KR20080005616A - 클로닝된 트랜스제닉 유제류에서 이종 (사람)면역글로블린의 발현 - Google Patents

클로닝된 트랜스제닉 유제류에서 이종 (사람)면역글로블린의 발현 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내인성 항체의 발현의 불활성화 및 감소, 및 이종 항체, 바람직하게는 사람 항체의 발현을 일으키는 유전적 변형을 포함하는 트랜스제닉 소의 생산에 관한 것이다. 이는 IgM H쇄 발현의 불활성화 및 임의로는 Ig L쇄 발현의 불활성화 및 추가적으로 소 이외의 항체, 바람직하게는 사람 항체의 발현을 일으키는 인공 염색체의 도입에 의해 달성된다.
이종 항체, 트랜스제닉 동물, 유제류.

Description

클로닝된 트랜스제닉 유제류에서 이종 (사람) 면역글로블린의 발현 {Expression of Xenogenous (Human) Immunoglobulins in Cloned, Transgenic Ungulates}
도 1a는 Ig 넉아웃 및 사람 인공 염색체를 포함한 소를 제조하기 위한 방법의 개략도이다. 도 1a의 시간축은 Ig 넉아웃 벡터 및 넉아웃 세포를 제조하기 위한 개산된 18개월, 넉아웃 세포로부터 태아를 생성하기 위한 2개월, 후속 넉아웃을 수행하기 위한 9개월, 송아지가 태어나기 위한 9개월의 임신기간, 송아지로부터 배가 생성되기 전의 12개월, HAC 전달을 수행하기 위한 6개월에 기초한다.
도 1b는 내인성 Ig 유전자 내에 돌연변이를 포함하고, ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 포함한 소를 제조하는 데 사용되는 방법의 개략도이다. 도 1b의 시간축은 수컷 및 암컷 넉아웃 세포를 단리하기 위해 3개월 동안 총 3,000개의 콜로니에 대해 일주일마다 25O개의 콜로니를 스크린한 것으로 개산된다. 1,500개 콜로니 당 하나 이상의 넉아웃 콜로니가 생산되는 것으로 추정된다. 동형접합성 넉아웃 유제류는 (1) 핵 전달 전에 단리된 넉아웃 세포 중에 두 번째 Ig 돌연변이를 도입하고, (2) 배, 태아 (예를 들어, 임신 ~60일의 태아), 또는 일차 핵 전달로부터 생성된 자손으로부터 얻은 세포 중에 제2 Ig 돌연변이를 도입하고, 생성된 동형접합성 세포를 이차 핵 전달에서 공여 세포로 사용하거나, 또는 (3) 반접합성 유제류를 교배하여 제조 될 수 있다. 도 1a 및 1b에서, "동형접합성"이란 동형접합을 나타내고; "반접합성"이란 반접합을 나타내고; "H"는 H쇄를 나타내고; "L"은 L쇄를 나타내고; "HAC"는 사람 인공 염색체를 나타내고; "HAC1"은 HAC를 나타내고; "HAC2"는 다른 HAC를 의미한다.
도 2a는 본 발명에 따른 μ(IgM H쇄) 넉아웃 구조체를 포함한다.
도 2b는 홀스타인 소의 면역글로블린의 제한효소 지도이다.
도 3a 및 3b는 도 3c에 예시된 μ넉아웃 DNA 구조체를 제조하기 위해 사용된 구조체 "pSTneoB" 및 "pLoxP-STneoB"의 개략적 예시를 포함한다.
도 3d는 μ넉아웃 구조체 내에 제1 상동성 영역으로 사용된 1.5kb 영역의 게놈 소 μH쇄 유전자좌의 폴리뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:47).
도 3e는 μ넉아웃 구조체 내에 제2 상동성 영역으로 사용된 3.1kb 영역의 게놈 소 μH쇄 유전자좌의 폴리뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:48). 이 서열에서, 각각의 "n"은 임의의 뉴클레오티드를 나타내거나 또는 뉴클레오티드가 없음을 나타낸다. 연속적 "n" 뉴클레오티드 영역은 폴리뉴클레오티드 서열이 결정되지 않은 약 0.9 내지 1.0kb 영역을 나타낸다.
도 3f는 퓨로마이신 내성, 소 μH쇄 넉아웃 구조체의 개략도이다.
도 3g는 소 κL쇄의 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO: 60). 이 서열의 전부 또는 일부는 κL쇄의 넉아웃 구조체에서 사용될 수 있다. 아울러, 이 κL쇄는 κL쇄 넉아웃 구조체에서 사용되기 위한 게놈 κL쇄를 단리하기 위해 사용될 수 있다.
도 4는 ΔHAC 또는 ΔΔHAC의 구조체의 개략도이다.
도 5는 ΔHAC 태아내의 사람 H쇄 및 L쇄를 코딩하는 게놈 DNA의 존재를 나타내는 아가로스 겔 사진이다.
도 6은 임신 77일째의 ΔHAC 태아 (태아 #5996) 내의 사람 Cμ엑손 3 및 4의 발현을 나타내는 아가로스 겔 사진이다.
도 7은 ΔHAC 태아 #5996 내의 내인성 소 H쇄의 재배열을 나타내는 아가로스 겔 사진이다.
도 8은 ΔHAC 태아 #5996 내의 재배열된 사람 H쇄의 발현을 나타내는 아가로스 겔 사진이다.
도 9는 ΔHAC 태아 #5996 내의 사람 H쇄 유전자좌로부터 스플라이싱된 불변 영역의 발현을 나타내는 아가로스 겔 사진이다.
도 10은 ΔHAC 태아 #5996 내의 재배열된 사람 H쇄의 발현을 나타내는 아가로스 겔 사진이다.
도 11a는 ΔHAC 태아 #5996 내의 재배열된 사람 H쇄의 폴리뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:49).
도 11b는 이 서열 영역 ("질의(Query)")과 사람 항-폐렴구균 항체 ("개체(Sbjt)")의 서열 배열이다 (SEQ ID NO: 각각 50 및 51). ΔHAC 태아 #5996의 질의 서열의 경우, 사람 항-폐렴구균의 상응하는 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드만을 나타내었다.
도 12a 및 12b는 ΔHAC 태아 #5996의 재배열된 사람 H쇄의 전사체의 두 개의 추가적인 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 52 및 54) 및 그 추정된 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO: 53 및 55)이다.
도 13은 사람 H쇄 및 L쇄 면역글로블린 유전자좌 모두를 포함하는 ΔΔHAC 태아 #5580을 나타내는 아가로즈 겔 사진이다.
도 14는 사람 H쇄 및 L쇄 유전자좌 모두를 함유하는 ΔΔHAC 태아 #5442A 및 5442B를 나타내는 아가로즈 겔 사진이다.
도 15는 ΔΔHAC 태아 #5442A 내의 사람 H쇄 유래의 스플라이싱된 μ불변 영역의 발현을 나타내는 아가로즈 겔 사진이다.
도 16은 ΔΔHAC 태아 #5868A 내의 사람 H쇄 유전자좌의 재배열 및 발현을 나타내는 아가로즈 겔 사진이다.
도 17은 ΔΔHAC 태아 #5442A 및 5442B 내의 사람 Ig λ유전자좌의 재배열 및 발현을 나타내는 아가로즈 겔 사진이다.
도 18은 ΔΔHAC 태아 #5442A 내의 사람 Ig λ유전자좌의 재배열 및 발현을 나타내는 아가로즈 겔 사진이다.
도 19는 ΔΔHAC 태아 #5868A 내의 사람 Ig λ유전자좌의 재배열 및 발현을 나타내는 아가로즈 겔 사진이다.
도 20은 ΔΔHAC 태아 #5442A 유래의 재배열된 사람 L쇄 전사체의 폴리뉴클레오티드 서열 및 상응하는 추정된 아미노산 서열이다 (각각, SEQ ID NO: 56 및 57).
도 21은 ΔΔHAC 태아 #5442A 유래의 재배열된 사람 L쇄 전사체의 다른 폴리 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 추정된 아미노산 서열이다 (각각, SEQ ID NO: 58 및 59).
도 22a-22h는 ΔΔHAC 태아 #5442A (도 22a-22d) 및 5442B (도 22e-22h)에 의한 사람 λL쇄 및 소 H쇄 단백질의 FACS 분석의 그래프이다. 이들 태아의 비장 유래의 림프세포를 피코에리트린 표지된 항-사람 λ항체와 반응시키거나 (도 22c 및 22d), FITC 표지된 항-소 IgM 항체로 반응시키거나 (도 22d 및 22h), 또는 항체와 반응시키지 않고 (도 22a, 22b, (22e 및 22f)), 이후 FASCalibur 세포 분류기 상에서 분석하였다. 한 항체로 표지된 세포의 백분율을 각각의 히스토그램 밑에 표시하였다.
도 23은 소 세포 내의 내인성의 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자 중으로 퓨로마이신 내성 유전자 및 전사 종결 서열을 도입하는 데 사용된 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 넉아웃 벡터의 개략도이다.
도 24는 AAV 표적 벡터의 골격으로 사용된 엑손 2,3 및 4를 포함하는 BamHI-XhoI 단편의 개략도이다. 네오마이신 내성 마커가 엑손 4 중으로의 삽입에 의한 유전자좌의 삽입 돌연변이를 위해 사용되었다. 적절한 표적의 후속적인 확인을 위해 사용된 PCR 프라이머의 어닐링 자리의 위치가 표시되었다.
도 25는 내인성 소 IgH 서열을 제거하기 위해 제조된 아데노-관련 바이러스 구조체의 구조의 개략도이다.
도 26은 적절한 표적화 이벤트를 위한 각각의 형질도입된 클론의 PCR 분석을 보여주는 아가로즈 겔의 사진이다. 이 실험에서 사용된 벡터는 도 24에 나타내었 다. 적절한 표적화를 나타내는 PCR 생성물은 별표로 표시하였다.
도 27은 HAC 운반 배에 대한 임신율을 나타내는 표이다.
본 발명은 재배열이 일어나고 다양한 항체 분자를 발현하는 이종 (xenogenous) 항체 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함하는 유전적으로 개질된 유제류 (ungulate, 有蹄類)에 관한 것이다. 특히, 이종 항체 유전자는 사람 기원의 것일 수 있다. 아울러, 본 발명은 내인성 항체 유전자의 발현이 감소 또는 제거된 유제류를 제공한다. 유제류 (예를 들어, 소) 내의 유전적 개질은 핵 전달 및 분자 기술의 조합을 사용하여 만들어진다. 이들 클로닝된 트랜스제닉 유제류는 치료, 진단 및 정제 목적과 같은 용도를 가진 보충가능하고 이론적으로 무한한 이종 폴리클로날 항체, 특히 사람 항체를 제공한다.
발명의 배경
1890년대에 신바사부로 키타자토 (Shinbasaburo Kitazato) 및 에밀 베링 (Emil Behring)이 특이한 결과의 실험을 보고하였다.; 특히, 이들은 면역 동물에서 혈청을 얻어 이를 다른 비면역 동물에게 주사하여 한 동물에서 다른 동물로 면역성이 전달될 수 있음을 입증하였다. 이 획기적인 실험은 임상 실무에서 수동적 면역의 도입의 기초가 되었다. 현재, 수동적 면역을 위한 사람 면역글로블린 (Ig)의 제조 및 사용은 표준 임상 실무이다. 미국에서만, 한 해에 1,400,000,000 달러의 사람 Ig 시장이 존재하며, 매년 16 계량 톤 이상의 사람 항체가 정맥내 항체 치료법에 사용되고 있다. 고도로 산업화된 국가 경제에서 필적할 만한 수준의 소비가 존재하며, 개발 도상국에서 그 수요가 급격하게 증가할 것으로 예상될 수 있다. 현재, 수동적 면역을 위한 사람 항체는 사람 공여자로부터 얻은 혈청에서 얻고 있다. 이는 치료 및 예방 용도로 사용할 수 있는 사람 항체의 양에 근본적인 한계가 있다는 것을 의미한다. 이미, 그 수요가 공급을 초과하고 있으며, 그 이용의 심각한 부족이 일반적으로 되었다.
불충분한 사람 Ig 공급과 관련된 문제의 일부를 해결하기 위한 노력으로, 다양한 기술이 개발되었다. 예를 들어, 조직 배양에서 재배열 방법에 의한 사람 Ig의 생성이 일반적이다. 특히, CHO 발현 시스템에서 사람 Ig의 재배열 발현이 잘 알려져 있으며, 현재 치료 용도의 다수의 사람 면역글로블린 (Ig) 및 키메라 항체의 제조를 위해 이용되고 있다.
사람 항체 (e.g., 모노클로날 항체)의 생성을 위해 재배열되지 않은 사람 면연글로블린 유전자를 보유한 마우스가 개발되었다 (WO 제98/24893호; W0 제96/33735호; WO 제97/13852호; W0 제98/24884호; W0 제97/07671호 (EP 제0843961호); U. S. 특허 제5,877,397호; U. S. 특허 제5,874,299호; U. S. 특허 제5,814,318호; U. S. 특허 제5,789,650호; U. S. 특허 제5,770,429호; U. S. 특허 제5,661,016호; U. S. 특허 제5,633,425호; U. S. 특허 제5,625,126호; U. S. 특허 제5,569,825호; 및 U. S. 특허 제5,545,806호 참조).
추가적으로, WO 제00/10383호 (EP 제1106061호)는 사람 염색체 단편을 개질 하고 이 단편을 미세세포 융합을 통해 특정 세포 중으로 전달하는 것을 기술하고 있다.
아울러, WO 제01/35735호는 소 IgM H쇄 넉아웃을 기술하고 있다.
US 특허 제5,849,992호 (1998. 12. 15 등록, Meade et al.) 및 US 특허 제5,827,690호 (1998. 10. 27 등록, Meade et al.)는 포유류 상피 세포 내에서의 항체의 발현을 제공하는 프로모터 조절 하에서 사람 Ig 유전자를 발현하는 마우스, 양, 돼지, 소, 및 염소를 포함하는 트랜스제닉 동물의 유즙 중에서 모노클로날 항체의 제조를 기술하고 있다. 특히, 이는 이 같은 동물, 예를 들어, 소의 유즙 중에서 항체의 발현을 가져온다.
그러나, 이전에 무엇이 보고되었든, 목적한 종의 항체(특히, 폴리클로날 항체), 특히 사람 Igs를 혈류 내에서 제조하고, 목적한 항원에 대해 특이적인 다양한 항체의 배열을 제공하는 개선된 방법 및 향상된 트랜스제닉 동물 (특히, 소)가 매우 바람직하다. 매우 특히, 유제류, 예를 들어, 소 중에서 사람 Ig의 제조가 특히 유익한데, (1) 소는 다량의 항체를 제조할 수 있고, (2) 소는 사람 항원에 대한 사람 항체를 제조하는 데 사용될 수 있기 때문이다. 다량의 폴리클로날 항체의 입수가능성은 감염성 질환의 치료 및 예방, 면역 시스템의 조절, 사람 세포의 제거 (예를 들어, 암 세포), 및 특정 사람 분자의 조절에 유용할 것이다. 사람 Ig가 마우스에서 발현되지만, 소 또는 다른 유제류에서 사람 Ig의 매단편이 재배열되고 발현될 것인지는 예상할 수 없는데, 이는 항체 유전자 구조, 항체 제조 기작 및 B 세포 기능이 상이하기 때문이다. 특히, 마우스와는 달리, 소 및 양은 면역생리학적인 면에서 사람과 다르다 (Lucier et al., J. Immkunolo. 161:5438, 1998; Parg et al., J. Immunol. 157:5748, 1996; 및 Butler, REV. Sci. Tech. 17:43, 2000). 예를 들어, 소 및 양에서의 항체 유전자 다양화는 사람 및 마우스에서 유전자 재배열보다는 유전자 전환 (gene conversion)에 더 많이 의존한다. 또한, 사람 및 마우스에서 B 세포의 일차 위치는 골수인데 반해, 소 및 양의 B세포는 일리얼 페이어스 패치 (illeal Payer's patch)에 위치하고 있다. 그 결과, 본 발명 이전에는 사람 면역글로블린 유전자좌의 면역글로블린 재배열 및 다양화가 소 (또는 다른 유제류)의 B 세포 계열에서도 일어날 것인지 예측하는 것이 비록 불가능하지는 않더라도 어려운 일이었다. 아울러, 그 내생 Ig가 없거나 또는 사람 항체가 간섭할 때 소가 살아남을 수 있을지, 즉, 그 정상적인 면역 기능을 발휘할 수 있을지 전혀 예상할 수 없었다. 예를 들어, 사람 Ig을 발현하는 소 B 세포가 정확하게 일리얼 페이어스 패치로 이동할 것인지 알 수 없었는데, 이는 이 이동이 사람에서는 일어나지 않기 때문이다. 또한, 보체 활성화, 사이토카인 방출 유도 및 항체 제거를 매개하는 사람 Fc 수용체 기능이 소 시스템에서 정상적일 것인지 분명하지 않았다.
본 발명의 목적은 사람, 또는 다른 종의 Ig 유전자좌를 재배열하고 발현하는 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 트랜스제닉 소)를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 이는 내인성 Ig에 추가하여 또는 이를 대신하여 사람 또는 기타 종의 Ig를 생산하는 B 세포를 갖는 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 소)를 제조하기 위해 사람 Ig 유전자를 포함하는 사람 염색체 단편을 안정하게 도입함으로써 달성된다. 또 한, 이는 이종 면역글로블린 사슬 또는 이종 항체를 코딩하는 핵산을 유제류의 염색체 중에 도입함으로써 달성된다. 본 발명의 추가적인 목적은 내인성 Ig의 발현이 감소되거나 또는 넉아웃된 트랜스제닉 유제류(예를 들어, 트랜스제닉 소)를 제조하는 것이다. 예를 들어, 넌센스 또는 결실 돌연변이가 내인성 면역글로블린쇄 또는 항체를 코딩하는 핵산에 도입될 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 목적은 L쇄 유전자좌의 불변 영역 엑손 및(또는) μ불변 영역 엑손이 넉아웃되고, 다른 종의 면역글로블린 (바람직하게는 사람)을 코딩하는 유전자좌를 포함하는 인공 염색체가 안정하게 도입된 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 트랜스제닉 소)를 제조하는 것이다.
본 발명의 보다 구체적인 목적은 내인성 L쇄 유전자좌의 불변 영역 엑손 및(또는) H쇄 유전자좌의 μ불변 영역 엑손이 넉아웃되고, 이종 H쇄 및 L쇄 Ig 유전자를 포함하는 인공 염색체(들), 바람직하게는 사람 H쇄 및 L쇄 유전자좌를 포함하는 사람 인공 염색체(들)이 안정하게 도입되어 다른 종, 바람직하게는 사람의 Ig를 생산하고, 자체 내인성 Ig를 생산하지 않는 트랜스제닉 유제류를 생성하는 핵 전달 및 상동성 재조합의 사용에 의해 클로닝된 유제류 (예를 들어, 클로닝된 소)를 제조하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 내인성 IgM H쇄 유전자의 하나 또는 두 대립 유전자가 돌연변이된, 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 분단된 유제류 (예를 들어, 소) 체세포 또는 태아 간세포 (ES), 바람직하게는 섬유아세포 또는 B 세포, 바람직하게는 수컷 체세포를 제조하는 것이다. 관련된 본 발명의 목적은 IgM H쇄 유전자좌의 하나 또는 두 대립 유전자가 돌연변이된, 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 분단된 클로닝된 유제류 (예를 들어, 소) 태아 및 자손을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 IgM H쇄 유전자의 한 대립 유전자가 돌연변이된, 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 분단된 유제류 (예를 들어, 소) 체세포 또는 ES 세포, 바람직하게는 섬유아세포 또는 B 세포, 예를 들어, 암컷 또는 수컷 체세포를 제조하는 것이다.
본 발명의 관련된 목적은 내인성 H쇄 IgM 유전자의 한 대립 유전자가 돌연변이된, 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 분단된 클로닝된 (유제류, 예를 들어, 소) 태아 또는 자손을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 각각 돌연변이, 예를 들어, 내인성 IgM의 한 대립 유전자의 분단 또는 Ig L쇄의 한 대립 유전자의 분단을 포함하는 수컷 및 암컷을 교배시키거나 또는 순차적 상동성 재조합으로 수컷 및 암컷 H쇄 및 L쇄 반접합성 (hemizygous) 넉아웃 (M 및 F 반접합성 H/L) 태아 및 유제류 송아지를 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 순차적 상동성 재조합에 의해 또는 상기에서 언급된 수컷 및 암컷 H쇄 및 L쇄 반접합성 넉아웃 동물 (M 및 F 반접합성 H/L)의 교배에 의해 IgM 유전자의 양쪽 H쇄가 분단되고 Ig L쇄의 양쪽 대립유전자가 분단된 동형접합성 넉아웃 (동형접합성 H/L) 태아를 제조하는 것이다.
본 발명의 다른 구체적인 목적은 비유제류 Ig들 또는 그들의 H쇄 또는 L쇄의 기능적 발현에 필요한 유전자를 함유한 핵산 (예를 들어, 인공 염색체)를 도입하는 것이다. 바람직하게는, 이들 Ig는 이들 Ig들 또는 Ig쇄를 코딩하는 핵산을 동형접합성 또는 반접합성 H/L 유제류 (예를 들어, 소) 체세포, 바람직하게는 섬유아세포 중으로 도입하여 생산되고, 핵산 (예를 들어, 사람 인공 염색체 DNA)이 생식세포계에 전달된 클로닝된 유제류 (예를 들어, 클로닝된 소)를 생산한다.
본 발명의 또 다른 목적은 Ig 발현을 제공하는 유전자들을 포함하는 인공 염색체, 바람직하게는 사람 인공 염색체 (HAC)를 상기에서 언급된 동형접합성 넉아웃 (동형접합성 H/L) 세포 중으로 도입하고, 면역화 반응으로 비유제류 Ig, 바람직하게는 사람 Ig를 발현하고 친화도 성숙이 일어나는 유제류 (바람직하게는, 소)를 핵 전달에 의해 제조하는 것이다.
본원에서 사용된, "인공 염색체"란 인공적 개질, 예를 들어, 선택 마커의 첨가, 클로닝 자리의 첨가, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환 등을 가진 포유류 염색체 또는 그 단편을 의미한다. "사람 인공 염색체 (HAC)"란 하나 이상의 사람 염색체(들)에서 유래한 인공 염색체를 의미한다. 인공 염색체는 숙주 세포의 내인성 염색체와는 독립적으로 숙주 세포 중에서 유지될 수 있다. 이 경우, HAC는 내인성 염색체와 함께 안정하게 복제 및 분리될 수 있다. 별법으로, 이는 숙주 세포의 내인성 염색체 중으로 전좌되거나 또는 삽입될 수 있다. 2개 이상의 인공 염색체가 숙주 세포 중으로 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 사람 염색체 #14 (Ig H쇄 유전자를 포함함), 사람 염색체 #2 (Ig κ쇄 유전자를 포함함) 및 사람 염색체 #22(Ig λ쇄를 포함함)로부터 유래한 인공 염색체가 도입될 수 있다. 별법으로, 이종 Ig H쇄 및 Ig L쇄 유전자를 모두 포함하는 인공 염색체(들), 예를 들어, ΔHAC 또는 ΔΔHAC가 도입될 수 있다. 바람직하게는, H쇄 유전자좌 및 L쇄 유전자좌는 상이한 염색체 팔 위 (즉, 중심절에 대해 반대편 상에)에 있을 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, HAC의 전체 크기는 약 10, 9, 8 또는 7 Mbp 이하이다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 Ig H쇄 및 L쇄 유전자를 포함하는 도입된 핵산 (예를 들어, 인공 염색체, 및 바람직하게는 사람 인공 염색체 (HAC)) 상에서 운반되는 Ig 유전자를 포함하고 발현하는 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 트랜스제닉 소) 유래의 수동적 면역화를 위한 사람 또는 기타 Ig의 공급원을 제조하는 것이다. 본 발명에서, 이들 핵산 (예를 들어, HAC들)은 자연적으로 배열된 사람 염색체 (사람 염색체 단편) 또는 인공적으로 조작된 사람 염색체 단편(즉, 이들은 사람 게놈에 대해 재배열될 수 있음)을 포함하는 인공 염색체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기에서 기술된 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 트랜스제닉 소) 유래의 B 세포를 사용하여 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 생산하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 폴리클로날 사람 Ig를 포함하는 유제류 항혈청 또는 유즙을 생산하는 것이다. 이 같은 사람 Ig, 바람직하게는 사람 IgG는 사람의 질환의 치료 또는 예방을 위한 정맥내 면역글로블린 (IVIG)로서 사용될 수 있다. 폴리클로날 사람 Ig는 바람직하게는 목적한 항원에 대해서 반응성이 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 내인성 유전자 또는 유전자들 중에 하나 이상의 돌연변이가 일어난 트랜스제닉 유제류를 생산하는 것이다. 트랜스제닉 유제류는 세포, 세포의 염색질체, 또는 세포의 핵을 난자 중으로 도입하여 제조된다. 세포는 세포에 의해서는 자연적으로는 발현되지 않는 내인성 유전자 중에 제1 돌연변이를 가진다. 난자 또는 난자로부터 형성된 배(胚)는 난자 또는 배가 태아로 발생할 수 있는 조건 하에서 숙주 유제류의 자궁 속으로 전달된다. 바람직하게는, 태아는 생육할 수 있는 자손으로 발생한다. 다른 바람직한 실시태양에서, 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 돌연변이될 내인성 유전자에 대해 상당한 서열 동일성을 가진 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하는 핵산을 도입함으로써, 카세트가 유전자의 한 내인성 대립유전자 중으로 도입되어 제1 돌연변이가 세포 중으로 도입된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 제1 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 돌연변이될 내인성 유전자에 대해 상당한 서열 동일성을 가진 제1 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 카세트를 포함하는 핵산을 세포 중으로 도입함으로써, 제1 카세트가 제1 트랜스제닉 세포를 생산하는 유전자의 제1 내인성 대립유전자 중으로 도입되어, 돌연변이가 세포 중으로 도입된다. 제1 트랜스제닉 세포 중으로 제2 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 유전자에 대해 상당한 서열 동일성을 가진 제2 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 카세트를 포함하는 핵산을 도입한다. 제2 선택 마커는 제1 선택 마커와 상이하고, 제2 카세트는 제2 트랜스제닉 세포를 생산하는 유전자의 제2 내인성 대립유전자 중으로 도입된다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 세포는 배, 태아, 또는 태아로부터 생산된 자손으로부터 단리되고, 다른 돌연변이가 세포 유전자 중으로 도입된다. 이후, 이차 핵 전달에서 생성된 세포, 세포의 염색질체, 또는 세포의 핵을 사용하여 두 개 이상의 돌연변이를 가진 트랜스제닉 유제류를 제조한다. 돌연변이는 한 유전자의 동일 또는 상이한 대립유전자 중에 또는 상이한 유전자 중에 존재한다. 바람직한 실시태양에서, 돌연변이된 세포는 섬유아세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포)이다. 바람직하게는, 돌연변이된 내인성 유전자는 섬유아세포에서는 비활성인 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 돌연변이된 내인성 유전자에 작동 가능하게 연결된 내인성 프로모터는 GAPDH와 같은 내인성 유지 (housekeeping) 유전자에 작동가능하게 연결된 내인성 프로모터 활성의 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10% 미만이다. 프로모터 활성은 임의의 표준 분석, 예를 들어, 유전자에 의해 코딩된 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 분석 (예를 들어, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13.3, John Wiley & Sons, 1995 참조)을 사용하여 측정될 수 있다. 트랜스제닉 유제류를 제조하기 위한 방법은 공여 세포 (즉, 핵 전달을 위해 사용되는 유전적 물질들의 공급원인 세포)에서는 발현되지 않는 유전자가 돌연변이될 수 있도록 한다는 장점이 있다.
따라서, 본 발명의 특징은 재배열이 일어나고 하나 이상의 이종 Ig 분자를 발현하는 이종 면역글로블린 (Ig) 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 갖는 트랜스제닉 유제류이다. 바람직한 실시태양에서, 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 실질적으로는 사람의 것이다. 바람직하게는, 핵산은 사람 항체 또는 폴리클로날 항체와 같은 이종 항체를 코딩한다. 다양 한 실시태양에서, Ig쇄 또는 항체는 혈청 및(또는) 유즙 중에서 발현된다. 다른 실시태양에서, 핵산은 ΔHAC 또는 ΔΔHAC와 같은 염색체 단편 내에 포함된다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에서 유지된다.
또 다른 실시태양에서, 핵산은 유제류의 염색체 중으로 도입된다. 다른 실시태양에서, 핵산은 V 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산이 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 J 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산과 분리된 재배열되지 않은 항체 L쇄 핵산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 (i) V 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산이 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 D 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산과 분리되고(또는) (ii) D 유전자 섹먼트를 코딩하는 모든 핵산이 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 J 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산과 분리된 재배열되지 않은 항체 H쇄 핵산 세그먼트를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 내인성 Ig 유전자, α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 유전자 및(또는) J쇄 유전자의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 외래 J쇄, 예를 들어, 사람 J쇄를 코딩하는 핵산을 가진다. 바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지, 또는 염소이다.
