DE69934914T2

DE69934914T2 - Verfahren zur rekonstruktion eines nicht-menschlichen tierischen embryos mittels kerntransfer und die herstellung des tieres daraus.

Info

Publication number: DE69934914T2
Application number: DE69934914T
Authority: DE
Inventors: Pasqualino Loi; Pietro Cappai
Original assignee: Istituto Zootecnico e Caseario per la Sardegna
Current assignee: Istituto Zootecnico e Caseario per la Sardegna
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2019-06-05
Also published as: AU4389699A; DE69934914D1; WO2000074477A1; US7064245B1; EP1191840B1; IL146829A0; EP1191840A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Erzeugung von Tieren, ausgeführt durch die Rekonstruktion der relevanten tierischen Embryonen durch Zellkernübertragung, enthaltend, aber nicht beschränkt auf die Erzeugung von genetisch selektierten und genetisch modifizierten Tieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Einführung
Das Klonen durch Zellkernübertragung ist ein klassisches Beispiel, wie experimentielle Modelle, die für die Grundlagenforschung gestaltet wurden, nachfolgend durch angewandte Forschung übernommen wurden.
Tatsächlich wurde die Übertragung einer differenzierten Zelle in kernlose Oozyten zuerst in Spemann (Spemann H., Embryonic Development und Induction. Hafner Publishing Company, New York, 1938: 210-211) angeregt, um zu sehen, ob die Totipotentialiät eines Zellkerns von einer differenzierten Zelle während der Entwicklung beschränkt wird. Eine große Anzahl von Schriftstücken stammte von jener Anregung und gipfelte in der Arbeit von Briggs und King (Briggs und King, PNAS 1952, 38: 455-461), wo sich aus dem Darmepithel entnommene Zellkerne, die in kernlose Xenopus-Eier übertragen wurden, zu lebensfähi gen genetisch identischen Tieren, korrekt ausgedrückt, einem Klon, entwickelten.
Technische Beschränkungen beschränkten über 30 Jahre die Zellkernübertragung auf die Amphybien, bevor ein grundlegendes Schriftstück von McGrath und Solter (McGrath und Solter, Science 1983, 220: 1300-1302) die moderne Entwicklung beim Säugetierklonen auslöste. Diese neue Aera in der Zellkerntransplantation erhielt weiteren Auftrieb durch ihre Verwendung zum Klonen von Embryos von Haustierarten, als Zellkerne von Blastomeren, die von 16-Zellen-Stadium-Schafembryonen genommen wurden, in der Lage waren, um eine vollständige Entwicklung bis zu normalen Lämmern nach einer Übertragung in kernlose Oozyten zu unterstützen (Willadsen S., Nature 1986, 320: 63-65). Seit dieser Artikel veröffentlicht wurde, begannen viele Embryologisten sich auf Zellkernübertragung zu konzentrieren und machten sich einige private Firmen zur kommerziellen Anwendung des Embryoklonens in der Rinderindustrie auf den Weg.
2. Beschreibung des Verfahrens zur Zellkernübertragung
Als ein Ergebnis der in diesen Jahren erbrachten Anstrengungen wurde das folgende Verfahren zum Rekonstruieren eines tierischen Embryos durch Zellkernübertragung entwickelt.
a. Individualisierung einer Rezipientenzelle
Metaphase-II-Oozyten werden allgemein als ein Rezipientenzytoblast zur Zellkernübertragung verwendet, insbesondere, wenn das Verfahren an Huftieren ausgeführt wird. Jedoch können auch fertilisierte Einzellen-Zygoten, bei denen beide Pronuklei entfernt wurden, grundsätzlich ebenfalls verwendet werden.
Wenn das frühere Verfahren angewandt wird, werden die Oozyten, die in vitro oder in vivo gealtert werden können und üblicherweise nach dem Auftreten des ersten polaren Körpers aufgenommen werden, in Hepes-gebuffertem Medium gehalten, das Cytocha lasin B enthält, einem Inhibitor von Microfilamenten, der der Oolemma die Plastizität verleiht, die für die weitere Manipulation erforderlich ist, der sie nachfolgend ausgesetzt werden.
b. Enukleation der Rezipientenzelle
Die so individualisierten Oozyten sind tatsächlich üblicherweise vor der Übertragung des Zellkerns von der Donatorzelle entkernt.
Bei der Mehrheit von wirtschaftlich wichtigen Tieren ovulieren die Oozyten in der Metaphase der zweiten meiotischen Teilung, wobei die 2. Chromatiden in einer Metaphasenspindel unter dem ersten polaren Körper angeordnet sind. Der hohe Anteil von Lipiden macht das Schafzytoplasma ziemlich dunkel, womit die Lokalisation der Chromosomen im Gegensatz zu anderen Tierarten, wie Maus und Hase, unmöglich gemacht wird.
Aus diesem Grund wurde die Entkernung ursprünglich mit einer angeschrägten Pipette durch blindlings Einziehen eines Teiles des Zytoplasmas unter dem ersten polarten Körper ausgeführt. Da ziemlich oft die Metaphasenspindel unter die Oozytenrinde wandert, insbesondere bei gealterten Oozyten, war die Entkernung nur in 70-75 % der Fälle erfolgreich. Die Einführung der Vitalfärbung Hoechst 33342, die reversibel an DNA bindet (Tsunoda et al., J. Reprod Fertil 1988, 82: 173-177) gestattet die präzise Lokalisierung der Chromosomen nach einer UV-Belichtung und wird bei der Zellkernübertragung weitestgehend verwendet.
c. Identifikation einer Donatorzelle
Vollständig oder teilweise differenzierte Zellen oder auch eine undifferenzierte Zelle können/kann als eine Donatorzelle (das sogenannte "Karyoplast": Blastomere von einem frühen Em bryo oder somatischen Zellen) verwendet werden. Eine solche Donatorzelle kann sowohl in vitro kultiviert als auch ex vivo abstrahiert werden, vorausgesetzt, dass sie jedoch einen normalen Inhalt von DNA hat und karyotypisch normal ist. Bevorzugter werden Zellen in G0- oder G1-Phase verwendet, da es tatsächlich das einzige Zellzyklusstadium ist, das nach der Embryorekonstruktion eine korrepte Ploidie garantiert (Campbell et al., Rev of Reprod 1996, 1: 40-46). Keine Entwicklung eines Embryos wurde jemals erhalten, wenn als Donatorzelle nicht lebende Zellen verwendet wurden.
d. Mögliche genetische Monifikation des Chromatins der Donatorzelle
Der Zellkern der Donatorzelle kann vor der Übertragung in die Rezipiententenzelle genetisch modifiziert werden, um transgene Tiere zu erhalten. Die Bezeichnung "transgen" deckt nicht nur das Tier ab, das wenigstens ein Gen von einer anderen Tierart in seiner somatischen und Keimlinie hat, sondern jegliches Tier, dessen Keimlinie einem technischen Eingriff durch rekombinante DNA-Technologie unterzogen wird.
