JP2007533328A - トランスジェニック動物及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
1890年、北里柴三郎及びEmil Behringは、驚くべき実験結果を報告した。すなわち、彼らは、免疫動物から血清を得て、それを非免疫動物に注射することにより、免疫を一方の動物から他方の動物に移すことができることを実証した。この画期的な実験によって、受動免疫法が臨床的治療法に取り入れられる基盤が築かれた。今日、受動免疫法のためにヒト免疫グロブリンを調製し使用することは、標準的な医療行為である。米国だけでも、ヒト免疫グロブリンに対して年間14億ドルの市場があり、毎年16トンを超えるヒト抗体が静注抗体療法に使用されている。産業先進国の経済にはこれに匹敵するレベルの消費が存在し、発展途上国においても需要が急速に成長すると予想され得る。現在、受動免疫のためのヒト抗体はヒトドナーの血清プールから得ている。これは、治療的及び予防的用途のために利用可能なヒト抗体の量に先天的に限界があることを意味する。既に需要は供給を上回っており、深刻な量不足が慢性化している。
細胞性プリオンタンパク質PrPCは、普遍的に発現される細胞膜グリコシルホスファチジルイノシトール結合型糖タンパク質である。このタンパク質は、伝達性海綿状脳障害、例えばウシにおけるBSE、及びヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)の発症に重要な役割を果たしている。その疾患に関連するプロテアーゼ抵抗型アイソフォームであるPrPScは、正常なPrPCをPrPScに変換する能力を有し、海綿状脳障害の発症及び伝達に必須であると考えられている。ニューロンにおけるPrPScの蓄積が致命的な神経変性に関係しているが、このタンパク質の正常な生理学的機能はまだ不明である。PrP遺伝子のコード領域に限定した破壊を有するマウスが作出されたが、これはほんのわずかな表現型の欠損を示すにすぎない。重要なことに、これらはPrPScによる感染には抵抗性があり、このことは、PrPCがプリオン病の発症に必要であることを示唆している(Prusinerら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10608-10612;Weissmannら(1994) Ann. NY Acad. Sci. 724:235-240)。
本発明者は、ウシが2つのIgM重鎖コード遺伝子を有し、その各々が発現されてVDJ再配列を受けることを見出した。さらに本発明者は、相同組換えを利用してウシ線維芽細胞においてこれらの遺伝子の各々を破壊したが、その細胞をクローニング方法において用いることにより、機能性IgMが低減した、実質的に排除された又は排除されたトランスジェニックウシを作製することができる。
本発明はまた、内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然突然変異を含むウシ又はウシ胎仔に関する。突然変異は、機能性プリオンタンパク質の発現を低減する、実質的に排除する又は排除するものであり、ヘミ接合性であっても又はホモ接合性であってもよい。さらに、ウシ又はウシ胎仔は、内因性抗体の発現を低減するさらなる突然変異を有してもよい。この突然変異は、例えば機能性IgM重鎖の発現を低減する又は実質的に排除するものでありうる。好ましくは、ウシ胎仔は受精後少なくとも30日であるが、出生までの任意の齢でありうる。好ましいウシとしては、新生ウシ、少なくとも1週齢の仔ウシであり、より好ましくは少なくとも2月齢である。
本発明は、2つの遺伝子改変(例えば突然変異又はトランスジーン若しくは人工染色体の挿入)を含む細胞の作製方法を提供する。該方法は、(a)第1遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物体細胞を準備するステップ、(b)上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくはその後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくはその後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ、(c)ステップ(b)で得られた卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚をレシピエントに移入するステップ、(d)上記胚又はそれより生じる胎仔若しくは幼若仔から細胞を単離するステップであって、該細胞が第1遺伝子改変を含有する、上記ステップ、並びに(e)ステップ(d)の細胞若しくはその後代のゲノムに第2遺伝子改変を導入し、2つの遺伝子改変を有する細胞を生成するステップを含む。
図1は、ウシ一次線維芽細胞における逐次的遺伝子ターゲティングを説明する概略図である。ホルスタイン胎仔線維芽細胞(#6939)をターゲティングし、その後、クロマチン移植系を用いてターゲティング細胞を含有するウエルを選択し、クローニングして、IgμU−/+胎仔を作製した。続いてIgμU−/+細胞系(#3287)を仔ウシの作製及びIgμUの第2アレルのターゲティングのために用いた。再度、細胞を選択し、胎仔の作製により再生した。胎仔を、IgμU−/−細胞系の作製、遺伝子発現分析、及び仔ウシの作製のために回収した。IgμU−/−細胞系(#4658)にCreリコンビナーゼ発現プラスミドをトランスフェクトし、neo遺伝子及びpuro遺伝子を同時に除去し、その後3回目のクロマチン移植を行ってクローン化胎仔及び細胞系を作製したが、これらにおいてはneo及びpuro選択マーカー遺伝子の両方が除去されていた。Creで除去したIgμU−/−線維芽細胞系の1つ(#1404)を3回目の遺伝子ターゲティングに使用して、三重ターゲティングCre/IgμU−/−/PrP−/+胎仔及び細胞系を作製した。1つの細胞系(#8334)を4回目の遺伝子ターゲティングに供して、ホモ接合性二重KO(cre/IgμU−/−/PrP−/−)胎仔及び細胞系を作製し、PrP遺伝子の発現を評価した。
概して、本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物(例えばウシ及び他の有蹄動物)、及びこれらの哺乳動物の作製方法に関する。特に本発明は、内因性IgM重鎖及び/又はプリオンタンパク質のレベルが低減したトランスジェニック有蹄動物に関する。本発明を以下にさらに詳細に説明する。
本発明は、ウシ類(例えばウシ)などの非ヒト哺乳動物において転写がサイレントな遺伝子及び転写活性を有する遺伝子を逐次的にターゲティングするための迅速な方法を提供する。より具体的には、本発明者は、最初にサイレント遺伝子であるウシ免疫グロブリンμU(IgμU)遺伝子の両方のアレルをノックアウトして、ヘテロ接合性及びホモ接合性ノックアウト仔ウシを作製するために用いた逐次的遺伝子ターゲティング系を見出した。IgμUターゲティングの後、IgμU−/−細胞系において線維芽細胞における転写活性を有する遺伝子であるウシプリオンタンパク質(PrP)遺伝子の両方のアレルを逐次的にノックアウトターゲティングし、ホモ接合性二重ノックアウト胎仔を作製した。本発明の方法を用いることにより、体細胞において遺伝子ターゲティングを逐次的に行うことができ、その結果多重アレル又は多重遺伝子非ヒト哺乳動物を作製することができる。本発明はさらに、米国特許出願公開第2003−0046722号(参照により本明細書に組み入れる)に記載されているように、各回のターゲティングの後に細胞系を再生するクローニング方法を利用する。
従って本発明者は、ウシIgM重鎖をコードする2つの遺伝子を決定した。ウシIgMをコードすると報告された最初の公開配列を図7に示す。この配列はGenBankアクセッション番号U63637(gi:1575489)として、Hammarstrom及び共同研究者により1996年に最初に公表され、その後それがImmunology (93: 581-588, 1998)に記載された。U63637は、2003年2月27日に2つ目の配列に置き換えられた(GenBankアクセッション番号U63637.2;gi:2859209;図8)。その後、Hammarstrom及び共同研究者はBos taurus重鎖定常領域をコードする3つ目の配列を登録した(GenBankアクセッション番号AY221099;gi:33413901;図9)。この3つ目の登録に関連する論文(Zhaoら(2003) J. Biol. Chem. 278:35024-35032)において、著者は、2つ目の配列と3つ目の配列には多型による相違があることを結論付けている(1つ目は撤回されている)。
本明細書に記載のように、逐次的遺伝子ターゲティングによって、健常なPrP欠損仔ウシの作出に成功した。かかる動物は、BSEの危険のないウシに由来する農業製品及び生物医学製品、例えば乳汁、ゼラチン、コラーゲン及び血清の製造のための改善された集団、並びにヒトの治療のためのヒト組換えタンパク質産生及びヒトにおける異種移植のための医療材料のための改善された供与源を提供する。本発明のウシ又はウシ胎仔は、一般的にそのような動物に農業的に由来する任意の産物を製造するために用いることができる。また、例えば米国特許出願公開第2003−0037347号、第2004−0068760号及び第2003−0056237号、又はPCT公開WO2004/044156号(全て参照により本明細書に組み入れる)に記載されている方法のいずれかによって、任意の組換えタンパク質、例えば限定されるものではないが、ヒト抗体を製造するために用いることができる。
