JP2008206428A - β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を構成するα−サブユニット、前記α−サブユニットを有するＨｅｘＡ、前記α−サブユニットをコードする遺伝子、ベクターおよび形質転換細胞 - Google Patents
β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を構成するα−サブユニット、前記α−サブユニットを有するＨｅｘＡ、前記α−サブユニットをコードする遺伝子、ベクターおよび形質転換細胞 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】 熱安定性およびリソソームへの輸送効率の少なくとも一つに優れる組換えＨｅｘＡを提供する。
【解決手段】 配列番号１記載のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換もしくは欠失が行われているアミノ酸配列からなるα−サブユニットを有するＨｅｘＡである。前記置換ないし欠失としては、例えば、Ｖ５１９Ａ（８）、Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ（Ｂ６）、Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ（Ｂ８）、Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ／Ｆ５２１Ｙ(Ｂ９)、Ｐ２０９Ｑ／Ｎ２２８Ｓ／Ｐ２２９Ｌ／Ｖ２３０Ｓかつ第２３１番目トレオニン（Ｔ）の欠失（Ａ２）、Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ（Ｇ４）の６種類がある。
【選択図】 図１
【解決手段】 配列番号１記載のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換もしくは欠失が行われているアミノ酸配列からなるα−サブユニットを有するＨｅｘＡである。前記置換ないし欠失としては、例えば、Ｖ５１９Ａ（８）、Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ（Ｂ６）、Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ（Ｂ８）、Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ／Ｆ５２１Ｙ(Ｂ９)、Ｐ２０９Ｑ／Ｎ２２８Ｓ／Ｐ２２９Ｌ／Ｖ２３０Ｓかつ第２３１番目トレオニン（Ｔ）の欠失（Ａ２）、Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ（Ｇ４）の６種類がある。
【選択図】 図１
Description
本発明は、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を構成するα−サブユニット、前記α−サブユニットを有するＨｅｘＡ、前記α−サブユニットをコードする遺伝子、ベクターおよび形質転換細胞に関する。
リソソーム病は、リソソーム酵素またはその補助因子（補助タンパク質など）をコードする遺伝子の変異が原因で発症する遺伝性代謝異常症である。リソソーム病では、リソソーム酵素による生体物質の分解に支障がでるため、生体内物質（基質）が組織内で過剰蓄積し、全身性の病状を伴なって発症する。リソソーム病としては、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症１型、ムコ多糖症２型、ムコ多糖症６型、ボンベ病、ＧＭ２ガングリオシドーシスなどがある。ＧＭ２ガングリオシドーシスは、糖脂質の一種であるＧＭ２ガングリオシドが、患者組織内、特に脳内に蓄積し、主として中枢神経症を伴なって発症する常染色体劣性遺伝病である。ＧＭ２ガングリオシドーシスには、リソソーム性β−ヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）を構成するα−サブユニットおよびβ−サブユニットをコードする遺伝子（ＨＥＸＡおよびＨＥＸＢ）の変異で発症するＴａｙ−Ｓａｃｈｓ病およびＳａｎｄｈｏｆｆ病などがある。
従来（１９９０年以前）では、根本治療が確立されておらず、リソソーム病は、生後、数年以内に死亡する不治の病とされてきた。しかし、近年の遺伝子工学、分子医学の発展に伴ない、リソソーム病に対し、骨髄移植、酵素補充療法および遺伝子治療法が開発されてきた。例えば、ゴーシェ病において、酵素補充療法の実用化が進んでいる。ゴーシェ病の酵素補充療法では、糖鎖トリミングにより末端マンノース残基を露出させた組換グルコセレプロシダーゼが、マクロファージの表面に存在するマンノースレセプター（ＭＲ）との結合を介して細胞内に取り込まれてリソソームに到達し、蓄積基質を分解するという原理に基づく。この原理に基づき、マンノース−６−リン酸残基（Ｍ６Ｐ）を含む組換えマトリクス型リソソーム酵素と標的細胞分子表面のカチオン依存性マンノース−６−リン酸レセプター（ＣＩ−Ｍ６ＰＲ）との結合を介した組換え酵素補充療法の実用化が進み、中枢神経症状を伴なわないリソソーム病の治療法として確立しつつある。例えば、グルコセレブロシダーゼ活性を有する二機能性融合タンパク質を用いた酵素補充療法がある（特許文献１）。
特表２００４−５２５６２１号公報
しかしながら、酵素補充療法においては、補充用酵素の量的な確保、安定供給およびコストの問題がある。この問題に対しては、遺伝子工学的手法により、野生型酵素を高機能化することで対処可能である。特に、リソソーム病の中でも、Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ病およびＳａｎｄｈｏｆｆ病において、酵素補充療法における酵素の高機能化が望まれている。
そこで、本発明は、高機能化したリソソーム酵素を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のβ−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を構成するα−サブユニットは、配列番号１記載のアミノ酸配列において、下記の（ａ１）から（ａ１２）の少なくとも一つのアミノ酸残基の置換もしくは欠失が行われているアミノ酸配列からなることを特徴とする。
（ａ１） 第５１９番目バリン（Ｖ）のアラニン（Ａ）への置換（Ｖ５１９Ａ）
（ａ２） 第５１８番目アスパラギン（Ｎ）のチロシン（Ｙ）への置換（Ｎ５１８Ｙ）
（ａ３） 第４３２番目リシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への置換（Ｋ４３２Ｒ）
（ａ４） 第４２９番目プロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）への置換（Ｐ４２９Ｑ）
（ａ５） 第５２１番目フェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）への置換（Ｆ５２１Ｙ）
（ａ６） 第２０９番目プロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）への置換（Ｐ２０９Ｑ）
（ａ７） 第２２８番目アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）への置換（Ｎ２２８Ｓ）
（ａ８） 第２２９番目プロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）への置換（Ｐ２２９Ｌ）
（ａ９） 第２３０番目バリン（Ｖ）のセリン（Ｓ）への置換（Ｖ２３０Ｓ）
（ａ１０）第２３１番目トレオニン（Ｔ）の欠失
（ａ１１）第５１番目セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）への置換（Ｓ５１Ｎ）
（ａ１２）第５３番目アラニン（Ａ）のトレオニン（Ｔ）への置換（Ａ５３Ｔ）
（ａ１） 第５１９番目バリン（Ｖ）のアラニン（Ａ）への置換（Ｖ５１９Ａ）
（ａ２） 第５１８番目アスパラギン（Ｎ）のチロシン（Ｙ）への置換（Ｎ５１８Ｙ）
（ａ３） 第４３２番目リシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への置換（Ｋ４３２Ｒ）
（ａ４） 第４２９番目プロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）への置換（Ｐ４２９Ｑ）
（ａ５） 第５２１番目フェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）への置換（Ｆ５２１Ｙ）
（ａ６） 第２０９番目プロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）への置換（Ｐ２０９Ｑ）
（ａ７） 第２２８番目アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）への置換（Ｎ２２８Ｓ）
（ａ８） 第２２９番目プロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）への置換（Ｐ２２９Ｌ）
（ａ９） 第２３０番目バリン（Ｖ）のセリン（Ｓ）への置換（Ｖ２３０Ｓ）
（ａ１０）第２３１番目トレオニン（Ｔ）の欠失
（ａ１１）第５１番目セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）への置換（Ｓ５１Ｎ）
（ａ１２）第５３番目アラニン（Ａ）のトレオニン（Ｔ）への置換（Ａ５３Ｔ）
本発明のα−サブユニットおよびβ−サブユニットから構成されるβ−ヘキソサミニダーゼＡは、前記α−サブユニットが、本発明のα−サブユニットであることを特徴とする。
本発明者等は、ＧＭ２ガングリオシドの分解系を中心に、高機能化の対象となる酵素として、β−ヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）を取り上げた。Ｈｅｘは、α−サブユニットおよびβ−サブユニットから構成される二量体である。前記各サブユニットには、各々、中性基質（例えば、４ＭＵＧ）と酸性基質（例えば、４ＭＵＧＳ）を分解する触媒部位が存在する。前記両サブユニットの組合せにより、Ｈｅｘには、ＨｅｘＡ（αβ）、ＨｅｘＢ（ββ）およびＨｅｘＳ（αα）の３種類のアイソザイムが存在する。これらのなかで、ＨｅｘＡのみが、ＧＭ２活性化因子と協同してＧＭ２ガングリオシドを分解することができる。しかし、ＨｅｘＡは、ＨｅｘＳに比べると熱安定性に優れるが、ＨｅｘＢよりは熱安定性が悪い。また、ＨｅｘＡが低濃度であっても十分な酵素補充効果を発揮すれば、酵素の必要量の減少につながる。これらのことを目的として一連の研究を重ねたところ、α−サブユニットにおいて、前記（ａ１）から（ａ１２）の少なくとも一つのアミノ酸残基の置換もしくは欠失を行えば、ＨｅｘＡにおいて、熱安定性およびリソソームへの輸送効率の少なくとも一方の向上が図れることを見出し、本発明に到達した。
本発明のα−サブユニットは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１）の置換（Ｖ５１９Ａ）のみが行われているアミノ酸配列からなるという態様であってもよい。以下、このα−サブユニットを有するＨｅｘＡを、「８」ということもある。「８」のＨｅｘＡは熱安定性に優れる。
本発明のα−サブユニットは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１）および前記（ａ２）の置換（Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ）のみが行われているアミノ酸配列からなるという態様であってもよい。以下、このα−サブユニットを有するＨｅｘＡを、「Ｂ６」ということもある。「Ｂ６」のＨｅｘＡは熱安定性に優れる。
