ES2280059T3

ES2280059T3 - Clonacion y produccion recombinante de enzimas de veneno de polistinae tales como hialuronidasa, y terapias inmunologicas basadas en las mismas.

Info

Publication number: ES2280059T3
Application number: ES05001983T
Authority: ES
Inventors: Te Paio King
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1998-10-01
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2007-09-01
Anticipated expiration: 2019-10-01
Also published as: US6372471B1; DE69924628T2; ATE346143T1; AU760812B2; CA2344578A1; EP1528102A2; EP1117769B1; DE69924628D1; ATE292678T1; DE69934150T2; EP1528102A3; AU6290699A; PT1117769E; WO2000018896A1; US20040175393A1; EP1117769A1; US6652851B1; DK1528102T3; EP1528102B1; US7060265B2

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una hialuronidasa de veneno de Polistinae que comprende una secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 4, o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, en donde dicha molécula de ácido nucleico esa adecuada para la expresión de una forma madura de dicha hialuronidasa.

Description

Clonación y producción recombinante de enzimas de veneno de Polistinae tales como hialuronidasa, y terapias inmunológicas basadas en las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se dirige a moléculas de ácido nucleico que codifican alérgenos de veneno de Polistinae, en particular hialuronidasa, o sus fragmentos inmunomoduladores, a vectores recombinantes que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y a células huésped que contienen los vectores recombinantes. La invención se dirige además a la expresión de tal molécula de ácido nucleico para producir la enzima, hialuronidasa, de veneno de Polistinae recombinante o sus fragmentos inmunomoduladores recombinantes. Tal alérgeno y sus fragmentos inmunomoduladores son útiles para la diagnosis de la alergia, para el tratamiento terapéutico de la alergia, para el tratamiento de enfermedades o trastornos del sistema inmunitario, o síntomas relacionados con los mismos, y para la modulación de respuestas inmunitarias hacia un inmunógeno.

Antecedentes de la invención

La alergia por picadura del insecto a las abejas y los véspidos es de presencia común. Los véspidos incluyen avispones, avispas comunes y avispas rojas (Golden y otros, 1989, Am. Med. Assoc. 262:240). Las personas susceptibles pueden sensibilizarse por la exposición a cantidades minúsculas de proteína del veneno; tan poco como 2-10 \mug de proteína son inyectados en la piel en una sola picadura por un véspido (Hoffman y Jacobson, 1984, Ann. Allergy. 52:276).

Existen muchas especies de avispones (género Dolichovespula), avispas comunes (género Vespula) y avispas rojas (género Polistes) en Norteamérica (Akre y otros, 1980, "Yellowjackets of America North of Mexico", Agriculture Handbook No. 552, US Department of Agriculture). Los véspidos tienen composiciones de veneno similares (King y otros, 1978, Biochemistry 17: 5165; King y otros, 1983, Mol. Immunol. 20:297; King y otros, 1984, Arch. Biochem. Biophys. 230:1; King y otros, 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75:621; King, 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 79:113; Hoffman, 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75:611). Su veneno contiene cada uno tres alérgenos del veneno principales, fosfolipasa (37 kD), hialuronidasa (43 kD) y antígeno 5 (23 kD) de función biológica hasta ahora desconocida. La Patente de EE.UU. Nº 5.593.877 describe la clonación y expresión de los alérgenos de veneno de véspido fosfolipasa y hialuronidasa. Según se describe en esta patente, los alérgenos recombinantes permiten la expresión de una proteína o sus fragmentos para el uso en inmunoterapia, diagnóstico y para investigar alérgenos de células T y B, indica con más detalle la razón para clonar enzimas de veneno de véspidos. Sin embargo, no se describían cDNAs de veneno de véspido únicos.

Además de los alérgenos de veneno de insecto descritos anteriormente, se ha presentado en los últimos años la secuencia de aminoácidos completa de varios alérgenos principales procedentes de diferentes hierbas (Perez y otros, 1990, J. Biol. Chem. 265:16210; Ansari y otros, 1989, Biochemistry 26:8665; Silvanovich y otros, 1991, J. Biol. Chem. 266:1204), polen de árboles (Breiteneder, 1989, EMBO J. 8:1935; Valenta y otros, 1991, Science, 253:557), polen de malas hierbas (Rafnar y otros, 1991, J. Biol. Chem. 266:1229; Griffith y otros, 1991, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 96:296), ácaros (Chua y otros, 1988, J. Exp. Med. 167:175), caspa de gato (Griffith y otros, 1992, Gene. 113:263) y moho (Aruda y otros, 1990, J. Exp. Med. 172:1529; Han y otros, 1991, J. Allergy Clin. Immunol. 87:327). Estos alérgenos principales son proteínas de 10-40 kD y tienen funciones biológicas ampliamente diferentes. Casi todos los alérgenos de secuencias conocidas tienen una extensión de similitud de secuencia variable con otras proteínas de nuestro entorno.

Aunque la Patente de EE.UU. Nº 5.593.877 proporciona la clonación y expresión de enzimas de veneno de véspidos, particularmente hialuronidasa y fosfolipasa, sigue existiendo una necesidad de identificar secuencias inusuales e inesperadas de tales enzimas, y de diseñar sistemas de expresión eficaces para ellas. Existe una necesidad particular de delinear los epítopos de células B y T cooperadoras de la avispa roja del papel (por ejemplo, Polistes annularis). En particular, los alérgenos de veneno de Polistinae principales fosfolipasa y hialuronidasa son objetivos apropiados para determinar los importantes epítopos de células B y T. Para dirigirse completamente a la base de la respuesta alérgica a alérgenos de véspido y para desarrollar inmunoterapias basadas en alérgenos, necesitan investigarse las secuencias de cDNA y proteínicas de varios alérgenos homólogos. Por otra parte, deben desarrollarse vectores adecuados para una expresión de alto nivel en bacterias y células eucarióticas de alérgenos de véspidos o sus fragmentos. Los alérgenos de véspidos recombinantes y sus fragmentos pueden usarse a continuación para mapear sus epítopos de células B y T en los sistemas múrido y, de forma más importante, humano, mediante pruebas de unión a anticuerpos y proliferación de células T, respectivamente.

También existe una necesidad en la técnica de usar péptidos que tengan epítopos de células T o B de alérgenos de veneno de véspido para estudiar la inducción de la tolerancia en ácaros y la inducción de la tolerancia en seres humanos.

Existe una necesidad adicional de probar si un péptido modificado inhibe la unión del epítopo de células T de alérgeno a una molécula del MHC clase II, o induce anergia de células T, o ambos.

Así, existe una necesidad en la técnica de una información de secuencias única acerca de alérgenos de veneno de véspidos y de una fuente abundante de tales alérgenos para investigaciones inmunológicas y para la terapia inmunológica de la alergia.

Por otra parte, debido al abuso de antibióticos en todo el mundo y a la extensión de numerosos virus, tales como HIV, Ébola, etc., se han realizado esfuerzos para producir nueva medicación con "super"-antibióticos y compuestos que tengan actividad contra virus. Por ejemplo, se ha desarrollado la AZT, junto con inhibidores de proteasas, para tratar sujetos que sufren HIV. Sin embargo, el coste de desarrollar nuevos "super"-antibióticos y medicaciones antivirales es enorme.

De ahí que lo que se necesite sean agentes y composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades y trastornos relacionados con el sistema inmunitario cuya actividad no dependa necesariamente de combatir el virus o patógeno particular, sino en cambio de modular o potenciar la capacidad del sistema inmunitario para combatir la enfermedad o el trastorno, mejorando de ese modo la enfermedad o el trastorno, o un síntoma relacionado con los mismos. Los venenos de himenópteros, particularmente venenos de véspido, proporcionan una posible fuente para tales agentes y composiciones farmacéuticas, según se describe en las Patentes de EE.UU. Nº 4.822.608 y 5.827.829.

La cita de referencias en la presente no debe considerarse una admisión de que esta sea técnica anterior a la presente invención.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica enzima de veneno de Polistinae que codifica una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC 4, o sus fragmentos inmunomoduladores. En particular, la invención se dirige a tales moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronidasa de veneno de Polistinae. En modalidades específicas, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T de una enzima de veneno de Polistinae. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica una porción antigénica de un epítopo de células B de una enzima de veneno de Polistinae.

Se encuentra sorprendentemente que el ácido nucleico de la invención, que no es genómico, contiene una secuencia no codificante, por ejemplo intrónica. En una modalidad específica, moléculas de cDNA para enzima de veneno de Polistinae contienen lo que parece ser un intrón. Así, ha resultado inesperadamente necesario someter a deleción la secuencia "intrónica" para obtener un ácido nucleico que codifique para una enzima de veneno de Polistinae madura, por ejemplo hialuronidasa.

De ahí que, ampliamente, la presente invención se extienda a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima de veneno, sus variantes que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC 4, o sus fragmentos inmunomoduladores. Según se apunta anteriormente, la molécula de ácido nucleico contiene secuencias no codificantes internas, es decir, además de las secuencias no traducidas (UTR) 5' y 3', pero no es una secuencia genómica. Ejemplos de enzimas de veneno de Polistinae que pueden ser codificadas por una molécula de ácido nucleico aislada de la invención incluyen, pero no se limitan a, fosfolipasa y hialuronidasa, sus variantes que tienen la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC 4, sus fragmentos inmunomoduladores, procedentes del veneno de numerosos venenos de Polistinae que pueden codificarse por una molécula de ácido nucleico aislada de la invención. Un ejemplo particular comprende Polistinae del género Polistes, y particularmente la especie
annularis.

En otra modalidad particular, la presente invención se extiende a una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica hialuronidasa de Polistes annularis que comprende una secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 4, más particularmente en donde el ácido nucleico aislado tiene una secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 3 o uno de sus fragmentos, o sus variantes, que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, y sus fragmentos inmunomoduladores.

Por otra parte, la presente invención se extiende además a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima de veneno de Polistinae o sus variantes, que codifica una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, o un fragmento inmunomodulador, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T o una porción antigénica de un epítopo de células B de la enzima de veneno de Polistinae. Por otra parte, la presente invención se extiende a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una hialuronidasa de veneno de Polistinae que comprende una secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 4, o uno de sus fragmentos inmunomoduladores; o variantes de dicha molécula que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, en donde dicha molécula es hibridable a la molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de DNA del Nº ID SEC: 3 bajo condiciones de hibridación de alta restricción correspondientes a una T_{m} mayor que o igual a aproximadamente 65ºC. Asimismo, la presente invención se extiende a un polipéptido aislado que comprende una porción inmunomoduladora y un epítopo de células T de una enzima de veneno de Polistinae, en donde el polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico aislada de la invención. Ejemplos de enzimas de veneno de avispa roja para las que las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención codifican una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T incluyen, pero ciertamente no se limitan a, hialuronidasa. En una modalidad específica, la hialuronidasa se origina a partir de un género Polistes, y particularmente de la especie annularis.

La invención proporciona además vectores de clonación y vectores de expresión, que permiten la expresión de los ácidos nucleicos. Tales vectores contienen ácidos nucleicos de la invención como los indicados anteriormente. En el caso de los vectores de expresión, tales ácidos nucleicos están asociados operativamente con una secuencia de control de la expresión.

La invención proporciona ventajosamente un método para producir hialuronidasa de veneno de Polistinae, sus variantes, que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, o sus fragmentos inmunomoduladores, que comprende las etapas de:

(a): cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico aislada hibridable a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de DNA del Nº ID SEC: 3, o preferiblemente que tiene una secuencia del Nº ID SEC: 3, o sus variantes, que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, en donde la molécula de ácido nucleico aislada está asociada operativamente con un promotor, de modo que la hialuronidasa de veneno de Polistinae, su variante conservada, su fragmento inmunomodulador o su análogo derivado son producidos por la célula huésped; y

(b): recuperar la hialuronidasa de veneno de Polistinae, o su variante, que codifica una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, o su fragmento inmunomodulador, así producidos, del cultivo, la célula o ambos.