本明細書で説明するように、本発明の方法は、非ヒト哺乳動物体細胞(有蹄動物体細胞など)への突然変異の導入を含む。好適な体細胞としては、胚、胎仔、仔動物又は成体動物に由来する細胞が含まれる。遺伝子ターゲティングに好ましい細胞としては、分化細胞、例えば線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、胎盤細胞及び筋細胞が挙げられる。好ましい細胞としてはまた、任意の器官、例えば膀胱、脳、食道、卵管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道及び子宮に由来するものが挙げられる。好ましくは、ドナー細胞、ドナー核、ドナークロマチン塊、又は再構成卵母細胞は4倍体ではない。
概して、本発明の遺伝子ターゲティング事象としては、遺伝子の不活性化、除去又は改変;遺伝子のアップレギュレーション;遺伝子置換;あるいは予め決定した遺伝子座におけるトランスジーン置換が挙げられる。ターゲティングを行って不活性化、除去又は改変を生じさせうる遺伝子の例は、ヒトに対して異種反応性の抗原(例えばα−1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ)をコードする遺伝子、抗体コード遺伝子、プリオンタンパク質の産生に寄与するPrP遺伝子座の遺伝子及び非ヒト動物におけるその正常な対応物、遺伝疾患に寄与し、その改変型、不活性型又は欠失型が動物の疾患モデルとなるヒトの遺伝子(例えば嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子)、食物不耐性又はアレルギーを引き起こす物質に寄与する遺伝子、糖タンパク質上の特定の糖残基の存在に寄与する遺伝子(例えば非ヒト動物におけるシチジンモノホスホ−N−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子)、並びに免疫グロブリン遺伝子の体細胞再配列に寄与する遺伝子(例えばRAG1及びRAG2など)である。
ターゲティング遺伝子突然変異には、目的の遺伝子におけるターゲティングアレルと相同な領域を有する核酸構築物を作製し、それにより該構築物がゲノムアレルに組み込まれてその発現を破壊することが必要である。従って、遺伝子を改変するために、3つの主要領域を含むようにターゲティングベクターを設計する。第1の領域は、ターゲティング対象の遺伝子座に相同である。第2の領域は、そのターゲティング遺伝子座の一部と特異的に置き換わるポリヌクレオチド配列(例えば抗生物質耐性タンパク質などの選択マーカーをコードする)である。第3の領域は、第1の領域と同様にターゲティング遺伝子座に相同であるが、野生型ゲノムにおいて第1の領域と隣接していない。ターゲティングベクターと所望の野生型遺伝子座との相同組換えにより、ターゲティングベクター中で相当する2つの相同性領域間の遺伝子座配列が欠失され、該配列が例えば薬剤耐性マーカーで置き換えられる。使用する各ベクターの特異性は、遺伝子ターゲティング手順のために選択される遺伝子座、及びこの方法で使用する配列にある。この手法は、全ての哺乳動物、例えば有蹄動物(ヤギ(Capra hircus)、ヒツジ(Ovis aries)、ブタ(Sus scrufa)、及びウシ類(Bos taurus又はBos indicus)など)に使用できる。上記のようなターゲティング突然変異を実施するための例示的なベクターを本明細書に記載する。他のターゲティング部位において相同組換えを行うためのベクターの構築方法は当業者に周知である。さらに、好適なベクターの構築は当業者の技術の範囲内である。
一般的に、ターゲティング細胞は通常選択マーカーを用いて同定する。しかしながら、細胞が既に選択マーカーを含有する場合には、異なる選択マーカーを含有する新たなターゲティング構築物が必要な場合もある。あるいは同じ選択マーカーを用いる場合には、薬剤濃度を上昇させる(例えば薬剤濃度を2倍にする)ことにより2回目のターゲティングにおいて細胞を選択する。
所望であれば、所望のポリペプチドをコードする異種核酸分子を、導入される突然変異の一部として内因性遺伝子に挿入してもよい。例えば、特定の種の抗体をコードする遺伝子を内因性遺伝子に導入しうる。好ましくは、例えばPCT公開WO97/07671号及びWO00/10383号(参照により本明細書に組み入れる)に開示されているものなどのヒト人工染色体をこの目的のために用いる。これらのヒト人工染色体はまた、対応の発行されている日本国特許第30300092号にも記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有し発現するヒト人工染色体の構築は、Shenら(1997) Hum. Mol. Genet. 6:1375-1382;Kuroiwaら(2000) Nature Biotechnol. 18:1086-1090;及びLoupertら(1998) Chromosome 107:255-259に開示されている。人工染色体の安定な挿入後、細胞系(例えばウシ胎仔線維芽細胞)をさらなる遺伝子ターゲティングのためのドナー細胞として用いうる。
本方法を用いて任意の数の例示的な遺伝子突然変異を哺乳動物に導入することができる。例えば、内因性有蹄動物IgJ鎖遺伝子をノックアウトして、ヒトに投与する本発明の抗体中の有蹄動物IgJ鎖の潜在的な抗原性を抑制することができる。ターゲティングベクターの構築のためには、Genbankアクセッション番号U02301に見られるウシIgJ鎖領域のcDNA配列を使用することができる。このcDNA配列をプローブとして用いて、RPC1−42(Oakland, CAのBACPAC)等のBACライブラリからウシIgJ鎖のゲノム配列を単離するか、又は任意の他の有蹄動物からJ鎖のゲノム配列を単離してもよい。さらに、ヒトJ鎖コード配列を、ヒトIgA及びIgM分子を機能性発現させるために本発明の有蹄動物に導入してもよい。ヒトJ鎖のcDNA配列は、GenBankアクセッション番号AH002836、M12759及びM12378として入手可能である。この配列は、本明細書に記載するような標準的な方法を用いて有蹄動物胎仔線維芽細胞に挿入し得る。例えば、HAC、YACベクター、BACベクター、コスミドベクター又はノックイン構築物中のヒトJ鎖核酸を、内因性有蹄動物染色体に組み込むか、又は内因性有蹄動物染色体から独立して維持させてもよい。得られたトランスジェニック有蹄動物細胞を、本明細書に記載する胚クローニング法に使用して、機能性有蹄動物J鎖の発現を低減するか又は排除する突然変異を有し、かつヒトJ鎖を発現する異種核酸を含む所望の有蹄動物を作製してもよい。
本発明者は、IgM重鎖をコードする遺伝子における1又は複数の突然変異を有する哺乳動物をクローニングするために用いることができる、哺乳動物(例えばウシなどの有蹄動物)のをクローニングするための多様な方法を既に開示している(例えば、米国特許出願公開第2002−0046722号及びPCT公開WO02/051997号参照)。これらの方法のいくつかにおいては、透過性化細胞を再プログラム培地(例えば細胞抽出物)を用いてインキュベートし、細胞からの因子の付加又は除去を可能にし、その後、透過性化細胞の細胞膜を再度封入して所望の因子を取り囲み、細胞の膜の完全性を回復する。またこれらのいくつかの方法で、核移植胚の生存子孫への発育に望ましくない遺伝子の転写を促進する可能性のある核成分(例えば転写因子)の放出を可能にする、ドナー核(例えば、単離された核又はドナー細胞内の核)のクロマチン塊への凝縮を行う。所望であれば、これらの方法のいずれかのステップを、1回以上繰り返して行ってもよいし、又は異なる再プログラム方法を連続して実施して、再プログラムの程度を増大させ、クローン化胎仔の生存率を高めてもよい。
本発明の一実施形態において、以下のようにCre/lox系を用いてマーカーを効率的に欠失し易くすることができる。ターゲティングベクターを担持する胎仔線維芽細胞を、エレクトロポレーションによってCre含有プラスミドでトランスフェクトする。GFPcre融合遺伝子を含むCreプラスミド(Gagnetenら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3326-3331)を使用することができる。これにより、Creタンパク質を含む全てのクローンの迅速な選択が可能になる。これらの細胞は、FACSソーティング、又は顕微鏡操作による緑色蛍光発光細胞の手操作による回収のいずれかにより、選択される。緑色の細胞は、活発に転写されるCreリコンビナーゼを担持し、つまり、薬剤耐性マーカーを欠失していることが期待される。Cre発現について選択した細胞をクローニングし、PCR分析によって薬剤耐性マーカーの欠失についてクローンを分析する。切除されたと判断された細胞を小さいクローンにまで増殖させ、2つに分割し、1つのアリコートを選択培地中で試験して、薬剤耐性遺伝子が確実に欠失されたことを確認する。他のアリコートは、次の回のターゲティング欠失に使用する。
