JP2677154B2 - 総ケトン体の測定方法および測定試薬 - Google Patents
総ケトン体の測定方法および測定試薬Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は検体中の総ケトン体の測
定方法に関し、更に詳細には、臨床検査の分野で糖尿病
の診断マーカーとして周知である、体液中、特に血清、
血漿または尿中のアセト酢酸および３−ヒドロキシ酪酸
の総量（以下、総ケトン体という）の測定方法並びにそ
のための測定試薬に関する。本発明は酵素を用い、簡便
で高精度の測定方法並びにそのための測定試薬を提供す
るものである。
定方法に関し、更に詳細には、臨床検査の分野で糖尿病
の診断マーカーとして周知である、体液中、特に血清、
血漿または尿中のアセト酢酸および３−ヒドロキシ酪酸
の総量（以下、総ケトン体という）の測定方法並びにそ
のための測定試薬に関する。本発明は酵素を用い、簡便
で高精度の測定方法並びにそのための測定試薬を提供す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】糖質の供給不足あるいは利用障害、スト
レス、運動過多、糖尿病等において糖代謝が障害を受け
ると、代替的に脂質代謝が亢進し脂肪組織から多量の脂
肪酸が遊離する。遊離した脂肪酸は、肝ミトコンドリア
でβ酸化を受け、その結果として体液中のアセト酢酸や
３−ヒドロキシ酪酸量が増加することが知られている。
これらの化合物を測定することは、特に糖尿病の病体把
握に有用であり、臨床的に極めて意義が深いものとされ
ている。（繁田 幸男：ケトン体 日本臨床 ４０秋季
臨時増刊号 ２５０（１９８２））これまでのケトン体
測定法としては、（１）ガスクロマトグラフィーによる
もの（Ａｎａｌｇｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７ ２３５
（１９７２）を参照、以下ＧＣ法と言う）、（２）ニト
ロプルシッドによるアセトン、アセト酢酸の呈色を利用
する半定量法（以下、半定量法と言う）、（３）アセト
酢酸を、ｐ−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロボレ
ートのジアゾニウム塩とカップリングさせることにより
呈色させ比色定量する方法。（特開昭５５−１５００４
を参照）またその改良法として、界面活性剤の存在下で
アセト酢酸とｐ−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロ
ボレートとを反応させた後にアルカリ化して安定なアゾ
化合物を生成させ、これを比色定量する方法（特開昭５
９−５９５９を参照。以下これらを比色法と言う）、
（４）３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いる酵素法
（繁田 幸男：日本臨床３８ ６３８（１９８０）、Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓｏｍ Ｄ．Ｈ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
８２ ９０−９６（１９６２）を参照。以下酵素法と言
う）、および（５）３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素によ
る酵素的サイクリング反応を利用した方法（特開平０４
−１５８７７９を参照。以下酵素サイクリング法と言
う）、が報告されている。
レス、運動過多、糖尿病等において糖代謝が障害を受け
ると、代替的に脂質代謝が亢進し脂肪組織から多量の脂
肪酸が遊離する。遊離した脂肪酸は、肝ミトコンドリア
でβ酸化を受け、その結果として体液中のアセト酢酸や
３−ヒドロキシ酪酸量が増加することが知られている。
これらの化合物を測定することは、特に糖尿病の病体把
握に有用であり、臨床的に極めて意義が深いものとされ
ている。（繁田 幸男：ケトン体 日本臨床 ４０秋季
臨時増刊号 ２５０（１９８２））これまでのケトン体
測定法としては、（１）ガスクロマトグラフィーによる
もの（Ａｎａｌｇｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７ ２３５
（１９７２）を参照、以下ＧＣ法と言う）、（２）ニト
ロプルシッドによるアセトン、アセト酢酸の呈色を利用
する半定量法（以下、半定量法と言う）、（３）アセト
酢酸を、ｐ−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロボレ
ートのジアゾニウム塩とカップリングさせることにより
呈色させ比色定量する方法。（特開昭５５−１５００４
を参照）またその改良法として、界面活性剤の存在下で
アセト酢酸とｐ−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロ
ボレートとを反応させた後にアルカリ化して安定なアゾ
化合物を生成させ、これを比色定量する方法（特開昭５
９−５９５９を参照。以下これらを比色法と言う）、
（４）３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いる酵素法
（繁田 幸男：日本臨床３８ ６３８（１９８０）、Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓｏｍ Ｄ．Ｈ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
８２ ９０−９６（１９６２）を参照。以下酵素法と言
う）、および（５）３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素によ
る酵素的サイクリング反応を利用した方法（特開平０４
−１５８７７９を参照。以下酵素サイクリング法と言
う）、が報告されている。
【０００３】ケトン体の測定の対象となる検体はヒトの
体液、特に主として糖尿病患者の血清または血漿であ
る。ケトン体はアセト酢酸と３−ヒドロキシ酪酸の総称
であり、通常３−ヒドロキシ酪酸がアセト酢酸に比べて
高濃度を占め、病態時にはさらにその差が開く傾向にあ
