ES2395898T3

ES2395898T3 - Fosfolipasas, ácidos nucleicos que las codifican, y métodos para obtenerlas y usarlas

Info

Publication number: ES2395898T3
Application number: ES03747055T
Authority: ES
Inventors: Svetlana Gramatikova; Geoff Hazlewood; David Lam; Nelson Barton
Original assignee: DSM IP Assets BV; Verenium Corp
Current assignee: DSM IP Assets BV; BASF Enzymes LLC
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2003-04-21
Publication date: 2013-02-15
Anticipated expiration: 2023-04-21
Also published as: WO2003089620A2; EP1497418B1; JP2005523019A; EP1497418A4; BR0309391A; AU2003243157C1; WO2003089620A3; AU2003243157A1; EA200401407A1; US20040005604A1; CN102174546A; EP1497418A2; EP2298871A1; PT1497418E; CA2481411A1; EA010903B1; CA2481411C; BRPI0309391B1; CN1659276A; AU2003243157B2

Abstract

Ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende (a) una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID NO: 1; (b) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 5 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEC ID nº 1, en la que el ácido nucleicocodifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa C, (c) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID NO: 2, enla que el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa C; (d) la secuencia de ácido nucleico de (a), (b) o (c), pero que no comprende una secuencia de ácido nucleico quecodifica una secuencia señal; (e) la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (d), que comprende además una secuencia de ácidonucleico que codifica un péptido o un polipéptido heterólogo; o (f) una secuencia de ácido nucleico totalmente complementaria a cualquiera de (a) a (e).

Description

Fosfolipasas, ácidos nucleicos que las codifican, y métodos para obtenerlas y usarlas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere generalmente a enzimas fosfolipasas, a polinucleótidos que codifican las enzimas, a métodos para obtener y usar estos polinucleótidos y polipéptidos. En particular, la invención proporciona nuevos polipéptidos que tienen actividad de fosfolipasa, ácidos nucleicos que los codifican y anticuerpos que se unen a ellos. También se proporcionan métodos industriales y productos que comprenden el uso de estas fosfolipasas.

ANTECEDENTES

Las fosfolipasas son enzimas que hidrolizan los enlaces de éster de los fosfolípidos. Correspondiente a su importancia en el metabolismo de fosfolípidos, estas enzimas están ampliamente extendidas entre procariotas y eucariotas. Las fosfolipasas afectan al metabolismo, construcción y reorganización de las membranas biológicas, y están implicadas en las cascadas de señales. Se conocen varios tipos de fosfolipasas que difieren en su especificidad según la posición del enlace atacada en la molécula fosfolipídica. La fosfolipasa A1 (PLA1) elimina el ácido graso de la posición 1 para producir ácido graso libre y también 1-liso-2-acilfosfolípido. La fosfolipasa A2 (PLA2) elimina el ácido graso de la posición 2 para producir ácido graso libre y 1-acil-2-lisofosfolípido. Las enzimas PLA1 y PLA2 pueden ser intra- o extracelulares, unidas a la membrana o solubles. PLA2 intracelular se encuentra en casi cualquier célula de mamífero. La fosfolipasa C (PLC) elimina el resto de fosfato para producir 1,2diacilglicerol y una fosfobase. La fosfolipasa D (PLD) produce 1,2-diacilglicerofosfato y un grupo base. PLC y PLD son importantes en la función celular y en la señalización. PLD ha sido la fosfolipasa dominante en la biocatálisis (véase, por ejemplo, Godfrey, T. y West S. (1996) Industrial enzymology, 299-300, Stockton Press, Nueva York). Las patatinas son otro tipo de fosfolipasa, que se piensa que trabajan como una PLA (véase, por ejemplo, Hirschberg HJ, et al., (2001), Eur J Biochem 268(19):5037-44).

Las oleaginosas habituales, tales como habas de soja, colza, semillas de girasol, sésamo y cacahuetes, se usan como fuentes de aceites y materias primas. En el proceso de extracción del aceite, las semillas se tratan mecánica y térmicamente. El aceite se separa y se divide de la harina mediante un disolvente. Usando destilación, el disolvente se separa entonces del aceite y se recupera. El aceite se “desgoma” y se refina. El contenido de disolvente en la harina se puede evaporar mediante tratamiento térmico en una “tostadora desolventizadora”, seguido del secado y enfriamiento de la harina. Después de que el disolvente se ha separado por destilación, el aceite bruto producido se procesa en aceite comestible, usando procedimientos de desgomado especiales y refinado físico. También se puede utilizar como materia prima para la producción de ácidos grasos y éster metílico. La harina se puede usar para raciones para animales.

El desgomado es la primera etapa en el refinado del aceite vegetal, y se diseña para eliminar fosfátidos contaminantes que se extraen con el aceite pero que interfieren con el procesamiento subsiguiente del aceite. Estos fosfátidos son solubles en el aceite vegetal solamente en una forma anhidra, y se pueden precipitar y eliminar si se hidratan simplemente. La hidratación se logra habitualmente mezclando una pequeña proporción de agua continuamente con aceite sustancialmente seco. Típicamente, la cantidad de agua es 75% del contenido de fosfáticos, que es típicamente 1 a 1,5%. La temperatura no es muy crítica, aunque la separación de las gomas hidratadas es mejor si la viscosidad del aceite se reduce a 50ºC hasta 80ºC.

Actualmente se usan muchos métodos para el desgomado del aceite. El procedimiento de desgomado del aceite se puede ayudar enzimáticamente usando enzimas fosfolipasas. Las fosfolipasas A1 y A2 se han usado para el desgomado de aceites en diversos procedimientos industriales, por ejemplo “desgomado ENZYMAX™ “ (Lurgi Life Science Technologies GmbH, Alemania). La fosfolipasa C (PLC) también se ha considerado para el desgomado de aceites debido a que el resto de fosfato generado por su acción sobre los fosfolípidos es muy soluble en agua y fácil de eliminar, y el diglicérido permanecería con el aceite y reduce pérdidas; véanse, por ejemplo, Godfrey, T. y West

S. (1996) Industrial Enzymology, p. 299-300, Stockton Press, Nueva York; Dahlke (1998) “An enzymatic process for the physical refining of seed oils”, Chem. Eng. Technol. 21:278-281; Clausen (2001) “Enzymatic oil degumming by a novel microbial phospholipase”, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103:333-340.

Los aceites con contenido elevado de fosfátidos, tales como soja, cánola y girasol, se procesan de forma diferente a otros aceites tales como el de palma. A diferencia del procedimiento de vapor o “refinado físico” para aceites con bajo contenido de fosfátidos, estos aceites con un contenido elevado de fósforo requieren tratamientos químicos y mecánicos especiales para eliminar los fosfolípidos que contienen fósforo. Estos aceites se refinan típicamente de forma química en un procedimiento que supone neutralizar los ácidos grasos libres para formar jabón y una fracción de goma insoluble. El proceso de neutralización es muy eficaz a la hora de eliminar los ácidos grasos libres y los fosfolípidos, pero este proceso también da como resultado pérdidas significativas de rendimiento y sacrificios en la calidad. En algunos casos, el aceite bruto con contenido elevado de fosfátidos se desgoma en una etapa anterior a la neutralización cáustica. Este es el caso para aceite de soja utilizado para lecitina, en el que el aceite se desgoma en primer lugar con agua o ácido.

Los fitosteroles (esteroles vegetales) son miembros de la familia “triterpénica” de productos naturales, que incluyen más de 100 fitosteroles diferentes y más de 4000 otros tipos de triterpenos. En general, se piensa que los fitosteroles estabilizan membranas vegetales, conduciendo el incremento en la relación esterol/fosfolípido a una rigidización de la membrana. Químicamente, los fitosteroles se parecen mucho en estructura al colesterol. Los fitosteroles principales son !-sitosterol, campesterol y estigmasterol. Otros incluyen estigmastanol (!-sitostanol), sitostanol, desmosterol, calinasterol, poriferasterol, clionasterol y brasicasterol.

Los esteroles vegetales son productos agrícolas importantes para las industrias de la salud y nutricional. Son emulsionantes útiles para fabricantes de cosméticos, y suministran la mayoría de intermedios esteroideos y precursores para la producción de fármacos hormonales. Los análogos saturados de fitosteroles y sus ésteres se han sugerido como agentes eficaces para reducir el colesterol, con beneficios de salud cardiológicos. Los esteroles vegetales reducen los niveles séricos de colesterol inhibiendo la absorción de colesterol en la luz intestinal, y tienen propiedades inmunomoduladoras a concentraciones extremadamente bajas, incluyendo una respuesta celular mejorada de linfocitos T y la capacidad citotóxica de las células asesinas naturales contra una estirpe celular cancerígena. Además, su efecto terapéutico se ha demostrado en estudios clínicos para el tratamiento de tuberculosis pulmonar, artritis reumatoide, manejo de pacientes infectados por VIH, e inhibición de estrés inmunitario en corredores de maratón.

Los ésteres de esteroles vegetales, también denominados como ésteres de fitosteroles, fueron aprobados como GRAS (Generalmente Reconocidos Como Seguros) por la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos para uso en margarinas y pastas para untar en 1999. En septiembre de 2000, la FDA también emitió una norma provisional que permite el etiquetado beneficioso para la salud de alimentos que contienen éster de fitosterol. En consecuencia, el enriquecimiento de alimentos con ésteres de fitosterol es muy deseado para la aceptación de los consumidores.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o una identidad de secuencia completa (100%) con un ácido nucleico ejemplar de la invención, por ejemplo SEC ID NO:1, y que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa C. Las identidades de secuencias se pueden determinar mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias

o mediante inspección visual.

En aspectos alternativos, el ácido nucleico aislado o recombinante codifica un polipéptido que comprende una secuencia como se expone en SEC ID NO:2, en la que el polipéptido tiene una actividad de fosfolipasa C.

En un aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST, tal como un algoritmo BLAST versión 2.2.2. En un aspecto, el ajuste de filtro se ajusta a blastall -p blastp -d “nr pataa” -F F, y todas las otras opciones se ajustan por defecto.

En un aspecto, la actividad de fosfolipasa comprende catalizar la hidrólisis de un enlace de éster de fosfato de glicerol (es decir, escisión de enlaces de éster de fosfato de glicerol). La actividad de fosfolipasa puede comprender catalizar la hidrólisis de un enlace de éster en un fosfolípido en un aceite vegetal. El fosfolípido del aceite vegetal puede comprender un fosfolípido de oleaginosa. La actividad de fosfolipasa comprende una actividad de fosfolipasa C (PLC).

El ácido nucleico aislado o recombinante puede codificar un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa que es termoestable. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura de entre alrededor de 37ºC a alrededor de 95ºC; entre alrededor de 55ºC a alrededor de 85ºC, entre alrededor de 70ºC a alrededor de 95ºC, o entre alrededor de 90ºC a alrededor de 95ºC. El ácido nucleico aislado o recombinante puede codificar un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa que es termotolerante. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa tras la exposición a una temperatura en el intervalo de mayor que 37ºC a alrededor de 95ºC, o cualquiera en el intervalo de mayor que 55ºC a alrededor de 85ºC. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa tras la exposición a una temperatura en el intervalo de mayor que 90ºC a alrededor de 95ºC a pH 4,5. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa en condiciones que comprenden alrededor de pH 7, pH 6,5, pH 6,0, pH 5,5, pH 5, o pH 4,5. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura entre alrededor de 40ºC y alrededor de 70ºC.

El ácido nucleico aislado o recombinante puede comprender una secuencia que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia como se expone en SEC ID NO:1, en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa. El ácido nucleico puede tener una longitud de al menos alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 o restos, o la longitud completa del gen o transcrito, con o sin una secuencia señal, como se describe aquí. Las condiciones restrictivas pueden ser muy restrictivas, moderadamente restrictivas o de baja restricción, como se describe aquí.

Las condiciones restrictivas pueden incluir una etapa de lavado, por ejemplo una etapa de lavado que comprende un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de alrededor de 65ºC durante alrededor de 15 minutos.

La invención proporciona una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad de fosfolipasa C, en el que la sonda comprende la secuencia como se expone en SEC ID NO:1, y la sonda identifica el ácido nucleico mediante unión o hibridación.

La invención proporciona pares de cebadores de amplificación, en los que el par de cebadores comprende un primer miembro que tiene una secuencia como se expone en alrededor de los primeros (el 5’) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más restos de SEC ID No:1, y un segundo miembro que tiene una secuencia como se expone en alrededor de los primeros (el 5’) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más restos de la hebra complementaria del primer miembro.

Las fosfolipasas se pueden generar mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando un par de cebadores de amplificación de la invención. El par de cebadores de amplificación puede amplificar un ácido nucleico de una librería, por ejemplo una genoteca, tal como una librería medioambiental.

Los métodos para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa comprenden la amplificación de un ácido nucleico molde con un par de secuencias cebadoras de amplificación capaz de amplificar una secuencia de ácido nucleico de la invención, o sus fragmentos o subsecuencias. El par de cebadores de amplificación puede ser un par de cebadores de amplificación de la invención.

La invención proporciona casetes de expresión que comprenden un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, el casete de expresión puede comprender el ácido nucleico que está enlazado operablemente a un promotor. El promotor puede ser un promotor vírico, bacteriano, de mamífero o vegetal. En un aspecto, el promotor vegetal puede ser un promotor de patata, de arroz, de maíz, de trigo, de tabaco o de cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor específico de tejido, o un promotor regulado medioambientalmente o un promotor regulado mediante el desarrollo. De este modo, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor específico de semillas, un promotor específico de hojas, un promotor específico de raíces, un promotor específico de tallos o un promotor inducido por escisión. En un aspecto, el casete de expresión puede comprender además un vector de expresión vegetal o de virus vegetal.

La invención proporciona vehículos de clonación que comprenden un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención o un ácido nucleico de la invención. El vehículo de clonación puede ser un vector vírico, un plásmido, un fago, un fagómido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial. El vector vírico puede comprender un vector adenovírico, un vector retrovírico o un vector vírico adenoasociado. El vehículo de clonación puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un plásmido, un vector derivado del bacteriófago P1 (PAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o un cromosoma artificial de mamífero (MAC).

La invención proporciona una célula transformada que comprende un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención, o un vehículo de clonación de la invención. En un aspecto, la célula transformada puede ser una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal. En un aspecto, la célula vegetal puede ser una célula de patata, de trigo, de arroz, de maíz, de tabaco o de cebada.

La invención proporciona plantas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La planta transgénica puede ser una planta de maíz, una planta de patata, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta oleaginosa, una planta de colza, una planta de haba de soja, una planta de arroz, una planta de cebada o una planta de tabaco. La invención proporciona semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La semilla transgénica puede ser una semilla de maíz, una pepita de trigo, una semilla oleaginosa, una colza (una planta de cánola), una semilla de haba de soja, una pepita de palma, una semilla de girasol, una semilla de sésamo, un cacahuete o una semilla de planta de tabaco.

Un oligonucleótido antisentido puede comprender una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a un ácido nucleico de la invención. Los métodos para inhibir la traducción de un mensaje de fosfolipasa en una célula comprenden administrar a la célula o expresar a la célula un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a un ácido nucleico de la invención.

Un oligonucleótido antisentido puede comprender una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a un ácido nucleico de la invención. Los métodos para inhibir la traducción de un mensaje de fosfolipasa en una célula comprenden administrar a la célula o expresar en la célula un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a un ácido nucleico de la invención. El oligonucleótido antisentido puede tener una longitud entre alrededor de 10 y 50, alrededor de 20 y 60, alrededor de 30 y 70, alrededor de 40 y 80, alrededor de 60 y 100, alrededor de 70 y 110, o alrededor de 80 y 120 bases.

Los métodos para inhibir la traducción de un mensaje de fosfolipasa, por ejemplo una fosfolipasa, en una célula comprenden administrar a la célula o expresar en la célula un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a un ácido nucleico de la invención. Las moléculas de ARN inhibidor (RNAi) bicatenarias pueden comprender una subsecuencia de una secuencia de la invención. El RNAi puede tener alrededor de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos dúplex de longitud. Los métodos para inhibir la expresión de una fosfolipasa, por ejemplo una fosfolipasa, en una célula comprenden administrar a la célula o expresar en la célula un ARN inhibidor (iRNA) bicatenario, en el que el ARN comprende una subsecuencia de una secuencia de la invención.

La invención proporciona un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o una identidad de secuencia completa (100%) con SEC ID NO:2. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID NO:2.

La invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes codificados con un ácido nucleico de la invención. El polipéptido tiene actividad de fosfolipasa C.

La invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden un polipéptido de la invención que carece de una secuencia señal. En un aspecto, el polipéptido que carece de una secuencia señal tiene al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad de secuencia con los restos 30 a 287 de SEC ID NO:2. Las identidades de secuencia se pueden determinar mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias, o mediante inspección visual.

Un polipéptido o péptido aislado o recombinante puede incluir al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 o más bases consecutivas de una secuencia polipeptídica o peptídica de la invención, secuencias sustancialmente idénticas a ella, y las secuencias complementarias a ella. El péptido puede ser, por ejemplo, un fragmento inmunógeno, un motivo (por ejemplo, un sitio de unión) o un sitio activo.

El polipéptido aislado o recombinante de la invención (con o sin una secuencia señal) tiene una actividad de fosfolipasa. En un aspecto, la actividad de fosfolipasa comprende catalizar la hidrólisis de un enlace de éster de fosfato de glicerol (es decir, escisión de enlaces de éster de fosfato de glicerol). La actividad de fosfolipasa puede comprender catalizar la hidrólisis de un enlace de éster en un fosfolípido en un aceite vegetal. El fosfolípido de aceite vegetal puede comprender un fosfolípido de oleaginosa. La actividad de fosfolipasa comprende una actividad de fosfolipasa C (PLC).

La actividad de fosfolipasa puede ser termoestable. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura de entre alrededor de 37ºC y alrededor de 95ºC, entre alrededor de 55ºC y alrededor de 85ºC, entre alrededor de 70ºC y alrededor de 95ºC, o entre alrededor de 90ºC y alrededor de 95ºC. La actividad de fosfolipasa puede ser termotolerante. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa tras la exposición a una temperatura en el intervalo desde mayor que 37ºC hasta alrededor de 95ºC, o en el intervalo desde mayor que 55ºC hasta alrededor de 85ºC. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa tras la exposición a una temperatura en el intervalo de mayor que 90ºC hasta alrededor de 95ºC a pH 4,5.

El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa en condiciones que comprenden alrededor de pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 o pH 4. El polipéptido puede retener una actividad de fosfolipasa en condiciones que comprenden alrededor de pH 7, pH 7.5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 o pH 11.

En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante puede comprender el polipéptido de la invención que carece de una secuencia señal. En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante puede comprender el polipéptido de la invención que comprende una secuencia señal heteróloga, tal como una secuencia señal heteróloga de fosfolipasa o no fosfolipasa.

Los péptidos aislados o recombinantes pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más identidad de secuencia con los restos 1 a 29 de SEC ID NO:2, y con otras secuencias señal como se expone en el listado de SEC ID, en el que las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Estos péptidos pueden actuar como secuencias señal sobre su fosfolipasa endógena, sobre otra fosfolipasa, o una proteína heteróloga (una enzima no fosfolipasa u otra proteína). Las proteínas quiméricas pueden comprender un primer dominio que comprende dicha secuencia señal y al menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una fosfolipasa.

Los polipéptidos quiméricos pueden comprender al menos un primer dominio que comprende un péptido señal (SP) de la descripción o un dominio catalítico (CD), o sitio activo, de una fosfolipasa de la invención y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, en el que el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado naturalmente con el péptido señal (SP) o dominio catalítico (CD). En un aspecto, el polipéptido o

péptido heterólogo no es una fosfolipasa. El polipéptido o péptido heterólogo puede ser aminoterminal a, carboxiterminal a, o puede estar en ambos extremos del péptido señal (SP) o dominio catalítico (CD).

Los ácidos nucleicos aislados o recombinantes pueden codificar un polipéptido quimérico, en el que el polipéptido quimérico comprende al menos un primer dominio que comprende un péptido señal (SP) o un dominio catalítico (CD), o sitio activo, de un polipéptido de la invención, y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido

o péptido heterólogo, en el que el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado naturalmente con el péptido señal (SP) o dominio catalítico (CD).

La actividad de fosfolipasa puede comprender una actividad específica a alrededor de 37ºC en el intervalo de alrededor de 100 a alrededor de 1000 unidades por miligramo de proteína. La actividad de fosfolipasa puede comprender una actividad específica de alrededor de 500 a alrededor de 750 unidades por miligramo de proteína. Como alternativa, la actividad de fosfolipasa comprende una actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 500 a alrededor de 1200 unidades por miligramo de proteína. La actividad de fosfolipasa puede comprender una actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 750 a alrededor de 1000 unidades por miligramo de proteína. La termotolerancia puede comprender retención de al menos la mitad de la actividad específica de la fosfolipasa a 37ºC después de ser calentada hasta la temperatura elevada. Como alternativa, la termotolerancia puede comprender retención de actividad específica a 37ºC en el intervalo de alrededor de 500 a alrededor de 1200 unidades por miligramo de proteína después de ser calentada hasta la temperatura elevada.

La invención proporciona el polipéptido aislado o recombinante de la invención, en el que el polipéptido comprende al menos un sitio de glucosilación. En un aspecto, la glucosilación puede ser una glucosilación enlazada mediante N. En un aspecto, el polipéptido se puede glucosilar después de ser expresado en una P. pastoris o una S. pombe.

La invención proporciona preparaciones proteicas que comprenden un polipéptido de la invención, en las que la preparación proteica comprende un líquido, un sólido o un gel.

La invención proporciona heterodímeros que comprenden un polipéptido de la invención y una segunda proteína o dominio. El segundo miembro del heterodímero puede ser una fosfolipasa diferente, una enzima diferente u otra proteína. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido, y el heterodímero puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o un marcador. En un aspecto, la invención proporciona homodímeros que comprenden un polipéptido de la invención.

La invención proporciona polipéptidos inmovilizados que tienen una actividad de fosfolipasa, en los que el polipéptido comprende un polipéptido de la invención, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido que comprende un polipéptido de la invención y un segundo dominio. En un aspecto, el polipéptido se puede inmovilizar sobre una célula, un metal, una resina, un polímero, un material cerámico, un vidrio, un microelectrodo, una partícula grafítica, una perla, un gel, una placa, una matriz o un tubo capilar.

La invención proporciona matrices que comprenden un polipéptido inmovilizado, en las que el polipéptido es una fosfolipasa de la invención o es un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona matrices que comprenden un ácido nucleico inmovilizado de la invención. La invención proporciona una matriz que comprende un anticuerpo inmovilizado de la invención.

La invención proporciona anticuerpos aislados o recombinantes que se unen específicamente a un polipéptido de la invención o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. La invención proporciona hibridomas que comprenden un anticuerpo de la invención.

La invención proporciona métodos para aislar o identificar un polipéptido con una actividad de fosfolipasa, que comprenden las etapas de: (a) proporcionar un anticuerpo de la invención; (b) proporcionar una muestra que comprende polipéptidos; y (c) poner en contacto la muestra de la etapa (b) con el anticuerpo de la etapa (a) en condiciones en las que el anticuerpo se puede unir específicamente al polipéptido, aislando o identificando de ese modo una fosfolipasa. La invención proporciona métodos para obtener un anticuerpo anti-fosfolipasa, que comprenden administrar a un animal no humano un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido de la invención, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria humoral, obteniendo de ese modo un anticuerpo anti-fosfolipasa.

La invención proporciona métodos para producir un polipéptido recombinante, que comprenden las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención enlazado operablemente a un promotor; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permiten la expresión del polipéptido, produciendo de ese modo un polipéptido recombinante. El ácido nucleico puede comprender una secuencia que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID NO:1 a lo largo de una región de al menos alrededor de 100 restos, en el que las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. El ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico que se hibrida en condiciones restrictivas a un ácido nucleico como se expone en SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma. El método puede comprender además transformar una célula hospedante con el ácido nucleico de la etapa (a) seguido de la expresión del ácido nucleico de la etapa (a), produciendo de ese modo un polipéptido recombinante en una célula transformada. El método puede comprender además insertar en un animal hospedante no humano el ácido nucleico

de la etapa (a), seguido de la expresión del ácido nucleico de la etapa (a), produciendo de ese modo un polipéptido recombinante en el animal hospedante no humano.

La invención proporciona métodos para identificar un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o un fragmento o variante del mismo, (b) proporcionar un sustrato de fosfolipasa; y,

(c): poner en contacto el polipéptido o un fragmento o variante del mismo de la etapa (a) con el sustrato de la etapa

(b): y detectar un incremento en la cantidad del sustrato o una disminución en la cantidad de producto de reacción, en el que una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción detecta un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa. En aspectos alternativos, el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID NO:1 a lo largo de una región de al menos alrededor de 100 restos, en el que las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En aspectos alternativos, el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia como se expone en SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma.

La invención proporciona métodos para identificar un sustrato de fosfolipasa, que comprenden las siguientes etapas:

(a): proporcionar un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato de ensayo; y, (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con el sustrato de ensayo de la etapa (b) y detectar un incremento en la cantidad de sustrato o una disminución en la cantidad de producto de reacción, en el que una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción identifica el sustrato de ensayo como un sustrato de fosfolipasa. En aspectos alternativos, el ácido nucleico puede tener al menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID NO:1 a lo largo de una región de al menos alrededor de 100 restos, en el que las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En aspectos alternativos, el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia como se expone en SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma.

La invención proporciona métodos para determinar si un compuesto se une específicamente a una fosfolipasa, que comprenden las siguientes etapas: (a) expresar un ácido nucleico o un vector que comprende el ácido nucleico en condiciones que permitan la traducción del ácido nucleico a un polipéptido, en el que el ácido nucleico y vector comprenden un ácido nucleico o vector de la invención; o, proporcionar un polipéptido de la invención (b) poniendo en contacto el polipéptido con el compuesto de ensayo; y, (c) determinar si el compuesto de ensayo se une específicamente al polipéptido, determinando de ese modo que el compuesto se une específicamente a la fosfolipasa. En aspectos alternativos, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID NO:1 a lo largo de una región de al menos alrededor de 100 restos, en el que las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En aspectos alternativos, el ácido nucleico se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia como se expone en SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma.

La invención proporciona métodos para identificar un modulador de una actividad de fosfolipasa, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa

(a) con el compuesto de ensayo de la etapa (b); y, medir una actividad de la fosfolipasa, en el que un cambio en la actividad de fosfolipasa medido en presencia del compuesto de ensayo, comparado con la actividad en ausencia del compuesto de ensayo, proporciona una determinación de que el compuesto de ensayo modula la actividad de fosfolipasa. En aspectos alternativos, el ácido nucleico puede tener al menos 85% de identidad de secuencia con SEC ID NO:1 a lo largo de una región de al menos alrededor de 100 restos, en el que las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En aspectos alternativos, el ácido nucleico se puede hibridar en condiciones restrictivas a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en una secuencia como se expone en SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma.

La actividad de fosfolipasa se puede medir proporcionando un sustrato de fosfolipasa y detectando un incremento en la cantidad del sustrato, o una disminución en la cantidad de un producto de reacción. La disminución en la cantidad del sustrato o el incremento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de ensayo, en comparación con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de ensayo, identifica al compuesto de ensayo como un activador de la actividad de fosfolipasa. El incremento en la cantidad del sustrato o la disminución en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de ensayo, en comparación con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de ensayo, identifica al compuesto de ensayo como un inhibidor de la actividad de fosfolipasa.

Los sistemas de ordenador pueden comprender un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos, en el que dicho dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenada en él una secuencia polipeptídica de la invención o una secuencia de ácido nucleico de la invención.

El sistema de ordenador puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene al menos una secuencia de referencia almacenada en él. El algoritmo de

comparación de secuencias puede comprender un programa de ordenador que indica polimorfismos. El sistema de ordenador puede comprender además un identificador que identifica uno o más rasgos en dicha secuencia.

Los medios legibles por ordenador pueden tener almacenada en ellos una secuencia que comprende una secuencia polipeptídica de la invención o una secuencia de ácido nucleico de la invención.

Los métodos para identificar un rasgo en una secuencia pueden comprender las etapas de: (a) leer la secuencia usando un programa de ordenador que identifica uno o más rasgos en una secuencia, en el que la secuencia comprende una secuencia polipeptídica de la invención o una secuencia de ácido nucleico de la invención; y, (b) identificar uno o más rasgos en la secuencia con el programa de ordenador.

Los métodos para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia pueden comprender las etapas de:

(a): leer la primera secuencia y la segunda secuencia mediante el uso de un programa de ordenador que compara las secuencias, en el que la primera secuencia comprende una secuencia polipeptídica de la invención o una secuencia de ácido nucleico de la invención; y, (b) determinar diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de ordenador. La etapa de determinar diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia comprende además la etapa de identificar polimorfismos. El método puede comprender además un identificador (y el uso del identificador) que identifica uno o más rasgos en una secuencia. El método puede comprender leer la primera secuencia usando un programa de ordenador e identificar uno o más rasgos en la secuencia.

Los métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de fosfolipasa a partir de una muestra medioambiental comprenden las etapas de: (a) proporcionar un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de fosfolipasa, en el que el par de cebadores es capaz de amplificar un ácido nucleico de la invención SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra medioambiental o tratar la muestra medioambiental de manera que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación al par de cebadores de amplificación; y,

(c): combinar el ácido nucleico de la etapa (b) con el par de cebadores de amplificación de la etapa (a) y amplificar el ácido nucleico procedente de la muestra medioambiental, aislando o recuperando de ese modo un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de fosfolipasa a partir de una muestra medioambiental. En un aspecto, cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación comprende un oligonucleótido que comprende al menos alrededor de 10 a 50 bases consecutivas de una secuencia de ácido nucleico de la invención. El par de secuencias cebadoras de amplificación puede ser un par de amplificación de la invención.

Los métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de fosfolipasa a partir de una muestra medioambiental comprenden las etapas de: (a) proporcionar una sonda polinucleotídica que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, o una subsecuencia de la misma; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra medioambiental o tratar la muestra medioambiental de manera que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para la hibridación a una sonda polinucleotídica de la etapa (a); (c) combinar el ácido nucleico aislado o la muestra medioambiental aislada de la etapa (b) con la sonda polinucleotídica de la etapa (a); y, (d) aislar un ácido nucleico que se hibrida específicamente con la sonda polinucleotídica de la etapa (a), aislando o recuperando de ese modo un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de fosfolipasa a partir de la muestra medioambiental. En aspectos alternativos, la muestra medioambiental comprende una muestra de agua, una muestra líquida, una muestra de suelo, una muestra de aire o una muestra biológica. La muestra biológica puede derivar de una célula bacteriana, una célula de protozoo, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula vegetal, una célula fúngica o una célula de mamífero.

La invención proporciona métodos para generar una variante de un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa que comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico molde que comprende un ácido nucleico de la invención; (b) modificar, suprimir o añadir uno o más nucleótidos en la secuencia molde, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico molde.

En un aspecto, el método comprende además expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido de fosfolipasa variante. En aspectos alternativos, las modificaciones, adiciones o supresiones se introducen mediante PCR propensa a errores, transposición de fragmentos, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por inserción de un casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje génico, mutagénesis saturada de sitio génico (GSSM), reensamblaje de ligación sintética (SLR) y/o una combinación de los mismos. En aspectos alternativos, las modificaciones, adiciones o supresiones se introducen mediante un método seleccionado del grupo que consiste en recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex con saltos, mutagénesis de reparación de desemparejamiento de punto, mutagénesis de hebra de hospedante deficiente en la reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis génica artificial, mutagénesis de conjunto, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos y/o una combinación de los mismos.

En un aspecto, el método se repite iterativamente hasta que se produce una fosfolipasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de una fosfolipasa codificada por el ácido nucleico molde. En un aspecto, la actividad alterada o diferente es una actividad de fosfolipasa en una condición ácida, en el que la fosfolipasa codificada por el ácido nucleico molde no es activa en la condición ácida. En un aspecto, la actividad alterada o diferente es una actividad de fosfolipasa a una temperatura elevada, en el que la fosfolipasa codificada por el ácido nucleico molde no es activa a la temperatura elevada. En un aspecto, el método se repite de forma iterativa hasta que se produce una secuencia codificante que tiene un uso de codones alterado con respecto al del ácido nucleico molde. El método se puede repetir de forma iterativa hasta que se produce un gen de fosfolipasa que tiene un nivel mayor o menor de expresión o estabilidad del mensaje con respecto al del ácido nucleico molde.

La invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa para incrementar su expresión en una célula hospedante, comprendiendo el método (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifica una fosfolipasa; y, (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico de la etapa (a) y sustituirlo por un codón preferido o usado de forma neutra que codifica el mismo aminoácido que el codón sustituido, en el que un codón preferido es un codón sobrerrepresentado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedante, y un codón no preferido o menos preferido es un codón subrepresentado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedante, modificando de ese modo el ácido nucleico para incrementar su expresión en una célula hospedante.

La invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa, comprendiendo el método (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifica una fosfolipasa; y, (b) identificar un codón en el ácido nucleico de la etapa (a) y sustituirlo por un codón diferente que codifica el mismo aminoácido que el codón sustituido, modificando de ese modo codones en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa.

La invención proporciona métodos para modificar un codón en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa para disminuir su expresión en una célula hospedante, comprendiendo el método (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifica una fosfolipasa; y, (b) identificar al menos un codón preferido en el ácido nucleico de la etapa

(a) y sustituirlo por un codón no preferido o menos preferido que codifica el mismo aminoácido que el codón sustituido, en el que un codón preferido es un codón sobrerrepresentado en secuencias codificantes en genes en una célula hospedante, y un codón no preferido o menos preferido es un codón subrepresentado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedante, modificando de ese modo el ácido nucleico para disminuir su expresión en una célula hospedante. En aspectos alternativos, la célula hospedante es una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de mamífero.

La invención proporciona métodos para producir una librería de ácidos nucleicos que codifica una pluralidad de sitios activos de fosfolipasa modificados o sitios de unión a sustrato, en el que los sitios activos modificados o sitios de unión a sustrato derivan de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de unión a sustrato, comprendiendo el método: (a) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de unión a sustrato, en el que la primera secuencia de ácido nucleico comprende un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifican variantes de aminoácidos de origen natural en una pluralidad de codones seleccionados como diana en el primer ácido nucleico; y, (c) usar el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de ácidos nucleicos variantes que codifican el sitio activo o que codifican el sitio de unión a sustrato que codifican un intervalo de variaciones de aminoácidos en cada codón de aminoácidos que se mutagenizó, produciendo de ese modo una librería de ácidos nucleicos que codifica una pluralidad de sitios activos de fosfolipasa modificados o sitios de unión a sustrato. En aspectos alternativos, el método comprende mutagenizar el primer ácido nucleico de la etapa (a) mediante un método que comprende un sistema de evolución dirigida optimizada, mutagénesis de saturación de sitio génico (GSSM), y reensamblaje de ligación sintética (SLR). El método puede comprender además mutagenizar el primer ácido nucleico de la etapa (a) o variantes mediante un método que comprende PCR propensa a errores, transposición de fragmentos, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por inserción de casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje génico, mutagénesis saturada de sitio génico (GSSM), reensamblaje de ligación sintética (SLR) y/o una combinación de los mismos. El método puede comprender además mutagenizar el primer ácido nucleico de la etapa (a) o variantes mediante un método que comprende recombinación, recombinación de secuencias recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex con saltos, mutagénesis de

reparación de desemparejamiento de punto, mutagénesis de hebra de hospedante deficiente en la reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis génica artificial, mutagénesis de conjunto, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y/o una combinación de los mismos.

Los métodos para obtener una pequeña molécula comprenden las etapas de: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas biosintéticas capaces de sintetizar o modificar una pequeña molécula, en el que una de las enzimas comprende una enzima de fosfolipasa codificada con un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato para al menos una de las enzimas de la etapa (a); y, (c) hacer reaccionar el sustrato de la etapa (b) con las enzimas en condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocatalíticas para generar una pequeña molécula mediante una serie de reacciones biocatalíticas.

Los métodos para modificar una pequeña molécula comprenden las etapas de: (a) proporcionar una enzima de fosfolipasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una pequeña molécula; y, (c) hacer reaccionar la enzima de la etapa (a) con la pequeña molécula de la etapa (b) en condiciones que faciliten una reacción enzimática catalizada por la enzima fosfolipasa, modificando de ese modo una pequeña molécula mediante una reacción enzimática de fosfolipasa. El método puede comprender proporcionar una pluralidad de sustratos de pequeñas moléculas para la enzima de la etapa (a), generando de ese modo una librería de pequeñas moléculas modificadas producidas mediante al menos una reacción enzimática catalizada por la enzima fosfolipasa. El método puede comprender además una pluralidad de enzimas adicionales en condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocatalíticas mediante las enzimas para formar una librería de pequeñas moléculas modificadas producidas mediante la pluralidad de reacciones enzimáticas. El método puede comprender además la etapa de ensayar la librería para determinar si una pequeña molécula modificada particular que exhibe una actividad deseada está presente en la librería. La etapa de ensayar la librería puede comprender además las etapas de eliminar sistemáticamente todas menos una de las reacciones biocatalíticas usadas para producir una porción de la pluralidad de las pequeñas moléculas modificadas en la librería ensayando la porción de la pequeña molécula modificada en busca de la presencia o ausencia de la pequeña molécula modificada particular con una actividad deseada, e identificar al menos una reacción biocatalítica específica que produce la pequeña molécula modificada particular de actividad deseada.

Los métodos para determinar un fragmento funcional de una enzima de fosfolipasa comprenden las etapas de: (a) proporcionar una encima de fosfolipasa que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención; y, (b) suprimir una pluralidad de restos de aminoácidos de la secuencia de la etapa (a) y ensayar la subsecuencia que queda en busca de actividad de fosfolipasa, determinando de ese modo un fragmento funcional de una enzima fosfolipasa. La actividad de fosfolipasa se puede medir proporcionando un sustrato de fosfolipasa y detectando un incremento en la cantidad del sustrato o una disminución en la cantidad de un producto de reacción. Una disminución en la cantidad de un sustrato enzimático o un incremento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de ensayo, en comparación con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de ensayo, identifica al compuesto de ensayo como un activador de la actividad de fosfolipasa.

La invención proporciona métodos para escindir un enlace de éster de fosfato de glicerol, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, o el polipéptido es codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un enlace de éster de fosfato de glicerol; y, (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido escinde el enlace de éster de fosfato de glicerol. En un aspecto, las condiciones comprenden entre alrededor de pH 5 y alrededor de 5,5, o entre alrededor de pH 4,5 y alrededor de 5,0. En un aspecto, las condiciones comprenden una temperatura de entre alrededor de 40ºC y alrededor de 70ºC. En un aspecto, la composición comprende un aceite vegetal. En un aspecto, la composición comprende un fosfolípido de oleaginosa. En un aspecto, la reacción de escisión puede generar una base fosforilada extraíble con agua y un diglicérido.

La invención proporciona métodos para el desgomado de aceite, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, o el polipéptido es codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un aceite vegetal; y, (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa

(a) y el aceite vegetal de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido puede escindir enlaces de éster en el aceite vegetal, desgomando de ese modo el aceite. En un aspecto, el aceite vegetal comprende oleaginosa. El aceite vegetal puede comprender aceite de palma, aceite de colza, aceite de maíz, aceite de haba de soja, aceite de cánola, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, o aceite de girasol. En un aspecto, el método comprende además la adición de una fosfolipasa de la invención, otra fosfolipasa, o una combinación de las mismas.

La invención proporciona métodos para convertir un fosfolípido no hidratable en una forma hidratable, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, o el polipéptido es codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un fosfolípido no hidratable; y, (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el fosfolípido no hidratable de la etapa (b) en condiciones en las que el

polipéptido puede escindir enlaces de éster en el fosfolípido no hidratable, convirtiendo de ese modo un fosfolípido no hidratable en una forma hidratable.

La invención proporciona métodos para desgomar un aceite, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido de la invención que tiene una actividad de fosfolipasa o un polipéptido codificado con un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende una grasa o un aceite que comprende un fosfolípido; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido puede desgomar la composición que comprende fosfolípido (en condiciones en las que el polipéptido de la invención puede catalizar la hidrólisis de un fosfolípido). En un aspecto, la composición que comprende aceite comprende un aceite vegetal, un aceite animal, un aceite de algas o un aceite de pescado. El aceite vegetal puede comprender un aceite de haba de soja, un aceite de colza, un aceite de maíz, un aceite de pepita de palma, un aceite de cánola, un aceite de girasol, un aceite de sésamo o un aceite de cacahuete. El polipéptido puede hidrolizar un fosfátido de un fosfolípido hidratable y/o un fosfolípido no hidratable en la composición que comprende aceite. El polipéptido puede hidrolizar un fosfátido en un enlace de fosfoéster de glicerilo para generar un diglicérido y un compuesto de fosfato soluble en agua. El polipéptido tiene una actividad de fosfolipasa C. La puesta en contacto puede comprender la hidrólisis de un fosfolípido hidratado en un aceite. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender una temperatura de alrededor de 20ºC a 40ºC a un pH alcalino. Las condiciones alcalinas pueden comprender un pH de alrededor de pH 8 a pH

10. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender un tiempo de reacción de alrededor de 3 a 10 minutos. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender la hidrólisis de fosfolípidos hidratables y no hidratables en aceite a una temperatura de alrededor de 50ºC a 60ºC, a un pH de alrededor de pH 5 a pH 6,5 usando un tiempo de reacción de alrededor de 30 a 60 minutos. El polipéptido puede estar unido a un filtro, y la grasa o aceite que contiene fosfolípido se hace pasar a través del filtro. El polipéptido se puede añadir a una disolución que comprende la grasa o aceite que contiene fosfolípido, y después la disolución se hace pasar a través de un filtro.

La invención proporciona métodos para convertir un fosfolípido no hidratable en una forma hidratable, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un fosfolípido no hidratable; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido convierte el fosfolípido no hidratable en una forma hidratable. El polipéptido tiene una actividad de fosfolipasa C.