有蹄動物又は有蹄動物細胞の作製のための上記方法のいずれかの好ましい実施形態において、本発明の有蹄動物を別の有蹄動物と交配させて、2以上の遺伝子改変を有する胚、胎仔又は生存子孫を作出する。好ましくは、1以上の細胞を胚、胎仔又は子孫から単離し、1以上のさらなる遺伝子改変をその単離細胞に導入する。
本発明はまた、異種抗体(例えばヒト抗体)を発現する本発明の有蹄動物を用いた抗体の製造方法を提供する。このような方法の1つでは、1以上の目的の抗原を、異種抗体遺伝子座をコードする核酸を有する本発明の有蹄動物に投与する。該遺伝子座における核酸セグメントは、再配列を経て、その抗原に特異的な抗体を生成する。その抗体を有蹄動物から回収する。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、目的の抗原と反応することが好ましい。好ましくは、抗体は有蹄動物の血清又は乳汁から回収される。
有蹄動物の例として、ウマ目(奇蹄類Perissodactyla)及びウシ目(偶蹄類Artiodactyla)のメンバー(ウシ(Bos)属のあらゆるメンバー等)が挙げられる。他の好適な有蹄動物としては、ヒツジ、オオツノヒツジ、ヤギ、バッファロー、アンテロープ、雄ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタ及びゾウが挙げられる。
一態様において、本発明は、IgM重鎖をコードする少なくとも2つの遺伝子の一方又は両方のアレルに突然変異(例えば、最初のATCコドンの後の突然変異、例としてこのコドンの10、20、50又は100塩基内の突然変異など)を有する有蹄動物細胞(例えばウシ細胞)を提供する。好ましくは、この突然変異は、機能性IgMタンパク質の発現を低減する又は実質的に排除する。好ましい実施形態において、機能性又は総IgMタンパク質の発現は、少なくとも10、20、40、60、80、90、95又は100%低減する。突然変異は、ヘミ接合性又はホモ接合性でありうる。いくつかの実施形態において、突然変異には、ポジティブセレクションマーカー(例えば抗生物質耐性遺伝子)の核酸への挿入が含まれる。好ましくは、ポジティブセレクションマーカーは、異種プロモーターに機能的に連結される。IgM重鎖をコードする遺伝子の両方のアレルに抗生物質耐性遺伝子が挿入された有蹄動物又は有蹄動物細胞に関して、各アレルは、同じ又は異なる抗生物質耐性遺伝子を含有しうる。好ましい実施形態において、ネガティブセレクションマーカー(例えばDT−A又はTk)が異種プロモーターと機能的に連結され、内因性アレルを破壊するために使用されるベクター中に存在する。突然変異は、遺伝子中に1以上のヌクレオチド(例えば連続するヌクレオチド)の欠失を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。
本発明者らは、複数の遺伝子ターゲティング事象を起こすための幅広く適用できる迅速な方法を開発した。上述したように、高効率なターゲティング系の逐次的な適用、及びクローン胎仔の作製(図1)による細胞系の再生(rejuvenation)を採用した。本発明者らは、線維芽細胞において転写的にサイレントなIgμU遺伝子をターゲティングすることを選んだ。この遺伝子を、雄ホルスタイン胎仔線維芽細胞系(#6939)中で特徴決定して、2つのアレル(図2A;表示のアレルA及びアレルB)を区別するのに使用できる多型マーカーDNA配列をKOベクター配列の外側で同定した。細胞系#6939に由来する胎仔線維芽細胞に第1のKOベクター(pBCμΔKOpuro;図2A)をエレクトロポレーションして、ピューロマイシン耐性を有する446のウエルを作製した。ウエルを14日目に分割し、細胞の半分をPCRによるスクリーニングに使用して(プライマー対;puroF2×puroR2、図2A)、正しくターゲティングされている細胞を含むウエルを同定した。初めは、6つのウエルがPCRで陽性であった。偽陽性ウエルを除外するために、全てのPCR産物を、puroF2及びpuroR2プライマーを用いた二方向配列決定分析に供した。2つのウエル(0.45%;#147、#384)が正しくターゲティングされていると同定された。配列分析により同定された多型の相違点に基づき、KOベクターをウエル#384中のアレルA及びウエル#147中のアレルBに導入した。2つのウエルの残った細胞を胚クローニングに使用して、胎仔を作製し、細胞系を再生させた。在胎40日目の妊娠率は50%であり(15/30;1レシピエントあたり2つの胚)、在胎60日目に6匹の胎仔を回収し、線維芽細胞を再度樹立した。
逐次的なターゲティングは、1又は複数の抗生物質選択マーカーを既に含む細胞系において新しく導入されたターゲティングベクターの抗生物質選択のための戦略を必要とする。最も単純な方法は、ターゲティング事象それぞれに異なる選択マーカー遺伝子を使用することである。しかし、この方法では、細胞系において実施することができるターゲティング事象の回数が制限される。別の方法は、マウス胚性幹細胞で行われているように(Abuin及びBradley(1996) Mol. Cell Biol. 16:1851-1856)、Cre−loxP組換え系を使用して選択マーカーを除去することである。本発明者らの再生IgμUターゲティング線維芽細胞では、選択マーカー遺伝子は発現されなかった。これは、線維芽細胞においてIgμU遺伝子座がサイレントであるためと考えられる。選択マーカー除去は、本発明者らのIgμU−/−線維芽細胞におけるさらなるターゲティングのために必要ではなかったが、Creリコンビナーゼ発現プラスミドでのトランスフェクションによって選択マーカーを除去する可能性を評価した。Creリコンビナーゼの一過性発現を意図したため、閉環プラスミドを使用し、抗生物質選択を培養の最初の3日間に限定した。ウシIgμU−/−細胞系#4658をトランスフェクションに使用し、選択した24のウエルを、ターゲティングアレルからの抗生物質選択遺伝子の切除についてPCRで評価した(図4A)。複数のウエルがpuro及びneo遺伝子の両方の切除の形跡を示し、1つを胎仔クローニング及び細胞系の再生のために選択した。在胎40〜50日の妊娠率は35%(21/60)であった。
第2の遺伝子を逐次的にターゲティングする可能性を評価するために、Cre切除IgμU−/−(Cre/IgμU−/−)線維芽細胞(細胞系#1404)を3回目のターゲティングに供してPrP遺伝子を破壊した。この遺伝子をまず特徴決定してKOベクター配列の外側にある多型配列を同定して、2つのアレルを区別した(図5A;表示したアレルC及びアレルD)。細胞を第3のKOベクター(pBPrP(H)KOneo、図5A)でトランスフェクトし、203のG418耐性ウエルをPCRでスクリーニングした。
実施例1〜3に記載の結果は、以下の方法を用いて得た。
IgμU定常領域遺伝子座のエキソン2周辺のウシゲノム断片を、プライマー対(5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'(配列番号1)及び5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'(配列番号2))で増幅した32P標識PCR断片をプローブとして用いて非同系ホルスタインゲノムライブラリから得た。1つのゲノムクローンを、制限マッピングでさらに分析した。エキソン2周辺の7.2kbのBglII−XhoIゲノム断片(5’側相同腕)及び2.0kbのBamHI−BglII断片(3’側相同腕)をpBluescript II SK(−)(Stratagene)にサブクローニングし、その後puro、STOPカセット(pBS302、Stratagene)及びDT−A(ジフテリアトキシンA)遺伝子を挿入した(pBCμΔKopuro)。第2のターゲティングベクターの構築のために、#6939から、プライマー対5'-GCAATAGCAAGTCCAGCCTCATCTG-3'(配列番号3)及び5'-CATCCTGTCTCTGGTGGTTTGAGGTC-3'(配列番号4)を用いてゲノムPCRを行った。BamHI−BglIIでの消化後、断片をpBCμΔKOpuroベクターの3’側の短い腕と置き換えた。配列決定により、BamHI−BglII断片が「アレルA」から増幅されたことを確認した。
ホルスタイン胎仔雄線維芽細胞を先に記載されるように培養し(Kuroiwaら、前掲)、それに、550V及び50μFにてGenePulser II(Bio-rad)を用いて30μgの各ターゲティングベクターをエレクトロポレーションした。48時間後、2週間の500μg/mlのG418又は1μg/mlのピューロマイシンの下で細胞を選択し、薬剤耐性コロニーを採取し、複製プレートに移した。ここで、一方はゲノムDNA抽出用(24ウエルプレート)、他方は胚クローニング用(48ウエルプレート)に移した。