る。アセトンは気化しやすく不安定であり、呼気からも
排出されるために一般的にあまり測定されない。
体液、特に主として糖尿病患者の血清または血漿であ
る。ケトン体はアセト酢酸と３−ヒドロキシ酪酸の総称
であり、通常３−ヒドロキシ酪酸がアセト酢酸に比べて
高濃度を占め、病態時にはさらにその差が開く傾向にあ
る。アセトンは気化しやすく不安定であり、呼気からも
排出されるために一般的にあまり測定されない。
【０００４】したがって、本発明でいうケトン体は「ア
セト酢酸と３−ヒドロキシ酪酸とを合わせたもの」を意
味するものとする。
セト酢酸と３−ヒドロキシ酪酸とを合わせたもの」を意
味するものとする。
【０００５】これまでのケトン体測定法の問題点を列記
すると以下のようになる。ＧＣ法はアセト酢酸および３
−ヒドロキシ酪酸を化学的にアセトンに転換させこのア
セトンを測定するものである。この方法は検体前処理を
必須とし多数の検体を処理するには問題を有する。
すると以下のようになる。ＧＣ法はアセト酢酸および３
−ヒドロキシ酪酸を化学的にアセトンに転換させこのア
セトンを測定するものである。この方法は検体前処理を
必須とし多数の検体を処理するには問題を有する。
【０００６】半定量法は、糖質の補給やインシュリンの
投与などの早急の処置を必要とする場合の指標として意
義がある。しかしながら、この方法は分子中の活性水素
を検出するという原理を用いるため、検体中に夾雑する
活性水素を有する化合物により妨害を受け、さらに活性
水素を持たない３−ヒドロキシ酪酸を測定できないとい
う本質的な欠陥がある。またアセト酢酸で０．５ｍＭ、
アセトンで２ｍＭ以上になって初めて検出し得る程度の
低感度であり、正常値付近での判定は不可能である。
投与などの早急の処置を必要とする場合の指標として意
義がある。しかしながら、この方法は分子中の活性水素
を検出するという原理を用いるため、検体中に夾雑する
活性水素を有する化合物により妨害を受け、さらに活性
水素を持たない３−ヒドロキシ酪酸を測定できないとい
う本質的な欠陥がある。またアセト酢酸で０．５ｍＭ、
アセトンで２ｍＭ以上になって初めて検出し得る程度の
低感度であり、正常値付近での判定は不可能である。
【０００７】比色法は感度が高く、短時間で測定できる
点で優れているが、測定操作に先立って検体に除タンパ
ク処理又は透析処理を施す必要がある。したがって、多
数の検体を測定対象とする自動分析装置への適用には適
していない。
点で優れているが、測定操作に先立って検体に除タンパ
ク処理又は透析処理を施す必要がある。したがって、多
数の検体を測定対象とする自動分析装置への適用には適
していない。
【０００８】酵素法は、３−ヒドロキシ酪酸の測定には
特に問題はない。しかしながら、アセト酢酸を測定する
場合、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（還元型ＮＡＤ）の消費量を測定するため高い吸光度域
において僅かな吸光度減少を測定するという原理上必然
的に測定精度が犠牲となる、という欠点を持っている。
特に問題はない。しかしながら、アセト酢酸を測定する
場合、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（還元型ＮＡＤ）の消費量を測定するため高い吸光度域
において僅かな吸光度減少を測定するという原理上必然
的に測定精度が犠牲となる、という欠点を持っている。
【０００９】酵素サイクリング法は感度が極めて高く、
検体前処理も必要としない特長を有し多数の検体を測定
対象とする自動分析装置へ容易に適用しうる測定法であ
る。しかしながら、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の補
酵素となりにくいチオニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（チオＮＡＤ）を使用するため、通常では考えら
れない高濃度の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を必要と
する。そのため経済的観点からみて実用性に問題があ
る。また、ＮＡＤのアナログである還元型チオＮＡＤの
極大吸収波長が４００ｎｍ付近であり、その波長で測定
を行うため、溶血、ビリルビン等の影響も受けやすい、
という問題がある。
検体前処理も必要としない特長を有し多数の検体を測定
対象とする自動分析装置へ容易に適用しうる測定法であ
る。しかしながら、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の補
酵素となりにくいチオニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（チオＮＡＤ）を使用するため、通常では考えら
れない高濃度の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を必要と
する。そのため経済的観点からみて実用性に問題があ
る。また、ＮＡＤのアナログである還元型チオＮＡＤの
極大吸収波長が４００ｎｍ付近であり、その波長で測定
を行うため、溶血、ビリルビン等の影響も受けやすい、
という問題がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】以上に示したこれまで
のケトン体測定法の欠点を解決し、検体中のケトン体を
検体前処理を必要とせずに簡便、迅速にかつ高精度に測
定できる方法、さらに汎用の自動分析装置を用いて測定
できる方法およびそのための試薬を提供することが本発
明の目的である。
のケトン体測定法の欠点を解決し、検体中のケトン体を
検体前処理を必要とせずに簡便、迅速にかつ高精度に測
定できる方法、さらに汎用の自動分析装置を用いて測定
できる方法およびそのための試薬を提供することが本発
明の目的である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】検体中のアセト酢酸およ
び３−ヒドロキシ酪酸の酵素的な測定法は下記の反応を
利用している。
び３−ヒドロキシ酪酸の酵素的な測定法は下記の反応を
利用している。
【００１２】