e. Zellkernübertragung von der Donatorzelle zu der Rezipientenzelle
Der Zellkern einer solchen Donatorzelle wird daher in die Rezipientenzelle übertragen. Eine solche Übertragung kann durch zwei verschiedene Verfahren ausgeführt werden: i) Zellfusion und ii) Zellkerninjektion. Gemäß dem ersteren Verfahren, welches das am üblichsten eingesetzte für Zellkerne von großer Dimension ist, wird die Donatorzelle dann durch dieselbe Entkernungspipette, die für das Endkernen der Rezipientenzelle verwendet wird, in den relevanten perivitellinen Raum eingesetzt. Der rekonstruierte Embryo wird dann in einer Fusionskammer zwischen zwei Platindrähten angeordnet, deren Zwischenraum mit Fusionsmedium gefüllt ist (0,3 M Mannitol mit 0,050 mM CaCl₂ und 0,100 mM MgSO₄). Die Zellfusion wird durch einen oder mehrere elektrische Impulse von Gleichstrom ausgelöst, der senkrecht zu den zwei Fusionspartnern angewandt wird. Die Frequenz der Fusion ist proportional bezüglich des Kontaktbereiches zwischen Zytoblast und Karyoplast und sie ist üblicherweise in dem Fall von Blastomeren hoch, wird aber in dem Fall von kleinen fötalen oder somatischen Zellen merklich kleiner. Der elektrische Impuls öffnet temporär Poren in den benachbarten Membranen und die zytoblasmische Kommunikation, die zwischen Karyoplast und Zytoblast gebildet wird, startet den Fusionsprozess, der üblicherweise innerhalb einer Stunde abgeschlossen ist; zwischenzeitlich induziert ein Zustrom von extrazellulären Kalziumionen die Aktivierung der Oozyte (Sun et al., Development 1991, 115: 947-956).
Gemäß dem Verfahren, das zum Punkt ii) oben berichtet wurde, wird die Zellkernübertragung durch Mikroinjektion des Donatorzellkerns mit einem Verfahren ausgeführt, das mehr verwendet wird, wenn kleine Zellen zu übertragen sind. Die abschließende Behandlung des Prozesses ist jedoch dieselbe wie die Übertragung, die durch Zellfusion ausgeführt wird, mit minimaler Modifikation (Collas P und Banes FL., Mol Reprod Dev 1994, 38: 264-267; Wakayama et al., Nature 1998, 394: 374).
f. Übertragung des Embryos in ein Rezipiententier
Die erfolgreich fusionierten Couplets oder mikroinjizierten Oozyten werden in Agarchips eingebettet und in das Ovidukt eines temporären Rezipiententiers übertragen. Das Einbetten ist eine notwendige Prozedur, die die Embryonen vor immunokompetenten Zellen schützt, die in den oviduktalen Lumen vorhanden sind.
Nach sieben Tagen werden die Ovidukte ausgespült, und jene Embryonen, die sich zu Blastozysten oder Morulaen entwickelt haben, werden aus dem Agar freigelegt und zu synchronen Rezipienten zur fristgerechten Entwicklung übertragen.
3. Technisches Problem
Ungeachtet der Bemühungen, die von vielen Laboratorien vorgenommen werden, war die Effizienz des Klonens im Hinblick auf Nachwuchserzeugung über einige Jahre immer niedrig und unvorhersagbar (Bondioli et al., Theriogenology 1994, 33: 165-174).
Diese geringe Effizienz lag primär an dem empirischen Ansatz, der zur Zellkernübertragung verwendet wurde.
Als eine Folge der Studien, die in den letzten Jahren durchgeführt wurden, wurden einige technische Beschränkungen, an denen eine solche niedrige Effizienz liegt, gezeigt.
Insbesondere klärten Grundsatzstudien, die in den letzten fünf Jahren am Verständnis der nuklearen zytoplasmatischen Interaktion in rekonstruierten Embryonen unternommen wurden, wie wenigstens einer der Gründe für die schlechte Entwicklung von geklonten Embryonen die Zelle-Zyklus-Kombination ist, was auch die ideale Kombination zum Rekonstruieren von Embryonen durch Zellkernübertragung angibt (Collas et al., Biol Reprod 1992, 46: 492-500; Barnes et al., Mol Reprod Dev 1993, 36: 33-41; Campbell et al., Biol Reprod 1994, 50: 1385, 1: 1385-1393; überprüft von Campbell et al., Rev of Reprod 1996, 1: 40- 47).
Eine andere unüberwindbare Grenze beim Embryoklonen wurde in der beschränkten Anzahl von Zellkernen identifiziert, die von einem einzelnen Embryo erhaltbar sind. In diesem Zusammenhang hat jedoch die Fähigkeit, gezüchtete Zelllinien zu verwenden, die von Embryonen erhalten wurden, eine große Anzahl von Vorteilen gegenüber der Verwendung von Zellteilungsstadiumsembryonen geboten.
In diesem Zusammenhang wurden die idealen Zellen für diesen Zweck erst in der embryonalen Stammzelle (ES) identifiziert, die jedoch unglücklicherweise nicht von Embryonen von großen Tieren isoliert wurden (Galli et al., Zygote 1994, 2: 385-389).
Die Erzeugung des ersten Schafes, das von einer gezüchteten Zelllinie geklont wurde, die von Embryonen erhalten wurde, überwand diese Grenze (Campbell et al., Nature 1996, 380: 64-66), was neue und wichtige Möglichkeiten in sowohl Grundlagen als auch angewandter Forschung eröffnete. Die Möglichkeit, kultivierte Zellen zu verwenden, repräsentiert nicht nur die ideale Lösung für die Erzeugung einer großen Anzahl von hoher genetischen Güte oder genetisch modifizierten Tieren, sondern die klaren Zellzyklusphasen, die Zellen in einer Kultur aufweisen, eröffnen auch die Möglichkeit, die ideale Zell-Zyklus-Kombination zur Zellkernübertragung zu verschiedenen Zellen auszuarbeiten.
Diesem grundlegenden Schriftstück folgten tatsächlich sofort zwei andere, der Bericht über das erste Säugetier, das durch die Zellkernübertragung einer somatischen Zelle erzeugt wurde (Wilmut et al., Nature 1997, 385: 810-813) und die ersten transgenen Lämmer, die durch Zellkernübertragung von genetisch modifizierten Zellen erzeugt wurden (Schieke et al., Science 1997, 278: 2130-2133).
Danach bestätigen zwei nachfolgende Berichte, die sich auf das somatische Klonen bei Mäusen bzw. Kuh bezogen, die Tatsache, dass das Tier, das aus einem solchen Prozess resultiert, tatsächlich ein Klon ist (Wakayama et al., Nature 1998, 394: 369- 374; Kato et al., Science 1998, 282: 2095-2099).
Der weitere Fortschritt, der in den letzten Jahren gemacht wurde, machte das Embryoklonen zu einer zuverlässigen Technologie, die potentiell beim Züchten von Tieren anwendbar ist (Heymann Y und Renard JP, Anim Reprod Science 1996, 42: 427-436; Loi et al., Theriogenology 1997, 48: 1-10; Loi et al., Biol of Reprod 1998, 58: 1177-1187).
