JP3653575B2 - 血中のd−アラビニトールの直接比色定量法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、D−アラビニトールの定量方法、カンジダ感染症の診断方法およびカンジダ感染症診断用キットに関する。
【0002】
【従来の技術およびその問題点】
カンジダ症は、真菌感染症の一種であり、特に深在性カンジダ症は白血病や悪性リンパ腫などの造血器悪性腫瘍や臓器移植のため免疫機能の低下した患者などに見られる疾患である。このカンジダ症の患者は、既に免疫機能が低下しており回復が難しいため、早期に発見し、治療する必要がある。
【0003】
深在性のカンジダ感染を判定する手段としては、カンジダ属の主要代謝産物であるD−アラビニトールの血中濃度を測定する方法、カンジダ抗原を検出する方法、カンジダに対する抗体を検出する方法または血液中の微生物を培養し、検鏡観察する方法などがある。
【0004】
これらのうち、D−アラビニトールによる方法は操作が比較的簡単であるため、有用である。この方法は、血中のD−アラビニトール濃度は健常人では数μmol/l であるが、カンジダ症患者では数十μmol/l まで上昇することを利用したものであり、D−アラビニトール脱水素酵素(以下、ARDと略記する)を用いたD−アラビニトール測定用試薬(LABOFIT 、半井化学株式会社製)が既に市販されている。この試薬に使用されているARDは、D−アラビニトールの他に、反応性は低いがD−マンニトールとも交差反応するため、上記測定用試薬は、D−アラビニトールとD−マンニトールの反応速度の差の大きい反応初期の段階でD−アラビニトール濃度を測定してカンジダ感染の有無を判定している。
【0005】
この方法は、試料のD−アラビニトール濃度を短時間に測定できる利点はあるが、ARDの酵素反応初期の段階で反応を測定するため、高感度の検出法である蛍光装置を用いる必要があり、また蛍光分析を行う場合には、測定値のバラツキを抑えるため血清などの生体試料を除蛋白した後測定を行う必要がある。しかしながら、この測定法では病院の臨床検査の現場に余り普及していない高価な蛍光測定装置を用いるため、装置の汎用性に欠け、さらに、測定に先立ち血清等の生体試料の除蛋白を要する点で煩雑である。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ARDによるD−アラビニトール測定の際のD−マンニトールの影響を回避し、かつ前処理が不要で、通常汎用される比色計で簡便に測定できるD−アラビニトールの定量方法を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の測定試薬の問題点を解消するため鋭意検討を重ねた結果、生体試料をまずマンニトール脱水素酵素(以下、MNDと略記する)で処理し、次いでARDで処理することにより、除蛋白などの前処理なしに、汎用されている比色装置を用いて生体試料のD−アラビニトール濃度を測定できることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は、マンニトール脱水素酵素により生体試料中のD−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のD−アラビニトールを比色定量することを特徴とするD−アラビニトールの定量方法を提供するものである。
【0009】
また、本発明は、マンニトール脱水素酵素により生体試料中のD−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のD−アラビニトールを比色定量して生体試料中のD−アラビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感染症の診断方法を提供するものである。
【0010】
さらに、本発明は、マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第1定量部、並びにアラビニトール脱水素酵素および発色系を含む第2定量部を有するカンジダ感染症診断用キットを提供するものである。
【0011】
なお、上記方法等は、D−マンニトールを先ず定量し、次いでD−アラビニトールを定量するものであり、この方法は、1つの測定用セルのみを用いて測定できるものである。しかし、D−マンニトールとD−アラビニトールは、2つの測定用セルを用いて並行して測定してもよく、この場合の定量方法等を以下に示す。
【0012】
1. マンニトール脱水素酵素による生体試料中のD−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるD−アラビニトールとD−マンニトールの総量の比色定量を並行して行うことを特徴とするD−アラビニトールの定量方法。
【0013】
2. マンニトール脱水素酵素による生体試料中のD−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるD−アラビニトールとD−マンニトールの総量の比色定量を並行して行い、生体試料中のD−アラビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感染症の診断方法。3. マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第1定量部、並びにマンニトール脱水素酵素、アラビニトール脱水素酵素および発色系を含む第2定量部を有するカンジダ感染症診断用キット。
【0014】
本発明において、生体試料とは、血液、尿などの体液が挙げられ、通常は血清、血漿などの血液由来の試料が挙げられる。
【0015】
本発明で使用するARDおよびMNDは、いずれの生物由来のものでも用いられ、例えば、ARDはAerobacter aerogenes由来のものが用いられ、MNDはLeuconostoc mesenteroides やLactobacillus brevis由来のものが用いられる。ARDの精製は、例えばFossitt, D.D. & Wood, W.A., Methods in Enzymology 9, 184-186 (1966) の文献の記載に従って行うことができる。また、MNDの精製は、例えばYamanaka, K., Methods in Enzymology, 41, 138-142 (1975) の文献記載に従って行うことができる。
