ES2881341T3

ES2881341T3 - Variantes de proteína beta-hexosaminidasa y métodos asociados para el tratamiento de gangliosidosis GM2

Info

Publication number: ES2881341T3
Application number: ES15772341T
Authority: ES
Inventors: Don Mahuran; Brian Mark
Original assignee: University of Manitoba; Hospital for Sick Children HSC
Current assignee: University of Manitoba; Hospital for Sick Children HSC
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2021-11-29
Anticipated expiration: 2035-03-17
Also published as: US10400227B2; EP3119892A2; HUE054748T2; PL3119892T3; US20150258180A1; EP3119892B1; WO2015150922A2; EP3119892A4; WO2015150922A3; CA2940728A1

Abstract

Una subunidad de β-hexosaminidasa variante que comprende una o más sustituciones en una posición seleccionada entre D433, I436, S491 y T494 correspondientes a la secuencia de la subunidad α de β- hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1) en donde la subunidad de β-hexosaminidasa variante forma un homodímero y en donde el homodímero está asociado a la proteína activadora de GM2 para hidrolizar el gangliósido GM2, en donde la subunidad de β-hexosaminidasa variante es una variante de una subunidad α y en donde la subunidad α de hexosaminidasa variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con los restos 89-528 de la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de proteína beta-hexosaminidasa y métodos asociados para el tratamiento de gangliosidosis GM2 Campo de la invención

Las realizaciones en el presente documento incluyen variantes proteicas de p-hexosaminidasa que son útiles para hidrolizar el gangliósido GM2, polinucleótidos que codifican al mismo y métodos relacionados.

Antecedentes de la invención

En el tejido humano normal hay dos isoenzimas p-hexosaminidasa (Hex) lisosomales principales: la Hex B altamente estable, un homodímero de subunidades p (codificado por el gen HEXB), y la Hex A menos estable, un heterodímero compuesto por una subunidad p y una subunidad a (codificada por el gen HEXA). Estos genes están relacionados evolutivamente con las estructuras primarias de las dos subunidades que codifican, siendo idénticos en ~60 %. Aunque Hex B y Hex A comparten muchos de los mismos sustratos naturales, solo Hex A puede hidrolizar el resto de N-acetilgalactosamina, unido en p, terminal no reductor del gangliósido GM2 glicolípido ácido (GM2) para producir gangliósido GM3 (GM3). Dado que el GM2 hidrófobo normalmente reside en un ambiente membranoso, Hex A está impedido estéricamente para unirse eficazmente al mismo in vivo. Este problema se supera mediante la presencia de una pequeña proteína de transporte de glicolípidos lisosomales, la proteína activadora de GM2 (GM2AP). La GM2A^pextrae una molécula de GM2 de la membrana lisosomal y a continuación el complejo se une específicamente a Hex A soluble, formando la estructura cuaternaria activa.

Una deficiencia de cualquiera de las dos subunidades de Hex A o la GM2AP, debido a una mutación en sus respectivos genes, puede conducir a la acumulación de GM2 en los lisosomas de células principalmente neuronales, donde la síntesis de los gangliósidos más complejos es la mayor. Esta acumulación conduce a la muerte de las células neuronales y a una de las tres enfermedades neurodegenerativas similares conocidas colectivamente como gangliosidosis GM2. Estas enfermedades incluyen la enfermedad de Tay-Sachs (TSD, MIM N.° 272800), deficiencias de la subunidad a, enfermedad de Sandhoff (SD, MIM N.° 268800), deficiencias de la subunidad p y deficiencias en la GM2AP que dan como resultado la forma rara de la variante AB (MIM N.° 272750).

Sinici et al., 2013 (PLoS One, 8(3): 1-8) describe el examen in cellulo de un constructo híbrido beta-alfa de subunidades de beta-hexosaminidasa A.

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas y proporciona una subunidad de p-hexosaminidasa variante que comprende una o más sustituciones en una posición seleccionada entre D433, l436, S491 y T494 correspondientes a la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1) en donde la subunidad de p-hexosaminidasa variante forma un homodímero y en donde el homodímero está asociado a la proteína activadora de G^m2para hidrolizar el gangliósido G^m2, en donde la subunidad de p-hexosaminidasa variante es una variante de una subunidad a y en donde la subunidad a de hexosaminidasa variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con los restos 89-528 de SEQ ID NO: 2.

La invención también proporciona: un polinucleótido aislado o recombinante que codifica una subunidad de phexosaminidasa variante de acuerdo con la invención;

un vector que comprende el polinucleótido recombinante de la invención;

una composición que comprende:

una subunidad de p-hexosaminidasa variante de acuerdo con la invención; o

un polinucleótido recombinante de acuerdo con la invención; o

un vector de acuerdo con la invención;

para uso en un método para tratar a un sujeto que presenta una acumulación celular anómala de gangliósido G^m2; y

una composición que comprende:

una subunidad de p-hexosaminidasa variante de acuerdo con la invención; o

un polinucleótido recombinante de acuerdo con la invención; o

un vector de acuerdo con la invención;

para uso en el tratamiento de gangliosidosis GM2.

En una divulgación, se incluye una nueva proteína p-hexosaminidasa variante que, al actuar como homodímero, puede hidrolizar el gangliósido GM2 (GM2) en presencia de GM2AP humana. Los homodímeros que se describen en el presente documento son capaces de unirse e hidrolizar GM2 in cellulo de manera eficaz.

En una divulgación, se incluye una subunidad de p-hexosaminidasa variante en donde la subunidad de phexosaminidasa variante forma un homodímero estable en condiciones fisiológicas y en donde la subunidad de phexosaminidasa variante está asociada a la proteína activadora de Gm²para hidrolizar el gangliósido Gm². La variante puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con los restos 89-529 de la SEQ ID NO: 1, variantes conservativas de la misma, o variantes de alineamiento alfa/beta de la misma.

En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende una o más de las sustituciones y/o deleciones que se enumeran en la Tabla 4. En una divulgación, la variante comprende una o más sustituciones en una posición seleccionada entre S184, P209, N228, V230, T231, P429, K432, D433, I436 o V436, N466, S491, L493, T494, F495, E498, L508, Q513, N518, V519, F521 y E523 correspondientes a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación, la variante comprende una o más sustituciones seleccionadas entre S184K, P209Q, N228S, V230L, T231S, P429Q, K432R, D433K, I436K o V436K, N466A, S491R, L493M, T494D, F495D, E498D, L508V, Q513A, N518Y, V519A, F521Y y E523N correspondientes a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación, la variante comprende entre 5 10, 10-15, 15-20 o 21 sustituciones seleccionadas entre S184K, P209Q, N228S, V230L, T231S, P429Q, K432R, D433K, I436K o V436K, N466A, S491R, L493M, T494D, F495D, E498D, L508V, Q513A, N518Y, V519A, F521Y y E523N. En una divulgación, la variante comprende una deleción en la posición P229 correspondiente a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1.

En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende, consiste básicamente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o con formas maduras del polipéptido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende, consiste básicamente en o consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 o con formas maduras del polipéptido que se presenta en la SEQ ID NO: 2. En una realización, la variante comprende, consiste básicamente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID NO: 2, o con formas maduras de la misma.

En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento comprende formas maduras del polipéptido. Por ejemplo, en una divulgación, la subunidad a variante no contiene un péptido señal N-terminal, tal como los aminoácidos 1 a 22 que se presentan en la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 1 a 22 que se presentan en la SEQ ID NO: 2. En una divulgación, la subunidad a variante no contiene la región de bucle que se presenta en los aminoácidos 75 a 88 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende, consiste básicamente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a una forma madura del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 2.

En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante está glicosilada. En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende una o más moléculas de manosa-6-fosfato. Opcionalmente, las moléculas de manosa-6-fosfato están unidas a oligosacárido u oligosacáridos unidos a Asn presentes en la subunidad a de hexosaminidasa variante.

En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante forma un complejo proteico con otra subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento, formando un dímero activo tal como un homodímero.

En una divulgación, también se proporciona un complejo proteico que comprende una o más subunidades a de hexosaminidasa variantes como se describe en el presente documento. En una divulgación, el complejo proteico es un dímero. En una divulgación, el complejo proteico es un homodímero que comprende dos subunidades a de hexosaminidasa variantes como se describe en el presente documento. En una divulgación, el complejo proteico comprende dos subunidades a de hexosaminidasa variantes como se presenta en la SEQ ID NO: 2, o formas maduras de la misma.

En una divulgación, el complejo proteico tiene un aumento de la estabilidad con respecto a la Hexosaminidasa A. Por ejemplo, en una divulgación el complejo proteico tiene un aumento de la resistencia a la desnaturalización por calor in vitro con respecto a la Hexosaminidasa A. En una divulgación, el complejo proteico tiene actividad de hidrólisis tanto de MUG (4-metilumbeliferil-2-acetamido-2-desoxi-p-D-glucopiranósido) como de MUGS (4-metilumbeliferil-2-acetamido-2-desoxi-p-D-glucopiranósido-6-sulfato). En una divulgación, el complejo proteico tiene una disminución de la relación de hidrólisis de MUG/MUGS con respecto a la Hexosaminidasa A. Por ejemplo, en una divulgación, el complejo proteico tiene un aumento de la actividad específica (medido como nmoles de MUGS/h/mg de proteína) con respecto a la Hexosaminidasa A.

En una divulgación, el complejo proteico tiene actividad de hidrólisis de gangliósido GM2. En una divulgación, el complejo proteico tiene actividad de hidrólisis de gangliósido GM2 in cellulo. Por ejemplo, en una divulgación el complejo proteico tiene actividad de hidrólisis de gangliósido GM2 en células cerebrales tales como células gliales o células neuronales, o células neuronales periféricas. En una divulgación, el complejo proteico se transporta a lisosomas. En una divulgación, el complejo proteico tiene actividad de hidrólisis de gangliósido GM2 en presencia de GM2AP. En una divulgación preferente, el complejo proteico es un homodímero.

En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento está conjugada con un péptido de penetración celular o una molécula que se dirige a receptores de membrana que experimentan endocitosis. En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento está conjugada con un péptido de penetración celular o una molécula que se dirige a receptores de membrana que experimentan endocitosis. En una realización, una subunidad a de hexosaminidasa variante o ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante está conjugada con un péptido u otra molécula que facilita el cruce de la barrera hematoencefálica.

