SEQ ID Nos: 53 y 55, respectivamente) de transcripciones de cadena pesada humana re-acomodada del feto ?HAC #5996. La Figura 13 es una imagen de un gel de agarosa que demuestra que el feto ??HAC #5580 contiene tanto lugares de inmunoglobulina de cadena pesada como ligera humanas. La Figura 14 es una imagen de un gel de agarosa gue demuestra que los fetos ??HAC #5442A, y 5442B contienen tanto lugares de cadena pesada como ligera humanas. La Figura 15 es una imagen de un gel de agarosa que muestra la expresión de la región constante mu dividida del lugar de cadena pesada humana en el feto ??HAC #5542A. La Figura 16 es una imagen de un gel de agarosa que muestra el re-arreglo y la expresión del lugar de cadena pesada humana en el feto ??HAC #5868A. La Figura 17 es una imagen de un gel de agarosa que muestra el re-arreglo y la expresión del lugar lambda de inmunoglobulina humana en los fetos ??HAC #5442A y 5442B. La Figura 18 es una imagen de un gel de agarosa que muestra el re-arreglo y la expresión del lugar lambda de inmunoglobulina humana en el feto ??HAC #5442A. La Figura 19 es una imagen de un gel de agarosa gue muestra el re-arreglo y la expresión del lugar lambda de inmunoglobulina humana en el feto ??HAC #5868A. La Figura 20 es una secuencia de polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente de una transducción de cadena ligera humana re-arreglada a partir del feto ??HAC #5442A (SEQ ID Nos: 56 y 57, respectivamente). La Figura 21 es otra secuencia de polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente de una transcripción de cadena ligera humana re-arreglada del feto ??HAC #5442A (SEQ ID Nos: 58 y 59, respectivamente) .

Las Figuras 22A-22H son gráficas de un análisis FAC? de la expresión de proteínas de cadena ligera lambda humana y de cadena pesada bovina por los fetos ??HAC #5442A (Figuras 22A-22D) y 5442B (Figuras 22E-22H) . Linfocitos de los bazos de estos fetos se hicieron reaccionar con un anti-cuerpo lambda antihumano etiquetado con ficoeriterina (Figuras 22C y 22D) , un anticuerpo IgM anti-bovino etiquetado FITC (Figuras 22D a 22H) , o ningún anti-cuerpo (Figuras 22A, 22B, (22E, y 22F) y luego analizadas en un clasificador de células FASCalibur. El porcentaje de células que fueron etiquetadas con uno de los anticuerpos se muestra debajo de cada histograma. La Figura 23 es una ilustración esquemática del vector knockout a- ( 1, 3) -galactosiltransferasa usado para insertar un gen de resistencia a la puromicina y una secuencia de terminación de la transcripción en el gen endógeno a- ( 1, 3) -galactosiltransferasa en células bovinas. La Figura 24 es una ilustración esquemática de un fragmento BamHI.XhoI que contiene los exones 2, 3 y 4 que se usó como una estructura central para el vector objetivo VAAV. Se uso un marcador de resistencia a la neomicina para la mutagénesis por inserción del lugar mediante la inserción en el exón 4. Se indica la localización de los sitios de recocido para los cebadores de reacción de cadena de polimerasa que se usaron para la confirmación posterior de la selección adecuada. La Figura 25 es la ilustración esquemática de la construcción de una construcción viral adeno-asociada diseñada para remover la secuencia de IgH bovina endógena. La Figura 26 es una imagen de un gel de agarosa que muestra el análisis de reacción de cadena de polimerasa de clonas transducidas individualmente para eventos de selección adecuados . El vector usado en este experimento se muestra en la Figura 24. Los productos de la reacción de cadena de polimerasa indicadores de la selección adecuada están marcados con asteriscos. La Figura 27 es una tabla que enlista las tasas de embarazo para los embriones que llevan cromosoma artificial humano . Descripción Detallada de la Invención Como se discutió anteriormente, la presente invención se relaciona con la producción de un ungulado transgénico, preferiblemente una vaca transgénica, donde la expresión de mmunoglobulma endógena opcionalmente ha sido recortada y un ácido nucleico (preferiblemente, un cromosoma artificial) se ha introducido establemente que comprende genes que son necesarios para la producción de anti-cuerpos funcionales de otras especies, preferiblemente humanos. Mediante esto, se puede obtener un animal transgénico que no produzca sus anti-cuerpos endógenos, sino en vez de eso produzca anti-cuerpos de otras especies. Cualguier anti-cuerpo no endógeno puede ser producido incluyendo, sin limitación anti-cuerpos humanos, de primates no humanos, de perro, gato, ratón, rata, o cobayo. Aunque la producción de anti-cuerpos monoclonales humanos en cabras se ha reportado anteriormente, ésta no se ha efectuado en vacas, en suero o en ningún ungulado que no exprese sus anti-cuerpos endógenos. Además, la inserción de los genes de cadena pesada o ligera (no re-arreglados) de linea germinal, el re-arreglo de estos genes y la expresión de anti-cuerpo diversificado no se han realizado en un ungulado transgénico. Es impredecible si estos ungulados sobrevivirán debido a que es incierto si las inmunoglobulinas humanas se expresarán funcionalmente, o se expresarán en suficientes cantidades para proporcionar respuestas inmunes adecuadas. También, es incierto si los cromosomas humanos se mantendrán establemente en los ungulados transgénicos. Todavía más, es incierto si esas células B de ungulado (por ejemplo, bovino) serán capaces de expresar o re-arreglar adecuadamente inmunoglobulinas no endógenos humanas o de otro tipo. En una modalidad preferida del presente enfoque, la producción de inmunoglobulina xenógena se lleva a cabo esencialmente mediante el uso combinado de transferencia nuclear, técnicas de recombinación homologa, y la introducción de cromosomas artificiales que llevan los lugares de inmunoglobulina xenógena enteros. Más específicamente, el proceso preferiblemente incluye la interrupción dirigida de uno o ambos alelos del gen de cadena pesada de IgM, y opcionalmente uno o ambos alelos del gen de cadena ligera de inmunoglobulina, aunque la producción de anti-cuerpos xenógenos también se puede llevar a cabo en animales de tipo natural (es decir, animales sin recortes de inmunoglobulina) . Los knockouts de genes (recortes) se pueden efectuar mediante la recombinación homologa secuencial, luego otro procedimiento de apareamiento. En una modalidad preferida, esto se efectúa efectuando inicialmente la interrupción dirigida de un alelo del gen de cadena pesada de IgM de un fibroblasto fetal ungulado macho o hembra (por ejemplo, bovino) en cultivo de tejido usando un vector de recombinación homologa conveniente. El uso de fibroblastos fetales se prefiere sobre algunas otras células somáticas ya que estas células se propagan fácilmente y se manipulan genéticamente en cultivo de tejido. Sin embargo, el uso de fibroblastos fetales no es esencial para la invención, y desde luego otros líneas celulares se pueden sustituir por ellas con resultados equivalentes. Este proceso, desde luego, conlleva la construcción de una construcción de ADN gue tiene regiones de homología con el alelo de cadena pesada de IgM objetivo tal que la construcción después de la integración en un alelo de cadena pesada de IgM en el genoma ungulado interrumpe la instrucción del mismo. Un vector ejemplar para llevar a cabo esta interrupción dirigida de un alelo de IgM se describe en el ejemplo que sigue. Respecto a esto, los métodos de construir vectores que proporcionen la recombinación homologa en un sitio seleccionado (objetivo) son muy conocidos para los expertos en la técnica. Más aún, en el presente ejemplo, la construcción de un vector conveniente está dentro del nivel de experiencia en la técnica, dado especialmente que la secuencia de la cadena pesada de igM bovina y los genes de cadena ligera lambda de inmunoglobulina se conocen, ya que son secuencias de genes de inmunoglobulón de otros ungulados (véase más adelante) . Con el fin de facilitar la recombinación homologa, los vectores usados para efectuar la recombinación homologa y la inactivación del gen IgM respectivamente, comprenden porciones de ADN que exhiben sustancial identidad de secuencia con los genes de cadena pesada de IgM y la cadena ligera de inmunoglobulina de ungulado. Preferiblemente, esta secuencia se presenta cuando menos en 98?, de identidad de secuencia, más preferiblemente, cuando menos el 99'i de identidad de secuencia, y todavía más preferiblemente serán isogénicos con los lugares de genes objetivo para facilitar la recombinación homologa y la supresión o inactivación dirigida al objetivo. Típicamente, y preferiblemente la construcción comprenderá un gen marcador gue proporciona la selección de recombinantes homólogos deseados, por ejemplo, células de fibroblastos, en donde el gen de cadena pesada de IgM y/o el gen de cadena ligera de inmunoglobulina han sido efectivamente interrumpidos. Los genes marcadores de ejemplo incluyen marcadores de resistencia a los antibióticos, marcadores de resistencia a fármacos, y proteina fluorescente verde, entre otros. Una construcción preferida se muestra en la Figura 2A y los materiales iniciales usados para hacer esta construcción en las Figuras 3A y 3B. Otras construcciones que contienen dos regiones de homología para un gen de inmunoglobulina endógena, que flanquean un marcador de selección positivo (por ejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico) que está operablemente enlazado a un promotor, se pueden generar usando técnicas de biología molecular estándares y usar en los métodos de la presente invención. La construcción knockout mu mostrada en las Figuras 2A y 3C se diseñó para remover los exones que codifican la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina bovina, designada como "exones C-mu 1-4" y los dos exones que codifican el dominio transmembrana, designados "exones TM" . Para construir este vector, la región designada como "1", un fragmento Xbal-Xhol de la secuencia bovina de cadena pesada mu genómica, fue sub-clonada en un vector de ADN comercial, pBluescript (Stratagene, LaJolla, California, Estados Unidos), previamente cortado con las enzimas Xbal y Xhol. En cuanto este fragmento fue clonado, hubo una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción Notl adyacente al sitio Xbal, usado para insertar un fragmento Notl de aproximadamente 3.5 Kb. Este fragmento contiene un marcador de resistencia a la neomicina, descrito adicionalmente más adelante. Si se desea, se pueden construir otras construcciones knockout mu usando la secuencia de cadena pesada mu genómica de otras razas de ungulados, especies, o géneros (por ejemplo, la secuencia de cadena pesada mu depositada como el número de acceso U63637 de Genbank de una cruza S iss Bull/Holstein) . En cuanto el fragmento "1" y el marcador de resistencia a la neomicina se unen entre si en pBluescript, permanece un sitio Sacl adyacente al marcador de resistencia a la neomicina. La nueva construcción se linealizó con Sacl y se convirtió en un extremo romo llenando los extremos pegajosos sobrantes de la digestión de Sacl, usando ADN polimerasa. El fragmento designado "2" fue aislado como un fragmento XhoI-BstI1071 y se convirtió en un fragmento terminado en romo llenando los extremos pegajosos sobrantes de Xhol y las enzimas BstI1071, usando ADN polimerasa. En cuanto terminó, la construcción final contenía la región 2, el marcador de resistencia a la neomicina y la región 1, respectivamente. Para la transfección de fibroblastos bovinos, la construcción fue digerida con la enzima de restricción, Kpnl (dos sitios Kpnl se muestran en el diagrama) y el fragmento de ADN se usó para la recombinación homologa. La construcción de resistencia a la neomicina fue ensamblada como sigue. Una construcción designada "pSTneoB" (Katoh y colaboradores, Cell Struct. Funct . 12:575, 1987; Japanese Collection of Research Biologicals (JCRB) deposit number: VE039) fue diseñada para contener un gen de resistencia a la neomicina bajo el control de un promotor SV40 y un mejorador corriente arriba de la región de codificación. Corriente abajo de la región de codificación está una secuencia de terminador SV40. El neo cassette fue separado del "pSTneoB" como un fragmento Xhol. Después de que los extremos del fragmento se convirtieron en extremos romos usando técnicas de biología molecular estándares, el fragmento terminado en romo fue clonado en el sitio EcoRV en el vector, pBS246 (Gibco/Life Technologies) . Este sitio está flanqueado por sitios loxP. La nueva construcción, designada "pLoxP-STNeoR", se usó para generar la construcción de ADN knockout mu. El fragmento deseado de esta construcción es flanqueado por sitios loxP y Notl, los cuales originalmente estaban presentes en el vector de clonación pBS246. El fragmento Notl deseado, contenía loxP-neo-loxP, se usó para el reemplazo de los exones de la región constante mu de inmunoglobulina. El promotor SV40 operablemente enlazado al gen de resistencia a la neomicina activa la transcripción del gen de resistencia a la neomicina, permitiendo que las células en las cuales el fragmento Notl deseado ha reemplazado los exones de la región constante mu se seleccionen basándose en su resistencia al antibiótico resultante. Después de que se obtiene la línea celular en la cual el alelo de la cadena pesada de IgM ha sido efectivamente interrumpido, se usa como un donante de transferencia nuclear para producir un feto ungulado clonado (por ejemplo, un feto bovino clonado) y ocasionalmente un feto o animal en donde uno de los alelos de cadena pesada IgM se interrumpe. Después de eso, una segunda ronda de interrupción dirigida de genes se puede efectuar usando células somáticas derivadas de las mismas, por ejemplo, fibroblastos, con el fin de producir células en las cuales el segundo alelo de cadena pesada de IgM se inactiva, usando un vector similar, pero conteniendo un marcador seleccionable diferente. Preferiblemente, al mismo tiempo que la primera interrupción de gen dirigida, una segunda línea celular somática de ungulado (por ejemplo, bovino) también se modifica genéticamente, lo cual similarmente puede ser de origen masculino o femenino. Si la primera linea celular manipulada es masculina, es preferible modificar una línea celular femenina; pero por el contrario, si la primera linea celular manipulada es femenina, es preferible seleccionar una línea celular masculina. De nuevo, preferiblemente, las células manipuladas comprenden fibroblastos fetales ungulados (por ejemplo, bovinos). En una modalidad preferida, el fibroblasto fetal femenino se modifica genéticamente para introducir una interrupción dirigida de un alelo del gen de cadena ligera lambda de inmunoglobulina. Este método similar ente se lleva a cabo usando un vector que tiene regiones de homología con la cadena ligera lambda de inmunoglobul ma de ungulado (por ejemplo, bovino) y un marcador seleccionable, cuya construcción de ADN se diseña de manera que después de la integración y la recombinación homóloga con la cadena ligera de inmunoglobulina endógena dé como resultado la interrupción (inactivación) del gen de cadena ligera lambda de la inmunoglobulina objetivo. En cuanto la linea celular de fibroblasto femenina se selecciona teniendo la interrupción dirigida deseada, similarmente se utiliza como una célula donante para la transf rencia nuclear del ADN de esta línea celular como un donante para la transferencia nuclear. De manera alternativa, esta célula puede someterse a una segunda ronda de recombinación homologa para inactivar la segunda cadena ligera lambda de inmunoglobulina usando una construcción de ADN similar a la usada para interrumpir el primer alelo, pero que contiene un marcador seleccionable diferente. Como se discutió en los antecedentes de la invención, se han reportado métodos para efectuar la transferencia nuclear, y particularmente para la producción de bovinos clonados y bovinos transgénicos clonados y se describen en la patente US ,995,577, emitida a Stice y colaboradores y cedida a la Universidad de Massachusetts . Todavía, se pueden alternativamente las técnicas de transferencia nuclear descritas en WO 95/16670; WO 96/07732; WO 97/0669; o WO 97/0668, (colectivamente, métodos de Roslin) . Los métodos de Roslin difieren de las técnicas de la Universidad de Massachusetts porque usan células donantes quietas en vez de proliferantes. Todas estas patentes se incorporan mediante referencia en la presente por entero. Estos procedimientos de transferencia nuclear producirán un feto clonado transgénico que puede ser usado para producir descendientes bovinos transgénicos clonados como por ejemplo, un descendiente que comprende una interrupción dirigida de cuando menos un alelo del gen de cadena ligera de inmunoglobulina y/o del gen de IgM. Después de que estas lineas celulares han sido creadas, se pueden utilizar para producir un feto y un descendiente (M y F Hemi H/L) knockout homocigoto de cadena ligera y de cadena pesada masculino y femenino. Más aún, estas técnicas no se limitan al uso para la producción de bovinos transgénicos, las técnicas anteriores también se pueden usar para la transferencia nuclear de otros ungulados. Después de la transferencia nuclear, la producción de animales deseados puede ser afectada apareando los ungulados o por dirección de genes secundarios usando el vector de selección homologa previamente descrito. Como se notó previamente, otro objeto de la invención incluye crear knockouts hemicigotos de cadena ligera y cadena pesada machos y hembras en donde estos knockouts hemicigotos se producen usando la líneas celulares ya descritas. Esto se puede efectuar ya sea apareando a los descendientes producidos de acuerdo con los métodos descritos anteriormente, en donde un descendiente que comprende un alelo interrumpido de un gen de cadena pesada IgM se aparea con otro descendiente que comprende un alelo interrumpido de la cadena ligera de inmunoglobulina.

Alternativamente, esto se puede afectar mediante la selección del gen secundario manipulando una célula que se obtiene a partir de un descendiente producido de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. Esto comprenderá efectuar mediante la recombinación homologa la interrupción dirigida de un alelo del gen de cadena pesada de IgM o el alelo de la cadena ligera de inmunoglobulina. Después de que se produce la línea celular que comprende un knockout hemicigoto de cadena ligera y cadena pesada masculino y femenino (M y F Hemi H/L) se usará para producir un feto o un becerro que comprende este knockout. Como se nota, esto se efectúa ya sea mediante apareamiento o mediante selección del gen secundario. En cuanto se obtienen knockouts hemicigotos de cadena ligera y cadena pesada machos y hembras, las células de estos animales se pueden utilizar para crear fetos knockout homocigotos (Homo H/L) . De nuevo, esto se efectúa ya sea mediante la selección secuencial de genes o mediante apareamiento.

Esencialmente, si se efectúa mediante apareamiento, esto implica aparear el knockout hemicigoto de cadena ligera y pesada macho con el knockout hemicigoto de cadena ligera y pesada hembra y la selección de un descendiente que comprenda un knockout homocigoto. Alternativamente, las células del knockout hemicigoto descritas anteriormente se pueden manipular en cultivo de tejido, de manera que se recorte el otro alelo del gen (lambda) de cadena ligera de inmunoglobulina o IgM. La dirección o selección del gen secundario se puede preferir al apareamiento ya que puede proporcionar resultados más rápidos, especialmente dado que el periodo de gestación de los ungulados, tales como los bovinos, es relativamente largo. En cuanto se han obtenido los knockout homocigotos (Homo H/L) , se utilizan para la introducción de un ácido nucleico deseado el cual contiene genes (preferiblemente, los lugares de gen enteros) para producir anti-cuerpos de una especie particular, tales como humanos. Preferiblemente, se usan cromosomas artificiales humanos, tales como los descritos en WO 97/07671 (EP 0843961) y WO 00/10383 (EP 1106061) . Esos cromosomas artificiales humanos también se describen en la patente japonesa correspondientemente emitida JP 30300092. Todas estas solicitudes se incorporan mediante referencia por entero en la presente. También, la construcción de cromosomas humanos artificiales que contienen y expresan genes de inmunoglobulina humana se describen en Shen y colaboradores, Hum. Mol. Genet. 6 (8) : 1375-1382 (1997) ; Kuroi a y colaboradores, Nature Biotechnol . 18 (10) : 1086-1090 (2000); y Loupert y colaboradores, Chromosome 107 (4) : 255-259 (1998), todas las cuales se incorporan mediante referencia por entero en la presente. Los cromosomas artificiales humanos también se pueden utilizar para introducir genes de anti-cuerpos xenógenos en células de animales de tipo natural; esto se lleva a cabo usando los métodos descritos anteriormente. La introducción de cromosoma artificial en células animales, especialmente células de fibroblastos fetales se puede realizar mediante la fusión de micro-células como se describe en la presente. Como una alternativa al uso de cromosoma artificial humano, se puede integrar ácido nucleico que codifica genes de inmunoglobulina en el cromosoma usando un vector YAC, vector BAC, o vector cósmido. Los vectores que comprenden genes de inmunoglobulina xenógena (WO 98/24893; WO 96/33735, WO 97/13852; WO 98/24882) se pueden introducir a las células de fibroblastos fetales usando métodos conocidos, tales como la electro-incorporación, lipofección, fusión con un esferoplasto de levadura que comprende un vector YAC, y similares. Además, los vectores que comprenden genes de inmunoglobulina xenógenos se pueden dirigir a los lugares de genes de inmunoglobulina endógenos de las células de fibroblastos fetales, dando como resultado la introducción simultánea del gen de inmunoglobulina xenógeno y la interrupción del gen de inmunoglobulina endógeno. La integración de un ácido nucleico que codifica un gen de inmunoglobulina xenógeno también se puede llevar a cabo como se describe en las patentes por Lonberg y colaboradores (supra) . En la construcción "knockin" usada para la inserción de los genes de inmunoglobulina xenógena en un cromosoma de un ungulado anfitrión, uno o más genes de inmunoglobulina y un gen de resistencia al antibiótico se pueden enlazar operablemente a un promotor el cual está activo en el tipo celular transfectado con la construcción. Por ejemplo, se puede usar un promotor especifico de tejido inducible, constitutivamente activo para activar la transcripción del gen de resistencia al antibiótico integrado, permitiendo que las células transfectadas se seleccionen basándose en su resistencia resultante al antibiótico. Alternativamente, se puede usar una construcción knockin en la cual el cassette knockin que contiene el o los genes de inmunoglobulina y el gen de resistencia al antibiótico no está operablemente enlazado a un promotor. En este caso, se pueden seleccionar células en las cuales el cassette knockin se integra corriente abajo de un promotor endógeno basándose en la expresión resultante del marcador de resistencia al antibiótico bajo el control del promotor endógeno. Estas células seleccionadas se pueden usar en los procedimientos de transferencia nuclear descritos en la presente para generar un ungulado transgénico que contiene un gen de inmunoglobulina xenógena integrado en un cromosoma anfitrión. Usando metodologías similares, es posible producir e insertar cromosomas artificiales que contienen genes para la expresión de inmunoglobulina de especies diferentes tales como perro, gato, otros ungulados, primates no humanos entre otras especies. Como se discutió anteriormente, y como se conoce en la técnica, los genes de inmunoglobulina de diferentes especies son muy conocidos por exhibir homología de secuencias sustancial a través de diferentes especies.

En cuanto se ha determinado que el cromosoma artificial insertado, por ejemplo, un cromosoma artificial humano se ha introducido establemente en la linea celular, por ejemplo, un fibroblasto fetal bovino se utiliza como un donante para una transferencia nuclear. Esto puede ser determinado por métodos de reacción de cadena de polimerasa. Similarmente, se tienen animales que comprenden el knockout homocigoto, y además comprenden un ácido nucleico establemente introducido, tal como un cromosoma artificial humano. Después de que se han obtenido becerros que incluyen el ácido nucleico establemente incorporado (por ejemplo, el cromosoma artificial humano), los animales se prueben para determinar si expresan genes de inmunoglobulina humanos como respuesta a la inmunización y a la maduración por afinidad. También se pueden realizar modificaciones del procedimiento global descrito anteriormente. Por ejemplo, primero se pueden introducir los genes de inmunoglobulina xenógenos y después se pueden inactivar los genes de inmunoglobulina endógenos. Además, un animal que retiene genes de inmunoglobulina xenógenos se puede aparear con un animal en el cual el gen de inmunoglobulina xenógeno está inactivado. Aunque los enfoques que se van a utilizar en la invención se han descrito anteriormente, las técnicas que se utilizan se describen en mayor detalle más adelante. Estos ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, y no deberán considerarse limitantes.