Reprogrammieren des Zellkerns der Donatorzelle
Aus allen diesen Berichten kann geschlossen werden, dass wenigstens ein kleiner Teil von somatischen Zellkernen zu brauchbaren Nachkommen entwickelt werden kann, und dass eine solche Entwicklung streng konsequent zum Erfolg beim "Reprogrammieren" des Donatorzellkerns ist, was in der Oozyte unmittelbar nach der Übertragung auftritt. Was immer noch nicht klar ist, ist der Mechanismus, der dieses Reprogrammieren reguliert, was tatsächlich an unbekannten Faktoren liegt, die in dem Zytoblast vorhanden sind.
Im Anschluss an die Transplantation in Oozyten verlieren somatische Zellkerne tatsächlich Teile (oder alle, im Fall von Dolly: siehe Campbell et al., Nature 1996, 380: 64-66) der strukturellen Komponenten der Chromosomen, die ihren differenzierten Zustand aufrecht erhalten und die Eigenschaft erlangen, die regulierte Expression von Genen durch embryonische und fötale Entwicklung auszuführen (Patterton und Wolffe, Dev. Biol 1996, 173: 2-13).
Grundsätzlich ist der Differenziationsprozess, der gleichzeitig mit der Aktivierung des embryonischen Genoms (es tritt beim Schaf beim 5. Zellzyklus, 8-16 Zellübergang, auf) beginnt, vollständig nach der Zellkernübertragung umgekehrt und verhält sich der übertragene Zellkern wie eine Zygote.
Somatische Zellkerne, die in reife Eier übertragen wurden, werden daher remodelliert, und diese morphologische Änderung ist mit der Re-Akquisition von Pluriopotential verbunden, und in einigen Fällen Totipontenzial (Gurdon I., J Ebryol Exp Morphol 1962, 10: 622-640).
Die molekulare Machinerie, die für ein solches Remodellieren (und daher Reprogrammieren) des Genoms (diploid, somatisch oder wie auch immer genom) verantwortlich ist, das in die Oozyte übertragen wird, ist noch nicht vollständig geklärt. Jedoch wird, da natürlich kein spezifischer und effizienter nuklearer Mechanismus zu diesem Zweck in der Oozyte während der Evolution für einen differenzierten Zellkern entwickelt werden konnte, der in die Oozyte selbst eingeführt wurde, von einem Mechanismus angenommen, derselbe zu sein, der auf das aploide Spermiumgenom zur Zeit der Aktivierung wirkt.
Nach der Fertilisation wird der Spermienzellkern tatsächlich schnell durch das Eizytoplasma remoduliert, um den väterlich Pronukleus zu erstellen. Das Erstellen des Pronukleus erfordert das molekulare Chaperon-Nukleoplasmin (Philpott et al., Cell 1991, 65: 569-578). Nukleoplasmin entfernt spezifisch die grundsätzlich spermienspezifischen Proteine und lagert gleichzeitig Histone H2A.X und H2.B auf Chromatin ab (Philpott und Leno, Cell 1992, 69: 759-767). Die resultierende spezialisierte chromosomale Konformation, die in dem Pronukleus gefunden wurde, wird auch in Zellkernen von Spaltungsstadiumembryonen beibehalten (Dimitrov et al., J Cell Biol 1994, 126: 591-601).
Ähnlich gibt es einen experimentiellen Beleg, dass Nukleoplasmin auch eine Hauptrolle beim Remodellieren von somatischen Zellkernen spielt, streng verbunden mit der Akquisition von Totipotential von somatischen Zellkernen, was die Freigabe von Chromatinkomponenten und das Aufnehmen von strukturellen und regulativen Proteinen von dem Zytoplasma erfordert (Philpott et al., Cell 1991 65: 569-578; Wangh et al., J Cell Science 1995, 108: 2187-2196).
Insbesondere wurde beobachtet, dass die spezifische Dissotiation von somatischen Verbinderhistonen H1 und H1° verbunden mit der Inkorporation des oozytenspezifischen Verbinderhistons B4 in das remodellierte Chromatin, vermittelt durch Nukleoplasmin, die Transkriptionskompetenz und somit das Totipotential von somatischen Zellkernen erhöht (Dimitrov und Wolffe, the EMBO Journal 1996, 15: 5897-5906).
Während jedoch der nukleosomale Übergang während des Remodellierens im Detail beschrieben wurde, (als Beweis siehe Patterton und Wolffe, Dev Biol 1996, 173: 2-13), ist die Regulierung der weitreichenden Chromatinstruktur während der Entwicklung viel weniger klar. Es gibt zunehmende Anzeichen dafür, dass Chromatinstrukturen hoher Ordnung eine Rolle bei der Akquisition und Aufrechterhaltung des festgelegten Status der Zellen spielt. Insbesondere wurde gezeigt, dass das Protein von SMC (Segregation von mitotischen Chromosomen) und Chromodomainfamilien für die Transkriptionssteuerung wichtig sind (Chang et al., Cell 1994, 79: 459-474; zum Beweis siehe: Patterton und Wolffe, Dev Biol 1996, 173: 2-13).
Aus der obigen Erwägung wurde angenommen, dass Änderungen in den Chromatinstrukturen das Reprogrammieren des übertragenen Zellkerns nach der relevanten Übertragung erleichtern kann (Wilmuth I. et al, Nature 1997, vol. 385, pag. 810-813; Campbell et al., 1996), und, dass um so mehr das Chromatin für zytoplasmische Remodellierfaktoren zugänglich ist, der Kern um so bessere Chancen hat, nach der Zellkernübertragung vollständig reprogrammiert zu werden.
Insbesondere wurde vorgeschlagen, dass die reduzierte Transkriptionsaktivität von ruhenden Zellen zum Reprogrammieren vorteilhaft sein kann (Campbell et al., 1996), obwohl kein direkter Vergleich mit Zellkernen in verschiedenen Stadien des Zellenzyklus vorgenommen wurde.
Auf die Verschiebung von sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren von mitotischem Chromatin (Martinz-Balbas et al., Cell 1995, 83: 229-238) beeinflusst das Remodellieren von mitotischen Zellen in Metaphasezytoplasma positiv (Fulka et al., BioEssay 1996, 18: 835-840) und induziert folglich ein besseres Reprogrammieren, wie in Mäuseexperimenten belegt wurde (Kwon und Kono PNAS 1996, 93: 13010-13013).
