CN1144539A - 在转基因动物中生产纤维蛋白原 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了在转基因非人类哺乳动物中生产纤维蛋白原的材料与方法。编码纤维蛋白原Aα，Bβ和γ链的DNA片段导入非人类哺乳动物的种系，该哺乳动物及其雌性后裔生产含有导入的DNA所表达的纤维蛋白原的乳汁。还公开了带有编码异源纤维蛋白原多肽链的DNA片段的非人类哺乳动物胚胎和转基因非人类哺乳动物。

Description

在转基因动物中生产纤维蛋白原
发明背景
血液凝集系列反应的最后一步是由凝血酶催化将可溶性的血浆蛋白纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白。凝血酶从纤维蛋白原的三条组成链之一(Aα)上切下一条小肽(纤维蛋白肽A)。随后纤维蛋白发生聚合，并在凝血因子XIII的激活下交联形成稳定的血栓。
纤维蛋白原是生物组织胶的一个关键成分(见U.S.Patent Nos.4,377,572和4,442,655)，生物组织胶能模拟自然血栓的形成，启动止血过程及修复受损组织。组织胶提供缝合线，卡钉以及其它缝合伤口的机械方法的附件或替代品。然而，这些产品的基本组分(纤维蛋白原，因子XIII和凝血酶)是从人的血浆库中通过低温沉淀(例如U.S.Patent Nos.4,377,572；4,362,567；4,909,251)或乙醇沉淀(例如U.S.PatentNos.4,442,655)或者是从单一提供者血浆中(如U.S.Patent No.4,627,879，Spotnitzet al.，Am.Surg.55：166-168，1989)制备的。得到的纤维蛋白原/因子XIII制剂在使用前迅速与牛凝血酶混合，将纤维蛋白原转变成纤维蛋白，并激活因子XIII，由此开始粘合剂的凝聚过程。
市场上可得到的粘合剂来源于血库中的血浆，由于血源产品已伴随有人免疫缺陷病毒(HIV)，肝炎病毒和其它致病原的传播，因此限制了这类粘合剂的可接受性和可得性，现在它们在美国已禁止使用。
使用自体血浆可降低疾病传播的危险，但自体粘合剂仅能使用于有选择的外科手术中，而且患者要预先提供所需的血液。
如上所述，纤维蛋白原由三种多肽链组成，每一种在装配好的分子中以双体存在。这些被命名为Aα，Bβ和γ链的多肽链，在肝脏中协调表达，装配和分泌。尽管可预期重组DNA技术已能提供一种替代方法来代替从血浆中分离纤维蛋白原，这一点已证明是有困难的。三种纤维蛋白原多肽链已分别单独在E.coli中表达(Lord，DNA4：33-38，1985；Bolyard and Lord，Gene66：183-192，1988；Bolyard and Lord，Blood73：1202-1206)，但有功能的纤维蛋白原还没能在真核系统中生产出来。生物感受态纤维蛋白原在酵母中的表达还未见报道。培养的转染的哺乳动物细胞已被用来表达生物感受态纤维蛋白原(Farrell et al.，Blood74：55a，1989；Hartwig and Danishefsky，J.Biol.Chem.266：6578-6585，1991；Farrell et al.，Biochemistry30：9414-9420，1991)，但表达水平之低使得生产商业数量的重组纤维蛋白原不具可行性。实验证据说明，与肝脏相比，培养细胞中的较低的转录效率可能是表达水平低的一个原因，但在转染的BHK细胞中增加纤维蛋白原链的mRNA的总量并没有引起纤维蛋白原蛋白分泌的相应增加(Prunkard and Forster，XIV Congress of the International Society on Thrombosisand Haemostasis，1993)。后面的这些结果暗示，纤维蛋白原的正确装配与加工有一些组织特异性的机制，而这些机制在普通的实验条件下的细胞株中并不存在。
现有技术中还需要生产大量的高质量的用于组织粘合剂和其它用途的纤维蛋白原的方法，更需要的是不含血液病原体的纤维蛋白原。本发明满足了这些需要并提供了其它有关的优势。发明概述
本发明的一个目的是提供商用数量的重组纤维蛋白原，尤其是重组人纤维蛋白原。本发明的另一个目的是提供在转基因动物，特别是家畜，如牛，绵羊，猪和山羊的乳腺组织中表达纤维蛋白原的材料和方法。
一方面，本发明提供了一种生产纤维蛋白原的方法，包括：(a)提供编码与纤维蛋白原Aα链相连接的分泌信号的第一条DNA片段，编码与纤维蛋白原Bβ链相连接的分泌信号的第二条DNA片段，和编码与纤维蛋白原γ链相连接的分泌信号的第三条DNA片段，其中第一、第二、第三条片段中的每一条都与在雌性哺乳动物宿主的乳腺中表达其所需要的附加的DNA片段相连接；(b)将DNA片段导入一个非人类哺乳动物物种的受精卵；(c)将该受精卵植入该物种的雌性动物的输卵管或子宫内，以获得带有该DNA结构的后代；(d)繁殖该后代以产生雌性后裔，来表达第一、第二、第三条DNA片段并生产出含有由这些片段编码的生物感受态纤维蛋白原的乳汁；(e)从这些雌性后裔中收集乳汁；以及(f)从这些乳汁中回收纤维蛋白原。在一个实施方案中，带有导入片段的受精卵在植入之前要培养一段时间。
另一方面，本发明提供了一种生产纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：(a)将编码与纤维蛋白原Aα链相连的分泌信号的第一条DNA片段掺入β-乳球蛋白基因，生产出第一个融合基因；(b)将编码与纤维蛋白原Bβ链相连的分泌信号的第二条DNA片段掺入β-乳球蛋白基因，生产出第二个融合基因；(c)将编码与纤维蛋白原γ链相连的分泌信号的第三条DNA片段掺入β-乳球蛋白基因，生产出第三个融合基因；(d)将第一、第二、第三个融合基因导入一非人类哺乳动物的种系，使得该DNA片段在该动物或其雌性后裔的乳腺中表达，并且生物感受态纤维蛋白原分泌到该哺乳动物或其雌性后裔的乳汁中；(e)从该哺乳动物或其雌性后裔中获取乳汁；以及(f)从乳汁中回收纤维蛋白原。在优选的实施方案中，哺乳动物是绵羊、猪、山羊或牛。
另一方面，本发明提供了一种生产纤维蛋白原的方法包括以下步骤：(a)提供一种非人类的转基因雌性哺乳动物，在其种系中带有编码纤维蛋白原Aα，Bβ及γ链的异源DNA片段，其中的DNA片段在该哺乳动物的乳腺中表达而该DNA片段所编码的纤维蛋白原被分泌到该哺乳动物的乳汁中；(b)从该哺乳动物中收集乳汁；(c)从乳汁中回收纤维蛋白原。
另一方面，本发明提供了一种非人类的哺乳动物的胚胎，在其细胞核中含有编码纤维蛋白原Aα，Bβ及γ链的外源DNA片段。在一个相关的方面，本发明提供了一种转基因的非人类雌性哺乳动物，它在乳汁中生产可回收量的人纤维蛋白原。
另一方面，本发明提供了一种生产哺乳动物的转基因后代的方法，它包括以下步骤：(a)提供编码纤维蛋白原Aα链的第一条DNA片段，编码纤维蛋白原Bβ链的第二条DNA片段，以及编码纤维蛋白原γ链的第三条DNA片段，其中所说的第一，第二和第三条DNA片段中的每一条都连接有附加的DNA片段，以满足使其在宿主雌性哺乳动物的乳腺中表达及分泌到宿主雌性哺乳动物乳汁中的要求；(b)将该DNA片段导入非人类哺乳动物的一个受精卵中；(c)将受精卵植入雌性非人类种属动物的输卵管或子宫内，以获得带有第一、第二和第三个DNA片段的后代。在一个相关的方面，本发明提供根据该程序生产的非人类哺乳动物。
另一方面，本发明提供了带有编码异源纤维蛋白原Aα，Bβ及γ链的种系DNA片段的非人类哺乳动物，其中该哺乳动物的雌性后裔在其乳腺中表达这些DNA片段来生产生物感受态纤维蛋白原。
参考以下的详细说明及附图后，本领域熟练技术人员将会明白本发明的这些方面及其它方面。附图简述
图1阐述人纤维蛋白原Aα链DNA序列的亚克隆。
图2是载体Zem228的部分限制性图谱。所用的符号MT-1p代表鼠金属硫蛋白启动子；SV40t代表SV40终止子；以及SV40p代表SV40启动子。
图3阐述人纤维蛋白原Bβ链DNA序列的亚克隆。
图4阐述人纤维蛋白原γ链DNA序列的亚克隆。
图5是载体Zem219b的部分限制性图谱。使用的符号MT-1P代表鼠金属硫蛋白启动子；hGHt代表人生长激素终止子；SV40p代表SV40启动子；DHFR代表二氢叶酸还原酶基因；以及SV40t代表SV40终止子。本发明的详细描述
在开始本发明的详述之前，定义一些用于本文的术语将会有所帮助：
用于本文时，术语“生物感受态纤维蛋白原”用来指当用凝血酶处理时能发生聚合形成不溶性纤维蛋白的纤维蛋白原。
术语“卵”用来指未受精的卵细胞、在原核融合以前已受精的卵细胞或早期胚胎(具有融合原核的受精卵细胞)。
“生产含有生物感受态纤维蛋白原的乳汁的雌性哺乳动物”是一个在怀孕与分娩后，在哺乳期间，生产含有可回收量的生物感受态纤维蛋白原的乳汁的动物。本领域熟练技术人员能认识到这些动物断断续续地产奶，因而断断续续地生产纤维蛋白原。
术语“后裔”用的即是其一般含义，包括子女及后代。
术语“异源的”用来指其来源与其所导入的动物物种不同的遗传物质，或者是从这些遗传物质中生产出来的蛋白质。
在本发明中，转基因动物技术被运用来在宿主雌性哺乳动物的乳腺中生产纤维蛋白原。所感兴趣的蛋白在乳腺中的表达及随后向乳汁中的分泌克服了在用其它途径分离蛋白质时所遇到的许多困难。乳汁很容易被收集，并可大量得到，而且能很好地进行生物化学鉴定，另外，存在于乳汁中的主要蛋白质的浓度很高(从约1g/L到15g/L)。
从商业观点来看，很清楚优选的是使用那些产奶量大的物种作为宿主。虽然较小的动物如小鼠和大鼠也可以使用(而且优选的是使用于验证概念阶段)，在本发明中优选的是使用家畜，包括但并非限于使用猪、山羊、绵羊和牛。绵羊是特别优选的，这是基于如下因素如在该物种中有转基因的历史，产乳量，费用及收集绵羊奶的设备的易得性。影响宿主物种的选择的因素的比较见WO88/00239。通常的愿望是选择已作为日常用途喂养的动物来繁殖，例如East，Friesland绵羊，或者是通过将转基因系喂养一段时间导入日常的家系。无论怎样，应该使用熟悉的，具有良好健康状况的动物。
根据本发明生产的纤维蛋白原可以是人纤维蛋白原或非人类动物的纤维蛋白原。作为药用的话，优选的是应用对患者来说是天然的蛋白质，因此本发明提供了在人类和畜类药物中都可使用的纤维蛋白原。编码人纤维蛋白原的成分链的克隆的DNA分子是由这些人描述的：Rixon et al.(Biochem.22：3237，1983)，Chung et al.(Biochem.22：3244，1983)，Chung et al.(Biochem.22：3250，1983)，Chung et al.(Adv.Exp.Med.Biol.281：39-48，1990)以及Chung et al.(Ann.NY Acad.Sci.408：449-456，1983)。牛纤维蛋白原的克隆由Brown et al.(Nuc.Acad.Res.17：6397，1989)和Chung etal.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1466-1470，1981)描述，其它的哺乳动物纤维蛋白原由Murakawa et al.(Thromb.Haemost.69：351-360，1993)描述。人类Aα，Bβ和γ链基因的代表性序列分别显示于SEQ ID NOS：1，3和5。那些熟练技术人员将明白这些序列的等位变异体将是存在的；另外的突变体可以通过氨基酸的置换、缺失或插入产生；而且这样的变异体在本发明中是有用的。一般地，优选的是那些包括仅仅有限数目的氨基酸置换、缺失或插入的工程变异体，并且任何置换都是保守性的，因此优选的方案是生产在序列上与相应的天然链至少有90％，较好的是至少95％，更好的是有至少99％或更多同一性的纤维蛋白原链多肽。术语“γ链”指的是包括纤维蛋白原的替代性拼接的γ’链(Chung et al.，Biochem.23：4232-4236，1984)。人类γ’链的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：6。较短的γ链是由SEQ ID NO：5的9511位和10054位核苷酸之间的替代性拼接而产生的，因而翻译终止于SEQ ID NO：5中的10065位核苷酸之后。
为获得在乳腺中的表达，使用了一种来源于乳蛋白基因的转录启动子。乳蛋白基因包括那些编码酪蛋白，β-乳球蛋白(BLG)，乳清蛋白，以及乳清酸性蛋白的基因。β-乳球蛋白启动子是优选的。若是羊β-乳球蛋白基因，羊BLG基因5’侧序列的至少约406bp(包括在SEQ ID NO：7的核苷酸3844-4257中)的区域将通常被用到。优选的是更大部分的5’侧序列，直到大约5Kbp。一条更大的DNA片段，包括5’侧启动子区域及β-乳球蛋白基因的5’非编码区域(包括在SEQ ID NO：7的核苷酸1-4257)是特别优选的。见Whitelaw et al.，Biochem.J.286：31-39，1992。来自于其它种属的类似的启动子DNA片段也是适用的。
β-乳球蛋白基因的其它区域也能掺入到结构中，正如待表达的基因的基因组区域。现有技术中通常接受的是失去了内含子的结构，例如，与那些含有这样的DNA序列的相比，其表达性很差(见Brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85：836-840，1988；Palmiter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：478-482，1991；Whitelawet al.，Transgenic Res.1：3-13，1991；WO 89/01343；WO 91/02318)。在这一点上，通常优选的方案是，在可能时，使用含有所有或一些编码所感兴趣的蛋白质或多肽的基因中的天然内含子的基因组序列。在本发明的某些实施例中，优选方案是还包括至少一些来自于β-乳球蛋白基因的内含子。一个这样的区域是一条提供内含子拼接及RNA多腺苷酸化的、来自于羊β-乳球蛋白基因的3’非编码区的DNA片段。当用一个基因的天然3’非编码区取代时，这一羊β-乳球蛋白片段同时能增强与稳定感兴趣的蛋白质或多肽的表达水平。在其它的实施方案中，一个或多个纤维蛋白原序列的起始ATG附近的区域被替换成来自于乳汁特异性蛋白基因的相应的序列。这样的替换提供了所推想的组织特异性起始环境以增强表达。很容易将全部的纤维蛋白原链的前原和5’非编码区序列置换为那些例如BLG基因的相应序列，尽管较小的区域也能被置换。
为了表达纤维蛋白原，编码纤维蛋白原的三种组分多肽链的每个DNA片段都连接有其表达所需的附加的DNA片段。这些附加的片段包括以上所提到过的乳类蛋白基因启动子，还有提供转录终止和mRNA多腺苷酸化的序列。表达单位还包括与编码纤维蛋白原多肽链的片段相连接的编码分泌信号的DNA片段。分泌信号可能是天然的纤维蛋白原分泌信号也可能是另一种蛋白，例如一种乳蛋白的信号肽。术语“分泌信号”用于此处指的是一个蛋白质中指导其穿过细胞的分泌途径到外面的部分。分泌信号最常见的是在蛋白质的N-端。例如，可见von Heinje.Nuc.Acids Res.14：4683-4690，1986；和meadeet al.，U.S.Patent No.4,873,316中所述。
表达单位的构建很容易通过将纤维蛋白原链序列插入到一个质粒或噬菌体载体中来实现，这些载体中含有附加的DNA片段；当然表达单位也能通过基本的任一序列的连接反应来构建。尤其便利的是提供一个含有编码乳蛋白的DNA片段的载体，并将编码乳蛋白的序列置换成编码一条纤维蛋白原链(包括分泌信号)的序列，因此产生一个包括有乳蛋白基因的表达调控序列的基因融合体。无论如何，表达单位在质粒或其它载体中的克隆方便了纤维蛋白原序列的扩增。扩增很容易在细菌(如E.coli)宿主细胞中进行，这样典型的载体将包括一个在细菌宿主细胞中的复制原点和一个选择性标记。