En particular, aunque estos ejemplos se enfocan en bovinos transgénicos, los métodos descritos se pueden utilizar para producir o probar cualquier ungulado transgénico. Procedimientos Knockout para Producir Ungulados Transgénicos que Expresan Inmunoglobulinas Humanas Como se comentó anteriormente, la presente invención se relaciona con la producción de fetos o de becerros Homo H/L. El enfoque se resume en la Figura 1. Hay tres esquemas señalados en la misma. El primero depende de los knockouts sucesivos en lineas celulares fetales regeneradas. Este enfoque es técnicamente más difícil y tiene el nivel más alto de riesgo pero como se hizo notar anteriormente potencialmente produce resultados más rápidos que los enfoques de cruza. Los otros dos esquemas se basan en cruza de animales. En el segundo esquema, solo se requieren knockouts simples de genes de cadena ligera y pesada en las líneas celulares masculina y femenina, respectivamente. Este esquema no se basa en la regeneración de las lineas celulares y es técnicamente el enfoque más simple pero tarda más para llevarse a cabo. El esquema 3 es uno intermedio entre los esquemas 1 y 2. En todos los esquemas sólo se generan fetos Homo H/L debido a dificultades potenciales en la sobrevivencia y mantenimiento de becerros knockout Homo H/L. Si es necesario, se puede usar inmunoterapia pasiva para aumentar la supervivencia de becerros knockout Homo H/L. Diseño Experimental La presente invención preferiblemente incluye la producción de knockout de cadena pesada macho hemicigoto (M Hemi H) y un knockout de cadena ligera hembra hemicigoto (F Hemi L) y la producción de fetos de 40 días a partir de estas supresiones dirigidas. Las células de los embriones se cosechan, y un alelo del lugar ligero se dirige a las células M Hemi H y un alelo del lugar de cadena pesada se dirige a las células F Hemi L dando como resultado células con supresiones hemicigotas tanto de los lugares H como L (Hemi H/L) . Estas células se usan para derivar fetos de 40 dias a partir de los cuales se aislan los fibroblastos . Los fibroblastos M Hemi H/L se dirigen con el otro alelo de cadena H para crear M Homo H/Hemi L, y los F Hemi H/L se dirigen con otro alelo de cadena L para crear F Homo L/Hemi H. Con el fin de crear supresiones homocigotas, se usan concentraciones más altas de fármacos para conducir la selección homocigota. Sin embargo, es posible que este enfoque no tenga éxito y que sea necesario el cruzamiento. Una estrategia ejemplar que se basa en la selección de cre/lox del cassette de selección permite los mismos sistemas selectivos usados para más de una supresión dirigida. Estos fibroblastos se clonan y los fetos de 40 dias se cosechan y las células de fibroblastos se aislan. Las células fetales de esta clonación se seleccionan como objetivos para producir supresiones homocigotas ya sea en los lugares H o L que resultan en fibroblastos fetales M Homo H/L y F Homo H/L. Estos fibroblastos se clonan y se derivan fetos de 40 dias y se aislan los fibroblastos. Los fibroblastos fetales Homo H/L se usan entonces para la incorporación de cromosoma artificial humano opcionalmente mediante el uso de procedimientos de cruza. Construcción de Bibliotecas Se usan células de fibroblastos fetales para construir una biblioteca genómica. Aunque se reporta que es importante que la construcción objetivo sea isogénica con las células usadas para la clonación, esto no es esencial para la invención. Por ejemplo, se pueden usar construcciones isogénicas, sustancialmente isogénicas o no isogénicas para producir una mutación en el gen de inmunoglobulina endógena. En un método posible, se usa ganado Holstein el cual genéticamente contiene un alto nivel de endogamia en comparación con otras crías de ganado. No hemos detectado ningún polimorfismo en los genes de inmunoglobulina entre diferentes animales. Esto sugiere que la homología de la secuencia deberá ser alta y que la selección con construcciones no isogénicas podría ser exitosa. Una biblioteca se construye a partir de una línea celular masculina y una línea celular femenina al mismo tiempo que se lleva a cabo la prueba de "capacidad de clonación". Se considera que al final del proceso, una biblioteca será producida y un número de diferentes lineas celulares fetales se probará y una línea celular se elegirá como la mejor para propósitos de clonación. Se construyen bibliotecas genómicas usando ADN de alto peso molecular aislado a partir de células de fibroblastos fetales. El ADN se fracciona en tamaño y ADN de alto peso molecular entre 20-23 Kb se inserta en el vector pago lambda LambdaZap o LambdaFix. Los inventores han tenido excelente éxito con las bibliotecas preparadas de Stratagene. Por lo tanto, el ADN se aisla y el ADN seleccionado por tamaño se envia a Stratagene para la preparación de la biblioteca. Para aislar clonas gue contienen cadenas pesadas y ligeras bovinas, se usa ADNc de IgM radio-etiquetado y ADNc de cadena ligera radio-etiquetada. Adicionalmente, las clonas genómicas de cadena ligera se aislan en caso que sea necesario para suprimir el lugar. Cada biblioteca de células fetales se selecciona para encontrar clonas que contienen cadena ligera y pesada bovina. Se anticipa que la selección de aproximadamente 105-106 placas deberá conducir al aislamiento de clonas que contienen ya sea el lugar de cadena pesada o de cadena ligera. En tanto se aislan, ambos lugares son sub-clonados en pBluescript y la restricción se mapea. Un mapa de restricción de estos lugares en Holsteins se proporciona en la Figura 2B (Knight y colaboradores J Immunol 140(10) :3654-9, 1988) . Adicionalmente, se obtiene un mapa de las clonas y se usa para ensamblar la construcción objetivo. Producción de Construcciones Objetivo En cuanto los genes de cadena pesada y ligera se aíslan, se hacen las construcciones. La construcción de IgM se hace suprimiendo el dominio de la membrana de región constante de IgM. Como lo muestra Raje sky y sus colaboradores en ratones, la supresión del dominio de la membrana en IgM da como resultado un bloque en el desarrollo de las células B ya que la IgM de superficies es una señal requerida para el desarrollo de las células B continuado (Kitamura y colaboradores, Nature 350:423-6) . De este modo el ganado IgM homocigoto carece de células B. Esto no plantea un problema ya que en la presente estrategia no son necesarios animales vivos que carecen de inmunoglobulina funcional. Sin embargo, si es necesario, se puede usar inmunoterapia pasiva para mejorar la supervivencia de los animales hasta el último paso cuando se introducen los lugares de inmunoglobulina humana. Una construcción objetivo ejemplar usada para efectuar el knockout del alelo de cadena pesada de IgM se muestra más adelante en la Figura 2A. Para la cadena pesada, el dominio IgM de la membrana se reemplaza con un cassette de neomicina flanqueado por sitios lox P. El dominio de la membrana unida se divide con el neo cassette de manera que el dominio de la membrana tenga un codón de detención TAG insertado inmediatamente 5' al sitio lox P asegurando que el dominio de la membrana se inactive. Esto se coloca en el extremo 5' de la construcción objetivo con aproximadamente 5-6 kilobases de ADN cromosomal 3 ' . Si aumentando las concentraciones de fármaco no se permite la supresión del segundo alelo ya sea de la cadena pesada o ligera de IgM, el sistema cre/lox (revisado en Sauer, 1998, Methods 14:381-392) se usa para suprimir el marcador seleccionable. Como se describe más adelante, el sistema cre/lox permite a supresión dirigida del marcador seleccionable. Todos los marcadores seleccionables se flanquean con secuencias lox P para facilitar la supresión de estos marcadores si esto fuera necesario . La construcción de cadena ligera contiene la región constante de cadena lambda bovina (por ejemplo, la región constante de cadena ligera lambda encontrada en Genbank número de acceso AF396698 o cualquier otra región constante de cadena ligera lambda de ungulado) y un cassette de gen resistente al a puromicina flanqueado por sitios lox P y remplazará el gen bovino con un cassette de puromicina flanqueado por sitios lox P. Aproximadamente 5-6 kilobases de ADN 3' a gen de región constante lambda remplazaré 3' al gen resistente a la puromicina. El gen resistente a la puromicina llegará los sitios lox P a los extremos tanto 5' como 3' para permitir la supresión si es necesario. Debido al alto grado de homología entre los genes de anti-cuerpos de ungulados, la secuencia de cadena ligera lambda bovina en el Genbank con número de acceso AF396698 se espera que hibride a la secuencia de cadena ligera lambda genómica de una variedad de ungulados y de este modo se puede usar en métodos estándares para aislar varias secuencias genómicas de cadena ligera lambda de ungulados. Estas secuencias genómicas se pueden usar en métodos estándares, tales como los descritos en la presente, para generar construcciones knockout para inactivar cadenas ligeras lambda endógenas en cualquier ungulado. Una construcción knockout de cadena ligera kapa se puede construir similarmente usando la secuencia de cadena ligera kapa bovina en la Figura 3G o cualquier otra secuencia de cadena ligera kapa de ungulado. Esta cadena ligera kapa de bovino se puede usar como una sonda de hibridación para aislar las secuencias de cadena ligera en kapa genómicas de una variedad de ungulados. Estas secuencias genómicas se pueden usar en métodos estándares, tales como los descritos en la presente, para generar construcciones knockout para inactivar cadenas ligeras knockout endógenas en cualquier ungulado. Los genes ungulados adicionales opcionalmente se pueden mutar o inactivar. Por ejemplo, el gen de cadena J de mmunoglobulina de ungulado endógeno se puede recortar para evitar la antigemcidad potencial de la cadena J de inmunoglobulma de ungulado en los anti-cuerpos de la invención que se administran a humanos. Para la construcción del vector objetivo, la secuencia del ADNc de la región de cadena J de inmunoglobulina bovina encontrada en Genbank número de acceso U02301 se puede usar. Esta secuencia de ADNc se puede usar como una sonda para aislar la secuencia genómica de la cadena J de inmunoglobulina bovina a partir de una biblioteca BAC tal como RPC1-42 (BACPAC en Oakland, California, Estados Unidos) o para aislar la secuencia genómica de la cadena J de cualquier otro ungulado. Adicionalmente, la cadena J humana que codifica las secuencias se puede introducir en los ungulados de la presente invención para la expresión funcional de las moléculas IgA e IgM humanas. La secuencia de ADNc de la cadena J humana está disponible en Genbank con los números de acceso AH002836, M12759, y M12378. Esta secuencia se puede insertar en un fibroblasto fetal ungulado usando métodos estándares, tales como los descritos en la presente. Por ejemplo, el ácido nucleico de cadena J humano en un vector HAC, YAC, un vector BAC, un vector cósmido, o una construcción knockin se pueden integrar en un cromosoma ungulado endógeno o mantenerse independientemente de los cromosomas de ungulados endógenos. Las células unguladas transgénicas resultantes se pueden usar en los métodos de transferencia nuclear descritos en la presente para generar los ungulados deseados que tengan una mutación que reduzca o elimine la expresión de la cadena J de un ungulado funcional y que contengan un ácido nucleico xenógeno que expresa la cadena J humana . Adicionalmente, el gen ungulado a-(l,3)-galactosiltransferasa se puede mutar para reducir o eliminar la expresión del epítope galactosil (al, 3 ) galactosa que se produce por la enzima - ( 1, 3) -galactosiltransferasa . Si los anti-cuerpos humanos producidos por los ungulados de la presente invención son modificados por este epítope carbohidrato, estos anti-cuerpos glicosilados se pueden inactivar o eliminar, cuando se administran como terapia para humanos, por los anti-cuerpos en los receptores que reaccionan con el epítope de carbohidrato. Para eliminar esta respuesta inmune posible al epítope de carbohidrato, la secuencia del gen alfa- (1,3)-galactosiltransferasa bovino se puede usar para diseñar una construcción knockout para inactivar este gen en ungulados (Genbank número de acceso J04989; Joziasse y colaboradores, J. Biol. Chem. 264 (24 ): 14290-7, 1989). Esta secuencia bovina o la secuencia porcina de alfa- (1, 3) -galactosiltransferasa descrita en las patentes US 6,153,428 y 5,821,117 se puede usar para obtener la secuencia genómica de alfa- (1, 3) -galactosiltransferasa de una variedad de ungulados para generar otros ungulados con la expresión reducida o eliminada del epitope galactosil ( l, 3) galactosa. Si se desea, el gen prión ungulado se puede mutar e inactivar para reducir el riesgo potencial de una infección tal como una encefalopatía espongiforme bovina (BSE) . Para a construcción del vector objetivo, la secuencia de ADN genómica del gen prión bovino se puede usar (Genbank numero de acceso AJ298878) . Alternativamente, esta secuencia de prión genómico se puede usar para aislar la secuencia de prión genómico de otros ungulados. El gen anterior se puede inactivar usando métodos estándares, tales como los descritos en la presente o los sugeridos para recortar el gen de alfa- (1,3)-galactosiltransferasa o el gen de prión en ovejas (Denning y colaboradores, Nature Biotech., 19:559-2562, 2001). Para seleccionar el segundo alelo de cada lugar, puede ser necesario ensamblar una nueva construcción objetivo que contiene un marcador seleccionable diferente, si el primer marcador seleccionable permanece en la célula. Como se describe en la Tabla 1, una variedad de estrategias de selección están disponibles si se pueden comparar y elegir el sistema de selección adecuado. Inicialmente, el segundo alelo es seleccionado elevando la concentración del fármaco (por ejemplo, duplicando la concentración del fármaco) . Si esto no tiene éxito, se puede emplear una nueva construcción objetivo. Las mutaciones adicionales o la inactivación de genes mencionado anteriormente se pueden incorporar en los ungulados de la presente invención utilizando distintas metodologías. En cuanto la linea celular del ungulado transgénico se genera para cada mutación deseada, se puede usar la endogamia para incorporar esta mutación adicional en los ungulados de la presente invención. Alternativamente, la células de fibroblastos fetales que tienen estas mutaciones adicionales se pueden usar como el material inicial para el recorte de lo genes de mmunoglobulma endógenos y/o la introducción de los genes de inmunoglobulina xenógenos. También, las células de fibroblastos fetales que tienen una mutación knockout en los genes de mmunoglobulma endógeno y/o que contienen genes de inmunoglobulina xenógenos se pueden usar como material inicial para estas mutaciones o inactivaciones adicionales. Supresión Dirigida de los Lugares de Inmunoqlobulina Las construcciones objetivo se introducen en fibroblastos embriónicos, por ejemplo, mediante la electro-incorporación. Las células que incorporan el vector objetivo se seleccionan mediante el uso del antibiótico adecuado. Las clonas que son resistentes al fármaco de elección serán seleccionadas para su cultivo. Estas clonas se someten a la selección negativa mediante ganciclovir, lo cual seleccionará las clonas que se han integrado adecuadamente. Alternativamente, las clonas que sobreviven la selección por fármacos se selección mediante reacción de cadena de polimerasa. Se estima que será necesario analizar cuando menos 500-1,000 clonas para encontrar una clona seleccionada adecuadamente. La estimación de los inventores se basa en Kitamura (Kitamura y colaboradores, Nature 350:423-6, 1991) quien encontró que cuando se selecciona el dominio de membrana de la región constante de cadena pesada de IgM aproximadamente 1 de 300 clonas neo resistentes se seleccionaron adecuadamente. De este modo se propone depositar los clonas en grupos de 10 clonas en una placa de 96 pozos y analizar los depósitos de 10 clonas para las clonas objetivo de selección. En cuanto se identifica un positivo, las clonas simples aisladas de la clona reunida serán seleccionadas. Esta estrategia hará posible la identificación de la clona buscada. Debido a que los fibroblastos se mueven en cultivo es difícil distinguir clonas individuales cuando más de aproximadamente diez clonas se producen por plato. Además, se pueden desarrollar estrategias para la propagación de clonas con transfección de alta eficiencia. Varias estrategias razonables, tales como clonación en dilución, se pueden usar. Excisión Cre/Lox del Marcador Resistente al Fármaco Como se mostró anteriormente, las construcciones objetivo de ejemplo contienen marcadores seleccionables flanqueados por sitios lox P para facilitar la supresión eficiente del marcador usando el sistema cre/lox. Fibroblastos fetales que llevan el vector objetivo son transfectados vía electro-incorporación con un plásmido que contiene Cre. Un plásmido Cre descrito recientemente que contiene el gen de fusión GFPcre [Gagneten S. Y colaboradores, Nucleic Acids Res 25:3326-3 (1997) ] se puede usar. Esto permite la selección rápida de todas las clonas que contienen la proteina Cre. Estas células se seleccionan ya sea mediante clasificación FACS o mediante cosecha manual de células fluorescentes verdes via la micro-manipulación. Las células que son verdes se espera que lleven recombinasa Cre transcrita activamente y por lo tanto suprimen el marcador resistente al fármaco. Las células seleccionadas para la expresión Cre se clonan y las clonas se analizan para la supresión del marcador de resistencia al fármaco via análisis por reacción de cadena de polimerasa. Las células que se determina que han sufrido escisión se cultivan en clonas pequeñas, se dividen y una alícuota se prueba en medio selectivo para asegurar con certeza que el gen de resistencia al fármaco ha sido suprimido. La otra alícuota se usa para la siguiente ronda de supresión dirigida.

Tabla 1: Marcadores seleccionables y fármacos para selección Gen Fármaco Neor G4181 Hph Higromicina B'' Puro Puromicina3 Ecogpt Ácido micofenólico4 Bsr Blasticidina S:' HisD Histidinol'' DT-A Toxina diftérica7 Southern PJ, Berg P. 1982. Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gen under control of the SV40 early región promoter. J Mol Appl Genet 1:327-41. 'Santerre RF, Alien NE, Hobbs JN Jr . Rao RN, Schmidt RJ. 1984. Expression of prokaryotic genes for hygromycin B and G418 resistance as dominant-selection markers in mouse L cells. Gen 30:147-56. 'Wirth M, Bode J, Zettlmeissl G, Hauser H. 1998. Isolation of overproducing recombinant mammalian cell Unes by a fast and simple selection procedure. Gen 73:419-26. ^Drews RE, Koljer MT, Sachar DS, Moran GP, Shnipper LE. 1996. Passage to nonselective media transiently alters growth of mycophenolic acid-resistant mammalian cells expressing the escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene: implications for sequential selection strategies. Anal Biochem 235:215-26. 5Karreman C. 1998. New positive/negative selectable markers for mammalian cells on the basis of Blasticidin deaminase-thymidine kinase fusions. Nucleic Acids Res 26:2508-10. -'Hartman SC, Mulligan RG . 1998. Two dominant-acting selectable markers for gen transfer studies in mammalian cells. Proc Nati Acad ?ci U S 85:8047-51. 7Yagi T. Nada S., Watanabe N, Tamemoto H, Kohmura N, Ikawa Y, Aizawa S. 1993. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Anal Biochem 214:77-86. Aplicación de Estrategias Objetivo para Alterar los Genes de Inmunoalobulina de Otros Ungulados Para alterar los genes de inmunoglobulina de otros ungulados, se diseñan vectores objetivo que contienen tres regiones principales. La primera región es homologa con el ligar que se va a seleccionar. La segunda región es un marcador de selección de fármaco que específicamente reemplaza una porción del lugar objetivo. La tercera región, como la primera región, es homologa al lugar objetivo pero no está contigua a la primera región en el genoma tipo natural. La recombinación homologa entre el vector objetivo y el lugar tipo natural deseado da como resultado la supresión de secuencias de lugar entre las dos regiones de homología representadas en el vector objetivo y el reemplazo de esa secuencia con un marcador de resistencia al fármaco. En las modalidades preferidas, el tamaño total de las dos regiones de homología es de aproximadamente 6 kilobases, y el tamaño de la segunda región que reemplaza una porción del lugar objetivo es de aproximadamente 2 kilobases. Esta estrategia objetivo es ampliamente útil para un rango amplio de especies desde células procarióticas hasta células humanas. La unicidad de cada vector usado está en el lugar usado para los procesamientos de selección de gen y las secuencias empleadas en esa estrategia. Este enfoque se puede usar en todos los ungulados, incluyendo, sin limitación, cabras (Capra hircus), ovejas (Ovis aries), y el cerdo (Sus scrufa) , asi como ganado (Bos taurus ) . El uso de la electro-incorporación para seleccionar genes específicos en las células de ungulados también se puede usar ampliamente en ungulados. El procesamiento general descrito en la presente es adaptable a la introducción de mutaciones dirigidas en los genomas de otros ungulados. La modificación de las condiciones de la electro-incorporación (voltaje y capacitancia) se pueden emplear para optimizar el número de transfectantes obtenido de otros ungulados. Además, la estrategia usada en la presente para seleccionar lugar de cadena pesada en ganado (es decir la remoción de todos los exones de codificación y secuencias de intervención usando un vector que contiene regiones homologas a las regiones que inmediatamente flanquea los exones removidos) también se puede usar igualmente bien en otros ungulados. Por ejemplo, el análisis extensivo de secuencias se ha realizado en el lugar de cadena pesada de inmunoglobulina de ovejas (Ovis apes), y el lugar de las ovejas es muy similar al lugar de los bovinos tanto en estructura como en secuencia (Genbank números de accesos Z71572, Z49180 hasta Z49188, M60441, M60440, AF172659 hasta AF172703) . Además del gran número de secuencias de ADNc reportadas para cadenas de inmunoglobulina de Ovis apes, la información de secuencia genómica ha sido reportada para el lugar de cadena pesada, incluyendo la cadena pesada con mejorador 5' (Genbank número de acceso Z98207) , la región de cambio mu 3' (Z98680) y la región de cambio mu 5' (Z98681) . La secuencia de ARNm completa para las ovejas de forma secretada de la cadena pesada ha sido depositada con el número de acceso X59994. Este depósito contiene la secuencia entera de cuatro exones de codificación, que son muy homólogos a la secuencia bovina correspondiente. La información sobre el lugar de ovejas se obtuvo de Genbank y se usó para determinar áreas de alta homología con la secuencia bovina para el diseño de cebadores usados para el análisis de reacción de cadena de polimerasa. Debido a que ADN no isogénico se usó para seleccionar células bovinas, encontrar áreas de alta homología con la secuencia de ovejas se usó como un indicador de que la conservación similar de las secuencias entre razas de vacas era probable. Luego la similitud entre las secuencias y estructuras de los lugares de inmunoglobulina bovina y ovina, se esperaría que las estrategias de selección usadas para remover lugares de inmunoglobulina bovina pudieran aplicarse con éxito al sistema ovino. Además, la información existente sobre el cerdo { Sus scrofa , número de acceso S42881) y la cabra ( Capra hircus, número de acceso AF14063), indica que los lugares de inmunoglobulina de ambas especies también son suficientemente similares a los lugares bovinos para utilizar las presentes estrategias de selección. Procesamientos para la Inserción de Cromosomas Artificiales Humanos Esencialmente, líneas celulares de fibroblastos fetales bovinos masculinos y femeninos que contienen secuencia de cromosoma artificial humano para (#14fg., #2fg., y #22fg.) se obtienen y seleccionan y usan para producir becerros clonados a partir de estas líneas. Por ejemplo, cromosoma artificial humano derivado del cromosoma humano #14 ("#14gf", que comprende el gen de cadena pesada de inmunoglobulina) , cromosoma humano #2 ("#2fg", que comprende el gen de cadena kapa Ig) y el cromosoma humano #22 ("#22fg", que comprende el gen cadena lambda Ig) se pueden introducir simultánea o sucesivamente. La transmisión de estos fragmentos de cromosomas de prueba apareando un animal macho #14fg. Con una hembra #2fg. Y animales #22fg. y evaluando los descendientes. Si la transmisión tiene éxito cuando dos lineas se aparean para producir una línea que contiene los tres fragmentos de cromosomas.