En un ejemplo particular, los métodos indicados anteriormente dan hialuronidasa del género Polistes, y particularmente de la especie annularis, en donde la hialuronidasa comprende una secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 4, sus variantes que tienen la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4 o sus fragmentos inmunomoduladores.

La presente invención se extiende además a composiciones farmacéuticas eficaces para el tratamiento de un estado alérgico específico para alérgenos de veneno. En particular, la presente invención se extiende a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una porción inmunomoduladora de una célula T o una porción antigénica de un epítopo de células B de una enzima de veneno de Polistinae, por ejemplo una hialuronidasa, y uno de sus portadores farmacéuticamente aceptables. Por consiguiente, en una modalidad preferida, una composición farmacéutica de la invención comprende un epítopo de células T inmunomodulador de hialuronidasa de veneno de Polistes annularis o una porción antigénica de un epítopo de células B de hialuronidasa de Polistes annularis.

Naturalmente, la presente invención se extiende a un método para tratar un estado alérgico específico para alérgenos de veneno de véspido, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención, cuyos ejemplos se indican anteriormente. La administración de una composición farmacéutica de la invención puede producirse parenteralmente y de forma particular oralmente, pulmonarmente, nasalmente, tópicamente o sistémicamente.

Por otra parte, la presente invención se extiende al uso de una enzima de veneno de Polistinae recombinante de la invención en la fabricación de un medicamento para, y un método asociado para, modular una respuesta inmunitaria de un inmunógeno, por ejemplo, tratar un estado alérgico hacia los véspidos o tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario o un síntoma de la enfermedad o el trastorno relacionado con el sistema inmunitario. El polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima de veneno de Polistinae, en donde el polipéptido comprende un fragmento inmunomodulador de enzima de veneno de Polistinae. Más particularmente, un agente para tratar una enfermedad o un trastorno relacionado con el sistema inmunitario, o un síntoma relacionado con el mismo, comprende una enzima de veneno de Polistinae o un vector que permite la expresión del veneno o la enzima de Polistinae in vivo.

De ahí que un agente para tratar un trastorno o una enfermedad relacionados con el sistema inmunitario, o uno de sus síntomas, comprenda un polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una hialuronidasa de veneno de Polistinae, o sus variantes que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, o sus fragmentos inmunomoduladores.

Por otra parte, la presente invención se extiende a una composición farmacéutica para modular una respuesta inmunitaria hacia un inmunógeno, por ejemplo, tratando un estado alérgico hacia los véspidos o tratando una enfermedad o trastorno relacionados con el sistema inmunitario o un síntoma relacionado con los mismos, en donde la composición farmacéutica comprende una enzima de veneno de Polistinae recombinante y uno de sus portadores farmacéuticamente aceptables.

La administración de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad o un trastorno relacionados con el sistema inmunitario a un sujeto puede llevarse a cabo parenteralmente y, de forma particular, oralmente, pulmonarmente, nasalmente, tópicamente o sistémicamente. Por otra parte, numerosas enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmunitario pueden tratarse con la presente invención. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad o un trastorno patógeno tal como una enfermedad o un trastorno viral, por ejemplo HIV, virus del herpes simple o papilomavirus; una enfermedad autoinmune, por ejemplo artritis o lupus; o una combinación de tales enfermedades o trastornos.

Un objetivo específico de la invención es proporcionar la sorprendente secuencia de DNA de moléculas de ácido nucleico (cDNA) aisladas que codifican hialuronidasa de Polistes annularis, sus variantes que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4 o sus fragmentos inmunomoduladores.

Otro objetivo adicional más de la invención es proporcionar secuencias de aminoácidos de hialuronidasa de Polistes annularis, junto con sus variantes, que tienen la actividad del Nº ID SEC: 4, incluyendo porciones inmunomoduladoras de epítopos de células T y porciones antigénicas de epítopos de células B de hialuronidasa de Polistes annularis, que o bien contienen, o bien más preferiblemente están libres de, secuencia "intrónica". Las secuencias de aminoácidos deducidas de hialuronidasa de Pol a permiten la comparación de su homología con enzimas análogas de otros véspidos. Esta información proporciona una base para evaluar la reactividad cruzada de los alérgenos, que puede ser importante para reacciones alérgicas y para tratamientos terapéuticos. De ahí que, en una modalidad específica, la presente invención permita a un experto normal en la técnica determinar y evaluar el grado de similitud de la hialuronidasa de Pol a con proteínas ambientales y/o proteínas autólogas. Se cree que la similitud de las enzimas de veneno de véspido con tales proteínas ambientales, y particularmente con proteínas autólogas, tiene importantes implicaciones para la respuesta alérgica.

Otro objetivo adicional más de la invención es proporcionar vectores de expresión y clonación que comprenden una molécula de ácido nucleico aislada que codifica hialuronidasa de Polistes annularis, incluyendo fragmentos que comprenden una porción inmunomoduladora y un epítopo de células T o una porción antigénica de un epítopo de células B de estas enzimas de veneno de Polistinae, de modo que las moléculas de ácido nucleico aisladas puedan reproducirse y expresarse.

Otro objetivo más de la invención comprende la producción de enzimas de veneno de Polistinae tales como hialuronidasa, junto con sus variantes que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4 o sus fragmentos inmunomoduladores, usando vectores de expresión de la invención, a pesar de la presencia de secuencias intrónicas en clones de cDNA.

Otro objetivo adicional más de la invención es proporcionar agentes y composiciones farmacéuticas para tratar un estado alérgico específico de un alérgeno en un sujeto, en donde los agentes y la composición farmacéutica comprenden un polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima de veneno de Polistinae, tal como hialuronidasa, particularmente de Polistes annularis, en donde el polipéptido comprende una porción antigénica de un epítopo de células B o una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T de una hialuronidasa de Polistinae.

Otro objetivo adicional más de la invención es proporcionar un método para tratar una alergia específica de alérgeno de veneno de véspido en un sujeto, en el que una composición farmacéutica para tratar un estado alérgico específico de un alérgeno se administra al sujeto.

Otro objetivo adicional más de la invención es proporcionar agentes y composiciones farmacéuticas que comprenden tales agentes que tratan una enfermedad o un trastorno relacionado con el sistema inmunitario en un mamífero, tal como una enfermedad o un trastorno patógeno, una enfermedad o un trastorno viral, una enfermedad o un trastorno autoinmune o una combinación de enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmunitario.

Otro objetivo adicional más de la invención es proporcionar agentes y composiciones farmacéuticas para modular la respuesta inmunitaria hacia un inmunógeno en un mamífero. Como resultado, la administración de tal composición farmacéutica modula la capacidad del sistema inmunitario para reconocen y atacar al inmunógeno. En una modalidad particular, la capacidad del sistema inmunitario del mamífero para reconocer y atacar al inmunógeno se incrementa al administrar la composición farmacéutica con relación a la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para reconocer y atacar al inmunógeno antes de la administración de una composición farmacéutica de la invención.

Abreviaturas

Dol m Dolichovespula maculata: avispón de cara blanca

Dol a D. arenaria: avispón amarillo

Pol a Polistes annularis: avispa roja

Pol e P. exclamans: avispa roja

Ves m Vespula maculifrons: avispa común

Ves v V. vulgaris: avispa común

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

RACE: amplificación rápida de extremos de cDNA

TCR: receptor de células T para antígeno.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La secuencia de nucleótidos de cDNA que codifica fosfolipasa A_{1} de veneno de Pol a (Nº ID SEC: 1) y la secuencia de aminoácidos de fosfolipasa A_{1} de veneno de Pol a (Nº ID SEC: 2). Nótese que los 18 primeros residuos de aminoácido del Nº ID SEC: 2 representan una porción de una secuencia de señal. De ahí que el residuo de aminoácido 19 del Nº ID SEC: 2 (glicina) sea el residuo de aminoácido del extremo N en fosfolipasa A_{1} de Pol a madura.

Figuras 2A y 2B. El cDNA de fosfolipasa de Pol a contiene dos intrones. (A) La secuencia de nucleótidos del intrón papla 1 (Nº ID SEC: 5), un intrón en cDNA de fosfolipasa A_{1} de veneno de Pol a situado entre los nucleótidos 111 y 112 del Nº ID SEC: 1. (B) Las secuencias de nucleótidos del intrón papla 2 (Nº ID SEC: 6), un intrón en cDNA de fosfolipasa A_{1} de veneno de Pol a entre los nucleótidos 720 y 721 del Nº ID SEC: 1.

Figura 3. Similitud de secuencias de residuos de aminoácidos entre fosfolipasa de veneno de avispón (Nº ID SEC: 1), fosfolipasa de avispa común (Nº ID SEC: 8) y fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel (Nº ID SEC: 2).

Figura 4. La secuencia de nucleótidos de cDNA que codifica hialuronidasa de veneno de Pol a (Nº ID SEC: 3) y la secuencia de aminoácidos de hialuronidasa de Pol a (Nº ID SEC: 4). Nótese que los 23 primeros residuos de aminoácidos del Nº ID SEC: 4 representan una porción de una secuencia de señal. De ahí que el residuo de aminoácido 30 del Nº ID SEC: 4 (serina) sea el residuo de aminoácido del extremo N de hialuronidasa de Pol a madura.

Figura 5. La secuencia de nucleótidos de Pahya (Nº ID SEC: 9), un intrón en cDNA de hialuronidasa de Pol a, situado entre los nucleótidos 733 y 734 del Nº ID SEC: 3.

Figura 6. Similitud de secuencias de residuos de aminoácidos entre hialuronidasa de veneno de abeja (bv) (Nº ID SEC: 10), hialuronidasa de Dol m (wfh) (Nº ID SEC: 11), hialuronidasa de Ves v (vv) (Nº ID SEC: 12) y hialuronidasa de Pol a (pa) (Nº ID SEC: 4).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican enzimas de veneno de Polistinae, tales como hialuronidasa, y a fragmentos inmunomoduladores y polipéptidos codificados por tales moléculas de ácido nucleico útiles en el diagnóstico y la terapia de alergia específica a veneno de véspidos. En modalidades específicas, la presente invención se dirige a una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica hialuronidasa de Pol a, sus variantes que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4 y sus fragmentos inmunomoduladores.

La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente y completamente inesperado de segmentos no codificantes internos de cDNA que codifica hialuronidasa de Pol a. Antes de este descubrimiento, los cDNAs para enzimas de veneno de véspido no contenían tales secuencias "intrónicas" aparentes.

Este descubrimiento tiene dos implicaciones significativas. La primera es que los cDNAs de Polistinae y, más particularmente, Polistes, y, más particularmente aún, Pol a, parecen contener "intrones". Así, las Polistinaes de esta subfamilia expresan mRNAs únicos, tienen capacidades de procesamiento de mRNA únicas y representan potencialmente variantes de reparación interesantes.

El término "intrones" se usa para referirse a secuencias de ácido nucleico que no se espera que estén presentes en un cDNA que codifica para hialuronidasa, y que no son secuencias UTR 5' ó 3'. Las secuencias pueden representar variantes de reparación inesperadas de las proteínas, procesamiento incompleto de mRNAs o algún rasgo regulador encontrado en esta subfamilia, género y especie de véspido.

