ES2616048T3

ES2616048T3 - Fabricación de enzimas sulfatasas lisosomales humanas, altamente fosforiladas, activas y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2616048T3
Application number: ES09702074.7T
Authority: ES
Inventors: Michel Claude Vellard; Vish Koppaka; Melita Dvorak-Ewell; Erno Pungor; Charles Hague
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Current assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2017-06-09
Anticipated expiration: 2029-01-16

Abstract

Una composición de enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) recombinante humana, comprendiendo dicha composición enzimática enzimas GALNS que comprenden una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a los aminoácidos 27 a 522 de SEQ ID NO: 4, útil para el tratamiento de una enfermedad por depósito lisosomal que está causada por o asociada con una deficiencia en dicha GALNS, en la que dichas enzimas GALNS de dicha composición: (a) tienen al menos una conversión del 50 % del resto de cisteína de la posición 53 en Cα-formilglicina (FGly); y (b) están glicosiladas ligadas a N en los restos de asparagina de las posiciones 178 y 397, y en la que al menos el 50 % de las cadenas de oligomanosa unidas al resto de asparagina de la posición 178 están bis-fosforiladas, opcionalmente, en la que la enzima GALNS es una proteína de fusión que comprende una señal de dirección celular ubicada en el extremo N- o C-terminal de la enzima GALNS.

Description

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humana que sea deficiente en la enzima lisosomal que se vaya ensayar, de manera que se puedan acumular los sustratos naturales para la enzima lisosomal. Por ejemplo, se pueden usar las células que presentan de forma natural una deficiencia total (100 %) o parcial de la actividad, por ejemplo, una reducción del 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o superior de la actividad. Se pueden usar células que expresen una enzima mutante con actividad disminuida, o células derivadas de pacientes que padecen una enfermedad por depósito lisosomal, por ejemplo, una mucopolisacaridosis. Se pueden usar células modificadas de forma recombinante para desactivar o reducir la actividad de la enzima lisosomal, por ejemplo, a través de la introducción de una mutación en el gen codificante o su promotor u otra región reguladora. Se pueden usar células tratadas para reducir la actividad de la enzima lisosomal, por ejemplo, tratadas con antisentido o ARNi para reducir la expresión de la enzima.

Las enzimas adecuadas que escinden (digieren) oligosacáridos pequeños de hidratos de carbono y que son "específicas de" (es decir, que digieren predominantemente) los sustratos naturales de la enzima lisosomal pueden ser seleccionadas por los expertos en la materia. Por ejemplo, para la detección de la actividad de GALNS o GLB1 (enzimas que degradan el queratán sulfato), la enzima de la etapa (d) puede ser queratanasa II o cualquier enzima que actúe principalmente sobre el queratán sulfato. Como otro ejemplo, para la detección de IDU, ARSB, IDS o GUSB (las enzimas que degradan el sulfato de dermatán), la enzima de la etapa (d) puede ser condroitinasa ABC o cualquier enzima que actúe principalmente sobre el sulfato de dermatán. Como otro ejemplo, para la detección de IDU, IDS, SGHS, G6S o GUSB (las enzimas que degradan el sulfato de heparano), la enzima de la etapa (d) puede ser heparanasa I o heparanasa II, o ambas. Como otro ejemplo más, para la detección de GAA (una enzima que degrada el glicógeno), la enzima de la etapa (d) puede ser α-amilasa o cualquier enzima que actúa principalmente en el glicógeno.

Este método basado en células es capaz de tener una gran sensibilidad en la detección de la actividad de la enzima lisosomal. En algunas realizaciones, la actividad de la enzima lisosomal es detectable cuando la concentración de enzima lisosomal es tan baja como de aproximadamente 10 nM, o aproximadamente 5 nM, o aproximadamente 1 nM, o aproximadamente 0,75 nM, o aproximadamente 0,5 nM, o aproximadamente 0,25 nM, o aproximadamente 0,1 nM, o aproximadamente 0,05 nM, o aproximadamente 0,01 nM, o aproximadamente 0.005 nM, o aproximadamente 1 pM, o aproximadamente 0,5 pM.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 describe la secuencia de nucleótidos del factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano (SEQ ID NO: 1).

La Figura 2 describe la secuencia de nucleótidos del factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano (SEQ ID NO: 2).

La Figura 3 describe la secuencia de nucleótidos de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana (SEQ ID NO: 3).

La Figura 4 describe la secuencia de nucleótidos de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana (SEQ ID NO: 4). El péptido señal de 26 aminoácidos en el extremo N-terminal está ausente en la GALNS procesada.

La Figura 5 representa la estructura y las características de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana procesada.

La Figura 6 muestra la expresión de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana de células G71S cotransfectadas con factor de modificación 1 de sulfatasas(SUMF1) humano y con vectores de expresión de GALNS humana. (A) Exploración del clon G71S en busca de GALNS activa en 96 pocillos. (B) Productividad de GALNS del clon G71S en picogramos por célula al día.

La Figura 7 ilustra un esquema del controlador del biorreactor WAVE usado para la producción a gran escala de células G71S que expresan la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana y variantes de la misma.

La Figura 8 muestra la estabilidad de la actividad de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana purificada tras el almacenamiento a 4 ºC (diamantes) o a -70 ºC (triángulos).

La Figura 9 muestra la purificación de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana mediante (A) cromatografía de flujo rápido Blue Sepharose 6 seguido de cromatografía (B) cromatografía Fractogel SE Hi-CAP. La pureza se determinó mediante tinción con azul de Coomassie de SDS-PAGE (izquierda) y mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-GALNS (IVA) (derecha).

La Figura 10 muestra la purificación de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana mediante ultrafiltración/diafiltración (UF/DF), cromatografía Fractogel SE Hi-Cap, cromatografía Sepharose quelante de Zn y cromatografía ToyoPearl Butyl 650M. La pureza se determina mediante tinción de azul de Coomassie de SDS

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PAGE (parte superior izquierda) y mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-GALNS (parte superior derecha), un anticuerpo anti-catepsina L (parte inferior izquierda) y un anti-CHOP (proteínas de células de ovario de hámster chino (parte inferior derecha). La Figura 11 muestra una reducción dependiente de la dosis en la cantidad de sustrato de sulfato de dermatán observada en las células GM01391 tratadas con IDU.

La Figura 12 muestra una reducción dependiente de la dosis en la cantidad de sustrato de sulfato de dermatán observada en las células GM00519 tratadas con ARSB.

La Figura 13 muestra la absorción de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana, ya sea sin marcar (círculos) o conjugada con A488 (cuadrados) o A555 (triángulos), por sinoviocitos cultivados.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de un método que reconcilia la necesidad de fabricar a gran escala enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes con la necesidad de obtener un producto de enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada, activa, que sea eficaz en lisosomas diana y que sea por tanto terapéuticamente eficaz.

La eficacia terapéutica de un preparado de enzima lisosomal depende del nivel de manosa-6-fosfato de dicho preparado. El fosfato se añadió a la glicoproteína diana mediante una modificación posterior a la traducción en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi temprano. Las enzimas lisosomales plegadas muestran un determinante terciario único que es reconocido por una enzima de modificación de oligosacáridos. El determinante se compone de un conjunto de lisinas espaciadas específicamente y se encuentra en la mayoría de las enzimas lisosomales a pesar de la ausencia de homología de secuencia primaria. La enzima de modificación, UDP-GlcNAc fosfotransferasa, se une al determinante proteico y añade GIcNAc-1-fosfato a la posición 6 de los restos de manosa terminales en los oligosacáridos próximos al sitio de unión; a continuación, una segunda enzima, la fosfodiéster α-GlcNAcasa, escinde el enlace de GlcNAc-fosfato para dar un oligosacárido terminal de manosa-6-fosfato (Canfield et al., patente de EE.UU. nº 6.537.785). El fin de la modificación de manosa-6-fosfato es desviar las enzimas lisosomales de la vía secretora hacia la vía lisosomal dentro de la célula. La enzima portadora de manosa-6-fosfato está unida por la MPR en el aparato de Golgi trans y se encamina a los lisosomas en lugar de la superficie celular.

Además de la presencia del marcador de manosa-6-fosfato en los oligosacáridos de enzimas lisosomales, el encaminamiento lisosomal de las enzimas depende de la acidificación de los endosomas de tráfico emergentes del extremo de la pila de Golgi trans. La inactivación química del entorno ácido dentro de estos endosomas con moléculas básicas difusibles da lugar a la devolución de los contenidos vesiculares, incluyendo las enzimas lisosomales, en el medio extracelular (Braulke et al., Eur. J. Cell Biol. 43(3): 316-321, 1987). La acidificación requiere una ATPasa vacuolar específica embebida dentro de la membrana del endosoma (Nishi et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(2): 94-103, 2002). Se espera que la insuficiencia de esta ATPasa potencie la secreción de enzimas lisosomales a expensas del encaminamiento lisosomal. Cabría esperar que las líneas celulares de fabricación que portan defectos en la ATPasa vacuolar evitaran el desvío no productivo de la enzima recombinante fosforilada hacia el compartimento lisosomal intracelular.

En 1984, se generaron y se caracterizaron mutantes de células de ovario de hámster chino (CHO) específicamente defectuosas en la acidificación endosomal (Park et al., Somat. Cell Mol. Genet. 17(2): 137-150, 1991). Se sometieron las células CHO-K1 a mutagénesis químicamente y se seleccionaron para la supervivencia a temperaturas elevadas en presencia de toxinas. Estas toxinas requerían la acidificación endosomal para la plena expresión de su letalidad (Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984). En el primer estudio, se escogió un cóctel de dos toxinas con diferentes mecanismos de acción para evitar la selección de la resistencia específica de la toxina. El principio es que aunque la probabilidad de mutaciones fortuitas que producen resistencia a una toxina particular es pequeña, la probabilidad de dos mutaciones fortuitas simultáneas específicas para dos toxinas totalmente diferentes no existe. Las selecciones se llevaron a cabo a temperatura elevada para permitir mutaciones sensibles a la temperatura. Esta selección genética dio lugar a dos mutantes, uno de los cuales fue designado G.7.1 (G71), que eran resistentes a las toxinas a temperaturas elevadas. La lesión en G71 no se debió a la absorción ni al mecanismo de acción de las dos toxinas, sino que se debió a la incapacidad del clon para acidificar los endosomas a temperaturas elevadas. Dicha incapacidad también fue evidente a temperaturas permisivas (34 ºC), aunque en menor medida. También se encontraron células G71 autotróficas para el hierro a temperaturas elevadas, a pesar de la absorción normal de la transferrina del medio (Timchak et al., J. Biol. Chem. 261(30): 14154-14159, 1986). Puesto que el hierro solo se liberó de la transferrina a un pH bajo, la auxotrofia para el hierro a pesar de la absorción normal de transferrina indicó una insuficiencia en la acidificación del endosoma. Otro estudio demostró que el defecto de acidificación se manifestó principalmente en los endosomas en lugar de los lisosomas (Stone et al., J. Biol. Chem. 262(20): 9883-9886, 1987). Los datos sobre G71 coincidieron con la conclusión de que una mutación dio lugar a la desestabilización de la ATPasa vacuolar responsable de la acidificación endosomal. La desestabilización fue más evidente a temperaturas elevadas (39,5 ºC), pero se expresó parcialmente incluso a temperaturas más bajas (34 ºC). Un estudio del tráfico de dos enzimas lisosomales endógenas, la catepsina D y la alfa-glucosidasa, en células G71 (Park et al., Somat. Cell Mol. Genet. 17(2): 137-150, 1991) demostró que ambas enzimas se secretaron

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cuantitativamente a temperaturas elevadas, y la glicosilación de las enzimas no se vio afectada. La secreción de la alfa-glucosidasa ácida fosforilada fue significativamente superior a las temperaturas no permisivas.

La eficacia terapéutica de un preparado de enzima sulfatasa lisosomal no solo depende del nivel de manosa-6fosfato, sino que también depende de la presencia de enzima activa en dicho preparado. Todas las sulfatasas conocidas contienen un resto de cisteína en su sitio catalítico; este resto de cisteína es modificado después de la traducción a Cα-formilglicina (FGIy) para activar la enzima. Esta activación de la enzima después de la traducción de cisteína en FGIy, que es catalizada por el factor de modificación 1 de sulfatasas(SUMF1), se produce en el retículo endoplasmático en sulfatasas desplegadas inmediatamente después de la traducción, antes de la dirección de las sulfatasas al lisosoma (Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:11963-11968, 1997). La importancia de esta modificación posterior a la traducción única se pone de relieve por el hecho de que las mutaciones en SUMF1, que dan lugar a la formación de FGIy insuficiente en las enzimas sulfatasas lisosomales, causan deficiencia múltiple de sulfatasa (MSD) en el ser humano (Diez-Ruiz et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6: 355-379, 2005).

Por lo tanto, la capacidad de las células G71, células CHO mutantes que son defectuosas en la acidificación endosomal, para expresar conjuntamente la enzima modificadora de sulfatasa (SUMF1) humana recombinante y una enzima sulfatasa lisosomal humana proporciona un mecanismo para la producción a gran escala de recombinante enzimas sulfatasas lisosomales humanas recombinantes altamente fosforiladas activas útiles para el tratamiento de trastornos por depósito lisosomal causados por o asociados con una deficiencia de dichas enzimas sulfatasas lisosomales.

I. DEFINICIONES

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos usados en la presente invención: Singleton et al., “DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY” (2ª ed. 1994); “THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY” (Walker ed., 1988); “THE GLOSSARY OF GENETICS”, 5ª ED., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, “THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY” (1991).

Cabe señalar en el presente documento que, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y “ella” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usan en el presente documento, los siguientes términos y expresiones tienen los significados que se les atribuyen a no ser que se especifique lo contrario.

La expresión "variante alélica" se refiere a cualquiera de dos o más formas polimórficas de un gen que ocupan el mismo locus genético. Las variaciones alélicas se presentan naturalmente por mutación, y pueden dar lugar a polimorfismos fenotípicos dentro de poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (es decir, sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. La expresión "variantes alélicas" también se refiere a ADNc derivados de transcripciones de ARNm de variantes alélicas genéticas, así como de las proteínas codificadas por los mismos.

El término "amplificación" se refiere a cualquier medio mediante el que se copia una secuencia polinucleótida, y por lo tanto, se la expande en un número más grande de moléculas polinucleótidas, por ejemplo, mediante transcripción inversa, reacción en cadena de la polimerasa y reacción en cadena de la ligasa.

Una primera secuencia es una "secuencia antisentido" con respecto a una segunda secuencia si un polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia se híbrida específicamente con un polinucleótido cuya secuencia es la segunda secuencia.

“ADNc” se refiere a un ADN que es complementario o idéntico a un ARNm, en forma mono o bicatenaria.

La anotación convencional se usa en el presente documento para describir secuencias de polinucleótidos: el extremo izquierdo de una secuencia de polinucleótido monocatenaria es el extremo 5'; el sentido hacia la izquierda de una secuencia de polinucleótido bicatenaria se refiere a la dirección 5'. El sentido de la adición de 5' a 3' de nucleótidos a productos de la transcripción de ARN nacientes se denomina la dirección de la transcripción. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina "cadena codificante"; las secuencias de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que un ARNm transcrito a partir de ese ADN y que están situadas 5' con respecto al extremo 5' del producto de la transcripción de ARN se denominan "secuencias cadena arriba"; las secuencias de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están 3' con respecto al extremo 3' del producto de transcripción de ARN codificante se denominan "secuencias cadena abajo”.

El término "complementario" se refiere a la compatibilidad topológica o al apareamiento entre sí de superficies

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interactivas de dos polinucleótidos. Así pues, las dos moléculas pueden describirse como complementarias, y además, las características de las superficies de contacto son complementarias entre sí. Un primer polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es idéntica a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido pareja de unión del segundo polinucleótido. Por lo tanto, el polinucleótido cuya secuencia 5'-TATAC-3' es complementaria a un polinucleótido cuya secuencia es 5'-GTATA-3'. Una secuencia de nucleótidos es "esencialmente complementaria" a una secuencia de nucleótidos de referencia si la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos en cuestión es esencialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia.

La expresión "sustitución conservativa" se refiere a la sustitución efectuada en un polipéptido de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente similar. Cada uno de los siguientes seis grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

El término "fragmento", cuando se usa en referencia a polipéptidos, se refiere a polipéptidos que son más cortos que el polipéptido de longitud completa en virtud de truncamiento ya sea en el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína o en ambos, y/o por la eliminación de una parte interna o la región de la proteína. Los fragmentos de un polipéptido se pueden generar mediante métodos conocidos en la técnica.

El término "mutante", cuando se usa en referencia a polipéptidos, se refiere a polipéptidos en los que uno o más aminoácidos de la proteína se han sustituido con un aminoácido diferente. La sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservativa, tal como se ha definido anteriormente, o puede ser una sustitución no conservativa. Los polipéptidos mutantes se pueden generar mediante métodos conocidos en la técnica.

El término "derivado", cuando se usa en referencia a polipéptidos, se refiere a polipéptidos modificados químicamente mediante técnicas, por ejemplo y sin limitación, tales como la ubiquitinación, el marcaje (por ejemplo, con radionúclidos o diversas enzimas), la unión del polímero covalente tal como la pegilación (es decir, la derivatización con polietilenglicol) y la inserción o sustitución mediante síntesis química de aminoácidos tales como ornitina, que normalmente no se producen en las proteínas humanas. Los polipéptidos derivados se pueden generar mediante métodos conocidos en la técnica.

El término "derivado", cuando se usa en referencia a las líneas celulares, se refiere a líneas celulares que son descendientes de la línea de células madre; por ejemplo, este término incluye células que han sido sometidas a pases o subclonadas a partir de células madre y que conservan la propiedad deseada, descendientes de la línea de células madre que se han mutado y seleccionado para la conservación de la propiedad deseada, y descendientes de la línea de células madre que se han modificado para contener diferentes vectores de expresión o diferentes ácidos nucleicos añadidos exógenamente.

El término "detección" se refiere a determinar la presencia, ausencia o cantidad de un analito en una muestra, y puede incluir la cuantificación de la cantidad del analito en una muestra o por célula en una muestra.

La expresión "fracción detectable" o el término "marcador" se refieren a una composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen 32P, 35S, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como las que se usan comúnmente en un ELISA), biotina-estreptavidina, dioxigenina, haptenos y proteínas para los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales, o moléculas de ácido nucleico con una secuencia complementaria a una diana. La fracción detectable suele generar una señal medible, tal como una señal radiactiva, cromogénica o fluorescente, que se puede usar para cuantificar la cantidad de fracción detectable unida de una muestra. La fracción detectable se puede incorporar o unir a un cebador o una sonda bien de forma covalente, o a través de enlaces iónicos, van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo, la incorporación de nucleótidos radiactivos, o nucleótidos biotinilados que son reconocidos por la estreptavadina. La fracción detectable puede ser directa o indirectamente detectable. La detección indirecta puede implicar la unión de una segunda fracción detectable directa

o indirectamente a la fracción detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser el ligando de una pareja de unión, tal como biotina, que es una pareja de unión para la estreptavidina, o una secuencia de nucleótidos, que es la pareja de unión para una secuencia complementaria, a la que puede hibridarse específicamente. La pareja de unión puede ser en sí misma directamente detectable, por ejemplo, se puede marcar un anticuerpo con una molécula fluorescente. La pareja de unión también puede ser indirectamente detectable, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria puede ser parte de una molécula de ADN ramificada que, a su vez, es detectable a través de la hibridación con otras moléculas de ácidos nucleicos marcadas. (Véase, por ejemplo, Fahrlander et al., Bio/Technology 6: 1165, 1988). La cuantificación de la señal se obtiene, por ejemplo,

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mediante recuento de centelleo, densitometría o citometría de flujo.

El término "diagnóstico" significa identificar la presencia o naturaleza de una afección patológica. Los métodos de diagnóstico difieren en cuanto a su especificidad y selectividad. Si bien es posible que un método de diagnóstico particular no proporcione un diagnóstico definitivo de una afección, basta con que el método proporcione una indicación positiva que ayude en el diagnóstico.

La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una dosis suficiente para producir un efecto deseado sobre un estado de salud, patología y enfermedad de un sujeto, o para fines de diagnóstico. El resultado deseado puede comprender una mejoría subjetiva u objetiva en el receptor de la dosis. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a aquella cantidad de un agente que es eficaz para producir el efecto beneficioso deseado sobre la salud.

La expresión "que codifica" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos de un polinucleótido, tales como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen ya sea una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Así pues, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm producido por ese gen producen la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, la secuencia de nucleótidos de la que es idéntica a la secuencia de ARNm se proporciona normalmente en listados de secuencias, y la cadena no codificante, usada como molde para la transcripción, de un gen o ADNc se puede decir que codifica la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones.

La expresión "dosis equivalente" se refiere a una dosis que contiene la misma cantidad de agente activo.

La expresión "secuencia de control de la expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que regula la expresión (transcripción y/o traducción) de una secuencia de nucleótidos ligada operativamente a la misma. La expresión "ligada operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos partes en la que la actividad de una parte (por ejemplo, la capacidad de regular la transcripción) da lugar a una acción sobre la otra parte (por ejemplo, la transcripción de la secuencia). Las secuencias de control de la expresión pueden incluir, por ejemplo y sin limitación, secuencias de promotores (por ejemplo, inducibles o constitutivos), potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (es decir, un ATG), señales de corte y empalme para intrones y codones de detención.

La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión ligadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que debe ser expresada. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; se pueden suministrar otros elementos para la expresión por parte de la célula hospedadora o por el sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los que se conocen en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que llevan incorporados el polinucleótido recombinante.

Las expresiones "altamente fosforilada", "alto nivel de fosforilación" y "alto nivel de oligosacáridos fosforilados" se refieren a preparados de enzimas sulfatasas lisosomales en las que al menos el 50 % de la enzima sulfatasa lisosomal se une al receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes a través de oligosacáridos fosforilados. La unión se caracteriza además por la sensibilidad a la competencia con manosa-6-fosfato. Una enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada también puede referirse a una enzima sulfatasa lisosomal con al menos 0,25, preferentemente al menos 0,5 y más preferentemente al menos 0,75 cadenas de oligomanosa bis-fosforiladas por cadena de proteína.

La expresión "cadenas de oligomanosa bis-fosforiladas", como se usa en el presente documento, se refiere a cadenas de oligosacáridos que contienen manosa de que están ligadas en N a restos de asparagina en las enzimas sulfatasas lisosomales y que comprenden dos restos de manosa-6-fosfato. Por lo general, las cadenas de oligomanosa bis-fosforiladas tienen 7 restos de manosa, es decir, bis-fosfato manosa 7 (BPM7), que están enlazados a dos restos de GlcNAc, que, a su vez, están enlazados al resto de asparagina en la enzima sulfatasa lisosomal.

Los términos "activo/a" y "activado/a", y la expresión "alto nivel de activación" se refieren a preparados de enzimas sulfatasas lisosomales en los que al menos el 50 %, preferentemente al menos el 70 %, más preferentemente al menos el 90 % e incluso más preferentemente al menos el 95 % del resto de cisteína del sitio activo de la proteína se ha modificado después de la traducción a Cα-formilglicina (FGIy).

La expresión "altamente fosforilada activa" se refiere a se refiere a preparados de enzimas sulfatasas lisosomales en los que al menos el 50 %, preferentemente al menos el 70 %, más preferentemente al menos el 90 % e incluso más preferentemente al menos el 95 % de los restos de cisteína del sitio activo de la proteína se ha modificado después

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algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Match. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 85: 2444, 1988, mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante examen visual.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos por pares, progresivos, para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. También representa un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360, 1987. El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153, 1989. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de

5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación se alinea con la siguiente secuencia más relacionada o agrupación de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias se alinean mediante una simple extensión de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue mediante una serie de alineamientos por pares, progresivos. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácido o nucleótido de las regiones de comparación de secuencias y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, se puede comparar una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencia usando los siguientes parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos terminales ponderados. Otro algoritmo que es útil para generar múltiples alineaciones de secuencias es Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994).

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que bien coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Estos aciertos de la palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar los HSP más largos que los contienen. Los aciertos de palabras se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mediante lo que se puede aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más de las alineaciones de restos puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 89: 10915, 1989).

Además de calcular el porcentaje de la identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU.

90: 5873-5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P (N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01 y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son esencialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo de forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Así pues, un polipéptido normalmente es esencialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos solo difieren en sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son esencialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe en el presente documento.

La expresión "esencialmente puro/a" o el término "aislado/a" significan que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar, más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual presente en la composición) y una fracción esencialmente purificada es una composición en la que la

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especie objeto comprende por lo menos aproximadamente el 50 % (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composición esencialmente pura significa que aproximadamente del 80 % al 90 % o más de la especie macromolecular presente en la composición es la especie purificada de interés. La especie objeto es purificada hasta su homogeneidad esencial (no es posible detectar especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales) si la composición consiste esencialmente en especies macromoleculares individuales. Las especies solventes, las moléculas pequeñas (< 500 Daltons), los agentes estabilizantes (por ejemplo, BSA) y las especies de iones elementales no se consideran especies macromoleculares para los fines de la presente definición. En algunas realizaciones, las enzimas sulfatasas lisosomales de la invención están esencialmente puras o aisladas con respecto a los materiales de partida macromoleculares usados en su síntesis. En alguna realización, la composición farmacéutica de la invención comprenden una enzima sulfatasa lisosomal terapéutica esencialmente purificada o aislada mezclada con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos o síntomas de patología a los efectos de reducir o eliminar estos signos o síntomas. Los signos o síntomas pueden ser bioquímicos, celulares, histológicos, funcionales, subjetivos u objetivos. Las enzimas sulfatasas lisosomales de la invención pueden administrarse como un tratamiento terapéutico o de diagnóstico.

La expresión "índice terapéutico" se refiere a un intervalo de dosis (cantidad y/o momento) por encima de la cantidad terapéutica mínima y por debajo de una cantidad inaceptablemente tóxica.

"Tratamiento" se refiere a tratamiento profiláctico o a tratamiento terapéutico o a tratamiento de diagnóstico.

La expresión "forma de dosificación unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de enzima sulfatasa lisosomal de la presente invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las especificaciones para las nuevas formas de dosificación unitarias de la presente invención dependen de la enzima sulfatasa lisosomal empleada en particular y del efecto por conseguir, y la farmacodinámica asociada con cada enzima sulfatasa lisosomal en el hospedador.

II. PRODUCCIÓN DE ENZIMAS SULFATASAS LISOSOMALES

En el presente documento, se muestra un nuevo método de producción de enzimas sulfatasas lisosomales altamente fosforiladas activas en cantidades que permiten el uso terapéutico de dichas enzimas. En general, el método incluye la transformación de una línea celular adecuada con el ADNc codificante del factor de modificación 1 de sulfatasas(SUMF1) humano o un fragmento biológicamente activo, mutante, variante o derivado del mismo y un ADNc codificante de la enzima sulfatasa lisosomal de longitud completa o un fragmento biológicamente activo, mutante, variante o derivado de la misma. Los expertos en la materia pueden preparar construcciones de expresión distintas de las que se describen expresamente en el presente documento para la producción óptima de dichas enzimas sulfatasas lisosomales en líneas celulares transfectadas adecuadas. Por otra parte, los expertos en la materia pueden diseñar fácilmente fragmentos de ADNc codificante de fragmentos biológicamente activos, variantes, mutantes o derivados del SUMF1 o de las enzimas sulfatasas lisosomales de origen natural que poseen una actividad biológica igual o similar a la de las enzimas de longitud completa de origen natural.

Células hospedadoras

Las células hospedadoras usadas para producir enzimas sulfatasas lisosomales recombinantes son líneas celulares de acidificación endosomal deficiente que se caracterizan por su capacidad para producir dichas enzimas sulfatasas lisosomales en cantidades que permitan el uso de la enzima terapéuticamente. La invención proporciona una línea celular de grupo de complementación END3, derivada de CHO-K1, designada G71. La invención también proporciona una línea celular G71 que se ha adaptado para el crecimiento en cultivo en suspensión exento de suero, designada G71S. La invención también proporciona derivados de las líneas celulares G71 y G71S que se han subclonado más o que contienen diferentes plásmidos de expresión.

Las células que contienen y expresan ADN o ARN que codifica una proteína recombinante se denominan en el presente documento células genéticamente modificadas. Las células de mamífero que contienen y expresan ADN o ARN codificante de la proteína recombinante se denominan células de mamífero genéticamente modificadas. La introducción del ADN o ARN en las células es mediante un método de transfección conocido, tal como, por ejemplo y sin limitación, electroporación, microinyección, bombardeo de microproyectiles, precipitación con fosfato de calcio, precipitación con fosfato de calcio modificado, tratamiento con lípidos catiónicos, fotoporación, metodologías de fusión, transferencia mediada por receptor o precipitación con polibreno. Como alternativa, el ADN o ARN se pueden introducir mediante la infección con un vector vírico. Los métodos de producción de células, incluyendo células de mamífero, que expresan ADN o ARN codificante de una proteína recombinante se describen en las solicitudes de patente de EE.UU. en trámite junto con la presente con n.º de serie 08/334.797, titulada “In Vivo Protein Production and Delivery System for Gene Therapy", de Richard F. Selden, Douglas A. Treco y Michael W. Heartlein (presentada

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como se describe en el presente documento, mediante la detección del producto de expresión. Por ejemplo, las células de mamífero que expresan enzimas sulfatasas lisosomales altamente fosforiladas activas se pueden identificar mediante un inmunoensayo enzimático de tipo sándwich. Los anticuerpos se pueden dirigir hacia la parte de agente activo.

Variantes de enzimas sulfatasas lisosomales

En ciertas realizaciones, se pueden preparar mutantes o variantes de enzimas GALNS altamente fosforiladas activas, y serán útiles en una variedad de aplicaciones en las que se pueden usar enzimas GALNS altamente fosforiladas activas. Los mutantes o las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido pueden ser, mutantes o variantes por sustitución, inserción o eliminación. Los mutantes o variantes por eliminación carecen de uno o más restos de la proteína nativa que no son esenciales para la función o la actividad inmunogénica. Un tipo común de mutante o variante por eliminación es aquel que carece de secuencias de señales secretoras o secuencias señal que dirigen a una proteína a unirse a una determinada parte de una célula. Los mutantes o variantes por inserción normalmente implican la adición de material en un punto no terminal del polipéptido. Esto puede incluir la inserción de un epítopo inmunoreactivo o simplemente un único resto. Las adiciones terminales, también denominadas proteínas de fusión, se describen a continuación.

Las variantes pueden ser esencialmente homólogas o esencialmente idénticas a la enzima sulfatasa lisosomal no modificada según lo establecido anteriormente. Las variantes preferidas son aquellas que son variantes de un polipéptido enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada activa que conserva al menos algo de la actividad biológica, por ejemplo, la actividad sulfatasa, de la enzima sulfatasa lisosomal. Otras variantes preferidas incluyen variantes de un polipéptido N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa humano que conservan al menos algo de la actividad de sulfatasa de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa humana.

Las mutantes o variantes por sustitución normalmente tienen intercambiado un aminoácido del polipéptido de tipo silvestre por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y se pueden diseñar para modular una o más propiedades del polipéptido tales como, por ejemplo y sin limitación, la estabilidad frente a la escisión proteolítica, sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones de este tipo son preferentemente conservativas, es decir, un aminoácido se sustituye con uno de forma y carga similares. Las sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica, e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina.

Un aspecto de la presente invención contempla la generación de mutantes o variantes del sitio de glicosilación en las que se ha mutado el sitio de glicosilación ligado a N de la enzima sulfatasa lisosomal. Dichos mutantes o variantes aportarán importante información relativa a la actividad biológica, la estructura física y el potencial de unión al sustrato de la enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada activa. En aspectos particulares, se contempla que es posible generar otros mutantes o variantes del polipéptido enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada activa que conserven la actividad biológica, pero que tengan actividad de unión al sustrato aumentada o reducida. Como tales, las mutaciones del sitio activo o de la región catalítica se contemplan particularmente con el fin de generar mutantes o variantes de proteínas con la actividad de unión al sustrato modificada. En dichas realizaciones, se comparó la secuencia de la enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada activa con la de las otras enzimas relacionadas, mutándose específicamente restos seleccionados.

Numerando los aminoácidos de la proteína madura desde el extremo amino terminal putativo como aminoácido número 1, las mutaciones ilustrativas que pueden ser útiles incluyen, por ejemplo, la sustitución de todas o algunas asparaginas potencialmente glicosiladas, incluyendo las posiciones 178 y 397 de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana recombinante (véase la Figura 5).

La unión al sustrato se puede modificar mediante mutaciones en/cerca del sitio activo de la enzima sulfatasa lisosomal. Teniendo en cuenta que dichas mutaciones son ilustrativas, los expertos en la materia reconocerán que se pueden realizar otras mutaciones de la secuencia de la enzima para proporcionar información estructural y funcional adicional sobre esta proteína y su actividad.

Para construir mutantes o variantes tales como las descritas anteriormente, un experto en la materia puede emplear tecnologías convencionales bien conocidas. En concreto, se contemplan las eliminaciones N-terminales, eliminaciones C-terminales, eliminaciones internas, así como la mutagénesis al azar y puntual.

Las eliminaciones N-terminales y C-terminales son formas de mutagénesis de eliminación que se aprovechan, por ejemplo, de la presencia de un sitio de restricción único adecuado cerca de la región C-o N-terminal. El ADN se escinde en el sitio y los extremos cortados son degradados mediante nucleasas tales como BAL31, exonucleasa III, DNasa I y nucleasa S1. La reunión de los dos extremos produce una serie de ADN con eliminaciones de tamaño variable alrededor del sitio de restricción. Las proteínas expresadas a partir de dicho mutante se pueden ensayar

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para determinar la función biológica apropiada, por ejemplo, la actividad enzimática, usando técnicas convencionales en la materia, y descritas en la memoria descriptiva. Se pueden emplear técnicas similares para los mutantes de eliminación internos mediante el uso de dos sitios de restricción convenientemente colocados, permitiendo de esta manera que se pueda realizar una eliminación definida con precisión, y los extremos se vuelven a ligar como antes.

También se contemplan mutantes de digestión parcial. En dichos casos, un experto en la materia emplearía un "cortador frecuente" que corte el ADN en numerosos lugares en función de la duración de la reacción. Por lo tanto, mediante la variación de las condiciones de reacción será posible generar una serie de mutantes de tamaño variable, que se puedan examinar después para determinar la actividad.

También se puede realizar una mutación por inserción al azar mediante el corte de la secuencia de ADN con una DNasa I, por ejemplo, y la inserción de un tramo de nucleótidos codificante de 3, 6, 9, 12, etc., aminoácidos y la religación del extremo. Una vez realizada dicha mutación, se pueden explorar los mutantes para detectar diversas actividades presentadas por la proteína de tipo silvestre.

La mutagénesis puntual también se puede emplear para identificar, en particular, qué restos de aminoácidos son importantes en determinadas actividades asociadas a la actividad biológica de la enzima sulfatasa lisosomal. Por lo tanto, un experto en la materia será capaz de generar cambios de una sola base de la cadena de ADN para dar lugar a un codón modificado y a una mutación de sentido erróneo.

Los aminoácidos de una determinada proteína se pueden modificar para crear una molécula equivalente, o incluso mejorada, de segunda generación. Dichas alteraciones contemplan la sustitución de un aminoácido dado de la proteína sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión al antígeno de anticuerpos o sitios de unión a moléculas de sustrato o receptores. Dado que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define esa actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteína, y su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtenerse una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, se pueden realizar varios cambios en las secuencias de ADN de genes sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica, como se describe más adelante.

Al hacer dichos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. Cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en su hidrofobicidad y características de carga (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol., 157(1):105-132, 1982). En general, los aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tengan un índice o valor hidropático similar y que sigan generando una proteína con actividad biológica similar, es decir, que todavía se obtenga una proteína funcionalmente biológica.

Además, se puede realizar la sustitución de aminoácidos similares eficazmente basándose en la hidrofilidad. La patente de EE.UU. n.º 4.554.101 afirma que la mayor hidrofilidad media local de una proteína, que se rige por la hidrofilidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como tal, se puede sustituir un aminoácido con otro que tenga un valor de hidrofilidad similar, y seguir obteniéndose una proteína biológicamente equivalente e inmunológicamente equivalente.

Las sustituciones de aminoácidos ilustrativas que pueden usarse en el presente contexto de la invención incluyen, pero sin limitación, el intercambio de arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Otras de dichas sustituciones que tienen en cuenta la necesidad de la conservación de parte o la totalidad de la actividad biológica, mientras se modifica la estructura secundaria de la proteína serán bien conocidas por los expertos en la materia.

Otro tipo de variante que se contempla para la preparación de los polipéptidos de acuerdo con la invención es el uso de miméticos de péptidos. Los miméticos son moléculas que contienen péptidos que imitan a los elementos de la estructura secundaria de las proteínas. Véase, por ejemplo, Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" en BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman y Hall, Nueva York (1993). La razón que subyace al uso de miméticos de péptidos es que la cadena principal peptídica de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos con el fin de facilitar las interacciones moleculares, tales como las de anticuerpo y antígeno. Se espera que un mimético de péptido permita interacciones moleculares similares a la molécula natural. Estos principios pueden usarse, junto con los principios descritos anteriormente, para diseñar moléculas de segunda generación que tengan muchas de las propiedades naturales de las enzimas sulfatasas lisosomales, pero con características modificadas e incluso mejoradas.

Glicosilación modificada de enzimas sulfatasas lisosomales

También se pueden producir variantes de una enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada activa que tengan un patrón de glicosilación modificado en relación con el polipéptido precursor, por ejemplo, eliminando una o más

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fracciones de hidratos de carbono, y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido nativo.

La glicosilación normalmente está ligada a N o a O. la expresión “ligada a N” se refiere a la unión de la fracción de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido a excepción de prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. La presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. Por lo tanto, se pueden añadir sitios de glicosilación ligada a N a un polipéptido mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o más de estas secuencias tripeptídicas. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Los sitios de glicosilación ligada a O se pueden añadir mediante la inserción o sustitución de uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del polipéptido inicial.