También, los fragmentos de cromosomas #14fg., #2fg., y #22fg. se pueden insertar en células fetales Homo H/L y usarse para generas becerros clonados o becerros HAC transgénicos cruzados con becerros Homo H/L. De manera alternativa, otros cromosomas artificiales humanos, tales como ?HAC o ??HAC se pueden introducir como se describen en el Ejemplo 2 o introducir usando cualquier otro método de transferencia de cromosomas. Razonamiento La transmisión de la línea germinal de los cromosomas artificiales humanos deberá ser útil para introducir los cromosomas artificiales humanos en los animales knockout de inmunoglobulina y en propagar animales en ganados de producción. La preocupación en la propagación de los cromosomas artificiales humanos a través la línea germinal es el apareamiento incompleto de material cromosomal durante la meiosis. Sin embargo, La transmisión de la línea germinal ha sido exitosa en ratones como lo muestra Tomizuka y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97:722, 2000) . La estrategia señalada en la Figura ÍA consiste en insertar #14fg, en la línea masculina de células y #2fg. y #22fg. en líneas celulares femeninas. Los becerros que retienen un cromosoma artificial humano se producen y la transmisión de la linea germinal se pude probar tanto a través de hembras como de machos. Parte de los descendientes resultantes (aproximadamente el 25 ) deberá contener tanto cromosomas artificiales humanos de cadena pesada como de ligera. La cruza adicional dará como resultado una linea de becerros que contienen los tres fragmentos cromosomales . Estos animales se usan para cruzarse con animales Homo H/L como producidos de células fetales como se describió previamente. Diseño Experimental Las células se obtienen del análisis original de lineas celulares. Estas pueden ser líneas Holstein o líneas diferentes que las usadas anteriormente. Esto permite la cruza al mismo tiempo que se mantiene tanta variación genética en el ganado como sea posible. La introducción de cromosomas artificiales humanos en las líneas celulares y la selección de líneas celulares positivas se efectúan entonces. Las líneas celulares seleccionadas se usan para la transferencia nuclear y se producen los becerros. Iniciando los 12 meses edad se recolectan semen y óvulos, se fertilizan, y se transfieren a los animales receptores. Las muestras de células se toman de análisis marcador de ADN y por capotipificación. Comenzando el nacimiento, se toman muestras de sangre y se analizan para determinar la presencia de proteínas de inmunoglobulina humana. Como se indicó anteriormente, los cromosomas artificiales humanos también se transfieren a lineas celulares Homo H/L usando los procesamientos desarrollados en los experimentos anteriores. Pruebas para Determinar la Expresión de Inmunoglobulina Humana La meta del experimento es generar células Homo H masculinas y fetos clonados, para insertar una o más cromosomas artificiales humanos que juntas contengan lugares de IgH humana e IgL humana (tales como HAC #14fg. y #22fg.) en células Homo H y generar becerros, y probar la expresión de la respuesta de la inmunoglobulina humana a la inmunización y a la maduración por afinidad. Esto se lleva a cabo como sigue. Diseño del Experimento Se generan células Homo H a partir de células Hemi H producidas como se describió anteriormente. El knockout doble se produce ya sea mediante selección por antibiótico o una segunda inserción. Los cromosomas artificiales humanos se transfieren a estas células como se describe anteriormente. SE producen becerros mediante transferencia nuclear. La prueba de los becerros que detienen el cromosoma artificial humano comienza poco después de nacer e incluyen (1) evaluación de la expresión de inmunoglobulina humana, (2) respuesta a la inmunización, (3) maduración por afinidad, y (4) transmisión de los cromosomas artificiales humanos a los descendientes. La expresión de inmunoglobulina humana se monitorea sangrando a los animales haciendo ensayos para determinar la presencia de la expresión de cadena ligera y pesada humanas mediante análisis ELISA, RT-PCR, o FACS. En cuanto se ha determinado gue el animal produce inmunoglobulina humana, los animales son inmunizados con toxoide tetánico en adyuvante. Los animales se sangran una vez a la semana después de la inmunización y las respuestas al antigeno se determinan via ELISA o FACS y se comparan a los sangrados anteriores recolectados antes de la inmunización. Un mes después de la inmunización inicial, los animales son reforzados con una forma acuosa del antígeno. Una semana después de refuerzo los animales son sangrados y la respuesta al antigeno se mide vía ELISA o FACS y se compara con el sangrado previo. El ensayo ELISA o FACS permite la medición de la mayoría de la titulación de la respuesta así como los isotipos de la cadena pesada producidos. Estos datos permiten la determinación de un aumento en la titulación de anti-cuerpo así como la ocurrencia de cambio de clase. Las estimaciones de afinidad promedio también se miden para determinar si la maduración por afinidad ocurre durante la respuesta al antígeno. Después de que se han obtenido bovinos transgénicos como se describió anteriormente, se utilizan para producir inmunoglobulinas transgénicas, preferiblemente humanas, pero potencialmente las de otras especies, por ejemplo, perros, datos, primates no humanos, otros ungulados tales como ovejas, cerdos, cabra, murinos tales como ratón, rata, cobayo, conejo, etcétera. Como se hace notar, los genes de inmunoglobulina humana se sabe que se conservan a través de las especies. Anti-Sueros Transgénicos y Leche que Contienen Anti-Cuerpos Xenógenos Los bovinos (u otros ungulados) producen anti-sueros transgénicos dirigidos a cualquier antigeno al que se exponga endógenamente, o antígenos administrados exógenamente . Por ejemplo, se pueden administrar antigenos al ungulado para producir reactivos deseados de anti-cuerpos con los antigenos, incluyendo antigenos tales como patógenos (por ejemplo, bacterias, virus, protozoarios, levaduras, u hongos) , antígenos de tumores, receptores, enzimas, citosina, etcétera. Los patógenos ejemplares para la producción de anti-cuerpos incluyen, sin limitación, virus de hepatitis (por ejemplo, hepatitis C) , virus de inmunodeficiencia (por ejemplo, VIH), virus de herpes, parvovirus, enterovirus, virus de ébola, virus de rabia, virus de sarampión, virus de vacuna, estreptococo (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae) , Hemófilo (por ejemplo, Haemophil us infl uenza) , Neisseria (por ejemplo, Hei sseria meningi ti s) , Coryunebacteri um diph teriae, Haemofil us (por ejemplo, Haemophil us pertussi s) , Cl ostri di um (por ejemplo, Cl ostridi um bot ulini um) , estafilococo, pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa ) , y virus sincitial respiratorio (RSV) . Uno o más patógenos se pueden administrar al ungulado transgénico para generar suero hiper-inmune útil para la prevención, estabilización, o tratamiento de una enfermedad específica. Por ejemplo, patógenos asociados con infección respiratoria en niños se pueden administrar a un ungulado transgénico para generar anti-suero reactivo con estos patógenos (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae, Haemophil us infl uenza, y/o Nei ssari a meningi ti s) . Estos patógenos opcionalmente pueden ser tratados para reducir su toxicidad (por ejemplo, mediante exposición al calor o a químicos tales como formaldehido) antes de la administración al ungulado. Para la generación de un aspecto amplio de una inmunoglobulina, una variedad de patógenos (por ejemplo, patógenos bacterianos y/o virales múltiples) se pueden administrar a un ungulado transgénico. Este suero hiper-inmune se puede usar para prevenir, estabilizar o tratar infección en mamíferos (por ejemplo, humanos) y es particularmente para tratar mamíferos con inmunodeficiencias genéticas o adquiridas. Además, los anti-cuerpos producidos por los métodos de la invención se pueden usar para suprimir al sistema inmune, por ejemplo, para tratar neuropatías, así como para eliminar células humanas particulares y modular moléculas especiales. Por ejemplo, anti-cuerpos anti-idiotípicos (es decir, anti-cuerpos que inhiben a otros anti-cuerpos) y anti-cuerpos que reaccionan con las células T, las células B, o citosina pueden ser útiles para el tratamiento de la enfermedad auto-inmune o neuropatía (por ejemplo, neuropatía debida a inflamación) . Estos anticuerpos se pueden obtener a partir de ungulados transgénicos a los que no se les ha administrado un antígeno, o pueden ser obtenidos de ungulados transgénicos a los que se les ha administrado un antígeno como células B, células T, o citosina (por ejemplo, TNFa) . Los anti-sueros transgénicos generados a partir de ungulados transgénicos a los que no se les ha administrado un antigeno se pueden usar para fabricar productos farmacéuticos que comprenden anti-cuerpos policlonales humanos, preferiblemente moléculas de IgG humanas. Estos anti-cuerpos humanos se pueden usar en lugar de anti-cuerpos aislados a partir de humanos tales como terapias de inmunoglobulina intravenosa (IVIG). El anti-suero transgénico opcionalmente puede enriquecerse para anti-cuerpos reactivos contra uno o más antígenos de interés. Por ejemplo, el anti-suero se puede purificar usando técnicas estándares tales como las descritas por Ausubel y colaboradores (Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13.3, John Wiley & Sons, 1995). Los métodos preferidos de purificación incluyen precipitación usando cuentas recubiertas de antígeno o anti-cuerpo, columna de cromatografía tal como la cromatografía por afinidad, purificación de afinidad de cuentas magnéticas, y paneo con un antígeno ilimitado en placa. Adicionalmente, el anti-suero transgénico se puede poner en contacto con uno o más antígenos de interés, y los anti-cuerpos que enlazan un antígeno se pueden separar de los anti-cuerpos no pegados basándose en el tamaño aumentado del complejo anti-cuerpo/antigeno . También se puede usar proteína A y/o proteína G para purificar moléculas de IgG. Si la expresión de los anti-cuerpos endógenos no se elimina, la proteina A y/o el anti-cuerpo contra la lambda de cadena ligera de inmunoglobulina humana (Pharmingen) se puede usar para separar los anti-cuerpos humanos deseados de los anti-cuerpos de ungulado endógenos o los anti-cuerpo quiméricos ungulado/humanos . La proteina A tiene mayor afinidad para la cadena pesada de inmunoglobulina humana que para la cadena pesada de inmunoglobulina bovina y se puede usar para separar las moléculas de inmunoglobulina deseadas que contienen dos cadenas pesadas humanas de otros anti-cuerpos que contienen una o dos cadenas pesadas de ungulados. Un anti-cuerpo contra una lambda de cadena ligera de inmunoglobulina humana se puede usar para separar moléculas de inmunoglobulina deseadas que tienen dos cadenas lambda de inmunoglobulina humana de las que tienen una o dos cadenas ligeras de inmunoglobulina de un ungulado. Adicionalmente o alternativamente, uno o más anti-cuerpos que son específicos para cadenas pesada o ligera de inmunoglobulina de ungulado se pueden usar en un paso de selección negativa para remover las moléculas de inmunoglobulina que contienen una o dos cadenas pesadas y/o ligeras de ungulado. Los anti-sueros resultantes pueden usarse para la inmunización pasiva contra un antígeno. Alternativamente, los anti-sueros tiene uso de diagnóstico, profiláctico, o purificación como por ejemplo para alcanzar la purificación de los antigenos. Alternativamente, después de la administración de los anti-sueros, se pueden aislar la célula B del bovino transgénico y usarse para la preparación de hibpdoma. Por ejemplo, se pueden usar técnicas estándares para fusionar una célula B de un ungulado transgénico con un mieloma para producir un hibridoma que secrete un anti-cuerpo monoclonal de interés (Mocikat, J. Immunol. Methods 225:185-189, 1999; Jonak y colaboradores, Hum. Antibodies Hybridomas 3:177-185, 1992; Srikumaran y colaboradores, Science 220:522, 1983) . Los hibpdomas preferidos incluyen los generales de la fusión de una célula B con un mieloma a partir de un mamífero del mismo género o especie que el ungulado transgénico. Otros mielomas preferidos son de un ratón Balb/C o un humano. En este caso, se proporcionan hibridomas para hacer anti-cuerpos monoclonales xenógenos contra un antígeno particular. Por ejemplo, esta tecnología se puede usar para producir anti-cuerpos monoclonales humanos, de gatos, perros, etcétera (dependiendo del cromosoma artificial específico) que son específicos a los patógenos. Las moléculas para seleccionar hibridomas que producen anti-cuerpos que tienen propiedades deseables, es decir, afinidad de enlace aumentado, avidez, son bien conocidos. Alternativamente una célula B a partir de un ungulado transgénico se puede modificar genéticamente para expresar un oncógeno, tal como ras, myc, abl, bcl2, o neu, o infectarse con un virus ADN o ARN de transformación, tal como el virus Epstein Barr el virus SV40 (Kumar y colaboradores, Immunol . Lett. 65:153-159, 1999; Knight y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3130-3134, 1998; Shammah y colaboradores, J. Immunol . Methods 160-19-25, 1993; Gustafsson y Hinhula, Hum. Antibodies Hybridomas 5:98-104, 1994; Kataoka y colaboradores, Differentiation 62:201-211, 997; Chatelut y colaboradores, Scand. J. Immunol. 48:659-666, 1998). Las células B resultantes inmortalizadas también se pueden usar para producir una cantidad teóricamente ilimitada de anti-cuerpo. Debido a que la inmunoglobulina también se secreta en la leche de los ungulados, la leche de ungulado también se puede usar como fuente de anticuerpos xenógenos. Aunque la invención se describa adecuadamente anteriormente, los siguientes ejemplos se proporcionan adicionalmente como ejemplificación adicional de la invención. EJEMPLO 1: Knockout IgM Bovino Se usaron los siguientes procedimientos para generar líneas celulares de fibroblastos bovinos en los cuales un alelo en el lugar de cadena pesada (mu) de inmunoglobulina se interrumpe por la recombinación homologa. Una construcción de ADN para efectuar un knockout IgM se generó mediante la remoción de los exones 1-4 del lugar Mu (que corresponde al gen de cadena pesada de IgM) que fueron remplazados con una copia de un gen con resistencia a la neomicina. Usando esta construcción, las líneas celulares resistentes a la neomicina se han obtenido que fueron exitosamente usadas en procedimientos de transferencia nuclear, y blastocitos de estas líneas celulares se han implantado en las vacas receptoras. Adicionalmente, algunos de estos blastocitos fueron probados para confirmar que la inserción dirigida ocurría adecuadamente en el lugar mu usando procedimientos de reacción de cadena de polimerasa. Los blastocitos resultantes de los procesamientos de transferencia nuclear a partir de varias líneas celulares obtenidas indicaron que los efectos knockout IgM heterocigotos estaban en gestación. Adicionalmente, tanto en lineas celulares masculinas como femeninas que comprende un solo knockout de cadena pesada de IgM (mu) fueron producidas. Se anticipa que la cruza de animales clonados de estas líneas celulares dará lugar a progenie en donde ambas mu están inactivadas. Estos procesamientos se discuten en mayor detalle más adelante. Construcción de ADN El ADN usado en todas las transíecciones descritas en este documento se generó como sigue. Los principales cuatro exones (excluyendo los exones del dominio de la transmembrana) , CH1-4, son flanqueados por un sitio de restricción Xhol en el extremo corriente abajo (CH4) y en un sitio Xbal en el extremo de corriente (CH1) . La construcción usada para el procesamiento de transfección consistió en 1.5 kilobases de secuencia genómica corriente abajo del sitio Xhol y 3.1 kilobases de secuencia genómica corriente arriba del sitio Xbal (Figuras 3D y 3E) . Estas secuencias se aislaron como se describe en la presente de una vaca Holstein de un ganado lechero en Massachusetts. Se insertó un marcador de resistencia a la neomicina entre estos dos fragmentos sobre un fragmento de 3.5 kilobases, remplazando 2.4 kilobases de ADN, que originalmente contenían CH1-4, de la secuencia genómica originadora. La estructura central del vector fue pBluescriptII SK+ (Stratagene) y la inserción de 8.1 kilobases fue purificada y usada para la transfección de fibroblastos fetales bovinos. Esta construcción se muestra en las Figuras 3A-3C. Otras construcciones knockout mu que contenían otras regiones homologas y/o contenían otro gen de resistencia al antibiótico también fueron construidas usando métodos estándares y usados para mutar un gen de cadena pesada mu endógeno. Procesamientos de Transfección/Knockout La transfección de bovino fetal fue realizada usando un reactivo comercial, Reactivo de Transfección Superfect (Qiagen, Valencia, California, Estados Unidos), número de catálogo 301305. Se generaron fibroblastos bovinos a partir de ganado Charláis machos probados de enfermedad en una instalación en Kansas de Hematech' s y se enviaron a los laboratorios de Biología Molecular Worcester de Hematech' s para su uso en todos los experimentos descritos. Cualquier otra raza de ungulado, género, o especie puede ser usada como la fuente de células donantes (por ejemplo, células somáticas tales como fibroblastos fetales) . Las células donantes se modifican genéticamente para contener una mutación que reduce o elimina la expresión de inmunoglobulina endógena, funcional. EL medio usado para el cultivo de fibroblastos fetales bovinos consistió en los siguientes componentes: 500 ml de MEM Alfa (Bio-Whittaker # 12-169F); 50 ml de suero de becerro fetal (Hy-Clone #A-1111-D) ; 2 ml antibiótico/antimiótico (Gibco/BRL #15245-012); 1.4 ml de 2-mercaptoetanol (Gibco/BRL #21985-023); 5.0 ml de L-Glutamina (Sigma Chemical #G-3126); y 0.5 ml de tartrato de tirosina (Sigma Chemical #T-6134) . El dia anterior a los procesamientos de transfección se sembraron células en platos de cultivo de tejido de 60 mm con una confluencia seleccionada de 40-80?, como se determina por examen microscópico . El día de la transíección, 5 microgramos de ADN, llevado a volumen total de 150 microlitros de medio libre de antibiótico, sin suero, se mezcló con 20 microlitros de reactivo transfección Superfect y se dejó asentarse a temperatura ambiente durante 5-10 minutos para la formación del complejo ADN- ?uperfect. Mientras la formación del complejo se estaba llevando a cabo, se removió el medio del plato de cultivo de tejido de 60 ml que contenia fibroblastos bovinos para ser transíectados, y las células se enjuagaron una vez con 4 ml de solución salina regulada de fosfato. Un ml de medio de cultivo se añadió a 170 microlitros de la mezcla de ADN/Superfect e inmediatamente se transfirió a las células en el plato de 60 mm. Las células incubaron a 38.5°C, 50/, bióxido de carbono durante 2.5 horas.