En otro aspecto de la divulgación, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante de la invención. Por ejemplo, en una divulgación la molécula de ácido nucleico codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante con una o más de las sustituciones y/o deleciones en las posiciones que se enumeran en la Tabla 4. En una divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante que comprende entre 5-10, 10-15, 15-20 o 21 de las sustituciones que se enumeran en la Tabla 4. En una divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante que comprende una deleción en la posición P229 correspondiente a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante que comprende una deleción en la posición P229 y entre 5-10, 10-15, 15-20 o 21 sustituciones seleccionadas entre S184K, P209Q, N228S, V230L, T231S, P429Q, K432R, D433K, I436K o V436K, N466A, S491R, L493M, T494D, F495D, E498D, L508V, Q513A, N518Y, V519A, F521Y y E523N correspondientes a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica una proteína que comprende, consiste básicamente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la subunidad a de hexosaminidasa variante que se presenta en la SEQ ID NO: 2, o con formas maduras de la SEQ ID NO: 2. En una divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende, consiste básicamente en, o consiste en una secuencia de ácidos nucleicos con al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos que se presenta en la SEQ ID NO: 3. En una divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende, consiste básicamente en, o consiste en la secuencia de ácidos nucleicos que se presenta en la SEQ ID NO: 3. En una realización, la molécula de ácido nucleico es ARN o ARN. Opcionalmente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc. En una realización, la secuencia de la molécula de ácido nucleico está optimizada con codón para expresión en una célula hospedadora particular, tal como una célula hospedadora de mamífero.

En otro aspecto, se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante de la invención. En una divulgación, el vector comprende una secuencia de ácidos nucleicos con al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos que se presenta en la SEQ ID NO: 3. En una realización, el vector es adecuado para su uso en terapia génica para el tratamiento de gangliosidosis GM2. En una realización, el vector es un vector retroviral. En una realización, el vector es un vector viral adenoasociado (AAV). En una realización, el vector es un vector de ARN tal como un vector lentiviral. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos está unida operativamente a un promotor. También se proporciona una célula hospedadora transfectada con una molécula de ácido nucleico o vector que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. En una realización, la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero.

En una divulgación se proporciona un método para producir una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. En una divulgación, el método comprende cultivar una célula hospedadora transfectada con un vector que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante en condiciones adecuadas para la expresión de la subunidad a de hexosaminidasa variante. Opcionalmente, el método comprende aislar la subunidad a de hexosaminidasa variante o un complejo proteico que comprende la subunidad a de hexosaminidasa variante de la célula hospedadora. En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante está glicosilada por la célula hospedadora. En una divulgación, la célula hospedadora produce formas maduras de la subunidad a de hexosaminidasa variante.

En otra divulgación, se proporciona un método para hidrolizar el gangliósido GM2 en una célula. En una divulgación, el método comprende poner en contacto la célula con una subunidad a de hexosaminidasa variante o complejo proteico que comprende una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. En otra divulgación, el método comprende transfectar la célula con una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. En una divulgación, la célula está in vitro, in vivo o ex vivo. En una divulgación, la célula es una célula cerebral tal como una célula glial o célula neuronal o una célula neuronal periférica. En una divulgación, la célula tiene una acumulación lisosomal de GM2. En una divulgación, la célula tiene una mutación asociada a la gangliosidosis GM2, opcionalmente enfermedad de Tay-Sachs o enfermedad de Sandhoff.

En otra divulgación se proporciona un método para tratar gangliosidosis GM2 en un sujeto que lo necesita. En una divulgación, el método comprende administrar al sujeto una subunidad a de hexosaminidasa variante o complejo proteico que comprende una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento, tal como para terapia de reemplazo enzimático. En una divulgación, el método comprende administrar al sujeto una molécula de ácido nucleico o vector que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento, tal como para terapia génica. Por ejemplo, en una divulgación el método comprende transfectar una o mas células en el sujeto con una molécula de ácido nucleico o vector que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. En una divulgación, el sujeto tiene la enfermedad de Tay-Sachs o la enfermedad de Sandhoff. En una divulgación, el sujeto es un ser humano.

También se desvela el uso de una subunidad a de hexosaminidasa variante, un ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante, una célula transfectada con un ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante o un complejo proteico que comprende una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento para el tratamiento de gangliosidosis GM2 en un sujeto que lo necesita. También se proporciona una subunidad a de hexosaminidasa variante, un ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante, una célula transfectada con un ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante o un complejo proteico que comprende una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento para uso en el tratamiento de gangliosidosis GM2 o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de gangliosidosis GM2. En una divulgación, el sujeto tiene la enfermedad de Tay-Sachs o la enfermedad de Sandhoff.

Otras características y ventajas de la presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, se debería entender que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferentes de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones llegarán a ser evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. La Oficina proporcionará copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con el dibujo o los dibujos en color, previa solicitud y pago de la tasa necesaria.

Se describirán realizaciones de la divulgación en relación a los dibujos en los que:

La Figura 1 muestra los cambios realizados a la estructura primaria de la subunidad a de Hex A (SEQ ID NO: 1) y la subunidad a de hexosaminidasa variante resultante (s Eq ID NO: 2). Se cree que los intercambios; es decir, de los que aparecen en la subunidad a de tipo silvestre a los presentes en la subunidad p de tipo silvestre; de los restos en recuadro en las posiciones S184K, P209Q, N228S, suprimir (A)P229, V230L, T231S, N466A, L508V, Q513A, N518Y, V519A, F521Y y E523N, usando la numeración de posición de la SEQ ID NO: 1, están implicados en la formación de la interfase del dímero de tipo p, y se cree que los intercambios de los restos en recuadro en las posiciones K432R, D433K, I436K (o V436K), S491R, L493M, T494D, F495D y E498D, son parte del dominio p permitiendo que Hex A interactúe con la proteína activadora de GM2. Se cree que el intercambio de restos en la posición 429, es decir P429Q, está implicado en ambos aspectos de las funciones únicas de la subunidad p.

La Figura 2 muestra un modelo del complejo cuaternario activo compuesto por Hex A (subunidad a y subunidad p) junto con la proteína activadora de GM2 (GM2AP) con una molécula de gangliósido GM2 insertada en el sitio activo de la subunidad a. La subunidad a está dibujada en color negro a la izquierda (formato de viñeta); mientras que la subunidad p está dibujada en color gris claro a la derecha (formato de viñeta). GM2AP está dibujada en un formato de estructura de alambres (cinta delgada) para distinguirla de las subunidades a y p, y los átomos del gangliósido GM2 se muestran como esferas para distinguirlo de la proteína. El parche en la subunidad p que se predice que se una a GM2A se muestra como una superficie de color gris claro y los restos que comprenden la región análoga en la subunidad a también se muestran como una superficie de color negro. Los restos que forman el parche de color negro en la subunidad a se mutaron para que coincidieran con los de la subunidad p en la subunidad a variante de modo que cuando las subunidades a variantes formen un homodímero, habrá un parche de unión a GM2AP en ambas subunidades, uno de los cuales adoptará la posición que se muestra para la superficie de color gris claro de la subunidad p. Los restos implicados en la interfase del dímero se muestran como barras.

La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos optimizada con codón de la subunidad a de hexosaminidasa variante (SEQ ID NO: 3).

La Figura 4 muestra la separación por HPTLC de los NBD-glicolípidos extraídos con la técnica de Folch que resulta de ensayos de fluorescencia de NBD-GM2 in cellulo (2-nitro1,3-benzoxadiazol (NBD)-4-ilo, unido covalentemente a una cadena corta de sn2 acilo (C6) de liso-gangliósido GM2) de tres colonias individuales, T1, T2 y T3 (3 experimentos individuales), de células gliales de TSD que expresan permanentemente la subunidad a variante (UT1-UT3 = células gliales de TSD sin transfectar, Std = estándares de NBD-lípido.

La Figura 5 muestra una transferencia de Western usando una IgG de conejo frente a Hex A humana. F Wt (fibroblastos humanos de tipo silvestre); G St (células gliales sin transfectar); 150 mM (elución en etapas con NaCl 150 mM de la columna de DEAE (dietilaminoetilo) (heterodímero p de la subunidad a variante y precursor de la subunidad a variante; probablemente algún homodímero de la subunidad a variante madura también eluya con la etapa de concentración de NaCl)); 500 mM (elución en etapas con NaCl 500 mM de la columna de DEA^e(homodímero de la subunidad a variante madura)). Variante P se refiere al precursor y Variante M se refiere a la forma madura. Las relaciones de MUG con respecto a MUGS también se muestran en la parte inferior.

La Figura 6 muestra el ensayo de hidrólisis de NBD-GM2 in vitro durante la noche del homodímero de la subunidad a variante aislado con Hex A purificada como control positivo y Hex B purificada usada como control negativo. Las muestras de Hex A, el homodímero de la subunidad a variante y Hex B tenían el mismo número de unidades de MUG (150 nmol/h), Ctrl no tiene fuente enzimática y LD contiene los estándares de NBD-lípido.