La invención proporciona métodos para refinar de forma cáustica una composición que contiene un fosfolípido, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido de la invención que tiene una actividad de fosfolipasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un fosfolípido; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) antes, durante o después del refinado cáustico. El polipéptido tiene una actividad de fosfolipasa C. El polipéptido se puede añadir antes del refinado cáustico, y la composición que comprende el fosfolípido puede comprender una planta y el polipéptido se puede expresar transgénicamente en la planta, el polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa se puede añadir durante la trituración de una semilla u otra parte vegetal, o el polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa se añade tras la trituración o antes del refinado. El polipéptido se puede añadir durante el refinado cáustico, y se pueden añadir niveles variables de ácido y material cáustico, dependiendo de los niveles de fósforo y de los niveles de ácidos grasos libres. El polipéptido se puede añadir tras el refinado cáustico: en una mezcladora intensa o mezcladora de retención antes de la separación; tras una etapa de calentamiento; en una centrífuga; en un lote de jabón; en un agua de lavado; o durante las etapas de lixiviación o desodorización.

La invención proporciona métodos para la purificación de un fitosterol o un triterpeno, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido de la invención que tiene una actividad de fosfolipasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un fitosterol o un triterpeno; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido puede catalizar la hidrólisis de un fosfolípido en la composición. El polipéptido tiene una actividad de fosfolipasa C. El fitosterol o un triterpeno puede comprender un esterol vegetal. El esterol vegetal puede derivar en aceite vegetal. El aceite vegetal puede comprender un aceite de coco, aceite de cánola, aceite de manteca de cacao, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite derivado de salvado de arroz, o aceite de alazor, aceite de sésamo, aceite de haba de soja o un aceite de girasol. El método puede comprender el uso de disolventes no polares para extraer cuantitativamente fitosteroles libres y ésteres de ácidos grasos fitosterílicos. El fitosterol o un triterpeno puede comprender un !-sitosterol, un campesterol, un estigmasterol, un estigmastanol, un !-sitostanol, un sitostanol, un desmosterol, un calinasterol, un poriferasterol, un clionasterol o un brasicasterol.

La invención proporciona métodos para refinar un aceite bruto, que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido de la invención que tiene una actividad de fosfolipasa,

o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un aceite que comprende un fosfolípido; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido puede catalizar la hidrólisis de un fosfolípido en la composición. El polipéptido tiene una actividad de fosfolipasa C. El polipéptido que puede tener una actividad de fosfolipasa está

en una disolución acuosa que se añade a la composición. El nivel de agua puede estar entre alrededor de 0,5 y 5%. El tiempo del proceso puede ser menor que alrededor de 2 horas, menor que alrededor de 60 minutos, menor que alrededor de 30 minutos, menor que 15 minutos, o menor que 5 minutos. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender una temperatura de entre alrededor de 25ºC-70ºC. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender el uso de un material cáustico. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender un pH de entre alrededor de pH 3 y pH 10, entre alrededor de pH 4 y pH 9, o entre alrededor de pH 5 y pH 9. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender la adición de emulsionantes y/o el mezclamiento después de la puesta en contacto de la etapa (c). Los métodos pueden comprender la adición de un interruptor de la emulsión y/o calor para promover la separación de una fase acuosa. Los métodos pueden comprender desgomar antes de la etapa de puesta en contacto para recoger la lecitina mediante centrifugación y después añadir una PLC, una PLC y/o una PLA para eliminar fosfolípidos no hidratables. Los métodos pueden comprender desgomar con agua el aceite bruto hasta menos de 10 ppm para aceites comestibles y el refinado físico subsiguiente hasta menos de alrededor de 50 ppm para aceites biodiesel. Los métodos pueden comprender la adición de ácido para promover la hidratación de fosfolípidos no hidratables.

Otros aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones que se acompañan.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos que se acompañan y la descripción más abajo. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán manifiestos a partir de la descripción y dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

Todas las publicaciones, patentes, publicaciones de patentes, secuencias de GenBank y depósitos de ATCC, citados aquí, se incorporan aquí expresamente como referencia para todos los fines.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los siguientes dibujos incluyen ilustraciones de realizaciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención como se engloba por las reivindicaciones.

La Figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema de ordenador, como se describe con detalle, más abajo.

La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia nucleotídica o proteica con una base de datos de secuencias a fin de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos, como se describe con detalle, más abajo.

La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una realización de un proceso en un ordenador para determinar si las secuencias son homólogas, como se describe con detalle, más abajo.

La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador para detectar la presencia de un rasgo en una secuencia, como se describe con detalle, más abajo.

Las Figuras 5A, 5B y 5C ilustran esquemáticamente un sistema modelo de dos fases para la simulación del desgomado mediado por PLC, como se describe con detalle en el Ejemplo 2, más abajo.

La Figura 6 ilustra esquemáticamente un proceso de refinado de aceite vegetal ejemplar usando las fosfolipasas de la invención.

La Figura 7 ilustra esquemáticamente un proceso de desgomado ejemplar de la invención para aceites físicamente refinados, como se explica con detalle, más abajo.

La Figura 8 ilustra esquemáticamente la hidrólisis de fosfátido con una fosfolipasa C de la invención, como se explica con detalle, más abajo.

La Figura 9 ilustra esquemáticamente la aplicación de una fosfolipasa C de la invención como un “Auxiliar del Refinado Cáustico” (Refinado Cáustico de Mezcla Larga), como se explica con detalle, más abajo.

La Figura 10 ilustra esquemáticamente la aplicación de una fosfolipasa C de la invención como un auxiliar del desgomado, como se explica con detalle, más abajo.

Símbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican elementos similares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona fosfolipasas, polinucleótidos que las codifican, y métodos para obtenerlas y usarlas. La invención proporciona enzimas que escinden eficientemente el enlace de éster de fosfato de glicerol en aceites, tales como aceites vegetales, por ejemplo fosfolípidos de oleaginosas, para generar una base fosforilada extraíble con agua y un diglicérido.

Una fosfolipasa de la invención se puede usar para desgomar enzimáticamente aceites vegetales, debido a que el resto de fosfato es soluble en agua y fácil de eliminar. El producto diglicérido permanecerá en el aceite, y por lo tanto reducirá las pérdidas. Las PLCs de la invención se pueden usar además de o en lugar de las PLA1s y PLA2s en el desgomado de aceites comerciales, tales como en el proceso ENZYMAX®, en el que los fosfolípidos se hidrolizan mediante PLA1 y PLA2.

En un aspecto, las fosfolipasas de la invención son activas a una temperatura elevada y/o a una temperatura baja, o a lo largo de un amplio intervalo de temperaturas, por ejemplo pueden ser activas en las temperaturas que oscilan entre 20ºC y 90ºC, entre 30ºC y 80ºC, o entre 40ºC y 70ºC. La invención también proporciona fosfolipasas de la invención que tienen actividad a pHs alcalinos o a pHs ácidos, por ejemplo acidez baja del agua. En aspectos alternativos, las fosfolipasas de la invención pueden tener actividad a pHs ácidos tan bajos como pH 6,5, pH 6,0, pH 5,5, pH 5,0, pH 4,5, pH 4,0 y pH 3,5. En aspectos alternativos, las fosfolipasas de la invención pueden tener actividad a pHs alcalinos tan elevados como pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9,0, y pH 9,5. En un aspecto, las fosfolipasas de la invención son activas en el intervalo de temperatura entre alrededor de 40ºC y alrededor de 70ºC en condiciones de baja actividad del agua (bajo contenido de agua).

La invención también proporciona métodos para modificar adicionalmente las fosfolipasas ejemplares de la invención para generar enzimas con propiedades deseables. Por ejemplo, las fosfolipasas generadas por los métodos de la invención pueden tener especificidades alteradas por sustratos, especificidades de unión a sustratos, patrones de escisión de sustratos, estabilidad térmica, perfil de pH/actividad, perfil de pH/estabilidad (tal como estabilidad incrementada a valores de pH bajos, por ejemplo pH < 6 o pH < 5, o elevados, por ejemplo pH > 9), estabilidad frente a la oxidación, dependencia de Ca2+, actividad específica, y similar. La invención proporciona alterar cualquier propiedad de interés. Por ejemplo, la alteración puede dar como resultado una variante que, en comparación con una fosfolipasa progenitora, tiene un perfil alterado de actividad a pH y temperatura alterados.

En un aspecto, las fosfolipasas de la invención se usan en diversas etapas del procesamiento de aceites vegetales, tales como la extracción de aceites vegetales, particularmente en la eliminación de “gomas fosfolipídicas” en un proceso denominado “desgomado de aceites”, como se describe aquí. La producción de aceites vegetales a partir de diversas fuentes, tales como habas de soja, colza, cacahuete, sésamo, girasol y maíz. Las enzimas fosfolipasa de la invención se pueden usar en lugar de PLA, por ejemplo fosfolipasa A2, en cualquier etapa de procesamiento de aceites vegetales.

Definiciones

El término “fosfolipasa” engloba enzimas que tienen cualquier actividad de fosfolipasa, por ejemplo que escinden un enlace de éster de fosfato de glicerol (que cataliza la hidrólisis de un enlace de éster de fosfato de glicerol), por ejemplo, en un aceite, tal como un aceite vegetal. La actividad de fosfolipasa de la invención puede generar una base fosforilada extraíble con agua y un diglicérido. La actividad de fosfolipasa de la invención también incluye la hidrólisis de enlaces de éster de fosfato de glicerol a temperaturas elevadas, temperaturas bajas, pHs alcalinos y a pHs ácidos. La expresión “una actividad de fosfolipasa” también incluye escindir un éster de fosfato de glicerol para generar una base fosforilada extraíble con agua y un diglicérido. La expresión “una actividad de fosfolipasa” también incluye cortar enlaces de éster entre glicerina y ácido fosfórico en fosfolípidos. La expresión “una actividad de fosfolipasa” también incluye otras actividades, tales como la capacidad para unirse a un sustrato, tal como un aceite, por ejemplo un aceite vegetal, que también incluye fosfatidilcolinas vegetales y animales, fosfatidil-etanolaminas, fosfatidilserinas y esfingomielinas. Para los polipéptidos de la invención, la actividad de fosfolipasa comprende una actividad de fosfolipasa C (PLC).

El término “anticuerpo” incluye un péptido o polipéptido derivado de, modelado tras o codificado sustancialmente por un gen inmunoglobulínico o genes inmunoglobulínicos, o sus fragmentos, capaces de unirse específicamente a un antígeno o epítopo, véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, Tercera Edición, W.E. Paul, ed., Raven Press,

N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85

97. El término anticuerpo incluye porciones que se unen a antígenos, es decir, “sitios de unión a antígenos” (por ejemplo, fragmentos, subsecuencias, regiones que determinan la complementariedad (CDRs)), que retienen la capacidad para unirse a antígeno, incluyendo (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados mediante un puente de disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región que determina la complementariedad (CDR) aislada. Los anticuerpos monocatenarios también están incluidos mediante la referencia al término “anticuerpo”.

El término “matriz” o “micromatriz” o “biochip” o “chip”, como se usan aquí, es una pluralidad de elementos diana, comprendiendo cada elemento diana una cantidad definida de uno o más polipéptidos (incluyendo anticuerpos) o ácidos nucleicos inmovilizados sobre un área definida de una superficie de sustrato, como se explica con más detalle, más abajo.

Como se usa aquí, los términos “ordenador”, “programa de ordenador” y “procesador” se usan en sus contextos generales más amplios e incorporan todos los citados dispositivos, como se describe con detalle, más abajo.

Una “secuencia codificante de” o una “secuencia codifica” un polipéptido o proteína particular es una secuencia de ácido nucleico que es transcrita y traducida en un polipéptido o proteína cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.

La expresión “casete de expresión”, como se usa aquí, se refiere a una secuencia nucleotídica que es capaz de efectuar la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia codificante proteica, tal como una fosfolipasa de la invención) en un hospedante compatible con tales secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos un promotor enlazado operablemente con la secuencia codificante polipeptídica; y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo señales de terminación de la transcripción. También se pueden usar factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, por ejemplo potenciadores. “Operablemente enlazado”, como se usa aquí, se refiere al enlazamiento de un promotor en dirección de una secuencia de ADN de manera que el promotor media la transcripción de la secuencia de ADN. De este modo, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes, cualquier forma de vector de “ADN desnudo” recombinante, y similar. Un “vector” comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir transitoria o permanentemente una célula. Se reconocerá que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico complejado con proteína o lípido. El vector comprende opcionalmente ácidos nucleicos y/o proteínas víricas o bacterianas, y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una cubierta lipídica vírica, etc.). Los vectores incluyen, pero no se limitan a, replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los que se pueden unir fragmentos de ADN y se pueden replicar. De este modo, los vectores incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN o ARN circular o lineal autorreplicante autónomo (por ejemplo, plásmidos, virus, y similares; véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.217.879), e incluyen tanto los plásmidos de expresión como no de expresión. Cuando un microorganismo recombinante o cultivo celular se describe como hospedante de un “vector de expresión”, esto incluye tanto ADN circular y lineal extracromosómico como ADN que se ha incorporado en el cromosoma o cromosomas del hospedante. Cuando un vector se mantiene mediante una célula hospedante, el vector se puede replicar de forma estable mediante las células durante mitosis como una estructura autónoma, o se incorpora en el genoma del hospedante.

“Plásmidos” se designan mediante una “p” en minúsculas, precedida y/o seguida por mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida aquí están comercialmente disponibles, están públicamente disponibles en una base no restringida, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles según procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a los descritos aquí son conocidos en la técnica y serán manifiestos para un experto normal.

El término “gen” significa el segmento de ADN implicado en producir una cadena polipeptídica, incluyendo, entre otras, regiones que preceden y que siguen a la región codificante, tales como líderes y tráiler, promotores y potenciadores, así como, cuando sea aplicable, secuencias interventoras (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

Las expresiones “ácido nucleico” o “secuencia de ácido nucleico”, como se usan aquí, se refieren a un oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, o a un fragmento de cualquiera de estos, a ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, ARNi) de origen genómico o sintético que puede ser monocatenario o bicatenario y puede representar una hebra sentido o antisentido, a ácido nucleico peptídico (PNA), o a cualquier material semejante a ADN o semejante a ARN, de origen natural o sintético, incluyendo, por ejemplo, ARNi, ribonucleoproteínas (por ejemplo, ARNi bicatenarios, por ejemplo RNPi). La expresión engloba ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. La expresión también engloba estructuras semejantes a ácidos nucleicos con cadenas principales sintéticas; véanse, por ejemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156.

“Aminoácido” o “secuencia de aminoácidos”, como se usa aquí, se refiere a una secuencia oligopeptídica, peptídica, polipeptídica, o proteica, o a un fragmento, porción, o subunidad de cualquiera de estas, y a moléculas de origen natural o sintéticas.

Los términos “polipéptido” y “proteína”, como se usan aquí, se refieren a aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos, y pueden contener aminoácidos modificados distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. El término “polipéptido” también incluye péptidos y fragmentos polipeptídicos, motivos y similares. La expresión también incluye polipéptidos glucosilados. Los péptidos y polipéptidos de la invención también incluyen todas las formas “miméticas” y “peptidomiméticas”, como se describe con más detalle, más abajo.

Como se usa aquí, el término “aislado” significa que el material se elimina de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos serían parte de un vector, y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y todavía estar aislados por cuanto tal vector o

composición no es parte de su entorno natural. Como se usa aquí, un material o composición aislado también puede ser una composición “purificada”, es decir, no requiere pureza absoluta; más bien, está presentado como una definición relativa. Los ácidos nucleicos individuales obtenidos de una librería se pueden purificar convencionalmente hasta homogeneidad electroforética. En aspectos alternativos, la invención proporciona ácidos nucleicos que se han purificado de ADN genómico o de otras secuencias en una librería u otro entorno en al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más órdenes de magnitud.

Como se usa aquí, el término “recombinante” significa que el ácido nucleico está adyacente a un ácido nucleico “de cadena principal” al que no está adyacente en su entorno natural. En un aspecto, los ácidos nucleicos representan 5% o más del número de insertos de ácidos nucleicos en una población de “moléculas de cadena principal” de ácido nucleico. “Moléculas de cadena principal” según la invención incluyen ácidos nucleicos tales como vectores de expresión, ácidos nucleicos autorreplicantes, virus, ácidos nucleicos integrantes, y otros vectores o ácidos nucleicos usados para mantener o manipular un inserto de ácido nucleico de interés. En un aspecto, los ácidos nucleicos enriquecidos representan 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más del número de insertos de ácidos nucleicos en la población de moléculas de cadena principal recombinantes. Polipéptidos o proteínas “recombinantes” se refiere a polipéptidos o proteínas producidos mediante técnicas de ADN recombinante; por ejemplo, producidos a partir de células transformadas mediante un constructo de ADN exógeno que codifica el polipéptido o proteína deseado. Polipéptidos o proteínas “sintéticos” son aquellos preparados mediante síntesis química, como se describe con más detalle, más abajo.

Una secuencia promotora está “enlazada operablemente a” una secuencia codificante cuando el ARN polimerasa que inicia la transcripción en el promotor transcribirá la secuencia codificante en ARNm, como se explica posteriormente, más abajo.

“Oligonucleótido” se refiere a polidesoxinucleótido monocatenario o dos hebras polidesoxinucleotídicas complementarias que se pueden sintetizar químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen 5’ fosfato, y de este modo no se ligarán a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha desfosforilado.

La expresión “sustancialmente idénticos”, en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias que tienen al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de restos nucleotídicos o de aminoácidos (de secuencia), cuando se comparan y alinean en busca de la máxima correspondencia, como se mide usando uno cualquiera de un algoritmo de comparación de secuencias conocido, como se explica con detalle más abajo, o mediante inspección visual. En aspectos alternativos, la descripción proporciona secuencias de ácido nucleico y polipeptídicas que tienen identidad sustancial con una secuencia ejemplar de la invención, por ejemplo SEC ID NO:1, a lo largo de una región de al menos alrededor de 100 restos, 150 restos, 200 restos, 300 restos, 400 restos, o una región que oscila entre alrededor de 50 restos hasta la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. Las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden ser sustancialmente idénticas a lo largo de toda la longitud de una región codificante polipeptídica.

Adicionalmente, una secuencia de aminoácidos “sustancialmente idéntica” es una secuencia que difiere de una secuencia de referencia en una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, particularmente cuando tal sustitución se produce en un sitio que no es el sitio activo de la molécula, y con la condición de que el polipéptido retenga esencialmente sus propiedades funcionales. Una sustitución de aminoácidos conservativa, por ejemplo, sustituye un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como una sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina). Uno o más aminoácidos se pueden suprimir, por ejemplo, de un polipéptido de fosfolipasa, dando como resultado la modificación de la estructura del polipéptido, sin alterar significativamente su actividad biológica. Por ejemplo, se pueden eliminar los aminoácidos amino-o carboxiterminales que no son necesarios para la actividad biológica de fosfolipasa. Las secuencias polipeptídicas modificadas de la invención se pueden ensayar en busca de la actividad biológica de fosfolipasa mediante cualquier número de métodos, incluyendo la puesta en contacto de la secuencia polipeptídica modificada con un sustrato de fosfolipasa y determinando si el polipéptido modificado disminuye la cantidad de sustrato específico en el ensayo o incrementa los bioproductos de la reacción enzimática de una fosfolipasa funcional con el sustrato, como se explica adicionalmente, más abajo.

“Hibridación” se refiere al proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través de emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas, de manera que se puede identificar una secuencia particular de interés incluso en muestras en las que está presente a concentraciones bajas. Adecuadamente, las condiciones restrictivas se pueden definir, por ejemplo, mediante las concentraciones de sal o formamida en las disoluciones de prehibridación e hibridación, o mediante la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la restricción se puede incrementar reduciendo la concentración de sal, incrementando la concentración de formamida, o elevando la temperatura de hibridación, alterando el tiempo de hibridación, como se describe en detalle, más abajo. En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la invención se definen mediante su capacidad para hibridarse en diversas condiciones de restricción /por ejemplo, elevada, media, y baja), como se expone aquí.

El término “variante” se refiere a polinucleótidos o polipéptidos de la invención modificados en uno o más pares de bases, codones, intrones, exones, o restos de aminoácidos (respectivamente) pero que todavía retienen la actividad biológica de una fosfolipasa de la invención. Las variantes se pueden producir mediante cualquier número de medios, incluyendo métodos tales como, por ejemplo, PCR propensa a errores, transposición de fragmentos, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por inserción de un casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje génico, (GSSM), y cualquier combinación de los mismos. Se incluyen aquí técnicas para producir fosfolipasas variantes que tienen actividad a un pH o temperatura, por ejemplo, que es diferente de una fosfolipasa de tipo salvaje.

La expresión “mutagénesis de saturación” o “GSSM” incluye un método que usa cebadores oligonucleotídicos degenerados para introducir mutaciones de punto en un polinucleótido, como se describe con detalle, más abajo.

La expresión “sistema de evolución dirigida optimizada” o “evolución dirigida optimizada” incluye un método para reensamblar fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas, por ejemplo genes relacionados, y se explica con detalle, más abajo.

La expresión “reensamblaje de ligación sintética” o “SLR” incluye un método para ligar fragmentos oligonucleotídicos de una manera no estocástica, y se explica con detalle, más abajo.

Generación y manipulación de ácidos nucleicos

La invención proporciona ácidos nucleicos, incluyendo casetes de expresión tales como vectores de expresión, que codifican los polipéptidos y fosfolipasas de la invención. La invención también incluye métodos para descubrir nuevas secuencias de fosfolipasas usando los ácidos nucleicos de la invención. También se proporcionan métodos para modificar los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, mediante reensamblaje de ligación sintético, sistema de evolución dirigida optimizada y/o mutagénesis de saturación.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden obtener, aislar y/o manipular, por ejemplo, mediante clonación y expresión de librerías de ADNc, amplificación de ADN mensajero o genómico mediante PCR, y similar. Al poner en práctica los métodos de la invención, los métodos homólogos se pueden modificar manipulando un ácido nucleico molde, como se describe aquí. La invención se puede poner en práctica conjuntamente con cualquier método o protocolo o dispositivo conocido en la técnica, que se describen bien en la bibliografía científica y de patentes.

Técnicas generales

Los ácidos nucleicos usados para practicar esta invención, ya sea ARN, ARNi, ácido nucleico antisentido, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o sus híbridos, se pueden aislar de una variedad de fuentes, se pueden manipular genéticamente, se pueden amplificar, y/o se pueden expresar/generar recombinantemente. Los polipéptidos recombinantes generados a partir de estos ácidos nucleicos se pueden aislar o clonar individualmente y se pueden ensayar para determinar una actividad deseada. Se puede usar cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo sistemas de expresión de células bacterianas, de mamíferos, de levaduras, de insectos o de plantas.

Como alternativa, estos ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro mediante técnicas de síntesis química bien conocidas, como se describe, por ejemplo, en Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; patente U.S. nº 4.458.066.

Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, subclonación, sondas marcadoras (por ejemplo marcaje de cebadores al azar usando la polimerasa de Klenow, la traducción por cortes, amplificación), secuenciación, hibridación, y similares, están bien descritos en la bibliografía científica y de patentes; véanse, por ejemplo, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ª ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).

Otros medios útiles para obtener y manipular ácidos nucleicos usados para poner en práctica los métodos de la invención es la clonación a partir de muestras genómicas, y, si se desea, identificar y volver a clonar insertos aislados o amplificados a partir de, por ejemplo, clones genómicos o clones de ADNc. Las fuentes de ácido nucleico usadas en los métodos de la invención incluyen librerías de genómico o de ADNc contenidas en, por ejemplo, cromosomas artificiales de mamíferos (MACs), véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 5.721.118; 6.025.155; cromosomas artificiales humanos, véase, por ejemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; cromosomas artificiales de levaduras (YAC); cromosomas artificiales bacterianos (BAC); cromosomas artificiales P1, véase, por ejemplo, Woon (1998) Genomics 50:306-316; vectores derivados de P1 (PACs), véase, por ejemplo, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; cósmidos, virus recombinantes, fagos o plásmidos.

En un aspecto, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención se ensambla en fase apropiada con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o su fragmento.

La invención proporciona proteínas de fusión y ácidos nucleicos que las codifican. Un polipéptido de la invención se puede fusionar a un péptido o polipéptido heterólogo, tal como péptidos de identificación N-terminales que proporcionan características deseadas, tales como estabilidad incrementada o purificación simplificada. Los péptidos y polipéptidos de la invención también se pueden sintetizar y expresar como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales enlazados a ellas para, por ejemplo, producir un péptido más inmunógeno, para aislar más fácilmente un péptido sintetizado recombinantemente, para identificar y aislar anticuerpos y células B que expresan anticuerpos, y similares. Los dominios que facilitan la detección y purificación incluyen, por ejemplo, péptidos quelantes de metales tales como tramos de polihistidina y módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad de FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). La inclusión de secuencias ligadoras escindibles, tales como el Factor Xa o enterocinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre un dominio de purificación y el péptido o polipéptido que comprende un motivo para facilitar la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un epítopo enlazada a seis restos de histidina seguido de una tiorredoxina y un sitio de escisión de enterocinasa (véanse, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). Los restos de histidina facilitan la detección y purificación, mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un medio para purificar el epítopo del resto de la proteína de fusión. La tecnología que pertenece a vectores que codifican proteínas de fusión, y la aplicación de las proteínas de fusión, está bien descrita en la bibliografía científica y de patentes, véase, por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53.

Secuencias de control transcripcionales y traduccionales

La invención proporciona secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) de la invención operablemente enlazadas a secuencia o secuencias de control de la expresión (por ejemplo, transcripcionales o traduccionales), por ejemplo promotores o potenciadores, para dirigir o modular la síntesis/expresión del ARN. La secuencia de control de la expresión puede estar en un vector de expresión. Los promotores bacterianos ejemplares incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucariotas ejemplares incluyen CMV inmediato temprano, HSV timidina cinasa, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína I de ratón.

Los promotores adecuados para expresar un polipéptido en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacI, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor lambda PR, el promotor lambda PL, promotores de operones que codifican enzimas glucolíticas tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), y el promotor de fosfatasa ácida. Los promotores eucariotas incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de HSV timidina cinasa, promotores de choque térmico, el promotor de SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y el promotor de metalotioneína I de ratón. También se pueden usar otros promotores conocidos que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas, o sus virus.

Vectores de expresión y vehículos de clonación

La invención proporciona vectores de expresión y vehículos de clonación que comprenden ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo secuencias que codifican las fosfatasas de la invención. Los vectores de expresión y los vehículos de clonación de la invención pueden comprender partículas víricas, baculovirus, fago, plásmidos, fagómidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN vírico (por ejemplo de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela, pseudorrabia y derivados de SV40), cromosomas artificiales a base de P1, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualesquiera otros vectores específicos para hospedantes específicos de interés (tales como bacilos, Aspergillus y levadura). Los vectores de la invención pueden incluir secuencias de ADN sintéticas, cromosómicas y no cromosómicas. Un gran número de vectores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica, y están comercialmente disponibles. Los vectores ejemplares incluyen: bacterianos: vectores pQE (Qiagen), plásmidos pBluescript, vectores pNH, vectores (lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo se puede usar cualquier otro plásmido u otro vector en tanto que sean replicables y viables en el hospedante. Se pueden emplear con la presente invención vectores con número de copias bajo o con número de copias elevado.

El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un origen de replicación, cualesquiera sitios de unión a ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de ayuste, secuencias de la terminación transcripcional, y secuencias no transcritas de flanqueo en 5’. En algunos aspectos, las secuencias de ADN derivadas de los sitios de ayuste y de poliadenilación de SV40 se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

En un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores seleccionables, para permitir la selección de células hospedantes que contienen el vector. Tales marcadores seleccionables incluyen genes que

codifican dihidrofolato reductasa, o genes que confieren resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, genes que confieren resistencia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli, y el gen TRP1 de S. cerevisiae. Las regiones promotoras se pueden seleccionar de cualquier gen deseado usando vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables.

Los vectores para expresar el polipéptido o su fragmento en células eucariotas también pueden contener potenciadores para incrementar los niveles de expresión. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de alrededor de 10 a alrededor de 300 pb de longitud, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación pb 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores adenovíricos.

Una secuencia de ADN se puede insertar en un vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se liga a la posición deseada en el vector tras la digestión del inserto y el vector con endonucleasas de restricción apropiadas. Como alternativa, se pueden ligar extremos romos tanto en el inserto como en el vector. En la técnica se conoce una variedad de técnicas de clonación, por ejemplo como se describe en Ausubel y Sambrook. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

El vector puede estar en forma de un plásmido, una partícula vírica, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN fágico, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fágico, ADN vírico tal como el virus de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela, y pseudorrabia. Una variedad de vectores de clonación y de expresión para uso con hospedantes procariotas y eucariotas se describen, por ejemplo, por Sambrook.

Los vectores bacterianos particulares que se pueden usar incluyen los plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucariotas particulares incluyen pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector en tanto que sea replicable y viable en la célula hospedante.

Células hospedantes y células transformadas

La invención también proporciona una célula transformada que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, por ejemplo una secuencia que codifica una fosfolipasa de la invención, un vector de la invención. La célula hospedante puede ser cualquiera de las células hospedantes familiares para los expertos en la técnica, incluyendo células procariotas, células eucariotas, tales como células bacterianas, células fúngicas, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, o células vegetales. Las células bacterianas ejemplares incluyen

E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. Las células de insecto ejemplares incluyen Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Las células de animales ejemplares incluyen CHO, COS o melanoma de Bowes, o cualquier estirpe celular de ratón o humana. La selección de un hospedante apropiado está dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica.

El vector se puede introducir en las células hospedantes usando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo transformación, transfección, transducción, infección vírica, pistolas génicas, o transferencia de genes mediada por Ti. Los métodos particulares incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Cuando sea apropiado, las células hospedantes manipuladas mediante ingeniería genética se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la invención. Tras la transformación de una cepa hospedante adecuada y el crecimiento de la cepa hospedante hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se puede inducir por medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de la temperatura o inducción química), y las células se pueden cultivar durante un período adicional para permitirles producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Las células se pueden cosechar mediante centrifugación, se pueden destruir por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para purificación adicional. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden destruir mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelacióndescongelación, tratamiento con ultrasonidos, interrupción mecánica, o uso de agentes de lisado celular. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. El polipéptido expresado o su fragmento se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con etanol o sulfato de amonio, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita, y cromatografía con lecitina. Las etapas de replegamiento proteico se pueden usar, según sea necesario, para

completar la configuración del polipéptido. Si se desea, para las etapas de purificación final, se puede emplear cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC).

También se pueden emplear diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las estirpes COS-7 de fibroblastos de riñón de mono y otras estirpes celulares capaces de expresar proteínas a partir de un vector compatible, tales como las estirpes celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.

Los constructos en células hospedantes se pueden usar de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del hospedante empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por células hospedantes que contienen el vector pueden estar glucosilados o pueden no estar glucosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir o no un resto de aminoácido metionina inicial.

Para producir un polipéptido de la invención, también se pueden emplear sistemas de traducción libres de células. Los sistemas de traducción libres de células pueden usar ARNm transcritos a partir de un constructo de ADN que comprende un promotor enlazado operablemente a un ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento del mismo. En algunos aspectos, el constructo de ADN se puede linealizar antes de llevar a cabo una reacción de transcripción in vitro. El ARNm transcrito se incuba entonces con un extracto de traducción libre de células apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedantes transformadas, tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, o tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Amplificación de ácidos nucleicos

En la práctica de la invención, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención, o ácidos nucleicos modificados, se pueden reproducir, por ejemplo, mediante amplificación. La invención proporciona pares de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con una actividad de fosfolipasa. En un aspecto, los pares de cebadores son capaces de amplificar secuencias de ácidos nucleicos de la invención, SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma. Un experto en la técnica puede diseñar pares de secuencias cebadoras de amplificación para cualquier parte de o para la longitud completa de estas secuencias.

La invención proporciona un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que el par de cebadores es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprende una secuencia de la invención, o sus fragmentos o subsecuencias. Uno o cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos alrededor de 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia, o alrededor de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 bases consecutivas de la secuencia.

La invención proporciona pares de cebadores de amplificación, en los que el par de cebadores comprende un primer miembro que tiene una secuencia como se expone mediante alrededor de los primeros (el 5’) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 restos de un ácido nucleico de la invención, y un segundo miembro que tiene una secuencia como se expone mediante alrededor de los primeros (el 5’) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 restos de la hebra complementaria del primer miembro. La invención proporciona fosfolipasas generadas mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando un par de cebadores de amplificación de la invención. La invención proporciona métodos para obtener una fosfolipasa mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando un par de cebadores de amplificación de la invención. En un aspecto, el par de cebadores de amplificación amplifica un ácido nucleico de una librería, por ejemplo una genoteca, tal como una librería medioambiental.

Las reacciones de amplificación también se pueden usar para cuantificar la cantidad de ácido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra celular), marcar el ácido nucleico (por ejemplo, para aplicarlo a una matriz o a una transferencia), para detectar el ácido nucleico, o para cuantificar la cantidad de un ácido nucleico específico en una muestra. En un aspecto de la invención, se amplifica el mensaje aislado de una célula o una librería de ADNc. El experto puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación oligonucleotídicos adecuados. Los métodos de amplificación también son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa PCR (véanse, por ejemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véanse, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificación de transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173); y replicación de secuencia autosostenida (véase, por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificación mediante Q Beta replicasa (véase, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491), ensayo de amplificación de Q-beta replicasa automatizado (véase, por

ejemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véanse también Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; patente U.S. nos 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.

Determinación del grado de identidad de secuencia

La invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o completa (100%) con SEC ID NO:1, y ácidos nucleicos que codifican SEC ID NO:2. La invención proporciona polipéptidos que comprenden secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o completa (100%) con un polipéptido ejemplar de la invención. El grado de identidad de secuencia (homología se puede determinar usando cualquier programa de ordenador y parámetros asociados, incluyendo aquellos descritos aquí, tales como BLAST 2.2.2. o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros por defecto.

En realizaciones alternativas, la identidad de secuencia puede ser a lo largo de una región de al menos alrededor de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 restos consecutivos, o la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. El grado de identidad de secuencia (homología) se puede determinar usando cualquier programa de ordenador y parámetros asociados, incluyendo los descritos aquí, tales como BLAST 2.2.2. o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros por defecto.

Las secuencias homólogas también incluyen secuencias de ARN en las cuales las uridinas sustituyen a las timidinas en las secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias homólogas se pueden obtener usando cualquiera de los procedimientos descritos aquí, o pueden resultar de la corrección de un error de secuenciación. Se apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos como se exponen aquí se pueden representar en el formato de un solo caracter tradicional (por ejemplo, véase Stryer, Lubert. Biochemistry, 3ª Ed., W. H Freeman & Co., Nueva York) o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleótidos en una secuencia.

En este aspecto de la invención, se usan diversos programas de comparación de secuencias identificados aquí. Las identidades de las secuencias proteicas y/o de ácidos nucleicos (homologías) se pueden evaluar usando cualquiera de los algoritmos y programas de comparación de secuencias conocidos en la técnica. Tales algoritmos y programas incluyen, pero no se limitan a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993).

La homología o identidad se puede medir usando el software de análisis de secuencias (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal software empareja secuencias similares asignando grados de homología a diversas supresiones, sustituciones y otras modificaciones. Los términos “homología” e “identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje específico de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales cuando se comparan y alinean en busca de la máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación o región designada según se mide usando cualquier número de algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Para la comparación de las secuencias, una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia (una secuencia ejemplar SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden usar los parámetros por defecto del programa, o se pueden diseñar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación”, como se usa aquí, incluye la referencia a un segmento de uno cualquiera del número de restos contiguos. Por ejemplo, en aspectos alternativos de la invención, restos contiguos que oscilan entre cualquiera de 20 a la longitud completa de una secuencia ejemplar de la invención, por ejemplo SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, se comparan con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén óptimamente alineadas. Si la secuencia de referencia tiene la identidad de secuencia requerida con una secuencia ejemplar de la invención, una identidad de secuencia de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más con una secuencia de la invención, por ejemplo SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, esa secuencia está dentro del alcance de la invención. En realizaciones alternativas, subsecuencias que oscilan desde alrededor de 20 hasta 600, alrededor de 50 hasta 200, y alrededor de 100 hasta 150 se comparan con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias están óptimamente alineadas. Los métodos de alineamiento de secuencia para la comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de

búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual en inspección visual. Otros algoritmos para determinar homología o identidad incluyen, por ejemplo, además de un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool en el National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (Blocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, el algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) y WHAT-IF. Tales programas de alineamiento se pueden usar también para cribar bases de datos genómicas para identificar secuencias polinucleotídicas que tienen secuencias sustancialmente idénticas. Existe un gran número de bases de datos genómicas, por ejemplo una porción sustancial del genoma humano que está disponible como parte del Human Genome Sequencing Project (Gibbs, 1995). Se han secuenciado varios genomas, por ejemplo M. genitalium (Fraser et al., 1995), M. jannaschii (Bult et al., 1996), H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997), y levadura (S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997), y D. melanogaster (Adams et al., 2000). También se ha hecho un progreso significativo a la hora de secuenciar el genoma de organismos modelo, tales como el ratón, C. elegans, y Arabadopsis sp. Las bases de datos que contienen información genómica anotadas con cierta información funcional están mantenidas por diversas organizaciones, y son accesibles vía internet.

Los algoritmos BLAST, BLAST 2.0 y BLAST 2.2.2 también se usan para la práctica de la invención. Se describen, por ejemplo, en Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que coinciden o satisfacen cierta puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se define como el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul (1990) más arriba). Estos resultados de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Los resultados de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se pueda incrementar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias nucleotídicas, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los resultados de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativo cae en la cantidad X desde su valor máximo logrado; la puntuación acumulativa va hasta cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cada secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) usa como defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defecto una longitud de palabra de 3, y expectativas (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras. el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual se produciría por casualidad un emparejamiento entre dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor que alrededor de 0,2, más preferiblemente menor que alrededor de 0,01, y lo más preferible menor que alrededor de 0,001. En un aspecto, las homologías de secuencia proteica y de ácido nucleico se evalúan usando el Basic Local Alignment Search Tool (“BLAST”). Por ejemplo, se pueden usar cinco programas BLAST específicos para llevar a cabo la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de búsqueda de aminoácidos frente a una base de datos de secuencias proteicas; (2) BLASTN compara una secuencia de búsqueda nucleotídica frente a una base de datos de secuencias nucleotídicas; (3) BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia nucleotídica de búsqueda (ambas hebras) frente a una base de datos de secuencias proteicas; (4) TBLASTN compara una secuencia proteica de búsqueda frente a una base de datos de secuencias nucleotídicas traducida en los seis marcos de lectura (ambas hebras); y (5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de búsqueda nucleotídica frente a las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias nucleotídicas. Los programas BLAST identifican secuencias homólogas identificando segmentos similares, que se denominan aquí como “pares de segmentos de puntuación elevada”, entre una secuencia de búsqueda de aminoácidos o de ácido nucleico y una secuencia de ensayo que se obtiene preferiblemente de una base de datos de secuencias proteicas o de ácidos nucleicos. Los pares de segmentos de puntuación elevada se identifican preferiblemente (es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntuación,

muchas de las cuales son conocidas en la técnica. Preferiblemente, la matriz de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993). Menos preferiblemente, también se usan las matrices PAM o PAM250 (véase, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).

En un aspecto de la invención, para determinar si un ácido nucleico tiene la identidad de secuencia requerida para que esté dentro del alcance de la invención, se usan los programas de NCBI BLAST 2.2.2, opciones por defecto frente a blastp. Hay alrededor de 38 opciones de ajuste en el problema BLAST 2.2.2. En este aspecto ejemplar de la invención, se usan todos los valores por defecto, excepto para el ajuste de filtro por defecto (es decir, todos los parámetros se ajustan por defecto excepto el filtrado, que se ajusta a OFF); en su lugar, se usa un ajuste “-F F”, que deshabilita el filtrado. El uso del filtrado por defecto da a menudo como resultado violaciones de Karlin-Altschul, debido a la longitud corta de la secuencia.

Los valores por defecto usados en este aspecto ejemplar de la invención incluyen:

“Filtro para baja complejidad: ON

> Tamaño de palabra: 3

> Matriz: Blosum62

> Costes de salto: Existencia: 11

> Extensión: 1”

Otros ajustes por defecto son: ajuste para baja complejidad OFF, tamaño de palabra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalización de existencia de salto de -11 y penalización de extensión de salto de -1.

En el Ejemplo 1, más abajo, se expone un programa ejemplar de NCBI BLAST 2.2.2. Obsérvese que la opción “-W” está por defecto en 0. Esto significa que, si no se ajusta, el tamaño de palabra está por defecto en 3 para proteína y 11 para nucleótidos.

Sistemas de ordenador y productos de programas de ordenador

Para determinar e identificar identidades de secuencia, homologías estructurales, motivos y similar in silico, la secuencia de la invención se puede almacenar, registrar y manipular en cualquier medio que se pueda leer y acceder mediante un ordenador. En consecuencia, la descripción proporciona ordenadores, sistemas de ordenador, medios legibles por ordenador, productos de programa de ordenador, y similares, registrados o almacenados en ellos, las secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención, por ejemplo una secuencia ejemplar de la invención, por ejemplo SEC ID NO:1, SEC ID NO:2. Como se usa aquí, las palabras “registrados” y “almacenados” se refieren a un proceso de almacenar información en un medio de ordenador. Un experto puede adoptar fácilmente cualesquiera métodos conocidos para registrar información en un medio legible por ordenador para generar productos que comprenden una o más de las secuencias de ácidos nucleicos y/o polipeptídicas de la invención.

Un medio legible por ordenador puede tener registrado en él al menos una secuencia de ácido nucleico y/o polipeptídica de la invención. Los medios legibles por ordenador incluyen medios legibles magnéticamente, medios legibles ópticamente, medios legibles electrónicamente y medios magnéticos/ópticos. Por ejemplo, los medios legibles por ordenador pueden ser un disco duro, un disco flexible, una cinta magnética, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD), Memoria de Acceso Aleatorio (RAM), o Memoria Sólo de Lectura (ROM), así como otros tipos de otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Los sistemas (por ejemplo, sistemas a base de internet), particularmente sistemas de ordenador, pueden almacenar y manipular las secuencias y la información de secuencia descritas aquí. Un ejemplo de un sistema 100 de ordenador se ilustra en forma de diagrama de bloques en la Figura 1. Como se usa aquí, “un sistema de ordenador” se refiere a los componentes de hardware, componentes de software, y componentes de almacenamiento de datos usados para analizar una secuencia nucleotídica o polipeptídica de la invención. El sistema 100 de ordenador puede incluir un procesador para procesar, acceder y manipular los datos de secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo bien conocido de unidad procesadora central, tal como, por ejemplo, la Pentium III de Intel Corporation, o procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD o International Business Machines. El sistema 100 de ordenador es un sistema de fines generales que comprende el procesador 105 y uno o más componentes 110 de almacenamiento de datos interno para almacenar datos, y uno o más dispositivos de recuperación de datos para recuperar los datos almacenados en los componentes de almacenamiento de datos. Un experto puede apreciar fácilmente que son adecuados cualquiera de los sistemas de ordenador actualmente disponibles.

