KR20070018075A - 트랜스제닉 동물 및 그의 용도 - Google Patents
트랜스제닉 동물 및 그의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20070018075A KR20070018075A KR1020067024364A KR20067024364A KR20070018075A KR 20070018075 A KR20070018075 A KR 20070018075A KR 1020067024364 A KR1020067024364 A KR 1020067024364A KR 20067024364 A KR20067024364 A KR 20067024364A KR 20070018075 A KR20070018075 A KR 20070018075A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- cell
- ungulate
- mutation
- transgenic
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 83
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 39
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 claims abstract description 185
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 117
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims abstract description 46
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims abstract description 46
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims abstract description 46
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 31
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 398
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 267
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 152
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 117
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 104
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 90
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 68
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 68
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 68
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 66
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 54
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 54
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 52
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 42
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 41
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 36
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 19
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 claims description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 14
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 14
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 4
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 claims description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 3
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 claims 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 102100034452 Alternative prion protein Human genes 0.000 description 143
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 117
- 244000309466 calf Species 0.000 description 103
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 92
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 239000000047 product Substances 0.000 description 39
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 37
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 31
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 31
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 30
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 27
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 27
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 27
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 23
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 23
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 21
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 20
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 20
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 17
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 15
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 12
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 11
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 11
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 10
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 10
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 9
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 8
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 8
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 7
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 7
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 7
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 101001068592 Bos taurus Major prion protein Proteins 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 6
- 102100039352 Immunoglobulin heavy constant mu Human genes 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 241000283726 Bison Species 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 5
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283699 Bos indicus Species 0.000 description 4
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 4
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 4
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282979 Alces alces Species 0.000 description 3
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 3
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 3
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 3
- 241000283705 Capra hircus Species 0.000 description 3
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 3
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 3
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 3
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 3
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241001502414 Ovis canadensis Species 0.000 description 3
- 241000283080 Proboscidea <mammal> Species 0.000 description 3
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 3
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 101150084954 bsr gene Proteins 0.000 description 3
- 244000309464 bull Species 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 229940008228 intravenous immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 3
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 101710190962 50S ribosomal protein L9 Proteins 0.000 description 2
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000834255 Bos taurus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005403 Casein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010031425 Casein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 102000011787 Histone Methyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108010036115 Histone Methyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- -1 IgμU or IgμAY) Proteins 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 2
- 241000283089 Perissodactyla Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 2
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000012788 optical film Substances 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 2
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- PJPGMULJEYSZBS-UHFFFAOYSA-N (+)-streptol Natural products OCC1=CC(O)C(O)C(O)C1O PJPGMULJEYSZBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100031912 A-kinase anchor protein 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100038740 Activator of RNA decay Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000009728 CDC2 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010034798 CDC2 Protein Kinase Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000136376 Colonides Species 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000774717 Homo sapiens A-kinase anchor protein 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000741910 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000741917 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 1 regulatory subunit 10 Proteins 0.000 description 1
- 101001061851 Homo sapiens V(D)J recombination-activating protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050586 Immunoglobulin J-Chains Proteins 0.000 description 1
- 108700029227 Immunoglobulin Light Chain Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000006835 Lamins Human genes 0.000 description 1
- 108010047294 Lamins Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000003789 Nuclear pore complex proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000163 Nuclear pore complex proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002488 Nucleoplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 244000304393 Phlox paniculata Species 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100038755 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000506 Protein phosphatase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000001183 RAG-1 Human genes 0.000 description 1
- 108060006897 RAG1 Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038743 Serine/threonine-protein phosphatase 1 regulatory subunit 10 Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102100035254 Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710104417 Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3 Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100029591 V(D)J recombination-activating protein 2 Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150062015 hyg gene Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005053 lamin Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000415 mammalian chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 108060005597 nucleoplasmin Proteins 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N okadaic acid Chemical compound C([C@H](O1)[C@H](C)/C=C/[C@H]2CC[C@@]3(CC[C@H]4O[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]4O3)=C)[C@@H](O)C[C@H](C)[C@@H]3[C@@H](CC[C@@]4(OCCCC4)O3)C)O2)C(C)=C[C@]21O[C@H](C[C@@](C)(O)C(O)=O)CC[C@H]2O QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N 0.000 description 1
- VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N okadaic acid Natural products CC(CC(O)C1OC2CCC3(CCC(O3)C=CC(C)C4CC(=CC5(OC(CC(C)(O)C(=O)O)CCC5O)O4)C)OC2C(O)C1C)C6OC7(CCCCO7)CCC6C VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- PJPGMULJEYSZBS-VZFHVOOUSA-N valienol Chemical group OCC1=C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PJPGMULJEYSZBS-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0273—Cloned vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8771—Bovine embryos
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
일반적으로, 본 발명은 유전적으로 변형된 비인간 포유동물 (예를 들어, 소 및 다른 유제류), 및 이들 포유동물의 제조방법을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 감소된 수준의 내생 IgM 중쇄 및(또는) 프리온 단백질을 가지는 트랜스제닉 유제류를 특징으로 한다.
내생 IgM 중쇄, 프리온, 광우병, 트랜스제닉 유제류, 유전자 조작, 유전적 변형, 탈핵 난자
Description
상동 재조합에 의한 유전자 표적화는 대상 유전자를 구체적으로 변형시키기 위한 효과적인 수단이다. 배아 줄기(ES) 세포의 이용가능성은 마우스에서의 유전자 기능을 연구하는 수단이 되어왔다. 비-쥐과 포유류 종에 있어서, ES 세포의 부족은 1차 체세포에서의 유전자 표적화에 의해, 그 후에는 핵 치환에 의해 극복되어왔다. 분자 생물학 기술의 진보에도 불구하고, 1차 세포에서의 유전자 표적화에는 저빈도의 상동 재조합 (McCreath et al. (2000) Nature 405:1066-1069), 1차 세포의 짧은 수명, 및 적절하게 표적화된 세포를 선별할 수 있는 방법의 한계와 같은 난점이 여전히 존재한다. 현재, 1차 세포 유전자 표적화 및 자손의 제조는, 침묵 유전자에 비해 상동 재조합이 고빈도로 일어나는 전사적 활성 유전자로 주로 수행되어져 왔다 (Denning et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:559-562). 나아가, 정확하게 표적화된 세포의 선별은 침묵 유전자에는 적용될 수 없는 방법인, 표적화된 유전자 프로모터가 선별 마커의 발현을 유도하도록 함으로써 달성될 수 있다 (Denning et al., 상기 문헌; Lai et al. (2002) Science 295:1089-1092; Yifan et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:251-255; Thomson, A. J., et al. , (2003) Reprod. Suppl. 61:495-508).
유전적 변형의 예후를 상세하게 평가하기 위해서는, 유전자의 양 대립 유전 자 모두가 파괴되어야 한다. 마우스에서, 이러한 파괴는 일반적으로 반접합(hemizygous) 트랜스제닉 1대 동물로부터 역교차(back crossing)에 의해 달성되어 동형접합 표적화 근친계(inbred line)를 생성한다. 동형접합으로의 교배는 마우스에서는 매우 많은 시간을 필요로 하며, 한 세대가 길고 근친교배의 예후에 의해 부정적으로 영향을 받는 종들에서는 더더욱 심각한 장애를 나타낸다. 돼지에 있어, 이러한 한계를 극복하여 동형접합 β(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 넉아웃 동물을 제조하기 위해 두가지 혁신적 접근법이 사용되어 왔다. 반접합 표적화 1차 세포는 시험관내에서, 유전자의 제2 대립 유전자에서 자연발생 점돌연변이로부터 (Denning et al., (2003) Reproduction 126:1-11) 또는 유사분열 재조합 (Piedrahita (2000) Theriogenology 53: 105-16)으로 인한 효소 활성 상실에 대해 선별하였으며 클로닝된 자손은 동형접합 넉아웃 세포주로부터 제조하였다. 그러나 이러한 접근법은 침묵 유전자에 대해서는 일반적으로 유용하지 않으며 또한 활성 유전자에 대해서도 널리 적용되지 못한다. 따라서, 비인간 포유동물에서 유전자 기능을 연구하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
유전적으로 변형된 동물에서의 항체 제조
1890년에, 시바사부로 키타자토(Shibasaburo Kitazato) 및 에밀 베링(Emil Behring)은 놀라운 결과를 가져온 실험을 발표하였는데, 특히 이들은 면역 동물로부터 혈청을 취하여 비면역 동물에 이를 주입함으로써 면역성이 하나의 동물에서 다른 동물로 전달될 수 있음을 증명하였다. 이러한 역사적인 실험은 수동 면역을 임상 관행에 도입하기 위한 기초를 세웠다. 오늘날, 수동 면역을 위해 인간 면역글로불린을 제조하고 사용하는 것은 표준 의료 관행이다. 미국에서만도, 인간 면역글로불린이 한해 14억 달러어치 판매되며, 매년 16,000 kg 이상의 인간 항체가 정맥내 항체 요법을 위해 사용된다. 매우 고도로 산업화된 국가의 경제에서 상당한 수준의 소비가 존재하며, 개발 도상국에서 그 수요가 빠르게 성장할 것으로 기대될 수 있다. 현재, 수동 면역을 위한 인간 항체는 인간 공여체의 혼주 혈청(pooled serum)으로부터 수득된다. 이는 치료적 사용 및 예방적 용도로 이용가능한 인간 항체의 양에 내재적 한계가 있음을 의미한다. 이미, 수요는 공급을 초과하여 심각한 입수 부족이 반복되어 왔다.
인간 면역글로불린의 불충분한 수요와 연관된 몇몇 문제점을 극복하기 위한 노력으로, 다양한 기술이 개발되어 왔다. 예를 들어, 조직 배양에서의 재조합 방법을 통한 인간 면역글로불린의 제조가 일반적이다. 특히, CHO 발현 시스템에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현은 주지되어 있고, 현재 이것은 치료용의 몇몇 인간 면역글로불린 및 키메라 항체의 제조에 널리 이용된다.
재배열되지 않은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 마우스 또한 인간 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 제조를 위해 개발되었다 (예를 들어, PCT 공개공보 W098/24893; W096/33735; WO97/13852; W098/24884; W097/07671; 및 미국 특허 제5,877,397; 5,874,299; 5,814,318; 5,789,650; 5,770,429; 5,661,016; 5,633,425; 5,625,126; 5,569,825; 및 5,545,806호 참조).
PCT 공개 공보 WO00/10383은 인간 염색체 단편의 변형 및 마이크로세포 융합 을 통한 특정 세포로의 단편의 전달을 기술한다. 미국 특허 제5,849,992 및 5,827,690호는 마우스, 양, 돼지, 소 및 염소를 포함하는 트랜스제닉 동물의 유즙에서 모노클로날 항체를 제조하는 것을 기술하는데, 이러한 트랜스제닉 동물은 유방 상피세포 내에서의 항체를 발현시키는 프로모터를 조절하여 인간 면역글로불린을 발현시킨다. 본질적으로, 이는 이러한 동물, 예를 들어 소의 유즙에서 항체를 발현시키게 된다. 미국 특허 공보 제2003-0037347-0호는 클로닝된 트랜스제닉 유제류에서의 인간 이종 면역글로불린의 발현을 기술한다.
전술한 것들에도 불구하고, 이종 항체 제조를 위한 숙주로 사용될 수 있을 유제류를 제조하는 또다른 개선된 방법은 본 산업에서 큰 가치가 있다.
프리온
단백질-결핍 소의 제조
세포 프리온 단백질 PrPC는 어디에서나 발현되는 원형질막의 글리코실포스파티딜이노시톨-고정 당단백질이다. 이 단백질은 가축의 BSE와 같은 전염성 해면상 뇌병증 및 인간의 크로이츠펠트-야콥 병 (Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)의 발병에 결정적인 역할을 한다. 이러한 질병과 연관된, 프토테아제-저항성 이소형인 PrPSc는 정상 PrPC를 PrPSc로 전환시키는 능력을 가지며 해면상 뇌병증의 발병 및 전염에 필수적인 것으로 생각된다. 뉴런에서의 PrPSc의 축적이 치명적인 신경변성과 연관되어 있음에도 불구하고, 단백질의 정상적인 생리학적 기능은 명확히 밝혀지지 않았다. PrP 유전자의 코딩 영역에 제한되어 파괴된 마우스를 제조하였는데 단지 사소한 표현형 결핍만을 나타내었다. 중요한 것은, 이들이 PrPSc에 의한 감염에 내성이 있었다는 것이며, 이는 PrPCf가 프리온 질병의 발병기전에 필수적이라는 것을 암시한다 (Prusiner et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10608-10612; Weissmann et al. (1994) Ann. NY Acad. Sci. 724:235-240).
BSE는 영국에서 1986년에 최초로 발견되었으며, 현재는 전세계에 걸쳐 많은 나라로 확산되었다. BSE는 오염된 소고기 제품의 직접적인 소비에 의해 소에서 인간으로 전염될 수 있으며, 이때 CJD의 변이형(vCJD)이 나타난다. 현재는, 이 치명적인 질병에 대한 어떠한 치료법도 없다. 질병의 원인이 되는 PrPSc 단백질에의 노출의 위험을 감소시키기 위해, 고가의 테스트 프로그램을 수행하여 수많은 다양한 제품으로부터 소의 성분을 제거하려는 노력이 많은 나라에서 시작되었다. BSE에 오염된 소 제품에 대한 걱정을 줄이기 위해, PrP 유전자 대립 유전자 중 동형접합 형질제거 돌연변이(null mutation)을 갖는 가축이 사용될 수 있다. 또한, 이러한 동물은 BSE에서의 PrP의 관련성을 조사하기 위한, 마우스 이외의 모델로서 유용할 수 있다.
<발명의 요약>
일반적으로, 본 발명은 유전적으로 변형된 비인간 포유동물 (예를 들어, 소 및 기타 유제류), 및 이들 포유동물의 제조 방법을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 내생 IgM 중쇄 및(또는) 프리온 단백질의 수준이 감소된 트랜스제닉 유제류를 특징으로 한다.
IgM
중쇄
단백질이
감소된
트랜스제닉
유제류
본 발명자들은 소가 2개의 IgM 중쇄-코딩 유전자를 가지며, 이들 각각은 발현되며 VDJ 재배열이 일어나는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 상동 재조합을 이용하여 소 섬유모세포에서의 이들 유전자 각각을 파괴하였고, 그 후 이들은 기능적 IgM이 감소되거나, 실질적으로 제거되거나, 또는 제거된 트랜스제닉 소를 제조하기 위한 클로닝 방법에 사용될 수 있다.
다른 유제류에서 단지 하나의 IgM-코딩 유전자만이 확인되었다고 하더라도, 본 발명자들의 관점에서 볼 때, 추가적인 유전자가 존재할 가능성이 있다.
본 발명의 트랜스제닉 유제류는 예를 들어, 이종 면역글로불린 및 이종 조혈모세포의 제조, 및 생체 내에 이종 조직 및 기관을 유지시키는데 유용하다.
따라서, 본 발명은 대조군 유제류에 비하여 10% 미만의 내생 IgM 중쇄를 생산하는 트랜스제닉 유제류를 특징으로 하는데, 이들의 게놈은 IgM 중쇄를 코딩하는 유전자(예를 들어, 소 IgμU 또는 소 IgμAY)의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 유제류는 상응하는 대조군 유제류에 비하여 5% 미만, 2% 미만, 심지어는 1% 미만을 생산한다. 가장 바람직하게는, 유제류는 IgM 중쇄를 전혀 생산하지 않거나 웨스턴 블롯팅으로 탐지되지 않는 수준의 IgM을 생산한다.
한 실시태양에서, 유제류는 그의 게놈이 IgM 중쇄를 코딩하는 2개의 유전자 각각에 돌연변이를 포함하는 트렌스제닉 유제류이다. 바람직하게는, 하나 이상의 돌연변이가 동형접합 돌연변이이고, 더욱 바람직하게는, 모든 돌연변이가 동형접합 돌연변이이다. 돌연변이는 삽입, 결실 또는 치환일 수 있는데, 가장 바람직하게는 외래 핵산의 삽입, 예를 들어, 상동 재조합에 의해 달성될 수 있다. 유제류가 여전히 몇몇 기능적 IgM 중쇄를 만들 수 있다면, 돌연변이의 결과로서 모든 기능적 IgM 중쇄가 없어지는 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 소에서 예시되나, 다른 유제류 (예를 들어, 양, 돼지 및 염소)에도 마찬가지로 적용가능하다. 소의 경우에, 두 개의 IgM-코딩 유전자는 IgμU 및 IgμAY이다.
유제류는 성체 유제류, 태아 유제류, 또는 유제류 배아일 수 있다.
또한 본 발명은 (i) 상기 기술한 바와 같이, 그의 게놈이 IgM 중쇄를 코딩하는 두 개의 유전자의 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 유제류 체세포, 및 (ii) 그의 게놈이 IgμAY의 반접합 또는 동형접합 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 소 체세포를 특징으로 한다. 적합한 세포는 섬유모세포, 상피세포, 내피세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 림프구 (B-세포 및 T-세포), 대식세포, 단핵구, 단핵세포, 심근세포, 기타 근육세포 및 표피세포를 포함한다.
본 발명은 또한 이종 항체의 제조 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법 중 하나는 (a) 이종 조혈모세포가 이식된 본 발명의 트랜스제닉 유제류를 제공하는 단계; 및 (b) 이러한 유제류로부터 (예를 들어, 혈청 또는 유즙으로부터) 이종 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
이종 항체를 제조하는 또다른 방법은 (a) 재배열이 일어나고 이종 면역글로불린을 발현하는 이종 면역글로불린 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산을 가지는 본 발명의 트랜스제닉 유제류를 제공하는 단계; (b) 1종 이상의 대상 항원 을 유제류에 투여하는 단계; 및 (c) 유제류로부터 이종 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 이종 조혈모세포가 이식된 본 발명의 트랜스제닉 유제류를 제공하는 단계; 및 (b) 이종 조혈모세포가 상기 트랜스제닉 유제류에서 증식되도록 하는 단계에 의해 이종 조혈모세포를 증식시키는 방법을 특징으로 한다. 원하는 경우, 증식된 조혈모세포를 트랜스제닉 유제류로부터 수집할 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 본 발명의 트랜스제닉 유제류를 제공하는 단계; (b) 원하는 동종 또는 이종 조직 또는 기관(예를 들어, 피부, 심장, 폐, 췌장, 간 또는 신장 조직)을 유제류 내로 이식하는 단계; 및 (c) 조직 또는 기관을 동물에서 유지시키는 단계에 의한, 생체 내에 원하는 조직 또는 기관을 유지하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 국면 중 임의의 국면에서, 트랜스제닉 유제류는 임의로는 재배열이 일어나고 1종 이상의 이종 면역글로불린을 발현하는 이종 면역글로불린 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 가질 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 이종 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 실질적으로 인간의 것이다. 바람직하게는, 핵산은 인간 항체와 같은 이종 항체 또는 폴리클로날 항체를 코딩한다. 다양한 실시태양에서, 면역글로불린 사슬 또는 항체는 혈청 및(또는) 유즙에서 발현된다. 다른 실시태양에서, 핵산은 염색체 단편, 예컨대 ΔHAC(FERM BP-7582, 국제 특허 생물 기탁소(Intemational Patent Organism Depository), 국립 산업기술 총합 연구소(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), 일본, 305-8565, 이바라끼껭, 츠쿠바시, 히가시 1-초메, 1-1, 츠쿠바 센트럴 6에 위치함) 또는 ΔΔHAC (FERM BP-7581) 내에 포함된다. 그밖의 다른 실시태양에서, 핵산은 숙주 염색체로부터 독립적으로 유제류 세포 내에서 유지된다.
본 발명의 임의의 국면의 또다른 실시태양에서, 유제류는 내생 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자, PrP 유전자, 및(또는) J 사슬 유전자의 하나의 대립 유전자 또는 양쪽 대립 유전자의 돌연변이를 가진다. 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 외래 J 사슬, 예컨대 인간 J 사슬을 코딩하는 핵산을 가진다. 바람직하게는, 돌연변이는 내생 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 효소, 갈락토실(α1,3)갈락토스 에피토프, 프리온 단백질 및(또는) J 사슬의 발현을 감소시키거나 제거한다. 그밖의 다른 바람직한 실시태양에서, 유제류는 이종 J 사슬 핵산, 예컨대 인간 J 사슬 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 유제류는 인간 J 사슬을 포함하는 인간 IgA 또는 IgM 분자를 생산한다. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 내생 유제류 핵산을 돌연변이 시키는데 사용되는 핵산 (예를 들어, 선별 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 돌연변이될 유전자와 실질적인 서열 동일성을 가지는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 넉아웃 카세트)는 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터에 포함되지 않는다. 예를 들어, 세포의 바이러스 감염을 수반하지 않는 형질감염 또는 리포펙션(lipofection)과 같은 표준 방법을 사용하여, 핵산을 유제류 세포 내로 삽입되는 플라스미드 또는 인공 염색체 내에 포함시킬 수 있다. 또다른 실시태양에서, 내생 유제류 핵산을 돌연변이 시키는데 사용되는 핵산 (예를 들어, 선별 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 돌연변이될 유전자와 실질적 서열 동일성을 가지는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 넉아웃 카세트)은 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터에 포함된다. 본 실시태양에 따르면, 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스는 유제류 세포를 감염시키기 위해 사용되는데, 바이러스 벡터의 일부 또는 전체가 유제류 세포 내로 삽입된다.
바람직하게는, 유제류는 소, 양, 돼지 또는 염소이다. 바람직하게는, 트랜스제닉 유제류는 다른 속의 면역글로불린 사슬 또는 항체, 예컨대, 임의의 다른 포유동물의 항체를 발현한다. 특히 바람직한 유제류는 양, 큰뿔양, 염소, 들소, 영양, 황소, 말, 당나귀, 노새, 사슴, 엘크(elk), 산림순록, 물소, 낙타, 라마, 알파카, 돼지 및 코끼리이다.
본 발명은 또한 재배열이 일어나고 이종 (예를 들어, 인간) 면역글로불린 유전자 좌위를 발현하는 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 트랜스제닉 소)를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 이는 예를 들어, 내생 면역글로불린에 추가하여 또는 이를 대신하여, 이종 면역글로불린를 생산하는 B-세포를 가지는 트랜스제닉 유제류를 제조하기 위해, 면역글로불린 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 유제류 내로 안정적으로 도입시킴으로써 달성될 수 있다. 이는 또한 이종 면역글로불린 사슬 또는 이종 항체를 코딩하는 핵산을 유제류의 염색체 내로 삽입함으로써 달성될 수 있다. 트랜스제닉 유제류는 IgM을 코딩하는 2개 이상의 유전자 내에 돌연변이를 가 져서, 내생 IgM의 발현이 감소되거나 제거된다. 한 실시태양에서, 본 발명은 둘 이상의 mu 불변 영역이 파괴되고, 다른 종의 면역글로불린, 바람직하게는 인간의 면역글로불린을 코딩하는 유전자 좌위를 포함하는 인공 염색체를 안정하게 혼입시킨 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 트랜스제닉 소)를 제조하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 유제류 체세포 또는 배아 줄기(ES) 세포, 바람직하게는 섬유모세포 또는 B-세포를 제조하는 방법을 특징으로 하는데, 여기서 2개 이상의 내생 IgM 중쇄 유전자의 하나의 대립 유전자 또는 양쪽 대립 유전자 모두가, 예를 들어, 상동 재조합에 의해 파괴된다.
본 발명은 또한 2개 이상의 내생 IgM 중쇄 유전자가 파괴된 유제류 내로, 비-유제류 면역글로불린 또는 이들의 중쇄 또는 경쇄의 기능적 발현에 충분한 유전자를 포함하는 핵산(예를 들어, 인공 염색체)을 삽입하는 방법을 특징으로 한다. 바람직하게는, 이들 면역글로불린은 이러한 면역글로불린 또는 면역글로불린 사슬을 코딩하는 핵산을 유제류 체세포, 바람직하게는 섬유모세포 내로 도입시킴으로써 제조된 인간 면역글로불린이며, 이는 핵산이 생식 계열 내로 전달된 클로닝된 유제류를 생성시킨다.
본 발명은 또한 인공 염색체, 바람직하게는 면역글로불린 발현을 제공하는 유전자를 포함하는 인간 인공 염색체 (HAC)를 전술한 동형접합 넉아웃 세포로 도입시키는 방법을 특징으로 하며, 이에 따라 면역화에 반응하여 비-유제류 면역글로불린, 바람직하게는 인간 면역글로불린을 발현시키고 친화력 성숙(affinity maturation)이 일어나는 유제류가 생성된다.
본 발명은 또한 상기 기술한 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 트랜스제닉 소)로부터 유래된 B-세포를 사용하는 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 폴리클로날 인간 면역글로불린을 생산하는 상기 기술된 트랜스제닉 유제류를 제공하고, 유제류로부터 유제류 항혈청 또는 유즙을 수집하여 폴리클로날 인간 면역글로불린을 포함하는 유제류 항혈청 또는 유즙을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 이러한 인간 면역글로불린, 바람직하게는 인간 IgG는 인간의 질병의 치료 또는 예방을 위한 정맥내 면역글로불린 (IVIG)으로서 사용될 수 있다. 폴리클로날 인간 면역글로불린은 바람직하게는 대상 항원에 대해 반응한다.
프리온
단백질이
감소된
트랜스제닉
유제류
본 발명은 또한 내생 프리온 핵산의 하나의 대립 유전자 또는 양쪽 대립 유전자 모두에서 비-자연적으로 발생한 돌연변이를 포함하는 소 또는 소 태아를 특징으로 한다. 돌연변이는 기능적 프리온 단백질의 발현을 감소시키거나, 실질적으로 제거하거나, 또는 제거하며, 반접합 또는 동형접합일 수 있다. 나아가, 소 또는 소 태아는 내생 항체의 발현을 감소시키는 추가적 돌연변이를 수반할 수 있다. 이러한 돌연변이는 예를 들어, 기능적 IgM 중쇄의 발현을 감소시킬 수 있거나 또는 실질적으로 제거할 수 있다. 바람직하게는, 소 태아는 수정 후 30일 이상이 된 것이지만, 출생 전 임의의 월령일 수 있다. 바람직한 소는 신생아 및 1주 이상의 주령, 더욱 바람직하게는 2월령 이상인 송아지를 포함한다.
관련된 국면에서, 본 발명은 본 발명의 소 또는 소 태아로부터 제조된 제품 및 프리온 단백질이 실질적으로 없는 산물을 제조하는 방법, 본 발명의 소 또는 소 태아로부터 산물을 제조하는 것과 관련된 방법, 또는 본 발명의 소 또는 소 태아로부터 산물을 수득하는 방법을 특징으로 한다. 예시적인 산물은 유즙, 젤라틴, 콜라겐, 및 소 또는 소 태아로부터 수득된 혈청 뿐 아니라, 소 또는 소 태아 내에서 생산된 재조합 단백질을 포함한다.
다형질성 또는 다유전자성 돌연변이를 포함하는 세포 및 비인간 포유동물의 제조 방법
본 발명은 2개의 유전적 변형(예를 들어, 돌연변이, 또는 트랜스진 또는 인공 염색체의 삽입)을 가지는 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 제1 유전적 변형을 가지는 비인간 포유류 체세포를 제공하는 단계; (b) 세포 또는 그의 자손, 상기 세포 또는 그의 자손의 염색질체, 또는 세포 또는 그의 자손의 핵을 유핵 또는 탈핵 난자 내로 삽입하는 단계; (c) 단계 (b)로부터 수득된 난자 또는 난자로부터 형성된 배아를 수여체 내로 이식하는 단계; (d) 배아, 태아, 또는 이들로부터 생성된 어린 성체로부터 제1 유전적 변형을 포함하는 세포를 단리하는 단계; (e) 제2 유전적 변형을 단계 (d)의 세포 또는 그의 자손의 게놈 내로 도입하여, 2개의 유전적 변형을 가지는 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
따라서 본 발명은 다형질성 또는 다유전자성 돌연변이를 포함하는 비인간 포유동물 및 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 포유동물의 예로는 유제류(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소, 말 또는 들소), 토끼, 마우스, 래트, 또는 영장류 (예를 들어, 원숭이, 개코원숭이, 또는 고릴라)가 있다. 본원에 제공되는 회생 기법(rejuvenation technique)을 사용하여, 세포의 수명은 증가되고, 이로써 장기간이 요구되는 세포의 유전자 조작이 가능해진다.