La Figura 7 muestra que cuando las células de fibroblastos de piel de TSD no transfectadas (control) se cultivan en un medio en el que las células gliales de TSD transfectadas, que expresan el híbrido, se habían cultivado durante 48 h (medio acondicionado (Medio-A)) se obtiene un aumento de ~38 veces de la actividad de MUGS intracelular. Si las mismas células se cultivan en medio acondicionado que contiene manosa-6-fosfato 5 mM, solo se obtiene un aumento de ~10 veces (Medio-A y M6P). Estos datos confirman que la manosa-6-fosfato está presente en los oligosacáridos unidos a Asn de la variante y que la enzima variante secretada puede interactuar con el receptor de manosa-6-fosfato ubicado en la membrana plasmática de otras células no transfectadas.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han desarrollado nuevas proteínas p-hexosaminidasa variantes (y polinucleótidos que las codifican) que, al actuar como homodímero, pueden hidrolizar el gangliósido GM2 (GM2) en presencia de GM2AP humana. Los homodímeros de la proteína p-hexosaminidasa variante que se describen en el presente documento son capaces de unirse e hidrolizar eficazmente GM2 in cellulo. Como ejemplo (como se establece en el Ejemplo 1 que sigue a continuación), los inventores sustituyeron, en el ADNc, nucleótidos de la subunidad a de hexosaminidasa que codifican 21 restos alineados que se encuentran únicamente en la subunidad p, mientras que realizaron una deleción de un codón para un resto de la subunidad a no codificado en la subunidad p. Cada una de estas sustituciones y la deleción se identifican en la Tabla 4. A continuación los inventores predijeron que estos restos de aminoácido estaban implicados en la formación de la interfase de subunidad-subunidad (para transmitir la estabilidad de la subunidad p al homodímero) o el complejo cuaternario activo (Hex A unido al complejo GM2-GM2AP) como se muestra en la Figura 2. Sorprendentemente, se mostró que la proteína variante resultante forma un homodímero estable, similar a Hex B, y se transporta eficazmente a través del receptor de manosa-6-fosfato al lisosoma donde fue capaz de hidrolizar g M2 usando GM2AP como cofactor específico de sustrato. Al igual que la Hex A endógena, las modificaciones postraduccionales de la variante dan como resultado la adición de moléculas de manosa-6-fosfato al oligosacárido u oligosacáridos unidos a Asn presentes en las subunidades variantes. A continuación estos oligosacáridos modificados son reconocidos y unidos por receptores de manosa-6-fosfato en el retículo endoplasmático/Golgi, lo que facilita el transporte de la proteína al lisosoma. Además, las células de fibroblastos de un paciente con enfermedad de Sandhoff, con deficiencia de p-hexosaminidasa A y B, cultivadas en medio que contiene la proteína variante que se describe en el presente documento pueden internalizar la proteína a través de los receptores de manosa-6-fosfato en su membrana plasmática, dando como resultado el transporte de la proteína variante al lisosoma.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, el término "variante" se refiere a un polipéptido que comprende una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos de la variante con respecto a una secuencia de referencia natural. Por ejemplo, un polipéptido "variante" puede incluir una o más deleciones, adiciones o sustituciones con respecto a una secuencia de referencia. En una divulgación, la secuencia de referencia codifica una subunidad a de hexosaminidasa de origen natural, opcionalmente la subunidad a de hexosaminidasa que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación, la variante comprende uno o más de los cambios de aminoácidos identificados en la Tabla 4. El término "variante" no pretende limitar el polipéptido variante a solo aquellos polipéptidos producidos por la modificación de un polipéptido o molécula de ácido nucleico existente que codifica la secuencia de referencia, sino que puede incluir polipéptidos variantes que se preparan de novo o partiendo de un polipéptido distinto de la secuencia de referencia. Las subunidades a de hexosaminidasa variantes que se describen en el presente documento forman un homodímero. Las subunidades a de hexosaminidasa variantes que se describen en el presente documento son capaces de hidrolizar el gangliósido GM2.

Como se usa en el presente documento, "subunidad a de hexosaminidasa" se refiere a un polipéptido de origen natural codificado por el gen HEXA, que incluye pero no se limita al gen definido por el número NM_000520 de acceso de secuencias de referencia de NCBI. En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa tiene la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación preferente, "subunidad a de hexosaminidasa" se refiere a un polipéptido de origen natural codificado por un gen HEXA que, cuando se forma en un homodímero activo, tal como se mide mediante MUG (4-metilumbeliferil-2-acetamido-2-desoxi-p-D-glucopiranósido) o MUGS (4-metilumbeliferil-2-acetamido-2-desoxi-p-D-glucopiranósido-6-sulfato), no hidrolizan el gangliósido GM2 de una manera dependiente de GM2AP humana.

Como se usa en el presente documento "complejo proteico" se refiere a un grupo de dos o más polipéptidos asociados que interactúan a través de interacciones proteína-proteína no covalentes. Algunos ejemplos de un complejo proteico incluyen dímeros proteicos. En una divulgación, el complejo proteico es un homodímero que comprende dos subunidades que son idénticas en gran medida y que comparten la misma secuencia de aminoácidos. En una divulgación, el complejo proteico comprende dos subunidades a de hexosaminidasa variantes como se describe en el presente documento, tal como dos subunidades a de hexosaminidasa variantes como se presenta en la SEQ ID nO: 2.

Como se usa en el presente documento "gangliósido GM2" se refiere al gangliósido GM2 conocido en ocasiones como p-D-GalNAc-(1^ 4)-[a-Neu5Ac-(2^3)]-p-D-Gal-(1^ 4)-p-D-Glc-(1^ 1)-W-octadecanoilesfingosina que está asociado a la enfermedad de Tay-Sachs y que por lo general se hidroliza a gangliósido GM3 en los lisosomas de sujetos sanos.

Como se usa en el presente documento, "ganglisidosis GM2" se refiere a una afección caracterizada por la acumulación de gangliósido GM2 en los lisosomas que con el tiempo conduce a la muerte de las células neuronales. Algunos ejemplos de gangliosidosis GM2 incluyen la enfermedad de Tay-Sachs o la enfermedad de Sandhoff. En una realización, gangliosidosis GM2 se refiere a una afección caracterizada por una deficiencia de phexosaminidasa A (Hex A). En una realización, la "ganglisidosis GM2" resulta de una deficiencia de cualquiera de la subunidad a o p en la p-hexosaminidasa A enzimática.

Como se usa en el presente documento, la expresión "variante de alineamiento alfa/beta" hará referencia a secuencias en donde se hacen sustituciones y/o deleciones correspondientes a la variación encontrada en restos de aminoácido particulares en una posición equivalente cuando se compara con secuencias nativas de la subunidad a de hexosaminidasa con respecto a secuencias nativas de la subunidad p de hexosaminidasa. A modo de ejemplo, en la secuencia nativa de la subunidad a de hexosaminidasa hay un resto de glicina en la posición 367 y en la secuencia nativa de la subunidad p de hexosaminidasa hay un resto de asparagina en la posición 399 (correspondiente a la misma posición cuando las secuencias están alineadas). Por lo tanto, una variante de alineamiento alfa/beta puede incluir cualquiera de glicina o asparagina en esta posición, a menos que se haya requerido específicamente una mutación diferente para lo contrario.

Como se usa en el presente documento, la expresión "homodímero estable" con referencia a homodímeros de subunidades de p-hexosaminidasa variantes hará referencia en el presente documento a homodímeros que presentan un aumento de la estabilidad con respecto a la Hexosaminidasa S.

Como se usa en el presente documento, la expresión "variante conservativa" hará referencia a secuencias que reflejan la incorporación de sustituciones de aminoácido conservativas. En la técnica se conocen bien las tablas de sustitución conservativa (véanse, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds) y la Tabla 1 que sigue a continuación).

T l 1: E m l i i n min i n rv iv

Productos y Composiciones

En un aspecto, la presente descripción proporciona subunidades a de hexosaminidasa variantes y productos, métodos y usos asociados. En una realización, las variantes se distinguen de las subunidades a de hexosaminidasa endógenas en que son capaces de formar un complejo proteico estable que comprende un homodímero, que a continuación puede interactuar con la GM2AP humana para hidrolizar el gangliósido GM2 in vivo. En una realización, las subunidades a de hexosaminidasa variantes que se describen en el presente documento forman un homodímero más estable que HexS, que es un homodímero de subunidades a de hexosaminidasa no variantes (de origen natural). En una divulgación, las variantes tienen identidad de secuencia con la subunidad a de hexosaminidasa (SEQ ID NO: 1) que se muestra en la Figura 1, o con la forma madura de la misma. En una divulgación, las variantes se distinguen de las subunidades a de hexosaminidasa endógenas en que comprenden uno o más de los cambios de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las que se enumeran en la Tabla 4.

En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende una o más sustituciones y/o deleciones seleccionadas entre las posiciones que se enumeran en la Tabla 4. En una divulgación, la variante comprende uno o más intercambios, es decir, la secuencia de la subunidad a se reemplaza por la secuencia alineada en la subunidad p, en las posiciones en la subunidad a seleccionadas entre S184, P209, ⁿ228, V230, T231, P429, K432, D433, I436, N466, S491, L493, T494, F495, E498, L508, Q513, N518, V519, F521 y E523 correspondientes a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, en una divulgación, la variante comprende una o más sustituciones seleccionadas entre S184K, P209Q, N228S, V230L, T231S, P429Q, K432R, D433K, I436K, N466A, S491R, L493M, T494D, F495D, E498D, L508V, Q513A, N518Y, V519A, F521Y y E523N correspondientes a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1, y opcionalmente una deleción en la posición P229 correspondiente a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. Aunque las sustituciones y deleción que se enumeran en la Tabla 4 se han definido por referencia a la subunidad a de hexosaminidasa endógena o de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), una persona con experiencia podría ser capaz de determinar fácilmente qué restos corresponden a los que se enumeran en la Tabla 4 en una secuencia de la subunidad a de hexosaminidasa diferente para introducir las sustituciones y/o deleción en dicha subunidad a de hexosaminidasa diferente para producir una variante. Por ejemplo, una persona con experiencia podría ser capaz de realizar un alineamiento entre una secuencia de la subunidad a de hexosaminidasa que se diferencia de la SEQ ID NO: 1 (tal como una secuencia de la subunidad a de hexosaminidasa con una o más mutaciones de origen natural o una secuencia de una especie no humana) y la SEQ ID NO: 1 para determinar qué restos corresponden a las posiciones que se enumeran en la Tabla 4.

En una divulgación, la variante comprende entre 5-10, 10-15, 15-20 o 21 sustituciones seleccionadas entre S184K, P209Q, N228S, V230L, T231S, P429Q, K432R, D433K, I436K o V436K, N466A, S491R, L493M, T494D, F495D, E498D, L508V, Q513A, N518Y, V519A, F521Y y E523N correspondientes a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación, la variante comprende una deleción en la posición P229 correspondiente a la numeración del aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 1. En una divulgación, la variante comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de las sustituciones que se enumeran en la Tabla 4, y opcionalmente una deleción en la posición P229. Una persona con experiencia podría ser capaz de identificar variantes que comprenden uno o más de los cambios de aminoácido que se enumeran en la Tabla 4 y, por ejemplo, que tienen las parteras funcionales de formar un homodímero y/o hidrólisis de gangliósido GM2 tal como siguiendo los protocolos experimentales identificados en el Ejemplo 1.