En un aspecto, el sistema 100 de ordenador incluye un procesador 105 conectado a un bus que está conectado a una memoria principal 115 (preferiblemente implementada como RAM) y uno o más dispositivos 110 de almacenamiento de datos internos, tales como un disco duro y/u otro medio legible por ordenador que tiene los

datos registrados en él. El sistema 100 de ordenador puede incluir además uno o más dispositivos 118 de recuperación de datos para leer los datos almacenados en los dispositivos 110 de almacenamiento de datos internos.

El dispositivo 118 de recuperación de datos puede representar, por ejemplo, una unidad de disco flexible, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta magnética, o un módem capaz de conectarse a un sistema de almacenamiento de datos remoto (por ejemplo, vía internet), etc. En algunas realizaciones, el dispositivo 110 de almacenamiento de datos interno es un medio legible por ordenador retirable tal como un disco flexible, un disco compacto, una cinta magnética, etc., que contiene la lógica de control y/o datos registrados en ellos. El sistema 100 de ordenador puede incluir ventajosamente o se puede programar mediante software apropiado para leer la lógica de control y/o los datos a partir del componente de almacenamiento de datos una vez insertado en el dispositivo de recuperación de datos.

El sistema 100 de ordenador incluye una pantalla 120 que se usa para presentar el resultado a un usuario de ordenador. También se debería observar que el sistema 100 de ordenador se puede enlazar a otros sistemas 125ac de ordenador en una red o red de área amplia, para proporcionar un acceso centralizado al sistema 100 de ordenador. El software para acceder y procesar las secuencias nucleotídicas o de aminoácidos de la invención puede residir en la memoria principal 115 durante la ejecución.

El sistema 100 de ordenador puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias para comparar una secuencia de ácido nucleico de la invención. El algoritmo y la secuencia o secuencias se pueden almacenar en un medio legible por ordenador. Un “algoritmo de comparación de secuencias” se refiere a uno o más programas que se implementan (local o remotamente) en el sistema 100 de ordenador para comparar una secuencia nucleotídica con otras secuencias nucleotídicas y/o compuestos almacenados en un medio de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparación de secuencias puede comparar las secuencias nucleotídicas de una secuencia ejemplar, por ejemplo SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, almacenadas en un medio legible por ordenador, con secuencias de referencia almacenadas en un medio legible por ordenador, para identificar homologías o motivos estructurales.

Los parámetros usados con los algoritmos anteriores se pueden adaptar dependiendo de la longitud de la secuencia y el grado de homología estudiada. En algunos aspectos, los parámetros pueden ser los parámetros por defecto usados por los algoritmos en ausencia de instrucciones por parte del usuario. La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia nucleotídica o proteica con una base de datos de secuencias a fin de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos. La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada almacenada en el sistema 100 de ordenador, o una base de datos pública tal como GENBANK que está disponible a través de Internet. El proceso 200 comienza en el estado 201 de partida y después continúa a un estado 202, en el que la nueva secuencia a comparar se almacena en una memoria en un sistema 100 de ordenador. Como se explica anteriormente, la memoria podría ser cualquier tipo de memoria, incluyendo RAM o un dispositivo de almacenamiento interno.

El proceso 200 continúa entonces a un estado 204 en el que una base de datos de secuencias se abre para el análisis y comparación. El proceso 200 continúa entonces a un estado 206 en el que la primera secuencia almacenada en la base de datos se lee en una memoria en el ordenador. Después se lleva a cabo una comparación en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es la misma que la segunda secuencia. Es importante observar que esta etapa no está limitada a llevar a cabo una comparación exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia en la base de datos. Aquellos expertos en la técnica conocen métodos bien conocidos para comparar dos secuencias nucleotídicas o proteicas, incluso si no son idénticas. Por ejemplo, se pueden introducir saltos en una secuencia a fin de elevar el nivel de homología entre las dos secuencias ensayadas. Los parámetros que controlan si se introducen saltos u otras características en una secuencia durante la comparación son introducidos normalmente por el usuario del sistema de ordenador.

Una vez que se ha llevado a cabo una comparación de las dos secuencias en el estado 210, se realiza una determinación en un estado 210 de decisión sobre si las dos secuencias son iguales. Por supuesto, el término “iguales” no está limitado a secuencias que son absolutamente idénticas. Las secuencias que están dentro de los parámetros de homología introducidos por el usuario se marcarán como “iguales” en el proceso 200. Si se realiza una determinación de que las dos secuencias son iguales, el proceso 200 continúa hasta un estado 214, en el que se presenta al usuario el nombre de la secuencia de la base de datos. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre presentado cumple las restricciones de homología que se introdujeron. Una vez que se presenta al usuario el nombre de la secuencia almacenada, el proceso 200 continúa a un estado 218 de decisión, en el que se realiza una determinación sobre si existen más secuencias en la base de datos. Si no existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en el estado 220 final. Sin embargo, si existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 continúa a un estado 224, en el que un puntero se mueve a la siguiente secuencia en la base de datos de manera que se puede comparar con la nueva secuencia. De esta manera, la nueva secuencia se alinea y compara con cada secuencia en la base de datos.

Se debería señalar que si se ha hecho una determinación en el estado 212 de decisión de que las secuencias no fueron homólogas, entonces el proceso 200 continuaría inmediatamente al estado 218 de decisión a fin de

determinar si cualesquiera otras secuencias estaban disponibles en la base de datos para comparación. Un sistema de ordenador puede comprender un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenado en él una secuencia de ácido nucleico de la invención, y un comparador de secuencias para llevar a cabo la comparación. El comparador de secuencias puede indicar un nivel de homología entre las secuencias comparadas o identificar motivos estructurales, o puede identificar motivos estructurales en secuencias que se comparan con estos códigos de ácido nucleico y códigos polipeptídicos.

La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una realización de un proceso 250 en un ordenador para determinar si dos secuencias son homólogas. El proceso 250 comienza en un estado 252 de partida y continúa entonces hacia un estado 254, en el que una primera secuencia a comparar se almacena en una memoria. La segunda secuencia a comparar se almacena entonces en una memoria en un estado 256. El proceso 250 continúa entonces hacia un estado 260, en el que el primer caracter en la primera secuencia se lee, y después hacia un estado 262, en el que se lee el primer caracter de la segunda secuencia. Se debería entender que si la secuencia es una secuencia nucleotídica, entonces el caracter sería normalmente A, T, C, G o U. Si la secuencia es una secuencia proteica, entonces puede ser un código de aminoácido de una sola letra, de manera que las secuencias primera y segunda se pueden comparar fácilmente. Entonces se realiza una determinación en un estado 264 de decisión sobre si los dos caracteres son iguales. Si son iguales, entonces el proceso 250 continúa hacia un estado 268, en el que se leen los siguientes caracteres en las secuencias primera y segunda. Entonces se realiza una determinación sobre si los siguientes caracteres son iguales. Si lo son, entonces el proceso 250 continúa este bucle hasta que dos caracteres no son iguales. Si se realiza una determinación de que los siguientes dos caracteres no son iguales, el proceso 250 continúa hacia un estado 274 de decisión para determinar si hay más caracteres en cualquier secuencia a leer. Si no hay más caracteres a leer, entonces el proceso 250 continúa hacia un estado 276, en el que se presenta al usuario el nivel de homología entre las secuencias primera y segunda. El nivel de homología se determina calculando la proporción de caracteres entre las secuencias que fueron las mismas del número total de secuencias en la primera secuencia. De este modo, si cada caracter en una primera secuencia de 100 nucleótidos se alinea con cada caracter en una segunda secuencia, el nivel de homología sería 100%.

Como alternativa, el programa de ordenador puede comparar una secuencia de referencia con una secuencia de la invención para determinar si las secuencias difieren en una o más posiciones. El programa puede registrar la longitud e identidad de nucleótidos o restos de aminoácidos insertados, suprimidos o sustituidos, con respecto a la secuencia de la referencia o de la invención. El programa de ordenador puede ser un programa que determine si una secuencia de referencia contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) con respecto a una secuencia de la invención, o si una secuencia de la invención comprende un SNP de una secuencia conocida. De este modo, en algunos aspectos, el programa de ordenador es un programa que identifica SNPs. El método se puede implementar mediante los sistemas de ordenador descritos anteriormente y el método ilustrado en la Figura 3. El método se puede llevar a cabo leyendo una secuencia de la invención y las secuencias de referencia a través del uso del programa de ordenador, e identificando diferentes con el programa de ordenador.

En otros aspectos, el sistema a base de ordenador comprende un identificador para identificar características en un ácido nucleico o polipéptido de la invención. Un “identificador” se refiere a uno o más programas que identifica ciertas características en una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un identificador puede comprender un programa que identifica un marco de lectura abierto (ORF) en una secuencia de ácido nucleico. La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 300 identificador para detectar la presencia de una característica en una secuencia. El proceso 300 comienza en un estado 302 de partida y continúa entonces hacia un estado 304 en el que una primera secuencia que se va a comprobar en busca de características se almacena en una memoria 115 en el sistema 100 de ordenador. El proceso 300 continúa entonces hacia un estado 306, en el que se abre una base de datos de características de secuencias. Tal base de datos incluiría una lista de cada atributo de la característica junto con el nombre de la característica. Por ejemplo, un nombre característico podría ser “Codón de Iniciación”, y el atributo sería “ATG”. Otro ejemplo sería el nombre característico “Caja TAATAA”, y el atributo de la característica sería “TAATAA”. Un ejemplo de tal base de datos se produce por el University of Wisconsin Genetics Computer Group. Como alternativa, las características pueden ser motivos polipeptídicos estructurales tales como hélices alfa, láminas beta, o motivos polipeptídicos funcionales tales como sitios activos enzimáticos, motivos de hélice-vuelta-hélice u otros motivos conocidos por los expertos en la técnica. Una vez que la base de datos de las características se abre en el estado 306, el proceso 300 continúa hacia un estado 308 en el que la primera característica se lee de la base de datos. Entonces se lleva a cabo en un estado 310 una comparación del atributo de la primera característica con la primera secuencia. Entonces se realiza una determinación en un estado 316 de decisión sobre si el atributo de la característica se encontró en la primera secuencia. Si se encontró el atributo, entonces el proceso 300 continúa hacia un estado 318, en el que se presenta al usuario el nombre de la característica encontrada. El proceso 300 continúa entonces hacia un estado 320 de decisión, en el que se realiza una determinación sobre si existen más características en la base de datos. Si no existen características, entonces el proceso 300 termina en un estado final 324. Sin embargo, si existen más características en la base de datos, entonces el proceso 300 lee la siguiente característica de secuencia en una etapa 326 y vuelve nuevamente al estado 310, en el que el atributo de la siguiente característica se compara frente a la primera secuencia. Si no se encuentra el atributo de la característica en la primera secuencia en el estado 316 de decisión, el proceso 300 continúa directamente al estado 320 de decisión a fin de determinar si existen más características en la base de

datos. De este modo, en un aspecto, la invención proporciona un programa de ordenador que identifica marcos de lectura abiertos (ORFs).

Una secuencia polipeptídica o de ácido nucleico de la invención se puede almacenar y manipular en una variedad de programas procesadores de datos en una variedad de formatos. Por ejemplo, una secuencia se puede almacenar como texto en un archivo de procesamiento de palabras, tal como MicrosoftWORD o WORDPERFECT, o como un archivo ASCII en una variedad de programas de bases de datos familiares para los expertos en la técnica, tales como DB2, SYBASE, u ORACLE. Además, muchos programas de ordenador y bases de datos se pueden usar como algoritmos de comparación de secuencias, identificadores, o fuentes de secuencias nucleotídicas o secuencias polipeptídicas de referencia a comparar con una secuencia de ácido nucleico de la invención. Los programas y bases de datos usados para la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST y BLAST2 (NCBI), BLASTN y BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), la base de datos del MDL Available Chemicals Directory, la base de datos del MDL Drug Data Report, la base de datos de Comprehensive Medicinal Chemistry, la base de datos de Derwent’s World Drug Index, la base de datos de BioByteMasterFile, la base de datos Genbank, y la base de datos Genseqn. Muchos otros programas y bases de datos serán manifiestos para un experto en la técnica dada la presente descripción.

Los motivos que se pueden detectar usando los programas anteriores incluyen secuencias que codifican cremalleras de leucina, motivos de hélice-vuelta-hélice, sitios de glucosilación, sitios de ubiquitinación, hélices alfa, y láminas beta, secuencias señal que codifican péptidos señal que dirigen la secreción de las proteínas codificadas, secuencias implicadas en la regulación de la transcripción tales como homeocajas, tramos ácidos, sitios activos enzimáticos, sitios de unión a sustrato, y sitios de escisión enzimática.

Hibridación de ácidos nucleicos

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que se hibridan en condiciones restrictivas a la secuencia de la invención SEC ID NO:1, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia como se expone en SEC ID NO:2. Las condiciones restrictivas pueden ser condiciones muy restrictivas, condiciones restrictivas medias, condiciones restrictivas bajas, incluyendo las condiciones de elevada restricción y de restricción reducida descritas aquí. En realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos de la invención como se definen por su capacidad para hibridarse en condiciones restrictivas pueden tener entre alrededor de cinco restos y la longitud completa de la molécula, por ejemplo un ácido nucleico ejemplar de la invención. Por ejemplo, pueden tener al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 restos de longitud. También están incluidos los ácidos nucleicos más cortos que la longitud completa. Estos ácidos nucleicos son útiles como, por ejemplo, sondas de hibridación, sondas de marcaje, sondas oligonucleotídicas de PCR, ARNi (mono- o bicatenario), antisentido o secuencias que codifican péptidos que se unen a anticuerpos (epítopos), motivos, sitios activos y similares.

En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse en condiciones de restricción elevada que comprenden alrededor de 50% de formamida a alrededor de 37ºC a 42ºC. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse en condiciones de restricción reducida que comprenden de alrededor de 35% a 25% de formamida a alrededor de 30ºC a 35ºC. Como alternativa, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse en condiciones de restricción elevada que comprenden a 42ºC en 50% de formamida, 5X SSPE, 0,3% de SDS, y un ácido nucleico de bloqueo de secuencia repetitiva, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmón (por ejemplo, 200 n/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado). En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse en condiciones de restricción reducida que comprenden 35% de formamida a una temperatura reducida de 35ºC.

Tras la hibridación, el filtro se puede lavar con 6X SSC, 0,5% de SDS a 50ºC. Estas condiciones se consideran condiciones “moderadas” por encima de 25% de formamida, y condiciones “bajas” por debajo de 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación “moderadas” es cuando la hibridación anterior se lleva a cabo a 30% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de “baja restricción” es cuando la hibridación anterior se realiza a 10% de formamida.

El intervalo de temperatura que corresponde a un nivel particular de restricción se puede estrechar adicionalmente calculando la relación de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando la temperatura en consecuencia. Los ácidos nucleicos de la invención también se definen por su capacidad para hibridarse en

condiciones de restricción elevadas, medias y bajas como se expone en Ausubel y Sambrook. Las variaciones en los intervalos y condiciones anteriores son bien conocidas en la técnica. Las condiciones de hibridación se explican adicionalmente, más abajo.

Sondas oligonucleotídicas y métodos para usarlas

La invención proporciona también sondas de ácido nucleico para identificar ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con una actividad de fosfolipasa. En un aspecto, la sonda comprende una secuencia como se expone en SEC ID NO:1. Las sondas identifican un ácido nucleico mediante unión o hibridación. Las sondas se pueden usar en matrices de la invención, véase la discusión más abajo, incluyendo, por ejemplo, matrices capilares. Las sondas de la invención también se pueden usar para aislar otros ácidos nucleicos o polipéptidos.

Las sondas de la invención se pueden usar para determinar si una muestra biológica, tal como una muestra de suelo, contiene un organismo que tiene una secuencia de ácido nucleico de la invención o un organismo a partir del cual se obtuvo el ácido nucleico. En tales procedimientos, se obtiene una muestra biológica que posee potencialmente el organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, y los ácidos nucleicos se obtienen de la muestra. Los ácidos nucleicos se ponen en contacto con la sonda en condiciones que permiten que la sonda se hibride específicamente a cualesquiera secuencias complementarias presentes en la muestra. Cuando sea necesario, las condiciones que permiten que la sonda se hibride específicamente a las secuencias complementarias se pueden determinar colocando la sonda en contacto con secuencias complementarias procedentes de muestras que se sabe que contienen la secuencia complementaria, así como secuencias de control que no contienen la secuencia complementaria. Las condiciones de hibridación, tales como la concentración salina del tampón de hibridación, la concentración de formamida del tampón de hibridación, o la temperatura de hibridación, se pueden variar para identificar condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a ácidos nucleicos complementarios (véase la explicación sobre condiciones de hibridación específica).

Si la muestra contiene el organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, entonces se detecta hibridación específica de la sonda. La hibridación se puede detectar marcando la sonda con un agente detectable tal como un isótopo radioactivo, un colorante fluorescente o una enzima capaz de catalizar la formación de un producto detectable. Muchos métodos para usar las sondas marcadas para detectar la presencia de ácidos nucleicos complementarios en una muestra son familiares para los expertos en la técnica. Estos incluyen transferencias Southern, transferencias Northern, procedimientos de hibridación de colonias, y transferencias de punto. En Ausubel y Sambrook se proporcionan protocolos para cada uno de estos procedimientos.

Como alternativa, se puede usar más de una sonda (al menos una de las cuales es capaz de hibridarse específicamente a cualesquiera secuencias complementarias que estén presentes en la muestra de ácido nucleico) en una reacción de amplificación para determinar si la muestra contiene un organismo que contiene una secuencia de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico). En un aspecto, las sondas comprenden oligonucleótidos. En un aspecto, la reacción de amplificación puede comprender una reacción de PCR. Los protocolos de PCR se describen en Ausubel y Sambrook (véase la exposición sobre reacciones de amplificación). En tales procedimientos, los ácidos nucleicos en la muestra se ponen en contacto con las sondas, se lleva a cabo la reacción de amplificación, y se detecta cualquier producto de amplificación resultante. El producto de la amplificación se puede detectar llevando a cabo la electroforesis en gel sobre los productos de reacción y tiñendo el gel con un intercalador tal como bromuro de etidio. Como alternativa, una o más de las sondas se puede marcar con un isótopo radioactivo, y la presencia de un producto de amplificación radioactivo se puede detectar mediante autorradiografía tras la electroforesis en gel.

También se pueden usar sondas derivadas de secuencias próximas a los extremos 3’ o 5’ de una secuencia de ácido nucleico de la invención en procedimientos de paseo cromosómico, para identificar clones que contienen secuencias adicionales, por ejemplo genómicas. Tales métodos permiten el aislamiento de genes que codifican proteínas adicionales de interés a partir del organismo hospedante.

En un aspecto, las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se usan como sondas para identificar y aislar ácidos nucleicos relacionados. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos relacionados así identificados pueden ser ADNc o ADN genómicos procedentes de organismos distintos de aquel a partir del cual se aisló en primer lugar el ácido nucleico de la invención. En tales procedimientos, una muestra de ácido nucleico se pone en contacto con la sonda en condiciones que permiten que la sonda se hibride específicamente a secuencias relacionadas. La hibridación de la sonda a ácidos nucleicos a partir del organismo relacionado se detecta entonces usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

En reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las condiciones usadas para lograr un nivel particular de restricción variarán, dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se hibriden. Por ejemplo, se pueden considerar la longitud, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia nucleotídica (por ejemplo, contenido de GC frente a AT), y el tipo de ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN frente a ADN) de las regiones que se hibridan de los ácidos nucleicos a la hora de seleccionar las condiciones de hibridación. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo, sobre un filtro. La hibridación se puede llevar a cabo en condiciones de baja restricción, restricción moderada o restricción elevada. Como ejemplo de hibridación de

ácidos nucleicos, primero se prehibrida una membrana polimérica que contiene los ácidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados durante 30 minutos a 45ºC en una disolución que consiste en 0,9 M de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, pH 7,0, 5,0 mM de Na2EDTA, 0,5% de SDS, 10X Denhardt, y 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. Entonces se añaden a la disolución aproximadamente 2 X 107 cpm (actividad específica 4-9 X 108 cpm/ug) de sonda oligonucleotídica marcada en el extremo con 32P. Después de 12-16 horas de incubación, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) en 1X SET (150 mM de NaCl, 20 mM de Tris hidrocloruro, pH 7,8, 1 mM de Na2EDTA) que contiene 0,5% de SDS, seguido de un lavado durante 30 minutos en 1X SET reciente a Tm-10ºC para la sonda oligonucleotídica. La membrana se expone entonces a una película autorradiográfica para la detección de las señales de hibridación.

Variando la restricción de las condiciones de hibridación usadas para identificar ácidos nucleicos, tales como ADNc

o ADN genómicos, que se hibridan a la sonda detectable, se pueden identificar y aislar ácidos nucleicos que tienen niveles diferentes de homología con la sonda. La restricción se puede variar llevando a cabo la hibridación a temperaturas variables por debajo de las temperaturas de fusión de las sondas. La temperatura de fusión, Tm, es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente complementaria. Las condiciones muy restrictivas se seleccionan para que sean iguales a o alrededor de 5ºC menores que la Tm para una sonda particular. La temperatura de fusión de la sonda se puede calcular usando las siguientes fórmulas ejemplares. Para sondas entre 14 y 70 nucleótidos de longitud, la temperatura de fusión (Tm) se calcula usando la fórmula: Tm = 81,5 + 16,6 (log [Na+]) + 0,41 (fracción G + C) - (600/N), en la que N es la longitud de la sonda. Si la hibridación se lleva a cabo en una disolución que contiene formamida, la temperatura de fusión se puede calcular usando la ecuación: Tm = 81,5 + 16,6 (log [Na+]) + 0,41 (fracción G + C) – (0,63% de formamida) - (600/N), en la que N es la longitud de la sonda. La prehibridación se puede llevar a cabo en 6X SSC, 5X de reactivo de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 ∀g de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, o 6X SSC, 5X de reactivo de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 ∀g de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, 50% de formamida. Las fórmulas para SSC y el reactivo de Denhardt y otras disoluciones se dan, por ejemplo, en Sambrook.

La hibridación se lleva a cabo añadiendo la sonda detectable a las disoluciones de prehibridación enumeradas anteriormente. Cuando la sonda comprende ADN bicatenario, se desnaturaliza antes de la adición a la disolución de hibridación. El filtro se pone en contacto con la disolución de hibridación durante un período de tiempo suficiente para permitir que la sonda se hibride a ADNc o ADN genómicos que contienen secuencias complementarias a ella u homólogas a ella. Para sondas de alrededor de 200 nucleótidos de longitud, la hibridación se puede llevar a cabo a 15-25ºC por debajo de la Tm. Para sondas más cortas, tal como sondas oligonucleotídicas, la hibridación se puede realizar a 5-10ºC por debajo de la Tm. En un aspecto, las hibridaciones en 6X SSC se llevan a cabo a aproximadamente 68ºC. En un aspecto, las hibridaciones en disoluciones que contienen 50% de formamida se llevan a cabo a aproximadamente 42ºC. Todas las hibridaciones anteriores se considerarían en condiciones de restricción elevada.

Tras la hibridación, el filtro se lava para eliminar cualquier sonda detectable no unida específicamente. La restricción usada para lavar los filtros también se puede variar dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se hibridan, la longitud de los ácidos nucleicos que se hibridan, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia nucleotídica (por ejemplo, contenido de GC frente a AT), y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN frente a ADN). Los ejemplos de lavados en condiciones de restricción progresivamente mayores son los siguientes; 2X SSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos (baja restricción); 0,1X SSC, 0,5% de SDS a temperatura ambiente durante 30 minutos hasta 1 hora (restricción moderada); 0,1X SSC, 0,5% de SDS durante 15 a 30 minutos a una temperatura entre la temperatura de hibridación y 68ºC (restricción elevada); y 0,15M de NaCl durante 15 minutos a 72ºC (restricción muy elevada). Se puede llevar a cabo un lavado de baja restricción final en 0,1X SSC a temperatura ambiente. Los ejemplos anteriores son meramente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se puede usar para lavar filtros. El experto en la técnica sabrá que hay numerosas recetas para lavados con diferentes restricciones.

Los ácidos nucleicos que se han hibridado a la sonda se pueden identificar mediante autorradiografía u otras técnicas convencionales. El procedimiento anterior se puede modificar para identificar ácidos nucleicos que tienen grados decrecientes de homología con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos de homología decreciente con la sonda detectable, se pueden usar condiciones menos restrictivas. Por ejemplo, la temperatura de hibridación se puede disminuir en incrementos de 5ºC desde 68ºC hasta 42ºC en un tampón de hibridación que tiene una concentración de Na+ de aproximadamente 1M. Tras la hibridación, el filtro se puede lavar con 2X SSC, 0,5% de SDS a la temperatura de hibridación. Estas condiciones se consideran condiciones “moderadas” por encima de 50ºC, y condiciones “bajas” por debajo de 50ºC. Un ejemplo de condiciones de hibridación “moderadas” es cuando la hibridación anterior se lleva a cabo a 55ºC. Un ejemplo de condiciones de hibridación de “baja restricción” es cuando la hibridación anterior se lleva a cabo a 45ºC.

Como alternativa, la hibridación se puede llevar a cabo en tampones, tales como 6X SSC, que contienen formamida a una temperatura de 42ºC. En este caso, la concentración de formamida en el tampón de hibridación se puede reducir en incrementos de 5% desde 50% hasta 0% para identificar clones que tienen niveles decrecientes de homología con la sonda. Tras la hibridación, el filtro se puede lavar con 6X SSC, 0,5% de SDS a 50ºC. Estas condiciones se consideran condiciones “moderadas” por encima de 25% de formamida, y condiciones “bajas” por

debajo de 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación “moderadas” es cuando la hibridación anterior se lleva a cabo a 30% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de “baja restricción” es cuando la hibridación anterior se lleva a cabo a 10% de formamida.

Estas sondas y métodos de la invención se pueden usar para aislar ácidos nucleicos que tienen una secuencia con al menos alrededor de 99%, 98%, 97%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, o al menos 50% de homología con una secuencia de ácido nucleico de la invención que comprende al menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ó 500 bases consecutivas de los mismos, y las secuencias complementarias a ella. La homología se puede medir usando un algoritmo de alineamiento, como se explica aquí. Por ejemplo, los polinucleótidos homólogos pueden tener una secuencia codificante que es una variante alélica de origen natural de una de las secuencias codificantes descritas aquí. Tales variantes alélicas pueden tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos cuando se compara con ácidos nucleicos de la invención.

Adicionalmente, las sondas y métodos de la invención se pueden usar para aislar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen al menos alrededor de 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, o al menos 50% de identidad de secuencia (homología) con un polipéptido de la invención que comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos del mismo según se determina usando un algoritmo de alineamiento de secuencias (tal como, por ejemplo, el algoritmo FASTA versión 3.0t78 con los parámetros por defecto, o un programa BLAST 2.2.2 con ajustes ejemplares como se expone aquí).

Inhibición de la expresión de fosfolipasas

La invención proporciona además ácidos nucleicos complementarios a (por ejemplo, secuencias antisentido a) los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo ácidos nucleicos que codifican fosfolipasas. Las secuencias antisentido son capaces de inhibir el transporte, ayuste o transcripción de genes que codifican fosfolipasa. La inhibición se puede efectuar a través de la selección de ADN genómico o ARN mensajero. La transcripción o función del ácido nucleico seleccionado se puede inhibir, por ejemplo, mediante hibridación y/o escisión. Un conjunto particularmente útil de inhibidores proporcionados por la presente invención incluye oligonucleótidos que son capaces de unirse a un gen o mensaje de fosfolipasa, evitando o inhibiendo en cualquier caso la producción o función de la enzima fosfolipasa. La asociación puede ser a través de hibridación específica de secuencias. Otra clase útil de inhibidores incluye oligonucleótidos que provocan la inactivación o escisión del mensaje de fosfolipasa. El oligonucleótido puede tener actividad enzimática, que provoca tal escisión, tal como ribozimas. El oligonucleótido puede estar químicamente modificado o conjugado a una enzima o composición capaz de escindir el ácido nucleico complementario. Se puede cribar un conjunto de muchos de tales oligonucleótidos diferentes en busca de aquellos con la actividad deseada.

La inhibición de la expresión de fosfolipasa puede tener una variedad de aplicaciones industriales. Por ejemplo, la inhibición de la expresión de fosfolipasa puede ralentizar o evitar la putrefacción. La putrefacción se puede producir cuando los lípidos o polipéptidos, por ejemplo lípidos o polipéptidos estructurales, se degradan enzimáticamente. Esto puede conducir al deterioro, o descomposición, de frutas y vegetales. En un aspecto, el uso de composiciones de la invención que inhiben la expresión y/o actividad de fosfolipasa, por ejemplo anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, ribozimas y ARNi, se usan para ralentizar o evitar la putrefacción. De este modo, en un aspecto, la invención proporciona métodos y composiciones que comprenden la aplicación sobre una planta o producto vegetal (por ejemplo, una fruta, semilla, raíz, hoja, etc.) de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, ribozimas y ARNi de la invención para ralentizar o evitar la putrefacción. Estas composiciones también se pueden expresar por la planta (por ejemplo, una planta transgénica) u otro organismo (por ejemplo, una bacteria u otro microorganismo transformado con un gen de fosfolipasa de la invención).

Las composiciones de la invención para la inhibición de la expresión de fosfolipasa (por ejemplo, antisentido, ARNi, ribozimas, anticuerpos) se pueden usar como composiciones farmacéuticas.

Oligonucleótidos antisentido

Los oligonucleótidos antisentido capaces de unirse a un mensaje de fosfolipasa pueden inhibir la actividad de fosfolipasa seleccionando como diana a ARNm. Las estrategias para diseñar oligonucleótidos antisentido están bien descritas en la bibliografía científica y de patentes, y el experto puede diseñar tales oligonucleótidos de fosfolipasas usando los nuevos reactivos de la invención. Por ejemplo, los protocolos de paseo génico/cartografiado de ARN para activar oligonucleótidos antisentido eficaces son bien conocidos en la técnica: véase, por ejemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183, que describe un ensayo de cartografiado de ARN, que se basa en técnicas moleculares estándar para proporcionar un método fácil y fiable para una selección potente de las secuencias antisentido. Véase también Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:191-198.

Los ácidos nucleicos de origen natural se usan como oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido pueden tener cualquier longitud; por ejemplo, en aspectos alternativos, los oligonucleótidos antisentido tienen entre alrededor de 5 y 100, alrededor de 10 y 80, alrededor de 15 y 60, alrededor de 18 y 40. La longitud óptima se puede

determinar mediante cribado habitual. Los oligonucleótidos antisentido pueden estar presentes en cualquier concentración. La concentración óptima se puede determinar mediante cribado habitual. Se conoce una amplia variedad de análogos nucleotídicos y de ácidos nucleicos sintéticos, de origen no natural, que pueden resolver este problema potencial. Por ejemplo, se pueden usar ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) que contienen cadenas principales no iónicas, tales como unidades de N-(2-aminoetil)glicina. También se pueden usar oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces de fosforotioato, como se describe en los documentos WO 97/03211; WO 96/39154; Mata 1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Los oligonucleótidos antisentido que tienen análogos de cadena principal de ADN sintéticos proporcionados por la invención también pueden incluir ácidos nucleicos con fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster de alquilo, sulfamato, 3’-tioacetal, metileno(metilimino), 3’-N-carbamato, y morfolino carbamato, como se describe anteriormente.

La metodología de química combinatoria se puede usar para crear grandes números de oligonucleótidos que se pueden cribar rápidamente en busca de oligonucleótidos específicos que tienen afinidades y especificidades de unión apropiadas con respecto a cualquier diana, tal como las secuencias de fosfolipasas sentido y antisentido de la invención (véase, por ejemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584).

Ribozimas inhibidoras

Las ribozimas capaces de unirse a un mensaje de fosfolipasa pueden inhibir la actividad de la enzima de fosfolipasa seleccionando como dianas a ARNm. Las estrategias para diseñar ribozimas y seleccionar la secuencia antisentido específica de fosfolipasa para la selección como diana están bien descritas en la bibliografía científica y de patentes, y el experto puede diseñar tales ribozimas usando los nuevos reactivos de la invención. Las ribozimas actúan mediante la unión a un ARN diana a través de la porción de unión a ARN diana de una ribozima que se mantiene en estrecha proximidad a una porción enzimática del ARN que escinde el ARN diana. De este modo, la ribozima reconoce y se une a ARN diana a través de un emparejamiento de bases complementarias, y una vez unida al sitio correcto, actúa enzimáticamente para escindir e inactivar el ARN diana. La escisión de un ARN diana de tal manera destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada si la escisión se produce en la secuencia codificante. Después de que una ribozima se ha unido y ha escindido su diana de ARN, es liberada típicamente de ese ARN y de este modo se puede unir y escindir a nuevas dianas repetidamente.

En algunas circunstancias, la naturaleza enzimática de una ribozima puede ser ventajosa con respecto a otras tecnologías, tales como la tecnología antisentido (en la que una molécula de ácido nucleico se une simplemente a una diana de ácido nucleico para bloquear su transcripción, traducción o asociación con otra molécula), ya que la concentración eficaz de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico puede ser menor que la de un oligonucleótido antisentido. Esta ventaja potencial refleja la capacidad de la ribozima para actuar enzimáticamente. De este modo, una única molécula de ribozima es capaz de escindir muchas moléculas de ARN diana. Además, una ribozima es típicamente un inhibidor muy específico, dependiendo la especificidad de la inhibición no sólo del mecanismo de unión del emparejamiento de bases, sino también del mecanismo mediante el cual la molécula inhibe la expresión del ARN al que se une. Esto es, la inhibición es provocada por la escisión de la diana de ARN, y de este modo la especificidad se define como la relación de la velocidad de escisión del ARN seleccionado como diana con respecto a la velocidad de escisión de ARN no seleccionado como diana. Este mecanismo de escisión depende de factores adicionales a los implicados en el emparejamiento de bases. De este modo, la especificidad de acción de una ribozima puede ser mayor que la del oligonucleótido antisentido que se une al mismo sitio de ARN.

La molécula de ARN de ribozima enzimática se puede conformar en un motivo de cabeza de martillo, pero también se puede conformar en el motivo de una horquilla de pelo, virus de la hepatitis delta, intrón del grupo I o ARN similar a ARNasaP (en asociación con una secuencia guía de ARN). Los ejemplos de tales motivos de cabeza de martillo se describen por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; los motivos de horquilla de pelo se describen por Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, y Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299; el motivo de virus de la hepatitis delta se describe por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; el motivo de ARNasaP se describe por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; y el intrón del grupo I se describe mediante la patente U.S. nº 4.987.071 de Cech. Las citas de estos motivos específicos no pretenden ser limitantes; los expertos en la técnica reconocerán que una molécula de ARN enzimática tiene un sitio de unión a sustrato específico complementario a una o más de las regiones de ARN del gen diana, y tiene secuencia nucleotídica en o rodeando a ese sitio de unión a sustrato que proporciona una actividad de escisión de ARN a la molécula.

ARN de interferencia (ARNi)

La molécula inhibidora de ARN, una molécula denominada “ARNi”, comprende una secuencia de fosfolipasa de la invención. La molécula de ARNi comprende una molécula de ARN bicatenario (ARNbc). El ARNi puede inhibir la expresión de un gen de fosfolipasa. En un aspecto, el ARNi tiene alrededor de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos de dúplex de longitud. Aunque la invención no está limitada por ningún mecanismo particular de acción, el ARNi puede entrar en una célula y provocar la degradación de un ARN monocatenario (ARNmc) de secuencias similares o idénticas, incluyendo ARNm endógenos. Cuando una célula se expone a ARN bicatenario (ARNbc), el ARNm del gen homólogo se degrada selectivamente mediante un proceso denominado interferencia del ARN (ARNi). Un mecanismo básico posible detrás del ARNi es la ruptura de un ARN bicatenario (ARNbc) que

coincide con una secuencia génica específica en trozos cortos denominados ARN de interferencia corto, que dispara la degradación de ARNm que coincide con su secuencia. En un aspecto, los ARNi de la invención se usan en terapéutica de silenciamiento de genes; véase, por ejemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. En un aspecto, la invención proporciona métodos para degradar selectivamente ARN usando los ARNi de la invención. El proceso se puede poner en práctica in vitro, ex vivo o in vivo. En un aspecto, las moléculas de ARNi de la invención se pueden usar para generar una mutación de pérdida de función en una célula, un órgano o un animal. Los métodos para obtener y usar moléculas de ARNi para degradar selectivamente ARN son bien conocidos en la técnica, véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.506.559; 6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.

Modificación de ácidos nucleicos

La invención proporciona métodos para generar variantes de los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo aquellos que codifican una enzima de fosfolipasa. Estos métodos se pueden repetir o usar en diversas combinaciones para generar enzimas de fosfolipasa que tienen una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente con respecto a la de una fosfolipasa codificada por el ácido nucleico molde. Estos métodos también se pueden repetir o usar en diversas combinaciones, por ejemplo, para generar variaciones en la expresión génica/del mensaje, traducción del mensaje o estabilidad del mensaje. En otro aspecto, la composición genética de una célula se altera, por ejemplo, mediante modificación de un gen homólogo ex vivo, seguido de su reinserción en la célula.

Un ácido nucleico de la invención se puede alterar por cualquier medio. Por ejemplo, métodos al azar o estocásticos,

o métodos no estocásticos o de “evolución dirigida”.

Los métodos para la mutación al azar de genes son bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, la patente

U.S. nº 5.830.696. Por ejemplo, se pueden usar mutágenos para mutar de forma aleatoria un gen. Los mutágenos incluyen, por ejemplo, irradiación con luz ultravioleta o con rayos gamma, o un mutágeno químico, por ejemplo mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoactivados, solos o en combinación, para inducir rupturas del ADN susceptibles de reparación mediante recombinación. Otros mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina o ácido fórmico. Otros mutágenos son análogos de precursores nucleotídicos, por ejemplo nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina, o acridina. Estos agentes se pueden añadir a una reacción de PCR en lugar del precursor nucleotídico, mutando de ese modo la secuencia. También se pueden usar agentes intercalantes, tales como proflavina, acriflavina, quinacrina y similares.

Se puede usar cualquier técnica en biología molecular, por ejemplo mutagénesis por PCR al azar, véase, por ejemplo, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471; o mutagénesis de múltiples casetes combinatoria, por ejemplo véase Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196. Como alternativa, los ácidos nucleicos, por ejemplo genes, se pueden reensamblar tras la fragmentación al azar, o “estocástica”, véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.291.242; 6.287.862; 6.287.861; 5.955.358; 5.830.721; 5.824.514; 5.811.238; 5.605.793. En aspectos alternativos, se introducen modificaciones, adiciones o supresiones mediante PCR propensa a error, transposición de fragmentos, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de inserción de casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje génico, mutagénesis saturada de sitio génico (GSSM), reensamblaje de ligación sintética (SLR), recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex con saltos, mutagénesis de reparación de desemparejamientos de punto, mutagénesis de cepa hospedante deficiente en la reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de conjunto, reacción de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y/o una combinación de estos y otros métodos.

Las siguientes publicaciones describen una variedad de procedimientos y/o métodos de recombinación recursivos que se pueden incorporar en los métodos de la invención: Stemmer (1999) “Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties” Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) “Evolution of a cytokine using DNA family shuffling” Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) “Protein evolution by molecular breeding” Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling” Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution” Nature 391:288-291; Crameri (1997) “Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”, Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) “Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) “Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines” Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) “Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling” Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al. (1996) “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling” Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al. (1996) “Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ‘headpiece dimer” Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” En: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nueva York. p. 447-457; Crameri y Stemmer (1995) “Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes” BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) “Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large

numbers of oligodeoxyribonucleotides” Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) “The Evolution of Molecular Computation” Science 270: 1510; Stemmer (1995) “Searching Sequence Space” Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370:389-391; y Stemmer (1994) “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.

Los métodos mutacionales para generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling et al. (1997) “Approaches to DNA mutagenesis: an overview” Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method” Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) “In vitro mutagenesis” Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein y Shortle (1985) “Strategies and applications of in vitro mutagenesis” Science 229:1193-1201; Carter (1986) “Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237:1-7; y Kunkel (1987) “The efficiency of oligonucleotide-directed mutagenesis” in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis que usa moldes que contienen uracilo (Kunkel (1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Methods in Enzymol. 154, 367-382; y Bass et al. (1988) “Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities” Science 242:240-245); mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller y Smith (1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller y Smith (1983) “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors” Methods in Enzymol. 100:468-500; y Zoller y Smith (1987) “Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagénesis de AND modificado con fosforotioato (Taylor et al. (1985) “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA” Nucl. Acids Res. 13: 87498764; Taylor et al. (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) “Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) “Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 16:791-802; y Sayers et al. (1988) “Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide” Nucl. Acids Res. 16: 803-814); mutagénesis que usa ADN dúplex con saltos (Kramer et al. (1984) “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer y Fritz (1987) Methods in Enzymol. “Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA” 154:350-367; Kramer et al. (1988) “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations” Nucl. Acids Res. 16: 7207; y Fritz et al. (1988) “Oligonucleotidedirected construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro” Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).

Los protocolos adicionales usados en los métodos de la invención incluyen reparación de desemparejamientos de punto (Kramer (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38:879-887), mutagénesis que usa cepas hospedantes deficientes en la reparación (Carter et al. (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; y Carter (1987) “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors” Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagénesis de supresión (Eghtedarzadeh (1986) “Use of oligonucleotides to generate large deletions” Nucl. Acids Res. 14: 5115), mutagénesis de restricción-selección y restricción-selección y restricción-purificación (Wells et al. (1986) “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin” Phil. Trans. R Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagénesis mediante síntesis génica total (Nambiar et al. (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223: 1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) “Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)” Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites” Gene 34:315-323; y Grundstrom et al. (1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis” Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), reparación de ruptura bicatenaria (Mandecki (1986); Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. “Oligonucleotidedirected double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181). En Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para resolver problemas con diversos métodos de mutagénesis, se pueden encontrar detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores.