本発明のα−サブユニットは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１）、前記（ａ２）、前記（ａ３）および前記（ａ４）の置換（Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ）のみが行われているアミノ酸配列からなるという態様であってもよい。以下、このα−サブユニットを有するＨｅｘＡを、「Ｂ８」ということもある。「Ｂ８」のＨｅｘＡは熱安定性に優れる。
本発明のα−サブユニットは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１）、前記（ａ２）、前記（ａ３）、前記（ａ４）および前記（ａ５）の置換（Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ／Ｆ５２１Ｙ）のみが行われているアミノ酸配列からなるという態様であってもよい。以下、このα−サブユニットを有するＨｅｘＡを、「Ｂ９」ということもある。「Ｂ９」のＨｅｘＡは熱安定性に優れる。
本発明のα−サブユニットは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ６）、前記（ａ７）、前記（ａ８）および前記（ａ９）の置換（Ｐ２０９Ｑ／Ｎ２２８Ｓ／Ｐ２２９Ｌ／Ｖ２３０Ｓ）並びに前記（ａ１０）の欠失のみが行われているアミノ酸配列からなるという態様であってもよい。以下、このα−サブユニットを有するＨｅｘＡを、「Ａ２」ということもある。「Ａ２」のＨｅｘＡは熱安定性に優れる。
本発明のα−サブユニットは、前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１１）および前記（ａ１２）の置換（Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ）のみが行われているアミノ酸配列からなるという態様であってもよい。以下、このα−サブユニットを有するＨｅｘＡを、「Ｇ４」ということもある。「Ｇ４」のＨｅｘＡは、細胞内で糖鎖が追加され、リソソームへの輸送効率が優れると共に、熱安定性にも優れる。
本発明の遺伝子は、ＨｅｘＡを構成するα−サブユニットをコードする遺伝子であって、配列番号２記載の塩基配列において、下記の（ｂ１）から（ｂ１２）の少なくとも一つの塩基の置換もしくは欠失が行われている塩基配列からなることを特徴とする。
（ｂ１） 第１５５５番目から第１５５７番目のｇｔａのｇｃｔへの置換
（ｂ２） 第１５５２番目から第１５５４番目のａａｔのｔａｔへの置換
（ｂ３） 第１２３４番目から第１２３６番目のａａｇのａｇｇへの置換
（ｂ４） 第１２２５番目から第１２２７番目のｃｃｔのｃａｇへの置換
（ｂ５） 第１５５５番目から第１５５７番目のｔｔｃのｔａｃへの置換
（ｂ６） 第６２５番目から第６２７番目のｃｃｔのｃａａへの置換
（ｂ７） 第６８２番目から第６８４番目のａａｃのａｇｃへの置換
（ｂ８） 第６８５番目から第６８７番目のｃｃｔのｃｔｔへの置換
（ｂ９） 第６８８番目から第６９０番目のｇｔｃのａｇｃへの置換
（ｂ１０）第６９１番目から第６９３番目のａｃｃの欠失
（ｂ１１）第１６１番目から第１６３番目のａｇｃのａａｃへの置換
（ｂ１２）第１６７番目から第１６９番目のｇｃｃのａｃｃへの置換
（ｂ１） 第１５５５番目から第１５５７番目のｇｔａのｇｃｔへの置換
（ｂ２） 第１５５２番目から第１５５４番目のａａｔのｔａｔへの置換
（ｂ３） 第１２３４番目から第１２３６番目のａａｇのａｇｇへの置換
（ｂ４） 第１２２５番目から第１２２７番目のｃｃｔのｃａｇへの置換
（ｂ５） 第１５５５番目から第１５５７番目のｔｔｃのｔａｃへの置換
（ｂ６） 第６２５番目から第６２７番目のｃｃｔのｃａａへの置換
（ｂ７） 第６８２番目から第６８４番目のａａｃのａｇｃへの置換
（ｂ８） 第６８５番目から第６８７番目のｃｃｔのｃｔｔへの置換
（ｂ９） 第６８８番目から第６９０番目のｇｔｃのａｇｃへの置換
（ｂ１０）第６９１番目から第６９３番目のａｃｃの欠失
（ｂ１１）第１６１番目から第１６３番目のａｇｃのａａｃへの置換
（ｂ１２）第１６７番目から第１６９番目のｇｃｃのａｃｃへの置換
本発明の遺伝子は、前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１）の置換（Ｖ５１９Ａ）のみが行われている塩基配列からなるという態様であってもよい。この態様の遺伝子は、前記「８」のＨｅｘＡを構成するα−サブユニットをコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子は、前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１）および前記（ｂ２）の置換（Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ）のみが行われている塩基配列からなるという態様であってもよい。この態様の遺伝子は、前記「Ｂ６」のＨｅｘＡを構成するα−サブユニットをコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子は、前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１）、前記（ｂ２）、前記（ｂ３）および前記（ｂ４）の置換（Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ）のみが行われている塩基配列からなるという態様であってもよい。この態様の遺伝子は、前記「Ｂ８」のＨｅｘＡを構成するα−サブユニットをコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子は、前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１）、前記（ｂ２）、前記（ｂ３）、前記（ｂ４）および前記（ｂ５）の置換（Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ／Ｆ５２１Ｙ）のみが行われている塩基配列からなるという態様であってもよい。この態様の遺伝子は、前記「Ｂ９」のＨｅｘＡを構成するα−サブユニットをコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子は、前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ６）、前記（ｂ７）、前記（ｂ８）および前記（ｂ９）の置換（Ｐ２０９Ｑ／Ｎ２２８Ｓ／Ｐ２２９Ｌ／Ｖ２３０Ｓ）並びに前記（ｂ１０）の欠失のみが行われている塩基配列からなるという態様であってもよい。この態様の遺伝子は、前記「Ａ２」のＨｅｘＡを構成するα−サブユニットをコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子は、前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１１）および前記（ｂ１２）の置換（Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ）のみが行われている塩基配列からなるという態様であってもよい。この態様の遺伝子は、前記「Ｇ４」のＨｅｘＡを構成するα−サブユニットをコードする遺伝子である。
本発明のベクターは、本発明の遺伝子が発現可能に挿入されていることを特徴とする。
本発明の形質転換細胞は、ＨｅｘＡを発現可能な形質転換細胞であって、本発明のベクターを含み、前記α−サブユニットが、前記ベクターにより発現可能であることを特徴とする。
以下、本発明について、例を挙げ、さらに詳細に説明する。
本発明のα−サブユニットは、配列番号１において、前記（ａ１）から前記（ａ１２）の少なくとも一つの置換もしくは欠失を有するアミノ酸配列からなる。本発明のα−サブユニットおよびこれを有するＨｅｘＡは、特に制限されないが、下記表に示す、「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」、「Ａ２」および「Ｇ４」の６種類があげられる。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列は、ヒトのＨｅｘＡのαサブユニット（野生型）のアミノ酸配列であり、配列番号２に示す核酸配列は、ヒトのＨｅｘＡのαサブユニット（野生型）の核酸配列である。
本発明のＨｅｘＡの製造方法は、特に制限されず、例えば、つぎの方法により製造方法がある。まず、本発明の所定のアミノ酸残基の置換もしくは欠失を伴なったα−サブユニットをコードする遺伝子をベクターに挿入する。前記ベクターとしては、特に制限されないが、例えば、ｐＣＸｈｙｇｒｏなどのプラスミドがあげられる。前記ベクターには、適当なプロモータを挿入することが好ましい。前記プロモータとしては、例えば、ＣＡＧがある。つぎに、β−サブユニットを発現可能な細胞に対し、前記ベクターを導入する。前記細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ヒト繊維芽細胞などがある。ベクターの導入法は、例えば、リポフェクション法により実施できる。前記ベクターを導入した形質転換細胞を培養し、培養した細胞を回収し、超音波等により細胞を破壊して内容物を回収する。この回収物から本発明のＨｅｘＡを得ることができる。
（実施例１）
本実施例では、前記「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」の５種類の組換えＨｅｘＡを調製し、その機能（熱安定性、ＧＭ２ガングリオシド分解能）を評価した。
本実施例では、前記「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」の５種類の組換えＨｅｘＡを調製し、その機能（熱安定性、ＧＭ２ガングリオシド分解能）を評価した。
（１） ヒト繊維芽細胞及び細胞培養
本実施例では、酵素の高機能化の評価のために、Ｓａｎｄｈｏｆｆ病患者由来皮膚繊維芽細胞（Ｆ５７２）および健常者由来皮膚繊維芽細胞（Ｆ５９２：コントロール）を用いた。これらの細胞は１０％ＦＣＳ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０培地中で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
本実施例では、酵素の高機能化の評価のために、Ｓａｎｄｈｏｆｆ病患者由来皮膚繊維芽細胞（Ｆ５７２）および健常者由来皮膚繊維芽細胞（Ｆ５９２：コントロール）を用いた。これらの細胞は１０％ＦＣＳ含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０培地中で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
（２） 試薬、材料、キット等
下記の試薬、材料およびキット等は、カッコ内の会社から購入した。
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ：４−ＭＵＧ（Ｓｉｇｍａ社）、
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ：４−ＭＵβＧａｌ（Ｓｉｇｍａ社）、
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ：４−ＭＵ（Ｓｉｇｍａ社）、