En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento, o un complejo proteico de la misma, está conjugada a una molécula que facilita la entrada de la proteína en la célula tal como un péptido de penetración celular o una molécula que se dirige a receptores de membrana que experimentan endocitosis. Por ejemplo, en una realización, el péptido de penetración celular se selecciona entre TAT, Angiopep, penetratina, TP, glicoproteína del virus de la rabia (RVG), péptido priónico, y SynB. En una realización, la variante está conjugada al fragmento C atóxico de la toxina del tétanos (TTC). Alternativamente o además, la subunidad a de hexosaminidasa variante o un complejo proteico de la misma puede estar conjugada a un péptido u otra molécula que facilita el cruce de la barrera hematoencefálica. En la técnica se conocen diversos conjugados útiles para facilitar el cruce de la barrera hematoencefálica, que incluyen, pero no se limitan a, los que se describen en Reinhard Gabathuler, Neurobiology of Disease 37 (2010) 48-57; Spencer BJ, y Verma IM, Proc Natl Acad Sci U S A. 1 de mayo de 2007; 104(18): 7594-930; Coloma et al., Pharm Res. Marzo de 2000; 17(3): 266-74; y Dobrenis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 2297-2301, marzo de 1992. En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante o complejo proteico está conjugada con el dominio de unión a receptor de lipoproteína de la apolipoproteína-B (ApoB-BD). En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante o complejo proteico de la misma está conjugada con un dominio de unión peptídico asociado al receptor de transferrina o receptor del factor de crecimiento de tipo insulínico.

En una divulgación, las subunidades a de hexosaminidasa variantes que se describen en el presente documento tienen identidad de secuencia con la subunidad a de hexosaminidasa que se presenta en la SEQ ID NO: 1, con la subunidad a de hexosaminidasa variante a modo de ejemplo que se presenta en la SEQ ID NO: 2, o con formas maduras de las mismas. En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende una secuencia que comprende, consiste básicamente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos un: 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o con la SEQ ID NO: 2. En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende, consiste básicamente en, o consiste en la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID NO: 2. En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante comprende, consiste básicamente en, o consiste en la forma madura de la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID NO: 2. Una forma madura a modo de ejemplo de la subunidad a de hexosaminidasa se muestra en la Figura 4 de Mark et al., "Crystal Structure of Human p-Hexosaminidase B: Understanding the Molecular Basis of Sandhoff and Tay-Sachs Disease", Journal of Molecular Biology Volumen 327, Número 5, 11 de abril de 2003, páginas 1093-1109.

La estructura cristalina de Hex B, Hex A y la GM2AP se han aclarado y se ha generado un modelo para la estructura cuaternaria activa, es decir, el complejo Hex A-GM2AP-GM2. Aunque cada subunidad tiene un sitio activo, se necesitan restos de la subunidad vecina en el dímero para estabilizarla y completarla. Por lo tanto, las subunidades monoméricas no están activas. Además, las estructuras confirman hallazgos previos de que la capacidad del sitio aactivo para hidrolizar de manera eficaz sustratos cargados negativamente, por ejemplo MUGS y GM2, proviene principalmente de dos diferencias de aminoácidos alineados en las subunidades, es decir, a-N424R y p-D453L. El resto básico R424 en la subunidad a puede emparejarse iónicamente con el 6-sulfato de MUGS o el ácido siálico de GM2, mientras que el resto ácido D452 en la subunidad p repele estos mismos restos. Por último, se identificaron varias áreas únicas en las subunidades a y p como potencialmente importantes para facilitar la formación de la estructura cuaternaria activa con la proteína GM2A.

Se generó un mapa de superficie de potencial electrostático y una interfase del dímero de Hex B humana. La posición de GalNAc-isofagomina (IFG) determinada cristalográficamente en el sitio activo de cada subunidad demuestra que cuatro de los seis enlaces de hidrógeno entre la enzima y el inhibidor dependen de las interacciones estabilizadoras de la subunidad asociada. En ausencia de las interacciones proteína-proteína que se forman tras la dimerización, Arg211, Glu491, Asp452 y Tyr450 probablemente estén demasiado desestructurados para ser catalíticamente activos.

Se generó un modelo predicho de complejo cuaternario activador de Hex A-GM2 humanas. El complejo proteico activador de GM2 (GM2-AP) se acopla en un gran surco entre las dos subunidades para que el azúcar GalNAc no reductor terminal en GM2 se pueda presentar en el sitio activo de la subunidad a y se pueda retirar. Dos bucles de superficie, presentes solo en la subunidad a, interactúan con la proteína activadora acoplada y parece que están implicados en la creación de un sitio de acoplamiento exclusivo de la subunidad a. El bucle de color magenta se retira por vía proteolítica de la subunidad b durante el procesamiento posterior a la producción y puede representar una modificación que regula la función metabólica de esta subunidad. Después de incorporar restricciones conformacionales en el modelo, se podría encontrar una posición probable para el resto de ácido siálico dentro del bolsillo del sitio activo. Una vez posicionado, se encontró que el carboxilato cargado negativamente del ácido siálico, que solo puede ser acomodado por la subunidad a, se acercaba dentro de la distancia del enlace de hidrógeno de Arg424, un resto cargado positivamente que es exclusivo de la subunidad a (la subunidad b contiene una Leu en esta posición). Se cree que aGlu394 y aAsn423 (que son ambos restos de Asp en la subunidad b) ayudan a mantener Arg424 en su posición. Arg424, a su vez, estabiliza el carboxilato cargado negativamente del ácido siálico del sustrato mediante interacciones electrostáticas y de enlace de hidrógeno. El resto ácido-base general, Glu323 (Glu355 en la subunidad p), interactúa con el átomo de oxígeno glicosídico del enlace escindible.

En muchas especies se conocen subunidades a de hexosaminidasa. La secuencia humana nativa (P06865) se comparó con secuencias nativas y el porcentaje de identidad de secuencia (usando BLAST en UniProt con opciones por defecto que incluyen el umbral E de 10, matriz automática, permitiendo espacios) se muestra en la Tabla 2 que sigue a continuación:

TABLA 2

La identidad de secuencia se evalúa generalmente mediante la búsqueda avanzada con la versión 2.1 del programa BLAST (los parámetros como anteriormente; Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool". J. Mol. Biol. 215: 403_410). BLAST es una serie de programas que están disponibles en línea a través del U.S. National Center for Biotechnology Information (National Library of Medicine Edificio 38A Bethesda, MD 20894). La búsqueda de Blast avanzada se ajusta a parámetros por defecto. Algunas referencias para los programas Blast incluyen: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool". J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W. y States, D.J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search". Nature Genet. 3: 266-272.; Madden, T.L., Tatusov, R.L. y Zhang, J. (1996) "Applications of network BL^aS^tserver" Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. y Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402); Zhang, J. y Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation". Genome Res. 7: 649-656).

En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento incluye formas maduras del polipéptido. Por ejemplo, en Mark et al., "Crystal Structure of Human p-Hexosaminidase B: Understanding the Molecular Basis of Sandhoff and Tay-Sachs Disease", Journal of Molecular Biology Volumen 327, Número 5, 11 de abril de 2003, páginas 1093-1109, se describen el procesamiento celular y formas maduras de la subunidad a de la p-hexosaminidasa B humana. Se espera que el procesamiento y las modificaciones postraduccionales de la subunidad a variante que se describe en el presente documento sean similares a los de la subunidad a de origen natural. En una realización, la subunidad a variante que se describe en el presente documento no contiene una secuencia señal N-terminal o se escinde para retirar una secuencia señal N-terminal. En una realización, la subunidad a variante no contiene el péptido señal que se presenta en los aminoácidos 1 a 22 y/o la región peptídica que se presenta en los aminoácidos S75 a H88 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En una realización, la subunidad a variante tiene identidad de secuencia con, comprende, consiste básicamente en o consiste en la forma madura de la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID NO: 2. En una realización, la subunidad a variante incluye una o más de una o más modificaciones postraduccionales, incluyendo procesamiento proteolítico y/o glicolítico. Por ejemplo, en una realización la subunidad a variante está glicosilada en Asn-X-Ser/Thr seleccionados, seguido opcionalmente por la adición de uno o dos marcadores de fosfato a uno o más oligosacáridos de tipo alta manosa. En una realización, la subunidad a variante que se describe en el presente documento se produce por vía recombinante o sintética para incluir una o más características de la forma madura de la proteína.

La subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento se puede preparar usando diferentes métodos conocidos en la técnica para producir polipéptidos. Por ejemplo, en una realización las variantes se preparan usando técnicas recombinantes tales como modificando y/o expresando una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido variante. Diversas tecnologías recombinantes que incluyen, pero no se limitan a, las desveladas por Sambrook et al., (Sambrook J et al., 2000. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (tercera edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press) también son adecuadas para preparar los péptidos que se describen en el presente documento. En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento se produce en un sistema de expresión de células de mamífero. En una realización, el sistema de expresión de células de mamífero da como resultado el procesamiento postraduccional de la subunidad a de hexosaminidasa variante expresada en el mismo. Opcionalmente, la subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento se produce en un sistema de expresión de células de mamífero que da como resultado la glicosilación del polipéptido. Los polipéptidos variantes que se desvelan en el presente documento también se preparan fácilmente mediante síntesis química usando técnicas bien conocidas en la técnica relacionadas con la química de proteínas tales como síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc.

85: 2149-2154) o síntesis en solución homogénea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I y II, Thieme, Stuttgart). Por lo tanto, en una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento es una proteína recombinante. En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento es una proteína sintética.

En una divulgación, también se proporciona un método para producir una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. En una divulgación, el método comprende la expresión recombinante de una molécula de ácido nucleico que codifica la subunidad a de hexosaminidasa variante. Por ejemplo, en una divulgación el método comprende cultivar una célula hospedadora transfectada con un vector que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante en condiciones adecuadas para la expresión de la subunidad a de hexosaminidasa variante. Opcionalmente, la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero o una célula hospedadora seleccionará para asegurar la modificación postraduccional de la subunidad a de hexosaminidasa variante. En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante está glicosilada por la célula hospedadora. En una divulgación, la célula hospedadora produce formas maduras de la subunidad a de hexosaminidasa variante. En algunas divulgaciones, el método comprende además aislar la subunidad a de hexosaminidasa variante o un complejo proteico que comprende la subunidad a de hexosaminidasa variante de la célula hospedadora o medio de cultivo.