24ウエル複製プレートから、胎仔、又は仔ウシ由来耳生検のゲノムDNAを、Puregene DNA抽出キット(GentraSystem)を用いて抽出した。IgμUターゲティングの際に生じた各相同組換え事象を同定するために、puroF2(5'-GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGC-3'、配列番号7)、puroR2(5'-ATGTACCTCCCAGCTGAGACAGAGGG-3'、配列番号8)、neoF3(5'-TTTGGTCCTGTAGTTTGCTAACACACCC-3'、配列番号9)、及びneoR3(5'-GGATCAGTGCCTATCACTCCAGGTTG-3'、配列番号10)プライマー対を使用した。PCRを98℃にて10秒間、68℃にて8分間を含む30サイクルで行った。ネガティブPCRについては、BCμf(5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'、配列番号11)及びBCμr(5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'、配列番号12)を、98℃にて10秒間、62℃にて30秒間、72℃にて1分間から構成される40サイクルのPCRに使用した。PrP遺伝子座の場合、neoF7(5'-TGTCAAAGAGACACTCCTCATTTGTCTTCC-3'、配列番号13)、neoR7(5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCC-3'、配列番号14)、puroF14(5'-TTGCTCCACCTTCCGTCTTCTGTC-3'、配列番号15)、及びpuroR14(5'-GTTGGCGCCTACCGGTGGATGTTTG-3'、配列番号16)プライマー対を使用した。PCRを、98℃にて10秒間、68℃にて5分間を含む30サイクルにて行った。ネガティブPCRについては、BPrPexF(5'-CCACATAGGCAGTTGGATCC-3'、配列番号17)、及びBPrPexR(5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3'、配列番号18)プライマー対を、98℃にて10秒間、62℃にて30秒間、72℃にて1分間から構成される40サイクルのPCRで使用した。Cre媒介型切除を検出するために、CreExF(5'-CAATAGCAAGTCCAGCCTCATCTGC-3'、配列番号19)、及びCreExR(5'-GTGGTTTCTTCGGTGGAAACAACG-3'、配列番号20)プライマー対を、98℃にて10秒間、68℃にて7分間で構成される40サイクルのPCRで使用してPCRを行った。全てのPCR産物を0.8%アガロースゲルで泳動させた。
各ターゲティングステップで相同組換えが正しく起きたかを確認するために、上記増幅したPCR産物を配列決定した。PCR産物をCHROMA SPIN−TE400カラム(BD Biosciences Clontech)に通して精製し、ACGT Inc.(Wheeling, IL)に送って配列決定した。PCRにフォワード及びリバースプライマーの両方を使用して二方向で配列決定した。各KOベクターが組み込まれたアレルを、PCR産物の配列における多型性により決定した。
クローン胎仔及び仔ウシを、先に記載されている透過性化細胞移入手順を使用して作製した(Sullivanら(2004) Biol. Reprod. 70:146-153)。in vitroで成熟させた卵母細胞を成熟の20時間後に脱核した。約50,000〜100,000の細胞を31.2UストレプトリシンO(SLO;Sigma)含有HBSS100μlに懸濁させ、37℃のH2O浴において30分間インキュベートして、正しくターゲティングされたクローンを透過性化した。
RNeasy miniキット(Qiagen)を用いて野生型(#6939)及びIgμU−/−胎仔の脾臓からRNAを抽出し、RT−PCR用のSuperScript第1鎖合成系(Invitrogen)を用いて第1鎖cDNA合成を行った。BCμf(5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'、配列番号21)及びBCμr(5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'、配列番号22)プライマーを、98℃にて10秒間、62℃にて30秒間、72℃にて1分間で構成される40サイクルのPCRに使用してPCRを行った。RNAを#4658(IgμU−/−)、#8443(IgμU−/−/PrP−/+)及びホモ接合性二重KO(IgμU−/−/PrP−/−)線維芽細胞からも抽出し、第1鎖cDNA合成を上述したように行った。PrPmF3(5'-CAAAACCTGGAGGAGGATGG-3'、配列番号23)及びPrPmR3(5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3'、配列番号24)プライマーを、98℃にて10秒間、62℃にて30秒間、72℃にて1分間の40サイクルで用いてPCRを行った。ウシα−アクチンmRNA発現の検出のために、bBAF(5'-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3'、配列番号25)及びbBAR(5'-AACCGACTGCTGTCACCTTC-3'、配列番号26)プライマーを同じPCR条件において用いた。ゲノムDNA混入の可能性を排除するために、逆転写酵素を用いないで別のRT−PCRを行った。PCR産物を0.8%アガロースゲルにおいて泳動させた。
IgμU−/−線維芽細胞の分析の間、IgμU−/−を増幅するように設計されたプライマーにより検出可能な転写産物の発現を同定した。この転写産物の内容を決定するために、RNeasy Miniキット(QIAGEN)を用いて在胎90日目で回収したIgμU−/−胎仔の脾臓から総RNAを抽出した。1マイクロリットルの総RNAを第1鎖cDNA合成(RT−PCR用のSuperScript第1鎖合成系, Invitrogen)に供した後、RT−PCRを以下に記載するように行った。使用したプライマー対は、5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'(BCμf;配列番号27)及び5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'(BCμr;配列番号28)であった。PCR反応混合物は、32.5μlの水、5μlの10XEx Taqバッファー(TAKARA)、8μlのdNTP混合物、10pmolのフォワードプライマー、10pmolのリバースプライマー、2μlの第1鎖cDNA、及び0.5μlのEx Taq(TAKARA)を含んでいた。以下の条件で反応混合物をインキュベートして35サイクルのPCRを行った。すなわち85℃にて3分間、94℃にて1分間、98℃にて10秒間、62℃にて30秒間、及び72℃にて1分間。PCR後、反応混合物を電気泳動により分析した。IgμU−/−胎仔には陽性PCR産物は無かった。しかし、別のプライマー対である5'-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3'(BCμf2;配列番号30)及び5'-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3'(BCμr2;配列番号31)をRT−PCRに使用した場合、IgμU−/−胎仔において陽性PCR産物が検出された(図10)。この矛盾の原因を決定するために、各プライマー配列をBLASTにより分析した。その結果から、BCμfプライマー配列がU63637.2に相当するウシIgμ配列に特異的であることが示された。他方で、BCμf2及びBCμr2配列は、U63637.2、及びU63637.2の多型変異体として先に報告されている別の配列AY230207と一致した。本発明者らは、U63637.2及びAY230207が、同じ遺伝子の多型変異体ではなく、ウシの異なるIgμ遺伝子であると結論付けた。本発明者らは、U63637.2のIgμ遺伝子をIgμU、そしてAY230207をIgμAYと称する。
IgμAY KOベクターを以下の通りに作製した。IgμAY遺伝子のエキソン2周辺のゲノムDNAを単離するために、5'-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3'(配列番号34)及び5'-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3'(配列番号35)(BCμ−f2及びBCμ−r2)を用いたPCRによりDNAプローブを増幅した。このプローブを用いて、#4658 IgμUホモ接合性KO細胞系由来のウシ(ホルスタイン)ゲノムλファージライブラリをスクリーニングし、83の陽性λファージクローンを同定した。これらのクローンは、無傷IgμAY遺伝子の両方のアレル、及びターゲティングIgμU遺伝子の両方のアレルを含んでいるはずである。無傷IgμAYクローンとターゲティングIgμUクローンとを区別するために、各クローンから単離したλDNAを、プライマー対BCμ−f2及びBCμ−r2を用いたPCRに供した。ターゲティングIgμU遺伝子を含むクローンの場合、エキソン2に組み込まれたKOカセットが存在するためにPCR産物は増幅されない。一方、PCR産物は無傷IgμAY遺伝子座からは増幅される。PCR産物を生成するクローンは無傷IgμAY遺伝子を含むものであるが、PCR産物を生成しないクローンはターゲティングIgμU遺伝子を含むものでなければならない。83のλファージクローンのうち、26がPCR産物を生成し、これらは無傷IgμAY遺伝子を含むクローンであることを配列決定により確認した(プライマーAYU−F2;5'-GGCTGACTCCCTACCTCCCCTACAC-3'(配列番号36))。PCR産物を生成しなかった少なくとも10の他のクローンは、配列決定(プライマーAYU−F2)で確認したところターゲティングIgμU遺伝子を含むことが証明された。上の記載から、ウシにおいて少なくとも2つのIgμ遺伝子があること、及び一方の遺伝子(IgμUと称するもの)が本発明者らのKO細胞系(#4658)において破壊されたが、他方の遺伝子(IgμAY)は無傷のままであったことが実証された(図12)。