한 국면에서, 본 발명은 (a) 내생 유전자의 제1 대립 유전자 내에 돌연변이를 가지는 유제류 체세포를 제공하는 단계; (b) 세포 또는 그의 자손, 세포 또는 그의 자손의 염색질체, 또는 세포 또는 그의 자손의 핵을 유핵 또는 탈핵 난자 내로 삽입하는 단계; (c) 단계 (b)로부터 수득된 난자 또는 이러한 난자로부터 형성된 배아를 소의 난관 또는 자궁 내로 이식하는 단계; (d) 단계 (c)의 이식된 난자 또는 배아를 태아로 발생시키는 단계; (e) 임신 25일 내지 90일 사이의 소의 태아 세포를 단리하는 단계; 및 (f) 돌연변이를 제1 내생 유전자의 제2 대립 유전자 내로 도입하거나 또는 상이한 제2 내생 유전자의 대립 유전자 내로 도입하여, 다형질성 또는 다유전자성 돌연변이를 포함하는 소 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 다형질성 또는 다유전자성 돌연변이를 포함하는 소 세포를 제조방법을 제공한다. 원하는 경우, 본 발명은 단계 (f)에서 수득된 세포로부터 시작하여, 상기 방법을 1회 이상 반복하여, 추가적 대립 유전자 또는 유전자 내로 돌연변이를 도입시키는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 (a) 다형질성 또는 다유전자성 돌연변이를 포함하는 비인간 포유류 세포(예를 들어, 상기 수득된 임의의 세포)를 제공하는 단계; (b) 세포 또는 그의 자손, 세포 또는 그의 자손의 염색질체, 또는 세포 또는 그의 자손의 핵을 유핵 또는 탈핵 난자 내로 삽입하는 단계; (c) 단계 (b)로부터 수득된 난자 또는 이러한 난자로부터 형성된 배아를 비인간 포유동물 내로 이식하는 단계; (d) 단계 (c)의 이식된 난자 또는 배아를 비인간 포유동물으로 발생시켜, 2개의 유전적 변형을 포함하는 비인간 포유동물을 제조하는 단계를 포함하는, 2개의 유전적 변형을 포함하는 비인간 포유동물 (예를 들어, 유제류)을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 원하는 경우, 단계 (b) 전에, 단계 (a)에 제공된 세포는 염색질 응축을 허용하는 조건 하에 가투과성으로 만들 수 있다.
본 발명의 예시적 비인간 포유동물은 유제류 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소, 말 또는 들소), 영장류 (예를 들어, 원숭이, 개코원숭이 또는 고릴라), 토끼, 마우스 및 래트이다. 바람직하게는, 2개의 유전적 변형을 포함하는 소, 예를 들어, 보스 타우루스(Bos taurus) 또는 보스 인디쿠스(Bos indicus)가 본원에 기술된 클로닝 방법을 사용하여 제조된다.
본 발명의 모든 전술한 국면에서, 임의의 체세포(예를 들어, 배아, 태아 또는 성체 세포)가 사용될 수 있다. 예시적 세포는 섬유모세포, 상피세포, 신경세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, B-림프구, T-림프구, 적혈구, 대식세포, 단핵구, 태반 세포 및 근육세포를 포함한다. 비인간 포유동물이 소라면, 바람직하게는, 체세포는 임신 25 내지 90일째, 임신 35 내지 60일째, 임신 35 내지 50일째, 임신 35 내지 45일째, 임신 38 내지 43일째, 가장 바람직하게는, 임신 약 40일째의 태아로부터 단리된다. 임의적으로, 체세포는 이들이 난자 내로 삽입되기 전에 본원에 기술된 바와 같이 가투과성으로 될 수 있다.
유전적 변형의 한 유형은 돌연변이이다. 돌연변이는 전사적 활성 유전자 또 는 전사적 침묵 유전자 내로 도입될 수 있다. 돌연변이가 도입될 수 있는 예시적 내생 유전자는 항체-코딩 유전자(예를 들어, J 사슬 또는 IgμU 또는 IgμAY와 같은 Igμ 유전자), α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 또는 프리온 유전자이다.
통상적으로, 돌연변이는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 항생제 내성 유전자와 같은 양성 선별 마커)를 내생 유전자 내로 삽입함으로써 도입된다. 임의적으로, 내생 유전자 내로 도입된 돌연변이는 이러한 유전자의 발현을 감소시킨다. 별법으로, 돌연변이는 항체와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 이종 핵산 분자의 삽입을 포함할 수 있다. 원하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 또한 양성 선별 마커를 플랭킹하는 리컴비나제 부위, 예컨대 loxP 부위를 포함하여, 양성 선별 마커가 리컴비나제 (예를 들어, Cre 리컴비나제)에 의해 제거되도록 할 수 있다.
유전적 변형의 또다른 유형은 돌연변이의 도입 없이 세포의 게놈 내로 삽입되는 트랜스진이다. 바람직한 한 트랜스진은 인간 인공 염색체와 같은 인공 염색체이다. 본원에서는 이종 항체 (예를 들어, 인간 항체)를 제조하기 위한 인공 염색체를 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 "대립 유전자"는 특정 염색체 상의 특정 위치를 차지하는 DNA 쌍의 하나의 구성원을 의미한다.
"인공 염색체"는 선별 마커의 첨가, 클로닝 부위의 첨가, 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 1개 이상의 뉴클레오티드의 치환 등과 같은 인공적 변형을 가지는 포유류 염색체 또는 그 단편을 의미한다. "인간 인공 염색체 (HAC)"는 하나 이상 의 인간 염색체(들)로부터 제조된 인공 염색체를 의미한다. 인공 염색체는 숙주 세포의 내생 염색체와 독립적으로 숙주 세포 내에 유지될 수 있다. 이러한 경우에, HAC는 내생 염색체와 함께 안정하게 복제되고 분리될 수 있다. 별법으로, HAC는 숙주 세포의 내생 염색체로 전위되거나 또는 삽입될 수 있다. 2개 이상의 인공 염색체가 숙주 세포에 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 인간 염색체 #14(Ig 중쇄 유전자를 포함), 인간 염색체 #2(Ig 카파 사슬 유전자를 포함), 인간 염색체 #22(Ig 람다 사슬 유전자를 포함)으로부터 유도된 인공 염색체가 도입될 수 있다. 별법으로, 이종 Ig 중쇄 유전자 및 Ig 경쇄 유전자를 모두 포함하는 인공 염색체(들), 예컨대 ΔAHAC, ΔΔHAC, 또는 κHAC이 도입될 수 있다. 바람직하게는 중쇄 유전자 좌위 및 경쇄 유전자 좌위는 상이한 염색체 팔(즉, 동원체의 다른 측)상에 있다. 그밖의 다른 바람직한 실시태양에서, HAC의 전체 크기는 약 12, 10, 9, 8, 또는 7 메가염기 이하이다.
"소 태아"는 수정 후 30일 이상인 자궁 내의 소를 의미한다.
"배아로부터 유래된 세포"는 배아 내에서 세포의 세포분열로 제조된 세포를 의미한다.
"키메라 배아"는 둘 이상의 배아에서 유래된 세포로부터 형성된 배아를 의미한다. 생성된 태아 또는 자손은 단지 하나의 초기 배아로부터 유래된 세포 또는 하나 이상의 초기 배아로부터 유래된 세포를 가질 수 있다. 원하는 경우, 태반 조직 및 태아 조직 내로 혼입된 각각의 배아로부터 유래된 세포의 백분율을 표준 FISH 분석 또는 하나의 배아에 첨가된 막 염색의 분석을 사용하여 결정할 수 있다.
"키메라 유제류"는 둘 이상의 배아로부터 유래된 세포로부터 형성된 유제류를 의미한다. 유제류는 단지 하나의 초기 배아로부터 유래된 세포 또는 일 이상의 초기 배아로부터 유래된 세포를 가질 수 있다. 원하는 경우, 태반 조직 및 태아 조직 내로 혼입된 각각의 배아로부터 유래된 세포의 백분율을 표준 FISH 분석 또는 하나의 배아에 첨가된 막 염색제의 분석을 이용하여 결정할 수 있다.
"염색질체"는 막에 의해 둘러싸여 있지 않은 하나 이상의 염색체를 의미한다. 바람직하게는, 염색질체는 세포의 염색체 모두를 포함한다. 인공적으로 유도되며 응축된 염색체를 포함하는 염색질체는 핵을 유사분열을 재프로그래밍하는 매질 (예를 들어, 유사분열 추출물)에 노출시킴으로써 형성될 수 있다. 별볍으로, 탈응축(decondense)되거나 또는 부분적으로 응축된 염색체를 포함하는, 인공적으로 유도된 염색질체는 본원에 기술된 바와 같이, 핵을 항-NuMA 항체를 포함하는 유사분열 추출물, 세정제 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액 중 하나에 노출시킴으로써 생성될 수 있다. 염색질체는 물리적으로 서로 접촉되지 않는 분리된 염색체를 포함할 수 있거나 또는 물리적 접촉하에 있는 둘 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
원하는 경우, 염색체 응축의 수준은 DNA 염료인, DAPI로 염색된 강도를 측정함으로써 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 염색체가 응축됨에 따라, 이러한 염색 강도는 증가한다. 따라서, 염색체의 염색 강도는 간기에서 탈응축된 염색체에 대한 염색 강도(응축율 0%로 나타냄)와 유사분열시 최대로 응축된 염색체에 대한 염색 강도(응축율 100%로 나타냄)와 비교할 수 있다. 이러한 비교를 토대로, 최대 응축%를 결정할 수 있다. 바람직한 응축 염색질체는 응축율이 최소한 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% 이상, 또는 100%이다. 탈응축되거나 또는 부분적으로 응축된 바람직한 염색질체는 응축율이 10% 미만이다.
"임신 일수"은 난자 또는 배아가 자궁 내로 이식된 시점으로부터의 일수를 의미한다.
"공여체 세포"는 그로부터 핵 또는 염색질체가 유래하는 세포, 또는 가투과성 세포를 의미한다.
"배아"는 모계 숙주의 자궁 막 내에 착상되지 않은 발생된 세포 집단을 의미한다. 따라서, 용어 "배아"는 수정된 난자; 공여체 염색질체, 핵, 또는 재프로그래밍된 세포를 포함하는 난자; 포낭전(pre-blastocyst) 단계 발생 세포단; 또는 모계 숙주의 자궁 막에 착상 전 및 생식 융기의 형성 전의 발생 단계에 있는 임의의 다른 발생세포단을 지칭할 수 있다. 배아는 세포 발생의 다단계를 지칭할 수도 있다. 예를 들어, 1세포 배아를 접합체로 지칭할 수 있으며, 분열된 배아로부터 형성된 세포의 둥근 고형 세포단을 상실배라고 지칭할 수 있으며, 포배강을 가지는 배아를 포낭배로 지칭할 수 있다. "배아 세포"는 배아로부터 단리된 세포 또는 배아 내에 포함된 세포이다.
"배아 클로닝"은 배아가 다른 동물의 세포 또는 세포 물질로부터 생성되는 과정을 의미한다. 배아 클로닝은 예를 들어, 공여체 세포, 핵 또는 염색질체를 난자에 삽입하거나 또는 난자와 융합함으로써 수행될 수 있다. 생성된 난자 또는 이러한 난자로부터 형성된 배아를 그 후 동물의 자궁 내로 이식하여, 클로닝된 동물 을 제조할 수 있다.
"인자의 풍부 또는 결핍"은 재프로그래밍 배지 (예를 들어, 세포 추출물)에 원래 존재하는 인자의 양의 최소한 20, 40, 60, 80% 이상, 또는 100% 만큼 자연-발생 인자 또는 재조합 인자를 첨가 또는 제거하는 것을 의미한다. 별법으로, 재프로그래밍 배지에 자연적으로 존재하지 않는 재조합 인자 또는 자연-발생 인자가 첨가될 수 있다. 바람직한 인자는 단백질 (예컨대 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 디아세틸라제, 히스톤, 프로타민, 핵의 라민, 전사 인자, 활성자 및 억제자), 막 소포, 및 소기관을 포함한다. 바람직한 한 실시태양에서, 인자는 하기 기술하는 바와 같이, 재프로그래밍 배지에 첨가되기 전에 정제된다. 별법으로, 하기 기술된 정제 방법 중 하나를 재프로그래밍 배지로부터 원치않는 인자를 제거하는데 사용할 수 있다.
"태아"는 모계 숙주의 자궁 막 내에 착상된 발생세포단을 의미한다. "태아 세포"는 출생을 포함하는 임신의 임의의 단계에서 태아로부터 단리된 임의의 세포 또는 태아 내에 포함된 임의의 세포이다.
"단편"은 본 발명의 항체의 상응하는 영역과 일치하지만 전장 서열에는 못미치는 연속 아미노산의 영역을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 표준 분석, 예컨대 본원에 기술된 것들에 기초하여 검정되는, 상응하는 항체가 결합하는 항원과 동일한 항원에 결합하는 능력을 가진다. 바람직하게는, 단편의 항원에 대한 결합은 상응하는 항체의 결합에 비해 최소한 20, 40, 60, 80, 또는 90%이다.
"유전자"는 염색체 상의 특정 위치를 차지하며 유기체 내에서 특정한 특성을 결정하는, DNA의 서열로 구성된 유전 단위를 의미한다. 유전자는 통상적으로 2개의 대립 유전자를 가진다.
"반접합 돌연변이"는 내생 유전자의 하나의 대립 유전자가 돌연변이되고 다른 대립 유전자는 돌연변이되지 않은 것을 의미한다.
"동형접합 돌연변이"는 내생 유전자의 2개의 대립 유전자가 돌연변이 된 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 양쪽 대립 유전자에서 돌연변이를 유도하는 사건은 동일할 수도 또는 동일하지 않을 수도 있다. 따라서, 2개의 상이한 표적화 벡터에 의해 표적화되는 내생 유전자의 2개의 대립 유전자가 동형접합 돌연변이로 여겨질 것이다.
"동형접합 넉아웃 비인간 포유동물"은 내생 유전자의 2개의 대립 유전자가 유전적으로 표적화되어, 기능적 유전자 산물의 발현의 특징적인 감소 또는 소실을 나타내는 인간 이외의 포유동물을 의미한다. 본 발명에 따르면, 양쪽 대립 유전자에서의 유전적 표적화 사건은 동일할 수도 또는 동일하지 않을 수도 있다. 따라서, 2개의 대립 유전자가 2개의 상이한 표적화 벡터로 유전적으로 표적화되어 내생 유전자를 발현하지 않게 하는 비인간 포유동물이 동형접합 넉아웃 비인간 포유동물로 여겨질 것이다.
"불멸화"란 불멸화 세포와 동일한 세포 유형, 속, 및 종의 자연-발생 대조 세포보다 또는 불멸화 세포가 유래된 공여체 세포보다 적어도 25, 50, 75, 90, 또는 95% 많은 세포 분열이 일어날 수 있는 것을 의미한다. 바람직하게는, 불멸화 세포는 대조군 세포 보다 최소 2, 5, 10 또는 20배 이상의 세포 분열이 일어날 수 있다. 더욱 바람직하게는, 불멸화 세포는 세포 분열이 무제한적으로 일어날 수 있다. 불멸화 세포는 생체내 또는 시험관내에서 이들의 정상 성장-조절 과정이 변형된 돌연변이를 자연적으로 획득한 세포를 포함한다. 그밖의 다른 바람직한 불멸화 세포는 종양유전자, 예컨대 ras, myc, abl, bc12, 또는 neu를 발현시키도록 유전적으로 변형된 세포 또는 형질전환 DNA 또는 RNA 바이러스, 예컨대 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr virus) 또는 SV40 바이러스에 감염된 세포를 포함한다(Kumar et al. (1999) Immunol. Lett. 65: 153-159; Knight et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3130-3134; Shammah et al. (1993) J. Immunol. Methods 160: 19-25; Gustafsson and Hinkula (1994) Hum. Antibodies Hybridomas 5: 98-104; Kataoka et al. (1997) Differentiation 62: 201-211; Chatelut et al. (1998) Scand. J. Immunol. 48: 659-666). 세포는 또한 텔로머라제 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다 (Roques et al. (2001) Cancer Res. 61:8405-8507).
"넉인(knock-in) 돌연변이"는 임의로는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 핵산을 세포의 염색체 내로 삽입하는 것을 의미한다.
"돌연변이"는 자연-발생 또는 표준 핵산 서열에, 삽입, 결실, 프레임쉬프트 돌연변이, 침묵 돌연변이, 넌센스(nonsense) 돌연변이, 또는 미스센스(missense) 돌연변이와 같은 변경이 이루어진 것을 의미한다. 바람직하게는, 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 자연-발생 서열로부터 1개 이상의 아미노산 변경을 가진다. 세포, 배아, 태아 또는 포유동물의 유전자 서열을 변경하기 위한 재조합 DNA 기술의 예는 또다른 유기체(예를 들어, 인간)로부터의 DNA 서열을 게놈 내로 삽입, 1개 이상의 DNA 서열의 결실, 1개 이상의 기본 돌연변이(예를 들어, 부위-지정 또는 무작위 돌연변이)를 표적 DNA 서열 내로 도입하는 것을 포함한다. 이러한 변형을 생성하는 방법의 예는 레트로바이러스에 의한 삽입, 인공 염색체 기법, 유전자 삽입, 조직 특이적 프로모터와 함께 무작위 삽입, 상동 재조합, 유전자 표적화, 전치 요소(transposable element) 및 외래 DNA를 도입시키기 위한 임의의 다른 방법을 포함한다. 상기 모든 방법은 분자 생물학계의 당업자에게 공지되어 있다. "비-자연 발생 돌연변이"는 인공적으로, 예를 들어, 재조합 수단으로 도입된 것이다.
"다형질성 돌연변이를 포함하는 비인간 포유동물" 또는 "다형질성 비인간 포유동물"은 내생 유전자의 2개의 대립 유전자가 돌연변이된 인간 이외의 포유동물을 의미한다. 2개의 대립 유전자 내의 돌연변이는 동일한 위치에 있을 수도 또는 있지 않을 수도 있으며, 동일한 유형의 변경에 기인할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 예를 들어, 다형질성 비인간 포유동물 중의 유전자의 대립 유전자는 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 통해 돌연변이 될 수 있다.
"다유전자성 돌연변이를 포함하는 비인간 포유동물" 또는 "다유전자성 비인간 포유동물"은 2개 이상의 상이한 유전자가 돌연변이된 인간 이외의 포유동물을 의미한다. 2개의 유전자 내의 돌연변이는 동일한 위치에 있을 수도 또는 있지 않을 수도 있으며, 동일한 유형의 변경에 기인할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 예를 들어, 다유전자성 비인간 포유동물 중의 2개의 유전자는 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 통해 돌연변이될 수 있다.
"핵"은 세포의 DNA의 대부분 또는 전부를 포함하는 막으로 둘러싸인 소기관을 의미한다. DNA는 탈응축된 형태로 염색체 내에 패킹되어 있다. 바람직하게는, DNA를 둘러싸는 막은 하나 또는 2개의 지질 이중층을 포함하거나 또는 뉴클레오포린(nucleoporin)을 가진다.
"가투과성화"란 원형질막 내의 세공의 형성 또는 원형질막의 부분적 또는 완전한 제거를 의미한다.
"태반"은 임신 기간 동안 암컷 포유동물에서 발달하며, 자궁 벽의 안쪽에 있고, 부분적으로 태아를 둘러싸고 있으며, 태아와 탯줄로 연결된 혈관성 막 기관을 의미한다.
"정제"는 자연적으로 동반되는 다른 성분으로부터 분리하는 것을 의미한다. 통상적으로, 50 중량% 이상에서 단백질, 항체, 및 자연적으로 관련된 자연-발생 유기 분자가 없을 때 그 인자는 실질적으로 순수하다. 바람직하게는, 인자는 75 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상 순수하다. 실질적으로 순수한 인자는 화학 합성, 자연 공급원으로부터 인자의 분리, 또는 인자를 자연적으로 제조하지 않는 재조합 숙주 세포 내에서 인자를 제조함으로써 수득될 수 있다. 단백질, 소포 및 소기관은 문헌 [Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1995]에 기술된 것과 같은 표준 기술을 사용하여 당업자에 의해 정제될 수 있다. 인자는 바람직하게는, 출발 물질에 비해 2, 5, 또는 10배 이상 순수하며, 이는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 광학 밀도, HPLC 분석, 또는 웨스턴 블롯팅 분석 (Ausubel et al., 상기 문헌)을 사용하여 측정된다. 정제의 바람직한 방법은 면역침강법, 면역친화성 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피, 자기 구슬 면역친화성 정제, 및 플레이트-결합 항체에 의한 패닝(panning)법을 포함한다.
"재클로닝(recloned)"은 후속하는 (예를 들어, 제2) 라운드의 클로닝에 사용되는 것을 의미한다. 특히, 본 발명의 방법을 통해 제조된 배아, 태아, 또는 성체 세포는 상기 기술한 바와 같이, 유사분열 재프로그래밍 배지 (예를 들어, 유사분열 세포 추출물) 내에서 인큐베이션되어 탈핵 난자로 삽입하기 위한 염색질체를 형성할 수 있다. 별법으로, 세포는 상기 기술한 바와 같이, 가투과성화되고, 재프로그래밍 배지에서 인큐베이션되어, 탈핵 난자 내로 삽입될 수 있다. 2회 이상의 클로닝을 수행시 공여체 염색질체 또는 공여체 세포의 부가적 재프로그래밍을 가져올 수 있으며, 이에 따라 마지막 라운드의 클로닝 후에는 생존가능한 자손을 제조할 확률이 증가될 수 있다.
"내생 항체의 발현 감소"는 B-세포 또는 B-세포의 집단에 의해 생산되는 내생, 기능적 항체의 양이 감소하는 것을 의미한다. 내생 항체의 양의 이러한 감소는 B-세포 당 생산되는 내생 항체의 양의 감소에 기인한 것일 수도 있고, 기능적 내생 B-세포의 수의 감소에 기인한 것일 수도 있으며, 또는 이들의 조합에 기인한 것일 수도 있다. 바람직하게는, B-세포에 의해 분비되는 내생 항체의 양 또는 내생 항체를 발현시키거나 분비하는 B-세포의 표면 상에서 발현되는 내생 항체의 양은 25, 50, 75, 90 또는 95% 이상 감소된다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 수여체 포유동물로부터 온 시료, 예컨대 혈액 시료에서의 내생 B-세포의 수는 25, 50, 75, 90, 또는 95% 이상 감소된다.
"재프로그래밍 배지"는 세포, 핵, 염색질체, 또는 염색체로부터 인자의 제거 또는 세포, 핵, 염색질체, 또는 염색체에 용매로부터의 첨가를 가능하게 하는 용액을 의미한다. 바람직하게는, 인자의 첨가 또는 제거는 공여 세포, 염색질체, 또는 핵 중의 mRNA 또는 단백질, 또는 재프로그래밍된 염색질체 또는 핵을 포함하는 세포 중의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 증가시키거나 또는 감소시킨다. 다른 실시태양에서, 재프로그래밍 배지에서 가투과성으로 된 세포, 염색질체, 또는 핵을 인큐베이션시키는 것은 공여체 세포의 표현형에 대하여, 가투과성으로 된 세포, 또는 재프로그래밍된 염색질체 또는 핵을 포함하는 세포의 표현형을 변경시킨다. 그밖의 또다른 실시태양에서, 재프로그래밍 배지에서 가투과성화 세포, 염색질체, 또는 핵을 인큐베이션하는 것은 가투과성으로 된 세포, 또는 재프로그래밍된 염색질체 또는 핵을 포함하는 세포가 공여 세포에 대하여 활성을 얻거나 잃도록 만든다.
예시적 재프로그래밍 배지는 단백질 또는 핵산과 같은 생물학적 분자를 포함하지 않는, 예컨대 완충액과 같은 용액을 포함한다. 이러한 용액은 핵, 염색질체, 또는 염색체로부터 1종 이상의 인자를 제거하는데 유용하다. 다른 바람직한 재프로그래밍 배지는 세포 핵, 세포질, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 세포 추출물과 같은 추출물이다. 예시적 세포 추출물은 난자 (예를 들어, 포유류, 척추동물 또는 무척추동물 난자), 수컷 세균 세포 (포유류, 척추동물 또는 무척추동물 세균 세포, 예컨대 정조세포, 정모세포, 정자세포 또는 정자) 및 줄기 세포 (예를 들어, 성체 또는 배아 줄기 세포)로부터 유래된 추출물을 포함한다. 그밖의 다른 재프로 그래밍 배지는 용액 또는 1종 이상의 자연-발생 또는 재조합 인자 (예를 들어, 핵산 또는 단백질, 예컨대, DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 디아세틸라제, 히스톤, 프로타민, 핵의 라민, 전사 인자, 활성자, 억제자, 염색질 리모델링 단백질, 성장 인자, 인터루킨, 시토킨 또는 기타 호르몬)가 첨가된 추출물, 또는 1종 이상의 인자가 제거된 추출물이다. 그밖의 다른 재프로그래밍 배지는 세정제의 용액(예를 들어, 0.01% 내지 0.1%, 0.1% 내지 0.5%, 또는 0.5% 내지 2% 이온성 또는 비-이온성 세정제, 예컨대 1종 이상의 하기의 세정제: SDS, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, CHAPS, Na-데옥시콜레이트, n-옥틸 글루코시드, 노니데트(Nonidet) P40, IGEPAL, 트윈 20, 트윈 40, 또는 트윈 80), 염 (예를 들어, ~0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 또는 2 M NaCl 또는 KCl), 폴리아민 (예를 들어, ~1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM 또는 10 mM 스페르민, 스페르미딘, 프로타민 또는 폴리-L-라이신), 단백질 키나제 (예를 들어, 시클린-의존성 키나제 1, 단백질 키나제 C, 단백질 키나제 A, MAP 키나제, 칼슘/칼모듈린-의존성 키나제, CK1 카세인 키나제, 또는 CK2 카세인 키나제), 및(또는) 포스파타제 억제제 (예를 들어, ~10 μM, 100 μM, 1 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM의 1종 이상의 하기의 억제제: Na-오르쏘바나데이트, Na-피로포스페이트, Na-플루오라이드, NIPP1, 억제제 2, PNUTS, SDS22, AKAP149, 또는 오카다산) 또는 뉴클리오플라스민을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 재프로그래밍 배지는 항-NuMA 항체를 포함한다. 원하는 경우, 공여체 세포, 핵 또는 염색질체를 재프로그래밍 하기 위해 다양한 재프로그래밍 배지가 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
"재프로그래밍된 세포"는 재프로그래밍 배지에 노출된 세포를 의미한다. 바람직하게는, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300개, 또는 그 이상의 mRNA 또는 단백질 분자가 공여체 또는 가투과성화 세포에서는 발현되지 않으나 재프로그래밍된 세포에서 발현된다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 재프로그래밍된 세포에서 발현되나 공여체 또는 가투과성화 세포에서는 발현되지 않는 mRNA 또는 단백질 분자의 수는 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 25, 25 내지 50, 50 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 또는 200 내지 300개를 포함한다. 바람직하게는, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300개, 또는 그 이상의 mRNA 또는 단백질 분자가 재프로그래밍된 세포에서 발현되지 않으나 공여체 또는 가투과성화 세포에서는 발현된다. 그밖의 또다른 바람직한 실시태양에서, 공여체 또는 가투과성화 세포에서는 발현되나 재프로그래밍된 세포에서는 발현되지 않는 mRNA 또는 단백질 분자의 수는 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 25, 25 내지 50, 50 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 또는 200 내지 300개를 포함한다. 그밖의 또다른 바람직한 실시태양에서, 이러한 mRNA 또는 단백질 분자는 공여체 세포 (즉, 공여체 또는 투과성화 출발 세포) 및 재프로그래밍된 세포에서 발현되나, 이들 세포의 발현 수준은 표준 분석법을 사용하여 측정시(예를 들어, Ausubel et al., 상기 문헌 참조) 2, 5, 10 또는 20배 이상 상이할 수 있다.
"실질적으로 동일"은 다른 서열과 80, 90, 95, 98% 이상, 또는 100% 동일한 서열을 가짐을 의미한다. 서열 동일성은 통상적으로 BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) 또는 이에 대해 구체적인 기본적 파라미터를 갖는 BLAST® 2를 사용하여 측정한다 (문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410]; 및 [Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett 174: 247-250] 참조). 이러한 소프트웨어 프로그램은 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 대한 상동성의 정도를 정함으로써 유사한 서열들을 매치시킨다. 보존적 치환은 통상적으로 다음의 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 이소루신, 루신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
"생존가능한 자손"은 자궁외(ex utero)에서 생존하는 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 모계 숙주에서 나온 시점으로부터 최소한 1초, 1분, 1시간, 1일, 1주일, 1달, 6달 또는 1년 동안 살아있다. 동물은 생존을 위해서 자궁내 환경에서는 순환계를 필요로 하지 않는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백할 것이다.
도 1은 소 1차 섬유모세포 내에서의 순차적 유전자 표적화를 나타내는 모식도이다. 홀슈타인(Holstein) 태아 섬유모세포 (#6939)를 표적화하고, 그 후 표적화된 세포를 포함하는 웰을 선별하여 클로닝하고, 염색질 전달 시스템을 사용하여 IgμU-/+ 태아를 제조하였다. 그 후 IgμU-/+ 세포주 (#3287)를 송아지의 제조 및 IgμU의 제2 대립 유전자의 표적화를 위해 사용하였다. 다시 한번, 세포를 선별하고 재생산하여 태아를 제조하였다. IgμU-/- 세포주의 제조, 유전자 발현 분석, 및 송아지의 제조를 위해 태아를 수집하였다. IgμU-/- 세포주 (#4658)를 Cre-리컴비나제 발현 플라스미드로 형질감염시켜 neo 및 puro 유전자 모두를 동시에 제거한 뒤, 제3 라운드의 염색질 전달을 통해 클로닝된 태아 및 세포주를 제조하였고, neo 및 puro 선별 마커 유전자를 절제하였다. 하나의 Cre-절제된 IgμU-/- 섬유모세포 세포주 (#1404)를 제3 라운드의 유전자 표적화를 위해 사용하여 삼중 표적화된 Cre/IgμU-/-/PrP-/+ 태아 및 세포주를 제조하였다. 하나의 세포주 (#8334)를 제4 라운드의 유전자 표적화에 적용시켜 이중으로 동형접합 KO (cre/IgμU-/-/PrP-/-) 태아 및 세포주를 제조하였고 PrP 유전자 발현을 평가하였다.