La presencia de estas secuencias "intrónicas" afecta significativamente a la preparación de vectores de expresión. Aunque es posible expresar los polipéptidos únicos codificados por estos cDNAs, en otra realización se requiere una modificación impredecible del cDNA para eliminar estos "intrones" para expresar formas maduras de las enzimas de veneno de Polistinae, por ejemplo, para el uso en inmunoterapia. Así, inesperadamente, ha resultado necesario tratar por ingeniería adicionalmente secuencias codificantes para hialuronidasa de Polistinae. Una vez que estas secuencias "intrónicas" se someten a deleción, pueden obtenerse proteínas de hialuronidasa que comprenden la secuencia de aminoácidos natural.

La invención se dirige además a vectores de expresión que comprenden dicha molécula de ácido nucleico de hialuronidasa y a métodos para producir polipéptidos de enzima de veneno de Polistinae de la invención expresando tales vectores de expresión y recuperando los polipéptidos de enzima de veneno de Polistinae producidos.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas eficaces para el tratamiento de un estado alérgico específico de alérgenos de veneno de véspido, y probablemente incluso un veneno de himenóptero, que comprende un polipéptido de la invención, y métodos para tratar tales estados alérgicos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones farmacéuticas de la invención.

Los polipéptidos de la invención también pueden ser útiles para el diagnóstico de estados alérgicos específicos para veneno de véspido, particularmente Polistinae. Además, se ha descubierto que, inesperadamente, la administración de una composición farmacéutica que comprende hialuronidasa de veneno de Polistinae puede usarse para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario, tal como una enfermedad o trastorno patógeno, una enfermedad o trastorno viral, una enfermedad o trastorno autoinmune o una combinación de tales enfermedades o trastornos.

De acuerdo con esto, según se usa aquí, el término "alérgeno de veneno de Polistinae" se refiere a una proteína encontrada en el veneno de una Polistinae, tal como la avispa roja del papel (Polistes annularis), al que las personas susceptibles se sensibilizan durante la exposición a la picadura del insecto. Aunque la mayoría de los antígenos se caracterizan por ser reactivos con anticuerpos de una clase de IgE específica, un alérgeno se caracteriza por ser también reactivo con anticuerpos de tipo IgE. Los anticuerpos de tipo IgE son responsables de mediar en los síntomas de un estado alérgico, es decir, hipersensibilidad de tipo inmediato.

Según se usa aquí, el término "véspido" se usa de acuerdo con la práctica de los expertos en el campo de la alergia y se refiere a insectos pertenecientes a la familia universal de Vespidae, es decir, avispas sociales incluyendo avispones, avispas comunes y avispas rojas del papel. En particular, los véspidos de la subfamilia Vespinae incluyen las subfamilias Vespinae y Polistinae. Más particularmente, los véspidos de la subfamilia incluyen los géneros Vespa Linnaeus, Vespula Thomson, Dolichovespula Rohwer y Polistes Latreille. Vespula y Dolichovespula pueden considerarse subgéneros del género Vespula. Especies del género Vespa incluyen, pero no se limitan a, V. crabro (L.) y V. orientalis (Linnaeus). Especies del género Vespula incluyen, pero no se limitan a, V. germanica (Fab.), V. squamosa (Drury), V. maculifrons (Buysson), V. flavopilosa (Jacobson), V. vulgaris (L.) y V. pensylvanica (Saussure). Especies del género Dolichovespula incluyen, pero no se limitan a, P. dominulus, D. maculata (L.) y D. arenaria (Fab.).

La subfamilia Polistinae incluye los géneros Polistes. Especies del género Polistes incluyen, pero no se limitan a, P. dominulus, Pol a (Linnaeus), P. exclamans (Viereck), P. metricus (Say), P. fuscatus (Fabricius), P. gallicus, P. pacificus, P. canadensis, P. kaibabensis, P. comanchus, P. commanchus, P. annularis, P. exclamans, P. instabilis, P. carnifex, P. major, P. metricus, P. perplexus, P. carolinus, P. flavus, P. fuscatus, P. aurifer, P. dorsalis, P. bellicosus, P. apachus, P. sulcifer, P. semenowi, P. atrimandibularis, P. biglumis, P. bischoffi, P. dominulus, P. nimpha, P. Pgallicus, P. associus, P. gigas, P. stigma, P. adustus, P. snelleni, P. mandarinus, P. chinensis, P. sulcatus, P. formosanus, P. japonicus, P. watttii, P. macaensis, P. jadwigae, P. olivaceus, P. rothneyi, P. jokohamae, P. poeyi, P. paraguayensis, P. rossi, P. cinctus, P. cavapyta, P. buysonni, P. brevifissus, P. ferreri, P. infuscatus, P. satan, P. melanotus, P. erythrocephalus, P. lanio, P. penai, P. aterrimus, P. huacapistana, P. versicolor, P. ninabamba, P. simillimus, P. adelphus, P. biguttatus, P. binotatus, P. consobrinus, P. peruvianus, P. weyrauchorum, P. xanthogaster, P. maranonensis, P. myersi, P. veracrucis, P. eburneus, P. stabilinus, P. pseudoculatus, P. apicalis, P. oculatus, P. crinitus, P. cubensis, P. minor, P. incertus, P. franciscanus, P. goeldii, P. olivaceus, P. bicolor, P. thoracicus, P. rufiventrus, P. moraballi, P. angulinus, P. subsericeus, P. testaceicolor, P. claripennis, P. billardieri, P. davillae, P. occipitalis, P. atrox, P. deceptor, P. niger, P. candidoi, P. geminatus, P. melanosoma, P. actaeon, P. obscurus, P. bequaertianus, P. cinerascens y P. apachus (Saussure).

Según se usa aquí, el término "hialuronidasa" se refiere a la clase de enzimas que actúan sobre la unidad de disacárido de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. Tales enzimas median en la hidrólisis de polímeros de disacáridos repetitivos que comprenden ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. Un ejemplo de tal polímero es el ácido hialurónico. La hialuronidasa cataliza la liberación de grupos reductores de N-acetilglucosamina desde el ácido hialurónico.

Una secuencia "genómica" contiene todos los intrones, secuencias no traducidas 5' y 3' y secuencias no transcritas (y a menudo reguladoras) 5' y 3' de un gen. Así, una secuencia codificante no es genómica cuando carece de uno o más intrones y secuencias no transcritas 5' y 3', particularmente secuencias reguladoras.

Según se usa aquí, el término "inmunomodulador" se refiere a una capacidad para incrementar o disminuir una respuesta inmunitaria específica de antígeno, a nivel bien de células B o bien de células T. La actividad inmunomoduladora puede detectarse, por ejemplo, en ensayos de proliferación de células T, mediante una medida de la producción de anticuerpos, la producción de linfoquinas o la capacidad de respuesta de células T. En particular, además de los efectos sobre las respuestas de células T, los polipéptidos inmunomoduladores de la invención pueden unirse a moléculas de inmunoglobulina (es decir, anticuerpo) sobre la superficie de células B y afectar también a las respuestas de células B.

Según se usa aquí, el término "derivado" se refiere a un ácido nucleico modificado que codifica una enzima de veneno hialuronidasa de Polistinae, particularmente Polistes, que contiene una substitución, deleción o inserción, y a la proteína codificada por el mismo. El término "derivado" se refiere específicamente a un derivado (o análogo) de unión a IgE baja que contiene substituciones de aminoácidos en residuos de aminoácido clave, dando como resultado una unión a IgE reducida sin romper la conformación global o estructura secundaria y terciaria de la proteína. Los derivados de baja unión a IgE se describen en PCT/DK99/00136.

Según se usa aquí, la expresión "enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario" se refiere a una enfermedad o trastorno que provoca una respuesta inmunitaria en un sujeto, o afecta a la capacidad del sistema inmunitario para responder a un inmunógeno. De ahí que ejemplos de enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmunitario comprendan una enfermedad o trastorno patógeno, una enfermedad o trastorno viral, por ejemplo HIV, virus de herpes simple o papilomavirus; una enfermedad autoinmue, por ejemplo artritis o lupus.

Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polímera de éster de fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de RNA") o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de DNA") bien en forma de una sola hebra o bien una hélice de doble hebra. Son posibles hélices de doble hebra de DNA-DNA, DNA-RNA y RNA-RNA. El término molécula de ácido nucleico, y en particular molécula de DNA o RNA, se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a formas terciarias particulares. Así, este término incluye DNA de doble hebra encontrado, entre otros, en moléculas de DNA lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al analizar la estructura de moléculas de DNA de doble hebra particulares, las secuencias pueden describirse aquí de acuerdo con la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de DNA (es decir, la hebra que tiene una secuencia homóloga al mRNA). Una "molécula de DNA recombinante" es una molécula de DNA que ha sufrido una manipulación biológica molecular.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un cDNA, DNA genómico o RNA, cuando una forma de una sola hebra de la molécula de ácido nucleico puede reasociarse a la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (véase Sambrook y otros, anteriormente). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "restricción" de la hibridación. Para el rastreo preliminar con respecto a moléculas de ácido nucleico homólogas, pueden usarse condiciones de hibridación de baja restricción, correspondientes a una T_{m} de 55ºC, por ejemplo, 5 x SSC, SDS al 0,1%, leche al 0,25% y ausencia de formamida; o formamida al 30%, 5 x SSC, SDS al 0,5%). Condiciones de hibridación de restricción moderada corresponden a una T_{m} superior (de aproximadamente 60ºC), por ejemplo, formamida al 40%, con 5 x ó 6 x SSC. Las condiciones de hibridación de alta restricción corresponden a la T_{m} más alta (mayor que o igual a aproximadamente 65ºC), por ejemplo, formamida al 50%, 5 x ó 6 x SSC). La hibridación requiere que las dos moléculas de ácido nucleico contengan secuencias complementarias, aunque, dependiendo de la restricción de la hibridación, son posibles desapareamientos entre bases. La restricción apropiada para hibridar moléculas de ácido nucleico depende de la longitud de las moléculas de ácido nucleico y el grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de ácido nucleico, mayor será el valor de T_{m} para híbridos de moléculas de ácido nucleico que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a una T_{m} superior) de hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular T_{m} (véase Sambrook y otros, anteriormente, 9,50-0,51). Para la hibridación con moléculas de ácido nucleico más cortas, es decir oligonucleótidos, la posición de los desapareamientos se hace más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook y otros, anteriormente, 11,7-11,8). Preferiblemente, una longitud mínima para una molécula de ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 10 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos y más preferiblemente la longitud es al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aún más preferiblemente 30 nucleótidos y lo más preferiblemente 40
nucleótidos.

El término "condiciones de hibridación estándar" se refiere a una T_{m} de 55ºC que utiliza condiciones como las indicadas anteriormente. En una modalidad preferida, la T_{m} es 60ºC; en una modalidad más preferida, la T_{m} es 65ºC.

Una "secuencia codificante" de DNA es una secuencia de DNA de doble hebra que se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no está limitada a, secuencias procarióticas, cDNA procedente de mRNA eucariótico, secuencias de DNA genómico procedentes de DNA eucariótico (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de DNA sintéticas. Si la secuencia codificante está destinada a la expresión en una célula eucariótica, una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción se situarán habitualmente 3' con respecto a la secuencia codificante.

Las secuencias de control de la transcripción y la traducción son secuencias reguladoras de DNA, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped. En células eucarióticas, las señales de poliadenilación son secuencias de control.

Una "secuencia promotora" es una secuencia reguladora de DNA capaz de unirse a RNA polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo (dirección 3'). Para los propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora está unida en su extremo 3' por el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende aguas arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción (convenientemente definido, por ejemplo, mapeando con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias de consenso) responsables de la unión de RNA polimerasa. Los promotores eucarióticos contendrán a menudo, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "TAT".

Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula cuando la RNA polimerasa transcribe la secuencia codificante en mRNA, que a continuación se traduce en la proteína codificada por la secuencia codificante.