En una divulgación, la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos que se ha modificado para reducir la inmunogenicidad de la proteína. Por ejemplo, en una divulgación, el modelado informático de la secuencia de aminoácidos de la subunidad a variante se usa para identificar y cambiar uno o más de los restos de aminoácido para minimizar el reconocimiento de epítopos por el sistema inmunitario. En una divulgación, la secuencia de aminoácidos de la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento se modifica para reducir la probabilidad de una respuesta inmunitaria indeseable cuando se administra a un sujeto o se usa para el tratamiento de gangliosidosis GM2. Algunos ejemplos de métodos útiles para reducir la inmunogenicidad de una proteína incluyen los que se describen en Bryson et al., "Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity of computational tools". BioDrugs. 1 de febrero de 2010; 24(1): 1-8; y Perry et al., "New approaches to prediction of immune responses to therapeutic proteins during preclinical development Drugs R D. 2008; 9(6): 385-96.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una subunidad a de hexosaminidasa variante de la invención. Por ejemplo, en una divulgación la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene identidad de secuencia con la subunidad a de hexosaminidasa variante a modo de ejemplo que se presenta en la SEQ ID NO: 2, o con formas maduras de dicha proteína. Por ejemplo, en una divulgación, la molécula de ácido nucleico comprende, consiste básicamente en, o consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o un 97 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, o con formas maduras de dicha proteína. En una divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante con una o más sustituciones o deleciones que se enumeran en la Tabla 4. Una secuencia de ácidos nucleicos optimizada con codón para la subunidad a de hexosaminidasa variante a modo de ejemplo se muestra en la Figura 3 y se identifica como SEQ ID NO: 3. Por lo tanto, en una realización, la molécula de ácido nucleico comprende, consiste básicamente en, o consiste en una secuencia que tiene al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 o un 97 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3. En una realización, la secuencia de la molécula de ácido nucleico está optimizada con codón para expresión en una célula hospedadora particular, tal como una célula hospedadora de mamífero.

Una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento se puede generar usando técnicas recombinantes, tal como mediante amplificación selectiva de un ácido nucleico usando los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y ADNc o ADN genómico y a continuación introduciendo modificaciones a dicha molécula de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico que se desvela en el presente documento también se puede sintetizar químicamente usando técnicas estándar. Se conocen diversos métodos de síntesis química de polidesoxinucleótidos, incluyendo la síntesis en fase sólida que, al igual que la síntesis peptídica, se ha automatizado completamente en sintetizadores de ADN disponibles en el mercado (véanse, por ejemplo, Itakura et al., documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.598.049; Caruthers et al., documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.458.066; e Itakura documentos de Patente de Estados Unidos N.os 4.401.796 y 4.373.071).

En una realización, también se proporciona un vector que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. Opcionalmente, el ácido nucleico es una molécula de ADN o una molécula de ARN. Estas moléculas de ácido nucleico se incorporan fácilmente de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica en un vector de expresión apropiado que asegura la expresión adecuada del polipéptido en un sistema de células cultivadas, tal como para producir y a continuación aislar el polipéptido variante in vitro para su uso en terapia de reemplazo enzimático. Alternativamente, la secuencia se podría incorporar a un virus; tal como retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, virus adenoasociado, lentivirus, virus del herpes simple y virus de la viruela o cualquier otro vector adecuado para terapia génica in vivo o ex vivo. Algunos vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos o virus modificados (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados, etc.), siempre Y cuando el vector sea compatible con la célula hospedadora usada. La expresión "vectores adecuados para la transformación de una célula hospedadora", significa que los vectores de expresión contienen una molécula de ácido nucleico que se desvela en el presente documento y secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedadoras a usar para expresión, que están unidas operativamente a la molécula de ácido nucleico. "Unido operativamente" significa que el ácido nucleico está unido a secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión del ácido nucleico. En una realización, el vector es adecuado para su uso en terapia génica para el tratamiento de gangliosidosis GM2.

Junto con la terapia de reemplazo enzimático, la terapia génica para TSD y SD es otro enfoque terapéutico que se está investigando en la actualidad. Los experimentos de transferencia génica de prueba de concepto han demostrado el potencial para el rescate terapéutico a largo plazo de las acumulaciones de gangliósido GM2 y la mejora de los síntomas de la enfermedad en modelos de ratón para SD o TSD. Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se han utilizado en más de 75 ensayos clínicos de transferencia génica debido a su excelente historial de seguridad, inmunogenicidad relativamente baja y capacidad para conferir expresión a largo plazo del transgén administrado. Recientemente, se ha demostrado la transferencia génica generalizada del sistema nervioso central (SNC) en modelos animales de felinos, porcinos y primates no humanos, lo que sugiere la posibilidad de un enfoque de transferencia génica traducible para trastornos tales como la enfermedad de Tay-Sachs usando vectores AAV.

Una limitación principal del AAV es su capacidad de empaquetamiento, que es de aproximadamente 4,5 kb de ADN extraño para el AAV monocatenario tradicional y de aproximadamente 2,1 kb para el AAV autocomplementario más eficaz. La secuencia de ADN codificante para la subunidad a de Hex A es ~1,6 kb, y ~1,7 kb para la subunidad p, a la cual se deben añadir otras secuencias en 3' y 5' para que expresión eficaz por células infectadas. El empaquetamiento de la subunidad a está dentro de las limitaciones de tamaño del genoma de AAV. Sin embargo, la sobreexpresión de la subunidad a por sí sola no podría conducir a una sobreabundancia de la isoenzima Hex A heterodimérica faltante, ya que la subunidad p endógena se podría volver limitante en este escenario. Para una terapia eficaz Hex A se sobreexpresa preferentemente ya que esto conduce a la secreción del exceso de enzima, que a continuación puede corregir de forma cruzada otras células no infectadas mediante el reconocimiento y la captación en sus lisosomas por sus receptores de manosa-6-fosfato de la membrana plasmática. El empaquetamiento de estas subunidades dentro de un solo genoma de AAV, junto con los elementos reguladores de la transcripción necesarios para impulsar la expresión, no es práctico debido a limitaciones de tamaño.

Por ejemplo, en una realización, el vector es un vector viral adenoasociado (AAV). En una realización, el vector es capaz de cruzar el vector hematoencefálico, tal como AAV9. En una realización, el vector es un vector lentiviral. Por ejemplo, en una realización se usa un vector lentiviral para transferir una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante en células madre hematopoyéticas, que a continuación se pueden administrar a un sujeto como un medio de terapia génica ex vivo. Las realizaciones que se describen en el presente documento incluyen otros vectores conocidos en la técnica por ser útiles para la expresión recombinante de proteínas y/o terapia génica.

En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento, o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, está conjugado con una molécula que facilita la entrada de la molécula de ácido nucleico o vector en la célula. En una realización, la molécula de ácido nucleico o vector está conjugada con un péptido de penetración celular. Por ejemplo, en una realización, la molécula de ácido nucleico o el vector está conjugado con un péptido de penetración celular seleccionado entre TAT, Angiopep, penetratina, TP, glicoproteína del virus de la rabia (RVG), péptido priónico y SynB. En una realización, la molécula de ácido nucleico o vector está conjugada con el fragmento C atóxico de la toxina del tétanos (TTC). Alternativamente o además, la molécula de ácido nucleico o vector puede estar conjugado con un péptido u otra molécula que facilite el cruce de la barrera hematoencefálica. En la técnica se conocen diversos conjugados útiles para facilitar el cruce de la barrera hematoencefálica, que incluyen, pero no se limitan a, los que se describen en Reinhard Gabathuler, Neurobiology of Disease 37 (2010) 48-57; Spencer BJ, y Verma IM, Proc Natl Acad Sci USA. 1 de mayo de 2007; 104(18): 7594-930; Coloma et al., Pharm Res. Marzo de 2000; 17(3): 266-74; y Dobrenis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa Vol. 89, pp. 2297-2301, marzo de 1992. En una realización, la molécula de ácido nucleico o vector está conjugada con el dominio de unión al receptor de lipoproteínas de la apolipoproteína-B (ApoB-BD). En una realización, la molécula de ácido nucleico o vector está conjugado con un dominio de unión peptídico asociado al receptor de transferrina o receptor del factor de crecimiento de tipo insulínico.

En una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una variante o complejo proteico como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una variante o complejo proteico como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica comprende un vector, tal como un vector adecuado para terapia génica. En una realización, se proporciona una célula hospedadora transfectada con una molécula de ácido nucleico o vector que codifica un polipéptido variante como se describe en el presente documento.

Las proteínas aisladas, moléculas de ácido nucleico o células hospedadoras que se describen en el presente documento se formulan opcionalmente en una composición farmacéutica para su administración a sujetos en una forma biológicamente compatible adecuada para administración in vivo. Por "forma biológicamente compatible adecuada para administración in vivo" se hace referencia a una forma de la sustancia a administrar en la que cualquier efecto tóxico se ve compensado por los efectos terapéuticos. Las sustancias se pueden administrar a organismos vivos, incluyendo seres humanos y animales. Una divulgación también incluye el uso de variantes, complejos proteicos, moléculas de ácido nucleico o células hospedadoras que se desvelan en el presente documento para el tratamiento de gangliosidosis GM2 o para la preparación de un medicamento para el tratamiento de gangliosidosis GM2.

Las proteínas aisladas, moléculas de ácido nucleico, vectores, células hospedadoras o composiciones farmacéuticas que se desvelan en el presente documento se pueden administrar a un sujeto mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, administración tópica, administración oral, administración en aerosol, instilación intratraqueal, inyección intraperitoneal, inyección en el líquido cefalorraquídeo incluyendo inyecciones intracerebroventriculares, intratecales e intracisternales, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyecciones intraparenquimatosas en el cerebro o la médula espinal e inyección subcutánea. Las dosificaciones a administrar dependen de las necesidades del paciente, del efecto deseado y de la vía de administración elegida. Se pueden introducir moléculas de ácido nucleico y polipéptidos en células usando vehículos de administración in vivo tales como liposomas. También se pueden introducir en estas células usando técnicas físicas tales como microinyección y electroporación o métodos químicos tales como coprecipitación, pegilación o usando liposomas. Las moléculas de ácido nucleico también se pueden administrar directamente a un sujeto, por ejemplo, usando técnicas de administración de "ADN desnudo". Opcionalmente, las moléculas de ácido nucleico o péptidos se introducen en células hospedadoras ex vivo y a continuación se administran a un sujeto.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante métodos conocidos para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que se pueden administrar a sujetos. En una realización, una cantidad eficaz de la molécula de ácido nucleico o péptido se combina en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Algunos vehículos adecuados se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA) o Handbook of Pharmaceutical Additives (compilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, Inglaterra (1995). Sobre esta base, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias en asociación con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y pueden estar contenidas en soluciones tamponadas con un pH adecuado y/o ser isoosmóticas con fluidos fisiológicos.