도 2A는 #6939 내의 IgμU 불변 영역 유전자 좌위의 구조, 제1 라운드의 표적화에 사용되는 puro 벡터, 및 표적화에 사용되는 게놈 PCR 분석을 나타내는 모식도이다. 표적화 벡터는 5' 동종 팔 (7.2kb), 3' 동종 팔 (2.0 kb), 전사 및 번역 정지 서열을 포함하는 STOP 카세트, 전사 및 번역 정지 서열, DT-A (디프테리아 독소 A 유전자), 및 플록스 puro 유전자를 포함하였다. 벡터는 넉아웃 카세트를 IgμU 불변 영역 유전자 좌위의 엑손 2에 삽입시키도록 설계하였다. #6939 섬유모세포에서, 다형성 서열은 나타낸 바와 같이, 대립 유전자 A 및 대립 유전자 B를 구별하는 것으로 발견되었다. 프라이머 쌍인 puroF2 x puroR2는 제1 표적화 사건을 확인하는데 사용되었다. PCR 및 서열분석 결과물은 벡터가 세포주 #3287 내의 대립 유전자 B 및 #2184-1 및 2 세포주 내의 대립 유전자 A 내로 삽입된 것을 보여주었는데, 이는 PCR 결과물에 존재하는 다형성 서열을 기초로 하였다.
도 2B는 puroF2 x puroR2 프라이머를 사용한 게놈 PCR에 의한 IgμU-/+ 태아의 확인을 나타내는 사진이다. N은 음성 대조군(제1 KO 벡터 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이고 P는 양성 대조군(puroF2-puroR2 영역을 커버하는 플라스미드 DNA의 ㎕ 당 약 104 카피 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이다. 세포주 #2184-1, #2184-2 및 #3287은 IgμU-/+이였다.
도 2C는 puroF2 x puroR2 프라이머를 사용한 게놈 PCR에 의한 IgμU-/+ 송아지의 유전형을 나타낸 사진이다. N은 음성 대조군(제1 KO 벡터 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이고 P는 양성 대조군(puroF2-puroR2 영역을 커버하는 플라스미드 DNA의 ㎕ 당 약 104 카피 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이다. 태어난 IgμU-/+ 송아지 13마리 중에서 (도 2C에서 또한 보여짐), 5마리가 제1 표적화 사건에 양성임이 유전자형 분석결과 확인되었다.
도 3A는 IgμU-/+ #3287 대립 유전자의 구조, 제2 대립 유전자를 표적화하는데 사용된 neo 벡터, 및 표적화 사건에 대한 게놈 PCR 분석을 나타내는 모식도이다. 프라이머 쌍인 neoF3 x neoR3을 대립 유전자 A에서의 neo 표적화 사건을 확인하기 위해 사용하였다. BCμf x BCμr은 야생형 대립 유전자의 부재를 확인하기 위해 사용된 프라이머 쌍이다. STOP 카세트의 존재로 인해, 프라이머는 표적화된 대립 유전자로부터 서열을 증폭시키지 못했을 것이다.
도 3B는 puroF2 x puroR2, neoF3 x neoR3, 및 BCμf x BCμr 프라이머를 사용한 게놈 PCR에 의한 IgμU-/- 태아 및 섬유모세포의 확인을 나타내는 일련의 사진이다. "P"는 양성 대조군(puroF2-puroR2 또는 neoF3-neoR3 영역을 커버하는 플라스미드 DNA ㎕ 당 104 카피 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이다. "N"은 음성 대조군(제1 KO 또는 제2 KO 벡터 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이며, #6939는 섬유모세포 원 세포주이다. 세포주 #4658, #3655, #5109, #5139 및 #4554는 대립 유전자 A (neo-표적화) 및 B (puro-표적화) 모두에서의 표적화 사건에 대해 양성이였으나, 야생형 대립 유전자에 대해서는 음성이였다.
도 3C는 90일 태아의 비장으로부터 추출된 mRNA에서의 IgμU 발현의 RT-PCR 분석을 보여주는 사진이다. 양성 대조군 "P"(상업적으로 입수가능한 폴리A+ 소 비장 RNA) 및 야생형 (#6939) 태아 (#1, #2)로부터는 확실한 발현이 탐지되었으나, IgμU-/- 태아로부터는 탐지되지 않았다.
도 3D는 puroF2 x puroR2, neoF3 x neoR3 및 BCμf x BCμr 프라이머를 사용한 게놈 PCR에 의한 IgμU-/- 송아지의 유전형을 보여주는 일련의 사진이다. N은 음성 대조군(제1 KO 또는 제2 KO 벡터 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이고 P는 양성 대조군(puroF2-puroR2 또는 neoF3-neoR3 영역을 커버하는 플라스미드 DNA ㎕ 당 약 104 카피 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이다. 태어난 두 마리의 IgμU-/- 송아지 (이들 중 하나는 도 3D에 나타남)의 유전자형을 분석하였고, IgμU 유전자의 대립 유전자 B 및 A 모두에서의 표적화 사건에 대해 양성이였으나, 야생형 대립 유전자에 대해서는 음성이였다.
도 4A는 IgμU-/- #4658 대립 유전자의 구조 및 선별 마커 유전자의 Cre-loxP 매개화된 제거에 대한 게놈 PCR 분석을 나타내는 모식도이다. 프라이머 쌍인 CreExF x CreExR에 의한 증폭은 puro 표적화 대립 유전자로부터 2.5 kb 단편, neo 표적화 대립 유전자로부터 4.3 kb, 또는 모든 선별 마커 유전자가 절제된 경우에는 짧은 0.4 kb 단편을 생성한다.
도 4B는 CreExF x CreExR 프라이머를 사용한 게놈 PCR에 의한 Cre/IgμU-/- 태아 및 섬유모세포의 확인을 보여주는 사진이다. #4658 세포주에서, Cre의 도입 전에, 2.5 kb (puro) 및 4.3 kb (neo) PCR 결과물을 탐지하였다. 5개의 Cre/IgμU-/- 태아 및 세포주에 있어서, 이들의 밴드는 완전히 사라졌고, 대신 0.4 kb (puro 및 neo 없음) 밴드가 탐지되었다.
도 5A는 Cre/IgμU-/- #1404 세포주에서의 PrP 유전자 좌위의 구조, PrP 유전자의 표적화 벡터, 및 표적화 사건에 대한 게놈 PCR 분석을 나타내는 모식도이다. 벡터는 5' 동종 팔 (1.2 kb), 3' 동종 팔 (8.3 kb), STOP 카세트, DT-A 유전자 및 플록스된 neo 유전자를 포함한다. 벡터는 PrP 유전자 좌위의 엑손 3에 위치하는 시작 ATG 코돈 바로 뒤에 넉아웃 카세트를 삽입하도록 설계하였다. 단일 염기 쌍 다형성은 나타낸 바와 같이 대립 유전자 C 및 대립 유전자 D 사이에서 발견되었다. 프라이머 쌍인, neoF7 x neoR7은 neo 표적화 사건을 보여주기 위해 고안되었고 다형 염기를 포함하도록 설계하였다. PCR 및 서열분석 결과물은 벡터가 대립 유전자 C 내로 통합되었음을 보여주었다.
도 5B는 양성 PrP 프라이머 쌍인 neoF7 x neoR7, 및 음성 IgμU 프라이머 쌍인 BCμf x BCμr을 사용한 게놈 PCR에 의한 삼중 표적화된 태아 및 섬유모세포 세포주 (IgμU-/-/PrP-/+)의 확인을 보여주는 일련의 사진이다. P는 양성 대조군(neoF7-neoR7 영역을 커버하는 플라스미드 DNA ㎕ 당 약 104 카피 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이고 #1404는 음성 대조군이다. 태아 #8103, 1661, 8375, 8112 및 8443로부터 유도된 세포주는 PrP 표적화에 대해서 양성이었고 야생형 IgμU 대립 유전자에 대해서는 음성이었는데, 이는 이들이 삼중 표적화된 세포주 (IgμU-/-/PrP-/+)임을 증명하는 것이다.
도 6A는 IgμU-/-/ PrP-/+ #8443 대립 유전자의 구조, 제2 대립 유전자를 표적화 하기 위해 사용되는 puro 벡터 및 표적화 사건에 대한 게놈 PCR 분석을 보여주는 모식도이다. 프라이머 쌍인 puroFl4 x puroRl4는 대립 유전자 D에서의 puro 표적화 사건을 확인하기 위해 사용되었다. BPrPex3F x BPrPex3R은 야생형 대립 유전 자의 부재를 확인하기 위해 사용된 프라이머 쌍이다. 동형접합 삽입에 의해 야기된 PrP 유전자의 양쪽 대립 유전자 상에서의 BPrPex3F 프라이머의 어닐링 부위의 파괴로 인해, 프라이머는 표적화된 대립 유전자로부터 서열을 증폭시키지 못하였을 것이다.
도 6B는 puroF14 x puroR14, neoF7 x neoR7 및 BPrPex3F x BPrPex3R 프라이머를 사용한 게놈 PCR에 의한 이중 동형접합 KO (IgμU-/-/PrP-/-) 태아 및 섬유모세포의 확인을 보여주는 일련의 사진이다. "P"는 양성 대조군(puroF14-puroR14 또는 neoF7-neoR7 영역을 커버하는 플라스미드 DNA ㎕ 당 약 104 카피 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이다. "N"은 음성 대조군(제3 KO 또는 제4 KO 벡터 및 #6939 게놈 DNA의 혼합물)이고, IgμU-/- 태아 세포주 (#4658) 및 IgμU-/-/PrP-/+ 세포주 (#8443)를표시하였다. 세포주 #8454, 8400 및 6397는 이중 동형접합 KO (IgμU-/-/PrP-/-) 태아의 세 개의 세포주이다. 이들은 PrP 유전자의 대립 유전자 C (neo-표적화) 및 D (puro-표적화)에서의 제3 및 제4 표적화 사건에 대해 양성이였으나 야생형 대립 유전자에 대해서는 음성이였다.
도 6C는 이중 동형접합 KO (IgμU-/-/PrP-/-) 태아에서의 RT-PCR 분석을 보여주는 사진이다. 탐지를 위해 PrP mRNA, PrPmF3 x PrPmR3 프라이머를 사용하였다. #4658 (IgμU-/-) 및 #8443 (IgμU-/-/PrP-/+) 태아로부터는 확실한 발현이 관찰되었으 나, 이중 동형접합 KO (IgμU-/-/PrP-/-) 태아로부터는 어떠한 발현도 관찰되지 않았다.
도 7은 진뱅크 수탁 번호: U63637의 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 8은 보스 타우루스 IgμU (진뱅크 수탁 번호: U636372.2)의 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 9는 보스 타우루스 IgμAY (진뱅크 수탁 번호: AY221099)의 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 10은 IgμAY가 IgμU-/- 세포 내에서 PCR에 의해 탐지될 수 있음을 보여주는 모식도이다.
도 11은 IgμAY 및 IgμU 모두 VDJ 재배열이 일어나고, 발현됨을 나타내는 서열 분석도이다.
도 12는 IgμAY의 게놈 구성을 보여주는 모식도이다.
도 13은 IgμAY의 AY 및 ay 대립 유전자의 서열을 보여준다.
도 14는 AY KO 벡터 및 ay KO 벡터를 보여주는 모식도이다.
도 15는 동시에 태어난 PrP+/+, PrP-/+(341), PrP-/- (342) 송아지를 나타낸다.
도 16A 내지 16D는 PrP-/- IgμU-/- 송아지 342의 유전자형 분석을 나타낸다. 도 16A는 PrP-/- IgμU-/- 송아지 342의 귀 생검으로부터 형성된 섬유모세포 세포주를 보여준다. 도 16B는 게놈 PCR에 의한 귀 생검 섬유모세포에서의 PrP-/- IgμU-/- 유전형의 검정을 보여준다. P, 양성 대조군; N, 음성 대조군. 나타낸 바와 같이, puroF14 x puroRl4 및 neoF7 x neoR7 프라이머를 사용하여, 송아지 342는 PrP 유전자의 양쪽 대립 유전자에서 표적화 마커에 대해 PCR-양성임을 보였다. 도 16C는 PrP-/- IgμU-/- 송아지에서 PrP 야생형-유래 대립 유전자의 부재를 보여준다. 송아지 342는 BPrPex3F x BPrPex3R 프라이머를 사용시 PrP 유전자의 야생형 대립 유전자에 대해 PCR-음성이였다. 도 16D는 BCμf x BCμr 프라이머를 사용시 PrP-/- IgμU-/- 송아지에서의 IgμU 야생형-유래 대립 유전자의 추가적 부재를 보여준다.
도 17A 내지 17B는 PrP-/- IgμU-/- 송아지 342에서의 PrP 유전자의 기능적 비활성을 나타낸다. 도 17A는 PrP-/- IgμU-/- 송아지 342로부터 온 섬유모세포에서의 mRNA 발현의 파괴를 보여준다. PrP-/- IgμU-/- 송아지 342 상에서 RT-PCR 분석을 수행하였다. PrP mRNA를 탐지하기 위하여, PrPmF3 x PrPmR3 프라이머를 사용하였다. PrP+/+ IgμU-/- 및 PrP-/+ IgμU-/- (송아지 341) 송아지에서는 확실한 발현이 탐지되었으나, PrP-/- IgμU-/- 송아지 342에서는 어떠한 발현도 탐지되지 않았다. 내부 양성 대조군으로서, 소 β-액틴 mRNA 발현 또한 프라이머 쌍 bBAF x bBAR를 사용하여 평가되었다. 도 17B는 PrP-/- IgμU-/- 송아지 342의 섬유모세포 내의 PrP 단 백질의 부재를 보여준다. PrP-/- Igμ-/- 송아지 342 상에서 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 양성 대조군로서, PrP+/+ IgμU-/- 송아지를 분석하였다. 음성 대조군로서, 이 분석에 이용된 모노클로날 항체가 소 PrP 단백질에 대해 특이적인 것이 알려졌기 때문에 마우스 섬유모세포로부터 온 단백질 추출물을 사용하였다. 33-35 kDa 단백질 밴드(소 PrP의 크기)의 존재는 PrP+/+ IgμU-/- 및 PrP-/+ IgμU-/+ 송아지로부터 온 단백질 추출물 내에서 탐지되었으나, PrP-/- IgμU-/- 송아지 342로부터 온 단백질 추출물 내에서는 어떠한 양성 밴드도 탐지되지 않았다. 동일한 블롯을 내부 양성 대조군로서 항-CDC2 모노클로날 항체로 염색하였다.
도 18은 PrP-/- 송아지의 뇌간에서의 PrP-/-의 부재를 보여준다. PrP-/- 송아지 354 및 282의 뇌간 상의 웨스턴 블롯팅 분석을 본원에 기술된 바와 같이 수행하였다. PrP-/- 송아지에서는 PrP 단백질의 어떠한 밴드로 탐지되지 않았다.
도 19는 상이한 PrP-/- 섬유모세포 세포주로부터 클로닝한 예시적 PrP-/- 송아지 352의 말초 혈액 림프구 (PBL) 내에서의 PrP 단백질의 부재를 보여준다. PrP-/- 송아지 352로부터 온 PBL의 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 33-35 kDa 소 PrP 단백질에 대한 어떠한 양성 밴드도 탐지되지 않았다.
일반적으로, 본 발명은 유전적으로 변형된 비인간 포유동물 (예를 들어, 소 및 기타 유제류), 및 이들 포유동물의 제조방법을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 감소된 수준의 내생 IgM 중쇄 및(또는) 프리온 단백질을 가지는 트랜스제닉 유제류를 특징으로 한다. 본 발명을 하기에 상세하게 기재한다.
다형질성
또는
다유전자성
돌연변이를 가지는 비인간 포유동물 및 세포의 제조 방법
본 발명은 비인간 포유동물, 예컨대 가축 (예를 들어, 소)에서 전사적 침묵 및 전사적 활성 유전자를 순차적으로 표적화하기 위한 신속한 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명자들은 침묵 유전자인 소 면역글로불린 μU (IgμU) 유전자의 두 대립 유전자 모두를 넉아웃시켜 이형접합 및 동형접합 넉아웃 송아지를 만드는데 처음으로 사용한, 순차적 유전자 표적화 시스템을 발견하였다. IgμU 표적화 후, 섬유모세포에서 전사적으로 활성인 유전자인 소 프리온 단백질 (PrP) 유전자의 두 대립 형질 모두를 IgμU-/- 세포주에서 순차적으로 넉아웃 표적화하여 이중 동형접합 넉아웃 태아를 제조하였다. 본 발명의 방법을 사용하여 체세포에서 유전자 표적화를 순차적으로 실시하여 다형질성 또는 다유전자성 비인간 포유동물을 제조할 수 있다. 본 발명은 또한 그 내용이 본원에 포함되는 미국 특허 공개 공보 제2003-0046722호에 기재된, 각 표적화 라운드 후에 세포주를 회복하기 위한 클로닝 방법을 사용하였다.
대상 유전자의 파괴는 먼저 반접합 유전자 넉아웃 세포의 제조와 배아 클로닝에 의한 태아 제조를 포함한다. 그후 임신 기간 중 임의의 시점에, 생성된 태아로부터 유전자적으로 표적화된 세포를 수득한다. 소에서, 이러한 세포 수득은 바람직하게는 임신 25 내지 90일째, 임신 35 내지 60일째, 임신 35 내지 50일째, 바람직하게는 임신 35 내지 45일째, 더욱 바람직하게는 임신 38 내지 43일째, 가장 바람직하게는 임신 약 40일째에 실시한다. 그런 다음, 동일 유전자 좌위의 제2 대립 유전자, 또는 별법으로는 상이한 내생 유전자의 대립 유전자를 수득한 세포에서 표적화한다. 그후 이러한 세포에서 태아를 얻고, 여기서 섬유모세포와 같은 체세포를 단리하여 추가의 클로닝 라운드에 사용할 수 있다. 그런 다음 원하는 다형질성 또는 다유전자성 돌연변이를 가지는 세포가 생성될 때까지 상기 단계를 반복할 수 있다. 필요한 경우, 이들 세포를 비인간 포유동물, 예컨대 유제류를 제조하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여, 본 발명자들은 각 표적화 실험에 형질감염에서 재생성된 세포주의 확립까지 약 2.5 개월이 걸리므로, 송아지에서 단일의 동형접합 유전적 변형은 14개월 (두 대립 유전자에 대한 표적화에 5개월 및 임신에 9개월 포함), 이중 동형접합 변형은 19개월이 걸린다는 것을 보인 바 있다. 반면, 이형접합된 소를 교배하여 동형접합 송아지를 제조하는데에는 약 5년이 소요될 것이므로, 두 마리의 이형접합된 소로부터 이중 동형접합 송아지를 제조하는 것은 비실용적이다. 본 명세서에 기재한 순차적 표적화 전략을 사용하면, 대형 동물 종에서의 복합적 유전적 변형이 용이할 뿐만 아니라, 많은 응용 분야에 사용하기에 직접적이며 유용하다.
유전적 변형된 대형 동물은 많은 경우에, 쥐보다 인간 질병의 연구, 예컨대 문헌[Harris (1997) Hum. Mol. Genet. 6:2191-2194]에서의 인간 낭성섬유증의 연구에 대한 더욱 적합한 모델이다.
동형접합 넉아웃 표적화는 예를 들어, 유전적 변형된 소에서 인간 폴리클로날 항체를 제조하려는 경우, 소 항체의 제거에 유용할 수 있다 (Kuroiwa (2002) Nature Biotechnol. 20:889-894). 또한, IgμU 유전자의 불활성화는 예를 들어 인간 또는 쥐와 실질적으로 상이하다고 알려진 소 면역학, 예를 들어, B-세포 분화 기작을 연구하는데 유용할 수 있다 (Butler (1997) Rev. Sci. Tech. 17: 43-70). α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 (Phelps et al. (2003) Science 299:411- 414) 및 주요 조직접합성 복합체 (MHC) 유전자와 같은 다른 유전자 등에 다수의 넉아웃을 가지는 돼지는 이종이식을 위한 기관 및 조직의 더욱 적합한 공급원일 수 있다. 농업에서는, 동형접합 넉아웃 표적화는 예컨대 소 프리온 유전자의 불활성화 및 "광우병" 위협의 제거와 같이 동물의 안전성 및 질병 저항성을 개선하는 데 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 생물의학적 및 농업적 적용 및 생식 세포 전이를 필요로 하지 않고, 유전자 기능 분석을 위한 동물에서의 복합 유전적 변형에 유용하다.
감소된
IgM
중쇄
단백질을 가지는
트랜스제닉
유제류
소 IgM 중쇄를 코딩하는 유전자가 2개 있음을 알아내었다. 소 Ig M을 코딩하는 것으로 주장된 제1 공개 서열을 도 7에 나타내었다. 이 서열은 1996년 해머스트롬(Hammarstrom) 및 그의 동료들에 의하여 진뱅크 수탁 번호: U63637 (gi:1575489)로 처음 공개된 후, 문헌[Immunology (93: 581-588,1998)]에 게재되었다. U63637은 2003년 2월 27일 제2 서열 (진뱅크 수탁 번호: U63637.2; gi: 2859209; 도 8)로 대체되었다. 이후, 해머스트롬 및 그의 동료들은 보스 타우루스 중쇄 불변 영역을 코딩하는 제3 서열 (진뱅크 수탁 번호: AY221099; gi:33413901; 도 9)을 제출하였다. 제3 서열의 제출을 수반한 논문(Zhao et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 35024-35032)에서, 저자들은 제2 및 제3 서열 (제1 서열은 철회됨) 간의 상이점은 다형성에 기인한 것이라고 결론내렸다.
본 발명자들은 IgμU 및 IgμAY로 지칭하는 두 개의 Ig 유전자를 가지고 발현하는 소를 예증하려고 한다. 두 유전자 모두 발현되기 때문에, IgM 중쇄 단백질을 가지지 않는 소를 제조하기 위해서는 두 유전자 모두를 돌연변이시켜야 한다.
다른 유제류에서는 1종의 IgM-코딩 유전자만이 확인되었으나, 본 발명에서 소에 2개의 Ig 유전자를 발견한 것에 비추어, 추가의 유전자가 존재할 가능성이 높다. 이들 추가의 유전자는 표준 기법, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 기법을 사용하여 확인할 수 있다.
다른 유제류의 면역글로불린 유전자를 교체하기 위하여, 표적화 벡터는 3개의 주요 영역을 가지도록 설계하였다. 제1 영역은 표적화할 유전자 좌위와 상동성이다. 제2 영역은 표적화된 유전자 좌위의 일부를 특이적으로 대체하는 약물 선별 마커이다. 제3 영역은 제1 영역과 마찬가지로 표적좌에 상동성이지만, 야생형 게놈에서 제1 영역과 인접하지 않는다. 표적화 벡터와 원하는 야생형 유전자 좌위 간의 상동 재조합에 의해, 표적화 벡터의 두 상동 영역 사이에 해당하는 유전자 좌위 서열이 결실되고, 상기 서열을 약물 내성 마커가 대체한다. 바람직한 실시태양에서, 두 상동 영역의 총 크기는 약 6 킬로염기이고, 표적화된 유전자 좌위 부분을 대체하는 제2 영역의 크기는 약 2 킬로염기이다. 이러한 표적화 전략은 원핵 세포에서 인간 세포에 이르기까지 넓은 범위의 종에 두루 유용하다. 사용되는 각 벡터는 유전자 표적화 과정을 위해 선택된 유전자 좌위 및 상기 전략에 사용되는 서열에 따라 다르다. 이 접근법은 염소(Caprahircus), 양(Ovis aries) 및 돼지(Susscrofa)를 포함하나 이에 한정되지 않는 모든 유제류 및 가축(Bos taurus and Bos indicus)에 사용할 수 있다.
유제류 세포 내의 특정 유전자의 표적화를 위하여 유제류에서 전기천공법도 널리 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재한 일반적 방법은 다른 유제류 게놈 내에 표적화된 돌연변이를 도입하는데 적용할 수 있다. 전기천공 조건 (전압 및 저항)을 조절하여 다른 유제류로부터 수득되는 형질감염체의 수를 최적화할 수 있다.
또한, 가축에서 중쇄 유전자 좌위를 표적화하기 위하여 본 명세서에서 사용한 전략 (즉, 모든 코딩 엑손 및 중간 서열을, 제거할 엑손의 바로 옆을 플랭킹하는 영역에 상동성인 영역을 포함하는 벡터를 사용하여 제거함)은 다른 유제류에서도 동등하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 양 (Ovis aries)의 한 면역글로불린 중쇄 유전자 좌위에 전체적인 서열 분석을 실시하였는데, 양 유전자 좌위는 구조 및 서열이 소 유전자 좌위와 매우 유사하다 (진뱅크 수탁 번호: Z71572, Z49180 내지 Z49188, M60441, M60440, AF172659 내지 AF172703). 재배열된 양 면역글로불린 사슬에 대해 보고된 다수의 cDNA 서열 뿐만 아니라, 중쇄 5' 인핸서 (진뱅크 수탁 번호: Z98207), 3' mu 스위치 영역 (진뱅크 수탁 번호: Z98680) 및 5' mu 스위치 영역 (진뱅크 수탁 번호: Z98681)를 포함하는 게놈 서열 정보도 중쇄 유전자 좌위에 대하여 보고되었다. 양의 분비형 중쇄에 대한 완전한 mRNA 서열도 진뱅크 수탁 번호: X59994로서 기탁되었다. 이는 상응하는 소 서열과 매우 유사성이 높은 4개의 코딩 엑손의 전서열을 포함한다.
따라서, 본 발명은 내생 IgM 발현이 2개 이상의 Igμ 유전자의 돌연변이에 의해 감소되거나 제거된 트랜스제닉 유제류, 바람직하게는 트랜스제닉 소의 제조에 관한 것이다. 임의로는, 다른 종, 바람직하게는 인간의 기능적 항체를 제조하기에 충분한 유전자를 포함하는 핵산 (예를 들어, 인공 염색체)을 안정적으로 도입하였다.
감소된
프리온
단백질을 가지는
트랜스제닉
유제류
본 명세서에서, 본 출원인들은 순차적 유전자 표적화를 통해 건강한 PrP 결핍 송아지를 성공적으로 제조하였다. 이러한 동물은 인간 치료를 위한 인간 재조합 단백질 제조를 위한 개선된 공급원, 인간 이종이식을 위한 의학적 재료, 및 물, 젤라틴, 콜라겐 및 혈청을 포함하는 BSE-없는 소-유래 농업적 및 생물의학적 물질의 제조를 위한 개선된 동물을 제공한다. 본 발명의 소 또는 소 태아는 이러한 동물로부터 농업적으로 일반적으로 생산되는 임의의 산물을 제조하는데 사용할 수 있다. 이들은 예를 들어, 그 내용이 본원에 포함되는 미국 특허 공개 공보 제2003-0037347호, 제2004-0068760호 및 제2003-0056237호, 또는 PCT 공개 공보 제W02004/044156호에 기재된 임의의 방법에 의해, 인간 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 재조합 단백질을 제조하는데 사용될 수도 있다.
비인간 포유류 세포
상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 방법은 비인간 포유류 체세포, 예컨대 유제류 체세포에 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 적합한 체세포로는 배아, 태아, 송아지 또는 성체 동물 세포를 포함한다. 유전자 표적화를 위한 바람직한 세포는 섬유모세포, 상피세포, 신경세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, B-림프구, T-림프구, 적혈구, 대식세포, 단핵구, 태반 및 근육세포와 같은 분화된 세포를 포함한다. 바람직한 세포는 또한 임의의 기관, 예컨대 방광, 뇌, 식도, 난관, 심장, 장, 쓸개, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 수뇨관, 요도 및 자궁 세포를 포함한다. 바람직하게는 공여체 세포, 공여체 핵, 공여체 염색질체 또는 재구성된 난자는 4배수체가 아니다.
세포는 유제류, 토끼, 마우스, 래트 또는 영장류를 포함하는 임의의 비인간 포유동물로부터 유래될 수 있다. 유제류로는 페리소다크틸라(Perissodactyla) 및 아르티오다크틸라(Artiodactyla) 목의 구성원, 예컨대 보스(Bos) 속의 임의의 구성원을 포함한다. 다른 바람직한 유제류로는 양, 큰뿔양, 염소, 들소, 영양, 황소, 말, 당나귀, 노새, 엘크, 삼림순록, 물소, 낙타, 라마, 알파카, 돼지 및 코끼리를 포함한다. 가장 바람직하게는, 비인간 포유동물은 소 (예를 들어, 보스 타우루스 또는 보스 인디쿠스)이다.