本発明は、プリオンタンパク質発現を欠損しているウシの作製を特徴とする。PrP−/−マウスは生存能力があり健康に見えるにも関わらず、ウシ類において遺伝子をノックアウトする効果は未だに決定されていない。PrP−/−ウシ類を作製するために、上述したウシ線維芽細胞のための逐次的遺伝子ターゲティング系を利用した。雄ホルスタイン線維芽細胞(細胞系4685、同じくIgμU−/−である)を、ノックアウトベクター(pBPrP(H)KOneo)でトランスフェクトし、正しくターゲティングされた細胞をクローニングして在胎40日のPrP−/+胎仔を作製し、これらを使用してPrP−/+細胞系を樹立した。胎仔細胞系を評価してPCR遺伝子型決定により正しいターゲティングを確認した。次いで、PrP−/+細胞系を第2のノックアウトベクター(pBPrP(H)KOpuro)でトランスフェクトした後、選択及びクローニングを行ってPrP−/−胎仔及び細胞系を作製した。細胞系における正しいターゲティングを、PCR遺伝子型決定により検証した。野生型PrP+/+/IgμU−/−(細胞系5112)、ヘテロ接合性ノックアウトPrP−/+IgμU−/−(細胞系8018)、及びホモ接合性ノックアウトPrP−/−/IgμU−/−(細胞系1718)線維芽細胞を胚クローニングに使用して仔ウシを作製した(表4)。第1シリーズのクローニングでは、PrP+/+/IgμU−/−(仔ウシ347;5.9%)、PrP−/+/IgμU−/−(仔ウシ341;4.3%)及びPrP−/−/IgμU−/−(仔ウシ342;3.2%)細胞系(図15)からそれぞれ1匹ずつ仔ウシを得た。
実施例6に記載の結果は、以下の方法を採用して得た。
クロマチン移植手順を採用してクローン仔ウシを作製した。in vitro成熟卵母細胞を成熟の20時間後に脱核した。約50,000〜100,000の細胞を31.2UストレプトリシンO(SLO;Sigma)と懸濁させながら100μlのHBSS中37℃のH2O浴において30分間インキュベートすることにより、正しくターゲティングされたクローンを透過性化した。透過性化細胞を沈降させ、洗浄し、ATP生成系(1mM ATP、10mMリン酸クレアチン、及び25μg/mlクレアチンキナーゼ)を含む40μl有糸分裂抽出物と38℃にて30分間インキュベートした。インキュベーションの終了後、反応混合物を希釈し、沈降させ、洗浄した。これらの細胞を脱核した卵母細胞と融合させ、成熟化してから28時間後に5μMカルシウムイオノフォアで4分間、その後10μg/mlシクロヘキシミド及び2.5μgサイトカラシンDで5時間かけて活性化させた。活性化の後、CT胚を洗浄し、胚盤胞段階になるまでin vitroでマウス胎仔線維芽細胞と共培養した。グレード1及び2の胚盤胞を選択し、同調レシピエントに移入した。本節に記載した全ての動物に関わる作業は、Transova Genetics Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従って行った。
ホルスタイン胎仔雄線維芽細胞を培養し、30μgの各ノックアウトベクターで550V及び50μFにてGene Pulser II(Bio-Rad)を用いてエレクトロポレーションした。48時間後、500μg/mlのG418又は1μg/mlのピューロマイシンを2週間用いて細胞を選択し、薬剤耐性コロニーを採取し、複製プレートに移した。一方はゲノムDNA抽出用(24ウエルプレート)に、他方は胚クローニング用(48ウエルプレート)に移した。
ゲノムDNAを、PUREGENE DNA単離キット(Gentra SYSTEMS)及び製造元のプロトコールを用いて、PrP−/−ホモ接合性KO仔ウシの耳生検又は血液のいずれか由来の線維芽細胞から抽出した。各ゲノムDNAサンプルを、50〜100μlの10mM Tris−Cl(pH8.0)及び1mM EDTA(EDTA)に再懸濁した。プライマー対neoF7;5'-TGTCAAAGAGACACTCCTCATTTGTCTTCC-3'(配列番号44)及びneoR7;5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCC-3'(配列番号45)を第1のターゲティングアレルを検出するために、並びにpuroF14;5'-TTGCTCCACCTTCCGTCTTCTGTC-3'(配列番号46)及びpuroR14;5'-GTTGGCGCCTACCGGTGGATGTG-3'(配列番号47)を第2のターゲティングアレルを検出するために用いてPCRによる確認を行った。PCR反応混合物は、17.9μlの水、3μlの10XLA PCRバッファーII(Mg2+plus)、4.8μlのdNTP混合物、10pmolのフォワードプライマー、10pmolのリバースプライマー、2μlのゲノムDNA、及び0.3μlのLA Taqを含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートすることにより30サイクルのPCRを行った:すなわち、85℃にて3分間、94℃にて1分間、98℃にて10秒間、及び68℃にて5分間。さらに、別のPCRを行って、(i)野生型PrPアレル(以下のプライマー対を使用:BPrPex3F;5'-CCACATAGGCAGTTGGATCC-3'(配列番号48)及びBPrPex3R;5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3'(配列番号49))、並びに(ii)IgμUアレル(PrP−/−IgμU−/−仔ウシについてのみ)(以下のプライマー対を使用:BCμf;5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3'(配列番号50)及びBCμr;5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3'(配列番号51))の不在を確認した。PCR反応混合物は、17.9μlの水、3μlの10XEx Taqバッファー、4.8μlのdNTP混合物、10pmolのフォワードプライマー、10pmolのリバースプラ
イマー、2μlのゲノムDNA、及び0.3μlのEx Taqを含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートすることにより30サイクルのPCRを行った:すなわち、85℃にて3分間、94℃にて1分間、98℃にて10秒間、60〜62℃にて30秒間、及び72℃にて1分間。PCRの後、電気泳動により反応混合物を分析した。
RNeasy Miniキット(QIAGEN)を用いて生検サンプルから総RNAを抽出した。1マイクロリットルの総RNAを、第1鎖cDNA合成(RT−PCR用のSuperScript第1鎖合成系、Invitrogen)、そしてその後RT−PCRに供した。以下のプライマー対を用いてRT−PCRを行った:すなわち、5'-AAGAAGCGACCAAAACCTGG-3'(配列番号52)及び5'-GTAACGGTGCATGTTTTCACG-3'(配列番号53)。PCR反応混合物は、32.5μlの水、5μlの10XEx Taqバッファー(TAKARA)、8μlのdNTP混合物、10pmolのフォワードプライマー、10pmolのリバースプライマー、2μlの第1鎖cDNA、及び0.5μlのEx Taq(TAKARA)を含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートして35サイクルのPCRを行った:すなわち、85℃にて3分間、94℃にて1分間、98℃にて10秒間、62℃にて30秒間、及び72℃にて1分間。ウシβアクチンmRNA発現の検出のために、プライマーbBAF(5'-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3';配列番号54)及びbBAR(5'-AACCGACTGCTGTCACCTTC-3';配列番号55)を同じPCR条件下で使用した。ゲノムDNA混入の可能性を排除するために、逆転写酵素を用いないで別のRT−PCR反応セットを行った。PCRの後、電気泳動により反応混合物を分析した。PrP−/−仔ウシ又はPrP−/−IgμU−/−KO仔ウシから調製されたどの生検サンプルにも陽性PCR産物は無かった。この結果は、仔ウシにおけるプリオン遺伝子発現の完全な不在を実証している。