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙ−６−ｓｕｌｆｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｓａｌｔ：４−ＭＵＧＳ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）、
Ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：Ｍ６Ｐ（Ｓｉｇｍａ社）、
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１０ Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ社）、
Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社）、
Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）、
ＱＩＡｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｘ Ｉｎｃ社）、
Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）、
ｄＮＴＰｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、
Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｘ Ｉｎｃ社）、
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（ＴａＫａＲａ社）、
ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社）、
ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｘ Ｉｎｃ社）、
Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（和光純薬社）、
Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ社）、
Ｕｎｉｆｅｃｔｅｒ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、
ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）、
Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｕｏｒｉｄｅ：ＰＭＳＦ（和光純薬社）、
Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ（ペプチド研社）、
Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（ペプチド研社）、
ＧｅｎｏｍｅＬａｂ（商標） ＤＣＩＴ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）、
ＣＥＱ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｅｌ−ＬＰＡＩ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）、
ＣＥＱ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）、
Ｖｉｖａ ｐｕｒｅ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎｓ Ｑ ｔｙｐｅ（ＶＩＶＡ ＳＣＩＥＮＣＥ社）、
５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ：ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ社）、
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、
Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社）、
ペルオキシダーゼ発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮ社）。
下記の試薬、材料およびキット等は、カッコ内の会社から購入した。
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ：４−ＭＵＧ（Ｓｉｇｍａ社）、
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ：４−ＭＵβＧａｌ（Ｓｉｇｍａ社）、
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ：４−ＭＵ（Ｓｉｇｍａ社）、
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙ−６−ｓｕｌｆｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｓａｌｔ：４−ＭＵＧＳ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）、
Ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：Ｍ６Ｐ（Ｓｉｇｍａ社）、
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１０ Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ社）、
Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社）、
Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）、
ＱＩＡｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｘ Ｉｎｃ社）、
Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）、
ｄＮＴＰｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、
Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｘ Ｉｎｃ社）、
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（ＴａＫａＲａ社）、
ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社）、
ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｘ Ｉｎｃ社）、
Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（和光純薬社）、
Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ社）、
Ｕｎｉｆｅｃｔｅｒ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、
ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）、
Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｕｏｒｉｄｅ：ＰＭＳＦ（和光純薬社）、
Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ（ペプチド研社）、
Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（ペプチド研社）、
ＧｅｎｏｍｅＬａｂ（商標） ＤＣＩＴ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）、
ＣＥＱ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｅｌ−ＬＰＡＩ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）、
ＣＥＱ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）、
Ｖｉｖａ ｐｕｒｅ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎｓ Ｑ ｔｙｐｅ（ＶＩＶＡ ＳＣＩＥＮＣＥ社）、
５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ：ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ社）、
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、
Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社）、
ペルオキシダーゼ発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮ社）。
（３） 抗体等
下記の抗体等を使用した。なお、カッコ内は、抗体等の購入先であり、カッコが無いものは、自家調製したものである。
Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨｅｘＡ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗ＨｅｘＡ抗体）、
抗ＧＭ２モノクローナル抗体：ＧＭＢ２８、
Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社）、
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ −ＡＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社）、
Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）、
Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。
下記の抗体等を使用した。なお、カッコ内は、抗体等の購入先であり、カッコが無いものは、自家調製したものである。
Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨｅｘＡ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗ＨｅｘＡ抗体）、
抗ＧＭ２モノクローナル抗体：ＧＭＢ２８、
Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社）、
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ −ＡＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社）、
Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）、
Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。
（４） アミノ酸置換型ＨＥＸＡ発現プラスミドベクターの構築