유전적으로 표적화할 세포가 배아 또는 태아로부터 유래된 것일 경우, 세포는 유전자 변형된 비인간 포유동물이 태어나기 전까지 임신 기간 중 임의의 시점에 단리될 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 소 세포는 바람직하게는 임신 25 내지 90일째, 임신 35 내지 60일째, 임신 35 내지 50일째, 바람직하게는 임신 35 내지 45일째, 더욱 바람직하게는 임신 38 내지 43일째, 가장 바람직하게는 임신 약 40일째에 분리한다. 양 세포는 바람직하게는 임신 25 내지 150일째, 임신 30 내지 100일째, 임신 35 내지 80일째, 더욱 바람직하게는 임신 35 내지 60일째, 가장 바람직하게는 임신 약 40일째에 분리한다. 말 세포는 바람직하게는 임신 25 내지 300일째, 임신 30 내지 100일째, 임신 35 내지 80일째, 더욱 바람직하게는 임신 35 내지 60일째, 가장 바람직하게는 임신 약 40일째에 분리한다. 돼지 세포는 바람직하게는 임신 25 내지 110일째, 임신 30 내지 90일째, 임신 30 내지 70일째, 더욱 바람직하게는 임신 30 내지 50일째, 가장 바람직하게는 임신 약 35일째에 분리한다. 염소 세포는 바람직하게는 임신 25 내지 150일째, 임신 30 내지 100일째, 임신 35 내지 80일째, 더욱 바람직하게는 임신 35 내지 60일째, 가장 바람직하게는 임신 약 40일째에 분리한다. 영장류 세포는 바람직하게는 임신 25 내지 150일째, 임신 30 내지 100일째, 임신 35 내지 80일째, 더욱 바람직하게는 임신 35 내지 60일째, 가장 바람직하게는 임신 약 40일째에 분리한다. 설치류 세포는 바람직하게는 임신 6 내지 18일째, 임신 8 내지 16일째, 임신 10 내지 16일째, 더욱 바람직하게는 임신 12 내지 16일째, 가장 바람직하게는 임신 약 14일째에 분리한다.
수여체 세포는 바람직하게는 핵이 제거되거나 제거되지 않을 수 있는 난자, 수정된 접합체 또는 2세포 배아이다. 전형적으로, 공여체 및 수여체 세포는 동일한 종으로부터 유래한다. 그러나, 상이한 종으로부터의 공여체 및 수여체 세포를 사용하여 재구성된 배아로부터 성공적으로 발생이 일어났다는 보고가 있다.
유전자
표적화
일반적으로, 본 발명의 유전적 표적화는 유전자의 불활성화, 제거 또는 변형; 유전자의 상향조절; 유전자 교체; 또는 특정 유전자 좌위에서 트랜스진 교체를 포함할 수 있다. 불활성화, 제거 또는 변형이 일어나도록 표적화될 수 있는 유전자의 예로는 인간에 대하여 이종반응성인 항체를 코딩하는 유전자 (예를 들어, α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제); 항체-코딩 유전자; 비인간 동물에서 프리온 단백질 및 그의 상응하는 정상체를 생산하는 PrP 좌의 유전자; 인간에서 유전병의 원인이 되고, 동물에서 변형, 불활성화 또는 결실된 형태가 상기 질병의 모델을 제공하는 유전자 (예를 들어, 낭성섬유증 막투과 전도성 조절자 유전자); 식품 내성 또는 알레르기를 유발하는 물질을 코딩하는 유전자; 당단백질 상에 특정 탄수화물 잔기가 존재하도록 하는 유전자 (예를 들어, 비인간 동물의 사이티딘 모노포스포-N-아세틸 뉴라민산 히드록실라제 유전자); 및 면역글로불린 유전자의 체세포적 재배열을 일으키는 유전자, 예컨대 RAG1 및 RAG2이다.
상향 조절을 위해 표적화할 수 있는 유전자 중에는 보완제-매개 용해를 억제하는 유전자 (예를 들어, 돼지 CD59, DAF 및 MCP)가 있다. 또한, 하기에 추가로 설명하는 바와 같이, 유전자의 교체도 행할 수 있다. 교체할 수 있는 유전자로는 혈액 구성성분을 생산하는 유전자 (예를 들어, 혈청 알부민), 식품 내성 또는 알레르기를 유발하는 요소를 코딩하는 유전자, 면역글로불린 유전자 및 표면 항체를 코딩하는 유전자가 있다.
본 발명의 방법을 사용하면, 표적화 사건을 포함하는 영장류 세포 클론의 확인, 단리, 분석 및 배양에 필요한 시간이 현격하게 최소화된다. 배양 시간의 감소는 핵 공여체로 사용되는 세포가 살아있고 정상이며 정배수체일 확률을 높이므로, 이것이 본 발명의 중요한 일면이다.
표적화
제작물
표적화된 유전자 돌연변이는 대상 유전자의 표적화할 대립 유전자에 상동성인 영역을 가지는 핵산 제작물을 생성하여, 이 제작물을 게놈상의 대립 유전자에 삽입시켜 그 발현을 파괴하여야 한다. 따라서, 유전자를 변형하기 위하여, 표적화 벡터는 3개의 주요 영역을 가지도록 설계한다. 제1 영역은 표적화할 유전자 좌위와 상동성이다. 제2 영역은 표적화된 유전자 좌위의 일부를 특이적으로 대체하는 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 항생제 내성 단백질과 같은 선별 마커를 코딩하는 서열)이다. 제3 영역은 제1 영역과 마찬가지로 표적좌에 상동성이지만, 야생형 게놈에서 제1 영역과 인접하지 않는다. 표적화 벡터와 원하는 야생형 유전자 좌위 간의 상동 재조합에 의해, 표적화 벡터의 두 상동 영역 사이에 해당하는 유전자 좌위 서열이 결실되고, 상기 서열이 예를 들어, 약물 내성 마커로 대체된다. 사용되는 각 벡터는 유전자 표적화 과정을 위해 선택된 유전자 좌위 및 상기 전략에 사용되는 서열에 따라 다르다. 이 접근법은 염소(Caprahircus), 양(Ovis aries), 돼지(Susscrofa) 및 가축(Bos taurus and Bos indicus)과 같은 유제류를 포함하는 모든 포유류에 사용할 수 있다. 이러한 표적화 돌연변이를 실시하기 위한 벡터의 예로는 본 명세서에 기재된 바와 같은 것이다. 다른 표적화 위치에서 상동 재조합을 일으키는 벡터를 제작하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 적합한 벡터의 제작은 당업계의 기술 범위 내이다.
상동 재조합을 돕기 위하여, 각각 상동 재조합 및 대상 유전자의 불활성화를 일으키기 위해 사용하는 벡터는 표적화할 유전자에 실질적인 서열 동일성을 나타내는 DNA 일부를 포함한다. 바람직하게는 이들 서열은 상동 재조합을 돕기 위하여 표적화된 유전자 좌위와 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성, 심지어는 100%의 서열 동일성을 가진다. 바람직한 실시태양에서, 두 영역의 상동 영역의 총 크기는 약 9 내지 9.5 킬로염기이고, 표적화된 유전자 좌위의 일부를 대체하기 위한 제2 영역의 크기는 약 2 킬로염기이다.
전형적으로, 제작물은 원하는 상동 재조합체, 예를 들어, 대상 유전자가 상동 재조합에 의해 파괴된 세포를 선별할 수 있게 하는 마커 유전자를 포함한다. 마커 유전자로는 항생제 내성 마커, 약물 내성 마커 및 녹색 형광 단백질 등을 포함한다. 네오마이신 내성 제작물의 일례는 다음과 같이 조립된다. "pSTneoB"로 명명한 제작물 (Katoh et al. (1987) Cell Struct. Funct. 12: 575; Japanese Collection of Research Biologicals (JCRB) deposit number: VE039)은 코딩 영역 상류에 SV40 프로모터 및 TK 인핸서에 의해 조절되는 네오마이신 내성 유전자를 포함하도록 설계되었다. 코딩 영역의 하류에는 SV40 종결 서열이 있다. neo 카세트를 XhoI 단편으로서 "pSTneoB"로부터 잘라냈다. 단편의 말단을 표준 분자생물학적 기법으로 평활(blunt) 말단으로 전환한 뒤, 평활 말단 단편을 벡터인 pBS246 (Gibco/Life Technologies)의 EcoRV 부위에 클로닝하였다. 이 부위는 loxP 절단 부위로 플랭킹된다. "pLoxP-STNeoR"로 명명한 새 제작물을 사용하여 mu 넉아웃 DNA 제작물을 생성하였다. 이 제작물의 원하는 단편은, pBS246 클로닝 벡터에 원래 존재하는 loxP 부위 및 NotI 부위로 플랭킹된다. loxP-neo-loxP를 포함하는 원하는 NotI 단편을 사용하여 면역글로불린 mu 불변 영역 엑손을 대체하였다. 네오마이신 내성 유전자에 작동가능하게 연결된 SV40 프로모터는 네오마이신 내성 유전자의 전사를 활성화하여, 세포가 이들로 인한 항성제 내성을 기초로 원하는 NotI 단편이 선별할 mu 불변 영역 엑손을 대체하도록 한다.
본 명세서에 사용된 가축에서 유전자를 표적화하기 위해 사용한 전략 (즉, 제거된 엑손의 바로 옆을 플랭킹하는 영역에 상동성인 영역을 포함하는 벡터를 사용하여 코딩 영역과 사이에 낀 서열의 일부를 제거하는 것)은 다른 포유동물에서도 사용될 수 있다. 예를 들어, 양(Ovis aries)의 한 면역글로불린 중쇄 유전자 좌위 상에 전체적인 서열 분석을 실시하였는데, 양 유전자 좌위는 구조 및 서열 양자 모두 소 유전자 좌위와 유사성이 높다 (진뱅크 수탁 번호: Z71572, Z49180 내지 Z49188, M60441, M60440, AF172659 내지 AF172703). 재배열된 양(Ovis aries) 면역글로불린 사슬에 대해 보고된 다수의 cDNA 서열 뿐만 아니라, 중쇄 5' 인핸서 (진뱅크 수탁 번호: Z98207), 3' mu 스위치 영역 (진뱅크 수탁 번호: Z98680) 및 5' mu 스위치 영역 (진뱅크 수탁 번호: Z98681)을 포함하는 게놈 서열 정보도 중쇄 유전자 좌위에 대하여 보고되었다. 양의 분비형 중쇄에 대한 완전한 mRNA 서열도 진뱅크 수탁 번호: X59994로서 기탁되었다. 이는 상응하는 소 서열과 매우 유사성이 높은 4개의 코딩 엑손의 전서열을 포함한다. 따라서, 진뱅크 서열은 PCR 프라이머 설계를 위하여 소 IgμU 서열과 상동성이 높은 구간을 정하는데 사용될 수 있다. 소 세포를 표적화하는데 비-동종 DNA가 사용되기 때문에, 양 서열로 상동성이 높은 구간을 찾는 것이 소의 종 간에 유사한 서열 전환이 일어날 수 있다는 것을 알리는 지표로 사용된다. 소 및 양 면역글로불린 유전자 좌위의 서열 및 구조의 유사성으로 미루어 보아, 본 명세서에서 사용하는 소 면역글로불린 유전자 좌위를 제거하기 위한 표적화 전략은 양 계에도 적용할 수 있을 것이다. 또한, 돼지(Sus scrofa; 진뱅크 수탁 번호: S42881) 및 염소(Capra hircus; 진뱅크 수탁 번호: AF140603)에 대하여 존재하는 정보는 이 두 종의 면역 글로불린 유전자 좌위 또한 충분히 유사하여, 본 표적화 전략을 사용할 수 있다는 것을 나타낸다.
세포 표적화의 한 방법에서, 표적화 제작물은 폴리아데닐화 신호 서열, 및 마커 유전자의 발현을 촉진하기 위한 조절된 발현을 포함한다. 이러한 제작물은 돌연변이화된 유전자의 발현과 상관없이 삽입된 서열을 탐지하여, 침묵 유전자 (즉, 섬유모세포에서 발현되지 않는 유전자) 내의 재조합체를 확인할 수 있도록 한다. 마커 유전자가 무작위 삽입이 아니라 상동 재조합에 의하여 게놈에 삽입되었는지를 결정하기 위하여, 서던 블롯팅, PCR 또는 DNA 서열분석과 같은 표준 분자생물학 기법을 사용할 수 있다.
표적화된
세포의 선별
유전적으로 표적화된 세포는 전형적으로 선별 마커를 이용하여 확인한다. 그러나, 세포가 이미 선별 마커를 포함하는 경우에는, 상이한 선별 마커를 포함하는 새로운 표적화 제작물이 요구된다. 다른 방법으로, 동일한 선별 마커를 사용하는 경우에는, 세포는 약물 농도를 증가시켜 (예를 들어, 약물 농도를 2배로 증가시켜) 제2 표적화 단계에서 선별될 수 있다.
표적화 제작물은 또한 loxP 부위로 플랭킹된 선별 마커를 포함하여, Cre/lox 시스템을 이용한 마커의 효율적인 제거를 도울 수도 있다. 따라서, 유전자 표적화 이후, 바람직하게는 배아 클로닝 전의 어떤 시점에, 세포로부터 유전 물질의 일부를 제거하기 위하여 이러한 절단을 실시할 수 있다. 이 물질은 선별 마커 또는 도입된 유전적 전사 촉진자일 수 있다. 이러한 제거는 이하 본 명세서에 기재하는 방법, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 방법에 따라 실시할 수 있다.
일례로, 표적화 벡터를 가지는 태아 섬유모세포는 전기천공법을 통하여 Cre-함유 플라스미드 (예를 들어, 문헌[Gagneten et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3326-3331]에 기재된 GFPCre 융합 유전자를 포함하는 Cre 플라스미드)로 형질감염된다. 이로서 Cre 단백질을 포함하는 모든 클론을 빠르게 선별할 수 있게 된다. 이와 관련하여, 세포는 FACS 분류 또는 미세조작을 통한 녹색 형광 발광 세포를 수작업으로 회수함으로써 선별된다. 녹색 발광 세포는 약물 내성 마커를 제거하는, 활발하게 전사된 Cre 리컴비나제를 가질 것으로 예상된다. Cre 발현으로 선별된 세포를 클로닝하고, PCR 분석에 의해 약물 내성 마커의 결실에 대하여 분석한다. 이러한 확인 후에, 상기 세포는 다음 단계의 유전적 표적화 또는 클로닝에 사용된다.
이종 핵산의 도입
원하는 경우, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 핵산 분자를, 도입되는 돌연변이의 일부로서 내생 유전자 내에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 특정 종의 항체를 코딩하는 유전자는 내생 유전자 내에 도입될 수 있다. 바람직하게는 그 내용이 본 명세서에 포함되는 PCT 공개 공보 W097/07671 및 WOOO/10383에 개시된 인간 인공 염색체가 이러한 목적으로 사용된다. 상기 인간 인공 염색체는 또한 상응하는 일본 특허 JP 30300092호에도 기재되어 있다. 인간 면역글로불린 유전자를 포함하고 발현하는 인간 인공 염색체의 제작은 문헌[Shen et al. (1997) Hum. Mol. Genet. 6:1375-1382; Kuroiwa et al. (2000) NatureBiotechnol. 18:1086-1090; andLoupert et al. (1998) Chromosome 107: 255-259]에 개시되어 있다. 인공 염색체에 안정적으로 삽입한 뒤, 세포주 (예를 들어, 소 태아 섬유모세포)는 추가의 유전자 표적화를 위한 공여체 세포로 사용될 수 있다.
인간 인공 염색체를 사용하는 것에 대한 대안으로서, 대상 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 YAC 벡터, BAC 벡터 또는 코스미드 벡터를 사용하여 염색체 내에 삽입될 수 있다. 이러한 벡터는 공지된 방법, 예컨대 전기천공법, 리포펙션, YAC 벡터를 포함하는 효모 스페로플라스트와의 융합 등을 이용하여 세포 (예를 들어, 태아 섬유모세포 세포) 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 대상 유전자를 포함하는 벡터는 세포 (예를 들어, 태아 섬유모세포 세포)의 상응하는 내생 유전자 좌위를 표적화하여, 대상 유전자의 도입 및 내생 유전자의 돌연변이를 동시에 일으킬 수 있다.
대상 유전자를 코딩하는 핵산의 도입은 또한 론버그(Lonberg) 등에 의한 특허 (내용이 모두 본원에 포함되는 미국 특허 제5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,750,172, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318 5,874,299, 5,877,397 및 6,300,129호)에 기재된 바와 같이 실시될 수 있다. 대상 유전자를 숙주 포유동물의 염색체 내로 삽입하는데 사용되는 "넉-인" 제작물에서, 1개 이상의 유전자 및 항생제 내성 유전자는 제작물로 형질감염되는 세포 종류에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 구성적으로 활성이고, 유도 가능하거나 또는 조직-특이적인 프로모터는 삽입된 항생제 내성 유전자의 전사를 활성화하는데 사용되어, 형질감염된 세포가 그들의 결과적인 항성제 내성을 기초로 선별되도록 할 수 있다. 별법으로, 대상 유전자 및 항생제 내성 유전자를 포함하는 넉-인 카세트가 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않은 넉-인 제작물을 사용할 수 있다. 이 경우, 넉-인 카세트가 내생 프로모터의 하류에 삽입된 세포는 내생 프로모터의 조절 하에 항생제 내성 마커가 발현되는 것에 기초하여 선별될 수 있다. 이렇게 선별된 세포는 대상 유전자가 숙주 염색체에 삽입된 트랜스제닉 비인간 포유동물을 생성하기 위한, 본 명세서에 기재된 배아 클로닝 방법에 사용될 수 있다. 별법으로, 외래 대상 유전자를 포함하는 동물은 내생 유전자를 불활성화시킨 동물과 교배할 수 있다.
예시적 유전자 돌연변이
본 발명의 방법을 사용하여 임의의 수의 대표적 유전자 돌연변이를 포유동물에 도입할 수 있다. 예를 들어, 내생 유제류 Ig J쇄 유전자는 인간에게 투여되는 본 발명의 항체에서 유제류 Ig J쇄의 잠재적 항원성을 방지하기 위해 넉아웃될 수 있다. 표적화 벡터의 제작을 위하여, 진뱅크 수탁 번호 UO2301인 소 Ig J쇄 영역 cDNA 서열을 사용할 수 있다. 이 cDNA 서열은 RPC1-42(BACPAC in Oaldand, CA)와 같은 BAC 라이브러리로부터 소 Ig J쇄의 게놈 서열을 단리하기 위한, 또한 다른 유제류로부터 쇄의 게놈 서열을 단리하기 위한 탐침으로 사용될 수 있다. 또한, 인간 J쇄 코딩 서열은 인간 IgA 및 IgM 분자의 기능적 발현을 위하여 본 발명의 유제류에 도입될 수 있다. 인간 J쇄의 cDNA 서열은 진뱅크 수탁 번호 AH002836, M12759 및 M12378로 입수가능하다. 이 서열은 본 명세서에 기재된 것과 같은 표준법을 사용하여 유제류 태아 섬유모세포 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, HAC, YAC 벡터, BAC 벡터, 코스미드 벡터 또는 넉-인 제작물 중의 인간 J쇄 핵산은 내생 유제류 염색체 내로 삽입되거나, 내생 유제류 염색체와 독립적으로 유지될 수 있다. 생성된 트랜스제닉 유제류 세포는 기능적 유제류 J쇄의 발현을 감소 또는 제거하는 돌연변이를 가지고, 인간 J쇄를 발현하는 이종 핵산을 포함하는 원하는 유제류를 생성하기 위한 본 명세서에 기재된 배아 클로닝 방법에 사용될 수 있다.
다른 예에서, 유제류와 같은 비인간 포유동물이 인간 항체를 생산하기 위해 유전적으로 조작되는 경우, 갈락토실(α1,3)갈락토스 에피토프를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자인, 유제류 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 발현도 감소 또는 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이 탄수화물 에피토프로 변형된 글리코실화된 인간 항체는 인간에게 치료제로서 투여되는 경우 때때로 이 에피토프에 반응성인 수여체 항체에 의해 불활성화되거나 제거된다. 이러한 가능성있는 면역 반응을 제거하기 위하여, 소 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 불활성화시키는 넉아웃 제작물을 설계하는데 이 유전자의 서열을 사용할 수 있다. 소 서열 (진뱅크 수탁 번호 J04989; Joziasse et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 14290-14297) 또는 돼지 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 서열 (미국 특허 제 5,821,117 및 6,153,428호에 기재됨)을 이들 종에서 상기 유전자를 불활성화시키거나, 다른 다양한 유제류에서 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 게놈 서열을 수득하여 상기 에피토프의 발현이 감소 또는 제거된 포유동물을 생성하는데 사용할 수 있다.
유제류 PrP 유전자 (프리온 단백질을 코딩함)는 소 해면상 뇌병증 (BSE)와 같은 감염의 잠재적 위험을 줄이기 위하여 돌연변이화 또는 불활성화될 수 있다. 소 PrP 유전자의 돌연변이는 하기에 기재한다.
상기 언급한 추가적인 돌연변이화 또는 유전자 불활성화는 다양한 방법을 사용하여 본 발명의 유제류에 도입될 수 있다. 트랜스제닉 유제류 세포주가 각각의 원하는 돌연변이에 대하여 생성되면, 교차교배하여 본 발명의 유제류에 이러한 추가적인 돌연변이를 도입할 수 있다. 별법으로, 이러한 추가적 돌연변이를 가지는 태아 섬유모세포는 내생 면역글로불린 유전자의 넉아웃 및(또는) 이종 면역글로불린 유전자의 도입을 위한 출발 물질로 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재한 바와 같이, 내생 면역글로불린 유전자에 넉아웃 돌연변이를 가지고(가지거나) 이종 면역글로불린 유전자를 포함하는 태아 섬유모세포는 이러한 추가적 돌연변이화 또는 불활성화를 위한 출발 물질로 사용될 수 있다.
클로닝된
비인간 포유동물의 제조
본 발명자들은 IgM 중쇄 코딩 유전자에 1개 이상의 돌연변이를 가지는 포유동물을 클로닝하는데 사용될 수 있는 다양한 포유동물 (예를 들어, 소와 같은 유제류) 클로닝 방법을 개시한 바 있다 (예를 들어, 미국 특허 공보 제2002-0046722호 및 PCT 공개 공보 W002/051997를 참조하라). 이들 방법 중 일부에서, 가투과성화된 세포를 재프로그래밍 배지 (예를 들어, 세포 추출물)에서 인큐베이션 하여, 세포로부터 성분들을 추가 또는 제거한 뒤,원하는 성분을 밀봉하기 위해 가투과성화된 세포의 세포막을 재봉입하고 세포의 막 균일성을 회복시켰다. 이들 방법의 일부는 또한 공여체 핵(예를 들어, 단리된 핵 또는 공여체 세포 내의 핵)이 염색질체로 응축되어 핵 이식 배아가 살아있는 자손으로 발생하는 것에 대해 바람직하지 않은 유전자의 전사를 촉진할 수 있는 전사 인자와 같은 핵 구성 성분이 방출되도록 하는 것을 포함한다. 원하는 경우, 이들 중 임의의 방법의 단계를 1 또는 2회 반복하거나, 상이한 재프로그래밍 방법을 재프로그래밍의 정도를 증가시키면서 순차적으로 실시하여, 클로닝된 태아의 생존률을 증가시킬 수 있다.
클로닝된 포유동물 (예를 들어, 소) 및 클로닝된 트랜스제닉 비인간 포유동물의 제조를 위한 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 매사추세츠 대학의 미국 특허 제5,995,577호, 및 PCT 공개 공보 W095/16670; W096/07732; W097/0669; 및 W097/0668 (통합적으로, "로슬린 법")에 기재되어 있다. 로슬린 법은 증식하는 공여체 세포보다는 증식하지 않는 것을 사용한다는 점에서 매사추세츠 대학의 기법과 상이하다. 상기 특허 문헌들은 모두 참조하여 본 명세서에 포함된다. 이들 기법은 트랜스제닉 소의 제조에 사용되는 것으로 한정되지 않으며, 이들 기법은 유제류와 같은 다른 비인간 포유동물의 배아 클로닝에도 사용될 수 있다.
배아 클로닝 후에, 원하는 동물의 제조는 유제류 교배 또는 상기 기술한 상동성 표적화 벡터를 사용하는 제2 유전자 표적화에 의하여 영향받을 수 있다.
약물 내성
마커의
Cre
/
Lox
절단
본 발명의 한 실시태양에서, Cre/Lox 계는 이후에 마커를 효율적으로 제거하는 것을 돕기 위해 사용된다. 표적화 벡터를 가지는 태아 섬유모세포는 전기천공법에 의하여 Cre-함유 플라스미드로 형질감염된다. GFPcre 융합 유전자를 포함하는 Cre 플라스미드 (Gagneten et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3326-3331)가 사용될 수 있다. 이는 Cre 단백질을 포함하는 모든 클론을 빠르게 선별할 수 있도록 한다. 이들 세포는 FACS 분류 또는 미세조작을 통한 녹색 형광 발광 세포를 수작업으로 회수함으로써 선별된다. 녹색 발광 세포는 Cre 리컴비나제를 가지므로 약물 내성 마커를 결실시킬 것으로 예상된다. Cre 발현으로 선별된 세포를 클로닝하고, PCR 분석에 의해 약물 내성 마커의 결실에 대하여 분석한다. 절단이 일어난 것으로 확인된 세포는 작은 클론으로 배양하고, 나누어, 약물 내성 유전자가 결실되었는지 여부를 확실하게 확인하기 위하여 선별 배지에서 한 분획을 시험한다. 다른 분획은 표적화된 결실의 다음 라운드에 사용한다.
유제류 교배 방법
유제류 또는 유제류 세포를 생성시키는 상기 임의의 방법의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 유제류는 2개 이상의 유전적 변형을 가지는 배아, 태아 또는 살아있는 자손을 제조하기 위하여 다른 유제류와 교배된다. 바람직하게는 배아, 태아 또는 자손으로부터 1개 이상의 세포를 단리하고, 단리한 세포(들)에 1개 이상의 추가적인 유전적 변형을 도입한다.
항체 제조 방법
본 발명은 또한 이종 항체 (예를 들어, 인간 항체)를 발현하는 본 발명의 유제류를 사용하는 항체 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법 중 하나는 이종 항체 유전자 좌위를 코딩하는 핵산을 가진 본 발명의 유제류에 1종 이상의 대상 항원을 투여하는 것을 포함한다. 유전자 좌위의 핵산 분절에 재배열이 일어나, 항원에 특이적인 항체가 생산된다. 항체는 유제류로부터 회수된다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있으며, 바람직하게는 대상 항원과 반응한다. 바람직하게는, 항체는 유제류의 혈청 또는 유즙으로부터 회수된다.
관련된 국면에서, 본 발명은 이종 항체 유전자 좌위를 코딩하는 핵산을 가지는 본 발명의 유제류로부터 이종 항체를 회수하는 것을 포함하는, 다른 항체 제조 방법을 제공한다. 유전자 좌위의 핵산 분절에 재배열이 일어나, 이종 항체가 생산된다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있으며, 바람직하게는 대상 항원과 반응한다. 바람직하게는, 항체는 유제류의 혈청 또는 유즙으로부터 회수된다. 바람직하게는, 유제류 항혈청 또는 유즙은 폴리클로날 인간 면역글로불린을 가진다. 바람직하게는 항혈청 또는 유즙은 소, 양, 돼지 또는 염소의 것이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린은 원하는 항원에 대한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 항혈청은 인간 질병의 치료 또는 예방을 위한 정맥내 면역글로불린 (IVIG)으로 사용된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 대상 항원을 유제류에 투여하고, 상기 항원에 대한 면역글로불린이 유제류에 의하여 생산된다. 바람직하게는 이종 면역글로불린 유전자 좌위 재배열 내의 핵산 분절, 및 대상 항원에 반응하는 이종 항체가 생산된다. 바람직하게는 항혈청 및(또는) 유즙은 내생 항체에 비해 2, 5, 10, 20 또는 50배 많은 이종항체를 포함하거나, 내생 항체를 전혀 포함하지 않는다. 원하는 경우에는, 하이브리도마 및 모노클로날 항체는 상기 기재한 트랜스제닉 유제류 (예를 들어, 트랜스제닉 소)로부터 유래한 이종 B-세포를 사용하여 제조된다. 유제류로부터 단리한 이종 항체 (예를 들어, 인간 항체)를 그후 독소, 치료적 활성 화합물, 효소, 시토킨, 방사능표지, 형광표지 또는 친화성 태그에 공유적으로 부착되도록 화학적으로 변형하는 것을 고려할 수도 있다. 원하는 경우, 형광 또는 방사능표지는 시험관내 또는 생체내 항체의 이미지화에 사용될 수 있다.
유제류 및 공여체 세포
유제류로는 페리소다크틸라(Perissodactyla) 및 아르티오다크틸라(Artiodactyla) 목의 구성원, 예컨대 보스(Bos) 속의 구성원을 포함한다. 다른 바람직한 유제류로는 양, 큰뿔양, 염소, 들소, 영양, 황소, 말, 당나귀, 노새, 사슴, 엘크, 삼림순록, 물소, 낙타, 라마, 알파카, 돼지 및 코끼리를 포함한다.