Eine solche Verschiebung ist eine "physiologische" Konsequenz der verringerten metabolischen Aktivität in erschöpften G0-Zellen (Campbell et al., Nature 1996), und eine Folge einer verlängerten Chromosomkondensation bei dem Verfahren, das von Wakayama (Wakayama et al., 1998) vorgeschlagen wurde. In beiden Fällen fällt die Verschiebung oder die Beendigung der Transkriptionsaktivität in die normale Aktivität der Zelle und ist nicht "per se" für das Genom-Reprogrammieren verantwortlich, wie klar durch die Tatsache dargelegt ist, dass der Phenotyp der Zelle nach beiden Zellzyklusstadien stabil erhalten bleibt. Jedoch sind, ungeachtet der Verwendung einer besonders definierten synchronen Population von G0-Zellkerndonatoren oder der gleichförmigen verlängerten Aussetzung der übertragenen Zellkerne in der zytoplastischen Umgebung, weniger als 2 der Zellkerne vollständig reprogrammiert und entwickeln sich nach der Zellkernübertragung zu lebensfähigen Jungen. Unter Beachtung, dass das Oozytenzytoplasma normalerweise einen transkriptionell inaktiven Spermienzellkern antreffen würde statt einen vollständig differenzierten Zellkern, ist die niedrige Effizienz, die aus der obigen Prozedur folgt, nicht überraschend. Bisher wurden keine alternativen Verfahren vorgeschlagen und führend sind invasive Verfahren, die aus zwei Gründen zum Verlust der Zelllebensfähigkeit führen kann: Erstens wird die Zellkernübertragung noch durch elektrisch vermittelte Zellenübertragung durchgeführt, welches Verfahren nur mit lebenden Zellen arbeitet, zweitens wird von einer nicht lebenden Zelle üblicherweise angenommen, kein guter Kandidat für die Zellkernübertragung zu sein.
Trotz der Tatsache, dass zahlreiche Studien zeigten, dass hohe Temperaturen Proteine denaturieren und Nukleinsäuren mit einem Schmelzübergang auftreten, wenn die Temperatur 55 °C übersteigt (Pain RH., Symp Soc Exp Biol 1987, 41: 21-33), und dass der denaturierende Zustand der Proteine das primäre Ziel für degradierende Enzyme (McLendon und Radany, J Biol Chem 1978, 253: 6335-6337) – und daher in dem spezifischen Fall auch für die spezifische Proteasomaktivität, die in reifen Oozyten verhanden ist (Saro CK und Hoschi M, J Biochem 1997, 122: 286-293) – ist, wurde die Eliminierung von solchen Faktoren durch die Denaturierung und nachfolgende Degradierung durch degradierende Enzyme in der Technik nicht beachtet.
In diesem Zusammenhang sollte jedoch die belegte Existenz eines realen epigenetischen "Zellengedächtnisses" berücksichtigt werden, das zum Aufrechterhalten eines stabilen Musters eines Genausdruckes in sich teilenden Zellen erforderlich ist und es den zellulären Phenotyen von differenzierten Zellen gestattet, durch die Zellteilung stabil fortgepflanzt zu werden.
Die DNA-Methylation und die Ausbreitung von spezifischen Chromatinstrukturen wurden insbesondere als gute Kandidaten für das Aufrechterhalten eines Zellengedächtnisses vorgeschlagen (Patterson und Wolffe, Dev. Biol 1996, 173: 2-13). Alternativ oder begleitend könnten einige Faktoren an mitotische Chromosomen gebunden bleiben, die als Lesezeichen für jene Gene wirken, die neu ausgedrückt werden müssen.
Dieselbe Folgerung kann für ruhende G0-Zellen gezogen werden. Diese Zellen sind noch metabolisch aktiv, wenn auch auf verringerten Niveaus, und werden nicht länger vermehrt, ohne durch geeignete extrazelluläre Signale aufgerufen zu werden, es zu tun. Natürlich ändert sich der Phenotyp von ruhenden Zellen nicht nach einer Reaktivierung, was angibt, dass ein stabiles Muster eines Genausdruckes durch spezifische Chromatinstrukturen auch während G0 aufrecht erhalten bleibt.
Entsprechend behalten sowohl mitotische als auch ruhende Zellen das epigenetische Zellgedächtnis, das den differenzierten Status beibehält. Die wesentliche Bedingung für ein vollständiges Reprogrammieren einer somatischen Zelle ist daher ihr vollständiges Remodellieren, das einen Übergang in chromosomale Strukturen und eine Komposition in Verbindung mit der Akquisition enthält, um den schnellen Teilungszyklus einer frühen Entwicklung auszuführen und um den regulierten Ausdruck von Genen durch embryonische und fötale Entwicklung bis zu der Geburt eines normalen lebensfähigen Tieres auszuführen.
Zwei klare Ansätze wurden für die Induktion eines vollständigen Reprogrammierens von somatischen Zellkernen vorgeschlagen. Der erste, postuliert von Campbell und Mitarbeitern (Campbell et al., Nature 1996, 380: 64-66) sagt, dass durch Serumentzug induzierte Zellkernruhe die fundamentale Bedingung für Zellkernreprogrammieren ist; die zweite, gefordert von Wakayama (Wakayama et al., Naure 1998, 394: 369-474), aber auch vorhergesagt von Campbell (Campbell et al., Naure 1996, 380: 64-66), sagt, dass ein verlängertes Aussetzen des Zellkernes in Zytoplasmaumgebung die Chancen für Zellkernreprogrammieren erhöht.
Jedoch ist die Bedeutung von Zellkernruhe zur somatischen Zellkernübertragung noch kontrovers. Tatsächlich wird in dem ersten Report über die Verwendung von G0-Zellen als Zellkerndonatoren (Campbell et al., Naure 1996, 380: 64-66) kein Vergleich mit Zellen in anderen Stadien des Zellenzyklus vorgenommen. Die Situation änderte sich nicht in dem folgendem Report (Wilmut et al., Nature 1997, 385: 810-813), wo ruhende Zellen von drei verschiedenen Zelllinien, embryon, fötal und reif erhaltene Zellen, als Zellkerndonatoren verwendet wurden.
Außerdem wurde bei dem sich aktiv vermehrenden fötalen Fibroblastzellen gezeigt, dass sie in der Kuh eine normale embryonische und fötale Entwicklung zeigen (Cibelli et al., Science 1998. 280: 1256-1258) und es wurden keine Unterschiede bei der Blastozystenproduktion zwischen sich vermehrenden und ruhenden somatischen fötalen Rinderzellen bei einer kürzlichen vergleichenden Studie gefunden (Le Bourhis D et al., Clevage et Insemination 1998, Octobre, n 286, 3-9).
So ist die Frage: Warum entwickelt sich, obwohl nahezu alle Zellen, die zur Zellkernübertragung verwendet werden, in G0 sind, nur ein kleiner Teil, 2 % zu Nachkommen? Was hilft jenen Zellen, ein vollständiges Totipotenzial nach der Zellkernübertragung zu erzielen?
4. ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, das die Denaturierung von den Nukleosomen und Chromatin der Donatorzellkerne vor einer Zellkernübertragung enthält. Diese Denaturierung erleichtert ein vollständigeres Reprogrammieren von differenzierten somatisch, embryonisch oder fötal erhaltenen Zellen vor der Zellkernübertragung.
Insbesondere kann eine solche Denaturierung durch Wärmebehandlung des Chromatins der Donatorzelle ausgeführt werden, was in der thermischen Denaturierung von Nukleosomen sowie weitreichenden Chromatinstrukturen und im Begünstigen des kompletten Remodellierens von Donatorzellkernen vor der Zellkernübertragung resultiert.
Insbesondere beeinträchtigt die Denaturierung durch thermische Behandlung die strukturellen Proteine, die in die Aufrechterhaltung des differenzierten Stadiums involviert sind.