ｐＴｒｉＥｘ−ｈＨＥＸＡをテンプレートとし、前記表１、表２および表３に従い、ＰＣＲ法で異なる部位特異的変異を導入したＨＥＸＡ遺伝子を増幅した。そして増幅された変異導入ｈＨＥＸＡ ｃＤＮＡ の５´末端を制限酵素ＸｈｏIで、また３´末端をＢｇｌＩＩで処理した後、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を持つプラスミドであるｐＣＸ ｈｙｇｒｏのＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する両制限酵素部位間に組み込み、ミスセンス変異導入型ＨＥＸＡ発現プラスミドベクター「８」、「Ｂ６］、「Ｂ９」および「Ａ２」とした。
ｐＴｒｉＥｘ−ｈＨＥＸＡをテンプレートとし、前記表１、表２および表３に従い、ＰＣＲ法で異なる部位特異的変異を導入したＨＥＸＡ遺伝子を増幅した。そして増幅された変異導入ｈＨＥＸＡ ｃＤＮＡ の５´末端を制限酵素ＸｈｏIで、また３´末端をＢｇｌＩＩで処理した後、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を持つプラスミドであるｐＣＸ ｈｙｇｒｏのＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する両制限酵素部位間に組み込み、ミスセンス変異導入型ＨＥＸＡ発現プラスミドベクター「８」、「Ｂ６］、「Ｂ９」および「Ａ２」とした。
（５） シークエンシング
精製したプラスミドＤＮＡを５５４ｎｇ（１００ｆｍｏｌ）取り、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで１０μＬにメスアップした後、９６℃、１分インキュベートした。Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ４μＬ、３．３μＭシークエンスプライマー ２μＬを加え優しく撹拌した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９６℃ ２０秒、５０℃ ２０秒、６０℃ ４分で３０サイクル行った。反応後、３Ｍ ＮａＯＡｃ ２μＬとＥｔＯＨ ６０μＬを加え反応を止めた後、直ぐに１４０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎ遠心した。上清を除去後、７５％ ＥｔＯＨで２回洗浄した後、ｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾燥後、Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ４０μＬに溶かし、−３０℃で保存した。そして、ＣＥＱ８０００ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用いて配列を解析した。
精製したプラスミドＤＮＡを５５４ｎｇ（１００ｆｍｏｌ）取り、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで１０μＬにメスアップした後、９６℃、１分インキュベートした。Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ４μＬ、３．３μＭシークエンスプライマー ２μＬを加え優しく撹拌した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９６℃ ２０秒、５０℃ ２０秒、６０℃ ４分で３０サイクル行った。反応後、３Ｍ ＮａＯＡｃ ２μＬとＥｔＯＨ ６０μＬを加え反応を止めた後、直ぐに１４０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎ遠心した。上清を除去後、７５％ ＥｔＯＨで２回洗浄した後、ｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾燥後、Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ４０μＬに溶かし、−３０℃で保存した。そして、ＣＥＱ８０００ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用いて配列を解析した。
（６） 遺伝子導入および細胞株の樹立
構築したベクターを、既に樹立したＨＥＸＢ単独発現ＣＨＯ細胞株に対して、Ｕｎｉｆｅｃｔｏｒを用いたリポフェクション法にて導入し、Ｇ４１８とハイグロマイシンによる薬剤セレクション後、限界希釈法にてシングルコロニーを選別し、恒常発現株であるＣＨＯ ｍｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢを樹立した。ＣＨＯ ｍｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢ株は、アミノ酸残基の置換もしくは欠失したαサブユニットを発現する株である。また、対照として、アミノ酸残基の置換および欠失のない野生型のαサブユニットおよびβサブユニットを発現するＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢも、前述と同様にして作製した。
構築したベクターを、既に樹立したＨＥＸＢ単独発現ＣＨＯ細胞株に対して、Ｕｎｉｆｅｃｔｏｒを用いたリポフェクション法にて導入し、Ｇ４１８とハイグロマイシンによる薬剤セレクション後、限界希釈法にてシングルコロニーを選別し、恒常発現株であるＣＨＯ ｍｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢを樹立した。ＣＨＯ ｍｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢ株は、アミノ酸残基の置換もしくは欠失したαサブユニットを発現する株である。また、対照として、アミノ酸残基の置換および欠失のない野生型のαサブユニットおよびβサブユニットを発現するＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢも、前述と同様にして作製した。
（７） Ｈｅｘ酵素活性測定
培養細胞をＰＢＳ １ｍＬあるいは３ｍＬで３回洗浄後、ＰＢＳ １．４ｍＬを添加しスクレイパーを用いて細胞を回収した後、３０００ｒｐｍ、４℃、５分の遠心操作を行い、細胞を沈殿させ、上清を除いた。この細胞ペレットに対し、プロテアーゼインヒビターとして１ｍＭペプスタチン、２ｍＭロイペプチン、１００ｍＭ ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ ＰＭＳＦの最終濃度となるように添加した１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．０を加え、超音波処理後、１２０００ｒｐｍ、４℃、１５分遠心を行い、上清を回収し細胞抽出液とした。この細胞抽出液を酵素液として、つぎの酵素活性測定を行った。すなわち、全Ｈｅｘ活性測定には人工蛍光基質である４−ＭＵＧを用い、ＨｅｘＡおよびＨｅｘＳ活性には４−ＭＵＧＳを用い、それぞれｐＨ４．５およびｐＨ４．２で行い、遊離した４−ＭＵの蛍光強度により定量した。対照酵素であるβ−ガラクトシダーゼの活性（β−Ｇａｌ）は、４−ＭＵβＧａｌを用いてｐＨ４．５で測定した。
培養細胞をＰＢＳ １ｍＬあるいは３ｍＬで３回洗浄後、ＰＢＳ １．４ｍＬを添加しスクレイパーを用いて細胞を回収した後、３０００ｒｐｍ、４℃、５分の遠心操作を行い、細胞を沈殿させ、上清を除いた。この細胞ペレットに対し、プロテアーゼインヒビターとして１ｍＭペプスタチン、２ｍＭロイペプチン、１００ｍＭ ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ ＰＭＳＦの最終濃度となるように添加した１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．０を加え、超音波処理後、１２０００ｒｐｍ、４℃、１５分遠心を行い、上清を回収し細胞抽出液とした。この細胞抽出液を酵素液として、つぎの酵素活性測定を行った。すなわち、全Ｈｅｘ活性測定には人工蛍光基質である４−ＭＵＧを用い、ＨｅｘＡおよびＨｅｘＳ活性には４−ＭＵＧＳを用い、それぞれｐＨ４．５およびｐＨ４．２で行い、遊離した４−ＭＵの蛍光強度により定量した。対照酵素であるβ−ガラクトシダーゼの活性（β−Ｇａｌ）は、４−ＭＵβＧａｌを用いてｐＨ４．５で測定した。
（８） ＨｅｘＡ画分の分離
前記細胞抽出液１ｍｇ分をリン酸ナトリウム緩衝液で４００μＬにメスアップ後、リン酸ナトリウム緩衝液で前処理したｖｉｖａ ｐｕｒｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに充填し、４５００ｒｐｍ、４℃、５分遠心後、同様の緩衝液を充填し遠心してカラム洗浄を２回行った。その後、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭおよび１Ｍ ＮａＣｌ／リン酸ナトリウム緩衝液を充填し、ステップワイズで４５００ｒｐｍ、４℃、５分遠心各濃度２回ずつ行い、溶出画分を回収した。なお、各濃度の間にリン酸ナトリウム緩衝液の洗浄操作を１回行った。前述の方法による溶出画分の酵素活性測定の結果より、４−ＭＵＧＳ分解活性の高い４００ｍＭ溶出画分を分子量３０，０００カットのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮後、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）を用いて緩衝液を置換し濃縮液（ＨｅｘＡ画分）を得た。
前記細胞抽出液１ｍｇ分をリン酸ナトリウム緩衝液で４００μＬにメスアップ後、リン酸ナトリウム緩衝液で前処理したｖｉｖａ ｐｕｒｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに充填し、４５００ｒｐｍ、４℃、５分遠心後、同様の緩衝液を充填し遠心してカラム洗浄を２回行った。その後、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭおよび１Ｍ ＮａＣｌ／リン酸ナトリウム緩衝液を充填し、ステップワイズで４５００ｒｐｍ、４℃、５分遠心各濃度２回ずつ行い、溶出画分を回収した。なお、各濃度の間にリン酸ナトリウム緩衝液の洗浄操作を１回行った。前述の方法による溶出画分の酵素活性測定の結果より、４−ＭＵＧＳ分解活性の高い４００ｍＭ溶出画分を分子量３０，０００カットのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮後、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）を用いて緩衝液を置換し濃縮液（ＨｅｘＡ画分）を得た。
（９） 培養液上清におけるＨｅｘ酵素の獲得
ＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢおよびＣＨＯ ｍｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢを９６ウェルプレートの５ウェル分でコンフルエントになるまで培養後、ＰＢＳ ２００μＬで２回洗浄を行い、血清非存在下Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０ ２００μＬで１週間培養後、上清を回収した。そして３０００ｒｐｍ、４℃、５分遠心を行い、上清を回収後、分子量３０，０００カットのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮後、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ４．３を用いて緩衝液を置換し濃縮液（Ｈｅｘ酵素液）を得た。
ＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢおよびＣＨＯ ｍｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢを９６ウェルプレートの５ウェル分でコンフルエントになるまで培養後、ＰＢＳ ２００μＬで２回洗浄を行い、血清非存在下Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０ ２００μＬで１週間培養後、上清を回収した。そして３０００ｒｐｍ、４℃、５分遠心を行い、上清を回収後、分子量３０，０００カットのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮後、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ４．３を用いて緩衝液を置換し濃縮液（Ｈｅｘ酵素液）を得た。
（１０） Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
前記（９）における濃縮液（抽出液）におけるサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合は２５μｇ、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの場合は４−ＭＵＧ分解活性で５００ｎｍｏｌ／ｈとなるように取り、６×サンプルバッファーおよびＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで全量２４μＬとなるように調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはゲル濃度１０％、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥはゲル濃度７．５％のアクリルアミドゲルで電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥともにセミドライ法により、ＰＶＤＦ膜にタンパクを転写し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ／ＴＢＳで一晩（１６〜１８時間）ブロッキングした。一次抗体には抗ＨｅｘＡ抗体（１０００倍希釈）あるいは抗α−ｓｕｂｕｎｉｔ抗体（５００倍希釈）を、二次抗体にはＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１０００倍希釈）を、そして三次反応にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰ ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（１０００倍希釈）を用いて、室温（ＲＴ、以下同じ）、１時間の反応を行った。それぞれの反応の間には０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで１０分×３回、ＴＢＳで１０分×１回の洗浄を行った。そして、ＢＣＩＰ／ＮＢＴをＡＰ発色Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈し膜を浸して発色させた。
前記（９）における濃縮液（抽出液）におけるサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合は２５μｇ、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの場合は４−ＭＵＧ分解活性で５００ｎｍｏｌ／ｈとなるように取り、６×サンプルバッファーおよびＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで全量２４μＬとなるように調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはゲル濃度１０％、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥはゲル濃度７．５％のアクリルアミドゲルで電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥともにセミドライ法により、ＰＶＤＦ膜にタンパクを転写し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ／ＴＢＳで一晩（１６〜１８時間）ブロッキングした。一次抗体には抗ＨｅｘＡ抗体（１０００倍希釈）あるいは抗α−ｓｕｂｕｎｉｔ抗体（５００倍希釈）を、二次抗体にはＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１０００倍希釈）を、そして三次反応にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰ ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（１０００倍希釈）を用いて、室温（ＲＴ、以下同じ）、１時間の反応を行った。それぞれの反応の間には０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで１０分×３回、ＴＢＳで１０分×１回の洗浄を行った。そして、ＢＣＩＰ／ＮＢＴをＡＰ発色Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈し膜を浸して発色させた。
反応組成液は、４−ＭＵＧＳ分解活性で２０００ｎｍｏｌ／ｈ のＨｅｘＡ画分に１μＬ ＢＳＡを加え、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）で全量１００μＬに調製した。前記反応組成液を、３７℃でＣＯ２インキュベーター中、２、５、８および１０日間インキュベートし、各日ごとに酵素活性測定を行った。
（１２） Ｃｅｌｌ Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｎｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ）
図４に示す手順により、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにより、ＧＭ２ガングリオシド分解能評価を実施した。すなわち、まず、コラーゲンコートした９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社）でＦ５７２をコンフルエントになるまで培養後、培地を除き、ＰＢＳ １５０μＬで洗浄後、血清非含有のＨａｍ’ｓ Ｆ−１０培地で２回洗浄した。その後、ＤＥＡＥカラムを用いて分離したＷＴのＨｅｘＡおよびアミノ酸置換型ＨｅｘＡを５００ｎｍｏｌ／ｈとなるように血清非含有の培地で希釈してウェルに添加し、２日間培養した後、１０％血清となるように血清を添加し、さらに２日間培養した。培地を除き、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を１００μＬ加え、４℃、一晩固定した。ＰＦＡを除去後、ＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を０．３％となるように全量１００μＬ添加し、ＲＴ、３０分放置した。Ｈ２Ｏ２を除去後、ＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄を行い、５％ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳをウェルに添加し、４℃、一晩ブロッキングした。液を除去後、一次抗体；抗ＧＭ２モノクローナル抗体を１００倍希釈で４℃、一晩反応後、液を捨て、ＰＢＳで洗浄した。二次抗体；Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈で添加し、１時間反応後、液を除き、ＰＢＳで洗浄後、三次抗体；ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈で添加し、１時間反応させた。液を除き、ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮ社）を用いて検出した。
図４に示す手順により、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにより、ＧＭ２ガングリオシド分解能評価を実施した。すなわち、まず、コラーゲンコートした９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社）でＦ５７２をコンフルエントになるまで培養後、培地を除き、ＰＢＳ １５０μＬで洗浄後、血清非含有のＨａｍ’ｓ Ｆ−１０培地で２回洗浄した。その後、ＤＥＡＥカラムを用いて分離したＷＴのＨｅｘＡおよびアミノ酸置換型ＨｅｘＡを５００ｎｍｏｌ／ｈとなるように血清非含有の培地で希釈してウェルに添加し、２日間培養した後、１０％血清となるように血清を添加し、さらに２日間培養した。培地を除き、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を１００μＬ加え、４℃、一晩固定した。ＰＦＡを除去後、ＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を０．３％となるように全量１００μＬ添加し、ＲＴ、３０分放置した。Ｈ２Ｏ２を除去後、ＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄を行い、５％ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳをウェルに添加し、４℃、一晩ブロッキングした。液を除去後、一次抗体；抗ＧＭ２モノクローナル抗体を１００倍希釈で４℃、一晩反応後、液を捨て、ＰＢＳで洗浄した。二次抗体；Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈で添加し、１時間反応後、液を除き、ＰＢＳで洗浄後、三次抗体；ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈で添加し、１時間反応させた。液を除き、ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮ社）を用いて検出した。
（１３） Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果
図１にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動の写真を示す。同図において、各記号は下記のとおりである。図示のように、「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」の全ての細胞株において、ＨｅｘＡが産生されており、特に、「Ｂ６」および「Ｂ９」において、ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢが選択的に産生され、ＨｅｘＳは産生されなかった。