다른 면에서, 본 발명의 특징은 내인성 항체의 발현을 감소시키는 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 유제류이다. 바람직하게는, 돌연변이는 기능적 IgM H쇄의 발현을 감소시키거나 또는 기능적 IgM H쇄의 발현을 실질적으로 제거한다. 다른 바 람직한 실시태양에서, 돌연변이는 기능적 Ig L쇄의 발현을 감소시키거나 또는 기능적 Ig L쇄의 발현을 실질적으로 제거한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 돌연변이는 기능적 IgM H쇄 및 기능적 Ig L쇄의 발현을 감소시키거나, 또는 돌연변이는 기능적 IgM H쇄 및 기능적 Ig L쇄의 발현을 실질적으로 제거한다. 바람직하게는, 유제류는 또한 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 유전자 및(또는) J쇄 유전자를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 외래 J쇄, 예를 들어, 사람 J쇄를 코딩하는 핵산을 가진다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 재배열이 일어나며 하나 이상의 이종 Ig 분자를 발현하는 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 갖는다. 바람직하게는, 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 실질적으로는 사람의 것이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 핵산은 다른 속 유래의 이종 항체 (예를 들어, 사람 항체) 또는 폴리클로날 항체를 코딩한다. 다양한 실시태양에서, Ig쇄 또는 항체는 혈청 중에서 발현된다. 다른 실시태양에서, 핵산은 ΔHAC 또는 ΔΔHAC와 같은 염색체 단편 내에 포함된다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에서 유지된다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 유제류의 염색체 중으로 도입된다. 바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지 또는 염소이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 유제류로부터 얻은 세포 또는 본 발명의 임의의 유제류의 제조에 유용한 세포를 제공한다.
따라서, 다른 면에서, 본 발명의 특징은 재배열이 일어나며 하나 이상의 이 종 Ig 분자를 B 세포 중에서 발현하는 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 갖는 유제류 체세포이다. 바람직하게는, 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 이종 항체를 코딩한다. 다양한 실시태양에서, 핵산은 ΔHAC 또는 ΔΔHAC와 같은 염색체 단편 내에 포함된다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에서 유지된다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 유제류의 염색체 중으로 도입된다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 실질적으로 사람의 것이다. 바람직하게는, 이종 항체는 다른 속 유래의 항체, 예를 들어, 사람 항체이다. 바람직하게는, 세포는 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 유전자 및(또는) J쇄 유전자를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 외래 J쇄, 예를 들어, 사람 J쇄를 코딩하는 핵산을 가진다. 예시적인 유제류 세포는 태아 섬유아세포 및 B-세포를 포함한다. 바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지 또는 염소이다.
다른 면에서, 본 발명의 특징은 Ig H쇄 및(또는) L쇄를 코딩하는 핵산 중에 돌연변이가 있는 유제류 체세포이다. 바람직한 실시태양에서, 세포는 IgM H쇄 또는 Ig L쇄의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 예시적인 돌연변이는 넌센스 및 결실 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 세포는 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 유전자 및(또는) J쇄를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 외래 J쇄, 예를 들어, 사람 J쇄를 코딩하는 핵산을 가진다. 바람직한 실시태양 에서, 또한, 세포는 재배열이 일어나며 하나 이상의 이종 Ig 분자를 B 세포 중에서 발현시킬 수 있는 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 갖는다. 바람직하게는, 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 실질적으로는 사람의 것이고(또는) 이종 항체, 예를 들어, 다른 속 유래의 항체 (예를 들어, 사람 항체)를 코딩한다. 다양한 실시태양에서, 핵산은 염색체 단편 중에 포함되고, 이로써 핵산은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에서 유지된다. 바람직한 염색체 단편은 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 포함한다. 다른 실시태양에서, 핵산은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에서 유지된다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 세포의 염색체 중으로 도입된다. 예시적인 유제류 세포는 태아 섬유아세포 및 B-세포를 포함한다. 바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지 또는 염소이다.
다른 면에서, 본 발명의 특징은 본 발명의 유제류 B-세포와 골수종 세포의 융합으로 형성된 하이브리도마이다. 바람직하게는, 하이브리도마는 외래 항체, 예를 들어, 사람 항체를 분비한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 유제류를 이용한 항체 생산법을 제공한다. 이 같은 한 방법은 이종 항체 유전자좌를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한 유제류에 하나 이상의 목적 항원을 투여하는 것을 포함한다. 유전자좌 중의 핵산 세그먼트는 재배열을 일으키고, 항원에 특이적인 항체를 생성하고, 항체는 유제류로부터 회수된다. 다양한 실시태양에서, 이종 항체 유전자좌를 코딩하는 핵산은 염색체 단편, 예를 들어, ΔHAC 또는 ΔΔHAC 중에 포함된다. 바람직하게는, 염색체 단편 은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에서 유지된다. 다른 실시태양에서, 핵산은 유제류의 염색체 중으로 도입된다. 바람직하게는 핵산은 실질적으로 사람의 것이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 항체의 L쇄 및(또는) 항체의 H쇄는 사람 핵산에 의해 코딩된다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 특정 항원에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체는 다양한 용도를 가진다; 예를 들어, 이들은 박테리아 또는 바이러스와 같은 병원성 미생물의 감염에 대한 예방 또는 치료 조성물의 성분으로 사용될 수 있다. 다양한 실시태양에서, 항체는 유제류의 혈청 또는 유즙으로부터 회수된다. 바람직한 실시태양에서, 유제류는 내인성 항원의 발현을 감소시키거나, 기능적 IgM의 H쇄의 발현을 감소시키거나, 또는 기능적 Ig L쇄의 발현을 감소시키는 돌연변이를 갖는다. 바람직하게는, 유제류는 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 유전자 및(또는) J쇄 유전자를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 외래 J쇄, 예를 들어, 사람 J쇄를 코딩하는 핵산을 가진다. 바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지 또는 염소이다.
관련된 면에서, 본 발명의 특징은 항체의 또 다른 제조 방법이다. 이 방법은 이종 항체 유전자좌를 코딩하는 유제류 핵산으로부터 이종 항체를 회수하는 것을 수반한다. 유전자좌 내의 핵산은 재배열을 거쳐 이종 항체를 생산한다. 다양한 실시태양에서, 이종 항체 유전자좌를 코딩하는 핵산은 염색체 단편, 예를 들어, ΔHAC 또는 ΔΔHAC 내에 포함된다. 구체적인 실시태양에서, 핵산은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에 유지된다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 유제 류의 염색체 중으로 도입된다. 바람직하게는, 핵산은 실질적으로 사람의 것이다. 구체적인 실시태양에서, 항체의 L쇄 및(또는) 항체의 H쇄는 사람 핵산에 의해 코딩된다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 구체적인 실시태양에서, 특정 항원으로 유제류를 면역화시키지 않고 생성된 폴리클로날 항체, 예를 들어, IgG 항체가 사람 혈청으로부터 생산된 IVIG (정맥내 면역글로블린)의 치료적 대체물로 사용된다. 다양한 실시태양에서, 항체는 유제류의 혈청 또는 유즙으로부터 회수된다. 바람직하게는, 유제류는 내인성 항체의 발현을 감소시키거나, 기능적 IgM H쇄의 발현을 감소시키거나 또는 기능적 Ig L쇄의 발현을 감소시키는 돌연변이를 가진다. 바람직하게는, 유제류는 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 유전자 및(또는) J쇄 유전자를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 외래 J쇄, 예를 들어, 사람 J쇄를 코딩하는 핵산을 가진다. 바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지 또는 염소이다.
또한, 본 발명은 트랜스제닉 유제류의 제조 방법을 제공한다. 이들 방법은 목적한 돌연변이를 갖거나 또는 목적한 이종 핵산을 갖는 트랜스제닉 유제류를 제조하는 데 사용될 수 있다.
이 같은 면에서, 본 발명의 특징은 세포, 세포의 염색질체 또는 세포의 핵을 난자에 도입하는 것을 수반하는 트랜스제닉 유제류의 제조 방법이다. 세포는 내인성 항체 H쇄 및(또는) L쇄 핵산 중에 제1 돌연변이를 포함한다. 난자 또는 난자로부터 형성된 배(胚)는 난자 또는 배가 태아로 발생할 수 있는 조건 하에서 숙주 유 제류의 자궁 속으로 전달된다. 바람직하게는, 태아는 생육할 수 있는 자손으로 발생한다. 바람직하게는 세포는 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 유전자 및(또는) J쇄 유전자를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 외래 J쇄, 예를 들어, 사람 J쇄를 코딩하는 핵산을 가진다. 바람직한 실시태양에서, 또한, 세포는 재배열이 일어나고 하나 이상의 이종 Ig 분자를 B 세포 중에서 발현시킬 수 있는 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 갖는다. 바람직하게는, 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 이종 항체를 코딩한다. 또 다른 실시태양에서, 핵산은 세포의 염색체 중으로 도입된다. 바람직하게는, 이종 항체는 다른 속의 항체, 예를 들어, 사람 항체이다. 구체적인 실시태양에서, 핵산은 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 내에 포함된다. 다른 구체적인 실시태양에서, 염색체 단편은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에 유지된다. 바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지 또는 염소이다.
상기 일면의 다양한 실시태양에서, 방법은 또한 배, 태아, 또는 태아로부터 생성된 자손으로부터 세포를 단리하고, 세포 중의 내인성 항체 H쇄 및(또는) L쇄 핵산 중에 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 세포, 세포의 염색질체, 또는 세포의 핵은 난자 중으로 삽입되고, 난자 또는 난자로부터 형성된 배는 난자 또는 배가 태아로 발생할 수 있는 조건 하에서 숙주 유제류의 자궁 속으로 전달된다.
상기 일면의 다른 실시태양에서, 트랜스제닉 유제류의 제조에 사용된 세포는 바람직하게는 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산에 대해 상당한 서열 동일성을 가진 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하는 핵산을 세포 중으로 삽입하는 것을 포함하는 방법으로 제조된다. 카세트는 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산의 한 내인성 대립유전자 중으로 도입된다.
다른 실시태양에서, 세포는 제1 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산에 대해 상당한 서열 동일성을 가진 제1 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 카세트를 포함하는 핵산을 세포 중으로 도입함으로써 제조된다. 제1 카세트는 제1 트랜스제닉 세포를 생산하는 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산의 제1 내인성 대립유전자 중으로 도입된다.
제1 트랜스제닉 세포 중으로 제2 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산에 대해 상당한 서열 동일성을 가진 제2 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 카세트를 포함하는 핵산을 도입한다. 제2 선택 마커는 제1 선택 마커와 상이다. 제2 카세트는 제2 트랜스제닉 세포를 생산하는 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산의 제2 내인성 대립유전자 중으로 도입된다.
또 다른 일면에서, 본 발명의 특징은 트랜스제닉 유제류의 또 다른 제조 방법이다. 이 방법은 하나 이상의 이종 핵산을 포함하는 세포를 난자 중으로 도입하는 것을 수반한다. 이종 핵산은 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하고, 유전자는 재배열이 일어나고 하나 이상의 이종 Ig 분자를 B 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 난자 또는 난자로부터 형성된 배는 난자 또는 배가 태아로 발생할 수 있는 조건 하에서 숙주 유제류의 자궁 속으로 전달된다. 바람직하게는, 태아는 생육할 수 있는 자손으로 발생한다. 바람직하게는, 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 이종 항체를 코딩한다. 다른 바람직한 실시태양에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 면역글로블린 사슬 또는 항체는 혈청 및(또는) 유즙 중에서 발현된다. 다양한 실시태양에서, 핵산은 염색체 단편, 예를 들어, ΔHAC 또는 ΔΔHAC 내에 포함된다. 핵산은 숙주 염색체와는 독립적으로 유제류 세포 중에서 유지될 수 있거나 또는 세포의 염색체 중으로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 실질적으로 사람의 것이다. 다른 실시태양에서, 이종 항체는 다른 속의 항체, 예를 들어, 사람 항체이다. 바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지 또는 염소이다.
관련된 다른 일면에서, 본 발명의 특징은 트랜스제닉 유제류를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 세포, 세포의 염색질체 또는 세포의 핵을 난자 중으로 도입하는 것을 수반한다. 세포는 세포에 의해서는 자연적으로는 발현되지 않는 내인성 유전자 중에 제1 돌연변이를 포함한다. 난자 또는 난자로부터 형성된 배는 난자 또는 배가 태아로 발생할 수 있도록 하는 조건 하에서 숙주 유제류의 자궁 속으로 전달된다. 바람직하게는, 태아는 생육할 수 있는 자손으로 발생한다. 바람직하게는, 돌연변이되는 유전자는 항체, α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 유전자 및(또는) J쇄를 코딩한다. 다른 바람직한 실시태양에서, 트랜스제닉 유제류 제조에 사용된 세포는 섬유아세포, 예를 들어, 태아 섬유아세포이다.
상기 방법의 다양한 실시태양에서, 세포는 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작 동가능하게 연결되고 유전자에 대해 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하는 핵산을 세포 중으로 도입하고; 이로써 카세트가 유전자의 한 내인성 대립유전자 중에 도입되어 제조된다. 다른 실시태양에서, 세포는 제1 선택 마커를 코딩하는 제1 핵산에 작동가능하게 연결되고 유전자에 대해 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 카세트를 포함하는 핵산을 세포 중으로 도입하여 제조된다. 제1 카세트는 제1 트랜스제닉 세포를 생산하는 유전자의 제1 내인성 대립유전자 중으로 도입된다. 제1 트랜스제닉 세포 중으로, 제2 선택 마커에 작동가능하게 연결되고, 유전자에 대해 실질적일 동일성을 갖는 제2 핵산에 작동가능하게 연력된 제2 프로모터를 포함하는 제2 카세트를 포함하는 핵산이 도입된다. 제2 선택 마커는 제1 선택 마커와 상이하다. 제2 카세트는 제2 트랜스제닉 세포를 생산하는 유전자의 제2 내인성 대립유전자 중으로 도입된다.
상기 일면의 다른 실시태양에서, 방법은 또한 제2 돌연변이를 트랜스제닉 유제류 중으로 도입하는 것을 포함한다. 이들 실시태양에서, 세포는 배, 태아 또는 태아로부터 형성된 자손으로부터 단리되고, 제2 돌연변이는 세포 내의 내인성 유전자 중으로 도입된다. 세포, 세포의 염색질체, 또는 세포의 핵산이 난자 중으로 도입되고, 난자 또는 난자로부터 형성된 배는 난자 또는 배가 태아로 발생할 수 있도록 하는 조건 하에서 숙주 유제류의 자궁 속으로 전달된다.
본 발명의 유제류는 목적한 항체를 함유한 혈청 또는 유즙을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이 같은 일면에서, 본 발명의 특징은 폴리클로날 사람 면역글로블 린을 함유한 유제류 항혈청이다. 바람직하게는, 항혈청은 소, 양, 돼지 또는 염소로부터 유래한다. 다른 바람직한 실시태양에서, Ig는 목적한 항원에 대한 것이다.
또 다른 일면에서, 본 발명의 특징은 폴리클로날 사람 Ig를 포함하는 유제류 유즙이다. 바람직하게는, 유즙은 소, 양, 돼지 또는 염소로부터 유래한다. 다른 바람직한 실시태양에서, Ig는 목적한 항원에 대한 것이다.
본 발명의 다양한 일면의 바람직한 실시태양에서, H쇄는 μH쇄이고, L쇄는 λL쇄 또는 κL쇄이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 이종 면역글로블린쇄 또는 항체를 코딩하는 핵산은 재배열되지 않은 형태이다. 바람직하게는, 목적한 항원이 이종 면역글로블린 유전자좌를 가지는 트랜스제닉 유제류로 투여되어, 목적한 항원에 대해 반응성인 항체가 생산된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 이종 항체가 유제류에 의해 생산된다. 다양한 실시태양에서, 하나 이상의 상이한 이종 Ig 또는 항체가 유제류에 의해 생산된다. 바람직한 핵 전달 방법은 본 발명의 세포, 세포의 염색질체, 또는 세포의 핵을 핵이 제거된 또는 핵이 있는 난자 중으로 도입하고, 난자 또는 난자로부터 형성된 배를 난자 또는 배가 태아로 발생할 수 있도록 하는 조건 하에서 숙주 유제류의 자궁 속으로 전달하는 것을 포함한다.
본 발명의 다양한 일면의 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자, 프리온 및(또는) J쇄 핵산의 하나 또는 두 대립유전자 중에 돌연변이가 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 α-(1,3)-갈락토실 전이효소, 갈락토실(α1,3) 갈락토오스 에피토프, 프리온 단백질 및(또는) J쇄의 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 또 다른 실시태양에서, 유제류는 이종 J쇄 핵산, 예를 들어, 사람 J쇄 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 유제류는 사람 J쇄를 함유한 사람 IgA 또는 IgM 분자를 생산한다. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 내인성 유제류 핵산을 돌연변이시키기 위해 사용된 핵산 (예를 들어, 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 돌연변이될 유전자에 실질적인 서열 동일성이 있는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 넉아웃 카세트)는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 중에 포함되지 않는다. 예를 들어, 핵산은 세포의 바이러스 감염을 수반하지 않는 트랜스펙션 또는 리포펙션과 같은 표준 방법을 사용하여 유제류 세포 중에 도입되는 플라스미드 또는 인공 염색체 내에 포함될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 내인성 유제류 핵산을 돌연변이시키기 위해 사용되는 핵산 (예를 들어, 선택 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 돌연변이될 유전자에 실질적인 서열 동일성을 갖는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 넉아웃 카세트)은 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 중에 포함된다. 이 실시태양에 따르면, 바이러스벡터를 함유한 바이러스는 유제류 세포를 감염시키기 위해 사용되어, 일부 또는 전체 바이러스 벡터를 유제류 세포 중으로 삽입시킨다.
예시적인 유제류는 페리소닥틸라 (Perissodactyla) 목 및 아르티오닥틸라 (Artiodactyla) 목, 예를 들어, 보스 (Bos) 속의 모든 구성원을 포함한다. 다른 바람직한 유제류는 양, 야생양, 염소, 버팔로, 영양, 수소, 말, 당나귀, 노새, 사슴, 엘크, 순록, 물소, 낙타, 라마, 알파카, 돼지 및 코끼리를 포함한다. 바람직하게는, 트랜스제닉 유제류는 다른 속의 항체 또는 면역글로블린쇄, 예를 들어, 다 른 포유류의 항체를 발현한다.
본원에서 사용된, "배열되기 전의 또는 배열되지 않은 형태의 핵산"이란 V(D)J 재배열이 일어나지 않은 핵산을 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 항체 L쇄의 V 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산 세그먼트는 하나 이상의 뉴클로에티드에 의해 J 유전자 세그먼트를 코딩하는 핵산과 분리되어 있다. 바람직하게는, 항체 H쇄의 V 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산 세그먼트는 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 D 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산과 분리되어 있고(또는) 항체 H쇄의 D 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산은 J 유전자 세그먼트를 코딩하는 모든 핵산 세그먼트와 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있다. 바람직하게는, 재배열되지 않은 형태의 핵산은 실질적으로는 사람의 것이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 핵산은 사람의 자연적으로 발생하는 핵산의 상응하는 영역과 70, 80, 90, 95 또는 99% 이상 동일하다.
상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명은 내인성 Ig 발현이 임의로 넉아웃되었으며, 다른 종, 바람직하게는 사람의 기능적 항체 제조에 필요한 유전자들을 포함한 핵산 (바람직하게는, 인공 염색체)가 안정하게 도입된 트랜스제닉 유제류, 바람직하게는 트랜스제닉 소에 관한 것이다. 이로써, 자신의 내인성 항체를 생산하지 않는 대신, 다른 종의 항체를 생산하는 트랜스제닉 항체를 얻을 수 있다. 생산될 수 있는 임의의 비내인성 항체는 사람, 비사람 영장류, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 기니아 피그 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 염소 중에서 사람 모노클로날 항체의 생산이 이전에 보고되었었지만, 이는 소, 혈청 또는 그 내인성 항체를 발현하지 않는 임의의 유제류에서는 효과가 없었다. 아울러, 생식세포계 (germline) (재배열되지 않았음) H쇄 또는 L쇄 유전자로의 도입, 이들 유전자의 재배열 및 다양화된 항체의 발현은 트랜스제닉 유제류에서 실행되지 않았다. 이같은 유제류가 생존할 수 있을지 예상할 수 없는데, 이는 사람 Ig가 기능적으로 발현될 것인지, 또는 적절한 면역 반응을 제공하기 위해 충분한 양으로 발현될 것인지 불확실하기 때문이다. 또한, 사람 염색체가 트랜스제닉 유제류 중에서 안정하게 유지될 것인지 불확실하다. 아울러, 유제류 (예를 들어, 소) B 세포가 사람 또는 비-내인성 Ig를 발현 또는 적절히 재배열할 수 있을지 불확실하다.
본 접근법의 다양한 실시태양에서, 이종 면역글로블린 생산은 본질적으로 핵 전달, 상동성 재조합 기술, 및 이종 Ig 유전자좌를 운반하는 인공 염색체의 도입을 함께 사용하여 달성된다. 보다 구체적으로, 방법은 바람직하게는 IgM H쇄의 대립하나 또는 두 개의 유전자, 및 임의로는 Ig L쇄의 하나 또는 두 개의 대립유전자의 표적화된 분단을 수반하지만, 또한, 이종 항체 생산은 야생형 동물 (즉, Ig 넉아웃이 없는 동물)에서도 달성될 수 있다. 유전자 넉아웃은 순차적인 상동성 재조합 이후 다른 교배 방법으로 달성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 이는 최초에 조직 배양 중의 수컷 또는 암컷 태아 유제류 (예를 들어, 소) 섬유아세포의 IgM H쇄 유전자의 한 대립유전자를 적합한 상동성 재조합 벡터를 사용하여 표적화된 분단을 일으켜 달성된다. 태아 섬유아세포의 사용은 다른 체세포보다 선호되는데, 이는 이들 세포가 조직 배양 중 용이하게 번식하고 유전적으로 조작될 수 있기 때 문이다. 그러나, 태아 섬유아세포의 사용은 본 발명에서 필수적인 것은 아니고, 실제로 다른 세포주들이 동등한 결과를 가지면서 이들을 치환할 수 있다.
물론 이 방법은 유제류 게놈 중으로 IgM H쇄 대립유전자의 도입이 그 발현을 중단시키도록 표적화된 IgM H쇄 대립유전자에 대한 상동성 영역을 가진 DNA 구조체의 제조를 수반한다. IgM 대립유전자의 이 같은 표적화된 분해를 수행하기 위한 예시적인 벡터가 하기 실시예에 기술되어 있다. 이와 관련하여, 표적화된 자리에서 상동성 재조합을 제공하는 벡터를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 아울러, 본 발명의 경우, 적합한 벡터의 제조는 당업계의 기술 수준 내에 있고, 다른 유제류의 면역글로블린 유전자의 서열과 같이 특히, 소 IgM H쇄 및 Ig λL쇄 유전자의 서열이 공지되어 있다 (하기 참조). 상동성 재조합을 용이하게 하기 위해, IgM 유전자의 상동성 재조합 및 불활성화를 달성하기 위해 사용된 벡터는 유제류 IgM H쇄 및 L쇄 유전자에 상당한 서열 동일성을 나타내는 DNA 부분을 포함한다. 바람직하게는, 상동성 재조합 및 표적화된 결실 또는 불활성화를 용이하게 하기 위해서 이들 서열은 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 보다 더 바람직하게는 동질유전자 (isogenic)이다.
일반적으로, 또한 바람직하게는 구조체는 목적한 상동성 재조합체, 예를 들어, IgM H쇄 유전자 및(또는) Ig L쇄 유전자가 효과적으로 분열된 섬유아세포의 선별을 제공하는 마커 유전자를 포함할 것이다. 예시적인 마커 유전자는 그 중에서도 항체 내성 마커, 약물 내성 마커 및 녹색 형광 단백질을 포함한다. 바람직한 구조체를 도 2a에 나타내었으며, 이 구조체를 제조하기 위해 사용된 출발 물질을 도 3a 및 3b에 나타내었다. 내인성 면역글로블린 유전자에 상동성이 있으며, 프로모터에 작동가능하게 연결된 양성 선별 마커 (예를 들어, 항체 내성 유전자)에 연결된 두 개의 영역을 포함한 다른 구조체는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
도 2a 및 3c에 나타낸 μ넉아웃 구조체는 "C-μ엑손 1-4"로 나타낸 소 면역글로블린 H쇄 구조체 영역 및 "TM 엑손"으로 나타낸 막횡단 도메인을 코딩하는 두 개의 엑손을 제거하도록 고안되었다.
이 벡터를 제조하기 위해, "1"로 나타낸, 게놈 μH쇄 소 서열의 XbaI-XhoI 단편을 미리 XbaI 및 XhoI으로 절단한 시판되는 DNA 벡터, pBluescript (Stratagene, LaJolla, California) 중으로 서브클로닝해 넣었다. 이 단편이 클로닝된 후, XbaI 자리에 인접하여 NotI 제한효소 인식 서열이 존재하므로, 이를 이용하여 약 3.5Kb의 NotI 단편을 삽입하였다. 이 단편은 하기에서 기술된 네오마이신 내성 마커를 포함한다. 바란다면, 다른 유제류 품종, 종 또는 속의 게놈 μH쇄 서열 (예를 들어, 스위스 숫소/홀스타인 잡종 유래의 Genebank 접수번호 U63637로 기탁된 μH쇄 서열)을 사용하여 다른 μ넉아웃 구조체를 제조할 수 있다.
단편 "l" 과 네오마이신 내성 마커가 pBluescipt 중에서 함께 연결되면, 네오마이신 내성 마커에 인접하여 SacI 자리가 남게 된다. SacI을 사용하여 신규 구조체를 선형화시키고, SacI 분해로 생긴 접착성 말단을 DNA 중합효소를 사용하여 블런트 말단으로 전환시켰다.
"2"로 나타낸 단편을 XhoI-BstI1071 단편으로 단리하고, XhoI 및 BstI1071 효소 절단으로 생긴 접착성 말단을 DNA 중합효소를 사용하여 무딘 발단 단편으로 전화시켰다.
완료된 후, 최종 구조체는 각각 영역 2, 네오마이신 내성 마커 및 영역 1을 포함하였다.
소 섬유아세포의 트랜스펙션을 위해, 구조체를 제한효소, KpnI (도표에서 두 개의 KpnI 자리로 나타냄)으로 절단하고, DNA 단편을 상동성 재조합을 위해 사용하였다.
네오마이신 내성 구조체를 다음과 같이 조립하였다. "pSTneoB"로 나타낸 구조체 (Katoh et al., Cell Struct. Funct. 12:575, 1987; Janpanese Collection of Research Biologicals (JCRB) 기탁번호: VE039)는 SV 프로모터 및 코딩 영역의 상류의 TK 인핸서 조절 하의 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 것을 나타낸다. 코딩 영역의 하류는 SV40 종결 서열이다. neo 카세트는 "pSTneoB"로부터 XhoI 단편으로 절단된다. 표준 분자생물학적 기술을 하용하여 단편의 말단을 블런트 말단으로 전환시킨 후, 블런트 말단의 단편을 벡터, pBS246 (Gibco/Life Technologies) 내의 EcoRV 자리 중으로 클로닝해 넣었다. 이 자리는 loxP 자리에 연결된다. "pLoxP-STNeoR"로 나타낸 신규 구조체를 사용하여 μ넉아웃 DNA 구조체를 제조하였다. 이 구조체의 목적한 단편은 원래 pBS246 클로닝 벡터 내에 존재했던 loxP 자리 및 NotI 자리에 연결된다. loxP-neo-loxP를 포함하는 목적한 NotI 단편이 면역글로블린 μ불변 영역 엑손의 치환을 위해 사용되었다. 네오마이신 내성 유전자에 작동가능하게 연결된 SV40 프로모터는 네오마이신 내성 유전자의 전사를 활성화시 켜서 목적한 NotI 단편이 μ불변 영역 엑손을 치환한 세포가 그 생성된 항생제 내성에 기초하여 선별될 수 있도록 한다.
IgM H쇄 대립유전자가 효과적으로 분단된 세포주를 얻은 후, 이를 핵 전달 공여체로 사용하여 클로닝된 유제류 태아 (예를 들어, 클로닝된 소 태아)를 제조하고, 최종적으로 IgM H쇄의 하나의 대립유전자가 분단된 태아 또는 동물을 제조하였다. 이후, 이들로부터 유도된 체세포, 예를 들어, 섬유아세포를 사용하여 두번째 IgM H쇄의 대립유전자가 불활성화된 세포를 제조하기 위해서, 유사하지만 상이한 내성 선별 마커를 함유한 벡터를 사용하여 이차 유전자 표적화된 분단을 달성할 수 있다.
바람직하게는, 제1 표적화된 유전자 분해에 수반하여, 제2 유제류 (예를 들어, 소) 체세포가 또한 유전적으로 변형되고, 이는 유사하게 수컷 또는 암컷 기원일 수 있다. 조작된 제1 세포주가 수컷이라면, 암컷 세포주를 변형시키는 것이 바람직하다. 반대로, 조작된 제1 세포주가 암컷이라면, 수컷 세포주를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는, 조작된 세포는 유제류 (예를 들어, 소) 태아 섬유아세포를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, Ig λL쇄 유전자의 한 대립유전자의 표적화된 분단을 도입하기 위해서 암컷 태아 섬유아세포가 유전적으로 변형된다. 이 방법은 유사하게 유제류 (예를 들어, 소) Ig λL쇄에 상동성이 있는 영역을 가진 벡터, 및 선별 마커를 사용하여 수행되고, 이 DNA 구조체는 삽입 및 내재 Ig L쇄와의 상동성 재조합 후 표적화된 Ig λL쇄 유전자의 분해 (비활성)가 일어나도록 고안된다.