Bei der vorliegenden Studie beurteilten wir die Effizienz einer Zellkernübertragung unter Verwendung von thermisch destabilisierten Donatorzellen von erwachsenen Mutterschafen. Die Erklärung war, dass die Wärmebehandlung Chromatin erzeugen würde, das zum Reprogrammieren als ein Ergebnis der Denaturierung von DNA-regulierenden Proteinen mehr abgeändert werden kann. Unter der Annahme, dass denaturierte Proteine leichter durch Proteolytische Enzyme (Parsell und Sauer, J. Bol. Chem. 1989, 264; 7590-7595), degradiert werden, wurde gefolgert, dass die proteolytische Oozyten-Maschinerie (Tokumoto T. International review of cytology, 1999, 186; 261-294) nukleosomale und Chromatin-Proteinkomplexe auf die thermische Denaturierung hin leichter verarbeiten kann. Es wurde geschlossen, dass die resultierende DNA dann leichter zugänglich für Programmierfaktoren sein könnte, die in dem Ooplasma vorhanden sind.
Die wissenschaftliche Erklärung des Erfolgs des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, welches jedoch den relevanten Umfang nicht bindet, ist, dass während die Oozythe die Molekularmaschinerie zum Remodellieren von somatischem Chromatin auf nukleosomalem Niveau hat, die Oozythe selbst nicht die spezifischen Pfade zum Remodulieren von weitreichenden Chromatinstrukturen, die in G0 vorhanden sind, oder kondensiertem Chromatin hat. Vermutlich wird das vollständige Reprogrammieren von somatischen Zellkernen versehentlich durch eine nicht spezifische Remodellieraktivität von Nukleoplasmin induziert, und/oder kann es alternativ sein, dass der kleine Teil von erfolgreich reprogrammierten Zellen degeneriert oder frühe Apoptikzellen sind, in anderen Worten, können sie eine strenge Kontrolle der Genexpression verloren haben.
Die vorliegende Erfindung kann zur Grundlagenforschung benutzt und auch auf alle Säugetierarten, ausgeschlossen Menschen, angewandt werden, insbesondere auf wirtschaftlich bedeutsame Huftiere: Rind, Schaf, Ziege, Schweine, Wasserbüffel, Pferde, und auch Labortiere: Mäuse, Hasen, Meerschweinchen oder Pelztiere. Die Erfindung ist anwendbar für die Erzeugung von Tieren mit hoher genetischer Güte, gefährdeten Tierarten und transgenen Tieren. Es ist zu beachten, dass für ein "transgenes" Tier nicht nur ein Tier vorgesehen ist, das in seinem Genom ein oder mehrere Gene von anderen Tierarten trägt, sondern auch Tiere, deren Genome irgendwie durch rekombinante DNA-Technologie modifiziert wurden.
In dem Fall, dass das vorliegende Verfahren für die Erzeugung eines transgenen Tiers angewandt wird, kann der Donatorzellkern genetisch vor seiner Verwendung zur Zellkernübertragung modifiziert werden, um eines oder mehrere Transgene zu enthalten. Der Donatorzellkern kann genetisch durch verschiedene Prozeduren modifiziert sein, die nun verfügbar sind: Transfektion, Elektroporation, virale Transfektion, Lipofektion und Goldmikroprojektilbombardment.
Es gibt einige Anwendungen der vorliegenden Erfindung sowohl zur Grundlagen- als auch zur angewandten Forschung. Die Kenntnis der thermischen Stabilität der verschiedenen Familien von DNA-Regelproteinen in Verbindung mit dem hier vorgeschlagenen Verfahren der Zellkernübertragung kann einzigartige Einblicke in den Mechanismus der Genomreprogrammierung bereit stellen. Zum ersten Mal wurde bewiesen, dass nicht lebende Zellen effizient nach einer Übertragung in entkernte Oozyten reprogrammiert werden können. Diese Tatsache hat mit Sicherheit einige praktische Anwendungen, von denen eine die Möglichkeit sein kann, genetische Banken mit niedrigen Kosten für die Erhaltung von seltenen und gefährdeten Tierarten zu erzeugen. Die meisten gefährdeten Tierarten leben in Afrika, wo Umgebungsbedingungen die Anwendung von flüssigem Stickstoff (-196 °C) für die Zellenaufbewahrung unpraktisch machen, wie durch FAO-Experten aus Anlass des Workshops "Die Auswirkung der Entwicklung in der Biotechnologie für die Konservierung von gefährdeten tierischen genetischen Resourcen: Reversible DNA-Ruhe und Klonen" angegeben wurde. Ein Bericht über den Workshop ist auf der FAO Homepage http://ww.fao.org/ verfügbar. Die Tatsache, dass sich nicht lebende Zellen nach einer Zellkernübertragung zu Embryonen und Föten entwickeln können, eröffnet zum ersten Mal die Möglichkeit, Zellen in billigeren Systemen als in einem gefriergetrockneten Zustand aufzubewahren. Dies würde einen dramatischen Einfluss auf die Erzeugung von genetischen Bänken für gefährdete Tierarten haben. Indem die Zelllebensfähigkeit nicht mehr das absolute Erfordernis zum Klonen ist, wird es möglich, das Ausmaß genetischer Manupulation vor einer Zellkernübertragung dramatisch zu erhöhen. Es könnte möglich sein, ein Individium einfach durch Zusammenfügen einzelnen Chromosomen von verschiedenen inter-intra-spezifischen Individuien herzustellen, vorausgesetzt, dass ein funktionales Centriolum zusammen mit den Chromosomen injiziert wird.
Als eine Folge dessen, was oben und unten angegeben ist, ist das Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Rekonstruieren eines tierischen Embryos einer nicht humanen Säugetierart, enthaltend den Schritt des Übertragens eines Diploidzellkerns von einer Donatorzelle oder der Donatorzelle, die den Zellkern enthält, in eine Rezipientenzelle, welche Donatorzelle eine G1- oder G0-Zelle von einer nicht menschlichen Säugetierspezies ist und welche Rezipientenzelle eine zellkernlose Metaphase-II-Oozyte einer nicht menschlichen Säugetierspezies ist, wobei das Chromatin innerhalb des Zellkerns denaturierenden Bedingungen vor dem Übertragen in die Rezipientenzelle ausgesetzt wird, welche Rezipientenzelle ferner in vitro oder in vivo kultiviert wird.
Das Chromatin kann in Chromosomen organisiert sein, die aus mehr als einer Donatorzelle ausgewählt sein können.
Spezifische Ausführungsbeispiele sind die Fälle, in denen die Donatorzelle aus einem einzelnen Individium oder von verschiedenen Individuen aufgenommen wurde, die zu einer einzelenen Tierart oder zu verschiedenen Tierarten gehören können. Die Donatorzelle kann kultiviert oder ex vivo extrahiert sein, vorzugsweise in der G1- oder G0-Phase aber auch in der N-Phase, vorausgesetzt, dass die Ploidie nach der Zellkernübertragung korrigiert wird; die Donatorzelle kann gefriergetrocknet oder tot sein und kann insbesondere eine embryonische Zelle, eine fötale Zelle, eine somatische Zelle oder eine Granulosazelle sein.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Chromatin wenigstens einer genetischen Modifikation unterzogen, die in der Einführung wenigstens einer etherologen DNA-Sequenz, der Entfernung wenigstens eines homologen Genes, der Modifikation wenigstens einen homologen Genes und der Duplikation wenigstens eines homologen Genes bestehen kann.