考虑到纤维蛋白原链基因的大小最为实际的是制备三种分离的表达单位，将其混合，并将混合物导入宿主中。然而，本领域熟练技术人员会明白其它的程序也是可行的。例如，三条链的表达单位可以单个分别导入不同的胚胎，随后通过繁殖使之结合。在第三种方法中，三个表达单位可以连接在一个合适的载体中，如酵母人工染色体或噬菌体P1克隆。两条或三条链的编码序列可以结合在多顺反子表达单位中(见Levinson etal.，U.S.Patent No.4,713,339)。
然后，表达单位被导入所选择的宿主的受精卵(包括早期胚胎)中。异源基因的导入可以通过几条途径之一而完成，包括显微注射(如U.S.Patent No.4,873,191)，反转录病毒感染(Jaenisch，Science 240：1468-1474，1988)或使用胚胎干细胞(ES)的定点整合(Bradly et al.，Bio/Technology 10：534-539，1992)。该受精卵然后被植入假孕雌性动物的输卵管或子宫内并让其继续发育。在其种系中带有导入的DNA的后代可以通过正常的孟德尔遗传方式将该DNA传给其后裔，并发展成转基因种群。制造转基因动物的一般方法是现有技术中已知的。如可见以下所引的参考文献：Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1986；Simons et al.，Bio/Technology 6：179-183，1988；Wall et al.，Biol.Repord.32：645-651，1985；Buhler et al.，Bio/Technology 8：140-143，1990；Ebert et al.，Bio/Technology 9：835-838，1991；Krimpenfort et al.，Bio/Technology 9：844-847，1991；Wall et al.，J.Cell.Biochem.49：113-120，1992；以及WIPO出版物WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757；以及GB 87/00458。将外源DNA导入哺乳动物及其生殖细胞的技术最初是在小鼠中发展起来的。见Gordon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：7380-7384，1980；Gordon and Ruddle，Science 214：1244-1246，1981；Palmiter andBrinster，Cell 41：343-345，1985；Brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：4438-4442，1985；and Hogan et al.，(ibid.)。这些技术后来也适用于较大的动物，包括家畜(见WIPO出版物WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757；以及Simons et al.，Bio/Technology 6：179-183，1988)。概括地说，到目前为止，已在转基因小鼠和家畜的生产中，用最有效的方法，将数以百计的感兴趣的线性DNA分子注射进受精卵的原核中。将该DNA注入受精卵的细胞质中也是可行的。
优选方案是获得每条纤维蛋白原链的平衡表达，使得成熟蛋白质的形成较有效。理想的是，三个表达单位应该在导入受精卵的同一个DNA分子中。然而，这种方法会产生一些技术上的难题，例如在注射和操作阶段。比如，纤维蛋白原表达单位的大小使得必须在注射前使用酵母人工染色体(YACs)或噬菌体P1来扩增和操作DNA。若按此方法进行，待注射的含有所有三个表达单位的DNA片段将会非常巨大，因此要求将注射方法作一些修改，如使用更大号的针头。在一个较为简单的方法中，使用的是各种单个表达单位的混合物。优选方案是结合等摩尔量的三种表达单位，虽然本领域熟练技术人员会明白这种比例可以根据所给的表达单位的性质而作一些改变。当使用较少摩尔数的一种或两种链时，也能得到某种程度的表达，但一般说来其水平会降低。通常可以预期的是若以偏离优选的等摩尔比例的比例进行，其表达效率将会下降。不管怎样，优选的方案是使用一种混合物，其中Aα∶Bβ∶γ表达单位的比例在0.5-1∶0.5-1∶0.5-1范围之内。若将其比例从等摩尔状态改变，优选的是使用相对多一些的Bβ表达单位。另外，一个表达单位或是两种表达单位的混合物也可导入单独的卵中，当然，由此而来的动物将只表达一条或两条纤维蛋白原链。要用这种方法产生完整的纤维蛋白原分子就要求随后进行一个繁殖过程，以结合存在于一群动物的个体中的所有三种表达单位。
一般地，雌性动物要用促滤泡激素处理使之超数排卵，然后交配。收集受精卵，然后用已知方法将异源DNA注射进入卵中。可见以下所引用的文献：U.S.Patent No.4,873,191；Gordon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7380-7384，1980；Gordonand Ruddle，Science 214：1244-1246，1981；Palmiter and Brinster，Cell 41：343-345，1985；Brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438-4442，1985；Hogan etal.，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1986；Simons et al.，Bio/Technology 6：179-183，1988；Wall et al.，Biol.Repord.32：645-651，1985；Buhler et al.，Bio/Technology 8：140-143，1990；Ebert et al.，Bio/Technology 9：835-838，1991；Krimpenfort et al.，Bio/Technology9：844-847，1991；Wall et al.，J.Cell.Biochem.49：113-120，1992；以及WIPO出版物WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757；以及GB 87/00458。
为了注射进入受精卵中，要用合适的限制性酶消化将表达单位从其各自的载体中切下。为了方便起见，优选的方案是设计的载体使得切下表达单位的酶不会在表达单位内部或载体上别的地方有切割位点。表达单位通过传统方法回收，例如电泳洗脱，随后用酚抽提，用乙醇沉淀，以及蔗糖密度梯度离心，或结合使用这些方法。
DNA注射到卵中，基本上是按照上述Hogan et al.的方法。在一次典型的注射中，使用体视可调焦显微镜(优选×50或×63)，将在一个装有胚胎培养基的盘子中的卵子固定。合适的培养基包括Hepes(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)或碳酸氢盐缓冲培养基如M2或M16(可购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)或合成的输卵管培养基(见下述)。使用一个用毛细管做的drummond吸管将卵固定并转移到注射装置上的玻璃载片的中央。在此步骤时，使用低倍镜(×4)观察。使用注射装置上的吸管将卵子定位于载玻片的中心。单个的卵随后被固定到吸管上以备注射。每一次注射，吸管/卵都要定位于视野的中心。然后将注射针头定位于卵的正下方。最好使用×40倍的Nomarski目镜，两个操作台的高度调节到使卵和针头同时聚焦。通过旋转卵和调节吸管，将原核定位。一旦原核被定位后，调节操作台的高度使其聚焦于原核膜。注射器针头位于卵的下方并使针尖正好处于原核中心下面的位置。然后使用注射操作装置调整针头的位置，使针头和原核进入同一个聚焦平面。通过注射操作装置上的操纵杆(joy stick)移动针头到卵的右方。用一个短的连续穿刺动作，将原核膜刺穿并使针尖留在原核内。通过玻璃针筒给注射针头加压，直到原核膨胀到接近原来体积的两倍。此时，缓慢地移走针头，转回到低倍镜(如×4)，将注射过的卵移到玻璃片上的不同的区域，并对另一只卵重复该程序。
DNA注射完毕之后，培养该卵细胞使原核融合，生产一单细胞胚胎或较晚期胚胎。一般地，卵的培养在该种的体温下并在含有平衡的盐和血清的缓冲培养基中进行。然后将活的胚胎转移进假孕的受体雌性动物中，典型的做法是将其植入输卵管或子宫，使之发育。在胚胎发生过程中，注射的DNA将以随机方式整合到少数发育胚胎的染色体中。
潜在的转基因后代通过血样和/或组织活体解剖进行筛选。从这些样品中制备出DNA并检查注入的结构的存在，可利用诸如聚合酶链式反应(PCR，见Mullis，U.S.Patent No.4,683,202)和Southern印迹(Southern，J.Mol.Biol.98：503，1975；Maniatis etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)等技术。“建立者(founder)”转基因动物，或称G0s，可以是完全转基因的，即在其所有细胞中都有转基因；也可以是部分的，只在某一类细胞中有转入的基因(见Wilkieet al.，Develop.Biol.118：9-18，1986)。在后一种情况下，生殖细胞集团中可能是全部的或部分的转基因的。而且，在后一种情况下，实际所得到的“建立者”的后代中的转基因后代的比例还不足根据孟德尔定律预测值的50％。“建立者”G0动物生长到性成熟期后，进行交配，得到后代，或称G1s。G1s同样检查转基因的存在，确定其是否从“建立者”G0动物中传了下来。若是雄性G0s，可使其与数个未转基因的雌性交配，以产生大量后代，此举增加了发现转基因传递的机会。雌性“建立者”G0可以通过自然交配、人工授精或超数排卵得到许多卵子并转移给代理母亲。后一种方法给出了在那些产仔量少的动物中观察到转基因传递的最好的机会。上述的繁殖程序被用来获得能将DNA以正常的孟德尔方式遗传给后代的动物，并使其发展成转基因动物的种群(小鼠、绵羊、猪、山羊、牛)。
从哺乳期的G0和G1雌性动物中得到的乳汁要进行异源蛋白的检查，依靠使用免疫技术如ECLISA(见Harlow and Lane，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988)以及Western印迹(见Towbin et al.，Procc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4354，1979)。由于在现有技术中公知的各种原因，异源蛋白的表达水平在不同的个体之间将是不同的。
一个令人满意的动物家族应该满足三个标准：它们应来源于同一个建立者G0动物；它们应该表现出稳定的转基因的传递；而且它们在代与代之间及个体动物的每次产乳期之间应该表现出稳定的表达水平。这些原则已经确定并讨论过(Carver et al.，Bio/Technology 11：1263-1270，1993)。来自于这样的一个合适的家族的动物可被称之为一个“系”。最初，雄性动物G0或G1，被用来通过自然地或人工受精繁殖出一群生产者动物。以这种方式，可以迅速产生许多带有相同的整合的转基因的雌性动物，从中可以得到乳汁供应。
纤维蛋白原从乳汁中的回收使用标准的做法，诸如：脱脂、沉淀、过滤以及蛋白质层析技术。
根据本发明生产的纤维蛋白原适用于人类及畜类医药，例如用于配制外科中的粘合剂。这种粘合剂是现有技术中公知的。如可见引用的文献U.S.Patent No.4,377,572；4,442,655；4,462,567；以及4,627,879。一般地，将纤维蛋白原与因子XIII结合形成第一种成分，在使用之前与含有凝血酶的第二种成分混合。凝血酶使纤维蛋白原转变成纤维蛋白，使混合物成为胶状，并激活因子XIII。激活的因子XIII使纤维蛋白交联，强化并稳定粘合剂基质。这样的典型的粘合剂中，含有大约30mg/ml-100mg/ml的纤维蛋白原与大约50μg/ml-500μg/ml的因子XIII。它们还可能含有其它成分，例如aprotinin，乳清蛋白，纤联蛋白，膨化剂以及溶剂。生产因子XIII的方法是现有技术中公知的。如可见U.S.Patent No.5,204,447。纤维蛋白原还可以用来包被聚合物如合成血管移植物的表面，如U.S.Patent No.5,272,074.(列于此处参考)所述。
通过下列的非限制性实施例对本发明做进一步的阐述。实施例1
去掉载体pUC18(Yanisch-Perron et al.，Gene 33：103-119，1985)上的多克隆位点，置换成一条合成的双链寡核苷酸(链显示于SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：27中)，该链含有限制性切点Pvu I/Mlu I/Eco RV/Xba I/Pvu I/Mlu I，并在5’端加有与Eco RI和Hind III配对的接头。pUC18用EcoRI和HindIII双酶切，其5’磷酸基团用牛胰磷酸酶除去，将寡核苷酸链连接到载体骨架中。做序列测定确定跨过连接区域的序列正确无误，新的质粒叫做pUCPM。
从pSS1tgXS(WIPO出版物WO 88/00239中公开)上切下β-乳球蛋白(BLG)基因Sal I-Xba I片段，克隆到用Sal I和Xba I酶切过的载体pUCPM中构建载体pUCXS。因此pUCXS是pUC18的一个衍生质粒，含有完整的BLG基因，该基因来自于噬菌体SS1(Ali and Clark，J.Mol.Biol.199：415-426，1988)上的从Sal I位点到Xba I位点的片段。
质粒pSStgSE(WIPO出版物WO 88/00239中公开)含有一个1290bp的BLG片段，其两侧有Sph I和Eco RI限制位点、一段跨过单一位点Not I的区域及一个位于BLG mRNA的5’非翻译引导区的Pvu II位点。在此Pvu II位点上连接有一个双链的8bp的DNA连接序列(5’-GGATATCC-3’)，构成Eco RV的识别位点。这个质粒称做pSS1SE/RV。pSS1SE/RV中Sph I和Eco RV间的DNA序列被酶切下来，并被用来置换pUCXS中的等价片段。得到的质粒称做pUCXSRV。插入到pUCXSRV中的BLG的序列显示于SEQ ID NO：7，在BLG基因的5’非翻译引导区的4245位核苷酸上有一个EcoRV的单一酶切位点。该位点允许插入一些在BLG启动子控制下的转录起始位点3’端的任何附加的DNA序列。
使用引物BLGAMP3(5’-TGG ATC CCC TGC CGG TGC CTC TGG-3’；SEQ ID NO：9)和BLGAMP4(5’-AAC GCG TCA TCC TCT GTG AGC CAG-3’；SEQ ID NO：10)，从pUCXSRV中的BLG基因的终止密码子的3’端的序列中生产出接近650bp的一个PCR片段。该PCR片段利用工程技术在5’端加有一个Bam HI位点，在3’端加有一个Mlu I位点，并被克隆进Bam HI和Mlu I切过的pGEM7zf(+)(Promega)构成pDAM 200(+)。
