EA026112B1 - Стабильная композиция, содержащая гиалуронидазу и иммуноглобулин, и способы ее применения - Google Patents

Abstract

Заявлены жидкие композиции для подкожного введения, содержащие иммуноглобулин (Ig) в концентрации по меньшей мере 10% вес./об., растворимую гиалуронидазу в концентрации по меньшей мере 50 ед./мл, которая присутствует в соотношении не менее 100 ед./г Ig, хлорид щелочного металла в концентрации не менее 50 мМ, имеющие рН примерно от 4 до 5 и стабильные при 28-32°С в течение не менее 6 месяцев; контейнеры, содержащие стабильную жидкую совместную композицию, и наборы, содержащие стабильную жидкую совместную композицию, или контейнеры; способ лечения поддающихся лечению иммуноглобулинами заболеваний или состояний, включающий подкожное введение субъекту стабильной жидкой совместной композиции, а также применение стабильной жидкой совместной композиции для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения поддающегося лечению Ig заболевания или состояния.

Description

Иммуноглобулины (1д) из плазмы крови человека впервые были использованы в 1952 году для лечения иммунодефицита. Первоначально для этой цели применяли внутримышечное или подкожное введение 1д. Для инъекционного введения для эффективного лечения различных заболеваний необходимо большее количество 1д, однако были разработаны продукты для внутривенного введения с низкой концентрацией 1д (50 мг/мл). Внутривенное введение (IV) иммуноглобулинов (ΐνΐθ) является основным способом лечения пациентов с иммунодефицитами. Хотя первые препараты ΐνΊΟ вызывали серьезные побочные эффекты, доступные в настоящее время препараты ΐνΐθ хорошо переносятся большинством больных с иммунодефицитом. Тем не менее, небольшая часть больных продолжает испытывать нежелательные, даже приводящие к нетрудоспособности реакции, такие как головная боль, усталость и боль в мышцах. Также, особенно при наличии у пациентов интеркуррентных инфекций, могут иметь место лихорадка и озноб. Нежелательные реакции часто сохраняются, несмотря на предварительное лечение ацетаминофеном, димедролом и кортикостероидами или при переходе на другие препараты ΐνΐθ. Кроме того, в связи с необходимостью внутривенного введения возникают проблемы с удобством лечения для пациента.

Подкожное введение (8Ц) иммуноглобулинов является альтернативой внутривенного введения. По сравнению с IV инфузией введение иммуноглобулинов имеет ряд преимуществ. Например, при таком способе введения снижена вероятность системной реакции, не требуется в некоторых случаях затруднительного IV доступа, увеличен минимальный уровень агента и пациенту предоставлено больше независимости.

Для терапевтического применения любого препарата 1д еще одним важным фактором для 1д продуктов является их стабильность при хранении. Безопасное обращение и введение композиции, содержащей белки, является важной задачей при разработке фармацевтической композиции. Белки обладают уникальными химическими и физическими свойствами, обусловливающими проблемы с их стабильностью, так для белков существуют различные пути деградации, что приводит как к химической, так и физической нестабильности. Химическая нестабильность включает дезаминирование, агрегацию, расщепление пептидной цепи и окисление остатков метионина. Физическая нестабильность охватывает многие явления, в том числе, например, агрегирование. Следовательно, существует потребность в стабильных композициях препаратов иммуноглобулинов.

Краткое описание изобретения

В настоящем документе предусмотрены композиции (составы), способы и наборы для подкожного введения стабильных жидких совместных композиций для лечения заболеваний и состояний, поддающихся лечению 1д. В настоящем документе предусмотрены стабильные жидкие совместные композиции (составы) для подкожного введения, содержащие иммуноглобулин (1д) в концентрации по меньшей мере 10% вес./об., растворимую гиалуронидазу в концентрации по меньшей мере 50 ед./мл, которая присутствует в соотношении не менее 100 единиц/грамм (ед./г) 1д, ИаС1 в концентрации не менее 50 мМ, с рН от 4 до 5. Совместные композиции стабильны при 28-32°С в течение не менее 6 месяцев.

Кроме того, может присутствовать аминокислота-стабилизатор, например, аланин, гистидин, аргинин, лизин, орнитин, изолейцин, валин, метионин, глицин и пролин. В некоторых примерах, аминокислота присутствует в количестве по меньшей мере 100 мМ. В одном примере аминокислота представляет собой глицин и присутствует в количестве по меньшей мере 100 мМ, 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ, 300 мМ, 350 мМ, 400 мМ, 450 мМ, 500 мМ и более. В другом примере количество глицина составляет 250 мМ.

Предусмотренная стабильная жидкая совместная композиция содержит по меньшей мере от 10% до 22% 1д, например 10% вес./об., 11% вес./об., 12% вес./об., 13% вес./об., 14% вес./об., 15% вес./об., 16% вес./об., 17% вес./об., 18% вес./об., 19% вес./об., 20% вес./об., 21% вес./об., 22% вес./об. или более. В некоторых примерах, концентрация 1д составляет 10% вес./об. или 20% вес./об. Используемый в совмест- 1 026112 ной композиции 1д представляет собой 1д из плазмы крови человека, например, он может быть очищен из плазмы крови человека фракционированием спиртом. В некоторых примерах 1д дополнительно очищают при одной или нескольких манипуляциях, выбранных из химической модификации, инкубации при рН 4,0 с пепсином или без него, осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ), ионообменной хроматографии, ферментативного расщепления, обработки растворителем/детергентом, диафильтрации и ультрафильтрации. Совместные композиции по настоящему документу могут содержать 1д, который содержит 1§С, 1дА и 1дМ. В некоторых примерах 1д содержит более 95% 1§С.

Кроме того, совместные композиции могут содержать Ναί',Ί. В некоторых примерах концентрация №С1 составляет от 50 мМ до 220 мМ, например, 50 мМ, 60 мМ, 70 мМ, 80 мМ, 90 мМ, 100 мМ, 110 мМ, 120 мМ, 130 мМ, 140 мМ, 150 мМ, 160 мМ, 170 мМ, 180 мМ, 190 мМ, 200 мМ, 210 мМ, 220 мМ и более. В одном примере концентрация ΝαΟ составляет 150 мМ.

Предусмотренные совместные композиции содержат растворимую гиалуронидазу, которая может представлять собой РН20 или ее усеченную форму. Например, растворимая гиалуронидаза может представлять собой овечью, бычью или человеческую усеченную РН20. В некоторых примерах, если РН20 представляет собой усеченную человеческую РН20, усеченная человеческая РН20 может быть выбрана из полипептидов с последовательностью аминокислот, приведенной в любой из 5>Еф ГО ΝΟ: 4-9, или их аллельных или других вариантов. В одном примере растворимая гиалуронидаза представляет собой гНиРН20.

Кроме того, концентрация растворимой гиалуронидазы может составлять от 50 до 500 ед./мл, например, 50 ед./мл, 100 ед./мл, 200 ед./мл, 300 ед./мл, 400 ед./мл, 500 ед./мл и более. Например, концентрация растворимой гиалуронидазы может составлять 100 ед./мл или 300 ед./мл. В совместной композиции по настоящему документу растворимая гиалуронидаза может быть представлена в соотношении от 100 ед./г 1д до 5000 ед./г 1д, например, 100 ед./г 1д, 150 ед./г 1д, 200 ед./г 1д, 250 ед./г 1д, 300 ед./г 1д, 400 ед./г 1д, 500 ед./г 1д, 600 ед./г 1д, 700 ед./г 1д, 800 ед./г 1д, 900 ед./г 1д, 1000 ед./г 1д, 1200 ед./г 1д, 1500 ед./г 1д, 1800 ед./г 1д, 2000 ед./г 1д, 3000 ед./г 1д, 4000 ед./г 1д, 5000 ед./г 1д или более. В некоторых примерах растворимая гиалуронидаза в соотношении 500 ед./г 1д, 1000 ед./г 1д, 1500 ед./г 1д или 3000 ед./г 1д. рН совместных композиций может составлять от 4,4 до 4,9 в концентрированном виде.

Совместные композиции (составы) по настоящему документу могут быть изготовлены для многократного введения или однократного введения. Кроме того, в примерах, где совместная композиция изготовлена для однократного введения, 1д присутствует в количестве, достаточном для лечения заболевания или состояния, поддающегося лечению 1д. Для лечения заболеваний или состояний, поддающихся лечению 1д, его можно вводить ежедневно, еженедельно, раз в две недели, раз в 2-3 недели, раз в 3-4 недели или ежемесячно. Введение совместной композиции проводят таким образом, чтобы количество вводимого 1д было по существу таким же, как при однократном внутривенном введении дозы при лечении заболеваний или состояний, поддающихся лечению 1д. В некоторых примерах количество 1д в совместной композиции может составлять приблизительно от 1 грамма (г) до 200 г, например, 1 грамм (г), 2 г, 3 г, 4 г, 5 г, 10 г, 20 г, 30 г, 40 г, 50 г, 60 г, 70 г, 80 г, 90 г, 100 г или 200 г. Кроме того, количество гиалуронидазы в композиции может составлять приблизительно от 500 единиц до 100000 единиц, например, 500 единиц, 1000 единиц, 2000 единиц, 5000 единиц, 10000 единиц, 30000 единиц, 40000 единиц, 50000 единиц, 60 000 единиц, 70 000 единиц, 80 000 единиц, 90 000 единиц, 100 000 единиц или более.

Предусмотренные жидкие совместные композиции по настоящему документу стабильны при 2832°С по меньшей мере от 6 месяцев до года, например, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев и более. Кроме того, жидкие совместные композиции стабильны при температуре 0-10°С по меньшей мере от 6 месяцев до 2 лет, например, 6 месяцев, 1 год, 2 года или более.

Также в настоящем документе предусмотрены наборы, содержащие любую стабильную жидкую совместную композицию по настоящему документу и, по желанию, инструкцию по эксплуатации.

В настоящем документе предусмотрены контейнеры, содержащие стабильные жидкие совместные композиции. Контейнер может представлять собой пробирку, бутылку, флакон или шприц. В примерах, где контейнер представляет собой шприц, контейнер дополнительно содержит иглу для инъекций. Таким образом, предусмотренные контейнеры содержат стабильную жидкую совместную композицию для однократного введения или многократного введения.

В настоящем документе предусмотрены способы лечения заболеваний или состояний, поддающихся лечению 1д, подкожным введением субъекту стабильной жидкой совместной композиции, содержащей растворимую гиалуронидазу и 1д. Совместную композицию вводят таким образом, чтобы количество вводимого 1д было по существу таким же, как при однократном внутривенном введении дозы при лечении заболеваний или состояний, поддающихся лечению 1д.

Кроме того, предусмотренные в настоящем документе способы предназначены для лечения заболеваний или состояний, поддающихся лечению 1д, выбранных из первичных иммунодефицитов, вторичных иммунодефицитов, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и острых инфекций.

В некоторых примерах совместная композиция может быть введена предусмотренными здесь способами для лечения первичного иммунодефицита. Первичный иммунодефицит может представлять собой обычный вариабельный иммунодефицит (СУГО), избирательный дефицит 1дА, дефицит 1§С, дефи- 2 026112 цит специфических антител, нарушения системы комплемента, врожденную агаммаглобулинемию, атаксию, телеангиэктазию, гиперпродукцию 1дМ, синдром Вискотта-Олдрича, тяжелый комбинированный иммунодефицит (§СГО), первичную гипогаммаглобулинемию, первичный иммунодефицит с дефицитом антител, сцепленную с Х-хромосомой агаммаглобулинемию (ХЬА) или гипогаммаглобулинемия младенцев.

В других примерах поддающиеся лечению 1д заболевания или состояния являются приобретенными иммунодефицитами, вторичными по отношению к гемобластозам. Гемобластозы могут быть выбраны из хронического лимфолейкоза (СЬЬ), множественной миеломы (ММ) и неходжкинской лимфомы (ИНЬ).

Если поддающиеся лечению 1д заболевания или состояния представляют собой воспалительные и аутоиммунные заболевания, воспалительные и аутоиммунные заболевания могут быть выбраны из болезни Кавасаки, хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии, синдрома ГийенаБарре, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, полимиозита, дерматомиозита, миозита с тельцами включения, миастенического синдрома Ламберта-Итона, мультифокальной моторной нейропатии, миастении и синдрома Мерч-Волтмана.

В некоторых примерах совместную композицию вводят для лечения острой бактериальной, вирусной или грибковой инфекции, вызванной, например, НаеторЫйак тЛиеп/ае типа В, Рзеиботоиаз аегищиоза типа А и В, §1арйу1ососси8 аитеик, стрептококками группы В, пневмококками типов 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, 23, аденовирусами типов 2 и 5; цитомегаловирусом, вирусом Эпштейна-Барр УСА, вирусом гепатита А, вирусом гепатита В, вирусом простого герпеса-1, вирусом простого герпеса-2; вирусом гриппа А, вирусом кори, вирусом парагриппа типов 1, 2 и 3, вирусом полиомиелита, вирусом ветряной оспы, АкретдШик и СаиДМа А1Ысаи8.

Кроме того, поддающиеся лечению 1д заболевания или состояния могут быть выбраны из ятрогенных иммунодефицитов, острого рассеянного энцефаломиелита; АИСА-положительного системного некротического васкулита, аутоиммунной гемолитической анемии; буллезного пемфигоида, рубцового пемфигоида; синдрома Эванса (включая аутоиммунную гемолитическую анемию с иммунной тромбоцитопенией); фетоматеринской/неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении (ΡΜΛΙΤ/ΝΛΙΤ); гемофагоцитарного синдрома, трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с высоким риском, 1дМ парапротеиновой невропатии, трансплантации почки, рассеянного склероза, опсоклонус-миоклонус атаксии, листовидной пузырчатки, обыкновенной пузырчатки, посттрансфузионной пурпуры; токсического эпидермального некролиза/синдрома Стивена Джонсона (ΊΈΝ/δΙδ), синдрома токсического шока, болезни Альцгеймера, системной красной волчанки, множественной миеломы, сепсиса, В-клеточных опухолей; паранеопластической мозжечковой дегенерации без антител и трансплантации костного мозга.

Подробное описание изобретения

Оглавление

A. Определения

B. Стабильные совместные композиции иммуноглобулина (1д) и гиапуронидазы

1. Терапия иммуноглобулинами

2. Подкожное введение композиций иммуноглобулина и гиалуронидазы

3. Стабильные совместные композиции

C. Иммуноглобулины и получение иммуноглобулинов

1. Получение и очистка

a. Способ Кон-Онкли

b. Модифицированный способ Кон-Онкли

c. Инактивация вирусов ά. Концентрация белка

е. Примеры препаратов 1д ί. 10% 1д ΐΐ. Препараты 1д с высокой концентрацией (например, 20% 1д)

2. Стабильность при хранении

a. Протеинстабилизирующие вспомогательные вещества

b. рН

Ό. Гиалуронидаза

1. РН20

2. Растворимая гиалуронидаза

a. Растворимая человеческая РН20

b. Растворимая рекомбинантная человеческая РН20 (гНиРН20)

3. Гликозилирование

4. Модификация гиалуронидазы для улучшения фармакокинетических свойств

Е. Способы получения нуклеиновых кислот, кодирующих растворимую гиалуронидазу и ее полипептиды

1. Векторы и клетки

2. Экспрессия

- 3 026112

a. Прокариотические клетки

b. Клетки дрожжей

c. Клетки насекомых

й. Клетки млекопитающих е. Растения

3. Способы очистки

Р. Получение, композиции и введение иммуноглобулинов и полипептидов растворимой гиалуронидазы

1. Дозировки

a. Иммуноглобулин

b. Гиалуронидаза

c. Хлористый натрий

й. Аминокислотные стабилизаторы е. Другие агенты

2. Лекарственные формы

3. Введение

С. Способы оценки активности, стабильности, биодоступности и фармакокинетики

1. Молекулярный размер

2. Биологическая активность

a. Иммуноглобулин

b. Гиалуронидаза

1. Фармакокинетика и переносимость

H. Способы лечения и терапевтическое применение

I. Первичный и вторичный иммунодефицит

a. Первичный иммунодефицит

b. Вторичной иммунодефицит

2. Воспалительные и аутоиммунные заболевания

a. Болезнь Кавасаки

b. Хронические воспалительные демиелинизирующие полиневропатии

c. Синдром Гийена-Барре

й. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура е. Воспалительные миопатии ί. Дерматомиозит ίί. полимиозит ίίί. миозит с тельцами

ί. Миастенический синдром Ламберта-Итона д. Мультифокальная моторная нейропатия 1ι. Миастения

ί. Синдром Мерч-Волтмана

3. Острые инфекции

4. Другие заболевания и состояния

I. Изделия и наборы

1. Примеры

А. Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, как это обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Все патенты, патентные заявки, опубликованные заявки и публикации, последовательности СепЬапк, базы данных, веб-сайты и другие печатные материалы, упомянутые на протяжении всего приведенного здесь раскрытия, если не указано иное, включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. В случае, если существует множество определений упомянутого в настоящем документе термина, преимущественную силу имеет определение, приведенное в этом разделе. Если в настоящем документе приведена ссылка на ИРЬ или другой такой идентификатор или адрес, то подразумевается, что такой идентификатор может измениться и конкретная информация в сети Интернет может появиться и исчезнуть, однако эквивалентную информацию можно найти с помощью функции поиска в Интернете. Такая ссылка свидетельствует о наличии и публичном распространении такой информации.

В настоящем документе иммуноглобулин и гамма-глобулин относятся к препаратам белков плазмы, полученным из плазмы взрослых доноров. Преобладают 1дС антитела, другие подклассы антител, такие как 1дА и 1дМ, также присутствуют. Терапевтические иммуноглобулины могут обеспечить пассивную иммунизацию путем повышения сывороточного уровня циркулирующих антител у реципиента. 1дС антитела могут, например, связывать и нейтрализовать бактериальные токсины; опсонизировать патогены; активировать комплемент и подавлять патогенные цитокины и фагоциты путем взаимодействия с цитокинами и их рецепторами, например,СИ5, интерлейкином-1а (ГЬ-а), интерлейкином-6 (1Ь-6),

- 4 026112 фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и Т-клеточными рецепторами. Терапевтические иммуноглобулины могут ингибировать активность аутоантител. Препараты иммуноглобулинов также включают, но не ограничиваются внутривенно вводимым иммуноглобулином (ЮГУ), иммуноглобулином IV, терапевтическим иммуноглобулином. Препараты иммуноглобулинов хорошо известны и включают в себя такие торговые марки как ВауСаш, Сапйтипе® Ν, Саттадатй® δ/ϋ, Сатшат®-Р, Гчеедат® ΕΝ, Рапд1оЪи1ш®, Ро1удат® δ/ϋ, δηηάοβΙοόΗΐίη®. Уепод1оЪи1ш®-1, Уепод1оЪи1ш®^, \νίηΡ1ιο®® δΌΡ и другие. Препараты иммуноглобулинов могут быть получены из плазмы крови человека или могут быть рекомбинантными.

В настоящем документе лечение внутривенным ГдС или 1СГУ обычно относится к способу лечения внутривенным введением композиции ГдС иммуноглобулинов пациенту для лечения ряда заболеваний, таких как иммунодефицит, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания. Иммуноглобулины ГдС, как правило, содержатся в плазме, откуда их и выделяют. Могут быть использованы полноразмерные антитела или их фрагменты.

В настоящем документе поддающееся лечению 1д заболевание или состояние относятся к любому заболеванию или состоянию, при котором используют препараты иммуноглобулинов. Такие заболевания и состояния включают, но не ограничиваются любыми заболеваниями, при которых увеличение циркулирующих антител приводит к улучшению, например, иммунодефицитами, приобретенными гипогаммаглобулинемиями, вторичными по отношению к гемобластозам; болезнью Кавасаки, хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатией (СЕИР), синдромом Гийена-Барре, идиопатической тромбоцитопенической пурпурой, воспалительной миопатией; миастеническим синдромом ЛамбертаИтона; мультифокальной моторной нейропатией, миастенией; синдромом Мерч-Волтмана, вторичной гипогаммаглобулинемией (в том числе ятрогенным иммунодефицитом); дефицитом специфических антител, острым рассеянным энцефаломиелитом; ΑNСΑ-положительным системным некротическим васкулитом, аутоиммунной гемолитической анемией; буллезным пемфигоидом; рубцовым пемфигоидом; Синдромом Эванса (в том числе аутоиммунной гемолитической анемией с иммунной тромбоцитопенией); фетоматеринской/неонатальной аллоиммунной тромбоцитопенией (ΡΜΑΙΤ/ΝΑΙΤ); гемофагоцитарным синдромом; трансплантацией аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с высоким риском, 1дМ парапротеиновой невропатией, трансплантацией почки, рассеянным склерозом, опсоклонусмиоклонус атаксией, листовидной пузырчаткой, обыкновенной пузырчаткой, посттрансфузионной пурпурой; токсическим эпидермальным некролизом/синдромом Стивена Джонсона (ΤΕΝ/δΙδ), синдромом токсического шока, болезнью Альцгеймера, системной красной волчанкой, множественной миеломой, сепсисом, В-клеточными опухолями; травмой и бактериальными, вирусными или грибковыми инфекциями.

В настоящем документе комнатная температура относится к диапазону, как правило, от приблизительно 18°С до приблизительно 32°С. Специалисту в данной области очевидно, что комнатная температура изменяется в зависимости от расположения и сложившихся условий. Например, комнатная температура может быть выше в более теплом климате, например, в Италии или Техасе.

В настоящем документе стабильный и стабильность по отношению к совместным композициям по настоящему документу относится к композициям, в которых белок (белки) (Гд и гиалуронидаза) по существу сохраняет свою физическую и химическую стабильность и целостность при хранении по меньшей мере в течение шести месяцев при температуре до 32°С. В настоящем документе стабильность при комнатной температуре означает стабильность в верхнем диапазоне типичной комнатной температуры для теплых районов (например, 28-32°С в Италии или Техас). Препараты стабильны при охлаждении и комнатной температуре, то есть при 0-32°С или до 32°С в течение не менее шести месяцев. Гд и гиалуронидаза демонстрируют стабильность в совместной композиции при хранении в течение не менее шести месяцев при комнатной температуре, в том числе при температурах до приблизительно 32°С. Тесты для оценки устойчивости каждого компонента хорошо известны специалистам в данной области и описаны здесь.

В настоящем документе стабильность Гд означает, что 1д существенно не агрегирует, денатурирует или фрагментируется, так что по меньшей мере 90% 1д присутствует в виде мономеров или олигомеров/димеров с молекулярной массой 1д от приблизительно 70 кДа до приблизительно 450 кДа. Таким образом, в композиции менее чем приблизительно 10%, например, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 4%, менее чем приблизительно 3%, менее чем приблизительно 2%, менее чем приблизительно 1% от 1д присутствует в виде агрегатов (т.е. имеет молекулярный вес, больший или равный 450 кДа).

Кроме того, не более чем 5%-7%, например, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0,5% или менее от 1д в совместной композиции фрагментировано (то есть имеет молекулярный вес менее 70 кДа).

В настоящем документе стабильность гиалуронидазы означает, что она сохраняет по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и более начальной активности гиалуронидазы перед хранением. Тесты для оценки активности гиалуронидазы известны специалистам в данной области и описаны здесь.

В настоящем документе хранение означает, что композицию не сразу вводят субъекту после по- 5 026112 лучения, но сохраняют в течение определенного периода времени при определенных условиях перед применением (например, при пониженной температуре, в жидкой или лиофилизированной форме). Например, жидкую композицию можно хранить до введения субъекту в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, как правило, по меньшей мере шесть месяцев, при различных температурах, например, в холодильнике (от 0° до 10°С) или при комнатной температуре (например, температуре до 32°С).

В настоящем документе режим введения представляет собой количество вводимого иммуноглобулина и частоту введения. Режим введения зависит от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и, следовательно, может меняться.

В настоящем документе в значительной степени так же, как при внутривенном режиме введения Гд (1УЮ) относится к режиму, при котором доза и/или частота введения находятся в пределах того количества, которое является эффективным для лечения конкретного заболевания или состояния, и, как правило, составляют приблизительно 10% от IV дозы или частоты. Количества ГУЮ, которые являются эффективными в лечении конкретного заболевания или состояния, известны или могут быть эмпирически определены специалистом в данной области. Например, для пациентов с первичным иммунодефицитом типичная ежемесячная доза ΐνίΟ составляет от 300 мг/кг (т.е. 21 г, предполагая, что средний взрослый человек весит 70 кг) до 600 мг/кг (т.е. 42 г). Таким образом, при введении Гд в сочетании с гиалуронидазой, для лечения первичных иммунодефицитов Гд вводят подкожно в дозах приблизительно от 300 до 600 мг/кг.

В настоящем документе частота введения относится ко времени между последовательными введениями доз иммуноглобулина. Например, частота может составлять один, два, три, четыре раза в неделю и зависеть от конкретного подвергающегося лечению заболевания или состояния.

Как правило, частота составляет менее одного раза в две-три недели, и, как правило, не более одного раза в месяц.

В настоящем документе гиалуронидазы (хиалуронидазы) относятся к классу ферментов, которые разрушают гиалуроновую кислоту. Гиалуронидазы включают, но не ограничиваются, бактериальными гиалуронидазами (ЕС 4.2.2.1 или ЕС 4.2.99.1), гиалуронидазами пиявок, других паразитов и ракообразных (ЕС 3.2.1.36), и гиалуронидазами млекопитающих (ЕС 3.2.1.35). Гиалуронидазы включают любые гиалуронидазы не человеческого происхождения, включая, но не ограничиваясь, мышиными, собачьими, кошачьими, заячьими, птичьими, бычьими, овечьими, свиными, лошадиными, рыбьими, лягушачьими, бактериальными гиалуронидазами, и гиалуронидазами пиявок, других паразитов и ракообразных. Примеры гиалуронидаз не человеческого происхождения включают бычью гиалуронидазу (БЕЦ ГО N0: 10 и 11), гиалуронидазу ос (БЕЦ ГО N0: 12 и 13), пчел (БЕЦ ГО N0: 14), шершней (БЕЦ ГО N0: 15), бумажных ос (БЕЦ ГО N0: 16), мыши (БЕЦ ГО N0: 17-19, 32), свиньи (БЕЦ ГО N0: 20-21), крысы (БЕЦ ГО N0: 2224, 31), кролика (БЕЦ ГО N0: 25), овец (БЕЦ ГО N0: 26 и 27), орангутанга (БЕЦ ГО N0: 28), обезьяны циномолгуса (БЕЦ ГО N0: 29), морской свинки (БЕЦ ГО N0: 30), золотистого стафилококка (БЕЦ ГО N0: 33), Б1гер1ососси8 руодепек (БЕЦ ГО N0: 34) и ОоЧпйшт регГппдещ (БЕЦ ГО N0: 35). Гиалуронидазы также включают гиалуронидазы человеческого происхождения. Примеры человеческих гиалуронидаз включают НУЛЫ (БЕЦ ГО N0: 36), ΗΥΆΕ2 (БЕЦ ГО N0: 37), ΗΥΆΕ3 (БЕЦ ГО N0: 38), ΗΥΆΕ4 (БЕЦ ГО N0: 39) и РН20 (БЕЦ ГО N0: 1). Также гиалуронидазы включают растворимые гиалуронидазы, включая баранью и бычью РН20, растворимую человеческую РН20 и гНиРН20.

Понятие гиалуронидазы включает полипептиды-предшественники гиалуронидазы и зрелые полипептиды гиалуронидазы (например, полипептиды, в которых удалена сигнальная последовательность), их усеченные формы, обладающие активностью, включает аллельные варианты и видовые варианты, варианты сплайсинга и другие варианты, включая полипептиды с 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности с полипептидами-предшественниками, приведенными в БЕЦ ГО N0: 1 и 10-39, или их зрелые формы. Например, упоминание гиалуронидазы также включает в себя варианты полипептидов-предшественников человеческой РН20, приведенные в БЕЦ ГО N0: 50-51.

Гиалуронидазы также включают полипептиды, содержащие химические или посттрансляционные модификации, а также полипептиды без химических или посттрансляционных модификаций. Такие модификации включают, но не ограничиваются пегилированием, альбуминированием, гликозилированием, фарнезилированием, карбоксилированием, гидроксилированием, фосфорилированием, а также другими модификациями полипептидов, известными в уровне техники.

В настоящем документе растворимая гиалуронидаза относится к любой гиалуронидазе, которая является растворимой в физиологических условиях. Как правило, у растворимой гиалуронидазы отсутствует весь гликофосфатидильный якорь (ОРГ) или его часть, или она по иным причинам не заякорена в клеточной мембране. Таким образом, при экспрессии из клетки растворимая гиалуронидаза выделяется в среду. Растворимая РН20 может быть идентифицирована, например, по распределению в водную фазу раствора Тритон® Х-114 при температуре 37°С (ВогФег и др., (1981) 1. Вю1. Сйет., 256:1604-7). Заякоренная в мембране гиалуронидаза, такая как заякоренная липидом гиалуронидаза, включая ОРГзаякоренную гиалуронидазу, переходит в обогащенную детергентом фазу, но переходит в обедненную детергентом или водную фазу после обработки фосфолипазой-С. Растворимые гиалуронидазы включают

- 6 026112 заякоренные в мембране гиалуронидазы, в которых один или несколько районов, связанных с заякореванием гиалуронидаза в мембране, удален или изменен, где растворимая форма сохраняет гиалуронидазную активность. Растворимые гиалуронидазы также включают рекомбинантные растворимые гиалуронидазы и полипептиды, содержащиеся ίη νίνο в источниках или очищенные из природных источников, таких как, например, экстракт из овечьих или коровьих яичек. Примером таких растворимых гиалуронидаз является растворимая человеческая РН20. Другие растворимые гиалуронидазы включают овечью (8ЕЦ ГО N0:27) и бычью (8ЕЦ ГО N0:11) РН20.

В настоящем документе растворимая человеческая РН20 или 8НиРН20 включает зрелые полипептиды РН20, в которых отсутствует вся сигнальная последовательность присоединения гликозилфосфатидилинозитольного (ΟΡΙ) якоря на С-конце или ее часть, так что после экспрессии полипептиды являются растворимыми. Примеры 8НиРН20 полипептидов включают зрелые полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ГО N0: 4-9 и 47-48. Полипептиды-предшественники таких примеров полипептидов 8НиРН20 включает сигнальную последовательность. Примерами предшественниками являются полипептиды, приведенные в 8ЕЦ ГО N0: 3, 40-46, каждый из которых содержит 35 аминокислотную сигнальную последовательность аминокислот в позициях 1-35. Растворимые полипептиды НиРН20 также включают полипептиды, деградировавшие во время или после процедур получения и очистки, описанных здесь.

В настоящем документе растворимая рекомбинантная человеческая РН20 (гНиРН20) относится к растворимой форме человеческой РН20, рекомбинантно экспрессированной в клетках яичников китайского хомяка (СНО). Растворимая гНиРН20 кодируется нуклеиновой кислотой, включающей в себя сигнальную последовательность, которая приведена в 8ЕЦ ГО N0: 49. Также предусмотрены молекулы ДНК, которые являются их аллельными вариантами, и другие их растворимые варианты. Нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимый гНиРН20, экспрессируют в клетках СНО, которые секретируют зрелый полипептид. При получении в культуральной среде у белка присутствует гетерогенность на С-конце, так что продукт включает в себя смесь полипептидов, которые могут включать один или несколько пептидов с последовательностями 8ЕЦ ГО N0: 4-9 при различном их содержании. Также предусмотрены соответствующие аллельные варианты и другие варианты, в том числе соответствующие предшественники человеческой РН20, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 50-51. Другие варианты могут обладать 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности с любой из 8ЕЦ ГО N0: 4-9 и 47-48, если они сохраняют гиалуронидазная активность и растворимы.

В настоящем документе активность относится к функциональной активности или активностям полипептида или функциональной активности или активностям его части, связанным с таковыми полноразмерного (целого) белка. Функциональная активность включает, но не ограничивается биологической активностью, каталитической и ферментативной активностью, антигенностью (способностью связывать антитела или конкурировать с полипептидом за связывание с антителами против полипептида), иммуногенностью, способностью к образованию мультимеров и способностью специфически связывать рецепторы или лиганды полипептида.

В настоящем документе гиалуронидазная активность относится к способности гиалуронидазы расщеплять гиалуроновую кислоту. Ιη νίίτο анализы для определения гиалуронидазной активности гиалуронидаз, таких как растворимая гНиРН20, известны и описаны в настоящем документе. Примеры анализов включают анализ микромутности, описанный ниже (см., например, пример 12), при котором расщепление гиалуроновой кислоты гиалуронидазой измеряют косвенно по нерастворимому осадку, образующемуся при связывании нерасщепленной гиалуроновой кислоты с сывороточным альбумином.

Используемый здесь термин ультрафильтрация (ИР) включает в себя различные способы мембранной фильтрации, в которых гидростатическое давление заставляет жидкость проходить через полупроницаемую мембрану. Взвешенные вещества и растворы веществ с высокой молекулярной массой не проходят через мембрану, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества проходят через мембрану. Такой процесс разделения часто используют для очистки и концентрирования растворов высокомолекулярных веществ (10³-10⁶ Да), особенно белковых растворов. В зависимости от размера молекул, которые удерживаются мембраной, доступно множество ультрафильтрационных мембран. Ультрафильтрация, как правило, характеризуется размером пор мембраны от 1 до 1000 кДа и рабочим давлением от 0,01 до 10 бар, и особенно полезна для разделения коллоидных растворов, например, белков и низкомолекулярных веществ, таких как сахара и соли.

Используемый здесь термин диафильтрация относится к процессу, проводимому с теми же мембранами, что и ультрафильтрацию, но при тангенциальном направлении потока. При диафильтрации буфер вводят в бак, где он рециркулирует, а фильтрат при рециркуляции удаляется из блока. Если продукт находится в ретентате (например, Ι§0), при диафильтрации прочие компоненты отделяются от продукта в фильтрат, тем самым происходит замена буфера и снижения концентрации нежелательных веществ.

Используемый здесь термин смешивание описывает действие, приводящие к равному распределению двух или более различных соединений или веществ в растворе или суспензии путем любого способа перемешивания, в настоящем документе полное равномерное распределение всех компонентов в

- 7 026112 растворе или суспензии в результате смешивания не требуется.

Используемый здесь термин растворитель охватывает любые жидкие вещества, способные растворять или диспергировать одно или несколько других веществ. Растворитель может представлять собой вещество неорганической природы, такое как вода, или может представлять собой органическую жидкость, такую как этанол, ацетон, метилацетат, этилацетат, гексан, петролейный эфир и т. д. При применении термина обработка растворителем и детергентом растворитель означает органический растворитель (например, три-Ы-бутил фосфат), который входит в смесь растворителя и детергента, используемую для инактивации вирусов с липидной оболочкой в растворе.

Используемый здесь термин детергент используется в настоящем документе взаимозаменяемо с терминами сурфактант или поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активные вещества, как правило, представляют собой амфифильные органические соединения, то есть содержащие как гидрофобные группы (хвосты), так и гидрофильные группы (головы), что делает поверхностно-активные вещества растворимыми в органических растворителях и воде. Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы по наличию формально заряженной группы в их голове. Неионогенные поверхностно-активные вещества не имеют заряженной группы в голове, в то время как ионогенные поверхностно-активные вещества несут суммарный заряд в голове соединения. Цвиттерионные поверхностноактивные вещества содержат голову с двумя противоположно заряженными группами. Некоторые примеры распространенных поверхностно-активных веществ (ПАВ) включают: анионные ПАВ (содержащие сульфатные, сульфонатные или карбоксильные анионы): перфтороктаноат (ΡΡΘΆ или РРО), перфтороктансульфонат (РРО8), додецилсульфат натрия (8Ό8), лаурилсульфат аммония и другие соли алкилсульфатов натрия, лауретсульфат натрия (также известный как натрия лаурилсульфат эфир или 8ЬЕ8), алкилбензол сульфонаты; катионные ПАВ (содержащие четвертичные аммониевые катионы): цетилтриметиламмоний бромид (СТАВ), также известный как гексадецилтриметиламмоний бромид, и другие соли алкилтриметиламмония, цетилпиридиний хлорид (СРС), полиэтоксилированные жирные амины (РОЕА), бензалкония хлорид (ВАС) бензетония хлорид (ΒΖΤ); цвиттерионные ПАВ (амфотерные): додецилсульфата бетаин; кокамидопропилбетаин, кокоамфоглицинат; неионные ПАВ: алкилполиэтиленоксид, алкилфенол полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленоксида (коммерческое название полоксамеры или полоксамины), алкилполиглюкозиды, в том числе октилглюкозид, децилмальтозид, жирные спирты (например, цетиловый спирт и олеиловый спирт), кокамид МЕА, кокамид ΌΕΆ, полисорбаты (Твин-20, Твин-80 и др.), детергент Тритон и додецилдиметиламин оксид.

В настоящем документе остатки природных аминокислот представляют собой остатки 20аминокислот, встречающихся в природе, которые включаются в белок за счет специфического распознавания нагруженной молекулы тРНК соответствующего кодона мРНК в организме человека.

В настоящем документе нуклеиновые кислоты включают ДНК, РНК и их аналоги, в том числе пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), и их смеси. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. При упоминании зондов или праймеров, необязательно меченых, например, обнаруживаемой меткой, например, люминесцентной или радиоактивной меткой, предусмотрены одноцепочечные молекулы. Длина таких молекул, как правило, достаточна для того, чтобы их мишень при гибридизации или праймировании библиотеки была статистически уникальна или была представлена низким числом копий (обычно менее 5, как правило, менее 3). Обычно зонд или праймер содержит последовательность по меньшей мере из 14, 16 или 30 расположенных подряд нуклеотидов, комплементарную или идентичную последовательности представляющего интерес гена. Зонды и праймеры могут включать 10, 20, 30, 50, 100 или более нуклеотидов в длину.

В настоящем документе пептид относится к полипептиду, который включает от 2 до 40 аминокислот в длину.

В настоящем документе аминокислоты, встречающиеся в различных приведенных в настоящем документе последовательностях аминокислот, определяются в соответствии с их известными, трехбуквенными или однобуквенными обозначениями (табл. 1). Нуклеотиды, встречающиеся в различных фрагментах нуклеиновых кислот, обозначены стандартными однобуквенными обозначениями, рутинно употребляемыми в уровне техники.

В настоящем документе термин аминокислота относится к органическому соединению, содержащему аминогруппу и карбоксильную группу. Полипептид содержит две или более аминокислот. В настоящем изобретении аминокислоты включают двадцать природных аминокислот, неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот (например, аминокислоты с боковой цепью у α-атома углерода).

В настоящем документе термин аминокислотный остаток относится к аминокислоте, образующейся при химическом расщеплении (гидролизе) полипептида по пептидным связям. Аминокислотные остатки по настоящему документу находятся в Ь изомерной форме.

Остатки в Ό изомерной форме, обозначенные таким образом, могут быть заменены на любой остаток Ь-аминокислоты, если при этом полипептид сохраняет желаемое свойство. ΝΗ₂ относится к свободной аминогруппе, присутствующей на аминоконце полипептида. СООН относится к свободной карбоксильной группе, присутствующей на карбоксильном конце полипептида. Аббревиатуры для обозначения аминокислотных остатков, соответствующие стандартной полипептидной номенклатуре, описан- 8 026112 ной в 1. ΒίοΙ. Скет, 243. 3557-3559 (1968) и принятой 37 С.Р.К. § 1.821-1.822, приведены в табл. 1.

Таблица 1. Таблица соответствия

Символ
Однобуквенное обозначение	Трехбуквенное обозначение	аминокислота
Υ	Туг	тирозин
О	О1у	глицин
Р	РЬе	фенилаланин
м	Ме!	метионин
А	А1а	аланин
8	8ег	серин
I	Не	изолейцин
Ь	Ьеи	лейцин
Т	ТЬг	валин
V	Уа1	треонин
Р	Рго	пролин
к	Ьуз	лизин
н	№з	гистидин
Ω	ΟΙη	глутамин
Е	О1и	глутаминовая кислота
Ζ	О1х	О1п и/или О1и
ЛУ	Тгр	триптофан
К	А Г 2	аргинин
□	Азр	аспарагиновая кислота
N	Азп	аспарагин
В	Азх	Азп и/или Азр
С	Суз	цистеин
X	Хаа	неизвестная или другая

Все последовательности аминокислотных остатков представлены в настоящем документе в виде формул при ориентации слева направо в обычном направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Термин аминокислотный остаток включает аминокислоты, перечисленные в табл. 1 соответствия, и модифицированные и необычные аминокислоты, такие как указанные в приведенных здесь в качестве ссылки § 1.821-1.822 37 С.Р.К. аминокислоты. Кроме того, следует отметить, что тире в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков обозначает пептидную связь с последовательностью из одного или более аминокислотных остатков, связь с аминоконцевой группой, такой как ΝΗ₂, или карбоксильной концевой группой, такой как СООН.

В настоящем документе природные аминокислоты относятся к 20 Ь-аминокислотам, которые встречаются в полипептидах.

В настоящем документе не природная аминокислота означает органическое соединение, которое имеет структуру, аналогичную природной аминокислоте, но измененное структурно, чтобы имитировать строение и реакционную способность природных аминокислот. Не встречающиеся в природе аминокислоты, таким образом, включают, например, аминокислоты или аналоги аминокислот за исключением 20 природных аминокислот и включают, но не ограничиваются, Ό-изостереомерами аминокислот. Примеры не природных аминокислот описаны здесь и известны специалистам в данной области.

В настоящем документе изокинетического смесь представляет собой смесь, в которой молярное соотношение аминокислот было скорректировано в зависимости от их скоростей реакции (см., например, ΟδΙίΌίΦ е1 а1., (1994) Вюро1утег§ 34: 1681).

В настоящем документе модификация применительно к изменению последовательности аминокислот полипептида или последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты и включает в себя удаление, вставку и замену аминокислот и нуклеотидов соответственно. Способы модификации полипептидов хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, технологию рекомбинантной ДНК.

В настоящем документе консервативные замены аминокислот понимаются, как известно специалистам в данной области, их введение, как правило, не изменяет биологическую активность полученных молекул. Специалистом в данной области очевидно, что, как правило, единичная аминокислотная замена в несущественных областях полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, \Уа150п е1 а1. Мо1еси1аг Вю1оду οί 1ке Сепе, 41Н Ейкюп, 1987, Тке Веп)ат1п/Ситт1пд8 РиЬ. со., с. 224). Такая замена может быть введена, как описано в табл. 1А, следующим образом.

- 9 026112

Таблица1 А

Исходный остаток	Консервативная замена
А1а (А)	С1у; 8ег
Аг8(К)	Ьуз
Азп(№>	Οίη; Ηΐ5
Суз (С)	Зег
О1п(<3)	Абп
О1и (Е)	Азр
О1у (О)	А1а; Рго
ΗΪ8 (Н)	Азп; С1п
Пе (1)	Ьеи; Уа1
Ьеи (Ь)	Пе; Уа1
Ьуз (К)	Агр: С1п; О1и
Ме1 (М)	Ьеи; Туг; Не
РЬе (Р)	Ме1; Ьеи; Туг
8ег (8)	ТЬг
ТЬг(Т)	8ег
Тгр (\У)	Туг
Туг(У)	Тгр; РЬе
Уа1 (V)	Не; Ьеи

Другие замены также допустимы и могут быть определены эмпирически или в соответствии с другим известными консервативными заменами.

В настоящем документе ДНК-конструкция представляет собой одноцепочечную или двухцепочечную, линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит фрагменты ДНК, комбинированные и соединенные в неприродном порядке. ДНК-конструкции существуют как результат человеческой манипуляции и включают клоны и другие копии искусственных молекул.

В настоящем документе фрагмент ДНК представляет собой часть более крупной молекулы ДНК с определенными атрибутами. Например, фрагмент ДНК, кодирующий указанный полипептид, представляет собой часть большей молекулы ДНК, такой как плазмида или фрагмент плазмиды, который при чтении от 5' к 3' кодирует последовательность аминокислот указанного полипептида.

В настоящем документе термин полинуклеотид означает одноцепочечный или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидных оснований, читаемый от 5' к 3' концу. Полинуклеотиды включают РНК и ДНК, и могут быть выделены из природных источников, синтезированы ίη νίΙΐΌ или получены комбинацией натуральных и синтетических молекул. Длину полинуклеотидных молекул в настоящем документе приводят в нуклеотидах (сокращенно н.т.) или парах оснований (сокращенно п.о.). Определение длины в нуклеотидах применяют для одноцепочечных и двухцепочечных молекул, где позволяет контекст. Когда термин применяют к двухцепочечной молекуле, он употребляется для обозначения общей длины и эквивалентен термину пара оснований. Специалисту в данной области техники очевидно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут незначительно отличаться по длине и что концы их могут быть расположены уступом, поэтому не все нуклеотиды в двухцепочечной молекуле полинуклеотида могут образовывать пары. Такие непарные концы, как правило, не превышают в длину 20 нуклеотидов.

В настоящем документе сходство между двумя белки или нуклеиновыми кислотами относится к подобию аминокислотных последовательностей белков или нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот. Сходство может быть определено по степени идентичности и/или гомологии последовательностей остатков и самих содержащихся в них остатков. Методы оценки степени сходства белков или нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области. Например, в одном методе оценки сходства последовательностей две аминокислотные или нуклеотидные последовательности выравнивают таким образом, чтобы достичь максимального уровня идентичности между последовательностями. Идентичность относится к степени, в которой аминокислотные или нуклеотидные последовательности инвариантны. При выравнивании аминокислотных последовательностей, и в некоторой степени нуклеотидных последовательностей, также возможно учитывать консервативные различия и/или частые замены аминокислот (или нуклеотидов). Различия являются консервативными при сохранении физикохимических свойств участвующих остатков. Выравнивание может быть глобальным (выравнивание сравниваемых последовательностей по всей длине последовательностей, включая все остатки) или локальным (выравнивание частей последовательностей, которые включают только наиболее близкие район или районы).

Идентичность имеет признанное в данной области значение и может быть рассчитана с применением опубликованных методов (см., например, Сотри1айоиа1 Мо1еси1аг Вю1о§у, Ьекк, А. М., изд. ОхГогй ишуеткку Ргекк, Нью-Йорк, 1988; Вюсотрийид: Шоттайск аий Оеиоте Рго)ес15. §тйй, Ό.ν., изд. Асайетю Ргекк, Нью-Йорк, 1993; СотриЮг Аиа1ук1к оГ Зес-Цюисе Оа1а, часть I, СттГйи, А.М. и СйГйи, Н.С., изд. Нитаиа Ргекк, Ие\у 1егкеу, 1994; Зециеисе Аиа1ук1к т Мо1еси1аг Вю1о§у, уои Нет)е, С., Асайетю Ргекк, 1987; и Зедиеисе Аиа1ук1к Рптег, СйЬккоу, М. аий Пеуетеих, к, изд. М ЗЮскЮи Ргекк, Ие\у Уотк,

- 10 026112

1991). Хотя существует множество методов определения идентичности между двумя полинуклеотидами или полипептидами, термин идентичность хорошо известен квалифицированному специалисту (СатШо,

H. , ЫрЮп, Ό., З1АМ 1 Аррйеб МаШ 48: 1073 (1988)).

В настоящем документе термин гомологичный (по отношению к последовательностям нуклеиновых кислот и/или аминокислот) означает большую или равную приблизительно 25% гомологию последовательностей, как правило, большую или равную 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% гомологию последовательностей; точный процент может быть указан, если это необходимо. В настоящем документе термины гомология и идентичность часто являются взаимозаменяемыми, если отдельно не указано иное. Как правило, для определения процента гомологии или идентичности последовательности выравнивают для достижения наибольшего совпадения остатков (см., например, СотрШаЙопа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, А.М., изд. ОхГогб Итуегкйу Ргекк, Ыете Уотк, 1988; Вюсошрибпд: ШГогта!кк апб Оепоте Ргсдеск, Зтйй, Ό.^., изд. Асабетк Ргекк, Ыете Уотк, 1993; СотрШег Апа1ук1к оГ Зедиепсе ΌαΙα, часть I, ОпГйп, А.М. и ОпГйп, Н.О., изд. Нитапа Ргекк, №\ν 1еткеу, 1994; Зедиепсе Апа1ук1к ш Мо1еси1аг Вк1оду, уоп Нет)е, О., Асабетк Ргекк, 1987; и Зедиепсе Апа1ук1к Рптег, Оййккоу, М. и Оеуегеих,

I. , изд. М Зксккп Ргекк, №\ν Уотк, 1991; СатШо и др. (1988) З1АМ 1 Аррйеб МаШ 48:1073). Для определения гомологии последовательностей количество консервативных аминокислот определяют с помощью стандартных алгоритмов программ выравнивания, при этом могут быть использованы установленные по умолчанию штрафы за разрыв, предусмотренные поставщиком программного обеспечения. Существенно гомологичные молекулы нуклеиновых кислот гибридизуются, как правило, при умеренно жестких условиях или при высоко жестких условиях по всей длине интересующих нуклеиновых кислот. Также предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, которые включают вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующихся молекулах нуклеиновых кислот.

Идентичность или гомология нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей любых двух молекул по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% может быть определена с помощью известных компьютерных алгоритмов, таких как программа РАЗТА, с использованием, например, параметров по умолчанию, как указано Реагкоп и др. (1988) Ргос. Ыаб. Асаб. ЗсГ ИЗА 85:2444 (другие программы включают пакет программ ОСО (Оеуегеих, 1. и др., Ыискк Аабк Кекеагсй 12(1): 387 (1984)), программы ВЬАЗТР, ВЬАЗТЫ, РАЗТА (А1ксйи1, З.Р. и др., 1 Мо1 Вю1 215: 403 (1990)); Ошбе к Ниде Сотриктк, Матйп 1. В1кйор, изд. Асабетк Ргекк, Зап Окдо, 1994 и СатШо и др. (1988) З1АМ 1 Аррйеб МаШ 48: 1073). Например, для определения идентичности может быть использована функция ВЬАЗТ базы данных Национального центра биотехнологической информации. Другие коммерчески или публично доступные программы включают программу МедАйдп от ПЫАЗбаг (Мэдисон, Висконсин) и программу Оар, разработанную компьютерной группой генетики Университета Висконсин (И^О) (Мэдисон, Висконсин). Процент гомологии или идентичности белков и/или молекул нуклеиновых кислот можно определить, например, путем сравнения их последовательностей с применением компьютерной программы ОАР (см., например, №еб1ешап и др. (1970) 1. Мо1. Вю1. 48:443, с изменениями от Зтйй и \Уа1егтап ((1981) Абу. Арр1. Ма1й. 2: 482). Программа ОАР определяет сходство как отношение количества выровненных символов (например, нуклеотидов или аминокислот), которые являются идентичными, к общему числу символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы ОАР могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичных символов и 0 для не идентичных) и взвешенную матрицу сравнения Спйккоу и др., (1986) Ыис1. Атбк Кек. 14:6745, как описано Зсй\уаг1/ и ЭауйоГГ в атласе белковых последовательнотей и структур Абак ОГ Ртокш Зедиепсе Апб ЗбисШте, Ыайопа1 Вюшебка1 Кекеагсй Роипбабоп, с. 353-358 (1979), (2) штраф в размере 3,0 для каждого разрыва и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом разрыве; и (3) штраф не применяют для разрывов на концах.

Таким образом, в настоящем документе термины идентичность или гомология относятся к сравнению исходного и исследуемого полипептида или полинуклеотида. В настоящем документе термин по меньшей мере на 90% идентичны относится к проценту идентичности от 90 до 99,99 по отношению к исходной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности полипептида. Принимая для иллюстративных целей длину сравниваемого и исходного полипептидов в 100 аминокислот, идентичность на уровне 90% и более свидетельствует о том, что не более 10% аминокислот (т.е. 10 из 100 аминокислот) в исследуемом полипептиде отличается от исходного полипептида. Подобное сравнение можно провести между исследуемым и исходным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точечных мутаций, случайным образом распределенных по всей длине полипептидной цепи, или они могут быть сосредоточены в одном или нескольких районах цепи различной длины вплоть до максимально допустимой, например, 10/100 отличающихся аминокислот (приблизительно, 90% идентичности). Отличия определяются как замены, вставки или делеции нуклеотидов или аминокислот. При уровне гомологии или идентичности выше приблизительно 85-90% результат не должен зависеть от выбранной программы и параметров штрафов за разрыв; такие высокие уровни идентичности могут быть легко оценены, часто с помощью ручного выравнивания без помощи программного обеспечения.

В настоящем документе выравнивание последовательностей относится к использованию гомологии

- 11 026112 (сходства и/или идентичности) для выравнивания соответствующих позиций в нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Как правило, две или более последовательностей, которые связаны 50% и большей идентичностью, выравниваются. Набор выровненных последовательностей относится к 2 или большему количеству последовательностей, которые выровнены в соответствующих позициях, и может включать последовательности, полученные на основе РНК, такие как ΕδΤ и другие кДНК, выровненные с последовательностью геномной ДНК.

В настоящем документе праймер относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые в соответствующих условиях (например, в присутствии четырех различных нуклеозидтрифосфатов и полимеризующего агента, такого как ДНК-полимераза, РНК-полимераза или обратная транскриптаза) в соответствующем буфере и при подходящей температуре могут выступать в качестве точки начала направляемого матрицей синтеза ДНК. Следует иметь в виду, что определенные молекулы нуклеиновых кислот могут служить в качестве зонда и в качестве праймера. Праймеры, однако, имеют на конце 3' гидроксильную группу для удлинения. Праймеры могут быть использованы для осуществления разнообразных методов, включая, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией (КТ)-ПЦР, ПЦР на РНК, ЛЦР, мультиплексную ПЦР, супрессионную ПЦР, ПЦР с захватом, ПЦР с экспрессией, 3' и 5' КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК), ίη 8Йи ПЦР, ПЦР с лигированием и другие протоколы амплификации.

Используемый в настоящем документе термин пары праймеров относится к набору праймеров, который включает 5' праймер (вышерасположенный), который гибридизуется с 5' концом амплифицируемой (например, методом ПЦР) последовательности, и 3' праймер (нижерасположенный), который гибридизуется с 3' концом амплифицируемой последовательности.

В настоящем документе термин специфически гибридизуется относится к отжигу оснований молекулы нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотида) с целевой молекулой нуклеиновой кислоты через комплементарное спаривание. Специалистам в данной области известны ίη νίίΓο и ίη νίνο параметры, которые влияют на специфическую гибридизацию, такие как длина и состав конкретной молекулы. Особенно важные для ίη νίίτο гибридизации параметры дополнительно включают температуру отжига и отмывания, состав буфера и концентрацию соли. Примеры условий отмывания для удаления неспецифически связанных молекул нуклеиновых кислот включают 0,1 х δδΡΕ, 0,1% δΌδ и 65°С при высокой жесткости и 0,2 х δδΡΕ, 0,1% δΌδ и 50°С при умеренной жесткости. Эквивалентные условия известны в уровне техники. Специалист в данной области для достижения специфической гибридизации молекул нуклеиновой кислоты с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты может легко изменить условия для конкретной задачи. При упоминании двух молекул нуклеиновых кислот комплементарность означает, что две нуклеотидные последовательности способны гибридизоваться, как правило, при наличии 25%, 15% или 5% не совпадающих нуклеотидов. При необходимости, может быть точно указан процент комплементарности. Как правило, две молекулы выбирают таким образом, что они гибридизуются при жестких условиях.

В настоящем документе термин в значительной степени идентичный по отношению к продукту означает достаточно близкий продукт, в котором интересующее свойство является в значительной степени неизменным, поэтому в значительной степени идентичный продукт может быть использован вместо исходного продукта.

В настоящем документе термины в значительной степени идентичные или сходные варьируются в зависимости от контекста, как это понимает специалист в данной области техники.

В настоящем документе аллельный вариант или аллельные различия относятся к любой из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один хромосомный локус. Аллельные различия естественно возникают в результате мутаций и могут привести к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в закодированном полипептиде) или могут приводить к полипептидам с измененной аминокислотной последовательностью. Термин аллельный вариант также используется здесь для обозначения белка, кодируемого аллельными вариантами гена. Обычно образцовая форма гена кодирует полипептид дикого типа и/или преобладающую форму полипептида в популяции или у одного представителя вида. Как правило, аллельные варианты, которые включают варианты между видами и внутри видов, обладают по меньшей мере 80%, 90% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с формой дикого типа и/или преобладающей формой у того же вида, причем степень идентичности зависит от гена и от того, является сравнение межвидовым или внутривидовым. Как правило, внутривидовые аллельные варианты обладают по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или большей идентичностью с формой дикого типа и/или преобладающей формой, в том числе 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью с формой дикого типа и/или преобладающей формой полипептида. Упоминание аллельного варианта в настоящем документе обычно относится к различиям в белках между представителями одного и того же вида.

Используемый здесь термин аллель является взаимозаменяемым с термином аллельный вариант и относится к альтернативным формам генов или их частей. Аллели занимают одинаковый локус или позицию в гомологичных хромосомах. Когда субъект имеет два одинаковых аллеля гена, субъект назы- 12 026112 вается гомозиготным субъектом по этому гену или аллелю. Когда субъект имеет два различных аллеля гена, субъект называется гетерозиготным по гену. Аллели конкретного гена могут отличаться друг от друга одним нуклеотидом или несколькими нуклеотидами и могут включать изменения, такие как замены, делеции и вставки нуклеотидов. Аллель гена также может быть одной из форм гена, содержащего мутацию.

В настоящем документе видовой вариант относятся к вариантам полипептида у различных видов, включая различные виды млекопитающих, такие как мышь и человек.

В настоящем документе вариант сплайсинга относится к варианту, образованному в результате различного процессинга первичного транскрипта геномной ДНК, что приводит более чем к одному типу мРНК.

Используемый здесь термин промотор означает часть гена, содержащую последовательность ДНК, которая обеспечивает связывание РНК-полимеразы и инициацию транскрипции. Промоторная последовательность обычно, но не всегда, находится в 5'-некодирующей области гена.

В настоящем документе выделенный или очищенный полипептид или белок или его биологически активная часть практически не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клеток или тканей, из которых происходит белок, или является в значительной степени свободным от химических веществ-предшественников и других химических веществ при его химическом синтезе. Препараты могут быть определены как существенно чистые, если они являются свободными от легко обнаруживаемых примесей, определяемых с помощью стандартных способов анализа, таких как тонкослойная хроматография (ТСХ), гель-электрофорез и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), используемых специалистами в области техники для оценки чистоты, или препараты могут быть определены как достаточно чистые, если дальнейшая очистка не изменяет физические и химические свойства вещества, такие как энзиматическая (ферментативная) и биологическая активность. Способы очистки соединений для получения существенно химически чистых соединений известны специалистам в данной области. Существенно химически чистые соединения, однако, могут представлять собой смесь стереоизомеров. В таких случаях дополнительная очистка может увеличить удельную активность соединения.

Термин практически не содержит клеточный материал относится к препаратам белков, в которых белок отделен от компонентов клеток, из которых он был выделен или получен рекомбинантно. В одном варианте термин практически не содержит клеточный материал относится к препаратам белкафермента, имеющего менее 30% (на сухой вес) белков не, являющихся ферментом, (также называемых здесь загрязняющими белками), как правило, менее 20% белков не, являющихся ферментом, или 10% белков не, являющихся ферментом, или менее приблизительно 5% белков не, являющихся ферментом. Если фермент представляет собой рекомбинантный белок, он также является практически свободным от питательной среды, т.е. среда культивирования составляет менее приблизительно 20%, 10% или 5% от объема препарата белка-фермента.

Используемый здесь термин практически не содержит химических веществ-предшественников и других химических веществ относится к препарату фермента, в котором белок отделен от химических веществ-предшественников и других химических веществ, которые использовали в синтезе белка. Этот термин включает препараты фермента, содержащие менее 30% (на сухой вес), 20%, 10%, 5% или менее химических веществ-предшественников или химических веществ и компонентов, не являющихся ферментом.

В настоящем документе термин синтетический, употребляемый, например, по отношению к синтетическим молекулам нуклеиновой кислоты, синтетическим генам или синтетическим пептидам относится к молекуле нуклеиновой кислоты или полипептиду, которые получают с помощью рекомбинантных методов и/или методов химического синтеза.

В настоящем документе получение рекомбинантными методами или с помощью методов рекомбинантной ДНК означает использование известных методов молекулярной биологии для экспрессии белков, кодируемых клонированной ДНК.

В настоящем документе вектор (или плазмида) относится к дискретному элементу, который используется для введения гетерологичных нуклеиновых кислот в клетки для их экспрессии или репликации. Векторы обычно остаются в эписомном состоянии, но могут быть разработаны векторы для интеграции гена или его части в хромосому генома. Также предусмотрены векторы, которые представляют собой искусственные хромосомы, такие как бактериальные искусственные хромосомы, искусственные хромосомы дрожжей и искусственные хромосомы млекопитающих. Процедуры выбора и использования таких векторов хорошо известны специалистам в данной области.

В настоящем документе вектор экспрессии включает векторы, способные экспрессировать ДНК, функционально связанную с регуляторными последовательностями, такими как промоторные районы, которые способны вызывать экспрессию таких фрагментов ДНК. Дополнительные последовательности могут включать промоторные и терминаторные последовательности и, при необходимости, могут включать одну или несколько точек начала репликации, один или более маркеров для отбора, энхансер, сигнал полиаденилирования и тому подобное. Векторы экспрессии обычно получают из плазмидной или

- 13 026112 вирусной ДНК, или вектор может содержать элементы того и другого. Таким образом, вектор экспрессии относится к рекомбинантным ДНК или РНК конструкциям, например, плазмидам, бактериофагам, рекомбинантным вирусам или другим векторам, которые после введения в соответствующую клеткухозяина приводят к экспрессии клонированной ДНК. Соответствующие векторы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области и включают векторы, которые реплицируются в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, векторы, которые остаются в эписомном состоянии, или векторы, которые интегрируются в геном клетки-хозяина.

В настоящем документе вектор также включает вирусный вектор или вирусные векторы. Вирусные векторы представляют собой сконструированные вирусы, функционально связанные с экзогенным геном для передачи (как носитель или челнок) экзогенного гена в клетки.

В настоящем документе термины функционально или функционально связанный по отношению к сегментам ДНК означают, что сегменты расположены так, что они функционируют в соответствии с их назначением, например, транскрипция инициируется после промотора и проходит через кодирующий сегмент до терминатора.

В настоящем документе термин оценка относится к качественному и количественному определению абсолютного значения активности белка, такого как фермент, например, протеаза, или его домена, присутствующих в образце, а также к получению индекса, коэффициента, процента, визуального показателя или другого показателя уровня активности. Оценка может быть прямой или косвенной, и химические вещества, определяемые в процессе исследования, не обязательно должны представлять собой непосредственно продукт реакции, например, непосредственный продукт протеолиза, но могут представлять собой, например, производные или некоторые дополнительные вещества. Например, обнаружение продукта расщепления белка можно проводить, например, с помощью 8Ό8-ΡΑΟΕ и окрашивания белка Кумасси синим.

Используемый здесь термин биологическая активность относится к активности соединения ίη νίνο или к физиологической реакции, которая проявляется при ίη νίνο введении соединения, композиции или другой смеси. Биологическая активность, таким образом, охватывает терапевтический эффект и фармацевтическую активность таких соединений, композиций и смесей. Биологическую активность можно наблюдать в ίη νίίΓο системах, предназначенных для исследования или использования такой активности. Таким образом, например, биологическая активность протеазы представляет собой ее каталитическую активность, при которой происходит гидролиз полипептида.

Используемый в настоящем документе термин эквивалент в отношении двух последовательностей нуклеиновых кислот означает, что две интересующие последовательности кодируют одну последовательность аминокислот или эквивалентные белки. Термин эквивалент в отношении двух белков или пептидов означает, что два белка или пептида обладают в значительной степени одинаковой аминокислотной последовательностью и включают только такие аминокислотные замены, которые существенно не изменяют активности или функции белка или пептида. Термин эквивалент в отношении свойства не обязательно означает, что свойство присутствует в той же степени (например, два пептида могут проявлять одну ферментативную активность при разной скорости катализа), но при этом активность, как правило, остается в значительной мере одинаковой.

В настоящем документе термины модулирует и модуляция или изменяет относятся к изменению активности молекулы, такой как белок. Примеры активности включают, но не ограничиваются биологической активностью, такой как передача сигнала. Модуляция может включать повышение активности (т.е. усиление активности или агонистическую активность), снижение активности (т.е. ослабление активности или ингибирование) или любые другие изменения активности (такие как изменения периодичности, частоты, длительности, кинетики или другого параметра). Термин модуляция зависит от контекста, как правило, модуляция относится к изменению параметра одного объекта по сравнению с другим указанным объектом, например, белком дикого типа, белком в основном состоянии или белком, экспрессируемым в указанном типе клеток или при определенном состоянии.

В настоящем документе композиция (состав) относится к любой смеси. Композиция (состав) может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, может быть водной или неводной или представлять собой комбинацию указанных типов.

В настоящем документе комбинация относится к любому соединению двух или более элементов. Комбинация может представлять собой два или более отдельных элемента, таких как две композиции или две совокупности, может представлять собой их смесь, например смесь двух или более элементов, или любые их вариации. Элементы комбинации, как правило, функционально связаны или сходны.

В настоящем документе набор относится к упакованной комбинации, которая дополнительно включает в себя другие элементы, такие как дополнительные реагенты и инструкции по применению комбинации или указанных элементов.

Используемый здесь термин заболевание или нарушение относится к патологическим состояниям организма, которые возникли в результате факторов или состояний, включающих, но не ограничивающихся инфекцией, приобретенными состояниями, генетическими состояниями и характеризуются идентифицируемыми симптомами. Заболевания и нарушения в настоящем документе включают заболевания

- 14 026112 и нарушения, поддающиеся лечению иммуноглобулинами.

В настоящем документе лечение субъекта с заболеванием или состоянием означает, что симптомы субъекта частично или полностью облегчаются или остаются неизменными после лечения. Поэтому лечение включает профилактику, процесс лечения и/или излечение.

Профилактика относится к предотвращению возможного заболеваний и/или предотвращению ухудшения симптомов или прогрессирования заболевания. Лечение также включает любое фармацевтическое применение предусмотренных здесь препаратов иммуноглобулинов и композиций.

В настоящем документе фармацевтически эффективный агент включает любое терапевтическое средство или биологически активное вещество, включая, но не ограничиваясь, например, анестетиками, вазоконстрикторами, диспергирующими агентами, обычными терапевтическими препаратами, включая низкомолекулярные препараты и терапевтические белки.

В настоящем документе лечение представляет собой любой способ уменьшения или иного благотворного изменения симптомов состояния, расстройства или заболевания.

В настоящем документе терапевтический эффект представляет собой эффект лечения субъекта, который заключается в изменении, как правило, улучшении или смягчении симптомов заболевания или состояния, или заключается в излечении заболевания или состояния.

Терапевтически эффективное количество относится к количеству композиции, молекулы или соединения, которое приводит к терапевтическому эффекту после введения субъекту.

Используемый здесь термин субъект относится к животному, в том числе млекопитающему, такому как человек.

В настоящем документе термин пациент относится к человеческому субъекту.

В настоящем документе улучшение симптомов заболевания или расстройства посредством лечения, например, фармацевтической композицией или лекарственным средством, относится к любому уменьшению симптомов, постоянному или временному, устойчивому или кратковременному, связанному с введением или приписываемому введению композиции или лекарственного средства.

В настоящем документе профилактика или предотвращение относится к способам уменьшения риска развития заболевания или состояния.

В настоящем документе терапевтически эффективное количество или терапевтически эффективная доза соединения или композиции представляет собой количество агента, соединения, материала или композиции, содержащей соединение, которое является, по меньшей мере, достаточным для проявления терапевтического эффекта. Таким образом, указанное количество необходимо для предотвращения, лечения, смягчения, устранения или частичного устранения симптомов заболевания или нарушения.

В настоящем документе единичная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, пригодным для человека и животных, содержащимся в индивидуальной упаковке, как известно в уровне техники.

В настоящем документе единичная дозированная композиция относится к композиции для непосредственного введения.

В настоящем документе изделие представляет собой продукт, который изготавливается и продается. В настоящем документе термин охватывает композиции 1д и гиалуронидазы, содержащиеся в упаковке.

В настоящем документе жидкая композиция относится к любой композиции, которая может течь. Таким образом, жидкие композиции включают композиции в полутвердой форме, пасты, растворы, водные смеси, гели, лосьоны, кремы и другие подобные композиции.

В настоящем документе набор относится к комбинации предусмотренных в настоящем документе композиций и другого объекта, предназначенного, например, для восстановления и активации, введения, диагностики и оценки биологической активности или свойства. Наборы необязательно включают инструкции по использованию.

В настоящем документе клеточный экстракт или лизат относится к смеси или фракции, которая состоит из лизированных или разрушенных клеток.

В настоящем документе животное включает любое животное, включая, но не ограничиваясь приматами, например, человеком, гориллой и низшими приматами, грызунами, такими как мыши и крысы, птицами, такими как куры, жвачными животными, например, козами, коровами, оленями, овцами, свиньями, и другими животными. Термин животные, не представляющие собой человека, исключает человека из круга предусмотренных животных. Ферменты, предусмотренные здесь, представляют собой ферменты из любого источника, включая животных, растения, прокариоты и грибы. Большая часть ферментов представляют собой ферменты животного происхождения, в том числе ферменты млекопитающих.

В настоящем документе контроль относится к образцу, который в значительной мере идентичен исследуемому образцу, за исключением того, что он не обладает в какой-то мере исследуемым параметром, или, если речь идет об образце плазмы, контроль может быть взят у нормального добровольца, не затронутого интересующим состоянием. Контроль также может представлять собой внутренний контроль.

- 15 026112

В настоящем документе упоминание понятий в единственном числе также включает множественное число, если контекст с очевидностью не указывает на иное. Таким образом, например, упоминание молекулы, включающей внеклеточный домен относится к молекулам с одним или несколькими внеклеточными доменами.

В настоящем документе диапазоны и количества могут быть обозначены как конкретные значения с добавлением термина приблизительно. Термин приблизительно также включает в себя точное значение. Следовательно, приблизительно 5 оснований означает приблизительно 5 оснований, а также 5 оснований.

В настоящем документе термины по желанию или необязательно означают, что описанные явления или обстоятельства могут иметь место или могут не иметь места, и что описание включает случаи, когда указанное явление или обстоятельство происходит, и случаи, когда это не так. Например, необязательно замещенная группа означает, что группа не является замещенной или является замещенной.

В настоящем документе аббревиатуры для любых защитных групп, аминокислот и других соединений, если не указано иное, употребляются в соответствии с их обычным использованием и являются признанными аббревиатурами, или употребляются в соответствии с Комиссией по биохимической номенклатуре ГИРАС-ГИВ (см. (1972) ВюсЬет. 11: 1726).

В. Совместные стабильные композиции иммуноглобулина (Гд) и гиалуронидазы

В настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции, содержащие иммуноглобулин (Гд) и гиалуронидазу. Совместные композиции сохраняют распределение молекулярного размера Гд и активность гиалуронидазы после длительного хранения в жидком виде при комнатной температуре (например, при 28-32°С) в течение не менее шести месяцев, Как правило, совместные композиции также сохраняют распределение молекулярного размера Гд и активность гиалуронидазы при хранении при стандартных температурах холодильника в течение по меньшей мере 1-2 лет. Совместные композиции могут быть использованы для лечения поддающихся лечению с помощью Гд заболеваний и состояний. В частности, стабильные совместные композиции, указанные в настоящем документе, изготовлены для подкожного введения.

1. Лечение иммуноглобулином

Иммуноглобулин является лекарственным средством, которое в первую очередь используется для лечения пациентов с иммунодефицитом. Расстройства, связанные с дефицитом иммуноглобулина, являются иммунодефицитами, для которых характерно отсутствие или снижение уровня сывороточных иммуноглобулинов, что приводит к повышенной восприимчивости к бактериальным инфекциям, особенно синусно-пульмонального тракта. Иммунодефициты делятся на первичные (генетические) и вторичные (приобретенные). Первичные иммунодефициты встречаются редко и включают в себя агаммаглобулинемию, сцепленную с Х-хромосомой, дефицит тяжелых цепей иммуноглобулинов, селективный дефицит иммуноглобулина О (ГдО), общий вариабельный иммунодефицит, сцепленный с Х-хромосомой синдром повышенного содержания иммуноглобулина М. Пониженные уровни иммуноглобулинов также выявляются у людей с комбинированными иммунодефицитами, связанными с дефектами Т- и В-клеток, включая, но не ограничиваясь тяжелым комбинированным иммунодефицитом или синдромом ВискоттаОлдрича (ГИГБ БаепБйс СоттШее, 1999). Более распространенными являются вторичные иммунодефициты, вызванные с различными факторами, включая, но не ограничиваясь недоеданием, вирусами, старением и лейкемией.