Una "secuencia de señal" puede incluirse antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un péptido de señal, N-terminal con respecto al polipéptido, que dirige la célula huésped para transportar el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido al medio, y este péptido de señal habitualmente es degradado selectivamente por la célula durante la exportación. Las secuencias de señal pueden encontrarse asociadas con una variedad de proteínas naturales para procariotas y eucariotas.

De acuerdo con la presente invención pueden emplearse técnicas de biología molecular, microbiología y DNA recombinante convencionales dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican a fondo en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en la presente "Sambrook y otros, 1989"); "DNA Cloning: a Practical Approach", Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "a Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

La presente invención se basa en la clonación y la determinación de la secuencia de una hialuronidasa de veneno de Polistinae. La clonación y la determinación de la secuencia de estas enzimas de veneno de Polistinae son altamente significativas, ya que los clones de cDNA contienen inesperadamente secuencias de nucleótidos adicionales que no parecen codificar polipéptido. Los estados alérgicos al veneno de véspido son comunes, y en algunos individuos sensibles una reacción alérgica puede avanzar hasta anafilaxis, que es potencialmente letal. Como con los véspidos en general, es probable que los componentes del veneno de Polistinae representen un papel importante en la producción de la alergia. Por lo tanto, es de gran importancia que se conozca la información de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos para los alérgenos de veneno de Polistinae, a fin de que pueda determinarse una información diagnóstica exacta acerca de la naturaleza del estado alérgico, especialmente sensibilidades a alérgenos específicos, y puedan efectuarse tratamientos terapéuticos eficaces del estado alérgico subyacente. Inesperadamente, este ha sido el caso aquí, ya que los cDNAs de Polistinae se encontraron sorprendentemente con secuencias no transcritas.

Aislamiento de una Molécula de Ácido Nucleico que Codifica una Enzima de Veneno de Avispa roja

El aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas de veneno de véspido se describió a fondo en la Patente de EE.UU. Nº 5.593.877. La presente invención trata de los descubrimientos inesperados y sorprendentes de que los cDNAs de Polistinae contienen "intrones". Típicamente, los intrones se someten a reparación de mRNA y de ahí que, por lo tanto, no se encuentren habitualmente en cDNAs. Las secuencias pueden representar variantes de reparación.

Se proporcionan adicionalmente derivados de una enzima de veneno de Polistinae, fragmentos y proteínas de fusión (véase posteriormente), así como moléculas de ácido nucleico que codifican los mismos.

La presente invención proporciona la secuencia de ácido nucleico completa de una enzima de veneno de Polistinae. En particular, la presente invención proporciona la secuencia de ácido nucleico de una hialuronidasa de Polistinae (avispa roja del papel) y hialuronidasa, en particular hialuronidasa de Pol a.

En una modalidad específica, para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima de veneno de Polistinae, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se combina con la amplificación rápida de la técnica de los extremos de cDNA descrita por Frohman y otros (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1998, 85:8998-9002; véase también Frohman, 1990, Amplifications: A Forum for PCR Users 5:11) para amplificar un fragmento que codifica una secuencia que comprende la enzima de veneno de Polistinae antes de la selección. Cebadores oligonucleotídicos que representan una enzima de veneno de Polistinae de la invención pueden usarse como cebadores en la PCR. Generalmente, tales cebadores se prepararon sintéticamente. Las secuencias para tales cebadores oligonucleotídicos pueden deducirse de la información de la secuencia de aminoácidos. Tales secuencias oligonucleotídicas pueden ser no degeneradas, pero más frecuentemente las secuencias son degeneradas. Más preferiblemente, los cebadores se basan en las secuencias de ácido nucleico pera las enzimas de veneno de Polistinae descritas aquí. Los oligonucleótidos pueden utilizarse como cebadores para amplificar mediante secuencias de PCR a partir de una fuente (RNA o DNA), preferiblemente una biblioteca de cDNA, de interés potencial. Por ejemplo, puede usarse PCR para amplificar una secuencia de codificación de enzima de veneno de Polistinae a partir de una biblioteca de cDNA de glándula ácida de Polistinae. La PCR puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el uso de un ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus y polimerasa de Taq (Gene Amp™).

Para aislar un homólogo de una enzima de veneno de Polistinae de cualquier especie de Polistinae puede elegirse sintetizar varios cebadores degenerados diferentes para el uso, por ejemplo, en reacciones de PCR. También es posible variar la restricción de las condiciones de hibridación usadas para cebar reacciones de PCR, para permitir un grado mayor o menor de similitud de las secuencias de nucleótidos entre un homólogo de una enzima de veneno de Polistinae y una enzima de veneno de Polistinae específica descrita aquí. Después de la amplificación satisfactoria de un segmento de un homólogo de una enzima de veneno de Polistinae, ese segmento puede clonarse y someterse a secuenciación y utilizarse como una sonda para aislar un clon de cDNA o genómico completo. Esto, a su vez, permitirá la determinación de la secuencia de nucleótidos completa, el análisis de su expresión y la producción de su producto proteínico para análisis funcional, según se describe posteriormente. De este modo, genes adicionales que codifican enzimas de veneno de Polistinae, en particular hialuronidasas, pueden identificarse y expresarse.

Genes que codifican una enzima de veneno de Polistinae pueden aislarse de una biblioteca adecuada rastreando con una sonda. Sondas útiles para aislar un gen de enzima de veneno de Polistinae pueden generarse de la información de secuencias proporcionada aquí.

Una biblioteca de expresión puede construirse mediante métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente, una biblioteca de cDNA se prepara a partir de células o tejidos que expresan una enzima de veneno de Polistinae, es decir, células procedentes de la glándula tóxica situada cerca del saco de veneno. A veces, la glándula tóxica se denomina glándula ácida. Por ejemplo, mRNA o RNA total puede aislarse, se elabora cDNA y se liga en un vector de expresión (por ejemplo, un derivado de plásmido o bacteriófago) de modo que sea capaz de ser expresado por la célula huésped en la que se introduce. Pueden usarse a continuación diversos ensayos de rastreo para seleccionar los clones positivos. Por ejemplo, puede usarse PCR con cebadores apropiados, que pueden sintetizarse basándose en las secuencias proporcionadas aquí. Se prefiere PCR ya que la producción amplificada puede detectarse directamente, por ejemplo, mediante tinción con bromuro de etidio. Alternativamente, sondas marcadas derivadas de las secuencias de ácido nucleico de la presente solicitud pueden usarse para rastrear las colonias. Aunque la glándula tóxica (ácida) puede ser difícil de aislar y la cantidad de mRNA ser problemática, la PCR específica basada en cebadores de la presente invención puede vencer estos problemas permitiendo una amplificación específica de cantidades traza de mRNA o cDNA o incluso DNA genómico.

Alternativamente, la presencia del gen puede detectarse mediante ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, pueden seleccionarse clones de cDNA o clones de DNA que seleccionan por hibridación los mRNAs apropiados, que producen una proteína que, por ejemplo, tiene migración electroforética, comportamiento de enfoque isoeléctrico, mapas de digestión proteolítica o propiedades antigénicas similares o idénticos a los conocidos para una enzima de veneno de Polistinae.

Algunas proteínas recombinantes expresadas por bacterias, por ejemplo hialuronidasas de veneno de Polistinae, pueden reaccionar con anticuerpos específicos para las proteínas naturales. Otras proteínas recombinantes expresadas bacterianamente, tales como fosfolipasas de veneno, pueden no reaccionar con anticuerpos específicos para la proteína natural. Así, en casos en los que las proteínas recombinantes son inmunorreactivas, es posible seleccionar con respecto a clones positivos mediante inmunotransferencia. Sin embargo, las proteínas eucarióticas expresadas bacterianamente pueden no plegarse en una conformación activa.

Generalmente, de acuerdo con la presente invención, puede usarse cualquier método de rastreo para clones positivos.

Alternativas a aislar el DNA genómico o cDNA de enzima de veneno de Polistinae incluyen, pero no se limitan a, sintetizar químicamente la propia secuencia génica a partir de la secuencia proporcionada aquí.

Los métodos anteriores no pretenden limitar los métodos por los que pueden obtenerse clones de una enzima de veneno de Polistinae.

Puede usarse un gran número de sistemas vector-huésped conocidos en la técnica. Posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vectorial debe ser compatible con la célula huésped usada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados de lambda o plásmidos tales como diversos derivados de pBR322, por ejemplo, los vectores pUC, CR, pGEX; pmal-c, pFLAG, etc. La inserción en un vector de clonación puede efectuarse, por ejemplo, ligando el fragmento de DNA en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. En un aspecto preferido de la invención, las moléculas de ácido nucleico amplificadas por PCR de la invención contienen nucleótidos A que sobresalen 3' y pueden usarse directamente para clonar en un vector pCR con salientes de nucleótido T compatibles (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el DNA no están presentes en el vector de clonación, los extremos de la molécula de DNA pueden modificarse enzimáticamente. Alternativamente, cualquier sitio deseado puede producirse ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) sobre los extremos de DNA; estos enlazadores ligados pueden comprender oligonucleótidos químicamente sintetizados específicos que codifican secuencias de reconocimiento con endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector segmentado de un gen de enzima de veneno de Polistinae puede modificarse mediante prolongación ("tailing") homopolímera. Moléculas recombinantes pueden introducirse en células huésped a través de transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de modo que se generan muchas copias de la secuencia génica.

En modalidades específicas, la transformación de células huésped con moléculas de DNA recombinante que incorporan la secuencia de cDNA o DNA sintetizado del gen de enzima de veneno de Polistinae aislada permite la generación de múltiples copias del gen. Así, el gen puede obtenerse en grandes cantidades haciendo crecer transformantes, aislando las moléculas de DNA recombinante de los transformantes y, cuando es necesario, recuperando el gen insertado del DNA recombinante aislado.

Expresión de un Polipéptido o Fragmento de Alérgeno de Veneno de Polistinae

Según se apunta anteriormente, los ácidos nucleicos aislados que codifican enzimas de veneno de Polistinae, particularmente proteínas de veneno de Polistes, contienen secuencias inesperadas que deben estar ausentes para que el cDNA codifique una proteína similar a otras enzimas de veneno de Polistinae, por ejemplo, según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.593.877. En una modalidad, los ácidos nucleicos que contienen "intrones" se expresan sin modificación adicional. En otra modalidad, los ácidos nucleicos se modifican usando las técnicas descritas aquí ejemplificadas posteriormente, o según se describe en las referencias citadas anteriormente, tales como Sambrook y otros, para producir una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de una enzima de veneno de Polistinae natural (aunque, según se analiza posteriormente, tal proteína puede tener una estructura secundaria o terciaria diferente, o incluir otras secuencias polipeptídicas fusionadas a ella).

La secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima de veneno de Polistinae o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, derivados o análogos puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia de codificación de proteína insertada. Tales elementos se denominan aquí un "promotor". Así, la molécula de ácido nucleico que codifica la enzima de veneno de Polistinae está asociada operativamente con el promotor. Un vector de expresión también incluye preferiblemente un origen de replicación. Las señales de transcripción y traducción necesarias pueden ser suministradas por el gen natural que codifica una enzima de veneno de Polistinae y/o sus regiones de flanqueo. Sistemas de huésped-vector potenciales incluyen, pero no se limitan a, sistemas de células de mamífero infectados con virus (por ejemplo, virus vacunal, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófago, DNA, DNA plasmídico o DNA cosmídico. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema huésped-vector utilizado, puede usarse uno cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados.