목적한 표적 분단이 있는 암컷 섬유아세포 세포주가 선택된 후, 이는 유사하게 핵 전달을 위한 공여 세포로 사용되거나, 또는 이 같은 세포주 유래의 DNA는 핵 전달을 위한 공여체로 사용된다.
별법으로, 이 세포는 첫번째 대립유전자를 분해시키기 위해서 사용된 구조체와 유사하지만, 상이한 선별 마커를 포함한 DNA 구조체를 사용하여 제2 Ig λL쇄를 불활성화시키기 위한 이차 상동성 재조합이 일어나도록 할 수 있다.
본 발명의 배경에서 기술한 것과 같이, 핵 전달 방법 및 특히, 클로닝된 소 및 클로닝된 트랜스제닉 소의 제조 방법이 보고되어 있으며 U.S. 특허 제5995577호 (스티스 (Stice) 등에게 등록되고 매사츄세츠 대학에 양도됨) 중에 기술되었다. 또한, 별법으로, WO 제95/16670호; WO 제96/07732호; WO 제97/0669호 또는 WO 제97/0668호에 기술된 핵 전달 기술 (총괄하여, 로슬린 (Roslin) 방법)이 사용될 수 있다. 로슬린 방법은 증식하는 공여체 세포보다는 정지 세포를 사용한다는 점에서 매사츄세츠 대학의 기술과는 상이하다. 이들 특허 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조문헌으로 삽입되었다. 이들 핵 전달 방법은 클로닝된 트랜스제닉 소 자손, 예를 들어, Ig L쇄 유전자 및(또는) IgM 유전자의 하나 이상의 대립유전자의 표적화된 분단을 포함하는 자손을 생산하도록 사용될 수 있는 트랜스제닉 클로닝된 태아를 생산할 것이다. 이 같은 세포주가 생성된 후, 이들은 수컷 및 암컷 H쇄 및 L쇄 반접합성 넉아웃 (M 및 F 반접합성 H/L) 태아 및 자손을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이들 기술은 트랜스제닉 소의 생산을 위한 사용에 제한되지 않는다; 상기 기술들은 다른 유제류의 핵 전달을 위해서도 사용될 수 있다.
핵 전달 후, 목적한 동물의 생산은 유제류의 교배 또는 앞서 기술된 상동성 표적화 벡터를 사용한 이차 유전자 표적화에 의해 영향을 받을 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 추가의 목적은 수컷 및 암컷 H쇄 및 L쇄 반접합성 넉아웃체의 생성을 포함하고, 여기서 이 같은 반접합성 넉아웃체는 상기에서 기술된 세포주를 사용하여 제조된다. 이는 상기에서 기술된 방법에 따라 제조된 자손의 교배에 의해 영향을 받을 수 있고, 여기서, IgM H쇄 유전자의 분단된 대립유전자를 포함하는 자손은 Ig L쇄의 분해된 대립유전자를 포함하는 다른 자손과 교배된다. 별법으로, 이는 상기에서 기술된 방법에 따라 제조된 자손으로부터 획득된 세포를 조작함으로써 이차 유전자 표적화에 의해 영향받을 수 있다. 이는 IgM H쇄 유전자의 대립유전자 또는 Ig L쇄의 대립유전자의 상동성 재조합 표적화된 분단에 의한 달성을 포함할 것이다. 수컷 및 암컷 H쇄 및 L쇄 반접합성 넉아웃 (M 및 F 반접합성 H/L)을 포함하는 세포주가 생성된 후, 이것은 이 같은 넉아웃을 포함하는 태아 또는 송아지를 생산하기 위해 사용될 것이다. 언급한 바와 같이, 이는 교배 또는 이차 유전자 표적화에 의해 달성될 것이다.
수컷 및 암컷 H쇄 및 L쇄 반접합성 넉아웃을 수득하면, 이들 동물로부터의 세포를 이용하여 동형접합성 넉아웃 (동형접합성 H/L) 태아를 제조할 수 있다. 이는 또한 순차적인 유전자 표적화 또는 교배에 의해 영향받는다. 본질적으로, 교배에 의해 영향 받는 경우, 수컷 H 및 L쇄 반접합성 넉아웃체를 암컷 H 및 L쇄 반접합성 넉아웃체와 교배시키고, 동형접합성 넉아웃을 포함하는 자손을 선택하는 것을 포함할 것이다. 별법으로, 상기 기재한 반접합성 넉아웃으로부터의 세포를 조직 배양액 중에서 조작하여, IgM 또는 Ig L쇄 (λ) 유전자의 다른 대립유전자를 넉아웃시킬 수 있다. 특히, 소와 같은 유제류의 임신 기간이 비교적 긴 경우, 이차 유전자 표적화가 더 빠른 결과를 제공할 수 있기 때문에 교배보다 바람직하다.
동형접합성 넉아웃체 (동형접합성 H/L)이 획득된 후, 이들은 사람과 같은 특정 종의 항체를 생산하기 위한 유전자 (바람직하게는, 전체 유전자좌)를 함유한 목적한 핵산의 도입을 위해 사용된다. 바람직하게는, WO 제97/07671호 (EP 제0843961호) 및 WO 제00/10383호 (EP 제1106061호)에 기술된 것과 같은 사람 인공 염색체가 사용된다. 또한, 이들 사람 인공 염색체는 대응 등록 일본 특허 JP 제30300092호에 기술되어 있다. 이들 두 출원 모두 그 전체 내용이 본원에 참조문헌으로 삽입되었다. 또한, 사람 면역글로블린 유전자를 포함하고 발현하는 인공 사람 염색체의 제조가 문헌 [Shen et al., Hum. Mol. Genet. 6(8): 1375-1382 (1997); Kuroiwa et al., Nature Biotechnol. 18(10):1086-1090 (2000) 및 Loupert et al., Chromosome 107(4):255-259 (1998)]에 기술되어 있으며, 그 전체 내용이 본원에 참조문헌으로 삽입되었다. 또한, 사람 인공 염색체는 야생형 동물 세포 중으로 이종 항체 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다; 이는 상기에서 기술된 방법으로 사용하여 달성된다. 동물 세포, 특히, 태아 섬유아세포 세포 중으로의 인공 염색체의 도입은 본원에서 기술된 것과 같은 미세세포 융합으로 수행될 수 있다.
사람 인공 염색체에 대한 별법으로, 면역글로블린 유전자를 코딩하는 핵산이 YAC 벡터, BAC 벡터, 또는 코스미드 (Cosmid) 벡터를 사용한 염색체 중으로 도입될 수 있다. 이종 Ig 유전자를 포함하는 벡터 (WO 제98/24893호, WO 제96/33735호, WO 제97/13852호, WO 제98/24884호)는 공지의 방법, 예를 들어, 전기천공법, 리포펙션, YAC 벡터를 포함하는 효모 스페로플라스트 (spheroplast)와의 융합 등을 사용하여 태아 섬유아세포 중으로 도입될 수 있다. 아울러, 이종 Ig 유전자를 포함하는 벡터는 태아 섬유아세포 세포의 내인성 Ig 유전자좌에 표적화되어, 이종 Ig 유전자의 도입 및 내인성 Ig 유전자의 분단을 동시에 일으킬 수 있다.
또한, 이종 면역글로블린 유전자를 코딩하는 핵산의 도입은 론베르그 (Lonberg) 등의 특허 (상기 참조)에서 기술된 것과 같이 수행될 수 있다. 이종 면역글로블린 유전자의 숙주 유제류의 염색체 중으로의 도입을 위해 사용된 "넉인 (knockin)" 구조체에서, 하나 이상의 면역글로블린 유전자와 항체 내성 유전자는 구조체로 트랜스펙션되는 세포형에서 활성이 있는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 삽입된 항생제 내성 유전자의 전사를 활성화시키기 위해서 항속적으로 활성이 있거나, 유도가능하거나 또는 조직 특이적인 프로모터가 사용될 수 있고, 그 생성된 항생제 내성에 기초하여 트랜스펙트된 세포가 선별될 수 있도록 한다. 별법으로, Ig 유전자(들) 및 항생제 내성 유전자를 포함하는 넉인 카세트가 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않은 넉인 구조체가 사용될 수 있다. 이 경우, 내인성 프로모터의 조절 하에서 생성된 항생제 내성 마커의 발현에 기초하여 넉인 카세트가 내인성 프로모터의 하류에 도입된 세포가 선별될 수 있다. 이들 선별된 세포가 본원에서 기술된 핵 전달 방법에서 사용되어 숙주 염색체 중으로 삽입된 이종 면역글로블린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 유제류를 생산한다.
비슷한 방법을 사용하여, 상이한 종, 예를 들어, 다른 종 중에서도 개, 고양이, 다른 유제류, 비사람 영장류의 Ig의 발현을 위한 인공 염색체를 생산하고 삽입하는 것이 가능하다. 상기에서 논의된 바와 같이, 또한, 당업계에 공지된 바와 같이, 상이한 종의 면역글로블린 유전자가 상이한 종에 걸쳐서 상당한 서열 상동성을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다.
삽입된 인공 염색체, 예를 들어, 사람 인공 염색체가 세포주, 예를 들어, 소 태아 섬유아세포 중에 안정하게 도입되었는지 측정한 후, 이를 핵 전달을 위한 공여체로 사용할 수 있다. 이는 PCR 방법으로 결정될 수 있다. 유사하게, 동형접합성 넉아웃을 포함하고, 추가로 안정하게 도입된 핵산, 예를 들어, 사람 인공 염색체를 포함한 동물이 획득된다. 안정하게 도입된 핵산 (예를 들어, 사람 인공 염색체)를 포함하는 송아지가 획득된 후, 이들이 면역화에 대한 반응으로 사람 Ig 유전자를 발현하고 친화도 성숙을 나타내는지 측정하기 위해 동물을 시험한다.
또한, 상기에서 기술된 전체 방법의 변형이 수행될 수 있다. 예를 들어, 이종 Ig 유전자가 도입될 수 있고, 이어서 이종 Ig 유전자가 불활성화될 수 있다. 아울러, 이종 Ig 유전자를 함유하는 동물을 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 동물과 교배할 수 있다. 본 발명에서 사용된 접근법이 상기에서 기술되었지만, 사용되는 기술을 하기에서 보다 상세히 기술한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되었으며, 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 특히, 이들 실시예가 트랜스제닉 소에 초점을 두고 있지만, 기술된 방법은 임의의 트랜스제닉 유제류를 생산하고 시험하기 위해 사용될 수 있다.
사람 Ig 를 발현하는 트랜스제닉 유제류를 생산하기 위한 넉아웃 방법
상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 동형접합성 H/L 태아 또는 송아지의 제조에 관한 것이다. 이 접근법은 도 1에 요약되어 있다. 세가지 설계가 개괄되어 있다. 첫번째는 재생된 태아 세포주에서의 연속적인 넉아웃에 의존한다. 이 접근법은 기술적으로 가장 어렵고, 가장 위험 수준이 높지만, 상기에서 언급한 바와 같이 잠재적으로 교배 접근법보다는 빠른 결과를 낸다. 다른 두 가지 설계는 동물을 교배하는 것에 의존한다. 두번째 설계에서, H쇄 및 L쇄 유전자의 단일 넉아웃체만이 각각 수컷 및 암컷 세포주에서 요구된다. 이 설계는 세포주의 재생에 의존하지 않고, 기술적으로 가장 간단한 접근법이지만, 달성하는 데 가장 긴 시간이 걸린다. 설계 3은 설계 1과 2 사이의 중간물이다. 모든 설계에서 동형접합성 H/L 태아만이 생성되는데, 이는 동형접합성 H/L 넉아웃 송아지의 생존 및 유지가 잠재적으로 어렵기 때문이다. 필요하다면, 동형접합성 H/L 넉아웃 송아지의 생존을 증가시키기 위해서 수동적 면역치료법이 사용될 수 있다.
실험 디자인
본 발명은 바람직하게는 반접합성 H쇄 넉아웃체 (M 반접합성 H) 및 반접합성 암컷 L쇄 넉아웃체 (F 반접합성 L)의 생산 및 이들 표적화된 결실 유래의 40일된 태아의 생성을 포함한다. 배로부터 세포를 수집하고, L쇄의 한 대립유전자를 M 반접합성 H 세포 중에서 표적화시키고, F 반접합성 L 세포 중에서 H쇄 유전자좌의 한 대립유전자를 표적화시켜서 H 및 L 유전자좌 양쪽에 반접합성 결실이 있는 세포를 생성한다 (반접합성 H/L). 이들 세포로부터 40일된 태아를 유도하고, 여기서 섬유아세포를 단리한다.
M 반접합성 H/L 섬유아세포를 다른 H 사슬 대립유전자로 표적화시켜서 M 동형접합성 H/반접합성 L을 생성하고, F 반접합성 H/L을 다른 L쇄 대립유전자로 표적화시켜서 F 동형접합성 L/반접합성 H를 생성한다. 동형접합성 결실을 생성하기 위해서, 높은 농도의 약물이 사용되어 동형접합성 표적화를 유도한다. 그러나, 이 접근법은 성공적이지 못할 수 있으며, 교배가 필요할 수 있다. 선별 카세트의 cre/lox 표적화에 의존하는 예시적인 방법은 하나 이상의 표적화된 결실에 대해 동일한 선별 시스템이 사용될 수 있도록 한다. 이들 섬유아세포를 클로닝하고, 40일된 태아를 수집하고, 섬유아세포를 단리한다. 이 클로닝으로부터의 태아 세포를 표적화시켜서 H 또는 L 유전자좌에서 동형접합성 결실을 생성하여, M 동형접합성 H/L 및 F 동형접합성 H/L 태아 섬유아세포를 생성한다. 이들 섬유아세포를 클로닝하고, 유도된 40일된 태아 및 섬유아세포를 단리한다. 이후, 동형접합성 H/L 태아 섬유아세포를 사용하여, 임의로 교배 방법을 사용하여, HAC을 도입한다.
라이브러리 구축
태아 섬유아세포를 사용하여 게놈 라이브러리를 구축한다. 표적 구조체가 클로닝될 세포와 동질유전자일 것이 중요하다고 보고되었지만, 본 발명에서 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 내인성 면역글로블린 유전자 중 돌연변이를 생성하기 위해서 동질유전자, 실질적으로 동질유전자, 또는 비동질유전자 구조체가 사용될 수 있다. 한 가지 가능한 방법에서, 유전적으로 다른 소 품종에 비해 높은 수준의 동종번식을 갖는 홀스타인 소가 사용된다. 본 발명자들은 상이한 동물들 중에서 면역글로블린 유전자 중 어떠한 다형성도 탐지하지 못했다. 이는 서열 상동성이 높아야 하고, 비동질유전자 구조체를 사용한 성공적이어야 한다는 것을 제시한다.
"클론화 가능성" 시험과 동시에 한 수컷 세포주 및 한 암컷 세포주로부터 라이브러리가 구축된다. 공정의 마지막에 라이브러리가 생성되고, 다수의 상이한 태아 세포주가 시험되고 한 세포주가 클로닝 목적을 위해 최적인 것으로 선택될 것이라고 예상된다. 태아 섬유아세포로부터 단리된 고분자량 DNA를 사용하여 게놈 라이브러리를 구축한다. DNA를 크기 분별화하고, 20-23Kb 범위의 고분자량의 DNA를 λ파지 벡터, LambdaZap 또는 LambdaFix 중에 삽입한다. 본 발명자들은 스트라타진(Stratagene)사가 제조한 라이브러리를 사용하여 훌륭하게 성공하였다. 따라서, DNA를 단리하고, 크기 선별된 DNA를 라이브러리 제조를 위해 스트라타진사로 보냈다. 소 H쇄 및 L쇄를 함유한 클론을 단리하기 위해서, 방사능표지된 IgM cDNA 및 방사능표지된 L쇄 cDNA를 사용한다. 아울러, 유전자좌를 결실시킬 필요가 있을 경우, L쇄 게놈 클론을 단리한다. 클론을 포함한 소 H쇄 및 L쇄에 대해 각각의 태아 세포 라이브러리를 스크리닝한다. 약 105-106 플라크의 스크리닝이 H쇄 또는 L쇄 유전자좌를 포함한 클론의 단리에 이를 수 있을 것으로 예상된다. 단리된 후, 양쪽 유전자좌를 pBluescript에 서브클로닝하여 넣고, 제한효소 지도를 제작하였다. 홀스타인의 이들 유전자좌의 제한효소 지도를 도 2b (Knight et al., J. Immunol 140(10):3654-9, 1988)에 제공하였다. 아울러, 획득한 클론의 지도를 제작하고, 표적 구조체를 조립하기 위해 사용한다.
표적화 구조체의 제조
H쇄 및 L쇄 유전자가 단리된 후, 구조체를 제조한다. IgM 구조체는 IgM 불변 영역 막 도메인을 결실시켜 제조된다. 러웨스키 (Rajewsky) 및 그 동료들이 마우스에서 보인 바와 같이, IgM의 막 도메인의 결실은 B 세포 발생을 정지시키는데, 이는 표면 IgM이 연속된 B 세포 발생에 요구되는 시그날이기 때문이다 (Kitamura et al., Nature 350:423-6). 따라서, 동형접합성 IgM 소는 B 세포가 결여되어 있다. 이는 문제를 일으키지는 않는데, 이는 본 계획에서 기능적 Ig가 결여된 살아있는 동물은 필요하지 않기 때문이다. 그러나, 필요하다면, 사람 Ig 유전자좌가 도입될 때 마지막 단계까지 동물의 생존을 향상시키기 위해 수동적 면역요법이 사용될 수도 있다.
IgM H쇄 대립유전자의 넉아웃을 달성하기 위해 사용된 예시적인 표적화 구조체를 도 2a에 도시하였다. H쇄의 경우, 막 IgM 도메인은 lox P 자리에 연결된 네오마이신 카세트로 치환된다. 부착된 막 도메인은 neo 카세트와 함께 스플라이싱되어 막 도메인은 lox P 자리의 5'에 인접하게 삽입된 TAG 종결 코돈을 가져서, 막 도메인이 확실히 불활성화되도록 한다. 이는 약 5-6kb의 3' 염색체 DNA를 가진 표적 구조체의 5'에 위치한다.
약물 농도의 증가가 IgM H쇄 또는 L쇄 중 어느 하나의 두 번째 대립유전자의 결실을 일으키지 못한다면, 선별 마커를 결실시키기 위해서 cre/lox 시스템 (문헌 [Sauer, 1998, Methods 14: 381-392] 중에서 고찰됨)을 사용한다. 하기에서 기술한 바와 같이, cre/lox 시스템은 선별 마커의 표적화된 결실을 허용한다. 모든 선별 마커는 loxP 서열에 연결되어 필요하다면, 이들 마커의 결실을 용이하게 한다.
L쇄 구조체는 소 λ쇄 구조체 영역 (예를 들어, Genebank 접수번호 AF396698에서 발견되는 λL쇄 불변 영역 또는 임의의 다른 유제류의 λL쇄 구조체 영역) 및 lox P 자리에 연결된 퓨로마이신 내성 유전자 카세트를 포함하고, 소 유전자를 lox P 자리에 연결된 퓨로마이신 카세트로 치환한다. λ불변 영역의 3'의 약 5-6kb의 DNA가 퓨로마이신 내성 유전자의 3'를 치환한다. 퓨로마이신 내성 유전자는 5' 및 3' 말단에 lox P 자리를 가져서 필요하다면, 결실이 일어나도록 한다. 유제류 항체 유전자 사이의 높은 상동성으로 인해, Genebank 접수번호 AF396698에서 발견되는 소 λL쇄 서열이 다양한 유제류의 게놈 λL쇄 서열과 혼성화할 것으로 예상되고, 따라서, 다양한 유제류 λ L쇄 게놈 서열을 단리하기 위한 표준 방법에서 사용될 수 있다. 이들 게놈 서열은 임의의 유제류 중에서 내인성 λ L쇄를 불활성화시키기 위한 넉아웃 구조체를 제조하기 위해 본원에서 기술된 것들과 같은 표준 방법에서 사용될 수 있다.
κL쇄 넉아웃 구조체가 도 3g의 소 κL쇄 서열 또는 임의의 다른 κL쇄 서열을 사용하여 유사하게 제조될 수 있다. 소 κL쇄는 다양한 유제류로부터 게놈 κ L쇄 서열을 단리하기 위한 혼성화 프로브로 사용될 수 있다. 이들 게놈 서열은 임 의의 유제류의 내인성 κL쇄를 불활성화시키기 위한 넉아웃 구조체를 제조하기 위한, 본원에서 기술된 것과 같은 표준 방법에서 사용될 수 있다.
추가적인 유제류 유전자가 임의로 돌연변이되거나 또는 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 사람에게 투여되는 본 발명의 항체 내의 유제류 Ig J쇄의 잠재적인 항원성을 방지하기 위해 유제류 내인성 Ig J쇄 유전자가 넉아웃될 수 있다. 표적화 벡터의 제조를 위해, Genebank 접수번호 U02301에서 발견되는 소 Ig J쇄의 cDNA 서열을 사용할 수 있다. 이 cDNA 서열은 RPC1-42와 같은 BAC 라이브러리 (Oakland, CA, BACPAC)로부터 소 Ig J쇄의 게놈 서열을 단리하기 위해 또는 임의의 다른 유제류의 J쇄의 게놈 서열을 단리하기 위해 프로브로 사용될 수 있다. 추가적으로, 사람 IgA 및 IgM 분자의 기능적 발현을 위해 본 발명의 유제류 중으로 사람 J쇄 코딩 서열이 도입될 수 있다. 사람 J쇄의 cDNA는 Genebank 접수번호 AH002836, M12759 및 M12378로 얻을 수 있다. 이 서열은 본원에서 기술된 것과 같은 표준 방법을 사용하여 유제류 태아 섬유아세포 중으로 도입될 수 있다. 예를 들어, HAC, YAC 벡터, BAC 벡터, 코스미드 벡터, 또는 넉인 구조체 내의 사람 J쇄가 내인성 유제류 염색체 중으로 도입되거나 또는 내인성 유제류 염색체와는 독립적으로 유지될 수 있다. 생성된 트랜스제닉 유제류 세포는 기능적 유제류 J쇄의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 돌연변이를 가지며, 사람 J쇄를 발현하는 이종 핵산을 함유하는 목적한 유제류를 생성하기 위해 본원에서 기술된 핵 전달 방법에서 사용될 수 있다.
아울러, α-(1,3)-갈락토실 전이효소에 의해 생성되는 갈락토실(α1,3)갈락 토스 에피토프를 감소시키거나 또는 제거하기 위해 유제류 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자를 돌연변이시킬 수 있다. 본 발명의 유제류에 의해 생성된 사람 항체가 이 카르복실레이트 에피토프에 의해 변형된다면, 이들 글리코실레이트된 항체는 사람에게 치료제로 투여되었을 때, 카르복실레이트 에피토프와 반응성인 수용자 내의 항체에 의해 불활성화되거나 또는 제거될 수 있다. 카르복실레이트 에피토프에 대한 이 가능한 면역 반응을 제거하기 위해, 소 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자 서열을 사용하여 이 유전자를 유제류 내에서 불활성화시키기 위한 넉아웃 구조체를 고안할 수 있다 (Genebank 접수번호 J04989; Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264(24):14290-7, 1989). U.S. 특허 제6,153,428호 및 제5,821,117호에 개시되어 있는 소 서열 또는 돼지 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 서열은 다양한 유제류로부터 게놈 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 서열을 획득하여 갈락토실(α1,3)갈락토오스 에피토프의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 다른 유제류를 생성하는 데 사용될 수 있다.
바란다면, 소 해면뇌면증 (BSE)과 같은 감염의 잠재적인 위험을 감소시키기 위해 유제류 프리온 유전자는 돌연변이되거나 또는 불활성화된다. 표적 벡터의 제조를 위해, 소 프리온의 게놈 DNA 서열이 사용될 수 있다 (Genebank 접수번호 AJ298878). 별법으로, 이 게놈 프리온 서열은 다른 유제류로부터 게놈 프리온 서열을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 프리온 유전자는 표준 방법, 예를 들어, 본원에서 기술된 것과 같은 방법 또는 양에서 α-(1,3)-갈락토실 전이효소 유전자 또는 프리온 유전자를 넉아웃시키기 위해 제안된 방법 (Denning et al., Nature Biotech., 19:559-562, 2001)을 사용하여 불활성화될 수 있다.
각각의 유전자좌의 두 번째 대립유전자의 표적화를 위해서, 만약 첫 번째 선별 마커가 세포 내에 남아있다면, 상이한 선별 마커를 함유한 신규 표적 구조체를 조립하는 것이 필요하다. 표 1에 나타낸 것과 같이, 다양한 선별 방법을 사용할 수 있고, 비교할 수 있고, 적절한 선별 시스템이 선택된다. 최초에, 두 번째 대립유전자는 약물 농도를 증가시켜 (예를 들어, 약물 농도를 두배로 하여) 표적화된다. 이것이 성공적이지 않을 경우, 신규 표적화 구조체가 사용될 수 있다.
상기에서 언급된 추가적인 돌연변이 또는 유전자 불활성화가 다양한 방법을 사용하여 본 발명의 유제류 내로 도입될 수 있다. 각각의 목적한 돌연변이에 대해 트랜스제닉 세포주가 생성되면, 본원 발명의 유제류 내로 이들 돌연변이들을 도입하기 위해 교차교배를 사용할 수 있다. 별법으로, 이들 추가 돌연변이를 가진 태아 섬유아세포 세포가 내인성 Ig 유전자의 넉아웃 및(또는) 이종 Ig 유전자의 도입을 위한 출발물질로 사용될 수 있다. 또한, 내인성 Ig 유전자 내에 넉아웃 돌연변이를 가지고(또는) 이종 Ig 유전자를 함유한 태아 섬유아세포가 이들 추가 돌연변이 또는 불활성화를 위한 출발물질로 사용될 수 있다.
Ig 유전자좌의 표적화된 결실
표적화 구조체가 예를 들어, 전기침공법에 의해 배 섬유아세포 내로 도입될 수 있다. 표적화 벡터를 도입하는 세포는 적절한 항생제 사용에 의해 선별된다. 선택된 약물에 내성이 있는 클론이 성장을 위해 선별될 것이다. 이후, 이들 클론 은 갱시클로버를 사용한 음성 선별을 거치고, 이는 적절하게 도입된 클론들을 선별할 것이다. 별법으로, 약물 선별에서 생존하는 클론들을 PCR로 선별한다. 적절한 표적화된 클론을 찾기 위해서 500-1000개 이상의 클론들을 스크린할 필요가 있는 것으로 추산된다. 발명자들의 추산은 IgM H쇄 불변 영역의 막 도메인을 표적화시킬 때, 300개의 neo 내성 클론 중 약 1개가 적절히 표적화된다는 것을 발견한, 키타무라의 발견 [Kitamura et al., Nature 350:423-6, 1991]에 기초한다. 따라서, 96웰 플레이트 중의 10개 클론 군 중으로 클론들을 수집하고, 선택된 표적 클론에 대해 10개 클론의 수집물을 스크린하는 것이 제안된다. 양성체가 동정되면, 수집된 클론으로부터 단리된 단일 클론을 스크리닝한다. 이 방법은 표적화된 클론의 확인을 가능하게 해야 한다.
섬유아세포가 배양물 중에서 이동하기 때문에, 배양 플레이트 하나 당 약 10개 이상의 클론이 생성될 경우, 각각의 클론을 구분하는 것이 어렵다. 아울러, 높은 효율의 트랜스펙션을 사용한 클론 증식을 위한 방법이 개발될 수 있다. 수 개의 합리적인 방법, 예를 들어, 희석 클로닝이 사용될 수 있다.
약물 내성 마커의 Cre / Lox 절단
상기에서 제시한 바와 같이, 예시적인 표적화 구조체는 cre/lox 시스템을 사용한 마커의 효과적인 결실을 용이하게 하기 위해 lox P 자리에 연결된 선별 마커를 함유한다. 표적 벡터를 운반하는 태아 섬유아세포는 플라스미드를 함유한 Cre를 사용하여 전기침공법에 의해 트랜스펙션된다. GFPcre 융합 유전자를 함유한 최 근에 기술된 Cre 플라스미드 [Gagneten S et al., Nucleic Acids Res 25:3326-31 (1997)]가 사용될 수 있다. 이는 Cre 단백질을 함유한 모든 클론의 신속한 선별을 가능하게 한다. 이들 세포들은 FACS 분별 또는 미세조작을 통한 녹색 형광 세포들의 수작업에 의한 수집에 의해 선별된다. 녹색인 세포는 활성을 갖도록 전사된 Cre 재배열효소를 운반할 것으로 예상되고, 따라서, 약물 내성 마커를 결실시킨다. Cre 발현으로 선별된 세포를 클로닝하고, 클론들을 PCT 분석을 통해 약물 내성 마커의 결실 여부를 분석한다. 절단이 일어난 것으로 측정된 세포들을 작은 클론으로 성장시키고, 분열시키고, 한 방울의 분취액을 선별 배지 내에서 시험하여 약물 내성 유전자가 결실되었는지를 확실히 확인한다. 다른 분취액을 다음번 표적 결실화를 위해 사용한다.