유전자 표적화에 바람직한 세포는 분화된 세포, 예컨대 상피세포, 신경세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, B-림프구, T-림프구, 적혈구, 대식세포, 단핵구, 섬유모세포 및 근육세포; 비분화된 세포, 예컨대 배아 세포 (예를 들어, 줄기 세포 및 배아 생식 세포)를 포함한다. 다른 바람직한 실시태양에서, 세포는 웅체 생식계, 예컨대 난소구, 과립층 또는 난관세포이다. 바람직한 세포는 또한 임의의 기관, 예컨대 방광, 뇌, 식도, 난관, 심장, 장, 쓸개, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 수뇨관, 요도 및 자궁 세포를 포함한다. 바람직하게는 공여체 세포, 공여체 핵, 공여체 염색질체 또는 재구성된 난자는 4배수체가 아니다.
트랜스제닉
유제류 세포
한 국면에서, 본 발명은 IgM 중쇄를 코딩하는 2개 이상의 유전자의 대립 유전자 중 1개 또는 2개 모두에 돌연변이 (예를 들어, 시작 ATC 코돈 이후의 돌연변이, 예컨대 상기 코돈으로부터 10, 20, 50 또는 100 염기 내에 있는 돌연변이)를 가지는 유제류 세포 (예를 들어, 소 세포)를 제공한다. 바람직하게는 돌연변이는 기능적 IgM 단백질의 발현을 감소시키거나 실질적으로 제거한다. 바람직한 실시태양에서, 기능적 또는 총 IgM 단백질의 발현은 10, 20, 40, 60, 80, 90, 95% 이상 또는 100% 감소한다. 돌연변이체는 반접합 또는 동형접합일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 돌연변이체는 핵산 내로 양성 선별 마커 (예를 들어, 항생제 내성 유전자)의 삽입하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 양성 선별 마커는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다. IgM 중쇄를 코딩하는 유전자의 양쪽 대립 유전자 내로 삽입된 항생제 내성 유전자를 가지는 유제류 또는 유제류 세포에 대하여, 각 대립 유전자는 동일하거나 상이한 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 음성 선별 마커 (예를 들어, DT-A 또는 Tk)는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 내생 대립 유전자를 파괴하기 위해 사용된 벡터 내에 존재한다. 돌연변이체는 유전자 내에 1개 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 인접하는 뉴클레오티드)의 결실을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
상기 국면의 바람직한 실시태양에서, 유제류 (예를 들어, 소) 또는 유제류 세포 (예를 들어, 소 세포)는 1개 이상의 트랜스진을 가지고, 트랜스진(들)에 의해 코딩되는 mRNA 또는 단백질 (예를 들어, 항체)을 발현한다. 유제류는 천연적으로 배열된 인간 염색체 분절 (예를 들어, 인간 염색체 단편) 또는 인공적으로 조작된 인간 염색체 단편을 포함하는 인공 염색체 (즉, 인간 게놈과 유사하게 재배열된 단편)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 이종 핵산은 염색체 단편 내에 존재한다. 핵산은 유제류 염색체 내에 삽입되거나, 숙주 염색체와 독립적으로 유제류 세포 내에 유지될 수 있다. 다양한 실시태양에서, 핵산은 염색체 단편, 예컨대 ΔHAC, ΔΔHAC 또는 κHAC에 존재한다. 다른 실시태양에서, 이종 항체는 다른 속으로부터의 항체, 예컨대 인간 항체이다.
바람직한 유제류 및 유제류 세포는 1개 이상의 B-세포에 이종 항체 유전자 좌위를 가지는 1개 이상의 핵산 (예를 들어, 재배열되어 1종 이상의 이종 Ig 분자를 발현하는 이종 면역글로불린 (Ig) 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산)을 가진다. 바람직하게는, 핵산은 V 유전자 분절을 코딩하는 모든 핵산 분절이 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 J 유전자 분절을 코딩하는 모든 핵산 분절와 분리되는, 재배열되지 않은 항체 경쇄 핵산 분절을 가진다. 다른 바람직한 핵산은 (i) V 유전자 분절을 코딩하는 모든 핵산 분절이 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 D 유전자 분절을 코딩하는 모든 핵산 분절와 분리되고(있거나) (ii) D 유전자 분절을 코딩하는 모든 핵산 분절이 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 J 유전자 분절을 코딩하는 모든 핵산 분절와 분리되는, 재배열되지 않은 항체 경쇄 핵산 분절을 가진다. 다른 바람직한 유제류는 1종 이상의 이종 면역글로불린을 발현하는 재배열된 이종 면역글로불린 유전자의 일부 또는 전부를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 가진다.
다른 바람직한 실시태양에서, 이종 항체의 경쇄 및(또는) 중쇄는 인간 핵산에 의해 코딩된다. 바람직한 실시태양에서, 중쇄는 임의의 군의 중쇄, 예컨대 μ, γ, δ, ε 또는 α이고, 경쇄는 λ 또는 κ경쇄이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 이종 면역글로불린 사슬 또는 항체를 코딩하는 핵산은 재배열되지 않은 형태이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 1군 이상의 이종 항체가 유제류에 의해 생산된다. 다양한 실시태양에서, 1종 이상의 상이한 이종 Ig 또는 항체가 유제류에 의해 생산된다. 이종 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다.
바람직하게는, 유제류는 또한 프리온 단백질, α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 및(또는) J쇄를 코딩하는 내생 핵산의 대립 유전자 1개 또는 2개 모두에 돌연변이를 가진다. 바람직하게는, 돌연변이는 내생 α-(l,3)-갈락토실트랜스퍼라제 효소, 갈락토실(α1,3)갈락토스 에피토프, 및(또는) J쇄의 발현을 감소 또는 제거한다. 바람직하게는, 유제류는 인간 J쇄를 포함하는 인간 IgA 또는 IgM 분자를 생산한다. 바람직한 유제류 세포 (예를 들어, 소 세포)는 체세포, 예컨대 태아 섬유모세포 또는 B-세포를 포함한다.
본 발명의 트랜스제닉 유제류 제조 방법은 2개 이상의 IgM 중쇄 유전자 (예를 들어, 소 IgμU 및 IgμAY 유전자)의 대립 유전자의 하나 또는 둘 모두의 돌연변이화 (예를 들어, 상동 재조합에 의한 돌연변이)를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 태아 섬유모세포는 적합한 상동 재조합 벡터를 사용하여 시험관내에서 표적화된다. 태아 섬유모세포를 사용하면, 이들 세포가 조직 배양에서 쉽게 증식하고 유전적으로 조작되기 때문에 다른 체세포를 사용하는 것보다 바람직하다. 그러나, 태아 섬유모세포를 사용하는 것은 본 발명에 필수적이지는 않고, 다른 세포로 이를 대체하여 동등한 결과를 얻을 수 있다. 적합한 체세포로는 섬유모세포, 상피세포, 내피세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 림프구 (B-세포 및 T- 세포), 대식세포, 단핵구, 단핵세포, 심근세포, 다른 근육세포, 과립층 세포, 구 세포, 태반 세포 및 표피세포를 포함한다.
표적화된 유전자 돌연변이는 표적화된 IgM 중쇄 대립 유전자에 상동성인 영역을 가지는 DNA 제작물을 제작하여, 유제류 게놈 내의 IgM 중쇄 대립 유전자에 제작물을 삽입시켜 그의 발현을 파괴할 것이 요구된다. 소 IgμU 및 IgμAY에 이러한 표적화된 돌연변이를 실시하기 위한 예시적인 백터는 하기 실시예에 기재되어 있다. 다른 표적 위치에 상동 재조합을 일으키는 벡터의 제작 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 현재 적합한 벡터의 제작은 특히 다른 유제류 (예를 들어, 양 및 염소)의 Igμ 유전자 서열이 알려져 있다는 점(하기를 참조하라)을 감안할 때 당업계의 기술 범주 내이다. 상동 재조합을 돕기 위하여, 각각 상동 재조합 및 IgM 유전자의 불활성화를 실시하는데 사용하는 벡터들은 유제류 IgM 중쇄 및 Ig 경쇄 유전자에 실질적인 서열 동일성을 나타내는 DNA의 일부를 포함한다. 바람직하게는, 이들 서열은 상동 재조합 및 표적화된 결실 또는 불활성화를 돕기 위하여, 표적화된 유전자 좌위에 대하여 98% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 더더욱 바람직하게는 표적화된 유전자 좌위와 동일하다.
전형적으로, 제작물은 원하는 상동 재조합체, 예를 들어 IgM 중쇄 유전자가 상동 재조합에 의하여 파괴된 섬유모 세포를 선별할 수 있도록 하는 마커 유전자를 포함한다. 예시적인 마커 유전자로는 항생제 내성 마커, 약물 내성 마커 및 녹색 형광 단백질 등이 있다.
한 네오마이신 내성 제작물을 다음과 같은 방법으로 조립하였다. "pSTneoB"로 명명한 제작물 (Katoh et al. (1987) Cell Struct. Funct. 12: 575; Japanese Collection of Research Biologicals (JCRB) deposit number: VE039)은 코딩 영역 상류에 SV40 프로모터 및 TK 인핸서에 의해 조절되는 네오마이신 내성 유전자를 포함하도록 설계되었다. 코딩 영역의 하류에는 SV40 종결 서열이 있다. neo 카세트를 XhoI 단편으로서 "pSTneoB"로부터 잘라냈다. 단편의 말단을 표준 분자생물학적 기법으로 평활 말단으로 전환한 뒤, 평활 말단 단편을 벡터인 pBS246 (Gibco/Life Technologies)의 EcoRV 부위에 클로닝하였다. 이 부위는 loxP 절단 부위로 플랭킹된다. "pLoxP-STNeoR"로 명명한 새 제작물을 사용하여 mu 넉아웃 DNA 제작물을 생성하였다. 이 제작물의 원하는 단편은, pBS246 클로닝 벡터에 원래 존재하는 loxP 부위 및 NotI 부위로 플랭킹된다. loxP-neo-loxP를 함유하는 원하는 NotI 단편을 면역글로불린 mu 불변 영역 엑손의 대체에 사용하였다. 네오마이신 내성 유전자에 작동가능하게 연결된 SV40 프로모터는 네오마이신 내성 유전자의 전사를 활성화하여, 세포가 이들로 인한 항성제 내성을 기초로 원하는 NotI 단편이 선별할 mu 불변 영역 엑손을 대체하도록 한다.
IgM 중쇄 대립 유전자가 효과적으로 파괴된 세포주를 수득한 후에, 이를 공여체 세포로 사용하여 클로닝된 유제류 태아 (예를 들어, 클로닝된 소 태아)를 제조하고, 최종적으로 IgM 중쇄 대립 유전자 중 하나가 파괴된 태아 또는 동물을 제조한다. 그런 다음, 상기 태아 또는 동물로부터 유래한 체세포 (예를 들어, 섬유모세포)를 사용하여 유전자 표적화 돌연변이 2단계를 실시하여, 제2 IgM 중쇄 대립 유전자가 파괴된 세포를 제조할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 이는 어떠한 방식으로든 본 발명을 한정하기 위함이 아니다.
<실시예 1> IgμU 유전자의 표적화
본 발명자들은 다수 유전자 표적화를 실시하는, 광범위하게 적용가능하고 신속한 방법을 개발하였다. 상기에서 논의된 바와 같이, 고효율 표적화 시스템의 순차적 적용 및 클로닝된 태아의 제조에 의한 세포주 회수 (도 1)를 사용하였다. 본 발명자들은 섬유모세포에서 전사되지 않는 IgμU 유전자를 표적으로 선택하였다. 이 유전자는 넉아웃 벡터 서열 바깥에서 두 대립 유전자를 구별하는데 사용될 수 있는 다형성 마커 DNA 서열을 확인하기 위하여 수컷 홀스타인 태아 섬유모세포 세포주 (#6939)에서 특성화되었다 (도 2A; 대립 유전자 A 및 대립 유전자 B 표시함). 세포주 #6939로부터의 태아 섬유모세포에 전기천공법으로 제1 KO 벡터 (pBCμΔKOpuro; 도 2A)를 도입하여 퓨로마이신에 내성인 446개의 웰을 제조하였다. 제14일째에 웰을 나누어, 세포의 절반을 정확하게 표적화된 세포를 포함하는 웰을 확인하기 위한 PCT 스크리닝 (프라이머 쌍; puroF2 x puroR2, 도 2A)에 사용하였다. 일단, 6개의 웰이 PCR에 의하여 양성을 나타냈다. 위양성(falso positive) 웰을 제거하기 위하여, 모든 PCR 생성물에 대하여 puroF2 및 puroR2 프라이머로 양방향 서열분석 분석을 실시하였다. 2개의 웰 (0.45%; #147, #384)이 정확하게 표적화된 것으로 확인되었다. 서열 분석에 의해 확인된 다형성 차이에 기초하여, 384번 웰에는 대립 유전자 A에, 147번 웰에는 대립 유전자 B에 넉아웃 벡터를 삽입하였다. 두 웰에서 남은 세포는 태아를 생성시켜 세포주를 회수하기 위하여 배아 클로닝에 사용하였다. 임신 40일째의 임신률은 50% (115/30; 수여체 당 배아 2개 씩)였고, 임신 60일째에 6개의 배아를 수집하여 섬유모세포를 재확립하였다.
6개 중 3개의 태아 (#2184-1, #2184-2 및 #3287)가 PCR (프라이머 쌍; puroF2 x puroR2) 및 서열 분석에 의하여 이형접합 넉아웃체 (IgμU-/+; 도 2B)임이 확인되었다.
비-표적화된 태아는 웰에서 표적화된 세포와 공존했던 비-표적화된 세포로부터 기인하였을 것이다. 태아 #2184-1 및 #2184-2 양자 모두 넉아웃 벡터가 대립 유전자 A에 삽입된 384번 웰에서 생성되었고, 태아 #3287는 넉아웃 벡터가 대립 유전자 B에 삽입된 147번 웰에서 생성되었다. 3개의 재생성된 세포주로부터 제조한 클로닝된 IgμU-/+ 배아를 153마리의 수여체로 이식하여, PCR (도 2C) 및 서열 분석으로 IgμU-/+ 임을 확인한 13마리 (8%)의 건강한 송아지를 제조하였다.
3개의 IgμU-/+ 세포주 (#2184-1 및 #2184-2, 대립 유전자 A에 표적화; #3287, 대립 유전자 B에 표적화) 모두, 짧은 상동성 팔이 #6939 세포주의 대립 유전자 A로부터 직접 증폭된 PCR-유래 서열로 대체된 제2 넉아웃 벡터(pBCμΔKOneo; 도 3A)를 이용한 표적화에 사용하였다. #2184-1 및 #2184-2 세포주에서는 G418에 내성인 총 1,211개의 웰을 PCR (프라이머 쌍; neoF3 x neoR3; 도 3A) 후 서열 분석에 의하여 스크리닝하였다. 5개의 웰이 양성이었고, 2개의 웰에서 벡터가 온전한 대립 유전자 B에 삽입되어 동형접합 넉아웃 (IgμU-/-) 세포가 생성되었으며, 3개의 웰에서는 대립 유전자 A 내의 표적화 벡터가 대체되었다. #3287 세포주에서는, G418에 내성인 568개의 웰을 PCR (프라이머 쌍; neoF3 x neoR3; 도 3A) 후 서열 분석에 의하여 스크리닝하였다. 7개의 웰이 양성이었고, 6개의 웰에서 벡터가 온전한 대립 유전자 A에 삽입되어 IgμU-/- 세포가 생성되었으며, 1개의 웰에서 대립 유전자 B 내의 표적화 벡터가 대체되었다. 전체적으로, 벡터는 대립 유전자 A에 대하여 3:1로 편중되었고, 예상한 바와 같이 세포주 #3287가 동형접합 표적화에 사용하기에 더욱 효율적이었다 (6/569, 1.1% 대 2/1211, 0.17%).
배아 클로닝을 위하여 세포주 #3287에서 유래한 2개의 IgμU-/- 웰 (#76, #91)을 선택하여 태아를 제조하고 세포주를 회생하였다. 전체적으로 임신 40 내지 50일째의 IgμU-/- 태아 임신률은 45% (40/89)였다. 임신 45일째에, 웰 #76에서 수득한 5개의 태아 및 웰 #91에서 수득한 15개의 태아를 수집하고, 평가하였다. 웰 #76의 5개의 태아 모두 (도 3B) 및 웰 #91의 태아 15개 중 3개에 대하여 PCR (프라 이머 쌍; puroF2 x puroR2 및 neoF3 x neoR3)로 양성임을 확인하였다. PCR 결과물을 서열 분석, 및 야생형 대립 유전자 (도 3B)에 대한 음성 PCR (프라이머 쌍; bCμf x bCμr; 도 3A)로 확인하였다. 재생성된 IgμU-/- 섬유모세포로부터 제조한 90일령 태아를 제조하고 비장 세포에서 IgμU 유전자 발현을 평가하여 기능적 넉아웃체인지 여부를 확인하였다. 발현 여부를 RT-PCR (프라이머 쌍; bCμf x bCμr, 도 3C)로 확인하였다. 5개의 IgμU-/- 세포주로부터 클로닝된 배아를 제조하였고, 이를 수여체에 이식하여 만기까지 발생하도록 하였다.
상기 군 중 2마리의 송아지가 최근 태어났으며, PCR (도 3D) 및 서열 분석에 의하여 IgμU-/-인 것으로 확인되어, 순차적 유전자 표적화 및 세포 회생의 연속적 단계에 의하여 건강한 송아지로 만기 완전 발생이 가능함이 입증되었다.
<실시예 2> Cre/LoxP 계를 이용한 선별 마커의 제거
순차적 표적화에는 1개 또는 복수 개의 항생제 선별 마커를 이미 가지고 있는 세포주에 새로이 도입된 표적화 벡터의 항생제 선별을 위한 전략이 필요하다. 가장 간단한 접근법은 각 표적화 실시마다 상이한 선별 마커 유전자를 사용하는 것이다. 그러나 이 접근법은 세포주 내에서 실시할 수 있는 표적화의 횟수를 제한한다. 다른 접근법은 쥐 배아 줄기 세포(Abuin and Bradley (1996) Mol. Cell Biol. 16: 1851-1856)에서 실시한 바와 같이 Cre-loxP 재조합 계를 이용하여 선별 마커를 제거하는 것이다. 재생성된 IgμU 표적화 섬유모세포에서, 선별 마커 유전자는 발현되지 않았는데, 이는 IgμU 유전자 좌위가 섬유모세포에서 발현되지 않기 때문일 것이다.
상기 IgμU-/- 섬유모세포에서 추가의 표적화를 위해 선별 마커 제거가 필수적이지는 않지만, 본 발명자들은 Cre 리컴비나제 발현 플라스미드로 형질감염시켜 선별 마커를 제거할 수 있는 가능성을 평가하였다. 본 발명은 Cre 리컴비나제의 일시적 발현을 위한 것이기 때문에, 닫힌 원형 플라스미드를 사용하였고, 항생제 선별은 배양 첫 3일에 국한하였다.
소 IgμU-/- 세포주 #4658를 형질감염시켰고, 24개의 선별된 웰에 대하여 표적화된 대립 유전자에서 항생제 내성 유전자의 절단이 일어난 것으로 PCR에 의해 확인되었다 (도 4A). 다수의 웰에서 puro 및 neo 유전자 양자 모두의 절단이 일어났다는 증거가 나타났으며, 이중 하나를 태아 클로닝 및 세포주 회생을 위하여 선택하였다. 임신 40 내지 50일째의 임신률은 35% (21/60)였다.
5개의 태아를 회수하여, 모두에게서 2개의 선별 마커를 제거하였다 (도 4B). Cre 리컴비나제 플라스미드는 #1404 태아를 제외한 모든 태아에서 게놈에 삽입되었다. 이러한 결과는 Cre-loxP 재조합을 체세포에서 선별 마커를 제거하는데 사용할 수 있다는 것을 의미한다. 이 계를 통상적으로 사용하기 위해서는 Cre-발현 플라스미드의 삽입 빈도를 감소시키기 위한 개선이 필요할 것이다.
<실시예 3> PrP 유전자의 표적화
제2 유전자의 순차적 표적화의 가능성을 평가하기 위하여, Cre-절단된 IgμU-/- (Cre/IgμU-/-) 섬유모세포 (세포주 #1404)에 대하여 PrP 유전자를 제거하기 위 해 제3차 표적화를 실시하였다. 이 유전자를 넉아웃 벡터 서열 바깥에서 두 대립 유전자를 구별하기 위한 다형성 서열을 확인하기 위해 먼저 특성화하였다 (도 5A; 대립 유전자 C 및 대립 유전자 D 표시함). 세포를 제3 넉아웃 벡터 (pBPrP(H) KOneo, 도 5A)로 형질감염시키고, 203개의 G418-내성 웰에 대하여 PCR로 스크리닝하였다.
13개의 웰 (6.4%)에서 세포가 Cre/IgμU-/- 하에서 이형접합 PrP 넉아웃 (Cre/IgμU-/-/PrP-/+)임이 확인되었다 (프라이머 쌍; neoF7 x neoR7; 도5A). 서열 분석에 의해 제3 넉아웃 벡터가 모든 양성 웰에서 PrP 유전자의 대립 유전자 C에 삽입되었음을 확인하였다. 몇몇 웰을 클로닝에 사용하여 임신 45일째에 28마리가 임신을 유지하였다 (71%; 표 1). 5개의 태아를 수집하였고, 모두가 PrP 유전자의 대립 유전자 C에 대한 표적화에 양성임이 PCR (도 5B; 프라이머 쌍; neoF7 x neoR7) 및 서열 분석으로 확인되었다.
<표 1> 태아 발생, 변형된 세포를 가지는 태아 및 송아지
| 변형 유형 | 제조된 클로닝된 배아 수 (%) | 이식된 수여체 수 (%) | 40 내지 45일째 임신 개체수 (%) | 양성 태아/수집된 개체수 (%) | 태어난 송아지 수(%) |
| IgμU-/+ | 55/422 (19) | 30 | 15 (50) | 3/9 (33) | - |
| IgμU-/+ | 153/3305 (15) | 153 | 99 (65) | - | 13 (8) |
| IgμU-/- | 438/2379 (26) | 89 | 40 (45) | 20/40 (50) | - |
| IgμU-/- | 333/4350 (11) | 171 | 107 (63) | - | 8 (6) |
| IgμU-/- PrP -/+ | 112/739 (22) | 39 | 28 (71) | 5/19 (26) | - |
| IgμU-/- PrP -/- | 240/1673 (20) | 38 | 26 (68) | 33/33 (100) | - |
<표 2> 삼중 유전자 표적화
| 세포주 (IgμU-/-) | 스크리닝된 군집 수 | 삼중 표적화된 군집 수 (IgμU-/-/PrP -/+) | 삼중 표적화 빈도 |
| #1404 | 203 | 13 | 6.4% |
| #4658 | 181 | 11 | 6.0% |
| #5112 | 187 | 10 | 5.3% |
예상한 대로 이후 실시한 음성 IgμU PCR에서 증폭은 탐지되지 않았다 (도 4B; 프라이머 쌍; bCμf x bCμr). 표 2에 나타낸 바와 같이, 소 섬유모세포에서 활성인 유전자인 PrP에 대한 표적화 효율은 섬유모세포에서 발현되지 않는 유전자인 IgμU에서보다 실질적으로 높았다 (각각 6.4% 대 0.63%).
이중 동형접합 넉아웃 태아 및 세포주를 제조하기 위한 사중 표적화 가능성을 조사하기 위하여, 삼중 표적화 세포주 (#8443, Cre/IgμU-/-/PrP-/+)를 PrP 유전자의 남은 대립 유전자에 대하여 제4 넉아웃 벡터로 형질감염시켰다. 제1 대립 유전자에 대해 사용된 PrP 표적화 벡터에서 neo 유전자를 puro 유전자로 대체하여 (pBPrP(H)KOpuro, 도 6A) 벡터를 제작하였다. 선별 및 PCR 스크리닝 (프라이머 쌍; puroF14 x puroR14, 도 6A)의 결과로서, 17개의 웰 (5.2%)에서 Cre/IgμU-/- 하에서 동형접합 PrP 넉아웃을 나타내는 세포 (Cre/IgμU-/-/PrP-/-)를 가지는 것을 확인하였다. 서열 분석에 의하여 제4 넉아웃 벡터가, 표적화 서열이 PrP 유전자의 대립 형질 C를 대체한 1개의 웰을 제외하고는 모든 양성 웰에서 PrP 유전자의 대립 유전자 D에 삽입되었음을 나타낸다. Cre/IgμU-/-/PrP-/- 양성 웰의 세포를 클로닝에 사용하여 태아를 제조하였고, 임신 45일째에 임신률 71% (28/39)을 나타내었다. 표적화-특이적 프라이머 쌍인 puroF14 x puroR14 및 neoF7 x neoR7을 이용한 양성 PCR 분석은 수집한 18개의 태아 모두 Cre/IgμU-/-/PrP-/- 임을 나타내었다 (도 6B). 서열분석 분석에 의하여 제3 (neo) 및 제4 (puro) PrP 표적화 벡터가 각각 대립 유전자 C 및 D에 삽입되었음을 확인하였다. 또한, 야생형 PrP 대립 유전자 (프라이머 쌍; BPrPex3F x BPrPex3R, 도 6B) 및 IgμU 대립 유전자의 부재를 확인하기 위한 음성 PCR 분석을 실시하였고, 예상한 대로 모든 4개의 넉아웃체에서 이를 확인하였다. PrP mRNA 발현을 평가하기 위하여, IgμU-/-, IgμU-/-/Prp-/+ 및 Cre/IgμU-/-/PrP-/- 세포주로부터의 섬유모세포를 RT-PCR로 검사하였다. PrP 유전자 발현의 기능적 파괴를 확인하였다 (도 6C). 표 3은 Cre/IgμU-/-/PrP-/- 세포주 #8018에서 사중 표적화 빈도를 나타낸다.
<표 3> 사중 유전자 표적화
| 세포주(IgμU-/-/Prp-/+) | 스크리닝된 군집 수 | 사중 표적화된 군집 수 (IgμU-/-/PrP-/-) | 사중 표적화 빈도수 |
| #8018 | 325 | 3 | 0.92% |
상기 결과는 유전자 표적화의 다회 라운드 반복이 세포 회수 접근법을 사용하여 활성 및 침묵 유전자 양자 모두에 대하여 체세포에서 쉽게 달성된다는 것을 나타낸다. 상기 계가 전사적 비활성 및 활성 유전자 양자 모두에 대한 표적화에 효과적으로 광범위한 적용이 가능함을 입증하였으며, 2회 이상의 표적화를 통해 건강한 송아지의 발생이 가능하였다. 또한, 추가의 표적화 라운드가 클로닝된 배아의 발생을 손상시켰음을 나타내지 않는다.
방법
실시예 1-3에 설명된 결과들은 하기 방법을 사용하여 얻어졌다.
KO
벡터의 구축
IgμU 일정 영역 좌위의 엑손 2 주위의 소 게놈 단편을 5'-TGGTCACTCCAAGT GAGTCG-3' (서열 1) 및 5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3' (서열 2)의 프라이머 쌍으로 증폭된 32P-표지된 PCR 단편으로 프로빙함으로써 비동질 홀스타인 게놈 라이브러리로부터 얻었다. 한 게놈 클론을 제한효소 매핑함으로써 추가로 분석하였다. 엑손 2 주위의 7.2 kb의 BglII-XhoI 게놈 단편(5' 상동 팔) 및 2.0 kb의 BamHI-BglII 단편(3' 상동 팔)을 pBluescript II SK(-)(슈트라타진(Stratagene) 내로 서브클로닝하고 나서, 퓨로(puro), STOP 카세트(pBS302, 슈트라타진) 및 DT-A(디프테리아 톡신 A) 유전자를 삽입하였다(pBCμΔKopuro). 두 번째 표적 벡터를 구축하기 위해, 5'-GCAATAGCAAGTCCAGCCTCATCTG-3' (서열 3) 및 5'-CATCCTGTCTCTGGTGGTTTGAGGTC-3' (서열 4)의 프라이머 쌍을 사용하여 #6939로부터 게놈 PCR을 수행하였다. BamHI-BglII로 절단한 후, pBCμΔKOpuro 벡터의 3'의 짧은 팔을 단편으로 대체하였다. 서열분석에 의해, BamHI-BglII 단편이 "대립유전자 A"로부터 증폭되었음을 확인하였다.
퓨로 유전자를 neo 유전자로 대체하였다 (pBCμΔKOneo 벡터). PrP 좌위의 엑손 3 주위의 소 게놈 단편을 5'-GATTGAATGGTCTCCAGGATG CC-3' (서열 5) 및 5'-GACAAGCTTAATATCCGCAGG-3' (서열 6)의 PCR 프라이머 쌍으로 증폭된 32P-표지된 DNA 단편으로 동일한 홀스타인 게놈 λ 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻었다. 한 게놈 클론을 제한효소 매핑에 의해 추가로 분석하였다. 엑손 3을 함유하는 8.3 kb의 BamHI 게놈 단편(3' 상동 팔) 및 1.2 kb의 BamHI-BglII 단편(5' 상동 팔)을 pBluescript II SK(-) 내로 서브클로닝하고 나서, 네오 및 STOP 카세트 모두를 ATG 개시 코돈 뒤에 있는 BamHI 부위에 삽입하였다. DT-A 유전자 또한 서브클로닝하였다 (pBPrP(H)KOneo 벡터). 유사하게, puro 유전자를 함유하는 다른 KO 벡터를 구축하였다 (pBPrP(H)KOpuro 벡터).