Sobre esta base, las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en el presente documento incluyen opcionalmente un compuesto o sustancia activa, tal como un complejo proteico como se describe en el presente documento que hidroliza el gangliósido GM2, en asociación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tal como un vehículo o diluyente, y contenido en soluciones tamponadas con un pH adecuado e isoosmóticas con los fluidos fisiológicos. Los métodos para combinar las moléculas activas con los vehículos o combinarlas con diluyentes son bien conocidos por los expertos en la materia. La composición incluye opcionalmente un agente de direccionamiento para el transporte del compuesto activo a sitios especificados dentro del tejido.

Opcionalmente, la composición farmacéutica comprende una subunidad a de hexosaminidasa variante, ácido nucleico o vector que codifica la misma, o un complejo proteico variante que hidroliza el gangliósido GM2 como se describe en el presente documento en una formulación con una o más moléculas que facilitan el transporte de la composición a través de la membrana celular o a través de la barrera hematoencefálica.

Métodos para hidrolizar el gangliósido GM2

En una divulgación se proporciona un método para hidrolizar el gangliósido GM2. Como se establece en el Ejemplo 1, los complejos proteicos que comprenden la subunidad a de hexosaminidasa variante que se describe en el presente documento son capaces de hidrolizar el gangliósido GM2 para producir el gangliósido GM3 en presencia de GM2AP. Por lo tanto, en una realización el método comprende poner en contacto una célula con una subunidad a de hexosaminidasa variante o complejo proteico que comprende una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. Opcionalmente, el método comprende transfectar o transducir una célula con una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. La célula puede estar in vitro, in vivo o ex vivo. En una realización, la célula es una célula cerebral tal como una célula glial o célula neuronal o una célula neuronal periférica tal como una célula que forma parte del sistema nervioso autónomo. En una realización, la célula tiene una acumulación lisosomal de GM2. En una realización, la célula tiene una mutación asociada a la gangliosidosis GM2, opcionalmente enfermedad de Tay-Sachs o enfermedad de Sandhoff. En una realización, la célula tiene una deficiencia de Hex A. En una realización la célula con deficiencia de Hex A puede ser una célula hepática o de médula ósea. En una realización, las células transfectadas o transducidas con una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante pueden sobreexpresar la variante provocando que gran parte de ella sea secretada. Como se muestra en la Figura 7, a continuación la variante secretada puede volver a ser capturada por células deficientes no infectadas, facilitando su hidrólisis de gangliósido GM2.

Tratamiento de gangliosidosis GM2 y/o deficiencias de ¡5-hexosaminidasa A

En una divulgación, se proporcionan métodos para el tratamiento de gangliosidosis GM2 y usos asociados de los productos y composiciones que se describen en el presente documento para el tratamiento de gangliosidosis GM2 en un sujeto que lo necesita.

Como se usa en el presente documento, y como se entiende bien en la técnica, "tratar" o "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo los resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, tal como aumentando el nivel de hidrólisis de gangliósido GM2 en las lisozimas de un sujeto con gangliosidosis GM2 o una reducción del nivel o número de síntomas experimentados por un sujeto con gangliosidosis GM2.

En una realización, el método comprende administrar al sujeto una subunidad a de hexosaminidasa variante, o un complejo proteico que comprende una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. También se proporciona el uso de una subunidad a de hexosaminidasa variante o un complejo proteico que comprende una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento para el tratamiento de gangliosidosis GM2 en un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, en una realización, los productos, composiciones y métodos que se describen en el presente documento son útiles para la terapia de reemplazo enzimático en un sujeto con una deficiencia de p-hexosaminidasa A.

En una realización, el método comprende administrar al sujeto una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento para el tratamiento de un sujeto con gangliosidosis GM2. También se proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico o vector que codifica una subunidad a de hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento para el tratamiento de gangliosidosis GM2. Por ejemplo, en una realización, las células de un sujeto se transfectan con una molécula de ácido nucleico o se transducen con un vector como se describe en el presente documento para expresar la subunidad a de hexosaminidasa variante en las células del sujeto, conocido comúnmente como "terapia génica". En una realización, la subunidad a de hexosaminidasa variante forma un complejo proteico dentro de las células infectadas y es transportada a la lisozima e hidroliza el gangliósido GM2. En una realización, la célula infectada expresa altos niveles de la variante y da como resultado su secreción en una forma que puede volver a ser capturada por otras células deficientes, no infectadas, se puede incorporar en sus lisosomas e hidrolizar el gangliósido GM2 almacenado.

La administración o usos de un producto o composición como se describe en el presente documento para el tratamiento de gangliosidosis GM2 puede ser in vivo y/o ex vivo. En una realización, la cantidad de producto o composición que se usa, se formula para usar o se administra a un sujeto es una cantidad terapéuticamente activa en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado, concretamente, el tratamiento de gangliosidosis GM2. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un producto de composición puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la sustancia para provocar una respuesta deseada en el individuo. Las formulaciones y/o los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. En una realización, las dosificaciones se pueden administrar usando infusiones intravenosas de forma semanal o quincenal. Opcionalmente, la proteína variante o composición farmacéutica que se describe en el presente documento se puede formular para su uso y/o se puede administrar directamente al SNC mediante inyecciones en bolo continuas o periódicas desde o través de una bomba implantada, tal como las que se prescriben en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 8.419.710.

La Tabla 3 que sigue a continuación muestra restos que comprenden las interfases del dímero en HexA y HexB basándose en un análisis de interfases PISA (del inglés Proteins, Interfaces, Structures and Assemblies (Proteínas, Interfases, Estructuras y Ensamblajes)).

TABLA 3: Restos de interfases del dímero

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de la divulgación y no limitan el alcance de la divulgación.

Ejemplo 1: Construcción y ensayo de una p-Hexosaminidasa variante

Se realizaron una serie de 21 sustituciones y una deleción en el ADNc que codifica la subunidad a de phexosaminidasa. Las sustituciones representaron nucleótidos que codifican restos que se encuentran únicamente en la subunidad p, mientras que la deleción se dirigió a un codón para un resto a no codificado en la subunidad p (Tabla 4, Figura 1). Basándose en un análisis de las estructuras cristalinas de HexA y HexB y en el modelado molecular, se predijo que estos aminoácidos podrían estar implicados en la formación de la interfase estable subunidad-subunidad de Hex B (homodímero p) o en esa área de la subunidad p que o con otras áreas en la subunidad a, permite que la Hex A heterodimérica forme el complejo cuaternario activo con el complejo GM2-GM2AP (Figura 2). Por lo tanto, se predijo que la subunidad a variante resultante podría formar un homodímero muy estable, como Hex B, que, como Hex A heterodimérica, puede hidrolizar GM2 usando GM2AP como cofactor específico de sustrato.

Como se establece a continuación, se demostró que la proteína variante con las modificaciones que se enumeran en la Tabla 4 forma un homodímero e hidroliza el gangliósido GM2 en presencia de la proteína activadora humana de GM2, GM2AP.

Materiales y métodos

Constructo Plasmídico: la subunidad a variante de p-hexosaminidasa se optimizó con codón para expresión En ratón y el ser humano mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA). Las secuencias de ADN codificantes se clonaron en el vector de expresión de mamífero pJ603 (ADN2.0), que dirige la expresión de la subunidad Hex a través del promotor de CMV y también coexpresa el gen de resistencia a neomicina (Figura 3).

Líneas celulares y cultivo tisular: una línea de células gliales de Tay-Sachs humana inmortalizada se obtuvo en R.A. Gravel. Los fibroblastos de piel humana de Tay-Sachs se obtuvieron en el centro de cultivo tisular de1Hospital For Sick Children. Todas las células se cultivaron en medio esencial alfa mínimo de Wisent Inc. (Canadá) en presencia de antibióticos al 1 % (penicilina y estreptomicina, Gibco BRL, Canadá) y se suplementaron con suero bovino fetal (FBS) (Wisent Inc., Canadá) al 10 % y se incubó a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO²al 5 %.

Compuestos químicos y ensayo de Hex: Debido a la complejidad de analizar la actividad de Hex con su sustrato natural (el complejo GM2-GM2AP), se introdujeron sustratos artificiales fluorescentes simples que son hidrolizados por Hex de una manera independiente de GM2AP. El más antiguo es el 4-metilumbeliferil-2-acetamido-2-p-D-glucopiranósido neutro (MUG). Sin embargo, cuando se usa MUG para analizar la actividad total de Hex en células de TSD, se obtienen niveles enzimáticos casi normales debido al aumento de los niveles de Hex B. Se desarrolló una versión de MUG más nueva, más específica y cargada negativamente, 4-metilumbeliferil-2-acetamido-2-desoxip-D-glucopiranósido-6-sulfato (MUGS), que solo se une escasamente y es hidrolizada por Hex B y, por lo tanto, se puede usar directamente para diagnosticar TSD. En SD, tanto Hex A como B son deficientes, pero una pequeña cantidad de actividad Hex (~2 % de la normal, medida por MUG) persiste debido a la dimerización ineficaz de las subunidades a para producir una isoenzima ácida inestable, Hex S (el sistema de degradación asociado al retículo endoplásmico elimina monómeros a que fallan al dimerizarse). Aunque la Hex S humana, como Hex B, es incapaz de interactuar con el complejo GM2-GM2AP, puede hidrolizar MUGS de manera más eficaz que Hex A porque posee dos sitios a activos. Las relaciones ~MUG/MUGS de las isoenzimas Hex son: Hex B, ~300/1; Hex A, 3-4/1; y Hex S, 1-1,5/1.