선별 마커 및 선별을 위한 약물
유전자 약물
Neor G4181
Hph 하이그로마이신 B2
Puro 퓨로마이신3
Ecogpt 마이코페놀산4
Bsr 블라스티딘 S5
HisD 히스티놀6
DT-A 디프테리아 독소7
1 Southern PJ, Berg P. 1982. SV40 초기 영역 프로모터 조절 하의 박테리아 유전자를 사용한, 포유동물 세포를 항생제 내성으로 만드는 형질전환. J. Mol. Appl. Genet 1: 327-41.
2 Santerre RF, Allen NE, Hobbs JN Jr, Rao RN, Schmidt RJ. 1984. 마우스 L 세포에서 우성-선별 마커로서 하이그로마이신 B 및 G418 내성을 위한 원핵 유전자의 발현. Gene 30:147-56.
3 Wirth M, Bode J, Zettlmeissl G, Hauser H. 1988. 신속하고 빠른 선별 방법에 의한 과잉생산 재배열 포유류 세포주의 동정. Gene 73:419-26.
4 Drews RE, Kolker MT, Sachar DS, Moran GP, Schnipper LE. 1996. 비선별 배지로의 계대배양은 에스케리치아 콜리 잔틴-구아닌 포스포라이보실전이효소 유전자를 발현하는 마이코페놀산-내성 포유류 세포의 성장을 일시적으로 변경한다. Anal Biochem 235:215-26.
5 Karreman C. 1998. 블라스티시딘 디아미나아제-티미딘 키나제 융합에 기초한 포유류 세포에 대한 신규 양성/음성 선별 마커. Nucleic Acids Re 26:2508-10.
6 Hartman SC, Mulligan RG. 1998. 포유류 세포 내에서의 유전자 전달 연구를 위한 두 개의 우성-활성 선별 마커. Proc Natl Acad Sci USA 85:8047-51.
7 Yagi T, Nada S., Watanabe N, Tamemoto H, Kohmura N, Ikawa Y, Aizawa S. 1993. 디프테리아 독소 A 단편 유전자를 사용한 상동성 재조합체에 대한 신규 음성 선별. Anal Biochem 214:77-86.
다른 유제류의 면역글로블린 유전자를 변경하는 표적화 방법의 응용
다른 유제류의 면역글로블린 유전자를 변경하기 위해, 3개의 주요 영역을 포함한 표적화 벡터를 고안한다. 첫 번째 영역은 표적화될 유전자좌에 대해 상동성이다. 두 번째 영역은 표적화된 유전자좌의 일부를 특이적으로 치환하는 약물 선별 마커이다. 세 번째 영역은 첫 번째 영역과 마찬가지로 표적화될 유전자좌에 대해서 상동성이지만, 야생형 게놈 내의 첫 번째 영역에 인접하지 않는다. 표적화 벡터와 목적한 야생형 유전자좌 사이의 상동성 재조합은 표적화 벡터 내에서 상동성이 있는 것으로 나타난 두 개의 영역 사이의 유전자좌 서열의 결실 및 약물 내성 마커에 의한 이 서열의 치환을 일으킨다. 바람직한 실시태양에서, 상동성이 있는 두 개의 영역의 전체 크기는 약 6kb이고, 표적화된 유전자좌의 일부를 치환하는 두 번째 영역의 크기는 약 2kb이다. 이 표적화 방법은 원핵세포로부터 사람 세포까지 넓은 범위의 종에 대해 광범위하게 유용하다. 사용된 각각의 벡터의 독특함은 유전자 표적화 방법을 위해 선택된 유전자좌 및 이 방법에서 사용된 서열에 있다. 이 방법은 소 (Bos taurus)는 물론 염소 (Capra hircus), 양 (Ovis aries) 및 돼지 (Sus scrufa)를 포함하여 모든 유제류에 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 유제류 세포 내의 특정 유전자의 표적화를 위한 전기천공법의 사용은 유제류 내에서 광범위하게 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 일반적인 방법은 다른 유제류 내로 표적화된 돌연변이를 도입하는 데 사용될 수 있다. 다른 유제류로부터 얻는 형질전환체의 수를 최적화시키기 위해서 전기천공법의 변형 (전압 및 용량)이 사용될 수 있다. 아울러, 소의 H쇄 유전자좌를 표적화시키기 위해서 본원에서 사용된 방법 (즉, 제거되는 엑손에 바로 인접하는 영역에 상동성이 있는 영역을 포함한 벡터를 사용하여 모든 코딩 엑손 및 그 사이의 서열의 제거)이 또한 다른 유제류에서 동등하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 양 (Ovis aries)의 면역글로블린 H쇄 유전자좌에 대해 광범위한 서열 분석이 수행되었으며, 양 유전자좌는 그 구조 및 서열 양면에서 소 유전자좌와 상당히 유사하다 (Genebank 접수번호 Z71572, Z49180부터 Z49188, M60441, M60440, AF172659부터 AF172703). 재배열된 양 (Ovis aries) 면역글로블린쇄에 대해 보고된 다수의 cDNA 서열과 아울러, H쇄 5' 인핸서 (Genebank 접수번호 Z98207), 3' μ 스위치 영역 (Z98680) 및 5' μ 스위치 영역 (Z98681)를 포함하는 H쇄 유전자좌에 대한 게놈 서열 정보가 보고되었다. 양의 H쇄의 분비 형태의 전체 mRNA 서열이 접수번호 X59994로 기탁되었다. 이 기탁은 4개의 코딩 엑손의 전체 서열을 포함하고, 이는 대응 소 서열과 상당한 상동성이다.
양 유전자좌에 대한 정보는 Genebank로부터 얻었으며, PCR 분석을 위해 사용된 프라이머의 고안을 위해 소 서열과 높은 상동성을 가진 영역을 결정하기 위해 사용되었다. 비동질유전자 DNA가 소 세포를 표적화하기 위해 사용되었기 때문에, 양 서열과 높은 상동성을 가진 영역의 탐지가 소의 품종 사이의 유사한 서열 전환이 일어나는 지표로 사용되었다. 소와 양 면역글로블린 유전자의 서열 및 구조 사이에 유사성이 있다면, 소 면역글로블린 유전자좌를 제거하기 위해 사용된 표적화 방법이 양 시스템에서도 성공적으로 사용될 것으로 예측된다. 아울러, 돼지 (Sus scrofa, 접수번호 S42881) 및 염소 (Capra hircus, 접수번호 AF 140603) 상에 존재하는 정보는 이들 두 종의 면역글로블린 유전자좌가 본 표적화 방법을 사용하는 소 유전자좌와 충분히 유사하다는 것을 나타낸다.
HAC 의 삽입 방법
본래, 사람 인공 염색체 서열 (#14fg., #2fg., 및 #22fg.)을 포함하는 수컷 및 암컷 소 태아 섬유아세포주를 얻고, 선별하고, 사용하여 이들 세포주로부터 클로닝된 송아지를 생산하였다.
예를 들어, 사람 염색체 #14 ("#14fg," Ig H쇄 유전자를 포함), 사람 염색체 #2("#2fg," Ig κ쇄 유전자를 포함) 및 사람 염색체 #22 ("#22fg," Ig λ쇄 유전자를 포함)으로부터 유래한 HAC이 동시에 또는 연속적으로 도입될 수 있다.
이들 염색체 단편의 전달은 수컷 #14fg. 동물을 암컷 #2fg. 및 #22fg. 동물과 교배하고, 그 자손을 평가하여 시험된다. 전달이 성공적이면, 이후 두 세포주를 교배하여 3개의 염색체 단편을 모두 함유한 세포주를 생산한다.
또한, #14fg., #2fg., 및 #22fg. 염색체 단편을 동형접합성 H/L 태아 세포 중으로 삽이하여 클로닝된 송아지를 생산하거나 또는 트랜스제닉 HAC 송아지를 동형접합성 H/L 송아지와 교배시키는 데 사용할 수 있다. 별법으로, 다른 HAC, 예를 들어, ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 실시예 2에서 기술한 것과 같이 도입하거나, 또는 기타 임의의 염색체 전달 방법을 사용하여 도입할 수 있다.
원리
HAC의 생식세포계 전달은 Ig 넉아웃 동물 중으로 HAC를 도입하고, 생산 동물들 중의 동물의 증식에 유용해야 한다. 생식세포주를 통한 HAC의 증식에서 주의점은 감수분열시 염색체 물질의 불완전한 접합이다. 그러나, 생식세포주 전달은 토미주카 등이 보여준 바와 같이 마우스에서 성공적이었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722, 2000).
도 1a에 개괄된 방법은 #14fg.를 수컷 세포주 중으로 삽입하고, #2fg. 및 #22fg.를 각각 암컷 세포주 중으로 삽입하는 것으로 구성된다. HAC을 함유한 송아지를 생산하고, 생식세포계 전달을 암컷 및 수컷 모두를 통해 시험할 수 있다. 생성된 자손의 일부 (~25%)는 H쇄 및 L쇄 HAC 모두를 포함해야 한다. 추가적인 교배는 세가지 염색체 단편 모두를 포함하는 송아지 계열을 생성해야 한다. 이들 동물은 상기에서 기술된 것과 같이 태아 세포로부터 생산된 동형접합성 H/L 동물과의 교배에 사용된다.
실험 고안
세포주의 초기 스크리닝으로부터 세포를 획득한다. 이들은 홀스타인이거나 또는 상기에서 사용된 것과는 다른 계열일 수 있다. 이는 동물 중에서 가능한 가장 많은 유전적 변형을 유지하는 교배를 허용한다. 이후, 세포주로의 HAC의 도입 및 양성 세포주의 선별이 수행된다. 선택된 세포주는 핵 전달을 위해 사용되고 송아지가 생산된다. 12개월된 정액 및 알을 수집하기 시작해서, 수정하고, 수용체 동물 중으로 전달한다. 세포 샘플을 얻어서 DNA 마커 분석 및 핵형조사에 사용한다. 출산 시점부터 혈액 샘플을 얻어서 사람 Ig 단백질의 존재를 분석한다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 상기 실험에서 개발된 방법을 사용하여 HAC을 동형접합성 H/L 세포주로 전달시킨다.
사람 Ig 발현의 시험
본 실험의 목적은 수컷 동형접합성 H 세포 및 클로닝된 태아를 생성하고, 사람 IgH 및 사람 IgL 유전자좌를 함께 함유한 하나 이상의 HAC (예를 들어, HAC #14fg. 및 #22fg.)을 동형접합성 H 세포 중으로 삽입하고, 송아지를 생산하고, 면역화에 대한 반응으로 사람 Ig의 발현 및 친화도 성숙을 시험하는 것이다.
실험 고안
상기에서 기술된 것과 같이 생산된 반접합성 H 세포로부터 동형접합성 H 세포를 생산한다. 항생제 선별 또는 추가 삽입에 의해 이중 넉아웃체를 생산한다. 상기에서 기술된 것과 같이 HAC이 이들 세포 중으로 전달된다. 송아지를 핵 전달에 의해 생산한다. HAC을 함유한 송아지의 시험을 출산 바로 직후 시작하고, 이는 (1) 사람 Ig 발현의 평가, (2) 면역화에 대한 반응, (3) 친화도 성숙, 및 (4) 자손 중으로 HAC의 전달을 포함한다.
동물의 혈액을 채취하고, ELISA, RT-PCT 또는 FACS 분석으로 사람 H쇄 및 L쇄의 존재를 분석하여 사람 Ig 발현을 모니터한다. 동물이 사람 Ig를 생산하는지를 측정한 후, 애주번트 중의 파상풍 독소로 동물을 면역화시킨다. 면역화 후 일주일 간격으로 동물의 혈액을 채취하고, 항원에 대한 반응을 EILSA 또는 FACS로 측정하고, 면역화시키기 전에 수집된 이전 혈액과 비교한다. 최초 면역화 1달 후에 수용성 형태의 항원으로 동물을 부스터한다. 부스터하고 1주일 후, 동물의 혈액을 채취하고, 항원에 대한 반응을 ELISA 또는 FACS로 측정하고, 이전혈액과 비교한다. ELISA 또는 FACS 분석은 생산된 H쇄 이소타입은 물론 반응 역가의 대부분의 측정을 가능하게 한다. 이 데이타는 클래스 스위칭의 발생은 물론 항체 역가의 증가의 측정을 가능하게 한다. 또한, 항원에 대한 반응 중 친화도 성숙이 일어났는지를 측정하기 위해 평균 친화도의 개산을 측정한다.
상기에서 기술한 것과 같이, 트랜스제닉 소를 얻은 후, 이들을 사용하여 트랜스제닉 Ig, 바람직하게는 사람 Ig이나 잠재적으로는 다른 종, 예를 들어, 개, 고양이, 비사람 영장류, 양, 돼지, 염소와 같은 기타 유제류, 마우스, 래트, 기니아피그와 같은 쥐과 동물, 토끼 등의 Ig를 생산하는데 사용한다. 언급한 바와 같이, Ig 유전자는 종 전체에서 보존된 것으로 알려져 있다.
트랜스제닉 항혈청 및 이종 항체를 함유한 유즙
소 (또는 기타 유제류)는 항원이 내인성으로 노출되거나, 또는 외인성으로 투여된 항원(들)이든 모든 항원(들)에 대한 트랜스제닉 항혈청을 생산한다. 예를 들어, 병원균과 같은 항원 (예를 들어, 박테리아, 바이러스, 원생동물, 효모 또는 진균), 암 항원, 수용체, 효소, 사이토카인 등을 포함하는 항원들에 반응성인 목적한 항체를 생산하기 위해 항원들이 유제류에 투여될 수 있다. 항체 생산을 위한 예시적인 병원균은 간염 바이러스 (예를 들어, C형 간염), 면역결핍 바이러스 (예를 들어, HIV), 헤르페스 바이러스, 파보바이러스, 장내바이러스, 에볼라 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 우두 바이러스, 스트렙토코코스 (예를 들어, 스트렙토코코스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia)), 헤모필러스 (예를 들어, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus inflenza)), 나이제리아 (예를 들어, 나이제리아 메닝지티스 (Neisseria meningitis)), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diptheria), 헤모필러스 (예를 들어, 헤모필러스 퍼투시스 (Haemophilus pertussis)), 클로스토리디움 (예를 들어, 클로스트리디움 보툴리니움 (Clostridium botulinium)), 스타필로코코스 (Staphylococcus), 슈도모나스 (예를 들어, 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aerugonosa)) 및 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 질환의 안정화 또는 치료에 유용한 본 발명의 과면역 혈청을 생산하기 위해 하나 이상의 병원균이 트랜스제닉 유제류에 투여될 수 있다. 예를 들어, 아동의 홉흡기 감염과 관련된 병원균이 트랜스제닉 유제류에 투여되어 이들 병원균 (예를 들어, 스트렙토코코스 뉴모니아, 헤모필러스 인플루엔자 및(또는) 나이제리아 메닝지티스)과 반응성인 항혈청을 생산하는 데 사용될 수 있다. 이들 병원균은 유제류에 투여되기 전에 그 독성을 감소시키기 위해 임의로 처리될 수 있다 (예를 들어, 열 또는 포름알데히드와 같은 화학물질에 노출시킴).
광범위한 범위의 Ig 생산을 위해, 다양한 병원균 (예를 들어, 다수의 박테리아 및(또는) 바이러스 병원균)이 트랜스제닉 유제류에 투여될 수 있다. 이 과면역 혈청은 포유동물 (예를 들어, 사람) 중의 감염 예방, 안정화 또는 치료를 위해 사용될 수 있고, 특히 유전적 또는 후천성 면역결핍증이 있는 포유동물의 치료에 유용하다.
아울러, 본 발명의 방법으로 생산된 항체는 특정 사람 세포를 제거하고, 특정 분자를 조절하기 위해서는 물론, 면역계를 억제하기 위해서, 예를 들어, 신경병증을 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-이디오타입 항체 (즉, 다른 항체를 저해하는 항체) 및 T 세포, B 세포, 또는 사이토카인에 대해 반응성인 항체가 자가면역 질환 또는 신경병증 (예를 들어, 염증으로 인한 신경병증)의 치료에 유용할 수 있다. 이들 항체는 항원이 투여되지 않은 트랜스제닉 유제류로부터 얻을 수 있거나, 또는 이들은 B 세포, T 세포 또는 사이토카인 (예를 들어, TNF α)와 같은 항원이 투여된 트랜스제닉 유제류로부터 얻을 수 있다.
항원이 투여되지 않은 트랜스제닉 유제류로부터 생성된 항혈청은 사람 폴리클로날 항체, 바람직하게는 사람 IgG 분자를 함유한 약품을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이들 사람 항체는 사람으로부터 단리된 항체 대신에 정맥내 면역글로블린 (IVIG) 치료법에 사용될 수 있다.
트랜스제닉 항혈청은 목적한 하나 이상의 항체에 대해 반응성인 항체에 대해 농후화될 수 있다. 예를 들어, 항혈청은 아수벨 등(Asubel et al.)에 의해 기술된 것 [Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13.3, John Wiley & Sons, 1995]과 같은 표준 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 바람직한 정제 방법은 항원 또는 항체 코팅된 비드를 사용한 침전, 친화도 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피, 자기 비드 친화도 정제, 및 플레이트-결합된 항체를 사용한 팬닝 (panning)을 포함한다. 아울러, 트랜스제닉 항혈청은 하나 이상의 목적하는 항원과 접촉될 수 있으며, 항원에 결합하는 항체는 증가된 크기의 항체/항원 복합체에 기초하여 비결합된 항체와 분리될 수 있다. 또한, 단백질 A 및(또는) 단백질 G가 IgG 분자를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 내인성 항체의 발현이 제거되지 않는다면, 목적한 사람 항체를 내인성 유제류 항체 또는 유제류/사람 키메라 항체로부터 분리하기 위해 단백질 A 및(또는) 사람 Ig L쇄 λ에 대한 항체 (Pharmingen)를 사용할 수 있다. 단백질 A는 사람 Ig H쇄에 대한 친화도가 소 Ig H쇄보다 높고, 두 개의 사람 H쇄를 포함한 Ig 분자를 한개 또는 두개의 유제류 H쇄를 포함한 다른 항체로부터 분리하기 위해 사용될 수 있다. 두개의 사람 Ig λ쇄를 갖는 목적한 Ig 분자를 한개 또는 두개의 유제류 Ig L쇄를 갖는 것들과 분리하기 위해 사람 Ig L쇄 λ에 대한 항체가 사용될 수 있다. 추가적으로, 또는 별법으로, 한개 또는 두개의 H쇄 및(또는) L쇄를 포함하는 Ig 분자를 제거하기 위해 유제류 Ig H쇄 또는 L쇄에 특이적인 하나 이상의 항체가 음성 선별 단계에서 사용될 수 있다.
생성된 항혈청은 그 자체로 항원에 대한 수동적 면역화를 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 항혈청은 진단적, 예방적 또는 정제 용도, 예를 들어, 항원의 정제 달성 용도를 갖는다.
별법으로, 항혈청의 투여 후, 트랜스제닉 소로부터 B 세포가 단리되고, 하이브리도마 제조를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 유제류로부터의 B 세포를 골수종세포와 융합하여 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위해 표준 기술이 사용될 수 있다 (Mocikat, J. Immunol. Methods 225:185-189, 1999; Jonak et al., Hum. Antibodies Hybridomas 3:177-185, 1992; Srikumaran et al., Science 220: 522, 1983). 바람직한 하이브리도마는 트랜스제닉 유제류와 동일한 속 또는 종의 포유동물 유래의 골수종세포와 B 세포의 융합으로 생성된 것들을 포함한다. 다른 바람직한 골수종세포는 Balb/C 마우스 또는 사람으로부터 유래한다. 이 경우, 하이브리도마는 특정 항원에 대한 이종 모노클로날 항체를 제조한다. 예를 들어, 이 기술은 병원균에 대해 특이적인 사람, 고양이, 개 등의 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다 (특정 인공 염색체에 따라). 목적한 성질, 즉, 증가된 결합 친화도, 결합활성을 갖는 하이브리도마의 선별 방법이 공지되어 있다.
별법으로, 트랜스제닉 유제류 유래의 B 세포는 종양유전자, 예를 들어, ras, myc, abl, bcl2 또는 neu를 발현하기 위해서 유전적으로 변형되거나, 또는 엡스타인 바 (Epstein Barr) 바이러스 또는 SV40 바이러스와 같은 형질전환 DNA 또는 RNA 바이러스로 감염될 수 있다 (Kumar et al., Immunol. Lett. 65:153-159, 1999; Knight et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3130-3134, 1988; Shammah et al., J. Immunol. Methods 160:19-25, 1993; Gustafsson and Hinkula, Hum. Antibodies Hybridomas 5:98-104, 1994; Kataoka et al., Differentiation 62:210-211, 1997; Chatelut et al., Scand. J. Immunol. 48:659-666, 1998). 생성된 불멸화된 B 세포가 또한 치료적으로 무제한 양의 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 또한, Ig가 유제류의 유즙 중으로 분비되기 때문에, 유제류 유즙이 또한 이종 항체의 공급원으로 사용될 수 있다.
본 발명이 상기에서 적절하게 기술되었지만, 하기 실시예들이 추가적으로 본 발명의 보다 구체적인 예를 제공한다.
실시예 1: 소 IgM 넉아웃
하기 방법은 면역글로블린 H쇄 (μ) 유전자좌가 상동성 재조합으로 분단된 소 섬유아세포주를 생성하기 위해 사용되었다. IgM 넉아웃을 달성하기 위한 DNA 구조체는 네오마이신 내성 유전자 카피로 치환되는 Mu 유전자좌의 엑손 1-4 (IgM H쇄 유전자에 해당)를 제거하여 생성되었다. 이 구조체를 사용하여, 핵 전달 방법에서 성공적으로 사용된 네오마이신 내성 세포주를 얻었으며, 이들 세포주 유래의 포배를 수용체 소에 이식하였다. 아울러, 표적화된 삽입이 μ유전자좌에서 적절하게 일어났는지 PCR 방법을 사용하여 이들 포배 중의 일부를 시험하여 확인하였다. 획득한 수 개의 세포주로부터 핵 전달 방법으로 생성된 포배는 반접합 IgM-KO 태아가 임신 중임을 나타내었다. 아울러, 단일 IgM H쇄 (μ)넉아웃을 포함하는 수컷 및 암컷 세포주 모두가 생산되었다. 이들 세포주로부터 클로닝된 동물의 교배는 μ의 두 카피가 모두 불활성화된 자손을 생성할 것으로 기대된다. 이들 방법을 하기에서 보다 구체적으로 기술한다.
DNA 구조체
본원에서 기술된 모든 트랜스펙션에서 사용된 DNA를 다음과 같이 생성하였다. 4개의 주요 엑손 (막횡단 도메인 엑손을 배제), CH 1-4는 하류 (CH4) 말단의 XhoI 제한효소 자리 및 상류 (CH1) 말단의 XbaI 자리에 인접하여 연결된다. 트랜스펙션 방법에 사용된 구조체는 XhoI 자리의 하류의 1.5Kb 게놈 서열 및 XbaI 자리의 상류의 3.1Kb 게놈 서열로 구성되었다 (도 3d 및 3e). 이들 서열을 본원에서 기술한 것과 같이 매사츄세츠주 소재의 젓소 무리 중 홀스타인 젖소로부터 단리하였다. 네오마이신 내성 마커를 3.5Kb 단편으로서 원래의 CH1-4를 포함하는 2.4Kb DNA를 치환하면서 이들 두 단편 사이에 삽입하였다. 벡터의 골격은 pBluescriptII SK+ (Stratagene)이었으며, 8.1kb의 삽입체를 정제하고, 소 태아 섬유아세포의 트랜스펙션을 위해 사용하였다. 이 구조체를 도 3a-3c로 제시한다. 기타 상동성 영역 및 다른 항생제 내성을 함유하는 기타 μ넉아웃 구조체가 또한 표준 방법을 사용하여 제조되고, 내인성 μH쇄 유전자를 돌연변이시키기 위해서 사용될 수 있다.
트랜스펙션 / 넉아웃 방법
태아 소의 트랜스펙션을 시판 시약, 슈퍼펙트 트랜스펙션 (Superfect Transfection) 시약 (Qiagen, Valencia, CA, USA), 카탈로그 번호 301305를 사용하여 수행하였다.
소 섬유아세포를 헤마테크(Hematech)사의 캔사스 시설의 질환-치료된 수컷 칼라이스 소로부터 생성하여, 기술된 모든 실험에서 사용하기 위해 헤마테크사의 월세스터 분자생물학 실험실로 보냈다. 임의의 기타 유제류 품종, 속, 또는 종을 공여체 세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포와 같은 체세포)의 공급원으로 사용할 수 있다. 공여체 세포는 기능적, 내인성 Ig의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 돌연변이를 함유하도록 유전적으로 변형된다.
소 태아 섬유아세포의 배양을 위해 사용된 배지는 하기 성분들을 포함한다: 500ml Alpha MEM (Bio-Whittaker #12-169F); 50ml 태아 송아지 혈청 (Hy-Clone #A-1111-D); 2ml 항균제/항진균제 (Gibco/BRL #15245-012); 1.4ml 2-멀캅토에탄올 (Gibco/BRL #21985-023); 5.0ml L-글루타민 (Sigma Chemical #G-3126); 및 0.5ml 티로신 타르트레이트 (Sigma Chemical #T-6134).
트랜스펙션 절차 전 날에, 현미경 시험으로 측정된 40-80%의 목표 전면성장률 (confluency)로 세포를 60mm 조직 배양 플레이트에 접종하였다.
트랜스펙션 당일, 5㎍의 DNA를 혈청 및 항생제가 없는 총 부피 150㎕의 배지 중에 넣고, 20㎕의 슈퍼펙트 트랜스펙션 시약과 혼합하고, DNA-슈퍼펙트 복합체 형성을 위해 실온에서 5-10분 동안 방치하였다. 복합체 형성이 일어나는 동안, 트랜스펙션되어야 하는 소 섬유아세포를 함유한 60mm의 조직 배양 플레이트로부터 배지를 제거하고, 세포를 4ml의 인산 완충용액 염수로 세척하였다. 1㎖의 성장 배지를 170㎕의 DNA/슈퍼펙트 혼합물에 첨가하고, 즉시 60mm 플레이트 중의 세포에 전달하였다. 세포를 38.5℃, 50% 이산화탄소에서 2.5 시간 동안 배양하였다. DNA/슈페퍽트와 함께 세포를 배양한 후, 배지를 흡입하여 제거하고, 세포를 4ml PBS로 4회 세척하였다. 5ml의 완전 배지를 첨가하고, 38.5℃, 5% CO2에서 배양물을 밤새 배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 현미경 관찰로 측정하여 세포가 플레이트로부터 떨어져 나올 때까지 1ml의 PBS 중 0.3% 트립신으로 37℃에서 배양하였다. 각 60mm의 배양 플레이트로부터 세포를 24웰 조직 배양 플레이트의 24개 웰에 나누어 넣었다 (41.7㎕/웰). 1㎖의 조직 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 38.5℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하도록 하였다.
모든 트랜스펙션 절차 중, 네오마이신 내성 유전자를 함유하지 않은 것으로 예상되며, 또한, G418을 조직 배양 배지 중에 첨가하고 48시간 후에 모든 세포가 사망할 것으로 예상되는, DNA를 함유하지 않은 슈퍼펙트/PBS 혼합물을 사용하여 허위 트랜스펙션을 수행하였다. 이들은 DNA를 받아들인 세포의 양성 선별을 위한 음성 대조구로 사용되었다.
24시간 배양한 후, 400㎍의 G418을 함유한 1㎖의 조직 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하여 최종 G418 농도를 200㎍/㎖로 만들었다. 7일간의 G418 선별을 위해 세포를 다시 배양기 중으로 돌려보냈다. 이 기간 동안 트랜스펙션된 것 및 허위 트랜스펙션된 플레이트 모두에 대해 세포 사망을 모니터하였고, 7일 후, 허위 트랜스펙션된 대부분의 웰에서 살아 있는 세포가 소수이거나 없었던 반면, DNA를 수용한 세포를 함유한 플레이트는 우수한 세포 성장을 보였다.
7일간의 선별 기간 후, 전면성장률이 90-100%인 웰의 세포를 0.2ml의 PBS 중 0.3%의 트립신을 사용하여 떼어내고, 팽창시키기 위해 35mm 조직 배양 플레이트로 옮기고, 합류도가 50% 이상이 될 때까지 배양하고, 이 시점에서 세포를 0.6ml의 PBS 중 0.3%의 트립신으로 트립신화시켰다. 각각의 35mm의 조직 배양 플레이트로부터, 0.6ml의 세포 현탁액 중 0.3ml을 추가 팽창을 위해 12.5㎠의 조직 배양 플라스크로 옮겼다. 나머지 0.3ml을 35mm의 배양플레이트 중에 재접종하고, 이들이 약 50%의 최소 합류도를 달성할 때까지 배양하였고, 이 시점에서 PCR 분석을 위한 DNA 추출을 위해 이들 플레이트로부터 얻은 세포를 처리하였다. 각각의 라인의 플라스크를 이들이 분석 받을 때까지 배양기 중에 유지하였으며, 이들이 목적한 DNA 삽입체를 함유하지 않았으면, 종결하거나 또는 추가 핵 전달 및 동결보존을 위해 유지하였다.