Véanse también las patentes U.S. nº 5.605.793 de Stemmer (25 de febrero de 1997), “Methods for In Vitro Recombination”; Patente U.S. nº 5.811.238 de Stemmer et al. (22 de septiembre de 1998) “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”; Patente U.S. nº 5.830.721 de Stemmer et al. (3 de noviembre de 1998), “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”; Patente U.S. nº 5.834.252 de Stemmer, et al. (10 de noviembre de 1998) “End-Complementary Polymerase Reaction”; Patente U.S. nº 5.837.458 de Minshull, et al. (17 de noviembre de 1998), “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”; documento WO 95/22625, Stemmer y Crameri, “Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”; documento WO 96/33207 por Stemmer y Lipschutz “End Complementary

Polymerase Chain Reaction”; documento WO 97/20078 por Stemmer y Crameri “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”; documento WO 97/35966 por Minshull y Stemmer, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”; documento WO 99/41402 por Punnonen et al. “Targeting of Genetic Vaccine Vectors”; documento WO 99/41383 por Punnonen et al. “Antigen Library Immunization”; documento WO 99/41369 por Punnonen et al. “Genetic Vaccine Vector Engineering”; documento WO 99/41368 por Punnonen et al. “Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”; documento EP 752008 por Stemmer y Crameri, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”; documento EP 0932670 por Stemmer “Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”; documento WO 99/23107 por Stemmer et al., “Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling”; documento WO 99/21979 por Apt et al., “Human Papillomavirus Vectors”; documento WO 98/31837 por del Cardayre et al. “Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination”; documento WO 98/27230 por Patten y Stemmer, “Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”; documento WO 98/27230 por Stemmer et al., “Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection”, documento WO 00/00632, “Methods for Generating Highly Diverse Libraries”, documento WO 00/09679, “Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences”, documento WO 98/42832 por Arnold et al., “Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers”, documento WO 99/29902 por Arnold et al., “Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences”, documento WO 98/41653 por Vind, “An in Vitro Method for Construction of a DNA Library”, documento WO 98/41622 por Borchert et al., “Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling”, y documento WO 98/42727 por Pati y Zarling, “Sequence Alterations using Homologous Recombination”.

Ciertas solicitudes U.S. proporcionan detalles adicionales con respecto a diversos métodos que generan diversidad, incluyendo “SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES” por Patten et al. presentado el 28 de septiembre de 1999,

(U.S. Ser. No. 09/407.800); “EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION” por del Cardayre et al., presentado el 15 de julio de 1998 (U.S. Ser. No. 09/166.188), y 15 de julio de 1999 (U.S. Ser. No. 09/354.922); “OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION” por Crameri et al., presentado el 28 de septiembre de 1999 (U.S. Ser. No. 09/408.392), y “OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION” por Crameri et al., presentado el 18 de enero de 2000 (PCT/US00/01203); “USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING” por Welch et al., presentado el 28 de septiembre de 1999 (U.S. Ser. No. 09/408.393); “METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS” por Selifonov et al., presentado el 18 de enero de 2000, (PCT/US00/01202) y, por ejemplo “METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS” por Selifonov et al., presentado el 18 de julio de 2000 (U.S. Ser. No. 09/618.579); “METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS” por Selifonov y Stemmer, presentado el 18 de enero de 2000 (PCT/US00/01138); y “SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION” por Affholter, presentado el 6 de septiembre de 2000 (U.S. Ser. No. 09/656.549).

Los métodos no estocásticos, o “de evolución dirigida”, incluyen, por ejemplo, mutagénesis de saturación (GSSM), reensamblaje de ligación sintética (SLR), o una combinación de los mismos, que se usan para modificar los ácidos nucleicos de la invención para generar fosfolipasas con propiedades nuevas o alteradas (por ejemplo, actividad en condiciones muy ácidas o alcalinas, temperaturas elevadas, y similares). Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos modificados se pueden cribar en busca de una actividad antes de ensayar para determinar una actividad de fosfolipasa u otra actividad. Se puede usar cualquier modalidad o protocolo de ensayo, por ejemplo usando una plataforma de matriz capilar. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.280.926; 5.939.250.

Mutagénesis de saturación, o GSSM

En un aspecto de la invención, la modificación génica no estocástica, un “proceso de evolución dirigida”, se usa para generar fosfolipasas con propiedades nuevas o alteradas. Las variaciones de este método se han denominado “mutagénesis de saturación de sitio génico”, “mutagénesis de saturación de sitio”, “mutagénesis de saturación” o simplemente “GSSM”. Se puede usar en combinación con otros procesos de mutagenización. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.171.820; 6.238.884. En un aspecto, GSSM comprende proporcionar un polinucleótido molde y una pluralidad de oligonucleótidos, en el que cada oligonucleótido comprende una secuencia homóloga al polinucleótido molde, seleccionando de ese modo como diana una secuencia específica del polinucleótido molde, y una secuencia que es una variante del gen homólogo; generar polinucleótidos de progenie que comprenden variaciones de secuencia no estocásticas replicando el polinucleótido molde con los oligonucleótidos, generando de ese modo polinucleótidos que comprenden variaciones de secuencias génicas homólogas.

En un aspecto, los cebadores de los codones que contienen una secuencia degenerada N,N,G/T se usan para introducir mutaciones de punto en un polinucleótido, para generar un conjunto de polipéptidos progenie en los que un intervalo completo de sustituciones de un solo aminoácido se representa en cada posición de aminoácido, por ejemplo un resto de aminoácido en un sitio activo enzimático o un sitio de unión a ligando seleccionado para ser modificado. Estos oligonucleótidos pueden comprender una primera secuencia homóloga contigua, una secuencia degenerada N,N,G/T, y, opcionalmente, una segunda secuencia homóloga. Los productos traduccionales de progenie aguas abajo procedentes del uso de tales oligonucleótidos incluyen todos los posibles cambios de

aminoácidos en cada sitio de aminoácido a lo largo del polipéptido, debido a que la degeneración de la secuencia N,N,G/T incluye codones para los 20 aminoácidos. En un aspecto, uno de tales oligonucleótidos degenerados (compuesto de, por ejemplo, un casete degenerado N,N,G/T) se usa para someter a cada codón original en un molde polinucleotídico progenitor a un intervalo completo de sustituciones de codones. En otro aspecto, se usan al menos dos casetes degenerados – ya sea en el mismo oligonucleótido o no, para someter al menos dos codones originales en un molde polinucleotídico progenitor a un intervalo completo de sustituciones de codones. Por ejemplo, más de una secuencia N,N,G/T puede estar contenida en un oligonucleótido para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N,N,G/T puede estar directamente contigua, o separada en una o más secuencias nucleotídicas adicionales. En otro aspecto, los oligonucleótidos aprovechables para introducir adiciones y supresiones se pueden usar solos o en combinación con los codones que contienen una secuencia N,N,G/T, para introducir cualquier combinación o permutación de adiciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos.

En un aspecto, la mutagénesis simultánea de dos o más posiciones de aminoácidos contiguas se realiza usando un oligonucleótido que contiene tripletes N,N,G/T contiguos, es decir, una secuencia degenerada (N,N,G/T)n. En otro aspecto, se usan casetes degenerados que tienen una degeneración menor que la secuencia N,N,G/T. Por ejemplo, puede ser deseable en algunos casos usar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia triplete degenerada compuesta solamente de un N, en el que dicho N puede estar en la primera, segunda o tercera posición del triplete. Cualquier otra base, incluyendo cualesquiera combinaciones y permutaciones de las mismas, se puede usar en las dos posiciones restantes del triplete. Como alternativa, puede ser deseable en algunos casos usar (por ejemplo, en un oligo) una secuencia triplete N,N,N degenerada.

En un aspecto, el uso de tripletes degenerados (por ejemplo, tripletes N,N,G/T) permite la generación sistemática y fácil de un intervalo completo de aminoácidos naturales posibles (para un total de 20 aminoácidos) en todas y cada una de las posiciones de aminoácidos en un polipéptido (en aspectos alternativos, los métodos también incluyen la generación de menos de todas las sustituciones posibles por resto de aminoácido, o codón, posición). Por ejemplo, para un polipéptido de 100 aminoácidos, se pueden generar 2000 especies diferentes (es decir, 20 aminoácidos posibles por posición X 100 posiciones de aminoácidos). Mediante el uso de un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos que contienen un triplete N,N,G/T degenerado, 32 secuencias individuales pueden codificar los 20 aminoácidos naturales posibles. De este modo, en una vasija de reacción en la que una secuencia polinucleotídica progenitora se somete a mutagénesis de saturación usando al menos uno de tales oligonucleótidos, se generan 32 polinucleótidos progenie distintos que codifican 20 polipéptidos distintos. Por el contrario, el uso de un oligonucleótido no degenerado en mutagénesis dirigida al sitio conduce a sólo un producto polipeptídico progenie por vasija de reacción. Los oligonucleótidos no degenerados se pueden usar opcionalmente en combinación con cebadores degenerados descritos; por ejemplo, los oligonucleótidos no degenerados se pueden usar para generar mutaciones de punto específicas en un polinucleótido de trabajo. Esto proporciona un medio para generar mutaciones de punto silenciosas específicas, mutaciones de punto que conducen a cambios de aminoácidos correspondientes, y mutaciones de punto que provocan la generación de codones de parada y la expresión correspondiente de fragmentos polipeptídicos.

En un aspecto, cada vasija de reacción de mutagénesis de saturación contiene polinucleótidos que codifican al menos 20 moléculas polipeptídicas progenie (por ejemplo, fosfolipasa) de manera que los 20 aminoácidos naturales están representados en la una posición de aminoácido específica correspondiente a la posición de codón mutagenizada en el polinucleótido progenitor (otros aspectos usan menos de 20 combinaciones naturales). Los polipéptidos progenie degenerados de 32 veces generados a partir de cada vasija de reacción de mutagénesis de saturación se pueden someter a amplificación clonal (por ejemplo, clonados en un hospedante adecuado, por ejemplo hospedante de E. coli, usando, por ejemplo, un vector de expresión) y se pueden someter a cribado de expresión. Cuando un polipéptido progenie individual se identifica mediante cribado para presentar un cambio favorable en la propiedad (cuando se compara con el polipéptido progenitor, tal como actividad de fosfolipasa incrementada en condiciones alcalinas o ácidas), se puede secuenciar para identificar la sustitución de aminoácido correspondientemente favorable contenida en él.

En un aspecto, al mutagenizar todas y cada una de las posiciones de aminoácidos en un polipéptido progenitor usando mutagénesis de saturación como se describe aquí, se pueden identificar cambios de aminoácidos favorables en más de una posición de aminoácido. Se pueden generar una o más nuevas moléculas progenie que contienen una combinación de todas o partes de estas sustituciones de aminoácidos favorables. Si se identifican 2 cambios de aminoácidos favorables específicos en cada una de 3 posiciones de aminoácidos en un polipéptido, las permutaciones incluyen 3 posibilidades en cada posición (ningún cambio del aminoácido original, y cada uno de dos cambios favorables) y 3 posiciones. De este modo, hay 3 x 3 x 3 ó 27 posibilidades totales, incluyendo 7 que se examinaron previamente – 6 mutaciones de un solo punto (es decir, 2 en cada una de tres posiciones) y ningún cambio en ninguna posición.

En otro aspecto, se puede usar mutagénesis de saturación de sitio junto con otros medios estocásticos o no estocásticos para variar la secuencia, por ejemplo reensamblaje de ligación sintética (véase más abajo), transposición de partículas, quimerización, recombinación y otros procesos de mutagenización y agentes mutagenizantes. Esta invención proporciona el uso de cualquier proceso o procesos mutagenizantes, incluyendo mutagénesis de saturación, de una manera repetitiva.

Reensamblaje de ligación sintética (SLR)

La invención proporciona un sistema de modificación génica no estocástico denominado “reensamblaje de ligación sintética”, o simplemente “SLR”, un “proceso de evolución dirigida”, para generar fosfolipasas con propiedades nuevas o alteradas. SLR es un método de ligar fragmentos oligonucleotídicos juntos de forma no estocástica. Este método difiere del barajado oligonucleotídico estocástico por cuanto los bloques de construcción de ácido nucleico no se barajan, concatenan o quimerizan aleatoriamente, sino más bien se ensamblan de forma no estocástica. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente U.S. Serie nº (CTSSN) 09/332.835 titulada “Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution” y presentada el 14 de junio de 1999 (“USSN 09/332.835”). En un aspecto, SLR comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polinucleótido molde, en el que el polinucleótido molde comprende una secuencia que codifica un gen homólogo; (b) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de bloques constructores, en el que los polinucleótidos de bloques constructores se diseñan para el reensamblaje cruzado con el polinucleótido molde a una secuencia predeterminada, y un polinucleótido de bloque constructor comprende una secuencia que es una variante del gen homólogo y una secuencia homóloga al polinucleótido molde que flanquea la secuencia variante; (c) combinar un polinucleótido de bloque constructor con un polinucleótido molde de manera que el polinucleótido de bloque constructor se reensambla de forma cruzada con el polinucleótido molde para generar polinucleótidos que comprenden variaciones de secuencias génicas homólogas.

SLR no depende de la presencia de niveles elevados de homología entre los polinucleótidos a reordenar. De este modo, este método se puede usar para generar no estocásticamente librerías (o conjuntos) de moléculas progenie que comprenden alrededor de 10100 quimeras diferentes. SLR se puede usar para generar librerías compuestas de alrededor de 101000 quimeras progenie diferentes. De este modo, los aspectos de la presente invención incluyen métodos no estocásticos para producir un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamblaje global que se escoge mediante diseño. Este método incluye las etapas de generar mediante diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos que tienen extremos ligables compatibles mutuamente utilizables, y de ensamblar estos bloques constructores de ácidos nucleicos, de manera que se logre un orden de ensamblaje global diseñado.

Los extremos ligables mutuamente compatibles de los bloques constructores de ácidos nucleicos a ensamblar se consideran “utilizables” para este tipo de ensamblaje ordenado si permiten que los bloques constructores se acoplen en órdenes predeterminados. De este modo, el orden de ensamblaje global en el que se pueden acoplar los bloques constructores de ácidos nucleicos se especifica mediante el diseño de los extremos ligables. Si se usa más de una etapa de ensamblaje, entonces el orden de ensamblaje global en el que se pueden acoplar los bloques constructores de ácidos nucleicos también se especifica mediante el orden secuencia de la etapa o etapas de ensamblaje. En un aspecto, los trozos constructores hibridados se tratan con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo, T4 ADN ligasa), para lograr un enlace covalente de los trozos constructores.

En un aspecto, el diseño de los bloques constructores oligonucleotídicos se obtiene analizando un conjunto de moldes de secuencias de ácidos nucleicos progenitoras que sirven como base para producir un conjunto progenie de polinucleótidos quiméricos finalizados. Estos moldes oligonucleotídicos progenitores sirven así como una fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de los bloques constructores de ácidos nucleicos que se van a mutagenizar, por ejemplo quimerizar o barajar.

En un aspecto de este método, las secuencias de una pluralidad de moldes de ácidos nucleicos progenitoras se alinean a fin de seleccionar uno o más puntos de demarcación. Los puntos de demarcación se pueden localizar en un área de homología, y comprenden uno o más nucleótidos. Estos puntos de demarcación son compartidos preferiblemente por al menos dos de los moldes progenitores. Los puntos de demarcación se pueden usar de ese modo para delinear los límites de los bloques constructores oligonucleotídicos a generar a fin de reordenar los polinucleótidos progenitores. Los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras sirven como puntos de quimerización potenciales en el ensamblaje de las moléculas progenie quiméricas finales. Un punto de demarcación puede ser un área de homología (compuesta de al menos una base nucleotídica homóloga) compartida por al menos dos secuencias polinucleotídicas progenitoras. Como alternativa, un punto de demarcación puede ser un área de homología que es compartida por al menos la mitad de las secuencias polinucleotídicas progenitoras, o puede ser un área de homología que es compartida por al menos dos tercios de las secuencias polinucleotídicas progenitoras. Incluso más preferiblemente, un punto de demarcación usable es un área de homología que es compartida por al menos tres cuartos de las secuencias polinucleotídicas progenitoras, o puede ser compartida por casi todas las secuencias polinucleotídicas progenitoras. En un aspecto, un punto de demarcación es un área de homología que es compartida por todas las secuencias polinucleotídicas progenitoras.

En un aspecto, un proceso de reensamblaje de ligación se lleva a cabo exhaustivamente a fin de generar una librería exhaustiva de polinucleótidos quiméricos progenie. En otras palabras, todas las posibles combinaciones ordenadas de los bloques constructores de ácidos nucleicos se representan en el conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas. Al mismo tiempo, en otra realización, el orden de ensamblaje (es decir, el orden de ensamblaje de cada bloque constructor en la secuencia 5’ a 3 de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación es por diseño (o no estocástico) como se describe anteriormente. Debido a la naturaleza no estocástica de esta invención, se reduce enormemente la posibilidad de productos secundarios indeseados.

En otro aspecto, el método de reensamblaje de ligación se lleva a cabo sistemáticamente. Por ejemplo, el método se lleva a cabo a fin de generar una librería sistemáticamente compartimentalizada de moléculas progenie, con compartimientos que se pueden ligar sistemáticamente, por ejemplo uno a uno. En otras palabras, esta invención proporciona que, mediante el uso selectivo y juicioso de bloques constructores de ácidos nucleicos específicos, acoplado con el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamblaje secuencialmente por etapas, se puede lograr un diseño en el que se obtienen conjuntos específicos de productos progenie en cada una de las varias vasijas de reacción. Esto permite que se lleve a cabo un procedimiento de examen y cribado sistemático. De este modo, estos métodos permiten que se examine sistemáticamente en grupos más pequeños un número potencialmente muy grande de moléculas progenie. Debido a su capacidad para llevar a cabo quimerizaciones de una manera que es muy flexible aunque igualmente exhaustiva y sistemática, particularmente cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras, estos métodos proporcionan la generación de una librería (o conjunto) compuesta de un gran número de moléculas progenie. Debido a la naturaleza no estocástica del reensamblaje de ligación de la actual invención, las moléculas progenie generadas comprenden preferiblemente una librería de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamblaje global que se escoge por diseño. La mutagénesis de saturación y los métodos de evolución dirigida optimizada también se pueden usar para generar diferentes especies moleculares progenie. Se aprecia que la invención proporciona libertad de elección y control con respecto a la selección de los puntos de demarcación, el tamaño y número de los bloques constructores de ácidos nucleicos, y el tamaño y diseño de los acoplamientos. Además, se aprecia que el requisito de homología intermolecular está muy relajado para la operabilidad de esta invención. De hecho, los puntos de demarcación se pueden escoger incluso en áreas de poca o ninguna homología intermolecular. Por ejemplo, debido al bamboleo de los codones, es decir, la degeneración de los codones, se pueden introducir sustituciones nucleotídicas en los bloques constructores de ácidos nucleicos sin alterar el aminoácido codificado originalmente en el molde progenitor correspondiente. Como alternativa, un codón se puede alterar de manera que se altere la codificación de un aminoácido original. Esta invención proporciona que tales sustituciones se puedan introducir en el bloque constructor de ácido nucleico a fin de incrementar la incidencia de puntos de demarcación homólogos intramolecularmente, y de este modo permite que se logre un número creciente de acoplamientos entre los bloques constructores, lo que a su vez permite que se genere un mayor número de moléculas quiméricas progenie.

En otro aspecto, la naturaleza sintética de la etapa en la que se generan los bloques constructores permite el diseño e introducción de nucleótidos (por ejemplo, uno o más nucleótidos, que pueden ser, por ejemplo, codones o intrones,

o secuencias reguladoras) que más tarde se pueden eliminar en un proceso in vitro (por ejemplo mediante mutagénesis) con un proceso in vivo (por ejemplo utilizando la capacidad de ayuste génico de un organismo hospedante). Se aprecia que en muchos casos la introducción de estos nucleótidos también puede ser deseable por muchas otras razones, además del beneficio potencial de crear un punto de demarcación utilizable.

En un aspecto, un bloque constructor de ácido nucleico se usa para introducir un intrón. De este modo, los intrones funcionales se introducen en un gen fabricado por el hombre, fabricado según los métodos descritos aquí. El intrón o intrones introducidos artificialmente pueden ser funcionales en células hospedantes para el ayuste génico de la misma manera que los intrones de origen natural sirven funcionalmente en el ayuste génico.

Sistema de evolución dirigida optimizada

La invención proporciona un sistema de modificación génica no estocástico denominado “sistema de evolución dirigida optimizada” para generar fosfolipasas con propiedades nuevas o alteradas. La evolución dirigida optimizada se refiere al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación y selección que permite la evolución molecular dirigida de ácidos nucleicos a través de recombinación. La evolución dirigida optimizada permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en el que la población generada está significativamente enriquecida en secuencias que tienen un número predeterminado de sucesos de cruzamiento.

Un suceso de cruzamiento es un punto en una secuencia quimérica en el que se produce un desplazamiento en la secuencia desde una variante parental a otra variante parental. Tal punto está normalmente en la unión donde se ligan juntos oligonucleótidos de dos progenitores para formar una única secuencia. Este método permite el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias oligonucleotídicas de manera que la población quimérica final de secuencias está enriquecida para el número escogido de sucesos de cruzamiento. Esto proporciona más control sobre la elección de variantes quiméricas que tienen un número predeterminado de sucesos de cruzamiento.

Además, este método proporciona un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del espacio de variantes proteicas posibles en comparación con otros sistemas. Previamente, si se generaron, por ejemplo, 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, sería extremadamente difícil ensayar tal número elevado de variantes quiméricas en busca de una actividad particular. Además, una porción significativa de la población progenie tendría un número muy elevado de sucesos de cruzamiento, lo que daría como resultado proteínas que tendrían menos probabilidad de tener niveles incrementados de una actividad particular. Usando estos métodos, la población de moléculas quiméricas se pueden enriquecer en aquellas variantes que tienen un número particular de sucesos de cruzamiento. De este modo, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante la reacción, cada una de las moléculas escogidas para el análisis posterior tendrá muy probablemente, por ejemplo, sólo tres sucesos de cruzamiento. Debido a que la población progenie resultante puede estar sesgada para que tenga un número predeterminado de sucesos de cruzamiento, los límites en la variedad funcional entre las moléculas quiméricas se

reducen. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula qué oligonucleótido de los polinucleótidos parentales originales puede ser responsable de afectar un rasgo particular.

Un método para crear una secuencia polinucleotídica progenie quimérica es crear oligonucleótidos que corresponden a fragmentos o porciones de cada secuencia parental. Cada oligonucleótido incluye preferiblemente una región única de solapamiento de manera que el mezclamiento de todos los oligonucleótidos da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento oligonucleotídico ensamblado en el orden correcto. En USSN 09/332.835 se puede encontrar información adicional. El número de oligonucleótidos generados para cada variante parental posee una relación con el número total de cruzamientos resultantes en la molécula quimérica que se crea finalmente. Por ejemplo, se pueden proporcionar tres variantes de secuencias nucleotídicas parentales para sufrir una reacción de ligación a fin de encontrar una variante quimérica que tiene, por ejemplo, mayor actividad a temperatura elevada. Como ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias oligonucleotídicas que corresponden a cada una de las porciones de cada variante parental. En consecuencia, durante el proceso de reensamblaje de ligación, podría haber hasta 50 sucesos de cruzamiento en cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleótidos quiméricos generados contendrá oligonucleótidos procedentes de cada variante parental en orden alterno es muy baja. Si cada fragmento oligonucleotídico está presente en la reacción de ligación en la misma cantidad molar, es probable que en algunas posiciones los oligonucleótidos procedentes del mismo polinucleótido parental se ligarán próximos entre sí, y de este modo no darán como resultado un suceso de cruzamiento. Si la concentración de cada oligonucleótido procedente de cada progenitor se mantiene constante durante cualquier etapa de ligación en este ejemplo, hay una posibilidad de 1/3 (suponiendo 3 progenitores) de que un oligonucleótido procedente de la misma variante parental se ligue en la secuencia quimérica y no produzca cruzamiento.

En consecuencia, se puede determinar una función de densidad de probabilidad (PDF) para predecir la población de sucesos de cruzamiento que es probable que se produzcan durante cada etapa en la reacción de ligación dado un número fijo de variantes parentales, un número de oligonucleótidos que corresponden a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada etapa en la reacción de ligación. Más abajo se describen las estadísticas y matemáticas detrás de la determinación de la PDF. Utilizando estos métodos, se puede calcular tal función de densidad de probabilidad, y de este modo enriquecer la población progenie quimérica para un número predeterminado de sucesos de cruzamiento que resultan de una reacción de ligación particular. Además, se puede predeterminar un número diana de sucesos de cruzamiento, y el sistema se puede programar entonces para calcular las cantidades de partida de cada oligonucleótido parental durante cada etapa en la reacción de ligación para dar como resultado una función de densidad de probabilidad que se centra en el número predeterminado de sucesos de cruzamiento. Un suceso de cruzamiento es un punto en una secuencia quimérica en el que se produce un desplazamiento en la secuencia desde una variante parental a otra variante parental. Tal punto está normalmente en la unión donde se ligan juntos oligonucleótidos de dos progenitores para formar una única secuencia. El método permite el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias oligonucleotídicas de manera que la población quimérica final de secuencias está enriquecida para el número escogido de sucesos de cruzamiento. Esto proporciona más control sobre la elección de variantes quiméricas que tienen un número predeterminado de sucesos de cruzamiento.

Además, estos métodos proporcionan un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del espacio de variantes proteicas posible en comparación con otros sistemas. Usando los métodos descritos aquí, la población de moléculas quiméricas se puede enriquecer para aquellas variantes que tienen un número particular de sucesos de cruzamiento. De este modo, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas escogidas para análisis posterior tiene muy probablemente, por ejemplo, sólo tres sucesos de cruzamiento. Debido a que la población progenie resultante se puede sesgar para que tenga un número predeterminado de sucesos de cruzamiento, los límites en la variedad funcional entre las moléculas quiméricas se reducen. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula qué oligonucleótido de los polinucleótidos parentales originales puede ser responsable de afectar a un rasgo particular.

En un aspecto, el método crea una secuencia polinucleotídica progenie quimérica creando oligonucleótidos que corresponden a fragmentos o porciones de cada secuencia parental. Cada oligonucleótido incluye preferiblemente una región única de solapamiento de manera que el mezclamiento de los oligonucleótidos juntos da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento oligonucleotídico ensamblado en el orden correcto. Véase también USSN 09/332.835.

El número de oligonucleótidos generados para cada variante parental posee una relación con el número total de cruzamientos resultantes en la molécula quimérica que se crea finalmente. Por ejemplo, se pueden proporcionar tres variantes de secuencias nucleotídicas parentales para sufrir una reacción de ligación a fin de encontrar una variante quimérica que tiene, por ejemplo, mayor actividad a temperatura elevada. Como ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias oligonucleotídicas que corresponden a cada una de las porciones de cada variante parental. Durante el proceso de reensamblaje de ligación, podría haber hasta 50 sucesos de cruzamiento en cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleótidos quiméricos generados contenga oligonucleótidos procedentes de cada variante parental en orden alterno es muy baja. Si cada fragmento oligonucleotídico está presente en la reacción de ligación en la misma cantidad molar, es probable que en algunas posiciones los oligonucleótidos procedentes del mismo polinucleótido parental se ligarán próximos entre sí, y de este

modo no darán como resultado un suceso de cruzamiento. Si la concentración de cada oligonucleótido procedente de cada progenitor se mantiene constante durante cualquier etapa de ligación en este ejemplo, hay una posibilidad de 1/3 (suponiendo 3 progenitores) de que un oligonucleótido procedente de la misma variante parental se ligue en la secuencia quimérica y no produzca cruzamiento.

En consecuencia, se puede determinar una función de densidad de probabilidad (PDF) para predecir la población de sucesos de cruzamiento que es probable que ocurran durante cada etapa en la reacción de ligación dado un número fijo de variantes parentales, un número de oligonucleótidos correspondientes a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada etapa en la reacción de ligación. Más abajo se describen las estadísticas y matemáticas que están detrás de la determinación de la PDF. Se puede calcular tal función de densidad de probabilidad, y de este modo enriquecer la población progenie quimérica para un número predeterminado de sucesos de cruzamiento que resultan de una reacción de ligación particular. Además, se puede predeterminar un número diana de sucesos de cruzamiento, y el sistema se puede programar entonces para calcular las cantidades de partida de cada oligonucleótido parental durante cada etapa en la reacción de ligación para dar como resultado una función de densidad de probabilidad que se centra en el número predeterminado de sucesos de cruzamiento.

Determinación de los sucesos de cruzamiento

Las realizaciones de la invención incluyen un sistema y software que recibe una función de densidad de probabilidad (PDF) de cruzamiento deseado, el número de genes progenitores a reensamblar, y el número de fragmentos en el reensamblaje, como entradas. La salida de este programa es una “PDF de fragmentos” que se puede usar para determinar una receta para producir genes reensamblados, y la PDF de cruzamiento estimada de esos genes. El procesamiento descrito aquí se lleva a cabo preferiblemente en MATLAB® (The Mathworks, Natick, Massachusetts), un lenguaje de programación y entorno de desarrollo para computación técnica.

Procesos iterativos

En la práctica de la invención, estos procesos se pueden repetir iterativamente. Por ejemplo, un ácido nucleico (o el ácido nucleico) responsable de un fenotipo de fosfolipasa alterado se identifica, se vuelve a aislar, se modifica nuevamente, se vuelve a ensayar en busca de su actividad. Este proceso se puede repetir iterativamente hasta que se manipule un fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede manipular en una célula una ruta completa anabólica o catabólica bioquímica, incluyendo la actividad de fosfolipasa.

De forma similar, si se determina que un oligonucleótido particular no tiene efecto en absoluto sobre el rasgo deseado (por ejemplo, un nuevo fenotipo de fosfolipasa), se puede eliminar como una variable sintetizando oligonucleótidos parentales más grandes que incluyen la secuencia a eliminar. Puesto que la incorporación de la secuencia en una secuencia más grande evita cualesquiera sucesos de cruzamiento, ya no habrá ninguna variación de esta secuencia en los polinucleótidos progenie. Esta práctica iterativa de determinar qué oligonucleótidos están más relacionados con el rasgo deseado, y cuáles no están relacionados, permite una exploración más eficiente de todas las variantes proteicas posibles que pueden proporcionar un rasgo o actividad particular.

Barajado in vivo

El barajado in vivo de las moléculas es uso en métodos de la invención que proporcionan variantes de polipéptidos de la invención, por ejemplo anticuerpos, enzimas de fosfolipasa, y similares. El barajado in vivo se puede llevar a cabo utilizando la propiedad natural de las células para recombinar multímeros. Aunque la recombinación in vivo ha proporcionado la ruta natural principal para la diversidad molecular, la recombinación genética sigue siendo un proceso relativamente complejo que implica 1) el reconocimiento de homologías, 2) escisión de las hebras, invasión de las hebras, y etapas metabólicas que conducen a la producción de quiasma recombinante; y finalmente 3) la resolución de quiasma en moléculas recombinadas discretas. la formación de quiasma requiere el reconocimiento de secuencias homólogas.

En un aspecto, la invención proporciona un método para producir un polinucleótido híbrido a partir de al menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido. La invención se puede usar para producir un polinucleótido híbrido introduciendo al menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que comparten al menos una región de homología de secuencia parcial en una célula hospedante adecuada. Las regiones de homología de secuencia parcial promueven procesos que dan como resultado la reorganización de secuencias productora de un polinucleótido híbrido. La expresión “polinucleótido híbrido”, como se usa aquí, es cualquier secuencia nucleotídica que resulta del método de la presente invención y contiene secuencia de al menos dos secuencias polinucleotídicas originales. Tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de sucesos de recombinación intermoleculares que promueven la integración de las secuencias entre moléculas de ADN. Además, tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de procesos de reclasificación reductiva intramolecular que utilizan secuencias repetidas para alterar una secuencia nucleotídica dentro de una molécula de ADN.

Producción de variantes de secuencias

La invención también proporciona métodos para obtener variantes de secuencias del ácido nucleico y secuencias de fosfolipasas de la invención o aislar enzima de fosfolipasa, por ejemplo fosfolipasa, variantes de secuencias que

usan los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención. En un aspecto, la invención proporciona variantes de un gen de fosfolipasa de la invención, que se pueden alterar por cualquier medio, incluyendo, por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos, o métodos no estocásticos o de “evolución dirigida”, como se describe anteriormente.

Las variantes aisladas pueden ser de origen natural. La variante también se puede crear in vitro. Las variantes se pueden crear usando técnicas de ingeniería genética tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química al azar, procedimientos de supresión con exonucleasas III, y técnicas de clonación estándar. Como alternativa, tales variantes, fragmentos, análogos, o derivados se pueden crear usando procedimientos de síntesis o modificación química. Otros métodos para obtener variantes también son familiares para los expertos en la técnica. Estos incluyen procedimientos en los que las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas de aislados naturales se modifican para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen características que potencian su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En tales procedimientos, se genera y se caracteriza un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias nucleotídicas con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Estas diferencias nucleotídicas pueden dar como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.

Por ejemplo, se pueden crear variantes usando PCR propensa a errores. En PCR propensa a errores, la PCR se lleva a cabo en condiciones en las que la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de manera que se obtiene una tasa elevada de mutaciones de punto a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. La PCR propensa a error se describe, por ejemplo, en Leung, D.W., et al., Technique, 1:11-15, 1989) y en Caldwell, R. C. y Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28-33, 1992. De forma breve, en tales procedimientos, los ácidos nucleicos a mutagenizar se mezclan con cebadores de PCR, tampón de reacción, MgCl2, MnCl2, Taq polimerasa y una concentración apropiada de dNTPs para lograr una tasa elevada de mutación de punto a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo usando 20 fmoles de ácido nucleico a mutagenizar, 30 pmoles de cada cebador de PCR, un tampón de reacción que comprende 50 mM de KCl, 10 mM de Tris HCl (pH 8,3) y 0,01% de gelatina, 7 mM de MgCl2, 0,5 mM de MnCl2, 5 unidades de Taq polimerasa, 0,2 mM de dGTP, 0,2 mM de dATP, 1 mM de dCTP, y 1 mM de dTTP. La PCR se puede llevar a cabo durante 30 ciclos de 94ºC durante 1 min., 45ºC durante 1 min., y 72ºC durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutagenizados se clonan en un vector apropiado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutagenizados.

También se pueden crear variantes usando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis oligonucleotídica se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57. De forma breve, en tales procedimientos, se sintetiza una pluralidad de oligonucleótidos bicatenarios que poseen una o más mutaciones a introducir en el ADN clonado, y se inserta en el ADN clonado a mutagenizar. Los clones que contienen el ADN mutagenizado se recuperan, y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifican.

Otro método para generar variantes es PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR a partir de una mezcla de fragmentos pequeños de ADN. Se produce paralelamente en el mismo vial un gran número de reacciones de PCR diferentes, cebando los productos de una reacción a los productos de otra reacción. La PCR de ensamblaje se describe en, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.965.408.

Todavía otro método para generar variantes es mutagénesis de PCR sexual. En la mutagénesis de PCR sexual, se produce in vitro la recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de una secuencia de ADN diferente pero muy relacionada, como resultado de la fragmentación al azar de la molécula de ADN basado en la homología de secuencia, seguido de la fijación del cruzamiento mediante extensión del cebador en una reacción de PCR. La mutagénesis de PCR sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1074710751. De forma breve, en tales procedimientos, una pluralidad de ácidos nucleicos a recombinar se digiere con ADNasa para generar fragmentos que tienen un tamaño medio de 50-200 nucleótidos. Los fragmentos del tamaño medio deseado se purifican y resuspenden en una mezcla de PCR. La PCR se lleva a cabo en condiciones que facilitan la recombinación entre los fragmentos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la PCR se puede llevar a cabo resuspendiendo los fragmentos purificados a una concentración de 10-30 ng/∀l en una disolución de 0,2 mM de cada dNTP, 2,2 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris HCl, pH 9,0, y 0,1% de Triton X-100. Se añaden 2,5 unidades de Taq polimerasa por 100:1 de mezcla de reacción, y la PCR se lleva a cabo usando el siguiente régimen: 94ºC durante 60 segundos, 94ºC durante 30 segundos, 50-55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos (30-45 veces) y 72ºC durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. En algunos aspectos, se pueden incluir oligonucleótidos en las reacciones de PCR. En otros aspectos, se puede usar el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I en un primer conjunto de reacciones de PCR, y se puede usar Taq polimerasa en un conjunto subsiguiente de reacciones de PCR. Las secuencias recombinantes se aíslan, y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifican.

Las variantes también se pueden crear mediante mutagénesis in vivo. En algunas realizaciones, las mutaciones al azar en una secuencia de interés se generan propagando la secuencia de interés en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que posee mutaciones en una o más de las rutas de reparación del ADN. Tales cepas “mutadoras” tienen una tasa de mutación al azar mayor que la de un progenitor de tipo salvaje. La propagación del

ADN en una de estas cepas generará eventualmente mutaciones al azar dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para uso para mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la Publicación PCT nº WO 91/16427.

Las variantes también se pueden generar usando mutagénesis por inserción de casete. En la mutagénesis por inserción de casete, una pequeña región de una molécula de ADN bicatenaria se sustituye por un “casete” oligonucleotídico sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido contiene a menudo secuencia nativa completa y/o parcialmente aleatorizada.

También se puede usar la mutagénesis de conjunto recursiva para generar variantes. La mutagénesis de conjunto recursiva es un algoritmo para la manipulación de proteínas (mutagénesis proteica) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes genotípicamente relacionados cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método usa un mecanismo de retroalimentación para controlar rondas sucesivas de mutagénesis por inserción de casete combinatoria. La mutagénesis de conjunto recursiva se describe, por ejemplo, en Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815.

En algunas realizaciones, se crean variantes usando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de conjunto exponencial es un proceso para generar librerías combinatorias con un porcentaje elevado de mutantes únicos y funcionales, en el que pequeños grupos de restos se distribuyen al azar en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales. La mutagénesis de conjunto exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave (1993) Biotechnology Res.11:1548-1552. Las mutagénesis al azar y dirigida al sitio se describen, por ejemplo, en Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455.

En algunas realizaciones, las variantes se crean usando procedimientos de barajado en los que porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos distintos se fusionan juntas para crear secuencias de ácidos nucleicos quiméricas que codifican polipéptidos quiméricos, como se describe, por ejemplo, en las patentes

U.S. nos 5.965.408; 5.939.250.

La invención también proporciona variantes de polipéptidos de la invención que comprenden secuencias en las que uno o más de los restos de aminoácidos (por ejemplo, de un polipéptido ejemplar de la invención) se sustituyen por un resto de aminoácido conservado o no conservado (por ejemplo, un resto de aminoácido conservado), y tal resto de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético. Las sustituciones conservativas son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. De este modo, los polipéptidos de la invención incluyen aquellos con sustituciones conservativas de secuencias de la invención, incluyendo pero sin limitarse a las siguientes sustituciones: sustituciones de un aminoácido alifático tal como alanina, valina, leucina e isoleucina por otro aminoácido alifático; la sustitución de una serina por una treonina

o viceversa; la sustitución de un resto ácido tal como ácido aspártico y ácido glutámico por otro resto ácido; la sustitución de un resto que posee un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro resto que posee un grupo amida; la sustitución de un resto básico tal como lisina y arginina por otro resto básico; y la sustitución de un resto aromático tal como fenilalanina, tirosina por otro resto aromático. Otras variantes son aquellas en las que uno o más de los restos de aminoácidos de los polipéptidos de la invención incluyen un grupo sustituyente.

Otras variantes dentro del alcance de la invención son aquellas en las que el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la semivida del polipéptido, por ejemplo polietilenglicol.

Variantes adicionales dentro del alcance de la invención son aquellas en las que aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido, tal como una secuencia líder, una secuencia secretora, una secuencia proproteínica o una secuencia que facilita la purificación, enriquecimiento o estabilización del polipéptido.

En algunos aspectos, las variantes, fragmentos, derivados y análogos de los polipéptidos de la invención retienen la misma función o actividad biológica que los polipéptidos ejemplares, por ejemplo una actividad de fosfolipasa, como se describe aquí. En otros aspectos, la variante, fragmento, derivado, o análogo, incluye una proproteína, de manera que la variante, fragmento, derivado, o análogo se puede activar mediante escisión de la porción proproteínica para producir un polipéptido activo.

Optimización de los codones para lograr niveles elevados de expresión proteica en células hospedantes

La invención proporciona métodos para modificar ácidos nucleicos que codifican fosfolipasa para modificar el uso de codones. En un aspecto, la invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa para incrementar o disminuir su expresión en una célula hospedante. La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican una fosfolipasa modificada para incrementar su expresión en una célula hospedante, enzimas de fosfolipasa así modificadas, y métodos para obtener las enzimas de fosfolipasa modificadas. El método comprende identificar un codón “no preferido” o un codón “menos preferido” en ácido nucleico que codifica fosfolipasa, y sustituir uno o más de estos codones no preferidos o menos preferidos por un “codón preferido” que codifica el mismo aminoácido que el codón sustituido, y al menos un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico se ha sustituido por un codón preferido que codifica el mismo aminoácido. Un codón preferido es un codón sobrerrepresentado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedante, y un codón no preferido o menos preferido es un codón subrepresentado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedante.

Las células hospedantes para expresar los ácidos nucleicos, casetes de expresión y vectores de la invención incluyen bacterias, levaduras, hongos, células vegetales, células de insecto y células de mamífero. De este modo, la invención proporciona métodos para optimizar el uso de codones en todas estas células, ácidos nucleicos alterados en los codones y polipéptidos obtenidos mediante los ácidos nucleicos alterados en codones. Las células hospedantes ejemplares incluyen bacterias gramnegativas, tales como Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens; bacterias grampositivas, tales como Streptomyces diversa, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis. Las células hospedantes ejemplares también incluyen organismos eucariotas, por ejemplo diversas levaduras, tales como Saccharomyces sp., que incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, y células y estirpes celulares de mamíferos y células y estirpes celulares de insectos. De este modo, la invención también incluye ácidos nucleicos y polipéptidos optimizados para la expresión en estos organismos y especies.