Die Denaturierung des Chromatins kann insbesondere direkt an den Nukleonproteinzusammenbau an dem Zellkern innerhalb oder außerhalb der Donatorzellen durch Auswählen einer Kombination von Temperatur, pH, ionischer Stärke und anderen chromatindestabilitierenden Mitteln oder durch Wärmebehandlung ausgeführt werden. In dem letzten Fall kann die Temperatur die Schmelztemperatur des regulativen Transkriptionsproteins und insbesondere ein Bereich von 45 °C bis 95 °C sein, wobei die bevorzugten Ausführungsbeispiele 55 °C und 75 °C sind.
Die Repizientenzelle ist üblicherweise eine Oozyte, in Metaphase II gereift in vitro, welche vor der Übertragung des Zellkerns der Donatorzelle entkernt wurde, und die Zellkernübertragung wird vorzugsweise durch Injektion ausgeführt.
Der resultierende tierische Embryo gehört zu einer nicht humanen Säugetiertierart, kann insbesondere eine Maus, eine Ratte, ein Hase, ein Meerschwein, ein Pelztier oder eine Huftierart sein, wie Rind, Schaf, Ziege, Schwein, Wasserbüffel und Pferd.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erzeugen eines nicht transgenen Tiers, enthaltend die folgenden Operationen: a. Kultivieren eines Tierembryos, der nach einem der Ansprüche 1 bis 11 rekonstruiert wurde, um Blastozysten zu erhalten; b. Übertragung der Blastozysten in ein geeignetes Rezipiententier; c. Veranlassen, dass sich der Tierembryo fristgerecht entwickelt, und weiteres Brüten des resultierenden Tieres.
Ein solches Verfahren kann ferner die Operation des Züchtens von dem resultierenden Tier enthalten.
Bei einem speziellen Ausführungsbeispiel wird der Embryo der Operation a. subkloniert, um mehr als ein Tier zu erhalten, das sich in bezeichnender Weise entwickelt, und ist ein genetisch modifizierter Embryo, der von dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Der Embryo kann auch genetisch modi fiziert werden vor der Operation a. vor der fristgerechten Entwicklung, und die Operation c. kann in vitro oder in vivo durch Übertragen des Embryos in ein temporäres Rezipiententier ausgeführt werden.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren der Erfindung enthält die Übertragung eines Diploidzellkerns in eine geeignete Rezipientenzelle von einer Donatorzelle nach dem Denaturieren durch eine geeignete Kombination aus Teperatur, pH, ionischer Stärke und anderer chromatin-destabilisierenden Mittel. Insbesondere wurde die Denaturierung durch Erhitzen der Zelle in Hepes-gebuffertem Medium bei 55 °C oder 75 °C ausgeführt. Die relevante Behandlung ist in dem Beispiel 1 erläutert.
Vorzugsweise wird zu diesem Zweck eine Granulosazelle verwendet, selbst wenn das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf nur Granulosazellen beschränkt ist; alle Zellen von einem erwachsenen Tier, einschließlich auch embryonischen und fötalen Zellen, können Dank der Tatsache verwendet werden, dass sie normale Diploid-G1 oder G0-Zellen sind.
Zellen können oder können nicht kultiviert werden vor der Zellkernübertragung. Jedoch ist eine Kultur notwendig, wenn diese Erfindung für die Erzeugung von transgenen Tieren verwendet wird. Tatsächlich erfordert die Anwendung der Molekularbiologietechnologien zur genetischen Modifikation einer Zellpopulation die Kultur der Zellen sowohl für die Transformation als auch für Screenen und Selektion der erfolgreich modifizierten Zellklone.
Nach der Behandlung, die im Beispiel 1 unten erläutert wird, wird der Zellkern daher in eine entkernte Metaphase II Oozyte übertragen. Die Oozyte wird durch Mikromanipulation nach der Lokalisation der Chromosomen unter UV-Licht entkernt; jedoch ist das vorliegende Verfahren nicht auf die obige Prozedur be schränkt, sondern auch alternative Lösungen, wie Nichtinvasive Ansätze, wie UV-Bestrahlung zur Entkernung, sind auch in Betracht zu ziehen.
Die Rezipienten-Oozyten können durch Superovulation von Donatorschafen oder bequemer in vitro von Eierstöcken, die am Schlachthof gesammelt werden, gemäß dem Protokoll, das in dem folgenden Beispiel 2 in vitro Reifung von Schaf-Oozyten erzeugt werden. In vitro Reifung von Oozyten, die von individuellen Muttertieren von hoher genetischer Güte oder transgen aufgenommen werden, werden in dem Fall erforderlich sein, dass die Erfindung auf die Multiplikation der Oozyten-Donatoren selbst angewandt wird, oder alternativ, wenn ein spezieller zytoplasmatischer Hintergrund benötigt wird.
Da das hierin vorgeschlagene Verfahren die Denaturierung der Zellen durch Erwärmen oder andere Denaturierungsmittel enthält, kann eine elektrisch vermittelte Zellfusion nicht zur Zellkernübertragung verwendet werden, weshalb die Injektion des behandelnden Zellkerns das bevorzugte Verfahren sein wird.
Die injizierten Cytoblasten werden mit einem dieser Verfahren aktiviert: ein oder mehrere elektrische Impulse, Ionomycin-6DMAP-Verbindung (Loi et al., Biol Reprod 1998, 58: 1177-1187), oder Ionomycin-Plus-Cycloheximid (Presicce und Yang, Mol Reprod Dev 1994, 37: 61-68). Nachfolgend an die Aktivierung können die rekonstruierten Embryonen in Agar eingebettet (Willadsen S., Nature 1979, 277: 298-300) und in vivo in gebundenem Ovidukt von temporären Rezipienten-Mutterschafen gemäß dem vorher veröffentlichten Verfahren (Loi et al., Theriogenology 1997, 48: 1-10) oder bequemer in vitro gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren kultiviert werden. Eine Kultur in vitro wird auch in dem Fall bevorzugt sein, dass geklonte Embryonen selbst als Zellkerndonatoren für eine serielle Zellkernübertragung verwendet werden müssen, um die Anzahl von nützlichen geklonten Tieren weiter zu vergrößern. Nach einer geeigneten Kultivierungsperiode in vitro, üblicherweise 6- 9 Tage, werden die Embryonen, die sich zum Blastozystenstadium entwickeln, in Rezipienten-Mutterschafe zur termingerechten Entwicklung übertragen. Geklonte Tiere, die mit dem vorliegenden Verfahren erzeugt wurden, können gezüchtet und zum Erzeugen einer Tierherde mit den vorhergesagten Charakteristika verwendet werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Rekonstruktion eines Tierembryos in ihren bevorzugten Ausführungsbeispielen enthält eventuell die folgenden Schritte:

1) Auswahl einer geeigneten Donatorzelle, die direkt von dem erwünschten Tier oder von kultivierten Zelllinien, in dem Fall, dass eine genetisch modifizierte Zelle für die Erzeugung eines transgenen Tieres verwendet wird, genommen werden kann
2) Wärmebehandlung der Zellen, die als Zellkerndonator zu verwenden sind.