표적화된 삽입의 스크리닝
상기에서 기술된 것과 같이, DNA 구조체를 포함한 트랜스펙션체의 스크리닝을 위한 DNA 공급원은 분석될 일세대의 세포를 함유한 35mm의 조직 배양 플레이트였다. 상기와 같이 DNA를 제조하고, 이를 레어드 (Laird) 등에 의해 발표된 방법 [Laird et al., "Simplified mammalian DNA isolation procedure." Nucleic Acids Research, 19:4293]으로부터 변경하였다. 세포 용균 완충용액을 하기 성분으로 제조하였다: 100mM Tris-HCl 완충용액, pH 8.5; 5mM EDTA, pH 8.0; 0.2% 소듐 도데실 술페이트; 200mM NaCl; 및 100㎍/ml 프로티나아제 K.
각각의 35mm 조직 배양 플레이트로부터 배지를 흡입시켜내고, 0.6ml의 상기 완충용액으로 교환하였다. 배양플레이트를 3시간 동안 배양기 중으로 되돌려보내고, 이 시간 동안, 세포 용균 및 단백질 분해가 일어나도록 하였다. 이 배양 후, 용균물을 1.5ml의 미세원심분리 튜브 중으로 옮기고, 0.6ml의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 반전시켜서 튜브를 완전히 교반하고, 3시간 동안 실온에서 정치하도록 하고, 이후 미세원심분리기에서 13,000rpm으로 회전 침전시켰다. 각각의 튜브로부터의 상징액을 버리고, 펠릿을 70%의 에탄올로 한차례 세척하였다. 70%의 에탄올을 흡입시켜내고, DNA 펠릿이 공기 건조되도록 하였다. 건조되고 나서, 각각의 펠릿을 30-50㎕의 Tris (10mM)-EDTA (1mM) 완충용액, pH 7.4 중에 재현탁시키고, 수화되도록 하고, 밤새 가용화시켰다. 각각의 DNA 용액 5-7㎕을 각각의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법에서 사용하였다.
트랜스펙션체를 분석하기 위해서 별개의 두 PCR 방법을 사용하였다. 첫번째 방법은 트랜스펙션에 사용된 DNA 내에 위치한 자리들에 어닐링하는 것으로 예상되는 두 개의 프라이머를 사용하였다. 첫번째 프라이머 서열은 DNA 구조체의 네오마이신 내성 카세트에 상동성이며, 두번째는 약 0.5Kb 떨어진 곳에 위치하여, 0.5Kb의 짧은 PCR 생성물을 생성한다. 특히, 프라이머 Neo1 (5'-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3', SEQ ID NO:42) 및 IN2521 (5'-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3', SEQ ID NO:43)을 사용하였다. PCR 반응을 위해 Qiagen PCR 키트를 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 각각의 프라이머 1pmol, 5㎕의 10X 반응 완충용액, 10㎕의 Q 용액, 5㎕의 DNA, 및 1㎕의 dNTP 용액을 함유하였다. 반응 혼합물을 H20를 사용하여 총 부피 50㎕로 만들었다. 94℃에서 2분간의 최초 변성을 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 이후, 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 및 72℃에서 2분간 인큐베이션하여 30 사이클의 변성, 어닐링 및 증폭을 수행하였다. 이후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 인큐베이션하고, 혼합물을 PCR 기계로부터 꺼낼때까지 4℃에서 인큐베이션하였다. 별법으로, G418 선별에서 생존하는 세포가 DNA 구조체의 삽입결과라는 것을 입증하기 위해서, 세포의 게놈 중으로 삽입해 들어가는 넉아웃 구조체의 영역에 상동성인 임의의 기타 프라이머를 적절한 반응 조건 하의 표준 PCR 반응에서 사용할 수 있다.
단지 적은 백분율의 트랜스펙션체가 목적한 위치 (μ유전자좌)에서 DNA 삽입을 함유할 것으로 예상되기 때문에, 도입된 DNA가 트랜스펙션체의 게놈 내에 존재한다는 것뿐만 아니라 목적한 위치에 삽입된 것임을 측정하기 위해 다른 쌍의 프라이머를 사용하였다. 적절한 삽입을 탐지하기 위해 사용된 PCR 방법은 DNA 구조체의 네오마이신 내성 카세트 내에 위치한 한 개의 프라이머 및 DNA가 IgM 유전자좌의 적절한 위치에 삽입했을 경우에 한해 1.8Kb 떨어져 어닐링할 것으로 예상되는 (상동성 영역이 트랜스펙션에 사용된 DNA 구조체 내에 포함된 영역 바깥에 있기 때문) 한 개의 프라이머를 사용하여 수행되었다. 프라이머는 하기 서열들이 목적한 위치에 삽입되었다면 DNA 구조체 내에 나타난 서열들에 바로 인접한 DNA 서열에 어닐링하도록 고안되었다 (유전자좌의 DNA 서열, 사전에 둘다 DNA 구조체 내에 존재하고, 게놈 내의 이들 서열에 인접한 것으로 측정되었음). 특히, 프라이머 NeoI 및 OUT3570 (5'-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAA GTC TGT C-3', SEQ ID NO:44)를 이 분석을 위해 사용하였다. 표적 구조체가 세포 중으로 삽입되었는지 확인하기 위해서, 첫번째 PCR 반응에 대해 상기에서 기술한 Qiagen PCR 키트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 별법으로, 이 PCR 분석은 세포의 게놈 중으로 삽입해 들어가는 넉아웃 구조체의 영역에 상동성인 임의의 기타 프라이머 및 삽입 부위의 상류 또는 하류의 세포의 게놈 내의 영역에 상동성인 임의의 기타 프라이머를 사용하여 임의의 적절한 반응 조건을 사용하여 수행될 수 있다.
이들 방법을 사용하여 적절한 유전자좌 중으로 DNA 구조체의 표적화된 삽입에 대해 135개의 독립적인 35mm 플레이트를 스크리닝하였다. 이들 중에서, 8개의 플레이트에서의 DNA가 적절한 표적화된 DNA 구조체를 함유하는 것으로 측정되었으며, 이들 중에서 3개를 핵 전달 방법에서 사용하기 위해 선택하였다. 이들 세포주를 "8-1C," "5-3C" 및 "10-1C"로 표시하였다. 수용체 소 중으로의 전달에 사용되지 않은 나머지 포배를 사용하여 추가 PCR 분석할 DNA를 추출하였다. 이 분석은 트랜스펙트된 세포주의 최초 스크리닝에서도 사용된 프라이머를 사용한 가지분리 (nested) PCR 방법을 사용하여 달성되었다.
상기에서 언급한 바와 같이, μ유전자좌의 엑손 1-4를 제거하기 위해 고안된 유전자 표적화 구조체를 사용하여 세 개의 세포주를 생성하였다. PCR에 기초한 시험을 사용하여 표적화된 삽입에 대해 모두 양성인 것으로 시험된 이들 세포주를 핵 전달을 위해 사용하였다. 적절히 표적화된 구조체를 시험하는 PCR법으로 이들 핵 전달로부터 생성된 나머지 포배를 스크리닝하였다. 하기 빈도의 양성 포배를 얻었다:
세포주 8-1C: 6/8
세포주 10-1C: 2/16
세포주 5-3C: 0/16
임신 40일째에 초음파로 총 11마리의 임신이 측정되었지만, 60일째에 7마리의 태아가 사망하였다. 신규 태아 섬유아세포를 재생하도록 나머지 4마리의 태아를 처리하고, PCR 분석을 위한 작은 조직 샘플을 만들기 위해 나머지 기관을 사용하였다. 분석 결과는 다음과 같다:
세포주 8-1C: 두 마리의 태아, PCR 결과 한 태아가 표적화된 삽입에
대해 양성임
세포주 10-1C: 한 마리의 태아, PCR 결과 표적화된 삽입에 대해 양성임.
세포주 5-3C: 한 마리의 태아, PCR 결과 표적화된 삽입에 대해 음성임.
놀랍게도, 표적화된 삽입에 대해 양성인 것으로 시험된 10-1C 포배의 빈도가 불과 2/16이었음에도, 이 세포주로부터 얻은 한 마리의 60일된 태아는 PCR 결과 양성이었다. 또한, 8-1C로부터 양성인 태아를 획득하였다. 구조체가 한쪽 말단에서 정확하게 표적화되었을 뿐 아니라 (이는 본래 구조체에 존재하는 짧은 상동성 영역의 PCR로 측정됨), 다른쪽 말단에서도 그렇다는 것을 확인하기 위해 모든 조직 샘플의 DNA의 서던 블롯 분석이 시행된다. 이제까지의 결과에 기초하여 독립적인 두 번의 삽입 사건에서 두 개의 H쇄 넉아웃 태아가 생산된 것으로 생각된다. 또한, 이들이 상이한 두 개의 세포주로부터 유래하였기 때문에, 하나 이상은 양쪽 말단에서 정확하게 삽입된 구조체를 가질 것이다. 서던 블롯 분석으로 표적화 구조체의 양쪽 말단의 적절한 표적화를 확인하면, 출산될 추가의 태아를 생성하기 위해 추가 핵 전달을 수행할 것이다.
핵 전달 및 배 전달
K/O 세포주 (8-1-C (18))을 사용하여 핵 전달을 수행하였으며, 8개의 배가 생성되었다. 이 배치로부터 총 6개의 배를 트랜스 오바 제넥티스 소재 ("TOG"; Iowa) 세 마리의 무병한 수용체로 전달하였다.
무병한 암컷 섬유아세포주를 얻기 위해서 동결된 배를 열 마리의 무병한 수용체로 전달하였다. 35-40일째에 임신을 확인한 후, 태아 회수를 스케줄하였다.
임신 진단 및 태아 회수
넉아웃된 태아 세포로부터 유래한 클로닝된 배가 전달된 18마리의 수용체의 임신 상태를 초음파검사로 조사하였다. 결과를 하기에 요약한다.
μH쇄 넉아웃 공여체 세포를 사용한 임신 40일째
클론 ID 전달받은 수용체의 수 임신 40일째 (%)
8-1-0C 5 4(80)
10-1-C 6 4(67)
5-3-C 5 3(60)
총합 16 11(69)
임신 진단
넉아웃 세포 (8-1C)로부터 클로닝된 배가 전달된 세 마리 수용체의 임신 상태를 조사하였다; 한 마리는 오픈되었으며, 나머지 두 마리는 한 달 후 재확인을 요하였다.
태아 회수 및 세포주의 확립
40일째에 K/O 배를 가진 11마리의 임신을 얻었다. 4마리의 살아있는 태아를 60일째에 이들로부터 분리하였다. 이들 4마리 모두에서 세포주를 확립하고, 장래 사용하기 위해 동결보존하였다. 또한, 태아로부터 동결 조직 샘플을 수집하고 모아서, PCR/서던 블롯 분석을 위해 헤마테크 분자생물학 실험실로 보냈다.
4개 세포주 모두 수컷이었다. 암컷 세포주를 얻기 위해서, 세포주를 확립하고, 무병의 수용체를 사용하여 트랜스 오바 제넥티스에서 확립된 임신동물의 55일째 수집된 태아 (6마리)로부터 유래한 K/O 세포의 추가적인 확립을 위해 동결건조하였다. 이 암컷 세포주는 수컷 세포주로부터 생성된 동물과 교배될 수 있는 클로닝된 동물을 생산하기 위해 사용될 수 있고, 자손들 중 이중 μ넉아웃을 함유하는 것을 스크리닝한다.
실시예 2: HAC 의 도입
면역글로블린 H쇄 (μ) 및 λL쇄가 단독으로 또는 조합하여 소 숙주에 의해 생산될 수 있음을 입증하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 아울러, 이들 실험은 면역글로블린쇄가 재배열되었으며, 폴리클로날 혈청이 얻어졌음을 입증하였다. 이들 방법에서, 면역글로블린-발현 유전자는 사람 인공 염색체를 사용하여 소 섬유아세포 중으로 도입되었다. 이후, 핵 전달을 위해 섬유아세포를 사용하고, 태아를 획득하고, 항체 생산을 분석하였다. 이들 방법 및 결과를 하기에서 보다 구체적으로 기술한다.
HAC 구조체
상기에서 기술된 염색체-클로닝 시스템을 사용하여 사람 인공 염색체 (HAC)을 제조하였다 (Kuriowa et al., Nature Biotech. 18:1086-1090, 2000). 요약해서, ΔHAC의 제조를 위해, HCF2 유전자좌에 삽입된 loxP 서열을 함유한 상기에서 기술된 사람 염색체 22 단편 (hChr22)을 텔로머-지시된 염색체 절단에 의해 AP000344 유전자좌에서 절단하였다 (Kuroiwa et al., Nucleic Acid Res., 26:3447-3448, 1998). 다음에, AP000344 유전자좌에서 절단된 상기 hChr22 단편(hCF22)를 함유하는 DT40 세포 클론을 안정하고 생식세포-전달이 가능한 사람 미니염색체 SC20 벡터를 함유하는 DT40 세포 클론 ("R 클론"으로 표시함)과 융합시켜 세포 하이브리드를 형성하였다. SC20 벡터는 loxP 서열을 S20 단편의 RNR2 유전자좌에 삽입하여 생성되었다. SC20 단편은 사람 Ig H쇄 유전자의 전체 영역을 포함하는 사람 염색체 14으로부터 유래한 자연적으로 생성되는 단편이다 (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722, 2000). 생성된 DT40 세포 하이브리드는 두 개의 hChr 단편을 함유하였다. hCF22와 SC20 벡터 사이에 Cre/loxP-매개된 염색체 전좌를 유도하기 위해서 DT40 하이브리드를 Cre 재배열효소-발현 벡터로 트랜스펙션하였다. HCF2 및 AP000344 유전자좌로 한정된 2.5Mbp의 hChr22 영역의 SC20 벡터 내의 loxP-클로닝 자리로의 클로닝을 확인하기 위해서 안정한 트랜스펙션체를 가지분리 PCR을 사용하여 분석하였다. 이후, 코딩된 녹색 형광 단백질의 형광에 기초하여 ΔHAC를 함유한 것으로 예상되는 PCR-양성 세포를 FACS 분류로 단리하였다. 또한, 2.5Mbp의 hChr22 삽입체를 함유한 ΔHAC의 존재를 확인하기 위해서, 분류된 세포의 형광 제자리 혼성화 (FISH) 분석을 사용하였다.
유사하게, 이 염색체-클로닝 시스템을 사용하여 ΔΔHAC를 제조하였다. AP000344 유전자좌에서 hChr22 단편을 절단하고, 이후, DT40 세포 내의 상동성 재조합에 의해 loxP 서열을 AP000553 유전자좌로 삽입하였다. 이후, 생성된 세포를 SC20 미니염색체 벡터를 함유한 R 클론과 융합시켰다. Cre/loxP-매개된 염색체 전좌를 일으키기 위해 새포 하이브리드를 Cre-발현 벡터로 트랜스펙션하였다. AP000553 및 AP000344 유전자좌로 한정된 1.5Mbp의 hChr22 삽입체를 함유한 ΔΔHAC의 생성을 PCR 및 FISH 분석으로 확인하였다.
생체 내에서 ΔHAC 및 ΔΔHAC의 기능성을 이들 HAC를 함유한 키메라 마우스의 생성으로 평가하였다. 이들 HAC를 개별적으로 마우스 배아간세포 (ES cell) 중으로 도입하고, 이후 이것을 표준 방법을 사용하여 키메라 마우스 생산에 사용하였다 (일본 특허 제2001-142371호; 출원일 2000. 5. 11). 생성된 마우스는 높은 정도의 키메라즘을 가지며 (털 색깔의 85-100%), 이들 HAC을 함유한 ES 세포의 높은 수준의 분화다능성 및 생체내에서의 이들 HAC의 유사분열 안정성을 나타낸다. 아울러, ΔHAC는 ΔHAC 키메라 마우스의 생식세포를 통해서 다음세대의 자손에 전달되고, 이 HAC의 감수분열 안정성을 나타낸다.
이들 HAC을 함유한 닭 DT40 세포는 국제 특허 생물체 기탁기관 (일본 305-8566, 이바라키-켄 히가시 1-쵸메 츄카부-시, 1-1, 츄카바 센트랄 6 소재, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)에 부다페스트 조약에 따라 2001년 5월 9일자로 기탁되었다. 기탁번호는 다음과 같다: ΔHAC (FERM BP-7582), ΔΔHAC (FERM BP-7581), 및 SC20 단편 (FERM BP-7583). 또한, 이들 HAC를 함유한 닭 DT40 세포가 대만 FIRDI (Food Industry Research and Development Institute)에 기탁되었다. 기탁번호 및 번호는 다음과 같다: ΔHAC (CCRC 960144; November 9, 2001), ΔΔHAC (CCRC 960145; November 9,2001), 및 SC20 단편 (세포주는 SC20(D)란 명칭으로 기탁되었다; CCRC 960099; August 18, 1999).
ΔHAC 중의 2.5 Mbp의 hChr22 삽입체는 Genebank 접수번호로 열거된 하기 BAC 인접체(contig)들로 구성된다: AC002470, AC002472, AP000550, AP000551, AP000552, AP000556, AP000557, AP000558, AP000553, AP000554, AP000555, D86995, D87019, D87012, D88268, D86993, D87004, D87022, D88271, D88269, D87000, D86996, D86989, D88270, D87003, D87018, D87016, D86999, D87010, D87009, D87011, D87013, D87014, D86991, D87002, D87006, D86994, D87007, D87015, D86998, D87021, D87024, D87020, D87023, D87017, AP000360, AP00361, AP000362, AC000029, AC000102, U07000, AP000343, 및 AP000344. ΔΔHAC 중의 1.5 Mbp의 hChr22 삽입체는 하기 BAC 인접체들로 구성된다: AP000553, AP000554, AP000555, D86995, D87019, D87012, D88268, D86993, D87004, D87022, D88271, D88269, D87000, D86996, D86989, D88270, D87003, D87018, D87016, D86999, D87010, D87009, D87011, D87013, D87014, D86991, D87002, D87006, D86994, D87007, D87015, D86998, D87021, D87024, D87020, D87023, D87017, AP000360, AP00361, AP000362, AC000029, AC000102, U07000, AP000343, 및 AP000344 (Dunham et al, Nature 402: 489-499,1999).
소 태아 섬유아세포의 생성
소 태아 섬유아세포를 생성하기 위해, 트랜스 오바 (아이오와주)에서 사육되었으며, 수컷 및 암컷 양친의 가계도가 연속 3대 동안 기록된, 질환처리된 홀스타인 또는 저지 소로부터 45 내지 60일된 태아를 수집하였다. 수집된 태아를 젖은 얼음 위에 실어 일차 태아 섬유아세포의 생성을 위해 헤마테크 월세스터 분자생물학과에 보냈다. 도착 후, 태아(들)을 조직 배양 후드 내의 비조직 배양 등급의 100mm 플라스틱 페트리 접시 중으로 옮겼다. 멸균된 핀셋 및 가위를 사용하여, 외배막 및 탯줄을 태아로부터 제거하였다. 태아를 새 페트리 접시로 옮긴 후, 머리, 사지 및 내부 장기들을 제거하였다. 내장을 제거한 태아를 하기 성분들로 구성된 약 10ml의 태아 세척액을 함유한 세번째 페트리접시에 옮겼다: Ca2 + 및 Mg2 +를 함유한 125ml의 1X 둘베코스-PBS (D-PBS) (Gibco-BRL, cat#. 14040); 0.5ml의 틸로신 타르트레이트 (8mg/ml, Sigma, cat#. T-3397); 2ml 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma, cat#.P-3539); 및 1ml 펑지존 (Gibco-BRL, cat#.15295-017) (혼합되고, 0.2㎛의 나일론 필터 유닛 [Nalgene, cat#.150-0020]을 통해 여과됨).
혈액의 흔적을 제거하기 위해서 태아를 태아 세척 용액으로 추가 3회 세척하고, 50ml의 원뿔형 조직 배양 튜브 중으로 옮기고, 멸균한 메스를 사용해서 작은 조각으로 미세하게 잘게 썰었다. 조직 조각을 Ca2 + 및 Mg2 +를 포함하지 않은 1X D-PBS (Gibco-BRL, cat#. 14190)으로 한 번 세척하였다. 조직 조각이 튜브 바닥에 가라앉도록 한 후, 상징액을 제거하고, 약 30ml의 세포 분리 완충용액 (Gibco-BRL, cat#.13151-014)로 갈아주었다. 튜브를 수회 반전시켜 혼합이 일어도록 하고, 38.5℃/5% CO2에서 20분 동안 조직 배양 배양기 중에서 배양하였다. 조직이 튜브 바닥으로 갈아앉도록 한 후, 현탁액을 제거하고, 동량의 신선한 세포 분리 완충용액으로 갈아주었다. 조직 및 세포 분리완충용액 혼합물을 24mm의 둥근 말단의 회전 막대를 포함한 멸균된 75ml의 유리 트립신화 플라스크 (Wheaton Science Products, cat#.355393)로 옮겼다. 플라스크를 38.5℃/5% CO2 조직 배양 배양기 중으로 옮기고 , 자석 교반 플레이트 위에 놓고, 약 20분 동안 효과적인 혼합이 일어나도록 충분한 속력으로 교반하였다. 플라스크를 조직 배양 후드 중으로 옮겼다. 조직 조각이 침전되도록 한 후, 상징액을 제거하고, 분리된 세포를 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 세포 펠릿을 440ml의 αMEM (BioWhittaker, cat#. 12-16F); 50ml의 방사능 조사된 소 혈청; 5ml의 GLUTAMAX-I 보충제 (Gibco-BRL, cat#.25050-061); 5ml의 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma, cat#.P-3539); 1.4ml의 2-멀캅토에탄올 (Gibco-BRL, cat#.21985-023) (태아 소 혈청을 제외한 모든 성분을 0.2㎛ 필터 유닛 [Nalgene, cat#.151-4020]을 통해 여과시켰음)으로 구성된 소량의 완전 섬유아세포 배양 배지 중에 재현탁시키고, 얼음 위에 저장하였다. 각각의 단계에서 추가 30ml의 세포 분리 용액을 사용하여 분리 과정을 추가로 3회 반복하였다. 세포를 수집하고, 완전 섬유아세포 배지 중에서 세척하고, 23 및 26 게이지 바늘을 통해 순차적으로 통과시키고, 마직막으로 70㎛ 세포 염색기 (B-D Falcon, cat#.352350)를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 트립판 블루 (0.4% 용액, Sigma, cat#. T-8154) 존재 하의 헤마사이토미터 중에서 계수하여 세포 밀도 및 생활도를 측정하였다.
일차 섬유아세포를 완전 섬유아세포 배지 중에서 38.5℃/5% CO2에서 T75cm2 조직 배양 플라스크 당 1×106 생세포의 밀도로 팽창시켰다. 배양 3일 후 또는 세포가 완전성장에 도달하기 전에, 섬유아세포를 1X D-PBS (Ca2 +또는 Mg2 +를 포함하지 않음)로 플라스크를 1회 세척하고, 실온에서 10ml의 세포 분리 완충용액을 사용하여 5 내지 10분간 배양하였다. 도립현미경을 사용하여 세포의 탈착을 시각적으로 모니터하였다. 이 단계에서, 위아래로 파잇페팅을 하여 세포 덩어리가 분리되도록 주의를 기울여야 한다. 세척 및 계수 후, 분리된 섬유아세포는 유전자 표적화 실험에 사용될 준비가 되었다. 또한, 이들 세포를 장기간 저장을 위해 저온저장하였다.
소 태아 섬유아세포 중으로 HAC 의 도입
Δ HAC 및 ΔΔ HAC을 미세세포-매개된 염색체 전달을 사용하여 DT40 세포 하이브리드로부터 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 중으로 전달하였다 (Kuroiwa et al., Nature Biotech. 18:1086-1090, 2000). Δ HAC을 함유한 CHO 클론 ("D15 클론")을 10% FBS (Gibco), 1mg/ml의 G418 및 0.2mg/ml의 하이그로마이신 B가 보충된 F12 (Gibco) 배지 중에서 37℃ 및 5% CO2로 배양하였다. D15클론을 T25 플라스크 중에서 12회 증식시켰다. 전면성장률이 80-90%에 도달하였을 때, 콜세미드 (Sigma)을 최종 농도 0.1 ㎍/ml로 배지 중에 첨가하였다. 3일 후, 배지를 10마이크로그램/ml의 사이토칼라신 B (Sigma)가 보충된 DMEM (Gibco)로 교환하였다. 미세세포를 수집하기 위해 플라스크를 8,000rpm에서 60분 동안 원심분리하였다. 미세세포를 8, 5 및 3-㎛ 필터 (Costar)를 통해 정제한 후, DMEM 배지 중에 재현탁시켰다. 소 섬유아세포와의 융합을 위해 사용된 미세세포를 하기에서 기술한다.
소 태아 섬유아세포를 10% FBS (Gibco)과 보충된 α-MEM (Gibco) 배지 중에서 37℃ 및 5% CO2로 배양하였다. 섬유아세포를 T175 플라스크 중에서 증식시켰다. 전면성장률이 70-80%에 도달하였을 때, 세포를 0.05% 트립신을 사용하여 플라스크로부터 떼어내었다. 섬유아세포를 DMEM 배지로 2회 세척한 후, 미세세포 현탁액 위에 중층하였다. 미세세포-섬유아세포 현탁액을 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PEG 1500 (Roche)를 제조자 프로토콜에 따라 펠릿에 첨가하여 미세세포와 소 섬유아세포의 융합이 가능하도록 하였다. 융합 후, 융합된 세포를 6개의 24-웰 플레이트에 플레이팅하고, 10% FBS가 보충된 α-MEM 배지 중에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 0.7mg/ml의 G418을 함유한 배지로 교환하였다. 약 2주 동안 G418 항생제 존재 한에서 성장시킨 후, G418 내성의 융합된 세포를 선별하였다. 이들 G418-내성 클론을 하기에서 기술한 것과 같이 핵 전달을 위해 사용하였다.
유사하게, CHO 클론 ΔΔ C13의 ΔΔ HAC를 MMCT를 사용하여 소 태아 섬유아세포 중으로 전달시켰다. 이들 선별된 G418-클론을 핵 전달을 위해 사용하였다.
핵 전달, 활성화 및 배 배양
본질적으로 앞서 기술된 것과 같이 핵 전달 방법을 수행하였다 (Cibelli et al., Science 1998: 280:1256-1258). 시험관내에서 성숙된 나자를 성숙한지 약 18-20시간 후 (hpm) 핵을 제거하고, 염색체 제거를 UV 하에서 비스벤즈미드 (Hoechst 33342, Sigma) 라벨링으로 확인하였다. 이들 세포질체 공여체 세포 쌍을 2.4kV/cm에서 20μsec의 단일 전기 펄스 (Electrocell manipulator 200, Genetronics, San Diego, CA)를 사용하여 융합시켰다. 3-4시간 후, 전체 전달된 쌍의 무작위 하부군 25%를 떼어내고, 전달된 핵의 비스벤즈미드 라벨링으로 융합을 확인하였다. 30 hpm 재구성된 난자 및 대조구를 칼슘 아이오노포 (5μM)를 사용하여 4분 동안 (Cal Biochem, San Diego, CA) 및 ACM 배양 배지 중의 10㎍ 사이클로헥시미드 및 2.5㎍ 사이토칼라신 D (Sigma)를 사용하여 6시간 동안 처리하여 활성화시켰다 (Lin et al., Mol. Repro. Dev. 1998:49:298-307; Presicce et al., Mol. Reprod. Dev. 1994:38:380-385). 활성화 알을 HEPES 용액으로 완충된 햄스터 배 배양 배지 (HECM-Hepes)로 5회 세척한 후, 방사능조사된 마우스 태아 섬유아세포 및 0.2ml의 배 시험된 미네랄오일 (Sigma)로 덮힌 0.5ml의 배 배양 배지를 포함한 4-웰 조직 배양 플레이트 중의 배양물에 넣었다. 각각의 웰 중에 25-50개의 배를 넣고, 공기 대기에서 38.5℃, 5% CO2 중에서 배양하였다. 4일째에 10% FCS를 배양 배지 중에 첨가하였다.
배 전달
7일째 및 8일째의 핵 전달 포배를 각각 6일째 및 7일째에 동조화된 수용체 어린 암소 중으로 전달하였다. 수용체 동물은 루탈리제 (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI)의 단일 주사 사용하여 동조화시킨 후, 발정기를 탐지하였다. 배 전달 30일 및 60일 후, 초음파건사로 수용체의 임신 유무를 조사하였으며, 이후 30일마다 직장 촉진으로 270일까지 검사하였다. 이들 소 태아 중 HAC의 보유를 하기 표 3에 요약하고, 하기 섹션에서 보다 자세히 기술한다.
