JPH07184689A - 血中のd−アラビニトールの直接比色定量法 - Google Patents
血中のd−アラビニトールの直接比色定量法Info
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- JPH07184689A JPH07184689A JP33476893A JP33476893A JPH07184689A JP H07184689 A JPH07184689 A JP H07184689A JP 33476893 A JP33476893 A JP 33476893A JP 33476893 A JP33476893 A JP 33476893A JP H07184689 A JPH07184689 A JP H07184689A
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Abstract
−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトール脱
水素酵素による該生体試料中のD−アラビニトールの比
色定量を行うことを特徴とするD−アラビニトールの定
量方法;該定量方法を用いたカンジダ感染症の診断方法
およびカンジダ感染症診断用キット。 【効果】 D−アラビニトールの定量を簡単に行うこと
ができ、簡易かつ正確にカンジダ感染症の診断を行える
ようになった。
Description
定量方法、カンジダ感染症の診断方法およびカンジダ感
染症診断用キットに関する。
染症の一種であり、特に深在性カンジダ症は白血病や悪
性リンパ腫などの造血器悪性腫瘍や臓器移植のため免疫
機能の低下した患者などに見られる疾患である。このカ
ンジダ症の患者は、既に免疫機能が低下しており回復が
難しいため、早期に発見し、治療する必要がある。
ては、カンジダ属の主要代謝産物であるD−アラビニト
ールの血中濃度を測定する方法、カンジダ抗原を検出す
る方法、カンジダに対する抗体を検出する方法または血
液中の微生物を培養し、検鏡観察する方法などがある。
方法は操作が比較的簡単であるため、有用である。この
方法は、血中のD−アラビニトール濃度は健常人では数
μmol/l であるが、カンジダ症患者では数十μmol/l ま
で上昇することを利用したものであり、D−アラビニト
ール脱水素酵素(以下、ARDと略記する)を用いたD
−アラビニトール測定用試薬(LABOFIT 、半井化学株式
会社製)が既に市販されている。この試薬に使用されて
いるARDは、D−アラビニトールの他に、反応性は低
いがD−マンニトールとも交差反応するため、上記測定
用試薬は、D−アラビニトールとD−マンニトールの反
応速度の差の大きい反応初期の段階でD−アラビニトー
ル濃度を測定してカンジダ感染の有無を判定している。
度を短時間に測定できる利点はあるが、ARDの酵素反
応初期の段階で反応を測定するため、高感度の検出法で
ある蛍光装置を用いる必要があり、また蛍光分析を行う
場合には、測定値のバラツキを抑えるため血清などの生
体試料を除蛋白した後測定を行う必要がある。しかしな
がら、この測定法では病院の臨床検査の現場に余り普及
していない高価な蛍光測定装置を用いるため、装置の汎
用性に欠け、さらに、測定に先立ち血清等の生体試料の
除蛋白を要する点で煩雑である。
るD−アラビニトール測定の際のD−マンニトールの影
響を回避し、かつ前処理が不要で、通常汎用される比色
計で簡便に測定できるD−アラビニトールの定量方法を
提供することを目的とする。
試薬の問題点を解消するため鋭意検討を重ねた結果、生
体試料をまずマンニトール脱水素酵素(以下、MNDと
略記する)で処理し、次いでARDで処理することによ
り、除蛋白などの前処理なしに、汎用されている比色装
置を用いて生体試料のD−アラビニトール濃度を測定で
きることを見出した。
酵素により生体試料中のD−マンニトールを比色定量
し、次いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料
中のD−アラビニトールを比色定量することを特徴とす
るD−アラビニトールの定量方法を提供するものであ
る。
により生体試料中のD−マンニトールを比色定量し、次
いでアラビニトール脱水素酵素により該生体試料中のD
−アラビニトールを比色定量して生体試料中のD−アラ
ビニトール濃度を定量することを特徴とするカンジダ感
染症の診断方法を提供するものである。
素および発色系を含む第1定量部、並びにアラビニトー
ル脱水素酵素および発色系を含む第2定量部を有するカ
ンジダ感染症診断用キットを提供するものである。
先ず定量し、次いでD−アラビニトールを定量するもの
であり、この方法は、1つの測定用セルのみを用いて測
定できるものである。しかし、D−マンニトールとD−
アラビニトールは、2つの測定用セルを用いて並行して
測定してもよく、この場合の定量方法等を以下に示す。
試料中のD−マンニトールの比色定量と、マンニトール
脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるD−