Después de la incubación de las células con los complejos de ADN/Superfect, el medio fue aspirado y las células fueron lavadas cuatro veces con 4 ml de solución regulada de fosfato. Cinco ml de medio completo se añadieron y los cultivos se incubaron durante la noche a 38.5°C, 5 por ciento de CO . Las células se lavaron una vez con suero regulado de fosfato y se incubaron con un ml de 0.3 por ciento tripsina en suero regulado de fosfato a 37°C hasta que las células fueron desprendidas de la placa, como se determinó por observación microscópica. Las células de cada plato de 60 mm se dividieron en 24 pozos de un plato de cultivo de tejido de 24 pozos (41.7 µl/pozo) . Un ml de medio de cultivo de tejido se añadió para pozo y las placas se dejaron incubar durante 24 horas a 38.5°C y 5 por ciento de C02 durante 24 horas. Durante todos los procesamientos de transíección, se realizaron transfecciones falsas usando una mezcla de Superfect/Suero regulado de fosfato que no contenia ADN, ya que ninguna de esas células se esperaría gue contuviera el gen resistente a la neomicina y todas las células se esperaría que murieran después de la adición de G418 al medio de cultivo de tejido. Esto sirvió como un control negativo para la selección positiva de células que recibieron el ADN. Después de una incubación de 24 horas, uno o más ml de medio de cultivo de tejido que contenía 400 microgramos de G418 se añadió para pozo, llevando a la concentración final de G418 a 200 microgramos/ml. Las células se colocaron de nuevo en el incubador durante 7 días de selección de G418. Durante este periodo, tanto las placas de transfección como las placas de transfección falsa fueron monitoreadas para determinar la muerte celular y durante 7 días la vasta mayoría de pozos de las transíecciones falsas no contenían células vivas mientras que las placas que contenían células que recibieron el ADN mostraron excelente cultivo celular. Después del periodo de selección de 7 dias las células de los pozos a confluencia de 90-100 por ciento fueron desprendidas usando 0.2 ml 0.3 por ciento tripsina en suero regulado de fosfato y se transfirieron a platos de cultivo de tejido de 35 mm para la expansión y se incubaron hasta que se volvieron 50 por ciento confluentes, en ese momento las células fueron tripsinizadas con 0.6 ml 0.3 por ciento de tripsina en suero regulado de fosfato. De cada placa de cultivo de tejido de 35 mm, 0.3 ml de la suspensión de células de 0.6 ml se transfirió a un matraz de cultivo de tejido de 12.5 cm; para la expansión adicional. Los 0.3 ml restantes fueron resembrados en platos de 35 mm y se incubaron hasta que alcanzaron una confluencia mínima de aproximadamente el 50 por ciento, en ese momento las células de las placas fueron procesadas para la extracción de ADN para análisis de reacción de cadena de polimerasa. Los matraces de cada línea fueron retenidos en el incubador hasta que sufrieron estos análisis y se determinó si tenían o no la integración de ADN deseada o se mantuvieron para la transferencia nuclear futura y la crio-preservación. Análisis para integraciones dirigidas Como se describió anteriormente la fuente de ADN para analizar los transfectantes que contenían la construcción de ADN fue un plato de cultivo de tejido de 35 mm que contenía un pasaje de las células que se van a analizar. El ADN se preparó como sigue y se adaptó de un procesamiento publicado por Laird y colaboradores (Laird y colaboradores, "Simplified mammalian DNA isolatíon procedure", Nucleic Acids Research, 19:4293). En pocas palabras, el ADN se preparó como sigue. Se preparó un regulador de lisis celular con los siguientes componentes: 100 mM Tris-HCl regulador, pH 8.5; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.2 por ciento dodecil sulfato de sodio; 200 mM NaCl; y 100 µg/ml proteinasa K. El medio se aspiró de cada plato de cultivo de tejido de 35 mm y se reemplazo con 0.6 ml del regulador anterior. Los platos se colocaron de nuevo en el incubador durante tres horas, durante este tiempo la lisis celular y la digestión de proteínas se dejó que ocurriera. Después de esta incubación, el Usado fue transferido a un tubo de micrófuga de 1 , 5 ml y se añadió 0.6 ml de isopropanol para precipitar el ADN. Los tubos fueron sacudidos por inversión y se dejó que se asentaran a temperatura ambiente durante 3 horas, después de lo cual los precipitados de ADN fueron centrifugados en una micro-centrífuga a 13,000 rpm durante diez minutos. El sobrenadante de cada tubo fue descartado y los aglomerados se enjuagaron con 70 por ciento de etanol una vez. El 70 por ciento de etanol fue aspirado y los aglomerados de ADN fueron dejados secar al aire. En cuanto estuvieron secos, cada aglomerado fue re-suspendido en 30-50 µl de Tris (10 mM) -EDTA (1 mM) regulador, pH 7.4 y se dejaron hidratar y solubilizar durante la noche. 5-7 microlitros de cada solución de ADN se usó para cada procesamiento de reacción de cadena de polimerasa (PCR) . Dos procesamientos de reacción de cadena de polimerasa separados se usaron para analizar los transfectantes. El primer procesamiento usó dos cebadores que se esperó que recocieran sitios que están localizados dentro del ADN usado para la transfección. La primer secuencia de cebador es homologa con el cassette de resistencia a la neomicma de la construcción de ADN y la segunda se localiza aproximadamente 0.5 kilobases más lejos, dando como resultado un producto de reacción de cadena de polimerasa corto de 0.5 kilobases. En particular, los cebadores neol (5'CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3'. SEQ ID NO: 42) y IN2521 (5'-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3', SEQ ID NO: 43) se usaron. Un juego de reacción de cadena de polimerasa Qiagen se usó para esta reacción de cadena de polimerasa. La mezcla de la reacción de cadena de polimerasa contenía 1 pmole de cada cebador, 5 µl de regulador de reacción 10X, 10 µl de solución Q, 5 µl de ADN, y 1 µl de solución dNTP. La mezcla de la reacción se llevó un volumen total de 50 µl con H O. Esta amplificación de reacción de cadena de polimerasa se realizó usando una incubación desnaturalizante inicial a 94°C durante 2 minutos. Luego, 30 ciclos de desnaturalización, recocido, y amplificación se realizaron mediante incubación a 94°C durante 45 segundos, 60°C durante 45 segundos, y 72°C durante dos minutos. Luego, la mezcla de la reacción se incubó a 72°C durante cinco minutos y a 4°C hasta que la mezcla fue removida de la máquina de reacción de cadena de polimerasa. Alternativamente, cualquier otro cebador que es homólogo a la región de la construcción knockout que se integra en el genoma de las células se puede usar en una reacción de cadena de polimerasa estándar bajo condiciones de reacción adecuadas para vivificar que las células que sobreviven la selección de G418 fueron resistentes como resultado de la integración de la construcción de ADN. Debido a que solamente un pequeño porcentaje de transfectantes se esperarla que contuviera una integración de ADN en el lugar deseado (el lugar Mu) , se usó otro par de cebadores para determinar no sólo que el ADN introducido estuviera presente en el genoma de los transfectantes, sino también que estuviera integrado en el lugar deseado. El procesamiento de reacción de cadena de polimerasa usado para detectar la integración adecuada se realizó usando un cebador localizado dentro del cassette de resistencia a la neomicina de la construcción de ADN y un cebador que se esperarla que se recociera sobre 1.8 kilobases más lejos, pero sólo si el ADN se había integrado en el ciclo adecuado del lugar de IgM (ya gue la región homologa estaba fuera de la región incluida en la construcción de ADN usada para la transfección) . El cebador fue diseñado para recocerse a la secuencia de ADN inmediatamente adyacente a las secuencias representadas en la construcción de ADN si tuviera gue integrarse en el lugar deseado (la secuencia de ADN del lugar, tanto dentro de la región presente en la construcción de ADN como adyacente a ellos en el genoma que fue previamente determinado) . En particular, los cebadores Neol y OUT3570 (5'-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAÁ GTC TGT C-3', SEQ ID NO: 44) se usaron para este análisis. Esta reacción de cadena de polimerasa se realizó usando un juego de reacción de cadena de polimerasa Quiagen como se describió anteriormente para la primera reacción de cadena de polimerasa para confirmar la integración de la construcción objetivo en las células. De manera alternativa, este análisis de reacción de cadena de polimerasa se puede realizar cualquier condición de reacción adecuada con cualquier otro cebador que sea homólogo a una región de la transcripción knockout que se integra en el genoma de la célula y cualquier otro cebador que sea homólogo a una región en el genoma de la célula que esté corriente arriba o corriente abajo del sitio de integración. Usando estos métodos, se seleccionaron 135 placas independientes de 35 ml para la integración dirigida de la construcción de ADN en el lugar adecuado. De esas el ADN de ocho placas se determinó que contenia una construcción de ADN seleccionada adecuadamente y de esos tres se seleccionaron para su uso en procesamientos de transferencia nuclear. Las líneas celulares se designaron "8-1C", "5-3C" y "10-1C". Los blastocitos sobrantes no usados para transferirse en las vacas receptoras se usaron para extraer ADN que se sometió a un análisis de reacción de cadena de polimerasa adicional. Este análisis fue efectivo usando un procesamiento de reacción de cadena de polimerasa anidado usando cebadores que también se usaron para el análisis inicial de líneas transfectadas. Como se hizo notar anteriormente, se generaron tres líneas celulares usando la construcción objetivo de gen diseñada para remover los exones 1-4 del lugar mu. Estas líneas todas demostraron ser positivas para inserciones seleccionadas usando un prueba basa en reacción de cadena de poli erasa y se usaron para las transferencias nucleares. Los blastocitos sobrantes resultantes de las transferencias nucleares fueron analizados mediante probar por reacción de cadena de polimerasa la construcción seleccionada adecuadamente. Las siguientes secuencias de blastocitos positivos se obtuvieron: Línea Celular 8-1C: 6/8 Linea Celular 10-1C: 2/16 Línea Celular 5-3C: 0/16 Aunque a los cuarenta días de gestación, se detectaron 11 embarazos totales por ultrasonido, por el dia 60, 7 fetos hablan muerto. Los 4 fetos restantes fueron procesados para regenerar nuevos fibroblastos fetales y los órganos restantes se usaron para producir muestras de tejido pequeño para el análisis por reacción de cadena de polimerasa. Los resultados del análisis son los siguientes: Linea 8-1C: dos fetos, un feto positivo para la inserción objetivo por PCR Linea 10-lC: un feto, positivo para la inserción dirigida mediante PCR. Linea 5-3C: un feto, negativo para la inserción dirigida mediante PCR. Sorprendentemente, aunque la frecuencia de los blastocitos 10-lC que demostraron ser positivos para la inserción objetivo fue solamente de 2/16, el feto viable de 60 dias obtenido de esa linea celular fue positivo como se determinó por reacción de cadena de polimerasa. Un feto positivo de 8-1C también se obtuvo. El análisis de manchado Southern de ADN de todas las muestras de tejido fue efectuado para verificar que la construcción no sólo seleccionó correctamente en un extremo (la cual se determinó mediante reacción de cadena de polimerasa de la región más corta de homología presente en la construcción original) pero también en el otro extremo. Basándose en los resultados hasta la fecha, se cree que dos fetos knockout de cadena pesada de dos eventos de integración independientes han sido producido. También, ya que estos fetos se derivaron de dos diferentes líneas, cuando menos uno es probable que tenga correctamente integrada la construcción en ambos extremos. En cuanto los análisis de manchado Southern han confirmado la selección adecuada de ambos extremos de la construcción objetivo, serán realizadas otras transferencias nucleares para generar fetos adicionales que llegarán a término. Transferencia Nuclear y Transferencia de Embrión Se realizaron transferencias nucleares con la linea celular K/0 (8-l-C(18)) y se produjeron ocho embriones. Un total de seis embriones de este lote fue transferido a tres receptores libres de enfermedad en Trans Ova Genetics ("TOG"; Iowa) . Embriones congelados han sido transferidos a diez receptores libres de enfermedad para obtener lineas celulares de fibroblastos hembras libres de enfermedad. Las recuperaciones fetales fueron programadas después de confirmar los embarazos a los 35-40 dias. Diagnóstico de Embarazo y Recuperación Fetal El estado de embarazo de 18 receptores transferidos con embriones clonados de células fetales knockout fue verificado por ultrasonografí . Los resultados se resumen enseguida.

Tabla 2 Embarazo a los 40 dias usando células donantes knockout de cadena pesada mu ID Clona No. Receptoras Embarazo a los 40 transferidas días { ) 8-1-0C 5 4(80) 10-1-C 6 4(67) 5-3-C 5 3(60) Total 16 11(69) Diagnóstico de Embarazo El estado de embarazo de tres receptores a los cuales se transfirieron embriones clonados de células knockout (8-1C) fue verificado; uno fue abierto y los otros dos requirieron re-confirmación después de un métodos Recuperaciones fetales y establecimiento de lineas celulares Once embarazos con los embriones knockout a los 40 se obtuvieron. Cuatro fetos vivos fueron removidos de estos a los 60 dias. Se establecieron lineas celulares de los cuatro y se crio-preservaron para uso futuro. También se recolectaron y se congelaron inmediatamente muestras de tejido de los fetos y se enviaron al laboratorio de biología molecular Hematech para análisis de reacción de cadena de polimerasa/manchado Southern. Las cuatro lineas celulares fueron masculinas. Con el fin de asegurar una linea celular femenina, se establecieron lineas celulares y se crio-preservaron para el establecimiento futuro de células knockout de los fetos (seis) recolectados a los 55 días de gestación de los embarazos establecidos en Trans Ova Genetics con receptores libres de enfermedad. Recientemente, la existencia de una línea celular femenina que contenía knockout mu fue confirmada. Esta línea celular femenina se usó para producir animales clonados que pueden se apareados con animales generados de las lineas celulares machos, y la progenie analizarse para determinar los gue contengan el knockout doble mu . EJEMPLO 2: Introducción del Cromosoma Artificial Humano Se llevaron a cabo experimentos adicionales para demostrar que la cadena pesada de inmunoglobulina (mu) y la cadena ligera lambda se pueden producir por un anfitrión bovino, ya sea sólo o en combinación. Además, estos experimentos demostraron que las cadenas de inmunoglobulina fueron re-acomodadas y que se obtuvo suero policlonal. En estos procesamientos, los genes que expresan inmunoglobulina se introdujeron en fibroblastos bovinos usando cromosomas artificiales humanos. Los fibroblastos se utilizaron entonces para la transferencia nuclear, y se obtuvieron fetos y se analizaron para determinar la producción de anti-cuerpos. Estos procesamientos y resultados se describen en mayor detalle más adelante . Construcciones de Cromosoma Artificial Humano Los cromosomas artificiales humanos (HAC) fueron construidos usando un sistema de clonación de cromosoma descrito anteriormente (Kuroiwa y colaboradores, Nature Biotech. 18: 1086-1090, 2000) . En breve, para la construcción del ?HAC, el fragmento 22 del cromosoma humano anteriormente reportado (hChr22) que contenía una secuencia loxP integrada en el lugar HCF2 fue truncada en el lugar AP000344 mediante una truncación cromosomal dirigida por telómero (Kuroiwa y colaboradores, Nucleic Acid Res. , 26: 3447-3448, 1998). Enseguida, se formaron híbridos celulares fusionando la clona de célula DT40 que contenía el fragmento hChr22 anterior (hcF22) truncado en el lugar AP000344 con una clona de célula DT40 (denotada "clona R") que contenía el vector SC20 mini-cromosoma humano transmisible-línea germinal y estable. El vector SC20 se generó insertando una secuencia loxP en el lugar RNR2 del fragmento S20. El fragmento SC20 es un fragmento que se presenta naturalmente derivado del cromosoma humano 14 que incluye la región entera del gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana (Tomizuka y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:722, 2000). Los híbridos celulares DT40 resultantes contenían ambos fragmentos hChr. Los híbridos DT40 fueron transfectados con un vector de expresión de recombmasa Cre para inducir la translocación cromosomal mediana por loxP/Cre entre hCF22 y el vector SC20. Los transíectantes estables fueron analizados usando reacción de cadena de polimerasa anidada para confirmar la clonación de las 2.5 megabases de la región hChr22, definida por los lugares HCF2 y AP000344, en el ciclo de clonación loxP en el vector SC20. Las células positivas por reacción de cadena de polimerasa que se esperaba que contenían ?HAC fueron aisladas entonces mediante clasificación FACS basado en la fluorescencia de la proteina fluorescente verde codificada. El análisis de hibridación fluorescente en el sitio (FISH) de las células clasificadas también se usó para confirmar la presencia de ?HAC que contiene la inserción hChr22 de 2.5 megabases. De manera similar, también se construyó el ??HAC usando este sistema de clonación de cromosomas. El fragmento hChr22 fue truncado en el lugar AP000344, y luego la secuencia loxP fue integrada en el lugar AP000553 mediante recombinación homologa en las células DT40. Las células resultantes se fusionaron con la clona R que contenia el vector mini-cromosoma SC20. Los híbridos celulares fueron transíectados con un vector de expresión Cre para permitir la translocación cromosomal mediada por Cre/loxP.

La generación del ??HAC gue contenia el inserto hChr22 de 1.5 megabases, definido por los lugares AP000553 y AP000344, fue confirmada por reacción de cadena de polimerasa y análisis FISH. La funcionalidad de ?HAC y ??HAC in vivo fue valorada mediante la generación de ratones quiméricos que contenían estos cromosomas artificiales humanos. Estos cromosomas artificiales humanos se introdujeron individualmente en células tallo embriónico de ratón (ES) , las cuales se usaron entonces para la generación de ratones quiméricos usando procesamientos estándares (patente japonesa 2001-142371; presentada el 11 de mayo de 2000) .

Los ratones resultantes tuvieron un alto grado de quimerismo (85-100% de color de pelo), demostrando un alto nivel de pluripotencia de las células de tallo embriónico que contenían estos cromosomas artificiales humanos y la estabilidad mitópica de estos cromosomas artificiales humanos en vivo. Además, ?HAC fue transmitido a través de la línea germinal del ratón quimérico ?HAC a la siguiente generación, demostrando la estabilidad mitótica de este cromosoma artificial humano. Células DT40 de pollo que retenían estos cromosomas artificiales humanos han sido depositados bajo el Tratado de Budapest el 9 de mayo de 2001 en el Depósito de Organismos de Patentes Internacionales, el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japón. Los números de depósito son los siguientes: ?HAC (FERM BP-7582), ??HAC ( FERM BP-7581), y fragmento SC20 (FERM BP-7583). Células DT40 de pollo que retienen estos cromosomas artificiales humanos también han sido depositadas en el Instituto de Investigación y Desarrollo para la Industria de los Alimentos (FIRDI) en Taiwán. Los números de depósito y las fechas son las que siguen: ?HAC (CCRC 960144; 9 de noviembre de 2001), ??HAC (CCRC 960145; 9 de noviembre de 2001), y el fragmento SC20 (la linea celular se depositó bajo el mismo nombre SC20 (D) ; CCRC 960099; 18 de agosto de 1999) . El inserto hChr22 de 2.5 megabases (Mb) en el ?HAC está compuesto de los siguientes contiguos BAC, que están listados por número de acceso en Genbank: AC002470, AC002472, AP000550, AP000551, AP000552, AP000556, AP000557, AP000558, AP000553, AP000554, AP000555, D86995, D87019, D87012, D88268, D86993, D87004, D87022, D88271, D88269, D86989, D88270, D87003, D87018, D87016, D86999, D87010, D87009, D87011, D87013, D87014, D86991, D87002, D87006, D86994, D87007, D87015, D86998, D87021, D87024, D87020, D87023, D87017, AP000360, AP000361, AP000362, AC000102, U07000, AP000343, y AP000344. El Inserto hChr22 de 1.5 megabases en ??HAC está compuesto de los siguientes contiguos de BAC: AP000553, AP000554, AP000555, D86995, D87019, D87012, D88268, D86993, D87004, D87022, D88271, D88269, D87000, D86996, D86989, D88270, D87003, D87018, D87016, D86999, D87010, D87009, D87011, D87013, D87014, D86991, D87002, D87006, D86994, D87007, D87015, D86998, D87021, D87024, D87020, D87023, D87017, AP000360, AP00361, AP000362, AC000029, AC000102, U07000, AP000343 y AP000344 (Dunham y colaboradores, Nature 402:489-499, 1999). Generación de Fibroblastos Fetales Bovinos Para generar fibroblastos fetales bovinos, fetos de los días 45 a 60 fueron recolectados de vacas Holstein o Jersey probadas para determinar enfermedades alojadas en Trans Ova (lowa), en las cuales el pedigrí de los padres macho y hembra fue documentado por tres generaciones consecutivas. Los fetos recolectados fueron enviados en hielo húmedo a la División de Biología Molecular de Worcester de Hematech para la generación de fibroblastos fetales primarios. Después de llegar, el o los fetos fueron transferidos a un grado de cultivo de no tejido, platos de petri de plástico de 100 mm en un capuchón de cultivo de tejido. Usando fórceps y tijeras estériles, se removieron la membrana estraembriónica y el cordón umbilical del feto. Después de transferir al feto a un nuevo plato de petri de plástico, la cabeza, las extremidades y los órganos internos fueron removidos. El feto sin visceras fue transferido a un tercer plato de petri que contenía aproximadamente 10 ml de solución de enjuague de feto compuesta de: 125 ml de IX de solución regulada de fosfato de Dubelcco con Ca- ' y Mg2+ (Gibco-BRL, cat#. 14040); 0.5 ml de tartrato de tilosina (8 mg/ml, Sigma, ca#. T-3397); 2 ml de penicilan-estreptomicina /Sigma, cat# P-3539) ; y 1 ml de fungizona (Gibco-BRL, cat#. 15295-017) (mezclado y filtrado a través de una unidad de filtro de nilón de 0.2 mieras [Nalgene, cat#. 150-0020) . El feto se lavó tres veces más con la solución de enjuague de feto para remover trazos de sangre, se transfirió a un tubo de cultivo de tejido cónico de 50 ml, y se rebanó finamente en pedazos pequeños con un escalpelo estéril. Los pedazos de tejido se lavaron una vez con suero regulado de fosfato de Dulbecco IX sin Ca+ y Mg:+ (Gibco-BRL, cat#. 14190). Después los pedazos de tejido se pusieron al fondo del tubo, el sobrenadante fue removido y reemplazado con aproximadamente 30 ml de regulador de disociación de células (Gibco-BRL, cat#. 13151-014) . El tubo se invirtió varias veces para permitir la mezcla y se incubó a 38.5°C/5% C0: durante 20 minutos en un incubador de cultivo de tejidos. Después de asentarse el tejido en el fondo del tubo, el sobrenadante se removió y se reemplazó con un volumen equivalente de regulador de disociación de células nueva. La mezcla de regulador de tejido y disociación de células se transfirió a un matraz de tripsinación de vidrio de 75 ml, estéril, (Wheaton Science Products, cat#. 355393) que contenía una barra agitadora, de fondo redondo, de 24 mm. El matraz se transfirió a un incubador de cultivo de tejido a 38.5°C/5% de C02, colocado en una placa de agitación magnética, y se agitó a una velocidad suficiente para permitir el mezclado eficiente durante aproximadamente 20 minutos. El matraz fue transferido a un capuchón de cultivo de tejido; los pedazos de tejido se dejaron que se asentarán, seguidos por la remoción del sobrenadante y la cosecha de las células disociadas mediante centrifugación a 1,200 rpm durante cinco minutos. El aglomerado de células fue re-suspendido en un volumen pequeño de medio de cultivo de fibroblastos completo compuesto de: 440 ml de alfa MEM (BioWhittaker, cat#, 12-169F); 50 ml de suero bovino fetal irradiado; 5 ml de GLUTAMAX-I suplemento (Gibco-BRL, cat#. 25050-061); 5 ml de penicilina-estreptomicina (Sigma, cat#. P-3539) ; 1.4 ml de 2-mercaptoetanol (Gibco-BRL, cat#. 21985-023) (todos los componentes excepto el suero bovino fetal fueron mezclados fueron filtrados a través de 0.2 mieras de unidad de filtro de nilón [Nalgene, cat#. 151-4020]), y almacenado en hielo. El proceso de disociación se repitió tres veces adicionales con 30 ml adicionales de solución de disociación de células durante cada paso. Las células reunieron, se lavaron en medio de fibroblasto completo; se pasaron secuencialmente a través de agujas calibre 23 y 26, y finalmente a través de un colador de celdas de 70 mieras (B-D Falcon, cat#. 352350) para generar una sola suspensión de células. La densidad celular y la viabilidad se determinaron contando en un hemacitómetro en presencia de azul tripano (solución al 0.4?,, Sigma, cat#. T-8154). Los fibroblastos primarios se expandieron a 38.5°C/ 5% C0_ en medio de fibroblastos completo a una densidad celular de 1 x 10h células viables por matraz de cultivo de tejido de 75 cm . Después de 3 días de cultivo o antes de que las células alcanzaran la confluencia, los fibroblastos fueron cosechados enjuagando el matraz una vez con solución regulada de fosfato de Tubelcco IX (sin Ca2+ y Mg ' ) y se incubaron con 10 ml de regulador de disociación de células durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. El desprendimiento de las células se monitoreó visual ente usando un microscopio invertido. En este paso, se tuvo cuidado para asegurar que los aglomerados de células se separaran pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Después del lavado y la cuantificación, los fibroblastos disociados estaban listos para su uso en experimentos dirigidos al gen. Estas células pudieron también crio-preservarse para el almacenamiento a largo plazo. Introducción de los Cromosomas Artificiales Humanos en Fibroblastos Fetales Bovinos ?HAC y ??HAC fueron transferidos de los híbridos celulares DT40 a células de ovario de hámster chino (CHO) usando transferencia de cromosomas mediados por micro-celda (Kuroiwa y colaboradores, Nature Biotech. 18: 1086-1090, 2000). La clona de ovario de hámster chino que contenia ?HAC ("clona D15") fue cultivada en medio F12 (Gibco) suplementado con 10 por ciento de solución reguladora de fosfato (Gibco), 1 mg/ml de G418 y 0.2 mg/ml de higromicina B a 37 °C y 5?, de COr . La clona D15 fue expandida en doce matraces T25. Cuando la confluencia alcanzó 80-907,, se añadió colcemida (Sigma) al medio a una concentración final de 0.1 microgramo/ml . Después de tres días, el medio se intercambió con DMEM (Gibco) complementado con 10 microgramos/ml de citocalacina B (Sigma) . Los matraces se centrifugaron durante 60 minutos a 8,000 rpm para recolectora en micro-células. Las micro-células se purificaron a través de filtros de 8, 5, y 3 mieras (Costar) y luego se re-suspendieron en medio DMEM. Las micro-células se usaron para la fusión con fibroblastos bovinos como se describe más adelante. Fibroblastos fetales bovinos se cultivaron en medio a- MEM (Gibco) suplementado con 10% de solución regulada de fosfato (Gibco) a 37°C y 5% de CO,. Los fibroblastos se expandieron en un matraz T175. Cuando la confluencia alcanzó 70-80%, las células fueron desprendidas del matraz con 0.05?, de tripsina. Las células de fibroblastos se lavaron dos veces con medio DMEM y luego se sobre-extendieron en la suspensión de micro-células. Después de que la suspensión de micro-células-fibroblastos se centrifugó durante cinco minutos a 1,500 rpm, se añadió PEG1500 (Roche) al aglomerado de acuerdo con el protocolo del fabricante para permitir la fusión de las micro-células con los fibroblastos bovinos. Después de la fusión, las células fusionadas se plaquearon en seis placas de 24 pozos y se cultivaron en medio a.MEM suplementado con 10 'i de solución regulada de fosfato durante 24 horas. El medio se intercambió entonces con medio que contenía 0.7 mg/ml de G418. Después del cultivo en presencia del antibiótico G418 durante aproximadamente dos semanas, las células fusionadas, resistentes al G418 se seleccionaron. Estas clonas resistentes al G418 se usaron para la transferencia nuclear, como se describe más adelante. De manera similar, ??HAC a partir de la clona de ovario de hámster chino ??C13 fue transferida a fibroblastos fetales bovinos por medio de MMCT . Las clonas resistentes al G418 seleccionadas se usaron para la transferencia nuclear. Transferencia Nuclear, Activación y Cultivo de Embrión El procedimiento de transferencia nuclear se llevó a cabo esencialmente como se describió anteriormente (Cibelli y colaboradores, Science 1998: 280:1256-1258). Oocitos madurados in vitro fueron enucleados aproximadamente 18-20 horas después de la maduración (hpm) y la remoción del cromosoma fue confirmado por etiquetación con bisBenzimida (Hoechst 33342, Sigma) bajo luz ultravioleta. Estos acoplados de citoplasto-célula donante se fusionaron, usando un pulso eléctrico único de 2.4 kV/cm durante 20 microsegundos (manipulador Electrocell 200, Genetronics, San Diego, California, Estados Unidos) . Después de 3-4 horas, un sub-conjunto aleatorio de 25% de los acoplados transferidos totales se removió, y la fusión fue confirmada mediante etiquetamiento con bisBenzimida del núcleo transferido. A 30 horas post-maduración los oocitos reconstruidos y los controles fueron activados con ionóforo de calcio (5 µM) durante 4 minutos (Cal Biochem, San Diego, California, Estados Unidos) y 10 microgramos de cicloheximida y 2.5 microgramos de Cytochalasin D (Sigma) en un medio de cultivo ACM durante 6 horas como se describió anteriormente (Lin y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 1998: 49:298-307; Presicce y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 1994:38:380-385). Después de la activación los óvulos fueron lavados en medio de cultivo de embrión de hámster regulado HEPES (HECM. Hepes) cinco veces y se colocaron en cautivo en placas de cultivo de tejido de 4 pozos que contenían fibroblastos fetales de ratón irradiados y 0.5 ml de medio de cultivo de embrión cubierto con 0.2 ml de aceite mineral probado de embrión (Sigma) . Veinticinco a 50 embriones fueron colocados en cada pozo y se incubaron a 38.5°C en 5% de C07 en atmósfera de aire. El día cuatro 10% de suero de becerro fetal se añadió al medio de cultivo . Transferencia de Embrión El dia 7 y 8 de transferencia nuclear los blastocitos fueron transferidos a vaquillas receptoras sincronizadas los días 6 y 7, respectivamente. Los animales receptores fueron sincronizados utilizando una sola inyección de Lutalyse (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, Michigan, Estados Unidos) seguido por detección del estro. Los receptores fueron examinados el dia y el dia 60 después de la transferencia de embrión mediante ultrasonografía para detectar la presencia de concepción y después de eso cada 30 días por palpación rectal hasta los 270 días. La retención de un cromosoma artificial humano en estos fetos bovinos se resume en la Tabla 3 y se describe con mayor detalle en las secciones que siguen.