소 태아에서 HAC 보유의 요약
HAC 세포 클론 수용체 /태아 수 NT 일 회수일 태아 연령 HAC보유
H L
ΔΔ 4-12 5580 2/14 4/13 58 + +
ΔΔ 2-14 5848 2/15 4/13 57 - -
ΔΔ 4-12 5868A 2/14 6/13 119 + +
ΔΔ 4-12 5868B 2/14 6/13 119 + +
ΔΔ 4-12 5542A 2/14 5/16 91 + +
ΔΔ 4-12 5542B 2/14 5/16 91 nd nd
ΔΔ 4-12 5174 2/14 5/16 91 (비정상) nd nd
ΔΔ 4-12 6097 2/14 유지 160 (7/24) + +
Δ 4-8 6032 1/31 3/30 58 + +
Δ 2-13 5983 2/2 3/30 56 + +
Δ 4-2 5968 2/2 3/30 56 + +
Δ 2-22 6045 2/2 3/30 56 + +
Δ 4-8 5846 1/31 4/20 79 + +
Δ 2-13 6053 2/2 4/27 84 + +
Δ 4-2 5996 2/1 4/20 77 + +
사람 염색체 #14의 단편을 함유한 HAC 의 도입
SC20 단편, 사람 염색체 #14 단편 ("hchr.14fg" Ig H쇄 유전자를 함유)를 상기에서 기술한 것과 실질적으로 동일한 방식으로 태아 섬유아세포 중으로 도입하였다. 또한, 임의의 기타 표준 염색체 전달 방법이 사람 Ig 유전자를 함유한 이 HAC 또는 다른 HAC를 공여체 세포 중으로 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 생성된 공여체 세포는 HAC를 함유한 트랜스제닉 유제류를 생성하기 위해 상기에서 기술된 것들과 같은 표준 핵 전달 방법에서 사용될 수 있다.
hchr.14fg를 함유한 세포로부터 클로닝된 배가 전달된 28개의 수용체의 임신 상태를 초음파검사로 조사하였다. 이 결과를 하기 표 4에 요약한다.
hchr .14 fg 를 함유한 공여체 세포를 사용한 임신 40일째
클론 ID 전달된 수용체의 수 임신 40일째 (%)
2-1 08 03 (38)
4-2 10 00 (00)
4-1 05 00 (00)
4-1 03 01 (33)
2-1 02 01 (50)
총합 28 05 (18)
임신율이 예상했던 것보다 낮았다. 이는 배 전달 중 비정상적으로 더운 날씨에 기인한 것으로 생각된다.
도 27에 예시한 것과 같이, 배를 함유한 HAC의 임신율은 비-트랜스제닉 클로닝된 임신에 상당한 것으로 보인다. ΔΔHAC 송아지를 임신한 수용체는 최근 살아있는 건강한 송아지를 출산하였다. 다른 것들은 이후 수개월에 걸쳐 출산될 것이다.
Δ HAC 소 태아 중의 사람 H쇄 유전자좌의 재배열 및 발현의 증명
클로닝된 ΔHAC-트랜스제닉 소 태아를 다양한 배태일에서 떼어내고, 사람 유전자좌의 존재, 재배열 및 발현을 분석하였다. 이들 태아의 비장 및 비림프계 조직 (간 및 뇌)으로부터 RT-PCR로 얻은 게놈 DNA 및 cDNA의 분석은 ΔHAC의 존재, 재배열 및 발현을 나타내었다.
Δ HAC 태아 중 사람 H쇄 및(또는) L쇄의 존재
사람 H쇄 및 L쇄가 ΔHAC 태아 중에 보유되었는지 측정하기 위해, 간 DNA를 ΔHAC 태아로부터 분리하고, 사람 H쇄 및 L쇄를 코딩하는 게놈 DNA의 존재를 PCR로 분석하였다.
게놈 H쇄 DNA의 탐지를 위해, 하기 프라이머를 사용하였다: VH3-F 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3' (SEQ ID NO:1) 및 VH3-R 5'-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3' (SEQ ID NO:2). λL쇄 DNA의 탐지를 위해 사용된 프라이머는 IgL-F 5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3' (SEQ ID NO:3) 및 IgL-R 5'GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3' (SEQ ID NO:4)였다. PCR 반응 혼합물은 18.9㎕의 물, 3㎕의 10X Ex Tau 완충용액, 4.8㎕의 dNTP 혼합물, 10pmol의 정방향 프라이머 및 10pmol의 역방향 프라이머, 1㎕의 게놈 DNA 및 0.3㎕의 Ex Taq을 포함한다. 반응 혼합물을 하기 조건 하에서 인큐베이션하여 38 사이클의 PCR을 수행하였다: 85℃에서 3분, 94℃에서 1분, 98℃에서 10초, 56℃에서 30초, 및 72℃에서 30초.
도 5에 나타낸 것과 같이, 태아 #5968, 6032 및 6045 각각은 사람 H쇄 (μ) 및 L쇄 (λ) 유전자좌를 포함하였다. 태아 #5996은 사람 H쇄 유전자좌만을 포함하였다. 태아 #5983은 사람 H쇄를 포함하지 않고, 사람 L쇄를 포함하지 않을 수 있다. 태아 #5846은 사람 서열 중 어느 것도 포함하지 않았다. 따라서, 태아 #5983 및 5846은 HAC를 포함하지 않을 수 있다. 이들 결과는 ΔHAC가 소 안에서 임신 58일째까지 안정하게 유지될 수 있다는 것을 암시하였다.
Δ HAC 태아 #5996 중 사람 Cμ엑손의 존재
ΔHAC가 존재하고, 태아 #5996의 사람 μ유전자롸의 불변 영역을 코딩하는 전사체를 발현하는지 측정하기 위해. Cμ3 및 Cμ4를 포함한 mRNA 전사체에 특이적인 프라이머를 사용하였다.
사람 μH쇄의 게놈 불변 영역의 RT-PCR 분석의 경우, 프라이머 "CH3-F1" (5'accacctatgacagcgtgac-3', SEQ ID NO:5) 및 "CH4-R2" (5'-gtggcagcaagtagacatcg-3', SEQ ID NO:6)을 사용하여 350bp의 RT-PCR 생성물을 생산하였다. 이 PCR 증폭은 95℃에서 5분 동안 초기 변성 인큐베이션에 의해 수행되었다. 이후, 35 사이클의 변성, 어닐링 및 증폭을 95℃에서 1분, 59℃에서 1분, 및 72℃에서 2분간 인큐베이션하여 수행하였다. 이후, 반응혼합물을 72℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 하기에서 기술된 것과 같은 프라이머 I7L 및 P9를 사용하여 재배열된 소 H쇄를 탐지하였다 (도 7). 내부 대조구로, GAPDH RNA 수준을 프라이머 "GAPDH 정방향" (5'-gtcatcatctctgccccttctg-3', SEQ ID NO:7) 및 "GAPDH 역방향" (5'-aacaacttcttgatgtcatcat-3', SEQ ID NO:8)을 사용하여 탐지하였다. GAPDH RNA의 이 증폭을 위해, 샘플을 95℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 및 72℃에서 2분 동안 35사이클로 인큐베이션하였다. 이후, 혼합물을 72℃에서 7분 동안 인큐베이션하였다.
이 분석은 태아 #5996의 비장의 RT-PCR이 대조구 사람 비장 cDNA (레인 4) 및 ΔHAC 키메아 마우스로부터 얻은 cDNA (레인 5)에 일치하는 밴드 (레인 3)를 생성한다는 것을 보여주었다 (도 6). 비림프계 조직에서는 이같은 밴드가 탐지되지 않았다: 소 간 (레인 1) 또는 소 뇌 (레인 2). RT-PCR을 지지하는 이들 조직의 능력은 간 (도 6의 레인 10) 및 뇌 (도 7의 레인 6)의 유지 유전자, GADPH의 성공적인 증폭에 의해 제시되었다.
배태 77일째의 소 H쇄 유전자좌의 재배열
면역글로블린 H쇄 재배열에 필요한 재배열 시스템의 발현 및 활성화에 필요한 발생 과정을 거쳤는지 확인하기 위해 ΔHAC 태아 #5996을 시험하였다. 이 분석을 위해, μ-VH 재배열을 코딩하는 mRNA 전사체의 존재를 탐지하기 위한 표준 RT-PCR 분석을 수행하였다. 태아 #5996의 비장, 간 및 뇌로부터 단리한 RNA을 프라이머 "17L" (5-ccctcctctttgtgctgtca-3', SEQ ID NO:9) 및 "P9" (5'-caccgtgctctcatcggatg-3', SEQ ID NO:10)을 사용한 RT-PCR에 의해 분석하였다. PCR 반응 혼합물을 95℃에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 하기 조건들을 사용하여 35 사이클의 변성, 어닐링 및 증폭을 수행하였다: 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 및 72℃에서 2분. 이후, 반응 혼합물을 72℃에서 10분간 인큐베이션하였다.
도 7의 레인 5는 재배열된 소 H쇄 증폭의 예상된 크기 (450bp)가 얻어졌음을 보여준다. 이 생성물은 재배열된 소 H쇄 전사체에 상응하는 서열을 함유한 것으로 알려진 대조구 소 CμH쇄 cDNA (레인 7)에 상응하는 위치로 이동하였다. 예상한 대로, 재배열된 H쇄는 발생 중 이 단계에서 비장 (레인 5)에서는 발현되었지만, 뇌 (레인 2) 및 간 (레인 3)에서는 발현되지 않았다.
Δ HAC 태아 #5996 중 사람 H쇄 유전자좌의 재배열 및 발현
Cμ및 VH 영역의 일부를 포함한 DNA 세그먼트의 증폭에 의해 사람 H쇄 유전자좌의 재배열 및 발현을 입증하였다. 재배열된 사람 Cμ- VDJ 서열을 포함하는 RNA 전사체가 존재하는지 측정하기 위해, Cμ의 일부(Cμ1) 및 VH (VH3-30)을 포함하는 RNA 전사체에 특이적인 프라이머를 사용하였다 (도 8).
이 RT-PCR 분석을 위해, 프라이머 "Cμ1" (5'-caggtgcagctggtggagtctgg-3', SEQ ID NO:11) 및 "VH3-30" (5'-caggagaaagtgatggagtc-3', SEQ ID NO;12)를 사용하여 450bp의 RT-PCR 생성물을 생성하였다. 이 RT-PCR은 95℃에서 3분간 반응 혼합물을 인큐베이션한 후, 95℃에서 30분, 69℃에서 30분, 및 72℃에서 45분 동안 40사이클 인큐베이션하고, 72℃에서 10분간 인큐베이션하여 수행되었다. 이후, 이 RT-PCR 생성물을 동일한 프라이머를 사용하여 95℃에서 3분 동안 1사이클, 95℃에서 1분, 59℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 40사이클, 및 72℃에서 10분 동안 1사이클하여 재증폭시켰다. 내부 대조구로, GAPDH의 RT-PCR 증폭체를 상기에서 기술한 것과 같이 수행하였다.
도 8의 젤은 태아 #5996의 비장의 RT-PCR 분석이 사람 비장 cDNA (레인 4) 또는 ΔHAC 키메라 마우스 비장 cDNA (레인 1)을 사용한 증폭 생성물에 일치하는 밴드 (레인 5)를 생성하였음을 보여준다. 소 간(레인 2) 및 소 뇌(레인 3)에서는 이같은 밴드가 탐지되지 않았다. 양성 대조구로, GAPDH RNA (레인 8 및 9)의 증폭은 이들 조직이 RT-PCR을 지지하는 능력을 보여주었다.
또한, 태아 #5996 내의 사람 H쇄 영역의 재배열 및 발현은 프라이머 CH3-F3 (5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3', SEQ ID NO:13) 및 CH4-R2 (5'-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3', SEQ ID NO:14)을 사용하여 입증되었다. 이들 PCR 반응 혼합물은 18.9㎕의 물, 3㎕의 10X Ex Taq 완충용액, 4.8㎕의 dNTP 혼합물, 10pmol의 정방향 프라이머, 10pmol의 역방향 프라이머, 1㎕의 cDNA, 및 0.3㎕의 Ex Taq.을 포함하였다. 반응 혼합물을 하기 조건 하에서 인큐베이션하여 40회의 PCR 사이클을 수행하였다: 85℃에서 3분, 94℃에서 1분, 98℃에서 10초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초.
도 9의 레인 6 및 7에서 나타낸 것과 같이, 태아 #5996의 비장으로부터 증폭된 서열은 두 개의 양성 대조구, 사람 비장으로부터의 샘플 (레인 8) 및 ΔHAC 키메라 마우스 비장 (레인 9)의 스플라이싱된 불변 영역 단편과 같은 크기였다. 예상한 것과 같이, 정상적인 마우스 비장 및 소 비장으로부터의 음성 대조구는 증폭된 서열을 포함하지 않았다 (레인 1 및 2). 태아 #5996의 간 및 뇌로부터의 샘플은 사람 μH쇄 불변영역 단편과 같은 크기의 증폭된 스플라이싱된 서열을 함유하지는 않았지만, RNA 샘플이 오염된 게놈 DNA로부터 유래한 스플라이싱되지 않은 게놈 단편의 증폭된 서열을 포함하였다 (레인 3, 4 및 5).
Δ HAC 태아 중 사람 H쇄 유전자좌의 VDJ 재배열
또한, ΔHAC 태아 #5996 중 H쇄 유전자좌의 VDJ 재배열을 추가 입증하기 위해 PCR 분석을 수행하였다. 첫번째 반응에서, Cμ-1 (5'-CAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3', SEQ ID NO:15)을 프라이머로 사용하고, 두번째 반응에서 Cμ-2 (5'-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3', SEQ ID NO:16)을 프라이머로 사용하고, 두 반응 모두에서 프라이머 VH3-30.3 (5'-CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3', SEQ ID NO:17)을 사용하여 가지분리 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 반응 혼합물은 18.9㎕의 물, 10pmol의 역방향 프라이머, 1㎕의 cDNA, 및 0.3㎕의 Ex Taq을 포함하였다. 첫번째 반응의 경우, 하기 조건 하에서 38 사이클을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다: 85℃에서 3분, 94℃에서 1분, 98℃에서 10초, 65℃에서 30초, 및 72℃에서 30초. 두번째 반응의 경우, 하기 조건 하에서 38 사이클을 수행하였다: VH3-30.3 및 Cμ-2 (5'-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3', SEQ ID NO:16)을 프라이머로 사용하여 85℃에서 3분, 94℃에서 1분, 98℃에서 10초, 65℃에서 30초, 및 72℃에서 30초.
도 10의 레인 6 및 7에 나타낸 것과 같이, 태아 #5996의 비장의 RT-PCR 분석은 레인 8 및 9의 양성 대조구와 동일한 크기의 H쇄 밴드를 생성하였다. 태아 #5996의 간 및 뇌로부터의 샘플은 일부 오염된 재배열된 DNA를 포함하였다 (레인 3 및 5). 레인 1 및 2의 음성 대조구는 부정확한 크기의 밴드를 생성하였다.
시퀀싱에 의한 Δ HAC 재배열의 입증
ΔHAC 태아 #5996의 비장의 RNA의 역전사로 얻은 cDNA를 재배열된 사람 μ에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭하고, 아가로즈 겔 상에서 이동시켰다. Cμ1-VH3-30 프라이머쌍을 사용한 증폭에 의해 얻은 밴드를 겔로부터 잘라내었다. 증폭된 cDNA를 밴드로부터 회수하고, 클로닝하였다. 재배열된 사람 μ에 대해 PCR-양성인 생성된 클론의 DNA를 정제하고 시퀀싱하였다 (도 11a)
이 HAC 태아에서 얻은 염기서열은 20개 이상의 알려진 사람 H쇄 염기서열과 95 % 이상의 상동성을 가진다. 예를 들어, 폐렴 쌍구균에 대한 사람 항체의 μ쇄는 이 염기서열 영역과 97%의 상동성을 지닌다(도 11b).
태아 #5996의 비장으로부터 프라이머 Cμ-2 및 VH3-30.3을 이용한 RT-PCR 분석을 통해 재배열된 사람 H쇄의 부가적인 서열을 얻고, 프라이머 Cμ-2 및 VH3-30.3를 이용해 다시 증폭하였다. RT-PCR산물을 CHROMA SPIN 컬럼 (CLONETECH)을 이용해 정제하고 pCR2.1 TA-클로닝 벡터 (Invitrogen)에 제조사의 프로토콜에 따라 클로닝하였다. 염료 종결 염기서열분석 반응 (ABI Applied System)을 BigDye 종결 반응 혼합물 (3㎕), 주형 플라스미드 (200 ng), 및 Cμ-2 프라이머(1.6 pmol)을 포함한 10㎕의 반응 혼합물로 수행하였다. 시퀀싱 반응을 ABI 3700 염기서열 분석기를 이용해 수행하였다. 이 분석을 위해 다음 조건 하에서 25 사이클을 수행하였다: 96℃에서 1분, 96℃에서 10초, 55℃에서 5초 및 60℃에서 4분.
2개 이상의 사람 H쇄 전사체가 동정되었으며 이들은 VH3-11/D7-27/JH3/Cμ및 VH3-33/D6-19/JH2/Cμ이다(도 12a 및 12b). 이러한 결과들은 태아 #5996의 비장 내에서 사람 μH쇄 유전자 좌의 VDJ 재배열이 HAC에서 일어남을 증명한다. 또한, 같은 태아에서 하나 이상의 재배열된 H쇄 염기서열의 동정은 HAC 태아가 다양한 사람 면역글로불린 서열을 만드는 능력을 가짐을 증명한다.
사람 H쇄 및 L쇄 유전자좌의 ΔΔ HAC 태아 내에서의 재배열 및 발현
ΔΔHAC에 대해 염색체 전좌인 소 태아 섬유아세포로부터 유래한 클로닝된 태아를 수용체 소로부터 임신 중 다양한 시기에 적출하였다. 태아를 HAC를 가진 사람 면역글로불린 H쇄와 λL쇄 유전자좌의 존재와 재배열에 대해 분석하였다. 이들 조직으로부터 얻은 게놈 DNA에 대한 연구 결과, 일부 태아에서 사람 면역글로불린 H쇄 및 L쇄의 존재를 나타내었다. 이들 태아의 비장에서 추출한 cDNA 검사 결과 일부 태아에서 면역글로불린 H쇄 및 L쇄 유전자좌의 재배열 및 발현이 나타났다. 또한, FACS 분석 결과는 태아들 중 두 마리에서 사람 λ L쇄 단백질이 비장 림프구의 표면에 발현됨이 나타났다.
ΔΔ HAC 태아 내에서의 사람 H쇄 및 L쇄 유전자좌의 존재
ΔΔHAC 태아가 사람 H쇄 및 L쇄 유전자좌를 가지고 있는지 확인하기 위해 58일된 태아 #5580, 57일된 태아 #5848, 91일된 태아 #5442A 및 5442B의 간에서 얻은 게놈 DNA를 PCR로 분석하였다. H쇄 유전자좌를 탐색하기 위한 PCR 프라이머로는 VH3-F(5-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3, SEQ ID NO: 18) 및 VH3-R(5-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3, SEQ ID NO: 19)를, L쇄 유전자좌를 탐색하기 위한 프라이머로는 IgL-F(5-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3, SEQ ID NO: 20) 및 IgL-R (5-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3, SEQ ID NO: 21)을 사용하였다. PCR 혼합물은 18.9㎕의 물, 3㎕의 10X Ex Taq 완충용액, 4.8㎕의 dNTP 혼합액, 10pmol의 정방향 프라이머, 10pmol의 역방향 프라이머, 1㎕의 게놈 DNA 및 0.3㎕의 Ex Taq을 포함하였다. 38 사이클의 PCR을 다음과 같이 수행하였다: 85℃에서 3분, 94℃에서 1분, 98℃에서 10초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 30초(도 13 및 14).
도 13 및 14에 예시된 바와 같이, 양성대조구인 58일된 태아 #5580은 사람 H쇄 및 L쇄 면역글로불린 유전자좌 양쪽을 모두 가지고 있다. 91일된 태아 #5442A 및 5442B 또한 H쇄 및 L쇄 유전자좌 (도 14)를 모두 가지고 있다. 이와는 대조적으로 태아 #5848은 사람 유전자좌를 어느 쪽도 가지고 있지 않았으며 ΔΔHAC를 가지고 있지 않을 것이라 추측된다. 이들 결과들은 ΔΔHAC가 소에서 임신 91일까지 안정적으로 유지됨을 제시한다.
ΔΔ HAC 태아 #5442A 내에서의 사람 H쇄 및 L쇄 유전자좌의 재배열 및 발현
재배열된 사람 H쇄 RNA 전사체의 ΔΔHAC 태아 #5442A 내에서의 발현을 탐색하기 위해 RT-PCR을 이용하였다. 사용한 RT-PCR 프라이머는 CH3-F3(5-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3, SEQ ID NO: 22) 및 CH3-R2(5-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3, SEQ ID NO: 23) 이다. RT-PCR 혼합물은 18.9㎕의 물, 3㎕의 10X Ex Taq 완충용액, 4.8㎕의 dNTP 혼합액, 10pmol의 정방향 프라이머, 10pmol의 역방향 프라이머, 1㎕의 cDNA 및 0.3㎕의 Ex Taq을 포함하였다. 40 사이클의 RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다: 85℃에서 3분, 94℃에서 1분, 98℃에서 10초, 60℃에서 30 초 및 72℃에서 30초.
도 15의 레인 4 및 5 는 태아 #5442A 비장에서 증폭된 스플라이싱된 μ H쇄 불변 영역 서열을 포함하고 있으며 그 크기가 양성 대조구 표본과 유사하다. 이러한 결과는 태아 #5442A의 비장에서 재배열된 μH쇄 전사체가 발현됨을 나타낸다. 스플라이싱 되지 않은 게놈 서열의 영역에서도 약한 밴드가 관찰되며 이는 RNA 표본에 오염된 게놈 DNA로부터 증폭된 것이다. 태아 #5442A의 간 및 뇌에서 얻은 대조구 표본은 증폭된 재배열된 H쇄 서열의 예상 크기에 해당하는 밴드를 만들어 내지 않았다.
ΔΔ HAC 태아 #5868A 내에서의 사람 H쇄 및 L쇄 유전자좌의재배열 및 발현
임신 119일째의 ΔΔHAC 태아 #5868A의 비장 내에서 재배열된 사람 H쇄 RNA 전사체의 발현을 탐색하기 위해 RT-PCR을 이용하였다. 사용한 RT-PCR 프라이머는 VH30-3 (5'-caggtgcagctggtggagtctgg-3', SEQ ID NO: 24) 및 CM-1 (5'-caggagaaagtgatggagtc-3', SEQ ID NO: 25)이다. 또한, 프라이머 "GAPDH up" (5'-gtcatcatctctgccccttctg-3', SEQ ID NO: 26) 및 "GAPDH down" (5'-aacaacttcttgatgtcatcat-3', SEQ ID NO: 27)을 GAPDH 대조구 전사체 증폭을 위해 사용하였다. 이 PCR 분석을 위해 반응 혼합물을 95℃에서 5 분간 인큐베이션 후 여러 주기의 변성, 어닐링 및 증폭을 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 및 72℃에서 2분간 인큐베이션하여 수행하였다. 이후, 반응 혼합물을 72℃에서 10분간 인큐베이션하였다.
도 16의 레인 3은 태아 ΔΔHAC #5868A 에 대한 분석에서 만들어진 RT-PCR 산물을 포함하고 있다. 이 RT-PCR산물은 재배열된 사람 H쇄 증폭에서 예상되는 크기 (470bp)이며 재배열된 사람 H쇄 전사체에 상응하는 서열을 가지고 있다고 알려진 대조구 cDNA와 같은 위치로 겔 내에서 이동한다. 대조구로서, ΔΔHAC #5868A 태아 비장 cDNA 및 정상 소 cDNA 표본은 GAPDH 프라이머로 증폭 했을 때 모두 산물을 만들어 내었으며 이는 cDNA가 증폭을 뒷받침할 수 있는 역량이 있음을 나타낸다(레인 7 및 8).
ΔΔ HAC 태아 #5442A 및 5442B 내에서의 사람 λ 유전자좌의 재배열 및 발현
사람 λ의 일부를 포함하는 전사체 증폭에 특이적인 프라이머를 재배열된 사람 L쇄 유전자좌에서 전사된 RNA를 탐색하기 위해 사용하였다.
도 17에 나타낸 RT-PCR 분석을 위해 동일 몰수의 프라이머 Cλ1 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3', SEQ ID NO: 28), Cλ2-3 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3', SEQ ID NO: 29), 및 Cλ7 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3', SEQ ID NO: 30)의 혼합물을 프라이머 Vλ1 LEA1 (5'-CCCCCAAGCTTRCCKGSTYYCCTCTCCTC-3', SEQ ID NO: 31) 와 함께 사용하였다. RT-PCR 반응 혼합물은 18.9㎕의 물, 3㎕의 10X Ex Taq 완충용액, 4.8㎕의 dNTP 혼합물, 10pmol의 정방향 프라이머, 10pmol의 역방향 프라이머, 1㎕의 cDNA 및 0.3㎕의 Ex Taq을 포함한다. RT-PCR 조건은 다음과 같다: 85℃에서 3분, 94℃에서 1분, 98℃에서 10초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분을 40 사이클 반복.
도 18에 나타낸 바와 같이 이 RT-PCR 분석을 동일 몰수의 프라이머 Vλ3LEA1 (5'-CCCCCAAGCTTGCCTGGACCCCTCTCTGG-3', SEQ ID NO: 32), Vλ3JLEAD (5'-ATCGGCAAAGCTTGGACCCCTCTCTGGCTCAC-3', SEQ ID NO: 33), VλBACK4 (5'-CCCCCAAGCTTCTCGGCGTCCTTGCTTAC-3', SEQ ID NO: 34) 의 혼합물 및 동일 몰수의 프라이머 Cλ1 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3', SEQ ID NO: 35), Cλ2-3 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3', SEQ ID NO: 36) 및 Cλ7 (5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3', SEQ ID NO: 37)의 혼합물을 사용해서도 수행하였다. RT-PCR 조건은 상기 도 7에 기술된 바와 같았다.
도 17의 레인 6 및 7, 및 도 18의 레인 4 및 5 는 태아 #5442A의 비장으로부터 얻은 RT-PCR 산물을 포함하며 이것은 양성 대조구 밴드와 크기가 유사하다. 이는 이 태아 내에 재배열된 L쇄 RNA가 존재함을 나타낸다. 태아 #5442B로부터 얻은 비장 표본에서는 적절한 크기의 밴드가 매우 약하게 생성되었으며 이는 그림에서 보이지 않는다. 이 RT-PCR 산물은 태아 #5442B 역시 재배열된 L쇄 면역글로불린 전사체가 비장에서 발현됨을 나타낸다. 예상한 바와 같이 태아 5442A 및 5442B의 뇌에서 얻은 표본에서는 재배열된 L쇄 전사체가 발현되지 않았다.
ΔΔ HAC 태아 #5868A 내에서의 사람 λ 유전자좌의 재배열 및 발현
재배열된 사람 λL쇄 유전자좌에서 만들어진 RNA 전사체는 ΔΔHAC 태아 #5868A 내에서도 역시 탐지되었다. 이 분석을 위해 사람 λ의 일부를 포함하는 전사체 증폭에 특이적인 프라이머를 재배열된 사람 L쇄 유전자좌의 일부를 코딩하는 전사체의 ΔΔHAC-코딩 발현을 탐색하기 위해 사용하였다. 프라이머 VL1LEAI (5'-cccccaagcttRccKgStYYcctctcctc-3'; SEQ ID NO: 38) 및 동몰량의 프라이머 CL1 (5'-gggaattcgggtagaagtcactgatcag-3'; SEQ ID NO: 39), CL2-3 (5'-gggaattcgggtagaagtcacttatgag-3'; SEQ ID NO: 40), 및 CL7 (5'-gggaattcgggtagaagtcacttacgag-3'; SEQ ID NO: 41)의 혼합물을 이 분석을 위해 사용하였다. 이 RT-PCR 반응을 위해 반응 혼합물을 95℃에서 5분간 인큐베이션한 후 여러 주기의 변성, 어닐링, 및 증폭을 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 및 72℃에서 2분간 배양하여 수행하였다. 그 후 반응 혼합물을 72℃에서 10분간 인큐베이션하였다.
이 분석은 ΔΔHAC #5868A의 비장의 cDNA (도 19의 레인 4)가 TC 쥐 비장 cDNA 양성 대조구(레인 6)와 같은 크기의 RT-PCR 산물을 생성함을 나타낸다. 이러한 RT-PCR 산물은 ΔΔHAC #5868A의 뇌 또는 간 cDNA 어느 쪽을 사용하였을 경우에도 탐색되지 않았다(각각 레인 2 및 3). 이들 조직이 RT-PCR을 뒷받침할 수 있는 역량이 있음은 유지 유전자 GAPDH가 프라이머 GAPDH up 및 GAPDH down을 이용해 성공적으로 증폭되는 것으로 확인하였다 (레인 8 및 10).