Los sustratos fluorogénicos sintéticos, MUGS, usados para analizar la actividad de Hex similares (por ejemplo, Hex S y las variantes) y MUG, usado para analizar la actividad de Hex total, obtenidos en Toronto Research Chemicals (Canadá), se usaron como se informó anteriormente en Tropak et al., (2004) Pharmacological enhancement of phexosaminidase activity in fibroblasts from adult Tay-Sachs and Sandhoff patients. J Biol Chem 279: 13478-13487. CBE, un inhibidor covalente de la glucocerebrosidasa, era de Toronto Research Chemicals (Canadá). El colesterol, adquirido en Sigma-Aldrich (Canadá), la fosfatidilcolina (huevo) y el fosfatidilinositol (hígado bovino) en Avanti Polar Lipids (Estados Unidos de América), y los filtros de policarbonato de 100 nm en Avestin, Inc. (Canadá), se usaron para producir los liposomas cargados negativamente descritos anteriormente (Tropak et al., (2010) A sensitive fluorescence-based assay for monitoring GM2 ganglioside hydrolysis in live patient cells and their lysates. Glycobiology 20: 356-365) en los que se incorporó el sustrato NBD-GM2 para los ensayos de Hex in vitro (véase a continuación). La GM2AP recombinante se expresó en Escherichia coli y a continuación se purificó (marcada con His6) y se volvió a plegar.

Se realizaron ensayos de NBD-GM2 in cellulo usando el derivado de GM2 fluorescente, NBD-GM2, como se informó anteriormente (Tropak et al., (2010) A sensitive fluorescence-based assay for monitoring GM2 ganglioside hydrolysis in live patient cells and their lysates. Glycobiology 20: 356-365). En resumen, se cultivaron células confluentes transfectadas o no transfectadas en placas de 10 cm durante 18 h en medio sin FBS que contenía NBD-GM2 (4,7 pg ml^-1) y CBE (50 pM). Después de retirar el medio, las células se enjuagaron con PBS y se incubaron con medio que contenía FBS al 5 % durante un periodo adicional de 2 horas antes de la recolección. La extracción diferencial de los gangliósidos ácidos y glicolípidos neutros de cada suspensión celular se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito por Folch (Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH (1957) A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 226: 497-509). A continuación, los extractos se limpiaron usando puntas de pipeta ZipTip C-18 y se prepararon para la separación de glicolípidos mediante cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) como se informó anteriormente. Las bandas correspondientes a los derivados de NBD-glicolípidos se visualizaron y se cuantificaron usando el dispositivo de formación de imágenes Storm.

El ensayo de NBD-GM2 in vitro se llevó a cabo con alícuotas que contenían 150 nmoles (MUG)/h de actividad de Hex total del homodímero de la subunidad a variante separado por intercambio iónico DEAE (véase a continuación) o Hex A y Hex B purificadas de placenta humana. Cada isoenzima se incubó durante la noche en tampón citrato fosfato de Mcllvaine (pH 4,1) que contenía NBD-GM2 incorporado en liposomas cargados negativamente más rGM2AP, en un volumen de reacción total de 50 |jl. Los glicolípidos (tanto ácidos como neutros) se unieron en una punta ZipTip C-18, se lavaron con agua, se eluyeron con metanol al 100 % y se concentraron mediante secado antes de su separación por HPTLC.

Transferencia de Western: los lisados de fibroblastos WT humanos y células gliales de TSD humanas se sometieron a SDS-PAGE en un gel de bis-acrilamida al 10 %, se transfirieron a nitrocelulosa y se procesaron como se describe en Hou et al., (1998) A Pro504Ser substitution in the p-subunit of p-hexosaminidase A inhibits a-subunit hydrolysis of GM2 ganglioside, resulting in chronic Sandhoff disease. J Biol Chem 273: 21386-21392. Las transferencias se incubaron con una IgG policlonal de conejo frente a Hex A humana, seguido de un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, de cabra, conjugado con peroxidasa de rábano picante, desarrolladas usando un sustrato quimioluminiscente de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Biosciences, Reino Unido) y se registró en una película de rayos X BIOMAX (Kodak).

Cromatografía de intercambio iónico: previamente se equilibró DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia), 250 jl, en una columna pequeña con tampón fosfato 10 mM a pH 6,0 que contenía NaCl 25 mM y glicerol al 5 %. Se recogieron células de dos placas de 15 cm y se sometieron a lisis mediante congelación-descongelación repetida en el tampón fosfato 10 mM mencionado anteriormente. Los lisados, 500 jl, se clarificaron mediante centrifugación, se pasaron a través de columnas de DEAE individuales y se recogieron como la fracción de flujo. La columna se lavó con una cantidad adicional de 1,5 ml. A continuación, la columna se eluyó con 1,5 ml del tampón fosfato que contenía NaCl 150 mM, seguido de otro lavado de 1 ml con el mismo tampón. Por último, las columnas se eluyeron con 1,25 ml de tampón que contenía NaCl 500 mM para recoger los homodímeros híbridos derivados de a, seguido de un lavado final de 1 ml. Todas las fracciones se analizaron con MUGS.

Resultados

El constructo que codifica la subunidad a variante se expresó transitoriamente en una línea de células gliales de TSD infantil humana, y se confirmó que expresaba el polipéptido variante y mostraba un aumento de los niveles de hidrólisis de MUGS. A continuación, estas células se colocaron en un medio que contenía neomicina para selección. Se produjeron colonias mixtas resistentes a neomicina y se aislaron y expandieron colonias clonales individuales para seleccionar colonias que expresan establemente el constructo. La actividad específica (nmoles de (MUG)/mg de proteína) de las colonias mixtas fue 8.000 veces mayor que la de las células gliales de TSD no transfectadas y 100 veces mayor que la de los fibroblastos humanos normales. Como se muestra en la Tabla 5, las colonias clonales individuales produjeron actividades específicas hasta dos veces mayores que las colonias mixtas. Previamente, los datos de actividad específica se obtuvieron a partir de la identificación sistemática de más de 200 poblaciones de células clonales que expresan de manera estable cualquiera de los dos híbridos derivados de p y solo se identificó un clon que expresaba niveles de actividad específica ~7 veces mayores que los fibroblastos de tipo silvestre. Las colonias de mezcla inicial expresaron niveles de actividad específica ~10 veces menores que los fibroblastos de tipo silvestre. Dado que todas estos constructos fueron optimizados con codón y expresados en el mismo vector, se puede concluir que la presente subunidad a de hexosaminidasa variante es más capaz de plegarse y dimerizarse en una isoenzima Hex funcional que cualquiera de los dos híbridos derivados de p descritos anteriormente en Sinici et al., (2013) In cellulo examination of a p-a hybrid construct of p-hexosaminidase A subunits, reported to interact with the GM2 activator protein and hydrolyze GM2 ganglioside. PLoS One 8: e57908.

Tres colonias clonales que se encontró que expresaban altamente la proteína variante se incubaron en medio que contenía NBD-GM2 (que se concentra en lisosomas mediante endocitosis) durante 18 horas, se lavaron, se sometieron a lisis y se extrajeron con Folch para producir una fase acuosa superior y una fase orgánica inferior (cloroformo). La fase superior, enriquecida en glicolípidos ácidos, y la fase inferior, enriquecida en glicolípidos neutros, se analizaron mediante HPTLC (Figura 4). Dado que este es un ensayo basado en células vivas, la hidrólisis de NBD-GM2 en NBD-GM3 va seguida rápidamente por la hidrólisis de NBD-GM3 en lactosilceramida (NBD-LacCer) y a continuación glucosilceramida (NBD-GlcCer). La hidrólisis de NBD-GlcCer a NBD-ceramida (NBD-Cer) es inhibida fuertemente por la adición de un inhibidor covalente de glucocerebrosidasa, conduritol-B-epóxido, CBE. Las tres colonias de células que expresan de manera estable el constructo produjeron niveles más elevados de NBD-GM3, NDB-LacCer y particularmente NBD-GlcCer que las células no transfectadas (Figura 4). Estos datos indican que la proteína variante puede corregir las células de TSD actuando como un homodímero o posiblemente como un heterodímero a de subunidad de variante p. Es importante destacar que los datos también demuestran que la proteína variante se transporta a los lisosomas de las células gliales de TSD donde se localiza el NBD-GM2.

Para determinar la composición de la subunidad de las isoenzimas Hex responsables de la hidrólisis in cellulo de NBD-GM2, el lisado de células gliales de TSD que se expresan permanentemente se separó mediante cromatografía de intercambio iónico DEAE. Basándose en las isoenzimas conocidas o pls predichas, a pH 6 y el NaCl 25 mM usado inicialmente en la separación, Hex B no se unirá. A pH 6 y NaCl 150 mM cualquier Hex heterodimérico (subunidad a de variante p), así como la subunidad a variante en su forma precursora (durante la maduración en el lisosoma la subunidad a pierde varios restos básicos que desplazan su pl) debería eluirse de la columna. A pH 6 y NaCl 500 mM, debería eluir la forma madura restante del homodímero de la subunidad a variante. Esta evaluación se confirmó mediante análisis de transferencia de Western de las fracciones que contenían el pico de actividad de Hex de la elución en etapas de 150 mM y 500 mM de la columna de DEAE, en comparación con los patrones de bandas producidos por fibroblastos humanos de tipo silvestre y lisados de células gliales de TSD no transfectadas (Figura 5). El homodímero de la subunidad a variante de la etapa de elución de NaCI 500 mM se usó a continuación en un ensayo in vitro con el NDB-GM2 contenido en liposomas cargados negativamente en presencia de GM2AP humana producida en bacterias. Se compararon los 150 nmoles de (MUG)/h de actividad de Hex total de la fracción de proteína variante con el mismo número de unidades de MUG de Hex A y Hex B purificadas (Figura 6). Solo el ensayo que contenía Hex A o la proteína variante produjo niveles detectables de NBD-GM3 (no se observa una degradación adicional de GM3 en el ensayo in vitro de forma significativa). Curiosamente, dado que MUG es hidrolizado por los sitios activos tanto de a como de p y GM2 solo por el sitio activo de a, se podría predecir que si las subunidades a variantes homodiméricas fueran capaces de unir e hidrolizar el complejo GM2-GM2AP en ambos de sus sitios activos, el mismo número de unidades de MUG de proteína variante debería producir el doble de NBD-GM3 que Hex A. Como se muestra en la Figura 6, parece que cuando el mismo número de unidades de MUG de cualquiera de la proteína variante o Hex A se usan en un ensayo in vitro con NBD-GM2 como sustrato y rGM2AP humano como cofactor específico del sustrato, la proteína variante produce al menos el doble de NBD-GM3 que Hex A.