세포 배양 및 형질감염
수컷 홀스타인 태아 섬유아세포를 이전에 설명된 바와 같이 배양하고(상기 문헌 [Kuroiwa et al.), 진펄서(GenePulser) II(바이오라드(Bio-rad))를 사용하여 550 V 및 50 μF에서 각각의 표적 벡터 30 ㎍으로 전기천공하였다. 48시간 후, 세포들을 2 주 동안 500 ㎍/ml의 G418 또는 1 ㎍/ml의 퓨로마이신 하에서 선별하고, 약물 내성 콜로니들을 떠내고 레플리카 플레이트로 옮겼다. 하나는 게놈 DNA 추출용(24-웰 플레이트)이고, 다른 하나는 배아 클로닝용(48-웰 플레이트)이었다.
게놈
PCR
분석
레플리카 24-웰 플레이트로부터, 송아지로부터의 태아 또는 귀 생검 게놈 DNA를 퓨어진(Puregene) DNA 추출 키트(젠트라시스템(GentraSystem)를 사용하여 추출하였다. IgμU 표적에서 일어나는 각각의 상동 재조합 사건을 확인하기 위해, puroF2 (5'-GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGC-3', 서열: 7), puroR2 (5'-ATGTACCTCCCAGCTGAGACAGAGGG-3', 서열: 8), neoF3 (5'-TTTGGTCCTGTAGTTTGCTAACACACCC-3', 서열: 9) 및 neoR3 (5'-GGATCAGTGCCTATCACTCCAGGTTG-3', 서열: 10) 프라이머 쌍들을 사용하였다. PCR을 98℃-10초, 68℃-8분을 포함하는 주기를 30회 수행하였다. 음성 PCR을 위해, BCμf (5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3', 서열: 11) 및 BCμr (5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3', 서열: 12)을 98℃-10초, 62℃-30초, 72℃-1분으로 이루어진 PCR 주기 40회 중에 사용하였다. PrP 좌위의 경우, neoF7 (5'-TGTCAAAGAGACACTCCTCATTTGTCTTCC-3', 서열: 13), neoR7 (5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCC-3', 서열: 14), puroF14 (5'-TTGCTCCACCTTCCGTCTTCTGTC-3', 서열: 15) 및 puroR14 (5'-GTTGGCGCCTACCGGTGGATGTTTG-3', 서열: 16) 프라이머 쌍들을 사용하였다. PCR을 98℃-10초, 68℃-5분을 포함하는 주기를 30회 수행하였다. 음성 PCR을 위해, BPrPexF (5'-CCACATAGGCAGTTG GATCC-3', 서열: 17) 및 BPrPexR (5'-ATAAGAGGCCTGCTCATG GC-3', 서열: 18) 프라이머 쌍들을 98℃-10초, 62℃-30초, 72℃-1분으로 이루어진 PCR 주기 40회 중에 사용하였다. Cre-매개된 절단을 탐지하기 위해, PCR을 98℃-10초, 68℃-7분으로 이루어진 PCR 주기 40회 중에 CreExF (5'-CAATAGCAAGTCCAGCCTCATCTGC-3', 서열: 19) 및 CreExR (5'-GTGGTTTCTTCGGTGGAAACAACG-3', 서열: 20) 프라이머 쌍을 사용하였다. 모든 PCR 생성물들을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다.
PCR
생성물 서열분석
상동 재조합이 각 표적화 라운드에서 정확하게 일어났는지 확인하기 위해, 상기 증폭된 PCR 생성물을 서열분석하였다. PCR 생성물을 크로마 스핀(CHROMA SPIN)-TE400 컬럼(BD 바이오사이언스 클론테크(BD Biosciences Clontech))을 통해 정제하고, 서열분석을 위해 ACGT 사(일리노이주 휠링)로 보냈다. 서열분석은 PCR에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머 모두를 사용하여 양방향으로 수행되었다. 각 KO 벡터가 통합된 대립유전자를 PCR 생성물 서열의 다형성에 의해 결정하였다.
가투과성화 세포 이식
앞서 설명된 바와 같은(문헌 [Sullivan et al. (2004) Biol. Reprod. 70: 146-153) 가투과성화 세포 이식 방법을 사용하여 클로닝된 태아 및 송아지를 만들었다. 시험관 내 성숙된 난자를 성숙 후 20 시간에 탈핵시켰다. 37℃ H2O 배쓰 중에서 30분 동안 100 ㎕ HBSS 중에 31.2 U 스트렙톨라이신 O(SLO; 시그마(Sigma))와 함께 현탁된 약 50,000 - 100,000개의 세포들을 인큐베이션시킴으로써, 정확하게 표적화된 클론들을 가투과성화시켰다.
가투과성화된 세포들을 침강시키고, 세정하고, 38℃에서 30분 동안 ATP 생성 계(1 mM ATP, 10 mM 크레아틴 인산 및 25 ㎍/ml 크레아틴 키나제)를 함유하는 40 ㎕의 유사분열 추출물로 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 반응 혼합물을 희석하고, 침강시키고, 세정하였다.
이 세포들을 탈핵된 난자와 융합시키고, 성숙 후 28 시간에 4분 동안 5 μM 칼슘 이온운반체로, 그 후 5시간 동안 10 ㎍/ml 시클로헥시미드 및 2.5 ㎍/ml 시토칼라신 D로 활성화시켰다. 활성화 후, 배아를 세정하고, 시험관 내에서 배반포 단계까지 마우스 태아 섬유아세포와 함께 배양시켰다. 1 등급 및 2 등급 배반포를 선별하고, 동기화된 수용체 내로 이식시켰다. 모든 동물 작업은 트랜소바 유전학 연구소 동물 관리 사용 위원회(Transova Genetics Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 이루어졌다.
RT
-
PCR
RNA를 알엔이지(RNeasy) 미니 키트(키아젠; Qiagen)를 사용하여 야생형(#6939) 및 IgμU-/- 태아의 비장으로부터 추출하고, RT-PCR용 수퍼스크립트 제1 사슬 합성 시스템(superscript first strand synthesis)(인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 cDNA 제1 사슬 합성을 수행하였다. BCμf (5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3', 서열: 21) 및 BCμr (5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3', 서열: 22) 프라이머들을 사용하여, 98℃-10초, 62℃-30초, 72℃-1분으로 이루어진 PCR 주기를 40회 수행하였다. 또한, #4658 (IgμU-/-), #8443 (IgμU-/-/PrP-/+) 및 이중 동형접합 KO (IgμU-/-/PrP-/-) 섬유아세포로부터 RNA를 추출하였고, 상기와 같이 cDNA 제1 사슬 합성을 수행하였다. PrPmF3 (5'-CAAAACCTGGAGGAGGATGG-3', 서열: 23) 및 PrPmR3 (5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3', 서열: 24) 프라이머를 사용하여 98℃-10초, 62℃-30초, 72℃-1분의 PCR 주기를 40회 수행하였다. 소 α-액틴 mRNA 발현을 탐지하기 위해, bBAF (5'-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3', 서열: 25) 및 bBAR (5'-AACCGACTGCTGTCACCTTC-3', 서열: 26) 프라이머들을 동일한 PCR 조건 중에 사용하였다. 게놈 DNA 오염의 가능성을 배제하기 위해, 다른 RT-PCR을 역전사효소 없이 수행하였다. PCR 생성물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다.
실시예
4:
Ig
μ
AY
확인
IgμU-/- 섬유아세포를 분석하는 동안, IgμU-/-를 증폭하기 위해 설계된 프라이머들에 의해 탐지될 수 있는 전사체의 발현을 확인하였다. 이 전사체가 무엇인지 결정하기 위해, 전체 RNA를 임신 90 일에 수집된 IgμU-/- 태아의 비장으로부터 알엔이지 미니 키트(키아젠)을 사용하여 추출하였다. 전체 RNA 1 마이크로리터를 제1 사슬 cDNA 합성(RT-PCT용 수퍼스퍼스크립트 제1 사슬 합성 시스템, 인비트로젠), 이어서 하기와 같이 수행되는 RT-PCR에 적용하였다. 사용된 프라이머 쌍은 5'-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3' (BCμf; 서열: 27) 및 5'- TGGAGTGAAATCAG GTGAAGG-3' (BCμr; 서열: 28)이었다. PCR 반응 혼합물은 32.5 ㎕의 물, 5 ㎕의 10X Ex Taq 완충액 (타카라(TAKARA)), 8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 제1 사슬 cDNA, 및 0.5 ㎕의 Ex Taq (타카라)을 함유하였다. 하기 조건에서 반응 혼합물을 인큐베이션시킴으로써 PCR 주기를 35회 수행하였다: 3분 동안 85℃, 1분 동안 94℃, 10초 동안 98℃, 30초 동안 62℃ 및 1분 동안 72℃. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다. IgμU-/- 태아에는 양성 PCR 생성물이 없었다. 하지만, 5'-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3' (BCμf2; 서열: 30) 및 5'-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3' (BCμr2; 서열: 31)의 다른 프라이머 쌍을 RT-PCR에 사용한 경우, 양성 PCR 생성물이 IgμU-/- 태아에서 탐지되었다 (도 10). 이러한 불일치의 원인을 결정하기 위해, 각각의 프라이머 서열을 BLAST로 분석하였다. 그 결과들은 BCμf 프라이머 서열이 U63637.2에 해당하는 소 Igμ 서열에 특이적이라는 것을 보여주었다. 반면에, BCμf2 및 BCμr2 서열은 U63637.2 및 U63637.2의 다형성 변이체로서 이전에 보고되었던 다른 서열 AY230207에 들어맞았다. 본 발명자들은 U63637.2 및 AY23027은 동일한 유전자의 다형성 변이체가 아니고, 소에 있는 상이한 Igμ 유전자들이라고 결론내었다. U63637.2 Igμ 유전자를 IgμU, AY230207을 IgμAY로 불렀다.
IgμAY 및 IgμU 유전자들 모두 VDJ 재배열 후에 발현되는지를 결정하기 위해, mRNA를 #6939 (원 세포주)-유래된 IgμU-/- 태아의 비장으로부터 유사하게 추출하였다. 85℃-3분, 94℃-1분, 98℃-10초, 62℃-30초 및 72℃-1분의 조건으로 이루어진 RT-PCR 주기 35회를 5'-CCCTCCTCTTTGTGCTGTCA-3' (BL17; 서열: 32) 및 5'-GTTCAGGCCATCATAGGAGG-3' (mBCμ-R2; 서열: 33)를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 크로마 스핀 TE- 100 컬럼(BD)을 통해 정제하고, ACGT 사로 보내, mBCμ-R2 프라이머로 이들을 직접 서열분석하였다. 서열 피크 차트에 따르면, #6939 태아에서는 IgμAY 전사체가 주로 발현되었고, 추가로 아주 소량의 IgμU가 발현되었으며, 이는 IgμAY 및 IgμU 모두 VDJ 재배열을 거치고 발현되었으며, 이들 모두 전사의 관점에서 기능적이라는 것을 보여준다(도 11). 하지만, IgμU KO 태아에서는, VDJ 재배열 후 발현된 것은 IgμAY이었다 (도 11).
실시예 5: IgμAY의 돌연변이
IgμAY KO 벡터를 하기와 같이 생성하였다. IgμAY 유전자의 엑손 2 주위의 게놈 DNA를 단리하기 위해, DNA 프로브를 5'- TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3' (서열 34) 및 5'-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3' (서열 35) (BCμ-f2 및 BCμ-r2)를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 이 프로브를 사용하여, #4658 IgμU 동형접합 KO 세포주로부터 유래한 소(홀스타인) 게놈 λ 파지 라이브러리들을 스크리닝하고, 83개의 양성 λ 파지 클론들을 확인하였다. 이 클론들은 온전한 IgμAY 유전자의 대립유전자 모두와 표적화된 IgμU 유전자의 대립유전자 모두를 함유하여야 한다. 온전한 IgμAY 클론과 표적화된 IgμU 클론을 구별하기 위해, 각 클론에서 단리된 λDNA를 BCμ-f2 및 BCμ-r2 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 적용하였다. 표적화된 IgμU 유전자를 함유하는 클론의 경우, PCR 생성물은 엑손 2에서 통합된 KO 카세트의 존재로 인해 증폭될 수 없다. 반면에, PCR 생성물은 온전한 IgμAY 좌위로부터는 증폭될 수 있으며, PCR 생성물을 만드는 클론은 온전한 IgμAY 유전자를 포함하는 것이어야 하지만, PCR 생성물을 만들지 않는 클론은 표적화된 IgμU 유전자를 포함하는 것이어야 한다. 83개의 λ 파지 클론들 중, 26개가 PCR 생성물을 만들었고, 이들은 서열에 의해 온전한 IgμAY 유전자를 함유하는 클론들로 확인되었다 (프라이머 AYU-F2; 5'-GGCTGACTCCCTACCTCCCCTACAC-3' (서열 36)). PCR 생성물을 만들지 않은 다른 10개 이상의 클론들은 표적화된 IgμU 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌고, 서열로 확인되었다 (프라이머 AYU-F2). 상기는 소에 2 이상의 Igμ 유전자가 존재하고, 한 유전자(IgμU로 불리는 것)는 본 방법의 KO 세포주(#4658)에서 파괴되었지만, 다른 유전자(IgμAY)는 여전히 온전하다는 것을 보여준다(도 12).
IgμAY의 대립유전자 모두를 구별하기 위해, 프라이머 AYU5' (5'-CGGAGCCCCTGGAGATGAGC-3') (서열 37)를 사용하여 모든 λ 파지 DNA를 서열분석하였다. 이 서열에 따라, IgμAY 유전자의 대립유전자들을 차별화시키는 다형성 서열을 발견하였고, 이를 AY 대립유전자 및 ay 대립유전자로 명명하였다 (도 13). 26개의 클론들 중, 5개의 클론들은 AY 대립유전자를 함유하였고, 21개의 클론들은 ay 대립유전자를 함유하였다. AY- 또는 ay-특이적인 KO 벡터를 구축하기 위하여, AY에 대해서는 #37 클론을, ay에 대해서는 #49 클론을 선택하였다. #37 및 #49 각각을 제한효소 매핑으로 추가로 분석하였다. 모든 CμAY 엑손을 함유하는 9 킬로베이스의 SalI-BamHI 게놈 단편을 Kpnl 부위가 이미 SrfI 부위로 대체된 pBluescript II SK(-) 내로 서브클로닝하였다. 그리고 나서, bsr 및 STOP 카세트 모두를 Cμ의 엑손 2 내에 위치하는 BglII 부위에 삽입하였다. bsr 및 STOP 카세트 모두는 IgμAY 유전자에 관해 센스 사슬 방향으로 존재하였다. 그리고 나서, 디프테리아 톡신 유전자(DT-A, 집코(Gibco))를 pBluescript II SK(-)의 NotI 부위에 첨가하였다. 표적 카세트가 랜덤하게 게놈 내에 통합된 세포를 죽이기 위해, DT-A를 표적 카세트 중 bsr 유전자에 대해 정방향으로 삽입하였다 (pBCμAYKObsr 벡터; 도 14). 유사하게, hyg 유전자를 함유하는 ay 대립유전자에 대한 다른 KO 벡터를 구축하였다 (pBCμayKOhyg 벡터; 도 14).
IgμAY KO 벡터를 사용한 IgμU 동형접합 KO 세포주 형질감염을 하기의 표준 전기천공 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 소 태아 섬유아세포를 배양하는데 사용된 배지는 500 ml 알파 MEM (집코, 12561-049), 50 ml 소태아 혈청 (하이-클론(Hy-클론) #ABL13080), 5 ml 페니실린-스트렙토마이신(시그마), 및 1 ml 2-메르캅토에탄올 (집코/BRL #21985-023)을 함유하였다. 형질감염 전날, 세포를 현미경 검사에 의해 측정된 바와 같이, 80-100% 조밀도로 T175 조직 배양 플라스크 상에 시딩하였다. 형질감염 당일에, 약 107개의 소 섬유아세포들을 트립신 처리하고, α-MEM 배지로 한 번 세정하였다. 800 ㎕의 α-MEM 중에 세포를 재현탁시킨 후, 1 mM 스퍼미딘을 함유한 HEPES 완충 염수(HBS) 중에 용해된 30 ㎍의 SrfI-절단된 KO 벡터 (pBCμAYKObsr 벡터)를 세포 현탁액에 첨가하고, 피펫팅으로 잘 혼합시켰다. 세포-DNA 현탁액을 전기천공 큐벳 내로 옮기고, 550 V 및 50 μF에서 전기천공하였다. 그 후, 전기천공된 세포를 혈청으로 보충된 α-MEM 배지가 있는 30개의 48-웰 플레이트 상에 위치시켰다. 48 시간 배양 후, 배지를 10 ㎍/ml의 블라스티시딘을 함유하는 배지로 대체하고, 세포를 2-3 주 동안 배양하여 블라스티시딘 내성 세포를 선별하였다. 선별 후, 100% 조밀도에 가까워진 모든 콜로니들을 2개의 레플리카 플레이트(24-웰 및 48-웰 플레이트), 즉 하나는 게놈 DNA 추출용이고, 다른 하나는 배아 클로닝용인 플레이트로 나누었다. 게놈 DNA를 콜로니로부터 추출하여 PCR에 의해 원하는 상동 재조합 사건이 있었는지 스크리닝하였다.
게놈 DNA를 제조자의 프로토콜에 따라 퓨어진 DNA 단리 키트(젠트라 시스템스)를 사용하여 각 24-웰로부터 독립적으로 추출하였다. 각 게놈 DNA 샘플을 20 ㎕의 10 mM 트리스_Cl (pH 8.0) 및 1 mM EDTA (EDTA) 중에 재현탁시켰다. AYKObsrF2 (5'-GGTAGTGCAGTTTCGAATGGACAAAAGG-3'' 서열: 38) 및 AYKObsrR2 (5'-TCAGG ATTTGCAGCACACAGGAGTG-3'; 서열: 39)의 프라이머 쌍을 사용한 PCR에 의해 스크리닝을 수행하였다. 한 프라이머 서열을 KO 벡터 내에 위치시키고, 다른 프라이머 서열을 표적화된 내생 좌위 중 통합된 벡터 바깥에 위치시켰다. 그러므로, 예상되는 PCR 생성물은 KO 벡터가 상동 재조합에 의해 표적화된 좌위 내로 통합되는 경우에만 탐지된다. PCR 반응 혼합물은 17.9 ㎕ 물, 3 ㎕의 1OX LA PCR 완충액 II (Mg2 + 있음), 4.8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol의 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 게놈 DNA, 및 0.3 ㎕의 LA Taq을 함유하였다. 40회의 PCR 주기를 다음 조건 하에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 수행하였다: 85℃-3분, 94℃-1분, 98℃-10초, 및 68℃-8분. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다. 322개의 스크리닝된 클론들 중, 22개의 클론들이 예상되는 PCR 생성물을 생성하였다. PCR 생성물을 서열분석한 결과, AY 대립유전자를 표적화하도록 설계된 KO 벡터만이 모든 클론들에서 AY 대립유전자 내로 통합되었다.
pBCμayKOhyg 벡터 또한 IgμU 동형접합 KO 세포주에 형질감염시켰지만, 이 벡터는 전기천공 전에 SalI으로 절단하였다. 453개의 히그로마이신-내성 콜로니들을 스크리닝한 결과, ayKOhygF2 (5'-TGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGAC-3'; 서열: 40) 및 ayKOhygR2 (5'-TAGG ATATGCAGCACACAGGAGTGTGG-3'; 서열: 41)의 프라이머 쌍들을 사용한 PCR에 의해 29개의 클론들을 양성으로 확인하였다. PCR 생성물들의 서열 분석은 ay 대립유전자를 표적화하도록 설계된 KO 벡터만이 ay 대립유전자 내로 통합되었음을 보여주었다. 상기 결과들로부터 판단해 보면, AY 및 ay KO 벡터 모두 대립유전자-특이적인 방식으로 각 대립유전자를 특이적으로 표적화하고, 7-8%의 빈도로 정확한 표적 클론들을 생성한다고 할 수 있다. 염색질 이식을 하기와 같이 수행하였다. 시험관 내 성숙된 난자를 20 hpm에서 탈핵시켰다. 소 Igμ 넉아웃 섬유아세포를 트립신처리하고, Ca/Mg 행크 균형 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution)(HBSS) 중에서 세정하고, 37℃ H2O 배쓰 내에서 30분 동안 100 ㎕ 중 31.25 유닛의 스트렙톨라이신 O(SLO; 미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마) 중에 50,000-100,000개의 세포들을 인큐베이션함으로써 가투과성화시켰다. 세포 샘플들을 프로피듐 요오다이드로 인큐베이션하고, 형광 현미경으로 관찰하여, 염료 흡수에 기초하여 가투과성화를 모니터링하였다. 가투과성화된 섬유아세포를 세정하고, 펠렛화하고, 37℃ H2O 배쓰 내에서 30분 동안 ATP-생성 계 (1 mM ATP, 10 mM 크레아틴 인산, 및 25 ㎍/ml 크레아틴 키나제)를 함유하는 MDBK 세포들로부터 제조된 40 ㎕의 유사분열 추출물 중에서 인큐베이션하였다. 세포 샘플들을 획스트(Hoechst) 33342로 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하여 염색질 응축을 모니터링하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 반응 혼합물을 500 ㎕의 세포 배양 배지(10% FBS가 있는 알파 MEM)로 희석시켰다. 이 세포들을 펠렛화하고 TL HEPES 중에 재현탁하고, 탈핵된 난자에서의 염색질 이식에 사용하였다. 12개의 태아를 bsrKO 벡터가 IgμAY 유전자의 AY 대립유전자 내로 통합된 반접합성 IgμAY KO 태아로 결정되었다. 마찬가지로, 11개의 태아가 hygKO 벡터가 IgμAY 유전자의 ay 대립유전자 내로 통합된 반접합성 IgμAY KO 태아로 결정되었다. 이 태아들은 또한 IgμU-/-이었다. IgμAY-/+/IgμU-/- 세포 주들 중 하나(A227, AY 대립유전자가 표적화됨)를 PBCμayKOhyg를 이용한 두 번째 표적화 실험에 사용하였다. 197개의 히그로마이신-내성 콜로니들을 스크리닝한 결과, 18개의 클론들을 프라이머 쌍 (ayKOhygF2 및 ayKOhygR2)을 이용한 PCR에 의해 양성으로 확인하였다. PCR 생성물의 서열 분석은 ay 대립유전자를 표적화하도록 설계된 KO 벡터만이 ay 대립유전자 내로 통합되어, 이중 동형접합 넉아웃 (IgμAY-/-/IgμU-/-) 세포를 생성하였다는 것을 보여주었다.
본 발명자들은 본원에서 설명되는 방법을 사용하여, IgμAY-/-/IgμU-/- 태아들을 만들었다. 이 태아들이 B 세포-결핍인지 검사하기 위하여, 임신 180일째에 IgμAY-/-/IgμU-/- 태아들을 수집하였다. 비장으로부터, 전체 RNA를 알엔이지 미니 키트(키아젠)을 사용하여 추출하였다. 전체 RNA 1 마이크로리터를 제1 사슬 cDNA 합성에 적용하고(RTPCR용 수퍼스크립트 제1 서열 합성 시스템, 인비트로젠) 나서, RT-PCR을 수행하였다. 한 번의 RT-PCR 반응을 하기와 같이 수행하였다. 사용된 프라이머 쌍(5'-CCCTCCTCTTTGTGCTGTCA-3' (BL17; 서열: 42) 및 5'- GTTCAGGCCATCATAGGAGG-3' (mBC/μR2 서열: 43))은 IgμAY 및 IgμU 증폭 모두에 상용성이다. PCR 반응 혼합물은 32.5 ㎕의 물, 5 ㎕의 10X Taq 완충액(타카라), 8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol의 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 제1 사슬 cDNA, 및 0.5 ㎕의 Ex Taq(타카라)를 함유하였다. 35회의 PCR 주기를 다음 조건에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 수행하였다: 85℃-30분, 94℃-1분, 98℃-10초, 62℃-30초 및 72℃-1분. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다. IgμAY-/-/IgμU-/- 태아들 중에는 양성 PCR 생성물이 없었다. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다. IgμAY 또는 IgμU 발현을 탐지할 수 없었다. 본 발명자들은 또한 IgM 중쇄 단백질의 존재를 탐지하기 위해, 유동세포계측법을 수행하였다. 그러한 단백질을 탐지할 수 없었다.
IgμU 유전자가 스스로 B 세포 발생을 도울 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 pbCμayKOhyg 및 pbCμAYKObsr 벡터를 사용하여 상기 설명된 바와 유사하게 IgμAY 넉아웃을 만들었다. 한 IgμAY-/- 세포주로부터, 180일째 태아를 만들고, VDJ-재배열된 IgμU 전사체를 탐지하기 위한 시도로 비장 조직 상에서 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCT 생성물의 서열은 IgμU 전사체의 VDJ 서열만을 보여주었고, IgμAY 유전자 발현의 파괴가 확인되었다. 서열 분석으로부터 본 발명자들은 JH-CμL 분절과 결합된 VH 및 DH 분절이 존재할 수 있으며, 이는 상응하는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3 영역을 포함함을 확인하였다. 나아가, RT-PCR 생성물의 직접 서열분석은 IgμU 전사체 뿐 아니라, IgμAY의 CDR3 영역 내의 다양화된 서열을 분명하게 보여주었다. IgμU cDNA의 서열은 특히 FR4 및 일정 영역에 있어 IgμAY와 약간 다른 기능적 IgM-유사 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 보인다. 이 데이터들은 IgμU 유전자가 IgμAY 발현과 독립적으로 발현되고, 그 후 CDR3의 다양화를 포함하는 기능적 VDJ-재배열이 있을 수 있음을 보여준다.
IgμU의 기능적 발현이 IgμAY를 통한 전통적인 경로에 무관하게 B 세포 발생을 충분히 수행시킬 수 있는지 조사하기 위해, 본 발명자들은 IgμAY-/- 180일째 태아에서 유동세포계측 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 대조군에 비해 상당한 양의 발생 중인 B 세포(IgM+B220+)를 확인하였다. 이 결과는 IgμU 단백질이 B 세포 표면 상에 전시될 수 있다는 것을 보여준다. 다음으로, 미성숙 B 세포(IgM+Igλ+)의 생성을 조사하기 위해, 항-소 IgM 폴리클로날 항체 및 항-소 Igλ-모노클로날 항체 모두로 염색하였다. 이중 양성 B 세포가 탐지되었으며, 이는 IgμU 중쇄가 Igλ-경쇄와 커플링되어 B 세포 수용체를 형성하는 미성숙 B 세포의 존재를 말해 준다. 나아가, 본 발명자들은 항-CD21 항체에 의해 인식되는 성숙한 B 세포의 생성을 탐지하였으며, RT-PCR에 의해 VDJ-재배열된 bIgD 유전자의 유전자 발현을 확인하였다. 이 관찰은 IgμU가 성숙한 B 세포 발생을 도울 수 있으며, VDJ-Cδ 유전자의 발현을 유발할 수 있다는 것을 말해준다. 또한, 본 발명자들은, γ 일정 영역 분절이 IgμU 유전자 클러스터의 일부로서 확인되지 않았음에도 불구하고, 클래스 스위칭이 일어나는 것과 VDJ-재배열된 bIgG의 발현을 탐지하였다. 흥미롭게도, IgμAY-/- 태아로부터의 bIgG 전사체의 CDR3의 다양화 정도는 IgμU-/- 태아에서 탐지된 것보다 훨씬 적었다. 하지만, IgμAY-/- 태아의 IgμU 전사체의 CDR3는 IgμU-/- 태아에서의 IgμAY 전사체에 비교될만한 수준으로 다양화되었다. 이 결과는 IgμU가 전통적인 IgμAY 좌위에 비해 많이 다양화된 IgG를 생성하는데 있어 덜 효율적일 수 있으며, 이는 아마도 IgμU 좌위가 bIgG 일정 영역에 시스로 연결되어 있지 않기 때문이라는 것을 보여준다. 이 데이터들은 IgμU가 B 세포 발생 동안에 IgμAY 기능 결여를 크게 대체할 수 있으며, 일부 트랜스-클래스 스위칭 메커니즘에 의해 IgμAY 좌위로부터 γ 일정 영역을 불러올 수 있을 것이라는 것을 강하게 제안한다.
이 결과들로부터, 소에는 2개의 기능적 IgM 좌위, 즉 IgμAY 및 IgμU가 존재하며, 이중 동형접합 넉아웃인 IgμAY-/-/IgμU-/-가 B 세포 결핍에 유용하다는 것을 알 수 있다.