【式１】 ３−ＨＢ ：３−ヒドロキシ酪酸 ＡｃＡ ：アセト酢酸 ３−ＨＢＤ ：３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素 ＮＡＤ+ ：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド ＮＡＤＨ ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド 本反応に基づく３−ＨＢの測定法は生成するＮＡＤＨの
紫外線吸収を測定するものであるが検体量を充分に取れ
ば、正常域（５９±３３μＭ：日本臨床 ４０秋季臨時
増刊号 ２５０（１９８２））においてもほぼ満足のい
く測定精度を示す。しかしながら本反応に基づくＡｃＡ
測定については、消費されるＮＡＤＨを測定することに
よって間接的に決定するため、充分な測定範囲をもつよ
うに設定された高い吸光度域（高濃度ＮＡＤＨ域）にお
いて低濃度の検体を測定する場合、僅かな吸光度減少を
測定することになるため測定値の精度が低くなる。（坂
本信夫：綜合臨床４０ １３５９−６４（１９９１）） 我々は３−ＨＢの測定法における利点即ち、低い吸光度
域（低濃度ＮＡＤＨ域）において生成するＮＡＤＨの吸
光度を測定し、定量する場合にほぼ満足のいく測定精度
を示す点に着目し、さらに乳酸脱水素酵素による妨害反
応、測定時における他の共存物質の影響に対する対策、
試薬の安定化等を考慮して鋭意検討を重ねた結果、本発
明を完成させた。
オチド ＮＡＤＨ ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド 本反応に基づく３−ＨＢの測定法は生成するＮＡＤＨの
紫外線吸収を測定するものであるが検体量を充分に取れ
ば、正常域（５９±３３μＭ：日本臨床 ４０秋季臨時
増刊号 ２５０（１９８２））においてもほぼ満足のい
く測定精度を示す。しかしながら本反応に基づくＡｃＡ
測定については、消費されるＮＡＤＨを測定することに
よって間接的に決定するため、充分な測定範囲をもつよ
うに設定された高い吸光度域（高濃度ＮＡＤＨ域）にお
いて低濃度の検体を測定する場合、僅かな吸光度減少を
測定することになるため測定値の精度が低くなる。（坂
本信夫：綜合臨床４０ １３５９−６４（１９９１）） 我々は３−ＨＢの測定法における利点即ち、低い吸光度
域（低濃度ＮＡＤＨ域）において生成するＮＡＤＨの吸
光度を測定し、定量する場合にほぼ満足のいく測定精度
を示す点に着目し、さらに乳酸脱水素酵素による妨害反
応、測定時における他の共存物質の影響に対する対策、
試薬の安定化等を考慮して鋭意検討を重ねた結果、本発
明を完成させた。
【００１３】検体中のＡｃＡを式１のように反応させて
３−ＨＢに変換する場合、ＮＡＤＨが定量的に消費され
ながら反応が完結する。この場合高濃度のＡｃＡを測定
するためには、それに見あうＮＡＤＨを反応系に添加し
なければならない。しかし充分量のＮＡＤＨを存在させ
る場合、当然ながら初期吸光度は高い状態にある。この
ような状態において、正常域程度の低濃度の検体を反応
させて得られる僅かな吸光度変化は、初期吸光度（高吸
光度）のノイズに隠されて正確に測定できない。本発明
者等はこの点に着目し、検討を重ねた結果、ＡｃＡを３
−ＨＢに変換する反応において、添加する還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の濃度を
０．２ｍＭ以下好ましくは０．０１〜０．１０ｍＭ程度
の低濃度とし、さらに酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ+）を補酵素としてＮＡＤＨを生
成する別の酵素反応（例えば、イソクエン酸脱水素酵素
（ＥＣ１．１．１．４１））を共役させることにより、
初期吸光度を低い状態で保ちながらＡｃＡを３−ＨＢに
変換しうることを見出した。即ち、低濃度のＮＡＤＨを
用い、共役酵素反応でＮＡＤＨを供給しながら、ＡｃＡ
を完全に３−ＨＢに変換する。その後過剰量のＮＡＤを
添加し、さらに反応ｐＨをアルカリ域にシフトさせるこ
とにより検体中に最初から存在する３−ＨＢとＡｃＡか
ら変換された３−ＨＢとを全てＡｃＡに変換する。この
際、反応に伴って生じるＮＡＤＨの吸光度を測定するこ
とにより精度良く検体中のＡｃＡを３−ＨＢと共に測定
しうることを見出した。またＮＡＤＨを生成する酵素反
応を共役させることによりｐＨ７〜７．５程度の弱アル
カリ域においても添加してある還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドが変性劣化せず安定に存在し、し
かも乳酸脱水素酵素を共役させることにより従来から問
題とされていた、高乳酸脱水素酵素検体測定時の誤差を
完全に回避しうることに成功した。
３−ＨＢに変換する場合、ＮＡＤＨが定量的に消費され
ながら反応が完結する。この場合高濃度のＡｃＡを測定
するためには、それに見あうＮＡＤＨを反応系に添加し
なければならない。しかし充分量のＮＡＤＨを存在させ
る場合、当然ながら初期吸光度は高い状態にある。この
ような状態において、正常域程度の低濃度の検体を反応
させて得られる僅かな吸光度変化は、初期吸光度（高吸
光度）のノイズに隠されて正確に測定できない。本発明
者等はこの点に着目し、検討を重ねた結果、ＡｃＡを３
−ＨＢに変換する反応において、添加する還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の濃度を
０．２ｍＭ以下好ましくは０．０１〜０．１０ｍＭ程度
の低濃度とし、さらに酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ+）を補酵素としてＮＡＤＨを生
成する別の酵素反応（例えば、イソクエン酸脱水素酵素
（ＥＣ１．１．１．４１））を共役させることにより、
初期吸光度を低い状態で保ちながらＡｃＡを３−ＨＢに
変換しうることを見出した。即ち、低濃度のＮＡＤＨを
用い、共役酵素反応でＮＡＤＨを供給しながら、ＡｃＡ
を完全に３−ＨＢに変換する。その後過剰量のＮＡＤを
添加し、さらに反応ｐＨをアルカリ域にシフトさせるこ
とにより検体中に最初から存在する３−ＨＢとＡｃＡか
ら変換された３−ＨＢとを全てＡｃＡに変換する。この
際、反応に伴って生じるＮＡＤＨの吸光度を測定するこ