Por ejemplo, los codones de un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa aislada de una célula bacteriana se modifican de manera que el ácido nucleico se exprese óptimamente en una célula bacteriana diferente de la bacteria a partir de la cual derivó la fosfolipasa, una levadura, un hongo, una célula vegetal, una célula de insecto o una célula de mamífero. Los métodos para optimizar codones son bien conocidos en la técnica; véanse, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253. Véase también Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, que describe la optimización de codones en sistemas de ratón; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24, que describe la optimización de codones en levadura; Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409, que describe la optimización de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264, que describe la optimización del uso de codones que afecta a la secreción en E. coli.

Animales no humanos transgénicos

Los animales no humanos transgénicos pueden comprender un ácido nucleico, un polipéptido, un casete de expresión o vector o una célula transfectada o transformada de la invención. Los animales no humanos transgénicos pueden ser, por ejemplo, cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas y ratones, que comprenden los ácidos nucleicos de la invención. Estos animales se pueden usar, por ejemplo, como modelos in vivo para estudiar la actividad de fosfolipasa, o como modelos para cribar moduladores de actividad de fosfolipasa in vivo. Las secuencias codificantes para los polipéptidos a expresar en los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar para ser constitutivas, o bajo el control de factores reguladores transcripcionales específicos de tejidos, específicos del desarrollo, o inducibles. Los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar y generar usando cualquier método conocido en la técnica; véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.211.428; 6.187.992; 6.156.952; 6.118.044; 6.111.166; 6.107.541; 5.959.171; 5.922.854; 5.892.070; 5.880.327; 5.891.698; 5.639.940; 5.573.933; 5.387.742; 5.087.571, que describen la obtención y uso de células transformadas y huevos y ratones transgénicos, ratas, conejos, ovejas, cerdos y vacas. Véase también, por ejemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157, que describe la producción de proteínas recombinantes en la leche de animales productores de leche transgénicos; véase Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461, que demuestra la producción de cabras transgénicas. La patente U.S. nº 6.211.428 describe la obtención y uso de mamíferos no humanos transgénicos que expresan en sus cerebros un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN. La patente U.S. nº 5.387.742 describe la inyección de secuencias de ADN recombinantes o sintéticas clonadas en huevos de ratón fertilizados, implantando los huevos inyectados en hembras falsamente preñadas, y haciéndolos crecer hasta ratones transgénicos cuyas células expresan proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer. La patente U.S. nº 6.187.992 describe la obtención y uso de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una interrupción del gen que codifica la proteína precursora de amiloide (APP).

“Animales a los que se les ha suprimido un gen” también se puede usar para la práctica de los métodos de la invención. Por ejemplo, en un aspecto, los animales transgénicos o modificados de la invención comprenden un “animal al que se le ha suprimido un gen”, por ejemplo un “ratón al que se le ha suprimido un gen”, manipulado para no expresar o para ser incapaz de expresar una fosfolipasa.

Plantas y semillas transgénicas

La invención proporciona plantas y semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una fosfolipasa), un casete o vector de expresión, o una célula transfectada o transformada de la invención. La invención también proporciona productos vegetales, por ejemplo aceites, semillas, hojas, extractos y similares, que comprenden un ácido nucleico y/o un polipéptido (por ejemplo, una fosfolipasa) de la invención. La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). La invención también proporciona métodos para obtener y usar estas plantas y semillas transgénicas. La planta o célula vegetal transgénica que expresa un polipéptido de la invención se puede construir según cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 6.309.872.

Los ácidos nucleicos y constructos de expresión de la invención se pueden introducir en una célula vegetal por cualquier medio. Por ejemplo, los ácidos nucleicos o constructos de expresión se pueden introducir en el genoma de un hospedante vegetal deseado, o los ácidos nucleicos o constructos de expresión pueden ser episomas. La introducción en el genoma de una planta deseada puede ser tal que la producción de fosfolipasa del hospedante

esté regulada por elementos de control transcripcionales o traduccionales endógenos. La invención también proporciona “plantas a las que se les ha suprimido un gen”, en las que la inserción de una secuencia génica mediante, por ejemplo, recombinación homóloga ha interrumpido la expresión del gen endógeno. Los medios para generar plantas “a las que se les ha suprimido un gen” son bien conocidos en la técnica; véanse, por ejemplo, Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365. Véase la discusión sobre plantas transgénicas, más abajo.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar para conferir rasgos deseados en esencialmente cualquier planta, por ejemplo plantas que contienen semillas oleaginosas, tales como habas de soja, colza, semillas de girasol, sésamo y cacahuetes. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar para manipular rutas metabólicas de una planta a fin de optimizar o alterar la expresión de fosfolipasa del hospedante. Pueden cambiar la actividad de fosfolipasa en una planta. Como alternativa, una fosfolipasa de la invención se puede usar en la producción de una planta transgénica para producir un compuesto no producido naturalmente por esa planta. Esto puede reducir los costes de producción o crear un nuevo producto.

En un aspecto, la primera etapa en la producción de una planta transgénica implica obtener un constructo de expresión para la expresión en una célula vegetal. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica. Pueden incluir seleccionar y clonar un promotor, una secuencia codificante para facilitar la unión eficiente de ribosomas a ARNm, y seleccionar las secuencias terminadoras génicas apropiadas. Un promotor constitutivo ejemplar es CaMV35S, procedente del virus del mosaico de la coliflor, que generalmente da como resultado un grado elevado de expresión en plantas. Otros promotores son más específicos y responden a pistas en el entorno interno o externo de la planta. Un promotor inducible por la luz ejemplar es el promotor del gen cab, que codifica la proteína de unión a clorofila a/b mayor.

En un aspecto, el ácido nucleico se modifica para lograr una mayor expresión en una célula vegetal. Por ejemplo, es probable que una secuencia de la invención tenga un mayor porcentaje de pares nucleotídicos A-T en comparación con el observado en una planta, algunos de los cuales prefieren pares nucleotídicos G-C. Por lo tanto, los nucleótidos A-T en la secuencia codificante se pueden sustituir por nucleótidos G-C sin cambiar significativamente la secuencia de aminoácidos para potenciar la producción del producto génico en células vegetales.

Se puede añadir un gen marcador seleccionable al constructo génico a fin de identificar células o tejidos vegetales que han integrado con éxito el transgén. Esto puede ser necesario debido a que el logro de la incorporación y expresión de genes en células vegetales es un suceso raro, que se produce en sólo un pequeño porcentaje de los tejidos o células seleccionados como dianas. Los genes marcadores seleccionables codifican proteínas que proporcionan resistencia a agentes que son normalmente tóxicos para las plantas, tales como antibióticos o herbicidas. Sólo las células vegetales que tienen integrado el gen marcador seleccionable sobrevivirán cuando se hagan crecer en un medio que contiene el antibiótico o herbicida apropiado. En cuanto a otros genes insertados, los genes marcadores también requieren secuencias promotoras y de terminación para el funcionamiento apropiado.

En un aspecto, la obtención de plantas o semillas transgénicas comprende incorporar secuencias de la invención y, opcionalmente, genes marcadores en un constructo de expresión diana (por ejemplo, un plásmido), junto con el posicionamiento de las secuencias promotoras y terminadoras. Esto puede implicar transferir el gen modificado a la planta a través de un método adecuado. Por ejemplo, un constructo se puede introducir directamente en el ADN genómico de la célula vegetal usando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células vegetales, o los constructos se pueden introducir directamente al tejido vegetal usando métodos balísticos, tal como bombardeo de partículas de ADN. Por ejemplo, véase, por ejemplo, Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69, que explican el uso del bombardeo de partículas para introducir transgenes en trigo; y Adam (1997) más arriba, para el uso de bombardeo de partículas para introducir YACs en células vegetales. Por ejemplo, Rinehart (1997) más arriba, usó bombardeo de partículas para generar plantas de algodón transgénicas. El aparato para acelerar partículas se describe en la patente U.S. nº 5.015.580; y el instrumento de aceleración de partículas comercialmente disponible de BioRad (Biolistics) PDS-2000; véase también John, patente U.S. nº 5.608.148; y Ellis, patente U.S. nº 5.681.730, que describen la transformación de gimnospermas mediada por partículas.

En un aspecto, los protoplastos se pueden inmovilizar e inyectar con ácidos nucleicos, por ejemplo, un constructo de expresión. Aunque la regeneración vegetal a partir de protoplastos no es fácil con cereales, la regeneración vegetal es posible en legumbres usando embriogénesis somática a partir de callo derivado de protoplasto. Los tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo usando técnica de pistola génica, en la que ADN se reviste en micropartículas de volframio, disparados 1/100 del tamaño de las células, que poseen el ADN profundamente en las células y orgánulos. El tejido transformado se induce entonces a regenerarse, habitualmente mediante embriogénesis somática. Esta técnica ha tenido éxito en varias especies de cereales, incluyendo maíz y arroz.

Los ácidos nucleicos, por ejemplo constructos de expresión, también se pueden introducir en células vegetales usando virus recombinantes. Las células vegetales se pueden transformar usando vectores víricos, tales como, por ejemplo, vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), véase Porta (1996) “Use of viral replicons for the expression of genes in plants”, Mol. Biotechnol. 5:209-221.

Como alternativa, los ácidos nucleicos, por ejemplo un constructo de expresión, se puede combinar con regiones de flanqueo de T-DNA adecuadas y se pueden introducir en un vector hospedante de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del hospedante de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción del constructo y marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula se infecta mediante la bacteria. Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarme y uso de vectores binarios, están bien descritas en la bibliografía científica. Véase, por ejemplo, Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlín 1995). El ADN en una célula de A. tumefaciens está contenido en el cromosoma bacteriano así como en otra estructura conocida como plásmido Ti (inductor de tumores). El plásmido Ti contiene un tramo de ADN denominado T-DNA (#20 kb de longitud) que es transferido a la célula vegetal en el proceso de infección y una serie de genes vir (virulencia) que dirigen el proceso de infección. A. tumefaciens puede infectar solamente a una planta a través de heridas: cuando una raíz o tallo vegetal es herido, da ciertas señales químicas, a cuya respuesta los genes vir de A. tumefaciens son activados y dirigen una serie de sucesos necesarios para la transferencia del T-DNA desde el plásmido Ti al cromosoma de la planta. El T-DNA entra entonces en la célula vegetal a través de la herida. Una suposición es que el T-DNA espera hasta que el ADN vegetal está siendo replicado o transcrito, y después se inserta él mismo en el ADN vegetal expuesto. A fin de usar A. tumefaciens como vector transgénico, se ha de eliminar la sección inductora de tumores de T-DNA, mientras que se retienen las regiones frontera de T-DNA y los genes vir. El transgén se inserta entonces entre las regiones frontera de T-DNA, donde es transferido a la célula vegetal y se integra en los cromosomas de la planta.

La invención proporciona la transformación de plantas monocotiledóneas usando los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo cereales importantes; véase Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218. Véanse también, por ejemplo, Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) más arriba; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, que explican la integración de T-DNA en ADN genómico. Véase también D’Halluin, patente U.S. nº 5.712.135, que describe un proceso para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de un cereal, u otra planta monocotiledónea.

En un aspecto, la tercera etapa puede implicar la selección y regeneración de plantas completas capaces de transmitir el gen diana incorporado a la siguiente generación. Tales técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo tisular, que se basa típicamente en un marcador biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias nucleotídicas deseadas. La regeneración vegetal a partir de los protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, p. 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nueva York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, p. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callo vegetal, explantes, órganos, o sus partes. Tales técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486. Para obtener plantas completas a partir de tejidos transgénicos tales como embriones inmaduros, se pueden hacer crecer en condiciones medioambientales controladas en una serie de medios que contienen nutrientes y hormonas, un proceso conocido como cultivo de tejidos. Una vez que se generan plantas completas y se producen semillas, comienza la evaluación de la progenie.

Después de que el casete de expresión se incorpora de forma estable en plantas transgénicas, se puede introducir en otras plantas mediante cruzamiento sexual. Se puede usar cualquiera de un número de técnicas de reproducción estándar, dependiendo de la especie a cruzar. Puesto que la expresión transgénica de los ácidos nucleicos de la invención conduce a cambios fenotípicos, las plantas que comprenden los ácidos nucleicos recombinantes de la invención se pueden cruzar sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. De este modo, la semilla de la invención se puede derivar de un cruce entre dos plantas transgénicas de la invención, o un cruce entre una planta de la invención y otra planta. Los efectos deseados (por ejemplo, expresión de los polipéptidos de la invención para producir una planta en la que está alterado el comportamiento de la floración) se pueden potenciar cuando ambas plantas parentales expresan los polipéptidos (por ejemplo, una fosfolipasa) de la invención. Los efectos deseados se pueden pasar a las futuras generaciones de plantas por medios de propagación estándar.

Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención se expresan o insertan en cualquier planta o semilla. Las plantas transgénicas de la invención pueden ser dicotiledóneas o monocotiledóneas. Los ejemplos de plantas transgénicas monocotiledóneas de la invención son hierbas tales como poa común (hierva verde, Poa), hierba forrajera tal como festuca, lolio, hierva templada, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz (maíz). Los ejemplos de plantas transgénicas dicotiledóneas de la invención son tabaco, legumbres, tales como lupinos, palata, remolacha, guisante, haba y haba de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tal como coliflor, colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana. De este modo, las plantas y semillas transgénicas de la invención incluyen un amplio intervalo de plantas, incluyendo, pero sin limitarse a, especies de los géneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea.

En realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos de la invención se expresan en plantas (por ejemplo, plantas transgénicas), tales como plantas que contienen oleaginosas, por ejemplo habas de soja, colza, semillas de girasol, sésamo y cacahuetes. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden expresar en plantas que contienen células de fibras, incluyendo, por ejemplo, algodón, árbol de algodón de seda (Kapok, Ceiba pentandra), Chilopsis linearis, árbol de creosota, Krascheninnikovia lanata, balsa, Boehmeria nivea, Hibiscus cannabinus, Cannabis sativa, Hibiscus sabdariffa, yute, sisal, abacá y lino. En realizaciones alternativas, las plantas transgénicas de la invención pueden ser miembros del género Gossypium, incluyendo miembros de cualquier especie de Gossypium, tales como

G. arboreum, G. herbaceum, G. barbadense, y G. hirsutum.

La invención también proporciona plantas transgénicas a usar para producir grandes cantidades de los polipéptidos (por ejemplo, una fosfolipasa o anticuerpo) de la invención. Por ejemplo, véanse Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296 (que producen la proteína de leche human beta-caseína en plantas de patata transgénicas usando un promotor de manopina sintasa (mas1’,2’) bidireccional, inducible con auxina, con métodos de transformación de disco de hoja mediada por Agrobacterium tumefaciens).

Usando procedimientos conocidos, el experto puede cribar plantas de la invención para detectar el incremento o disminución de ARNm o proteína transgénica en plantas transgénicas. Los medios para detectar y cuantificar ARNm

o proteínas son bien conocidos en la técnica.

Polipéptidos y péptidos

La invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que tienen una identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o completa (100%) de identidad de secuencia) con SEC ID NO: 2.

Los polipéptidos de la invención también pueden ser más cortos que la longitud completa de polipéptidos ejemplares (por ejemplo, SEC ID NO:2). Los polipéptidos (péptidos, fragmentos) que oscilan en tamaño entre alrededor de 5 y la longitud completa de un polipéptido, incluyen una enzima, tal como una fosfolipasa, por ejemplo fosfolipasa; siendo los tamaños ejemplares de alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 o más restos, por ejemplo restos contiguos de las fosfolipasas ejemplares de SEC ID NO:2. Los péptidos de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas de marcaje, antígenos, tolerágenos, motivos, sitios activos de fosfolipasa.

El polipéptido de la invención tiene actividad de fosfolipasa C (PLC). Ésta, en referencia a las actividades de los polipéptidos, se muestra en la Tabla 1, más abajo:

Tabla 1

SEC ID nº: Tipo de enzima

103,104: Patatina

11,12: Patatina

13,14: Patatina

17,18: Patatina

25,26: Patatina

27,28: Patatina

33,34: Patatina

35,36: Patatina

43,44: Patatina

45,46: Patatina

55,56: Patatina

59,60: Patatina

65,66: Patatina

71,72: Patatina

77,78: Patatina

SEC ID nº Tipo de enzima

86,87 Patatina 87,88 Patatina 91,92 Patatina 95,96 Patatina 99,100 Patatina

1,2 PLC 101,102 PLC 105,106 PLC 3,4 PLC 31,32 PLC 5,6 PLC 7,8 PLC

81,82 PLC 89,90 PLC 9,10 PLC 93,94 PLC 97,98 PLC 15,16 PLD 19,20 PLD 21,22 PLD 23,24 PLD 29,30 PLD 37,38 PLD 39,40 PLD 41,42 PLD 47,48 PLD 49,50 PLD 51,52 PLD 53,54 PLD 57,58 PLD 61,62 PLD 63,64 PLD 67,68 PLD 71,72 PLD 73,74 PLD 5

SEC ID nº: Tipo de enzima

75,76: PLD

79,80: PLD

83,84: PLD

Los polipéptidos y péptidos de la invención se pueden aislar de fuentes naturales, y pueden ser polipéptidos sintéticos o pueden ser polipéptidos generados recombinantemente. Los péptidos y proteínas se pueden expresar recombinantemente in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos de la invención se pueden obtener y aislar usando cualquier método conocido en la técnica. Los polipéptidos y péptidos de la invención también se pueden sintetizar, todo o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por ejemplo, la síntesis peptídica se puede llevar a cabo usando diversas técnicas en fase sólida (véanse, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3□13) y la síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Los péptidos y polipéptidos de la invención se pueden también glucosilar. La glucosilación se puede añadir posttraduccionalmente ya sea de forma química o mediante mecanismos biosintéticos celulares, en el que estos últimos incorporan el uso de motivos de glucosilación conocidos, que pueden ser nativos para la secuencia o se pueden añadir como un péptido o se pueden añadir en la secuencia codificante del ácido nucleico. La glucosilación se puede enlazar mediante O o enlazar mediante N.

Los péptidos y polipéptidos de la invención, como se definen anteriormente, incluyen todas las formas “miméticas” y “peptidomiméticas”. Los términos “mimético” y “peptidomimético” se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos de la invención. El mimético puede estar compuesto completamente de análogos sintéticos no naturales de aminoácidos, o es una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales y análogos parcialmente no naturales de aminoácidos. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácidos naturales, en tanto que tales sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético. En cuanto a los polipéptidos de la invención que son variantes conservativas, la experimentación habitual determinará si un mimético está dentro del alcance de la invención, es decir, que su estructura y/o función no esté sustancialmente alterada. De este modo, en un aspecto, una composición mimética está dentro del alcance de la invención si tiene una actividad de fosfolipasa.

Las composiciones miméticas polipeptídicas de la invención pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. En aspecto alternativo, las composiciones miméticas de la invención incluyen uno o todos los siguientes tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de restos distintos de los enlaces de amida naturales (“enlace peptídico”); b) restos no naturales en lugar de restos de aminoácidos de origen natural;

: o c) restos que inducen un mimetismo estructural secundario, es decir, inducen o estabilizan una estructura secundaria, por ejemplo una vuelta beta, vuelta gamma, lámina beta, conformación de hélice alfa, y similar. Por ejemplo, un polipéptido de la invención se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus restos están unidos por medios químicos distintos de enlaces peptídicos naturales. Los restos peptidomiméticos individuales se pueden unir mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N’diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos enlazantes que pueden ser una alternativa a los enlazamientos con enlaces de amida tradicionales (“enlace peptídico”) incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=O)-CH2-para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (véase, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, p. 267-357, “Peptide Backbone Modifications,” Marcell Dekker, NY).

Un polipéptido de la invención también se puede caracterizar como un mimético al contener todos o algunos restos no naturales en lugar de restos de aminoácidos de origen natural. Los restos no naturales están bien descritos en la bibliografía científica y de patentes; más abajo se describen unas pocas composiciones no naturales ejemplares, útiles como miméticos de restos de aminoácidos naturales y directrices. Los miméticos de aminoácidos aromáticos se pueden generar sustituyendo, por ejemplo, D-o L-nafilalanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2-tienilalanina; D-o L-1, 2, 3-, o 4-pirenilalanina; D- o L-3-tienilalanina; D- o L-(2-piridinil)-alanina; D- o L-(3-piridinil)-alanina; D- o L-(2pirazinil)-alanina; D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalanina; D-pfluoro-fenilalanina; D o L-p-bifenilfenilalanina; K- o L-p-metoxi-bifenilfenilalanina; D- o L-2-indol(alquil)alaninas; y, D

: o L-alquilaninas, en los que alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, secisotilo, iso-pentilo sustituidos o no sustituidos, o aminoácidos no ácidos. Los anillos aromáticos de un aminoácido no

natural incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, y piridilo.

Los miméticos de aminoácidos ácidos se pueden generar mediante sustitución mediante, por ejemplo, aminoácidos no carboxilados a la vez que se mantiene una carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Los grupos laterales carboxílicos (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) también se pueden modificar selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R’-N-C-N-R’) tales como, por ejemplo, 1-ciclohexil-3(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida o 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil) carbodiimida. Aspartilo o glutamilo también se puede convertir en restos asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio. Los miméticos de aminoácidos básicos se pueden generar mediante sustitución con, por ejemplo, (además de lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido (guanidino)-acético, o ácido (guanidino)alquil-acético, en los que alquilo es como se define anteriormente. Los derivados de nitrilo (por ejemplo, que contienen el resto CN-en lugar de COOH) se pueden sustituir por asparagina

o glutamina. Los restos asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar a los restos aspartilo o glutamilo correspondientes. Los miméticos de restos de arginina se pueden generar haciendo reaccionar arginilo con, por ejemplo, uno o más reactivos convencionales, incluyendo, por ejemplo, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, o ninhidrina, preferiblemente en condiciones alcalinas. Los miméticos de restos de tirosina se pueden generar haciendo reaccionar tirosilo con, por ejemplo, compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Se puede usar N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar especies O-acetiltirosílicas y derivados 3-nitro, respectivamente. Los miméticos de restos de cisteína se pueden generar haciendo reaccionar restos de cisteinilo con, por ejemplo, alfa-haloacetatos tales como ácido 2-cloroacético o cloracetamida y aminas correspondientes, para dar derivados carboximetílicos o carboxiamidometílicos. Los miméticos de restos de cisteína también se pueden generar haciendo reaccionar restos cisteinílicos con, por ejemplo, bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromobeta-(5-imidozoil)propiónico; fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo; disulfuro de metil 2-piridilo; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4 nitrofenol; o, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Los miméticos de lisina se pueden generar (y los restos aminoterminales se pueden alterar) haciendo reaccionar lisinilo con, por ejemplo, anhídrido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. Los miméticos de restos de lisina y que contienen otros alfa-amino también se pueden generar mediante reacción con imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitro-bencenosulfónico, Ometilisourea, 2,4-pentanodiona y reacciones catalizadas con transamidasa con glioxilato. Los miméticos de metionina se pueden generar mediante reacción con, por ejemplo, sulfóxido de metionina. Los miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, 3-o 4-hidroxiprolina, deshidroprolina, 3- o 4metilprolina o 3,3-dimetilprolina. Los miméticos de restos de histidina se pueden generar haciendo reaccionar histidilo con, por ejemplo, procarbonato de dietilo o bromuro de para-bromofenacilo. Otros miméticos incluyen, por ejemplo, los generados mediante hidroxilación de prolina y lisina; la fosforilación de los grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo; la metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; la acetilación de la amina Nterminal; la metilación de restos amídicos de cadena principal o la sustitución con aminoácidos N-metílicos, o la amidación de grupos carboxílicos C-terminales.

Un resto, por ejemplo, un aminoácido, de un polipéptido de la invención también se puede sustituir por un aminoácido (o resto peptidomimético) de la quiralidad opuesta. De este modo, cualquier aminoácido de origen natural en la configuración L (que también se puede denominar como R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) se puede sustituir por el aminoácido del mismo tipo estructural químico o un peptidomimético, pero de la quiralidad opuesta, denominado como el D-aminoácido, pero también se puede denominar como la forma R o

S.

La invención también proporciona métodos para modificar los polipéptidos de la invención mediante procesos naturales, tales como procesamiento post-traduccional (por ejemplo, fosforilación, acilación, etc.), o mediante técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Las modificaciones se pueden producir en cualquier parte en el polipéptido, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos, y los términos amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en los mismos grados o grados variables en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación con ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de un fosfatidilinositol, ciclación de reticulación, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, y adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteína, tal como arginilación. Véase, por ejemplo, Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2ª Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, p. 1-12 (1983).

También se pueden usar métodos de síntesis química de péptidos de fase sólida para sintetizar el polipéptido o fragmentos de la invención. Tal método se conoce en la técnica desde principios de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963) (véase también Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III., p. 11-12)), y se ha empleado recientemente en kits de síntesis y diseño de péptidos de laboratorio comercialmente disponibles (Cambridge Research Biochemicals). Tales kits de laboratorio

comercialmente disponibles han utilizado generalmente las enseñanzas de H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984), y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de “varillas” o “alfileres”, todos los cuales están conectados a una única placa. Cuando se utiliza tal sistema, se invierte y se inserta una placa de varillas o alfileres en una segunda placa de pocillos o depósitos correspondientes, que contiene disoluciones para la unión o anclaje de un aminoácido apropiado a las puntas de los alfileres o varillas. Repitiendo tal etapa del proceso, es decir, invirtiendo e insertando las puntas de las varillas y alfileres en disoluciones apropiadas, se construyen aminoácidos en péptidos deseados. Además, hay disponible un número de sistemas de síntesis de péptidos FMOC disponibles. Por ejemplo, el ensamblaje de un polipéptido o fragmento se puede llevar a cabo sobre un soporte sólido usando un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems, Inc. Modelo 431A™. Tal equipo proporciona un acceso fácil a los péptidos de la invención, ya sea mediante síntesis directa o mediante síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar usando otras técnicas conocidas.

Enzimas de fosfolipasa

La invención proporciona nuevas fosfolipasas, ácidos nucleicos que las codifican, anticuerpos que se unen a ellos, péptidos que representan los sitios antigénicos de la enzima (epítopos) y sitios activos, y métodos para obtenerlos y usarlos. Los polipéptidos de la invención tienen actividad de fosfolipasa C, como se describe anteriormente. En aspectos alternativos, las fosfolipasas de la invención tienen actividades que se han modificado a partir de aquellas de las fosfolipasas ejemplares descritas aquí. La invención incluye fosfolipasas con o sin secuencias señal, y las propias secuencias señal. La invención incluye fosfolipasas inmovilizadas, anticuerpos anti-fosfolipasa y sus fragmentos. La invención incluye heterocomplejos, por ejemplo proteínas de fusión, heterodímeros, etc., que comprenden las fosfolipasas de la invención.

La determinación de los péptidos que representan los sitios antigénicos de la enzima (epítopos), sitios activos, sitios de unión, secuencias señal, y similares, se puede hacer mediante protocolos de cribado rutinarios.

Las enzimas de la invención son catalizadores muy selectivos. Al igual que otras enzimas, catalizan reacciones con estereo-, regio- y quimioselectividades exquisitas que no tienen parangón en la química sintética convencional. Además, las enzimas de la invención son notablemente versátiles. Se pueden personalizar para funcionar en disolventes orgánicos, operar a pHs extremos (por ejemplo, pHs elevados y pHs bajos), temperaturas extremas (por ejemplo, temperaturas elevadas y temperaturas bajas), niveles extremos de salinidad (por ejemplo, salinidad elevada y baja salinidad), y reacciones catalíticas con compuestos que no están estructuralmente relacionados con sus sustratos fisiológicos naturales. Las enzimas de la invención se pueden diseñar para que sean reactivas frente a un amplio intervalo de sustratos naturales y no naturales, permitiendo así la modificación de virtualmente cualquier compuesto de plomo orgánico. Las enzimas de la invención también se pueden diseñar para ser muy enantio- o regioselectivas. El grado elevado de especificidad por los grupos funcionales mostrado por estas enzimas permite a cualquiera rastrear cada reacción en una secuencia sintética que conduzca a un nuevo compuesto activo. Las enzimas de la invención también se pueden diseñar para catalizar muchas reacciones diversas no relacionadas con su función fisiológica nativa en la naturaleza.

La presente invención explota las propiedades catalíticas únicas de las enzimas. Mientras que el uso de biocatalizadores (es decir, enzimas purificadas o brutas, células no vivas o vivas) en transformaciones químicas requiere normalmente la identificación de un biocatalizador particular que reacciona con un compuesto de partida específico. La presente invención usa biocatalizadores seleccionados, es decir, las enzimas de la invención, y las condiciones de reacción que son específicas para grupos funcionales que están presentes en muchos compuestos de partida. Cada biocatalizador es específico para un grupo funcional, o varios grupos funcionales relacionados, y puede reaccionar con muchos compuestos de partida que contienen este grupo funcional. Las reacciones biocatalíticas producen una población de derivados a partir de un único compuesto de partida. Estos derivados se pueden someter a otra ronda de reacciones biocatalíticas para producir una segunda población de compuestos derivados. Se pueden producir miles de variaciones del compuesto original con cada iteración de la derivatización biocatalítica.

Las enzimas reaccionan en sitios específicos de un compuesto de partida sin afectar al resto de la molécula, un proceso que es muy difícil de lograr usando métodos químicos tradicionales. Este grado elevado de especificidad biocatalítica proporciona el medio para identificar una única enzima activa en una librería. La librería se caracteriza por la serie de reacciones biocatalíticas usadas para producirla, una denominada “historia biosintética”. El cribado de la librería en busca de actividades biológicas y el trazado de la historia biosintética identifica la secuencia de reacciones específicas que produce el compuesto activo. La secuencia de reacciones se repite, y se determina en la estructura del compuesto sintetizado. Este modo de identificación, a diferencia de otros enfoques sintéticos y de cribado, no requiere tecnologías de inmovilización, y los compuestos se pueden sintetizar y ensayar libremente en disolución usando virtualmente cualquier tipo de ensayo de cribado. Es importante señalar que el grado elevado de especificidad de las reacciones enzimáticas sobre grupos funcionales permite el “trazado” de reacciones enzimáticas específicas que constituyen la librería producida biocatalíticamente.

La invención también proporciona métodos para descubrir nuevas fosfolipasas usando los ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos de la invención. En un aspecto, las librerías de fagos lambda se criban para el descubrimiento de fosfolipasas a base de expresión. El uso de librerías de fagos lambda en el cribado permite la

detección de clones tóxicos, el acceso mejorado al sustrato, una menor necesidad de manipulación mediante ingeniería de un hospedante, haciendo un bypass del potencial para cualquier desplazamiento resultante de la excisión másica de la librería, y un crecimiento más rápido a densidades bajas de clones. El cribado de las librerías de fagos lambda puede hacerse en fase líquida o en fase sólida. El cribado en fase líquida da una mayor flexibilidad en las condiciones del ensayo, una flexibilidad adicional de sustratos, una mayor sensibilidad para clones débiles, y una facilidad de automatización con respecto al cribado en fase sólida.

Muchas de las etapas de procedimiento se llevan a cabo usando automatización robótica que permite la ejecución de muchos miles de reacciones biocatalíticas y ensayos de cribado por día, así como aseguran un nivel elevado de exactitud y reproducibilidad (véase la discusión de ensayos, más abajo). Como resultado, se puede producir una librería de compuestos derivados en cuestión de semanas. Para enseñanzas posteriores sobre la modificación de moléculas, incluyendo moléculas pequeñas, véase el documento PCT/US94/09174.

Secuencias señal de fosfolipasas y dominios catalíticos

Una secuencia señal que comprende un péptido comprende/consiste en una secuencia como se expone en los restos 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32 o 1 a 33 de un polipéptido de la invención, por ejemplo SEC ID NO:2. Las secuencias señal ejemplares se exponen en el listado de SEC ID, por ejemplo restos 1 a 24 de SEC ID NO:2.

Las secuencias señal de fosfolipasa de la invención pueden ser péptidos aislados, o secuencias unidas a otra fosfolipasa o un polipéptido que no es fosfolipasa, por ejemplo como una proteína de fusión. En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos que comprenden secuencias señal de fosfolipasa de la invención. En un aspecto, los polipéptidos que comprenden secuencias señal de fosfolipasa de la invención comprenden secuencias heterólogas a una fosfolipasa de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una secuencia señal de fosfolipasa de la invención y secuencias procedentes de otra fosfolipasa o una proteína no fosfolipasa). En un aspecto, la invención proporciona fosfolipasas de la invención con secuencias señal heterólogas, por ejemplo secuencias con una secuencia señal de levadura. Una fosfolipasa de la invención puede comprender una secuencia señal heteróloga, por ejemplo en un vector, por ejemplo un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).

En un aspecto, las secuencias señal de la invención se identifican tras la identificación de nuevos polipéptidos de fosfolipasa. Las rutas mediante las cuales las proteínas se clasifican y transportan a su localización celular apropiada se denominan a menudo como rutas de selección de dianas proteicas. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de selección de dianas es una secuencia de aminoácidos corta en el término amino de un polipéptido recientemente sintetizado denominado la secuencia señal. Esta secuencia señal dirige una proteína a su localización apropiada en la célula, y se elimina durante el transporte o cuando la proteína alcanza su destino final. La mayoría de las proteínas lisosómicas, de membrana, o segregadas tienen una secuencia señal aminoterminal que las marca para la translocación en la luz del retículo endoplásmico. Se han determinado más de 100 secuencias señal para proteínas en este grupo. Las secuencias señal pueden variar en longitud desde 13 hasta 36 restos de aminoácidos. Los expertos en la técnica conocen diversos métodos de reconocimiento de secuencias señal. Por ejemplo, en un aspecto, nuevos péptidos señal de fosfolipasa se identifican mediante un método denominado como SignalP. SignalP usa una red neural combinada que reconoce tanto péptidos señal como sus sitios de escisión (Nielsen, et al., “Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites”. Protein Engineering, vol. 10, nº 1, p. 1-6 (1997)).

Se debería entender que en algunos aspectos las fosfolipasas de la invención pueden no tener secuencias señal. En un aspecto, la invención proporciona las fosfolipasas de la invención que carecen de toda o parte de una secuencia señal. En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una fosfolipasa enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico de una fosfolipasa diferente, u opcionalmente se puede desear una secuencia señal de una proteína que no es fosfolipasa.

La invención también proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden secuencias señal (SPs) y dominios catalíticos (CDs) de la invención y secuencias heterólogas. Las secuencias heterólogas son secuencias no asociadas naturalmente (por ejemplo, a una fosfolipasa) con una SP y/o un CD. La secuencia a la que la SP y/o el CD no están asociados de forma natural puede estar en el extremo aminoterminal de las SP y/o de los CD, en el extremo carboxiterminal, y/o en ambos extremos tanto de SP y/o CD. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende (o consiste en) un polipéptido que comprende una secuencia señal (SP) y/o un dominio catalítico (CD) de la invención, con la condición de que no esté asociado con ninguna secuencia a la que está asociado de forma natural (por ejemplo, una secuencia de fosfolipasa). De forma similar, en un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos. De este modo, en un aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante de la invención comprende una secuencia codificante para una secuencia señal (SP) y/o dominio catalítico (CD) de la invención y una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia no asociada de forma natural con una secuencia señal (SP) y/o dominio catalítico (CD) de la invención). La secuencia heteróloga puede estar en el extremo 3’ terminal, en el extremo 5’ terminal, y/o en ambos extremos de la secuencia codificante de SP y/o CD.

Ensayos para actividad de fosfolipasa

La invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que tienen una actividad de fosfolipasa, y ácidos nucleicos que los codifican. Para determinar si un polipéptido tiene una actividad de fosfolipasa y está dentro del alcance de la invención, se puede usar cualquiera de los muchos ensayos de actividad de fosfolipasa conocidos en la técnica. Los protocolos habituales para determinar la actividad de fosfolipasa C son bien conocidos en la técnica.

Los ensayos de actividad ejemplares incluyen ensayos de turbidez, ensayos de metilumbeliferil fosfocolina (fluorescente), ensayos de lipasa con Amplex Red (fluorescente), ensayos de cromatografía de capa fina (TLC), ensayos citolíticos y ensayos con p-nitro-fenilfosforilcolina. Usando estos ensayos, los polipéptidos se pueden cribar rápidamente en busca de la actividad de fosfolipasa.

La actividad de fosfolipasa puede comprender una actividad de acil hidrolasa de lípido (LAH). Véase, por ejemplo, Jimenez (2001) Lipids 36:1169-1174, que describe un ensayo micelar mixto a base de octaetilenglicol monododecil éter para determinar la actividad de acil hidrolasa de lípidos de una patatina. Pinsirodom (2000) J. Agric. Food Chem. 48:155-160, describe una actividad de patatina de acil hidrolasa de lípidos (LAH) ejemplar.

Los ensayos de turbidez para determinar la actividad de fosfolipasa se describen por ejemplo en Kauffmann (2001) “Conversion of Bacillus thermocatenulatus lipase into an efficient phospholipase with increased activity towards longchain fatty acyl substrates by directed evolution and rational design”, Protein Engineering 14:919-928; Ibrahim (1995) “Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of Candida albicans”, Infect. Immun. 63:1993-1998.

Los ensayos de metilumbeliferil fosfocolina (fluorescente) para determinar la actividad de fosfolipasa se describen, por ejemplo, en Goode (1997) “Evidence for cell surface and internal phospholipase activity in ascidian eggs”, Develop. Growth Differ. 39:655-660; Diaz (1999) “Direct fluorescence-based lipase activity assay”, BioTechniques 27:696-700.

Los ensayos de fosfolipasa con Amplex Red (fluorescente), para determinar la actividad de fosfolipasa, están disponibles como kits, por ejemplo la detección de fosfolipasa específica de fosfatidilcolina usando un kit de ensayo de fosfolipasa específico de Amplex Red fosfatidilcolina de Molecular Probes Inc. (Eugene, OR), según las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se mide en un lector de microplacas de fluorescencia usando excitación a 560 ± 10 nm y detección de la fluorescencia a 590 ± 10 nm. El ensayo es sensible a concentraciones muy bajas de enzima.

Los ensayos de cromatografía de capa fina (TLC) para determinar la actividad de fosfolipasa se describen, por ejemplo, en Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197:3-13; Taguchi (1975) “Phospholipase from Clostridium novyi type A.I”, Biochim. Biophys. Acta 409:75-85. La cromatografía de capa fina (TLC) es una técnica ampliamente usada para la detección de actividad de fosfolipasa. Se han usado diversas modificaciones de este método para extraer los fosfolípidos de las mezclas de ensayo acuosas. En algunos ensayos de PLC, la hidrólisis se detiene mediante adición de cloroformo/metanol (2:1) a la mezcla de reacción. El material de partida sin reaccionar y el diacilglicerol se extraen en la fase orgánica y se pueden fraccionar mediante TLC, mientras que el producto del grupo de cabeza permanece en la fase acuosa. Para una medida más precisa de la digestión fosfolipídica, se pueden usar sustratos radiomarcados (véase, por ejemplo, Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197:3-13). Las relaciones de productos y reaccionantes se pueden usar para calcular el número real de moles de sustrato hidrolizado por unidad de tiempo. Si todos los componentes se extraen por igual, cualesquiera pérdidas en esta acción afectarán por igual a todos los componentes. La separación de los productos de la digestión fosfolipídica se puede lograr mediante TLC con gel de sílice, usándose cloroformo/metanol/agua (65:25:4) como un sistema disolvente (véase, por ejemplo, Taguchi (1975) Biochim. Biophys. Acta 409:75-85).

Los ensayos con p-nitrofenilfosforilcolina para determinar la actividad de fosfolipasa se describen, por ejemplo, en Korbsrisate (1999) “Cloning and characterization of a nonhemolytic phospholipase gene from Burkholderia pseudomallei”, J. Clin. Microbiol. 37:3742-3745; Berka (1981) “Studies of phospholipase (heat labile hemolysin) in Pseudomonas aeroginosa”, Infect. Immun. 34:1071-1074. Este ensayo se basa en la hidrólisis enzimática del análogo sustrato p-nitrofenilfosforilcolina para liberar un compuesto cromógeno amarillo, p-nitrofenol, detectable a 405 nm. Este sustrato es conveniente para un cribado de producción elevada.

Un ensayo citolítico puede detectar fosfolipasas con actividad citolítica basándose en la lisis de eritrocitos. Las fosfolipasas tóxicas pueden interactuar con membranas de células eucariotas e hidrolizar fosfatidilcolina y efingomielina, conduciendo a la lisis celular. Véase, por ejemplo, Titball (1993) Microbiol. Rev. 57:347-366.

Fosfolipasas híbridas (quiméricas) y librerías peptídicas

En un aspecto, la invención proporciona fosfolipasas híbridas y proteínas de fusión, incluyendo librerías peptídicas, que comprenden secuencias de la invención. Las librerías peptídicas de la invención se pueden usar para aislar moduladores peptídicos (por ejemplo, activadores o inhibidores) de dianas, tales como sustratos de fosfolipasa, receptores, enzimas. Las librerías peptídicas de la invención se pueden usar para identificar parejas de unión formales de dianas, tales como ligandos, por ejemplo citocinas, hormonas y similares. En un aspecto, la invención proporciona proteínas quiméricas que comprenden una secuencia señal (SP) y/o dominio catalítico (CD) de la invención y una secuencia heteróloga (véase anteriormente).

La invención también proporciona métodos para generar fosfolipasas “mejoradas” e híbridas usando los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para generar enzimas que tienen actividad a pHs extremos alcalinos y/o pHs ácidos, temperaturas elevadas y bajas, condiciones osmóticas, y similares. La invención proporciona métodos para generar enzimas híbridas (por ejemplo, fosfolipasas híbridas).