En una modalidad alternativa, una enzima de veneno de Polistinae recombinante de la invención, o uno de sus fragmentos inmunomoduladores o variantes que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, se expresa cromosómicamente, después de la integración de las secuencias de codificación de la enzima de veneno de Polistinae mediante recombinación. A este respecto, puede usarse cualquiera de un número de sistemas de amplificación para alcanzar altos niveles de expresión génica estable (véase Sambrook y otros, 1989, anteriormente, en la Sección 16.28).

La célula en la que se introduce el vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica la enzima de veneno de Polistinae se cultiva en un medio de cultivo celular apropiado bajo condiciones que proporcionan la expresión de la enzima de veneno de Polistinae por la célula. La enzima de veneno de Polistinae expresada puede recuperarse a continuación del cultivo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos se describen con detalle posteriormente.

En otra modalidad, puede expresarse una proteína de fusión de enzima de veneno de Polistinae. Una proteína de fusión de enzima de veneno de Polistinae comprende al menos una porción funcionalmente activa de una proteína que no es de enzima de veneno de Polistinae empalmada a través de un enlace peptídico a al menos una porción inmunomoduladora de una enzima de veneno de Polistinae. Las secuencias que no son de enzima de veneno de Polistinae pueden ser amino- o carboxilo-terminales con respecto a las secuencias de enzima de veneno de Polistinae. Una molécula de DNA recombinante que codifica tal proteína de fusión comprende una secuencia que codifica al menos una porción funcionalmente activa de una enzima que no es de veneno de Polistinae empalmada en el marco a la secuencia codificante para una enzima de veneno de Polistinae. Puede codificar un sitio de segmentación para una proteasa específica, por ejemplo, Factor X, preferiblemente en la unión de las dos proteínas.

En otra modalidad específica, un fragmento de la enzima de veneno de Polistinae se expresa como una proteína libre (sin fusión).

En otra modalidad, una forma periplásmica de la proteína de fusión (que contiene una secuencia de señal) puede producirse para la exportación de la proteína al periplasma de Escherichia coli. La exportación al periplasma puede promover el plegamiento apropiado de la proteína expresada.

Cualquiera de los métodos descritos previamente en la Patente Nº 5.593.877 para la inserción de fragmentos de DNA en un vector puede usarse para construir vectores de expresión que contienen un gen que consiste en señales de control de la transcripción/traducción apropiadas y las secuencias codificantes de proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas de DNA recombinante y sintéticas in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de veneno de Polistinae, o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que la proteína o el péptido de enzima de veneno de Polistinae se exprese en un huésped transformado con la molécula de DNA recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína de enzima de veneno de Polistinae puede controlarse mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el huésped seleccionado para la expresión. Promotores que pueden usarse para controlar la expresión de genes de enzima de veneno de Polistinae incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano inmediato de CMV, la región promotora temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto y otros, 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner y otros, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster y otros, 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff y otros, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) o el promotor tac (DeBoer y otros, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); véase además "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; elementos promotores procedentes de levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de fosfatasa alcalina y las regiones de control de la transcripción de animales, que exhiben especificidad tisular y se han utilizado en animales transgénicos.

Una vez que una molécula de DNA recombinante particular se identifica y aísla, varios métodos conocidos en la técnica pueden usarse para propagarla. Una vez que se establecen un sistema huésped y condiciones de crecimiento adecuados, vectores de expresión recombinantes pueden propagarse y prepararse en cantidad. Según se explica previamente, los vectores de expresión que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, los siguientes vectores o sus derivados: virus de seres humanos o animales tales como virus vacunal o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; virus de levadura; vectores bacteriofágicos (por ejemplo, lambda) y vectores de DNA plasmídicos y cosmídicos, por nombrar solo unos pocos.

Además, puede elegirse una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico en el modo específico deseado. Diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, glicosilación, segmentación [por ejemplo, de la secuencia de señal]) de proteína. Líneas celulares o sistemas huésped apropiados pueden elegirse para asegurar la modificación y el procesamiento de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano puede usarse para producir un producto proteínico central no glicosilado. Sin embargo, la proteína enzimática expresada en bacterias no puede plegarse apropiadamente. La expresión en levadura puede producir un producto glicosilado. La expresión en células de insecto puede usarse para incrementar la probabilidad de glicosilación y plegamiento (naturales) de una enzima de veneno de Polistinae heteróloga. Por otra parte, diferentes sistemas de expresión de vector/huésped pueden afectar a las reacciones de procesamiento, tales como segmentaciones proteolíticas, en una extensión diferente. Es interesante apuntar que se ha observado que la glicosilación y el replegamiento apropiado no son esenciales para la actividad inmunomoduladora de un alérgeno de veneno de Polistinae ya que el alérgeno producido bacterianamente es activo en un ensayo de proliferación de células T.

Los vectores se introducen en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo transfección, electroporación, electrotransferencia, microinyección, traducción, fusión celular, DEAE-dextrano, purificación con fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola génica o un transportador de vectores de DNA (véanse, por ejemplo, Wu y otros, 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut y otros, Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).

Vectores preferidos, particularmente para la producción de proteínas in vivo, son vectores virales, tales como lentivirus, retrovirus, herpesvirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus vacunales, baculovirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Así, un vector que codifica una enzima de veneno de Polistinae puede introducirse in vivo o ex vivo usando un vector viral o a través de la introducción directa de DNA. La expresión en tejidos elegidos como diana puede efectuarse orientando el vector transgénico a células específicas, tales como con un vector viral o un ligando receptor, o usando un promotor específico para el tejido, o ambos. El aporte génico orientado se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 95/28494, publicada en octubre de 1995.

Vectores virales comúnmente usados para los procedimientos de orientación y expresión in vivo o ex vivo son vectores basados en DNA y vectores retrovirales. Métodos para construir y usar vectores virales son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniques, 7:980-990, 1992). Preferiblemente, los vectores virales son defectuosos con respecto a la replicación, esto es son incapaces de replicarse autónomamente en la célula diana. Preferiblemente, el virus defectuoso con respecto a la replicación es un virus mínimo, es decir, retiene solo las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsidar el genoma para producir partículas virales.

Los vectores virales de DNA incluyen un virus de DNA atenuado o defectuoso, tal como, pero no limitado a, virus de herpes simple (HSV), papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adenoasociado (AAV), virus vacunal y similares. Ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no se limitan a, un vector de virus de herpes 1 (HSV1) defectuoso (Kaplitt y otros, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330, 1991; Publicación de Patente Internacional Nº WO 94/21807, publicada el 29 de septiembre de 1994; Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y otros, (J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992; véase también La Salle y otros, Science 259:988-990, 1993) y un vector de virus adenoasociado defectuoso (Samulski y otros, J. Virol. 61:3096-3101, 1987; Samulski y otros, J. Virol. 63:3822-3828, 1989; Lebkowski y otros, Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996, 1988).

Diversas compañías producen vectores virales comercialmente, incluyendo, pero de ningún limitadas a, Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores de AAV), Cell Genesys (Foster City, CA; vectores retrovirales, adenovirales, de AAV y vectores lentivirales), Clontech (vectores retrovirales y baculovirales), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; vectores adenovirales y de AAV), Genvec (vectores adenovirales), IntroGene (Leiden, Países Bajos; vectores adenovirales), Molecular Medicine (vectores retrovirales, adenovirales, de AAV y vectores virales de herpes), Norgen (vectores adenovirales), Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vectores lentivirales) y Transgene (Strasbourg, Francia; vectores adenovirales, vacunales, retrovirales y lentivirales).

En otra modalidad, el vector puede introducirse in vivo mediante lipofección, como DNA desnudo, o con otros agentes que facilitan la transfección (péptidos, polímeros, etc.). Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987); Felgner y Ringold, Science 337:387-388, 1989; véase Mackey y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031, 1988; Ulmer y otros, Science 259:1745-1748, 1993). Compuestos y composiciones lipídicos útiles para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en las Publicaciones de Patente Internacionales WO95/18863 y WO96/17823 y en la Patente de EE.UU. Nº 5.459.127. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con el propósito de la orientación (véase Mackey y otros, anteriormente). Los péptidos, por ejemplo hormonas o neurotransmisores, y las proteínas, tales como anticuerpos, o las moléculas no peptídicas, orientados, podrían acoplarse a liposomas químicamente.

Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO95/21931), péptidos derivados de proteínas que se unen a DNA (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO96/25508) o un polímero catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO95/21931).

Alternativamente, vectores de DNA no virales para terapia génica pueden introducirse en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato cálcico, uso de una pistola génica (transfección balística; véanse, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 5.204.253, Patente de EE.UU. Nº 5.853.663, Patente de EE.UU. Nº 5.885.795 y Patente de EE.UU. Nº 5.702.384 y véase Sanford, TIB-TECH, 6:299-302, 1988; Fynan y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:11478-11482, 1993; y Yang y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:1568-9572, 1990), o el uso de un transportador de vectores de DNA (véase, por ejemplo, Wu y otros, J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; Wu y Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988; Hartmut y otros, Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730, 1991). También pueden usarse sistemas de aporte de DNA mediados por receptores (Curiel y otros, Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987). Las Patentes de EE.UU. Nº 5.580.859 y 5.589.466 describen el aporte de secuencias de DNA exógenas, libres de agentes que facilitan la transfección, en un mamífero. Recientemente, se ha descrito una técnica de transferencia de DNA in vivo de alta eficacia y voltaje relativamente bajo, denominada electrotransferencia (Mir y otros, C.P. Acad. Sci., 321:893, 1998; WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175).

Tanto cDNA como secuencias genómicas pueden clonarse y expresarse.

Se contempla además que las enzimas de veneno de Polistinae de la presente invención, o sus variantes que codifican un hialuronidasa que tiene la actividad de hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, o sus fragmentos inmunomoduladores pueden prepararse sintéticamente, por ejemplo mediante síntesis de péptidos en fase sólida.

Aislamiento y Purificación

Una vez que se identifica la proteína de enzima de veneno de Polistinae recombinante, puede aislarse y purificarse mediante métodos estándar incluyendo cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.

En una modalidad particular, una enzima de veneno de Polistinae y sus fragmentos pueden tratarse por ingeniería para incluir aproximadamente seis residuos de histidilo, lo que hace posible el aislamiento selectivo de la proteína recombinante en una columna de quelación de Ni. En un aspecto preferido, las proteínas se purifican adicionalmente mediante cromatografía en fase inversa.

En otra modalidad, en la que enzima de veneno de Polistinae recombinante se expresa como una proteína de fusión, la porción que no es enzima de veneno de Polistinae de la proteína de fusión puede orientarse para la purificación por afinidad. Por ejemplo, un anticuerpo específico para la porción que no es de enzima de veneno de Polistinae de la proteína de fusión puede inmovilizarse sobre un soporte sólido, por ejemplo Sepharose activada con bromuro de cianógeno, y usarse para purificar la proteína de fusión. En otra modalidad, un socio de unión de la porción que no es de enzima de veneno de Polistinae de la proteína de fusión, tal como un receptor o ligando, puede inmovilizarse y usarse para purificar por afinidad la proteína de fusión.

En una modalidad, una proteína de fusión de enzima de veneno de Polistinae, preferiblemente purificada, se usa sin modificación adicional, es decir, sin segmentar o retirar de otro modo la porción que no es de enzima de veneno de Polistinae de la proteína de fusión. En una modalidad preferida, la proteína de fusión de enzima de veneno de Polistinae puede usarse terapéuticamente, por ejemplo para modular una respuesta inmunitaria.

En una modalidad adicional, la proteína de fusión purificada se trata para segmentar la proteína que no es de enzima de veneno de Polistinae o una de sus porciones de la enzima de enzima de veneno de Polistinae. Por ejemplo, cuando la proteína de fusión se ha preparado para incluir un sitio de segmentación sensible a proteasas, la proteína de fusión puede tratarse con la proteasa para segmentar el sitio específico para la proteasa y liberar enzima de veneno de Polistinae.