とにより精度良く検体中のＡｃＡを３−ＨＢと共に測定
しうることを見出した。またＮＡＤＨを生成する酵素反
応を共役させることによりｐＨ７〜７．５程度の弱アル
カリ域においても添加してある還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドが変性劣化せず安定に存在し、し
かも乳酸脱水素酵素を共役させることにより従来から問
題とされていた、高乳酸脱水素酵素検体測定時の誤差を
完全に回避しうることに成功した。
【００１４】本発明の検体中の総ケトン体測定法では、
２段階の反応を経てから分光光度計で吸光度を測定す
る。第１段反応では検体中のＡｃＡを低濃度に制御した
ＮＡＤＨの存在下において３−ＨＢＤの作用により完全
に３−ＨＢに導く。この時消費されるＮＡＤＨはＮＡＤ
Ｈを生成する別の酵素反応（例えば、イソクエン酸脱水
素酵素（ＥＣ１．１．１．４１））を共役させることに
より、高濃度のＡｃＡを反応させた場合においても短時
間でＮＡＤＨは初期レベル（高濃度にはならないレベ
ル）に回復する。またこの第１段反応において、添加し
てある乳酸脱水素酵素の作用により検体中のピルビン酸
が速やかに乳酸に変換され、この時消費されるＮＡＤＨ
は、ＮＡＤＨを生成する別の酵素反応を共役させること
によりＡｃＡを反応させた場合と同様に、短時間でＮＡ
ＤＨは初期レベルに回復する。第２段反応では過剰量の
ＮＡＤを添加し、反応ｐＨをアルカリ域にシフトさせる
ことにより３−ＨＢからＡｃＡへの反応を開始させる。
これと同時に、第１反応においてＮＡＤＨを生成した酵
素反応の阻害剤を添加し、さらに乳酸脱水素酵素の周知
の阻害剤を添加することにより副反応を停止させ、検体
中のＡｃＡを３−ＨＢに変換すると共にＮＡＤＨの生成
反応を正確に導き、生成ＮＡＤＨの量を吸光度増加量と
して捉える。（実施例１，２参照） 前述のように第１段反応におけるＮＡＤＨの濃度を低濃
度に即ち低い吸光度に制御すると共に、第２段反応にお
いて、ＡｃＡの３−ＨＢへの変換におけるＮＡＤＨの生
成反応に基づく吸光度の増加として総ケトン体濃度を捉
えることができる。この方法により、自動分析装置によ
る高精度な総ケトン体の測定が可能となった。またＮＡ
ＤＨを生成する別の酵素反応の共役により、ＮＡＤＨの
安定化がなされ、さらに乳酸脱水素酵素反応を共役させ
ることにより従来から問題とされていた、高乳酸脱水素
酵素検体測定時の誤差を完全に回避できた。（実施例５
参照） 乳酸脱水素酵素の添加の理由は、検体中のピルビン酸を
乳酸に変換するためである。検体中にピルビン酸が存在
すると、乳酸脱水素酵素による逆反応によって乳酸を生
じる際にＮＡＤＨがＮＡＤ+に変換されてしまうため主
反応で生じたＮＡＤＨが減少し、測定誤差を生じる。こ
の現象は乳酸脱水素酵素を多く含む検体ほど顕著であ
り、ケトン体測定の障害となる。
２段階の反応を経てから分光光度計で吸光度を測定す
る。第１段反応では検体中のＡｃＡを低濃度に制御した
ＮＡＤＨの存在下において３−ＨＢＤの作用により完全
に３−ＨＢに導く。この時消費されるＮＡＤＨはＮＡＤ
Ｈを生成する別の酵素反応（例えば、イソクエン酸脱水
素酵素（ＥＣ１．１．１．４１））を共役させることに
より、高濃度のＡｃＡを反応させた場合においても短時
間でＮＡＤＨは初期レベル（高濃度にはならないレベ
ル）に回復する。またこの第１段反応において、添加し
てある乳酸脱水素酵素の作用により検体中のピルビン酸
が速やかに乳酸に変換され、この時消費されるＮＡＤＨ
は、ＮＡＤＨを生成する別の酵素反応を共役させること
によりＡｃＡを反応させた場合と同様に、短時間でＮＡ
ＤＨは初期レベルに回復する。第２段反応では過剰量の
ＮＡＤを添加し、反応ｐＨをアルカリ域にシフトさせる
ことにより３−ＨＢからＡｃＡへの反応を開始させる。
これと同時に、第１反応においてＮＡＤＨを生成した酵
素反応の阻害剤を添加し、さらに乳酸脱水素酵素の周知
の阻害剤を添加することにより副反応を停止させ、検体
中のＡｃＡを３−ＨＢに変換すると共にＮＡＤＨの生成
反応を正確に導き、生成ＮＡＤＨの量を吸光度増加量と
して捉える。（実施例１，２参照） 前述のように第１段反応におけるＮＡＤＨの濃度を低濃
度に即ち低い吸光度に制御すると共に、第２段反応にお
いて、ＡｃＡの３−ＨＢへの変換におけるＮＡＤＨの生
成反応に基づく吸光度の増加として総ケトン体濃度を捉
えることができる。この方法により、自動分析装置によ
る高精度な総ケトン体の測定が可能となった。またＮＡ
ＤＨを生成する別の酵素反応の共役により、ＮＡＤＨの
安定化がなされ、さらに乳酸脱水素酵素反応を共役させ
ることにより従来から問題とされていた、高乳酸脱水素
酵素検体測定時の誤差を完全に回避できた。（実施例５
参照） 乳酸脱水素酵素の添加の理由は、検体中のピルビン酸を
乳酸に変換するためである。検体中にピルビン酸が存在
すると、乳酸脱水素酵素による逆反応によって乳酸を生
じる際にＮＡＤＨがＮＡＤ+に変換されてしまうため主
反応で生じたＮＡＤＨが減少し、測定誤差を生じる。こ
の現象は乳酸脱水素酵素を多く含む検体ほど顕著であ
り、ケトン体測定の障害となる。
【００１５】本発明では検体中のピルビン酸をＮＡＤＨ
と乳酸脱水素酵素により予じめ乳酸に転化しておき、ピ
ルビン酸による障害を除いておく。次いで、第２段階反
応では乳酸がピルビン酸となる逆反応が起らないよう乳
酸脱水素酵素の阻害剤を用いる。
と乳酸脱水素酵素により予じめ乳酸に転化しておき、ピ
ルビン酸による障害を除いておく。次いで、第２段階反
応では乳酸がピルビン酸となる逆反応が起らないよう乳
酸脱水素酵素の阻害剤を用いる。
【００１６】本発明の測定法の反応機構は以下のような
式で表わすことができる。尚、使用試薬については好ま
しい例示である。
式で表わすことができる。尚、使用試薬については好ま
しい例示である。
【００１７】
【式２】
【００１８】
【式３】 本発明において、上記反応第１段階で３−ＨＢＤ（およ
び乳酸脱水素酵素）との共役反応に利用可能な酵素は、
例示したイソクエン酸脱水素反応以外に次の酵素を使用
できる。
び乳酸脱水素酵素）との共役反応に利用可能な酵素は、
例示したイソクエン酸脱水素反応以外に次の酵素を使用
できる。