En un aspecto, los métodos de la invención producen nuevos polipéptidos híbridos utilizando procesos celulares que integran la secuencia de un primer polinucleótido tal como polinucleótidos híbridos resultantes codifican polipéptidos que demuestran actividades derivadas de los primeros polipéptidos biológicamente activos. Por ejemplo, los primeros polinucleótidos pueden ser SEC ID NO:1 que codifica fosfolipasa de la invención SEC ID NO:2. El primer ácido nucleico puede codificar una enzima de un organismo que funciona efectivamente en una condición medioambiental particular, por ejemplo salinidad elevada. Se puede “integrar” con una enzima codificada por un segundo polinucleótido de un organismo diferente que funciona efectivamente en una condición medioambiental diferente, tal como temperaturas extremadamente elevadas. Por ejemplo, cuando los dos ácidos nucleicos pueden producir una molécula híbrida mediante por ejemplo recombinación y/o reclasificación reductiva. Un polinucleótido híbrido que contiene secuencias de los polinucleótidos originales primero y segundo puede codificar una enzima que muestra características de ambas enzimas codificadas por los polinucleótidos originales. De este modo, la enzima codificada por el polinucleótido híbrido puede funcionar efectivamente en condiciones medioambientales compartidas por cada una de las enzimas codificadas por los polinucleótidos primero y segundo, por ejemplo salinidad elevada y temperaturas extremas.

Como alternativa, un polipéptido híbrido que resulta de este método de la invención puede mostrar actividad enzimática especializada no presentada en las enzimas originales. Por ejemplo, tras la recombinación y/o reclasificación reductiva de polinucleótidos que codifican actividades de fosfolipasa, el polinucleótido híbrido resultante codificado por un polinucleótido híbrido se puede cribar en busca de actividades especializadas obtenidas de cada una de las enzimas originales, es decir, el tipo de enlace sobre el que actúa la fosfolipasa, y la temperatura a la que funciona la fosfolipasa. De este modo, por ejemplo, la fosfolipasa se puede cribar para averiguar aquellas funcionalidades químicas que distinguen la fosfolipasa híbrida de las fosfolipasas originales, tales como: (a) amida (enlaces peptídicos), es decir, fosfolipasas; (b) enlaces de éster, es decir, amilasas y lipasas; (c) acetales, es decir, glucosidasas, y, por ejemplo, la temperatura, pH o concentración de sal a la que funciona el polipéptido híbrido.

Las fuentes de los polinucleótidos a “integrar” con ácidos nucleicos de la invención se pueden aislar de organismos individuales (“aislados”), colecciones de organismos que se han hecho crecer en medios definidos (“cultivos de enriquecimiento”), u organismos no cultivados (“muestras medioambientales”). El uso de un enfoque independiente de cultivos para derivar polinucleótidos que codifican nuevas bioactividades a partir de muestras medioambientales es lo más preferible puesto que permite el acceso a fuentes inexplotadas de biodiversidad. Las “librerías medioambientales” se generan a partir de muestras medioambientales, y representan los genomas colectivos de organismos de origen natural logrados en vectores de clonación que se pueden propagar en hospedantes procariotas adecuados. Debido a que el ADN clonado se extrae inicialmente de forma directa a partir de muestras medioambientales, las librerías no están limitadas a la pequeña fracción de procariotas que se puede hacer crecer en cultivo puro. Adicionalmente, una normalización del ADN medioambiental presente en estas muestras podría permitir una representación más igualitaria del ADN procedente de todas las especies presentes en la muestra original. Esto puede incrementar drásticamente la eficiencia de hallar genes interesantes a partir de constituyentes minoritarios de la muestra que pueden estar subrepresentados por varios órdenes de magnitud en comparación con la especie dominante.

Por ejemplo, las librerías génicas generadas a partir de uno o más microorganismos sin cultivar se criban en busca de una actividad de interés. Las rutas potenciales que codifican moléculas bioactivas de interés se capturan primero en células procariotas en forma de librerías de expresión génica. Los polinucleótidos que codifican actividades de interés se aíslan de tales librerías y se introducen en una célula hospedante. La célula hospedante se hace crecer en condiciones que promueven la recombinación y/o reclasificación reductiva, creando biomoléculas potencialmente activas con nuevas actividades o actividades mejoradas.

Los microorganismos a partir de los cuales se pueden preparar polinucleótidos híbridos incluyen microorganismos procariotas, tales como Eubacteria y Archaebacteria, y microorganismos eucariotas inferiores tales como hongos, algunas algas y protozoos. Los polinucleótidos se pueden aislar de muestras medioambientales. El ácido nucleico se puede recuperar sin cultivar un microorganismo, o se puede recuperar de uno o más organismos cultivados. En un aspecto, tales microorganismos pueden ser extremófilos, tales como hipertermófilos, psicrófilos, psicrótrofos, halófilos, barófilos y acidófilos. En un aspecto, los polinucleótidos que codifican enzimas de fosfolipasa aislados de microorganismos extremófilos se usan para obtener enzimas híbridas. Tales enzimas pueden funcionar a temperaturas por encima de 100ºC, por ejemplo, en manantiales calientes terrestres y respiraderos térmicos de las profundidades marinas, a temperaturas por debajo de 0ºC en, por ejemplo, aguas árticas, en el entorno salino saturado de, por ejemplo, el Mar Muerto, a valores de pH alrededor de 0 en, por ejemplo, depósitos de carbón y manantiales geotérmicos ricos en azufre, o a valores de pH mayores que 11 en, por ejemplo, lodos de aguas residuales. Por ejemplo, las fosfolipasas clonadas y expresadas a partir de organismos extremófilos pueden mostrar una actividad elevada en un amplio intervalo de temperaturas y pHs.

Los polinucleótidos seleccionados y aislados como se describen aquí, incluyendo al menos un ácido nucleico de la invención, se introducen en una célula hospedante adecuada. Una célula hospedante adecuada es cualquier célula que es capaz de promover la recombinación y/o reclasificación reductiva. Los polinucleótidos seleccionados pueden estar en un vector que incluye secuencias de control apropiadas. La célula hospedante puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura,

o preferiblemente la célula hospedane puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula hospedante se puede efectuar mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, o electroporación (Davis et al., 1986).

Como ejemplos representativos de hospedantes apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como

E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como levadura; células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS o Bowes melanoma; adenovirus; y células vegetales. La selección de un de un hospedante apropiado para la recombinación y/o reclasificación reductiva, o sólo para la expresión de proteína recombinante, se considera que está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas aquí. Los sistemas de cultivo de células de mamífero que se pueden emplear para la recombinación y/o reclasificación reductiva, o sólo para la expresión de proteína recombinante, incluyen, por ejemplo, las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas en “SV40transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants” (Gluzman, 1981), las estirpes celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados, y sitios de unión a ribosoma necesarios, sitio de poliadenilación, sitios dadores y aceptores de ayuste, secuencias de terminación transcripcional, y secuencias no transcritas de flanqueo en 5’. Las secuencias de ADN derivadas del ayuste SV40 y sitios de poliadenilación se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

Las células hospedantes que contienen los polinucleótidos de interés (para recombinación y/o reclasificación reductiva, o sólo para la expresión de proteína recombinante) se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similar, son aquellas usadas previamente con la célula hospedante seleccionada para expresión, y serán manifiestas para los expertos normales. Los clones que se identifican por tener la actividad enzimática específica se pueden secuenciar entonces para identificar la secuencia polinucleotídica que codifica una enzima que tiene la actividad potenciada.

En otro aspecto, los ácidos nucleicos y métodos de la presente invención se pueden usar para generar nuevos polinucleótidos para rutas bioquímicas, por ejemplo rutas de uno o más operones o racimos génicos o sus porciones. Por ejemplo, las bacterias y muchos eucariotas tienen un mecanismo coordinado para regular genes cuyos productos están implicados en procesos relacionados. Los genes se agrupan, en estructuras denominadas “racimos génicos”, en un único cromosoma, o se transcriben juntos bajo el control de una única secuencia reguladora, incluyendo un único promotor que inicia la transcripción de todo el racimo. De este modo, un racimo génico es un grupo de genes adyacentes que son idénticos o están relacionados, habitualmente en cuanto a su función.

El ADN del racimo génico se puede aislar de diferentes organismos y se puede ligar en vectores, particularmente vectores que contienen secuencias reguladoras de la transcripción que pueden controlar y regular la producción de una proteína detectable o una actividad de matriz relacionada con proteínas a partir de los racimos génicos ligados. El uso de vectores que tienen una capacidad excepcionalmente grande para la introducción de ADN exógeno es particularmente apropiado para uso con tales racimos génicos, y se describe a título de ejemplo aquí para incluir el factor f (o factor de fertilidad) de E. coli. Este factor f de E. coli es un plásmido que afecta a la transferencia de alta frecuencia de sí mismo durante la conjugación, y es ideal para lograr y propagar de forma estable grandes fragmentos de ADN, tales como racimos génicos de muestras microbianas mixtas. Como vectores de clonación, se pueden usar “fósmidos”, cósmidos o vectores de cromosoma artificial bacteriano (BAC). Estos derivan del factor f de

E. coli que es capaz de integrar de forma estable grandes segmentos de ADN genómico. Cuando se integran con ADN de una muestra medioambiental no cultivada mixta, esto hace posible lograr grandes fragmentos genómicos en forma de una “librería de ADN medioambiental” estable. Los vectores cosmídicos se diseñaron originalmente para clonar y propagar grandes segmentos de ADN genómico. La clonación en vectores cosmídicos se describe con detalle en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Una vez ligados en un vector apropiado, dos o más vectores que contienen diferentes racimos génicos de policetida sintasa se pueden introducir en una célula hospedante adecuada. Las regiones de homología de secuencia parcial compartida por los racimos génicos promoverán procesos que dan como resultado la reorganización de las secuencias, dando como resultado un racimo génico híbrido. El nuevo racimo génico híbrido se puede cribar entonces en busca de actividades mejoradas no encontradas en los racimos génicos originales.

De este modo, en un aspecto, la invención se refiere a un método para producir un polipéptido híbrido biológicamente activo usando un ácido nucleico de la invención, y cribar el polipéptido en busca de una actividad (por ejemplo, actividad potenciada) mediante:

(1) introduciendo al menos un primer polinucleótido (por ejemplo, un ácido nucleico de la invención) en ligación operable, y un segundo polinucleótido en ligación operable, compartiendo dicho al menos primer

nucleótido y segundo nucleótido al menos una región de homología de secuencia parcial, en una célula hospedante adecuada;

(2): hacer crecer la célula hospedante en condiciones que promueven la reorganización de secuencias dando como resultado un polinucleótido híbrido en enlazamiento operable;

(3): expresar un polipéptido híbrido codificado por el polinucleótido híbrido;

(4): cribar el polipéptido híbrido en condiciones que promueven la identificación de la actividad biológica deseada (por ejemplo, actividad de fosfolipasa potenciada); y

(5): aislar el polinucleótido que codifica el polipéptido híbrido.

Los métodos para cribar diversas actividades enzimáticas son conocidos por los expertos en la técnica, y se explican en la presente memoria descriptiva. Tales métodos se pueden emplear cuando se aíslan polipéptidos y polinucleótidos de la invención.

La reclasificación in vivo se puede centrar en procesos “intermoleculares”, denominados colectivamente como “recombinación”. En bacterias, generalmente se denomina como un fenómeno “dependiente de RecA”. La invención se puede basar en procesos de recombinación de una célula hospedante para recombinar y reclasificar secuencias,

o la capacidad de las células para mediar procesos reductivos para disminuir la complejidad de secuencias cuasi repetidas en la célula mediante supresión. Este proceso de “reclasificación reductiva” se produce mediante un proceso “intramolecular”, dependiente de RecA. De este modo, en un aspecto de la invención, usando los ácidos nucleicos de la invención, se generan nuevos polinucleótidos mediante el proceso de reclasificación reductiva. El método implica la generación de constructos que contienen secuencias consecutivas (secuencias codificantes originales), su inserción en un vector apropiado, y su introducción subsiguiente en una célula hospedante apropiada. La reclasificación de las identidades moleculares individuales se produce mediante procesos combinatorios entre las secuencias consecutivas en el constructo que posee regiones de homología, o entre unidades cuasi repetidas. El proceso de reclasificación recombina y/o reduce la complejidad y extensión de las secuencias repetidas, y da como resultado la producción de nuevas especies moleculares.

Diversos tratamientos se pueden aplicar para potenciar la tasa de reclasificación. Estos podrían incluir el tratamiento con luz ultravioleta, o productos químicos que dañan el ADN, y/o el uso de estirpes celulares hospedantes que presentan niveles potenciados de “inestabilidad genética”. De este modo, el proceso de reclasificación puede implicar recombinación homóloga o la propiedad natural de secuencias cuasi repetidas para dirigir su propia evolución.

Las secuencias repetidas o “cuasi repetidas” desempeñan un papel en la inestabilidad genética. “Cuasi repetidas” son repeticiones que no están restringidas a su estructura de unidad original. Las unidades cuasi repetidas se pueden presentar como un conjunto de secuencias en un constructo; unidades consecutivas de secuencias similares. Una vez ligadas, las uniones entre las secuencias consecutivas se hacen esencialmente invisibles, y la naturaleza cuasi repetitiva del constructo resultante es ahora continua a nivel molecular. El proceso de supresión que lleva a cabo la célula para reducir la complejidad del constructo resultante funciona entre las secuencias cuasi repetidas. Las unidades cuasi repetidas proporcionan un repertorio prácticamente ilimitado de moldes sobre los que se pueden producir sucesos de deslizamiento. Los constructos que contienen las cuasi repeticiones proporcionan así eficazmente elasticidad molecular suficiente de que se pueden producir sucesos de supresión (y potencialmente inserción) virtualmente en cualquier parte en las unidades cuasi repetitivas. Cuando las secuencias cuasi repetidas están todas ligadas en la misma orientación, por ejemplo cabeza a cola o viceversa, la célula no puede distinguir unidades individuales. En consecuencia, el proceso reductivo se puede producir a través de las secuencias. Por el contrario, cuando por ejemplo las unidades se presentan cabeza a cabeza, en lugar de cabeza a cola, la inversión delinea los puntos finales de la unidad adyacente, de manera que la formación de supresión favorecerá la pérdida de unidades discretas. De este modo, en un aspecto de la invención, las secuencias a reclasificar están en la misma orientación. La orientación al azar de secuencias cuasi repetidas dará como resultado la pérdida de eficiencia de reclasificación, mientras que la orientación consistente de las secuencias ofrecerá la eficiencia más elevada. Sin embargo, aunque el tener un menor número de las secuencias contiguas en la misma orientación disminuye la eficiencia, todavía puede proporcionar suficiente elasticidad para la recuperación eficaz de nuevas moléculas. Se pueden obtener constructos con las secuencias cuasi repetidas en la misma orientación para permitir una mayor eficiencia.

Las secuencias se pueden ensamblar en la orientación cabeza a cola usando cualquiera de una variedad de métodos, incluyendo los siguientes: a) se pueden utilizar cebadores que incluyen una cabeza poly-A y una cola poly-T que cuando son monocatenarios proporcionarían orientación. Esto se logra obteniendo las primeras pocas bases de los cebadores a partir de ARN y por tanto fácilmente ARNasa H eliminada. b) Se pueden utilizar cebadores que incluyen sitios de escisión de restricción únicos. Se requerirían múltiples sitios, una batería de secuencias únicas, y etapas repetidas de síntesis y ligación. c) Las pocas bases internas del cebador se podrían tiolar y se podría usar una exonucleasa para producir moléculas con una cola apropiada.

La recuperación de las secuencias reclasificadas se basa en la identificación de vectores de clonación con un índice repetitivo (RI) reducido. Las secuencias codificantes reclasificadas se pueden recuperar entonces mediante amplificación. Los productos se vuelven a clonar y se expresan. La recuperación de vectores de clonación con RI reducido se puede ver afectada por: 1) el uso de vectores mantenidos sólo establemente cuando el constructo se reduce en complejidad. 2) La recuperación física de vectores acortados mediante procedimientos físicos. En este caso, el vector de clonación se recuperaría usando procedimientos de aislamiento de plásmidos estándar y se fraccionarían en tamaño en un gel de agarosa, o columna con un corte de bajo peso molecular utilizando procedimientos estándar. 3) La recuperación de vectores que contienen genes interrumpidos que se pueden seleccionar cuando disminuye el tamaño del inserto. 4) El uso de técnicas de selección directas con un vector de expresión y la selección apropiada.

Las secuencias codificantes (por ejemplo, genes) de organismos relacionados pueden demostrar un grado elevado de homología y codificar productos proteicos bastante diversos. Estos tipos de secuencias son particularmente útiles en la presente invención como cuasi repeticiones. Sin embargo, este proceso no está limitado a tales repeticiones casi idénticas.

Lo siguiente es un método ejemplar de la invención. Las secuencias de ácidos nucleicos codificantes (cuasi repeticiones) derivan de tres (3) especies, incluyendo un ácido nucleico de la invención. Cada secuencia codifica una proteína con un conjunto distinto de propiedades, incluyendo una enzima de la invención. Cada una de las secuencias difiere en un único par o unos pocos pares de bases en una posición única en la secuencia. Las secuencias cuasi repetidas se amplifican separada o colectivamente y se ligan en conjuntos aleatorios de manera que todas las posibles permutaciones y combinaciones están disponibles en la población de moléculas ligadas. El número de unidades cuasi repetidas se puede controlar mediante las condiciones de ensamblaje. El número medio de unidades cuasi repetidas en un constructo se define como el índice repetitivo (RI). Una vez formados, los constructos se pueden fraccionar o no por tamaños en un gel de agarosa según protocolos publicados, se pueden insertar en un vector de clonación, y se pueden transfectar en una célula hospedante apropiada. Las células se propagan entonces y se efectúa la “reclasificación reductiva”. La velocidad del proceso de reclasificación reductiva se puede estimular mediante la introducción de daño de ADN si se desea. Si la reducción en RI está mediada por la formación de supresión entre secuencias repetidas mediante un mecanismo “intramolecular”, o mediada por sucesos parecidos a recombinación a través de mecanismos “intermoleculares” es inmaterial. El resultado final es una reclasificación de las moléculas en todas las posibles combinaciones. En un aspecto, el método comprende la etapa adicional de cribar los miembros de la librería del conjunto barajado para identificar miembros de la librería barajados individuales que tienen la capacidad de unirse o de otro modo interactuar o catalizar una reacción particular (por ejemplo, tal como un dominio catalítico de una enzima) con una macromolécula predeterminada, tal como por ejemplo un receptor proteinoso, un oligosacárido, virión, u otro compuesto o estructura predeterminada. Los polipéptidos, por ejemplo fosfolipasas, que se identifican a partir de tales librerías se pueden usar para diversos fines, por ejemplo los procesos industriales descritos aquí, y/o se pueden someter a uno o más ciclos adicionales de barajado y/o selección.

En otro aspecto, se prevé que antes o durante la recombinación o reclasificación, los polinucleótidos generados mediante el método de la invención se puedan someter a agentes o procesos que promuevan la introducción de mutaciones en los polinucleótidos originales. La introducción de tales mutaciones incrementaría la diversidad de polinucleótidos híbridos resultantes y polinucleótidos codificados a partir de ellos. Los agentes o procesos que promueven la mutagénesis pueden incluir, pero no se limitan a: (+)-CC-1065, o un análogo sintético tal como (+)-CC1065-(N3-adenina (véase Sun y Hurley, (1992); un aducto 4’-fluoro-4-aminobifenílico N-acetilado o desacetilado capaz de inhibir la síntesis de ADN (véase, por ejemplo, van de Poll et al. (1992)); o un aducto 4-aminobifenílico Nacetilado o desacetilado capaz de inhibir la síntesis de ADN (véase también van de Poll et al. (1992), p. 751-758); cromo trivalente, una sal de cromo trivalente, un aducto de ADN con hidrocarburo aromático policíclico (PAH) capaz de inhibir la replicación de ADN, tal como 7-bromometilbenz[a]antraceno (“BMA”), tris(2,3-dibromopropil)fosfato (“Tris-BP”), 1,2-dibromo-3-cloropropano (“DBCP”), 2-bromoacroleína (2BA), benzo[a]pireno-7,8-dihidrodiol-9-10epóxido (“BPDE”), una sal de halógeno de platino(II), N-hidroxi-2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]-quinolina (“N-hidroxi-IQ”), y N-hidroxi-2-amino-1-metil-6-fenilimidazo[4,5-f]-piridina (“N-hidroxi-PhIP”). Los medios especialmente preferidos para ralentizar o detener la amplificación de PCR consiste en luz ultravioleta (+)-CC-1065 y (+)-CC-1065(N3-adenina). Los medios particularmente englobados son aductos de ADN y polinucleótidos que comprenden los aductos de ADN de los polinucleótidos o conjunto de polinucleótidos, que se pueden liberar o eliminar mediante un proceso que incluye calentar la disolución que comprende los polinucleótidos antes del procesamiento posterior.

Metodologías de cribado y dispositivos de monitorización “en línea”

En la práctica de los métodos de la invención, se puede usar una variedad de aparatos y metodologías en conjunción con los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo para cribar polipéptidos en busca de actividad de fosfolipasa, para cribar compuestos como moduladores potenciales de actividad (por ejemplo, potenciación o inhibición de la actividad enzimática), en busca de anticuerpos que se unen a un polipéptido de la invención, en busca de ácidos nucleicos que se hibridan a un ácido nucleico de la invención, y similares.

Soportes sólidos para la enzima inmovilizada

Las enzimas de fosfolipasa, sus fragmentos y los ácidos nucleicos que codifican las enzimas y fragmentos se pueden fijar a un soporte sólido. Esto es a menudo económico y eficiente en el uso de las fosfolipasas en procesos industriales. Por ejemplo, un consorcio o cóctel de enzimas de fosfolipasa (o sus fragmentos activos), que se usan en una reacción química específica, se pueden unir a un soporte sólido y sumergir en una vasija del proceso. Se puede producir la reacción enzimática. Después, el soporte sólido se puede sacar de la vasija, junto con las enzimas fijadas a él, para uso repetido. En una realización de la invención, un ácido nucleico aislado de la invención se fija a un soporte sólido. En otra realización de la invención, el soporte sólido se selecciona del grupo de un gel, una resina, un polímero, un material cerámico, un vidrio, un microelectrodo, y cualquier combinación de los mismos.

Por ejemplo, los soportes sólidos útiles en esta invención incluyen geles. Algunos ejemplos de geles incluyen sefarosa, gelatina, glutaraldehído, glutaraldehído tratado con quitosano, albúmina-glutaraldehído, quitosano-xantana, gel de toyopearl (gel polimérico), alginato, alginato-polilisina, carrageenano, agarosa, glioxil agarosa, agarosa magnética, dextrano-agarosa, hidrogel de poli(carbamoilsulfonato), hidrogel de BSA-PEG, polialcohol vinílico (PVA) fosforilado, monoaminoetil-N-aminoetil (MANA), amino, o cualquier combinación de los mismos.

Otro soporte sólido útil en la presente invención son las resinas o polímeros. Algunos ejemplos de resinas o polímeros incluyen celulosa, acrilamida, nailon, rayón, poliéster, resina de intercambio iónico, AMBERLITE™ XAD-7, AMBERLITE™ XAD-8, AMBERLITE™ IRA-94, AMBERLITE™ IRC-50, polivinilo, poliacrílico, polimetacrilato, o cualquier combinación de los mismos.

Otro tipo de soporte sólido útil en la presente invención es material cerámico. Algunos ejemplos incluyen material cerámico no poroso, material cerámico poroso, SiO2, Al2O3. Otro tipo de soporte sólido útil en la presente invención es vidrio. Algunos ejemplos incluyen vidrio no poroso, vidrio poroso, vidrio aminopropílico, o cualquier combinación de los mismos. Otro tipo de soporte sólido que se puede usar es un microelectrodo. Un ejemplo es una magnetita revestida con polietilenimina. Como soporte sólido, se pueden usar partículas grafíticas.

Otro ejemplo de un soporte sólido es una célula, tal como un glóbulo rojo.

Métodos de inmovilización

Hay muchos métodos que serían conocidos por un experto en la técnica para inmovilizar enzimas o sus fragmentos,

o ácidos nucleicos, sobre un soporte sólido. Algunos ejemplos de tales métodos incluyen, por ejemplo, generación de gotitas electrostáticas, medios electroquímicos, vía adsorción, vía unión covalente, vía reticulación, vía una reacción o proceso químico, vía encapsulamiento, vía atrapamiento, vía alginato de calcio, o vía poli(metacrilato de 2-hidroxietilo). Métodos parecidos se describen en Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Editado por S. P. Colowick y N. O. Kaplan. Volumen 136; e Immobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Editado por G. F. Bickerstaff. Series: Methods in Biotechnology, Editado por J. M. Walker.

Matrices capilares

Las matrices capilares, tales como la GIGAMATRIX™, Diversa Corporation, San Diego, CA, se pueden usar en los métodos de la invención. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención se pueden inmovilizar o aplicar a una matriz, incluyendo matrices capilares. Las matrices se pueden usar para activar o monitorizar librerías de composiciones (por ejemplo, pequeñas moléculas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) en busca de su capacidad para unirse a o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la invención. Las matrices capilares proporcionan otro sistema para soportar y cribar muestras. Por ejemplo, un aparato de cribado de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en una matriz de capilares adyacentes, en el que cada capilar comprende al menos una pared que define una luz para retener una muestra. El aparato puede incluir además material intersticial colocado entre capilares adyacentes en la matriz, y uno o más indicios de referencia formados en el material intersticial. Un capilar para cribar una muestra, en el que el capilar se adapta para ser unido en una matriz de capilares, puede incluir una primera pared que define una luz para retener la muestra, y una segunda pared formada de un material filtrante, para filtrar la energía de excitación proporcionada a la luz para excitar la muestra.

Un polipéptido o ácido nucleico, por ejemplo un ligando, se puede introducir en un primer componente en al menos una porción de un capilar de una matriz capilar. Cada capilar de la matriz capilar puede comprender al menos una pared que define una luz para retener el primer componente. Se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detrás del primer componente. Se puede introducir un segundo componente en el capilar, en el que el segundo componente se separa del primer componente por la burbuja de aire. Se puede introducir una muestra de interés como un primer líquido marcado con una partícula detectable en un capilar de una matriz capilar, en el que cada capilar de la matriz capilar comprende al menos una pared que define una luz para retener el primer líquido y la partícula detectable, y en el que la al menos una pared se reviste con un material de unión para unir la partícula detectable a la al menos una pared. El método puede incluir además eliminar el primer líquido del tubo capilar, en el que la partícula detectable unida se mantiene en el capilar, e introducir un segundo líquido en el tubo capilar.

La matriz capilar puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprenden al menos una pared exterior que define una luz. La pared exterior del capilar puede ser una o más paredes fusionadas juntas. De forma similar, la pared puede definir una luz que es de forma cilíndrica, cuadrada, hexagonal, o de cualquier otra forma geométrica,

en tanto que las paredes formen una luz para retener un líquido o muestra. Los capilares de la matriz capilar se pueden mantener juntos en estrecha proximidad para formar una estructura plana. Los capilares se pueden unir juntos, fusionándolos (por ejemplo, cuando los capilares están hechos de vidrio), pegándolos, uniéndolos, o sujetándolos lado a lado. La matriz capilar puede estar formada de cualquier número de capilares individuales, por ejemplo un intervalo de 100 a 4.000.000 de capilares. Una matriz capilar puede formar una placa de microtitulación que tiene alrededor de 100.000 o más capilares individuales unidos juntos.

Matrices o “biochips”

Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención se pueden inmovilizar o aplicar a una matriz. Una matriz se puede usar para cribar o monitorizar librerías de composiciones (por ejemplo, pequeñas moléculas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) en busca de su capacidad para unirse a o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la invención. Por ejemplo, en un aspecto de la invención, un parámetro monitorizado es la expresión transcrita de un gen de fosfolipasa. Uno o más o todos los transcritos de una célula se pueden medir mediante hibridación de una muestra que comprende transcritos de la célula, o ácidos nucleicos representativos de o complementarios a transcritos de una célula, mediante hibridación a ácidos nucleicos inmovilizados en una matriz o “biochip”. Mediante el uso de una “matriz” de ácidos nucleicos en un microchip, algunos o todos los transcritos de una célula se pueden cuantificar simultáneamente. Como alternativa, también se pueden usar matrices que comprenden ácido nucleico genómico, para determinar el genotipo de una cepa recientemente obtenida mediante ingeniería obtenida mediante los métodos de la invención. También se pueden usar “matrices polipeptídicas” para cuantificar simultáneamente una pluralidad de proteínas.

La presente invención se puede poner en práctica con cualquier “matriz” conocida, también denominada como “micromatriz” o “matriz de ácido nucleico” o “matriz polipeptídica” o “matriz de anticuerpo” o “biochip”, o variación de los mismos. Las matrices son genéricamente una pluralidad de “puntos” o “elementos diana”, comprendiendo cada elemento diana una cantidad definida de una o más moléculas biológicas, por ejemplo oligonucleótidos, inmovilizadas sobre un área definida de una superficie de sustrato para la unión específica a una molécula de la muestra, por ejemplo transcritos de ARNm.

En la práctica de los métodos de la invención, cualquier matriz conocida y/o método para obtener y usar matrices se pueden incorporar en todo o en parte, o sus variaciones, como se describe, por ejemplo, en las patentes U.S. nos 6.277.628; 6.277.489; 6.261.776; 6.258.606; 6.054.270; 6.048.695; 6.045.996; 6.022.963; 6.013.440; 5.965.452; 5.959.098; 5.856.174; 5.830.645; 5.770.456; 5.632.957; 5.556.752; 5.143.854; 5.807.522; 5.800.992; 5.744.305; 5.700.637; 5.556.752; 5.434.049; véanse también, por ejemplo, los documentos WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; véanse también, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32. Véanse también las solicitudes de patentes

U.S. publicadas nos 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.

Anticuerpos y métodos de cribado a base de anticuerpos

La invención proporciona anticuerpos aislados o recombinantes que se unen específicamente a una fosfolipasa de la invención. Estos anticuerpos se pueden usar para aislar, identificar o cuantificar las fosfolipasas de la invención o polipéptidos relacionados. Estos anticuerpos se pueden usar para inhibir la actividad de una enzima de la invención. Estos anticuerpos se pueden usar para aislar péptidos relacionados con aquellos de la invención, por ejemplo enzimas de fosfolipasa relacionadas. Los anticuerpos se pueden usar en inmunoprecipitación, tinción (por ejemplo, FACS), columnas de inmunoafinidad, y similares. Si se desea, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican antígenos específicos se pueden generar mediante inmunización seguido de aislamiento del polipéptido o ácido nucleico, amplificación o clonación e inmovilización de polipéptido sobre una matriz de la invención. Como alternativa, los métodos de la invención se pueden usar para modificar la estructura de un anticuerpo producido por una célula a modificar, por ejemplo se puede incrementar o disminuir una afinidad por el anticuerpo. Además, la capacidad para obtener o modificar anticuerpos puede ser un fenotipo manipulado en una célula mediante los métodos de la invención.

Los métodos de inmunización, producción y aislamiento de anticuerpos (policlonales y monoclonales) son conocidos por los expertos en la técnica, y se describen en la biliografía científica y de patentes; véanse, por ejemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York. Los anticuerpos también se pueden generar in vitro, por ejemplo usando librerías de presentación de fagos que expresan sitios de unión a anticuerpos recombinantes, además de los métodos in vivo tradicionales que usan animales. Véanse, por ejemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45.

Los polipéptidos se pueden usar para generar anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de la invención. Los anticuerpos resultantes se pueden usar en procedimientos de cromatografía por inmunoafinidad para aislar o purificar el polipéptido o para determinar si el polipéptido está presente en una muestra biológica. En tales procedimientos, una preparación proteica, tal como un extracto, o una muestra biológica se ponen en contacto con un anticuerpo capaz de unirse específicamente a uno de los polipéptidos de la invención.

En procedimientos de inmunoafinidad, el anticuerpo se une a un soporte sólido, tal como una perla u otra matriz de columna. La preparación proteica se coloca en contacto con el anticuerpo en condiciones en las que el anticuerpo se une específicamente a uno de los polipéptidos de la invención. Después de un lavado para eliminar las proteínas no unidas específicamente, se eluyen los polipéptidos unidos específicamente.

La capacidad de las proteínas en una muestra biológica para unirse al anticuerpo se puede determinar usando cualquiera de una variedad de procedimientos familiares para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la unión se puede determinar marcando el anticuerpo con un marcador detectable tal como un agente fluorescente, un marcador enzimático, o un radioisótopo. Como alternativa, la unión del anticuerpo a la muestra se puede detectar usando un segundo anticuerpo que tiene tal marcador detectable en él. Los ensayos particulares incluyen ensayos de ELISA, ensayos de sándwich, radioinmunoensayos, y transferencias Western.

Los anticuerpos policlonales generados frente a los polipéptidos de la invención se pueden obtener mediante inyección directa de los polipéptidos en un animal, o administrando los polipéptidos a un animal. Por ejemplo, un animal no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces al propio polipéptido. De esta manera, se puede usar incluso una secuencia que codifica sólo un fragmento del polipéptido para generar anticuerpos que se pueden unir a todo el polipéptido nativo. Tales anticuerpos se pueden usar entonces para aislar el polipéptido de células que expresan ese polipéptido.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de estirpes celulares. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma, la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana, y la técnica de hibridoma de EBV (véase, por ejemplo, Cole (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos monocatenarios frente a los polipéptidos de la invención. Como alternativa, se pueden usar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados frente a estos polipéptidos o sus fragmentos.

Los anticuerpos generados frente a los polipéptidos de la invención se pueden usar en el cribado de polipéptidos similares de otros organismos y muestras. En tales técnicas, los polipéptidos procedentes del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo, y se detectan aquellos anticuerpos que se unen específicamente al anticuerpo. Para detectar la unión al anticuerpo, se puede usar cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente.

Kits

La invención proporciona kits que comprenden las composiciones, por ejemplo ácidos nucleicos, casetes de expresión, vectores, células, polipéptidos (por ejemplo, fosfolipasas) y/o anticuerpos de la invención. Los kits también pueden contener material de instrucción que enseña las metodologías y usos industriales de la invención, como se describe aquí.

Usos industriales y médicos de las enzimas de la invención

La invención proporciona muchos usos industriales y aplicaciones médicas para las enzimas de la invención, fosfolipasas C, incluyendo la conversión de un fosfolípido no hidratable en una forma hidratable. El desgomado de aceites, el procesamiento de aceites procedentes de plantas, peces, algas y similares, por nombrar sólo unas pocas aplicaciones. Los métodos para usar enzimas de fosfolipasa en aplicaciones industriales son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las fosfolipasas y métodos de la invención se pueden usar para el procesamiento de grasas y aceites como se describe, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente JP H6-306386, que describe la conversión de fosfolípidos presentes en los aceites y grasas en sustancias solubles en agua que contienen grupos ácido fosfórico.

Las fosfolipasas de la invención se pueden usar para procesar aceites vegetales y fosfolípidos tales como los derivados de o aislados de soja, cánola, palma, semilla de algodón, maíz, pepita de palma, coco, cacahuete, sésamo, girasol. Las fosfolipasas de la invención se pueden usar para procesar aceites esenciales, por ejemplo aquellos procedentes de aceites de semillas de frutas, por ejemplo uva, albaricoque, borraja, etc. Las fosfolipasas de la invención se pueden usar para procesar aceites y fosfolípidos en formas diferentes, incluyendo formas brutas, desgomadas, gomas, agua de lavado, arcilla, sílice, grasa para jabón, y similares. Los fosfolípidos de la invención se pueden usar para procesar aceites con alto contenido en fósforo, aceites de pescado, aceites de animales, aceites vegetales, aceites de algas, y similares.

Las fosfolipasas de la invención se pueden usar para procesar y obtener aceites comestibles, aceites biodiésel, liposomas para fármacos y cosméticos, fosfolípidos estructurados y lípidos estructurados. Las fosfolipasas de la invención se pueden usar en la extracción de aceites.

Las fosfolipasas de la invención se pueden usar para procesar y obtener diversos jabones.

Refinado cáustico

En un procedimiento ejemplar de la invención, las fosfolipasas se usan como auxiliares del refinado cáustico. Más particularmente, se usa una PLC de la invención en los procedimientos como añadido, ya sea antes, durante o después de un proceso de refinado mediante neutralización cáustica (ya sea refinado continuo o por lotes). La cantidad de enzima añadida puede variar según el procedimiento. El nivel de agua usado en el procedimiento debería ser bajo, por ejemplo alrededor de 0,5 a 5%. Como alternativa, el compuesto cáustico se añade al procedimiento múltiples veces. Además, el procedimiento se puede llevar a cabo a diferentes temperaturas (25ºC a 70ºC), con diferentes ácidos o cáusticos, y a pH variable (4-12). Los ácidos que se pueden usar en un procedimiento de refinado cáustico incluyen, pero no se limitan a, ácidos fosfórico, cítrico, ascórbico, sulfúrico, fumárico, maleico, clorhídrico y/o acético. Los ácidos se usan para hidratar fosfolípidos no hidratables. Los compuestos cáusticos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, KOH y NaOH. Los compuestos cáusticos se usan para neutralizar ácidos grasos libres. Como alternativa, las fosfolipasas, o más particularmente una PLC o una PLD, y una fosfatasa, se usan para la purificación de fitosteroles a partir de la goma/grasa para jabón.

Una realización alternativa de la invención para ayudar a la fosfolipasa antes del refinado cáustico es expresar la fosfolipasa en una planta. En otra realización, la fosfolipasa se añade durante la trituración de la planta, semillas u otra parte de la planta. Como alternativa, la fosfolipasa se añade tras la trituración pero antes del refinado (es decir, en vasijas de contención). Además, la fosfolipasa se añade como un pretratamiento de refinado, con o sin ácido.

Otra realización de la invención, ya descrita, es añadir la fosfolipasa durante un procedimiento de refinado cáustico. En este procedimiento, los niveles de ácido y cáustico se varían dependiendo del nivel de fósforo y del nivel de ácidos grasos libres. Además, en el procedimiento se usan intervalos amplios de temperatura y de pH, dependiendo del tipo de enzima usada.

En otra realización de la invención, la fosfolipasa se añade tras el refinado cáustico (Fig. 9). En un caso, la fosfolipasa se añade en una mezcladora intensa o en una mezcladora de retención, antes de la separación. Como alternativa, la fosfolipasa se añade tras la etapa de calentamiento. En otra realización, la fosfolipasa se añade en la etapa de centrifugación. En una realización adicional, la fosfolipasa se añade a la grasa para jabón. Como alternativa, la fosfolipasa se añade al agua de lavado. En otro caso, la fosfolipasa se añade durante las etapas de blanqueo y/o desodorizado.

Desgomado de aceites y procesamiento del aceite vegetal

Las fosfolipasas de la invención se pueden usar en diversas etapas del procesamiento de aceites vegetales, tales como en la extracción de aceites vegetales, particularmente en la eliminación de “gomas de fosfolípidos” en un procedimiento denominado “desgomado de aceites”, como se describe anteriormente. La invención proporciona métodos para procesar aceites vegetales a partir de diversas fuentes, tales como habas de soja, colza, cacahuetes y otras nueces, sésamo, girasol, palma y maíz. Los método se pueden usar conjuntamente con procedimientos basados en la extracción como con hexano, con el refinado subsiguiente de los extractos brutos a aceites comestibles, incluyendo el uso de los métodos y enzimas de la invención. La primera etapa en la secuencia de refinado es el proceso denominado “desgomado”, que sirve para separar fosfátidos mediante adición de agua. El material precipitado mediante desgomado se separa y se procesa posteriormente a mezclas de lecitinas. Las lecitinas comerciales, tales como lecitina de haba de soja y lecitina de girasol, son materiales semisólidos o muy viscosos. Consisten en una mezcla de lípidos polares, principalmente fosfolípidos, y aceite, principalmente triglicéridos.

Las fosfolipasas de la invención se pueden usar en cualquier procedimiento de “desgomado”, incluyendo desgomado con agua, desgomado con aceite ALCON (por ejemplo, para habas de soja), desgomado safinco “superdesgomado”, desgomado UF, desgomado TOP, unidesgomado, desgomado en seco y desgomado con ENZYMAX™. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.355.693; 6.162.623; 6.103.505; 6.001.640; 5.558.781;

5.264.367. Diversos procedimientos de “desgomado”, incorporados por los métodos de la invención, se describen en Bockisch, M. (1998) en Fats and Oils Handbook, The extraction of Vegetable Oils (Capítulo 5), 345-445, AOCS Press, Champaign, Illinois. Las fosfolipasas de la invención se pueden usar en la aplicación industrial de desgomado enzimático de aceites triglicéridos como se describe, por ejemplo, en el documento EP 513709.

Las fosfolipasas de la invención se pueden usar en la aplicación industrial del desgomado enzimático como se describe, por ejemplo, en el documento CA 1102795, que describe un método para aislar lípidos polares a partir de lípidos de cereales mediante la adición de al menos 50% en peso de agua. Este método es un desgomado modificado, en el sentido de que utiliza el principio de añadir agua a una mezcla de aceite bruta.

En un aspecto, la invención proporciona procedimientos enzimáticos que comprenden el uso de fosfolipasas de la invención (una PLC) que comprenden la hidrólisis de fosfolípidos hidratados en un aceite a una temperatura de alrededor de 20ºC a 40ºC, a un pH alcalino, por ejemplo un pH de alrededor de pH 8 a pH 10, usando un tiempo de reacción de alrededor de 3 a 10 minutos. Esto puede dar como resultado niveles finales de fósforo en aceite menores que 10 ppm. La invención también proporciona procedimientos enzimáticos que comprenden el uso de fosfolipasas de la invención (una PLC) que comprenden la hidrólisis de fosfolípidos hidratables y no hidratables en aceite a una temperatura de alrededor de 50ºC a 60ºC, a un pH ligeramente por debajo del neutro, por ejemplo de alrededor de pH 5 a pH 6,5, usando un tiempo de reacción de alrededor de 30 a 60 minutos. Esto puede dar como resultado niveles de fósforo en aceite finales menores que 10 ppm.

En un aspecto, la invención proporciona procedimientos enzimáticos que utilizan una enzima de fosfolipasa C para hidrolizar un enlace de fosfoéster de glicerilo y permitir de ese modo la devolución de la porción de diacilglicérido de los fosfolípidos nuevamente al aceite, por ejemplo un aceite vegetal, de pescado o de algas (un “auxiliar del refinado cáustico de fosfolipasa C (PLC)”); y reducir el contenido de fosfolípidos en una etapa de desgomado hasta niveles suficientemente bajos para que los aceites con alto contenido de fósforo se refinen físicamente (un “auxiliar del desgomado de fosfolipasa C (PLC)”). Los dos enfoques pueden generar valores diferentes y tener diferentes aplicaciones diana.