Tabla 3: Resumen de la retención de cromosoma artificial humano en fetos bovinos HAC Clona cu'p/ F'.v-h -i NT Tech a Ldncl l et al " l t-i» 1 on H?C H L ?? 4-12 5580 2/14 4/13 58 + + ?? 2-14 5848 2/15 4/13 57 - - ?? 4-12 5868A 2/14 6/13 119 + + ?? 4-12 5868B 2/14 6/13 119 + + ?? 4-12 5542A 2/14 5/16 91 + + ?? 4-12 5542B 2/14 5/16 91 + + ?? 4-12 5174 2/14 5/16 91 nd nd (anormal) ?? 4-12 6097 2/14 Perma 160 (7/24) nd nd nece ? 4-8 6032 1/31 3/30 58 + + ? 2-13 5983 2/2 3/30 56 - - ? 4-2 5968 2/2 3/30 56 + + ? 2-22 6045 2/2 3/30 56 + + ? 4-8 5846 1/31 4/20 79 - - ? 2-13 6053 2/2 4/27 84 + - ? 4-2 5996 2/1 4/20 77 + - Introducción de un cromosoma artificial humano que contiene un fragmento de cromosoma humano #14 El fragmento SC20, un cromosoma humano fragmento #14 ("hchr .14fg", que contiene el gen de cadena pesada de inmunoglobulina) , fue introducido en células de fibroblasto fetal en sustancialmente la misma manera como se describió anteriormente. Cualquier otro método de transferencia de cromosomas estándar también pudo usarse para insertar este cromosoma artificial humano u otro cromosoma artificial humano que contuviera el gen de inmunoglobulina humana en células donantes. Las células donantes resultantes se pueden usar en técnicas de transferencia nuclear estándares, tales como las descritas anteriormente, para generar ungulados transgénicos con el cromosoma artificial humano. El estado de embarazo de los 28 receptores a los cuales se transfirieron los embriones clonados de células que contenían el hchr.l4fg fue verificado mediante ultrasonografía . Los resultados se resumen en la Tabla 4. Tabla 4: Embarazo a los 40 dias usando células donantes que contienen hchr.l4fg ID Clona No. de receptoras Embarazo a los 40 transferidas días ( ?, ) 2 - 1 08 03 (38) 4 - 2 10 00 (00) 4 - 1 05 00 (00) 4 - 1 03 01 (33) 2 - 1 02 01 (50) 28 01 (18) Las tasas de embarazo fueron menores que lo anticipado.

Se cree que esto se puede atribuir a un clima anormalmente extremadamente caliente durante la transferencia de embriones. Como se ilustra en la Figura 27, las tasas de embarazo para los embriones que tenían el cromosoma artificial humano parecieron ser equivalentes a los embarazos clonados no transgénicos. Un receptor que llevaba un becerro ??HAC recientemente parió un becerro vivo sano. Otros nacerán durante los próximos meses. Demostración de Re-Arreslo y Expresión de Lusar de Cadena Pesada Humana en un Feto Bovino ?HAC Fetos bovinos transgénicos ?HAC clonados fueron removidos a varios dias de gestación y analizados para detectar la presencia, el re-arreglo y la expresión de lugares de inmunoglobulina humana. El análisis de ADN genómico y ADNc obtenido mediante RT-PCR a partir del bazo y tejidos no linfoides (hígado y cerebro) de uno de estos fetos se indicó la presencia, el re-arreglo y la expresión del ?HAC. Presencia de Cadena Ligera y/o Pesada Humana en Fetos ?HAC Para determinar si las cadenas pesada y ligera humanas eran retenidas en fetos ?HAC, el ADN del hígado se aisló a partir de fetos ?HAC y se analizó mediante reacción de cadena de polimerasa para detectar la presencia de ADN genómico que codifica las cadenas pesada y ligera humanas. Para la detección del ADN de cadena pesada genómica, los siguientes cebadores fueron usados: VHE-F 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3' (SEQ ID NO: 1) y VH3-R 5'-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3' (?EQ ID NO: 2) . Los cebadores usados para la detección del ADN de cadena ligera lambda fueron IgL-F 5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3' (SEQ ID NO: 3) e IgL-R 5'-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3' (SEQ ID NO: 4) . Las mezclas de reacción de cadena de polimerasa que contenían 18.9 microlitros de agua, 3 microlitros de 10X regulador Taq, 4.8 microlitros de mezcla dNTP, 10 pmol de cebador hacia adelante y 10 pmol de cebador inverso, un microlitro de ADN genómico, y 0.3 microlitros de Ex Taq. Treinta y ocho ciclos de reacción de cadena de polimerasa se realizaron incubando las mezclas de la reacción en las siguientes condiciones: 85°C durante tres minutos, 94°C durante un minuto, 98°C durante 10 segundos, 56°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos. Como se muestra en la Figura 5, los fetos #5968, 6032 y 6045 contenían tanto lugares de cadena ligera (?) como cadena pesada (µ) . El feto #5996 contenia solamente el lugar de cadena pesada humana. El feto #5983 no contenía la cadena pesada humana y puede no haber contenido la cadena ligera humana. El feto #5846 no contenía ninguna de las dos secuencias humanas. De este modo, los fetos #5983 y 5846 pueden no haber retenido el cromosoma artificial humano. Estos resultados sugieren que ?HAC puede ser establemente retenido hasta el día de gestión número 58 en los bovinos . Presencia de Exones Cmu Humanos en Fetos ?HAC #5996 Los cebadores específicos para una transcripción de ARNm que incluyen porciones de Cmu 3 y Cmu 4 se usaron para determinar si ?HAC estaba presente y expresar transcripciones que codifican la región constante del lugar mu humano del feto #5996.

Para este análisis RT-PCR de la región constante genómica de la cadena pesada mu humana, se usaron los cebadores "CH3-F1" (5'accacctatgacagcgtgac-3' . SEQ ID NO: 5) y "CH4-R2" (5 -gtggcagcaagtagacatcg-3' , SEQ ID NO: 6) para generar un producto de RT-PCR de 350 pares de bases. Esta amplificación por reacción de cadena de polimeraea se realizó mediante una incubación de desnaturalización inicial a 95°C durante cinco minutos. Luego, se realizaron 35 ciclos de desnaturalización, recocido, y amplificación mediante la incubación a 95°C durante un minuto, 59°C durante un minuto, y 72°C durante dos minutos.

Luego, las mezclas de la reacción se incubaron a 72°C durante 10 minutos. La cadena pesada bovina re-arreglada fue detectada usando los cebadores 17L y P9, como se describe más adelante (Figura 7). Como un control interno, se detectaron niveles de ARN de GAPDH usando los cebadores "GAPDH hacia adelante" (5'-gtcatcatctctgccccttetg-3' , SEQ ID NO: 7) y "GAPDH inverso" (5'-aacaacttcttgatgtcatcat-3' , SEQ ID NO: 8). Para esta amplificación del ADN GAPDH, las muestras se incubaron a 95°C durante cinco minutos, seguido por 35 ciclos de incubación a 95°C durante un minuto, 55°C durante un minuto, y 72°C durante dos minutos. Luego, las mezclas se incubaron a 72°C durante siete minutos . Este análisis mostró que el análisis RT-PCR del bazo del feto #5996 produjo una banda (franja 3) que coincide con los productos de la amplificación generados usando el ADNc de bazo -inhumano de control (franja 4) y el ADNc obtenido de un ratón quimérico ?HAC (franja 5) (Figura 6) . Ninguna banda de éstas fue detectada en tejidos no linfoides: hígado bovino (franja 1) o cerebro bovino (franja 2) . La capacidad de estos te idos para soportar la RT-PCR fue mostrada por la amplificación exitosa del gen doméstico, GADPH, tanto en hígado (franja 10 de la Figura 6) como en cerebro (franja 6 de la Figura 7) . Re-Arreglo del Lugar de Cadena Pesada Bovina por 77 Dias de Gestación El feto ?HAC #5996 fue probado para determinar si había sufrido los procesos de desarrollo necesarios para la expresión de activación del sistema de recombinación requerido para el rearreglo del lugar de cadena pesada de inmunoglobulina. Para este análisis, se realizó un análisis de RT-PCR estándar para detectar la presencia de transcripciones de ARNm que codifican los rearreglos mu-VH. El ARN aislado del bazo, hígado, y cerebro del feto #5996 se analizó mediante RT-PCR usando los cebadores "17L" (5' -ccctcctctttgtgctgtca-3' , SEQ ID NO: 9) y "P9" (5'-caccgtgctctcatcggatg-3' , SEQ ID NO: 10). Las mezclas de la reacción de cadena de polimerasa se incubaron a 95°C durante 3 minutos, y luego 35 ciclos de desnaturalización, recocido, y amplificación se realizaron usando las siguientes condiciones: 95 centígrados durante un minuto, 58°C durante un minuto, y 72°C durante dos minutos. La mezcla de la reacción se incubó a 72°C durante 10 minutos.

La franja 5 de la Figura 7 muestra que un producto del tamaño esperado para la amplificación de una cadena pesada bovina re-arreglada (450 pares de bases) se obtuvo. Este producto migró a una posición equivalente a las del ADNc de cadena pesada Cmu bovino de control conocido por contener secuencias correspondientes a las transcripciones de cadena pesada bovina re-arregladas (franja 7). Como se espera, la cadena pesada re-arreglada fue expresada en el bazo (franja 5), pero ausente del cerebro (franja 2) e hígado (franja 3) en este punto de desarrollo. Re-Arreglo y Expresión del Lugar de Cadena Pesada Humana en el Feto ?HAC #5996 El re-arreglo y la expresión del lugar de cadena pesada humana fueron demostrada mediante la amplificación de un segmento de ADN que incluye porciones de las regiones Cmu y VH. Los cebadores específicos para las transcripciones de ADN que incluyen porciones de Cmu (Cmul) y VH (VH3-30) se usaron para determinar las transcripciones de ARN que contenían secuencias Cmu-VDJ humano re-acomodadas estaban presentes (Figura 8) . Para este análisis de RT-PCR, se usaron los cebadores "Cmul" (5' -caggtgcagctggtggagtctgg-3' , SEQ ID NO: 11) y "VH3-30" (5' caggagaaagtgatggagtc-3' , SEQ ID NO: 12) para producir un producto de RT-PCR de 450 pares de bases. Esta RT-PCR se realizó incubando las mezclas de reacción a 95°C durante 3 minutos, seguidos por 40 ciclos de incubación a 95°C durante 30 minutos, 69°C durante 30 minutos y 72°C durante 45 minutos, y un ciclo de incubación a 72 °C durante 10 minutos. Este producto de RT-PCR fue re-amplificado con los mismos cebadores mediante un ciclo de incubación a 95°C durante tres minutos, 40 cíelos de incubación a 95°C durante un minuto, 59°C durante un minuto, 72°C durante un minuto, y un ciclo de incubación a 72°C durante 10 minutos. Como un control interno, se realizó amplificación por RT-PCR del GAPDH como se describe anteriormente. El gel en la Figura 8 muestra que el análisis RT-PCR del bazo del feto #5996 produjo una banda (franja 5) que coincide con los productos de amplificación generados usando ADNc de bazo humano (franja 4) o ADNc de bazo de ratón quimérico ?HAC (franja 1) . Esta banda no fue detectada en hígado bovino (franja 2 ) o en cerebro bovino (franja 3) . Como un control positivo, la amplificación del ARN de GADPH (franjas 8 y 9) mostró la capacidad de estos tejidos para soportar la RT-PCR. El re-arreglo y la expresión de la región de cadena pesada humana en el feto #5996 también se demostró mediante análisis RT-PCR usando los cebadores CH3-F3 (5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA -3', SEQ ID NO: 13) y CH4-R2 (5'-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3' , SEQ ID NO: 14). Estas mezclas de reacción de cadena de polimerasa contenían 18.9 microlitros de agua, 3 microlitros de 10X regulador Ex Taq, 4.8 microlitros de mezcla dNTP, 10 pmol de célula hacia adelante, 10 pmol de célula inverso, 1 microlitro de ADNc, y 0.3 microlitros de Ex Taq. Se realizaron cuatro ciclos de reacción de cadena de polimerasa incubando las mezclas de la reacción bajo las siguientes condiciones: 85 centígrados durante tres minutos, 94°C durante un minuto, 98°C durante 10 segundos, 60°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos. Como se muestra en las franjas 6 y 7 de la Figura 9, una secuencia amplificada del bazo del feto #5996 tuvo el mismo tamaño que los fragmentos de región constante rebanados de los dos controles positivos: una muestra de un bazo humano (franja 8) y un bazo de ratón quimérico ?HAC (franja 9) . Como se espera, los controles negativos de un bazo de ratón normal y un bazo bovino no contenían una secuencia amplificada (franjas 1 y 2) . Muestras del hígado y cerebro del feto #5996 no contenían una secuencia rebanada amplificada del mismo tamaño que los fragmentos de región constante de cadena pesada mu humana rebanada sino contenían una secuencia amplificada de un fragmento genómico no rebanado derivado del ADN genómico contaminando la muestra de ARN (franjas 3, 4, y 5) . Re-Arreglo VDJ del Lugar de Cadena Pesada Humana en un Feto ?HAC El análisis RT-PCR también se realizó para demostrar además del re-arreglo de VDJ en el lugar de cadena pesada en el feto ?HAC #5996. Se realizó RT-PCR anidado usando el cebador Cmu-1 (5'-CAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3' , SEQ ID NO: 15) para esta primera reacción, el cebador Cmu-2 (5' -AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3' , SEQ ID NO: 16) para la segunda reacción, y el cebador VH3-30.3 (5'-CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3' , SEQ ID NO: 17) para ambas reacciones. Las mezclas de reacción RT-PCR contenían 18.9 microlitros de agua, 3 microlitros de 10X regulador Ex Taq, 4.8 microlitros de mezcla de dNTP, 10 pmol del cebador hacia adelante, 10 pmol de cebador inverso, 1 microlitro de ADNc y 0.3 microlitros de Ex Taq. La RT-PCR se realizó usando 38 ciclos bajo las siguientes condiciones para la primera reacción: 85°C durante tres minutos, 94°C durante un minuto, 98°C durante 10 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos. Para la segunda reacción, se realizaron 38 ciclos bajo las siguientes condiciones: 85°C durante tres minutos, 94°C durante un minuto, 98°C durante 10 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos usando los cebadores VH3-30.3 y Cmu-2 (5'-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3' , SEQ ID NO: 16). Como se muestra en las franjas 6 y 7 de la Figura 10, el análisis RT-PCR del bazo del feto #5996 produjo una banda de cadena pesada del mismo tamaño que los controles positivos en las franjas 8 y 9. Las muestras del hígado y cerebro del feto #5996 contenían algún ADN re-acomodado contaminante (franjas 3 y 5) . Los controles negativos en las franjas 1 y 2 produjeron bandas del tamaño incorrecto. Verificación del Re-Arreglo de ?HAC Mediante Secuenciamiento El ADNc obtenido mediante la transcripción inversa del ARN del bazo del feto ?HAC #5996 se amplificó con cebadores específicos para mu y run humano re-arreglado sobre un gel de agarosa. La banda producida por amplificación con el par cebador Cmul-VHE-30 fue separado del gel. El ADNc amplificado se recuperó de la banda y se clonó. El ADN de la clona resultante que fue positiva por reacción de cadena de polimerasa para mu humano re-acomodado fue purificado y secuenciado (Figura HA) . La secuencia de este efecto ?HAC es mayor del 95 por ciento homólogo sobre 20 secuencias de cadena pesada humana conocida. Por ejemplo, la cadena mu de un anti-cuerpo antineumococo humano es 97% homologa a una región de esta secuencia (Figura 11B) . Secuencias adicionales de las cadenas pesadas humanas re-arregladas también se obtuvieron mediante análisis RT-PCR del bazo del feto #5996 usando los cebadores Cmu-1 y VH3-30.3, seguido por la re-amplificación usando los cebadores Cmu-2 y VH3-30.3. Los productos de la RT-PCR se purificaron usando una columna CHROMA SPIN (CLONETECH) y se clonaron en el vector de clonación pCR2.1 TA (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reacción de secuencia de terminador de tinte (ABI Applied System) se realizó una mezcla de reacción de volumen de 10 microlitros compuesto por mezcla de reacción terminador BigDye (3 icrolitros) , plásmido en plantilla (200 ng) , y el cebador Cmu-2 (1.6 pmol) . La reacción de secuenciamiento se realizó usando un secuenciador ABI 3700. Para este análisis, se condujeron veinticinco ciclos bajo las siguientes condiciones: 96°C durante un minuto, 96°C durante 10 segundos, 55°C durante cinco segundos, y 60°C durante cuatro minutos. Cuando menos fueron identificadas dos transcripciones de cadena pesada humana re-arregladas, que fueron VH3-11/D7-27/JH3/Cµ y VH3-33/D6-19/ H2 ) Cµ (Figura 12A y 12B) . Estos resultados demuestran que el re-arreglo VDJ del lugar de cadena pesada mu humana ocurre en el ?HAC en el bazo del feto #5996. La identificación de más de una secuencia de cadena pesada re-arreglada a partir del mismo feto también demuestra la capacidad de los fetos ?HAC para generar diversas secuencias de inmunoglobulina humana. Re-Arreslo y Expresión de Luqaras de Cadena Pesada y Cadena Lisera Humana en Feto ??HAC Fetos clonados derivados de fibroblastos fetales bovinos trans-cromosomales para el ??HAC se removieron de vacas receptoras en varios días de gestación. Los fetos se analizaron para determinar la presencia y el re-arreglo de lugares de cadena ligera lambda y pesada de inmunoglobulina humana llevados por el cromosoma artificial humano. Los estudios del ADN genómico de estos tejidos indicaron la advertencia de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina humana en algunos de los fetos. El examen del ADNc derivado de los bazos de estos fetos indicó el re-arreglo de expresión de los lugares de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina en algunos de estos fetos. El análisis FACS también demostró la expresión de proteína de cadena ligera lambda humana en la superficie de linfocitos esplénico en dos de los fetos . Presencia de Lugares de Cadena Pesada y Ligera Humana en Fetos ??HAC Para determinar si los fetos ??HAC retenían los lugares de cadena pesada y ligera humana, se realizó análisis por reacción de cadena de polimerasa sobre el ADN genómico del hígado de fetos de 58 días #5880, el feto de 57 dias #5848, y los fetos de 91 dias #5442A y 5442B. Los cebadores de reacción de cadena de polimerasa usados para la detección de los lugares de cadena pesada fueron VH3-F (5' -AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3' , ?EQ ID NO: 18) y VH3-R (5'-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3' , SEQ ID NO: 19), y los cebadores usados para la detección de cadena ligera fueron IgL-F (5 -GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3' , SEQ ID NO: 20) e IgL-R (5'-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3' , SEQ ID NO: 21). Las mezclas de la reacción de cadena de polimerasa contenían 18.9 microlitros de agua, 3 µl de 10X regulador Ex Tag, 4.8 microlitros de mezcla dNTP, 10 pmol de cebador hacia adelante, 10 pmol de cebador inverso, 1 microlitro de ADN genómico, y 0.3 µl de Ex Taq. Se realizaron treinta y ocho ciclos de reacción de cadena de polimerasa como sigue: 85°C durante tres minutos, 94°C durante un minuto, 98°C durante 10 segundos, 56°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos (Figuras 13 y 14) . Como se ilustra en las Figuras 13 y 14, el feto de 58 días #5580 de control positivo contenía tanto lugares de mmunoglobulma de cadena pesada y ligera humana.