En una modalidad particular de la presente invención, tales enzimas de veneno de Polistinae recombinantes incluyen, pero ciertamente no se limitan a, las que contienen, como secuencia de aminoácidos primaria, la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos que se representa substancialmente en la Figura 4 (ID SEC Nº: 4) así como sus variantes que tienen la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4.

Derivados y Análogos de Enzimas de Veneno de Polistinae

La producción y el uso de derivados y análogos relacionados con enzimas de veneno de Polistinae son inmunomoduladores, es decir, capaces de modular una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Por otra parte, los análogos o derivados de enzimas de veneno de Polistinae, particularmente hialuronidasa de Polistes annularis, también pueden usarse para tratar trastornos o enfermedades relacionados con el sistema inmunitario, o un síntoma relacionado con los mismos. El derivado o análogo puede unirse a una inmunoglobulina específica para enzima de veneno de Polistinae, incluyendo IgG e IgE. Derivados o análogos de enzima de veneno de Polistinae pueden probarse con respecto a la actividad inmunomoduladora deseada mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, los ensayos descritos posteriormente.

En particular, pueden elaborarse derivados de enzima de veneno de Polistinae alterando las secuencias de ácido nucleico de la invención mediante substituciones, adiciones o deleciones. Debido a la degeneración de las secuencias codificantes de nucleótidos, otras secuencias de DNA que codifican substancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un ácido nucleico que codifica una enzima de veneno de Polistinae pueden usarse en la práctica de la presente invención. Estas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos que comprenden la totalidad o porciones de un gen que codifica la enzima de veneno de Polistinae que se altera mediante la substitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Asimismo, los derivados incluyen, pero no se limitan a, los que contienen, como una secuencia de aminoácidos primaria, la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de una enzima de veneno de Polistinae, incluyendo secuencias alteradas en las que residuos dentro de la secuencia son substituidos por residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes, dando como resultado una substitución de aminoácidos conservativa. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia puede substituirse por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Substitutos para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

Derivados o análogos de enzima de veneno de Polistinae incluyen, pero no se limitan a, los que son substancialmente homólogos a una enzima de veneno de Polistinae o sus fragmentos, o cuyo ácido nucleico codificante es capaz de hibridarse a una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima de veneno de Polistinae. La hibridación puede producirse bajo condiciones de moderadamente restrictivas a altamente restrictivas, dependiendo del grado de similitud de secuencia, como es bien conocido en la técnica.

Los derivados y análogos pueden producirse mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que dan como resultado su producción pueden producirse a nivel génico o proteínico. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de la enzima de veneno de Polistinae clonada puede modificarse mediante cualquiera de numerosas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York). La secuencia puede segmentarse en sitios apropiados con una endonucleasa o endonucleasas de restricción, seguido por modificación enzimática adicional, si se desea, aislarse y ligarse in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de una enzima de veneno de Polistinae, debe tenerse cuidado de asegurar que el gen modificado permanezca dentro del mismo marco de lectura traduccional que la enzima de veneno de Polistinae, no interrumpido por señales de parada de la traducción.

Adicionalmente, el gen que codifica una enzima de veneno de Polistinae puede mutarse in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de endonucleasas de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar la modificación in vitro adicional. Puede usarse cualquier técnica para mutagénesis conocida en la especialidad, incluyendo, pero no limitada a, mutagénesis dirigida al sitio (Hutchinson, C. y otros, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant y otros, 1986, Gene 44:177; Hutchinson y otros, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), uso de enlazadores TAB® (Phannacia), etc. Las técnicas de PCR se prefieren para la mutagénesis dirigida al sitio (véase Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capítulo 6, pp. 61-70).

Las manipulaciones de la enzima de veneno de Polistinae recombinante también pueden realizarse a nivel proteínico. Pueden prepararse los fragmentos u otros derivados o análogos de enzima de veneno de Polistinae recombinantes que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo mediante glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, reducción y carboximetilación, derivación mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, segmentación proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a, segmentación química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH_{4}, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.

En una modalidad particular, la enzima de veneno de Polistinae o uno de sus fragmentos inmunomoduladores se expresa en un sistema de expresión de células de insecto, por ejemplo, usando un vector de expresión de baculovirus. Según se apunta anteriormente, esto debe dar glicosilación y estructura, particularmente estructura secundaria y terciaria, "naturales" del polipéptido expresado. La glicosilación y estructura naturales del polipéptido expresado pueden ser muy importantes para usos diagnósticos, ya que los anticuerpos específicos para la enzima detectados en ensayos diagnósticos serán específicos para la enzima natural, es decir, según se introduce por una picadura de un véspido.

Ensayos de Actividad con Péptidos de la Invención

Se conocen numerosos ensayos en la inmunología para evaluar la actividad inmunomoduladora de un antígeno. Por ejemplo, las proteínas de enzima de veneno de Polistinae producidas mediante la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden usarse en ensayos diagnósticos para enfermedades alérgicas, que se describen con detalle posteriormente. En general, tales proteínas pueden probarse con respecto a la capacidad para unirse a anticuerpos específicos para la enzima. Preferiblemente, tales anticuerpos que se detectan en el ensayo diagnóstico son de la clase IgE. Sin embargo, es importante apuntar que se ha encontrado que anticuerpos específicos para alérgenos naturales se unen débilmente a alérgenos de veneno de véspido desnaturalizado. Las enzimas de veneno de Polistinae producidas en sistemas de expresión eucarióticos, y particularmente sistemas de expresión de células de insecto, pueden tener la estructura correcta para la unión a anticuerpo. Las enzimas de veneno de Polistinae expresadas en sistemas de expresión bacterianos no pueden, y requerirían así un replegamiento antes del uso en un ensayo diagnóstico para la unión a anticuerpo.

En otra modalidad, las proteínas de la invención pueden probarse en un ensayo de proliferación para respuestas de células T. Para tales ensayos de respuesta de células T, el sistema de expresión usado para producir la enzima no parece afectar a la actividad inmunomoduladora de la proteína. Generalmente, se obtienen linfocitos de un huésped sensibilizado. El huésped puede ser un ratón que se ha inmunizado con una enzima de veneno de Polistinae, tal como hialuronidasa de veneno de Polistinae que se ha producido recombinantemente de acuerdo con la presente invención.

En una modalidad preferida, se obtienen leucocitos de sangre periférica de un ser humano que es sensible a veneno de véspido. Usando técnicas que son bien conocidas en la especialidad, la respuesta de linfocitos T a la proteína puede medirse in vitro. En una modalidad específica, posteriormente, se detectan respuestas de células T midiendo la incorporación de ^{3}H-timidina, que se incrementa con la síntesis de DNA asociada con la proliferación.

La proliferación celular también puede detectarse usando un ensayo de MTT (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63; Niks y Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140-151). Cualquier método para detectar la proliferación de células T conocido en la técnica puede usarse con la enzima de Polistinae producida de acuerdo con la presente invención.

De forma similar, ensayos de producción de linfoquinas pueden ponerse en práctica de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, la producción de linfoquinas puede ensayarse usando ensayos inmunológicos o de coestimulación (véase, por ejemplo, Fehlner y otros, 1991, J. Immunol. 146:799) o usando la técnica de ELISPOT (Czerkinsky y otros, 1988, J. Immunol. Methods 110:29). Alternativamente, puede detectarse mRNA para linfoquinas, por ejemplo, mediante amplificación (véase Brenner y otros, 1989, Biotechniques 7:1096) o hibridación in situ (véase, por ejemplo, Kasaian y Biron, 1989, J. Immunol. 142:1287). De particular interés son aquellos individuos cuyas células T producen linfoquinas asociadas con episodios de cambio de isotipo IgE, por ejemplo, IL-4 e IL-5 (Purkeson e Isakson, 1992, J. Exp. Med. 175:973-982). También son de interés los fragmentos polipeptídicos de la enzima de veneno de Polistinae que contienen epítopos reconocidos por células T implicadas en episodios de cambio de
IgE.

Así, en un aspecto preferido, las proteínas producidas de acuerdo con la presente invención pueden usarse en ensayos in vitro con linfocitos de sangre periférica o, más preferiblemente, líneas celulares derivadas de linfocitos de sangre periférica, obtenidos de individuos sensibles a enzima de veneno de véspido para detectar la secreción de linfoquina normalmente asociada con respuestas alérgicas, por ejemplo, IL-4. Tales ensayos pueden indicar qué componente o componentes del veneno son responsables del estado alérgico. De forma más importante, pueden probarse los fragmentos de la enzima de veneno de Polistinae. De este modo, pueden identificarse epítopos específicos responsables de la respuesta de células T asociada con la respuesta alérgica. Las secuencias de tales epítopos pueden compararse con otras enzimas de veneno de véspido y con proteínas ambientales o autólogas para determinar si existen similitudes de secuencia que sugieren posible reactividad cruzada. Los péptidos pueden probarse con respecto a la capacidad para inducir anergia de células T, por ejemplo mediante administración de megadosis, modificación para producir un antagonista del epítopo, administración en ausencia de las señales coestimulantes apropiadas y otros métodos que se cree que dan como resultado anergia de células T. Los péptidos que contienen tales epítopos son candidatos ideales para la terapia.

En una modalidad adicional, el polipéptido de la invención puede usarse directamente en ensayos para detectar la extensión de reactividad cruzada con otras proteínas ambientales y/o proteínas homólogas, con las que comparten su similitud de secuencia. En particular, los fragmentos de las enzimas de veneno de Polistinae que tienen similitud de secuencia con tales proteínas ambientales, y, más particularmente, homólogas, pueden evaluarse con respecto a la reactividad cruzada con anticuerpos o células T específicos para tales proteínas. En otra modalidad específica, se evalúa la reactividad cruzada de hialuronidasa de veneno de Polistinae con la proteína PH-20 de membrana de esperma.

Usos Diagnósticos y Terapéuticos de los Polipéptidos de Enzima de Veneno de Polistinae

La presente invención proporciona una fuente plena de una enzima de veneno de Polistinae, producida mediante técnicas recombinantes. Alternativamente, dada la información de secuencia proporcionada por la presente invención, fragmentos polipeptídicos, derivados o análogos de las enzimas de veneno de Polistinae pueden producirse ventajosamente mediante síntesis de péptidos.

La invención contempla el uso de enzimas de veneno de Polistinae, o fragmentos inmunomoduladores o variantes que tienen la actividad de hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, para la preparación de composiciones diagnósticas o terapéuticas, para el uso en el diagnóstico y la terapia de estados alérgicos específicos de alérgenos de veneno de véspido, tratar estados alérgicos específicos de alérgenos de veneno de véspido, tratar estados relacionados con el sistema inmunitario y modular la respuesta inmunitaria en un mamífero contra un inmunógeno. En particular, hialuronidasa de Polistes, en particular hialuronidasa de Pol a, o fragmentos inmunomoduladores, variantes que tienen la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4 se contemplan para el uso en el diagnóstico, la terapia, el tratamiento y la modulación de la respuesta inmunitaria de acuerdo con la presente invención.

Métodos Diagnósticos

Según se usa aquí, el término diagnóstico incluye ensayos diagnósticos in vitro o in vivo. Generalmente, tales ensayos se diseñan para medir la actividad de anticuerpos IgE específicos para un alérgeno dado. Tales ensayos diagnósticos dependen fuertemente de la disponibilidad de alérgeno puro. Esto es especialmente cierto para determinar la sensibilidad a un componente del alérgeno específico de un veneno de véspido. Los ensayos diagnósticos in vitro para la sensibilidad a enzimas incluyen radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo inmunorradiométrico (IRMA), pruebas radioalergosorbentes (RAST), ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA), ELISPOT, ensayo alergosorbente magnético, inmunotransferencia, ensayos de liberación de histamina, y similares.