La subunidad a variante que se describe en el presente documento se produjo sustituyendo 21 aminoácidos alineados únicos de la subunidad p de Hex (Tabla 4, Figura 1) y produciendo deleción en aP229, que no tiene un resto alineado correspondiente en la subunidad. La subunidad a y la subunidad p de Hex tienen solo aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia, y la selección de los restos específicos que se describen en el presente documento representa un pequeño porcentaje de las diferencias totales entre las dos subunidades. Se predijo que estos restos podrían definir la interfase subunidad p-subunidad más estable, y el área de la subunidad p necesaria para Hex A (junto con otra área en la subunidad a) para unir el complejo GM2-GM2AP (Tabla 4, Figura 2), en la estructura primaria de la subunidad a (Figura 1). Esto produjo una subunidad a de hexosaminidasa variante que, en su forma homodimérica (Figura 5), es transportada al lisosoma (Figura 4) donde puede hidrolizar el gangliósido GM2 de manera dependiente de GM2AP humana (Figuras 4 y 6). El ADNc que codifica esta subunidad híbrida tiene un tamaño de 1.584 bases (Figura 1), lo que permitirá su incorporación en AAV para aplicaciones de terapia génica potenciales para pacientes con TSD y SD. Este constructo también se podría usar para producir Hex para terapia de reemplazo enzimático para estos mismos pacientes.

Tabla 4: cambios de aminoácido en la subunidad a de Hex A para convertir la interfase del dímero a a p e introducir la supuesta superficie de unión a GM2AP de la subunidad p en la subunidad a. Opcionalmente, la posición 436 del resto puede ser valina como resultado de un polimorfismo neutro conocido y el cambio de aminoácido es valina a lisina es decir V436K.

Tabla 5: actividad es ecífica de células transfectadas de control

Tabla 6: cambios de aminoácido alternativos en la subunidad a de Hex A para convertir la interfase del dímero a a p

^

Ejemplo 2: la p-hexosaminidasa variante se internaliza a través de receptores de manosa-6-fosfato de la membrana plasmática

Las formas secretadas de la proteína variante son reconocidas por los receptores de manosa-6-fosfato de la membrana plasmática de las células deficientes y se internalizan. Se cultivaron fibroblastos de Tay-Sachs infantiles durante 48 horas en medio acondicionado (Medio-A); es decir, medios en los que las células gliales de Tay-Sachs, transfectadas con el vector de expresión que codifica la proteína p-hexosaminidasa variante, se habían cultivado previamente durante tres días. Otro matraz de estas células también se cultivó en medio acondicionado que contenía manosa-6-fosfato 5 mM (Medio-A y M6P). A continuación, las células se lavaron, se recolectaron y se sometieron a lisis. Se determinaron los niveles de actividad específicos de MUGS (nmoles de MU/mg de proteína). La Figura 7 muestra las "veces de aumento" en las actividades específicas de MUGS con respecto a las de las células de control cultivadas en medio no acondicionado, es decir, 1 = sin cambios en la actividad específica de MUGS. Véase que la pequeña cantidad de actividad MUGS en las células de control probablemente representa Hex B (MUG/MUGS = 300/1). Como se muestra en la Figura 7, el nivel de actividad de MUGS de las células cultivadas en medio acondicionado que contiene proteína variante secretada fue significativamente mayor en ausencia de manosa-6-fosfato en comparación con el medio acondicionado que contiene manosa-6-fosfato, lo que sugiere que la proteína variante se internaliza a través de receptores de manosa-6-fosfato de la membrana plasmática.

REALIZACIONES ADICIONALES

En diversas realizaciones, se incluye una subunidad de p-hexosaminidasa variante en donde la subunidad de phexosaminidasa variante forma un homodímero y en donde el homodímero está asociado a la proteína activadora de GM2 para hidrolizar el gangliósido GM2. La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede formar un homodímero que es estable en condiciones fisiológicas. La p-hexosaminidasa variante puede incluir una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia con los restos 89-529 de la SEQ ID NO: 1, variantes conservativas de la misma, o variantes de alineamiento alfa/beta de la misma. La p-hexosaminidasa variante puede incluir una secuencia de aminoácidos que tenga una o más sustituciones o deleciones en las posiciones correspondientes a los restos N228, P229, T231, P429, L508, Q513, N518, y V519 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1). La p-hexosaminidasa variante puede incluir una secuencia de aminoácidos que tenga una o más sustituciones seleccionadas entre el grupo que consiste en N228S, T231S, P429Q, L508V, Q513A, N518Y, y V519A de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1). La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una deleción en una posición correspondiente al resto 229 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1). La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una secuencia de aminoácidos que incluya una o más sustituciones en posiciones correspondientes a los restos P429 y K432 de la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1). La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una secuencia de aminoácidos que incluya una o más sustituciones seleccionadas entre el grupo que consiste en P429Q o K432R de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1). La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una secuencia de aminoácidos que incluya al menos tres sustituciones o deleciones en posiciones correspondientes a los restos N228, P229, T231, P429, K432, L508, Q513, N518, y V519 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1). La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una secuencia de aminoácidos que incluya al menos cinco sustituciones o deleciones en posiciones correspondientes a los restos N228, P229, T231, P429, K432, L508, Q513, N518, y V519 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1). La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una secuencia de aminoácidos que incluya una o más de una sustitución en una posición correspondiente al resto 209 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en P209Q, P209T y P209S; una sustitución en una posición correspondiente al resto 433 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en D433K y D433R; una sustitución en una posición correspondiente al resto 436 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en I436K, I436R, V436K y V436R; una sustitución en una posición correspondiente al resto 491 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en S491R y S491H; y una sustitución en una posición correspondiente al resto 494 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en T494D y T494E. La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud entre 400 y 550 aminoácidos. La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90 % de identidad de secuencia con los restos 89-528 de la SEQ ID NO: 2. La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con los restos 89-528 de la SEQ ID NO: 2. La subunidad de phexosaminidasa variante puede estar conjugada con un péptido u otra molécula que facilite el cruce de la barrera hematoencefálica. La subunidad de p-hexosaminidasa variante puede estar conjugada con péptido de dominio de unión de ApoB.

En diversas realizaciones, se puede incluir un polinucleótido aislado o recombinante que codifica una subunidad de p-hexosaminidasa variante que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con los restos 89-529 de la SEQ ID NO: 1, en donde la subunidad de p-hexosaminidasa variante forma un homodímero y en donde dicho homodímero está asociado a la proteína activadora de GM2 para hidrolizar el gangliósido GM2. El polinucleótido aislado o recombinante puede codificar una subunidad de p-hexosaminidasa variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con los restos 89-529 de la SEQ ID NO: 1.

En diversas realizaciones, se incluye una subunidad de p-hexosaminidasa variante que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o un 99 % de identidad de secuencia con los restos 89-528 de la SEQ ID NO: 2.

En diversas realizaciones, se incluye un vector que tiene un polinucleótido recombinante como se describe en el presente documento.

En diversas realizaciones, se incluye un método para tratar a un sujeto que presenta una acumulación celular anómala de gangliósido GM2, comprendiendo el método administrar una composición que comprende una subunidad de p-hexosaminidasa variante como se describe en el presente documento. En diversas realizaciones, el método puede incluir administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende una subunidad de p

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una subunidad de p-hexosaminidasa variante que comprende una o más sustituciones en una posición seleccionada entre D433, I436, S491 y T494 correspondientes a la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1) en donde la subunidad de p-hexosaminidasa variante forma un homodímero y en donde el homodímero está asociado a la proteína activadora de G^m2para hidrolizar el gangliósido G^m2, en donde la subunidad de p-hexosaminidasa variante es una variante de una subunidad a y en donde la subunidad a de hexosaminidasa variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con los restos 89-528 de la SEQ ID NO: 2.

2. La subunidad de p-hexosaminidasa variante de la reivindicación 1, en donde el homodímero es estable en condiciones fisiológicas.

3. La subunidad de p-hexosaminidasa variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con los restos 89-529 de la SEQ ID NO: 2.

4. La subunidad de p-hexosaminidasa variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una sustitución en una posición correspondiente al resto 209 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1)

5. La subunidad de p-hexosaminidasa variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una o más de:

una sustitución en una posición correspondiente al resto 209 de la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en P209Q, P209Ty P209S;

una sustitución en una posición correspondiente al resto 433 de la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en D433K y D433R;

una sustitución en una posición correspondiente al resto 436 de la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en I436K, I436R, V436K y V436R;

una sustitución en una posición correspondiente al resto 491 de la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en S491R y S491H;y

una sustitución en una posición correspondiente al resto 494 de la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), la sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en T494D y T494E.

6. La subunidad de p-hexosaminidasa variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde

a) la secuencia de aminoácidos comprende una o más sustituciones o deleciones en posiciones correspondientes a los restos N228, P229, T231, P429, L508, Q513, N518, y V519 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1); y/o

b) la secuencia de aminoácidos comprende una o más sustituciones seleccionadas entre el grupo que consiste en N228S, T231S, P429Q, L508V, Q513A, N518Y, y V519A de la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1); y/o

c) la secuencia de aminoácidos comprende una deleción en una posición correspondiente al resto 229 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1); y/o

d) la secuencia de aminoácidos comprende al menos tres sustituciones o deleciones, opcionalmente al menos cinco sustituciones o deleciones, en posiciones correspondientes a los restos N228, P229, T231, P429, K432, L508, Q513, N518, y V519 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1).

7. La subunidad de p-hexosaminidasa variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una o más sustituciones en posiciones correspondientes a los restos P429 y K432 de la secuencia de la subunidad a de p-hexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1), opcionalmente una o más sustituciones seleccionadas entre el grupo que consiste en P429Q o K432R de la secuencia de la subunidad a de phexosaminidasa nativa (SEQ ID NO: 1)

8. La subunidad de p-hexosaminidasa variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una longitud entre 400 y 550 aminoácidos.

9. La subunidad de p-hexosaminidasa variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la subunidad está conjugada con un péptido u otra molécula que facilita el cruce de la barrera hematoencefálica, opcionalmente en donde la subunidad está conjugada con un péptido de dominio de unión de ApoB.

10. Un polinucleótido aislado o recombinante que codifica una subunidad de p-hexosaminidasa variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Un vector que comprende el polinucleótido recombinante de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una composición que comprende:

una subunidad de p-hexosaminidasa variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9; o un polinucleótido recombinante de acuerdo con la reivindicación 10; o

un vector de acuerdo con la reivindicación 11;

para uso en un método para tratar a un sujeto que presenta una acumulación celular anómala de gangliósido G^m2.

13. Una composición que comprende:

un vector de acuerdo con la reivindicación 11;

para uso en el tratamiento de gangliosidosis GM2.