JPH07184689A - 血中のｄ−アラビニトールの直接比色定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】マンニトール脱水素酵素により生体試料中のＤ
−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱
水素酵素による該生体試料中のＤ−アラビニトールの比
色定量を行うことを特徴とするＤ−アラビニトールの定
量方法；該定量方法を用いたカンジダ感染症の診断方法
およびカンジダ感染症診断用キット。 【効果】 Ｄ−アラビニトールの定量を簡単に行うこと
ができ、簡易かつ正確にカンジダ感染症の診断を行える
ようになった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｄ−アラビニトールの
定量方法、カンジダ感染症の診断方法およびカンジダ感
染症診断用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術およびその問題点】カンジダ症は、真菌感
染症の一種であり、特に深在性カンジダ症は白血病や悪
性リンパ腫などの造血器悪性腫瘍や臓器移植のため免疫
機能の低下した患者などに見られる疾患である。このカ
ンジダ症の患者は、既に免疫機能が低下しており回復が
難しいため、早期に発見し、治療する必要がある。

【０００３】深在性のカンジダ感染を判定する手段とし
ては、カンジダ属の主要代謝産物であるＤ−アラビニト
ールの血中濃度を測定する方法、カンジダ抗原を検出す
る方法、カンジダに対する抗体を検出する方法または血
液中の微生物を培養し、検鏡観察する方法などがある。

【０００４】これらのうち、Ｄ−アラビニトールによる
方法は操作が比較的簡単であるため、有用である。この
方法は、血中のＤ−アラビニトール濃度は健常人では数
μmol/l であるが、カンジダ症患者では数十μmol/l ま
で上昇することを利用したものであり、Ｄ−アラビニト
ール脱水素酵素（以下、ＡＲＤと略記する）を用いたＤ
−アラビニトール測定用試薬（LABOFIT 、半井化学株式
会社製）が既に市販されている。この試薬に使用されて
いるＡＲＤは、Ｄ−アラビニトールの他に、反応性は低
いがＤ−マンニトールとも交差反応するため、上記測定
用試薬は、Ｄ−アラビニトールとＤ−マンニトールの反
応速度の差の大きい反応初期の段階でＤ−アラビニトー
ル濃度を測定してカンジダ感染の有無を判定している。

【０００５】この方法は、試料のＤ−アラビニトール濃
度を短時間に測定できる利点はあるが、ＡＲＤの酵素反
応初期の段階で反応を測定するため、高感度の検出法で
ある蛍光装置を用いる必要があり、また蛍光分析を行う
場合には、測定値のバラツキを抑えるため血清などの生
体試料を除蛋白した後測定を行う必要がある。しかしな
がら、この測定法では病院の臨床検査の現場に余り普及
していない高価な蛍光測定装置を用いるため、装置の汎
用性に欠け、さらに、測定に先立ち血清等の生体試料の
除蛋白を要する点で煩雑である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＡＲＤによ
るＤ−アラビニトール測定の際のＤ−マンニトールの影
響を回避し、かつ前処理が不要で、通常汎用される比色
計で簡便に測定できるＤ−アラビニトールの定量方法を
提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の測定
試薬の問題点を解消するため鋭意検討を重ねた結果、生
体試料をまずマンニトール脱水素酵素（以下、ＭＮＤと
略記する）で処理し、次いでＡＲＤで処理することによ
り、除蛋白などの前処理なしに、汎用されている比色装
置を用いて生体試料のＤ−アラビニトール濃度を測定で
きることを見出した。

【０００８】すなわち、本発明は、マンニトール脱水素
酵素により生体試料中のＤ−マンニトールを比色定量
し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料
中のＤ−アラビニトールを比色定量することを特徴とす
るＤ−アラビニトールの定量方法を提供するものであ
る。

【０００９】また、本発明は、マンニトール脱水素酵素
により生体試料中のＤ−マンニトールを比色定量し、次
いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のＤ
−アラビニトールを比色定量して生体試料中のＤ−アラ
ビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感
染症の診断方法を提供するものである。