pUCXSRV用Kpn I消化，最大的含有载体的条带用凝胶纯化。该条带含有全部的pUC质粒序列以及一些BLG基因上的3’非编码区序列。在此骨架中连接上一个来自pDAM200(+)的小的Kpn I片段；后者在2.6Kbp的BLG3’侧区域的5’末端利用工程技术以正确的方向产生了一个Bam HI位点。该质粒称做pBLAC200。从pBLAC200得到的2.6Kbp的ClaI-XbaI片段连接到ClaI-XbaI酶切的pSP72载体(Promega)中，由此在BLG序列的上游置入一EcoRV位点，此质粒称为pBLAC210。
从pBLAC210上得到的2.6Kbp的Eco RV-Xba I片段连接到Eco RV-Xba I酶切的pUCXSRV上，形成pMAD6。此时，从pUCXSRV上切下了所有编码序列和内含子序列，形成了由4.3Kbp的5’启动子和侧翼有单一Eco RV位点的2.6Kbp的3’下游序列组成的一条BLG的“迷你”基因。在pMAD6的Eco RV位点插入一个寡核苷酸接头(ZC6839：ACT ACG TAGT；SEQ ID NO：11)。这一修改破坏了Eco RV位点，但产生了一个用于克隆目的的Sna BI位点。该载体命名为pMAD6-Sna。信使mRNA起始于Sna BI位点的上游并终止于Sna BI位点的下游。前体转录将编码一个单个BLG来源的内含子，即内含子6，它完整地位于基因的3’非翻译区内。实施例2
编码单个纤维蛋白原链的克隆得自于University of Washington，Seattle的Dr.Earl W.Davie实验室。一个基因组纤维蛋白原Aα链克隆(Chung et al.，1990，ibid.)得自于质粒BS4。该质粒含有插入载体pUC18的Sal I和Bam HI位点的Aα链克隆，但缺失了Aα链头四个氨基酸的编码序列。基因组Bβ链DNA(Chung et al.，ibid.)分离自λCharon 4A噬菌体克隆(命名为βλ4)的两个Eco RI片段，每条片段长5.6Kbp。两个片段分别克隆到已用Eco RI消化并经牛胰磷酸酶处理过的pUC19中。得到的克隆用限制性酶Pvu II消化筛选，鉴定出有5’和3’Bβ插入的质粒(分别命名为β5’RI/puc和β3’RI/puc)。基因组γ链克隆按Rixon et al.(Biochemistry 24：2077-2086，1985)所述分离。克隆pγ12A9包括5’非编码序列及约4535bp的γ链编码序列。克隆pγ12F3包括其余的编码序列和3’非编码核苷酸。这两个质粒都是基于pBR322的在Eco RI位点插入纤维蛋白原序列的质粒。这些质粒被用来作为个自PCR反应的模板。
为了将纤维蛋白原链编码序列插进表达载体中，使用Mullis(U.S.Patent No.4,683,202)所述的PCR技术给其加尾。该步骤是移去天然的5’和3’非翻译序列，在其每条编码序列的第一个ATG的上游加上一条9个碱基的序列(CCT GCA GCC)，提供Aα链的头四个密码子，除去了Aα链序列中的一个内部的Mlu I位点，并增加了限制性位点以方便随后的克隆操作。
参看图1，Aα链编码序列的5’末端通过PCR反应加尾。PCR反应体系中，含有分别为20pmol的引物ZC6632(SEQ ID NO：12)和ZC6627(SEQ ID NO：13)，约10ng的质粒BS4模板DNA，10μl的含有分别为2.5mM的各种dNTP的混合液，7.5μl的10×Pyrococcus furiosus(Pfu)DNA聚合酶缓冲液#1(200mM Tris-HCl，pH8.2，100mM KCl，60mM(NH4)2SO4，20mMMgCl2，1％Triton X-100，100μg/ml的去核酸酶牛血清白蛋白)(Stratagene，La Jolla，CA)，加水至75μl。混合物在一个DNA热循环仪(Perkin-Elmer)上以如下方式进行5个循环：94℃45秒，40℃90秒，72℃120秒；再进行20个循环：94℃45秒，45℃90秒，72℃120秒；然后在72℃保温7分钟。5’PCR片段用Bam HI和Hind III消化，然后将该Bam HI-Hind III片段与一个内部的2.91Kbp的Hind III-Xba I片段及经Bam HI，Xba I消化的pUC18一起连接。对PCR产生的外显子序列进行序列测定。
再参看图1，通过一系列步骤给Aα编码序列的3’末端加尾。其中使用重叠延伸PCR反应(Ho et al.，Gene 77：51-59，1989)使Aα序列的终止密码子上游563位碱基上的Mlu I位点发生了突变。在第一个反应中，在如上所述的反应体系中加有分别为40pmol的引物ZC6521(SEQ ID NO：14)和ZC6520(SEQ ID NO：15)，约10ng的质粒BS4模板DNA。反应进行5个循环：94℃45秒，40℃90秒，72℃120秒；再进行15个循环：94℃45秒，45℃90秒，72℃120秒；然后在72℃保温7分钟。第二个反应以同样的方式进行，但使用每种分别为40pmol的引物ZC6519(SEQ ID NO：16)和ZC6518(SEQ ID NO：17)并以BS4为模板。从第一个和第二个反应中得到的PCR片段通过凝胶电泳分离并从凝胶上洗脱下来。每种回收的反应产物的约1/10与每种分别为40pmol的引物ZC6521(SEQ IDNO：14)和ZC6518(SEQ ID NO：17)在一个PCR反应中结合，在此反应中，每个片段(含有个别的碱基变化)的互补的3’末端作为其互补链3’延伸反应的引物与其退火。使用与第一个和第二个3’PCR反应中相同的反应条件进行PCR反应。然后将反应产物用Xba I和Bam HI消化，并将Xba I-Bam HI片段克隆到Xba I和Bam HI消化的pUC18中。对PCR产生的外显子序列进行序列测定。
如图1中所示，5’Bam HI-Xba I片段(3.9Kbp)和3’Xba I-Bam HI片段(1.3Kbp)插入到载体Zem228的Bam HI位点，Zem228是一个pUC18的衍生质粒，在小鼠MT-1启动子和SV40终止子之间有一个Bam HI克隆位点，并在SV40启动子和终止子旁侧有一个新霉素抗性标记。见欧洲专利局出版物EP 319，944和图2。从载体Zem228上分离出完整的Aα编码序列Sna BI片段，插入到质粒pMAD6-Sna的Sna BI位点。
参看图3，使用寡核苷酸ZC6629(SBQ ID NO：18)，ZC6630(SEQ ID NO：19)和ZC6625(SEQ ID NO：20)通过PCR给Bβ链的5’末端加尾。这些引物以成对结合的方式(ZC6629+ZC6625或ZC6630+ZC6625)使用，产生起始于第一个ATG密码子(SEQ IDNO：3中的470位)的Bβ编码序列(命名为N1-β)或起始于第三个ATG密码子(SEQ IDNO：3中的512位)的Bβ编码序列(命名为N3-β)。在如上所述的反应混合物中加入5ng的β5’RI/puc模板DNA，并结合每种分别为20pmol的引物(N1-β：ZC6629，SEQID NO：18+ZC6625，SEQ ID NO：20或N3-β：ZC6630，SEQ ID NO：19+ZC6625，SEQ ID NO：20)。混合体系进行如下的5个循环：94℃45秒，40℃120秒(N1-β)或90秒(N3-β)，72℃120秒；再进行20个循环：94℃45秒，45℃120秒(N1-β)或90秒(N3-β)，72℃120秒；然后在72℃保温7分钟。两种反应产物都用EcoRI和Bgl II消化，并将酶切的片段与内部的Bgl II-Xba I片段和Eco RI+Xba I消化的pUC19一起连接。使用寡核苷酸引物ZC6626(SEQ ID NO：21)和ZC6624(SEQ ID NO：22)以及约5ng的β3’RI/puc模板在一个如上所述的反应混合物中给Bβ链序列的3’末端加尾。混合物温育5个循环：94℃45秒，40℃90秒，72℃120秒；再进行15个循环：94℃45秒，45℃90秒，72℃120秒；然后在72℃保温7分钟。分离出一个990bp的Bgl II-EcoRI片段。该3’片段与邻近的编码片段(340bp，Sph I-Bgl II)和Sph I+Eco RI消化的pUC19连接。对PCR产生的3’和5’外显子进行序列测定。在Xba I+Sph I消化的pUC19中连接两个内部片段(4285bp Xba I-Eco RI和383bp Eco RI-Sph I)构建第三个中间载体。然后装配完整的Bβ编码序列(两种形式)，连接5’Eco RI-Xba I片段中的一个，内部Xba I-Sph I片段，3’Sph I-Eco RI片段和Eco RI消化的载体pUC19。然后Bβ序列以7.6Kbp的Sna BI片段的形式分离出来，插入到pMAD6-Sna的Sna BI位点中。
参看图4，使用寡核苷酸引物ZC6514(SEQ ID NO：23)和ZC6517(SEQ ID NO：24)以及约5ng的pγ12A9为模板通过PCR给γ链序列的5’末端加尾。使用40pmol的每种引物按如上所述进行PCR反应。反应进行5个循环：94℃45秒，40℃60秒，72℃120秒；接着进行15个循环：94℃45秒，45℃60秒，72℃120秒。得到的213bp的片段用Bam HI和Spe I消化，将得到的酶切片段与邻近的下游4.4Kbp的Spe I-Eco RI片段和BamHI+Eco RI消化的pUC19连接。使用每种40pmol的寡核苷酸引物ZC6516(SEQ ID NO：25)和ZC6515(SEQ ID NO：26)，约50ng的pγ12F3模板以及与用于5’片段的相同的热循环程序给γ链序列的3’末端加尾。得到的500bp的片段用Bam HI和Spe I消化，将得到的酶切片段与上游2.77Kbp的Eco RI片段和Eco RI+Bam HI消化的pUC19连接。所有PCR产生的外显子都进行序列测定。然后装配完整的γ’链编码序列，在Bam HI+Xba I消化的Zem219b中，连接一个4.5Kbp的Bam HI-Eco RI5’片段，一个1.1Kbp的Eco RI-PstI内部片段和一个2.14Kbp的Pst I-Xba I3’片段。Zem219b是一个pUC18衍生载体，含有一个小鼠金属硫蛋白启动子和一个与SV40启动子连接的DHFR选择标记(图5)。质粒Zem219b已以E.coli XL1-blue转化子的形式保藏于American Type CultureCollection，编号为68979。完整的γ’链编码序列以一个7.8Kbp的Sna BI片段的形式分离出来并插入到pMAD6-Sna的Sna BI位点。实施例3
用于初始繁殖系(C57BL6J，CBACA)的小鼠得自于Harlan Olac Ltd.(Bicester，UK)。让其成对交配产生F1杂交系(B6CBAF1)，以得到受体雌性，超数排卵的雌性，用于繁殖的雄性，以及被结扎的雄性。所有的动物都保持在一种14小时光亮/10小时黑暗的循环中，并喂以任意量的水和食物(Special Diet Services RM3，Edinburgh，Scotland)。
转基因小鼠的产生基本上如Hogan et al.，在Manipulating the Mouse Embryo：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1986中所述。雌性B6CBAF1动物在4-5周龄时通过注射怀孕雌鼠的血清促性腺激素(FOLLIGON，Vet-Drug，Falkirk，Scotland)(5iu)，随后在45小时后注射人绒毛膜促性腺激素(CHORULON，Vet-Drug，Falkirk，Scotland)(5iu)，使之超数排卵。然后让其与一只种鼠交配过夜。随后检查这些雌性动物交配是否阳性。那些已经交配的雌性动物被选出，收集它们的卵子以备用于显微注射。
如Hogan et al.(ibid.)所述将DNA注射到受精卵中。简而言之，每种含有Aα，Bβ和γ表达单位的载体用Mlu I消化，各表达单位用蔗糖密度梯度离心分离出来。所有使用的化学药品均为试剂级(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)，所有的溶液均为无菌及无核酸酶的。溶于1M NaCl，20mM Tris pH8.0，5mMEDTA的20％及40％的蔗糖溶液使用UHP水制备并经过滤除菌。混合等体积的20％和40％的蔗糖溶液，制备30％的蔗糖溶液。分步将0.5ml的40％、30％和20％的蔗糖溶液铺设到2ml的晶形塑料管中，并静置1小时，做成一种梯度。100μl的DNA溶液(接近8μgDNA)加到梯度液的顶部，然后于Beckman TL100超速离心机中使用TLS-55转头(BeckmanInstruments，Fullerton，CA，USA)在15℃下以26,000rpm转速离心17-20小时。使用一只20号的针头穿刺离心管的底部，分部收集各梯度的液滴于96孔板中。取出3μl的液体在1％的琼脂糖小胶上分析。将含有所需要的DNA片段的部分汇集起来，然后在0.3MNaAc中于-20℃用乙醇沉淀过夜。DNA沉淀物重溶于50-100μl UHP水中并用荧光计测量定量。表达单位稀释于Dulbecco’s磷酸缓冲盐(无钙和镁)(每升中含0.2gKCL，0.2gKH2PO4，8.0gNaCl，1.15gNa2HPO4)，以1∶1∶1的摩尔比混合(使用N1-β或是N3-β表达单位)，其浓度调节到大约6μg/ml，并注射到卵子中(每只卵大约总共2pl的DNA溶液)。
通过处于自然发情期的B6CBAF1雌鼠与结扎过的雄鼠交配，制备6-8周龄的受体雌鼠。那些交配检测为阳性的雌鼠保留下来准备转移显微注射后的卵。
潜在的转基因动物出生之后，于4周龄时在无菌条件下对尾部进行活体解剖。组织样品放入2ml含有200μg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim，Germany)的，尾缓冲液(0.3MNaAc，50mMHCl，1.5mMMgCl2，10mM Tris-HCl，PH8.5，0.5％NP40，0.5％Tween20)中，颠倒数次混匀。样品于55℃-60℃振荡(250rpm)3小时至过夜。通过PCR和Southern印迹检查制备于活体解剖样品的DNA中注射的结构的存在。剧烈振荡消化后的组织，取5μl液体放入0.5ml的微量离心管中。对照包括阳性和阴性尾部样品。每管中加入40μl的硅酮油(BDH，Poole，UK)并短暂地离心。管在一个热循环仪(如Omni-gene，Hybaid，Teddington，UK)的加热块上保温到95℃，10分钟。此后，每管中加入45μl的PCR混合液，这样，每个反应混合液的最终组成为：50mM KCl；2mMMgCl2；10mM Tris-HCl(pH8.3)；0.01％的明胶；0.1％NP40；10％的DMSO；500nM的各种引物；200μM的dNTPs；0.02U/μl的Taq聚合酶(Boehinger Mannheim，Mannheim，Germany)。按照所用的特定引物所要求的温度变化，每管重复进行30个循环。引物可能会有不同，但所有的引物都必须以BLG启动子区为目标。这对于注射的DNA片段是特异性的，因为小鼠中没有BLG基因。然后在每管中加入12μl的5X上样缓冲液，其中含有Orange G标记染料(0.25％Orange G(Sigma)15％Ficoll-400[PharmaciaBiosystems Ltd.，Milton Keynes，UK])，反应混合物在含有EB(Sigma)的1.6％琼脂糖凝胶中电泳，直到标记染料迁移到胶的2/3长度处。在254nm波长的紫外灯下观察凝胶。用这种方法可以鉴定出具有一个或多个注射的DNA片段的转基因小鼠。
