DE10355838A1

DE10355838A1 - Verfahren zur Herstellung von Phospholipase A2

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Publication number: DE10355838A1
Application number: DE2003155838
Authority: DE
Inventors: Yvonne Markert; Johanna Dr. Mansfeld; Renate Prof. Dr. Ulbrich-Hofmann
Original assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Current assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2003-11-26
Publication date: 2005-07-07
Also published as: DE112004002690D2; WO2005052144A3; WO2005052144A2

Abstract

Der Erfindung liegt das Problem zu Grunde, eine Phospholipase A¶2¶ zu gewinnen, die nicht aus einem tierischen Organismus isoliert wird, in industriellem Maßstab herstellbar ist und für die biokatalytische Spaltung von Phospholipiden geeignet ist. DOLLAR A Analog der Nukleotidsequenz des Gens der natürlich vorkommenden PLA¶2¶ der Honigbiene werden Oligonukleotide mit jeweils 50-60 bp synthetisch hergestellt, die alternierend die beiden Stränge der DNA darstellen und an ihren Enden jeweils um bis zu 25 Nukleotide komplementär überlappen. Das dem N-Terminus des Proteins entsprechende DNA-Ende wird modifiziert und das Codon für das N-terminale Isoleucin durch das Codon für Alanin oder Valin ersetzt. Mittels PCR-Technik wird aus den synthetisch hergestellten Oligonukleotiden die vollständige Gensequenz erhalten. Das Enzym wird mittels Proteinexpression in der Zelle erhalten, welches anschließend isoliert und renaturiert wird. DOLLAR A Phospholipase A¶2¶ wird zur biokatalytischen Spaltung von natürlich vorkommenden Phospholipiden eingesetzt. Die spezifischen Spaltprodukte (Lysophospholipide) gelangen als Emulgatoren in der pharmazeutischen, kosmetischen und Diätmedizin zum Einsatz.

Description

Phospholipase A₂ (PLA₂) ist ein für die spezifische Abspaltung der in sn-2-Stellung positionierten Fettsäure in Glycerophospholipiden verantwortliches Enzym /1/. Enzyme diesen Typs, welche vor allem in tierischen Organismen vorkommen, werden zur Gewinnung von Lysophospholipiden aus natürlichen Phospholipiden eingesetzt. Lysophospholipide gelangen als Emulgatoren in der pharmazeutischen, kosmetischen und Diätindustrie zum Einsatz.

Auf Grund der relativ geringen Größe der extracellulären Enzyme (13 – 18 kDa) ist auch eine synthetische Herstellung der o. g. Gene beschrieben /10, 8, 6/.

Bevorzugt verwendet werden bisher PLA₂ aus Rinder- und Schweinepankreas. Bekannt ist auch die direkte Gewinnung des Enzyms aus dem Gift der Honigbiene oder verschiedener Schlangenarten.

Des Weiteren ist bekannt, PLA₂ auf rekombinantem Wege zu gewinnen, indem das Gen für das Enzym aus Schweine- /2, 3/ bzw. Rinderpankreas /4, 5/ oder aus Bienen- /6, 7/ bzw. Schlangengift /8, 9/ in den Mikroorganismus Escherichia coli oder die Hefe Saccharomyces cerevisiae transformiert und in diesen exprimiert wird.

Bei den bisher angewandten industriellen Verfahren wird das Enzym stets aus tierischen Organismen gewonnen, was in verschiedenen Bereichen, insbesondere im Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Bereich auf wenig Akzeptanz stößt, weil in Ländern mit moslemischen und jüdischen Bevölkerungsanteilen (einschließlich den USA) Erzeugnisse, die mit tierischen Produkten Kontakt hatten, nicht marktfähig sind. Darüber hinaus werden auch in den europäischen Ländern derartige Erzeugnisse aus Sicherheitsbedenken (Virus- und Prionengefahr) zunehmend abgelehnt.

Der Erfindung liegt das Problem zu Grunde, eine Phospholipase A₂ zu gewinnen, die nicht aus einem tierischen Organismus gewonnen wird, in industriellem Maßstab herstellbar ist und für die biokatalytische Spaltung von Glycerophospholipiden zu Lysophospholipiden geeignet ist, da die bisherigen Ansätze für eine industrielle Anwendung nicht geeignet sind.

Erfindungsgemäß wird das Problem gemäß Anspruch 1 dadurch gelöst, dass analog der Nucleotidsequenz der natürlich vorkommenden PLA₂ der Honigbiene (bv-PLA₂), welche in den bekannten Verfahren zur Anwendung kommt, Oligonucleotide mit jeweils 50 – 60 bp synthetisiert wurden, die alternierend die beiden Stränge der DNA repräsentieren und an ihren Enden jeweils um bis zu 25 Nucleotide komplementär überlappen (siehe Abbildung). Dabei wurden die Oligonucleotidsequenzen der bei E. coli anzutreffenden Codonnutzung angepaßt. An den Enden der DNA-Stränge wurden geeignete Restriktionsschnittstellen (Ncol, Hindlll) für die Klonierung in den Expressionsvektor eingeführt. Da das N-terminale Isoleucin in der natürlichen Sequenz die Abspaltung des Startmethionins verhindert /11/ und zu einem um einen Methioninrest verlängerten Enzym führt (M-PLA₂), wurde das dem N-Terminus des Proteins entsprechende DNA-Ende modifiziert, indem das Codon für das N-terminale Isoleucin durch das Codon für Alanin (I1A-PLA₂) bzw. Valin (I1V-PLA₂) ersetzt wurde.

Mittels Polymerasekettenreaktion (PCR-Technik) wurde aus den Oligonucleotiden die vollständige Gensequenz erhalten. Das erhaltene PCR-Amplifikat wurde mit den entsprechenden Restriktionsendonucleasen behandelt und in den Expressionsvektor pET-28b(+) (Novagen) kloniert. In diesem Vektor war zuvor die einen Hiss-Tag kodierende Sequenz durch die Restriktionsendonucleasen Ncol und Hindlll entfernt worden.

Die Expression der Enzyme erfolgte im E.coli-Stamm BL21(DE3) (Stratagene). Im Ergebnis wurden drei Enzymvarianten erhalten, die sich von der kommerziell erhältlichen PLA₂ aus der Honigbiene (bv-PLA₂) dadurch unterscheiden, dass sie nicht glykosyliert und am N-Terminus modifiziert sind. Durch N-terminate Proteinsequenzierung konnte nachgewiesen werden, dass die Enzyme M-PLA₂ und I1V-PLA₂ noch das Startmethionin besitzen, während die Sequenz von I1A-PLA₂ mit Alanin beginnt. Alle Enzymvarianten besaßen die gleiche spezifische Aktivität gegenüber dem Substrat 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, das in Form von Mischmicellen mit Triton X-100 präpariert wurde. Die erhaltenen spezifischen Aktivitäten sind ähnlich der Aktivität des aus dem Gift der Honigbiene gewonnenen Enzyms. Durch die Verfolgung der Fluoreszenzeigenschaften der Enzyme in Gegenwart von Guanidinhydrochlorid konnte gezeigt werden, dass die Enzymvarianten im Vergleich mit dem Enzym aus der Honigbiene keine signifikanten Unterschiede in ihrer Konformationsstabilität aufweisen. In Tabelle 1 sind die entsprechenden Daten zusammengefaßt.

Ausführungsbeispiel 1
sEine Vorkultur von Zellen des Expressionsstammes, vorzugsweise BL21(DE 3), die das entsprechende Plasmid mit der Sequenz der PLA₂ enthielten, wurde durch Animpfen von 50 ml TCYM-Medium mit 50 μg ml^–1 Kanamycin mit einer Einzelkolonie der o. g. Zellen und Kultivierung über Nacht bei 30 °C erhalten. Die Vorkultur wurde in 1 l TCYM Medium/50 μg ml^–1 Kanamycin überführt und bei 37 °C inkubiert. Bei Erreichen einer OD₆₀₀ von 1 wurden die Zellen mit 1 mM Isopropyl-β-D-galaktosid (IPTG) induziert. 4 Stunden nach der Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation für 15 min bei 6100 g geerntet. Unter diesen Bedingungen betrug der Anteil der rekombinanten Enzyme am Gesamtprotein, bestimmt durch densitometrische Auswertung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophoresegelen, 26 – 30 %. Die rekombinanten Enzyme lagen in Form von inclusion bodies vor. Die Zellen konnten vor der Weiterverarbeitung bei –20 °C gelagert werden.
Zur Isolierung der inclusion bodies wurden die Zellen in 35 ml Zellaufschlusspuffer (0,1 M Tris/HCl, pH 7,0; 1 mM EDTA) suspendiert, im Ultraturrax (Janke und Kunkel) zerkleinert, für 30 min bei 4 °C mit 1,5 mg ml^–1 Lysozym (Serva) behandelt. Anschließend erfolgte eine zweimalige Hochdruckhomogenisation mittels Gaulin-Homogenisator bei 1200 bar und eine Inkubation mit 10 μg ml^–1 DNase (La Roche) und 3 mM MgCl₂ bei 25 °C für 30 min. Nach Zentrifugation bei 48400 g für 20 min befanden sich die inclusion bodies im Pellet. Sie wurden zweimal gewaschen durch Behandlung mit

1. einer Lösung von 60 mM EDTA, 6% (w/v) Triton X-100, 1,5 M NaCl bei 4 °C für 30 min (das Volumen der Lösung betrug 50% des Volumens der inclusion bodies) und
2. 50 ml 0,1 M Tris/HCl, pH 7,0, 20 mM EDTA mit jeweils anschließender Zentrifugation bei 48400 g für 20 min.

Die gereinigten inclusion bodies waren wiederum bei –20 °C gut lagerbar.
Zur Gewinnung der aktiven Enzyme wurden zunächst 200 mg der inclusion bodies in 10 ml Solubilisierungspuffer (6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM Tris/HCl, pH 8,3, 100 mM Dithiothreitol) gelöst. Nach zwei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert der Lösung mit 1 M HCl auf pH 5,0 eingestellt, und die Lösung wurde zweimal gegen je 1 l 20 mM Essigsäure/4 M Guanidinhydrochlorid für jeweils 3 h dialysiert. Das Dialysat konnte vor der Weiterverarbeitung bei –20 °C für mindestens 2 Wochen gelagert werden.
Anschließend wurde die Proteinlösung unter Rühren in den Renaturierungspuffer (1 M Tris/HCl, pH 8,3, 10 mM CaCl₂, 1 mM EDTA, 5 mM Gluthation (reduzierte Form), 1 mM Gluthation (oxidierte Form)) eingetropft und 24 h belassen. Die Volumina wurden so gewählt, dass die Proteinkonzentration im Renaturierungsansatz 50 μg ml^–1 und die Guanidinhydrochloridkonzentration 200 mM nicht überschritt. Danach erfolgte eine Konzentrierung der Proteinlösung und Pufferaustausch (50 mM Tris/HCl, pH 7.0) in einer Ultrafiltrationszelle (Pall Filtron, 3 K Omega Membran). Die Renaturierungsausbeuten betrugen 66 – 69 %. Die aktiven Enzyme enthielten noch ca. 10 – 20 % Proteinverunreinigungen.
Eine Reinigung der Enzyme bis zur Homogenität in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese erfolgte durch Kationenaustauschchromatographie an einer MonoS-Säule (Pharmacia) unter Einsatz eines Elutionsgradienten, der durch die Pufferlösungen 50 mM Tris/HCl, pH 7,0 und 50 mM Tris/HCl, pH 9,0, 1 M NaCl erhalten wurde. Tabelle 1 stellt die erhaltenen Ausbeuten an den gereinigten Enzymen dar.
Ausführungsbeispiel 2
Die Enzymvariante I1A wurde einer Maßstabsvergrößerung unterworfen. Dazu wurde eine Vorkultur nach Ausführungsbeispiel 1 in 1 l LB-Medium mit 50 μg ml^–1 Kanamycin hergestellt, die zum Animpfen für 7 l Hauptmedium (77 g K₂HPO₄, 3,5 g NaCl, 35 g Glucose, 350 g Hefeextrakt, 3,5 g MgSO₄, 0,8 g Thiamin, 50 μg ml^–1 Kanamycin) verwendet wurde. Der Fermenter (Biostat 10-Liter, Braun) wurde bei pH 7,0 und 37 °C mit 20% (w/v) NaOH als Base und 20% (v/v) H₃PO₄ als Säure sowie Polypropylenglykol als Antischaumzusatz betrieben. Nach Verbrauch der Glucose im Hauptmedium wurde eine Fütterung (3-4 l) mit 50 % (w/v) Hefeextrakt/25 % (v/v) Glycerin begonnen und manuell langsam erhöht. Die Induktion mit 1 mM IPTG erfolgte bei einer OD₆₀₀ von 50-60. 4 Stunden nach der Induktion wurden die Zellen geerntet. Der Anteil des rekombinanten Proteins am Gesamtzellprotein betrug 10% bei der erreichten Biotrockenmasse von 70 g l^–1.
Tabelle 1: Proteinausbeute, Aktivität und Stabilität der PLA₂-Varianten
Literatur

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Claims

Verfahren zur Herstellung von Phospholipase A₂ zur Anwendung als industrieller Biokatalysator, gekennzeichnet dadurch, dass Oligonucleotide, die der Aminosequenz der natürlich vorkommenden Phospholipase A₂ entsprechen, mit jeweils 50 bis 60 bp synthetisch hergestellt werden, wobei die Oligonucleotide alternierend die beiden Stränge der DNA darstellen und an ihren Enden jeweils um bis zu 25 Nucleotide komplementär überlappen.
Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass das an dem dem N-Terminus des Proteins entsprechenden Ende der DNA befindliche Codon für Isoleucin durch die Codons für Alanin oder Valin ersetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, dass aus den Oligonucleotiden mittels Polymerasekettenreaktion die vollständige Gensequenz erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, dass das Enzym mittels Proteinexpression in E. coli hergestellt und nach erfolgter Isolierung aus den Aggregaten renaturiert wird.