【００１９】 アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１） グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．
１．１．４９） アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．５）お
よび（ＥＣ１．２．１．３） グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）
および（ＥＣ１．１．１．１１９） 実施に際しては共役反応に用いる上で最も好ましいのは
イソクエン酸脱水素酵素である。
１．１．４９） アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．５）お
よび（ＥＣ１．２．１．３） グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）
および（ＥＣ１．１．１．１１９） 実施に際しては共役反応に用いる上で最も好ましいのは
イソクエン酸脱水素酵素である。
【００２０】それぞれの酵素の使用については、本発明
の反応及び吸光度測定を妨害しない基質を用いることが
できる。
の反応及び吸光度測定を妨害しない基質を用いることが
できる。
【００２１】反応第２段階で使用される酵素阻害剤とし
ては次のものが使用できる。
ては次のものが使用できる。
【００２２】イソクエン酸脱水素酵素に対しては、一般
的に使用されているキレート剤、例えばＥＤＴＡ、及び
トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−酢酸等がある。
的に使用されているキレート剤、例えばＥＤＴＡ、及び
トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−酢酸等がある。
【００２３】乳酸脱水素酵素の阻害剤としてはシュウ
酸、オキサミン酸等がある。
酸、オキサミン酸等がある。
【００２４】また本発明の第１段階反応は使用共役酵素
の種類等によって異なるが通常ｐＨ７．０〜７．５、好
しくはｐＨ７．３〜７．５で行われる。第２段階反応は
通常ｐＨ８．０〜９．０、好しくはｐＨ８．７〜８．９
で行われる。
の種類等によって異なるが通常ｐＨ７．０〜７．５、好
しくはｐＨ７．３〜７．５で行われる。第２段階反応は
通常ｐＨ８．０〜９．０、好しくはｐＨ８．７〜８．９
で行われる。
【００２５】
【実施例】次に実施例により、本発明をさらに詳細かつ
具体的に説明する。
具体的に説明する。
【００２６】
【実施例１】 総ケトン体測定における検量線 ０〜１０００μｍｏｌ／ｌの濃度のＡｃＡ及び３−ＨＢ
を本発明の方法により反応させた場合に得られる検量線
を図１（ＡｃＡ検量線）及び図２（３−ＨＢ検量線）に
示した。反応条件は下記の通りである。
を本発明の方法により反応させた場合に得られる検量線
を図１（ＡｃＡ検量線）及び図２（３−ＨＢ検量線）に
示した。反応条件は下記の通りである。
【００２７】各濃度のＡｃＡ及び３−ＨＢを検体とし、
これら２０μｌに対して以下の組成の第１試薬２４０μ
ｌ、第２試薬６０μｌを反応させ日立７１５０型自動分
析装置により主波長３４０ｎｍ、副波長７００ｎｍとし
２４〜５０測光ポイント間において吸光度変化量を測定
した。
これら２０μｌに対して以下の組成の第１試薬２４０μ
ｌ、第２試薬６０μｌを反応させ日立７１５０型自動分
析装置により主波長３４０ｎｍ、副波長７００ｎｍとし
２４〜５０測光ポイント間において吸光度変化量を測定
した。
【００２８】第１試薬 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ８０ｍＭ ＮａＣｌ ６０ｍＭ 酢酸マグネシウム＊1 １０ｍＭ ＤＬ−イソクエン酸 ２ｍＭ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ０．０５ｍＭ アデノシン−５’−モノホスフェート＊2 １ｍＭ イソクエン酸脱水素酵素 １０００Ｕ／ｌ ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素 ２０００Ｕ／ｌ 乳酸脱水素酵素 １０００Ｕ／ｌ ｐＨ７．４０ ＊１：イソクエン酸脱水素酵素が活性を有するための補因子であるＭｇ+2の供給 源 ＊２：イソクエン酸脱水素酵素を活性化するための補因子第２試薬 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５００ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン− Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸 ５０ｍＭ シュウ酸 ２００ｍＭ 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ５ｍＭ ｐＨ８．８０ ＡｃＡは３−ＨＢの検量線と同様に還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドの生成反応として捉えられ、
低濃度から高濃度にわたって良好な直線性を示した。
ドアデニンジヌクレオチドの生成反応として捉えられ、
低濃度から高濃度にわたって良好な直線性を示した。
【００２９】
【実施例２】 総ケトン体測定における反応タイムコー
ス 実施例１に示した検量線における反応タイムコースを図
３（ＡｃＡ）及び図４（３−ＨＢ）に示した。図におけ
る横軸は日立７１５０型自動分析装置における測光ポイ
ントを示し、縦軸は主波長３４０ｎｍ、副波長７００ｎ
ｍにおける吸光度を示す。
ス 実施例１に示した検量線における反応タイムコースを図
３（ＡｃＡ）及び図４（３−ＨＢ）に示した。図におけ
る横軸は日立７１５０型自動分析装置における測光ポイ
ントを示し、縦軸は主波長３４０ｎｍ、副波長７００ｎ
ｍにおける吸光度を示す。
【００３０】図３において、第１段反応では検体中のＡ
ｃＡを低濃度に制御したＮＡＤＨの存在下において３−
ＨＢＤの作用により完全に３−ＨＢに導く。この時消費
されるＮＡＤＨは還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを生成するイソクエン酸脱水素酵素による反応