挑选阳性的尾部样品以获得纯的DNA。DNA样品通过使用一个BLG启动子探针(SEQID NO：7中的2523-4253位核苷酸)做Southern印迹进行筛选。使用合适的限制性酶(例如EcoRI)进行特异性裂解可以分辨出含有Aα，Bβ和γ序列的三种结构。
基本上按如上所述的方法制备的转基因小鼠的Southern印迹的分析结果表明。有多于50％的后代含有所有三种纤维蛋白原序列。阳性动物的乳汁的还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检查表明，所有三种蛋白链都存在且其浓度接近1mg/ml。完全装配好的纤维蛋白原的量则与乳汁存在的各亚单位之间的比例有关。在小鼠乳汁中没有明显的与高浓度的人类纤维蛋白原相关的表型。实施例4
供体母羊在0日用阴道内的含孕酮的棉球(CHRONOGEST Goat Sponge，Intervet，Cambridfe，UK)处理。棉球留在原处保持10或12天。
超数排卵的诱导是通过用总共1单位的羊促卵泡激素(OFSH)(OVAGEN，HorizonAnimal Reproduction Technology Pty.Ltd.，New Zealand)处理，分8次肌肉注射给药，每次注射0.125单位，注射开始于-4日的5：00pm结束于0日的8：00am。在-4日给供者母羊肌肉注射0.5ml的黄体裂解试剂(ESTRUMATE，Vet-Drug)引起黄体退化，使之回复到发情和排卵期。为了使排卵同步，供体动物在0日5：00pm肌肉注射2ml合成的释放激素类似物(RECEPTAL，Vet-Drug)。
在人工授精(A.I.)之前，供体动物要断绝食物和水至少12小时。动物在+1日在镇静和局部麻醉状态下通过子宫内窥人工授精。在人工授精前大约15分钟通过肌肉注射0.05-0.1ml/10kg体重的甲苯噻嗪(ROMPUN，Vet-Drug)或0.1ml/10kg体重剂量的ACP注射液(10mg/ml)(Vet-Drug)使其镇静。人工授精使用从Poll Dorset公羊中刚收集的精液进行。精液用等量的过滤后的磷酸缓冲液稀释，每个子宫喇叭口里注射0.2ml的稀释精液。在人工授精前后，马上给供体动物肌肉注射AMOXYPEN(Vet-Drug)。
从1日5：00pm起给供体动物断绝食物和水，于2日回收受精卵。回收在全麻状态下进行，麻醉是通过静脉注射5％的硫喷妥钠(INTRAVAL SODIUM，Vet-Drug)，剂量为每10kg体重3ml。插管后通过吸入1-2％Halthane/O2/N2保持麻醉状态。为了回收受精卵，要进行一次腹腔切开手术，并从腹腔中取出子宫。卵子的回收是通过给输卵管倒灌注加有New Zealand来源的牛血清白蛋白的Ovum Culture Medium(AdvancedProtein Products，Brierly Hill，West Midlands，UK)。灌注之后，将子宫放回腹腔，缝合伤口。供体动物允许在操作后恢复或是让其“安乐死”。允许恢复的供体动物在操作之前或之后立即肌肉注射操作者推荐剂量的Amoxypen L.A.。
含有三种纤维蛋白原链表达单位的质粒用MluI消化，表达单位片段通过蔗糖密度梯度离心回收与纯化。用荧光计测定片段的浓度，并用上述的不含钙和镁的Dulbecco’s磷酸缓冲液稀释。浓度调节到6μg/ml，约2pl的混合液显微注射进入每个具有可见原核的受精卵的一个原核中。
所有经过原核显微注射的受精卵在体外培养于38.5℃，5％CO2：5％O2：90％N2气氛以及大约100％的湿度，培养基为加有20％v/v的结扎公羊血清的二氧化碳缓冲的合成输卵管培养基(见表)。血清可在56℃加热灭活30分钟，使用前冷冻储存于-20℃。受精卵培养一段合适的时间，使早期胚胎死亡(由操作技术引起的)发生。弃掉那些已死的或停止发育的胚胎。已经发育到5或6次细胞分裂的胚胎转移到同步化的受体母羊中。
        表
  合成输卵管培养基
储液A(可保存使用3个月)
NaCl             6.29g
KCl              0.534g
KH2PO4        0.162g
MgSO4.7H2O    0.182g
青霉素           0.06g
60％乳酸钠糖浆   0.6ml
Super H2O      99.4ml
储液B(可保存使用2周)
NaHCO3         0.21g
酚红             0.001g
Super H2O      10ml
储液C(可保存使用2周)
丙酮酸钠         0.051g
Super H2O      10ml
储液D(可保存使用3个月)
CaCl2·2H2O   0.262g
Super H2O      10ml
储液E(可保存使用3个月)
Hepes            0.651g
酚红             0.001g
Super H2O    10ml
配制10ml碳酸氢盐缓冲培养基
储液A         1ml
储液B         1ml
储液C         0.07ml
储液D         0.1ml
Super H2O    7.83ml
Osmolarity应该是265-285 mOsm。加入2.5ml热灭活的绵羊血过滤除菌。
配制10mls Hepes缓冲培养基
储液A         1ml
储液B         0.2ml
储液C         0.07ml
储液D         0.1ml
储液E         0.8ml
Super H2O    7.83ml
Osmolarity应该是265-285 mOsm。加入2.5ml热灭活的绵羊血过滤除菌。
受体母羊用阴道内的含孕酮的棉球(CHRONOGEST Ewe Sponge or CHRONOGEST Ewe-Lamb Sponge，Intervet)处理，棉球留在原处保持10或12天。在-1日取走棉球，给母羊肌肉注射1.5ml(300iu)的促卵泡激素替代物(P.M.S.G.，Intervet)以及0.5ml的黄体裂解试剂(Estrumate，Coopers Pitman-Moore)。在0日和1日8：00am-5：00pm之间用结扎的公羊试验母羊的发情期。
在6日或7日将体外培养存活下来的胚胎放回受体母羊(从5日或6日5：00pm开始禁食)中。胚胎转移在如上所述的全麻状态下进行。子宫通过剖腹取出，可使用腹窥镜，也可不用。胚胎返回到那些至少具有一个合适的黄体的母羊的子宫的一个或两个喇叭口内。放回子宫之后，缝合腹部伤口。给动物在操作之前或之后立即肌肉注射操作者所推荐剂量的Amoxypen L.A.，让受体动物恢复。
羊羔在耳部挂上标签，放回饲养棚中。母羊和羊羔可以圈养喂以完全饲料和其它辅助饲料，或者随意喂以干草，也可到草地上放养。
在其第一周龄内(或在不损害健康的前提下尽可能早地)，使用两种取样方式试验羊羔中异源DNA的存在。从颈静脉中抽取10ml血样到一个EDTA针管中，如果合适，在头一周内还可以从羊羔中第二次取出血样。组织样品的获取是通过尾部活体解剖，使用一个橡皮筋缠上三圈使尾部失去反应，然后尽可能快地取样(通常在其长出尾巴后200min之内)。组织立刻放入尾部缓冲液中。尾部样品保存于室温并于收集当日分析。所有的羊羔在解剖之后立即肌肉注射操作者所推荐剂量的Amoxypen L.A.，被切过的尾部末端喷以抗生素喷雾剂。
首先分离白细胞从绵羊血液中提取DNA。10ml的血样稀释于20ml的Hank’s缓冲盐(HBS；Sigma Chemical Co.)中。在两个15ml的螺口管中每个内的5ml Histopaque(Sigma)上覆盖10ml的稀释血液。这些管于3,000rpm(最大2,000xg)离心，于室温下缓慢降速15分钟。将白血细胞分界面移到一个干净的15ml管中，用HBS稀释到15ml。稀释的细胞液于室温3,000rpm离心10分钟，回收细胞沉淀，溶于2-5ml尾部缓冲液中。
为了从白细胞中提取DNA，在细胞中加入10％的SDS使其终浓度达到1％，并颠倒管使之混匀。加入1mg新配的蛋白酶K溶液，混合液于45℃保温过夜，DNA用等体积的酚/氯仿抽提3次，并用氯仿/异戊醇抽提一次。加入0.1体积的3M NaAc和2倍体积的乙醇，颠倒混匀。沉淀的DNA用一只干净的末端有标记的玻璃棒缠绕成团。用70％乙醇洗涤后，使DNA凉至半干，然后重新溶解于TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH7.4)中。
来自于血液和尾部的DNA样品使用对BLG启动子区及纤维蛋白原链编码区特异的探针进行Southern印迹分析。
虽然出于阐述本发明的目的，在此做了一些特殊实施方案的描述，但应理解的是，在不背离本发明的精神实质和范围的情况下，除了前面所述的，尚可对其进行各种修改。相应地，本发明将仅受后面所附的权利要求书的限制。
              序列表(1)一般信息：(i)申请人：ZymoGenetics，Inc.
       1201 Eastlake Avenue East
       Seattle，Washington 98102
       United States of America
       Pharmaceutical Proteins Ltd.
       Roslin
       Edinburgh
       Midlothian，Scotland EH25 9PP(ii)发明名称：在转基因动物中生产纤维蛋白原(iii)序列数：27(iv)联系地址：
(A)联系人：ZymoGenetics，Inc.
(B)街道：1201 Eastlake Avenue East
(C)城市：Seattle
(D)州：华盛顿州
(E)国家：美国
(F)邮编：98102(v)计算机可读形式：
(A)媒介类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version#1.25(vi)本申请资料
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：(vi)律师/代理人信息：
(A)姓名：Parker，Gary E
(B)注册号：31-648
(C)案号/文档号：93-15PC(viii)通讯信息：
(A)电话：206-442-6673
(B)传真：206-442-6678(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征
(A)长度：5943bp
(B)类型：核酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)来源：
(B)克隆：人纤维蛋白原A-α链(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：连接(31..84，1154..1279，1739..1922，3055..3200，
             3786..5210)(xi)序列描述：SEQ ID NO：1GTCTAGGAGC CAGCCCCACC CTTAGAAAAG ATG TTT TCC ATG AGG ATC GTC TGC            54
                             Met Phe Ser Met Arg Ile Val Cys
                               1               5CTA GTT CTA AGT GTG GTG GGC ACA GCA TGG GTATGGCCCT TTTCATTTTT              104Leu Val Leu Ser Val Val Gly Thr Ala Trp
 10                  15TCTTCTTGCT TTCTCTCTGG TGTTTATTCC ACAAAGAGCC TGGAGGTCAG AGTCTACCTG          164CTCTATGTCC TGACACACTC TTAGCTTTAT GACCCCAGGC CTGGGAGGAA ATTTCCTGGG          224TGGGCTTGAC ACCTCAAGAA TACAGGGTAA TATGACACCA AGAGGAAGAT CTTAGATGGA          284TGAGAGTGTA CAACTACAAG GGAAACTTTA GCATCTGTCA TTCAGTCTTA CCACATTTTG          344TTTTGTTTTG TTTTAAAAAG GGCAAGAATT ATTTGCCATC CTTGTACCTA TAAAGCCTTG          404GTGCATTATA ATGCTAGTTA ATGGAATAAA ACATTTTATG GTAAGATTTG TTTTCTTTAG          464TTATTAATTT CTTGCTACTT GTCCATAATA AGCAGAACTT TTAGTGTTAG TACAGTTTTG          524CTGAAAGGTT ATTGTTGTGT TTGTCAAGAC AGAAGAAAAA GCAAACGAAT TATCTTTGGA          584AATATCTTTG CAGTATCAGA AGAGATTAGT TAGTAAGGCA ATACGCTTTT CCGCAGTAAT          644GGTATTCTTT TAAATTATGA ATCCATCTCT AAAGGTTACA TAGAAACTTG AAGGAGAGAG     704GAACATTCAG TTAAGATAGT CTAGGTTTTT CTACTGAAGC AGCAATTACA GGAGAAAGAG     764CTCTACAGTA GTTTTCAACT TTCTGTCTGC AGTCATTAGT AAAAATGAAA AGGTAAAATT     824TAACTGATTT TATAGATTCA AATAATTTTC CTTTTAGGAT GGATTCTTTA AAACTCCTAA     884TATTTATCAA ATGCTTATTT AAGTGTCACA CACAGTTAAG AAATTTGTAC ACCTTGTCTC     944CTTTAATTCT CATAACAACT CCATAAAATG GGTCCTAGGA TTTCCATTTG AAGATAAGAA    1004ACCTGAAGCT TGCCGAAGCC CTGTGTCTGC TCTCCTTAAT CTCTGTGAGA GTGCCATCTC    1064TTCCTGGGGA CTTGTAGGCA TGCCACTGTC TCCTCTTCTG GCTAACATTG CTGTTGCTCT    1124CTTTTGTGTA TGTGAATGAA TCTTTAAAG ACT GCA GAT AGT GGT GAA GGT GAC      1177
                            Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp
                                 20                  25TTT CTA GCT GAA GGA GGA GGC GTG CGT GGC CCA AGG GTT GTG GAA AGA      1225Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Gly Pro Arg Val Val Glu Arg
         30                  35              40CAT CAA TCT GCC TGC AAA GAT TCA GAC TGG CCC TTC TGC TCT GAT GAA      1273His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu
     45                  50                  55GAC TGG GTAAGCAGTC AGCGGGGGAA GCAGGAGATT CCTTCCCTCT GATGCTAGAG       1329Asp Trp
 60GGGCTCACAG GCTGACCTGA TTGGTCCCAG AAACTTTTTT AAATAGAAAA TAATTGAATA    1389GTTACCTACA TAGCAAATAA AGAAAAGGAA CCTACTCCCA AGAGCACTGT TTATTTACCT    1449CCCCAACTCT GGATCATTAG TGGGTGAACA GACAGGATTT CAGTTGCATG CTCAGGCAAA    1509ACCAGGCTCC TGAGTATTGT GGCCTCAATT TCCTGGCACC TATTTATGGC TAAGTGGACC    1569CTCATTCCAG AGTTTCTCTG CGACCTCTAA CTAGTCCTCT TACCTACTTT TAAGCCAACT    1629TATCTGGAAG AGAAAGGGTA GGAAGAAATG GGGGCTGCAT GGAAACATGC AAAATTATTC    1689TGAATCTGAG AGATAGATCC TTACTGTAAT TTTCTCCCTT CACTTTCAG  AAC  TAC      1744
                                                   Asn TyrAAA TGC CCT TCT GGC TGC AGG ATG AAA GGG TTG ATT GAT GAA GTC AAT      1792Lys Cys Pro Ser Gly Cys Arg Met Lys Gly Leu Ile Asp Glu Val Asn
     65                  70                  75CAA GAT TTT ACA AAC AGA ATA AAT AAG CTC AAA AAT TCA CTA TTT GAA      1840Gln Asp Phe Thr Asn Arg Ile Asn Lys Leu Lys Asn Ser Leu Phe Glu
 80                  85                  90TAT CAG AAG AAC AAT AAG GAT TCT CAT TCG TTG ACC ACT AAT ATA ATG      1888Tyr Gln Lys Asn Asn Lys Asp Ser His Ser Leu Thr Thr Asn Ile Met95                 100                 105                 110GAA ATT TTG AGA GGC GAT TTT TCC TCA GCC AAT AGTAAGTATTA              1932Glu Ile Leu Arg Gly Asp Phe Ser Ser Ala Asn
            115                 120CATATTTACT TCTTTGACTT TATAACAGAA ACAACAAAAA TCCTAAATAA ATATGATATC    1992CGCTTATATC TATGACAATT TCATCCCAAA GTACTTAGTG TAGAAACACA TACCTTCATA    2052ATATCCCTGA AAATTTTAAG AGGGAGCTTT TGTTTTCGTT ATTTTTTCAA AGTAAAAGAT    2112GTTAACTGAG ATTGTTTAAG GTCACAAAAT AAGTCAGAAT TTTGGATTAA AACAAGAATT    2172TAAATGTGTT CTTTTCAACA GTATATACTG AAAGTAGGAT GGGTCAGACT CTTTGAGTTG    2232ATATTTTTGT TTCTGCTTTG TAAAGGTGAA AACTGAGAGG TCAAGGAACT TGTTCAAAGA    2292CACAGAGCTG GGAATTCAAC TCCCAGACTC CACTGAGCTG ATTAGGTAGA TTTTTAAATT    2352TAAAATATAG GGTCAAGCTA CGTCATTCTC ACAGTCTACT CATTAGGGTT AGGAAACATT    2412GCATTCACTC TGGGCATGGA CAGCGAGTCT AGGGAGTCCT CAGTTTCTCA AGTTTTGCTT    2472TGCCTTTTTA CACCTTCACA AACACTTGAC ATTTAAAATC AGTGATGCCA ACACTAGCTG    2532GCAAGTGAGT GATCCTGTTG ACCCAAAACA GCTTAGGAAC CATTTCAAAT CTATAGAGTT    2592AAAAAGAAAA GCTCATCAGT AAGAAAATCC AATATGTTCA AGTCCCTTGA TTAAGGATGT    2652TATAAAATAA TTGAAATGCA ATCAAACCAA CTATTTTAAC TCCAAATTAC ACCTTTAAAA    2712TTCCAAAGAA AGTTCTTCTT CTATATTTCT TTGGGATTAC TAATTGCTAT TAGGACATCT    2772TAACTGGCAT TCATGGAAGG CTGCAGGGCA TAACATTATC CAAAAGTCAA ATGCCCCATA    2832GGTTTTGAAC TCACAGATTA AACTGTAACC AAAATAAAAT TAGGCATATT TACAAGCTAG    2892TTTCTTTCTT TCTTTTTTCT CTTTCTTTCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTCT TTCTTTCTTT    2952CTTTCTTTCT TTCTCCTTCC TTCCTTTCTT CCTTTCTTTT TTGCTGGCAA TTACAGACAA    3012ATCACTCAGC AGCTACTTCA ATAACCATAT TTTCGATTTC AG  AC CGT GAT AAT       3065
                                           Asn Arg Asp Asn
                                                       125ACC TAC AAC CGA GTG TCA GAG GAT CTG AGA AGC AGA ATT GAA GTC CTG      3113Thr Tyr Asn Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile Glu Val Leu
            130                 135                 140AAG CGC AAA GTC ATA GAA AAA GTA CAG CAT ATC CAG CTT CTG CAG AAA      3161Lys Arg Lys Val Ile Glu Lys Val Gln His Ile Gln Leu Leu Gln Lys
        145                 150                 155AAT GTT AGA GCT CAG TTG GTT GAT ATG AAA CGA CTG GAG GTAAGTATGT       3210Asn Val Arg Ala Gln Leu Val Asp Met Lys Arg Leu Glu
    160                 165                 170GGCTGTGGTC CCGAGTGTCC TTGTTTTTGA GTAGAGGGAA AAGGAAGGCG ATAGTTATGC    3270ACTGAGTGTC TACTATATGC AGAGAAAAGT GTTATATCCA TCATCTACCT AAAAGTAGGT    3330ATTATTTTCC TCACTCCACA GTTGAAGAAA AAAAAATTCA GAGATATTAA GTAAATTTTC    3390CAACGTACAT AGATAGTAAT TCAAAGCAAT GTTCAGTCCC TGTCTATTCC AAGCCATTAC    3450ATCACCACAC CTCTGAGCCC TCAGCCTGAG TTCACCAAGG ATCATTTAAT TAGCGTTTCC    3510TTTGAGAGGG AATAGCACCT TACTCTTGAT CCATTCTGAG GCTAAGATGA ATTAAACAGC    3570ATCCATTGCT TATCCTGGCT AGCCCTGCAA TACCCAACAT CTCTTCCACT GAGGGTGCTC    3630GATAGGCAGA AAACAGAGAA TATTAAGTGG TAGGTCTCCG AGTCAAAAAA AATGAAACCA    3690GTTTCCAGAA GGAAAATTAA CTACCAGGAA CTCAATAGAC GTAGTTTATG TATTTGTATC    3750TACATTTTCT CTTTATTTTT CTCCCCTCTC TCTAG GTG GAC ATT GAT ATT AAG       3803
                                   Val Asp Ile Asp Ile Lys
                                                   175ATC CGA TCT TGT CGA GGG TCA TGC AGT AGG GCT TTA GCT CGT GAA GTA     3851Ile Arg Ser Cys Arg Gly Ser Cys Ser Arg Ala Leu Ala Arg Glu Val
        180                 185                 190GAT CTG AAG GAC TAT GAA GAT CAG CAG AAG CAA CTT GAA CAG GTC ATT     3899Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gln Gln Lys Gln Leu Glu Gln Val Ile
    195                 200                 205GCC AAA GAC TTA CTT CCC TCT AGA GAT AGG CAA CAC TTA CCA CTG ATA     3947Ala Lys Asp Leu Leu Pro Ser Arg Asp Arg Gln His Leu Pro Leu Ile
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        260                 265                 270GGC TCC ACC TCT TAT GGA ACC GGA TCA GAG ACG GAA AGC CCC AGG AAC     4139Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Thr Gly Ser Glu Thr Glu Ser Pro Arg Asn
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370                 375                 380CAA TGG CAC TCT GAA TCT GGA AGT TTT AGG CCA GAT AGC CCA GGC TCT     4475Gln Trp His Ser Glu Ser Gly Ser Phe Arg Pro Asp Ser Pro Gly Ser385                 390                 395                 400GGG AAC GCG AGG CCT AAC AAC CCA GAC TGG GGC ACA TTT GAA GAG GTG     4523Gly Asn Ala Arg Pro Asn Asn Pro Asp Trp Gly Thr Phe Glu Glu Val
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130                 135                 140Val Ile Glu Lys Val Gln His Ile Gln Leu Leu Gln Lys Asn Val Arg145                 150                 155                 160Ala Gln Leu Val Asp Met Lys Arg Leu Glu Val Asp Ile Asp Ile Lys
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        180                 185                 190Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gln Gln Lys Gln Leu Glu Gln Val Ile
    195                 200                 205Ala Lys Asp Leu Leu Pro Ser Arg Asp Arg Gln His Leu Pro Leu Ile
210                 215                 220Lys Met Lys Pro Val Pro Asp Leu Val Pro Gly Asn Phe Lys Ser Gln225                 230                 235                 240Leu Gl n Lys Val Pro Pro Glu Trp Lys Ala Leu ThrAsp Met Pro Gln