En diversos procedimientos ejemplares de la invención, un número de etapas distintas componen el procedimiento de desgomado que antecede a los procedimientos de blanqueo del núcleo y refinado con desodorización. Estas etapas incluyen calentar, mezclar, retener, separar y secar. Tras la etapa de calentamiento, se añade agua y a menudo ácido y se mezclan para permitir que la “goma” de fosfolípido insoluble se aglomere en partículas que se pueden separar. Mientras que el agua separa muchos de los fosfátidos en el desgomado, las porciones de los fosfolípidos son fosfátidos no hidratables (NHPs) presentes como sales de calcio o magnesio. Los procedimientos de desgomado se dirigen a estos NHPs mediante la adición de ácido. Tras la hidratación de los fosfolípidos, el aceite se mezcla, se retiene y se separa mediante centrifugación. Finalmente, el aceite se seca y se almacena, se transporta o refina, como se ilustra, por ejemplo, en la Figura 6. Las gomas resultantes se procesan posteriormente para productos de lecitina, o se añaden nuevamente a la harina.

En diversos procedimientos ejemplares de la invención, los niveles de fósforo se reducen suficientemente bajos para el refinado físico. El procedimiento de separación puede dar como resultado pérdidas de rendimiento potencialmente mayores que el refinado cáustico. Adicionalmente, los procedimientos de desgomado pueden generar productos de desecho que no se pueden vender como lecitina comercial, véase, por ejemplo, la Figura 7 para un procedimiento de desgomado ejemplar para aceites físicamente refinados. Por lo tanto, estos procedimientos no han logrado una cuota significativa de mercado, y los procedimientos de refinado cáustico continúan dominando la industria para soja, cánola y girasol. Obsérvese sin embargo que una enzima de fosfolipasa C empleada en un procedimiento de desgomado especial disminuiría la formación de gomas y la devolución de la porción de diglicérido del fosfolípido nuevamente al aceite.

En un aspecto, una enzima de fosfolipasa C de la invención hidroliza un fosfátido en un enlace de fosfoéster de glicerilo para generar un diglicérido y un compuesto de fosfato soluble en agua. El fosfátido hidrolizado se mueve a la fase acuosa, dejando el diglicérido en la fase oleosa, como se ilustra en la Figura 8. Un objetivo del “auxiliar de refinado cáustico” de PLC es convertir las gomas de fosfolípidos formadas durante la neutralización en un diacilglicérido que migrará nuevamente a la fase oleosa. Por el contrario, un objetivo del “auxiliar de desgomado de PLC” es reducir los fosfolípidos en el aceite bruto hasta un fósforo equivalente a menos de 10 partes por millón (ppm).

En un aspecto, una enzima de fosfolipasa C de la invención hidrolizará el fosfátido tanto de los fosfolípidos hidratables como de los no hidratables en aceites neutralizados brutos y desgomados antes del blanqueo y desodorización. La enzima diana se puede aplicar como un producto de inclusión casual en el procedimiento de neutralización cáustica existente, como se ilustra en la Figura 9. En este aspecto, la enzima no necesitará soportar niveles extremos de pH si se añade tras la adición del compuesto cáustico.

En un aspecto, una fosfolipasa de la invención permite eliminar el fósforo hasta los niveles bajos aceptables en el refinado físico. En un aspecto, una PLC de la invención hidrolizará el fosfátido tanto de los fosfolípidos hidratables como de los no hidratables en aceites brutos antes del blanqueo y desodorización. La enzima diana se puede aplicar como un producto de aplicación inmediata en la operación de desgomado existente; véase, por ejemplo, la Figura

10. Dado el mezclamiento subóptimo en el equipo comercial, es probable que se necesitará ácido para poner en contacto los fosfolípidos no hidratables con la enzima en la interfaz aceite/agua. Por lo tanto, en un aspecto, se usa una PLC de la invención estable a ácidos.

En un aspecto, un procedimiento de auxiliar de desgomado de PLC de la invención puede eliminar pérdidas en una,

o en las tres, áreas señaladas en la Tabla 2. Las pérdidas asociadas en un procedimiento de PLC se pueden estimar en alrededor de 0,8% frente al 5,2% en base a la masa debido a la eliminación del fosfátido.

Tabla 2: Pérdidas apuntadas por los productos de PLC

Auxiliar del refinado cáustico: Auxiliar del desgomado

1) Aceite perdido en la formación y separación de goma 2,1%: X X

2) Aceite saponificado en la adición cáustica 3,1%: X

3) Aceite atrapado en arcilla en el blanqueo* <1,0%: X X

Pérdida de rendimiento total #5,2%: #2,1% #5,2%

Los beneficios potenciales adicionales de este procedimiento de la invención incluyen los siguientes: ♦ Adsorbentes reducidos – se necesitan menos adsorbentes con menor fósforo (< 5 ppm) ♦ Menor uso de compuestos químicos – menos costes químicos y de procesamiento asociados con la hidratación de fosfolípidos no hidratables ♦ Menor generación de desechos – se necesita menos agua para eliminar fósforo del aceite

Los aceites procesados (por ejemplo, “desgomado”) mediante los métodos de la invención incluyen oleaginosas, por

5 ejemplo aceite de haba de soja, aceite de colza y aceite de girasol. En un aspecto, el “auxiliar del refinado cáustico de PLC” de la invención puede ahorrar 1,2% con respecto a los procedimientos de refinado cáustico existentes. La aplicación del auxiliar del refinado se dirige a aceite de soja que se ha desgomado para lecitina, y también se excluyen de los cálculos de valor/carga.

Las dianas de comportamiento de los procedimientos de la invención pueden variar según las aplicaciones, y más 10 específicamente el punto de adición de enzima; véase la Tabla 3.

Tabla 3: Dianas de comportamiento mediante aplicación

Auxiliar del refinado cáustico: Auxiliar del desgomado

Niveles entrantes de fósforo en aceite: <200 ppm* 600-1.400 ppm

Niveles finales de fósforo en aceite: <10 ppm † <10 ppm

Gomas hidratables y no hidratables: Sí Sí

Tiempo de residencia: 3-10 minutos 30 minutos‡

Formulación líquida: Sí Sí

pH diana: 8-10‡‡‡ 5,0-5,5‡‡

Temperatura diana: 24-40ºC 1 #50-60ºC

Contenido de agua: <5% 1-1,25%

Pureza de la formulación enzimática: Sin lipasa/proteasa Sin lipasa/proteasa

Otros requisitos clave: Eliminación de Fe Eliminación de Fe

* Aceite desgomado con agua † Niveles diana logrados en la etapa de neutralización cáustica aguas abajo, pero se deben de mantener ‡ 1-2 horas existente ‡‡ El desgomado ácido requerirá una enzima que sea estable en condiciones mucho más ácidas: pH a 2,3 para ácido cítrico a 5% (#Roehm USPN 6.001.640). ‡‡‡ El pH del aceite neutralizado NO es neutro. El ensayo en POS indica que el pH estará en el intervalo alcalino

45 de 6,5-10 (9 de diciembre de 2002). Es necesario determinar el intervalo de pH típico.

Otros procedimientos que se pueden usar con una fosfolipasa de la invención, por ejemplo una fosfolipasa A1, pueden convertir fosfolípidos nativos no hidratables en una forma hidratable. En un aspecto, la enzima es sensible al calor. Esto puede ser deseable, puesto que el calentamiento del aceite puede destruir la enzima. Sin embargo, la reacción de desgomado se debe ajustar a pH 4-5 y 60ºC para adecuar esta enzima. A una dosis de saturación de aceite de 300 unidades/kg, este procedimiento ejemplar es útil llevando el contenido de fósforo en aceite previamente desgomado con agua hasta ∃10 ppm de P. Las ventajas pueden ser un menor contenido de H2O y los ahorros resultantes en el uso, manipulación y desechos. La Tabla 4 enumera aplicaciones ejemplares para usos industriales para las enzimas de la invención:

Tabla 4: Aplicación ejemplar

Auxiliar del refinado cáustico: Auxiliar del desgomado

Producción de aceite de soja sin lecitina: X

Aceite de soja refinado químico, aceite de girasol, aceite de cánola: X X

Aceites con bajo contenido de fosfátido (por ejemplo palma): X

Además de estos diversos procedimientos de “desgomado”, las fosfolipasas de la invención se pueden usar en cualquier etapa del procesamiento de aceites vegetales. Los aceites que se “procesan” o “desgoman” en los métodos de la invención incluyen aceites de haba de soja, aceites de colza, aceites de maíz, aceite procedente de pepitas de palma, aceites de cánola, aceites de girasol, aceites de sésamo, aceites de cacahuete, y similares. Los productos principales de este procedimiento incluyen triglicéridos.

En un procedimiento ejemplar, cuando la enzima se añade a y reacciona con un aceite bruto, la cantidad de fosfolipasa empleada es alrededor de 10-10.000 unidades, o, como alternativa, alrededor de 100-2.000 unidades, por 1 kg de aceite bruto. El tratamiento enzimático se lleva a cabo durante 5 minutos hasta 10 horas a una temperatura de 30ºC a 90ºC, o, como alternativa, alrededor de 40ºC a 70ºC. Las condiciones pueden variar dependiendo de la temperatura óptima de la enzima. La cantidad de agua añadida para disolver la enzima es 5

1.000 partes en peso por 100 partes en peso de aceite bruto, o, como alternativa, alrededor de 10 a 200 partes en peso por 100 partes en peso de aceite bruto.

Al terminar tal tratamiento enzimático, el líquido de la enzima se separa con un medio apropiado, tal como un separador centrífugo, y se obtiene el aceite procesado. Los compuestos que contienen fósforo, producidos mediante descomposición enzimática de sustancias gomosas en tal procedimiento, se transfieren prácticamente todos a la fase acuosa y se eliminan de la fase oleosa. Al terminar el tratamiento enzimático, si es necesario, el aceite procesado se puede lavar adicionalmente con agua o con ácido orgánico o inorgánico tal como, por ejemplo, ácido acético, ácido fosfórico, ácido succínico, y similar, o con disoluciones salinas.

En un procedimiento ejemplar para el desgomado mediante ultrafiltración, la enzima se une a un filtro o la enzima se añade a un aceite antes de la filtración, o la enzima se usa para limpiar periódicamente los filtros.

En un procedimiento ejemplar para un auxiliar del refinado físico mediado por fosfolipasas, se añaden agua y enzima al aceite bruto. En el refinado físico mediado por fosfolipasas, el nivel de agua puede ser bajo, es decir, 0,5-5%, y el tiempo del proceso debería ser corto (menos de 2 horas, o menos de 60 minutos, o menos de 30 minutos, o menos de 15 minutos, o menos de 5 minutos). El procedimiento se puede llevar a cabo a diferentes temperaturas (25ºC a 70ºC) usando diferentes ácidos y/o compuestos cáusticos, a diferentes pHs (por ejemplo, 3-10).

En aspectos alternativos, el desgomado con agua se lleva a cabo primero para recoger lecitina mediante centrifugación, y después se añade PLC o PLC y PLA para eliminar fosfolípidos no hidratables (el procedimiento se debería llevar a cabo a una concentración baja de agua). En otro aspecto, se lleva a cabo el desgomado con agua del aceite bruto hasta menos de 10 ppm (aceites comestibles) y el refinado físico subsiguiente (menos de 50 ppm para biodiésel). En un aspecto, se añade un emulsionante, y/o el aceite bruto se somete a una mezcladora intensa para promover el mezclamiento. Como alternativa, se añade un interruptor de la emulsión, y/o el aceite bruto se calienta para promover la separación de la fase acuosa. En otro aspecto, se añade un ácido para promover la hidratación de fosfolípidos no hidratables. Adicionalmente, las fosfolipasas se pueden usar para mediar la purificación de fitosteroles a partir de la goma/grasa para jabones.

Las enzimas de la descripción se pueden usar en cualquier método de procesamiento de aceites, por ejemplo desgomado o procedimientos equivalentes. Por ejemplo, las enzimas de la invención se pueden usar en procedimientos como se describen en las patentes U.S. nos 5.558.781; 5.264.367; 6.001.640. El procedimiento descrito en USPN 5.558.781 usa fosfolipasa A1, A2 o B, rompiendo esencialmente la lecitina en el aceite que se comporta como un emulsionante.

Las enzimas y métodos de la descripción se pueden usar en procedimientos para la reducción de componentes que contienen fósforo en aceites comestibles que comprenden una cantidad derivada de fósforo no hidratable, usando una fosfolipasa de la invención, por ejemplo un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa A y/o B, como se describe, por ejemplo, en la patente EP número EP 0869167. En un aspecto, el aceite comestible es un aceite bruto, un aceite denominado “no desgomado”. En un aspecto, el método tratamiento un aceite no desgomado, incluyendo aceites prensados o aceites extraídos, o una mezcla de los mismos, de, por ejemplo, colza, haba de soja, sésamo, cacahuete, maíz o girasol. El contenido de fosfátidos en un aceite bruto puede variar de 0,5 a 3% p/p, que corresponde a un contenido de fósforo en el intervalo de 200 a 1200 ppm, o en el intervalo de 250 a 1200 ppm. Aparte de los fosfátidos, el aceite bruto también puede contener pequeñas configuraciones de hidratos de carbono, compuestos de azúcar y compuestos ácidos de metal/fosfátido de Ca, Mg y Fe. En un aspecto, el procedimiento comprende el tratamiento de un fosfolípido o lisofosfolípido con la fosfolipasa de la invención para hidrolizar grupos acilo grasos. En un aspecto, el fosfolípido o lisofosfolípido comprende lecitina o lisolecitina. En un aspecto del procedimiento, el aceite comestible tiene un contenido de fósforo entre alrededor de 50 y 250 ppm, y el procedimiento comprende tratar el aceite con una fosfolipasa de la invención para hidrolizar una parte principal del fosfolípido y separar una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado del aceite. En un aspecto, antes del procedimiento de desgomado enzimático, el aceite se desgoma con agua. En un aspecto, los métodos proporcionan la producción de un pienso para animales, que comprende mezclar la fosfolipasa de la invención con sustancias de pienso y al menos un fosfolípido.

Las enzimas y métodos de la invención se pueden usar en procedimientos de desgomado de aceites como se describe, por ejemplo, en el documento WO 98/18912. Las fosfolipasas de la invención se pueden usar para reducir el contenido de fosfolípido en un aceite comestible. El procedimiento puede comprender tratar el aceite con una fosfolipasa de la invención para hidrolizar una parte importante de fosfolípido y separar una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizable del aceite. Este procedimiento es aplicable a la purificación de cualquier aceite comestible, que contenga un fosfolípido, por ejemplo aceites vegetales, tales como aceite de haba de soja, aceite de colza y aceite de girasol, aceites de pescado, y aceites de algas y de animales, y similares. Antes del tratamiento enzimático, el aceite vegetal se pretrata preferiblemente para eliminar cieno (mucílago), por ejemplo mediante refinado húmedo. El aceite puede contener 50-250 ppm de fósforo como fosfolípido al comienzo del tratamiento con fosfolipasa, y el procedimiento de la invención puede reducir este valor por debajo de 5-10 ppm.

Las enzimas de PLC de la invención se pueden usar en procedimientos como se describe en la Solicitud JP nº H5132283, presentada el 25 de abril de 1993, que comprende un procedimiento para la purificación de aceites y grasas, que comprende una etapa de convertir fosfolípidos presentes en los aceites y grasas en sustancias solubles en agua que contienen grupos ácido fosfórico, y eliminarlos como sustancias solubles en agua. Para la conversión en sustancias solubles en agua, se usa una acción enzimática.

las enzimas de la invención se pueden usar en procedimientos como se describe como el “Procedimiento de Refinado Orgánico” (ORP) (IPH, Omaha, NE), que es un método para refinar aceites de semillas. ORP puede tener ventajas con respecto al refinado químico tradicional, incluyendo un rendimiento mejorado del aceite refinado, valor añadido de los coproductos, costes de capital reducidos, y menores costes medioambientales.

Las enzimas de la invención se pueden usar en procedimientos para el tratamiento de un aceite o grasa, animal o vegetal, bruta, semiprocesada o refinada, que comprende añadir a tal aceite o grasa al menos una enzima de la invención que permite hidrolizar y/o despolimerizar los compuestos no glicerílicos contenidos en el aceite, como se describe, por ejemplo, en la Solicitud EP número: 82870032.8. Los métodos ejemplares de la invención para la hidrólisis y/o despolimerización de compuestos no glicerídicos en aceites son:

1) La adición y mezcla en aceites y grasas de una enzima de la invención o complejos enzimáticos disueltos previamente en una pequeña cantidad de disolvente apropiado (por ejemplo agua). Es posible un cierto número de disolventes, pero se escoge un disolvente no tóxico y adecuado para la enzima. Esta adición se puede hacer en procedimientos con cargas sucesivas, así como también en procedimientos continuos. La cantidad de enzima o enzimas necesaria a añadir a los aceites y grasas, según este procedimiento, puede oscilar, dependiendo de las enzimas y los productos a procesar, de 20 a 400 ppm, es decir, de 0,02 kg a 0,4 kg de enzima para 1000 kg de aceite o grasa, y preferiblemente de 20 a 100 ppm, es decir, de 0,02 a 0,1 kg de enzima para 1000 kg de aceite, entendiéndose que estos valores son para enzimas concentradas, es decir, sin diluyente o disolvente.

2) Pasar el aceite o grasa a través de un lecho filtrante fijo o insoluble de enzima o enzimas de la invención sobre soportes sólidos o semisólidos, que presentan preferiblemente una estructura porosa o fibrosa. En esta técnica, las enzimas son atrapadas en las microcavidades de la estructura porosa o fibrosa de los soportes. Estos consisten, por ejemplo, en resinas o polímeros sintéticos, carbonatos de celulosa, geles tales como agarosa, filamentos de polímeros o copolímeros con estructura porosa, que atrapan pequeñas gotitas de enzima en disolución en sus cavidades. Con respecto a la concentración enzimática, es posible llegar hasta la saturación de los soportes.

3) La dispersión de los aceites y grasas en forma de gotitas finas, en una disolución enzimática diluida, que contienen preferiblemente 0,2 a 4% en volumen de una enzima de la invención. Esta técnica se describe, por ejemplo, en la patente belga nº 595.219. Una columna cilíndrica con una altura de varios metros, con tapa cónica, se llena con una disolución enzimática diluida. Para este fin, se escoge un disolvente que no es tóxico y no miscible en el aceite o grasa a procesar, preferiblemente agua. La parte inferior de la columna está equipada con un sistema de distribución en la que el aceite o grasa se inyecta de forma continua en una forma extremadamente dividida (aproximadamente 10.000 flujo por m2). De este modo, se forma un número infinito de gotitas de aceite o grasa, que se elevan lentamente en la disolución de enzimas y llegan a la superficie, evacuándose continuamente en la parte superior de la tapa cónica del reactor.

El aceite de palma se puede pretratar antes del tratamiento con una enzima de la invención. Por ejemplo, se calientan alrededor de 30 kg de aceite de palma bruto hasta +50ºC. Se preparan disoluciones al 1% en agua destilada con celulasas y pectinasas. Se añaden 600 g de cada una de estas a disoluciones acuosas del aceite con agitación fuerte durante unos pocos minutos. El aceite se mantiene entonces a +50ºC con agitación moderada, durante un tiempo total de reacción de dos horas. Después, la temperatura se eleva hasta +90ºC para desactivar las enzimas y preparar la mezcla para la filtración y el procesamiento posterior. El aceite se seca a vacío y se seca con un auxiliar de la filtración.

Las enzimas de la invención se pueden usar en procedimientos como se describen en la patente europea EP 0513709 B2. Por ejemplo, la invención proporciona un procedimiento para la reducción del contenido de componentes que contienen fósforo en aceites animales y vegetales mediante descomposición enzimática usando una fosfolipasa de la invención. Un aceite animal o vegetal desmucilaginado previamente, con un contenido de fósforo de 50 a 250 ppm, se agita con un ácido carboxílico orgánico, y el valor del pH de la mezcla resultante se ajusta a pH 4 hasta pH 6, se añade una disolución enzimática que contiene fosfolipasa A1, A2, o B de la invención a la mezcla en una vasija de mezclamiento con agitación turbulenta y con formación de gotitas finas, en la que se forma una emulsión con 0,5 a 5% en peso con respecto al aceite, llevándose dicha emulsión a través de al menos una vasija de reacción subsiguiente en movimiento turbulento durante un tiempo de reacción de 0,1 a 10 horas a temperaturas en el intervalo de 20 a 80ºC, y en la que el aceite tratado, tras la separación de la disolución acuosa, tiene un contenido de fósforo por debajo de 5 ppm.

El procedimiento de refinado orgánico es aplicable tanto a aceite bruto como desgomado. El procedimiento usa la adición en línea de un ácido orgánico en condiciones controladas del procedimiento, conjuntamente con separación centrífuga convencional. El agua separada de forma natural de los fosfolípidos del aceite vegetal (“VOP”) se recicla y se reusa. El uso total del agua se puede reducir sustancialmente como resultado del Procedimiento de Refinado Orgánico.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar en el tratamiento enzimático de aceites comestibles, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 6.162.623. En estos métodos ejemplares, la invención proporciona una enzima anfifílica. Se puede inmovilizar, por ejemplo preparando una emulsión que contiene una fase hidrófoba continua y una fase acuosa dispersa que contiene la enzima, y un soporte para la enzima, y eliminando agua de la fase dispersa hasta que esta fase se convierte en partículas revestidas con enzima sólidas. La enzima puede ser una lipasa. La lipasa inmovilizada se puede usar para reacciones catalizadas mediante lipasa, tales como interesterificación de mono-, di- o triglicéridos, desacidificación de un aceite triglicérido, o eliminación de fosfolípidos a partir de un aceite triglicérido cuando la lipasa es una fosfolipasa. La fase acuosa puede contener un líquido de fermentación, un aceite triglicérido comestible puede ser la fase hidrófoba, y los soportes incluyen azúcares, almidón, dextrano, derivados de celulosa solubles en agua, y restos de fermentación. Este método ejemplar se puede usar para procesar triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos, glicerol, fosfolípidos o ácidos grasos, que pueden estar en la fase hidrófoba. En un aspecto, el procedimiento para la eliminación de fosfolípidos a partir de un aceite triglicérido comprende mezclar un aceite triglicérido que contiene fosfolípidos con una preparación que contiene una fosfolipasa de la invención; hidrolizar los fosfolípidos a lisofosfolípidos; separar los fosfolípidos hidrolizados del aceite, en el que la fosfolipasa es una fosfolipasa inmovilizada.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar en el tratamiento enzimático de aceites comestibles, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 6.127.137. Este método ejemplar hidroliza ambos grupos acilo grasos en fosfolípido intacto. La fosfolipasa de la invención usada en estos métodos no tiene actividad de lipasa, y es activa a pH muy bajo. Estas propiedades la hacen muy adecuada para uso en el desgomado de aceites, ya que se pueden suprimir tanto la hidrólisis enzimática como alcalina (saponificación) del aceite. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para hidrolizar grupos acilo grasos en un fosfolípido o lisofosfolípido, que comprende tratar el fosfolípido o lisofosfolípido con la fosfolipasa que hidroliza ambos grupos acilo grasos en un fosfolípido y está esencialmente libre de actividad de fosfolipasa. En un aspecto, la fosfolipasa de la invención tiene un óptimo de temperatura a alrededor de 50ºC, medido a pH 3 a pH 4 durante 10 minutos, y un pH óptimo de alrededor de pH 3, medido a 40ºC durante alrededor de 10 minutos. En un aspecto, el fosfolípido o lisofosfolípido comprende lecitina o lisolecitina. En un aspecto, después de hidrolizar una parte importante del

fosfolípido, se separa del aceite una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para eliminar fosfolípido de un aceite comestible, que comprende tratar el aceite a pH 1,5 a 3 con una dispersión de una disolución acuosa de la fosfolipasa de la invención, y separar del aceite una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado. En un aspecto, el aceite se trata para eliminar mucílago antes del tratamiento con la fosfolipasa. En un aspecto, el aceite antes del tratamiento con la fosfolipasa contiene el fosfolípido en una cantidad correspondiente a 50 a 250 ppm de fósforo. En un aspecto, el tratamiento con fosfolipasa se realiza a 30ºC a 45ºC durante 1 a 12 horas a una dosis de fosfolipasa de 0,1 a 10 mg/l en presencia de 0,5 a 5% de agua.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar en el tratamiento enzimático de aceites comestibles, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 6.025.171. En este método ejemplar las enzimas de la invención se inmovilizan preparando una emulsión que contiene una fase hidrófoba continua, tal como un aceite triglicérido, y una fase acuosa dispersa que contiene una enzima anfifílica, tal como lipasa o una fosfolipasa de la invención, y material soporte que se disuelve parcialmente o está parcialmente sin disolver en la fase acuosa, y eliminando agua de la fase acuosa hasta que la fase se convierte en partículas de soporte revestidas con enzima sólidas. La parte sin disolver del material soporte puede ser un material que es insoluble en agua y en aceite, o un material soluble en agua en forma no disuelta debido a que la fase acuosa ya está saturada con el material soluble en agua. La fase acuosa se puede formar con un líquido de fermentación de lipasa bruta que contiene restos de fermentación y biomasa que pueden servir como materiales soporte. La lipasa inmovilizada es útil para el reordenamiento y desacidificación de ésteres en aceites. Tras una reacción, la enzima inmovilizada se puede regenerar para una reacción subsiguiente añadiendo agua para obtener una disolución parcial del soporte, y con la enzima resultante y la fase acuosa que contiene el soporte dispersas en una fase hidrófoba evaporando agua para nuevamente formar partículas de soporte revestidas con enzima.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar en el tratamiento enzimático de aceites comestibles, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 6.143.545. Estreñimiento método ejemplar se usa para reducir el contenido de componentes que contienen fósforo en un aceite comestible que comprende una cantidad elevada de contenido de fósforo no hidratable, usando una fosfolipasa de la invención. En un aspecto, el método se usa para reducir el contenido de componentes que contienen fósforo en un aceite comestible que tiene un contenido de fósforo no hidratable de al menos 50 ppm medido pretratando el aceite comestible, a 60ºC, mediante adición de una disolución que comprende ácido cítrico monohidratado en agua (agua añadida frente a aceite es igual a 4,8% p/p; (ácido cítrico) en fase acuosa = 106 mM, en emulsión de agua/aceite = 4,6 mM) durante 30 minutos; transfiriendo 10 ml de la emulsión de agua en aceite pretratada a un tubo; calentando la emulsión en un baño de agua hirviendo durante 30 minutos; centrifugando a 5000 rpm durante 10 minutos, transfiriendo alrededor de 8 ml de la fase superior (aceite) a un nuevo tubo, y dejando que sedimente durante 24 horas; y extrayendo 2 g de la fase transparente superior para la medida del contenido de fósforo no hidratable (ppm) en el aceite comestible.

Las fosfolipasas y métodos de la descripción también se pueden usar en el tratamiento enzimático de aceites comestibles, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.532.163. La invención proporciona procedimientos para el refinado de aceite y grasa mediante el cual los fosfolípidos en el aceite y grasa a tratar se pueden descomponer y eliminar eficientemente. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para el refinado de aceite y grasa que comprende hacer reaccionar, en una emulsión, el aceite y grasa con una enzima de la invención, por ejemplo una enzima que tiene una actividad para descomponer enlaces de éster de ácido graso con glicerol en glicerofosfolípidos (por ejemplo, una PLA2 de la descripción); y otro procedimiento en el que el aceite

o grasa tratado con la enzima se lava con agua o una disolución acuosa ácida. En un aspecto, la disolución acuosa ácida a usar en la etapa de lavado es una disolución de al menos un ácido, por ejemplo ácido cítrico, ácido acético, ácido fosfórico y sus sales. En un aspecto, la condición emulsionada se forma usando 30 partes en peso o más de agua por 100 partes en peso del aceite y grasa. Puesto que el aceite y grasa se pueden purificar sin emplear la etapa de refinado alcalina convencional, se puede reducir la generación de agua de lavado de desecho y el desecho industrial. Además, el rendimiento de la recuperación del aceite se mejora debido a que no se produce en el procedimiento de la invención la pérdida de aceite o grasa neutra debido a su inclusión en estos desechos. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para refinar aceite y grasa que contiene alrededor de 100 a

10.000 ppm de fosfolípidos, que comprende: hacer reaccionar, en una condición emulsionada, dicho aceite y grasa con una enzima de la invención que tiene actividad para descomponer enlaces de éster de ácido graso con glicerol en glicerofosfolípidos. En un aspecto, la invención proporciona procedimientos para refinar aceite y grasa que contiene alrededor de 100 a 10.000 ppm de fosfolípidos, que comprende hacer reaccionar, en una condición emulsionada, aceite y grasa con una enzima de la invención que tiene actividad para descomponer enlaces de éster de ácido graso con glicerol en glicerofosfolípidos; y lavar subsiguientemente el aceite o grasa tratado con un agua de lavado.

Las fosfolipasas y métodos de la descripción también se pueden usar en el tratamiento enzimático de aceites comestibles, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.264.367. El contenido de componentes que contienen fósforo y el contenido de hierro de un aceite vegetal o animal comestible, tal como un aceite, por ejemplo aceite de haba de soja, que se ha refinado en húmedo para eliminar mucílago, se reducen mediante descomposición enzimática poniendo en contacto el aceite con una disolución acuosa de una enzima, por ejemplo una fosfolipasa A1, A2, o B, y separando entonces la fase acuosa del aceite tratado. En un aspecto, la invención proporciona un método enzimático para disminuir el contenido de componentes que contienen fósforo y hierro en aceites, que se han refinado para eliminar mucílago. Un aceite, que se ha refinado para eliminar mucílago, se puede tratar con una

enzima PLC de la invención. Se pueden lograr contenidos de fósforo por debajo de 5 ppm, y contenidos de hierro por debajo de 1 ppm. El bajo contenido de hierro puede ser ventajoso para la estabilidad del aceite.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar para preparar aceites transesterificados, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.288.619. La invención proporciona métodos para la transesterificación enzimática para preparar un aceite de margarina que tiene tanto un contenido bajo de ácido trans como un contenido bajo de ácido graso de cadena intermedia. El método incluye las etapas de proporcionar una mezcla de reacción de transesterificación que contiene un material fuente de ácido esteárico y un aceite vegetal líquido comestible, transesterificar el material fuente de ácido esteárico y el aceite vegetal usando una lipasa específica de las posiciones 1, 3, y finalmente hidrogenar entonces la mezcla de ácidos grasos para proporcionar un material fuente de ácido graso reciclado para una reacción de reciclaje con el aceite vegetal. La invención también proporciona un método en contracorriente para preparar un aceite transesterificado. El método incluye las etapas de proporcionar una zona de reacción de transesterificación que contiene una lipasa específica de las posiciones 1, 3, introducir un aceite vegetal en la zona de transesterificación, introducir un material fuente de ácido esteárico, conducir un fluido en contracorriente de gas supercrítico o de gas licuado subcrítico, llevar a cabo una reacción de transesterificación de la corriente de triglicérido con la corriente de ácido esteárico o monoéster de ácido esteárico en la zona de reacción, extraer una corriente de aceite de margarina triglicérido transesterificado, extraer una fase fluida en contracorriente, hidrogenar el ácido esteárico o monoéster de ácido esteárico transesterificado para proporcionar un material fuente de ácido esteárico reciclado hidrogenado, e introducir el material fuente de ácido esteárico reciclado hidrogenado en la zona de reacción.

En un aspecto, el compuesto fosfolipídico muy insaturado se puede convertir en un triglicérido mediante uso apropiado de una fosfolipasa C de la invención para eliminar el grupo fosfato en la posición sn-3, seguido de la síntesis del éster acílico mediante la lipasa 1,3. El fosfolípido sustituido en 2 se puede usar como un ingrediente alimentario funcional directamente, o se puede hidrolizar subsiguientemente de forma selectiva en un reactor 160 usando una fosfolipasa C inmovilizada de la invención para producir un 1-diglicérido, seguido de la esterificación enzimática como se describe aquí para producir un producto de triglicérido que tiene un componente de ácido graso poliinsaturado sustituido en 2.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar en un procedimiento de desgomado enzimático de aceites vegetales como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 6.001.640. Este método de la invención comprende una etapa de desgomado en la producción de aceites vegetales. Los aceites vegetales de los que se han eliminado fosfátidos hidratables mediante un procedimiento de desgomado acuoso previo se liberan de fosfátidos no hidratables mediante tratamiento enzimático usando una fosfolipasa de la invención. El procedimiento puede ser suave, económico y amigable para el medioambiente. Las fosfolipasas que sólo hidrolizan lisolecitina, pero no lecitina, se usan en este procedimiento de desgomado.

En un aspecto, para permitir que la enzima de la invención actúe, ambas fases, la fase oleosa y la fase acuosa que contiene la enzima, se deben mezclar íntimamente. Puede no ser suficiente agitarlas simplemente. La buena dispersión de la enzima en el aceite es ayudada si se disuelve en una pequeña cantidad de agua, por ejemplo 0,55% en peso (con relación al aceite), y se emulsiona en el aceite en esta forma, para formar gotitas de menos de 10 micrómetros de diámetro (media ponderal). Las gotitas pueden ser menores de 1 micrómetro. La agitación turbulenta se puede realizar con velocidades radiales por encima de 100 cm/s. El aceite también se puede hacer circular en el reactor usando una bomba giratoria externa. La fase acuosa que contiene la enzima también se puede dispersar finamente por medio de acción de ultrasonidos. Se puede usar un aparato de dispersión.

La reacción enzimática tiene lugar probablemente en la superficie frontera entre la fase oleosa y la fase acuosa. Es el objetivo de todas estas medidas para el mezclamiento crear la superficie más grande posible para la fase acuosa que contiene la enzima. La adición de tensioactivos aumenta la microdispersión de la fase acuosa. En algunos casos, por lo tanto, se añaden a la disolución enzimática tensioactivos con valores de HLB por encima de 9, tales como dodecilsulfato de sodio, como se describe, por ejemplo, en el documento EP-A 0513709. Un método eficaz similar para mejorar el emulsionamiento es la adición de lisolecitina. Las cantidades añadidas pueden estar en el intervalo de 0,001% a 1%, con referencia al aceite. La temperatura durante el tratamiento enzimático no es crítica. Se pueden usar temperaturas entre 20ºC y 80ºC, pero esta última sólo se puede aplicar durante un tiempo corto. En este aspecto, se usa una fosfolipasa de la invención que tiene una buena tolerancia a la temperatura y/o al pH bajo. Son óptimas las temperaturas de aplicación entre 30ºC y 50ºC. El período de tratamiento depende de la temperatura, y se puede mantener más corto al incrementar la temperatura. Generalmente son suficientes los tiempos de 0,1 a 10 horas, o 1 a 5 horas. La reacción tiene lugar en un reactor de desgomado, que se puede dividir en etapas, como se describe, por ejemplo, en el documento DE-A 4339556. Por lo tanto, es posible la operación continua, junto con la operación discontinua. La reacción se puede llevar a cabo en etapas de temperatura diferentes. Por ejemplo, la incubación puede tener lugar durante 3 horas a 40ºC, después durante 1 hora a 60ºC. Si la reacción transcurre en etapas, esto también abre la posibilidad de ajustar diferentes valores de pH en las etapas individuales. Por ejemplo, en la primera etapa, el pH de la disolución se puede ajustar a 7, por ejemplo, y en una segunda etapa a 2,5, añadiendo ácido cítrico. Sin embargo, en al menos una etapa, el pH de la disolución enzimática debe estar por debajo de 4, o por debajo de 3. Si el pH se ajusta subsiguientemente por debajo de este nivel, se puede encontrar un deterioro del efecto. Por lo tanto, el ácido cítrico se puede añadir a la disolución enzimática antes de que ésta última se mezcle en el aceite.

Tras terminar el tratamiento enzimático, la disolución enzimática, junto con los productos de descomposición del NHP contenido en ella, se puede separar de la fase oleosa, por lotes o de forma continua, por ejemplo por medio de centrifugación. Puesto que las enzimas se caracterizan por un nivel elevado de estabilidad, y la cantidad de los productos de descomposición contenidos en la disolución es pequeña (pueden precipitar como lodo), la misma fase enzimática acuosa se puede usar varias veces. También existe la posibilidad de liberar la enzima del lodo, véase, por ejemplo, el documento DE-A 4339556, de manera que se puede usar nuevamente una disolución enzimática que está esencialmente libre de lodo. En un aspecto de este procedimiento de desgomado, se obtienen aceites que contienen menos de 15 ppm de fósforo. Un objetivo son contenidos de fósforo menores de 10 ppm, o menores de 5 ppm. Con contenidos de fósforo por debajo de 10 ppm, es fácilmente posible el procesamiento adicional del aceite según el procedimiento de desacidificación destilativa. Un número de otros iones, tales como magnesio, calcio, cinc, así como hierro, se puede eliminar del aceite, por ejemplo por debajo de 0,1 ppm. De este modo, este producto posee prerrequisitos ideales para una buena resistencia a la oxidación durante el procesamiento y almacenamiento posteriores.

Las fosfolipasas y métodos de la descripción también se pueden usar para reducir la cantidad de componentes que contienen fósforo en aceites vegetales y animales como se describe, por ejemplo, en la patente europea EP 0513709. En este método, el contenido de componentes que contienen fósforo, especialmente fosfátidos, tales como lecitina, y el contenido de hierro en aceites vegetales y animales, que se han deslodado previamente, por ejemplo aceite de soja, se reducen mediante ruptura enzimática usando una fosfolipasa A1, A2 o B de la descripción.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar para refinar grasa o aceites como se describe, por ejemplo, en el documento JP 06306386. La invención proporciona procedimientos para refinar una grasa o aceite, que comprenden una etapa de convertir un fosfolípido en una grasa o un aceite en una sustancia soluble en agua que contiene grupos fosfóricos, y eliminar esta sustancia. La acción de una enzima de la invención (por ejemplo, una PLC) se utiliza para convertir el fosfolípido en la sustancia. De este modo, es posible refinar una grasa

o aceite sin llevar a cabo una etapa de refinado alcalino a partir de la que se producen desechos industriales que contienen agua de desecho alcalina y una gran cantidad de aceite. La mejora de los rendimientos se puede lograr debido a que la pérdida de grasa o aceite neutro del escape de los desechos se puede reducir a cero. En un aspecto, las sustancias gomosas se convierten en sustancias solubles en agua y se eliminan como sustancias solubles en agua añadiendo una enzima de la invención que tiene una actividad de fosfolipasa C en la etapa de desgomado del aceite bruto y llevando a cabo el tratamiento enzimático. En un aspecto, la fosfolipasa C de la invención tiene una actividad que corta enlaces de éster de glicerina con ácido fosfórico en fosfolípidos. Si es necesario, el método puede comprender lavar el aceite tratado con enzima con agua o una disolución acuosa ácida. En un aspecto, la enzima de la invención se añade a y se hace reaccionar con el aceite bruto. La cantidad de fosfolipasa C empleada puede ser 10 a 10.000 unidades, o alrededor de 100 a 2.000 unidades, por 1 kg de aceite bruto.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar para procedimientos de desgomado con agua como se describe, por ejemplo, en Dijkstra, Albert J., et al., Oleagineux, Corps Gras, Lipides (1998), 5(5), 367-370. En este método ejemplar, el procedimiento de desgomado con agua se usa para la producción de lecitina y para procedimientos de desgomado en seco que usan un ácido de desgomado y tierra de blanqueo. Este método puede ser económicamente factible sólo para aceites con un bajo contenido de fosfátido, por ejemplo aceite de palma, aceites láuricos, etc. Para aceites de semillas que tienen un contenido elevado de NHP, se usa el procedimiento de refinado ácido, con lo que este procedimiento se lleva a cabo en el molino de aceite para permitir el desecho de la goma vía la harina. En un aspecto, este aceite refinado con ácido es una operación de “pulido” posible a llevar a cabo antes del refinado físico.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar para procedimientos de desgomado como se describen, por ejemplo, en Dijkstra, et al., Res. Dev. Dep., N.V. Vandemoortele Coord. Cent., Izegem, Belg. JAOCS,

J. Am. Oil Chem. Soc. (1989), 66:1002-1009. En este método ejemplar, el procedimiento de desgomado total implica dispersar un ácido, tal como H3PO4 o ácido cítrico, en aceite de haba de soja, permitir un tiempo de contacto, y mezclar después una base, tal como sosa cáustica o silicato de sodio, en la emulsión de ácido en aceite. Esto mantiene el grado de neutralización suficientemente bajo para evitar formar jabones, debido a que eso conduciría a una mayor pérdida de aceite. Subsiguientemente, el aceite se hace pasar a un separador centrífugo en el que la mayoría de las gomas se eliminan de la corriente de aceite para producir una fase de goma con un contenido mínimo de aceite. La corriente de aceite se hace pasar entonces a un segundo separador centrífugo para eliminar todas las gomas que quedan para producir una fase de goma diluida, que se recicla. El lavado y el secado o el refinado alcalino en línea completan el procedimiento. Tras la adopción del procedimiento de desgomado total, en comparación con el procedimiento de refinado alcalino clásico, se obtiene una mejora del rendimiento global de alrededor de 0,5%. El aceite desgomado totalmente se puede refinar subsiguientemente de forma alcalina, se puede blanquear y desodorizar, o se puede blanquear y refinar físicamente.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar para la eliminación de fosfolípidos no hidratables a partir de un aceite vegetal, por ejemplo aceite de haba de soja, como se describe, por ejemplo, en Hvolby, et al., Sojakagefabr., Copenhagen, Den., J. Amer. Oil Chem. Soc. (1971) 48:503-509. En este método ejemplar, el aceite desgomado con agua se mezcla a diferentes valores de pH fijos con disoluciones tampón con y sin Ca++, reactivos de unión a Mg/Ca, y tensioactivos. Los fosfolípidos no hidratables se pueden eliminar en un estado no convertido

como un componente de micelas o de emulsionantes mixtos. Además, los fosfolípidos no hidratables son eliminables mediante conversión en formas disociadas, por ejemplo mediante eliminación de Mg y Ca de los fosfatidatos, lo que se puede lograr mediante acidulación o mediante tratamiento con reactivos complejantes de Mg/Ca o precipitantes de Mg/Ca. La eliminación o conversión química de los fosfolípidos no hidratables puede dar como resultado la formación reducida de emulsión y la separación mejorada del aceite desacidificado a partir de la capa de emulsión y la grasa para jabón.