生存仔ウシの生検若しくは血液サンプル又は死滅仔ウシの脳サンプルから、総タンパク質を抽出し、Bio−Radタンパク質アッセイ試薬を用いてタンパク質含量を定量した。約75μgのタンパク質サンプルを、12%SDS PAGEゲルにおいて非還元条件下で泳動させてウェスタンブロット分析を行った。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、抗ウシプリオンタンパク質モノクローナル抗体(F89/160.1.5;Alexis Biochemicals)を一次抗体として用いて膜を染色し、マウスIgG(H+L)に対するペルオキシダーゼ標識されたアフィニティ精製抗体で二次的に染色した。染色した膜を、ECL plusウェスタンブロッティング検出システム(Amersham Bioscience)を用いて現像し、フィルム現像機によりBiomax露光(light)フィルムに露光した。陽性コントロールとして、組換えウシPrPタンパク質(Alexis Biochemicals)を使用した。陰性コントロールとして、マウス線維芽細胞由来タンパク質抽出物を分析した。内部陽性コントロールとして、同じブロットを抗CDC2モノクローナル抗体で同様に染色した。PrP−/−仔ウシ又はPrP−/−IgμU−/−KO仔ウシから調製されたどの生検サンプルにおいてもプリオンタンパク質バンドは検出されなかった。この結果は、仔ウシにおけるプリオンタンパク質発現の完全な不在を実証した。
pBCμAYKObsrベクターでのIgμU−/−PrP−/−細胞系8454のトランスフェクションを、以下の標準エレクトロポレーションプロトコールを用いて行った。ウシ胎仔線維芽細胞を培養するために使用した培地は、500mlαMEM(Gibco, 12561-049)、50mlウシ胎仔血清(Hy-Clone #ABL13080)、5mlペニシリン−ストレプトマイシン(SIGMA)、及び1ml 2−メルカプトエタノール(Gibco/BRL #21985-023)を含んでいた。トランスフェクションの前日、細胞をT175組織培養フラスコに80〜100%の密集度(顕微鏡検査で判断)で播種した。トランスフェクション当日、約107のウシ線維芽細胞をトリプシン処理し、αMEM培地で1回洗浄した。800μlのαMEMへの細胞の再懸濁の後、1mMスペルミジン含有HEPES緩衝化生理食塩水(HBS)に溶解した30μgのSrfI消化KOベクター(pBCμAYKObsrベクター)を、細胞懸濁液に添加し、ピペッティングによりよく混ぜた。細胞−DNA懸濁液をエレクトロポレーションキュベットに移し、550V及び50μFにてエレクトロポレーションを行った。その後、エレクトロポレーションした細胞を、血清を添加したαMEM培地の入った30枚の48ウエルプレート上に播いた。48時間の培養後、培地を10μg/mlのブラスチシジンを含む培地と置き換え、細胞を2〜3週間培養して、ブラスチシジン耐性細胞を選択した。選択後、100%に近い密集度に達した全てのコロニーを、2つの複製プレート(24ウエル及び48ウエルプレート)に分けた。すなわち、一方はゲノムDNA抽出用、他方のプレートは核移植用とした。コロニーからゲノムDNAを抽出して、PCRにより所望の相同組換え事象についてスクリーニングした。
IgμAY−/−IgμU−/−PrP−/−ホモ接合性三重KO仔ウシから採取した血液サンプルから、総タンパク質を抽出し、Bio−Radタンパク質アッセイ試薬を用いてタンパク質含量を定量した。約75μgのタンパク質サンプルを12%SDSpageゲルにおいて非還元条件下で泳動させることにより、ウェスタンブロット分析を行った。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、抗ウシプリオンタンパク質モノクローナル抗体(F 89/160.1.5,Alexis Biochemicals製)を一次抗体として、その後マウスIgG(H+L)に対するペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製二次抗体で膜を染色した。染色した膜を、ECL plusウェスタンブロッティング検出系(Amersham Bioscience)を用いて現像し、フィルム現像機によりBiomax露光フィルムに露光した。陽性コントロールとして、組換えウシPrPタンパク質(Alexis Biochemicals)を使用した。陰性コントロールとして、マウス線維芽細胞由来のタンパク質抽出物を使用した。
IgμAY−/−IgμU−/−PrP−/−ホモ接合性三重KO仔ウシがIgMタンパク質を欠損することを確認するため、フローサイトメトリー分析を以下に記載するように行った。末梢血液を新生仔ウシから頸静脈穿刺によりヘパリン添加チューブに回収した。RBC溶解バッファー(Sigma, St. Louis, MO)を用いた赤血球溶解によりヘパリン添加血液から全白血球(ロイコサイト(leukocytes))を回収し、滅菌ハンクス平衡塩溶液(HBSS)(Sigma, St. Louis, MO)で2回洗浄した。細胞をFACS染色培地(4%ウマ血清又はヤギ血清、2mM EDTA、及び0.2%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水)に再懸濁し、非特異的結合をブロックするために室温にて30分間インキュベートした。ヒツジ抗ウシIgM−FITC(Bethyl Laboratories, Mongomery, TX)又はロバ抗ヒツジ/ウシIg−ビオチン抗体(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)、その後ストレプトアビジン−FITC又はストレプトアビジン−PE二次抗体(Caltag Laboratories, Burlingame, CA)を使用してB細胞上のウシ表面IgM(sIgM)を標識化した。発達中のウシB細胞上の表面B220マーカーを標識化するために、マウス抗ウシB220(CD45R)抗体クローンGS5A(VMRD, Pullman, WA)、その後抗マウスIgG1−PE二次抗体(Caltag Laboratories, Burlingame, CA)を使用した。Serotec Inc.(Raleigh, NC)から得たマウス抗ウシCD21クローンMCA1424及びマウス抗反すう類CD43クローン1096の抗体、その後抗マウスIgG1−PE二次抗体(Caltag Laboratories, Burlingame, CA)を使用して、ウシB細胞上の表面CD21及びCD43マーカーを標識化した。106細胞(WBC)含有FACS染色培地を含む50マイクロリットルの細胞懸濁液を単独で又はV字底マイクロタイターウエル又はチューブと組合せて、各表面マーカー抗体での染色に使用した。細胞を一次抗体と室温暗所にて20〜30分間インキュベートし、FACS洗浄バッファー(2mM EDTA及び0.2%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水)で遠心分離により2回洗浄した。細胞を50μlのFACS染色培地にもう一度再懸濁し、適切な蛍光標識二次抗体と15〜20分間室温暗所にてインキュベートした。最後に、細胞をFACS洗浄バッファーで2回洗浄し、2〜4%ホルムアルデヒド含有PBSで固定した。次いで、表面標識された固定細胞を分析し、FACScanフローサイトメーター(BD Biosciences, San Diego, CA)でデータを取得した。リストモードファイルデータを単色又は二色プロファイル用のWinMDIソフトウェアを用いて最終的に分析した。FACSの結果は、ホモ接合性三重KO仔ウシにおけるあらゆる発達中のB細胞の完全な不在を実証した。
IgMレベルが低減した動物の用途の1つは、異種抗体の作製である。異種抗体の作製方法の1つは、抗体重鎖及び/又は軽鎖を発現する1以上のヒト人工染色体を有する動物を作製することである。このために、ΔΔHAC(λHAC)及びκHACをミクロセル媒介型染色体移入法(MMCT)(Kuroiwaら(2000) Nature Biotech. 18:1086-1090)を用いてDT40細胞ハイブリッドからチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に移した。λHAC(「ΔΔC10クローン」)を含むCHOクローンを、10%FBS(Gibco)、1mg/mlのG418、及び0.2mg/mlのハイグロマイシンBを添加したF12(Gibco)培地中で37℃及び5%CO2にて培養した。ΔΔC10クローンを12のT25フラスコまで増殖させた。密集度が80〜90%に到達したら、コルセミド(Sigma)を0.1μg/mlの最終濃度となるよう培地に添加した。3日後、培地を、10μg/mlのサイトカラシンB(Sigma)を添加したDMEM(Gibco)と交換した。フラスコを8,000rpmにて60分間遠心分離してミクロセルを回収した。ミクロセルを8μm、5μm及び3μmフィルター(Costar)を通して精製し、その後DMEM培地に再懸濁させた。以下に記載するように、ミクロセルをウシ線維芽細胞との融合に使用した。