시퀀싱을 통한 ΔΔ HAC 재배열의 확인
태아 #5442A의 비장 표본으로, 동몰량의 프라이머 Cλ1, Cλ2-3, 및 Cλ7 의 혼합물을 프라이머 Vλ1LEA1와 함께, 또는 동몰량의 프라이머 Vλ3LEAl, Vλ3JLEAD, 및 VλBACK4의 혼합물 및 동일 몰수의 프라이머 Cλ1, Cλ2-3, 및 Cλ7 의 혼합물을 사용해 RT-PCR 분석을 수행하였다. PCR 산물을 CHROMA SPIN 칼럼 (Clontech)을 이용해 정제하고 pCR2.1 TA-클로닝 벡터 (Invitrogen)에 제조사가 제공한 절차에 따라 클로닝하였다. 염료 종결 염기서열분석 반응 (ABI Applied System)을 Cλ1, Cλ2-3, 및 Cλ7 프라이머의 동일 몰수 혼합물을 사용해 수행하였다. 96℃에서 1분, 96℃에서 10초, 55℃에서 5초 및 60℃에서 4분을 25 사이클 수행하였다. 10㎕의 반응 혼합물은 BigDye 종결 반응 혼합물 (3㎕), 주형 플라스미드 (200ng), 및 Cλ1, Cλ2-3, 및 Cλ7 프라이머(1.6pmol)를 포함한다. 반응혼합물은 ABI 3700 염기서열 분석기를 이용해 분석하였다.
두 개 이상의 재배열된 사람 λL쇄 전사체가 동정되었다 (V1-17/JL3/Cλ 및 V2-13/JL2/Cλ). 이들 결과는 태아 #5442A의 비장 내의 ΔΔHAC 내에서 사람 λ L쇄 유전자의 VJ 재배열이 일어남을 보여준다.
ΔΔ HAC 태아 #5442A 및 5442B 내에서의 사람 λL쇄 및 소 H쇄의 발현에 대한 FACS 분석
ΔΔHAC 태아 #5442A 및 5442B의 비장 림프구들에서의 사람 λL쇄 및 소 H쇄 단백질 발현을 분석하였다. 이들 세포들을 피코에리트린으로 표지된 항-사람 λ 항체 (도 22c 및 22d), FITC로 표지된 항 소 IgM 항체 (도 22d 및 22h)와 함께, 또는 항체 없이 (도 22a, 22b, 22e, 및 22f) 20분간 4℃에서 반응 하였다. 세포를 2% FCS를 포함한 PBS로 2회 세척한 후 FASCalibur 세포 분리기를 이용해 분석하였다. 전기적으로 게이트를 설정하기 위해 항체와 반응하는 세포의 백분율을 항체가 없는 대조구를 이용해 계산하였다. 이 백분율 값은 각 히스토그램 아래쪽에 표시되어 있다. 태아 #5442A (도 22a-22d) 및 태아 #5442B (도 22e-22h)는 사람 λ L쇄 단백질 및 소 H쇄 단백질을 모두 발현하였다.
*실시예 3: 이종 항체 및 감소된 양의 내인성 항체를 생산하는 트랜스제닉 유제류
또한, 이종 항체를 발현하며 및 감소된 수준으로 내인성 항체를 발현하는 트랜스제닉 유제류를 제조할 수 있다. 기능적 이종 면역글로불린 H쇄 또는 L쇄 유전자 수를 내인성 H쇄 또는 L쇄 유전자에 수에 비해 증가시킴으로써 이종 항체를 발현하는 B 세포의 백분율을 증가 시킬 수 있다.
이들 트랜스제닉 유제류를 만들기 위해 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 트랜스제닉 유제류를 내인성 면역글로불린쇄의 하나 또는 두 대립 유전자에 돌연변이 (예를 들어 μH쇄 또는 λ또는 κL쇄)를 가지고 있는 트랜스제닉 유제류와 교배할 수 있다. 원한다면, 생성된 트랜스제닉 유제류를 (i) 하나 또는 두 내인성 α-(1,3)-갈락토실 전이효소, 프리온, 및(또는) J쇄 핵산 대립 유전자에 돌연변이를 가지고 있는 트랜스제닉 유제류, (ii) 외인성 J쇄 핵산 (예를 들어, 사람 J쇄)를 포함하는 트랜스제닉 유제류와 교배 할 수 있다. 별법으로, ΔHAC 또는 ΔΔHAC 트랜스제닉 태아에서 얻은 세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포)에서 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자를 돌연변이시켜 유전적으로 변형할 수도 있다. 다른 가능한 방법으로 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 내인성 면역글로불린(μH쇄 및(또는) λL쇄)이 반접합성 또는 동형접합성으로 비활성인 세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포)에 도입할 수도 있다. 상기의 어느 방법으로도 세포는 (i) 돌연변이, 바람직하게는 넉아웃 돌연변이를 하나 또는 두 내인성 α-(1,3)갈락토실 전이효소, 프리온, 및(또는) J쇄 핵산 대립 유전자 중로 도입시킴 또는 (ii) 외인성 J쇄 핵산 중으로 도입시킴으로써 유전적으로 변형될 수 있다. 생성된 트랜스제닉 세포는 원하는 트랜스제닉 유제류를 만들기 위해 핵 이식 절차에 이용될 수 있다. 예시적인 방법이 아래에 기술되어 있다.
DNA 구조체
상기에서 기술된 μH쇄 (도 2a), λL쇄, κL쇄, α-(1,3)갈락토실 전이효소, 프리온, 및(또는) J쇄 넉아웃 구조체가 이용될 수 있다. 별법으로, 아래에 기술된 퓨로마이신 내성 μH쇄 구조체가 이용될 수도 있다 (도 3f). 이 넉아웃 구조체는 소 μH쇄 유전자좌의 네 개의 주요한 코딩 엑손을 제거하도록 설계되었으나 막통과 부위는 온전하며, 따라서 μH쇄 유전자좌의 비활성화를 가져온다.
퓨로마이신 내성 구조체는 아래와 같이 조합하였다. 코딩 엑손 1에 매우 근접한 부위를 포함한 4.4Kb의 XhoI 단편을 pBluescript II SK+의 XhoI 자리에 삽입하였다. 퓨로마이신 내성 유전자를 가진 pPGKPuro 플라스미드는 미국 화이트헤드 인스티튜트의 피터 더블유. 레어드 (Peter W. Laird) 박사로부터 구했다. 퓨로마이신 내성 유전자를 포함하는 1.7Kb의 XhoI 단편을 4.4Kb 단편에 인접하며, 상기 단편의 하류에 있는 폴리링커 영역 내의 SalI 자리에 서브클로닝하였다. 이 1.7Kb의 퓨로마이신 마커가 소 H쇄 유전자좌의 코딩 엑손 CH1, CH2, CH3 및 CH4를 대체한다. 야생형 게놈 염기서열에서 이 네 엑손들의 하류에 있는 μ유전자좌의 4.6Kb 영역을 포함하는 XbaI 단편을 두번째 상동성 영역으로 사용하기 위해 구조체에 첨가하였다.
최종 표적화 구조체를 제조하기 위해 세 개의 조합된 단편을 NotI 및 MluI으로 잘라 이 구조체의 서브클론을 제조하였다. MluI 제한효소 절단은 4.6Kb 단편을 잘라 1.4Kb로 만들었다. NcoI 자리는 폴리링커 내에 존재하며 서브클론된 DNA 자체는 자르지 않았다. MluI 부위는 클레나우 효소 단편으로 채워 블런트 말단을 제조하였으며 NotI/채운 MluI 단편을 pBluescript II SK+ 벡터에 존재하는 NotI 및 SmaI 자리를 이용해 새로운 pBluescript II SK+ 벡터에 서브클로닝하였다. 유전자 표적화를 위해 최종 벡터를 NotI으로 선형화하였다.
전기천공법을 통한 유전자 표적화 및 트랜스펙트된 섬유아세포의 약물 선별
전기천공을 위해 제한된 횟수의 집단 계대를 거친 1 x 107 개의 소 태아 섬유아세포 (예를 들어, 실시예 2에 기술된 것과 같이 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 트랜스제닉 태아로부터 얻은 섬유아세포)의 단일 세포 현탁액을 1200 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 0.8 ml의 무혈청 α-MEM 배지에 재분산시켰다. 재분산된 세포는 0.4cm의 천공 큐벳 (Invitrogen, cat.#:P460-50)에 옮겼다. 이후, 제한효소에 의해 선형화된 30㎍의 유전자 표적화 DNA를 첨가하고 큐벳의 내용물을 1ml 피펫을 이용하여 혼합한 후 상온에서 2분간 배양하였다. 큐벳을 Gene Pulser II 전기천공 시스템 (BioRad)의 충격 챔버에 넣고 1000 볼트 및 50 μF 에서 전기 천공하였다. 큐벳을 재빨리 조직 배양 후드로 옮기고 전기 천공된 세포를 약 30ml의 완전 섬유아세포 배지로 피펫을 통해 옮겼다. 세포를 100mm 조직 배양 플레이트 (Corning cat.#: 431079)에 동일하게 분주한 후 세포가 고루 퍼지도록 가볍게 흔들어 주고 38.5℃/5% CO2에서 16 내지 24시간 동안 배양하였다. 배지를 흡입하여 제거한 후 선택을 위한 선별 약물을 포함한 완전 섬유아세포 배지로 교환하였다. 배지를 이틀마다 교환하며 7일 내지 14일간 계속 배양하였다. 약물 선별 절차 동안 대표적인 플레이트를 육안으로 관찰하여 세포사 및 콜로니 형성을 모니터하였다. 음성 대조구 플레이트는 유전자 표적화 벡터가 없는 상태에서 전기 천공한 섬유아세포를 포함하도록 하였으며 약물 선별 절차 동안 콜로니가 형성되지 않았다.
약물 내성 섬유아세포 콜로니의 채집 및 세포군의 팽창
약물 선별 단계가 끝난 후에 (일반적으로, 7일 내지 14 일), 약물 내성 콜로니를 육안으로 식별할 수 있었으며, 48웰 조직 배양 플레이트에서의 세포군의 팽창을 위해 옮길 준비가 되었다. 이 전이 절차를 돕기 위해 개개의 콜로니를 조직 배양 플레이트 아래에 착색된 마커 (Sharpie)를 이용해 원형으로 표시하였다. 콜로니를 함유한 조직 배양 플레이트를 1X D-PBS(Ca2 + 및 Mg2 + 를 포함하지 않음)로 2회 세척한 후, 플레이트당 5ml의 1:5로 희석된 세포 박리 완충용액을 가하였다. 상온에서 3 내지 5분간 배양 단계를 거치면 개개의 콜로니가 세포 배양 플레이트의 바닥으로부터 떨어지기 시작한다. 콜로니가 떨어지기 전에 각각을 48웰 세포 배양 플레이트의 한 개 웰에 P200 피펫맨 및 에어로졸 피펫 팁 (200 또는 250 ㎕)을 이용해 옮겼다. 이동 후 위아래로 피펫팅 하면서 콜로니를 완전히 분리한 후 1ml의 완전 섬유아세포 배지를 가하였다. 세포의 약물 내성을 보장하기 위해 약물 선택을 48웰 단계에 걸쳐 계속하였다. 옮긴 콜로니를 38.5℃/5% CO2 하에서 배양하면서 도립현미경을 통해 육안으로 관찰하였다. 2일 내지 7일 후 전면성장에 이른 웰들을 1X D-PBS(Ca2 + 및 Mg2 +를 포함하지 않음)로 2회 세척한 후, 0.2ml의 세포 박리 완충용액을 가하고 5분간 상온에서 배양해 세포를 웰 바닥으로부터 떼어 냈다. 세포 박리 후 상기 P1000 피펫맨 및 에어로졸 피펫팁 (1000 ㎕)을 이용해 위아래로 피펫팅해서 세포들을 분리하였다. 약 75%의 분리된 섬유아세포를 이후의 PCR 분석을 위해 세포군 팽창을 하도록, 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 옮겼으며 나머지 25%의 세포를 두 번째 24웰 플레이트의 한 웰에 옮겨 세포군 팽창을 시켜 최종적으로 체세포 핵 이식 실험을 위해 사용하였다. 원래 세포들의 75%를 포함한 플레이트가 전면성장으로 팽창하면 유전적 분석을 위해 그 클론으로부터 DNA를 분리하였다.
DNA 준비
유전학적 분석을 위해 DNA를 단리하기 위한 절차는 레어드 (Laird) 등 (Nucleic Acids Research, 1991, Volume 19, No. 15.)으로부터 적용하였다. 특히 특정 클론이 24웰 플레이트의 한 웰에서 거의 전면성장에 이르면 그 웰에서 배양 배지를 흡입하고 부착 세포를 PBS로 2회 세척하였다. PBS를 흡입하여 제거한 후 세포를 용해시키고, 분리할 DNA로부터 과량의 단백질 분해를 위해 0.2ml의 완충용액으로 교환하였다. 이 완충용액은 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl 및 100 ug/ml 프로티나아제 K로 이루어져 있다. 24웰 플레이트를 조직배양기 안에 다시 넣어 3시간 이상 배양하여 단백질 분해 및 DNA 방출이 일어나도록 하였다. 이 절차를 거친 점성이 높은 산물을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 0.2ml의 이소프로판올을 가하여 DNA 침전이 일어나게 하였다. 침전물을 원심분리로 회수하고 DNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 펠릿을 10mM Tris, pH 8, 및 1mM EDTA를 포함한 25-50㎕의 완충용액에 녹였다. 이 DNA를 클론의 PCR 분석을 위해 사용하였다.
클론들의 스크리닝
클론들을 스크리닝하기 위해 두 가지 다른 접근법을 사용하였다. 두 방법 모두 PCR을 사용한다. 이 절에 기술된 모든 접근방법은 임의의 다른 유전자의 표적화에 적용될 수 있다. 다른 점은 유전적 분석을 위해 사용하는 프라이머의 염기서열뿐이다.
첫 번째 접근법에 따라, 두 쌍의 별개의 프라이머를 안정적인 트랜스펙션 산물의 증폭을 위해 독립적으로 사용하였다. 한 쌍의 프라이머는 클론의 삽입 부위에 상관 없이 게놈에서 표적화 벡터의 존재를 탐색하기 위해 사용하였다. 프라이머는 표적화 벡터에 존재하는 DNA 염기서열에 어닐링하도록 설계하였다. 이 PCR 반응에서 PCR 산물의 세기는 게놈에 삽입된 표적화 벡터의 개수와 상관관계가 있다. 따라서 한 개의 표적화 벡터만을 가지고 있는 세포는 PCR 반응에서 덜 강한 밴드를 만들어 내는 경향이 있다. 다른 한 쌍의 프라이머는 목적한 유전자좌에 삽입된 벡터의 카피만을 탐지하기 위해 설계하였다. 이 경우에는 한 프라이머는 표적화 벡터 내에 어닐링되도록 고안되었고, 다른 하나는 표적 유전자좌에 특이적인 염기서열에 어닐링하도록 고안되었다. 이 경우에 PCR 산물은 표적화 벡터가 표적화 벡터에 존재하지 않는 자리 바로 옆에 삽입될 경우에만 탐지되며 이는 원하는 표적화 현상이 일어났음을 나타낸다. 만약 산물이 탐지되면 클론을 핵 이식에 사용하였다.
네오마이신 내성 H쇄 넉아웃 구조체를 위해서 프라이머 Neol (5'-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3', SEQ ID NO: 42) 및 IN2521 (5'-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3', SEQ ID NO: 43)를 삽입 위치와 무관하게 세포 내 표적화 벡터의 존재의 탐지를 위해 사용하였다. 프라이머 Neol 및 OUT3570 (5'-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAA GTC TGT C-3', SEQ ID NO: 44)을 μ H쇄 유전자좌에 삽입된 표적화 구조체 만을 특이적으로 증폭하기 위해 사용하였다.
네오마이신 내성 H쇄 넉아웃 구조체의 삽입을 분석하기 위한 PCR 반응에는 Qiagen PCR 키트를 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 1pmole 의 각 프라이머, 5㎕의 10X 반응 완충용액, 10㎕의 Q 용액, 5㎕의 DNA, 및 1㎕의 dNTP 용액을 포함하였다. 반응 혼합물은 물로 총 부피가 50㎕가 되도록 하였다. 이 PCR 증폭은 초기 변성 인큐베이션을 94℃에서 2분 수행한 후 30 사이클의 변성, 어닐링, 및 증폭을 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 및 72℃에서 2분간 배양하여 수행하였다. 이후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 배양하고 PCR 기계에서 꺼낼 때까지 4℃에서 보관하였다.
다른 접근방법으로 하나의 프라이머 세트를 표적화 부위의 증폭을 위해 사용하였으며 PCR 산물의 크기를 정확한 표적화 진단에 사용하였다. 한 프라이머는 표적화 벡터에 없는 유전자좌의 영역에 어닐링하도록 고안되었고, 다른 하나는 표적화 벡터에 존재할 뿐 아니라 야생형 유전자좌에도 존재하는 부위에 부착되도록 고안하였다. 이 경우에 게놈의 원하지 않는 부위에 삽입된 표적화 벡터는 탐지되지 않는다. 표적화 벡터에 의해 결실되는 영역이 그 자리에 삽입되는 약물 선별 마커와 크기가 다르므로, 산물의 크기는 증폭되는 유전자좌가 야생 유전자형인지 표적화된 유전자형인지에 의존한다. 표적화 벡터의 삽입이 일어나지 않거나 부적절하게 삽입된 클론의 DNA로부터 증폭할 경우 야생형 유전자좌에 대해 예상되는 크기의 PCR 산물 하나가 만들어진다. 정확히 표적화된(넉아웃) 대립유전자를 가진 클론의 DNA로부터 증폭할 경우 2개의 PCR 산물이 만들어진다. 하나는 야생형 대립유전자로부터의 증폭된 것이며, 다른 하나는 치환하는 서열과 길이가 상이하고, 마커에 의해 야생형 대립유전자의 일부 염기서열이 치환되어 변형된 예측가능한 크기의 것이다.
퓨로마이신 내성 H쇄 넉아웃 구조체의 경우 프라이머 Shortend (5'-CTG AGC CAA GCA GTG GCC CCG AG-3', SEQ ID NO: 45) 및 Longend (5'-GGG CTG AGA CTG GGT GAA CAG AAG GG-3', SEQ ID NO: 46)를 사용하였다. 이들 쌍의 프라이머는 야생형 H쇄 유전자좌 및 퓨로마이신 구조체에 의해 적절하게 표적화된 유전자좌를 모두 증폭한다. 두 밴드의 크기 차는 약 0.7Kb이다. 짧은 밴드의 존재가 적절한 표적화를 의미한다.
퓨로마이신 내성 H쇄 넉아웃 구조체의 삽입을 분석하기 위한 PCR 반응의 경우 Promega Master Mix 키트를 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 1pmole 의 각 프라이머, 2.5㎕의 DNA, 및 25㎕의 2X Promega Master Mix를 포함하였다. 반응 혼합물은 물로 총 부피가 50㎕가 되도록 하였다. 이 PCR 증폭은 초기 변성 인큐베이션을 94℃에서 2분 수행한 후 30 사이클의 변성, 어닐링, 및 증폭을 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 및 72℃에서 2분간 배양하여 수행하였다. 이후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 배양하고 PCR 기계에서 꺼낼 때까지 4℃에서 보관하였다.
일차 핵 이식
면역글로불린 유전자가 불활성화된 선별된 섬유아세포를 실시예 2에 기술된 바와 같이 핵 이식에 사용하여 내인성 면역글로불린에 돌연변이가 있고 이종 면역글로불린 유전자를 코딩하는 HAC를 가진 트랜스제닉 유제류를 만들 수 있다. 또는, 표준 방법을 사용하여 핵 이식을 수행하여 선별된 트랜스제닉 섬유아세포의 핵 또는 염색질체 (즉, 막에 의해 둘러 싸이지 않은 하나 이상의 염색체)를 핵을 제거한 난자 (U.S.S.N. 60,258,151; 2000. 12. 22 출원)에 삽입할 수 있다. 이 방법들은 내인성 α-(1,3)갈락토실 전이효소, 프리온 및(또는) J쇄 핵산이 돌연변이화된 세포에 사용될 수도 있다.
이차 돌연변이 유도 및 핵 이식
원한다면, 세포 (예를 들어, 섬유아세포)를 일차 핵 이식으로 만든 트랜스제닉 유제류로부터 얻을 수 있다. 추가 유전자 표적화를 상기 기술한 것과 같이 일차 표적화에서 불활성화된 유전자의 제2 대립유전자를 불활성화 시킬 수 있다. 별법으로, 다른 면역글로불린 (예를 들어 μH쇄, λL쇄, κL쇄, 또는 J쇄), α-(1,3)갈락토실 전이효소 또는 프리온 유전자를 이번 표적화에서 불활성화 시킬 수 있다. 이차 표적화의 경우 높은 농도의 항생제가 사용되거나 또는 다른 항생제 내성 마커를 가진 넉아웃 구조체가 사용될 수 있다. 항생제 내성 세포들은 상기에서 기술한 바와 같이 선별할 수 있다. 선별된 세포들은, 내인성 면역글로불린 유전자 중에 두 개의 돌연변이를 가지며, 이종 면역글로불린 유전자를 코딩하는 HAC를 가진 트랜스제닉 유제류를 만들기 위해 이차 핵 이식에 사용할 수 있다. 또는, 선별된 항생제 내성 세포를 먼저 하기에서 기술한 바와 같이 처리하여 G1기 세포를 단리하여 이차 핵 이식에 사용 할 수 있다.
핵 이식을 위한 G1기 세포의 단리를 위해, 단리 24 시간 전에 5.0 ×105 개의 세포를 100ml의 α-MEM + FCS를 포함한 100mm 조직 배양 플레이트에 깔았다. 다음 날, 단리하기 전에 플레이트를 PBS로 세척하고 배양 배지를 1-2 시간 동안 교환하였다. 플레이트를 30-60초 동안 Vortex-Genie 2 (텍사스주 휴스턴 소재의 Fisher Scientifics)를 이용해 진탕하고 배지를 제거하고, 1000G에서 5분간 돌리고, 펠릿을 250㎕의 MEM + FCS에 재분산하였다. 새로 분열하여 세포질 브릿지로 부탁되어 있는 세포 쌍들은 초기 G1 기에 있으므로 이들을 선별하였다. 이 단리 절차는 진탕 분리(Shake Off) 방법이라 인용된다.
실시예 4: 감소된 α-1,3- 갈락토실 전이효소 활성을 가진 트랜스제닉 유제류
α-1,3-갈락토실 전이효소 대립유전자 유전자좌 하나가 돌연변이화된 소 섬유아세포주를 상동성 재조합으로 만들었다. α-갈락토실 전이효소 넉아웃 세포를 제조하기 위한 DNA 구조체를, 촉매 도메인을 포함하는 엑소 9 중의 퓨로마이신 내성 유전자 (puro, 실시예 3에 기술) 및 전사 종료 카세트 (STOP)을 삽입시켜 기능적인 전장 α-갈락토실 전이효소 mRNA의 전사를 막는 데 사용하였다. 따라서, 생성된 미성숙 α-갈락토실 전이효소 전사체는 촉매 도메인이 결여되어 있다. DNA 구조체 (즉, α-갈락토실 전이효소 KO 벡터)를 세 개의 독립적인 섬유아세포주에 전기 천공한 후 퓨로마이신 내성 콜로니를 골랐다. PCR 분석결과에 기초해 확인한 결과 엑손 9 영역 중의 상동성 재조합이 일부 콜로니에서 일어났다. 따라서, α-1,3-갈락토실 전이효소의 하나의 대립유전자 유전자좌가 돌연변이화된 소 섬유아세포주를 만들었다. 원한다면, 제2 동형접합 넉아웃 세포를 선별하기 위해, 동일한 넉아웃 벡터 및 높은 항생제 농도를 이용해서, 또는 다른 약물 내성 유전자를 가진 다른 넉아웃 벡터를 이용해서, 제2 대립유전자를 돌연변이화시킬 수 있다. 또한, 이 방법은 본원에서 기술한 핵 이식 방법에 사용할 트랜스제닉 세포를 만들기 위해 다른 유제류 세포로부터 본원 발명의 트랜스제닉 유제류를 생산하기 위해 적용할 수 있다.
이 방법은 아래에 더 상세하게 기술되어 있다.
α-1,3- 갈락토실 전이효소 KO 벡터의 제조
α-1,3-갈락토실 전이효소 KO 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다 (도 23). α-1,3-갈락토실 전이효소 유전자의 엑손 9 주위의 게놈 DNA를 얻기 위해 다음 프라이머 쌍 5'-gatgatgtctccaggatgcc-3' (SEQ ID NO: 61) 및 5'-gacaagcttaatatccgcagg-3' (SEQ ID NO: 62)를 이용해 PCR로 DNA 프로브를 증폭하였다. 이 프로브를 사용해 소 게놈 X 파아지 라이브러리를 스크리닝하여 7개의 양성 파아지 클론들을 동정하였다. 한 클론의 경우, 샤롤레 수소 섬유아세포에서 얻은 DNA를 제한효소 지도작성을 통해 추가 분석하였다. 엑손 9을 포함하는 NotI-XhoI 단편을 pBluescript II SK (-)에 서브클로닝하고 puro 및 STOP 카세트를 촉매 도메인의 5'의 NotI-XhoI단편 안의 AviI 자리에 삽입하였다. 또한, 표적화 카세트가 비상동성으로 삽입된 세포를 죽이기 위해 디프테리아 독소 유전자(DT-A, Gibco)를 벡터 구조체에 추가하였다.
트랜스펙션 / 넉아웃 절차
세 개의 태아섬유아세포 세포주의 트랜스펙션 (두 개는 저시 수소, 하나는 저시 암소로부터 얻음)을 다음과 같은 표준 전기 천공 절차에 따라 수행하였다. 소 태아 섬유아세포를 배양하기 위한 배지는 500ml α-MEM (Gibco, #12561-049), 50ml 송아지 태아 혈청 (Hy-Clone #ABL13080), 5ml 페니실린-스트렙토마이신 (SIGMA), 및 1ml 2-멀캅토에탄올 (Gibco/BRL #21985-023)를 포함한다. 트랜스펙션 전날 세포를 T175 조직배양 플라스크에 현미경으로 검사 결과 목표 전면성장률이 80-100%이 되도록 접종하였다. 트랜스펙션 당일 약 107개의 소 섬유아세포를 트립신 처리하여 α-MEM 배지로 1회 세척하였다. 세포를 0.8ml의 α-MEM 배지에 재분산한 후 세포 현탁액에 30㎍의 DNA를 넣고 피펫으로 잘 섞었다. 세포-DNA 현탁액을 천공 큐벳에 옮긴 후 1000 볼트 및 50 μF 에서 전기 천공하였다. 이후, 전기 천공한 세포를 혈청이 첨가된 α-MEM 배지를 포함하는 12장의 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 48시간 배양 후 배지를 1 ㎍/ml의 퓨로마이신을 가지고 있는 배지로 교환하고, 세포를 2-3주간 퓨로마이신 내성 세포를 골라내기 위해 배양하였다. 선별 후 100% 전면성장에 가까운 콜로니를 골라내어 게놈 DNA를 콜로니들로부터 추출하고 PCR로 원하는 상동성 재조합 현상이 일어났는지를 스크리닝 하였다.
표적화된 삽입의 스크리닝
상기에서 기술된 대로 게놈 DNA를 각 24웰로부터 독립적으로 PUREGENE DNA 분리 키트 (Gentra SYSTEMS)를 이용해 제조사 매뉴얼에 따라 분리하였다. 각 게놈 DNA 표본은 20㎕의 10mM Tris-Cl (pH8.0) 및 1mM EDTA (EDTA)에 녹였다. PCR을 이용한 스크리닝은 다음 프라이머 쌍을 이용해 수행하였다. 5'-aagaagagaaaggtagaagaccccaaggac-3' (SEQ ID NO: 63) 및 5'-cctgggtatagacaggtgggtattgtgc-3' (SEQ ID NO: 64). 한 프라이머의 서열은 α-1, 3-갈락토실 전이효소 KO 벡터 내에 위치하며, 다른 프라이머의 서열은 표적화된 내인성 유전자좌 내의 삽입된 벡터 바로 바깥쪽에 위치한다 (도 23). 따라서 예상되는 PCR 산물은 넉아웃 벡터가 표적화 유전자좌에 상동성 재조합으로 삽입될 경우에만 탐색된다.
PCR 반응 혼합물은 18.9㎕의 물, 3㎕의 10X LA PCR 완충용액 II (Mg2 + 첨가), 4.8㎕의 dNTP 혼합액, 10pmol의 정방향 프라이머 10pmol의 역방향 프라이머, 1㎕의 DNA, 및 0.3㎕의 LA Taq을 포함한다. 40 사이클의 PCR을, 반응 혼합물을 다음 조건에서 인큐베이션하여 수행하였다; 85℃에서 3분, 94℃에서 1분, 98℃에서 10초, 및 68℃ 에서 15분. PCR 후 반응 혼합물을 전기영동하여 분석하였다. 예상되는 크기의 PCR 산물을 생성하는 퓨로마이신 내성 클론을 선택하였다 (도 23). 따라서, α-1,3-갈락토실 전이효소 대립유전자 유전자좌 하나가 KO 벡터에 의해 돌연변이화된 소 섬유아세포주를 성공적으로 만들었다.