Adicionalmente, los fetos de 91 dias #5542A y 5542B también contenían tanto lugares de cadena pesada como ligera (Figura 14) . En cambio, el feto #5848 no contenia ni lugares humanos y puede no haber contenido ??HAC. Estos resultados sugieren que el ??HAC se puede retener establemente hasta el día 91 de gestación en bovinos . Re-Arreglo y Expresión del Lugar de Cadena Pesada Humana en el Feto ??HAC #5542A Se usó RT-PCR para detectar la expresión de transcripciones de ARN de cadena pesada humana re-arreglada en el feto ??HAC #5542A. Los cebadores de RT-PCR usados fueron CHE-FE (5' -GGAGACCACCAAACCCTCCAA-3' , SEQ ID NO: 22) y CH4-RE (5'- GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3' , SEQ ID NO: 23). Las mezclas de la reacción de RT-PCR contenían 18.9 microlitros de agua, 3 microlitros de 10X regulador Ex Taq, 4.8 microlitros de mezcla dNTP, 10 pmol de cebador hacia adelante, 10 pmol de cebador inverso, 1 microlitro de ADNc, y 0.3 microlitros de Ex Taq. Se realizaron cuarenta ciclos de RT-PCR como sigue: 85°C durante tres minutos, 94°C durante un minuto, 98°C durante 10 segundos, 60°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos. Las franjas 4 y 5 de la Figura 15 contenían secuencias de región constante de cadena pesada mu rebanada amplificada del bazo del feto #5442A que son similares en tamaño a las muestras de control positivo. Estos resultados indican que el feto #5442A expresó una transcripción de cadena pesada mu re-arreglada en su bazo. También se ven bandas deslavadas en la región de la secuencia genómica sin rebanar, que se amplifican a partir del ADN contaminado en la muestra de ARN. Muestras de control para el hígado y el cerebro del feto #5442A no produjo una banda del tamaño esperado para una secuencia de cadena pesada re-arreglada amplificada . Re-Arreglo y Expresión del Lugar de Cadena Pesada Humana en el Feto ??HAC # 5868A Se usó RT-PCR para detectar la expresión de transcripciones de ARN de cadena pesada humana re-arreglada en el bazo de un feto ??HAC a los 119 días de gestación (feto #5868A) . Los cebadores usados para este análisis fueron VH30-3 (5'-caggtgcagctggtggagtctgg-3' , SEQ ID NO: 24) y CM-1 (5'-caggagaaagtgatggagtc-3 , SEQ ID NO: 25). Adicionalmente, los cebadores "GAPDH arriba" (5' -gtcatcatctctgccccttctg-3' , SEQ ID NO: 26 y "GAPDH abajo" ( 5' -aacaacttcttgatgtcatcat-3' - SEQ ID NO: 27) se usaron para amplificar transcripciones de control GAPDH. Para este análisis de RT-PCR, la mezcla de la reacción se incubó en 95°C durante cinco minutos y luego se realizaron múltiples ciclos de desnaturalización, recocido y amplificación mediante incubación a 95°C durante un minuto, 58°C durante un minuto, y 72°C durante dos minutos. Luego la mezcla se incubó a 72°C durante 10 minutos. La franja 3 de la Figura 16 contiene el producto de la RT-PCR producido de este análisis del feto ??HAC #5868A. Este producto de RT-PCR tuvo el tamaño esperado para la amplificación de una cadena pesada humana re-arreglada (470 pares de bases) y migró a la misma posición en el gel que el ADNc de control conocido por contener secuencias correspondientes a las transcripciones de cadena pesada humana re-arreglada. Como controles, tanto las muestras del ADNc de bajo fetal del feto ??HAC #5868A como las muestras de ADNc bovino normal generaron un producto cuando se amplificaron con cebadores GAPDH, demostrando la capacidad del ADNc para soportar la amplificación (franjas 7 y 8) . Re-Arreglo y Expresión del Lugar lambda Humano en los Fetos ??HAC #5442A y 5442B Cebadores específicos para la amplificación de la transcripción que incluyen porciones de lambda humana se usaron para detectar las transcripciones de ARN a partir del lugar de cadena ligera lambda humana re-arreglada. Para el análisis RT-PCR mostrado en la Figura 17, una mezcla equimolar de los cebadores C?l (5 -GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3' , SEQ ID NO: 28), CX2-3 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3' , SEQ ID NO: 29), y C?7 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3' , SEQ ID NO: 30) se usaron con el cebador V?l LEA1 (5' -CCCCCAAGCTTRCCKGSTYYCCTCTCCTC-3' , SEQ ID NO: 31). Las mezclas de la reacción RT-PCR contenían 18.9 microlitros de agua, 3 microlitros de 10X regulador Ex Taq, 4,8 microlitros de mezcla dNTP, 10 pmol de cebador hacia adelante, 10 p ol de cebador inverso, 1 microlitro de ADNc y 0.3 microlitros de Ex Taq. Las condiciones de la RT-PCR fueron las siguientes: 40 ciclos de 85°C durante tres minutos, 94°C durante un minuto, 98°C durante 10 segundos, 60°C durante 30 segundos, y 72°C durante un minuto. Como se muestra en la Figura 18, este análisis de RT-PCR. También se realizó usando una mezcla equimolar de los cebadores VA3LEA1 (5' -CCCCCAAGCTTGCCTGGACCCCTCTCTGG-3' ; SEQ ID NO: 32), V?3JLEAD (5' -ATCGGCAAAGCTTGGACCCCTCTCTGGCTCAC-3' , SEQID NO: 33), VXBACK4 (5' -CCCCCAAGCTTCTCGGCGTCCTTGCTTAC-3' , ?EQ ID O: 34) y una mezcla equimolar de los cebadores C?l (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3' , SEQ ID NO: 35) C?2-3 (5 -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3' , SEQ ID NO: 36) y C?7 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3' , SEQ ID NO: 37). Las condiciones de reacción de RT-PCR fueron iguales a las descritas anteriormente para la Figura 7. Las franjas 6 y 7 de la Figura 17 y las franjas 4 y 5 de la Figura 18 contenían productos RT-PCR del bazo del feto #5442A que son similares en tamaño a las bandas de control positivo, indicando la presencia de transcripciones de ARN de cadena ligera re-arreglada en este feto. La muestra del bazo del feto #5442B produjo bandas muy débiles del tamaño apropiado que no son visibles en la imagen. Este producto RT-PCR indica que el feto #5442B también expresó una transcripción de inmunoglobulina de cadena ligera re-arreglada en su bazo. Como se espera, muestras del cerebro de los fetos #5442A y 5442B no expresaron transcripciones de cadena ligera lambda re-arreglada. Re-Arreglp y Expresión del Lugar Lambda Humano en el Feto ??HAC # 5868A Transcripciones de ARN de lugares de cadena ligera lambda humana re-arreglada también se detectaron en fetos ??HAC #5868A. Para este análisis, los cebadores específicos para la amplificación de una transcripción incluyendo porciones de lambda humana se usaron para detectar la expresión codificada ??HAC de transcripciones se codifican porciones de un lugar lambda humano re-arreglada. El cebador VL1 LEAI (5'-cccccaagcttRccKgStYYcctctcctc-3' ; SEQ ID NO: 38) y una mezcla equimolar de los cebadores CL1 (5' -gggaattcgggtagaagtcactgatcag-3'; SEQ ID NO: 39), CL2-3 (5' -gggaattcgggtagaagtcacttatgag-3' ; SEQ ID NO: 40), y CL7 ( 5' -gggaattcgggtagaagtcacttacgag-3 ' ; ?EQ ID NO: 41) se usaron para este análisis. Para esta reacción de RT-PCR, las mezclas de la reacción se incubaron a 95°C durante 5 minutos y luego se realizaron múltiples ciclos de desnaturalización, recocido y amplificación mediante la incubación a 95°C durante un minuto, 60°C durante un minuto, y 72°C durante dos minutos. Luego, las mezclas se incubaron a 72°C durante 10 minutos. Este análisis demostró que el ADNc del bazo del ??HAC #5868A (franja 4 de la Figura 19) produjo un producto de RT-PCR. Del mismo tamaño que el ADNc de bazo de ratón TC (franja 6) control positivo. No fue detectado producto RT-PCR usando ya sea el ADNc del cerebro o del hígado del ??HAC #58T8A (franjas 2 y 3, respectivamente) . La capacidad de cada uno de estos tejidos para soportar la RT-PCR fue mostrada por la amplificación exitosa del gen doméstico, GAPDH, usando los cebadores "GAPDH arriba" y "GAPDH abajo" (franjas 8 y 10) . Verificación del Re-Arreglo ??HAC mediante Secuenciamiento Se realizó análisis RT-PCR en una muestra de bazo del feto #5442A usando una mezcla equimolar de los cebadores C?l, C?2-3, y C?7 CON EL CEBADOR V?lLEAl, o una mezcla equimolar de los cebadores VA3LEA1, VX3JLEAD, y VABACK4 y una mezcla equimolar de los cebadores C?l, C?2-3, y C?7. Los productos de la reacción de cadena de polimerasa se purificaron usando una columna CHROMA SPIN (CLONETECH) y se clonaron en el vector de clonación pCR2.1 TA (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reacción de secuencia de terminador de tinte (ABI Applied System) se llevó a cabo usando los cebadores C?l, C?2-3 y C?7 en una mezcladora equimolar. Se realizaron veinticinco ciclos a 96°C durante un minuto, 96°C durante 10 segundos, 55°C durante cinco segundos, y 60°C durante cuatro minutos. La mezcla de la reacción de 10 microlitros contenía mezcla de la reacción BigDye Terminator (3 microlitros), plásmido recocido (200 ng) , y los cebadores C?l, C?2-3, y C?7 (1.6 pmol) . La mezcla de la reacción se analizó usando un secuenciador ABI 3700. Cuando menos dos transcripciones de cadena ligera lambda humana re-arregladas se identificaron (Vl-17/JL3/C? y V2-13/JL2/C?) . Estos resultados demostraron que el re-arreglo VJ de los genes de cadena ligera lambda humano ocurrieron en el ??HAC en el bazo del feto #5442A (Figuras 20 y 21) . Análisis FAC? de la Expresión de Cadena Ligera Lambda Humana y Cadena Pesada Bovina en Feto ??HAC #5442A y 5442B Linfocitos esplénicos de los fetos ??HAC #5442A y 5442B se analizaron para determinar la expresión de las proteínas de cadena ligera lambda humana y cadena pesada bovina. Estas células se hicieron reaccionar con un anti-cuerpo lambda antihumano etiquetado con ficoeriterina (Figuras 22C y 22D) , un anticuerpo IgM anti-bovino etiquetado con FITC (Figuras 22D y 22H) , o sin anti-cuerpo (Figuras 22A, 22B, 22E, y 22F) durante 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron luego dos veces con solución regulada de fosfato más 2 ml de suero de becerro fetal y se analizaron en un clasificador de células FASCalibur. El porcentaje de las células que reaccionaron con el anti-cuerpo se calculó usando los controles sin anti-cuerpo para electrónicamente fijar los portales. Estos porcentajes se exhibieron debajo de cada histograma. El feto #5442A (Figuras 22A-22D) y el feto #5442B (Figuras 22E-22H) expresaron tanto proteína de cadena ligera lambda humana como proteína de cadena pesada bovina. EJEMPLO 3: Ungulados Transgénicos que Producen Anti-cuerpos Xenógenos y Cantidades Reducidas de Anti-cuerpos Endógenos Los ungulados transgénicos que expresan un anti-cuerpo xenógeno y que tienen un nivel reducido de expresión de anticuerpos endógenos también se generaron. Aumentando el número de genes de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina xenógena funcional relativa al número de genes de cadena pesada o ligera endógenos funcionales, el porcentaje de células B que expresan anti-cuerpos xenógenos deberá aumentar. Para generar estos ungulados transgénicos, los ungulados transgénicos ?HAC o ??HAC pueden ser cruzados con ungulados transgénicos que contienen una mutación en uno o ambos alelos de una cadena de mmunoglobulma endógena (por ejemplo, una cadena pesada mu o una cadena ligera kappa o lambda) . Si se desea, los ungulados transgénicos resultantes se pueden cruzar con (i) ungulados transgénicos que contienen una mutación en uno o ambos alelos de un prión endógeno alfa- (1,3)-galactosiltransferasa, y/o un ácido nucleico de cadena J o (n) ungulados transgénicos que contienen un ácido nucleico de cadena J exógeno (por ejemplo, cadena J humana) . De manera alternativa, una célula (por ejemplo, un fibroblasto fetal) de un feto transgénico ?HAC o ??HAC se puede modificar genéticamente mediante la mutación de uno o más genes de mmunoglobulma endógena. En otro método posible, se introduce ?HAC o ??HAC en una célula (por ejemplo, un fibroblasto fetal) en el cual las inmunoglobulmas endógenas (cadena pesada mu y/o ligera lambda) se mactivan hemicigóticamente u homocigóticamente . En cualquiera de los métodos anteriores, las células también se pueden modificar genéticamente mediante (i) la introducción de una mutación, preferiblemente una mutación knockout, en uno o ambos alelos de un prión endógeno alfa- (1,3)-galactosiltransferasa, y/o ácido nucleico de cadena J o (ii) la introducción de un ácido nucleico de cadena J exógeno. La célula transgénica resultante se puede usar entonces en procedimientos de transferencia nuclear para generar los ungulados transgénicos deseados. Métodos ejemplares se describen más adelante. Construcciones de ADN La cadena pesada mu (Figura 2A) , la cadena ligera lambda, la cadena ligera kappa, el prión alfa- (1,3)-galactosiltransferasa, y/o las construcciones knockout de cadena J descritas anteriormente se pueden usar. Alternativamente, la construcción de cadena pesada mu resistente a la puromicina se puede usar (Figura 3F) . Esta construcción knockout fue diseñada para remover los 4 principales exones de codificación del lugar de cadena pesada mu bovina pero dejar el dominio de la transmembrana intacto, dando como resultado la inactivación del lugar de cadena pesada mu. La construcción resistente a la puromicina se ensambló como sigue. Un fragmento Xhol de 4.4 kilobases gue contenía la región inmediatamente próxima al exón de codificación 1 fue insertado en el sitio Xhol del plásmido pBluescript II SK+ . El plásmido pPGKPuro, que contiene un gen resistente a la puromicina, se obtuvo del Dr . Peter W. Laird, Whitehead Institute, Estados Unidos. Un fragmento Xhol de 1.7 kilobases que contenia un gen resistente a la puromicina fue sub-clonado adyacente a, y corriente abajo de, el fragmento de 4.4 kilobases en un sitio Salí presente en la región polivinculo. Este marcador de puromicina de 1.7 kilobases reemplaza los exones de codificación CH1, CH2, CH3 y CH4 del lugar de cadena pesada de inmunoglobulina bovina. Un fragmento Xbal que contiene una región de .6 kilobases del lugar mu que está corriente abajo de sus cuatro exsnes en la secuencia genómica del tipo natural fue añadida a esta construcción para su uso como la segunda región de homología . Para generar la construcción objetivo final, una subclona de esta construcción se generó cortando los tres fragmentos ensamblados con Notl y Mlul . La digestión por restricción Mlul trunca el fragmento de 4.6 kilobases hasta 1.4 kilobases. El sitio Notl está en el polivínculo y no corta el ADN subclonado mismo. El sitio Mlul fue llenado con un fragmento de Klenow para generar un extremo romo, y el Notl/llenado en el fragmento Mlul fue subclonado en un vector nuevo pBluescript II SK+ usando los sitios Notl y Smal presentes en el vector pBluescript. Para la selección del gen, el vector final se linealiza con Notl. Dirección al objetivo del Gen Mediante Electroincorporación y Selección de Fármacos de Fibroblastos Transfectados Para la electroincorporación, una suspensión de una sola célula de 1 x 10' fibroblastos fetales bovinos (por ejemplo fibroblastos obtenidos como se describe en el Ejemplo 2 de un feto transgénico ?HAC o ??HAC) que había sufrido un número limitado de duplicaciones de población se centrifuga a 1,200 rpm durante cinco minutos y se resuspende en 0.8 ml en un medio Alfa-MEM libre de suero. Las células resuspendidas se transfieren a una cubeta de electroincorporación de 0.4 cm (Invitrogen, catálogo # P460-50) . Enseguida 30 microgramos de un ADN de vector objetivo de gen, linealizado con la enzima de restricción, y el contenido de la cubeta se mezcla usando una pipeta de 1 ml, seguido por un paso de incubación de dos minutos a temperatura ambiente. La cubeta se inserta en una cámara de choque en un sistema de electro-incorporación Gen Pulser II (Biorad) y luego se electro-incorpora a 1,000 voltios en 50 µF. La cubeta rápidamente se transfiere a una capucha de cultivo de tejido y las células electroincorporadas se pipetean en aproximadamente 30 ml de medio de fibroblasto completo. Las células se distribuyen igualmente en 30 platos de cultivo de tejido de 100 mm (Corning, catálogo # 431079), se agitan suavemente para distribuir de manera pareja las células, y se incuba a 38.5°C/5?, CO: durante 16 a 24 horas. El medio se remueve mediante aspiración y se reemplaza con medio de fibroblasto completo que contiene el fármaco de selección. El medio se cambia cada dos días y continúa durante un período de tiempo total de 7 a 14 dias.

Durante el proceso de selección de fármaco, las placas representativas se monitorean visualmente para verificar la muerte celular y la formación de colonias. Las placas de control negativo establecen que contienen fibroblastos que se electroincorporan en ausencia del vector objetivo de gen y no producen colonias durante el proceso de selección de fármaco. Recolección de Colonias de Fibroblastos Resistentes al Fármaco v Expansión de Células Después de terminar el paso de selección de fármaco (usualmente de 7 a 14 días), las colonias resistentes al fármaco son visibles macroscópicamente y están listas para transferirse a placas de cultivo de tejido de 48 pozos para su expansión. Para ayudar al proceso de transferencia, las colonias individuales se circulan en el fondo de la placa de cultivo de tejido usando un marcador de color (Sharpie) . Las placas de cultivo de tejido que contienen colonias se lavan dos veces con solución regulada de fosfato de Dubelcco IX (sin Ca2+ y Mg?i ) y luego 3 ml de una dilución 1:5 del regulador de disociación de células se añade por placas. Después de 3 a cinco minutos de un paso de incubación a temperatura ambiente, las colonias individuales comienzan a desprenderse del fondo del plato de cultivo de tejido. Antes de que las colonias se desprendan, se transfieren individualmente a un solo pozo de placa de cultivo de tejido de 48 pozos usando una pipeta P200 y una punta de pipeta de barrera aerosol (200 o 250 microlitros) . Después de la transferencia, la colonia se disocia completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo y un ml de medio de fibroblasto completo se añade. Para asegurar que las células son resistentes al fármaco, la selección del fármaco se continúa en toda la etapa de 48 pozos. Las colonias transferidas se cultivan a 38.5°C/5% CO,. y se monitorean visualmente usando un microscopio invertido. De dos a siete días después, los pozos que están logrando la confluencia se lavan dos veces con solución regulada de fosfato de Dubelcco IX (sin Ca~+ y Mg+) y se desprenden del fondo del pozo mediante la adición de 0.2 ml de regulador de disociación de células, seguido por un paso de incubación a temperatura ambiente de cinco minutos. Después del desprendimiento, las células se disocian adicionalmente pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta P1000 y una punta de pipeta de aerosol (100 µl) . Aproximadamente 75% de los fibroblastos disociados se transfieren a un pozo individual de placa de cultivo de tejido de 24 pozos para expandirse adicionalmente para el análisis de reacción de cadena de polimerasa posterior y el 25'?, se transfiere a un solo pozo de un segundo plato de 24 pozos para su expansión y eventualmente se usa para experimentos de transferencia nuclear de células somáticas. Cuando las células en el plato que contiene 75% de las células originales se expande hasta casi la confluencia, el ADN se aisla de esa clona para el análisis genético . Preparación de ADN El procedimiento usado para aislar el ADN para los análisis genéticos se adapta de Laird y colaboradores, Nucleic Acids Researach, 1991, Volumen 19, No. 15. En particular, en cuanto una clona particular ha alcanzado casi la confluencia en un pozo de un plato de 24 pozos, el medio de cultivo se aspira de ese pozo y las células adherentes se lavan dos veces con solución regulada de fosfato. La solución regulada de fosfato se aspira y se reemplaza con 0.2 ml de regulador para Usar las células y digerir la proteína en exceso del ADN que se va a aislar. Este regulador está compuesto de 100 mM de Tris-HCl (pH 8.5), 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl y 100 µg/ml de proteinasa K. La placa de 24 pozos se devuelve al incubador de cultivo de tejido por un mínimo de tres horas para permitir la liberación del ADN y la digestión de la proteína. El producto viscoso de este procedimiento se transfiere a un tubo de micro-centrífuga de 1.5 ml y se añade 0.2 ml de isopropanol para precipitar el ADN. El precipitado se recupera mediante centrifugación, el aglomerado de ADN se enjuaga con 70% de etanol, y después de secarse al aire, el aglomerado se resuspende en 25-50 µl de regulador que contiene 10 mM Tris, pH 8, y 1 Mm EDTA. El ADN se usa para los análisis de reacción de cadena de polimerasa de clona. Análisis de Clonas Se usan dos enfoques diferentes para analizar clonas, ambos empleando la reacción de cadena de polimerasa (PCR) . Todos los enfoques descritos en esta sección son adaptables a la selección de cualquier otro gen, la única diferencia son las secuencias de los cebadores usados para el análisis genético. De acuerdo con el primer enfoque, dos pares separados de cebadores se usan para amplificar independientemente productos de una transfección estable. Se usa un par de cebadores para detectar la presencia del vector objetivo en el genoma de una clona, independientemente del sitio de integración. Los cebadores se designan para recocer a secuencias de ADN, ambos presentes en el vector objetivo. La intensidad del producto de la reacción de cadena de polimerasa para esta reacción de cadena de polimerasa se puede correlacionar con el número de copias del vector objetivo que se han integrado en el genoma. De este modo, las células que contienen sólo una copia del vector objetivo tienden a dar como resultado bandas menos intensas en la reacción de cadena de poli erasa. El otro par de cebadores se diseña para detectar sólo las copias del vector que integraron el lugar deseado. En este caso, se designa un cebador para recocerse dentro del vector objetivo y el otro se designa para recocerse a secuencias específicas al lugar que está siendo seleccionado, que no está presente en el vector objetivo. En este caso, un producto de reacción de cadena de polimerasa sólo se detecta si el vector objetivo se ha integrado directamente cerca del sitio no presente en el vector objetivo, indicando un evento de selección deseada. Si se detecta el producto, la clona se usa para transferencia nuclear.

Para la construcción knockout de cadena pesada resistente a la neomicina, se usaron los cebadores Neol (5'-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3', SEQ ID NO: 42) y el IN2521 (5'-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3', SEQ ID NO: 43) para detectar la presencia del vector objetivo en las células, independientemente de la localización de integración. Los cebadores Neol y OUT3570 (5'-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAÁ GTC TGT C-3', SEQ ID NO: 44) se usa para amplificar específicamente sólo las copias de la construcción objetivo que se integran en el lugar de cadena pesada mu. Para estas reacciones de cadena de polimerasa para analizar la integración de la construcción knockout de cadena pesada resistente a la neomicina, se usa un juego de reacción de cadena de polimerasa Qiagen. La mezcla de la reacción de cadena de polimerasa contiene 1 pmol de cada cebador, 5 ul de regulador de reacción 10X, 10 µl de solución Q, 5 µl de ADN, y 1 µl de solución dNTP. La mezcla de la reacción se lleva a un volumen total de 50 µl con H:0. Esta amplificación de reacción de cadena de polimerasa se realiza usando una incubación de desnaturalización inicial a 94°C durante dos minutos. Luego, se realizan 39 ciclos de desnaturalización, recocido, y amplificación mediante la incubación a 94°C durante 45 segundos, 60°C durante 45 segundos, y 72°C durante dos minutos. Luego, la mezcla de la reacción se incuba a 72°C durante cinco minutos y a 4°C hasta que la mezcla se remueve de la máquina de reacción de cadena de polimerasa. En el enfoque alternativo, se usa un juego de un solo cebador para amplificar el lugar objetivo y el tamaño de los productos de reacción de cadena de polimerasa es diagnóstico de la selección correcta. Un cebador se designa para recocerse a una región del lugar no presente en el vector objetivo y el otro cebador se designa para recocerse en un sitio presente en el vector objetivo pero también presente en el lugar del tipo natural. En este caso, no hay detección del vector objetivo que se haya integrado a sitios no deseables en el genoma. Debido a que la región suprimida por el vector objetivo es diferente del tamaño del marcador de selección de fármaco insertado en su lugar, el tamaño del producto depende de si el lugar amplificado es del genotipo del tipo natural o del genotipo seleccionado. La amplificación del ADN de clonas que contienen inserciones incorrectas o no tienen inserciones en absoluto del vector objetivo da como resultado un solo producto de reacción de cadena de polimerasa del tamaño esperado para el lugar del tipo natural. La amplificación del ADN a partir de clonas que contienen un alelo correctamente dirigido ("recortado" da como resultado dos productos de reacción de cadena de polimerasa, uno que representa la amplificación del alelo del tipo natural y uno alterado, de tamaño predecible debido al reemplazo de alguna secuencia en el alelo de tipo natural con el marcador de resistencia al fármaco, el cual tiene diferente longitud que la secuencia que reemplazó.