             245                 250                255Met Arg Met Glu Leu Glu Arg Pro Gly Gly Asn Glu Ile Thr Arg Gly
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    275                 280                 285Pro Ser Ser Ala Gly Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser
290                 295                 300Thr Gly Asn Arg Asn Pro Gly Ser Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr305                 310                 315                 320Trp Lys Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser Ala Gly Ser Trp Asn Ser
            325                 330                 335Gly Ser Ser Gly Thr Gly Ser Thr Gly Asn Gln Asn Pro Gly Ser Pro
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530                 535                 540Glu Ser Arg Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn Thr Lys Glu Ser545                 550                 555                 560Ser Ser His His Pro Gly Ile Ala Glu Phe Pro Ser Arg Gly Lys Ser
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(A)长度：8878bp
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(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)来源：
(B)克隆：人纤维蛋白原B-β链(ix)特征：
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(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：连接(470..583，3258..3449，3939..4122，5043..5270，
              5831..5944，6633..6758，6967..7252，7871..8102)(xi)序列描述：SEQ ID NO：3GAATTCATGC CCCTTTTGAA ATAGACTTAT GTCATTGTCA GAAAACATAA GCATTTATGG      60TATATCATTA ATGAGTCACG ATTTTAGTGG TTGCCTTGTG AGTAGGTCAA ATTTACTAAG     120CTTAGATTTG TTTTCTCACA TATTCTTTCG GAGCTTGTGT AGTTTCCACA TTAATTTACC     180AGAAACAAGA TACACACTCT CTTTGAGGAG TGCCCTAACT TCCCATCATT TTGTCCAATT     240AAATGAATTG AAGAAATTTA ATGTTTCTAA ACTAGACCAA CAAAGAATAA TAGTTGTATG     300ACAAGTAAAT AAGCTTTGCT GGGAAGATGT TGCTTAAATG ATAAAATGGT TCAGCCAACA     360AGTGAACCAA AAATTAAATA TTAACTAAGG AAAGGTAACC ATTTCTGAAG TCATTCCTAG     420CAGAGGACTC AGATATATAT AGGATTGAAG ATCTCTCAGT TAAGTCTAC ATG AAA         475
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                  Asp Asn Glu Asn Val Val Asn Glu Tyr Ser
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                             Glu Cys Glu Glu Ile Ile Arg Lys
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265                 270                 275GTAAGCTTTC GACAGTTGTT GACCTGTTGA TCTGTAATTA TTTGGATACC GTAAAATGCC    6004AGGAAACAAG GCCAGGTGTG GTGGCTCATA CCTGTAATTC CAGCACCTTG GGAGGCCAAA    6064GTGGGCTGAT AGCTTGAGCC TAGGAGTTTG AAACTAGCCT GGGCAACATA ATGAGACCCT    6124AACTCTACAA AAAAAAAAAA AATACCAAAA AAAAAAAAAA AATCAGCTGT GTTGGTAGTA    6184TGTGCCTGTA GTCCCAGCTA TCCAGGAGGC TGAGATGGGA GATCACCTGA GCCCACAACC    6244TGGAGTCTTG ATCATGCTAC TGAACTGTAG CCTGGGCAAC AGAGGATAGT GAGATCCTGT    6304CTCAAAAAAA AAAATTAATT AAAAAGCCAG GAAACAAGAC TTAGCTCTAA CATCTAACAT    6364AGCTGACAAA GGAGTAATTT GATGTGGAAT TCAACCTGAT ATTTAAAAGT TATAAAATAT    6424CTATAATTCA CAATTTGGGG TAAGATAAAG CACTTGCAGT TTCCAAAGAT TTTACAAGTT    6484TACCTCTCAT ATTTATTTCC TTATTGTGTC TATTTTAGAG CACCAAATAT ATACTAAATG    6544GAATGGACAG GGGATTCAGA TATTATTTTC AAAGTGACAT TATTTGCTGT TGGTTAATAT    6604ATGCTCTTTT TGTTTCTGTC AACCAAAG  GA TGG ACA GTG ATT CAG AAC CGT       6655
                           Gly Trp Thr Val Ile Gln Asn Arg
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                                      Gly Glu Tyr Trp Leu
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        360                 365                 370AAC AAA TAC AGA GGA ACA GCC GGT AAT GCC CTC ATG GAT GGA GCA TCT      7172Asn Lys Tyr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Ala Leu Met Asp Gly Ala Ser
    375                 380                 385CAG CTG ATG GGA GAA AAC AGG ACC ATG ACC ATT CAC AAC GGC ATG TTC      7220Gln Leu Met Gly Glu Asn Arg Thr Met Thr Ile His Asn Gly Met Phe
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       Leu Thr Ser Asp Pro Arg Lys Gln Cys Ser Lys Glu Asp
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430                 435                 440AGA TAC TAC TGG GGT GGA CAG TAC ACC TGG GAC ATG GCA AAG CAT GGC      8006Arg Tyr Tyr Trp Gly Gly Gln Tyr Thr Trp Asp Met Ala Lys His Gly445                 450                 455                 460ACA GAT GAT GGT GTA GTA TGG ATG AAT TGG AAG GGG TCA TGG TAC TCA      8054Thr Asp Asp Gly Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly Ser Trp Tyr Ser
                465             470                 475ATG AGG AAG ATG AGT ATG AAG ATC AGG CCC TTC TTC CCA CAG CAA TAGTCCCCAA8109Met Arg Lys Met Ser Met Lys Ile Arg Pro Phe Phe Pro Gln Gln
        480                 485                 490TACGTAGATT TTTGCTCTTC TGTATGTGAC AACATTTTTG TACATTATGT TATTGGAATT    8169TTCTTTCATA CATTATATTC CTCTAAAACT CTCAAGCAGA CGTGAGTGTG ACTTTTTGAA    8229AAAAGTATAG GATAAATTAC ATTAAAATAG CACATGATTT TCTTTTGTTT TCTTCATTTC    8289TCTTGCTCAC CCAAGAAGTA ACAAAAGTAT AGTTTTGACA GAGTTGGTGT TCATAATTTC    8349AGTTCTAGTT GATTGCGAGA ATTTTCAAAT AAGGAAGAGG GGTCTTTTAT CCTTGTCGTA    8409GGAAAACCAT GACGGAAAGG AAAAACTGAT GTTTAAAAGT CCACTTTTAA AACTATATTT    8469ATTTATGTAG GATCTGTCAA AGAAAACTTC CAAAAAGATT TATTAATTAA ACCAGACTCT    8529GTTGCAATAA GTTAATGTTT TCTTGTTTTG TAATCCACAC ATTCAATGAG TTAGGCTTTG   8589CACTTGTAAG GAAGGAGAAG CGTTCACAAC CTCAAATAGC TAATAAACCG GTCTTGAATA   8649TTTGAAGATT TAAAATCTGA CTCTAGGACG GGCACGGTGG CTCACGACTA TAATCCCAAC   8709ACTTTGGGAG GCTGAGGCGG GCGGTCACAA GGTCAGGAGT TCAAGACCAG CCTGACCAAT   8769ATGGTGAAAC CCCATCTCTA CTAAAAATAC AAAAATTAGC CAGGCGTGGT GGCAGGTGCC   8829TGTAGGTCCC AGCTAGCCTG TGAGGTGGAG ATTGCATTGA GCCAAGATC               8878(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征
(A)长度：491个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4Met Lys Arg Met Val Ser Trp Ser Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys1               5                  10                  15His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly
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                 Arg Leu Asp Gly Ser Val Asp Phe Lys Lys Asn
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  Thr Ala Asp Tyr Ala Met Phe Lys Val Gly Pro Glu Ala Asp
  285                 290                 295AAG TAC CGC CTA ACA TAT GCC TAC TTC GCT GGT GGG GAT GCT GGA GAT     7516Lys Tyr Arg Leu Thr Tyr Ala Tyr Phe Ala Gly Gly Asp Ala Gly Asp
300                 305                 310GCC TTT GAT GGC TTT GAT TTT GGC GAT GAT CCT AGT GAC AAG TTT TTC     7564Ala Phe Asp Gly Phe Asp Phe Gly Asp Asp Pro Ser Asp Lys Phe Phe315                 320                 325                 330ACA TCC CAT AAT GGC ATG CAG TTC AGT ACC TGG GAC AAT GAC AAT GAT     7612Thr Ser His Asn Gly Met Gln Phe Ser Thr Trp Asp Asn Asp Asn Asp