Además, puede determinarse la presencia de epítopos que son predominantemente reactivos con anticuerpos IgE, o con otros isotipos, por ejemplo IgG. Tales epítopos pueden solaparse o ser distintos. En particular, fragmentos de las enzimas de veneno de Polistinae de la invención pueden usarse para identificar tales epítopos de células B específicos. La identificación de epítopos específicos puede proporcionar una base para desarrollar terapias, según se describe posteriormente.

Por otra parte, pueden usarse ensayos diagnósticos in vitro sobre linfocitos de sangre periférica, según se describe posteriormente. Tales ensayos diagnósticos pueden dar información detallada acerca de la respuesta de células T específicas para enzima, el fenotipo de las respuestas de células T y preferiblemente el epítopo de células T de la enzima implicada en respuestas de células T. El epítopo inmunodominante y el epítopo implicado en episodios de cambio de clase de isotipo IgE pueden detectarse, si no son iguales. En particular, los epítopos de células T de enzimas de veneno de Polistinae que estimulan la proliferación y/o la secreción de linfoquina de células T de un fenotipo asociado con episodios de cambio de clase de isotipo IgE pueden identificarse para un individuo específico o para una clase de individuos que comparten haplotipo del MHC o una expresión de la región variable del receptor de células T predominante, o ambos.

Los ensayos in vitro para la alergenicidad consisten generalmente en ensayos de sensibilidad de punzadas cutáneas, en los que cantidades divididas en serie de un alérgeno se administran bien subcutáneamente o bien intradérmicamente a la piel de un paciente, y se detectan reacciones tipo roncha y eritema. Como con los ensayos in vitro, la disponibilidad de enzima de veneno pura incrementa mucho el valor de los resultados de los ensayos diagnósticos in vivo ya que la reactividad cruzada con impurezas en extractos preparados a partir de sacos de veneno de véspido puede evitarse.

Métodos Terapéuticos

Las composiciones terapéuticas de la invención (véase posteriormente) pueden usarse en inmunoterapia, también denominada terapia de hiposensibilización. La inmunoterapia ha resultado eficaz en enfermedades alérgicas, particularmente alergia a insectos. Los alérgenos se administran parenteralmente a través de un largo período de tiempo en dosis gradualmente creciente. Tal terapia puede ser particularmente eficaz cuando el alérgeno o los alérgenos a los que es sensible el paciente se han identificado específicamente y la terapia se orienta a este alérgeno u alérgenos. Así, la disponibilidad de enzima de veneno de Polistinae en grandes cantidades es importante para la inmunoterapia de la alergia.

En otra modalidad, la presente invención contempla el uso de polipéptidos que comprenden al menos un epítopo de células T inmunomodulador de una enzima de veneno de Polistinae para inducir alergia de células T específica a una enzima de veneno de véspido. La identificación de tales péptidos se describe anteriormente. Más preferiblemente, un péptido que comprende tal epítopo de células T y que carece de epítopo de células B puede administrarse a un paciente. La presencia de epítopos de células B en un alérgeno puede provocar una reacción sistémica no deseable cuando el alérgeno se usa para inmunoterapia. Así, una ventaja particular de la invención es la capacidad para proporcionar polipéptidos de alérgeno que no provocan efectos sistémicos no deseables.

En una modalidad, uno o más fragmentos polipeptídicos pueden inyectarse subcutáneamente para disminuir la respuesta de células T a la molécula entera, por ejemplo, según se describe por Brine y otros, (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7608-12).

En otra modalidad, uno o más fragmentos polipeptídicos pueden administrarse intranasalmente para suprimir respuestas específicas para alérgenos en sujetos normales y sensibilizados (véase, por ejemplo, Hoyne y otros, 1993, J. Exp. Med. 178:1783-88).

Se espera que la administración de un péptido de enzima de veneno de Polistinae de la invención induzca anergia, dando como resultado el cese de la producción de anticuerpos específicos de alérgenos o respuesta de células T específica de alérgenos, o ambos, y así tienen un efecto terapéutico.

En un aspecto preferido de la invención, la terapia basada en péptidos para inducir anergia de células T se adapta para cada individuo o grupo de individuos. Usando los métodos diagnósticos de la presente invención, pueden identificarse el epítopo o los epítopos de células T específicos de una enzima de veneno de véspido implicada en la respuesta alérgica. Los péptidos que comprenden estos epítopos pueden usarse a continuación en un régimen de inmunoterapia individualizado.

Tratamiento de Enfermedades o Trastornos Relacionados con el Sistema Inmunitario o un Síntoma Relacionado con los Mismos

Según se explica anteriormente, la presente invención se refiere a polipéptidos para tratar enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmunitario, o para modular la respuesta inmunitaria en un mamífero hacia un inmunógeno, en donde los polipéptidos son codificados por moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican enzimas de veneno de Polistinae, tales como hialuronidasa de Polistes annularis. En particular, los componentes del veneno de véspido, particularmente hialuronidasa, tienen aplicaciones en la modulación de una respuesta inmunitaria de un sujeto a diversos inmunógenos, tales como patógenos o virus, por nombrar solo unos pocos. En una modalidad particular, componentes de un veneno de Polistinae, y particularmente hialuronidasa de Polistes annularis, y sus variantes conservadas, sus fragmentos o análogos o sus derivados modulan un sistema inmunitario de sujeto para tener una capacidad incrementada para combatir patógenos y virus, incluyendo, pero no limitados a, HIV, virus de herpes simple o papilomavirus. En una modalidad específica, tal método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de DNA del Nº ID SEC: 3, sus variantes, que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC 4, sus fragmentos inmunomoduladores, o una molécula de ácido nucleico aislada hibridable a la misma, en donde el polipéptido comprende una porción antigénica de un epítopo de células B o una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T de hialuronidasa de Polistes annularis.

Por otra parte, se ha descubierto que los componentes de veneno de Polistinae, tales como hialuronidasa de Polistes annularis, también tienen aplicaciones para tratar una enfermedad o trastorno relacionados con el sistema inmunitario, o un síntoma relacionado con los mismos. Según se usa aquí, la expresión "enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario" se refiere a una enfermedad o trastorno que provoca una respuesta inmunitaria de un sujeto, o afecta a la capacidad del sistema inmunitario para responder a un inmunógeno. Ejemplos de enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmunitario que pueden tratarse con agentes y composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad o trastorno patógeno, una enfermedad o trastorno viral, por ejemplo, HIV, virus de herpes simple o papilomavirus; o una enfermedad autoinmune, por ejemplo artritis o lupus. De ahí que la presente invención abarque agentes para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario, o un síntoma relacionado con los mismos, en una modalidad específica que comprende un polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de DNA del Nº ID SEC: 3, sus variantes, que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, sus fragmentos inmunomoduladores, en donde el polipéptido aislado comprende una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T o una porción antigénica de un epítopo de células B de hialuronidasa de Polistes annularis.

De ahí que, naturalmente, la presente invención se extienda a una composición farmacéutica para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario, que comprende una enzima de veneno de Polistinae, o sus variantes, que tienen la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4, o sus fragmentos inmunomoduladores. Por otra parte, la presente invención se extiende a un método para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario, o un síntoma relacionado con los mismos, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario en un sujeto. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa aquí para significar una cantidad suficiente para tratar y preferiblemente incrementar en al menos aproximadamente 30 por ciento, más preferiblemente en al menos 50 por ciento, lo más preferiblemente en al menos 90 por ciento, la capacidad del sistema inmunitario de un sujeto para combatir eficazmente un inmunógeno. A medida que se efectúen estudios adicionales, surgirá información relativa a los niveles de dosificación apropiados para la modulación de la respuesta del sistema inmunitario hacia un inmunógeno en diversos pacientes, y el trabajador experto normal, considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, será capaz de determinar la dosificación apropiada. El aporte puede ser de la proteína o un vector terapéutico génico. De ahí que, por ejemplo, si la enfermedad o el trastorno relacionado con el sistema inmunitario implica HIV, un cambio clínicamente significativo implicaría, por ejemplo, un incremento en el conteo de glóbulos blancos en un sujeto al que se administra una composición farmacéutica de la invención con relación al conteo de glóbulos blancos antes de la administración. Otros de tales ejemplos de verificación de un cambio clínicamente significativo en un sujeto serán fácilmente evidentes para un experto normal en la técnica. Por otra parte, a medida que se efectúen estudios adicionales, surgirá información relativa a los niveles de dosificación apropiados para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario, o un síntoma relacionado con los mismos, en diversos pacientes, y el trabajador experto normal, considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, será capaz de determinar la dosificación apropiada. Ejemplos de composiciones farmacéuticamente aceptables se describen posteriormente.

Composiciones Farmacéuticamente Aceptables

Las composiciones diagnósticas o terapéuticas in vivo de la invención también pueden contener portadores, excipientes, diluyentes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables apropiados. Según se usa aquí, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa preferiblemente aprobado por una agencia reguladora de un gobierno, en particular el gobierno federal o un gobierno estatal, o listado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para usar en animales y más particularmente en seres humanos. Portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.

Tales portadores farmacéuticamente aceptable pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse en portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen manitol, albúmina de suero humano (HSA), almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, carbonato magnésico, estearato magnésico, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.

Tales composiciones contendrán una cantidad diagnóstica o terapéutica eficaz del compuesto activo junto con una cantidad adecuada de portador a fin de proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. Aunque la inyección intravenosa es una forma muy eficaz de administración, pueden emplearse otros modos, tales como mediante inyección o mediante administración oral, nasal o parenteral.

La invención se clarificará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, no siendo el ejemplo 1 parte de esta invención.

Ejemplo 1 Fosfolipasa de avispa roja del papel

Basándose, en parte, en los métodos y la descripción de la Patente de EE.UU. Nº 5.593.877, se obtuvieron ácidos nucleicos que codifican fosfolipasa de Pol a (avispa roja del papel). Sin embargo, estos ácidos nucleicos incluyen sorprendentemente secuencias internas que no codifican para una secuencia de aminoácidos encontrada según se espera en la proteína natural. Aunque los ácidos nucleicos descritos en este Ejemplo son cDNAs y no son genómicos, parecen incluir "intrones".

Materiales y métodos

Los métodos usados son los mismos que los descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.593.877, que usa RACE.

Resultados

Cuando se examinaba cDNA de fosfolipasa A de avispa roja del papel producido con RACE, se observó que su longitud era más larga que la necesaria para codificar proteína de fosfolipasa A de avispa roja del papel. Se descubrió que, sorprendentemente, esta longitud aumentada era el resultado de intrones incorporados en el cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel. Tal descubrimiento era inesperado a la luz de estudios efectuados sobre los cDNAs de otros venenos de véspido, que invariablemente no contenían intrones. Por ejemplo, los cDNAs de fosfolipasa de avispa común y avispón no contienen tales intrones.

Debido a esta diferencia principal no prevista entre el cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel y otros cDNAs de fosfolipasa de veneno de véspido, se requerían biotécnicas y etapas especiales para aislar cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel, que no se necesitaban para obtener el cDNA de fosfolipasa de veneno de otros véspidos, tales como avispón y avispa común. En particular, para aislar la secuencia de cDNA que codifica fosfolipasa A_{1} para avispa roja del papel, era necesario determinar el tamaño y la localización y el número de intrones.

Usando la secuencia de aminoácidos derivada de la degradación con bromuro de cianógeno de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel, el código genético y la secuencia de nucleótidos de cDNA de fosfolipasa de avispa roja derivada del protocolo RACE, se descubrieron dos intrones. El primer intrón, denominado posteriormente aquí "intrón 1 papla" comprende una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC: 5 (Figura 2A). El intrón papla 1 comprende 114 nucleótidos y está normalmente situado entre los nucleótidos 111 y 112 de la secuencia de cDNA que codifica fosfolipasa A_{1}, indicada el Nº ID SEC: 1.