실시예
6:
프리온
단백질이 발현되지 않는 소 제조
본 발명은 프리온 단백질이 발현되지 않는 소를 제조하는 것을 특징으로 한다. PrP-/- 쥐가 생존가능하고 건강해 보이지만, 소에서는 그 유전자를 넉아웃한 효과가 이전에 측정되지 않았다. PrP-/- 소를 만들기 위한 시도로, 본 발명자들은 상기 설명된 소 섬유아세포에 대한 순차적인 유전자 표적 계를 연구하였다. 수컷 홀스타인 섬유아세포(세포 주 4685, IgμU-/-이기도 함)를 넉아웃 벡터(pBPrp(H)Koneo)로 형질감염시키고; 정확하게 표적화된 세포를 클로닝하여 PrP-/+ 세포주를 확립하는데 사용되는 임신 40일째 PrP-/+ 태아를 만들었다. PCR 유전자형분류에 의해 정확한 표적화를 확인하기 위해 태아 세포주를 평가하였다. 그리고 나서, PrP-/+ 세포주를 두 번째 넉아웃 벡터(pBPrp(H)KOpuro)로 형질감염한 후, 선별하고 클로닝하여 PrP-/- 태아 및 세포주를 만들었다. 세포주에서의 정확한 표적화는 PCR 유전자형분류에 의해 확증하였다. 야생형, PrP+/+/IgμU-/- (세포주 5112), 이형접합 넉아웃, PrP-/+/IgμU-/-(세포주 8018), 및 동형접합 넉아웃, PrP-/-/IgμU-/-(세포주 1718) 섬유아세포를 배아 클로닝에 사용하여 송아지를 만들었다 (표 4). 첫 번째 일련의 클로닝에서, 본 발명자들은 PrP+/+/IgμU-/- (송아지 347; 5.9%), PrP-/+/IgμU-/- (송아지341; 4.3%) 및 PrP-/-/IgμU-/- (송아지 342; 3.2%) 세포주로부터 각각 한 마리의 송아지를 얻었다 (도 15).
<표 4> PrP-/- 섬유모세포주로부터 클로닝된 첫 번째 계열의 송아지 제조
| 유전자형 | 세포주 ID | 이식된 수용체 수 | 태어난 송아지 수 (%) | 생존한 송아지 수 (%) |
| PrP+/+/IgμU-/- | 5112 | 17 | 1 (5.9) | 1 (5.9) |
| PrP-/+/IgμU-/- | 8018 | 23 | 2 (8.6) | 1 (4.3) |
| PrP-/-/IgμU-/- | 1718 | 31 | 2 (6.4) | 1 (3.2) |
송아지 341 및 342의 유전자형을 확증하기 위해, 본 발명자들은 각 송아지로부터 작은 피부 생검을 수집하고, 섬유아세포 세포주를 확립하였다 (도 16A). 섬유아세포의 외형 또는 성장률에 있어, 두 넉아웃 유전자형 및 대조군 섬유아세포로부터 어떠한 차이점도 관찰되지 않았다. 각 표적화된 PrP 유전자 대립유전자 (프라이머 쌍; neoF7 x neoR7 및 puroF14 x puroR14; 도 16B)에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 유전자형분류를 수행하고 나서, 확인을 위해 서열 분석을 수행하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 야생형 PrP 대립유전자가 존재하지 않는 것을 확인하기 위해 두 번째 PCR(상기 문헌 Kuroiwa et al.)을 수행하였다 (프라이머 쌍; BPrPex3F x BPrPex3R, 도 16C). 본 결과는 송아지 341이 이형접합 PrP 넉아웃이고, 송아지 342는 동형접합 PrP 넉아웃이라는 것을 확인해 주었다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 야생형 IgμU 대립유전자가 존재하지 않는 것을 확인하기 위해 341 및 342 송아지에서 bCμf x bCμr (도 16D)의 프라이머 쌍을 사용하여 비슷한 PCR 분석을 수행하였고, 기대했던 대로, 모든 네 번의 표적화 사건들이 확인되었다 (PrP-/-/IgμU-/-). 이는 이중 동형접합 넉아웃(PrP-/-/IgμU-/-) 송아지를 처음 제조한 것을 보여주며, 이는 일차 체세포 유전자 표적화 4회 후 배아 클로닝이 살아있는 송아지를 만드는데 상용성이 있다는 것을 보여준다.
송아지 342에서의 PrP 유전자의 기능적 불활성화를 보여주기 위해, 본 발명자들은 섬유아세포로부터 mRNA 및 전체 단백질을 추출하였다. 대조군으로서, 본 발명자들은 PrP+/+/IgμU-/- 송아지 347 및 PrP-/+/IgμU-/- 송아지 341을 분석하였다. mRNA 발현 분석을 위해, 본 발명자들은 RT-PCR(프라이머 쌍; PrPmF3 x PrPmR3, 도 17A)을 수행하고 나서, PrP-/-/IgμU-/- 송아지 342에서 PrP mRNA 발현의 파괴를 확인한 반면, PrP+/+/IgμU-/- 송아지 347 및 PrP-/+/IgμU-/- 송아지 341에서는 완전한 발현을 탐지하였다. 단백질 발현 분석을 위해, 본 발명자들은 마우스 항-소 PrP 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 본 발명자들은 PrP+/+/IgμU-/- 송아지 347 및 PrP-/+/IgμU-/- 송아지 341에 대해 적당한 띠를 탐지하였지만, PrP-/-/IgμU-/- 송아지 342 또는 음성 대조군 마우스 섬유아세포에 대해서는 띠를 관찰하지 못했다 (도 17B). 뿐만 아니라, 본 발명자들은 태어난 지 1주일 내에 죽은 두 마리의 PrP-/- 송아지들로부터 뇌 샘플을 수집하여 그 샘플에 대해 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 뇌 샘플에서는 아무런 PrP-양성 띠가 탐지되지 않았다(도 18). 이 결과는 다른 실험실의 상이한 마우스 항-소 PrP 모노클로날 항체(6H4, 프리오닉스(Prionics))로도 확인하였다. 이 데이터들은 PrP 유전자가 PrP-/-/IgμU-/- 및 PrP-/- 송아지들에서 기능적으로 불활성화되었다는 것을 분명하게 보여준다.
모든 송아지들은 인증된 수의사 또는 훈련된 동물 관리 기술요원에 의해 평가되었다. 1주 및 1달째에, 송아지 341 및 342를 대조군과 함께 다음 파라미터들의 평가를 포함한 소정의 신체검사를 받게 했다: 체중, 체온, 심박수, 심박음, 경정맥 팽창, 호흡률, 호흡음, 기침, 비강분비물 또는 안구 비정상 여부, 식욕, 일반적 행동(경계 및 활동, 느림, 과다활동), 걸음걸이, 자세, 관절, 고창병, 배설물(설사, 변비), 생식기, 및 탯줄(건조, 팽창, 부어오름, 감염). 뿐만 아니라, 표준 혈액학 및 혈청 화학을 위해 혈액 샘플을 취하였다. 현재까지 송아지 341 및 342에 대한 모든 파라미터들은 이들 연령군에 대해 정상이다.
추가적인 확증을 위해, 단지 PrP-/-이고 다른 임의의 유전적 변형이 없는 두 번째 PrP-/- 배아 클론 세트를 만들고, 51마리의 수용체로 이식하였다. 이 이식들로부터, 7마리의 송아지(14%)가 태어났다(표 5). 이 송아지들을, 혈액 생검(도 19)로부터 단리된 말초혈 백혈구(PBL)가 PrP-/-인지 PCR 유전자형분류 및 웨스턴 블롯팅 분석으로 확증하였다. 1주째 송아지의 신체 검사에서 임의의 명백한 비정상도 확인되지 않았고, 현재까지 PrP-/-/IgμU-/- 및 Prp-/- 송아지 사이에 표현형의 뚜렷한 차이는 없다.
<표 5> PrP-/- 섬유모세포주로부터 클로닝된 첫 번째 일련의 송아지 제조
| 유전자형 | 세포주 ID | 이식된 수용체 수 | 태어난 송아지 수 (%) | 생존한 송아지 수 (%) |
| PrP-/- | 5211 | 30 | 7 (23) | 5 (16) |
| PrP-/- | 5232 | 21 | 3 (14) | 2 (10) |
방법
실시예 6에 설명된 결과들은 하기 방법을 사용하여 얻었다.
배아
클로닝
염색질 이식 방법을 사용하여 클로닝된 송아지들을 만들었다. 시험관 내 성숙된 난자들을 성숙 후 20시간에 탈핵시켰다. 37℃ H2O 배쓰 내에서 30분 동안 100 ㎕ HBSS 중 31.2 U의 스트렙톨라이신 O(SLO; 시그마)와 함께 약 50,000-100,000개의 세포들을 인큐베이션함으로써 정확하게 표적화된 클론들을 가투과성화시켰다. 가투과성화된 세포들을 침강시키고, 세정하고, 38℃에서 30분 동안 ATP 생성 계(1 mM ATP, 10 mM 크레아틴 인산 및 25 ㎍/ml 크레아틴 키나제)를 함유하는 40 ㎕의 유사분열 추출물로 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 반응 혼합물을 희석하고, 침강시키고, 세정하였다. 이 세포들을 탈핵된 난자와 융합시키고, 성숙 후 28 시간에 4분 동안 5 μM 칼슘 이온운반체로, 그 후 5시간 동안 10 ㎍/ml 시클로헥시미드 및 2.5 ㎍/ml 시토칼라신 D로 활성화시켰다. 활성화 후, CT 배아를 세정하고, 시험관 내에서 배반포 단계까지 마우스 태아 섬유아세포와 함께 배양시켰다. 1 등급 및 2 등급 배반포를 선별하고, 동기화된 수용체 내로 이식시켰다. 본 섹션에서 설명된 모든 동물 작업은 트랜소바 유전학 연구소 동물 관리 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 이루어졌다.
세포 배양 및 형질감염
수컷 홀스타인 태아 섬유아세포를 배양하고, 진펄서 II(바이오라드)를 사용하여 550 V 및 50 μF에서 각각의 넉아웃 벡터 30 ㎍으로 전기천공하였다. 48시간 후, 세포들을 2 주 동안 500 ㎍/ml의 G418 또는 1 ㎍/ml의 퓨로마이신을 사용하여 선별하고, 약물 내성 콜로니들을 떠내고 레플리카 플레이트로 옮겼다. 하나는 게놈 DNA 추출용(24-웰 플레이트)이고, 다른 하나는 배아 클로닝용(48-웰 플레이트)이었다.
게놈
PCR
분석
게놈 DNA를 퓨어진 DNA 단리 키트(젠트라 시스템스) 및 제조자의 프로토콜을 사용하여 PrP-/- 동형접합 KO 송아지의 귀 생검 또는 혈액으로부터 얻은 섬유아세포로부터 추출하였다. 각 게놈 DNA 샘플을 50-100 ㎕의 10 mM 트리스-Cl(pH 8.0) 및 1 mM EDTA(EDTA) 중에 재현탁시켰다. 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 확인 과정을 수행하였다. neoF7; 5'- TGTCAAAGAGACACTCCTCATTTGTCTTCC-3' (서열 44) 및 neoR7; 5'- TCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCC-3' (SEQ ID, NO: 45)를 사용하여 첫 번째 표적 대립유전자를 탐지하고, puroF14; 5'- TTGCTCCACCTTCCGTCTTCTGTC-3' (서열 46) 및 puroR14; 5'- GTTGGCGCCTACCGGTGGATGTG-3' (서열 47)을 사용하여 두 번째 표적 대립유전자를 탐지하였다. PCR 혼합물은 17.9 ㎕ 물, 3 ㎕의 10X LA PCR 완충액 II (Mg2 + 있음), 4.8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol의 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 게놈 DNA, 및 0.3 ㎕의 LA Taq를 함유하였다. 30회의 PCR 주기를 하기 조건에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 수행하였다: 85℃-3분, 94℃-1분, 98℃-10초, 및 68℃-5분. 뿐만 아니라, BPrPex3F; 5'-CCACATAGGCAGTTGGATCC-3' (서열 48) 및 BPrPex3R; 5'-ATAAGAGGCC TGCTCATGGC-3' (서열 49)의 프라이머 쌍을 사용한 PCR을 따로 수행하여 (i) 야생형 PrP 대립유전자가 존재하지 않음을 확인하고, BCμf; 5'- TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3' (서열 50) 및 BCμr; 5'-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3' (서열 51)의 프라이머 쌍을 사용하여 IgμU 대립유전자(PrP-/-/IgμU-/- 송아지의 경우에만)가 존재하지 않음을 확인하였다. PCR 반응 혼합물은 17.9 ㎕ 물, 3 ㎕의 l0X Ex Taq 완충액, 4.8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 게놈 DNA, 및 0.3 ㎕의 Ex Taq를 함유하였다. 30회의 PCR 주기를 하기 조건에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 수행하였다: 85℃-3분, 94℃-1분, 98℃-10초, 60-62℃-30초, 및 72℃-1분. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다.
RT
-
PCR
생검 샘플로부터, 알엔이지 미니 키트(키아젠)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 1 마이크로리터의 전체 RNA를 제1 사슬 cDNA 합성(RT-PCT용 수퍼스크립트 제1 사슬 합성 시스템; 인비트로젠)에 적용시키고, 그 후 RT-PCT을 수행하였다. RT-PCT은 5'-AAGAAGCGACCAAAACCTGG-3' (서열 52) 및 5'- GTAACGGTGCAT GTTTTCACG-3' (서열 53)의 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다. PCT 반응 혼합물은 32.5 ㎕ 물, 5 ㎕의 l0X Ex Taq 완충액 (타카라), 8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 제1 사슬 cDNA, 및 0.5 ㎕의 Ex Taq (타카라)를 함유하였다. 35회의 PCR 주기를 하기 조건에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 수행하였다: 85℃-3분, 94℃-1분, 98℃-10초, 62℃-30초 및 72℃-1분. 소 β-액틴 mRNA 발현을 탐지하기 위해, bBAF (5'-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3'; 서열: 54) 및 bBAR (5'-AACC GACTGCTGTCACCTTC-3'; 서열: 55)의 프라이머를 동일한 PCR 조건 하에서 사용하였다. 게놈 DNA 오염의 가능성을 배제하기 위해, 역전사효소 없는 다른 세트의 RT-PCT 반응을 또한 수행하였다. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다. PrP-/- 또는 PrP-/-/IgμU-/- KO 송아지로부터 얻은 어떠한 생검 샘플에서도 양성 PCR 생성물은 존재하지 않았다. 이 결과는 송아지에서 프리온 유전자가 완전히 발현되지 않는다는 것을 확증하는 것이었다.
웨스턴
블롯팅
살아있는 송아지의 생검 또는 혈액 샘플 또는 죽은 송아지의 뇌 샘플로부터, 전체 단백질을 추출하고, 단백질 함량을 바이오라드 단백질 분석 시약을 사용하여 정량하였다. 웨스턴 블롯팅 분석을 비환원 조건의 12% SDS PAGE 겔 상에서 약 75 ㎍의 단백질 샘플을 전기영동함으로써 수행하였다. 그리고 나서 단백질들을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 막을 항-소 프리온 단백질 모노클로날 항체(F 89/160.1.5; 알렉시스 바이오케미칼스(Alexis Biochemicals))를 일차 항체로서 염색하고, 마우스 IgG(R+L)에 대한 퍼옥시다제-표지된 친화도 정제된 항체로 이차 염색하였다. 염색된 막을 ECL 플러스 웨스턴 블롯팅 탐지 시스템(아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience))을 사용하여 현상하고, 필름 현상액으로 바이오맥스(Biomax) 광 필름에 노출시켰다. 양성 대조군으로서, 재조합 소 PrP 단백질(알렉시스 바이오케미칼스)을 사용하였다. 음성 대조군으로서, 뮤린 섬유아세포로부터의 단백질 추출물을 분석하였다. 내부 양성 대조군으로서, 동일한 블럿을 항-CDC2 모노클로날 항체로 비슷하게 염색하였다. PrP-/- 또는 PrP-/-/IgμU-/- KO 송아지로부터 얻은 어떠한 생검 샘플에서도 프리온 단백질 띠가 탐지되지 않았다. 이 결과는 송아지에서 프리온 단백질이 완전히 발현되지 않는다는 것을 확증하는 것이었다.
실시예
7:
프리온
단백질 및
IgM
중쇄가
발현되지 않는 소 제조
하기 표준적인 전기천공 프로토콜을 사용하여 IgμU-/-PrP-/- 세포주 8454를 pBCμAYKObsr 벡터로 형질감염시켰다. 소 태아 섬유아세포를 배양하는데 사용한 배지는 500 ml 알파 MEM (집코, 12561-049), 50 ml 소 태아 혈청 (하이-클론(Hy-Clone) #ABL13080), 5 ml 페니실린-스트렙토마이신 (시그마), 및 1 ml의 2-메르캅토에탄올 (집코/BRL #21985-023)을 함유하였다. 형질감염 전날, 세포를 현미경 검사에 의해 측정된 바와 같이, 80-100% 조밀도로 T175 조직 배양 플라스크 상에 시딩하였다. 형질감염 당일에, 약 107개의 소 섬유아세포들을 트립신 처리하고, α-MEM 배지로 한 번 세정하였다. 800 ㎕의 α-MEM 중에 세포를 재현탁시킨 후, 1 mM 스퍼미딘을 함유한 HEPES 완충 염수(HBS) 중에 용해된 30 ㎍의 SrfI-절단된 KO 벡터 (pBCμAYKObsr 벡터)를 세포 현탁액에 첨가하고, 피펫팅으로 잘 혼합시켰다. 세포-DNA 현탁액을 전기천공 큐벳 내로 옮기고, 550 V 및 50 μF에서 전기천공하였다. 그 후, 전기천공된 세포를 혈청으로 보충된 α-MEM 배지가 있는 30개의 48-웰 플레이트 상에 위치시켰다. 48 시간 배양 후, 배지를 10 ㎍/ml의 블라스티시딘을 함유하는 배지로 대체하고, 세포를 2-3 주 동안 배양하여 블라스티시딘 내성 세포를 선별하였다. 선별 후, 100% 조밀도에 가까워진 모든 콜로니들을 2개의 레플리카 플레이트(24-웰 및 48-웰 플레이트), 즉 하나는 게놈 DNA 추출용이고, 다른 하나는 핵 이식용인 플레이트로 나누었다. 게놈 DNA를 콜로니로부터 추출하여 PCR에 의해 원하는 상동 재조합 사건이 있었는지 스크리닝하였다.
상기 설명된 바와 같이, 게놈 DNA를 제조자의 프로토콜에 따라 퓨어진 DNA 단리 키트(젠트라 시스템스)를 사용하여 각 24-웰로부터 독립적으로 추출하였다. 각 게놈 DNA 샘플을 20 ㎕의 10 mM 트리스-Cl (pH 8.0) 및 1 mM EDTA (EDTA) 중에 재현탁시켰다. PCR에 의한 스크리닝을 AYKObsrF2 (5'-GGTAGTGCAGTTTCGAATGGACAAAAGG-3'; 서열: 56) 및 AYKObsrR2 (5'-TCAGG ATTTGCAGCACACAGGAGTG-3'; 서열: 57)의 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다. 한 프라이머 서열을 KO 벡터 중에 위치시키고, 다른 프라이머 서열을 표적화된 내생 좌위 중 통합된 벡터 바깥에 위치시켰다. 그러므로, 예상되는 PCR 생성물은 KO 벡터가 상동 재조합에 의해 표적화된 좌위 내로 통합되는 경우에만 탐지된다. PCR 반응 혼합물은 17.9 ㎕ 물, 3 ㎕의 1OX LA PCR 완충액 II (Mg2 + 있음), 4.8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol의 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 게놈 DNA, 및 0.3 ㎕의 LA Taq을 함유하였다. 40회의 PCR 주기를 다음 조건 하에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 수행하였다: 85℃-3분, 94℃-1분, 98℃-10초, 및 68℃-8분. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다. 198개의 스크리닝된 클론들 중, 14개의 클론들이 예상되는 PCR 생성물을 생성하였다. PCR 생성물을 서열분석한 결과, AY 대립유전자를 표적화하도록 설계된 KO 벡터만이 모든 클론들에서 AY 대립유전자 내로 통합되었다.
상기 넉아웃(IgμAY -/+IgμU-/-PrP-/-) 세포들 또는 이 세포들로부터의 핵들을 본원에 설명된 핵 이식 방법 중 임의의 것에 사용하여 IgμAY-/+IgμU-/-PrP-/- 넉아웃 유제류(예를 들어, 넉아웃 송아지)를 만들었다. 원하는 경우, 넉아웃 태아 또는 살아있는 유제류로부터의 세포를 하기 설명된 바와 같이 사용하여 동형접합 프리온 넉아웃 세포를 만들 수 있다. 한 가지 특정 방법에서, 섬유아세포(예를 들어, 일차 소 태아 섬유아세포)를 18시간 동안 1 ㎍/ml 노코다졸로 유사분열 중에 동기화시키고, 유사분열 진탕분리(mitotic shake-off)에 의해 수확하고, 인산 완충 염수 중에 2번, 세포 용균 완충액(20 mM Hepes, pH 8.2, 5 mM MgCl2, 10 mM EDTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제) 중에 1번 세정하였다. 침강된 세포들을 한 부피의 빙냉 세포 용균 완충액 중에 재현탁시키고, 1시간 동안 얼음 상에서 팽윤시키고, 밀착 유리 유봉을 사용하여 다운스-균질화시켰다. 용균액을 4℃에서 15분 동안 15,000 x g에서 원심분리하고, 상등액(유사분열 추출물)을 분취하고, 액체 질소 중에 냉동시키고, -80℃에 보관하였다. 신선한 또는 냉동된 추출물을 사용하였다. 시험관 내 성숙된 난자를 20 hpm에서 탈핵시켰다. 선별된 콜로니들로부터의 형질감염된 소 태아 섬유아세포들을 Ca2 +/Mg2 + 없는 행크 균형 염 용액(HBSS) 중에서 세정하고, 약 37℃의 H2O 배쓰 내에서 30분 동안 100 ㎕ HBSS 중 31.2 U의 스트렙톨라이신 O(SLO; 미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마)와 함께 현탁된 세포들을 인큐베이션함으로써 가투과성화시켰다. 막 불투과성 DNA 염색제인 프로피듐 요오다이드(0.1 ㎍/ml)의 흡수에 의해 가투과성화를 측정하였다. 가투과성화된 섬유아세포를 침강시키고, 세정하고, 약 37℃에서 30-45분 동안 ATP 계 (1 mM ATP, 10 mM 크레아틴 인산, 및 25 ㎍/ml 크레아틴 키나제)를 함유하는 40 ㎕의 유사분열 추출물 중에서 인큐베이션하였다. 분취액들을 0.1 ㎍/ml의 획스트 33342로 표지하고, 염색질 응축을 모니터링하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 반응 혼합물을 500 ㎕의 알파 MEM/10% 소태아 혈청(하이클론(Hyclone)으로 희석시켰다. 세포들을 탈핵된 난자와 융합시키고, 난자를 28 hpm에서 활성화시키고, 배아를 시험관 내에서 배반포 단계까지 배양하였다. 암컷 수용체 당 2개의 배아를 이식하였다. 초음파 검사로 임신 여부를 모니터링하고, C-섹션을 수용체에 대해 수행하여 세포주를 만들기 위한 태아를 회수하였다.
pBCμayKOhyg 벡터를 상기 IgμAY-/+IgμU-/-PrP-/- 세포주에 형질감염시켰지만, 이 벡터는 전기천공 전에 SalI으로 절단하였다. 119개의 히그로마이신-내성 콜로니들을 스크리닝한 결과, 4개의 클론들을 ayKOhygF2 (5'-TGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGAC-3'; 서열: 58) 및 ayKOhygR2 (5'-TAGG ATATGCAGCACACAGGAGTGTGG-3'; 서열: 59)의 프라이머 쌍들을 사용하여 PCR에 의해 양성으로 확인하였다. PCR 생성물들의 서열 분석은 ay 대립유전자를 표적화하도록 설계된 KO 벡터만이 ay 대립유전자 내로 통합되었음을 보여주었다. 상기 결과들로부터, 본 발명자들은 AY 및 ay KO 벡터 모두 대립유전자-특이적인 방식으로 각 대립유전자를 특이적으로 표적화하고, 정확한 표적 클론들을 생성할 수 있다고 결론내렸다.
본원에서 설명된 방법을 사용하여, 본 발명자들은 확인된 IgμAY-/-IgμU-/-PrP-/- 콜로니들로부터 염색질 이식을 수행하고, 결국 4개의 IgμAY-/-IgμU-/-PrP-/- 태아들을 만들었으며, 이로부터 4개의 세포주들을 확립하였다. 또한, 본 발명자들은 한 마리의 IgμAY-/-IgμU-/-PrP-/- 송아지를 얻었다. 유전자형분류는 하기와 같이 수행하였다. 게놈 DNA를 제조자의 프로토콜에 따라 퓨어진 DNA 단리 키트(젠트라 시스템스)를 사용하여 IgμAY-/-IgμU-/-PrP-/- 삼중 동형접합 KO 송아지의 귀 생검 또는 혈액으로부터 얻은 섬유아세포로부터 추출하였다. 각 게놈 DNA 샘플을 50-100 ㎕의 10 mM 트리스-Cl (pH 8.0) 및 1 mM EDTA (EDTA) 중에 재현탁시켰다. IgμAY 및 IgμU의 증폭 모두에 상용성인 5'-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3' (BCμf2; 서열: 60) 및 5'-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3' (BCμr2; 서열: 61) 프라이머 쌍을 사용한 PCR을 수행하여, IgμAY 및 IgμU 유전자의 야생형 대립유전자가 존재하지 않음을 확인하였고, 다른 BPrPex3F (5'-CCACATAGGCAGTTGGATCC-3' (서열 629) 및 BPrPex3R (5'-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3' (서열 63) 프라이머 쌍을 사용하여 PrP 유전자의 야생형 대립유전자가 존재하지 않음을 확인하였다. PCR 반응 혼합물은 17.9 ㎕ 물, 3 ㎕의 10X Ex Taq 완충액, 4.8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 게놈 DNA, 및 0.3 ㎕의 Ex Taq를 함유하였다. 30회의 PCR 주기를 하기 조건에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 수행하였다: 85℃-3분, 94℃-1분, 98℃-10초, 60-62℃-30초 및 72℃-1분. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다. 결과들은 태어난 송아지가 IgμAY-/- Ig μU-/-PrP-/-라는 것을 보여주었다.
실시예
8:
Ig
μ
AY
-/-
Ig
μ
U
-/-
PrP
-/-
삼중 동형접합
KO
송아지에서
프리온
단백질이 발현되지 않음을 확증
IgμAY-/- Ig μU-/-PrP-/- 삼중 동형접합 KO 송아지로부터 취한 혈액 샘플로부터, 전체 단백질을 추출하고, 단백질 함량을 바이오라드 단백질 분석 시약을 사용하여 정량하였다. 웨스턴 블롯팅 분석을 비환원적 조건의 12% SDS 겔 상에서 약 75 mg의 단백질 샘플을 전기영동시킴으로써 수행하였다. 단백질들을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 막을 항-소 프리온 단백질 모노클로날 항체(F 89/160.1.5; 알렉시스 바이오케미칼스)를 일차 항체로서 염색하고, 마우스 IgG(R+L)에 대한 퍼옥시다제-표지된 친화도 정제된 항체로 이차 염색하였다. 염색된 막을 ECL 플러스 웨스턴 블롯팅 탐지 시스템(아머샴 바이오사이언스)을 사용하여 현상하고, 필름 현상액으로 바이오맥스 광 필름에 노출시켰다. 양성 대조군으로서, 재조합 소 PrP 단백질(알렉시스 바이오케미칼스)을 사용하였다. 음성 대조군으로서, 뮤린 섬유아세포로부터의 단백질 추출물을 사용하였다.
IgμAY-/- Ig μU-/-PrP-/- 삼중 동형접합 KO 송아지로부터 얻은 생검 샘플에서는, 어떠한 띠도 항체로 염색되지 않았다. 이 결과는 송아지에서 프리온 단백질이 완전히 발현되지 않는다는 것을 확증하는 것이었다.