図１にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動の写真を示す。同図において、各記号は下記のとおりである。図示のように、「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」の全ての細胞株において、ＨｅｘＡが産生されており、特に、「Ｂ６」および「Ｂ９」において、ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢが選択的に産生され、ＨｅｘＳは産生されなかった。
ＣＨＯ：Ｈｅｘを発現しない細胞株の酵素抽出液
ＣＨＯ ｈＨＥＸＡ：ＨｅｘＡの野生型（ＷＴ）αサブユニットのみ発現するＣＨＯ細胞株の酵素抽出液
ＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢ：ＨｅｘＡの野生型（ＷＴ）αサブユニットおよび野生型（ＷＴ）βサブユニットを発現するＣＨＯ細胞株の酵素抽出液
「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」：前述のアミノ酸残基の置換を行ったＣＨＯ細胞株の酵素抽出液
ＣＨＯ ｈＨＥＸＡ：ＨｅｘＡの野生型（ＷＴ）αサブユニットのみ発現するＣＨＯ細胞株の酵素抽出液
ＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢ：ＨｅｘＡの野生型（ＷＴ）αサブユニットおよび野生型（ＷＴ）βサブユニットを発現するＣＨＯ細胞株の酵素抽出液
「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」：前述のアミノ酸残基の置換を行ったＣＨＯ細胞株の酵素抽出液
（１４） 熱安定性評価の結果
前記（１１）の熱安定性の評価の結果を図２のグラフに示す。同図は、８日目の酵素活性の結果である。なお、同図では、後述の「Ｇ４：Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ」の結果も合わせて示している。図示のように、アミノ酸残基を置換もしくは欠失させた「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」の全てにおいて、野生型（ＷＴ）に対し、熱安定性が向上した。特に、「Ｂ９」では、野生型の約２倍の熱安定性を示した。
前記（１１）の熱安定性の評価の結果を図２のグラフに示す。同図は、８日目の酵素活性の結果である。なお、同図では、後述の「Ｇ４：Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ」の結果も合わせて示している。図示のように、アミノ酸残基を置換もしくは欠失させた「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」の全てにおいて、野生型（ＷＴ）に対し、熱安定性が向上した。特に、「Ｂ９」では、野生型の約２倍の熱安定性を示した。
（１５） ＧＭ２ガングリオシド分解能評価の結果
前記（１２）のＧＭ２ガングリオシド分解能評価の結果を図３のグラフに示す。図示のように、健常者の細胞株であるＦ５９２では、ＧＭ２ガングリオシドは分解されているが、Ｓａｎｄｈｏｆｆ病患者の細胞株であるＦ５７２では、ＧＭ２ガングリオシドが蓄積していた。前記Ｆ５７２に対し、野生型（ＷＴ）のＨｅｘＡおよび組換型のＨｅｘＡ（「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」）を投与（５００ｎｍｏｌ／ｈ）すると、ＧＭ２ガングリオシドが分解された。特に、「８」、「Ｂ８」および「Ｂ９」は、野生型（ＷＴ）に対し、高いＧＭ２ガングリオシド分解活性を示した。これらのことから、本発明の組換えＨｅｘＡは、リソソームへの輸送効率に優れるといえる。
前記（１２）のＧＭ２ガングリオシド分解能評価の結果を図３のグラフに示す。図示のように、健常者の細胞株であるＦ５９２では、ＧＭ２ガングリオシドは分解されているが、Ｓａｎｄｈｏｆｆ病患者の細胞株であるＦ５７２では、ＧＭ２ガングリオシドが蓄積していた。前記Ｆ５７２に対し、野生型（ＷＴ）のＨｅｘＡおよび組換型のＨｅｘＡ（「８」、「Ｂ６」、「Ｂ８」、「Ｂ９」および「Ａ２」）を投与（５００ｎｍｏｌ／ｈ）すると、ＧＭ２ガングリオシドが分解された。特に、「８」、「Ｂ８」および「Ｂ９」は、野生型（ＷＴ）に対し、高いＧＭ２ガングリオシド分解活性を示した。これらのことから、本発明の組換えＨｅｘＡは、リソソームへの輸送効率に優れるといえる。
（実施例２）
本実施例では、アミノ酸置換による糖鎖追加型の組換えＨｅｘＡである「Ｇ４」を調製し、その機能（熱安定性、ＧＭ２ガングリオシド分解能）を評価した。
本実施例では、アミノ酸置換による糖鎖追加型の組換えＨｅｘＡである「Ｇ４」を調製し、その機能（熱安定性、ＧＭ２ガングリオシド分解能）を評価した。
（１） ヒト繊維芽細胞及び細胞培養
ヒト繊維芽細胞及び細胞培養は、実施例１と同様とした。
ヒト繊維芽細胞及び細胞培養は、実施例１と同様とした。
（２） 試薬、材料、キット等
試薬、材料およびキット等は、実施例１と同様のものを使用した。
試薬、材料およびキット等は、実施例１と同様のものを使用した。
（３） アミノ酸置換型ＨＥＸＡ発現プラスミドベクターの構築
ｐＴｒｉＥｘ−ｈＨＥＸＡをテンプレートとし、前記表３の「Ｇ４」に示す糖鎖付加部位を追加するためのミスセンス変異を導入したＨＥＸＡ遺伝子を、ＰＣＲ法により増幅した。そして増幅された変異導入ｈＨＥＸＡ ｃＤＮＡ の５´末端を制限酵素ＸｈｏIで、また３´末端をＢｇｌＩＩで処理した後、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を持つプラスミドであるｐＣＸ ｈｙｇｒｏのＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する両制限酵素部位に組み込み、糖鎖追加型ミスセンス変異導入型ＨＥＸＡ発現プラスミドベクター「Ｇ４」とした。
ｐＴｒｉＥｘ−ｈＨＥＸＡをテンプレートとし、前記表３の「Ｇ４」に示す糖鎖付加部位を追加するためのミスセンス変異を導入したＨＥＸＡ遺伝子を、ＰＣＲ法により増幅した。そして増幅された変異導入ｈＨＥＸＡ ｃＤＮＡ の５´末端を制限酵素ＸｈｏIで、また３´末端をＢｇｌＩＩで処理した後、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を持つプラスミドであるｐＣＸ ｈｙｇｒｏのＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する両制限酵素部位に組み込み、糖鎖追加型ミスセンス変異導入型ＨＥＸＡ発現プラスミドベクター「Ｇ４」とした。
（４） シークエンシング
精製したプラスミドＤＮＡを５５４ｎｇ（１００ｆｍｏｌ）取り、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで１０μＬにメスアップした後、９６℃、１分インキュベートした。Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ４μＬ、３．３μＭシークエンスプライマー ２μＬを加え優しく撹拌した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９６℃ ２０秒、５０℃ ２０秒、６０℃ ４分で３０サイクル行った。反応後、３Ｍ ＮａＯＡｃ ２μＬとＥｔＯＨ ６０μＬを加え反応を止めた後、直ぐに１４０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎ遠心した。上清を除去後、７５％ ＥｔＯＨで２回洗浄した後、ｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾燥後、Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ４０μＬに溶かし、−３０℃で保存した。そして、ＣＥＱ８０００ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用いて配列を解析した。
精製したプラスミドＤＮＡを５５４ｎｇ（１００ｆｍｏｌ）取り、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで１０μＬにメスアップした後、９６℃、１分インキュベートした。Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ４μＬ、３．３μＭシークエンスプライマー ２μＬを加え優しく撹拌した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９６℃ ２０秒、５０℃ ２０秒、６０℃ ４分で３０サイクル行った。反応後、３Ｍ ＮａＯＡｃ ２μＬとＥｔＯＨ ６０μＬを加え反応を止めた後、直ぐに１４０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎ遠心した。上清を除去後、７５％ ＥｔＯＨで２回洗浄した後、ｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾燥後、Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ４０μＬに溶かし、−３０℃で保存した。そして、ＣＥＱ８０００ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用いて配列を解析した。
（５） 遺伝子および細胞株の樹立
構築したベクターを、既に樹立したＨＥＸＢ単独発現ＣＨＯ細胞株に対して、Ｕｎｉｆｅｃｔｏｒを用いたリポフェクション法にて導入し、Ｇ４１８とハイグロマイシンによる薬剤セレクション後、限界希釈法にてシングルコロニーを選別し、恒常発現株であるＣＨＯ ｇｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢ：Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ（Ｇ４）株を樹立した。また、対照として、アミノ酸残基の置換および欠失のない野生型のαサブユニットおよびβサブユニットを発現するＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢも、前述と同様にして作製した。
構築したベクターを、既に樹立したＨＥＸＢ単独発現ＣＨＯ細胞株に対して、Ｕｎｉｆｅｃｔｏｒを用いたリポフェクション法にて導入し、Ｇ４１８とハイグロマイシンによる薬剤セレクション後、限界希釈法にてシングルコロニーを選別し、恒常発現株であるＣＨＯ ｇｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢ：Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ（Ｇ４）株を樹立した。また、対照として、アミノ酸残基の置換および欠失のない野生型のαサブユニットおよびβサブユニットを発現するＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢも、前述と同様にして作製した。
（６） 細胞株からのＨｅｘＡの分離
ＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢ（野生型）株および前記Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ株を、それぞれ血清非存在下で７日間培養後、５０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心後、培養液の上清を回収した。その後、３０，０００ｃｕｔのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａを用いて上清を濃縮し、１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ６．０）でバッファー交換後さらに濃縮した。この濃縮液に対し、プロテアーゼインヒビターを添加後、０．２２μｍ ｐｏｒｅの滅菌フィルターを用いてｆｉｌｔｒａｔｉｏｎした。この濃縮液を４−ＭＵＧ分解活性で２８５２００ｎｍｏｌ／ｈ分、Ｈｉｔｒａｐ ＦＦ ｃｏｌｕｍｎ（１ｍＬ）に充填し、ＡＫＴＡを用いてＮａＣｌ濃度勾配（０〜０．３Ｍ）により溶出し分画した。素通り画分をＨｅｘＢ画分、０〜０．１５Ｍ ＮａＣｌ勾配溶出画分をＨｅｘＡ画分とし採取した。採取した分画液は、１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ６．０）でバッファー交換後、４℃で保存した。
ＣＨＯ ｈＨＥＸＡ／ｈＨＥＸＢ（野生型）株および前記Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ株を、それぞれ血清非存在下で７日間培養後、５０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心後、培養液の上清を回収した。その後、３０，０００ｃｕｔのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａを用いて上清を濃縮し、１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ６．０）でバッファー交換後さらに濃縮した。この濃縮液に対し、プロテアーゼインヒビターを添加後、０．２２μｍ ｐｏｒｅの滅菌フィルターを用いてｆｉｌｔｒａｔｉｏｎした。この濃縮液を４−ＭＵＧ分解活性で２８５２００ｎｍｏｌ／ｈ分、Ｈｉｔｒａｐ ＦＦ ｃｏｌｕｍｎ（１ｍＬ）に充填し、ＡＫＴＡを用いてＮａＣｌ濃度勾配（０〜０．３Ｍ）により溶出し分画した。素通り画分をＨｅｘＢ画分、０〜０．１５Ｍ ＮａＣｌ勾配溶出画分をＨｅｘＡ画分とし採取した。採取した分画液は、１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ６．０）でバッファー交換後、４℃で保存した。
（７） Ｈｅｘ酵素活性測定
Ｈｅｘ酵素活性測定は、実施例１と同様にして実施した。
Ｈｅｘ酵素活性測定は、実施例１と同様にして実施した。
（８） Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇは、実施例１と同様にして実施した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇは、実施例１と同様にして実施した。
（９） 熱安定性の評価方法
熱安定性の評価方法は、実施例１同様にして実施した。
熱安定性の評価方法は、実施例１同様にして実施した。
（１０） Ｃｅｌｌ Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｎｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ）
図４に示す手順により、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにより、ＧＭ２ガングリオシド分解能評価を実施した。すなわち、まず、コラーゲンコートした９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社）でＦ５７２をコンフルエントになるまで培養後、培地を除き、ＰＢＳ １５０μＬで洗浄後、血清非含有のＨａｍ’ｓ Ｆ−１０培地で２回洗浄した。その後、ＤＥＡＥカラムを用いて分離したＷＴ ＨｅｘＡおよびＧ−ＨｅｘＡを５０ ｎｍｏｌ／ｈ、１５０ｎｍｏｌ／ｈおよび５００ｎｍｏｌ／ｈの各濃度となるように血清非含有の培地で希釈してウェルに添加し、２日間培養した後、１０％血清となるように血清を添加し、さらに２日間培養した。なお、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を添加する実験では、組換え酵素を添加する３０分前に、最終濃度５ｍＭとなるように培地にＭ６Ｐを添加した。つぎに、培地を除き、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を１００μＬ加え、４℃、一晩固定した。ＰＦＡを除去後、ＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を０．３％となるように全量１００μＬ添加し、ＲＴ、３０分放置した。Ｈ２Ｏ２を除去後、ＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄を行い、５％ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳをウェルに添加し、４℃、一晩ブロッキングした。液を除去後、一次抗体；抗ＧＭ２モノクローナル抗体を１００倍希釈で４℃、一晩反応後、液を捨て、ＰＢＳで洗浄した。二次抗体；Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈で添加し、１時間反応後、液を除き、ＰＢＳで洗浄後、三次抗体；ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈で添加し、１時間反応させた。液を除き、ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮ社）を用いて検出した。
図４に示す手順により、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにより、ＧＭ２ガングリオシド分解能評価を実施した。すなわち、まず、コラーゲンコートした９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社）でＦ５７２をコンフルエントになるまで培養後、培地を除き、ＰＢＳ １５０μＬで洗浄後、血清非含有のＨａｍ’ｓ Ｆ−１０培地で２回洗浄した。その後、ＤＥＡＥカラムを用いて分離したＷＴ ＨｅｘＡおよびＧ−ＨｅｘＡを５０ ｎｍｏｌ／ｈ、１５０ｎｍｏｌ／ｈおよび５００ｎｍｏｌ／ｈの各濃度となるように血清非含有の培地で希釈してウェルに添加し、２日間培養した後、１０％血清となるように血清を添加し、さらに２日間培養した。なお、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を添加する実験では、組換え酵素を添加する３０分前に、最終濃度５ｍＭとなるように培地にＭ６Ｐを添加した。つぎに、培地を除き、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を１００μＬ加え、４℃、一晩固定した。ＰＦＡを除去後、ＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を０．３％となるように全量１００μＬ添加し、ＲＴ、３０分放置した。Ｈ２Ｏ２を除去後、ＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄を行い、５％ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳをウェルに添加し、４℃、一晩ブロッキングした。液を除去後、一次抗体；抗ＧＭ２モノクローナル抗体を１００倍希釈で４℃、一晩反応後、液を捨て、ＰＢＳで洗浄した。二次抗体；Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈で添加し、１時間反応後、液を除き、ＰＢＳで洗浄後、三次抗体；ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈で添加し、１時間反応させた。液を除き、ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キット（ＳＵＭＩＬＯＮ社）を用いて検出した。
（１１） ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
図５にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動の写真を示す。図示のように、アミン酸残基を置換して糖鎖追加型にしたＳ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ（Ｇ４）では、野生型（ＷＴ）のＨｅｘＡの分子量５８ｋＤに比べ、５９ｋＤに高分子量化していた。なお、同図において、ＣＨＯｈβは、野生型ｈＨＥＸＢ遺伝子を単独で導入したＣＨＯ細胞株（クローン）または前記細胞株の抽出液を示す。
図５にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動の写真を示す。図示のように、アミン酸残基を置換して糖鎖追加型にしたＳ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ（Ｇ４）では、野生型（ＷＴ）のＨｅｘＡの分子量５８ｋＤに比べ、５９ｋＤに高分子量化していた。なお、同図において、ＣＨＯｈβは、野生型ｈＨＥＸＢ遺伝子を単独で導入したＣＨＯ細胞株（クローン）または前記細胞株の抽出液を示す。
（１２） 酵素活性測定の結果
Ｇ４の酵素活性測定の結果を、図６のグラフに示す。図示のように、Ｇ４は、野生型（ＷＴ）と同等の酵素活性を示した。なお、同図において、ＣＨＯは、ｈＨＥＸ遺伝子を導入していないＣＨＯ株（または、その抽出液）であり、ｈαは、野生型ｈＨＥＸＡ遺伝子を単独で導入したＣＨＯ株（または、その抽出液）であり、ｈβは、野生型ｈＨＥＸＢ遺伝子を単独で導入したＣＨＯ株（または、その抽出液）である。
Ｇ４の酵素活性測定の結果を、図６のグラフに示す。図示のように、Ｇ４は、野生型（ＷＴ）と同等の酵素活性を示した。なお、同図において、ＣＨＯは、ｈＨＥＸ遺伝子を導入していないＣＨＯ株（または、その抽出液）であり、ｈαは、野生型ｈＨＥＸＡ遺伝子を単独で導入したＣＨＯ株（または、その抽出液）であり、ｈβは、野生型ｈＨＥＸＢ遺伝子を単独で導入したＣＨＯ株（または、その抽出液）である。
（１３） 熱安定性の評価結果
熱安定性の評価結果を、図２のグラフに示す。同図に示すように、Ｇ４（Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ）は、野生型（ＷＴ）に対し、熱安定性に優れていた。
熱安定性の評価結果を、図２のグラフに示す。同図に示すように、Ｇ４（Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ）は、野生型（ＷＴ）に対し、熱安定性に優れていた。
（１４） ＧＭ２ガングリオシド分解能評価の結果
ＧＭ２ガングリオシド分解能の評価結果を図７のグラフに示す。なお、横軸における５０、１００、１５０の数字は、酵素の投与量（ｎｍｏｌ／ｈ）を示す。図示のように、健常者の細胞株であるＦ５９２では、ＧＭ２ガングリオシドは分解されているが、Ｓａｎｄｈｏｆｆ病患者の細胞株であるＦ５７２では、ＧＭ２ガングリオシドが蓄積していた。前記Ｆ５７２に対し、野生型（ＷＴ）のＨｅｘＡおよび組換型のＨｅｘＡ（「Ｇ４」）を投与すると、投与量に応じて、ＧＭ２ガングリオシドが分解された。これらのことから、本発明の組換えＨｅｘＡは、リソソームへの輸送効率に優れるといえる。一方、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を酵素と併せて投与すると、ＧＭ２ガングリオシドの分解能が低下した。これらのことより、Ｇ４には、糖鎖が付加（追加）されていることが確認できた。