3) Embryorekonstruktion durch Injektion von wärmebehandelten Zellen
4) Kultivierung in vitro oder in vivo des rekonstruierten Embryos
5) Übertragung der Blastozysten in endgültige Rezipienten.

Thermisch destabilisierte Zellkerne entwickelten sich in höherer Proportion zu Blastozysten im Vergleich zu Kontrollembryos, die mit frischen, unbehandelten Zellen rekonstruiert wurden (siehe Tabelle 1 mit den Ergebnissen von Beispiel 2).
In dem begleitenden Beispiel 1 werden die Zellen in Hepes-gebuffertem synthetischem oviduktalem Fluid (SOF) erwärmt, jedoch kann jegliches Medium, dessen ionische Stärke und pH zur Chromosomdestabilisierung optimiert wurde, bevorzugt werden. Zwei Temperaturen wurden bei der vorliegenden Anwendung ausge wählt, 55 °C und 75 °C, aber zwischenliegende oder höhere Temperaturen können einen besseren Effekt auf das genomische Reprogrammieren ausüben.
In dem Fall der Erzeugung eines transgenen Embryos nach der Operation 1) und vor der Operation 2) sollen die zwei folgenden zusätzlichen Operationen ausgeführt werden:

1a) Genetische Modifikation der kultivierten Zellen mit der geeigneteren DNA-Rekombinationstechnologie; dies kann enthalten: Gen-Knock-Out, Zerstörung, Hinzufügung, Verdopplung oder andere Genmodifikationen;
1b) Screenen und Selktieren von erfolgreich modifizierten Zellen.

Soweit wurde eine allgemeine Beschreibung vorliegender Erfindung angegeben. Mit Hilfe der folgenden Beispiele wird nun eine detailiertere Beschreibung von spezifischen Ausführungsbeispielen angegeben, um ein besseres Verständnis der Ziele, Charakteristika, Vorteile und Betriebsmethoden der Erfindung anzugeben. Solche Beispiele dienen nur zum Illustrieren und beschränken nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung, die in den angefügten Ansprüchen definiert ist.
BEISPIELE
Beispiel 1. Wärmedenaturierung der Donatorzelle
Zusammengefasste Granulosazellen von Cumulus-Oozyten-Komplexen (COCs) wurden durchwegs bei den Beispielen verwendet, obwohl andere Arten von Zellen verwendet werden können. COCs wurden in Hyaluronidase (300 UI/ml) für wenige Sekunden inkubiert, dann in eine einzelne Zellenpopulation durch kräftiges Pipettieren dissoziiert. Die Zellen wurden zweimal in Hepes SOF gewaschen und in Hepes SOF bei entweder 55 °C oder 75 °C in einem Wasserbad für 15 Minuten erwärmt. Nach der Behandlung wur den die Zellen zentrifugiert, neu im Manipulationsmedium eingestellt (Hepes gebuffertes TCM 199 + 4 mg/ml BSA) und zur Zellkernübertragung innerhalb ein bis zwei Stunden verwendet.
Gefriertrocknen von Granulosazellen
Ein Aliquot von Granulosazellen, die von in vitro gereiften Oozyten genommen wurden, wurde zentifugiert, und das resultierende Pellet mit 100 μl von Hepes TCM 199 plus 7 % DMSO (Dimethylsulphoxid) neu eingestellt, eingeführt in 2 ml Glasampullen und direkt eingetaucht in flüssigen Stickstoff (-196 °C). Gefrorene Zellen wurden in einem vorgekühlten Aluminiumblock angeordnet und in einem Lyophilisierer (Edwards) gefriergetrocknet. Gefriergetrocknete Zellen wurden in der Dunkelheit bei Raumtemperatur bis zur Verwendung aufbewahrt.
Vor der Verwendung zur Zellkernübertragung wurden die gefriergetrockneten Zellen neu hydriert mit 100 μl von Milli-Q-Wasser und wärmebehandelt wie im Beispiel 1 beschrieben ist.
Beispiel 2. Embryo-Rekonstruktion durch Zellkernübertragung Oozyte in vitro Reifung
Eierstöcke wurden unmittelbar nach dem Schlachten eingesammelt und zu dem Labor in einer Salzlösung bei ungefähr 35 °C innerhalb 1-2 Stunden transportiert. Oozyten wurden durch Dissektion von Eierstöcken in TCM-199, angereichert mit 5 % Kalbsserum, 0,05 mg/ml Heparin, 0,05 mg/ml Gentamicinsulphat, erhalten.
Follikulare Oozyten wurden unter dem Stereomikroskop evaluiert, und nur diese, die von wenigstens 2 Schichten von Granulosazellen bedeckt waren und mit gleichmäßig granuliertem Zytoplasma, wurden für IVM ausgewählt. Das Medium, das zur Reifung verwendet wurde, war bicarbonatgebuffertes TCM-199 mit der auf 275 mOsm/Kg eingestelltem Osmolarität und Glutamin in der Konzentration 2 mM vorliegend. Das Reifungsmedium war mit 10 % fötalem Rinderserum, 5 μg/ml FSH (Ovagen, ICP, Neuseeland), 5 μg/ml LH, 1 μg/ml Estradiol, 0,3 mM Sodiumpiruvat und 100 μM Cysteamin angereichert. Oozyten wurden in 0,4 ml von Medium in 4-wandigen Schalen (Nunc, Nuclon, Dänemark) bedeckt mit Mineralöl inkubiert. IVM-Bedingungen waren 5 % CO₂ in einer befeuchteten Luft bei 30 °C für 24 Stunden.
Embryonenrekonstruktion
Metaphase II Oozyten wurden von den Kumuluszellen abgestreift und für 15 Minuten in der Anwesenheit von 5 μg/ml Hoechst 33342 inkubiert. Die Entkernung wurde in einem Manipuliermedium (Hepes TCM 199 ÷ 4 mg/ml BSA) ergänzt mit 7,5 μg/ml Cytochalasin B ausgeführt. Die Oozyten wurden mit einer Haltepipette immobilisiert und für 2-3 Sekunden W-Licht zur Lokalisierung der Chromosomen ausgesetzt. Ein Teil des Zytoplasmas mit der Metaphasenspindel wurde dann in die Entkernungspipette eingesaugt. Entkernte Oozyten wurden für 30 Minuten in die Kultur zurückgegeben, um das Cytochalasin B abzuwaschen.
Dasselbe Medium wurde zur Zellkernübertragung verwendet. Frische Zellen wurden mit einer Injektionspipette (4 μs) aufgenommen und abgegeben, bis die Membrane vollständig zerstört war, worauf hin der Kern in die Oozyte injiziert wurde. Wärmebehandelte Zellen wurden mit einer breiteren Pipette (10 μs) mit derselben Prozedur injiziert.