실시예
9:
Ig
μ
AY
-/-
Ig
μU
-/-
PrP
-/-
삼중 동형접합
KO
송아지에서
IgM
단백질이 발현되지 않음을 확증
IgμAY-/- Ig μU-/-PrP-/- 삼중 동형접합 KO 송아지에 IgM 단백질이 결여되어 있다는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 하기에 설명된 바와 같은 유동세포계측법을 수행하였다. 경정맥 천자에 의해 갓 태어난 송아지로부터 말초혈을 헤파린처리된 튜브 내로 수집하였다. RBC-용균 완충액(미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마)을 사용하여 적혈구 용균시키고, 멸균 행크 완충 염 용액(HBSS)(미주리주 세이트루이스에 소재한 시그마)으로 2번 세정함으로써 헤파린처리된 혈액으로부터 전체 백혈구(류코사이트(leukocyte))를 단리하였다. 세포를 FACS 염색 배지(4% 말 혈청 또는 염소 혈청, 2 mM EDTA, 및 0.2% 소듐 아자이드를 함유하는 인산 완충 염수) 중에 재현탁시키고, 비특이적 결합을 블로킹하기 위해 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 양 항-소 IgM-FITC (텍사스주 몽고메리에 소재한 베틸 레이버러토리스(Bethyl Laboratories)) 또는 당나귀 항-양/소 Ig-비오틴 항체 (뉴저지주 피스캐터웨이에 소재한 아머샴 바이오사이언스), 그리고 이어서 스트렙타비딘-FITC 또는 스트렙타비딘-PE 이차 항체(캘리포니아주 벌링게임에 소재한 칼택 레이버러토리스(Caltag Laboratories))를 사용하여 B 세포 상의 소 표면 IgM(sIgM)을 표지하였다. 발생하고 있는 소 B 세포 상의 표면 B220 마커를 표지하기 위해, 마우스 항-소 B220 (CD45R) 항체 클론 GS5A (워싱턴주 풀맨에 소재한 VMRD), 그리고 이어서 항-마우스 IgG1-PE 이차 항체(캘리포니아주 벌링게임에 소재한 칼택 레이버러토리스)를 사용하였다. 마우스 항-소 CD21 클론 MCA1424 및 마우스 항-반추동물 CD43 클론 1096 (노스캐롤라이나주 랄레이에 소재한 세로텍(Serotec Inc.)) 항체, 그리고 이어서 항-마우스 IgG1-PE 이차 항체 (캘리포니아주 벌링게임에 소재한 칼택 레이버러토리스)를 사용하여 소 B 세포 상의 표면 CD21 및 CD43 마커를 표지하였다. FACS 염색 배지 중의 106개의 세포(WBC)들을 함유하는 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 V-바닥 마이크로타이터 웰 또는 튜브 중에서 각 표면 마커 항체 단독, 뿐 아니라 그 조합으로 염색하는데 사용하였다. 세포들을 20-30분 동안 실온의 암소에서 일차 항체와 인큐베이션하고, 원심분리에 의해 FACS 세정 완충액 (2mM EDTA 및 0.2% 소듐 아자이드를 함유하는 인산 완충 염수)으로 2번 세정하였다. 세포들을 50 ㎕의 FACS 염색 배지 중에서 다시 재현탁시키고, 실온의 암소에서 15-20분 동안 적당한 형광 표지된 이차 항체들과 인큐베이션하였다. 마지막으로, 세포들을 FACS 세정 완충액으로 2번 세정하고, PBS 중의 2-4% 포름알데히드로 고정시켰다. 그리고 나서, 표면 표지된 고정 세포들을 분석하고, 팩스캔(FACScan) 유동세포계측기(캘리포니아주 샌디에고에 소재한 BD 바이오사이언스(BD Biosciences))로 데이터를 획득하였다. 마지막으로, 리스트 방식 파일 데이터를 윈MDI(WinMDI) 소프트웨어를 사용하여 단일 색상 또는 이중 색상 프로파일로 분석하였다. FACS 결과는 삼중 동형접합 KO 송아지에서 발생 중인 B 세포가 전혀 존재하지 않음을 보여주었다.
실시예
10:
Ig
μ
AY
-/-
/
Ig
μU
-/-
세포주로의
HAC
이식
IgM 수준이 감소된 동물의 한 가지 용도는 이종 항체를 만드는 것이다. 이종 항체를 만드는 한 가지 방법은 항체 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하는 하나 이상의 인간 인공 염색체를 갖는 동물을 만드는 것이다. 이를 위해, ΔΔHAC(λHAC) 및 κHAC를 마이크로셀-매개 염색체 이식(MMCT)(문헌 [Kuroiwa et al. (2000) Nature Biotech. 18:1086-1090]을 사용하여 DT40 세포 하이브리드로부터 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포로 이식하였다. λHAC("ΔΔC10 클론")를 함유하는 CHO 클론을 10% FBS (집코), 1 mg/ml의 G418, 및 0.2 mg/ml의 히그로마이신 B로 보충된 F12(집코) 배지 중에서 배양하였다 (37℃ 및 5% CO2). ΔΔC10 클론을 12개의 T25 플라스크 내로 확장시켰다. 조밀도가 80-90%에 달했을 때, 콜시미드(colcemid)(시그마)를 최종 농도 0.1 ㎍/ml로 배지에 첨가하였다. 3일 후, 배지를 10 ㎍/ml의 시토칼라신 B (시그마)로 보충된 DMEM(집코)로 교환하였다. 플라스크를 8,000 rpm에서 60분 동안 원심분리하여 마이크로셀을 수집하였다. 마이크로셀을 8, 5, 및 3 ㎛ 필터(코스타(Costar))를 통해 정제하고 나서, DMEM 배지 중에 재현탁시켰다. 마이크로셀을 하기에 설명된 바와 같이 소 섬유아세포와의 융합에 사용하였다.
소 태아 섬유아세포를 37℃, 5% CO2에서 10% FBS(집코)로 보충된 α-MEM(집코) 배지 중에서 배양하였다. 섬유아세포를 T175 플라스크에서 확장시켰다. 조밀도가 70-80%에 달했을 때, 세포를 0.05% 트립신으로 플라스크로부터 떨어뜨렸다. 섬유아세포를 DMEM 배지로 2회 세정하고 나서, 마이크로셀 현탁액 위에 부었다. 마이크로셀-섬유아세포 현탁액을 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, PEG1500(로쉬(Roche))을 제조자의 프로토콜에 따라 펠렛에 첨가하여 마이크로셀과 소 섬유아세포가 융합될 수 있게 하였다. 융합 후, 융합된 세포들을 6개의 24-웰 플레이트 내로 위치시키고, 24시간 동안 10% FBS로 보충된 α-MEM 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 배지를 0.8 mg/ml의 G418을 함유하는 배지로 교환하였다. 약 2주 동안 G418 항체 존재 하에서 성장시킨 후, G418 내성있는 융합된 세포들을 선별하였다. 이 G418 내성 클론들을 본원에서 설명된 바와 같이, 염색질 이식에 사용하였다.
실시예
11: 임신 180일째
HAC
/
Ig
μ
AY
-/-
/
Ig
μU
-/-
태아에서의 인간
IgM
,
IgG
, 및
Ig
λ 발현
HAC/IgμAY-/-/IgμU-/- 태아가 IgM, IgG, Igλ 및 Igκ과 같은 인간 면역글로불린을 발현할 수 있는지를 검사하기 위해, 본 발명자들은 임신 180일째의 HAC/IgμAY-/-/IgμU-/- 태아를 수집하였다. 전체 RNA를 알엔이지 미니 키트(키아젠)을 사용함으로써 비장으로부터 추출하였다. 전체 RNA 1 마이크로리터를 제1 사슬 cDNA 합성(RT-PCR용 수퍼스크립트 제1 사슬 합성 시스템, 인비트로젠)에 적용시키고, 그 후 RT-PCR을 수행하였다. 인간 IgM 발현을 탐지하기 위해, RT-PCR 반응을 5'- AGGCCAGCATCTGCGAG GAT-3' (CH3-F3; 서열: 64) 및 5'- GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3' (CH4-R2; 서열: 65) 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다. 인간 IgG 발현에 대해서는 5'-CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3' (서열 66), 5'- CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3' (서열 67), 5'-GAGGTGCA GCTGGTGGAGTCTGG-3' (서열 68), 5'-CAGGTGCAGCTGCAGGAG TCGGG-3' (서열 69), 5'-GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3', 5'-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3' (서열 70), 및 5'-CAGGTGCA GCTGGTGCAGTCTGG-3'(서열 71) (VH 전체 혼합)의 프라이머를 5'- CACCACGCTGCTGAGGGAGTAGAGT-3'(hCg1R2; 서열: 72) 프라이머와 함께 사용하였다. 인간 Igλ 발현에 있어서는, 5'-TCCTCTGAGGAGCTTCAAGC-3' (hCL-F2; 서열: 73) 및 5'-AGGGTTTATTGAGTGCAGGG-3' (hCL-R2; 서열: 74) 프라이머 쌍을 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 32.5 ㎕ 물, 5 ㎕의 10X Ex Taq 완충액 (타카라), 8 ㎕의 dNTP 혼합물, 10 pmol 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 제1 사슬 cDNA, 및 0.5 ㎕의 Ex Taq (타카라)를 함유하였다. 35회의 PCR 주기를 하기 조건에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 수행하였다: 85℃-3분, 94℃-1분, 98℃-10초, 60-62℃-30초 및 72℃-1분. PCR 후, 반응 혼합물을 전기영동에 의해 분석하였다. λHAC/IgμAY-/-/IgμU-/- 태아로부터, RT-PCR에 의해 인간 IgM, IgG, 및 Igλ 발현이 탐지되었다.
인간 면역글로불린이 단백질 수준에서 세포 표면에 발현되는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한, 상기 설명된 바와 같은 유동세포계측법을 수행하였다. 염소 항-인간 IgM-FITC (텍사스주 몽고메리에 소재한 베틸 레이버러토리스), 염소 항-인간 IgM-FITC (노스캐롤라이나주 랄레이에 소재한 세로텍), 또는 염소 항-인간 IgM-PE (노스캐롤라이나주 랄레이에 소재한 세로텍) 항체를 사용하여 180일 이상 된 HAC 태아의 말초혈 B 세포 상에 발현된 인간 sIgM을 표지하였다. B 세포 상에 발현된 경쇄를 탐지하기 위해, 염소 항-인간 람다-FITC 항체 (베틸 레이버러토리스) 또는 염소 항-인간 람다-PE 항체 (세로텍)를 사용하였다. 이중 색상 분석을 위해, FITC-표지된 항-인간 IgM 항체 및 PE-표지된 경쇄 항체 조합을 사용하였다. 본 발명자들은 항-인간 IgM 및 경쇄 항체에 양성인 세포 군을 탐지하였다. 나아가, 본 발명자들은 샌드위치 ELISA 분석법을 수행하여, 친화도 정제된 포획 항체 및 적당한 HRP-효소 표지된 탐지 항체를 사용하여 λHAC/IgμAY-/-/IgμU-/- 송아지에서 분비된 인간 IgG를 탐지하였다. 각 분석법에 있어서의 포획 항체 및 탐지 항체의 세부사항들은 하기 표 6에 나타나 있다.
| 분석법 | 기준물질 ( 보정자 ) | 포획 항체 | 탐지 항체 |
| 인간 IgG ELISA | 인간 기준 혈청 (베틸 레이버러토리스) | 친화도 정제된 염소 항-인간 IgG, 또는 친화도 정제된 염소 항-인간 IgG-Fc 특이적 항체 (베틸 레이버러토리스) | 염소 항-인간 IgG-HRP 접합형 (베틸 레이버러토리스) |
코팅 완충액(0.05 M 탄산나트륨, pH 9.6) 중에 희석된 포획 항체를 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 마이크로타이터 플레이트(넝크 이뮤노맥시소프 엘리사 플레이트(Nunc ImmunoMaxiSorp Elisa plates) 상에서 코팅하였다. 포획 항체를 코팅한 후, 플레이트를 자동화된 플레이트 세정기를 사용하여 인산 완충 염수(PBS)/트윈20 완충액으로 3-5회 세정하였다. 적당한 기준물질(보정자)을 표준 곡선을 그리는 정량용 연속 희석액들 중에 첨가하였다.
양성 대조군 및 음성 대조군을 QC 검사를 위한 모든 분석법 중에 포함시켰다. 그리고 나서, λHAC/IgμAY-/-/IgμU-/- 송아지들로부터의 혈청 샘플을 4개의 연속적으로 희석된 희석액으로서 이중으로 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청 면역글로불린을 포획한 후, 플레이트를 자동화된 플레이트 세정기를 사용하여 다시 PBS-트윈 완충액으로 3-5번 세정하였다. HRP-효소 표지된 적당한 탐지 항체를 모든 웰 내로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 플레이트를 자동화된 플레이트 세정기를 사용하여 PBS/트윈 완충액으로 3-5회 다시 세정하였다. 결합된 항체들을 TMB-기질 용액(매사추세츠주 게티스버그에 소재한 KPL)을 첨가하고, 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션함으로써 탐지하였다. 반응을 10% 인산을 첨가함으로써 종결시켰다. 그리고 나서 KC4 소프트웨어를 사용하여 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 데이터를 KC4 소프트웨어로 분석하고, 값들을 4변수 표준 곡선 상에 내삽함으로써 측정하였다. 생후 14일째에 수집된 혈액 샘플에서, 7.1 ㎍/ml의 인간 IgG가 ELISA에 의해 탐지되었다.
기타 실시태양
본 명세서 중에 인용된 모든 문헌 및 특허들은 그 각각의 개별적인 문헌 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 표시되어 인용문헌에 의해 삽입되어 있는 것처럼 본원에서 인용되고 있다. 상기 발명이 명료한 이해를 위해 예시 및 예증 방식으로 일부 상세하게 설명되어 있지만, 첨부된 청구항의 취지 또는 권리범위를 벗어나지 않으면서 특정 변경법 및 변형법들이 이루어질 수 있다는 것은 본 발명 교시에 비추어 당업자에게 곧바로 명백할 것이다.
Claims (84)
- 게놈에 IgM 중쇄를 코딩하는 2개의 유전자의 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 유제류.
- 제1항에 있어서, 돌연변이 중 1개 이상이 반접합 돌연변이인 트랜스제닉 유제류.
- 제2항에 있어서, 돌연변이 2개 모두가 반접합 돌연변이인 트랜스제닉 유제류.
- 제1항에 있어서, 돌연변이 중 1개 이상이 동형접합 돌연변이인 트랜스제닉 유제류.
- 제4항에 있어서, 돌연변이 2개 모두가 동형접합 돌연변이인 트랜스제닉 유제류.
- 제5항에 있어서, 기능적 IgM 중쇄가 없는 트랜스제닉 유제류.
- 제1항에 있어서, 돌연변이 중 1개 이상이 외래 서열의 삽입에 의한 것인 트 랜스제닉 유제류.
- 대조군 유제류에 비하여 10% 미만의 내생 IgM 중쇄를 생산하고, 게놈에 IgM 중쇄를 코딩하는 유전자의 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 유제류.
- 제8항에 있어서, 상기 돌연변이가 기능적 IgM 중쇄의 발현을 실질적으로 제거하는 것인 트랜스제닉 유제류.
- 제9항에 있어서, 상기 유제류는 소이고, 상기 유전자는 IgμU인 트랜스제닉 유제류.
- 제9항에 있어서, 상기 유제류는 소이고, 상기 유전자는 IgμAY인 트랜스제닉 유제류.
- 제1항에 있어서, PrP 동형접합 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 유제류.
- 제1항에 있어서, 재배열이 일어나고 이종 면역글로불린을 발현하는 이종 면역글로불린 유전자의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 트랜스제닉 유제류.
- 제13항에 있어서, 상기 이종 면역글로불린이 인간 면역글로불린인 트랜스제닉 유제류.
- 제13항에 있어서, 상기 핵산이 염색체 단편 내에 포함되는 것인 트랜스제닉 유제류.
- 제15항에 있어서, 상기 염색체 단편이 ΔHAC, ΔΔHAC 또는 κHAC인 것인 트랜스제닉 유제류.
- 제1항에 있어서, 안정적으로 이식된 인간 조혈모세포를 추가로 포함하는 트랜스제닉 유제류.
- 제1항에 있어서, 안정적으로 이식된 개, 고양이, 쥐 또는 비인간 영장류 조혈모세포를 추가로 포함하는 트랜스제닉 유제류.
- 게놈에 IgM 중쇄를 코딩하는 2개의 유전자의 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 유제류 체세포.
- 제19항에 있어서, 돌연변이 중 1개 이상이 반접합 돌연변이인 트랜스제닉 유제류 체세포.
- 제19항에 있어서, 상기 세포가 소 세포이고, 상기 2개의 유전자가 IgμU 및 IgμAY인 트랜스제닉 유제류 체세포.
- 게놈에 IgμAY의 반접합 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 소 체세포.
- 게놈에 IgμAY의 동형접합 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 소 체세포.
- 제23항에 있어서, 재배열이 일어나고 이종 면역글로불린을 발현하는 이종 면역글로불린 유전자 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 트랜스제닉 소 체세포.
- 제24항에 있어서, 상기 이종 면역글로불린이 인간 면역글로불린인 트랜스제닉 소 체세포.
- 제24항에 있어서, 상기 핵산이 염색체 단편 내에 포함되는 것인 트랜스제닉 소 체세포.
- 제26항에 있어서, 상기 염색체 단편이 ΔHAC, ΔΔHAC 또는 κHAC인 것인 트랜스제닉 소 체세포.
- 제19항에 있어서, 섬유모세포, 상피세포, 내피세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, B-세포, T-세포, 대식세포, 단핵구, 단핵세포, 심근세포, 다른 근육세포, 태반 세포 및 표피세포로부터 선택되는 트랜스제닉 유제류 체세포.
- 제19항에 있어서, PrP의 동형접합 돌연변이를 추가로 포함하는 트랜스제닉 유제류 체세포.
- (a) 재배열이 일어나고 이종 면역글로불린을 발현하는 이종 면역글로불린 유전자 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 제19항에 따른 트랜스제닉 유제류를 제공하는 단계;(b) 상기 유제류에 1종 이상의 대상 항원을 투여하는 단계; 및(c) 상기 유제류로부터 이종 항체를 회수하는 단계를 포함하는 이종 항체의 제조 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 이종 항체가 인간 항체를 포함하는 것인 제조 방법.
- (a) 이식된 이종 조혈모세포를 추가로 포함하는 제19항에 따른 트랜스제닉 유제류를 제공하는 단계; 및(b) 상기 유제류로부터 이종 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 유제류에서의 이종 항체 제조 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 이종 항체가 인간 항체를 포함하는 것인 제조 방법.
- (a) 이식된 이종 조혈모세포를 추가로 포함하는 제19항에 따른 트랜스제닉 유제류를 제공하는 단계; 및(b) 상기 트랜스제닉 유제류에서 상기 이종 조혈모세포가 증식하도록 하는 단계를 포함하는, 이종 조혈모세포의 증식 방법.
- 제34항에 있어서, (c) 상기 트랜스제닉 유제류로부터 단계 (b)의 상기 증식된 조혈모세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 증식 방법.
- (a) 제19항에 따른 트랜스제닉 유제류를 제공하는 단계;(b) 상기 트랜스제닉 유제류에 원하는 동종 또는 이종 조직 또는 기관을 이식하는 단계; 및(c) 상기 유제류에서 상기 조직 또는 기관을 유지하는 단계를 포함하는, 원하는 조직 또는 기관을 생체내에서 유지하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 조직이 피부, 심장, 폐, 췌장, 간 또는 신장 조직을 포함하는 것인 방법.
- 내생 프리온 핵산의 대립 유전자 1개 또는 2개 모두에 비-자연적으로 발생한 돌연변이를 포함하는 소 또는 소 태아.
- 제38항에 있어서, 상기 돌연변이가 기능적 프리온 단백질의 발현을 감소시키는 것인 소 또는 소 태아.
- 제38항에 있어서, 상기 돌연변이가 기능적 프리온 단백질의 발현을 실질적으로 제거하는 것인 소 또는 소 태아.
- 제38항에 있어서, 상기 돌연변이가 반접합인 소 또는 소 태아.
- 제38항에 있어서, 상기 돌연변이가 동형접합인 소 또는 소 태아.
- 제38항에 있어서, 내생 항체의 발현을 감소시키는 돌연변이를 추가로 포함하는 소 또는 소 태아.
- 제43항에 있어서, 상기 돌연변이가 기능적 IgM 중쇄의 발현을 감소시키는 것 인 소 또는 소 태아.
- 제43항에 있어서, 상기 돌연변이가 기능적 IgM 중쇄의 발현을 실질적으로 제거하는 것인 소 또는 소 태아.
- 제38항에 있어서, 수정후 30일 이상된 소 또는 소 태아.
- 제38항에 있어서, 갓 태어난 소 또는 소 태아.
- 제38항에 있어서, 1주령 이상인 소 또는 소 태아.
- 제48항에 있어서, 2월령 이상인 소 또는 소 태아.
- 제38항의 소 또는 소 태아로부터 생산된 산물.
- 제50항에 있어서, 유즙, 젤라틴, 콜라겐 또는 혈청인 산물.
- 제50항에 있어서, 재조합 단백질인 산물.
- 내생 프리온 핵산의 대립 유전자 1개 또는 2개 모두에 비-자연적으로 발생한 돌연변이를 포함하는 소 또는 소 태아 내에서 상기 산물을 제조하거나 그로부터 상기 산물을 수득하는 것을 포함하는, 프리온 단백질이 실질적으로 없는 산물을 생산하는 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 산물이 유즙, 젤라틴, 콜라겐 또는 혈청인 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 산물이 재조합 단백질인 방법.
- (a) 제1 유전적 변형을 포함하는 비인간 포유류 체세포를 제공하는 단계;(b) 상기 세포 또는 그의 자손, 상기 세포 또는 그의 자손의 염색질체, 또는 상기 세포 또는 그의 자손의 핵을 유핵 또는 탈핵 난자에 삽입하는 단계;(c) 단계 (b)에서 수득한 상기 난자 또는 상기 난자로부터 형성된 배아를 수여체에 이식하는 단계;(d) 상기 배아 또는 그로부터 생성된 태아 또는 어린 성체로부터 상기 제1 유전적 변형을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및(e) 상기 세포 또는 그의 자손의 게놈에 제2 유전적 변형을 도입하여, 2개의 유전적 변형을 포함하는 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 2개의 유전적 변형을 포함하는 세포의 제조 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 제1 유전적 변형 또는 상기 제2 유전적 변형이 돌연 변이를 포함하는 것인 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 제1 유전적 변형은 제1 돌연변이를 포함하고, 상기 제2 유전적 변형은 제2 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 제1 돌연변이는 내생 유전자의 제1 대립 유전자 내에 있고, 상기 제2 돌연변이는 내생 유전자의 제2 대립 유전자 내에 있는 것인 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 제1 돌연변이는 제1 내생 유전자의 제1 대립 유전자 내에 있고, 상기 제2 돌연변이는 제2 내생 유전자의 제1 대립 유전자 내에 있는 것인 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 제1 유전적 변형 또는 상기 제2 유전적 변형이 인공 염색체를 포함하는 것인 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 인공 염색체가 항체를 코딩하는 것인 방법.
- 제56항에 있어서, 단계 (e)에서 수득한 세포 또는 그의 자손에서 시작하여 상기 방법을 1회 이상 반복함으로써 추가의 유전적 변형을 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제56항에 있어서, 단계 (a)의 상기 체세포가 태아 세포 또는 성체 세포인 것인 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 태아 또는 성체 세포가 섬유모세포, 상피세포, 신경세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, B-림프구, T-림프구, 적혈구, 대식세포, 단핵구 및 근육세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- (a) 제56항의 방법으로 수득한 세포 또는 그의 자손을 제공하는 단계;(b) 상기 세포 또는 그의 자손, 상기 세포 또는 그의 자손의 염색질체, 또는 상기 세포 또는 그의 자손의 핵을 유핵 또는 탈핵 난자에 삽입하는 단계; 및(c) 상기 난자 또는 상기 난자로부터 형성된 배아를 상기 난자 또는 상기 배아가 포유동물로 발생할 수 있는 조건 하에서 수여체에 이식하여 2개의 유전적 변형을 포함하는 포유동물을 제조하는 단계를 포함하는, 2개의 유전적 변형을 포함하는 비인간 포유동물의 제조 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 포유동물이 유제류인 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 유제류가 소인 방법.
- (a) 제1 유전적 변형을 포함하는 비인간 포유류 체세포를 제공하는 단계;(b) 상기 포유류 체세포를 염색질 응축을 허용하는 조건하에서 가투과성으로 만드는 단계;(c) 상기 가투과성화된 세포를 유핵 또는 탈핵 난자에 삽입하는 단계;(d) 단계 (c)로부터 수득한 상기 난자 또는 상기 난자로부터 형성된 배아를 수여체에 이식하는 단계;(e) 상기 배아 또는 그로부터 생성된 태아 또는 어린 성체로부터 상기 유전적 변형을 포함하는 세포를 단리하는 단계; 및(f) 상기 세포 또는 그의 자손의 게놈에 제2 유전적 변형을 도입하여, 2개의 유전적 변형을 포함하는 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 2개의 유전적 변형을 포함하는 세포의 제조 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 제1 유전적 변형 또는 상기 제2 유전적 변형이 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
- 제70항에 있어서, 상기 제1 유전적 변형이 제1 돌연변이를 포함하고, 상기 제2 유전적 변형이 제2 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
- 제71항에 있어서, 상기 제1 돌연변이가 내생 유전자의 제1 대립 유전자 내에 있고, 상기 제2 돌연변이가 내생 유전자의 제2 대립 유전자 내에 있는 것인 방법.
- 제71항에 있어서, 상기 제1 돌연변이가 제1 내생 유전자의 제1 대립 유전자 내에 있고, 상기 제2 돌연변이가 제2 내생 유전자의 제1 대립 유전자 내에 있는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 제1 유전적 변형 또는 상기 제2 유전적 변형이 인공 염색체를 포함하는 것인 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 인공 염색체가 항체를 코딩하는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 단계 (e)에서 수득한 세포 또는 그의 자손으로부터 시작하여 상기 방법을 1회 이상 반복함으로써 추가의 유전적 변형을 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제69항에 있어서, 단계 (a)의 상기 체세포가 태아 세포 또는 성체 세포인 것인 방법.
- 제77항에 있어서, 상기 태아 또는 성체 세포가 섬유모세포, 상피세포, 신경세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, B-림프구, T-림프구, 적혈구, 대식세포, 단핵구 및 근육세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- (a) 제69항의 방법으로 수득한 세포 또는 그의 자손을 제공하는 단계;(b) 상기 세포 또는 그의 자손, 상기 세포 또는 그의 자손의 염색질체, 또는 상기 세포 또는 그의 자손의 핵을 유핵 또는 탈핵 난자에 삽입하는 단계; 및(c) 상기 난자 또는 상기 난자로부터 형성된 배아를, 상기 난자 또는 상기 배아가 포유동물로 발생할 수 있도록 하는 조건하에서 수여체에 이식하여, 2개의 유전적 변형을 포함하는 포유동물을 제조하는 단계를 포함하는, 2개의 유전적 변형을 포함하는 비인간 포유동물의 제조 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 포유동물이 유제류인 방법.
- 제80항에 있어서, 상기 유제류가 소인 방법.
- 제56항의 방법으로 수득한 세포를 사용하여 제조된 비인간 포유동물.
- 제82항에 있어서, 유제류인 비인간 포유동물.
- 제83항에 있어서, 상기 유제류가 소인 비인간 포유동물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020067024364A KR20070018075A (ko) | 2004-04-22 | 2005-04-21 | 트랜스제닉 동물 및 그의 용도 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60/564,458 | 2004-04-22 | ||
| US60/564,445 | 2004-04-22 | ||
| US60/657,186 | 2005-02-28 | ||
| KR1020067024364A KR20070018075A (ko) | 2004-04-22 | 2005-04-21 | 트랜스제닉 동물 및 그의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070018075A true KR20070018075A (ko) | 2007-02-13 |
Family
ID=43651631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020067024364A KR20070018075A (ko) | 2004-04-22 | 2005-04-21 | 트랜스제닉 동물 및 그의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20070018075A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9806943B2 (en) | 2014-04-24 | 2017-10-31 | A10 Networks, Inc. | Enabling planned upgrade/downgrade of network devices without impacting network sessions |
-
2005
- 2005-04-21 KR KR1020067024364A patent/KR20070018075A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9806943B2 (en) | 2014-04-24 | 2017-10-31 | A10 Networks, Inc. | Enabling planned upgrade/downgrade of network devices without impacting network sessions |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7420099B2 (en) | Transgenic animals and uses thereof | |
| KR100882030B1 (ko) | 클로닝된 트랜스제닉 유제류에서 이종 (사람)면역글로블린의 발현 | |
| JP4318736B2 (ja) | ヒト抗体遺伝子を発現する非ヒト動物とその利用 | |
| JP3732407B2 (ja) | 染色体の改変方法 | |
| JP4082740B2 (ja) | 内因性遺伝子が破壊されている分化多能性保持細胞 | |
| JP4087338B2 (ja) | キメラ非ヒト動物 | |
| JP2005504507A5 (ko) | ||
| US7074983B2 (en) | Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin | |
| US20090047289A1 (en) | Osteopontin Specific Antibodies and Methods of Use Thereof | |
| KR20050093761A (ko) | 프리온 단백질 활성이 감소된 트랜스제닉 유제동물 및 그의용도 | |
| US20090151011A1 (en) | Chimeric Non-Human Animal and Use Thereof | |
| KR20050000558A (ko) | 인간 항체를 제조할 수 있는 트랜스제닉 유제동물 | |
| JP6775224B2 (ja) | マウス人工染色体ベクター及びその使用 | |
| KR20070018075A (ko) | 트랜스제닉 동물 및 그의 용도 | |
| US10717991B2 (en) | Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof | |
| WO2009111086A1 (en) | Transgenic non-human mammals with kappa light chain of xenogenous immunoglobulin | |
| JP3030092B2 (ja) | キメラ動物およびその作製法 | |
| JP2007312792A (ja) | キメラ動物およびその作製法 | |
| JP2007068506A (ja) | ｒａｂ８ａ遺伝子欠損マウス | |
| JPH11313576A (ja) | キメラ動物およびその作製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |