DE69934150T2

DE69934150T2 - Klonierung und rekombinante Herstellung von Polistinae Insektengift- Enzymen, beispielsweise Hyaluronidase, und davon abgeleitete immunologische Therapien

Info

Publication number: DE69934150T2
Application number: DE69934150T
Authority: DE
Inventors: Paio Te New York King
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1998-10-01
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2019-10-02
Also published as: US6372471B1; AU760812B2; EP1117769A1; ATE292678T1; EP1528102B9; WO2000018896A1; EP1117769B1; US20040175393A1; DE69924628T2; AU6290699A; ATE346143T1; ES2280059T3; EP1528102B1; DK1528102T3; DE69924628D1; CA2344578A1; US6652851B1; US7060265B2; JP2002525107A; EP1528102A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Nukleinsäuremoleküle gerichtet, die Polistinae-Giftallergene kodieren, insbesondere Hyaluronidase oder immunmodulatorische Fragmente davon, rekombinante Vektoren, die solche Nukleinsäuremoleküle umfassen, und Wirtszellen, die die rekombinanten Vektoren enthalten. Die Erfindung ist zudem auf die Expression eines solchen Nukleinsäuremoleküls zur Herstellung des rekombinanten Polistinae-Giftenzyms Hyaluronidase oder rekombinanter immunmodulatorischer Fragmente davon gerichtet. Solch ein Allergen und immunmodulatorische Fragmente davon sind zur Diagnose von Allergien, zur therapeutischen Behandlung einer Allergie, für die Behandlung von Immunsystem-assoziierten Erkrankungen oder Krankheiten oder Symptomen, die damit verwandt sind, und zur Modulierung der Immunreaktion auf ein Immunogen, nützlich.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es kommt häufig zu einer Insektenstichallergie gegen Bienen und Vespide. Die Vespiden umfassen Hornissen, Gelbjacken und Wespen (Golden et al., 1989, Am. Med. Assoc. 262: 240). Empfängliche Personen können durch Aussetzen an kleinste Mengen der Giftproteine sensibilisiert werden; nur 2–10 μg des Proteins wird in die Haut bei einem einzelnen Stich durch ein Vespid injiziert (Hoffman und Jacobson, 1984, Ann. Allergy. 52:276).
Es gibt viele Spezies von Hornissen (Gattung Dolichovespula), Gelbjacken (Gattung Vespula) und Wespen (Gattung Polistes) in Nordamerika (Akre et al., 1980, "Yellowjackets of America North of Mexico", Agriculture Handbook Nr. 552, US Department of Agriculture). Die Vespiden haben ähnliche Giftzusammensetzungen (King et al., 1978, Biochemistry 17: 5165; King et al., 1983, Mol. Immunol. 20: 297; King et al., 1984, Arch. Biochem. Biophys. 230: 1; King et al., 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75: 621; King, 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 79: 113; Hoffman, 1985, J. Allergy and Clin. Immunol.
75: 611). Ihr Gift enthält jeweils drei hauptsächliche Giftallergene, Phospholipase (37 kD), Hyaluronidase (43 kD) und Antigen 5 (23 kD) von bisher unbekannter biologischer Funktion. Das U.S. Patent Nr. 5,593,877 beschreibt die Klonierung und Expression der Vespidgiftallergene Phospholipase und Hyaluronidase. Wie in diesem Patent beschrieben wird, ermöglichen die rekombinanten Allergene die Expression eines Proteins oder Fragments davon zur Verwendung in der Immuntherapie, Diagnose und zur Untersuchung von T- und B-Zellallergenen, es zeigt in mehr Detail die Überlegungen zur Klonierung von Vespidgiftenzymen. Jedoch wurden die einzelnen Vespidgift-cDNAs nicht beschrieben.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Insektengiftallergenen ist die vollständige Aminosäuresequenz von verschiedenen wichtigen Allergenen aus verschiedenen Gräsern (Perez et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16210; Ansari et al., 1989, Biochemistry 26: 8665; Silvanovich et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 1204), aus Baumpollen (Breiteneder, 1989, EMBO J. 8: 1935; Valenta et al., 1991, Science, 253: 557), aus Kräuterpollen (Rafnar et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 1229; Griffith et al., 1991, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 96: 296), aus Milben (Chua et al., 1988, J. Exp. Med. 167: 175), aus Katzenhaaren (Griffith et al., 1992, Gene. 113: 263) und Pilzen (Aruda et al., 1990, J. Exp. Med. 172:1529; Han et al., 1991, J. Allergy Clin. Immunol. 87:327) in den letzten paar Jahren bekannt gemacht worden. Diese hauptsächlichen Allergene sind Proteine von 10–40 kD, und sie haben viele unterschiedliche biologische Funktionen. Fast alle Allergene der bekannten Sequenzen haben in einem variierenden Ausmaß eine Sequenzähnlichkeit mit anderen Proteinen in unserer Umgebung.
Obwohl das U.S. Patent Nr. 5,593,877 die Klonierung und Expression von Vespidgiftenzymen, insbesondere Hyaluronidase und Phospholipase, zur Verfügung stellt, bleibt ein Bedarf zur Identifizierung ungewöhnlicher und unerwarteter Sequenzen für solche Enzyme und zur Entwicklung effektiver Expressionssysteme für diese. Es gibt einen besonderen Bedarf zur Untersuchung der B- und Helfer T-Zellepitope der Papierwespe (z. B. Polistes annularis). Insbesondere sind die hauptsächlichen Polistinae-Giftallergene Phospholipase und Hyaluronidase geeignete Ziele zur Bestimmung der wichtigen B- und T-Zellepitope. Um die Basis für eine allergene Reaktion gegen Vespidallergene vollständig zu bestimmen, und um Allergen-basierende Immuntherapien zu entwickeln, müssen die cDNA- und Proteinsequenzen von verschiedenen homologen Allergenen untersucht werden. Zudem sollten Vektoren, die für eine starke Expression von Vespidallergenen oder deren Fragmente in Bakterien- und eukaryontischen Zellen geeignet sind, entwickelt werden. Rekombinante Vespidallergene und deren Fragmente können dann verwendet werden, um deren B- und T-Zellepitope in den murinen, und wichtiger noch, den menschlichen Systemen durch jeweils Antikörperbindungs- und T-Zellproliferationstests zu bestimmen.
Es gibt auch einen Bedarf auf dem Gebiet, Peptide mit T- und B-Zellepitopen der Vespidgiftallergene zu verwenden, um die Induktion einer Toleranz in Mäusen und die Induktion einer Toleranz in Menschen zu untersuchen.
Es gibt auch einen weiteren Bedarf zur Untersuchung, ob ein modifiziertes Peptid die Allergen-T-Zellepitopbindung an das MHC Klasse II Molekül hemmt oder T-Zellanergie induziert oder beides macht.
Es gibt auch einen Bedarf auf dem Gebiet an einzigartiger Sequenzinformation über Vespidgiftallergene und eine möglichst breite Quelle solcher Allergene für immunologische Untersuchungen und zur immunologischen Therapie der Allergie.
Zudem wurden Versuche, bedingt durch die Überverwendung von Antibiotika in der ganzen Welt, und die Ausbreitung vieler Viren wie HIV, Ebola, etc., zur Herstellung neuer "super" Antibiotikamedikamentation und Verbindungen mit Aktivität gegen Viren durchgeführt. Zum Beispiele wurde AZT zusammen mit Proteasehemmern entwickelt, um Personen zu behandeln, die an HIV leiden. Jedoch sind die Kosten der Entwicklung neuer "super" Antibiotika und antiviraler Medikamente enorm.
Daher besteht ein Bedarf an Mitteln und pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Krankheiten oder Erkrankungen, die mit dem Immunsystem assoziiert sind, deren Aktivität nicht notwendigerweise auf der Bekämpfung des jeweiligen Virus oder des Pathogens beruht, sondern eher die Fähigkeit des Immunsystems moduliert oder verstärkt, die Krankheit oder Erkrankung zu bekämpfen, wodurch die Krankheit oder Erkrankung oder die damit verbundenen Symptome abgeschwächt werden. Hymenoptera-Gifte, insbesondere Vespidgifte stellen eine mögliche Quelle für solche Mittel und pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verfügung, wie in den U.S. Patenten Nr. 4,822,608 und 5,827,829 beschrieben wird.
Das Zitieren von Literaturquellen hierin soll nicht dahingehend ausgelegt werden, dass zugegeben wird, dass solche Quellen Stand der Technik für die vorliegende Erfindung sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Nukleinsäuremolekül, das Polistinae-Giftenzym kodiert, das eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 oder immunmodulatorische Fragmente davon kodiert, zur Verfügung. Insbesondere ist die Erfindung auf solche Nukleinsäuremoleküle gerichtet, die eine Polistinae-Gift-Hyaluronidase kodieren. In speziellen Ausführungsformen kodiert ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung einen immunmodulatorischen Teil eines T-Zellepitops eines Polistinae-Giftenzyms. In einer anderen Ausführungsform kodiert ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung einen antigenen Teil eines B-Zellepitops eines Polistinae-Giftenzyms.
Von der Nukleinsäure der Erfindung, die nicht genomisch ist, wurde überraschenderweise in einer Ausführungsform herausgefunden, dass sie eine nicht kodierende, z. B. Intronsequenz enthält. In einer spezifischen Ausführungsform enthalten cDNA-Moleküle für das Polistinae-Giftenzym das, was ein Intron zu sein scheint. Somit hat es sich unerwarteter Weise als notwendig herausgestellt, diese "Intron"-Sequenz zu entfernen, um eine Nukleinsäure zu erhalten, die für ein reifes Polistinae-Giftenzym, z. B. Hyaluronidase kodiert.
Somit erstreckt sich die vorliegende Erfindung im weiten Sinne auf ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Giftenzym kodiert, Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 oder ein immunmodulatorisches Fragment davon kodieren. Wie oben erwähnt wird, enthält das Nukleinsäuremolekül interne nicht- kodierende Sequenzen, d. h. zusätzlich zu 5' und 3'-nicht-translatierten (UTR) Sequenzen, ist aber nicht eine genomische Sequenz. Beispiele von Polistinae-Giftenzymen, die durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phospholipase und Hyaluronidase.
Varianten davon mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4, immunmodulatorische Fragmente davon aus dem Gift der vielen Polistinae-Gifte können durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert werden. Ein besonderes Beispiel umfasst Polistinae der Gattungs Polistes und insbesondere die Spezies Annularis.
In einer anderen besonderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches Hyaluronidase aus Polistes annularis, umfassend eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4, kodiert, genauer gesagt, wobei die isolierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder einem Fragment davon aufweist, oder Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID NO: 4 und immunmodulatorische Fragmente davon kodieren.
Zudem umfasst die vorliegende Erfindung zusätzlich ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polistinae-Giftenzym kodiert, Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 oder ein immunmodulatorisches Fragment kodieren, worin das isolierte Nukleinsäuremolekül einen immunmodulatorischen Teil eines T-Zellepitops oder eines antigenen Teils eines B-Zellepitops des Polistinae-Giftenzyms kodiert. Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Polistinae-Gift-Hyaluronidase, die eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 umfasst, oder ein immunmodulatorisches Fragment davon kodiert, oder Varianten des Moleküls, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID NO: 4 kodieren, wobei das Molekül unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz, die einer T_m von größer oder gleich etwa 65°C entsprechen, mit dem aus der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 3 bestehenden Nukleinsäuremolekül hybridisieren kann. Genauso umfasst die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polyeptid, das einen immunmodulatorischen Teil eines T-Zellepitops eines Polistinae-Giftenzyms umfasst, wobei das Polypeptid durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert wird. Beispiele von Wespengiftenzymen, für die die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung einen immunmodulatorischen Teil eines T-Zellepitops kodieren, umfassen Hyaluronidase, sind aber gewiss nicht darauf beschränkt. In einer besonderen Ausführungsform stammt die Hyaluronidase aus der Gattung Polistes und insbesondere aus der Spezies Annularis.
Die Erfindung stellt zudem Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren zur Verfügung, die eine Expression der Nukleinsäuren ermöglichen. Solche Vektoren enthalten Nukleinsäuren der Erfindung, wie sie oben dargestellt werden. In dem Fall von Expressionsvektoren sind solche Nukleinsäuren funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz assoziiert.
Die Erfindung stellt vorteilhafter Weise ein Verfahren zur Herstellung einer Polistinae-Gift-Hyaluronidase, von Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, oder immunmodulatorischen Fragmenten davon zur Verfügung, umfassend:

(a) das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Nukleinsäuremolekül umfasst, das an ein isoliertes Nukleinsäuremolekül hybridisierbar ist, das eine DANN Sequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst, oder vorzugsweise mit einer Sequenz von SEQ ID NO: 3, oder Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül funktionell mit einem Promoter assoziiert ist, so dass die Polistinae-Gift-Hyaluronidase, eine konservierte Variante davon, ein immunmodulatorisches Fragment davon oder ein Analogon oder ein Derivat davon durch die Wirtszelle hergestellt wird; und
(b) die Rückgewinnung der Polistinae-Gift-Hyaluronidase, oder einer Variante davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodiert, eines immunmodulatorischen Fragments davon oder eines Analogons oder Derivats davon, das derart hergestellt wird, aus der Kultur, der Wirtszelle oder beiden.

In einem bestimmten Beispiel ergeben die oben dargestellten Verfahren Hyaluronidase der Gattung Polistes und insbesondere der Spezies Annularis, wobei die Hyaluronidase eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 umfasst, Varianten davon mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 oder immunmodulatorische Fragmente davon.
Die vorliegende Erfindung umfasst zusätzlich pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Behandlung einer Giftallergen-spezifischen allergenen Erkrankung wirksam sind. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusam mensetzung, die ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das einen immunmodulatorischen Teil eines T-Zell- oder eines antigenen Teils eines B-Zellepitops eines Polistinae-Giftenzyms, z. B. einer Hyaluronidase kodiert, und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel umfasst. Konsequenterweise umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung ein immunmodulatorisches T-Zellepitop der Polistes annularis-Gift-Hyaluronidase oder einen antigenen Teil eines B-Zellepitops der Polistes annularis-Hyaluronidase.
Selbstverständlich umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Vespidgiftallergen-spezifischen allergischen Erkrankung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung umfasst, für die Beispiele oben dargestellt werden. Die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung kann parenteral und insbesondere oral, pulmonal, nasal, topisch oder systemisch erfolgen.
Zudem umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung eines rekombinanten Polistinae-Giftenzyms der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für, und ein damit assoziiertes Verfahren zur Modulierung einer Immunreaktion auf ein Immunogen, z. B. die Behandlung einer Vespidallergieerkrankung oder die Behandlung einer Immunsystemassoziierten Erkrankung oder Krankheit oder eines Symptoms einer Krankheit oder Erkrankung, die mit dem Immunsystem assoziiert ist. Das Polypeptid wird durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kodiert, das ein Polistinae-Giftenzym kodiert, wobei das Polypeptid ein immunmodulatorisches Fragment eines Polistinae-Giftenzyms umfasst. Insbesondere umfasst ein Mittel zur Behandlung einer Immunsystem-assoziierten Krankheit oder Erkrankung oder eines Symptoms, das damit assoziiert ist, ein Polistinae-Giftenzym oder einen Vektor, der die Expression des Polistinae-Gifts oder Enzyms in vivo ermöglicht.
Folglich umfasst ein Mittel zum Behandeln einer mit dem Immunsystem zusammenhängenden Störung oder Krankheit oder eines Symptoms davon ein isoliertes Polypeptid, das durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches eine Polistinae-Gift-Hyaluronidase kodiert, oder Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, kodiert wird, oder immunmodulatorische Fragmente davon.
Zudem umfasst die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Modulierung einer Immunreaktion gegen ein Immunogen, z. B. die Behandlung einer Vespid-allergenen Erkrankung oder die Behandlung einer Erkrankung oder einer Krankheit oder eines Symptoms, das mit dem Immunsystem assoziiert ist, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein rekombinantes Polistinae-Giftenzym und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel umfasst.
Die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Wesen zur Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung, die mit dem Immunsystem assoziiert ist, kann parenteral und insbesondere oral, pulmonal, nasal, topisch oder systemisch durchgeführt werden. Zudem können viele Erkrankungen oder Krankheiten, die mit dem Immunsystem assoziiert sind, mit der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Beispiele davon umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, eine pathogene Erkrankung oder Krankheit wie eine virale Krankheit oder Erkrankung, z. B. HIV, Herpes Simplex-Virus oder Papiloma-Virus; eine Autoimmunerkrankung, z. B. Arthritis oder Lupus; oder eine Kombination von solchen Krankheiten oder Erkrankungen.
Es ist eine spezifische Aufgabe der Erfindung, die überraschende DNA-Sequenz von isolierten Nukleinsäuremolekülen (cDNA-Molekülen), welche Polistes annularis-Hyaluronidase kodieren, Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 oder immunmodulatorische Fragmente davon kodieren, zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der Erfindung, Aminosäuresequenzen von Polistes annularis-Hyaluronidase zusammen mit Varianten davon mit der Aktivität von SEQ ID N. 4, einschließlich immunmodulatorischer Teile der T-Zellepitope und antigener Teile der B-Zellepitope der Polistes annularis- Hyaluronidase zur Verfügung zu stellen, enthaltend, oder mehr bevorzugt frei von einer "Intron-"Sequenz. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Hyaluronidase aus Pol a ermöglichen den Vergleich der Homologie zu analogen Enzymen aus anderen Vespiden. Diese Information stellt eine Basis zur Beurteilung einer Kreuzreaktivität der Allergene zur Verfügung, die für allergene Reaktionen und für therapeutische Behandlungen wichtig sein kann. Somit ermöglicht in einer besonderen Ausführungsform die vorliegende Erfindung einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, den Grad der Ähnlichkeit von Hyaluronidase aus Pol a zu Umgebungsproteinen und/oder autologen Proteinen zu bestimmen und zu bewerten. Es wird angenommen, dass die Ähnlichkeit der Vespidgiftenzyme mit solchen Umgebungsproteinen und insbesondere mit autologen Proteinen wichtige Implikationen für die allergene Reaktion hat.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der Erfindung, die Expression und Klonierung von Vektoren bereit zu stellen, die ein isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassen, das Polistes annularis-Hyaluronidase, einschließlich Fragmente, die einen immunmodulatorischen Teil eines T-Zellepitops oder einen antigenen Teil eines B-Zellepitops dieses Polistinae-Giftenzyms umfassen, kodiert, so dass das isolierte Nukleinsäuremolekül reproduziert und exprimiert werden kann.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung umfasst die Herstellung von Polistinae-Giftenzymen wie Hyaluronidase zusammen mit Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, oder immunstimulatorischen Fragmenten davon unter Verwendung von Expressionsvektoren der Erfindung, trotz des Vorhandenseins von Intronsequenzen in cDNA-Klonen.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Allergen-spezifischen allergischen Erkrankungen in einem Wesen zur Verfügung zu stellen, wobei die Mittel und pharmazeutischen Zusammensetzungen ein isoliertes Polypeptid umfassen, das durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kodiert wird, die ein Polistinae-Giftenzym, wie Hyaluronidase, kodiert, insbesondere aus Polistes annularis, wobei das Polypeptid einen antigenen Teil eines B-Zellepitops oder einen immunmodulatorischen Teil eines T-Zellepitops einer Polistinae-Hyaluronidase umfasst.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Behandlung einer Vespidgiftallergen-spezifischen Allergie in einem Wesen zu behandeln, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Allergen-spezifischen Allergieerkrankung dem Wesen verabreicht wird.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der Erfindung, Mittel und pharmazeutische Zusammensetzungen bereit zu stellen, die solche Mittel umfassen, die eine Krankheit oder Erkrankung, die mit dem Immunsystem assoziiert ist, in Säugetieren behandeln, wie eine pathogene Erkrankung oder Krankheit, eine virale Erkrankung oder Krankheit, eine Autoimmunkrankheit oder Erkrankung oder eine Kombination von Erkrankungen oder Krankheiten, die mit dem Immunsystem assoziiert sind.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Modulierung der Immunreaktion gegen ein Immunogen in einem Säugetier zur Verfügung zu stellen. Als ein Ergebnis moduliert die Verabreichung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung die Fähigkeit des Immunsystems, das Immunogen zu erkennen und anzugreifen. In einer besonderen Ausführungsform wird die Fähigkeit des Immunsystems des Säugetieres, das Immunogen zu erkennen und anzugreifen, durch die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung relativ zu der Fähigkeit des Immunsystems des Wesens erhöht, das Immunogen vor der Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung zu erkennen und anzugreifen. ABKÜRZUNGEN
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Die cDNA Nukleotidsequenz, die die Pol a Giftphospholipase A₁ (SEQ ID NO: 1) kodiert, und die Aminosäuresequenz von Pol a Giftphospholipase A₁ (SEQ ID NO: 2).
Es wird betont, dass die ersten 18 Aminosäurereste von SEQ ID NO: 2 einen Teil einer Signalsequenz darstellen. Somit ist der Aminosäurerest 19 von SEQ ID NO: 2 (Glycin) der N-terminale Aminosäurerest in der reifen Pol a Phospholipase A₁.
2A und 2B. Pol a Phospholipase cDNA enthält zwei Introns. (A) Die Nukleotidsequenz des Papla Intron 1 (SEQ ID NO: 5), ein Intron in der Pol a Giftphospholipase A₁ cDNA, ist zwischen den Nukleotiden 111 und 112 von SEQ ID NO: 1 lokalisiert. (B) Die Nukleotidsequenz des Papla Intron 2 (SEQ ID NO: 6), ein Intron in Pol a Giftphospholipase A₁ cDNA, ist zwischen den Nukleotiden 720 und 721 von SEQ ID NO: 1 lokalisiert.
3. Aminosäurerestsequenzähnlichkeit zwischen Hornissengiftphospholipase (SEQ ID NO: 7), Gelbjackenphospholipase (SEQ ID NO: 8) und Papierwespenphospholipase A₁ (SEQ ID NO: 2).
4. Die cDNA-Nukleotidsequenz, die Pol a Gifthyaluronidase (SEQ ID NO: 3) kodiert, und die Aminosäuresequenz der Pol a-Hyaluronidase (SEQ ID NO: 4). Es wird betont, dass die ersten 23 Aminosäurereste von SEQ ID NO: 4 einen Teil einer Signalsequenz darstellen. Somit ist Aminosäurerest 30 von SEQ ID NO: 4 (Serin) der N-terminale Aminosäurerest der reifen Pol a-Hyaluronidase.
5. Die Nukleotidsequenz von Pahya (SEQ ID NO: 9), einem Intron in Pol a-Hyaluronidase cDNA, das zwischen den Nukleotiden 733 und 734 von SEQ ID NO: 3 lokalisiert ist.
6. Aminosäurerestsequenzähnlichkeit zwischen Bienengift (bv)-Hyaluronidase (SEQ ID NO: 10), Dol m (wfh) Hyaluronidase (SEQ ID NO: 11), Ves v (vv) Hyaluronidase (SEQ ID NO: 12) und Pol a (pa) Hyaluronidase (SEQ ID NO: 4).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die Polistenae-Giftenzyme, wie Hyaluronidase, und immunmodulatorische Fragmente, kodieren, und Polypeptide, die durch solche Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, gerichtet, die in der Diagnose und Therapie von Vespidgift-spezifischer Allergie nützlich sind. In besonderen Ausführungsformen ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das Pol a-Hyaluronidase kodiert, Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, und immunmodulatorische Fragmente davon.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden und völlig unerwarteten Entdeckung von internen nicht kodierenden Segmenten von cDNAs, die Pol a-Hyaluronidase kodieren. Vor dieser Entdeckung enthielten cDNAs für Vespidgiftenzyme solche augenscheinlichen "Intron"-Sequenzen nicht.
Diese Entdeckung hat zwei wichtige Implikationen. Die erste ist, dass Polistinae-, und insbesondere Polistes-, und ganz besonders Pol a- cDNAs scheinbar "Introns" enthalten. Somit exprimieren Polistinae dieser Unterfamilie einzigartige mRNAs mit einzigartigen mRNA-Prozessierungsfähigkeiten und stellen potentiell interessante Spleißvarianten dar.
Der Begriff "Intron" wird verwendet, um Nukleinsäuresequenzen zu bezeichnen, von denen nicht erwartet wird, dass sie in einer cDNA vorhanden sind, die für Hyaluronidase kodiert, und die nicht 5' oder 3' UTR-Sequenzen sind. Diese Sequenzen können unerwartete Spleißvarianten der Proteine, unvollständige Prozessierung von mRNAs oder ein regulatorisches Merkmal darstellen, das in dieser Unterfamilie, Gattung und Spezies von Vespiden zu finden ist.
Das Vorhandensein dieser "Intron"-Sequenzen hat einen wesentlichen Einfluss auf die Herstellung von Expressionsvektoren. Während es möglich ist, die einzigartigen Polypeptide, die durch diese cDNAs kodiert werden, zu exprimieren, ist in einer anderen Ausführungsform eine nicht voraussagbare Modifikation der cDNA notwendig, um diese "Introns" zu eliminieren, um die reife Form der Polistinae-Giftenzyme zu exprimieren, z. B. zur Verwendung in einer Immuntherapie. Somit hat es sich unerwarteter Weise als notwendig erwiesen, die kodierenden Sequenzen für Polistinae-Hyaluronidase weiter zu verändern. Sobald diese "Intron"-Sequenzen entfernt werden, können Hyaluronidase-Proteine, die die natürliche Aminosäuresequenz umfassen, erhalten werden.
Die Erfindung ist zudem auf Expressionvektoren gerichtet, die das Hyaluronidase-Nukleinsäuremolekül umfassen, und auf Verfahren zur Herstellung von Polistinae-Giftenzympolypeptiden der Erfindung durch die Exprimierung solcher Expressionsvektoren und die Rückgewinnung der hergestellten Polistinae-Giftenzympolypeptide.
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die wirksam für die Behandlung eines Vespidgift-, und wahrscheinlich sogar eines Hymenopteragift-Allergen-spezifischen allergischen Zustandes sind, die ein Polypeptid der Erfindung umfassen, und Verfahren zur Behandlung solcher allergischer Zustände, die das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung umfassen.
Die Polypeptide der Erfindung können auch zur Diagnose von Vespid-, insbesondere Polistenae-, Gift-spezifischen allergischen Zuständen nützlich sein.
Zusätzlich wurde unerwarteter Weise entdeckt, dass die Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Polistinae-Gift-Hyaluronidase umfassen, verwendet werden kann, um eine Krankheit oder Erkrankung zu behandeln, die mit dem Immunsystem assoziiert ist, wie eine pathogene Erkrankung oder Krankhit, eine virale Erkrankung oder Krankheit, eine Autoimmunkrankheit oder Erkrankung oder eine Kombination von solchen Krankheiten oder Erkrankungen.
Dementsprechend bezieht sich der Begriff " Polistinae-Giftallergien", wie er hierin verwendet wird, auf ein Protein, das in dem Gift einer Polistenae, wie einer Papierwespe (Polistes annularis), zu finden ist, auf das empfängliche Personen nach einem Stich des Insekts sensibilisiert werden. Während die meisten Antigene durch Reaktivität mit spezifischen Antikörpern der IgG-Klasse charakterisiert sind, ist ein Allergen auch dadurch gekennzeichnet, dass es mit Antikörpern des IgE-Typs reagiert. Die Antikörper des IgE-Typs sind für die Vermittlung der Symptome eines allergischen Zustandes verantwortlich, d. h. eine sofortige Überempfindlichkeit.
Wie er hierin verwendet wird, wird der Begriff "Vespid" gemäß der Praxis von den Personen auf dem Gebiet der Allergie verwendet, und bezieht sich auf Insekten, die zu der weltweiten Familie der Vespidae gehören, d. h. soziale Wespen einschließlich Hornis sen, Gelbjacken und Papierwespen. Insbesondere umfassen die Vespiden der Unterfamilie Vespinae die Unterfamilien Vespinae und Polistinae. Insbesondere umfassen die Vespiden der Unterfamilie die Gattungen Vespa Linnaeus, Vespula Thomson, Dolichovespula Rohwer und Polistes Latreille. Vespula und Dolichovespula können als Untergattungen der Gattung Vespula bezeichnet werden. Spezies in der Gattung Vespula umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, V. crabro (L.) und V. orientalis (Linnaeus). Spezies in der Gattung Vespula umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, V. germanica (Fab.), V. squamosa (Drury), V. maculifrons (Buysson), V. flavopilosa (Jacobson), V. vulgaris (L.) und V. pensylvanica (Saussure). Spezies in der Gattung Dolichovespula umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, P. dominulus, D. maculata (L.) und D. arenaria (Fab.).
Die Unterfamilie Polistinae umfasst die Gattung Polistes. Spezies in der Gattung Polistes umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, P. dominulus, Pol a (Linnaeus), P. exclamans (Viereck), P. metricus (Say), P. fuscatus (Fabricius), P. gallicus, pacificus, P. canadensis, P. kaibabensis, P. comanchus, P. commanchus, P. annularis, P. exclamans, P. instabilis, P. carnifex, P. major, P. metricus, P. perplexus, P. carolinus, P. flavus, P. fuscatus, P. aurifer, P. dorsalis, P. bellicosus, P. apachus, P. sulcifer, P. semenowi, P. atrimandibularis, P. biglumis, P. bischoffi, P. dominulus, P. nimpha, P. Pgallicus, P. associus, P. gigas, P. stigma, P. adustus, P. snelleni, P. mandarinus, P. chinensis, P. sulcatus, P. formosanus, P. japonicus, P. watttii, P. macaensis, P. jadwigae, P. olivaceus, P. rothenyi, P. jokohamae, P. poeyi, P. paraguayensis, P. rossi, P. cinctus, P. cavapyta, P. buysonni, P. brevifissus, P. ferreri, P. infuscatus, P. satan, P. melanotus, P. erythrocephalus, P. lanio, P. penai, P. aterrimus, P. huacapistana, P. versicolor, P. ninabamba, P. simillimus, P. adelphus, P. biguttatus, P. binotatus, P. consobrinus, P. peruvianus, P. weyrauchorum, P. xanthogaster, P. maranonensis, P. myersi, P. veracrucis, P. eburneus, P. stabilinus, P. pseudoculatus, P. apicalis, P. oculatus, P. crinitus, P. cubensis, P. minor, P. incertus, P. franciscanus, P. goeldii, P. olivaceus, P. bicolor, P. thoracicus, P. rufiventrus, P. moraballi P. angulinus, P. subsericeus, P. testaceicolor, P. claripennis, P. billardieri, P. davillae, P. occipitalis, P. atrox, P. deceptor, P. niger, P. candidoi, P. geminatus, P. melanosoma, P. actaeon, P. obscurus, P. bequaertianus, P. cinerascens und P. apachus (Saussure).
Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Hyaluronidase" auf die Klasse von Enzymen, die auf die Disaccarideinheit der D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin einwirken. Solche Enzyme vermitteln die Hydrolyse von Polymeren aus sich wiederholenden Disacchariden, die D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin umfassen. Ein Beispiel eines solchen Polymers ist Hyaluronidase. Hyaluronidase katalysiert die Freisetzung von reduzierenden Gruppen des N-Acetylglucosamins aus Hyaluronidase.
Eine "genomische" Sequenz enthält alle 5' und 3' nicht translatierten Sequenzen und 5' und 3' nicht transkribierten (und oft regulatorische) Sequenzen eines Gens. Somit ist eine kodierende Sequenz nicht genomisch, wenn sie nicht ein oder mehrere Introns und 5' und 3' nicht-transkribierte Sequenzen aufweist, insbesondere regulatorische Sequenzen.
Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff "immunmodulatorisch" auf die Fähigkeit zur Erhöhung oder Verringerung einer Antigen-spezifischen Immunreaktion entweder auf der B-Zell- oder der T-Zell-Ebene. Eine immunmodulatorische Aktivität kann z. B. in T-Zellproliferationsassays, durch Messung der Antikörperproduktion, Lymphokinproduktion oder T-Zellreaktivität nachgewiesen werden. Insbesondere können zusätzlich zu den Wirkungen auf T-Zellreaktionen die immunmodulatorischen Polypeptide der Erfindung an Immunglobulin (d. h. Antikörper)- Moleküle auf der Oberfläche von B-Zellen binden und auch B-Zellreaktionen beeinflussen.
Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Derivat" auf eine modifizierte Nukleinsäure, die ein Polistenae-, insbesondere ein Polistes-, Hyaluronidase-Giftenzym kodiert, das eine Substitution, Deletion oder Insertion enthält, und das dadurch kodierte Protein. Der Begriff "Derivat" bezieht sich insbesondere auf ein schwach IgE-bindendes Derivat (oder Analogon), das Aminosäuresubstitutionen an Schlüssel-Aminosäureresten enthält, was in verringerter IgE-Bindung ohne Unterbrechung der Gesamtkonformation oder der sekundären und tertiären Struktur des Proteins resultiert. Schwach IgE-bindende Derivate werden in der PCT/DK 99/00136 beschrieben.
Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Immunsystem-assoziierte Krankheit oder Erkrankung" auf eine Krankheit oder eine Erkrankung, die eine Immunreaktion in einem Wesen auslöst, oder die Fähigkeit des Immunsystems betrifft, auf ein Immunogen zu reagieren. Somit umfassen Beispiele von Immunsystem-assoziierten Krankheiten oder Erkrankungen eine pathogene Krankheit oder Erkrankung, eine virale Krankheit oder Erkrankung, z. B. HIV, Herpes Simplex-Virus oder Papiloma-Virus; eine Autoimmunerkrankung, z. B. Arthritis oder Lupus.
Ein "Nukleinsäuremolekül" bezieht sich auf die polymere Phosphatesterform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; "RNA-Moleküle") oder Deoxyribonukleosiden (Deoxyadenosin, Deoxyguanosin, Deoxythymidin oder Deoxycytidin; "DNA-Moleküle") in entweder einzelsträngiger Form oder als doppelsträngige Helix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices sind auch möglich. Der Begriff Nukleinsäuremolekül und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül bezieht sich nur auf die primäre oder sekundäre Struktur des Moleküls und schränkt diese nicht auf irgendeine der tertiären Formen ein. Somit umfasst dieser Begriff doppelsträngige DNA, die inter alia in linearen oder zirkulären DNA-Molekülen zu finden ist (z. B. Restriktionsfragmente), Viren, Plasmide und Chromosomen. Bei der Diskussion der Struktur von bestimmten doppelsträngigen DNA-Molekülen können Sequenzen hierin gemäß der normalen Konvention beschrieben werden, bei der nur die Sequenz in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des nicht-transkribierten Stranges der DNA genannt wird (d. h. der Strang mit einer zu der mRNA homologen Sequenz). Ein "rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, das eine molekulare biologische Manipulation durchlaufen hat.
Ein Nukleinsäuremolekül ist mit einem anderen Nukleinsäuremolekül, wie einer cDNA, einer genomischen DNA oder RNA "hybridisierbar", wenn eine einzelsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls an das andere Nukleinsäuremolekül unter den geeigneten Bedingungen der Temperatur und Ionenstärke der Lösung (siehe Sambrook et al., supra) binden kann. Die Bedingungen der Temperatur und Ionenstärke bestimmen die "Stringenz" der Hybridisierung. Für erste Untersuchungen von homologen Nukleinsäuremolekülen können Hybridisierungsbedingungen geringer Stringenz verwendet werden, die einer T_m von 55° entsprechen, z. B. 5 × SSC, 0,1 % SDS, 0,25 % Milch und kein Formamid; oder 30 % Formamid, 5 × SSC, 0,5 % SDS). Hybridisierungsbedingungen für mittlere Stringenz entsprechen einer höheren T_m (ungefähr 60°), z. B. 40 % Formamid mit 5 × oder 6 × SSC. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen entsprechen der höchsten T_m (größer oder gleich etwa 65°), z. B. 50 % Formamid, 5 × oder 6 × SSC. Die Hybridisierung setzt voraus, dass die zwei Nukleinsäuremoleküle komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl abhängig von der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind. Die geeignete Stringenz zur Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen hängt von der Länge der Nukleinsäuremoleküle und dem Grad der Komplementierung ab, welches Variablen sind, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind. Je größer der Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nukleotidsequenzen, desto größer ist der Wert der T_m für Hybride von Nukleinsäuremolekülen mit diesen Sequenzen. Die relative Stabilität (entsprechend höheren T_m) von Nukleinsäurehybridisierungen verringert sich in der folgenden Reihenfolge: RNA : RNA, DNA : RNA, DNA : DNA. Für Hybride mit mehr als 100 Nukleotiden Länge wurden Gleichungen zur Berechnung der T_m abgeleitet (siehe Sambrook et al., supra, 9.50–0.51). Zur Hybridisierung mit kürzeren Nukleinsäuremolekülen, d. h. Oligonukleotiden, wird die Position der Fehlpaarungen wichtiger und die Länge des Oligonukleotids bestimmt seine Spezifität (siehe Sambrook et al., supra, 11.7–11.8). Vorzugsweise beträgt eine minimale Länge für ein hybridisierbares Nukleinsäuremolekül wenigstens ungefähr 10 Nukleotide; vorzugsweise mindestens ungefähr 10 Nukleotide; mehr bevorzugt beträgt die Länge mindestens ungefähr 20 Nukleotide; sogar noch mehr bevorzugt 30 Nukleotide; und am meisten bevorzugt 40 Nukleotide.
Der Begriff "Standard-Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf eine T_m von 55 °C und verwendet Bedingungen, die oben dargestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die T_m 60 °C; in einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist die T_m 65 °C.
Eine DNA-"kodierende Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die in ein Polypeptid in vivo transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz bestimmen sich durch ein Startkodon an dem 5' (Amino)-terminus und ein Translationsstopkodon an dem 3'(Carboxyl)-terminus. Eine kodierende Sequenz kann prokaryontische Sequenzen, cDNA aus eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryontischer (z. B. Säugetier-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen umfassen, ist aber nicht darauf eingeschränkt. Wenn die kodierende Sequenz zur Expression in einer eukaryontischen Zelle vorgesehen ist, werden üblicherweise ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz 3' zu der kodierenden Sequenz lokalisiert sein.
Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen sind regulatorische DNA Sequenzen wie Promotoren, Verstärker, Terminatoren und Ähnliche, die die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle zur Verfügung stellen. In eukaryontischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Steuerungssequenzen.
Eine "Promotersequenz" ist eine regulatorische DNA Region, die in der Lage ist, RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts gelegenen (3'-Richtung) kodierenden Sequenz zu initiieren. Für die Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotersequenz an den 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle gebunden und verlängert sich stromaufwärts (5'-Richtung), um die minimale Anzahl von Basen oder Elemente zu umfassen, die notwendig sind, um die Transkription in Mengen zu initiieren, die über dem Hintergrund nachweisbar sind. Innerhalb der Promotersequenz wird eine Transkriptionsinitiationsstelle zu finden sein (z. B. durch Kartierung mit Nuklease S1 leicht definierbar) sowie Protein-bindende Domänen (Konsensussequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryontische Promotoren werden oft, aber nicht immer, "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen enthalten.
Eine kodierende Sequenz steht "unter der Kontrolle" von transkriptionellen und translatorischen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche dann in das Protein translatiert wird, das die kodierende Sequenz kodiert.
Eine "Signalsequenz" kann vor der kodierenden Sequenz mit umfasst sein. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid N-terminal zu dem Polypeptid, das die Wirtszelle dahin ausrichtet, das Polypeptid zu der Zelloberfläche zu transportieren oder das Polypeptid in das Medium zu sezernieren, und dieses Signalpeptid wird üblicherweise durch die Zelle beim Export selektiv abgebaut. Signalsequenzen können mit einer Reihe von Proteinen assoziiert, die in Prokaryonten und Eukaryonten vorhanden sind, aufgefunden werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können konventionelle Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinante DNA-Techniken im Umfang des Fachwissens auf dem Gebiet eingesetzt werden. Solche Techniken werden vollständig in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: a Labora tory Manual", Zweite Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (hierin "Sambrook et al., 1989"); "DNA-Cloning: a Practical Approach", Band I und II (D.N. Glover Hrsg. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait Hrsg. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, Hrsg. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "a Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Klonierung und Sequenzbestimmung einer Polistinae-Gift-Hyaluronidase. Die Klonierung und Sequenzbestimmung dieser Polistinae-Giftenzyme ist besonders wichtig, da die cDNA-Klone unerwarteter Weise extra Nukleotidsequenzen enthalten, die das Polypeptid scheinbar nicht kodieren. Vespidgift-allergische Zustände sind üblich und in einigen empfindlichen Individuen kann eine allergische Reaktion zur Anaphylaxe führen, die potentiell tödlich ist. Wie bei den Vespiden im Allgemeinen spielen Polistinae-Giftkomponenten wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Ausbildung von Allergien. Es ist daher von großer Bedeutung, dass die Nukleotid- und Aminosäuresequenzinformation für die Polistinae-Giftallergene bekannt ist, so dass genaue diagnostische Information über die Natur des allergischen Zustandes, insbesondere spezifischer allergener Empfindlichkeiten, bestimmt werden kann, und wirksame therapeutische Behandlungen des entsprechenden allergischen Zustandes eingeleitet werden können. Das war unerwarteter Weise der Fall hier, da Polistinae cDNAs überraschenderweise mit nicht transkribierten Sequenzen aufgefunden wurden.
Isolierung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Wespengiftenzym kodiert
Die Isolierung der Nukleinsäuremoleküle, die Vespidgiftenzyme kodieren, wurde vollständig in dem U.S. Patent Nr. 5,593,877 beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft die unerwarteten und überraschenden Entdeckungen, dass Polistinae cDNAs "Introns" enthalten. Typischerweise werden Introns aus der mRNA ausgespleißt, und sind daher üblicherweise nicht in cDNAs zu finden. Die Sequenzen können Spleißvarianten darstellen.
Derivate eines Polistinae-Giftenzyms, Fragmente und Fusionsproteine (siehe infra) werden zusätzlich zur Verfügung gestellt sowie Nukleinsäuremoleküle, die diese kodieren.
Die vorliegende Erfindung stellt die vollständige Nukleinsäuresequenz eines Polistinae-Giftenzyms zur Verfügung. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung die Nukleinsäuresequenz einer Polistinae-Hyaluronidase (Papierwespe-) und eine Hyluronidase, insbesondere die Pol a-Hyaluronidse zur Verfügung.
In einer besonderen Ausführungsform wird, um ein Nukleinsäuremolekül zu erhalten, das ein Polistinae-Giftenzym kodiert, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit der schnellen Amplifikation der cDNA-Enden (RACE)-Technik, die durch Frohman et al. beschrieben wird (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1998, 85: 8998–9002; siehe auch Frohman, 1990, Amplifications: A Forum for PCR Users 5:11), zur Amplifikation eines Fragments kombiniert, das eine Sequenz kodiert, die das Polistinae-Giftenzym vor der Selektion umfasst. Oligonukleotidprimer, die ein Polistinae-Giftenzym der Erfindung darstellen, können als Primer in der PCR verwendet werden. Im Allgemeinen werden solche Primer synthetisch hergestellt. Sequenzen für solche Oligonukleotidprimer können aus der Aminosäuresequenzinformation abgeleitet werden. Solche Oligonukleotidsequenzen können nicht degeneriert sein, aber häufiger sind die Sequenzen degeneriert. Mehr bevorzugt basieren die Primer auf den Nukleinsäuresequenzen für die hierin offenbarten Polistinae-Giftenzyme. Die Oligonukleotide können als Primer verwendet werden, um durch PCR Sequenzen aus einer Quelle (RNA oder DNA), vorzugsweise einer cDNA-Bibliothek von potentiellem Interesse, zu amplifizieren. Zum Beispiel kann eine PCR verwendet werden, um eine Polistinae-Giftenzym-kodierende Sequenz aus einer cDNA Bibliothek aus der Polistinae-Säuredrüse zu amplifizieren. Die PCR kann z. B. durch Verwendung eines Perkin-Elmer Cetus Thermozyklers und der Taq-Polymerase (Gene Amp^®) durchgeführt werden.
Zur Isolierung eines Homologen eines Polistinae-Giftenzyms aus jeglicher Spezies von Polistinae kann man verschiedene unterschiedliche degenerierte Primer zur Verwendung z. B. in PCR-Reaktionen auswählen. Es ist auch möglich, die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, die bei Beginn der PCR-Reaktionen verwendet werden, zu variieren, um mehr oder weniger Grad an Nukleotidsequenzähnlichkeit zwischen einem Homologen eines Polistinae-Giftenzyms und einem spezifischen Polistinae-Giftenzym, das hierin offenbart wird, zu ermöglichen. Nach erfolgreicher Amplifikation eines Segments eines Homologen eines Polistinae-Giftenzyms kann das Segment kloniert und sequenziert werden und als eine Sonde zur Isolierung einer vollständigen cDNA oder eines genomischen Klons verwendet werden. Dieser wird wiederum die Bestimmung der vollständigen Nukleotidsequenz, die Analyse ihrer Expression und die Produktion ihres Proteinprodukts zur funktionellen Analyse, wie es infra beschrieben wird, ermöglichen. Auf diese Weise können zusätzliche Gene, die Polistinae-Giftenzyme kodieren, insbesondere Hyaluronidasen, identifiziert und exprimiert werden.
Gene, die ein Polistinae-Giftenzym kodieren, können aus einer geeigneten Bibliothek durch Untersuchung mit einer Sonde isoliert werden. Nützliche Sonden zur Isolierung eines Polistinae-Giftenzymgens können aus der hierin zur Verfügung gestellten Sequenzinformation generiert werden.
Eine Expressionsbibliothek kann durch Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Vorzugsweise wird eine cDNA-Bibliothek aus Zellen oder Geweben hergestellt, die ein Polistinae-Giftenzym exprimieren, d. h. Zellen aus der Giftdrüse, die in der Nähe des Giftsacks lokalisiert ist. Manchmal wird die Giftdrüse auch als Säuredrüse bezeichnet. Zum Beispiel können mRNA oder Gesamt-RNA isoliert werden, cDNA wird hergestellt und in einen Expressionsvektor ligiert (z. B. ein Plasmid- oder Bakteriophagenderivat), so dass diese in der Lage ist, durch die Wirtszelle, in die sie dann eingeführt wird, exprimiert zu werden. Verschiedene Untersuchungsassays können dann verwendet werden, um die positiven Klone auszuwählen. Zum Beispiel kann eine PCR mit geeigneten Primern, die basierend auf den hierin zur Verfügung gestellten Sequenzen synthetisiert werden können, verwendet werden. Eine PCR ist bevorzugt, da die amplifizierte Produktion direkt nachgewiesen werden kann, z. B. durch Ethidiumbromidfärbung. Alternativ dazu können die markierten Sonden, die aus den Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurden, zur Untersuchung der Kolonien verwendet werden. Obwohl die Gift(säure)drüse schwierig zu isolieren sein kann und die Menge an mRNA problematisch sein kann, kann eine spezifische PCR, basierend auf den Primern der vorliegenden Erfindung, durch das Ermöglichen einer spezifischen Amplifikation von Spurenmengen an mRNA oder cDNA oder sogar genomischer DNA diese Probleme lösen.
Alternativ dazu kann das Vorhandensein des Gens durch Assays nachgewiesen werden, die auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften sei nes exprimierten Produktes basieren. Zum Beispiel können cDNA Klone oder DNA Klone, die die richtigen mRNAs als Hybrid selektieren, ausgewählt werden, die ein Protein herstellen, das z. B. eine ähnliche oder identische elektrophoretische Wanderung, ein isoelektrisches Fokussierungsverhalten, eine proteolytische Verdaukartierung oder antigene Eigenschaften aufweist, die für ein Polistinae-Giftenzym bekannt sind.
Solche rekombinanten Proteine, die durch Bakterien exprimiert werden, z. B. Polistinae-Gifthyaluronidasen, können mit Antikörpern reagieren, die spezifisch für die nativen Proteine sind. Andere bakteriell exprimierte rekombinante Proteine wie Giftphospholipasen können nicht mit Antikörpern reagieren, die spezifisch für das native Protein sind. Somit ist es in Fällen, bei denen rekombinante Proteine immunreaktiv sind, möglich, positive Klone durch Immunblotten auszuwählen. Jedoch können bakteriell exprimierte eukaryontische Proteine nicht in eine aktive Konformation falten.
Im Allgemeinen kann gemäß der vorliegenden Erfindung jedes Verfahren zur Untersuchung der positiven Klone verwendet werden.
Alternativen zur Isolierung der Polistinae-Giftenzym- genomischen DNA oder cDNA umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, die chemische Synthese der Gensequenz aus der hierin zur Verfügung gestellten Sequenz.
Die oben genannten Verfahren sollen die Verfahren, durch die die Klone eines Polistinae-Giftenzyms erhalten werden können, nicht einschränken.
Es können eine große Anzahl von Vektor-Wirts-Systemen, die auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden. Mögliche Vektoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Plasmide oder modifizierte Viren, aber das Vektorsystem muss mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Solche Vektoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Bakteriophagen wie Lambda-Derivate oder Plasmide wie verschiedene pBR322-Derivate, z. B., pUC-, CR-, pGEX-Vektoren, pmal-c, pFLAG, etc. Das Einfügen in einen Klonierungsvektor kann z. B. durch Ligieren des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor durchgeführt werden, der komplementäre kohäsive Termini aufweist. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung enthalten die PCR-amplifizierten Nukleinsäuremoleküle der Erfindung 3'-überhängende A-Nukleotide und können direkt zur Klonierung in einem pCR-Vektor mit kompatiblen T-Nukleotidüberhängen verwendet werden (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Jedoch können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden, wenn die komplementären Restriktionsschnittstellen, die verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, nicht in dem Klonierungsvektor vorhanden sind. Alternativ dazu kann jegliche gewünschte Stelle durch Ligieren von Nukleotidsequenzen (Linkern) an die DNA-Termini hergestellt werden; diese ligierten Linker können spezifische chemisch synthetisierte Oligonukleotide, die Restriktionsendonukleaseerkennungssequenzen kodieren, umfassen. In einem alternativen Verfahren kann der gespaltene Vektor und ein Polistinae-Giftenzymgen durch homopolymeres "Tailing" modifiziert werden. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen durch Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation, etc. eingeführt werden, so dass viele Kopien der Gensequenz generiert werden.
In spezifischen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die das isolierte Polistinae-Giftenzymgen, die cDNA oder die synthetisierte DNA-Sequenz einbauen, die Generierung von mehreren Kopien des Gens. Somit kann das Gen in großen Mengen durch das Wachsen lassen von Transformanten, das Isolieren der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und, falls notwendig, das Isolieren des eingefügten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA erhalten werden.
Expression eines Polistinae-Giftallergen-Polypeptides oder Fragments
Wie oben aufgezeigt wird, enthalten die isolierten Nukleinsäuren, die Polistinae-Giftenzyme, insbesondere Polistes-Giftproteine kodieren, unerwartete Sequenzen, die in der cDNA abwesend sein sollten, um ein Protein zu kodieren, das zu anderen Polistinae-Giftenzymen ähnlich ist, z. B. wie sie in dem U.S. Patent Nr. 5,593,877 beschrieben werden. In einer Ausführungsform werden die "Intron"-enthaltenden Nukleinsäuren ohne weitere Modifikation exprimiert. In einer anderen Ausführungsform werden die Nukleinsäuren unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken modifiziert und beispielhaft infra dargestellt, oder wie in den oben zitierten Literaturstellen beschrieben wird, wie in Sambrook et al., um ein Protein mit einer Aminosäuresequenz eines nativen Polistinae-Giftenzyms herzustellen (obwohl, wie unten diskutiert wird, solch ein Protein eine unterschiedliche sekundäre oder tertiäre Struktur aufweisen kann oder andere Polypeptidsequenzen umfassen kann, die damit verbunden sind).
Die Nukleotidsequenz, die für ein Polistinae-Giftenzym kodiert, oder ein immunmodulatorisches Fragment, Derivat oder Analogon davon, kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden, d. h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingeführten Protein-kodierenden Sequenz enthält. Solche Elemente werden hierin ein "Promoter" genannt. Somit ist das Nukleinsäuremolekül, das das Polistinae-Giftenzym kodiert, funktionell mit dem Promoter assoziiert. Ein Expressionsvektor umfasst vorzugsweise auch einen Replikationsursprung. Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale können auch durch das native Gen, das ein Polistinae-Giftenzym kodiert, und/oder seine flankierenden Regionen zur Verfügung gestellt werden. Potentielle Wirts-Vektor-Systeme umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Säugetierzellsysteme, die mit einem Virus infiziert sind (z. B. Vaccinia-Virus, Adenovirus, etc.); Insektenzellsysteme, die mit einem Virus infiziert sind (z. B. Baculovirus); Mikroorganismen wie Hefe-enthaltende Hefevektoren; oder Bakterien, die mit einem Bakteriophagen, DNA, Plamid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind. Die Expressionselemente von Vektoren variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. Abhängig von dem verwendeten Wirts-Vektor-System kann jedes einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein rekombinantes Polistinae-Giftenzym der Erfindung oder ein immunmodulatorisches Fragment, oder Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, chromosomal nach Integration der Polistinae-Giftenzym-kodierenden Sequenz durch Rekombination exprimiert. Diesbezüglich kann jegliches einer Anzahl von Amplifikationssystemen verwendet werden, um große Mengen einer stabilen Genexpression zu erreichen (siehe Sambrook et al., 1989, supra, in Abschnitt 16.28).
Die Zelle, in der der rekombinante Vektor, der das Nukleinsäuremolekül umfasst, das das Polistinae-Giftenzym kodiert, wird in einem geeigneten Zellkulturmedium unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des Polistinae-Giftenzyms durch die Zelle bereit stellen. Das exprimierte Polistinae-Giftenzym kann aus der Kultur gemäß Verfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, gewonnen werden. Solche Verfahren werden im Detail infra beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Polistinae-Giftenzym – Fusionsprotein exprimiert werden. Ein Polistinae-Giftenzym – Fusionsprotein umfasst wenigstens einen funktionell aktiven Teil eines Nicht-Polistinae – Giftenzymproteins, der über eine Peptidbindung an wenigstens einen immunmodulatorischen Teil eines Polistinae-Giftenzyms gebunden ist. Die Nicht-Polistinae – Giftenzymsequenzen können Amino- oder Carboxyterminal zu den Polistinae-Giftenzymsequenzen vorliegen. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das solch ein Fusionsprotein kodiert, umfasst eine Sequenz, die wenigstens einen funktionell aktiven Teil eines Nicht-Polistinae-Giftenzyms kodiert, die im Leserahmen mit der kodierenden Sequenz eines Polistinae-Giftenzyms verbunden ist. Es kann eine Spaltstelle für eine spezifische Protease, z. B. Faktor Xa, vorzugsweise an der Bindungsstelle der zwei Proteine kodiert sein.
In einer anderen besonderen Ausführungsform wird ein Fragment des Polistinae-Giftenzyms als ein freies (Nicht-Fusions-) Protein exprimiert.
In einer anderen Ausführungsform kann eine periplasmatische Form des Fusionsproteins (eine Signalsequenz enthaltend) für den Export des Proteins in das Periplasma von Escherichia coli hergestellt werden. Der Export in das Periplasma kann die richtige Faltung des exprimierten Proteins unterstützen.
Jegliches der zuvor in dem Patent Nr. 5,593,877 für die Einfügung von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschriebenen Verfahren kann zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die ein Gen enthalten, das aus geeigneten Transkriptions-/Translationskontrollsignalen und den Protein-kodierenden Sequenzen besteht. Solche Verfahren können in vitro rekombinante DNA- und synthetische Techniken und in vivo Rekombinationen (genetische Rekombination) umfassen. Die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polistinae-Giftenzym oder ein immunmodulatorisches Fragment davon kodiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz der Art reguliert werden, dass das Polistinae-Giftenzymprotein oder Peptid in einem Wirt, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, exprimiert wird. Zum Beispiel kann die Expression eines Polistinae-Giftenzymproteins durch jegliches Promoter/Verstärker element, das auf dem Gebiet bekannt ist, kontrolliert werden, aber diese regulatorischen Elemente müssen in dem Wirt funktionell sein, der zur Expression ausgewählt wird. Promotoren, die verwendet werden können, um die Polistinae-Giftenzymgenexpression zu steuern, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, den sehr frühen CMV-Promoter, die frühe SV40 Promoterregion (Benoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den Promoter, der in dem 3' langen terminalen Repeat des Rous sarcoma Virus enthalten ist (Yamamato, et al., 1980, Cell 22: 787–797), den Herpes Thymidin-Kinase Promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42); prokaryontische Expressionsvektoren wie den β-Lactamase Promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727–3731) oder der tac-Promoter (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25); siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; Promoterelmente aus Hefe und anderen Pilzen wie der Gal 4Promoter, der ADC (Alkoholdehydrogenase) Promoter, der PGK (Phosphoglycerinkinase) Promoter, der alkalische Phosphatase Promoter; und die tierischen Transkriptionskontrollregionen, die Gewebespezifität aufzeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden.
Sobald ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert ist, können verschiedene Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden, um dieses zu vermehren. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und Wachstumsbedingungen etabliert sind, können die rekombinanten Expressionsvektoren in Mengen vermehrt und hergestellt werden. Wie zuvor erklärt wurde, umfassen die Expressionsvektoren, die verwendet werden können, sind aber nicht eingeschränkt auf, die folgenden Vektoren oder deren Derivate: menschliche oder tierische Viren wie Vaccinia-Virus oder Adenovirus; Insektenviren wie Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagenvektoren (z. B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder modifiziert und das Genprodukt in einer gewünschten spezifischen Weise prozessiert. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die translationale und post-translationale Prozessierung und Modifikation (z. B. Glycosylierung, Spaltung [z. B. der Signalsequenz]) von Proteinen. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können ausgewählt werden, um die ge wünschte Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins sicherzustellen. Zum Beispiel kann die Expression in einem bakteriellen System verwendet werden, um ein nicht-glycosyliertes Kernproteinprodukt herzustellen. Jedoch kann das in Bakterien exprimierte Enzymprodukt nicht korrekt gefaltet sein. Die Expression in Hefe kann ein glycosyliertes Produkt herstellen. Die Expression in Insektenzellen kann verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit einer "nativen" Glycosylierung und Faltung eines heterologen Polistinae-Giftenzyms zu erhöhen. Zudem können unterschiedliche Vektor/Wirts-Expressionssysteme die Prozessierungsreaktionen wie proteolytische Spaltungen in einem unterschiedlichen Ausmaß beeinflussen. Es ist interessant, festzustellen, das beobachtet wurde, dass die Glycosylierung und korrekte Faltung für die immunmodulatorische Aktivität eines Polistinae-Giftallergens nicht wesentlich ist, da das bakteriell hergestellte Allergen in einem T-Zellproliferationsassay aktiv ist.
Vektoren werden in die gewünschten Wirtszellen durch Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, eingeführt, z. B. Transfektion, Elektroporation, Elektrotransfer, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphatfällung, Lipofektion (Lysosomenfusion), Verwendung einer Genpistole oder eines DNA-Vektortransporters (siehe z. B. Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963–967; Wu und Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621–14624; Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, angemeldet am 15. März 1990).
Bevorzugte Vektoren, insbesondere zur Proteinherstellung in vivo, sind virale Vektoren wie Lentiviren, Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Vaccinia-Viren, Baculoviren und andere rekombinante Viren mit wünscheswertem zellulären Tropismus. Somit kann ein Vektor, der ein Polistinae-Giftenzym kodiert, in vivo oder ex vivo unter Verwendung eines viralen Vektors oder durch die direkte Einführung von DNA eingeführt werden. Die Expression in Zielgeweben kann durch das Zielen des transgenen Vektors auf spezifische Zellen durchgeführt werden, wie durch einen viralen Vektor oder Rezeptorliganden oder durch Verwendung eines Gewebe-spezifischen Promoters oder beiden. Gezielte Genablieferung wird in der internationalen Patentveröffentlichung WO 954/28494, die im Oktober 1995 veröffentlicht wurde, beschrieben.
Üblicherweise sind für in vivo oder ex vivo Ziel- und Expressionsprozeduren verwendete virale Vektoren DNA-basierende Vektoren und retrovirale Vektoren. Verfahren zur Her stellung und Verwendung viraler Vektoren sind auf dem Gebiet bekannt (siehe z. B. Miller und Rosman, BioTechniques, 7: 980–990, 1992). Vorzugsweise sind die viralen Vektoren replikationsdefizient, d. h., sie sind nicht in der Lage, autonom in der Zielzelle zu replizieren. Vorzugsweise ist das replikations-defiziente Virus ein minimales Virus, d. h. es hat nur noch die Sequenzen seines Genoms, die für die Verkapselung des Genoms zur Herstellung viraler Partikel notwendig sind.
Virale DNA-Vektoren umfassen ein attenuiertes oder defizientes DNA-Virus wie, aber nicht eingeschränkt auf, das Herpes simplex-Virus (HSV), Papillomavirus, Epstein Barr-Virus (EBV), Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus (AAV), Vaccinia-Virus und Ähnliche. Beispiele von besonderen Vektoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, einen defizitären Herpesvirus I (HSV1)- Vektor (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320–330, 1991; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/21807, veröffentlicht am 29. September 1994; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/05263, veröffentlicht am 2. April 1994); einen attenuierten Adenovirus-Vektor, wie der Vektor, der durch Stratford-Perricaudet et al. beschrieben wird (J. Clin. Invest. 90: 626–630, 1992; siehe auch La Salle et al., Science 259: 988–990, 1993); und einen defizienten Adeno-assoziierten Virus-Vektor (Samulski et al., J. Virol. 61: 3096–3101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63: 3822–3828, 1989; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3988–3996, 1988).
Verschiedene Firmen prouzieren kommerziell virale Vektoren, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, Avigen, Inc. (Alameda, CA; AAV-Vektoren), Cell Genesys (Foster City, CA; retrovirale, adenovirale, AAV-Vektoren und lentivirale Vektoren), Clontech (retrovirale und baculovirale Vektoren), Genovo Inc. (Sharon Hill, PA; adenovirale und AAV-Vektoren), Genvec (adenovirale Vektoren), IntroGene (Leiden, Niederlande; adenovirale Vektoren), Molecular Medicine (retrovirale, adenovirale, AAV- und Herpes-virale Vektoren), Norgen (adenovirale Vektoren), Oxford BioMedica (Oxford, Großbritannien; lentivirale Vektoren) und Transgene (Strassburg, Frankreich; adenovirale, Vaccinia-, retrovirale und lentivirale Vektoren).
In einer anderen Ausführungsform kann der Vektor in vivo durch Lipofektion als nackte DNA oder mit anderen transfektionsunterstützenden Mitteln (Peptide, Polymere, etc.) eingeführt werden. Synthetische kationische Lipide können verwendet werden, um Liposomen zur in vivo Transfektion eines Gens, das einen Marker kodiert, herzustellen (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413–7417, 1987; Felgner und Ringold, Science 337: 387–388, 1989; siehe Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8027–8031, 1988; Ulmer et al., Science 259: 1745–1748, 1993). Nützliche Lipidverbindungen und Zusammensetzungen zum Transfer von Nukleinsäuren werden in den internationalen Patentveröffentlichungen WO 95/18863 und WO 96/17823 und in dem U.S. Patent Nr. 5,459,127 beschrieben. Lipide können chemisch an andere Moleküle zum Zweck der Zielgebung gekoppelt werden (siehe Mackey et al., supra). Gezielte Peptide, z. B. Hormone oder Neutrotransmitter und Proteine wie Antikörper oder Nicht-Peptidmoleküle könnten chemisch an Liposomen gekoppelt werden.
Andere Moleküle sind auch zur Erleichterung der Transfektion einer Nukleinsäure in vivo nützlich, wie ein kationisches Oligopeptid (z. B. internationale Patentveröffentlichung WO 95/21931), Peptide, die aus DNA-Bindungsproteinen abgeleitet sind (z. B. internationale Patentveröffentlichung WO 96/25508), oder ein kationisches Polymer (z. B. internationale Patentveröffentlichung WO 95/21931).
Alternativ dazu können nicht-virale DNA-Vektoren zur Gentherapie in die gewünschten Wirtszellen durch Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, eingeführt werden, z. B. Elektroporaton, Mikroinjektikon, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphatfällung, Verwendung einer Genpistole (ballistische Transfektion; siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,204,253, U.S. Patent Nr. 5,853,663, U.S. Patent Nr. 5,885,795 und U.S. Patent Nr. 5,702,384 und siehe Sanford, TIB-TECH, 6: 299–302, 1988; Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 11478–11482, 1993; und Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 1568–9572, 1990), oder Verwendung eines DNA-Vektortransporters (siehe z. B. Wu, et al., J. Biol. Chem. 267: 963–967, 1992; Wu und Wu, J. Biol. Chem. 263: 14621–14624, 1988; Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, angemeldet am 15. März 1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726–2730, 1991). Rezeptor-vermittelte DNA-Lieferansätze können auch verwendet werden (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147–154, 1992; Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432, 1987). Die U.S. Patente Nr. 5,580,859 und 5,589,466 offenbaren die Ablieferung exogener DNA-Sequenzen, die frei von Transfektions-erleichternden Mitteln sind, in ein Säugetier. Kürzlich wurde eine in vivo DNA-Transfertechnik mit relativ geringer Spannung und hoher Effizienz, die Elektrotransfer genannt wird, beschrieben (Mir et al., C.P. Acad. Sci., 321: 893, 1998; WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175).
Sowohl cDNA- wie auch genomische Sequenzen können kloniert und exprimiert werden.
Es ist zudem vorgesehen, dass die Polistinae-Giftenzyme der vorliegenden Erfindung oder Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, oder immunmodulatorische Fragmente davon synthetisch hergestellt werden können, z. B. durch Festphasenpeptidsynthese.
Isolierung und Aufreinigung
Sobald das rekombinante Polistinae-Giftenzymprotein identifiziert ist, kann es durch Standardverfahren einschließlich einer Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größen-klassifizierende Säulenchromatographie), Zentrifugation, differenzielle Löslichkeit oder durch jegliche andere Standardtechnik für die Aufreinigung von Proteinen isoliert und aufgereinigt werden.
In einer besonderen Ausführungsform kann ein Polistinae-Giftenzym oder Fragmente davon konstruiert werden, um ungefähr sechs Histidylreste zu umfassen, was es möglich macht, die selektive Isolierung des rekombinanten Proteins auf einer Nickel-Chelat-Säule durchzuführen. In einem bevorzugten Aspekt werden die Proteine zusätzlich durch Umkehrphasenchromatographie aufgereinigt.
In einer anderen Ausführungsform, in der das rekombinante Polistinae-Giftenzym als ein Fusionsprotein exprimiert wird, kann der Nicht-Polistinae – Giftenzymanteil des Fusionsproteins zur Affinitätsreinigung verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Antikörper, der spezifisch für den Nicht-Polistinae – Giftenzymanteil des Fusionsproteins ist, auf einer festen Phase, z. B. einer Cyanogenbromid-aktivierten Sepharose, immobilisiert werden und verwendet werden, um das Fusionsprotein aufzureinigen. In einer anderen Ausführungsform kann ein Bindungspartner des Nicht-Polistinae – Giftenzymanteils des Fusionsproteins, wie ein Rezeptor oder Ligand, immobilisiert werden und zur Affinitätsaufreinigung des Fusionsproteins verwendet werden.
In einer Ausführungsform wird ein Polistinae-Giftenzym – Fusionsprotein, vorzugsweise aufgereinigt, ohne weitere Modifikation verwendet, d. h. ohne Spaltung oder anderweitiges Entfernen des Nicht-Polistinae – Giftenzym-Anteils des Fusionsproteins. In einer bevorzugten Ausführungsform des Polistinae-Giftenzym – Fusionsproteins kann dieses therapeutisch verwendet werden, z. B. zur Modulierung einer Immunreaktion.
In einer weiteren Ausführungsform wird das aufgereinigte Fusionsprotein behandelt, um das Nicht-Polistinae – Giftenzymprotein oder einen Teil davon aus dem Polistinae-Giftenzym abzuspalten. Zum Beispiel kann, wenn das Fusionsprotein so hergestellt wurde, dass es eine Protease-empfindliche Spaltstelle umfasst, das Fusionsprotein mit der Protease behandelt werden, um die Protease-spezifische Stelle zu spalten und das Polistinae-Giftenzym freizusetzen.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen solche rekombinanten Polistinae-Giftenzyme diejenigen, die als primäre Aminosäuresequenz die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz enthalten, wie sie im Wesentlichen in 4 (SEQ ID NO: 4) gezeigt wird, sowie Varianten davon mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Derivate und Analoge von Polistinae-Giftenzymen
Die Produktion und Verwendung von Derivaten und Analoga, die mit Polistinae-Giftenzymen verwandt sind, sind immunmodulatorisch, d. h. in der Lage, eine Antigenspezifische Immunreaktion zu modulieren. Zudem können Analoga oder Derivate der Polistinae-Giftenzyme, insbesondere Hyaluronidase aus Polistes annularis, verwendet werden, um Immunsystem-assoziierte Krankheiten oder Erkrankungen oder ein Symptom, das damit verbunden ist, zu behandeln. Das Derivat oder das Analogon kann an ein Polistinae-Giftenzym- spezifisches Immunglobulin einschließlich IgG und IgE binden. Derivate oder Analoga des Polistinae-Giftenzyms können auf die gewünschte immunmodulatorische Aktivität durch Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, getestet werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, die Assays, die infra beschrieben werden.
Insbesondere können die Polistinae-Giftenzym-Derivate durch das Verändern der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen hergestellt werden. Bedingt durch die Degeneration der Nukleotid-kodierenden Sequenzen können auch andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die Nukleinsäure kodieren, die ein Polistinae-Giftenzym kodiert, in der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Nukleotidsequenzen, die das gesamte oder einen Teil eines Gens umfassen, das das Polistinae-Giftenzym kodiert, die durch Substitution von verschiedenen Kodons geändert sind, die den gleichen Aminosäurerest innerhalb der Sequenz kodieren, wodurch eine schweigende Änderung hergestellt wird. In ähnlicher Weise umfassen die Derivate, sind aber nicht eingeschränkt auf, solche, die als primäre Aminosequenz die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz des Polistinae-Giftenzyms enthalten, einschließlich geänderte Sequenzen, in denen funktionell äquivalente Aminosäurereste gegen Reste innerhalb der Sequenz ausgetauscht sind, die in einer konservativen Aminosäuresubstitution resultieren. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure von ähnlicher Polarität substituiert werden, die als ein funktionelles Äquivalent dient, was in einer schweigenden Änderung resultiert. Substitutionen für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beispiel umfassen die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparagin und Glutaminsäure.
Derivate oder Analoga des Polistinae-Giftenzym umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, solche, die im Wesentlichen homolog zu einem Polistinae-Giftenzym oder Fragmenten davon sind, oder deren kodierende Nukleinsäure in der Lage ist, an ein Nukleinsäuremolekül zu hybridisieren, das ein Polistinae-Giftenzym kodiert. Die Hybridisierung kann unter moderat stringenten bis hoch stringenten Bedingungen abhängig von dem Grad der Sequenzähnlichkeit vorkommen, wie auf dem Gebiet wohlbekannt ist.
Derivate und Analoga können durch verschiedene Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Die Manipulationen, die in deren Herstellung resultieren, können auf der Gen- oder Proteinebene vorkommen. Zum Beispiel kann die Nukleinsäuresequenz des klonierten Polistinae-Giftenzyms durch jegliche der vielen Strategien modifiziert werden, die auf dem Gebiet bekannt sind (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuklease(n) gespalten werden, gefolgt durch weitere enzymatische Modifikation, falls erwünscht, isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Herstellung des Gens, das ein Derivat oder Analogon eines Polistinae-Giftenzyms kodiert, sollte darauf geachtet werden, sicher zu stellen, dass das modifizierte Gen in dem gleichen Translationsleseraster wie das Polistinae-Giftenzym verbleibt und nicht durch Translationsstoppsignale unterbrochen wird.
Zusätzlich kann das Gen, das ein Polistinae-Giftenzym kodiert, in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminations-Sequenzen herzustellen und/oder zu zerstören, oder Variationen in den kodierenden Regionen zu kreieren und/oder neue Restriktionsendonukleasestellen zu schaffen oder bereits existierende zu zerstören, um eine weitere in vitro Modifikation zu erleichtern. Jegliche Technik zur Mutagenese, die auf dem Gebiet bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, die in vitro Positions-gerichtete Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551; Zoller und Smith, 1984, DNA 3: 479–488; Oliphant et al., 1986, Gene 44: 177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 710), Verwendung von TAB^® Linker (Pharmacia), etc. PCR-Techniken sind zur Positions-gerichteten Mutagenese bevorzugt (siehe Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology; Principles and Applicatons for DNA Amplification, H. Erlich, Hrsg., Stockton Press, Kapitel 6, S. 61–70).
Mutationen des rekombinanten Polistinae-Giftenzyms können auch auf der Proteinebene hergestellt werden. Rekombinante Polistinae-Giftenzymfragmente oder andere Derivate oder Analoga, die unterschiedlich während oder nach der Translation modifiziert werden, z. B. durch Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Reduktion und Carboxymethylierung, Derivatisierung durch bekannte schützende/blockierende Gruppen, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden, etc. Jede der vielen chemischen Modifikationen kann durch bekannte Techniken durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, eine spezifische chemische Spaltung durch Cyanbromid, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH₄; Acetylierung, Formylierung, Oxidation, Reduktion; metabolische Synthese in der Gegenwart von Tunicamycin; etc.
In einer besonderen Ausführungsform wird das Polistinae-Giftenzym oder immunmodulatorische Fragment davon in einem Insektenzellexpiessionssystem, z. B. unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors, exprimiert. Wie oben aufgezeigt wurde, sollte dies eine "native" Glycosylierung und Struktur, insbesondere sekundäre und tertiäre Struktur des exprimierten Polypeptids ergeben. Die native Glycosylierung und Struktur des exprimierten Polypeptids kann für diagnostische Verwendungen sehr wichtig sein, da Enzym-spezifische Antikörper, die in diagnostischen Assays nachgewiesen werden, spezifisch für das native Enzym sind, d. h. wie es durch einen Stich von einem Vespiden eingeführt wird.
Aktivitätsassays mit Peptiden der Erfindung
Es sind verschiedene Assays in der Immunologie zur Evaluierung der immunmodulatorischen Aktivität eines Antigens bekannt. Zum Beispiel können die Polistinae-Giftenzymproteine, die durch Expression der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung hergestellt werden, in diagnostischen Assays für allergische Erkrankungen verwendet werden, die im Detail infra beschrieben werden. Im Allgemeinen können solche Proteine auf die Fähigkeit hin getestet werden, Antikörper zu binden, die spezifisch für das Enzym sind. Vorzugsweise sind solche Antikörper, die in dem diagnostischen Assay nachgewiesen werden, aus der IgE-Klasse. Jedoch ist es wichtig, festzustellen, dass natürliche Allergenspezifische Antikörper schwach an denaturierte Vespidgiftallergene binden. Polistinae-Giftenzyme, die in eukaryontischen Expressionssystemen und insbesondere in Insektenzellexpressionssystemen hergestellt werden, können die korrekte Struktur zur Antikörperbindung aufweisen. Polistinae-Giftenzyme, die in bakteriellen Expressionssystemen exprimiert werden, können dieses nicht, und diese benötigen daher eine Umfaltung vor der Verwendung in einen diagnostischen Assay zur Antikörperbindung.
In einer anderen Ausführungsform können die Proteine der Erfindung in einem Proliferationsassay auf T-Zell-Reaktionen getestet werden. Für solche T-Zell-Reaktionsassays scheint das Expressionssystem, das zur Herstellung des Enzyms verwendet wird, keine Wirkung auf die immunmodulatorische Aktivität des Proteins auszuüben. Im Allgemeinen werden Lymphozyten aus einem sensibilisierten Wirt erhalten. Der Wirt kann eine Maus sein, die mit einem Polistinae-Giftenzym, wie einer Polistinae-Gift-Hyaluronidase, die rekombinant gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, immunisiert wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden periphere Blutleukozyten aus einem Menschen erhalten, der empfindlich auf Vespidgift ist. Unter Verwendung von Techniken die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, kann die T-Lymphozyten-Reaktion auf das Protein in vitro gemessen werden. In einer besonderen Ausführungsform weiter unten werden T-Zell-Reaktionen durch Messung der Aufnahme von ³H-Thymidin nachgewiesen, die sich mit der DNA-Synthese erhöht, die mit einer Proliferation assoziiert ist.
Die Zellproliferation kann auch unter Verwendung eines MTT-Assays (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55–63; Niks und Otto, 1990, J. Immunol. Methods, 130: 140–151) nachgewiesen werden. Es kann jegliches Verfahren zum Nachweis der T-Zell-Proliferation, das auf dem Gebiet bekannt ist, mit dem Polistinae-Enzym verwendet werden, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
In ähnlicher Weise können Lymphokin-Produktionsassays gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. In einer Ausführungsform kann die Lymphokinproduktion durch Verwendung immunologischer oder co-stimulatorischer Assays bestimmt werden (siehe z. B. Fehlner et al., 1991, J. Immunol. 146: 799) oder unter Verwendung der ELISPOT-Technik (Czerkinsky et al., 1988, J. Immunol. Methods, 110: 29). Alternativ dazu kann die mRNA für die Lymphokine nachgewiesen werden, z. B. durch Amplifikation (siehe Brenner et al., 1989, Biotechniques, 7: 1096) oder in situ Hybridisierung (siehe z. B. Kasaian und Biron, 1989, J. Immunol., 142: 1287). Von besonderem Interesse sind solche Individuen, deren T-Zellen Lymphokine produzieren, die mit IgE-Isotyp Wechselvorgängen assoziiert sind, z. B. IL-4 und IL-5 (Purkeson und Isakson, 1992, J. Exp. Med., 175: 973–982). Auch von Interesse sind Polypeptidfragmente des Polistinae- Giftenzyms, die Epitope enthalten, die durch T-Zellen erkannt werden, die in den IgE-Wechselvorgängen involviert sind.
Somit können in einem bevorzugten Aspekt die Proteine, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, in in vitro Assays mit periphären Blutlymphozyten verwendet werden, oder, mehr bevorzugt, Zelllinien, die aus peripheren Blutlymphozyten abgeleitet sind, die aus Vespidgiftenzym-empfindlichen Individuen erhalten wurden, zum Nachweis der Sezernierung von Lymphokinen, die üblicherweise mit allergischen Reaktionen assoziiert sind, z. B. IL-4. Solche Assays können anzeigen, welche Giftkomponente oder Komponenten für den allergischen Zustand verantwortlich sind. Wichtiger noch, die Fragmente des Polistinae-Giftenzyms können getestet werden. Auf diese Art können spezifische Epitope, die für T-Zell-Reaktionen verantwortlich sind, die mit einer allergischen Reaktion assoziiert sind, identifiziert werden. Die Sequenzen solcher Epitope können mit anderen Vespidgiftenzymen und mit Umgebungs- oder autologen Proteinen zur Bestimmung, ob es Sequenzähnlichkeiten gibt, die eine mögliche Kreuzreaktivität nahelegen, verglichen werden. Die Peptide können auf die Fähigkeit getestet werden, T-Zell-Anergie zu induzieren, z. B. durch Verabreichung einer Mega-Dosis, Modifikation zur Herstellung eines Epitopantagonisten, Verabreichung in der Abwesenheit des geeigneten co-stimulatorischen Signals und andere Verfahren, von denen angenommen wird, dass sie in T-Zell-Anergie resultieren. Peptide, die solche Epitope enthalten, sind ideale Kandidaten für therapeutische Mittel.
In einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung direkt in Assays verwendet werden, um das Ausmaß der Kreuzreaktivität mit anderen Umgebungsproteinen und/oder homologen Proteinen nachzuweisen, mit denen sie Sequenzähnlichkeiten aufweisen. Insbesondere können die Fragmente der Polistinae-Giftenzyme, die Sequenzähnlichkeiten mit solchen Umgebungs- und insbesondere homologen Proteinen aufweisen, auf Kreuzreaktivität mit Antikörpern oder T-Zellen, die für solche Proteine spezifisch sind, untersucht werden. In einer besonderen Ausführungsform kann die Kreuzreaktivität der Polistinae-Gift-Hyaluronidase mit dem Sperma-Membranprotein PH-20 bewertet.
Diagnostische und therapeutische Verwendungen der Polistinae-Giftenzympolypeptide
Die vorliegende Erfindung stellt eine reiche Quelle eines reinen Polistinae-Giftenzyms zur Verfügung, die durch rekombinante Techniken hergestellt wird. Alternativ dazu können mit der gegebenen Sequenzinformation der vorliegenden Erfindung Polypeptidfragmente, Derivate oder Analoga der Polistinae-Giftenzyme vorteilhaft durch Peptidsynthese hergestellt werden.
Die Erfindung schlägt die Verwendung von Polistinae-Giftenzymen oder immunmodulatorischen Fragmenten, oder Varianten mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 zur Herstellung von diagnostischen oder therapeutischen Zusammensetzungen, zur Verwendung in der Diagnose und Therapie von Vespidgiftallergen-spezifischen allergischen Zuständen, zur Behandlung Immunsystem-assoziierter Zustände und zur Modulierung der Immunreaktion in einem Säugetier gegen ein Immunogen vor. Insbesondere werden Polistes-Hyaluronidase, genauer gesagt, Pol a-Hyaluronidase oder immunmodulatorische Fragmente, oder Varianten mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 zur Verwendung in der Diagnose, Therapie, Behandlung und Modulierung einer Immunreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen.
Diagnostische Verfahren
Als Verwendung hierin umfasst der Begriff Diagnose in vitro und in vivo diagnostische Assays. Im Allgemeinen sind solche Assays entwickelt, um die Aktivität von IgE-Antikörpern zu messen, die spezifisch für ein gegebenes Allergen sind. Solche diagnostischen Assays hängen stark von der Verfügbarkeit des reinen Allergens ab. Dies ist besonders wahr für die Bestimmung der Empfindlichkeit gegen eine spezifische Allergenkomponente eines Vespidgiftes. In vitro diagnostische Assays auf Enzymempfindlichkeit umfassen den Radioimmunassay (RIA), den immunradiometrischen Immunassay (IR-MA), den Radio-allergosorbierenden Test (RAST), den Enzym-gebundenen immunsorbierenden Assay (ELISA), ELISPOT, den magnetischen allergosorbierenden Assay, Immunblots, Histaminfreisetzungsassays und Ähnliche.
Ferner kann man das Vorhandensein von Epitopen bestimmen, die überwiegend mit IgE-Antikörpern oder mit anderen Isotypen, z. B. IgG reaktiv sind. Solche Epitope können überlappen oder einzigartig sein. Insbesondere können Fragmente der Polistinae-Giftenzyme der Erfindung verwendet werden, um solche spezifischen B-Zell-Epitope zu identifizieren. Die Identifizierung von spezifischen Epitopen kann eine Basis zur Entwicklung von Therapien, wie sie weiter unten beschrieben werden, zur Verfügung stellen.
Außerdem kann man in vitro diagnostische Assays auf periphere Blutlymphozyten wie sie oben beschrieben werden, verwenden. Solche diagnostischen Assays können detaillierte Information über die Enzym-spezifischen T-Zell-Reaktionen, den Phänotyp der T-Zell-Reaktion und vorzugsweise das T-Zell-Epitop des Enzyms, das in die T-Zell-Reaktionen involviert ist, geben. Das immundominante Epitop und das Epitop, das in IgE-Isotypen – Klassenwechselvorgänge involviert ist, kann nachgewiesen werden, wenn es nicht dasselbe ist. Insbesondere können die T-Zell-Epitope der Polistinae-Giftenzyme, die eine Proliferation und/oder Lymphokinsezernierung aus T-Zellen eines Phänotyps, der mit IgE-Isotyp – Klassenwechselvorgängen assoziiert ist, stimulieren, für ein bestimmtes Individuum oder eine Klasse von Individuen identifiziert werden, die einen MHC-Haplotyp oder eine überwiegende Expression der variablen Region des T-Zell-Rezeptors oder beides gemeinsam haben.
In vivo Assays auf Allergenität bestehen im Allgemeinen aus Hautkontaktempfindlichkeits-Assays, bei denen seriell verdünnte Mengen eines Allergens entweder subkutan oder intradermal in die Haut eines Patienten verabreicht werden und Ring- und Erythema-Reaktionen nachgewiesen werden. Wie bei den in vitro Assays, erhöht die Verfügbarkeit des reinen Giftenzyms den Wert der Ergebnisse der in vivo diagnostischen Assays erheblich, da eine Kreuzreaktivität mit Unreinheiten in den Extrakten, die aus Vespidgiftsäcken hergestellt wurden, vermieden werden kann.
Therapeutische Verfahren
Therapeutische Zusammensetzungen der Erfindung (siehe unten) können in der Immuntherapie, die auch als Hyposensibilisierungstherapie bezeichnet wird, verwendet werden. Die Immuntherapie hat sich bei allergischen Erkrankungen, insbesondere der Insektenallergie, als wirksam herausgestellt. Allergene werden parenteral über einen lan gen Zeitraum in sich langsam erhöhenden Dosierungen verabreicht. Solch eine Therapie kann besonders wirksam sein, wenn das Allergen oder die Allergene, gegen die der Patient empfindlich ist, spezifisch identifiziert wurden, und die Therapie sich auf dieses) Allergene) richtet. Somit ist die Verfügbarkeit von reinem Polistinae-Giftenzym in großen Mengen für eine Immuntherapie einer Allergie von Bedeutung.
In einer anderen Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Polypeptiden, die wenigstens ein immunmodulatorisches T-Zell-Epitop eines Polistinae-Giftenzyms umfassen, zur Induzierung einer spezifischen T-Zell-Allergie gegen ein Vespidgiftenzym. Die Identifizierung solcher Peptide wird oben beschrieben. Mehr bevorzugt kann ein Peptid, das ein solches T-Zell-Epitop umfasst und kein B-Zell-Epitop aufweist, an einen Patienten verabreicht werden. Das Vorhandensein von B-Zell-Epitopen auf einem Allergen kann eine unerwünschte systemische Reaktion bewirken, wenn das Allergen zur Immuntherapie verwendet wird. Somit ist es ein besonderer Vorteil der Erfindung, Allergen-Polypeptide zur Verfügung zu stellen, die keine unerwünschten systemischen Effekte bewirken.
In einer Ausführungsform können ein oder mehrere Polypeptidfragmente subkutan injiziert werden, um die T-Zell-Reaktionen auf das gesamte Molekül zu verringern, z. B. wie es in Brine et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 7608–12) beschrieben wird.
In einer anderen Ausführungsform kann ein oder mehrere Polypeptidfragmente intranasal verabreicht werden, um Allergen-spezifische Reaktionen in nativen oder sensibilisierten Probanden zu unterdrücken (siehe z. B. Hoyne et al., 1993, J. Exp. Med., 178: 1783–88).
Von der Verabreichung eines Polistinae-Giftenzympeptids der Erfindung wird erwartet, dass eine Anergie induziert, die in der Unterbrechung der Allergen-spezifischen Antikörperherstellung oder Allergen-spezifischen T-Zell-Reaktion oder beidem resultiert und somit eine therapeutische Wirkung aufweist.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird die Peptid-basierende Therapie zur Induzierung einer T-Zell-Anergie für jedes Individuum oder eine Gruppe von Individuen einzeln optimiert. Unter Verwendung der diagnostischen Verfahren der vorliegenden Er findung können das spezifische T-Zell-Epitop oder die Epitope eines Vespidgiftenzyms, das in die allergische Reaktion involviert ist, identifiziert werden. Peptide, die diese Epitope umfassen, können dann in einer individualisierten Immuntherapie verwendet werden.
Behandlung von Immunsystem-assoziierten Erkrankungen oder Krankheiten oder einem damit assoziierten Symptom
Wie oben erklärt wird, betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide zur Behandlung von Immunsystem-assoziierten Erkrankungen oder Krankheiten, oder zur Modulierung einer Immunreaktion in einem Säugetier gegen ein Immunogen, wobei die Polypeptide durch isolierte Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, die Polistinae-Giftenzyme wie Hyaluronidase aus Polistes annularis kodieren. Insbesondere haben Komponenten des Vespidgiftes, insbesondere Hyaluronidase, Anwendungen bei der Modulierung einer Immunreaktion eines Probanden gegen verschiedene Immunogene wie Pathogene und Viren, um nur einige zu nennen. In einer besonderen Ausführungsform modulieren Komponenten eines Polistinae-Gifts und insbesondere Hyaluronidase aus Polistes annularis und konservierte Varianten davon, Fragmente davon oder Analoga oder Derivate davon das Immunsystem eines Probanden, um eine erhöhte Stabilität herzustellen, um Pathogene und Viren zu bekämpfen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, HIV, Herpes Simplex-Virus oder Papilloma-Virus. In einer besonderen Ausführungsform umfasst ein solches Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Probanden, die ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das eine DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst, degenerierte Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, immunmodulatorische Fragmente davon oder ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das damit hybridisierbar ist, umfasst, wobei das Polypeptid einen antigenen Teil eines T-Zell-Epitops oder einen immunmodulatorischen Teil eines B-Zell-Epitops von Polistes annularis-Hyaluronidase umfasst.
Zudem wurde herausgefunden, dass Komponenten des Polistinae-Gifts wie Hyaluronidase aus Polistes annularis, auch Anwendungen bei der Behandlung einer Immunsystem-assoziierten Krankheit oder Erkrankung oder eines damit assoziierten Symptoms haben. Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Immunsystem-assoziierte Krankheit oder Erkrankung" auf eine Krankheit oder Erkrankung, die eine Immunreaktion in einem Probanden auslöst, oder Auswirkungen auf die Fähigkeit des Immunsystems zur Reaktion auf ein Immunogen aufzeigt. Beispiele von Immunsystem-assoziierten Krankheiten oder Erkrankungen, die mit Mitteln und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, eine pathogene Erkrankung oder Krankheit; eine virale Krankheit oder Erkrankung, z. B. HIV, Herpes Simplex-Virus oder Papilloma-Virus; oder eine Autoimmunerkrankung, z. B. Arthritis oder Lupus. Somit umfasst die vorliegende Erfindung Mittel zur Behandlung einer Immunsystem-assoziierten Krankheit oder Erkrankung oder eines damit assoziierten Symptoms in einer spezifischen Ausführungsform, umfassend ein isoliertes Polypeptid, das durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das eine DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst, Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 kodieren, immunmodulatorische Fragmente davon, wobei das isolierte Polypeptid einen immunmodulatorischen Anteil eines T-Zell-Epitops oder einen antigenen Anteil eines B-Zell-Epitops von Polistes annularis-Hyaluronidase umfasst.
Somit umfasst natürlicherweise die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung einer Immunsystem-assoziierten Krankheit oder Erkrankung, die ein Polistinae-Giftenzym, oder Varianten davon, mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID N. 4 oder immunmodulatorische Fragmente davon umfassen. Zudem umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Immunsystemassoziierten Krankheit oder Erkrankung oder eines damit assoziierten Symptoms, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Immunsystem-assoziierten Erkrankung oder Krankheit an einen Probanden. Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" wird hierin verwendet, um eine Menge zu bedeuten, die ausreicht, um zu behandeln und vorzugsweise die Fähigkeit des Immunsystems eines Probanden, ein Immunogen wirksam zu bekämpfen, um mindestens 30 %, mehr bevorzugt mindestens 50 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 % zu erhöhen. Wenn weitere Studien durchgeführt werden, wird es Informationen bezüglich der geeigneten Dosierungsmengen zur Modulation einer Immunsystemreaktion gegen ein Immunogen in verschiedenen Patienten geben und der durchschnittliche Fachmann wird unter Berücksichtigung des therapeutischen Zusammenhangs, des Alters und des allgemeinen Gesundheitszustands des Empfängers in der Lage sein, eine geeignete Dosierung sicher zu stellen. Die Verabreichung kann durch das Protein oder einen Gentherapievektor erfolgen. Somit würde z. B., sollte die Immunsystem-assoziierte Krankheit oder Erkrankung HIV involvieren, eine klinisch signifikante Änderung z. B. eine Erhöhung der Zahl der weißen Blutzellen in einem Probanden involvieren, dem eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung verabreicht wurde, relativ zu der Zahl der weißen Blutzellen vor der Verabreichung. Andere solche Beispiele zur Beobachtung einer klinisch signifikanten Änderung in einem Probanden werden sich dem Fachmann auf dem Gebiet in offensichtlicher Weise ergeben. Zudem wird es, wenn weitere Studien durchgeführt werden, Informationen bezüglich der geeigneten Dosierungsmengen zur Behandlung einer Immunsystem-assoziierten Krankheit oder Erkrankung oder eines damit assoziierten Symptoms in verschiedenen Patienten geben, und die Fachleute werden unter Berücksichtigung des therapeutischen Zusammenhangs, des Alters und des allgemeinen Gesundheitszustandes des Empfängers in der Lage sein, eine korrekte Dosierung sicher zu stellen. Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen werden weiter unten beschrieben.
Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen
Die in vivo diagnostischen oder therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können auch bestimmte pharmazeutisch verträgliche Trägermittel, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel und Adjuvanzien umfassen. Wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Begriff "pharmazeutisch verträglich" vorzugsweise durch eine Zulassungsbehörde einer Regierung, insbesondere der Bundesregierung oder einer Landesregierung, anerkannt, oder in der U.S. Pharmakopöe oder in einer anderen allgemein anerkannten Pharmakopöe zur Verwendung in Tieren und spezieller in Menschen aufgelistet. Geeignete pharmazeutische Trägermittel werden in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E.W. Martin beschrieben.
Die pharmazeutisch verträglichen Trägermittel können sterile Flüssigkeiten wie Wasser und Öle, einschließlich solche, die aus Erdöl stammen oder von einem tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprung, wie Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und Ähnliches sein. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht werden soll. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen können auch als flüssige Trägermittel eingesetzt wer den, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Hilfsmittel umfassen Mannitol, menschliches Serumalbumin (HSA), Stärke, Glucose, Lactose, Sucrose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Silicagel, Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Talk, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerin, Propylenglycol, Wasser, Ethanol und Ähnliches. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, langsam freisetzenden Formulierungen und Ähnlichen annehmen.
Solche Zusammensetzungen werden eine wirksame diagnostische oder therapeutische Menge der aktiven Verbindung zusammen mit einer geeigneten Menge des Trägermittels enthalten, um die Form zur geeigneten Verabreichung an den Patienten bereit zu stellen. Während die intravenöse Injektion eine sehr wirksame Form der Verabreichung ist, können andere Modi eingesetzt werden, wie die Injektion oder die orale, nasale oder parenterale Verabreichung.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele erklärt, die ausschließlich exemplarisch für die Erfindung vorgesehen sind.
BEISPIEL 1: Papierwespenphospholipase
Teilweise basierend auf den Verfahren und der Offenbarung des U.S. Patents Nr. 5,593,877 wurden Nukleinsäuren, die Pol a (Papierwespen)- Phospholipase kodieren, erhalten. Jedoch umfassen diese Nukleinsäuren überraschenderweise interne Sequenzen, die nicht für eine Aminosäuresequenz kodieren, die in dem nativen Protein erwartet wird. Obwohl die in diesem Beispiel beschriebenen Nukleinsäuren cDNAs und nicht genomisch sind, scheinen sie "Introns" zu enthalten.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Die verwendeten Verfahren sind die gleichen, wie sie in dem U.S. Patent Nr. 5,593,877 unter Verwendung von RACE beschrieben werden.
Ergebnisse
Als Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA, die mit RACE hergestellt wurde, untersucht wurde, wurde beobachtet, dass ihre Länge länger als zur Kodierung des Papierwespen-Phospholipase A₁-Proteins notwendig war. Es wurde überraschend entdeckt, dass diese vergrößerte Länge das Ergebnis von Introns war, die in die Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA eingebaut werden. Solche eine Entdeckung war im Lichte der Studien, die mit den cDNAs von anderen Vespidgiften durchgeführt wurden, die alle keinerlei Introns enthalten, unerwartet. Zum Beispiel enthalten die Phospholipase cDNAs der Gelbjacke und der Hornisse keine solchen Introns.
Bedingt durch diesen großen nicht voraussehbaren Unterschied zwischen Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA und anderen Vespidgift-Phospholipase cDNAs, waren besondere Biotechniken und Schritte zur Isolierung der Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA notwendig, die nicht notwendig waren, um die Giftphospholipase cDNA aus anderen Vespiden wie der Hornisse oder der Gelbjacke zu erhalten. Insbesondere war es notwendig, die Größe und Position und Anzahl der Introns zu bestimmen, um die cDNA-Sequenz zu isolieren, die die Phospholipase A₁ der Papierwespe kodiert.
Unter Verwendung der Aminosäuresequenz, die aus dem Cyanbromidabbau der Papierwespen-Phospholipase A₁ abgeleitet wurde, des genetischen Kodes und der Nukleotidsequenz der Wespen-Phospholipase cDNA, die aus dem RACE-Protokoll abgeleitet wurde, wurden zwei Introns entdeckt. Das erste Intron, hiernach als "Papla-Intron 1" bezeichnet, umfasst eine Nukleotidsequenz wie sie in SEQ ID NO: 5 (2A) gezeigt wird. Papla Intron 1 umfasst 114 Nukleotide und ist normalerweise zwischen den Nukleotiden 111 und 112 der cDNA-Sequenz lokalisiert, die Phospholipase A₁ kodiert, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird.
Ein zweites Intron, das hiernach als "Papla Intron 2" bezeichnet wird, wurde auch entdeckt. Dieses Intron umfasst eine Nukleotidsequenz wie sie in SEQ ID NO: 6 (2B) gezeigt wird. Papla Intron 2 enthält 127 Nukleotide und ist normalerweise zwischen den Nukleotiden 720 und 721 von SEQ ID NO: 1 lokalisiert.
Um die cDNA-Sequenz zu isolieren, die die Papierwespen-Phospholipase A₁ (SEQ ID NO: 1) kodiert, mussten diese Introns aus der Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA, die mit RACE abgeleitet wurde, ohne die Störung des Leserasters der kodierenden Nukleotide entfernt werden. Im Wesentlichen musste die Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA neu entwickelt werden, so dass nur die kodierenden Nukleotide umfasst waren. Dieses Rückentwicklungsverfahren war technisch besonders schwierig, weil, sollte ein kodierendes Nukleotid aus Versehen zusammen mit einem Intron entfernt werden oder sollte ein nicht-kodierendes Nukleotid nicht entfernt werden, eine Verschiebung im Leseraster hergestellt werden würde, die zu Mutationen führen würde und eine vorzeitige Terminierung der Expression der cDNA bewirken könnte.
In diesem Rückentwicklungsprozess wurden speziell entwickelte Oligonukleotide chemisch synthetisiert, die jeweils komplementär zu den kodierenden Nukleotiden waren, die 5' und 3' von einem der Introns lokalisiert sind. Die amplifizierte Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA, die aus RACE abgeleitet worden war, wurde dann in ein selbst-replizierendes Plasmid kloniert. Dieses Plasmid wurde denaturiert und unter gering stringenten Bedingungen wurde den Oligonukleotiden ermöglicht, an die Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA zu binden, was die Introns einzelsträngig zurückließ. Diese Oligonukleotide dienten dann als Primer zur DNA-Synthese, die ein doppelsträngiges Plasmid generierte, worin die Introns von einem der Stränge deletiert waren. Eine Zelle wurde dann mit dem Plasmid unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren transfiziert und die Zelle wurde dann kloniert. Da in einem der zwei DNA-Stränge in dem ursprünglichen Plasmid die Introns deletiert waren, enthielten die Hälfte der transfizierten Stränge ein doppelsträngiges Plasmid, in dem die Introns entfernt worden waren. Die klonierten wurden dann untersucht, um die Zellen mit dem Plasmid zu isolieren, das Papierwespen-cDNA umfasst, die eine DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 9 (ohne Introns) umfasst. Kopien des jeweiligen Plasmids wurden dann zur Bestätigung der Deletion der Introns isoliert und sequenziert. Die neu entwickelte Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA wurde dann aus dem jeweiligen Plasmid unter Verwendung der in Beispiel 1 und in der Anmeldung mit der fortlaufenden Nr. 08/474,853 und in dem U.S.-Patent 5,593,877, die hiermit durch Referenzieren in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden, beschriebenen Prozeduren entfernt, sequenziert, amplifiziert und in einen Expressionsvektor kloniert.
Es wurde ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der Papierwespen-Phospholipase A₁ (SEQ ID NO: 2) mit anderen Vespidgift-Phospholipasen durchgeführt. Insbesondere wurde die SEQ ID NO: 2 mit Phospholipase aus der weißgesichtigen Hornisse (D. maculata) (SEQ ID NO: 7) und der Phospholipase aus der Gelbjacke (V. vulgaris) (SEQ ID NO: 8) verglichen. Die Ergebnisse des Sequenzvergleichs werden in 3 gezeigt.
BEISPIEL 2: Papierwespenhyaluronidase
Unter Verwendung der in dem U.S. Patent Nr. 5,593,877 beschriebenen Prozeduren wurde die cDNA-Sequenz, die Papierwespen (Pol a) Hyaluronidase (SEQ ID NO: 3) und ihre korrespondierende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) kodiert, isoliert und in 4 dargestellt. Die Nukleotide 449 bis 536 von SEQ ID NO: 3 kodieren einen Teil einer Signalsequenz. Somit ist der Aminosäurerest an dem N-Terminus der reifen Pol a Hyaluronidase Serin, das durch die Nukleotide 536, 537 und 538 kodiert wird.
Überraschenderweise hatte die Papierwespen-Hyaluronidase cDNA, die aus dem RA-CE-Protokoll hergestellt wird, das oben gezeigt wird, eine größere Länge als zur Kodierung des Pol a-Hyaluronidaseproteins notwendig. Somit wurde geschlossen, dass Papierwespen-Hyaluronidase cDNA wenigstens ein Intron enthält. Das Vorhandensein von wenigstens einem Intron innerhalb der Papierwespen-Hyaluronidase cDNA war unerwartet im Lichte der Studien mit Hyaluronidase cDNA aus anderen Vespidgiften wie der Gelbjacke und der Hornisse, die keine Introns enthalten. Als ein Ergebnis waren spezielle Biotechniken zur Isolierung der cDNA-kodierenden Sequenz der Papierwespen-Hyaluronidase notwendig, die zu denen ähnlich waren, die zur Isolierung der Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA eingesetzt wurden und in Beispiel 3 oben dargestellt werden.
Anfänglich wurde eine Bestimmung der Lokalisierung und Größe der Introns innerhalb der Papierwespen-Hyaluronidase cDNA durchgeführt. Sobald die Introns lokalisiert waren, mussten sie in einer Weise entfernt werden, die jegliche kodierenden Nukleotide nicht stört. Somit war es wie bei der Papierwespen-Phospholipase A₁ cDNA notwendig, die Papierwespen-Hyaluronidase cDNA derartig neu zu entwickeln, dass nur kodierende Nukleotide mit umfasst wären. Diese Rückentwicklung war technisch sehr schwierig, weil, sollte ein kodierendes Nukleotid aus Versehen zusammen mit einem Intron entfernt werden, oder sollte ein nicht-kodierendes Nukleotid nicht entfernt werden, eine Mutation im Leseraster durch Verschiebung in die Wespen-Hyaluronidase cDNA eingeführt werden würde.
Die cDNA-kodierende reife Papierwespen-Hyaluronidase (SEQ ID NO: 3) wurde unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt, das zu dem ähnlich ist, das verwendet wurde, um die cDNA-kodierende Papierwespen-Phospholipase A₁ supra zu isolieren. Die cDNA ohne Introns wurde dann wiederum unter Verwendung der oben beschriebenen Prozeduren sequenziert, amplifiziert und in einen Expressionsvektor kloniert.
Es wurde herausgefunden, dass Papierwespen-Hyaluronidase cDNA ein Intron enthielt. Dieses Intron, das hiernach als "Pahya" bezeichnet wird, ist 94 Nukleotide lang und hat eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 9 (5) gezeigt wird. Normalerweise ist dieses Intron zwischen den Nukleotiden 733 und 734 von SEQ ID NO: 3 lokalisiert.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz der Papierwespen-Hyaluronidase (SEQ ID NO: 4) mit anderen Vespidgift-Phospholipasen wurde durchgeführt. Insbesondere wurde SEQ ID NO: 4 mit der Hyaluronidase aus Bienengift (SEQ ID NO: 10), der Hyaluronidase aus der weißgesichtigen Hornisse (D. maculata) (SEQ ID NO: 11) und der Hyaluronidase aus der Gelbjacke (V. vulgaris) (SEQ ID NO: 12) verglichen. Die Ergebnisse dieses Sequenzvergleiches werden in der 6 gezeigt. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Polistinae-Gift-Hyaluronidase, umfassend eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4, oder ein immunmodulatorisches Fragment davon kodiert, wobei das Nukleinsäuremolekül zur Expression einer reifen Form der Hyaluronidase geeignet ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NO:3, oder ein Fragment davon, das das Immunmodulatorische Fragment kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül oder Varianten davon, die eine Hyaluronidase mit der Aktivität der Hyaluronidase von SEQ ID NO:4 kodieren.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Molekül unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz, die einer T_m von größer oder gleich etwa 65 °C entsprechen, mit dem aus der DNA-Sequenz von SEQ ID NO:3 bestehenden isolierten Nukleinsäuremolekül hybridisieren kann.
Expressionsvektor, umfassend das isolierte Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, funktionell assoziiert mit einem Promotor.
Zelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 5.
Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder eines immunmodulatorischen Fragments davon, das umfasst: (a) Züchten einer Zelle nach Anspruch 6, so dass die Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder das immunmodulatorische Fragment davon durch die Zelle produziert wird; und (b) Gewinnen der so produzierten Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder des so produzierten immunmodulatorischen Fragments davon aus der Kultur; der Zelle oder beiden.
Rekombinante Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder ein immunmodulatorisches Fragment davon, kodiert durch das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Rekombinante Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder ein immunmodulatorisches Fragment davon, kodiert durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, wobei es sich um ein Fusionsprotein handelt.
Rekombinante Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder das immunmodulatorische Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, exprimiert durch eine Bakterien- oder Hefezelle.
Fusionsprotein nach Anspruch 9, wobei die rekombinante Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder das immunmodulatorische Fragment davon mittels einer Peptidbindung mit mindestens einem funktionell aktiven Teilstück eines nicht aus Polistinae-Gift stammenden Enzyms fusioniert ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 11, ferner umfassend eine Spaltungsstelle für eine spezifische Protease.
Rekombinante Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder das immunmodulatorische Fragment davon nach Anspruch 9, die bzw. das eine Polyhistidin-Sequenz umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Modulieren einer Immunreaktion gegen ein Immunogen in einem Säuger, umfassend die rekombinante Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder ein immunmodulatorisches Fragment davon nach einem der Ansprüche 8 bis 13 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung der rekombinanten Polistinae-Gift-Hyaluronidase oder des immunmodulatorischen Fragments davon nach einem der Ansprüche 8 bis 13 bei der Herstellung eines Medikaments zum Modulieren einer Immunreaktion gegen ein Immunogen in einem Säuger.
Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder Verwendung nach Anspruch 15, wobei es sich bei der Immunreaktion um ein für ein Vespidengift-Allergen spezifisches allergisches Leiden handelt.
Zusammensetzung oder Verwendung nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Vespidengift-Allergen um eine Hyaluronidase handelt.