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    365                 370                 375GTATGTTTTC  CTTTCTTAGA  TTCCAAGTTA  ATGTATAGTG  TATACTATTT  TCATAAAAAA        7763TAATAAATAG  ATATGAAGAA  ATGAAGAATA  ATTTATAAAG  ATAGTAGGGA  TTTTATCATG        7823TTCTTTATTT  CAACTAAGTT  CTTTGAAACT  GGAAGTGGAT  AATACCAAGT  TCATGCCTAA        7883AATTAGCCCT  TCTAAAGAAA  TCCACCTGCT  GCAAAATATC  CAGTAGTTTG  GCATTATATG        7943TGAAACTATC  ACCATCATAG  CTGGCACTGT  GGGTTGTGGG  ATCTCCTTTA  GACATACAAC        8003ATAAATGATC  TGGATGGATT  AACATTACTA  CATGGATGCT  TGTTGACACA  TTAACCTGGC        8063TTCCCATGAG  CTTTGTGTCA  GATACACGCA  GTGAACAGGT  GTTTGGAGGA  ACAGAATAAA        8123GAGAAGGCAA  GCACTGGTAA  GGGCAGGGGT  TTGTGAAAGC  TTGAGAGAAG  AGACCAGTCT        8183GAGGACAGTA  GACACTTATT  TTAGGATGGG  GGTTGGATGA  GGAGGCTATA  GTTTGCTATA        8243AGCTTGGAAT  GGTTTGGAAC  ACTGGTTTCA  CTCACCTACC  CAGCAGTTAT  GTGTGGGGAA        8303GCCTTACCGA  TGCTAAAGGA  TCCATGTTAC  AATAATGGCA  TTATTTGGAA  ATCCCAGTGG        8363TATTCCATGA  ATAAAACCAC  TATGAAGATA  ATCCCACTCA  ACAGACTCTC  CGTTGGAGAA        8423GGACAGCAAC  ACCACCCTGG  GAAAGCCAAA  CAGTCAGACC  AGACCTGTTT  AGCATCAGTA        8483GGACTTCCCT  ACCATATCTG  CTGGGTAGAT  GAGTGAAACC  AGTGTTCCAA  ACCACTCCGG        8543GCTTGTAGCA  AACCATAGTC  TCCTCATCTA  CCAAGATGAG  CAACCTTACC  TCCTGATGTC        8603CTAGCCAATC  ACCAACTAGG  AAACTTTGCA  CAGTTTATTT  AAAGTAACAG  TTTGATTTTC        8663ACAATATTTT  TAAATTGGAG  AAACATAACT  TATCTTTGCA  CTCACAAACC  ACATAATGAG        8723AAGAAACTCT  AAGGGAAAAT  GCTTGATCTG  TGTGACCCGG  GGCGCCATGC  CAGAGCTGTA        8783GTTCATGCCA  GTGTTGTGCT  CTGACAAGCC  TTTTACAGAA  TTACATGAGA  TCTGCTTCCC        8843TAGGACAAGG  AGAAGGCAAA  TCAACAGAGG  CTGCACTTTA  AAATGGAGAC  ATAAAATAAC        8903ATGCCAGAAC  CATTTCCTAA  AGCTCCTCAA  TCAACCAACA  AAATTGTGCT  TTCAAATAAC        8963CTGAGTTGAC  CTCATCAGGA  ATTTTGTGGC  TCCTTCTCTT  CTAACCTGCC  TGAAGAAAGA        9023TGGTCCACAG  CAGCTGAGTC  CGGGATGGAT  AAGCTTAGGG  ACAGAGGCCA  ATTAGGGAAC        9083TTTGGGTTTC TAGCCCTACT AGTAGTGAAT AAATTTAAAG TGTGGATGTG ACTATGAGTC    9143ACAGCACAGA TGTTGTTTAA TAATATGTTT ATTTTATAAA TTGATATTTT AGGAATCTTT    9203GGAGATATTT TCAGTTAGCA GATAATACTA TAAATTTTAT GTAACTGGCA ATGCACTTCG    9263TAATAGACAG CTCTTCATAG ACTTGCAGAG GTAAAAAGAT TCCAGAATAA TGATATGTAC    9323ATCTACGACT TGTTTTAG  GT GGC ACT TAC TCA AAA GCA TCT ACT CCT AAT      9373
                Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Ala Ser Thr Pro Asn
                            380                 385GGT TAT GAT AAT GGC ATT ATT TGG GCC ACT TGG AAA ACC CGG TGG TAT      9421Gly Tyr Asp Asn Gly Ile Ile Trp Ala Thr Trp Lys Thr Arg Trp Tyr
    390                 395                 400TCC ATG AAG AAA ACC ACT ATG AAG ATA ATC CCA TTC AAC AGA CTC ACA      9469Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro Phe Asn Arg Leu Thr
405                 410                 415ATT GGA GAA GGA CAG CAA CAC CAC CTG GGG GGA GCC AAA CAG GTC AGA      9517Ile Gly Glu Gly Gln Gln His His Leu Gly Gly Ala Lys Gln Val Arg420                 425                 430                 435CCA GAG CAC CCT GCG GAA ACA GAA TAT GAC TCA CTT TAC CCT GAG GAT      9565Pro Glu His Pro Ala Glu Thr Glu Tyr Asp Ser Leu Tyr Pro Glu Asp
            440                 445                 450GAT TTG TAGAAAATTA ACTGCTAACT TCTATTGACC CACAAAGTTT CAGAAATTCT       9621Asp LeuCTGAAAGTTT CTTCCTTTTT TCTCTTACTA TATTTATTGA TTTCAAGTCT TCTATTAAGG    9681ACATTTAGCC TTCAATGGAA ATTAAAACTC ATTTAGGACT GTATTTCCAA ATTACTGATA    9741TCAGAGTTAT TTAAAAATTG TTTATTTGAG GAGATAACAT TTCAACTTTG TTCCTAAATA    9801TATAATAATA AAATGATTGA CTTTATTTGC ATTTTTATGA CCACTTGTCA TTTATTTTGT    9861CTTCGTAAAT TATTTTCATT ATATCAAATA TTTTAGTATG TACTTAATAA AATAGGAGAA    9921CATTTTAGAG TTTCAAATTC CCAGGTATTT TCCTTGTTTA TTACCCCTAA ATCATTCCTA    9981TTTAATTCTT CTTTTTAAAT GGAGAAAATT ATGTCTTTTT AATATGGTTT TTGTTTTGTT   10041ATATATTCAC AGGCTGGAGA CGTTTAAAAG ACCGTTTCAA AAGAGATTTA CTTTTTTAAA   10101GGACTTTATC TGAACAGAGA GATATAATAT TTTTCCTATT GGACAATGGA CTTGCAAAGC       10161TTCACTTCAT TTTAAGAGCA AAAGACCCCA TGTTGAAAAC TCCATAACAG TTTTATGCTG       10221ATGATAATTT ATCTACATGC ATTTCAATAA ACCTTTTGTT TCCTAAGACT AGATACATGG       10281TACCTTTATT GACCATTAAA AAACCACCAC TTTTTGCCAA TTTACCAATT ACAATTGGGC       10341AACCATCAGT AGTAATTGAG TCCTCATTTT ATGCTAAATG TTATGCCTAA CTCTTTGGGA       10401GTTACAAAGG AAATAGCAAT TATGGCTTTT GCCCTCTAGG AGATACAGGA CAAATACAGG       10461AAAATACAGC AACCCAAACT GACAATACTC TATACAAGAA CATAATCACT AAGCAGGAGT       10521CACAGCCACA CAACCAAGAT GCATAGTATC CAAAGTGCAG CTG                         10564(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征
(A)长度：453个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6Met Ser Trp Ser Leu His Pro Arg Asn Leu Ile Leu Tyr Phe Tyr Ala1               5                  10                  15Leu Leu Phe Leu Ser Ser Thr Cys Val Ala Tyr Val Ala Thr Arg Asp
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     35                  40                  45Cys Gly Ile Ala Asp Phe Leu Ser Thr Tyr Gln Thr Lys Val Asp Lys
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        340                 345                 350Ala Glu Gln Asp Gly Ser Gly Trp Trp Met Asn Lys Cys His Ala Gly
    355                 360                 365His Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Ala Ser
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    435                 440                 445Pro Glu Asp Asp Leu
450(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征
(A)长度：10807bp
(B)类型：核酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性(vii)来源：
(B)克隆：卵β-乳球蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：7ACGCGTGTCG ACCTGCAGGT CAACGGATCT CTGTGTCTGT TTTCATGTTA GTACCACACT       60GTTTTGGTGG CTGTAGCTTT CAGCTACAGT CTGAAGTCAT AAAGCCTGGT ACCTCCAGCT      120CTGTTCTCTC TCAAGATTGT GTTCTGCTGT TTGGGTCTTT AGTGTCTCCA CACAATTTTT      180AGAATTGTTT GTTCTAGTTC TGTGAAAAAT GATGCTGGTA TTTTGATAAG GATTGCATTG      240AATCTGTAAA GCTACAGATA TAGTCATTGG GTAGTACAGT CACTTTAACA ATATTAACTC      300TTCACATCTG  TGAGCATGAT  ATATTTTCCC  CCTCTATATC  ATCTTCAATT  CCTCCTATCA          360GTTTCTTTCA  TTGCAGTTTT  CTGAGTACAG  GTCTTACACC  TCCTTGGTTA  GAGTCATTCC          420TCAGTATTTT  ATTCCTTTGA  TACAATTGTG  AATGAGGTAA  TTTTCTTAGT  TTCTCTTTCT          480GATAGCTCAT  TGTTAGTGTA  TATATAGAAA  AGCAACAGAT  TTCTATGTAT  TAATTTTGTA          540TCCTGCAACA  GATTTCTATG  TATTAATTTT  GTATCCTGCT  ACTTTACGGA  ATTCACTTAT          600TAGCTTTTTG  GTGACATCTT  GAGGATTTTC  TGAAGAAAAT  GGCATGGTAT  GGTAGGACAA          660GGTGTCATGT  CATCTGCAAA  CAGTGGCAGT  TTTCCTTCTT  CCCTTCCAAC  CTGGATTTCT          720TTGATTTCTT  TCTGTCTGAG  TACGACTAGG  ATTCCCAATA  CTATACCGAA  TAAAAGTGGC          780AAGAGTGGAC  ATCCTTGTCT  