アラビニトールとD−マンニトールの総量の比色定量を
並行して行うことを特徴とするD−アラビニトールの定
量方法。
試料中のD−マンニトールの比色定量と、マンニトール
脱水素酵素およびアラビニトール脱水素酵素によるD−
アラビニトールとD−マンニトールの総量の比色定量を
並行して行い、生体試料中のD−アラビニトール濃度を
定量することを特徴とするカンジダ感染症の診断方法。 3. マンニトール脱水素酵素および発色系を含む第1
定量部、並びにマンニトール脱水素酵素、アラビニトー
ル脱水素酵素および発色系を含む第2定量部を有するカ
ンジダ感染症診断用キット。
などの体液が挙げられ、通常は血清、血漿などの血液由
来の試料が挙げられる。
いずれの生物由来のものでも用いられ、例えば、ARD
はAerobacter aerogenes由来のものが用いられ、MND
はLeuconostoc mesenteroides やLactobacillus brevis
由来のものが用いられる。ARDの精製は、例えばFoss
itt, D.D. & Wood, W.A., Methods in Enzymology 9,18
4-186 (1966) の文献の記載に従って行うことができ
る。また、MNDの精製は、例えばYamanaka, K., Meth
ods in Enzymology, 41, 138-142 (1975) の文献記載に
従って行うことができる。
基質の比色定量に従来用いられている発色系をすべて用
いることができ、このような発色系としては、NAD+
(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型)/ジ
アホラーゼ/NTB(p−ニトロテトラゾリウムブルー
クロライド)が挙げられ、ジアホラーゼの代わりにフェ
ナジンメトサルフェート(PMS)、あるいは1−メト
キシPMSも使用できる。また、テトラゾリウム塩とし
ては、NTB以外にINT(2−(4−ヨードフェニー
ル)−3−(4−ニトロフェニール)−5−フェニール
−2H テトラゾリウム・クロライド、あるいはMTT
(3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5
−ジフェニル−2H テトラゾリウム・ブロマイド)が
挙げられる。
を、NAD+ /ジアホラーゼ/NTBを発色系として用
いた場合について例示すると、以下のようになる。
−アラビニトールはARDによりD−キシルロースに酸
化され、同時にNADHが生成する。生じたNADH
は、NTBの存在下に、ジアホラーゼでNAD+ に酸化
され、NTBからはジホルマザンが生じる。このジホル
マザンを波長540nm付近にて比色定量することによ
り、D−アラビニトールを定量できる。同様にして、反
応(2)ではD−マンニトールを定量できる。
ールの定量は、生体試料中にMNDを加えて反応(2)
を行い、次いでARDを加えて反応(1)を行うことに
より1つの測定用セル中で行ってもよく、2つの測定用
セルを用い、一方はMNDのみを加えてD−マンニトー
ルのみを定量し、他方はMND及びARDを加えD−マ
ンニトールおよびD−アラビニトールの総量を定量し、
その差からD−アラビニトールの定量を行ってもよい。
清を用い、発色系としてNADH/ジアホラーゼ/NT
Bを用いた場合には、血清100μlに対し、ARDを
0.1〜10単位、MNDを0.1〜20単位、NAD
+ を0.5〜10mg、ジアホラーゼを0.1〜10単
位およびNTBを10〜500μg使用する。各酵素反
応は、25〜45℃の温度下に30秒〜60分間程度反
応させる。
定するため、該試料中に含まれる夾雑成分の影響を無効
にする目的で、種々の添加剤を生体試料に加えることが
できる。このような添加剤としては、例えば、乳酸脱水
素酵素の阻害剤であるオキサミド酸、アスコルビン酸の
影響を無くすためのアスコルビン酸オキシダーゼなどを
加えることができる。またこの時、反応液にTween
系やTriton系などの界面活性剤を0.1〜5%程
度添加することが望ましい。
中のD−アラビニトール濃度は健常人では数μmol/l で
あるが、カンジダ症患者では数十μmol/l まで上昇する
ことを利用したものであり、D−アラビニトール濃度が
設定値以上になれば、カンジダに感染したものと判定さ
れる。
ビニトールの濃度を、高価な蛍光測定装置を用いること
なく汎用品である比色計を用いて測定できるようになっ
た。
除蛋白をしなくても測定値が大きく変動することはな
い。
常血清の自動分析装置により測定されている生化学検査
項目中に組み込むことが可能となり、測定の操作性が大
幅に改善されることになる。
ば、簡単な装置で容易に且つ高い正確度でカンジダ感染
症の診断を行うことができる。
トを用いれば、カンジダ感染症の診断を簡単かつ正確に
行うことができる。
て、より詳細に説明する。
方法で得られる。
の培養はペプトン、酢酸ナトリウム、グルコースを各1
%、酵母エキスを0.2%含み、その他に無機塩類を含
む培地で行った。培養液30リットルを18000gで
遠心分離し、菌体を分離後、破砕して粗酵素液を得た。
該粗酵素液をプロタミン処理、イオン交換、ゲル濾過の
各工程にて精製し、6500単位の精製酵素標品を調製
した。本酵素の比活性は203単位/mgであった。
は8.6付近である。また、基質特異性はD−マンニト
ールに極めて高いことが知られている。
方法で得られる。
はD−アラビニトール2%、酵母エキス1%、硫酸アン
モニウム0.5%を含み、その他に無機成分を含む培地
で行った。培養液10リットルを18000gで遠心分
離し、菌体を分離後、破砕して粗酵素液を得た。該粗酵
素液をプロタミン処理、イオン交換、ゲル濾過の各工程
にて精製し、16800単位の精製酵素標品を調製し
た。本酵素の比活性は81単位/mgであった。
は9付近である。また、基質特異性はD−アラビニトー
ルに対して100%作用するとしたとき、D−マンニト
ールに50%程度作用し、その他の糖に対してはほとん
ど作用しない。
で定量し、検量線を作成した。
して、全容を42mlとした。
して、全容を42mlとした。
700μl加え、混和後37℃で20分間加熱した後、
試薬3を400μl加えて反応を停止する。盲検は、試
薬1に代えて試薬2を等量加えて同様にして反応を行っ
た。反応液の吸光度は、540nmにて測定し、盲検の
吸光度を差し引いた。以上の方法で測定した値より、図
1に示す検量線を作成した。
マンニトールを一定量含んだD−アラビニトール標準液
について同様の測定を行い、図1の検量線より定量値を
得た。結果を下記表1に示す。
の定量を試みた。
して、全容を32mlとした。
ュ株式会社製)を用いて、D−アラビニトールの検量線
の作成を行った。以下の表2に、測定サイクル(1サイ
クルは25秒)及び測定モードを説明する。反応温度は
37℃、測定波長は550nmで実施した。
て得られた検量線を図2に示す。
調べるため、各成分およびD−アラビニトール50μM
を含む試験液を自動分析装置「COBAS MIRA
S」(日本ロシュ株式会社製)にて測定した。図2の検
量線から求めた定量結果を下記表3に示す。
ールの添加回収試験を実施した結果を、以下の表4に示
す。表4中、回収率は、定量したD−アラビニトールの
値から無添加試料の定量値を差し引き、添加したD−ア
ラビニトールに対する比率で示した。
量線を示す。
Claims (3)
- 【請求項1】マンニトール脱水素酵素により生体試料中
のD−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトー
ル脱水素酵素により該生体試料中のD−アラビニトール
を比色定量することを特徴とするD−アラビニトールの
定量方法。 - 【請求項2】マンニトール脱水素酵素により生体試料中
のD−マンニトールを比色定量し、次いでアラビニトー
ル脱水素酵素により該生体試料中のD−アラビニトール
を比色定量して生体試料中のD−アラビニトール濃度を
定量することを特徴とするカンジダ感染症の診断方法。 - 【請求項3】マンニトール脱水素酵素および発色系を含
む第1定量部、並びにアラビニトール脱水素酵素および
発色系を含む第2定量部を有するカンジダ感染症診断用
キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33476893A JP3653575B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 血中のd−アラビニトールの直接比色定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33476893A JP3653575B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 血中のd−アラビニトールの直接比色定量法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07184689A true JPH07184689A (ja) | 1995-07-25 |
JP3653575B2 JP3653575B2 (ja) | 2005-05-25 |
Family
ID=18281020
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP33476893A Expired - Lifetime JP3653575B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 血中のd−アラビニトールの直接比色定量法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3653575B2 (ja) |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP33476893A patent/JP3653575B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3653575B2 (ja) | 2005-05-25 |
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