Conmutación de dominios

Diversas partes de proteínas de enzima sulfatasa lisosomal poseen una gran cantidad de homología de secuencia. Las mutaciones se pueden identificar en polipéptidos de enzimas sulfatasas lisosomales que pueden alterar su función. Estos estudios son potencialmente importantes al menos por dos razones. En primer lugar, proporcionan una expectativa razonable de que todavía pueden existir otros homólogos, variantes alélicas y mutantes de este gen en especies relacionadas, tales como rata, conejo, mono, gibón, chimpancé, mono, babuino, vaca, cerdo, caballo, oveja y gato. Tras el aislamiento de estos homólogos, variantes y mutantes, y en combinación con otros análisis, se pueden identificar ciertos dominios activos o funcionales. En segundo lugar, esto proporcionará un punto de partida para el posterior análisis mutacional de la molécula como se ha descrito anteriormente. Una forma de aprovechar esta información está en la "conmutación de dominios"

La conmutación de dominios implica la generación de moléculas recombinantes usando polipéptidos diferentes pero relacionados. Por ejemplo, mediante la comparación de la secuencia de una enzima sulfatasa lisosomal, por ejemplo, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa, con la de una enzima sulfatasa lisosomal similar a partir de otra fuente y con mutantes y variantes alélicas de estos polipéptidos, se pueden hacer predicciones en cuanto a las regiones funcionalmente significativas de estas moléculas. Es posible, entonces, cambiar dominios relacionados de estas moléculas en un esfuerzo para determinar la criticidad de estas regiones para la función y los efectos de la enzima en los trastornos por depósito lisosomal. Estas moléculas pueden tener el valor adicional de que estas "quimeras" se pueden distinguir de las moléculas naturales, mientras que, posiblemente, proporcionan la misma o incluso una mejor función.

Basándose en las numerosas enzimas sulfatasas lisosomales que se están identificando ahora, se añadirá un nuevo análisis de las mutaciones y de sus efectos previstos sobre la estructura secundaria a esta comprensión. Se contempla que los mutantes que cambian dominios entre las enzimas sulfatasas lisosomales proporcionarán información útil sobre las relaciones de estructura/función de estas moléculas y los polipéptidos con los que interactúan.

Proteínas de fusión

Además de las mutaciones descritas anteriormente, la presente invención contempla además la generación de un tipo especializado de la variante de inserción conocida como una proteína de fusión. Esta molécula generalmente tiene toda o una parte sustancial de la molécula nativa, unida por el extremo N-o C-terminal, a la totalidad o una parte de un segundo polipéptido. Por ejemplo, las fusiones normalmente emplean secuencias líder de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en un hospedador heterólogo. Otra fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un epítopo de anticuerpo, para facilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un sitio de escisión en o cerca de la unión de fusión facilitará la eliminación del polipéptido foráneo después de la purificación. Otras fusiones útiles incluyen la unión de dominios funcionales, tales como sitios activos de enzimas, dominios de glicosilación, señales de dirección celular o regiones transmembrana.

Existen varios sistemas de expresión de proteínas de fusión disponibles en el mercado que se pueden usar en la presente invención. Los sistemas particularmente útiles incluyen, pero sin limitación, el sistema de glutatión Stransferasa (GST) (Pharmacia, Piscataway, NJ), el sistema de proteínas de unión a maltosa (NEB, Beverley, MA), el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), el sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Estos sistemas son capaces de producir polipéptidos recombinantes portadores de solo un pequeño número de aminoácidos adicionales, que, con poca probabilidad, afectarán a la capacidad antigénica del polipéptido recombinante. Por ejemplo, tanto el sistema FLAG como el sistema 6xHis añaden solo secuencias cortas, ambos de los cuales se sabe que son pobremente antigénicos y que no afectan adversamente al plegamiento del polipéptido a su conformación nativa. Otra fusión Nterminal que se contempla que es útil es la fusión de un dipéptido Met-Lys en la región N-terminal de la proteína o péptidos. Dicha fusión puede producir aumentos beneficiosos en la expresión o la actividad de la proteína.

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enzima y no detectable, respectivamente. El porcentaje de proteínas GALNS que contienen BPM7 se estimó en un 29 %.

Caracterización de oligosacáridos Bis7. Se determinó la ubicación de los oligosacáridos de manosa 7 bis-fosforilada (BPM7) en la GALNS. El resto de asparagina (Asn) de la posición 178 estaba glicosilado ligado a N a BPM7. El resto Asn de la posición 397 no estaba glicosilado ligado a N a BPM7, pero resultó ser azúcares de tipo predominantemente oligomanosa.

Hidroxiapatita de afinidad. Se desarrolló un modelo de hueso in vitro para determinar si la GALNS tenía la capacidad de dirigirse al hueso. Se preparó una suspensión de hidroxiapatita de grado HTP-ADN a 4 mg/ml (Bio-RAD) y se equilibró en DBS + 50 g/ml de BSA, pH 7,4. La GALNS purificada, después de la adición de 50 g/ml de BSA, se desaló en DBS, pH 7,4. La GALNS desalada, a una concentración final de aproximadamente 2 mg/ml, se diluyó en serie en DBS + 50 g/ml de BSA, pH 7,4 en una placa de 96 pocillos. Se transfirieron 50 l de la GALNS diluida en serie a placas con filtro de 96 pocillos (Millipore n.º MSGVN2210, PVDF hidrófilo, baja unión a proteínas, 22 m de tamaño de poro). Se añadieron 50 l de la suspensión de hidroxiapatita a los pocillos de la placa de filtro que contenía la GALNS diluida en serie y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC con agitación suave. La placa se sometió a filtración al vacío.

Los sobrenadantes del filtro de vacío se analizaron mediante bien HPLC o la actividad de la enzima GALNS como se ha descrito anteriormente. La GALNS purificada resultó tener una Kd de hidroxiapatita de 3-4,0 M.

La línea celular G71S que expresa el factor modificar de la sulfatasa 1 (SUMF1) humano produce enzimas sulfatasas lisosomales con mayores cantidades de activación (es decir, la conversión del resto de cisteína del sitio activo en Cα-formilglicina (FGIy)).

Para determinar si la enzima sulfatasa lisosomal recombinante purificada (por ejemplo, N-acetilgalactosamina-6sulfatasa (GALNS) humana) expresada junto con SUMF1 en las células G71S presenta un aumento de la activación, se determinó la cantidad de conversión del resto de cisteína del sitio activo en FGIy de la enzima sulfatasa lisosomal purificada.