También se descubrió un segundo intrón, denominado aquí posteriormente "intrón papla 2". Este intrón comprende una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC: 6 (Figura 2B). El intrón papla 2 contiene 127 nucleótidos y normalmente está situado entre los nucleótidos 720t 721 del Nº ID SEC: 1.

Para aislar la secuencia de cDNA que codifica fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel (Nº ID SEC: 1) estos intrones tenían que retirarse del cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel derivado de RACE sin romper el marco de lectura de los nucleótidos codificantes. En esencia, el cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel tenía que rediseñarse de modo que solo se incluyeran nucleótidos codificantes. Este procedimiento de rediseño era técnicamente muy difícil debido a que, si un nucleótido codificante se retiraba accidentalmente junto con un intrón o si un nucleótido no codificante no se retiraba, se produciría un cambio del marco de lectura que daría como resultado mutaciones y podría provocar una terminación prematura de la expresión del cDNA.

En este procedimiento de rediseño, oligonucleótidos especialmente diseñados se sintetizaron químicamente, cada uno complementario a los nucleótidos codificantes situados 5' y 3' de uno de los intrones. El cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel amplificado derivado de RACE se clonó a continuación en un plásmido autorreplicante. Este plásmido se desnaturalizó y, bajo condiciones de baja restricción, se permitió que los oligonucleótidos se reasociaran al cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel, dejando los intrones de una sola hebra. Estos oligonucleótidos servían a continuación como cebadores para la síntesis de DNA, que generaba un plásmido de doble hebra en el que los intrones se sometían a deleción de una de las hebras. Una célula se transfectó a continuación con el plásmido usando métodos descritos anteriormente y la célula se clonó a continuación. Puesto que una de las dos hebras de DNA en el plásmido original tenía los intrones sometidos a deleción, la mitad de las células transfectadas contenía un plásmido de doble hebra en el que se habían retirado los intrones. Los clones se rastrearon a continuación para aislar las células que tenían el plásmido que comprendía cDNA de avispa roja del papel que comprendía una secuencia de DNA del Nº ID SEC: 9 (sin intrones). A continuación, copias del plásmido particular se aislaron y se sometieron a secuenciación para confirmar la deleción de los intrones. El cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel rediseñado se retiró a continuación del plásmido particular, se sometió a secuenciación, se amplificó y se clonó en un vector de expresión, usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 y en la Solicitud Nº de Serie 08/474.853 y en la Patente de EE.UU. 5.593.877, que se incorporan aquí mediante referencia en sus totalidades.

Se realizó una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel (Nº ID SEC: 2) con otras fosfolipasas de veneno de véspido. En particular, el Nº ID SEC: 2 se comparó con fosfolipasa de avispón de clara blanca (D. maculata) (Nº ID SEC: 7) y fosfolipasa de avispa común (V. vulgaris) (Nº ID SEC: 8). Los resultados de esta comparación de secuencias se muestran en la Figura 3.

Ejemplo 2 Hialuronidasa de avispa roja del papel

Usando los procedimientos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.593.877, la secuencia del cDNA que codifica hialuronidasa de avispa roja del papel (Pol a) (Nº ID SEC: 3) y su correspondiente secuencia de aminoácidos (Nº ID SEC: 4) se aislaron y se indican en la Figura 4. Los nucleótidos 449 a 536 del Nº ID SEC: 3 codifican una porción de una secuencia de señal. De ahí que el residuo de aminoácido en el extremo N de hialuronidasa de Pol a madura sea serina, que es codificada por los nucleótidos 536, 537 y 538.

Sorprendentemente, el cDNA de hialuronidasa de avispa roja del papel producida a partir del protocolo RACE indicado anteriormente tenía más longitud que la necesaria para codificar proteína de hialuronidasa de Pol a. De ahí que se concluyó que el cDNA de hialuronidasa de avispa roja del papel contenía al menos un intrón. La presencia de al menos un intrón dentro del cDNA de hialuronidasa de avispa roja era inesperada a la luz de estudios sobre el cDNA de hialuronidasa de otros venenos de véspido, tales como avispa común y avispón, que no contienen intrones. Como resultado, biotécnicas especiales similares a las empleadas para aislar cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel, indicadas en el Ejemplo 1 anteriormente, se requerían para aislar la secuencia codificante de cDNA de hialuronidasa de avispa roja del papel.

Inicialmente, se realizó una determinación en cuanto a la localización y el tamaño de los intrones dentro del cDNA de hialuronidasa de avispa roja del papel. Una vez que los intrones se localizaban, tenían que retirarse de tal manera que no perturbaran los nucleótidos codificantes. De ahí que, justo como con el cDNA de fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel, fuera necesario rediseñar el cDNA de hialuronidasa de avispa roja del papel de modo que solo se incluyeran nucleótidos codificantes. Este procedimiento de rediseño era técnicamente muy difícil debido a que, si un nucleótido codificante se retiraba accidentalmente junto con un intrón o si un nucleótido no codificante no se retiraba, tendría lugar una mutación de cambio de marco sin sentido en el cDNA de hialuronidasa de avispa roja.

El cDNA que codifica hialuronidasa de avispa roja del papel madura (Nº ID SEC: 3) se preparó usando un procedimiento similar al usado para aislar el cDNA que codifica fosfolipasa A_{1} de avispa roja del papel, anteriormente. El cDNA sin intrones posteriormente se sometió a secuenciación, se amplificó y se clonó en un vector de expresión, usando de nuevo los procedimientos descritos anteriormente.

Se encontró que el cDNA de hialuronidasa de avispa roja del papel contiene un intrón. Este intrón, denominado posteriormente aquí "pahya", tiene 94 nucleótidos de longitud y tiene una secuencia de nucleótidos como la explicada en el Nº ID SEC: 9 (Figura 5). Normalmente, este intrón está situado entre los nucleótidos 733 y 734 del Nº ID SEC: 3.

Se realizó una comparación de la secuencia de aminoácidos de la hialuronidasa de avispa roja del papel (Nº ID SEC: 4) con otras fosfolipasas de veneno de véspido. En particular, el Nº ID SEC: 4 se comparó con hialuronidasa de veneno de abeja (Nº ID SEC: 10), hialuronidasa de avispón de clara blanca (D. maculata) (Nº ID SEC: 11) y hialuronidasa de avispa común (V. vulgaris) (Nº ID SEC: 12). Los resultados de esta comparación de secuencias se muestran en la Figura 6.

<110> King, Te Piao

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<120> CLONACIÓN Y PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE ENZIMAS DE VENENO DE POLISTINAE TALES COMO FOSFOLIPASA Y HIALURONIDASA, Y TERAPIAS INMUNOLÓGICAS BASADAS EN LAS MISMAS

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<130> 2313/2F138

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<140> No cedida

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<141> 1999-10-01

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<160> 12

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<170> FastSEQ para windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 1368

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400> 1

1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 320

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400> 2

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6

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<210> 3

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<211> 0

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400> 3

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9

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<210> 4

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400> 4

10

11

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<210> 5

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<211> 114

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<212> DNA

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<213> Polistes annularis

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<400> 5

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12

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<210> 6

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<211> 127

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<212> DNA

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<213> Polistes annularis

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<400> 6

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13

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<210> 7

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<211> 317

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<212> PRT

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<213> Dolichovespula maculata

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<400> 7

14

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<210> 8

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<211> 300

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<212> PRT

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<213> Vespula vulgaris

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<400> 8

15

16

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<210> 9

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<211> 94

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<212> DNA

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<213> Polistes annularis

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<400> 9

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17

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<210> 10

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<211> 343

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<212> PRT

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<213> Apis melliferis

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<400> 10

18

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<210> 11

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<211> 331

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<212> PRT

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<213> Dolichovespula maculata

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<400> 11

19

20

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<210> 12

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<211> 331

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<212> PRT

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<213> Vespula vulgaris

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<400> 12

21

22

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LISTADO DE SECUENCIA

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<110> King, Te Piao

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<130> 2313/2F138-EP0

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<140> EP 99950198.4

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<141> 1999-10-01

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<160> 12

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 1048

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<212> DNA

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<213> Polistes annularis

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<400> 1

23

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<210> 2

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<211> 320

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400> 2

24

25

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<210> 3

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<211> 1273

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<212> DNA

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<213> Polistes annularis

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<400> 3

26

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<210> 4

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400> 4

27

28

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<210> 5

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<211> 114

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<212> DNA

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<213> Polistes annularis

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<400> 5

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29

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<210> 6

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<211> 127

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<212> DNA

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<213> Polistes annularis

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<400> 6

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30

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<210> 7

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<211> 317

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<212> PRT

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<213> Dolichovespula maculata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Vespula vulgaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

32

\hskip1cm

33

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<210> 9

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<211> 94

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<212> DNA

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<213> Polistes annularis

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<400> 9

34

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<210> 10

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<211> 347

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Apis melliferis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

35

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 331

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<212> PRT

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<213> Dolichovespula maculata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

37

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 331

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<212> PRT

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<213> Vespula vulgaris

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<400> 12

39

40

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una hialuronidasa de veneno de Polistinae que comprende una secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 4, o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, en donde dicha molécula de ácido nucleico esa adecuada para la expresión de una forma madura de dicha hialuronidasa.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de DNA del Nº ID SEC: 3, o uno de sus fragmentos que codifica dicho fragmento inmunomodulador.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada o sus variantes que codifican una hialuronidasa que tiene la actividad de la hialuronidasa del Nº ID SEC: 4.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, en donde dicha molécula es hibridable a la molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de DNA del Nº ID SEC: 3 bajo condiciones de hibridación de alta restricción correspondientes a una T_{m} mayor que o igual a aproximadamente 65ºC.

5. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, asociada operativamente con un promotor.

6. Una célula que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un método para producir una hialuronidasa de veneno de Polistinae recombinante o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, que comprende:

(a): cultivar una célula de acuerdo con la reivindicación 6 de modo que la hialuronidasa de veneno de Polistinae, o uno de sus fragmentos moduladores, sea producida por la célula; y

(b): recuperar la hialuronidasa de veneno de Polistinae, o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, así producida del cultivo, la célula o ambos.

8. Una hialuronidasa de veneno de Polistinae recombinante o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, codificados por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Una hialuronidasa de veneno de Polistinae recombinante o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, codificados por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, que es una proteína de fusión.

10. La hialuronidasa de veneno de Polistinae recombinante o uno de sus fragmentos inmunomoduladores de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, expresados por una célula bacteriana o de levadura.

11. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha hialuronidasa de veneno de Polistinae recombinante o uno de sus fragmentos inmunomoduladores se fusiona a través de un enlace peptídico a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima que no es de veneno de Polistinae.

12. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además un sitio de segmentación para una proteasa específica.

13. La hialuronidasa de veneno de Polistinae recombinante o uno de sus fragmentos inmunomoduladores de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende una secuencia de polihistidina.

14. Una composición farmacéutica para modular una respuesta inmunitaria hacia un inmunógeno en un mamífero, que comprende la hialuronidasa de veneno de Polistinae recombinante o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, y un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Uso de una hialuronidasa de veneno de Polistinae recombinante o uno de sus fragmentos inmunomoduladores, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en la fabricación de un medicamento para modular una respuesta inmunitaria hacia un inmunógeno en un mamífero.

16. La composición de acuerdo con la reivindicación 14 o el uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la respuesta inmunitaria es un estado alérgico específico para alérgeno de veneno de véspido.

17. La composición o el uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el alérgeno de veneno de véspido es una hialuronidasa.