Para la construcción de knockout de cadena pesada resistente a la puromicina, se usaron los cebadores Shortend (5'-CTG AGC CAÁ GCA GTG GCC CCG AG-3', SEQ ID NO: 45) y Longend (5'-GGG CTG AGA CTG GGT GAA CAG AAG GG-3', SEQ ID NO: 46) . Este par de cebadores amplifican tanto el lugar de cadena pesada de tipo natural como los lugares que han sido adecuadamente seleccionados por la construcción de puromicina. La diferencia de tamaño entre las dos bandas es de aproximadamente 0.7 kilobases. La presencia de la banda más corta es indicadora de la selección adecuada. Para esta reacción de cadena de polimerasa para analizar la integración de la construcción knockout de cadena pesada resistente a la puromicina se usó un juego mezclador Promega Master. La mezcla de la reacción de cadena de polimerasa contiene 1 pmol de cada cebador, 2.5 µl de ADN, y 25 µl de 2X Promega Master Mix. La mezcla de la reacción se lleva a un volumen total de 50 µl con H20. Esta amplificación de reacción de cadena de polimerasa se realiza usando una incubación por desnaturalización inicial a 94°C durante dos minutos. Luego, 30 ciclos de desnaturalización, recocido y amplificación se realizan medíante la incubación a 94°C durante 45 segundos, 60°C durante 45 segundos, y 72°C durante dos minutos. Luego, la mezcla de la reacción se incuba a 72°C durante cinco minutos y a 4°C hasta que la mezcla se remueve de la máquina de reacción de cadena de polimerasa . Primera Ronda de Transferencia Nuclear Las células de fibroblasto seleccionadas en las cuales se ha inactivado un gen de inmunoglobulina se pueden usar para la transferencia nuclear como se describe en el Ejemplo 2 para generar un ungulado transgénico que contiene una mutación en un gen de inmunoglobulina endógeno y que contiene un cromosoma artificial humano que codifica un gen de inmunoglobulina xenógeno. Alternativamente, la transferencia nuclear se puede realizar usando métodos estándar para insertar un núcleo o masa de cromatina (es decir, uno o más cromosomas no cubiertos por una membrana) a partir de un fibroblasto transgénico seleccionado en un oocito enucleado (solicitud de patente US 60/258,151; presentada el 22 de diciembre de 2000) . Estos métodos se pueden usar para células en las cuales se ha mutado un prión endógeno alfa- (1, 3) -galactosiltransferasa y/o ácido nucleico cadena J. Segunda Ronda de Mutagénesis y Transferencia Nuclear Si se desea, una célula (por ejemplo, un fibroblasto fetal) se puede obtener a partir de un ungulado transgénico generado de la primera ronda de transferencia nuclear. Otra ronda de selección de gen se puede realizar como se describió anteriormente para inactivar el segundo alelo del gen inactivado en la primera ronda de selección. Alternativamente, otra inmunoglobulina (por ejemplo, de cadena pesada mu, de cadena ligera lambda, de cadena ligera kappa, o cadena J) , alfa- (1,3)-galactosiltransferasa, o gen prión se puede inactivar en esta ronda de selección. Para esta segunda ronda de selección, se puede usar ya sea una concentración mayor de antibiótico o una construcción knockout con un marcador de resistencia antibiótico diferente. Las células con resistencia al antibiótico se pueden seleccionar como se describió anteriormente. Estas células seleccionadas se pueden usar en una segunda ronda de transferencia nuclear como se describió anteriormente para generar, por ejemplo, un ungulado transgénico que contiene dos mutaciones en genes de inmunoglobulina endógena y que contienen un cromosoma artificial humano que codifica un gen de inmunoglobulina xenógeno. Alternativamente, las células resistentes al antibiótico seleccionado ' primero pueden ser tratadas para aislar las células fase Gl como se describe más adelante, las cuales se usan para la segunda ronda de transferencia nuclear. El aislamiento de las células Gl para la transferencia nuclear, 5.0 x 105 células se plaquean sobre placas de cultivo de tejido de 100 mm que contienen 10 ml de -MEM + FC?, veinticuatro horas antes del aislamiento. El siguiente día, las placas se lavan con solución reguladora de fosfato y el medio de cultivo se reemplaza durante 1-2 horas antes del aislamiento. Las placas se sacuden durante 30-60 segundos en un Vortex-Genie 2 (Fisher Scientific, Houston, Texas, Estados Unidos, velocidad media) , el medio se remueve, se centrifuga a 1,000 G durante cinco minutos y el aglomerado se resuspende en 250 microlitros de MEM +FCS. Nuevamente divididos los pares de células unidos por puentes citoplásmicos, y luego se seleccionan, ya que estas células están casi en Gl . Este procedimiento de aislamiento se conoce como el método de "sacudido". EJEMPLO 4 : Ungulados Transgenicos que Tienen Actividad Reducida de oí-1 , 3-galactosiltransferasa Líneas celulares de fibroblastos bovinos en los cuales un alelo del lugar a-1 , 3-galactos?ltransferasa se muta fueron generadas por recombinación homologa. La construcción de ADN para generar las células knockout -galactosiltransferasa se usó para evitar la transcripción de ARNm a-galactosiltransf rasa de longitud completa, funcional insertando tanto un gen de resistencia a la puromicina (puro, descrito en el Ejemplo 3) como un cassette de terminación de la transcripción (STOP) en el exón 9 que contiene el dominio catalítico. De este modo, la transcripción inmadura resultante de a-galactosiltransferasa carece del dominio catalítico. La construcción de ADN (es decir, el vector knockout a-galactosiltransferasa) fue electro-incorporado en tres líneas celulares de fibroblastos bovinos independientes, y luego se aislaron colonias resistentes a la puromicma. Basándose en el análisis de reacción de cadena de polimerasa, se presentó la recombinación homologa en la región del exón 9 en algunas colonias. De esta manera, las lineas celulares de fibroblastos bovinos en las cuales un alelo del lugar l, 3-galactosiltransferasa se mutó fueron generadas. Si se desea, el segundo alelo se puede mutar usando el mismo vector knockout y una concentración mayor de antibiótico para seleccionar células knockout homocigosas o usar otro vector knockout con un gen de resistencia al antibiótico diferente. Este método también se puede aplicar a células de otros ungulados para generar células transgénicas para su uso en los métodos de transferencia nuclear descritos en la presente para producir ungulados transgénicos de la presente invención. Estos métodos se describen más adelante adicionalmente. Construcción de un vector knockout a-1 , 3-galactosil-transferasa El vector knockout a-1, 3-galactosiltransferasa fue generado como sigue (Figura 23) . Para aislar el ADN genómico alrededor del exón 9 del gen a-1 , 3-galactosiltransferasa, se amplificó una sonda de ADN mediante reacción de cadena de polimerasa usando el siguiente par de cebadores 5'-gatgatgtctccaggatgcc-3' (SEQ ID NO: 61) y 5'-gacaagcttaatatccgcagg-3' (SEQ ID NO: 62) . Usando esta sonda, se analizó una biblioteca de fago ? genómico bovino, y 7 clonas fago ? positivas se identificaron. Una clona, que contenia ADN de una célula de fibroblasto bovino Charoláis macho, se analizó además mediante mapeo de restricción. El fragmento genómico Not I-Xho I que contiene el exón 9 fue sub-clonado en el pBluescript II SK(-), y luego tanto el cassette puro como el cassette STOP se insertaron en el sitio Avi I en el fragmento genómico Not I-Xho I el cual es 5' al dominio catalítico. Un gen de toxina de diphtheria (DT-A, Gibco) también se añadió a la construcción de vector para matar las células en las cuales el cassette objetivo se integrara no homólogamente . Procedimientos de Transfección/Knockout La transfección de tres líneas celulares de fibroblastos fetales (dos de un bovino Jersey macho y uno de un bovino Jersey hembra) se realizó usando un protocolo de electro-incorporación estándar como sigue. El medio usado para cultivar los fibroblastos fetales bovinos contenia 500 ml Alfa MEM (Gibco, 12561-049), 50 ml de suero de becerro fetal (Hy-Clone #ABL13080), 5 ml de penicilina-estreptomicina (SIGMA) , y 1 ml de 2-mercaptoetanol (Gibco/BRL #21985-023) . El día anterior a la transfección, se sembraron las células en un matraz de cultivo de tejido T175 con una confluencia objetivo de 80-100%, como se termina por examen microscópico. El día de la transfección, aproximadamente 107 células de fibroblastos bovinos fueron tripsinizados y se lavaron una vez con medio alfa-MEM, después de la resuspensión de las células en 800 microlitros de alfa-MEM, 30 microgramos de ADN se añadieron a la suspensión de células y se mezcló bien mediante pipeta. La suspensión de células-ADN se transfirió a una cubeta de electro-incorporación y se electro-incorporó a 1,000 voltios y 50 µF después de eso, las células electro-incorporadas se plaguearon en placas de 24 pozos con el medio alfa-MEM suplementado con el suero. Después de un cultivo de 48 horas, el medio se reemplazó con medio que contenía 1 microgramos/ml de puromicma, y las células se cultivaron durante 2-3 semanas para seleccionar al as células resistentes a la puromicina. Después de la selección, todas las colonias que alcanzaron cerca del 100% de confluencia fueron recolectadas, y el ADN genómico se extrajo de las colonias para analizar los eventos de recombinación homologa deseada mediante de reacción de cadena de polimerasa. Análisis de Integraciones Dirigidas Como se describió anteriormente, el ADN genómico se extrajo de cada v24 pozos independientemente utilizando el juego de aislamiento de ADN PUREGENE (Gentra Systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada muestra de ADN genómico fue resuspendido en 20 µl de 10 mM Tris-CL (pH 8.0) y 1 mM EDTA (EDTA) . EL análisis mediante reacción de cadena de polimerasa se realizó usando el siguiente par de cebadores 5'-aagaagagaaggtagaagacccaaggac-3' (SEQ ID NO: 63) y 5'-cctgggtatagacaggtgggtattgtgc-3' (SEQ ID NO: 64) . La secuencia de un cebador se localiza en el vector knockout a-1, 3- (1,3)-galactosiltransferasa, en la secuencia del otro cebador se localiza justo fuera del vector integrado en el lugar endógeno seleccionado (Figura 23) . Por lo tanto, el producto de reacción de cadena de polimeraea esperado deberá detectarse sólo cuando el vector knockout se integre en el lugar seleccionado mediante recombinación homologa. Las mezclas de la reacción de cadena de polimerasa contenían 18.9 microlitros de agua, 3 microlitros de 10X LA regulador de reacción de cadena de polimerasa II (Mg?+ plus), 4.8 microlitros de mezcla de dNTP, 10 pmol de cebador hacia delante, 10 pmol de cebador inverso, 1 microlitros de ADN genómico, y 0.3 microlitros de LA Taq. Se realizaron cuarenta ciclos de reacción de cadena de polimerasa incubando las mezclas de la reacción con las siguientes condiciones: 85°C durante tres minutos, 94°C durante un minuto, 98°C durante 10 segundos, y 68°C durante 15 minutos. Después de la reacción de cadena de polimerasa las mezclas de la reacción se analizaron mediante electroforesis. Lae clonas resistentes a la puromicina que generaron productos de reacción de cadena de polimerasa del tamaño esperado se seleccionaron (Figura 23) . De este modo, líneas celulares de fibroblastos bovinos en las cuales un alelo del lugar a-1, 3- (1, 3) -galactosiltransferasa se mutaron por el vector knockout, se generaron con éxito. EJEMPLO 5: Método Alternativo para Producir Ungulados Transgenicos Usando Virus Adeno-asociado para Mutar en Gen Endógeno Se pueden usar virus adeno-asociados (AAV) para el reemplazo específico de secuencia objetivo presentes en el genoma de la células (Inoue y colaboradores, Mol. Ther. 3 ( 4 ): 526-530, 2001); Hirata y colaboradores, J. Virol. 74 ( 10) : 16536-42, 2000) ; Inoue y colaboradores, J. Virol. 73 ( 9) : 7376-80, 1999); y Russell y colaboradores, Nat. Genet. 18 ( 4 ): 325-30, 1998)). La tasa objetiva de gen es muy eficiente en comparación con los enfoques de dirección al gen más convencionales. El virus adeno-asociado tiene un rango amplio de especificidades de anfitriones de tejido, incluyendo especificidad tanto para fibroblastos de la piel bovinos como humanos. De este modo, el virus adeno-asociado se puede usar para producir células de ungulado transgénico que contienen una o más mutaciones en una inmunoglobulina endógena (por ejemplo, cadena pesada mu, cadena ligera lambda, cadena ligera kappa o cadena J) , alfa- (1, 3) - (1, 3) -galactosiltransferasa, o gen prión. Estas células transgénicas se pueden usar entonces en los métodos de transferencia nuclear descritos en la presente para producir ungulados transgénicos de la presente invención. Usar el virus adeno-asociado dio como resultado la recombinación homologa del lugar de cadena pesada de inmunoglobulina bovina a frecuencias más altas que lo previamente obtenido usando estrategias de dirección de gen tradicionales (es decir, procesamientos de electro . incorporación y lipofección) . En la primera ronda de experimentos de dirección al gen, se obtuvieron cinco clonas de fibroblasto dirigido adecuadamente entre 73 transductantes estables que contenían el ADN introducido a través de un vector de virus adeno-asociado . Estos experimentos se llevaron a cabo como sigue. Vectores Knockout de Virus Adeno-Asociados Las construcciones de virus adeno-asociados pueden interrumpir un gen ya sea por simple inserción de secuencias extrañas o reemplazo de secuencias endógenas con nuevas secuencias presentes en el vector de virus adeno-asociado . La Figura 24 muestra una construcción de virus adeno-asociado en la cual cuatro exones de codificación de la región constante mu de la cadena pesada de inmunoglobulina bovina se presentan en un fragmento BamHI-XhoI de 2,822 pares de bases. Un fragmento de 1.16 kilobases que contiene un marcador de resistencia a la neomicina presente en el vector comercialmente disponible, pMCINeo, se insertó en un sitio ?acII presente en el exón cuatro del lugar de cadena pesada mu a partir de un bovino Holstein, Este lugar es uno contenido en la clona adecuada aislada para generar el vector knockout descrito en el Ejemplo 1. Para generar el vector de virus adeno-asociado, el sitio SacII en el lugar de cadena pesada mu fue llenado para crear extremos romos, los cuales después se ligaron a los vínculos Salí romos (New England Biolabs) . Luego, el fragmento Xhol del pMCINeo, que contiene el gen de resistencia al a neomicina, se ligó al sitio Salí añadido al lugar a través del enlace Salí. Esta vinculación se puede realizar debido a que los sitios de restricción Xhol y Salí tienen extremos compatibles. Este vector knockout causa una inserción de interrupción del gen de resistencia a la neomicina en el gen de cadena pesada mu endógeno, mediante lo cual se inactiva el gen de cadena pesada mu. Esta inactivación de gen ocurre sin suprimir regiones del lugar mu endógeno. Un vector alternativo se diseñó para remover los exones 3 y 4 del lugar endógeno durante la selección, dando como resultado el reemplazó de estos dos exones con una copia funcional del gen de resistencia a la neomicina (Figura 25) . Esta construcción, se generó usando amplificación de reacción de cadena de polimerasa de ADN genómico de un bovino Jersey hembra. En particular, la región 3 ' de homología se amplificó utilizando los siguientes cebadores: 5' GGGGTCTAGAgcagacactacactgatgggcccttggtcc 3' (SEQ ID NO: 65), que añade un sitio de restricción Sbal, y 5'GGGGAAGCTTcgtgtccctggtcctgtctgacacag 3' (SEQ ID NO: 66), que añade un sitio de restricción HindIII. La región 5' de homología se amplificó con los cebadores 5'GGGGCTCGAGgtcggcgaaggatggggggaggtg 3' (SEQ ID NO: 67), que añade un sitio de restricción Xhol y 5'GGGGGGTACCgctgggctgagctgggcagagtggg 3' (?EQ ID NO: 68), que añade un sitio de restricción Kpnl. Los nucleótidos en estas secuencias de cebadores son nucleótidos que no se recuecen al lugar de cadena pesada mu sino se incluyen en los cebadores para añadir sitios de restricción para facilitar pasos posteriores de subclonación. Las primeras cuatro guaninas se añaden para separar los sitios de restricción del extremo de los cebadores debido a que las enzimas de restricción no disocian sitios que están muy al extremo de los cebadores así como en sitios internos. La región 5' de homología tiene 1.5 kilobases de largo y contiene los exones 1 y 2. La región 5' de homología también contiene los primeros 25 nucleótidos del exón 3 para mantener el sitio aceptador de rebanadas del exón 3. El ciclo aceptador de rebanadas permite que el exón 3 sea usado para rebanar y así prevenir el rebanamiento posible de los exones 1 y 2 hacia el dominio de transmembrana corriente abajo para formar un producto de membrana-unión aberrante. La región 3' de homología tiene 1.24 kilobases de largo que contiene la región inmediatamente corriente abajo del exón 4. Para la construcción mostrada en la Figura 24, el cassette objetivo se insertó en el vector de virus adeno-asociado reportado por Ryan y colaboradores (J. Virol. 70:1542-1553, 1996) , que contiene secuencias de repetición terminal larga virales (LTR) , usando métodos estándares. El vector virus de adeno-asociado fue empacado en capsidas usando la línea celular de empaque TtetA4 como previamente se describió (Inoue and Russell, 1998, J. Virol . 72:7024-7031, 1998) y se purificó como se describió previamente (Zolotukm y colaboradores, Gen Therapy, 6:973-985, 1999) . Para la construcción mostrada en la Figura 25, el método anterior o cualquier otro método estándar se puede usar para insertar el cassette objetivo en el vector de virus adeno-asociado escrito por Ryan y colaboradores o cualquier otro vector de adeno-asociado (tal como el vector disponible comercialmente de Stratagene) y generar virus que contienen el vector. Procesamientos de Transducción Fibroblastos de un bovino Jersey hembra fueron sembrados en un pozo de placa de cultivo de tejido de 48 pozos a 40,000 células por pozo y se cultivaron en medio completo a 38.5°C y 5?, de CO hasta que las células se unieron a la superficie inferior del pozo. En cuanto las células se adhirieron, el medio fue removido y reemplazado con 0.2 ml de medio fresco que contenia partículas de virus adeno-asociado como el vector ilustrado en la Figura 24 a una multiplicidad de infección (MOI) de 500-20,000 partículas/células. El MOI se eligió basado en experimentos piloto que determinaron los números resultantes de colonias y la separación de las colonias durante la fase de selección de fármaco. Las placas se incubaron durante la noche. Después de esta incubación, los pozos transducidos se enjuagaron con solución regulada de fosfato sin calcio ni magnesio y se desprendieron de los pozos usando ya sea tripsina o el regulador de disociación de células descrito anteriormente. Se obtuvo una suspensión de células uniforme mediante el pipeteo suave de las células desprendidas y las células del pozo se redistribuyeron entre diez platos de cultivo de tejido de 100 mm. Los platos se incubaron con medio completo durante la noche. Después de esta incubación de platos de 100 mm, el medio se reemplazó con medio selectivo que contenia G418 una concentración de 350 microlitros/ml . El medio selectivo se cambió cada 2-3 días hasta que las colonias fueron macroscópicamente visibles en la superficie del plato. En ese punto, las colonias individuales fueron recogidas y transferidas a sus propios vasos .

Regiones que contenían colonias fueron marcadas en la superficie externa del plato de cultivo de tejidos. En cuanto todas las colonias fueron circuladas, el medio se expiró de las placas, y las placas se lavaron tres veces con solución regulada de fosfato sin calcio ni magnesio. Después del lavado, las placas fueron inundadas con una dilución de 1:25 IX tripsina y se les dejó asentarse a temperatura ambiente hasta que las colonias visiblemente han empezado a desprenderse de la superficie de la placa. Las placas se mantuvieron estacionarias para evitar que las colonias desprendidas flotaran a otro lugar de la placa. Una punta de pipeta se usó para recoger los aglomerados de células en un volumen de 50 microlitros, y el contenido de la punta de la pipeta se transfirió a un pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos. En cuanto todas las colonias fueron transferidas, se añadió un medio completo que contenía G418, y las clonas aisladas se dejó que proliferaran hasta casi la confluencia. Cuando un pozo individual estaba casi en la confluencia, se lavó dos veces con solución regulada de fosfato sin calcio ni magnesio. Las células se desprendieron usándose 0.2 ml de regulador de disociación de células. De esta suspensión de células, 20 microlitros se transfirió a una nueva placa de 24 pozos, y las células restantes se dejó que se volvieran a adherir a la superficie de la placa de 24 pozos original después de la adición de 2.0 ml y el medio completo. La placa original se incubó a una confluencia del 100%. La nueva placa sirve como una fuente de células seleccionadas adecuadamente para futuros procesamientos de clonación de bovinos . Cuando un pozo de la placa original de 24 pozos logró estar 100% confluente, el medio se removió, y las células se lavaron una vez con solución regulada de fosfato. La solución regulada de fosfato se removió y se reemplazó con un regulador de lisis de células adoptado de Laird y colaboradores (Nucleic Acids Res. 19:4293, 1991). Brevemente, 0.2 ml de regulador de lisis que contenia 200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.5, 5 mM EDTA, 0.2 por ciento SDS, y 100 µg/ml de proteinasa K se añadió al pozo. El pozo se regresó al incubador para entre tres horas y durante la noche. El lisado de las celda viscosa se transfirió entonces a un tubo de microfuga. Un volumen igual de isopropanol se añadió para precipitar el ADN. Después de una centrifugación de Io minutos en una microfuga, el sobrenadante fue descartado, y el aglomerado fue lavado una vez con 0.5 ml de 70?, de etanol. Después de la remoción del etanol, el aglomerado de ADN fue secado al aire y resuspendido en 35 microlitros de regulador TE (10 mM Tris pH 8 y I mM EDTA) . Alícuotas de 3 icrolitros se usaron para el análisis de reacción de cadena de polimerasa. Análisis de reacción de cadena de polimerasa Muestras de ADN de las clonas resistentes al fármaco transducidas con partículas de virus adeno-asociado fueron analizadas para la selección adecuada del vector usando análisis de reacción de cadena de polimerasa. Esta estrategia de análisis usó un cebador que se recuece con el ADN que codifica el marcador de selección de fármacos y otro cebador que se recuece dentro del lugar objetivo, pero fuera la secuencia presente en las partículas objetivo del virus adeno-asociado. Los productos de reacción de cadena de polimerasa sólo se detectan si el ADN que se dirige al virus adeno-asociado se ha integrado en el lugar deseado del genoma endógeno. Los resultados de un sólo experimento de selección usando estas partículas de virus adeno-asociado se muestran en la Figura 26. Basándose en este análisis, cinco de cada 73 clonas independientes contenían el ADN vector objetivo adecuado. Este método también se puede usar con el vector del virus adeno-asociado mostrado en la Figura 25 o con cualquier otro adeno virus adecuado o vector viral adeno-asociado. Si se desea, el segundo alelo de cadena pesada mu se puede mutar en las colonias aisladas transduciéndolo con un vector de virus adeno-asociado con un gen de resistencia al antibiótico diferente (es decir, un gen distinto que un gen resistente a la neomicina) . Para seleccionar las células knockout homocigotas resultantes, las células infectadas se cultivan en presencia del antibiótico correspondiente. De manera alternativa, las colonias aisladas se pueden transducir con un vector de virus adeno-asociado que contiene un gen de resistencia a la neomicina y cultivar en presencia de una alta concentración de antibiótico (es decir, una concentración de antibiótico gue mata células knockout heterocigotas pero no mata células knockout homocigotas) . Otras modalidades En la anterior descripción, será aparente que se pueden hacer variaciones y modificaciones a la invención descrita en la presente para adaptarla a varios usos y condiciones. Estas modalidades también están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones . Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente mediante referencia al mismo grado que si cada publicación independiente o solicitud de patente especifica e individualmente se indicará que está incorporada mediante referencia.