Actividad de GALNS. Se determinó el porcentaje de activación, es decir, el porcentaje de conversión del resto de cisteína del sitio activo (Cys) en Cα-formilglicina (FGIy), de la GALNS mediante LC/MS (TFA). El TIC/1000 para Cys, FGIy y Gly resultaron ser 39, 1.840 y 183, respectivamente, lo que indica que aproximadamente el 90 % de la GALNS purificada está en una forma activa (es decir, FGIy).

Resumen. La Tabla 7 muestra un resumen de la caracterización de la GALNS recombinante expresada en células del clon 4 de G71S. La Tabla 8 muestra un resumen de la caracterización de GALNS recombinante expresada en células de clon C2 de G71S.

Tabla 7: Caracterización de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana producida del clon 4 de G71S

Categoría del ensayo: GALNS

Actividad específica: Actividad/Antígeno por ELISA: 0,165 U/mg

Actividad específica: Actividad/Proteína: 7,7 U/mg

Pureza medida por C4-RP: > 95 % (6 lotes analizados)

Tamaño medido por SEC: 115 kDa (homodímero)

Estabilidad en suero a 37 ºC: 217 horas

Absorción: Condrocitos: 4,9 nM

Absorción: Fibroblastos: 5,0 nM

Absorción: Osteoblastos: 7,8 nM

Productividad: 1,3 pg/célula/día

Título: 4,2 mg/l

Unión a la placa del receptor de M6P: 2,4 nM

Unión a la columna del receptor de M6P: % unido: 56 %

Contenido de M6P medido por CE: % hidratos de carbono totales: 29 %

Contenido de M6P: moles de M6P/moles de GALNS: 0,58

Contenido de ácido siálico medido por CE: 1 %

Afinidad de hidroxiapatito: 4 M

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10

15

20

25

30

35

40

45

50

Categoría del ensayo GALNS Activación: % de FGly 90 %

Tabla 8: Caracterización de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana producida del clon C2 de G71S

Categoría del ensayo: GALNS

Actividad específica: Actividad/Proteína: 6,4 U/mg

Pureza medida por C4-RP: 97 %

Tamaño medido por SEC: 115 kDa (homodímero)

Absorción: Fibroblastos: 3,4 nM

Título: 6,4 mg/l (4 lotes analizados)

Unión a la placa del receptor de M6P: 5,7 nM

Contenido de M6P medido por CE: % de hidratos de carbono totales: 34,5 %

Contenido de M6P: moles de M6P/moles de GALNS: 0,69

Estos resultados demuestran que la GALNS humana recombinante purificada tiene un alto nivel de activación, y altos niveles de fosforilación de manosa 6-fosfato. Así pues, las células G71S que expresan conjuntamente SUMF1 y una enzima sulfatasa lisosomal (es decir, GALNS) producen eficientemente enzima sulfatasa lisosomal altamente fosforilada activa. El aumento del nivel de restos de alto contenido de manosa sobre dichas enzimas sulfatasas lisosomales conduce a un aumento de la absorción por MPR en las células.

EJEMPLO VII

ABSORCIÓN Y ACTIVIDAD DE LA N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATASA (GALNS) HUMANA RECOMBINANTE EN CONDROCITOS DE MORQUIO IN VITRO

Se evaluó la absorción de la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana recombinante por los lisosomas de condrocitos de Morquio y la capacidad de GALNS para degradar el queratán sulfato (KS) in vitro.

Los condrocitos de pacientes con mucopolisacaridosis de tipo IVa (MPS IVa, Síndrome de Morquio) tienen una actividad de GALNS reducida y presentan la acumulación lisosomal de KS. Se estableció un modelo in vitro de MPS IVa usando condrocitos aislados de biopsias de la cresta ilíaca de un paciente con MPS IVa. Los condrocitos primarios, sin embargo, se desdiferencian y pierden sus características de condrocitos en cultivo. Por lo tanto, se establecieron las condiciones de cultivo para inducir la diferenciación de los condrocitos in vitro.

Se cultivaron condrocitos aislados de un paciente con MPS IVa, designados MQCH, en perlas de alginato en presencia de IGF-1, TGF-, transferrina, insulina y ácido ascórbico (medio de crecimiento de condrocitos, Lonza n.º CC-3225). Se cambió el medio de cultivo dos veces a la semana durante los experimentos, de 6 a 15 semanas. Estas condiciones de cultivo indujeron la expresión del fenotipo y la diferenciación de los condrocitos. Estas células MQCH expresaron marcadores de condrocitos, incluyendo la región determinante del sexo Y-box 9 (Sox 9), colágeno II, colágeno X, proteína de la matriz oligomérica del cartílago y ARNm de aggregan, de acuerdo con lo medido mediante análisis de RT-PCR cuantitativa usando ARN aislado de cultivos de células MQCH. Estas células MQCH cultivadas también elaboraron la matriz extracelular.

Se realizó una microscopía confocal para confirmar que las células MQCH acumulan KS. Se trataron células MQCH de un cultivo de 8 semanas con tripsina, se citocentrifugaron en portaobjetos de vidrio, se fijaron en acetona y se congelaron hasta su uso. Después de la descongelación, se rehidrataron las células y se tiñeron usando, como anticuerpos primarios y secundarios, un anticuerpo monoclonal anti-KS (Chemicon) y un anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con Alexa-488 (verde), respectivamente. Las células MQ-CH mostraron tinción intracelular punteada, en consonancia con la acumulación lisosomal de KS.

Para determinar si la GALNS humana recombinante purificada podría ser captada por las células MQCH en los lisosomas y degradar el KS, se incubó un cultivo de células MQCH de 6 semanas con GALNS humana recombinante 10 nM dos veces a la semana durante 9 semanas. Se midieron la absorción de GALNS y la depuración de KS mediante microscopía confocal. Los anticuerpos primarios usados fueron: (a) un anticuerpo policlonal de conejo anti-GALNS y un anticuerpo monoclonal de proteína-1 de membrana asociada anti-lisosomal (LAMP-1) o (b) un anticuerpo monoclonal anti-KS y un anticuerpo policlonal anti-LAMP-1. Los anticuerpos secundarios usados fueron: anticuerpos conjugados con Alexa-488 (verde) para detectar anticuerpos anti-GALNS o anti-KS, o anticuerpos conjugados con Alexa-555 o -594 (rojo) para la detección de anticuerpos anti-LAMP-1. Se montaron preparados de células MQCH en medio de montaje que contenía DAPI, que tiñe los núcleos.

Se observó una ubicación conjunta significativa de la enzima GALNS y KS con el marcador lisosomal, LAMP-1 en las células MQCH tratadas con GALNS. Tras la exposición de MQCH a GALNS humana recombinante, se disminuyó la cantidad de KS intracelular.

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Claims

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