HAC/IgμAY−/−/IgμU−/−胎仔が、IgM、IgG、Igλ及びIgκ等のヒト免疫グロブリンを発現できるか否かを検証するため、在胎180日のHAC/IgμAY−/−/IgμU−/−胎仔を回収した。RNeasy Miniキット(QIAGEN)を用いて総RNAを脾臓から抽出した。1マイクロリットルの総RNAを第1鎖cDNA合成(RT−PCR用のSuperScript第1鎖合成系, Invitrogen)、その後RT−PCRに供した。ヒトIgM発現を検出するため、以下のプライマー対を用いてRT−PCR反応を行った;すなわち、5'-AGGCCAGCATCTGCGAGGAT-3'(CH3−F3;配列番号64)及び5'-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3'(CH4−R2;配列番号65)。ヒトIgG発現のために、プライマー5'-CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'(配列番号66)、5'-CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3'(配列番号67)、5'-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3'(配列番号68)、5'-CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3'(配列番号69)、5'-GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'、5'-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3'(配列番号70)、及び5'-CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'(配列番号71)(VH All Mix)を、5'-CACCACGCTGCTGAGGGAGTAGAGT-3'(hCg1R2;配列番号72)と組み合わせて使用した。ヒトIgλ発現のために、以下のプライマー対を使用した:すなわち、5'-TCCTCTGAGGAGCTTCAAGC-3'(hCL−F2;配列番号73)及び5'-AGGGTTTATTGAGTGCAGGG-3'(hCL−R2;配列番号74)。PCR反応混合物は、32.5μlの水、5μlの10XEx Taqバッファー(TAKARA)、8μlのdNTP混合物、10pmolのフォワードプライマー、10pmolのリバースプライマー、2μlの第1鎖cDNA、及び0.5μlのEx Taq(TAKARA)を含んでいた。反応混合物を以下の条件下でインキュベートすることにより35サイクルのPCRを行った:すなわち、85℃にて3分間、94℃にて1分間、98℃にて10秒間、60〜62℃にて30秒間、及び72℃にて1分間。PCR後、反応混合物を電気泳動により分析した。λHAC/IgμAY−/−/IgμU−/−胎仔から、RT−PCRによりヒトIgM、IgG及びIgλ発現が検出された。
本明細書で引用した全ての文献及び特許は、個々の文献又は特許を具体的かつ個々に参照により組み入れられると記載するのと同等に参照により本明細書に組み入れられる。本発明を、明確に理解してもらうために例示及び実施例によりある程度詳細に説明したが、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の思想又は範囲から逸脱することなくそれに対して特定の変更及び改変を行うことができることは当業者であれば容易に理解できるであろう。
Claims (84)
- IgM重鎖をコードする2つの遺伝子の突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物。
- 少なくとも1つの突然変異がヘミ接合性突然変異である、請求項1記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 両方の突然変異がヘミ接合性突然変異である、請求項2記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 少なくとも1つの突然変異がホモ接合性突然変異である、請求項1記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 両方の突然変異がホモ接合性突然変異である、請求項4記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 有蹄動物が機能性IgM重鎖を欠損する、請求項5記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 少なくとも1つの突然変異が外因性配列の挿入によるものである、請求項1記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 対照有蹄動物と比較して10%未満の内因性IgM重鎖を産生し、かつIgM重鎖をコードする遺伝子の突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物。
- 突然変異が機能性IgM重鎖の発現を実質的に排除する、請求項8記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 有蹄動物がウシであり、遺伝子がIgμUである、請求項9記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 有蹄動物がウシであり、遺伝子がIgμAYである、請求項9記載のトランスジェニック有蹄動物。
- PrPのホモ接合性突然変異を含む、請求項1記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 再配列を経て異種免疫グロブリンを発現する異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする核酸をさらに含む、請求項1記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 異種免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項13記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 核酸が染色体断片内に含まれる、請求項13記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 染色体断片がΔHAC、ΔΔHAC又はκHACである、請求項15記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 安定に移植されたヒト造血幹細胞をさらに含む、請求項1記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 安定に移植されたイヌ、ネコ、マウス又は非ヒト霊長類の造血幹細胞をさらに含む、請求項1記載のトランスジェニック有蹄動物。
- IgM重鎖をコードする2つの遺伝子の突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニック有蹄動物体細胞。
- 少なくとも1つの突然変異がヘミ接合性突然変異である、請求項19記載の細胞。
- 細胞がウシ細胞であり、2つの遺伝子がIgμU及びIgμAYである、請求項19記載の細胞。
- IgμAYのヘミ接合性突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニックウシ体細胞。
- IgμAYのホモ接合性突然変異を含むゲノムを有するトランスジェニックウシ体細胞。
- 再配列を経て異種免疫グロブリンを発現する異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする核酸をさらに含む、請求項23記載の細胞。
- 異種免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項24記載の細胞。
- 核酸が染色体断片内に含まれる、請求項24記載の細胞。
- 染色体断片がΔHAC、ΔΔHAC又はκHACである、請求項26記載の細胞。
- 線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、B細胞、T細胞、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、胎盤細胞及び表皮細胞から選択される、請求項19記載の細胞。
- PrPのホモ接合性突然変異をさらに含む、請求項19記載の細胞。
- 異種抗体の製造方法であって、以下のステップ:
(a)請求項19記載のトランスジェニック有蹄動物であって、再配列を経て異種免疫グロブリンを発現する異種免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部をコードする核酸をさらに含む有蹄動物を準備するステップ;
(b)上記有蹄動物に1又は複数の目的抗原を投与するステップ;及び
(c)上記有蹄動物から異種抗体を回収するステップ
を含む方法。 - 異種抗体がヒト抗体を含む、請求項30記載の方法。
- 有蹄動物において異種抗体を作製する方法であって、以下のステップ:
(a)請求項19記載のトランスジェニック有蹄動物であって、移植された異種造血幹細胞をさらに含む有蹄動物を準備するステップ;及び
(b)上記有蹄動物から異種抗体を回収するステップ
を含む方法。 - 異種抗体がヒト抗体を含む、請求項32記載の方法。