Las fosfolipasas y métodos de la descripción también se pueden usar para el desgomado de aceites vegetales como se describe, por ejemplo, Buchold, et al., Frankfurt/Main, Alemania. Fett Wissenschaft Technologie (1993), 95(8), 300-304. En este procedimiento para el desgomado de aceites vegetales comestibles, se usan suspensiones acuosas de una enzima de la descripción, por ejemplo fosfolipasa A2, para hidrolizar el ácido graso unido a la posición sn2 del fosfolípido, dando como resultado 1-acil-lisofosfolípidos que son insolubles en aceite y de este modo más susceptibles a la separación física. Incluso la adición de pequeñas cantidades correspondientes a alrededor de 700 unidades de lecitasa/kg de aceite da como resultado una concentración residual de P menor que 10 ppm, de manera que el refinado químico es sustituible por el refinado físico, eliminando la necesidad de neutralización, división de la grasa para jabón, y tratamiento con agua de desecho.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar para el desgomado de aceites vegetales como se describe, por ejemplo, por EnzyMax. Dahlke, Klaus. Dept. G-PDO, Lurgi Ol-Gas, Chemie, GmbH, Frankfurt, Alemania. Oleagineux, Corps Gras, Lipides (1997), 4(1), 55-57. Este procedimiento ejemplar es un procedimiento de desgomado para el refinado físico de casi cualquier tipo de aceite. Mediante una hidrólisis catalizada enzimáticamente, los fosfátidos se convierten en lisofosfátidos solubles en agua, que se separan del aceite mediante centrifugación. El contenido de fósforo residual en el aceite desgomado enzimáticamente puede ser tan bajo como 2 ppm de P.

Las fosfolipasas y métodos de la invención también se pueden usar para el desgomado de aceites vegetales como se describe, por ejemplo, por Cleenewerck, et al., N.V. Vamo Mills, Izegem, Belg. Fett Wissenschaft Technologie (1992), 94:317-22; y, Clausen, Kim; Nielsen, Munk. Novozymes A/S, Den. Dansk Kemi (2002) 83(2):24-27. Las fosfolipasas y métodos de la invención pueden incorporar el refinado previo de aceites vegetales con ácidos como se describe, por ejemplo, por Nilsson-Johansson, et al., Fats Oils Div., Alfa-Laval Food Eng. AB, Tumba, Swed. Fett Wissenschaft Technologie (1988), 90 (11), 447-51; y, Munch, Ernst W. Cereol Deutschland GmbH, Mannheim, Alemania. Editore(s): Wilson, Richard F. Proceedings of the World Conference on Oilseed Processing Utilization, Cancun, Mexico, Nov. 12-17, 2000 (2001), Meeting Date 2000, 17-20.

Las fosfolipasas y métodos de la descripción también se pueden usar para el desgomado de aceites vegetales como se describe, por ejemplo, por Jerzewska, et al., Inst. Przemyslu Miesnego i Tluszczowego, Warsaw, Pol., Tluszcze Jadalne (2001), 36(3/4), 97-110. En este procedimiento de la invención, el desgomado enzimático de aceite de colza hidratado con bajo contenido de ácido erúcico es mediante el uso de una fosfolipasa A2 de la descripción. La enzima puede catalizar la hidrólisis de enlaces de éster de ácido graso al átomo de carbono central del resto de glicerol en fosfolípidos. Puede hidrolizar fosfolípidos no hidratables a sus lisocompuestos hidratables correspondientes. Con una preparación enzimática no purificada, se pueden lograr mejores resultados con la adición de una preparación del 2% durante 4 horas (87% de eliminación de P).

Purificación de fitosteroles a partir de aceites vegetales

La invención proporciona métodos para purificar fitosteroles y triterpenos, o esteroles vegetales, a partir de aceites vegetales. Los fitosteroles que se pueden purificar usando fosfolipasas y métodos de la invención incluyen !sitosterol, campesterol, estigmasterol, estigmastanol !-sitostanol, sitostanol, desmosterol, calinasterol, poriferasterol, clionasterol y brasicasterol. Los esteroles vegetales son productos agrícolas importantes para las industrias de la salud y de la nutrición. De este modo, las fosfolipasas y métodos de la invención se usan para obtener emulsionantes para fabricantes cosméticos e intermedios esteroideos y precursores para la producción de fármacos hormonales. Las fosfolipasas y métodos de la invención se usan para obtener (por ejemplo, purificar) análogos de fitosteroles y sus ésteres para uso como agentes reductores de colesterol con beneficios sanitarios cardiológicos. Las fosfolipasas y métodos de la invención se usan para purificar esteroles vegetales para reducir los niveles séricos de colesterol inhibiendo la absorción de colesterol en la luz intestinal. Las fosfolipasas y métodos de la invención se usan para purificar esteroles vegetales que tienen propiedades inmunomoduladoras a concentraciones extremadamente bajas, incluyendo respuesta celular potenciada de linfocitos T, y la capacidad citotóxica de células asesinas naturales contra una estirpe celular de cáncer. Las fosfolipasas y métodos de la invención se usan para purificar esteroles vegetales para el tratamiento de tuberculosis pulmonar, artritis reumatoide, manejo de pacientes infectados con VIH, e inhibición de estrés inmunitario, por ejemplo en corredores de maratón.

Las fosfolipasas y métodos de la invención se usan para purificar componentes de esteroles presentes en las fracciones de esteroles de aceites vegetales de primera necesidad (por ejemplo, aceites de coco, cánola, manteca de cacao, maíz, algodón, lino, oliva, palma, cacahuete, salvado de arroz, alazor, sésamo, haba de soja, girasol), tales como sitosterol (40,2-92,3%), campesterol (2,6-38,6%), estigmasterol (0-31%) y 5-avenasterol (1,5-29%).

Los métodos de la invención pueden incorporar el aislamiento de esteroles derivados de plantas en oleaginosas

mediante extracción con disolventes con cloroformo-metanol, hexano, cloruro de metileno, o acetona, seguido de la saponificación y purificación cromatográfica para obtener esteroles totales enriquecidos. Como alternativa, las muestras vegetales se pueden extraer mediante extracción con fluido supercrítico con dióxido de carbono supercrítico, para obtener extractos lipídicos totales a partir de los cuales se pueden enriquecer y aislar los esteroles. Para la caracterización y cuantificación subsiguientes de los compuestos de esterol, el aislado bruto se puede purificar y separar mediante una amplia variedad de técnicas cromatográficas, incluyendo cromatografía en columna (CC), cromatografía de gases, cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC) de fase normal, HPLC de fase inversa, y electrocromatografía capilar. De todas las técnicas de aislamiento y separación cromatográficas, los procedimientos de CC y TLC emplean los ensayos más accesibles, asequibles y adecuados para la limpieza, purificación de muestras, ensayos cualitativos y estimados preliminares de los esteroles en muestras de ensayo.

Los fitosteroles se pierden en los aceites vegetales como subproductos durante los procedimientos de refinado de aceites comestibles. Las fosfolipasas y métodos de la invención usan fitosteroles aislados de tales subproductos para obtener productos enriquecidos en fitosteroles aislados a partir de tales subproductos. Los métodos de aislamiento y purificación de fitosteroles de la invención pueden incorporar subproductos de la industria del procesamiento de aceites, y pueden comprender operaciones tales como destilación molecular, extracción líquidolíquido y cristalización.

Los métodos de la invención pueden incorporar procedimientos para la extracción de lípidos para extraer fitosteroles. Por ejemplo, los métodos de la invención pueden usar disolventes no polares como hexao (usado habitualmente para extraer la mayoría de los tipos de aceites vegetales) para extraer cuantitativamente fitosteroles libres y ésteres de ácidos grasos fitosterílicos. Los glucósidos esterílicos y los glucósidos esterílicos acilados grasos se extraen sólo parcialmente con hexano, y el incremento de la polaridad del disolvente da un mayor porcentaje de extracción. Un procedimiento que se puede usar es el método de cloroformo-metanol de Bligh y Dyer para la extracción de todas las clases de lípidos de esterol, incluyendo fosfolípidos. Un método ejemplar tanto para separar cualitativamente como para analizar cuantitativamente las clases de lípidos de fitosteroles comprende la inyección del extracto lipídico en el sistema de HPLC.

Las fosfolipasas y métodos de la invención se pueden usar para eliminar esteroles de grasas y aceites, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 6.303.803. Este es un método para reducir el contenido de esterol de las grasas y aceites que contienen esteroles. Es un procedimiento eficiente y eficaz desde el punto de vista del coste, basado en la afinidad del colesterol y otros esteroles por moléculas anfipáticas que forman bicapas fluidas hidrófobas, tales como bicapas fosfolipídicas. Los agregados de fosfolípidos se ponen en contacto, por ejemplo, con una grasa o aceite que contiene esterol en un medio acuoso, y después se mezclan. La estructura molecular de esta mezcla fosfolipídica agregada tiene una elevada afinidad por el colesterol y otros esteroles, y puede eliminar selectivamente tales moléculas de grasas y aceites. La mezcla de separación acuosa se mezcla durante un tiempo suficiente para reducir selectivamente el contenido de esterol del producto graso/oleoso a través del reparto del esterol en la porción de los agregados fosfolipídicos. La grasa o aceite con un contenido reducido de esterol se separa de la mezcla de separación acuosa. Como alternativa, la fracción correspondientemente enriquecida en esterol también se puede aislar de la mezcla de separación acuosa. Estas etapas se pueden llevar a cabo a temperaturas ambientes, los costes implicados en el calentamiento se minimizan, así como la posibilidad de degradación térmica del producto. Adicionalmente, se necesita una cantidad mínimo de equipo, y puesto que todos los materiales requeridos son de grado alimentario, los métodos no requieren precauciones especiales con respecto a la manipulación, eliminación de desechos, o contaminación del producto o productos finales.

Las fosfolipasas y métodos de la invención se pueden usar para eliminar esteroles de grasas y aceites, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.880.300. Los agregados fosfolipídicos se ponen en contacto con, por ejemplo, grasa o aceite que contiene esterol en un entorno acuoso, y después se mezclan. Tras el mezclamiento adecuado, la grasa o aceite con contenido reducido de esterol se separa de la mezcla de separación acuosa. Como alternativa, el fosfolípido correspondientemente enriquecido en esterol también se puede aislar de la mezcla de separación acuosa. Los aceites de plantas (por ejemplo, vegetales) contienen esteroles vegetales (fitosteroles) que también se pueden eliminar usando los métodos de la presente invención. Este método es aplicable a un producto graso/oleoso en cualquier etapa de un ciclo de procesamiento comercial. Por ejemplo, el procedimiento de la invención se puede aplicar a aceites refinados, blanqueados y desodorizados (“aceites RBD”), o a cualquier etapa del procesamiento antes de lograr el estado de RBD. Aunque el aceite RBD puede tener una densidad alterada en comparación con el aceite pre-RBD, los procedimientos se adaptan fácilmente a aceites RBD o pre-RBD, o a diversos otros productos grasos/oleosos, mediante variación del contenido de fosfolípidos, composición de fosfolípidos, relaciones fosfolípido:agua, temperatura, presión, condiciones de mezclamiento, condiciones de separación, como se describe más abajo.

Como alternativa, las enzimas y métodos de la invención se pueden usar para aislar fitosteroles u otros esteroles en etapas intermedias en el procesamiento de aceites. Por ejemplo, se sabe que los fitosteroles se pierden durante la desodorización de los aceites vegetales. Una fracción de destilado que contiene esterol, procedente por ejemplo de una etapa intermedia del procesamiento, se puede someter a los procedimientos de extracción de esterol descritos anteriormente. Esto proporciona una lecitina enriquecida en esterol u otro material fosfolipídico, que se puede procesar posteriormente a fin de recuperar los esteroles extraídos.

Composiciones detergentes

Las composiciones detergentes pueden comprender una o más fosfolipasa de la invención, y métodos para obtener y usar estas composiciones. Para los métodos para obtener y usar composiciones detergentes, véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.413.928; 6.399.561; 6.365.561; 6.380.147. Las composiciones detergentes pueden ser una composición acuosa de una o dos partes, una composición líquida no acuosa, un sólido moldeado, una forma granular, una forma en partículas, un comprimido prensado, un gel y/o una pasta y una forma en suspensión. Los métodos capaces de eliminar rápidamente manchas gruesas de alimento, películas de restos de alimento, u otras composiciones menores de alimentos, usan estas composiciones detergentes. Las fosfolipasas de la invención pueden facilitar la eliminación de manchas por medio de hidrólisis catalítica de fosfolípidos. Las fosfolipasas de la invención se pueden usar en detergentes lavavajillas y en detergentes para la colada.

El contenido de enzima activa real depende del método de fabricación de una composición detergente, y no es crítico, suponiendo que la disolución detergente tenga la actividad enzimática deseada. En un aspecto, la cantidad de fosfolipasa presente en la disolución final oscila desde alrededor de 0,001 mg a 0,5 mg por gramo de la composición detergente. La enzima particular escogida para uso en el procedimiento y productos de esta invención depende de las condiciones de utilidad final, incluyendo la forma física del producto, pH de uso, temperatura de uso, y tipos de suciedades a degradar o alterar. La enzima se puede escoger para proporcionar actividad y estabilidad óptimas para cualquier conjunto dado de condiciones de utilidad. En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención son activos en los intervalos de pH de alrededor de 4 a alrededor de 12, y en el intervalo de temperatura de alrededor de 20ºC a alrededor de 95ºC. Los detergentes de la invención pueden comprender tensioactivos catiónicos, no iónicos semipolares o zwitteriónicos; o sus mezclas.

Las fosfolipasas de la presente invención se pueden formular en detergentes en polvo y líquidos que tienen pH entre 4,0 y 12,0 a niveles de alrededor de 0,01 a alrededor de 5% (preferiblemente 0,1% a 0,5%) en peso. Estas composiciones detergentes también pueden incluir otras enzimas, tales como proteasas, celulasas, lipasas o endoglucosidasas conocidas, así como mejoradores de los detergentes y estabilizantes. La adición de fosfolipasas de la invención a composiciones de limpieza convencionales no crea ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, también es adecuada cualquier temperatura y pH adecuado para el detergente para las presentes composiciones, en tanto que el pH esté dentro del intervalo anterior, y la temperatura esté por debajo de la temperatura de desnaturalización de la enzima descrita. Además, los polipéptidos de la invención se pueden usar en una composición de limpieza sin detergentes, nuevamente ya sea sola o en combinación con mejoradores del detergente y estabilizantes.

La presente invención proporciona composiciones de limpieza que incluyen composiciones detergentes para limpiar superficies duras, composiciones detergentes para limpiar tejidos, composiciones lavavajillas, composiciones para la limpieza oral, composiciones para la limpieza de la dentadura, y disoluciones limpiadoras de lentes de contacto.

Un método para lavar un objeto puede comprender poner en contacto el objeto con una fosfolipasa de la invención en condiciones suficientes para el lavado. Una fosfolipasa de la invención se puede incluir como un aditivo detergente. La composición detergente de la invención se puede formular, por ejemplo, como una composición detergente para la colada a mano o a máquina, que comprende una fosfolipasa de la invención. Un aditivo para la colada, adecuado para el pretratamiento de tejidos manchados, puede comprender una fosfolipasa de la invención. Una composición suavizante de tejidos puede comprender una fosfolipasa de la invención. Como alternativa, una fosfolipasa de la invención se puede formular como una composición detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas generales. En aspectos alternativos, los aditivos detergentes y composiciones detergentes de la invención pueden comprender una o más enzimas tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, otra fosfolipasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una manasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo una lactasa, y/o una peroxidasa. Las propiedades de la enzima o enzimas de la invención se escogen para que sean compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la enzima o enzimas están presentes en cantidades eficaces. En un aspecto, las enzimas de fosfolipasa de la invención se usan para eliminar materiales de mal olor de los tejidos. Diversas composiciones detergentes y métodos para obtenerlas que se pueden usar en la práctica de la invención se describen, por ejemplo, en las patentes U.S. nos 6.333.301; 6.329.333; 6.326.341; 6.297.038; 6.309.871; 6.204.232; 6.197.070; 5.856.164.

Tratamiento de desechos

Las fosfolipasas de la invención se pueden usar en el tratamiento de desechos. Un procedimiento de digestión de desechos sólidos puede usar fosfolipasas de la invención. Los métodos pueden comprender reducir la masa y volumen de un desecho sólido sustancialmente no tratado. El desecho sólido se puede tratar con un procedimiento digestivo enzimático en presencia de una disolución enzimática (que incluye fosfolipasas de la invención) a una temperatura controlada. El desecho sólido se puede convertir en un desecho licuado y cualquier desecho sólido residual. El desecho licuado resultante se puede separar de cualquier desecho solidificado residual. Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.709.796.

Otros usos para las fosfolipasas de la invención

Las fosfolipasas de la invención también se pueden usar para estudiar el sistema de señalización de fosfoinositida (PI); en el diagnóstico, pronóstico y desarrollo de tratamiento de trastornos bipolares (véase, por ejemplo, Pandey (2002) Neuropsychopharmacology 26:216-228); como antioxidantes; como fosfolípidos modificados; como agentes espumantes y de gelación; para generar lípidos angiogénicos para vascularizar tejidos; para identificar fosfolipasa PLC, moduladores (agonistas o antagonistas), por ejemplo inhibidores para uso como antineoplásicos, agentes antiinflamatorios y como agentes analgésicos. Se pueden usar para generar fosfolípidos ácidos para controlar el sabor amargo en alimentos y fármacos. Se pueden usar en la purificación de grasas. Se pueden usar para identificar inhibidores peptídicos para el tratamiento de enfermedades víricas, inflamatorias, alérgicas y cardiovasculares. Se pueden usar para obtener vacunas. Se pueden usar para obtener glicéridos de ácidos grasos poliinsaturados y fosfatidilgliceroles.

Las fosfolipasas de la invención, enzimas de PLC, se usan para generar inmunotoxinas y diversos compuestos terapéuticos para tratamientos contra el cáncer.

Las fosfolipasas de la invención se pueden usar conjuntamente con otras enzimas para decolorar (es decir, eliminar la clorofila) y en detergentes (véase anteriormente), por ejemplo conjuntamente con otras enzimas (por ejemplo, lipasas, proteasas, esterasas, fosfatasas).

La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se entenderá que la invención no está limitada a tales ejemplos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: PROGRAMA BLAST USADO PARA EL PERFIL DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS

Este ejemplo describe un programa ejemplar de identificación de secuencias para determinar si un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención. Se usa un programa BLAST 2.2.2 de NCBI, con opciones por defecto de blastp. Se usaron todos los valores por defecto excepto para el ajuste del filtro por defecto (es decir, todos los parámetros se ajustaron por defecto excepto el filtrado, que se ajustó a OFF); en su lugar se usa un ajuste “-F F”, que inhabilita el filtrado. El uso del filtrado por defecto da a menudo como resultado violaciones de Karlin-Altschul debido a la longitud corta de secuencia. Los valores por defecto usados en este ejemplo:

“Filtro para baja complejidad: ON

> Tamaño de palabra: 3

> Matriz: Blosum62

> Costes de salto: Existencia: 11

> Extensión: 1”

Otros ajustes por defecto fueron: filtro para baja complejidad OFF, tamaño de palabra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalización de existencia de salto de -11 y penalización de extensión de salto de -1. La opción “-W” se ajustó por defecto a 0. Esto significa que, si no se ajusta, los defectos para el tamaño de palabra es 3 para las proteínas y 11 para nucleótidos. Las lecturas de los parámetros:

<<README.bts.txt>>

> argumentos de blastall:

> -p Nombre del programa [String]

> -d Base de datos [String] > defecto = nr > -i Archivo de consulta [File In]

> defecto = stdin > -e Valor de expectativa (E) [Real]

> defecto = 10,0 > -m opciones de vista de alineamiento:

> 0 = por pares, > 1 = anclado a consulta que muestra identidades, > 2 = anclado a consulta que no muestra identidades, > 3 = anclado a consulta plana, muestra identidades,

> 4 = anclado a consulta plana, sin identidades, > 5 = anclado a consulta, sin identidades y extremos romos,

> 6 = anclado a consulta plana, sin identidades y extremos romo, > 7 = salida XML Blast, > 8 = tabular, > 9 tabular con líneas de comentario [Número entero] > defecto = 0 > -o Archivo de salida de informe BLAST [salida de archivo] Opcional > defecto = stdout > -F Secuencia de consulta de filtro (DUST con blastn, SEG con otros) [String] > defecto = T > -G Coste para abrir un salto (cero invoca comportamiento por defecto) [Numero entero] > defecto = 0 > -E Coste para extender un salto (cero invoca comportamiento por defecto) [Numero entero] > defecto = 0 >-X X Valor de caída para alineamiento con saltos (en bits) (cero invoca comportamiento por defecto) [Numero > entero] > defecto = 0 > -I Muestra GI’s en deflines [T/F] > defecto = F > -q Penalización para un desemparejamiento nucleotídico (sólo blastn) [Número entero] > defecto = -3 > -r Premio para un emparejamiento nucleotídico (sólo blastn) [Número entero] > defecto = 1 > -v Número de secuencias de bases de datos para mostrar descripciones de una línea para (V) [Número entero] > defecto = 500 > -b Número de secuencias de bases de datos para mostrar alineamientos para (B) [Número entero] > defecto = 250 > -f Umbral para extender resultados, defecto si cero [Número entero] > defecto = 0 > -g Llevar a cabo alineamiento con saltos (no disponible con tblastx) [T/F] > defecto = T > -Q Código genético de búsqueda a usar [Número entero] > defecto = 1 > -D Código genético DB (para tblast[nx] sólo) [Número entero] > defecto = 1 > -a Número de procesadores a usar [Número entero] > defecto = 1 > -O Archivo SeqAlign [Salida de archivo] Opcional > -J Cree la búsqueda defline [T/F] > defecto = F > -M Matriz [String] > defecto = BLOSUM62 > -W Tamaño de palabra, defecto si es cero [Número entero] > defecto = 0 > -z Longitud efectiva de la base de datos (úsese cero para el tamaño real) [String] > defecto = 0 > -K Número de mejores resultados de una region a mantener (defecto offby, si se usa se recomienda un valor de 100) [Número entero] > defecto = 0 > -P 0 para multiples resultados 1-pasada, 1 para un solo resultado 1-pasada, 2 para 2-pasada > [Número entero] > defecto = 0 > -Y Longitud efectiva del espacio de búsqueda (úsese cero para el tamaño real) > [Real] > defecto = 0 > -S Hebras de consulta para buscar frente a base de datos (para blast[nx], y tblastx). 3 es ambos, 1 es parte superior, 2 es parte inferior [Número entero] > defecto = 3 > -T Produce salida HTML [T/F] > defecto = F > -1 Búsqueda restringida de base de datos para listar GI’s [String] Opcional > -U Usar filtrado de letra minúscula de secuencia FASTA [T/F] Opcional > defecto = F > -y Caída (X) para extensiones blast en bits (0.0 invoca comportamiento por defecto) [Real] > defecto = 0.0 > -Z Valor de caída X para alineamiento con saltos final (en bits) [Número entero] > defecto = 0

> -R archivo de punto de comprobación PSI-TBLASTN [File In] Opcional > -n búsqueda MegaBlast [T/F] > defecto = F > -L Localización en la secuencia de consulta [String] Opcional > -A Tamaño de ventana de múltiples resultados (cero para algoritmo de un solo resultado) [Número entero] > defecto = 40

EJEMPLO 2: SIMULACIÓN DE DESGOMADO MEDIADO POR PLC

Este ejemplo describe la simulación de desgomado mediado por fosfolipasa C (PLC).

Debido a su mala solubilidad en agua, originalmente se disolvió fosfatidilcolina (PC) en etanol (100 mg/ml). Para el ensayo inicial, se preparó una disolución madre de PC en 50 mM de ácido 3-morfolinopropanosulfónico o 60 mM de ácido cítrico/NaOH a pH 6. La disolución madre de PC (10 ∀l, 1 ∀g/∀l) se añadió a 500 ∀l de aceite de haba de soja refinado (2% de agua) en un tubo Eppendorf. Para generar una emulsión, el contenido del tubo se mezcló durante 3 minutos mediante remolino (véase Fig. 5A). La fase oleosa y la fase acuosa se separaron mediante centrifugación durante 1 minuto a 13.000 rpm (Fig. 5B). Los tubos de reacción se preincubaron a la temperatura deseada (37ºC, 50ºC, o 60ºC), y se añadieron 3 ∀l de PLC procedente de Bacillus cereus (0,9 U∀l) a la fase acuosa (Fig. 5C). La desaparición de PC se analizó mediante TLC usando cloroformo/metanol/agua (65:25:4) como un sistema disolvente (véase, por ejemplo, Taguchi (1975) más arriba), y se visualizó tras la exposición a vapor de I2.

La Figura 5 ilustra esquemáticamente un sistema modelo de dos fases para la simulación del desgomado mediado por PLC. Fig. 5A: Generación de emulsión mezclando aceite bruto con 2% de agua para hidratar los fosfáticos contaminantes (P). Fig. 5B: Las fases oleosa y acuosa se separaron después de la centrifugación, y se añadió PLC a la fase acuosa, que contiene los fosfátidos precipitados (“gomas”). La hidrólisis de PLC tiene lugar en la fase acuosa. Fig. 5C: El transcurso de tiempo de la reacción se monitoriza extrayendo alícuotas de la fase acuosa y analizándolas mediante TLC.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Svetlana Gramatikoya, Nelson Barton Geoff Hazlewood, David Lam

<120> FOSFOLIPASAS, ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN YH MÉTODOS PARA OBTENERLAS Y USARLAS

<130> 09010-094001

<140>

<150>

<160> 106

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 849

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 1

<210> 2

<211> 282

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(24) 10 <400> 2

<210> 3

<211> 852

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental. <400>3

<210> 4

<211> 283

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(24) 10 <400> 4

<210> 5

<211> 843

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 5

<210> 6

<211> 280 10 <212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL 15 <222> (1)...(24)

<400> 6

<210> 7

<211> 963

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 7

<210> 8

<211> 320

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(29) 10 <400> 8

<210> 9

<211> 999

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 9

<210> 10

<211> 332

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20) 10 <400> 10

<210> 11

<211> 1041

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 11

<210> 12

<211> 346

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 12

<210> 13

<211> 1038

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 13

<210> 14

<211> 345

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 14

<210> 15

<211> 1344

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 15

<210> 16

<211> 447

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 16

<210> 17

<211> 1137

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 17

<210> 18

<211> 378

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 18

<210> 19

<211> 1248

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 19

<210> 20

<211> 415 5 <212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL 10 <222> (1)...(19)

<400> 20

<210> 21

<211> 1716

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 21

5 <210> 22

<211> 571

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 10 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(28)

<400> 22

<210> 23

<211> 1473

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 23

10 <210> 24

<211> 490

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 15 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 24

<210> 25

<211> 1098

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 25

<210> 26

<211> 365

<212> PRT

<213> Desconocida 10 <220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 26

<210> 27

<211> 1287

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 27

<210> 28

<211> 428

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 28

<210> 29

<211> 753

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 29

<210> 30

<211> 250

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 30

<210> 31

<211> 1422

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 31

<210> 32

<211> 473

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20) 10 <400> 32

<210> 33

<211> 792

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 33

10 <210> 34

<211> 263

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 15 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 34

<210> 35

<211> 1389

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 35

<210> 36

<211> 462

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 36

<210> 37

<211> 1329

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 37

<210> 38 10 <211> 443

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental. 15 <221> SEÑAL

<222> (1)...(23)

<400> 38

<210> 39

<211> 1335

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 39

5 <210> 40

<211> 444

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 10 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 40

<210> 41

<211> 1419

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 41

<210> 42

<211> 472

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 42

<210> 43

<211> 1287

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 43

<210> 44

<211> 428

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 44

<210> 45

<211> 1038

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 45

10 <210> 46

<211> 345

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 15 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 46

<210> 47

<211> 1476

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 47

<210> 48

<211> 491

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 48

<210> 49

<211> 1257

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 49

<210> 50

<211> 418 5 <212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL 10 <222> (1)...(23)

<400> 50

<210> 51

<211> 1482

<212> ADN 123

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 51

<210> 52

<211> 493

<212> PRT

<213> Desconocida 10 <220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 52

<210> 53

<211> 1491

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 53

10 <210> 54

<211> 496

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 15 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 54

<210> 55

<211> 1041

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 55

<210> 56

<211> 346

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 56

<210> 57

<211> 1413

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 57

<210> 58

<211> 470

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 58

<210> 59

<211> 1038

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 59

10 <210> 60

<211> 345

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 15 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 60

<210> 61

<211> 1257

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 61

<210> 62

<211> 418

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(21) 10 <400> 62

<210> 63

<211> 1242

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 63

<210> 64

<211> 413

<212> PRT

<213> Desconocida 10 <220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(18)

<400> 64

<210> 65

<211> 1164

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 65

5 <210> 66

<211> 387

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 10 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 66

<210> 67

<211> 1419

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 67

<210> 68

<211> 472

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 68

<210> 69

<211> 1038

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 69

10 <210> 70

<211> 345

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 70

<210> 71

<211> 3264

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 71

<210> 72

<211> 1088

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 72

<210> 73

<211> 753

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 73

<210> 74

<211> 250

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 74

10 <210> 75

<211> 1335

<212> ADN

<213> Desconocido

<220> 15 <223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 75

<210> 76

<211> 444

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 76

<210> 77

<211> 1026

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 77

<210> 78

<211> 341

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 78

<210> 79

<211> 1701

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 79

<210> 80

<211> 566

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(23) 10 <400> 80

<210> 81

<211> 1422

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 81

10 <210> 82

<211> 473

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 15 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(25)

<400> 82

<210> 83

<211> 1290

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 83

<210> 84

<211> 429

<212> PRT 10 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(22) 15 <400> 84

<210> 85

<211> 1038

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 85

<210> 86

<211> 345

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 86

<210> 87

<211> 870

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 87

<210> 88

<211> 289

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 88

<210> 89

<211> 1422

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 89

<210> 90

<211> 473

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(25) 10 <400> 90

<210> 91

<211> 1035

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 91

10 <210> 92

<211> 344

<212> PRT

<213> Desconocida

<220> 15 <223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 92

<210> 93

<211> 963

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 93

<210> 94

<211> 320

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(29) 10 <400> 94

<210> 95

<211> 1038

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 95

<210> 96

<211> 345

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 96

<210> 97

<211> 1422

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 97

<210> 98

<211> 473

<212> PRT 5 <213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL

<222> (1)...(25) 10 <400> 98

<210> 99

<211> 1053

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 99

<210> 100

<211> 350

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 100

<210> 101

<211> 996

<212> ADN

<213> Bacteria

<400> 101

<210> 102 5 <211> 331

<212> PRT

<213> Bacteria

<220>

<221> SEÑAL 10 <222> (1)...(39)

<400> 102

<210> 103

<211> 2205

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 103

<210> 104

<211> 734

<212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<400> 104

<210> 105

<211> 756

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de una muestra medioambiental.

<400> 105

<210> 106

<211> 251 5 <212> PRT

<213> Desconocida

<220>

<223> Obtenida de una muestra medioambiental.

<221> SEÑAL 10 <222> (1)...(30)

<400> 106

Claims

REIVINDICACIONES

1. Ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende

(a)

una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID NO: 1;

(b)

una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEC ID nº 1, en la que el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa C,

(c)

un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID NO: 2, en la que el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa C;

(d)

la secuencia de ácido nucleico de (a), (b) o (c), pero que no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal;

(e)

la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (d), que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido o un polipéptido heterólogo; o

(f)

una secuencia de ácido nucleico totalmente complementaria a cualquiera de (a) a (e).
2. Sonda que comprende

(a)

el ácido nucleico aislado, sintético o recombinante según la reivindicación 1;

(b)

la sonda de (a), que comprende además un marcador detectable; o

(c)

la sonda de (b), en la que el marcado detectable comprende un isótopo radioactivo, un colorante fluorescente

o una enzima.
3.

Par de cebadores de amplificación, comprendiendo dicho par de cebadores un primer miembro que tiene una secuencia como se expone aproximadamente mediante los 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más primeros restos (en 5’) de SEC ID NO: 1; y

un segundo miembro que tiene una secuencia como se expone aproximadamente mediante los 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 ó más primeros restos (en 5’) de la hebra complementaria del primer miembro.
4.

Casete de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1.
5.

Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1.
6.

Célula transformada que comprende (a) un ácido nucleico exógeno, en el que el ácido nucleico exógeno comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1; o (b) un casete de expresión o un vector que comprende un ácido nucleico exógeno, comprendiendo dicho ácido nucleico exógeno el ácido nucleico según la reivindicación 1, siendo la célula una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal.
7.

Procedimiento de producción de un polipéptido recombinante que comprende las etapas de: (a) producir un ácido nucleico según la reivindicación 1; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permiten la expresión del polipéptido, produciendo de ese modo un polipéptido recombinante.
8.

Planta transgénica que comprende (a) un ácido nucleico exógeno, comprendiendo dicho ácido nucleico exógeno el ácido nucleico según la reivindicación 1; (b) un casete de expresión o un vector que comprende un ácido nucleico exógeno, comprendiendo dicho ácido nucleico el ácido nucleico según la reivindicación 1; (c) la célula transformada según la reivindicación 6; (d) la planta transgénica de (a), (b) o (c), siendo dicho planta una planta de maíz, una planta de sorgo, una planta de patata, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta oleaginosa, una planta de colza, una planta de soja, una planta de arroz, una planta de cebada, una planta gramínea, una planta de algodón, de palmera, de sésamo, una planta de cacahuete, una planta de girasol o una planta de tabaco.
9.

Semilla transgénica que comprende (a) un ácido nucleico exógeno, comprendiendo dicho ácido nucleico exógeno el ácido nucleico según la reivindicación 1; (b) un casete de expresión o un vector que comprende un ácido nucleico exógeno, comprendiendo dicho ácido nucleico el ácido nucleico según la reivindicación 1; (c) la célula transformada según la reivindicación 6; (d) la semilla transgénica de (a), (b) o (c), siendo dicha semilla una semilla de maíz, una semilla de trigo, una semilla de oleaginosas, una semilla de colza, una semilla de haba de soja, una pepita de palma, una semilla de girasol, una semilla de sésamo, una semilla de arroz, de cebada, de cacahuete, de algodón, de palma, de cacahuete, de sésamo, una semilla de girasol o una semilla de planta de tabaco.
10.

Polipéptido aislado, sintético o recombinante, que comprende:

(a)

una secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID NO: 2;

(b)

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2, teniendo dicho polipéptido una actividad de fosfolipasa C,

(c)

un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa C codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1;

(d)

una secuencia de aminoácidos de (a), (b) o (c), que tiene una actividad de fosfolipasa C, y que tiene al menos una sustitución conservativa de restos de aminoácidos;

(e)

la secuencia de aminoácidos de (d), comprendiendo dicha al menos una sustitución conservativa de restos de aminoácidos la sustitución de un aminoácido por otro de características similares;

(f)

la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a) a (e), pero que no comprende una secuencia señal;

(g)

la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a) a (f) que comprende además un péptido o polipéptido heterólogo; o

(h)

el polipéptido de (g), comprendiendo dicho polipéptido al menos un sitio de glucosilación.
11.

Polipéptido que comprende:

(a)

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2;

(b)

un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa C codificado por el ácido nucleico que tiene el menos 98% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1; o

(c)

el polipéptido de (a) o (b), pero que no comprende una secuencia señal.
12.

Composición que comprende un polipéptido como se expone en la reivindicación 10 u 11.
13.

Anticuerpo aislado (a) que se une específicamente a SEC ID NO: 2.
14.

Método de generación de una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, que comprende:

(i)

(a) proporcionar un ácido nucleico molde que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 (a), (b) o (c); y (b) modificar, suprimir o añadir uno o varios nucleótidos en la secuencia molde, o una combinación de estos, para generar una variante del ácido nucleico molde;

(ii)

el método de (i), que comprende además expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido de fosfolipasa variante;

(iii) el método de (i), en el que las modificaciones, adiciones o supresiones se introducen mediante un método que comprende PCR propensa a errores, barajado de partículas, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR por ensamblaje, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por casete, mutagénesis de conjunto recursivo, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje génico, mutagénesis de saturación de sitio génico (GSSM), reensamblaje por ligamiento sintético (SLR), recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex con saltos, mutagénesis por reparación de desemparejamiento de punto, mutagénesis de cepa hospedante deficiente en la reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por supresión, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, síntesis de gen artificial, mutagénesis de conjunto, creación de multímero de ácido nucleico quimérico, o una combinación de estos; o

(iv) el método de (iii), siendo dicho método repetido de manera iterativa hasta que se produzca una fosfolipasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de un polipétido codificado por el ácido nucleico molde.
15.

Método para hidrolizar, romper o interrumpir una composición que comprende un fosfolípidos, que comprende:

(i)

(a) producir un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, comprendiendo dicho polipéptido el polipéptido según la reivindicación 10 u 11; (b) producir una composición que comprende un fosfolípido; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que la fosfolipasa hidroliza, rompe o interrumpe la composición que comprende un fosfolípido;

(ii)

el método de (i), en el que la composición comprende una bicapa o una membrana lipídica que comprende un fosfolípido; o

(iii) el método de (i), en el que la composición comprende una célula vegetal, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula animal.
16.

Método de desgomado de un aceite, que comprende:

(i)

(a) producir una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, comprendiendo dicho polipéptido el polipéptido según la reivindicación 10 u 11; (b) producir una composición que comprende una grasa o un aceite que contiene un fosfolípido; y (c) poner en contacto dicho polipéptido de la etapa (a) y dicha composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido pueda catalizar la hidrólisis de un fosfolípido en dicha composición;

(ii)

el método de (i), en el que la composición que comprende un aceite comprende un aceite o grasa de planta, de animal, de alga o de pescado;

(iii) el método de (ii), en el que el aceite vegetal comprende un aceite de haba de soja, una aceite de colza, un aceite de maíz, un aceite de palma, un aceite de cánola, un aceite de girasol, un aceite de sésamo o un aceite de cacahuete;

(iv)

el método de (i), en el que dicho polipéptido hidroliza un fosfátido a partir de un fosfolípido hidratable o no hidratable en la composición que comprende un aceite;

(v)

el método de (i), en el que el polipéptido hidroliza un fosfátido en un enlace de fosfoéster de glicerilo para generar un diglicérido y un compuesto de fosfato hidrosoluble;

(vi)

el método de (i), en el que la puesta en contacto comprende la hidrólisis de un fosfolípido hidratado en un aceite;

(vii) el método de (i), en el que el polipéptido está unido a un filtro, y la grasa o el aceite que contiene un fosfolípido se hace pasar a través del filtro; o

(viii) el método de (vii), en el que el polipéptido se añade a una disolución que comprende una grasa o un aceite que contiene un fosfolípido y después en el que la disolución se hace pasar a través de un filtro.
17.

Método para convertir un fosfolípido no hidratable en una forma hidratable, que comprende:

(i) (a) producir una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, comprendiendo dicho polipéptido el polipéptido según la reivindicación 10 u 11; (b) producir una composición que comprende un fosfolípido no hidratable; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido convierte el fosfolípido no hidratable en una forma hidratable.
18.

Método para el refinado cáustico de una composición que contiene un fosfolípidos, que comprende:

(i)

(a) producir una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, comprendiendo dicho polipéptido el polipéptido según la reivindicación 10 u 11; (b) proporcionar una composición que comprende un fosfolípido; y (c) poner en contacto dicho polipéptido de la etapa (a) con dicha composición de la etapa (b) antes, durante o después del refinado cáustico;

(ii)

el método de (i), en el que dicho polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa se añade antes del refinado cáustico, y comprendiendo dicha composición que comprende dicho fosfolípido una planta, y dicho polipéptido es expresado de manera transgénica en la planta, añadiéndose dicho polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa durante la trituración de una semilla u otra parte de la planta, o siendo dicho polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa añadido después del triturado o antes del refinado;

(iii) el método de (i), en el que dicho polipéptido que tiene una actividad fosfolipasa se añade durante el refinado cáustico, y se añaden diferentes porcentajes de ácido y de agente cáustico según los niveles de fósforo y los niveles de ácidos grasos libres; o

(iv) el método de (i), en el que dicho polipéptido que tiene una actividad fosfolipasa se añade después del refinado cáustico: en una mezcladora intensa o una mezcladora de retención antes de la separación; después de una etapa de calentamiento; en una centrifugadora; en una grasa para jabón; en un detergente; o durante etapas de blanqueo o desodorización.
19.

Método de refinado de un aceite, que comprende:

(i)

(a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que dicho polipéptido comprende el polipéptido según la reivindicación 10 u 11; (b) proporcionar una composición que comprende un aceite; y (c) poner en contacto dicho polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa

(b)

en condiciones en las que dicho polipéptido puede catalizar la hidrólisis de un fosfolípido en dicha

composición;

(ii) el método de (i), en el que dicho polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa está en una disolución acuosa que se añade a la composición;

(iii) el método de (i), en el que dichas condiciones de hidrólisis comprenden el uso de agentes cáusticos; o

(iv)

el método de (i), en el que dichas condiciones de hidrólisis comprenden la adición de emulsionantes o el mezclamiento después de la puesta en contacto de la etapa (c);

(v)

el método de (i), que comprende añadir un emulsionante o calentar para inducir la separación de una fase acuosa;

(vi)

el método de (i), que comprende el desgomado antes de la etapa de puesta en contacto para recoger la lecitina por centrifugación y después añadir una PLC o una PLA para eliminar los fosfolípidos no hidratables;

(vii) el método de (i), que comprende el desgomado acuoso de aceite bruto a menos de 10 ppm para aceites comestibles, y después el refinado físico hasta menos de aproximadamente 50 ppm para aceites biodiesel; o

(viii) el método de (i), que comprende la adición de ácido para inducir la hidratación de los fosfolípidos no hidratables.
20.

Método para fabricar un biodiesel que comprende el uso de un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que dicho polipéptido comprende el polipéptido según la reivindicación 10 u 11, o está codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1.
21.

Método para el tratamiento de desechos que comprende el uso de un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que dicho polipéptido comprende el polipéptido según la reivindicación 10 u 11, o está codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1.
22.

Método para el refinado físico que comprende el uso de un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que dicho polipéptido comprende el polipéptido según la reivindicación 10 u 11, o está codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1.
23.

Método para tratar un aceite que comprende el uso de un polipéptido que tiene una actividad de fosfolipasa, en el que dicho polipéptido comprende el polipéptido según la reivindicación 10 u 11, o está codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 1.