の共役により、高濃度のＡｃＡを反応させた場合におい
ても短時間でＮＡＤＨは初期レベルに回復する。第２段
反応では過剰量のＮＡＤを添加し、反応ｐＨをアルカリ
域にシフトさせることにより３−ＨＢからＡｃＡへの反
応が進行し、５分間という短時間において反応は完結す
る。
ｃＡを低濃度に制御したＮＡＤＨの存在下において３−
ＨＢＤの作用により完全に３−ＨＢに導く。この時消費
されるＮＡＤＨは還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを生成するイソクエン酸脱水素酵素による反応
の共役により、高濃度のＡｃＡを反応させた場合におい
ても短時間でＮＡＤＨは初期レベルに回復する。第２段
反応では過剰量のＮＡＤを添加し、反応ｐＨをアルカリ
域にシフトさせることにより３−ＨＢからＡｃＡへの反
応が進行し、５分間という短時間において反応は完結す
る。
【００３１】図４において、検体中の３−ＨＢは第１段
反応ではなんら変化を受けず、第２段反応によりＡｃＡ
へ反応が進行し、５分間という短時間において反応は完
結する。
反応ではなんら変化を受けず、第２段反応によりＡｃＡ
へ反応が進行し、５分間という短時間において反応は完
結する。
【００３２】
【実施例３】 総ケトン体測定における添加回収試験 種々の総ケトン体濃度の患者血清と、それらにＡｃＡ及
び３−ＨＢを既知量添加し調製した検体を、実施例１の
測定条件において測定し、加えたＡｃＡ及び３−ＨＢの
回収率により本測定条件における測定値の正確性を検討
した。結果を表１（ＡｃＡ）、表２（３−ＨＢ）に示
す。
び３−ＨＢを既知量添加し調製した検体を、実施例１の
測定条件において測定し、加えたＡｃＡ及び３−ＨＢの
回収率により本測定条件における測定値の正確性を検討
した。結果を表１（ＡｃＡ）、表２（３−ＨＢ）に示
す。
【００３３】平均回収率はほぼ１００％であり、本測定
条件における測定値の正確性が示される。
条件における測定値の正確性が示される。
【００３４】
【表１】
【表２】
【００３５】
【実施例４】 総ケトン体測定における測定精度 同時再現性において、本発明の総ケトン体測定法におけ
るＡｃＡ測定精度を、従来の吸光度減衰における方法と
比較した。測定条件は実施例１に示した通りである。
るＡｃＡ測定精度を、従来の吸光度減衰における方法と
比較した。測定条件は実施例１に示した通りである。
【００３６】従来の吸光度減衰法としては、株式会社三
和化学研究所の血中アセト酢酸測定用“ケトンテストＡ
「三和」”を能書に従って使用し、日立７１５０型自動
分析装置により測定を行った。
和化学研究所の血中アセト酢酸測定用“ケトンテストＡ
「三和」”を能書に従って使用し、日立７１５０型自動
分析装置により測定を行った。
【００３７】正常者プール血清にＡｃＡを５０、１０
０、２００μＭそれぞれ添加したものを検体とし、同一
の検体を１０回同時測定し得られる吸光度の変動係数に
より測定精度を比較した。
０、２００μＭそれぞれ添加したものを検体とし、同一
の検体を１０回同時測定し得られる吸光度の変動係数に
より測定精度を比較した。
【００３８】結果を表３に示す。
【００３９】吸光度減衰法に比較して、本発明の方法は
極めて高精度であることが示される。
極めて高精度であることが示される。
【００４０】
【表３】
【００４１】
【実施例５】 検体中の乳酸脱水素酵素による測定値へ
の干渉 正常者プール血清に、乳酸脱水素酵素５０００ＩＵ／ｌ
及びピルビン酸２ｍＭ又は乳酸２０ｍＭを添加したもの
と、未添加のプール血清を検体として本発明における方
法により測定して得た吸光度の比較を表４に示す。測定
条件は実施例１の通りである。
の干渉 正常者プール血清に、乳酸脱水素酵素５０００ＩＵ／ｌ
及びピルビン酸２ｍＭ又は乳酸２０ｍＭを添加したもの
と、未添加のプール血清を検体として本発明における方
法により測定して得た吸光度の比較を表４に示す。測定
条件は実施例１の通りである。
【００４２】本発明における方法では、検体中に乳酸脱
水素酵素とその基質であるピルビン酸又は乳酸が高濃度
に存在していても、測定吸光度になんら変化は認められ
ず、これらの影響を完全に回避していることが示され
る。
水素酵素とその基質であるピルビン酸又は乳酸が高濃度
に存在していても、測定吸光度になんら変化は認められ
ず、これらの影響を完全に回避していることが示され
る。
【００４３】
【表４】
【００４４】
【実施例６】 相関性 本発明における総ケトン体測定値の正確性を、既存の方
法との相関性により確認した。既存の方法は以下に示す
通りである。
法との相関性により確認した。既存の方法は以下に示す
通りである。
【００４５】１．ＡｃＡ測定試薬（吸光度減衰法） 製造発売元：株式会社三和化学研究所 販売名 ：血中アセト酢酸測定用“ケトンテストＡ
「三和」” ２．３−ＨＢ測定試薬（吸光度増加法） 製造発売元：株式会社三和化学研究所 販売名 ：血中３−ヒドロキシ酪酸測定用 “ケトンテストＢ「三和」” 本発明における測定は実施例１記載の条件にて行い、既
存の方法における測定は上記の各試薬を添付能書に従っ
て使用し、日立７１５０型自動分析装置により測定を行
った。
「三和」” ２．３−ＨＢ測定試薬（吸光度増加法） 製造発売元：株式会社三和化学研究所 販売名 ：血中３−ヒドロキシ酪酸測定用 “ケトンテストＢ「三和」” 本発明における測定は実施例１記載の条件にて行い、既
存の方法における測定は上記の各試薬を添付能書に従っ
て使用し、日立７１５０型自動分析装置により測定を行
った。
【００４６】“ケトンテストＡ「三和」”と“ケトンテ
ストＢ「三和」”夫々における測定結果の和と本発明に
おける測定値間の相関性を図５に示した。
ストＢ「三和」”夫々における測定結果の和と本発明に
おける測定値間の相関性を図５に示した。
【００４７】結果はほぼＹ＝Ｘであり、かつ相関係数も
１に近い。本発明の測定法は従来の方法と相関性が高
く、非常に高い信頼性を有することが示される。
１に近い。本発明の測定法は従来の方法と相関性が高
く、非常に高い信頼性を有することが示される。
【００４８】
【発明の効果】以上の実施例にも示された通り、本発明