실시예 5: 내인성 유전자에 돌연변이를 일으키기 위한, 아데노 연관 바이러스를 이용해 트랜스제닉 유제류를 생산하기 위한 다른 방법
아데노 연관 바이러스(AAV)를 세포의 게놈에 존재하는 표적화된 염기서열을 특이적으로 치환하기 위해 사용할 수 있다(Inoue et al., Mol. Ther. 3 (4): 526-530, 2001); Hirata et al., J. Virol. 74 (10): 16536-42, 2000); Inoue et al., J. Virol. 73 (9): 7376-80, 1999); 및 Russell et al., Nat. Genet. 18 (4): 325-30, 1998)). 유전자 표적화 비율은 일반적인 유전자 표적화 방법에 비해 상당히 효과적이다. AAV는 소 및 사람 피부 섬유아세포에 대한 특이성을 포함해 숙주 및 조직 특이성이 매우 넓다. 따라서, AAV는 내인성 면역글로불린 (예를 들어 μH쇄, λL쇄, κL쇄 또는 J쇄), α-1,3-갈락토실 전이효소, 또는 프리온 유전자 중에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 유제류 세포를 생산하는데 사용할 수 있다. 이 트랜스제닉 세포는 본원에서 기술된 핵 이식 방법을 통해 이 발명의 트랜스제닉 유제류 생산에 사용할 수 있다.
AVV를 사용함으로써 소 면역글로불린 H쇄 유전자좌의 상동성 재조합이 이전의 전통적인 유전자 표적화 방법 (즉, 전기천공 및 리포펙션 절차)에 비해 높은 빈도로 일어난다. 일차 유전자 표적화 실험에서 AAV 벡터로 도입된 DNA를 가진 73개의 안정적 형질도입 세포 중 적절히 표적화된 다섯 개의 섬유아세포 클론을 얻었다.
이 실험들은 아래와 같이 수행하였다.
AAV 넉아웃 벡터
AAV 구조체는 외래 서열의 단순 삽입 또는 AAV 벡터에 존재하는 신규 서열에 의한 내인성 서열의 치환에 의해 유전자를 분단시킬 수 있다. 도 24는 소 면역글로불린 H쇄 μ불변 영역의 모두 네 개의 코딩 엑손이 2882bp의 BamHI-XhoI 단편 상에 존재함을 나타낸다. 상업적으로 구매 가능한 벡터, pMC1Neo에 존재하는 네오마이신 내성 마커를 포함하는 1.16Kb 단편을 홀스타인 소의 μH쇄 유전자좌의 엑손 4에 존재하는 SacII 자리에 삽입하였다. 이 유전자좌는 실시예 1에 기술된 넉아웃 벡터를 제조하기 위해 분리한 파아지 클론 내에 포함된다. AAV 벡터를 만들기 위해 μH쇄 유전자좌의 SacII 자리를 채워 블런트 말단으로 만들고, 블런트 SalI 링커 (New England Biolabs)를 연결하였다. 그 후, pMC1Neo의 네오마이신 내성 유전자를 포함한 XhoI 단편을 SalI 링커에 의해 유전자좌에 첨가된 SalI 부위에 연결하여 넣었다. 이 연결은 XhoI 및 SalI 제한효소 절단부위가 호환 가능한 말단을 가지므로 가능하다. 이 넉아웃 벡터는 네오마이신 내성 유전자에 의한 μH쇄 유전자의 삽입 분단을 일으키며 그 결과 μH쇄 유전자를 불활성화 시킨다. 이 유전자 불활성화는 내인성 μ유전자좌 영역의 결실 없이 일어난다.
표적화 과정 중, 내인성 유전자좌의 엑손 3 및 4를 제거하여 이 두 엑손을 기능성 네오마이신 내성 유전자 카피로 교체하기 위한 다른 벡터를 설계할 수도 있다 (도 25). 이 구조체는 저시 암소의 게놈 DNA의 PCR 증폭을 통해 만들 수 있다. 특히 상동성이 있는 3' 영역은 다음 프라이머들로 증폭할 수 있다: XbaI 제한효소 자리를 첨가하는 5' GGGGTCTAGAgcagacactacactgatgggcccttggtcc 3' (SEQ ID NO: 65) 및 HindIII 제한효소 자리를 첨가하는 5' GGGGAAGCTTcgtgtccctggtcctgtctgacacag 3' (SEQ ID NO: 66). 상동성이 있는 5' 영역은 다음 프라이머들로 증폭할 수 있다: XhoI 제한효소 자리를 첨가하는 5' GGGGCTCGAGgtcggcgaaggatggggggaggtg 3' (SEQ ID NO: 67) 및 KpnI 제한효소 자리를 첨가하는 5'GGGGGGTACCgctgggctgagctgggcagagtggg 3' (SEQ ID NO: 68). 프라이머 서열에서 대문자로 표시된 염기는 μH쇄 유전자좌에 어닐링되지 않으며, 이후 서브클로닝 단계를 원활히 하기 위한 제한효소 자리의 첨가를 위해 프라이머에 포함한 부분이다. 제한 효소가 프라이머 말단에 있는 자리들을 내부에 있는 자리들처럼 절단하지 못하므로, 제한효소 절단 자리를 프라이머 말단에서 떨어뜨리기 위해 처음에 네 개의 구아닌을 삽입하였다. 상동성이 있는 5' 영역은 엑손 1, 2를 포함하며 길이 1.5Kb이다. 또한, 5' 상동성 영역은 엑손 3의 스플라이싱 수용 자리를 유지하기 위해 엑손 3'의 처음 25 염기를 포함했다. 엑손 3'의 스플라이싱 수용 자리는 스플라이싱에 이용되며, 따라서, 엑손 1 및 2가 하류의 막통과 부위로 가능하게 스플라이싱하여 비정상적 막 결합 생성물을 형성하는 것을 방지한다. 3' 상동성 영역은 엑손 4의 바로 하류 영역을 포함하며 길이 1.24Kb이다.
도 24에 제시된 구조체의 경우, 표적화 카세트를 리안 (Ryan)등 (J. of Virology 70: 1542-1553,1996)에 의해 보고된 긴 말단 반복(LTR)을 가지고 있는 AAV 벡터 중으로 표준 방법을 사용하여 삽입하였다. 이 AAV 벡터를 종전에 기술된 대로 (Inoue and Russell, 1998, J. Virol. 72: 7024-7031,1998) TtetA2 패키징 세포주에 의해 캡시드 안에 패키징한 후 종전에 기술된 것과 같이 정제하였다 (Zolotukhin et al., Gene Therapy, 6: 973-985,1999). 도 24에 제시된 구조체의 경우, 표적화 카세트를 리안 등에 의해 기술된 AAV 벡터, 또는 다른 AAV 벡터 (예를 들어, Stratagene에서 상업적으로 구매 가능한 것들) 중으로 삽입하고, 벡터를 포함한 바이러스를 제조하기 위해 상기 방법 또는 다른 표준 방법이 사용될 수 있다.
형질도입 절차
저시 암소의 섬유아세포를 한 웰당 40,000개의 세포로 48웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 접종하고, 38.5℃ 및 5% CO2 하의 완전 배지에서 세포들이 각 웰의 바닥 표면에 부착할 때까지 배양하였다. 세포가 부착하면 배지를 제거하고, 감염 중복성 (MOI)이 세포당 입자가 20,000이 되도록 도 24에 제시된 벡터를 가진 AAV 입자를 포함하고 있는 0.2ml의 새 배지로 갈아 주었다. MOI는 약물 선별 기간 동안 콜로니의 개수 및 콜로니간의 간격을 결정하기 위한 지표 실험에 기초해 선택하였다. 플레이트를 밤새 배양하였다. 배양 후 형질 도입된 웰들을 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 세척한 후 트립신 또는 상기에서 기술한 세포 박리 완충용액을 이용해 떼어냈다. 떼어낸 세포들에 피펫팅을 서서히 하여 균일한 세포 현탁액을 얻고, 각 웰에서 얻은 세포를 100mm 조직 배양 플레이트에 재분배하였다. 플레이트들을 완전배지을 사용하여 밤새 배양하였다.
100mm 플레이트 배양 후 배지를 350 ㎍/ml 농도의 G418을 포함한 선별 배지로 교환하였다. 선별 배지는 플레이트 표면에 콜로니가 육안으로 보일 때까지 2-3일마다 바꾸어 주었다. 이 시기에 각 콜로니를 골라내어 각자의 용기에 옮겼다.
콜로니를 포함한 영역을 조직 배양 플레이트의 바깥 표면에 표시하였다. 모든 콜로니를 원형으로 표시한 후 배지를 플레이트로부터 흡입하여 제거하고 플레이트를 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 플레이트에 1:25로 희석된 1X 트립신을 주입하고 콜로니가 플레이트 표면에서 떨어지는 것이 보일 때까지 상온에 두었다. 플레이트는 떨어진 콜로니가 플레이트의 다른 위치로 부유하는 것을 방지하기 위해 정지 상태에 두었다. 세포덩어리를 50㎕부피로 떼어내기 위해 피펫 팁을 사용하였으며, 피펫 팁의 내용물을 24웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 옮겼다. 모든 콜로니를 옮긴 후 G418을 포함한 완전배지를 넣고 거의 완전성장에 이를 때까지 분리한 클론을 증식시켰다.
각 웰이 완전성장에 이르면 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 두 번 세척한 후 세포를 0.2ml 세포 박리 완충용액으로 떼내었다. 이 세포 현탁액 중 20㎕를 새로운 24웰 플레이트에 옮기고 나머지 세포들은 원래 24웰 플레이트에 다시 부착하도록한 후, 0.2ml의 완전 배지를 넣어 주었다. 최초의 플레이트를 100% 전면성장 할 때까지 배양하였다. 새로운 플레이트를 이후 소 클로닝 절차에 사용할 적절히 표적화된 세포 공급원으로 사용하였다.
최초 24웰 플레이트의 각 웰이 100% 전면성장에 이르면 배지를 제거하고 세포를 PBS로 한 번 세척하였다. PBS를 제거한 후 세포 용해 완충용액으로 교체하였다. 세포 용해 완충용액은 Laired 등(Nucleic Acids Res. 19: 4293, 1991)에서 차용하였다. 간략히 설명하면 200mM NaCl, 100mM Tris HC1 (pH 8.5), 5mM EDTA, 0.2 % SDS, 및 100 ㎍/ml 프로티나아제 K를 포함한 용해 완충용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 세 시간 내지 밤새 배양기 중에 다시 넣어 두었다. 점성이 있는 세포 용해액을 마이크로 원심분리 튜브에 옮겼다. 동일 부피의 이소프로판올을 넣어 DNA를 침전시켰다. 마이크로 원심분리기에서 10분간 돌린 후 상층액을 버리고 펠릿을 0.5ml의 70% 에탄올로 한 번 세척하였다. 에탄올 제거 후 DNA 펠릿을 공기 중에서 건조하고 35㎕의 TE 완충용액(10mM Tris pH 8 및 1mM EDTA)에 녹였다. 이를 3㎕씩 분주하여 PCR 분석에 사용하였다.
PCR 분석
AAV 입자로 형질 도입한 약물 내성 균주에서 얻은 DNA 표본을 PCR 분석을 통해 적절한 표적화를 스크리닝하였다. 이 스크리닝 전략은 약물 선별 마커를 코딩하는 DNA에 어닐링하는 한 프라이머와 AAV 표적화 입자에 존재하는 염기서열 외부인 표적화 유전자좌에 어닐링하는 프라이머를 사용한다. PCR 산물은 AAV 표적화 DNA가 내인성 게놈의 원하는 위치에 삽입된 경우에만 탐색된다.
이 AAV 입자를 이용한 단일 표적화 실험의 결과가 도 26에 제시되어 있다. 이 분석에 기초한 결과 73개의 독립적인 클론 중 5 개가 적절히 표적화된 벡터 DNA를 포함하고 있었다.
*이 방법은 도 25에 제시한 AAV 벡터, 또는 다른 적절한 아데노 바이러스 또는 아데노 연관 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 원한다면, 딘리된 콜로니에서 제2 μH쇄 대립유전자를 다른 항생제 내성 유전자 (즉, 네오마이신 내성 유전자 외의 유전자)를 가진 AAV 벡터로 형질 전환시킴으로써 달니된 콜리니들 중에서 돌연변이시킬 수 있다. 생성된 동형접합성 넉아웃 세포를 선별하기 위해 감염시킨 세포를 상응하는 항생제 존재 하에서 배양하였다. 별법으로, 단리된 콜로니를 네오마이신 내성 유전자를 가진 AAV 벡터로 형질도입하고 높은 농도의 항생제 (즉, 이형접합성 넉아웃 세포는 죽이나 동형접합성 넉아웃 세포는 죽이지 않는 항생제 농도) 존재 하에서 배양할 수도 있다.
다른 실시태양
상기 기술로부터, 본원에 기술된 발명이 다양한 용도 및 조건에 적응하기 위해서 변형 및 개질이 일어날 수 있다는 것이 명백할 것이다. 또한, 이 같은 실시태양은 하기 청구범위 내에 들어간다.
본원에서 언급된 모든 문헌은 각각의 독립적인 문헌 또는 특허 출원이 참조문헌으로 삽입된 것으로 구체적으로, 개별적으로 지시된 것과 같은 정도로 본원에 참조문헌으로 삽입되었다.
본 발명은 재배열이 일어나고 다양한 항체 분자를 발현하는 이종 (xenogenous) 항체 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함하는 유전적으로 개질된 유제류 (ungulate, 有蹄類)를 제공한다. 아울러, 본 발명은 내인성 항체 유전자의 발현이 감소 또는 제거된 유제류를 제공한다. 이들 클로닝된 트랜스제닉 유제류는 치료, 진단 및 정제 목적과 같은 용도를 가진 보충가능하고 이론적으로 무한한 이종 폴리클로날 항체, 특히 사람 항체를 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> Hematech LLC Kirin Beer Kabushiki Kaisha <120> Expression of Xenogenous (Human) Immunoglobulins in Cloned, Transgenic Ungulates <130> 50195/008KR3 <140> PCT/US01/43128 <141> 2001-11-16 <150> US 60/311,625 <151> 2001-08-09 <150> US 60/256,458 <151> 2000-12-20 <150> US 09/714,185 <151> 2000-11-17 <160> 68 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 1 agtgagataa gcagtggatg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 2 cttgtgctac tcccatcact 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 3 ggagaccacc aaaccctcca aa 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 4 gagagttgca gaaggggtyg act 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 5 accacctatg acagcgtgac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 1 5 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser 35 40 45 Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Gly Asp Ala Phe 85 90 95 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala 100 105 110 Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser 115 120 125 Asp Thr Ser 130 <210> 54 <211> 411 <212> DNA <213> Bovine <400> 54 gtggagtctg ggggaggctt ggtacagcct gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcg 60 tcaggattca ccttcaggaa ctttggcatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 120 ctggagtggg tgacagttat atggtatgac ggaagtaatc aatactatat agactccgtg 180 aagggccgat tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca tgttgtatct gcaaatgaac 240 agcctgagag ccgaggatac ggctgtgtat tactgtgcga gagatcgcaa tggcctgaag 300 tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg gtcactgtct catcagggag tgcatccgcc 360 ccaacccttt tccccctcgt ctcctgtgag aattccccgt cggatacgag c 411 <210> 55 <211> 137 <212> PRT <213> Bovine <400> 55 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu 1 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe Gly Met His Trp 20 25 30 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Val Ile Trp 35 40 45 Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 50 55 60 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn 65 70 75 80 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg 85 90 95 Asn Gly Leu Lys Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser 115 120 125 Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser 130 135 <210> 56 <211> 441 <212> DNA <213> Bovine <400> 56 accctcctca ctcactgtgc agggtcctgg gcccagtctg tgctgactca gccaccctca 60 gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgtt ctggaagcag ctccaacatc 120 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Ala Pro Ser 115 120 125 Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala 130 135 140 Thr Leu Val 145 <210> 58 <211> 459 <212> DNA <213> Bovine <400> 58 agttggaccc ctctctggct cactctcttc actctttgca taggttctgt ggtttcttct 60 gagctgactc aggaccctgc tgtgtctgtg gccttgggac agacagtcag gatcacatgc 120 caaggagaca gcctcagaag ctattatgca agctggtacc agcagaagcc aggacaagcc 180 cctgtacttg tcatctatgg taaaaacaac cggccctcag ggatcccaga ccgattctct 240 ggctccagct caggaaacac agcttccttg accatcactg gggctcaggc ggaggatgag 300 gctgactatt actgtaactc ccgggacagc agtggtaacc atgtggtatt cggcggaggg 360 accaagctga ccgtcctagg tcagcccaag gctgccccct cggtcactct gttcccaccc 420 tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc acactggtg 459 <210> 59 <211> 153 <212> PRT <213> Bovine <400> 59 Ser Trp Thr Pro Leu Trp Leu Thr Leu Phe Thr Leu Cys Ile Gly Ser 1 5 10 15 Val Val Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 20 25 30 Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 35 40 45 Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 50 55 60 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln 85 90 95 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 100 105 110 Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 115 120 125 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 130 135 140 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val 145 150 <210> 60 <211> 723 <212> DNA <213> Bovine <400> 60 atgagattcc ctgctcagct cctggggctc ctcctgctct gggtcccagg atccagtggg 60 gatgttgtgc tgacccagac tcccctctcc ctgtctatca tccctggaga gacggtctcc 120 atctcctgca agtctactca gagtctgaaa tatagtgatg gaaaaaccta tttgtactgg 180 cttcaacata aaccaggcca atcaccacag cttttgatct atgctgtttc cagccgttac 240 actggggtcc cagacaggtt cactggcagt gggtcagaaa cagatttcac acttacgatc 300 aacagtgtgc aggctgagga tgttggagtc tattactgtc ttcaaacaac atatgtccca 360 aatactttcg gccaaggaac caaggtagag atcaaaaggt ctgatgctga gccatccgtc 420 ttcctcttca aaccatctga tgagcagctg aagaccggaa ctgtctctgt cgtgtgcttg 480 gtgaatgatt tctaccccaa agatatcaat gtcaagtgga aagtggatgg ggttactcag 540 agcagcagca acttccaaaa cagtttcaca gaccaggaca gcaagaaaag cacctacagc 600 ctcagcagca tcctgacact gcccagctca gagtaccaaa gccatgacgc ctatacgtgt 660 gaggtcagcc acaagagcct gactaccacc ctcgtcaaga gcttcagtaa gaacgagtgt 720 tag 723 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 61 gatgatgtct ccaggatgcc 20 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 62 gacaagctta atatccgcag g 21 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 63 aagaagagaa aggtagaaga ccccaaggac 30 <210> 64 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 64 cctgggtata gacaggtggg tattgtgc 28 <210> 65 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 65 ggggtctaga gcagacacta cactgatggg cccttggtcc 40 <210> 66 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 66 ggggaagctt cgtgtccctg gtcctgtctg acacag 36 <210> 67 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 67 ggggctcgag gtcggcgaag gatgggggga ggtg 34 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 68 ggggggtacc gctgggctga gctgggcaga gtggg 35

Claims (60)

  1. B 세포 내에서 재배열이 일어나고, 하나 이상의 이종 Ig 분자를 발현시킬 수 있는 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 유제류 체세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 이종 항체를 코딩하는 것인 유제류 체세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 염색체 단편 내에 포함되는 유제류 체세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 염색체 단편이 ΔHAC 또는 ΔΔHAC인 유제류 체세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 유제류 세포 내에서 숙주 염색체와 독립적으로 유지되는 것인 유제류 체세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 염색체 내로 삽입되는 것인 유제류 체세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 실질적으로 사람의 것인 유제류 체세포.
  8. 제2항에 있어서, 상기 이종 항체가 다른 속의 항체인 유제류 체세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이종 항체가 사람 항체인 유제류 체세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 세포가 태아 섬유아세포인 유제류 체세포.
  11. 제1항에 있어서, 상기 세포가 B-세포인 유제류 체세포.
  12. 제1항에 있어서, 상기 유제류가 소, 양, 돼지 또는 염소인 유제류 체세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유제류가 소인 유제류 체세포.
  14. 제1항에 있어서, Ig H쇄 및(또는) L쇄를 코딩하는 핵산 중에 내인성 Ig H쇄 및(또는) L쇄의 발현을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 유제류 체세포.
  15. 제14항에 있어서, 상기 돌연변이가 넌센스 또는 결실 돌연변이인 유제류 체세포.
  16. 제14항에 있어서, 상기 세포가 B-세포인 유제류 체세포.
  17. 제11항의 세포와 골수종세포의 융합으로 형성된 하이브리도마.
  18. (a) 유전자좌 내의 핵산 세그먼트에 상기 항원에 특이적인 항체의 생산을 초래하는 재배열이 일어나는 이종 항체 유전자좌를 코딩하는 핵산을 포함하는 유제류에, 목적한 하나 이상의 항원을 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 유제류로부터 상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 항체의 생산방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 유제류가 내인성 Ig 유전자의 발현을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 핵산이 실질적으로 사람의 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 항체의 L쇄가 사람 핵산에 의해 코딩되는 것인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 항체의 H쇄가 사람 핵산에 의해 코딩되는 것인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 유제류가 소, 양, 돼지 또는 염소인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 유제류가 소인 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날인 방법.
  26. 제18항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날인 방법.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 상기 유제류의 혈청 또는 유즙으로부터 회수되는 것인 방법.
  28. 유전자좌 내의 핵산 세그먼트에 이종 항체의 생산을 일으키는 재배열이 일어나는 이종 항체 유전자좌를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 유제류로부터, 이종 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 유제류가 내인성 Ig 유전자의 발현을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 핵산이 실질적으로 사람의 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항체의 L쇄가 사람 핵산에 의해 코딩되는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 항체의 H쇄가 사람 핵산에 의해 코딩되는 것인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 유제류가 소, 양, 돼지 또는 염소인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 유제류가 소인 방법.
  35. 제28항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날인 방법.
  36. 제28항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날인 방법.
  37. 제28항에 있어서, 상기 항체가 상기 유제류의 혈청 또는 유즙으로부터 회수되는 것인 방법.
  38. (a) 재배열이 일어나고 하나 이상의 비유제류 이종 Ig 분자를 발현하는 이종 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포, 상기 세포의 염색체질 또는 상기 세포의 핵을 난자 중에 삽입하는 단계; 및
    (b) 난자 또는 배가 태아로 발생할 수 있는 조건 하에서 상기 난자 또는 상기 난자로부터 형성된 배를 숙주 유제류의 자궁 속으로 전달하는 단계
    를 포함하는, 재배열이 일어나고, 하나 이상의 이종 Ig 분자를 발현하는 이종 면역글로블린 (Ig) 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 트랜스제닉 유제류의 생산 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포가 내인성 항체 H쇄 및(또는) L쇄 핵산 중에 내인성 항체 H쇄 및(또는) L쇄의 발현을 감소시키는 제1 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 태아가 살아있는 자손으로 발생하는 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 또한 상기 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산에 상당한 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하는 핵산을 상기 세포 중으로 도입함으로써, 상기 카세트가 상기 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산의 한 내인성 대립유전자 중으로 삽입되는 단계를 포함하는 방법으로 상기 세포가 제조되는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 세포가
    (a) 제1 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 또한 상기 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산에 상당한 서열 동일성을 갖는 제1 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 카세트를 포함하는 핵산을 상기 세포 중으로 삽입함으로써, 상기 제1 카세트가 제1 트랜스제닉 세포를 생산하는 상기 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산의 제1 내인성 대립유전자 중으로 삽입되는 단계; 및
    (b) 제1 선별가능한 마커와 상이한 제2 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 또한 상기 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산에 상당한 서열 동일성을 갖는 제2 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 카세트를 포함하는 핵산을 상기 제1 트랜스제닉 세포 중으로 삽입함으로써, 상기 제2 카세트가 제2 트랜스제닉 세포를 생산하는 상기 항체 H쇄 또는 L쇄 핵산의 제2 내인성 대립유전자 중으로 삽입되는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 생산되는 것인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 추가로
    (c) 상기 배, 상기 태아, 또는 상기 태아로부터 생성된 자손으로부터 세포를 단리하는 단계;
    (d) 상기 세포 중의 내인성 항체 H쇄 및(또는) L쇄 핵산 중에 제2 돌연변이를 도입하는 단계;
    (e) 상기 세포, 상기 세포의 염색질체, 또는 상기 세포의 핵을 난자 중으로 삽입하는 단계; 및
    (f) 상기 난자 또는 상기 배가 태아로 발생할 수 있도록 하는 조건 하에서 상기 난자 또는 상기 난자로부터 형성된 배를 숙주 유제류의 자궁 속으로 전달하는 단계
    를 포함하는 방법.
  44. 제38항에 있어서, 상기 핵산이 이종 항체를 코딩하는 것인 방법.
  45. 제38항에 있어서, 상기 핵산이 염색체 단편 내에 포함되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 염색체 단편이 ΔHAC 또는 ΔΔHAC인 방법.
  47. 제38항에 있어서, 상기 핵산이 유제류 세포 중에서 숙주 염색체와 독립적으로 유지되는 것인 방법.
  48. 제38항에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 염색체 중으로 삽입되는 것인 방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 이종 항체가 다른 속의 항체인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 이종 항체가 사람 항체인 방법.
  51. 제38항에 있어서, 상기 유제류가 소, 양, 돼지 또는 염소인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 유제류가 소인 방법.
  53. 제44항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 항체인 방법.
  54. 제38항에 있어서, 상기 면역글로블린쇄 또는 항체가 혈청 및(또는) 유즙 중에서 발현되는 것인 방법.
  55. 제38항에 있어서, 상기 핵산이 실질적으로 사람의 것인 방법.
  56. 폴리클로날 사람 면역글로블린 (Ig)를 포함하는 유제류 항혈청.
  57. 폴리클로날 사람 Ig를 포함하는 유제류 유즙.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 유제류가 소, 양, 돼지 또는 염소인 유제류 항혈청 또는 유즙.
  59. 제58항에 있어서, 상기 유제류가 소인 유제류 항혈청 또는 유즙.
  60. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 Ig가 목적한 항체에 대한 것인 유제류 항혈청 또는 유즙.
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
CN1668187A (zh) * 2002-05-17 2005-09-14 赫马技术有限公司 能够产生人抗体的转基因有蹄动物
JPWO2004031385A1 (ja) 2002-10-04 2006-02-02 麒麟麦酒株式会社 ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター
BR0315300A (pt) * 2002-11-08 2005-08-30 Hematech Llc Ungulados transgênicos tendo atividade de proteìna priÈnica reduzida e seus usos
EP1660537A2 (en) 2003-08-14 2006-05-31 Dyax Corp. Endotheliase-2 ligands
CA2540667A1 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. A process for producing exogenous protein in the milk of trangenic mammals and a process for purifying proteins therefrom
US7420099B2 (en) * 2004-04-22 2008-09-02 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Transgenic animals and uses thereof
ES2679282T3 (es) * 2004-10-22 2018-08-23 Revivicor Inc. Porcinos transgénicos que carecen de cadena ligera de inmunoglobulina endógena
US20080026457A1 (en) 2004-10-22 2008-01-31 Kevin Wells Ungulates with genetically modified immune systems
US20090041783A1 (en) 2005-04-28 2009-02-12 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
ES2548377T3 (es) 2008-10-27 2015-10-16 Revivicor, Inc. Ungulados inmunodeprimidos
CN112715482B (zh) * 2008-12-18 2022-11-11 伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心 表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
PL2564695T3 (pl) 2009-07-08 2015-10-30 Kymab Ltd Modele zwierzęce i cząsteczki terapeutyczne
CN102803488A (zh) 2009-11-17 2012-11-28 协和发酵麒麟株式会社 人类人工染色体载体
CA2846322A1 (en) 2011-09-19 2013-03-28 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
IN2014CN02113A (ko) 2011-09-21 2015-05-29 Fujirebio Kk
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
JP2015502165A (ja) 2011-12-22 2015-01-22 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 発現ベクター構成、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
EP2880055B1 (en) * 2012-08-03 2017-06-28 Sab, Llc Complex chromosome engineering for production of human antibodies in transgenic animals
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
CA2925723A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2016094679A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
AU2017285224B2 (en) * 2016-06-14 2023-05-18 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
AU2017348743C1 (en) 2016-10-31 2022-03-03 National University Corporation Tottori University Human antibody–producing non-human animal and method for preparing human antibodies using same

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JPH07509137A (ja) * 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
JP4038236B2 (ja) 1993-03-16 2008-01-23 オースチン・リサーチ・インスティテュート 異種移植治療におけるブタＧａ１α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの使用
CN1054840C (zh) 1993-12-16 2000-07-26 普罗格特-甘布尔公司 制备磺化脂肪酸烷酯表面活性剂的方法
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5639940A (en) * 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
ATE390933T1 (de) 1995-04-27 2008-04-15 Amgen Fremont Inc Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8
US5683993A (en) 1995-06-22 1997-11-04 Ciba Vision Corporation Compositions and methods for stabilizing polymers
JP3030092B2 (ja) 1995-08-29 2000-04-10 麒麟麦酒株式会社 キメラ動物およびその作製法
WO1997007671A1 (fr) 1995-08-29 1997-03-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique et procede de constitution
EP0942968B1 (en) 1996-12-03 2008-02-27 Amgen Fremont Inc. Fully human antibodies that bind EGFR
TWI255853B (en) 1998-08-21 2006-06-01 Kirin Brewery Method for modifying chromosomes
AU1777301A (en) * 1999-11-19 2001-05-30 Hematech, Llc Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins
US6721750B1 (en) 2001-07-03 2004-04-13 Bellsouth Intellectual Property Corporation System and method for broadband capacity tracking

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