【0016】
本発明で使用する発色系は、脱水素酵素の基質の比色定量に従来用いられている発色系をすべて用いることができ、このような発色系としては、NAD+ (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型)/ジアホラーゼ/NTB(p−ニトロテトラゾリウムブルークロライド)が挙げられ、ジアホラーゼの代わりにフェナジンメトサルフェート(PMS)、あるいは1−メトキシPMSも使用できる。また、テトラゾリウム塩としては、NTB以外にINT(2−(4−ヨードフェニール)−3−(4−ニトロフェニール)−5−フェニール−2H テトラゾリウム・クロライド、あるいはMTT(3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H テトラゾリウム・ブロマイド)が挙げられる。
【0017】
本発明のD−アラビニトールの測定機構を、NAD+ /ジアホラーゼ/NTBを発色系として用いた場合について例示すると、以下のようになる。
【0018】
【化1】
【0019】
反応(1)では、NAD+ の存在下に、D−アラビニトールはARDによりD−キシルロースに酸化され、同時にNADHが生成する。生じたNADHは、NTBの存在下に、ジアホラーゼでNAD+ に酸化され、NTBからはジホルマザンが生じる。このジホルマザンを波長540nm付近にて比色定量することにより、D−アラビニトールを定量できる。同様にして、反応(2)ではD−マンニトールを定量できる。
【0020】
本発明による生体試料中のD−アラビニトールの定量は、生体試料中にMNDを加えて反応(2)を行い、次いでARDを加えて反応(1)を行うことにより1つの測定用セル中で行ってもよく、2つの測定用セルを用い、一方はMNDのみを加えてD−マンニトールのみを定量し、他方はMND及びARDを加えD−マンニトールおよびD−アラビニトールの総量を定量し、その差からD−アラビニトールの定量を行ってもよい。
【0021】
本発明の方法は、例えば生体試料として血清を用い、発色系としてNADH/ジアホラーゼ/NTBを用いた場合には、血清100μlに対し、ARDを0.1〜10単位、MNDを0.1〜20単位、NAD+ を0.5〜10mg、ジアホラーゼを0.1〜10単位およびNTBを10〜500μg使用する。各酵素反応は、25〜45℃の温度下に30秒〜60分間程度反応させる。
【0022】
本発明では、血清などの生体試料を直接測定するため、該試料中に含まれる夾雑成分の影響を無効にする目的で、種々の添加剤を生体試料に加えることができる。このような添加剤としては、例えば、乳酸脱水素酵素の阻害剤であるオキサミド酸、アスコルビン酸の影響を無くすためのアスコルビン酸オキシダーゼなどを加えることができる。またこの時、反応液にTween系やTriton系などの界面活性剤を0.1〜5%程度添加することが望ましい。
【0023】
本発明のカンジダ感染症の診断方法は、血中のD−アラビニトール濃度は健常人では数μmol/l であるが、カンジダ症患者では数十μmol/l まで上昇することを利用したものであり、D−アラビニトール濃度が設定値以上になれば、カンジダに感染したものと判定される。
【0024】
【発明の効果】
本発明によれば、生体試料中のD−アラビニトールの濃度を、高価な蛍光測定装置を用いることなく汎用品である比色計を用いて測定できるようになった。
【0025】
また、蛍光測定装置を用いていないため、除蛋白をしなくても測定値が大きく変動することはない。
【0026】
さらに、上記両効果から、本測定方法は通常血清の自動分析装置により測定されている生化学検査項目中に組み込むことが可能となり、測定の操作性が大幅に改善されることになる。
【0027】
本発明のカンジダ感染症の診断方法によれば、簡単な装置で容易に且つ高い正確度でカンジダ感染症の診断を行うことができる。
【0028】
また、本発明のカンジダ感染症診断用キットを用いれば、カンジダ感染症の診断を簡単かつ正確に行うことができる。
【0029】
【実施例】
以下、本発明を参考例および実施例を用いて、より詳細に説明する。
【0030】
参考例1
本発明で用いるMND(1.1.1.67)は、以下の方法で得られる。
【0031】
1.酵素の調製
本酵素は、Leuconostoc mesenteroides に由来し、菌株の培養はペプトン、酢酸ナトリウム、グルコースを各1%、酵母エキスを0.2%含み、その他に無機塩類を含む培地で行った。培養液30リットルを18000gで遠心分離し、菌体を分離後、破砕して粗酵素液を得た。該粗酵素液をプロタミン処理、イオン交換、ゲル濾過の各工程にて精製し、6500単位の精製酵素標品を調製した。本酵素の比活性は203単位/mgであった。
【0032】
2.酵素の諸性質
本酵素は、pH5〜9で安定であり、反応に適したpHは8.6付近である。また、基質特異性はD−マンニトールに極めて高いことが知られている。
【0033】
参考例2
本発明で用いるARD(1.1.1.11)は、以下の方法で得られる。
【0034】
1.酵素の調製
本酵素は、Aerobacter aerogenesに由来し、菌株の培養はD−アラビニトール2%、酵母エキス1%、硫酸アンモニウム0.5%を含み、その他に無機成分を含む培地で行った。培養液10リットルを18000gで遠心分離し、菌体を分離後、破砕して粗酵素液を得た。該粗酵素液をプロタミン処理、イオン交換、ゲル濾過の各工程にて精製し、16800単位の精製酵素標品を調製した。本酵素の比活性は81単位/mgであった。
【0035】
2.酵素の諸性質
本酵素は、pH5〜9で安定であり、反応に適したpHは9付近である。また、基質特異性はD−アラビニトールに対して100%作用するとしたとき、D−マンニトールに50%程度作用し、その他の糖に対してはほとんど作用しない。
【0036】
【実施例1】
D−アラビニトールの標準液を、次の方法で定量し、検量線を作成した。
【0037】