の測定方法は極めて高精度のものであり、自動分析装置
へ容易に適用するものである。すなわち、本発明の方法
により、従来問題であった総ケトン体特にＡｃＡの測定
が簡便化、高精度化し、自動分析装置による信頼性の高
い測定が検体未処理のまま可能となった。
の測定方法は極めて高精度のものであり、自動分析装置
へ容易に適用するものである。すなわち、本発明の方法
により、従来問題であった総ケトン体特にＡｃＡの測定
が簡便化、高精度化し、自動分析装置による信頼性の高
い測定が検体未処理のまま可能となった。
【図１】アセト酢酸における検量線を示す。
【図２】３−ヒドロキシ酪酸における検量線を示す。
【図３】アセト酢酸の検量線における反応タイムコース
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図４】３−ヒドロキシ酪酸の検量線における反応タイ
ムコースを示すグラフである。
ムコースを示すグラフである。
【図５】“ケトンテストＡ「三和」”及び“ケトンテス
トＢ「三和」”夫々における測定結果の和と本発明にお
ける測定値間の相関性を示すグラフである。
トＢ「三和」”夫々における測定結果の和と本発明にお
ける測定値間の相関性を示すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】（１）検体中のアセト酢酸を３−ヒドロキ
シ酪酸に変換し、 （２）検体中に元から存在する３−ヒドロキシ酪酸と上
記（１）で変換された３−ヒドロキシ酪酸との両方を、
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の作用により酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で反応さ
せ、 （３）上記（２）の反応によって生じた還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドの量を測定することから
なる総ケトン体の測定方法。 - 【請求項２】 上記（１）の工程における反応を、３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の作用により、還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下において行う
ことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 上記（１）の工程において、酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてその
還元型に変換する別の酵素反応を共役させることを特徴
とする請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 上記（２）の反応によって生じる還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの量を吸光度と
して測定する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】（１）緩衝剤、 （２）３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素 （３）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、 （４）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、 （５）３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素との共役反応によ
り酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換する酵
素、および（６）上記（５）の酵素の基質、 からなる総ケトン体の測定試薬。 - 【請求項６】更に、上記（６）の酵素の阻害剤を含む請
求項５記載の総ケトン体の測定試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5046628A JP2677154B2 (ja) | 1993-03-08 | 1993-03-08 | 総ケトン体の測定方法および測定試薬 |
| US08/205,797 US5618686A (en) | 1993-03-08 | 1994-03-04 | Method of measuring the total ketone body and a sample reagent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5046628A JP2677154B2 (ja) | 1993-03-08 | 1993-03-08 | 総ケトン体の測定方法および測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253895A JPH06253895A (ja) | 1994-09-13 |
| JP2677154B2 true JP2677154B2 (ja) | 1997-11-17 |
Family
ID=12752565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5046628A Expired - Lifetime JP2677154B2 (ja) | 1993-03-08 | 1993-03-08 | 総ケトン体の測定方法および測定試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5618686A (ja) |
| JP (1) | JP2677154B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7074983B2 (en) * | 1999-11-19 | 2006-07-11 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin |
| US7414170B2 (en) * | 1999-11-19 | 2008-08-19 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovines capable of human antibody production |
| US7820878B2 (en) * | 1999-11-19 | 2010-10-26 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| WO2001035735A1 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Hematech, Llc | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| US6541216B1 (en) | 1999-12-22 | 2003-04-01 | Roche Diagnostics Corporation | Amperometric biosensor test strip |
| US6762035B1 (en) * | 2002-02-04 | 2004-07-13 | Surendra K. Gupta | Method and test strips for the measurement of fat loss during weight loss programs |
| US6703216B2 (en) | 2002-03-14 | 2004-03-09 | The Regents Of The University Of California | Methods, compositions and apparatuses for detection of gamma-hydroxybutyric acid (GHB) |
| AU2003290689A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-06-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Transgenic ungulates having reduced prion protein activity and uses thereof |
| JP2007533328A (ja) | 2004-04-22 | 2007-11-22 | キリンホールディングス株式会社 | トランスジェニック動物及びその用途 |
| US20100268043A1 (en) * | 2007-11-07 | 2010-10-21 | Ofer Yodfat | Device and Method for Preventing Diabetic Complications |
| MX2022015171A (es) | 2020-06-01 | 2023-01-16 | Gambro Lundia Ab | Sistema y metodo de tratamiento sanguineo extracorporeo. |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2237940C3 (de) * | 1972-08-02 | 1980-12-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure |
| CS164231B2 (ja) * | 1972-09-28 | 1975-11-07 | ||
| AT339505B (de) * | 1974-03-14 | 1977-10-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Enzymatisches analysenverfahren |
| JPS5327493A (en) * | 1976-08-27 | 1978-03-14 | Risei Ui | Ultra micro analysis for acetone and kit for carrying out the analysis |
| US4529704A (en) * | 1979-11-05 | 1985-07-16 | Miles Laboratories, Inc. | Device and method for preparation of a control solution for ketone determination. |
| US4517301A (en) * | 1982-12-06 | 1985-05-14 | Miles Laboratories, Inc. | Ketone control test composition, method and test device |
| JPS59162899A (ja) * | 1983-03-08 | 1984-09-13 | Kyoto Daiichi Kagaku:Kk | β‐ヒドロキシ酪酸の定量用組成物 |
| JPH0673475B2 (ja) * | 1985-04-26 | 1994-09-21 | オリエンタル酵母工業株式会社 | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
| US5204267A (en) * | 1991-12-17 | 1993-04-20 | Osborn Laboratories, Inc. | Method of glucose stabilization and analysis in dried blood spot samples |
-
1993
- 1993-03-08 JP JP5046628A patent/JP2677154B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-03-04 US US08/205,797 patent/US5618686A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5618686A (en) | 1997-04-08 |
| JPH06253895A (ja) | 1994-09-13 |
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