【００１０】さらに、本発明は、マンニトール脱水素酵
素および発色系を含む第１定量部、並びにアラビニトー
ル脱水素酵素および発色系を含む第２定量部を有するカ
ンジダ感染症診断用キットを提供するものである。

【００１１】なお、上記方法等は、Ｄ−マンニトールを
先ず定量し、次いでＤ−アラビニトールを定量するもの
であり、この方法は、１つの測定用セルのみを用いて測
定できるものである。しかし、Ｄ−マンニトールとＤ−
アラビニトールは、２つの測定用セルを用いて並行して
測定してもよく、この場合の定量方法等を以下に示す。

【００１２】１． マンニトール脱水素酵素による生体
試料中のＤ−マンニトールの比色定量と、マンニトール
脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるＤ−
アラビニトールとＤ−マンニトールの総量の比色定量を
並行して行うことを特徴とするＤ−アラビニトールの定
量方法。

【００１３】２． マンニトール脱水素酵素による生体
試料中のＤ−マンニトールの比色定量と、マンニトール
脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるＤ−
アラビニトールとＤ−マンニトールの総量の比色定量を
並行して行い、生体試料中のＤ−アラビニトール濃度を
定量することを特徴とするカンジダ感染症の診断方法。 ３． マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第１
定量部、並びにマンニトール脱水素酵素、アラビニトー
ル脱水素酵素および発色系を含む第２定量部を有するカ
ンジダ感染症診断用キット。

【００１４】本発明において、生体試料とは、血液、尿
などの体液が挙げられ、通常は血清、血漿などの血液由
来の試料が挙げられる。

【００１５】本発明で使用するＡＲＤおよびＭＮＤは、
いずれの生物由来のものでも用いられ、例えば、ＡＲＤ
はAerobacter aerogenes由来のものが用いられ、ＭＮＤ
はLeuconostoc mesenteroides やLactobacillus brevis
由来のものが用いられる。ＡＲＤの精製は、例えばFoss
itt, D.D. & Wood, W.A., Methods in Enzymology 9,18
4-186 (1966) の文献の記載に従って行うことができ
る。また、ＭＮＤの精製は、例えばYamanaka, K., Meth
ods in Enzymology, 41, 138-142 (1975) の文献記載に
従って行うことができる。

【００１６】本発明で使用する発色系は、脱水素酵素の
基質の比色定量に従来用いられている発色系をすべて用
いることができ、このような発色系としては、ＮＡＤ⁺
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型）／ジ
アホラーゼ／ＮＴＢ（ｐ−ニトロテトラゾリウムブルー
クロライド）が挙げられ、ジアホラーゼの代わりにフェ
ナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、あるいは１−メト
キシＰＭＳも使用できる。また、テトラゾリウム塩とし
ては、ＮＴＢ以外にＩＮＴ（２−（４−ヨードフェニー
ル）−３−（４−ニトロフェニール）−５−フェニール
−２Ｈ テトラゾリウム・クロライド、あるいはＭＴＴ
（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５
−ジフェニル−２Ｈ テトラゾリウム・ブロマイド）が
挙げられる。

【００１７】本発明のＤ−アラビニトールの測定機構
を、ＮＡＤ⁺ ／ジアホラーゼ／ＮＴＢを発色系として用
いた場合について例示すると、以下のようになる。

【００１８】

【化１】

【００１９】反応（１）では、ＮＡＤ⁺ の存在下に、Ｄ
−アラビニトールはＡＲＤによりＤ−キシルロースに酸
化され、同時にＮＡＤＨが生成する。生じたＮＡＤＨ
は、ＮＴＢの存在下に、ジアホラーゼでＮＡＤ⁺ に酸化
され、ＮＴＢからはジホルマザンが生じる。このジホル
マザンを波長５４０ｎｍ付近にて比色定量することによ
り、Ｄ−アラビニトールを定量できる。同様にして、反
応（２）ではＤ−マンニトールを定量できる。

【００２０】本発明による生体試料中のＤ−アラビニト
ールの定量は、生体試料中にＭＮＤを加えて反応（２）
を行い、次いでＡＲＤを加えて反応（１）を行うことに
より１つの測定用セル中で行ってもよく、２つの測定用
セルを用い、一方はＭＮＤのみを加えてＤ−マンニトー
ルのみを定量し、他方はＭＮＤ及びＡＲＤを加えＤ−マ
ンニトールおよびＤ−アラビニトールの総量を定量し、
その差からＤ−アラビニトールの定量を行ってもよい。

【００２１】本発明の方法は、例えば生体試料として血
清を用い、発色系としてＮＡＤＨ／ジアホラーゼ／ＮＴ
Ｂを用いた場合には、血清１００μｌに対し、ＡＲＤを
０．１〜１０単位、ＭＮＤを０．１〜２０単位、ＮＡＤ
⁺ を０．５〜１０ｍｇ、ジアホラーゼを０．１〜１０単
位およびＮＴＢを１０〜５００μｇ使用する。各酵素反
応は、２５〜４５℃の温度下に３０秒〜６０分間程度反
応させる。

【００２２】本発明では、血清などの生体試料を直接測
定するため、該試料中に含まれる夾雑成分の影響を無効
にする目的で、種々の添加剤を生体試料に加えることが
できる。このような添加剤としては、例えば、乳酸脱水
素酵素の阻害剤であるオキサミド酸、アスコルビン酸の
影響を無くすためのアスコルビン酸オキシダーゼなどを
加えることができる。またこの時、反応液にＴｗｅｅｎ
系やＴｒｉｔｏｎ系などの界面活性剤を０．１〜５％程
度添加することが望ましい。

【００２３】本発明のカンジダ感染症の診断方法は、血
中のＤ−アラビニトール濃度は健常人では数μmol/l で
あるが、カンジダ症患者では数十μmol/l まで上昇する
ことを利用したものであり、Ｄ−アラビニトール濃度が
設定値以上になれば、カンジダに感染したものと判定さ
れる。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、生体試料中のＤ−アラ
ビニトールの濃度を、高価な蛍光測定装置を用いること
なく汎用品である比色計を用いて測定できるようになっ
た。

【００２５】また、蛍光測定装置を用いていないため、
除蛋白をしなくても測定値が大きく変動することはな
い。

【００２６】さらに、上記両効果から、本測定方法は通
常血清の自動分析装置により測定されている生化学検査
項目中に組み込むことが可能となり、測定の操作性が大
幅に改善されることになる。

【００２７】本発明のカンジダ感染症の診断方法によれ
ば、簡単な装置で容易に且つ高い正確度でカンジダ感染
症の診断を行うことができる。

【００２８】また、本発明のカンジダ感染症診断用キッ
トを用いれば、カンジダ感染症の診断を簡単かつ正確に
行うことができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明を参考例および実施例を用い
て、より詳細に説明する。

【００３０】参考例１ 本発明で用いるＭＮＤ（１．１．１．６７）は、以下の
方法で得られる。

【００３１】１．酵素の調製 本酵素は、Leuconostoc mesenteroides に由来し、菌株
の培養はペプトン、酢酸ナトリウム、グルコースを各１
％、酵母エキスを０．２％含み、その他に無機塩類を含
む培地で行った。培養液３０リットルを１８０００ｇで
遠心分離し、菌体を分離後、破砕して粗酵素液を得た。
該粗酵素液をプロタミン処理、イオン交換、ゲル濾過の
各工程にて精製し、６５００単位の精製酵素標品を調製
した。本酵素の比活性は２０３単位／ｍｇであった。

【００３２】２．酵素の諸性質 本酵素は、ｐＨ５〜９で安定であり、反応に適したｐＨ
は８．６付近である。また、基質特異性はＤ−マンニト
ールに極めて高いことが知られている。