TATTTTTCTG  ACCTTAGAGG  AAATGCTTTC  AGTTTTTCAC          840CATTAATTAT  AATGTTTACT  GTGGGCTTGT  CATATGTGGC  CTTCATTATA  TGGAGGTCTA          900TTCCCTCTAT  ACCCACCTTG  TTGAGAGTTT  TTATCATAAA  AGTATGTTGA  ATTTTGTCAA          960AAGTTTTTCC  TGCATCTATT  GAGATGATTT  TTACTCTTCA  ATTCATTAAT  GATTTTTATT         1020CTTCATTTTG  TTAATGATTT  CCATTCTTCA  ATTTGTTAAC  GTGGTATATC  ACATTGATTG         1080ATTTGTGGAT  ACCTTTGTAT  CCCTGGGATA  AACCTCACTT  GATCATGAGC  TTTCAATGTA         1140TTTTTGAATT  CACTTTGCTA  ATATTCTGTT  GGGTATTTTT  GCATCTCTAT  TCATCAATGA         1200TATTGGCCTA  AGAAAGGTTT  TGTCTGGTTT  TAGTATCAGG  GTGATGCTGG  CCTCATAGAG         1260AGAGTTTAGA  AGCATTTCCT  CCTCTTTGAT  TTTTCGGAAT  AGTTTGAGTA  GGATAGGTAT         1320TAACTCTTCT  TTAAATGTTT  GGGGACTTCC  CTGGTGAGCC  GGTGGTTGAG  AATCCGCCTC         1380AGGGATGTGG  GTTTGATCCC  TGGTCAGGGA  ACCATTAATA  AGATCCCACA  TGCTGCAGGC         1440AACAAGCCCC  CAAGCTGCAA  CCACTGAGCT  GCAACCGCTG  CAGTGCCCAC  AGGCCACGAC         1500CAGAGAAAGC  CCACATACAG  CAGGGAAGAC  CCAGCACAAC  CGGAAAAAGG  AGTTTGGTGG         1560AATACAGCTG  TGAAGCCGTC  TGGTCCTGGA  CTCCTGCTTG  AGGGAATTTT  TTAAAAATTA         1620TTGATTCAAT  TTCATTACTG  GTAACTGGTC  TGTTCATATT  TTCTATTTCT  TCCGGGTTCA         1680GTCTTGGGAG  ATTGTACATG  CCTAGGAATG  TGTCCGTTTC  TTCTAGGTTG  TCCATTTTAT         1740TGGACATGCA  TGGGAGCACA  CAGCACCGAC  CAGCGAGACT  CATGCTGGCT  TCCTGGGGCC    1800AGGCTGGGGC  CCCAAGCAGC  ATGGCATCCT  AGAGTGTGTG  AAAGCCCACT  GACCCTGCCC    1860AGCCCCACAA  TTTCATTCTG  AGAAGTGATT  CCTTGCTTCT  GCACTTACAG  GCCCAGGATC    1920TGACCTGCTT  CTGAGGAGCA  GGGGTTTTGG  CAGGACGGGG  AGATGCTGAG  AGCCGACGGG    1980GGTCCAGGTC  CCCTCCCAGG  CCCCCCTGTC  TGGGGCAGCC  CTTGGGAAAG  ATTGCCCCAG    2040TCTCCCTCCT  ACAGTGGTCA  GTCCCAGCTG  CCCCAGGCCA  GAGCTGCTTT  ATTTCCGTCT    2100CTCTCTCTGG  ATGGTATTCT  CTGGAAGCTG  AAGGTTCCTG  AAGTTATGAA  TAGCTTTGCC    2160CTGAAGGGCA  TGGTTTGTGG  TCACGGTTCA  CAGGAACTTG  GGAGACCCTG  CAGCTCAGAC    2220GTCCCGAGAT  TGGTGGCACC  CAGATTTCCT  AAGCTCGCTG  GGGAACAGGG  CGCTTGTTTC    2280TCCCTGGCTG  ACCTCCCTCC  TCCCTGCATC  ACCCAGTTCT  GAAAGCAGAG  CGGTGCTGGG    2340GTCACAGCCT  CTCGCATCTA  ACGCCGGTGT  CCAAACCACC  CGTGCTGGTG  TTCGGGGGGC    2400TACCTATGGG  GAAGGGCTTC  TCACTGCAGT  GGTGCCCCCC  GTCCCCTCTG  AGATCAGAAG    2460TCCCAGTCCG  GACGTCAAAC  AGGCCGAGCT  CCCTCCAGAG  GCTCCAGGGA  GGGATCCTTG    2520CCCCCCCGCT  GCTGCCTCCA  GCTCCTGGTG  CCGCACCCTT  GAGCCTGATC  TTGTAGACGC    2580CTCAGTCTAG  TCTCTGCCTC  CGTGTTCACA  CGCCTTCTCC  CCATGTCCCC  TCCGTGTCCC    2640CGTTTTCTCT  CACAAGGACA  CCGGACATTA  GATTAGCCCC  TGTTCCAGCC  TCACCTGAAC    2700AGCTCACATC  TGTAAAGACC  TAGATTCCAA  ACAAGATTCC  AACCTGAAGT  TCCCGGTGGA    2760TGTGAGTTCT  GGGGCGACAT  CCTTCAACCC  CATCACAGCT  TGCAGTTCAT  CGCAAAACAT    2820GGAACCTGGG  GTTTATCGTA  AAACCCAGGT  TCTTCATGAA  ACACTGAGCT  TCGAGGCTTG    2880TTGCAAGAAT  TAAAGGTGCT  AATACAGATC  AGGGCAAGGA  CTGAAGCTGG  CTAAGCCTCC    2940TCTTTCCATC  ACAGGAAAGG  GGGGCCTGGG  GGCGGCTGGA  GGTCTGCTCC  CGTGAGTGAG    3000CTCTTTCCTG  CTACAGTCAC  CAACAGTCTC  TCTGGGAAGG  AAACCAGAGG  CCAGAGAGCA    3060AGCCGGAGCT  AGTTTAGGAG  ACCCCTGAAC  CTCCACCCAA  GATGCTGACC  AGCCAGCGGG    3120CCCCCTGGAA  AGACCCTACA  GTTCAGGGGG  GAAGAGGGGC  TGACCCGCCA  GGTCCCTGCT    3180ATCAGGAGAC  ATCCCCGCTA  TCAGGAGATT  CCCCCACCTT  GCTCCCGTTC  CCCTATCCCA    3240ATACGCCCAC  CCCACCCCTG  TGATGAGCAG  TTTAGTCACT  TAGAATGTCA  ACTGAAGGCT    3300TTTGCATCCC  CTTTGCCAGA  GGCACAAGGC  ACCCACAGCC  TGCTGGGTAC  CGACGCCCAT    3360GTGGATTCAG  CCAGGAGGCC  TGTCCTGCAC  CCTCCCTGCT  CGGGCCCCCT  CTGTGCTCAG    3420CAACACACCC  AGCACCAGCA  TTCCCGCTGC  TCCTGAGGTC  TGCAGGCAGC  TCGCTGTAGC    3480CTGAGCGGTG  TGGAGGGAAG  TGTCCTGGGA  GATTTAAAAT  GTGAGAGGCG  GGAGGTGGGA    3540GGTTGGGCCC  TGTGGGCCTG  CCCATCCCAC  GTGCCTGCAT  TAGCCCCAGT  GCTGCTCAGC    3600CGTGCCCCCG  CCGCAGGGGT  CAGGTCACTT  TCCCGTCCTG  GGGTTATTAT  GACTCTTGTC    3660ATTGCCATTG  CCATTTTTGC  TACCCTAACT  GGGCAGCAGG  TGCTTGCAGA  GCCCTCGATA    3720CCGACCAGGT  CCTCCCTCGG  AGCTCGA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(B)克隆：ZC6624(xi)序列描述：SEQ ID NO：22GCTGCGGAAT TCTACGTACT ATTGCTGTGG GAA             33(2)SEQ ID NO：23的信息：(i)序列特征
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(B)克隆：ZC6514(xi)序列描述：SEQ ID NO：23CGACGCGGAT CCTACGTACC TGCAGCCATG AGTTGGTCCT TGCAC 45(2)SEQ ID NO：24的信息：(i)序列特征
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Claims (29)

1.一种生产纤维蛋白原的方法，包括：
提供编码与纤维蛋白原Aα链相连接的分泌信号的第一条DNA片段，编码与纤维蛋白原Bβ链相连接的分泌信号的第二条DNA片段，和编码与纤维蛋白原γ链相连接的分泌信号的第三条DNA片段，其中第一、第二、第三条片段中的每一条都与在雌性哺乳动物宿主的乳腺中表达其所需要的附加的DNA片段相连接；
将所说的DNA片段导入一个非人类哺乳动物物种的受精卵；
将所说的受精卵植入所说的物种的雌性动物的输卵管或子宫内，以获得带有所说的DNA结构的后代；
繁殖所说的后代以产生雌性后裔，来表达所说的第一、第二、第三条DNA片段并生产出含有由这些片段编码的生物感受态纤维蛋白原的乳汁；
从所说的雌性后裔中收集乳汁；
从这些乳汁中回收纤维蛋白原。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的物种选自由绵羊，猪，山羊和牛组成的一组。
3.根据权利要求1的方法，其中所说的第一，第二和第三条DNA片段中的每一条包括一个内含子。
4.根据权利要求1的方法，其中所说的第一，第二和第三条DNA片段的摩尔比在0.5-1∶0.5-1∶0.5-1范围之内。
5.根据权利要求1的方法，其中所说的第一，第二和第三条DNA片段中的每一条都连接有选自由酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳清蛋白以及乳清酸性蛋白基因启动子组成的一组中的一个转录启动子。
6.根据权利要求1的方法，其中所说的第一，第二和第三条DNA片段在β-乳球蛋白启动子的控制之下表达。
7.根据权利要求1的方法，其中所说的导入步骤包括向所说的受精卵的一个原核中注射所说的第一，第二和第三条DNA片段。
8.根据权利要求1的方法，其中所说的纤维蛋白原是人类纤维蛋白原。
9.根据权利要求1的方法，其中所说的第二条DNA片段包括如SEQ ID NO：3所示的从470位-8100位核苷酸的核苷酸序列。
10.根据权利要求1的方法，其中所说的第二条DNA片段包括如SEQ ID NO：3的从512位-8100位核苷酸的核苷酸序列。
11.一种生产纤维蛋白原的方法，包括：
将编码与纤维蛋白原Aα链相连的分泌信号的第一条DNA片段掺入β-乳球蛋白基因，生产出第一个融合基因；
将编码与纤维蛋白原Bβ链相连的分泌信号的第二条DNA片段掺入β-乳球蛋白基因，生产出第二个融合基因；
将编码与纤维蛋白原γ链相连的分泌信号的第三条DNA片段掺入β-乳球蛋白基因，生产出第三个融合基因；
将所说的第一、第二、第三个融合基因导入一非人类哺乳动物的种系，使得所说的DNA片段在该哺乳动物或其雌性后裔的乳腺中表达，并且生物感受态纤维蛋白原分泌到该哺乳动物或其雌性后裔的乳汁中；
从所说的哺乳动物或其雌性后裔中获得乳汁；
从所说的乳汁中回收所说的纤维蛋白原。
12.根据权利要求11的方法，其中所说的哺乳动物是绵羊，猪，山羊或牛。
13.根据权利要求11的方法，其中所说的第一，第二和第三个融合基因中的每一个包括一个内含子。
14.根据权利要求11的方法，其中所说的第一，第二和第三个融合基因的摩尔比在0.5-1∶0.5-1∶0.5-1范围之内。
15.根据权利要求11的方法，其中所说的导入步骤包括向所说的受精卵的一个原核中注射所说的第一，第二和第三个融合基因，并将所说的卵植入假孕的雌性动物的输卵管，以产生在其种系中带有所说的融合基因的雌性后代。
16.一种生产纤维蛋白原的方法，包括：
提供一种非人类的转基因雌性哺乳动物，在其种系中带有编码纤维蛋白原Aα，Bβ及γ链的异源DNA片段，其中所说的DNA片段在所说的哺乳动物的乳腺中表达而所说的DNA片段所编码的纤维蛋白原分泌到所说的哺乳动物的乳汁中；
从所说的哺乳动物中收集乳汁；
从所说的乳汁中回收所说的纤维蛋白原。
17.根据权利要求16的方法，其中所说的哺乳动物是绵羊，猪，山羊或牛。
18.一种非人类哺乳动物的胚胎，在其细胞核中含有编码纤维蛋白原Aα，Bβ及γ链的异源DNA片段。
19.一种在其乳汁中生产可回收量的人类纤维蛋白原的转基因非人类哺乳动物。
20.一种生产哺乳动物的转基因后代的方法，包括：
提供编码纤维蛋白原Aα链的第一条DNA片段，编码纤维蛋白原Bβ链的第二条DNA片段，和编码纤维蛋白原γ链的第三条DNA片段，其中第一、第二、第三条片段中的每一条都与在雌性哺乳动物宿主的乳腺中表达其并分泌到所说的宿主雌性哺乳动物的乳汁中所需要的附加的DNA片段相连接；
将所说的DNA片段导入一个非人类哺乳动物的受精卵；
将所说的受精卵植入所说的非人类物种的雌性动物的输卵管或子宫内，以获得带有所说的第一、第二和第三条DNA片段的后代。
21.根据权利要求20的方法，其中所说的后代是雌性的。
22.根据权利要求20的方法，其中所说的后代是雄性的。
23.一种根据权利要求20的方法生产的非人类哺乳动物。
24.根据权利要求23的非人类哺乳动物，其中所说的哺乳动物是雌性的。
25.根据权利要求24的雌性哺乳动物，其生产含有所说的DNA片段所编码的生物感受态纤维蛋白原的乳汁。
26.根据权利要求23的非人类哺乳动物，其中所说的哺乳动物是雄性的。
27.一种在其种系中带有编码异源纤维蛋白原的Aα，Bβ及γ链的DNA片段的非人类哺乳动物，其中所说的哺乳动物的雌性后裔在其乳腺中表达所说的DNA片段并生产生物感受态纤维蛋白原。
28.根据权利要求27的哺乳动物，其中所说的哺乳动物是雌性的。
29.根据权利要求27的哺乳动物，其中所说的哺乳动物是雄性的。
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