- 異種造血幹細胞を増殖させる方法であって、以下のステップ:
(a)請求項19記載のトランスジェニック有蹄動物であって、移植された異種造血幹細胞をさらに含む有蹄動物を準備するステップ;及び
(b)上記トランスジェニック有蹄動物において上記異種造血幹細胞を増殖させるステップ
を含む方法。 - (c)上記トランスジェニック有蹄動物からステップ(b)の増殖した造血幹細胞を回収するステップをさらに含む、請求項34記載の方法。
- 所望の組織又は器官をin vivoにおいて維持する方法であって、以下のステップ:
(a)請求項19記載のトランスジェニック有蹄動物を準備するステップ;
(b)上記トランスジェニック有蹄動物に所望の同種又は異種の組織又は器官を移植するステップ;及び
(c)上記有蹄動物において上記組織又は器官を維持するステップ
を含む方法。 - 組織が皮膚、心臓、肺、膵臓、肝臓又は腎臓組織を含む、請求項36記載の方法。
- 内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然突然変異を含むウシ又はウシ胎仔。
- 突然変異が機能性プリオンタンパク質の発現を低減する、請求項38記載のウシ又はウシ胎仔。
- 突然変異が機能性プリオンタンパク質の発現を実質的に排除する、請求項38記載のウシ又はウシ胎仔。
- 突然変異がヘミ接合性である、請求項38記載のウシ又はウシ胎仔。
- 突然変異がホモ接合性である、請求項38記載のウシ又はウシ胎仔。
- 内因性抗体の発現を低減する突然変異をさらに含む、請求項38記載のウシ又はウシ胎仔。
- 突然変異が機能性IgM重鎖の発現を低減する、請求項43記載のウシ又はウシ胎仔。
- 突然変異が機能性IgM重鎖の発現を実質的に排除する、請求項43記載のウシ又はウシ胎仔。
- ウシ胎仔が受精後少なくとも30日である、請求項38記載のウシ又はウシ胎仔。
- ウシが新生ウシである、請求項38記載のウシ又はウシ胎仔。
- ウシが少なくとも1週齢である、請求項38記載のウシ又はウシ胎仔。
- ウシが少なくとも2月齢である、請求項48記載のウシ又はウシ胎仔。
- 請求項38記載のウシ又はウシ胎仔により産生される産物。
- 乳汁、ゼラチン、コラーゲン又は血清である、請求項50記載の産物。
- 組換えタンパク質である、請求項50記載の産物。
- プリオンタンパク質を実質的に欠損する産物の製造方法であって、内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然突然変異を含むウシ又はウシ胎仔において該産物を製造する、あるいは該ウシ又はウシ胎仔から該産物を得ることを含む方法。
- 産物が乳汁、ゼラチン、コラーゲン又は血清である、請求項53記載の方法。
- 産物が組換えタンパク質である、請求項53記載の方法。
- 2つの遺伝子改変を含む細胞の作製方法であって、以下のステップ:
(a)第1遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物体細胞を準備するステップ;
(b)上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくはその後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくはその後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ;
(c)ステップ(b)で得られた卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚をレシピエントに移入するステップ;
(d)上記胚又はそれより生じる胎仔若しくは幼若仔から細胞を単離するステップであって、該細胞が第1遺伝子改変を含有する、上記ステップ;並びに
(e)上記細胞若しくはその後代のゲノムに第2遺伝子改変を導入し、2つの遺伝子改変を含む細胞を生成するステップ
を含む方法。 - 第1遺伝子改変又は第2遺伝子改変が突然変異を含む、請求項56記載の方法。
- 第1遺伝子改変が第1突然変異を含み、第2遺伝子改変が第2突然変異を含む、請求項57記載の方法。
- 第1突然変異が内因性遺伝子の第1アレル内にあり、第2突然変異が内因性遺伝子の第2アレル内にある、請求項58記載の方法。
- 第1突然変異が第1内因性遺伝子の第1アレル内にあり、第2突然変異が第2内因性遺伝子の第1アレル内にある、請求項58記載の方法。
- 第1遺伝子改変又は第2遺伝子改変が人工染色体を含む、請求項56記載の方法。
- 人工染色体が抗体をコードする、請求項61記載の方法。
- ステップ(e)で得られた細胞又はその後代を用いて開始し、上記方法を1回又はそれ以上繰り返して行い、さらなる遺伝子改変を導入するステップをさらに含む、請求項56記載の方法。
- ステップ(a)における体細胞が胎仔細胞又は成体細胞である、請求項56記載の方法。
- 胎仔又は成体細胞が、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球又は筋細胞からなる群より選択される、請求項64記載の方法。
- 2つの遺伝子改変を含む非ヒト哺乳動物の作製方法であって、以下のステップ:
(a)請求項56記載の方法により得られた細胞又はその後代を準備するステップ;
(b)上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくは該後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくは該後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ;並びに
(c)上記卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚を、該卵母細胞又は該胚が哺乳動物に発育可能な条件下でレシピエントに移入し、それにより2つの遺伝子改変を含む哺乳動物を作製するステップ
を含む方法。 - 哺乳動物が有蹄動物である、請求項66記載の方法。
- 有蹄動物がウシである、請求項67記載の方法。
- 2つの遺伝子改変を含む細胞の作製方法であって、以下のステップ:
(a)第1遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物体細胞を準備するステップ;
(b)上記哺乳動物体細胞を、クロマチン凝縮が可能な条件下にて透過性化処理するステップ;
(c)上記透過性化細胞を有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ;
(d)ステップ(c)から得られた卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚をレシピエントに移入するステップ;
(e)上記胚又はそれより生じる胎仔若しくは幼若仔から細胞を単離するステップであって、該細胞が上記遺伝子改変を含有する、上記ステップ;並びに
(f)上記細胞若しくはその後代のゲノムに第2遺伝子改変を導入し、それにより2つの遺伝子改変を含む細胞を作製するステップ
を含む方法。 - 第1遺伝子改変又は第2遺伝子改変が突然変異を含む、請求項69記載の方法。
- 第1遺伝子改変が第1突然変異を含み、第2遺伝子改変が第2突然変異を含む、請求項70記載の方法。
- 第1突然変異が内因性遺伝子の第1アレル内にあり、第2突然変異が内因性遺伝子の第2アレル内にある、請求項71記載の方法。
- 第1突然変異が第1内因性遺伝子の第1アレル内にあり、第2突然変異が第2内因性遺伝子の第1アレル内にある、請求項71記載の方法。
- 第1遺伝子改変又は第2遺伝子改変が人工染色体を含む、請求項69記載の方法。
- 人工染色体が抗体をコードする、請求項74記載の方法。
- ステップ(e)で得られた細胞又はその後代を用いて開始し、上記方法を1回又はそれ以上繰り返し、それによりさらなる遺伝子改変を導入するステップをさらに含む、請求項69記載の方法。
- ステップ(a)における体細胞が胎仔細胞又は成体細胞である、請求項69記載の方法。
- 胎仔又は成体細胞が、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球又は筋細胞からなる群より選択される、請求項77記載の方法。
- 2つの遺伝子改変を含む非ヒト哺乳動物の作製方法であって、以下のステップ:
(a)請求項69記載の方法により得られた細胞又はその後代を準備するステップ;
(b)上記細胞若しくはその後代、該細胞若しくは該後代由来のクロマチン塊、又は該細胞若しくは該後代由来の核を、有核若しくは脱核卵母細胞に挿入するステップ;並びに
(c)上記卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚を、該卵母細胞又は該胚が哺乳動物に発育可能な条件下でレシピエントに移入し、2つの遺伝子改変を含む哺乳動物を作製するステップ
を含む方法。 - 哺乳動物が有蹄動物である、請求項79記載の方法。
- 有蹄動物がウシである、請求項80記載の方法。
- 請求項56記載の方法から得られた細胞を用いて作製される非ヒト哺乳動物。
- 有蹄動物である、請求項84記載の哺乳動物。
- ウシである、請求項83記載の哺乳動物。
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