【００３３】参考例２ 本発明で用いるＡＲＤ（１．１．１．１１）は、以下の
方法で得られる。

【００３４】１．酵素の調製 本酵素は、Aerobacter aerogenesに由来し、菌株の培養
はＤ−アラビニトール２％、酵母エキス１％、硫酸アン
モニウム０．５％を含み、その他に無機成分を含む培地
で行った。培養液１０リットルを１８０００ｇで遠心分
離し、菌体を分離後、破砕して粗酵素液を得た。該粗酵
素液をプロタミン処理、イオン交換、ゲル濾過の各工程
にて精製し、１６８００単位の精製酵素標品を調製し
た。本酵素の比活性は８１単位／ｍｇであった。

【００３５】２．酵素の諸性質 本酵素は、ｐＨ５〜９で安定であり、反応に適したｐＨ
は９付近である。また、基質特異性はＤ−アラビニトー
ルに対して１００％作用するとしたとき、Ｄ−マンニト
ールに５０％程度作用し、その他の糖に対してはほとん
ど作用しない。

【００３６】

【実施例１】Ｄ−アラビニトールの標準液を、次の方法
で定量し、検量線を作成した。

【００３７】 これらを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶か
して、全容を４２ｍｌとした。

【００３８】 これらを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶か
して、全容を４２ｍｌとした。

【００３９】試薬３ ０．５Ｍクエン酸溶液 操作方法 Ｄ−アラビニトールを含む標準液１００μｌに試薬１を
７００μｌ加え、混和後３７℃で２０分間加熱した後、
試薬３を４００μｌ加えて反応を停止する。盲検は、試
薬１に代えて試薬２を等量加えて同様にして反応を行っ
た。反応液の吸光度は、５４０ｎｍにて測定し、盲検の
吸光度を差し引いた。以上の方法で測定した値より、図
１に示す検量線を作成した。

【００４０】次に、本発明の効果を確認するため、Ｄ−
マンニトールを一定量含んだＤ−アラビニトール標準液
について同様の測定を行い、図１の検量線より定量値を
得た。結果を下記表１に示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】

【実施例２】自動分析装置により、Ｄ−アラビニトール
の定量を試みた。

【００４３】 これらを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶か
して、全容を３２ｍｌとした。

【００４４】 試薬Ｂ ＡＲＤ ２５０単位／ｍｌ 操作方法 自動分析装置「ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ Ｓ」（日本ロシ
ュ株式会社製）を用いて、Ｄ−アラビニトールの検量線
の作成を行った。以下の表２に、測定サイクル（１サイ
クルは２５秒）及び測定モードを説明する。反応温度は
３７℃、測定波長は５５０ｎｍで実施した。

【００４５】

【表２】

【００４６】Ｄ−アラビニトール標準液を用いて測定し
て得られた検量線を図２に示す。

【００４７】次に、血中に共存する他の糖成分の影響を
調べるため、各成分およびＤ−アラビニトール５０μＭ
を含む試験液を自動分析装置「ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ
Ｓ」（日本ロシュ株式会社製）にて測定した。図２の検
量線から求めた定量結果を下記表３に示す。

【００４８】

【表３】

【００４９】次に、血清試料を用いて、Ｄ−アラビニト
ールの添加回収試験を実施した結果を、以下の表４に示
す。表４中、回収率は、定量したＤ−アラビニトールの
値から無添加試料の定量値を差し引き、添加したＤ−ア
ラビニトールに対する比率で示した。

【００５０】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｄ−アラビニトールの検量線を示す。

【図２】自動分析装置を用いたＤ−アラビニトールの検
量線を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マンニトール脱水素酵素により生体試料中
   のＤ−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトー
   ル脱水素酵素により該生体試料中のＤ−アラビニトール
   を比色定量することを特徴とするＤ−アラビニトールの
   定量方法。
2. 【請求項２】マンニトール脱水素酵素により生体試料中
   のＤ−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトー
   ル脱水素酵素により該生体試料中のＤ−アラビニトール
   を比色定量して生体試料中のＤ−アラビニトール濃度を
   定量することを特徴とするカンジダ感染症の診断方法。
3. 【請求項３】マンニトール脱水素酵素および発色系を含
   む第１定量部、並びにアラビニトール脱水素酵素および
   発色系を含む第２定量部を有するカンジダ感染症診断用
   キット。