Claims

REIVI DICACIONES 1. Un ungulado transgénico, que comprende uno o mas ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen de inmunoglobulina (Ig) xenógeno, que sufre re-arreglo y expresa mas de una molécula de Ig xenógena.
2. El ungulado de la reivindicación 1, donde dicho ácido nucleico es sustancialmente humano.
3. El ungulado de la reivindicación 1, que comprende ácido nucleico que codifica un anti-cuerpo xenógeno.
4. El ungulado de la reivindicación 3, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género.
5. El ungulado de la reivindicación 4, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo humano.
6. El ungulado de la reivindicación 3, donde dicho anti-cuerpo es un anti-cuerpo policlonal.
7. El ungulado de la reivindicación 1, donde dicha cadena de Ig o anti-cuerpo es expresado en suero y/o leche.
8. El ungulado de la reivindicación 1, donde dicho ácido nucleico está contenido dentro de un fragmento de cromosoma.
9. El ungulado de la reivindicación 6, donde dicho fragmento de cromosoma es ?HAC.
10. El ungulado de la reivindicación 6, donde dicho fragmento de cromosoma es ??HAC.
11. El ungulado de la reivindicación 1, donde dicho ácido nucleico es integrado en un cromosoma de dicho ungulado.
12. El ungulado de la reivindicación 1, que comprende una mutación que reduce la expresión de un gen Ig endógeno.
13. El ungulado de la reivindicación 3, donde dicho ácido nucleico comprende segmentos de ácido nucleico de cadena ligera, de anti-cuerpo, sin re-arreglar, en los cuales todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen V están separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen J por uno o mas nucleótidos.
14. El ungulado de la reivindicación 3, donde dicho ácido nucleico comprende segmentos de ácido nucleico de cadena pesada, de anti-cuerpo, sin re-arreglar, en los cuales ya sea (i) todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen V estén separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen D por uno o mas nucleótidos y/o (ii) todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen D están separados de todos los segmentos de ácido nucleico que codifican un segmento de gen J por uno o mas nucleótidos .
15. El ungulado de la reivindicación 1, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
16. El ungulado de la reivindicación 15, donde dicho ungulado es un bovino.
17. Un ungulado transgénico, que comprende una mutación que reduce la expresión de un anti-cuerpo endógeno.
18. El ungulado de la reivindicación 17, donde dicha mutación reduce la expresión de la cadena pesada de IgM funcional .
19. El ungulado de la reivindicación 18, donde dicha mutación elimina sustancialmente la expresión de la cadena pesada de IgM funcional.
20. El ungulado de la reivindicación 17, donde dicha mutación reduce la expresión de la cadena ligera de Ig funcional.
21. El ungulado de la reivindicación 20, donde dicha mutación elimina sustancialmente la expresión de la cadena ligera de Ig funcional.
22. El ungulado de la reivindicación 17, donde dicha mutación reduce la expresión de la cadena pesada de IgM funcional y la cadena ligera de Ig funcional.
23. El ungulado de la reivindicación 17, donde dicha mutación elimina sustancialmente la expresión de la cadena pesada de IgM funcional y la cadena ligera de Ig funcional.
24. El ungulado de la reivindicación 17, que comprende uno o mas ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen Ig xenógeno que sufre re-arreglo y expresa mas de una molécula de Ig xenógena.
25. El ungulado de la reivindicación 24, donde dicho ácido nucleico es sustancialmente humano.
26. El ungulado de la reivindicación 17, que comprende ácido nucleico que codifica un anti-cuerpo xenógeno.
27. El ungulado de la reivindicación 26, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo humano.
28. El ungulado de la reivindicación 26, donde dicho anti-cuerpo es un anti-cuerpo policlonal.
29. El ungulado de la reivindicación 24, donde dicha cadena de Ig o anti-cuerpo es expresado en suero.
30. El ungulado de la reivindicación 24, donde dicho ácido nucleico está contenido dentro de un fragmento de cromosoma .
31. El ungulado de la reivindicación 30, donde dicho fragmento de cromosoma es un ?HAC.
32. El ungulado de la reivindicación 30, donde dicho fragmento de cromosoma es un ??HAC.
33. El ungulado de la reivindicación 24, donde dicho ácido nucleico está integrado en un cromosoma de dicho ungulado.
34. El ungulado de la reivindicación 26, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género.
35. El ungulado de la reivindicación 34, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo humano.
36. El ungulado de la reivindicación 17, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
37. El ungulado de la reivindicación 36, donde dicho ungulado es un bovino.
38. Una célula somática de ungulado, que comprende uno o mas ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen Ig xenógeno, donde dicho gen es capaz de sufrir re-arreglo y expresar una o mas moléculas de Ig xenógenas en células B.
39. La célula de la reivindicación 38, donde dicho ácido nucleico codifica un anti-cuerpo xenógeno.
40. La célula de la reivindicación 38, donde dicho ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma.
41. La célula de la reivindicación 40, donde dicho fragmento de cromosoma es un ?HAC o un ??HAC.
42. La célula de la reivindicación 38, donde dicho ácido nucleico está integrado en un cromosoma de dicha célula.
43. La célula de la reivindicación 38, donde dicho ácido nucleico es sustancialmente humano.
44. La célula de la reivindicación 39, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género.
45. La célula de la reivindicación 44, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo humano.
46. La célula de la reivindicación 38, donde dicha célula es un fibroblasto fetal.
47. La célula de la reivindicación 38, donde dicha célula es una célula B.
48. La célula de la reivindicación 38, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
49. La célula de la reivindicación 47, donde dicho ungulado es un bovino.
50. Una célula somática de ungulado, que comprende una mutación es un ácido nucleico que codifica una cadena pesada y/o ligera de Ig.
51. La célula de la reivindicación 50, que comprende una mutación en un ácido nucleico que codifica una cadena pesada de IgM.
52. La célula de la reivindicación 51, que comprende una mutación en ambos alelos de dicha cadena pesada de IgM.
53. La célula de la reivindicación 50, que comprende una mutación en un ácido nucleico que codifica una cadena ligera de Ig.
54. La célula de la reivindicación 53, que comprende una mutación en ambos alelos de dicha cadena ligera de Ig.
55. La célula de la reivindicación 50, donde dicha mutación es una mutación sin sentido o eliminación.
56. La célula de la reivindicación 50, comprendiendo además uno o mas ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen Ig xenógeno, donde dicho gen es capaz de sufrir re-arreglo y expresar una o mas moléculas Ig xenógenas en células B.
57. La célula de la reivindicación 56, donde dicho ácido nucleico es sustancialmente humano.
58. La célula de la reivindicación 56, comprendiendo además ácido nucleico gue codifica un anti-cuerpo xenógeno.
59. La célula de la reivindicación 56, donde dicho ácido nucleico esté contenido en un fragmento de cromosoma, con lo cual se mantiene dicho ácido nucleico en dicha célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión.
60. La célula de la reivindicación 59, donde dicho fragmento de cromosoma es un ?HAC o un ??HAC.
61. La célula de la reivindicación 56, donde dicho ácido nucleico es integrado en un cromosoma de dicha célula.
62. La célula de la reivindicación 58, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género.
63. La célula de la reivindicación 62, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo humano.
64. La célula de la reivindicación 50, donde dicha célula es un fibroblasto fetal.
65. La célula de la reivindicación 50, donde dicha célula es una célula B.
66. La célula de la reivindicación 50, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
67. La célula de la reivindicación 66, donde dicho ungulado es un bovino.
68. Un hibridoma formado de la fusión de la célula de la reivindicación 47 o 65 con una célula de mieloma.
69. Un método de producir anti-cuerpos, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) administrar uno o mas antígenos de interés a un ungulado que comprende ácido nucleico que codifica un lugar de gen de anti-cuerpo xenógeno, donde los segmentos de ácido nucleico en dicho lugar de gen sufre re-arreglo, dando como resultado la producción de anti-cuerpos específicos a dicho antígeno; y (b) recuperar dichos anti-cuerpos de dicho ungulado.
70. El método de la reivindicación 69, donde dicho ungulado comprende una mutación que reduce la expresión de un anti-cuerpo endógeno.
71. El método de la reivindicación 70, donde dicha mutación reduce la expresión de la cadena pesada de IgM funcional .
72. El método de la reivindicación 70, donde dicha mutación reduce la expresión de la cadena ligera de Ig funcional.
73. El método de la reivindicación 69, donde dicho ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma.
74. El método de la reivindicación 73, donde dicho fragmento de cromosoma es un ?HAC o un ??HAC.
75. El método de la reivindicación 73, donde se mantiene ácido nucleico es una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión.
76. El método de la reivindicación 69, donde dicho ácido nucleico es integrado en un cromosoma de dicho ungulado.
77. El método de la reivindicación 69, donde dicho ácido nucleico es sustancialmente humano.
78. El método de la reivindicación 69, donde la cadena ligera de dichos anti-cuerpos es codificada por un ácido nucleico humano .
79. El método de la reivindicación 69, donde la cadena pesada de dichos antí-cuerpos es codificada por un ácido nucleico humano .
80. El método de la reivindicación 69, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
81. El método de la reivindicación 79, donde dicho ungulado es un bovino.
82. El método de la reivindicación 69, donde dichos anti-cuerpos son monoclonales .
83. El método de la reivindicación 69, donde dichos anti-cuerpos son policlonales.
84. El método de la reivindicación 69, donde dichos anti-cuerpos son recuperados del suero o la leche de dicho ungulado .
85. Un método de producir anti-cuerpos, dicho método comprendiendo recuperar anti-cuerpos xenógenos de un ungulado que comprende ácido nucleico que codifica un lugar de gen de anticuerpo xenógeno, donde los segmentos de ácido nucleico en dicho lugar de gen sufren re-arreglo, dando como resultado la produc-ción de anti-cuerpos xenógenos.
86. El método de la reivindicación 85, donde dicho ungulado comprende una mutación que reduce la expresión de un anti-cuerpo endógeno.
87. El método de la reivindicación 86, donde dicha mutación reduce la expresión de la cadena pesada de IgM funcio-nal .
88. El método de la reivindicación 86, donde dicha mutación reduce la expresión de la cadena ligera de Ig funcional.
89. El método de la reivindicación 85, donde dicho ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma.
90. El método de la reivindicación 89, donde dicho fragmento de cromosoma es un ?HAC o un ??HAC.
91. El método de la reivindicación 89, donde se mantiene ácido nucleico en una célula de ungulado independíentemente del cromosoma anfitrión.
92. El método de la reivindicación 85, donde dicho ácido nucleico es integrado en un cromosoma de dicho ungulado.
93. El método de la reivindicación 85, donde dicho ácido nucleico es sustancialmente humano.
94. El método de la reivindicación 93, donde la cadena ligera de dichos anti-cuerpos es codificada por un ácido nucleico humano .
95. El método de la reivindicación 93, donde la cadena pesada de dichos anti-cuerpos es codificada por un ácido nucleico humano .
96. El método de la reivindicación 85, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
97. El método de la reivindicación 96, donde dicho ungulado es un bovino.
98. El método de la reivindicación 85, donde dichos anti-cuerpos son monoclonales.
99. El método de la reivindicación 85, donde dichos anti-cuerpos son policlonales.
100. El método de la reivindicación 85, donde dichos anti-cuerpos son recuperados del suero o la leche de dicho ungulado .
101. Un método de producir un ungulado transgénico, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) insertar una célula, una masa de cromatina de una célula, o un núcleo de una célula en un oocito, donde dicha célula comprende una primera mutación en un ácido nucleico de cadena pesada y/o cadena ligera de anti-cuerpo endógeno; y (b) transferir dicho oocito o un embrión formado a partir de dicho oocito al útero de un ungulado anfitrión bajo condiciones que permitan a dicho oocito o dicho embrión desarrollarse en un feto.
102. El método de la reivindicación 101, donde dicho feto se desarrolla en progenie viable.
103. El método de la reivindicación 101, donde dicha célula es preparada por medio de un método que comprende insertar en dicha célula un ácido nucleico que comprende un cassette que incluye un promotor enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y enlazado operativamente a uno o mas ácidos nucleicos que tienen identidad de secuencia sustancial a dicho ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera de anti-cuerpo; con lo cual dicho cassette es integrado en un alelo endógeno de dicho ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera de anti-cuerpo.
104. El método de la reivindicación 101, donde dicha célula es producida por un método que comprende los pasos de: (a) insertar en dicha célula un ácido nucleico que comprende un primer cassette que incluye un primer promotor enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un primer marcador seleccionable y enlazado operativamente a un primer ácido nucleico que tiene identidad de secuencia sustancial con dicho ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera de anti-cuerpo; con lo cual dicho primer cassette es integrado en un primer alelo endógeno de dicho ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera de anti-cuerpo que produce una primera célula transgénica; y (b) insertar en dicha primera célula transgénica un ácido nucleico que comprende un segundo cassette que incluye un segundo promotor enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un segundo marcador seleccionable y enlazado operativa-mente a un segundo ácido nucleico que tiene identidad de secuencia sustancial con dicho ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera de anti-cuerpo; donde dicho segundo marcador seleccionable difiere de dicho primer marcador seleccionable; con lo cual dicho segundo cassette es integrado en un segundo alelo endógeno de dicho ácido nucleico de cadena pesada o cadena ligera de anti-cuerpo que produce una segunda célula transgénica.
105. El método de la reivindicación 101, comprendiendo además los pasos de: (c) aislar una célula de dicho embrión, dicho feto, o la progenie producida de dicho feto; (d) introducir una segunda mutación en un ácido nucleico de cadena pesada y/o cadena ligera de anti-cuerpo endógeno en dicha célula; (e) insertar dicha célula, una masa de cromatina de dicha célula, o un núcleo de dicha célula en un oocito; y (f) transferir dicho oocito o un embrión formado a partir de dicho oocito al útero de un ungulado anfitrión bajo condiciones que permitan a dicho oocito o dicho embrión desarrollarse en un feto.
106. El método de la reivindicación 101, donde dicha célula comprende uno o mas ácidos nucleicos que codifican todo o parte de un gen Ig xenógeno, donde dicho gen es capaz de sufrir re-arreglo y expresar una o mas moléculas de Ig xenógenas en células B, y donde dicha célula es insertada en dicho oocito.
107. El método de la reivindicación 106, donde dicho ácido nucleico codifica un anti-cuerpo xenógeno.
108. El método de la reivindicación 106, donde dicho ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma.
109. El método de la reivindicación 108, donde dicho fragmento de cromosoma es un ?HAC o un ??HAC.
110. El método de la reivindicación 108, donde dicho ácido nucleico es mantenido en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión.
111. El método de la reivindicación 106, donde dicho ácido nucleico es integrado en un cromosoma de dicha célula.
112. El método de la reivindicación 107, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género.
113. El método de la reivindicación 112, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo humano.
114. El método de la reivindicación 101, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
115. El método de la reivindicación 114, donde dicho ungulado es un bovino.
116. Un método de producir un ungulado transgénico, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) insertar una célula que tiene uno o mas ácidos nucleicos xenógenos en un oocito; donde dicho ácido nucleico xenógeno codifica todo o parte de un gen Ig xenógeno; dicho gen capaz de sufrir re-arreglo y expresar mas de una molécula de Ig xenógena en células B; y (b) transferir dicho oocito o un embrión formado a partir de dicho oocito en el útero de un ungulado anfitrión bajo condiciones que permitan a dicho oocito o dicho embrión desarrollarse en un feto.
117. El método de la reivindicación 116, donde dicho ácido nucleico codifica un anti-cuerpo xenógeno.
118. El método de la reivindicación 117, donde dicho anti-cuerpo es un anti-cuerpo policlonal.
119. El método de la reivindicación 116 o 117, donde dicha cadena o anti-cuerpo de inmunoglobulina es expresado en suero y/o leche.
120. El método de la reivindicación 116, donde dicho feto se desarrolla en progenie viable.
121. El método de la reivindicación 116, donde dicho ácido nucleico está contenido en un fragmento de cromosoma.
122. El método de la reivindicación 121, donde dicho fragmento de cromosoma es un ?HAC o un ??HAC.
123. El método de la reivindicación 121, donde dicho ácido nucleico es mantenido en una célula de ungulado indepen-dientemente del cromosoma anfitrión.
124. El método de la reivindicación 116, donde dicho ácido nucleico es integrado en un cromosoma de dicha célula.
125. El método de la reivindicación 116, donde dicho ácido nucleico es sustancialmente humano.
126. El método de la reivindicación 116, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo de otro género.
127. El método de la reivindicación 126, donde dicho anti-cuerpo xenógeno es un anti-cuerpo humano.
128. El método de la reivindicación 116, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
129. El método de la reivindicación 128, donde dicho ungulado es un bovino.
130. El ungulado de la reivindicación 8 o 30, donde dicho ácido nucleico es mantenido en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión.
131. La célula de la reivindicación 40, donde dicho ácido nucleico es mantenido en una célula de ungulado independientemente del cromosoma anfitrión.
132. Anti-suero de ungulado, que comprende inmunoglo-bulinas (Igs) humanas policlonales .
133. Leche de ungulado, que comprende Igs humanas policlonales .
134. El anti-suero o la leche de ungulado de la reivindicación 132 o la reivindicación 133, donde dicho ungulado es un bovino, ovino, porcino o caprino.
135. El anti-suero o la leche de ungulado de la reivindicación 134, donde dicho ungulado es un bovino.
136. El anti-suero o la leche de ungulado de la reivindicación 132 o la reivindicación 133, donde dichas Igs están dirigidas contra un antígeno deseado.
137. Un método de producir un ungulado transgénico, dicho método comprendiendo los pasos de : (a) insertar una célula, una masa de cromatina de una célula, o un núcleo de una célula en un oocito, donde dicha célula comprende una primera mutación en un gen endógeno, donde dicho gen no es expresado naturalmente por dicha célula; y (b) transferir dicho oocito o un embrión formado a partir de dicho oocito al útero de un ungulado anfitrión bajo condiciones que permitan a dicho oocito o dicho embrión desarro-liarse en un feto.
138. El método de la reivindicación 137, donde dicho feto se desarrolla en progenie viable.
139. El método de la reivindicación 137, donde dicha célula es preparada por un método que comprende insertar en dicha célula un ácido nucleico que comprende un cassette que incluye un promotor enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y enlazado operativamente a uno o mas ácidos nucleicos que tienen identidad de secuencia sustancial a dicho gen; con lo cual dicho cassette es integrado en un alelo endógeno de dicho gen.
140. El método de la reivindicación 137, donde dicha célula es producida por un método que comprende los pasos de: (a) insertar en dicha célula un ácido nucleico que comprende un primer cassette que incluye un primer promotor enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un primer marcador seleccionable y enlazado operativamente a un primer ácido nucleico que tiene identidad de secuencia sustancial con dicho gen; con lo cual dicho primer cassette es integrado en un primer alelo endógeno de dicho gen que produce una primera célula transgénica; y (b) insertar en dicha primera célula transgénica un ácido nucleico que comprende un segundo cassette que incluye un segundo promotor enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un segundo marcador seleccionable y enlazado operativa-mente a un segundo ácido nucleico que tiene identidad de secuencia sustancial con dicho gen; donde dicho segundo marcador seleccionable difiere de dicho primer marcador seleccionable; con lo cual dicho segundo cassette es integrado en un segundo alelo endógeno de dicho gen que produce una segunda célula transgénica.
141. El método de la reivindicación 137, comprendiendo además los pasos de: (c) aislar una célula de dicho embrión, dicho feto, o progenie producida a partir de dicho feto; (d) introducir una segunda mutación en un gen endógeno en dicha célula; (e) insertar dicha célula, una masa de cromatina de dicha célula, o un núcleo de dicha célula en un oocito; y (f) transferir dicho oocito o un embrión formado a partir de dicho oocito al útero de un ungulado anfitrión bajo condiciones que permiten a dicho oocito o dicho embrión desarrollarse en un feto.
142. El método de la reivindicación 137, donde dicha célula es un fibroblasto.
143. El método de la reivindicación 142, donde dicha célula es un fibroblasto fetal.
144. El método de la reivindicación 137, donde dicho gen codifica un anti-cuerpo.
145. El ungulado de la reivindicación 1 o la reivindicación 17, que comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica alfa- (1, 3) -galactosiltrans-ferasa .
146. El ungulado de la reivindicación 1 o la reivindicación 17, que comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno gue codifica una proteína prión.
147. El ungulado de la reivindicación 1 o la reivindicación 17, que comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica la cadena J.
148. El ungulado de la reivindicación 1 o la reivindicación 17, que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena J endógena.
149. El ungulado de la reivindicación 148, donde dicha cadena J es una cadena J humana.
150. La célula de la reivindicación 38 o la reivindicación 50, que comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica alfa- ( 1, 3) -galactosiltrans-ferasa .
151. La célula de la reivindicación 38 o la reivindicación 50, que comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica una proteína prión.
152. La célula de la reivindicación 38 o la reivindi-cación 50, que comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica una cadena J.
153. La célula de la reivindicación 38 o 50, que comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica una cadena J.
154. La célula de la reivindicación 153, donde dicha cadena J es una cadena J humana.
155. El método de las reivindicaciones 69, 85, 101 o 116, donde dicho ungulado comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica alfa- (1,3) -galactosi1transferasa.
156. El método de la reivindicación 69, 85, 101 o 116, donde dicho ungulado comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica una proteina prión,
157. El método de la reivindicación 69, 85, 101, 116 o 137, donde dicho ungulado comprende una mutación en uno o ambos alelos de un ácido nucleico endógeno que codifica una cadena J.
158. El método de la reivindicación 69, 85, 101, 116 o 137, donde dicho ungulado comprende un ácido nucleico que codifica una cadena J exógena.
159. El método de la reivindicación 158, donde dicha cadena J es una cadena J humana.