これらを、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に溶かして、全容を42mlとした。
【0038】
これらを、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に溶かして、全容を42mlとした。
【0039】
試薬3 0.5Mクエン酸溶液
操作方法
D−アラビニトールを含む標準液100μlに試薬1を700μl加え、混和後37℃で20分間加熱した後、試薬3を400μl加えて反応を停止する。盲検は、試薬1に代えて試薬2を等量加えて同様にして反応を行った。反応液の吸光度は、540nmにて測定し、盲検の吸光度を差し引いた。以上の方法で測定した値より、図1に示す検量線を作成した。
【0040】
次に、本発明の効果を確認するため、D−マンニトールを一定量含んだD−アラビニトール標準液について同様の測定を行い、図1の検量線より定量値を得た。結果を下記表1に示す。
【0041】
【表1】
【0042】
【実施例2】
自動分析装置により、D−アラビニトールの定量を試みた。
【0043】
これらを、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に溶かして、全容を32mlとした。
【0044】
試薬B ARD 250単位/ml
操作方法
自動分析装置「COBAS MIRA S」(日本ロシュ株式会社製)を用いて、D−アラビニトールの検量線の作成を行った。以下の表2に、測定サイクル(1サイクルは25秒)及び測定モードを説明する。反応温度は37℃、測定波長は550nmで実施した。
【0045】
【表2】
【0046】
D−アラビニトール標準液を用いて測定して得られた検量線を図2に示す。
【0047】
次に、血中に共存する他の糖成分の影響を調べるため、各成分およびD−アラビニトール50μMを含む試験液を自動分析装置「COBAS MIRA S」(日本ロシュ株式会社製)にて測定した。図2の検量線から求めた定量結果を下記表3に示す。
【0048】
【表3】
【0049】
次に、血清試料を用いて、D−アラビニトールの添加回収試験を実施した結果を、以下の表4に示す。表4中、回収率は、定量したD−アラビニトールの値から無添加試料の定量値を差し引き、添加したD−アラビニトールに対する比率で示した。
【0050】
【表4】
【図面の簡単な説明】
【図1】D−アラビニトールの検量線を示す。
【図2】自動分析装置を用いたD−アラビニトールの検量線を示す。
Claims (6)
- マンニトール脱水素酵素により生体より採取した生体試料中のD−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のD−アラビニトールを比色定量することを特徴とするD−アラビニトールの定量方法。
- マンニトール脱水素酵素により生体より採取した生体試料中のD−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のD−アラビニトールを比色定量して生体試料中のD−アラビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感染症の有無を判定する方法。
- マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第1定量部、並びにアラビニトール脱水素酵素および発色系を含む第2定量部を有し、マンニトール脱水素酵素により生体より採取した生体試料中のD−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のD−アラビニトールを比色定量して生体試料中のD−アラビニトール濃度を定量するための、カンジダ感染症診断用キット。
- マンニトール脱水素酵素による生体より採取した生体試料中のD−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるD−アラビニトールとD−マンニトールの総量の比色定量を並行して行うことを特徴とするD−アラビニトールの定量方法。
- マンニトール脱水素酵素による生体より採取した生体試料中のD−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるD−アラビニトールとD−マンニトールの総量の比色定量を並行して行い、生体試料中のD−アラビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感染症の有無を判定する方法。
- マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第1定量部、並びにマンニトール脱水素酵素、アラビニトール脱水素酵素および発色系を含む第2定量部を有し、マンニトール脱水素酵素による生体より採取した生体試料中のD−マンニトールの比色定量と、マンニトール脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるD−アラビニトールとD−マンニトールの総量の比色定量を並行して行い、生体試料中のD−アラビニトール濃度を定量するための、カンジダ感染症診断用キット。
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JPH07184689A JPH07184689A (ja) | 1995-07-25 |
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JP33476893A Expired - Lifetime JP3653575B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 血中のd−アラビニトールの直接比色定量法 |
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-
1993
- 1993-12-28 JP JP33476893A patent/JP3653575B2/ja not_active Expired - Lifetime
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