Oozytenaktivierung
Sofort nach der Injektion wurden die rekonstruierten Embryonen mit 5 Minuten Behandlung von 5 μM Ionomycin gefolgt von 5 Stunden Inkubation bei 38,5 °C in SOF ergänzt mit 10 μM Cycloeximid aktiviert. Nach 5 Studen wurden die rekonstruierten Embryonen in vitro für 7-9 Tage kultiviert.
In Vitro Kultur
Die rekonstruierten Embryonen wurde auf 20 μl Kulturtropfen bestehend aus SOF ergänzt mit 2 % (v/v) BME-wesentlichen Aminosäuren, 1 % (v/v) MEM-unwesentlichen Aminosäuren, 1 mM Glutamin und 8 mg/ml säurefreie fetthaltige BSA verteilt. Am 3. und 5. Tag der Kultur (Tag 0 – der Tag der Zellkernübertragung) wurden 5 % FBS mit entzogener Aktivkohle zu dem Medium hinzugefügt. Die Kultur wurde bis 9 Tage fortgesetzt, dann wurden die rekonstruierten Embryonen, die sich zum Blastozystenstadium entwickelt hatten, zu synchronisierten Rezipienten übertragen.
Ergebnisse von Beispiel 1
Die Wärmebehandlung tötete alle Zellen und induzierte eine evidente Denaturierung in allen Zellenkompartments, einschließlich der zytoplasmatischen Membrane, die vollständig entfernt wurde.
Erwärmte gefriergetrocknete Zellen zeigten dieselben Merkmale wie die frischen.
Die Ergebnisse von Beispiel 2 sind in der Tabelle 1 zusammengefasst:
Tabelle 1
Entwicklung zum Blastozystenstadium von frischen und wärmebehandelten Granulosazellen, transplantiert in entkernte Metaphase II Oozyten.
Im Durchschnitt entwickelten sich 60 % von kultivierten Embryonen in der frischen Gruppe und mehr als 70 % in beiden 55 und 75 °C Gruppen zum Morulastadium (Bereich: 2-25-Zellen); jedoch wurden nur Blastozystenstadiumembryonen betrachtet.
Blastozysten von allen Gruppen (Gesamtanzahl 50) wurden in Rezipientenmutterschafe zur fristgemäflen Entwicklung übertragen, wovon die Ergebnisse in der Tabelle 2 zusammengefasst sind. Tabelle 2
Drei Rezipienten wurden noch nicht untersucht, so dass sich der Anteil von schwangeren Tieren wahrscheinlich ändert. Tabelle 3 Entwicklung von Embryonen, die mit denaturierten, gefriergetrockneten Granulosazellen rekonstruiert wurden

* Kein Embryo entwickelte sich bei diesem vorausgehenden Versuch zu Blastozysten, wahrscheinlich, weil die Qualität der Oozyten, die als ein Rezipientenzytoblast verwendet wurden, sehr schlecht war. Jedoch wird nicht ausgeschlossen, dass gefriergetrocknete Zellen durch das Verfahren erfolgreich neu programmiert werden können, das mit der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wird.

Claims

Verfahren zum Rekonstruieren eines Tierembryos einer nicht menschlichen Säugetierspezies, enthaltend den Schritt des Übertragens eines Diploidzellkerns von einer Donatorzelle oder der Donatorzelle, die den Zellkern enthält, in eine Rezipientenzelle, welche Donatorzelle eine G1- oder G0-Zelle von einer nicht menschlichen Säugetierspezies ist und welche Rezipientenzelle eine zellkernlose Metaphase-II-Oozyte einer nicht menschlichen Säugetierspezies ist, wobei das Chromatin innerhalb des Zellkerns denaturierenden Bedingungen vor dem Übertragen in die Rezipientenzelle ausgesetzt wird, welche Rezipientenzelle ferner in vitro oder in vivo kultiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Denaturierungsbedingungen Wärmebehandlung oder jegliche Kombination von Temperatur, pH, ionische Stärke und andere Chromatin denaturierende Mittel sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wärmebehandlung bei einer Schmelztemperatur der transkriptionalen Regelproteine ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wärmebehandlung in einen Bereich von 45 °C bis 95 °C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wärmebehandlung bei 55 °C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wärmebehandlung bei 75 °C ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, wobei das Chromatin in Chromosomen organisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Donatorzelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus embryonischer Zelle, fötaler Zelle, somatischer Zelle besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Donatorzelle eine kultivierte Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Donatorzelle eine Granulosazelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Donatorzelle eine tote Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Chromatin wenigstens einer genetischen Modifikation unterzogen ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die genetische Modifikation das Einführen von wenigstens einer heterelogenen DNA-Sequenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die genetische Modifikation das Entfernen von wenigstens einem homologenen Gen enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die genetische Modifikation die Modifikation wenigstens eines homologenen Genes enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die genetische Modifikation die Duplizierung wenigstens eines homologenen Genes enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Denaturierungsbehandlung an dem Nukleoproteingefüge ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Denaturierungsbehandlung an dem Zellkern innerhalb der Donatorzellen ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Denaturierungsbehandlung an dem Zellkern außerhalb der Donatorzelle ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, wobei die Oozyte in vitro gereift ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Zellkernübertragung durch Injektion ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 21, wobei der Tierembryo zu einer Spezies gehört, die aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen und Pelzspezies besteht.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 21, wobei die nicht menschliche Säugetierspezies eine Huftierspezies ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Huftierspezies aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Rind, Schaf, Ziege, Schwein, Wasserbüffel und Pferd besteht.
Verfahren zum Erzeugen eines nicht transgenen Tieres, enthaltend die folgenden Operationen: a. Kultivieren eines Tierembryos, der nach einem der Ansprüche 1 bis 11 rekonstruiert wurde, um Blastozysten zu erhalten; b. Übertragen der Blastozysten in ein geeignetes nicht menschliches Rezipententier; c. Veranlassen, dass sich der Tierembryo in bezeichneter Weise entwickelt, und weiteres Brüten des resultierenden Tieres.
Verfahren zum Erzeugen eines genetisch modifizierten Tieres, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Huftiere, wie im Anspruch 23 beansprucht ist, enthaltend die folgenden Operationen: a. Kultivieren eines genetisch modifizierten Tierembryos, der gemäß einem der Ansprüche 3 bis 16 rekonstruiert wurde, um Blastozysten zu erhalten; b. Übertragen der Blastozysten in ein geeignetes nicht menschliches Rezipiententier; c. Veranlassen, dass sich der Tierembryo in bezeichneter Weise entwickelt, und weiteres Brüten des resultierenden Tieres.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei der Embryo subkloniert wird, um mehr als ein sich in bezeichneter Weise entwickelndes Tier zu erhalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 oder 27 in Abhängigkeit von Anspruch 26, wobei der Embryo der Operation a. vor dem Entwickeln in bezeichneter Weise genetisch modifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26, 27, in Abhängigkeit von Anspruch 26, oder 28, wobei die Operation a. in vitro ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26, 27, in Abhängigkeit von Anspruch 26 oder 28, wobei die Operation a. in vivo ausgeführt wird.