ＧＭ２ガングリオシド分解能の評価結果を図７のグラフに示す。なお、横軸における５０、１００、１５０の数字は、酵素の投与量（ｎｍｏｌ／ｈ）を示す。図示のように、健常者の細胞株であるＦ５９２では、ＧＭ２ガングリオシドは分解されているが、Ｓａｎｄｈｏｆｆ病患者の細胞株であるＦ５７２では、ＧＭ２ガングリオシドが蓄積していた。前記Ｆ５７２に対し、野生型（ＷＴ）のＨｅｘＡおよび組換型のＨｅｘＡ（「Ｇ４」）を投与すると、投与量に応じて、ＧＭ２ガングリオシドが分解された。これらのことから、本発明の組換えＨｅｘＡは、リソソームへの輸送効率に優れるといえる。一方、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を酵素と併せて投与すると、ＧＭ２ガングリオシドの分解能が低下した。これらのことより、Ｇ４には、糖鎖が付加（追加）されていることが確認できた。
以上説明したように、本発明の組換αサブユニットおよびＨｅｘＡは、熱安定性およびリソソームへの輸送効率の少なくとも一方に優れる。
Claims (17)
- β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を構成するα−サブユニットであって、配列番号１記載のアミノ酸配列において、下記の（ａ１）から（ａ１２）の少なくとも一つのアミノ酸残基の置換もしくは欠失が行われているアミノ酸配列からなることを特徴とするβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニット。
（ａ１） 第５１９番目バリン（Ｖ）のアラニン（Ａ）への置換（Ｖ５１９Ａ）
（ａ２） 第５１８番目アスパラギン（Ｎ）のチロシン（Ｙ）への置換（Ｎ５１８Ｙ）
（ａ３） 第４３２番目リシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への置換（Ｋ４３２Ｒ）
（ａ４） 第４２９番目プロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）への置換（Ｐ４２９Ｑ）
（ａ５） 第５２１番目フェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）への置換（Ｆ５２１Ｙ）
（ａ６） 第２０９番目プロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）への置換（Ｐ２０９Ｑ）
（ａ７） 第２２８番目アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）への置換（Ｎ２２８Ｓ）
（ａ８） 第２２９番目プロリン（Ｐ）のロイシン（Ｌ）への置換（Ｐ２２９Ｌ）
（ａ９） 第２３０番目バリン（Ｖ）のセリン（Ｓ）への置換（Ｖ２３０Ｓ）
（ａ１０）第２３１番目トレオニン（Ｔ）の欠失
（ａ１１）第５１番目セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）への置換（Ｓ５１Ｎ）
（ａ１２）第５３番目アラニン（Ａ）のトレオニン（Ｔ）への置換（Ａ５３Ｔ） - 前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１）の置換（Ｖ５１９Ａ）のみが行われているアミノ酸配列からなる請求項１記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニット。
- 前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１）および前記（ａ２）の置換（Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ）のみが行われているアミノ酸配列からなる請求項１記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニット。
- 前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１）、前記（ａ２）、前記（ａ３）および前記（ａ４）の置換（Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ）のみが行われているアミノ酸配列からなる請求項１記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニット。
- 前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１）、前記（ａ２）、前記（ａ３）、前記（ａ４）および前記（ａ５）の置換（Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ／Ｆ５２１Ｙ）のみが行われているアミノ酸配列からなる請求項１記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニット。
- 前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ６）、前記（ａ７）、前記（ａ８）および前記（ａ９）の置換（Ｐ２０９Ｑ／Ｎ２２８Ｓ／Ｐ２２９Ｌ／Ｖ２３０Ｓ）並びに前記（ａ１０）の欠失のみが行われているアミノ酸配列からなる請求項１記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニット。
- 前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記（ａ１１）および前記（ａ１２）の置換（Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ）のみが行われているアミノ酸配列からなる請求項１記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニット。
- α−サブユニットおよびβ−サブユニットから構成されるβ−ヘキソサミニダーゼＡであって、前記α−サブユニットが、請求項１から７のいずれか一項に記載のα−サブユニットであるβ−ヘキソサミニダーゼＡ。
- β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を構成するα−サブユニットをコードする遺伝子であって、配列番号２記載の塩基配列において、下記の（ｂ１）から（ｂ１２）の少なくとも一つの塩基の置換もしくは欠失が行われている塩基配列からなることを特徴とするβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニットをコードする遺伝子。
（ｂ１） 第１５５５番目から第１５５７番目のｇｔａのｇｃｔへの置換
（ｂ２） 第１５５２番目から第１５５４番目のａａｔのｔａｔへの置換
（ｂ３） 第１２３４番目から第１２３６番目のａａｇのａｇｇへの置換
（ｂ４） 第１２２５番目から第１２２７番目のｃｃｔのｃａｇへの置換
（ｂ５） 第１５５５番目から第１５５７番目のｔｔｃのｔａｃへの置換
（ｂ６） 第６２５番目から第６２７番目のｃｃｔのｃａａへの置換
（ｂ７） 第６８２番目から第６８４番目のａａｃのａｇｃへの置換
（ｂ８） 第６８５番目から第６８７番目のｃｃｔのｃｔｔへの置換
（ｂ９） 第６８８番目から第６９０番目のｇｔｃのａｇｃへの置換
（ｂ１０）第６９１番目から第６９３番目のａｃｃの欠失
（ｂ１１）第１６１番目から第１６３番目のａｇｃのａａｃへの置換
（ｂ１２）第１６７番目から第１６９番目のｇｃｃのａｃｃへの置換 - 前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１）の置換（Ｖ５１９Ａ）のみが行われている塩基配列からなる請求項９記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニットをコードする遺伝子。
- 前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１）および前記（ｂ２）の置換（Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ）のみが行われている塩基配列からなる請求項９記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニットをコードする遺伝子。
- 前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１）、前記（ｂ２）、前記（ｂ３）および前記（ｂ４）の置換（Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ）のみが行われている塩基配列からなる請求項９記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニットをコードする遺伝子。
- 前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１）、前記（ｂ２）、前記（ｂ３）、前記（ｂ４）および前記（ｂ５）の置換（Ｐ４２９Ｑ／Ｋ４３２Ｒ／Ｎ５１８Ｙ／Ｖ５１９Ａ／Ｆ５２１Ｙ）のみが行われている塩基配列からなる請求項９記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニットをコードする遺伝子。
- 前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ６）、前記（ｂ７）、前記（ｂ８）および前記（ｂ９）の置換（Ｐ２０９Ｑ／Ｎ２２８Ｓ／Ｐ２２９Ｌ／Ｖ２３０Ｓ）並びに前記（ｂ１０）の欠失のみが行われている塩基配列からなる請求項９記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニットをコードする遺伝子。
- 前記配列番号２の塩基配列において、前記（ｂ１１）および前記（ｂ１２）の置換（Ｓ５１Ｎ／Ａ５３Ｔ）のみが行われている塩基配列からなる請求項９記載のβ−ヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニットをコードする遺伝子。
- 請求項９から１５のいずれか一項に記載の遺伝子が発現可能に挿入されていることを特徴とするベクター。
- α−サブユニットおよびβ−サブユニットから構成されるβ−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を発現可能な形質転換細胞であって、請求項１６記載のベクターを含み、前記α−サブユニットが、前記ベクターにより発現可能であることを特徴とする形質転換細胞。
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|---|---|---|---|
| JP2007044790A JP2008206428A (ja) | 2007-02-24 | 2007-02-24 | β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を構成するα−サブユニット、前記α−サブユニットを有するＨｅｘＡ、前記α−サブユニットをコードする遺伝子、ベクターおよび形質転換細胞 |
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| JP2007044790A JP2008206428A (ja) | 2007-02-24 | 2007-02-24 | β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）を構成するα−サブユニット、前記α−サブユニットを有するＨｅｘＡ、前記α−サブユニットをコードする遺伝子、ベクターおよび形質転換細胞 |
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