Людям с этими заболеваниями требуется заместительная терапия иммуноглобулином, чтобы предотвратить инфекцию или уменьшить ее тяжесть.

Заместительная терапия иммуноглобулинами была впервые применена в 1952 году с помощью внутримышечного и подкожного введения. Однако для эффективного лечения необходимы большие количества Гд, что привело к появлению внутривенно вводимых препаратов с низкой концентрацией Гд (50100 мг/мл). С 1981 года большинство доступных в Соединенных Штатах иммуноглобулиновых препаратов - это препараты для внутривенного введения. В основном иммуноглобулиновые препараты - это стерильные, очищенные продукты, которые содержат иммуноглобулин О (ГдО, ГдМ, ГдА или их комбинации). Как правило, иммуноглобулиновые препараты содержат 95-99% ГдО и только следовые количества иммуноглобулинов А (ГдА), М (ГдМ), Ό (ГдИ) и Е (ГдЕ). Гд препараты для внутривенного введения, как правило, содержат от 3 до 12% Гд.

Недавно были разработаны иммуноглобулиновые препараты для подкожного введения (Оагби1£ е1 а1. (2006) Сигг. 0рш. А11егду СПп. Гттипо1. 6: 434-42; Оагби1£ е1 а1. (2006) I. С1ш. Гттипо1. 26: 177-85; 0сЬ8 е1 а1. (2006) I. С1т. Гттипо1. 26:265-73) и по меньшей мере один продукт, ^уад1оЪш®, лицензирован для подкожного введения в США. Подкожное введение Гд по сравнению с внутривенным имеет ряд преимуществ, таких как лучшая переносимость и возможность лечения на дому.

Биодоступность иммуноглобулина при подкожном введении в целом меньше, чем при внутривенном введении. После введения внутривенно иммуноглобулины сразу же становятся доступны в крови и медленно достигают равновесия с экстрасосудистым компартментом в течение от 3 до 5 дней (БсЫ££ е1 а1. (1986) I. СПп. Гттипо1. 6: 256-64). Подкожно вводимый иммуноглобулин медленно всасывается из подкожного пространства в кровь и в то же время достигает равновесия с экстрасосудистым компар- 16 026112 тментом, при этом отсутствует всплеск IV содержания иммуноглобулина. Биодоступность не была хорошо изучена, но в недавнем испытании препаратов ΖΕΒ-ВеЬгшд (например, νίναβίοόίη ®), путем измерения площади под кривой (ЛИС) было определено, что поглощалось только 67% иммуноглобулина, и, таким образом, рекомендуемая доза составляет 137% от дозы для внутривенного введения (0сЬз еί а1. (2006) ί. Οίη. 1ттипо1. 26: 265-73). Несмотря на технические трудности при сравнении ЛИС для двух разных способов и частот приема, исследования подкожного введения иммуноглобулина на кроликах позволяют предположить, что при подкожном введении биодоступность снижается. Это может быть связано со способом абсорбции больших белковых молекул, которые не могут диффундировать через стенки капилляров, и поэтому должны поглощаться через лимфатическую систему (§ирег8ахо еί а1. (1990) РЬагт. Ке8. 7:167-9).

Все препараты иммуноглобулинов, используемые в настоящее время для подкожного введения, содержат 16% 1д, в отличие от иммуноглобулиновых препаратов для внутривенного введения, которые содержат от 5 до 12% 1д. Более высокая концентрация иммуноглобулинов в препаратах для подкожного введения по сравнению с препаратами для внутривенного введения позволяет уменьшить объем инфузий, такие препараты не могут вводиться внутривенно. Этот способ подкожной иммуноглобулиновой терапии считается эффективным, безопасным, а также высоко оценивается пациентами, так как имеет низкий риск системных побочных эффектов и приводит к более высокой остаточной сывороточной концентрации 1§О по сравнению с ежемесячными внутривенными инфузиями (Оагби1£ еί а1. (1995) ί. Αάν. №ιγ5., 21: 917-27; Оагби1Г е1 а1. (1993) С1ш. Ехр. 1ттию1, 92:200-4; Оагби1£ е1 а1. (1991) ЬаисеБ 338: 162-6).

Кроме меньшей биодоступности при подкожном введении 1д, есть и другое различие между подкожным и внутривенным введением: лишь небольшие объемы могут вводиться подкожно в каждое место, что требует использования нескольких мест для введения при недельном или двухнедельном (или более длительном) курсе. В целом, для взрослых объем подкожной инфузии в одно место введения может составлять 20-40 мл, для детей в одно место введения возможно вводить меньшие объемы. В настоящее время общепринятой дозировкой для внутривенного введения является доза 300-600 мг/кг раз в 3-4 недели или, для подкожного введения 100-200 мг/кг раз в неделю (Вегдег (2008) ЮтишЕ А11егду С1ш. №г1Н Ат. 28(2):413-438). Таким образом, подкожно вводится до 15 г 1д в неделю. Это означает, что необходимо введение 16-20% 1д по меньшей мере в 3 места введения в неделю. Хотя введение раз в неделю или раз в две недели имеет дополнительное преимущество в виде поддержания более высокого минимального уровня агента, по сравнению с введением раз в месяц, требование проведения нескольких уколов было сдерживающим фактором для многих пациентов.

Тем не менее, для иммуноглобулиновой терапии подкожные методы введения становится все более популярной альтернативой внутривенному введению. Пациенты, к которым неприменимы внутривенные инфузии иммуноглобулинов, часто оказываются толерантными к подкожным инъекциям. Подкожное введение считается эффективным, безопасным, а также имеет высокую оценку от пациентов, так как имеет низкий риск системных побочных эффектов и может применяться в домашних условиях или в стационаре (Оагби1£ еί а1. (1995) ί.Αάν. №г§. 21: 917-27; Оагби1£ еί а1. (1993) С1ш. Ехр. Iттииο1. 92: 200-4; Оагби1£ е1 а1. (1991) ^аисеί 338: 162-6).

2. Подкожное введение композиций иммуноглобулина и гиалуронидазы

Биодоступность 1д при подкожном введении увеличена при введении в сочетании с гиалуронидазой, что позволяет сделать дозировки и частоты подкожного введения иммуноглобулина сравнимыми с таковыми при внутривенном введении (см., например, заявку США № 2010-0074885 и международную заявку \У0 2009-117085, каждая из которых включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме). Подкожное (ПК) пространство, образованное сетью коллагеновых питей и заполненное гиалуроновой кислотой, желеобразным веществом, в значительной степени обеспечивает сопротивление жидкости в тканях. Гиалуронидазы относятся к семейству природных ферментов, которые расщепляют гиалуроновую кислоту, которая является заполняющим пространство гелеобразным веществом, обнаруживаемым во внеклеточном матриксе и в тканях и органах по всему организму, таких как кожа и глаза.

Гиалуронидаза расщепляет глюкозамидные связи в гиалуроновой кислоте между С1 Х-ацетилглюкозаминовым фрагментом и С₄ глюкуронового фрагмента. Это временно снижает вязкость клеточного матрикса и способствует диффузии введенных жидкостей, способствуя тем самым их поглощению. После этого гиалуроновая кислота восстанавливается в исходное состояние в течение 24 ч. Соответственно биодоступность, фармакокинетика и/или фармакодинамические характеристики совместных композиций, содержащих гиалуронидазу, улучшаются. На основании экспериментов на животных можно сказать, что увеличение дисперсии жидкости позволяет вводить до 1 л в час подкожно, что примерно равно значениям при внутривенном введении.

При наличии гиалуронидазы биодоступность подкожно вводимых 1д увеличивается, как правило, до более чем 90% от биодоступности 1д при лечении с применением внутривенного введения. Кроме того, при совместном введении с растворимой гиалуронидазой возможны инфузии больших объемов в одном месте подкожного введения. Например, в одно место единовременно можно вводить до 600 мл и более препарата иммуноглобулина, например, 200 мл, 300 мл, 400 мл, 500 мл, 600 мл и более могут быть однократно введены в одно место введения. К примеру, препараты 1д, содержащие примерно 5-12%, на- 17 026112 пример, 10% белка, которые обычно применяются только для внутривенной иммуноглобулиновой терапии, могут быть введены подкожно совместно с растворимой гиалуронидазой в дозах, эквивалентных однократным месячным дозам для внутривенного введения, например, приблизительно 100 мг/кг, 200 мг/кг, 300 мг/кг, 400 мг/кг, 500 мг/кг, 600 мг/кг или более. Препараты Гд в композиции с гиалуронидазой можно вводить при более высоких концентрациях белка, к примеру, 12-25% Гд например, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% или более. Препараты можно вводить в виде разовой дозы или разделить на несколько доз ежедневно или еженедельно, например, раз в неделю или раз в две, три или четыре недели, или комбинированно. Таким образом, Гд в случае подкожного введения в присутствии гиалуронидазы можно вводить один раз в месяц в предпочтительной дозе для ГУО для конкретного терапевтического показания. Кроме того, так как гиалуронидаза образовывает каналы в коже, она может увеличить скорость инфузии. Таким образом, препараты иммуноглобулинов для подкожных инфузии, вводимые совместно с гиалуронидазой, позволяют увеличивать скорость инфузии и тем самым сокращать время иммуноглобулиновой терапии.

При подкожном введении Гд в присутствии гиалуронидазы могут быть решены некоторые или все ограничения и проблемы, связанные с подкожным введением Гд.

Таким образом, в силу дисперсионных свойств гиалуронидазы при подкожном введении Гд в присутствии растворимой гиалуронидазы возможно применять аналогичные ГУО введению дозы при аналогичной ГУО введению частоте один раз в месяц, сохраняя при этом аналогичную ГУГО введению биодоступность.

3. Стабильные совместные композиции

Так как подкожно вводимые препараты иммуноглобулина имеют преимущества в виде возможности лечения на дому, в настоящем документе предусмотрены стабильные, готовые к применению препараты Гд и гиалуронидазы. Белки, используемые для терапии, как правило, в процессе обработки и хранения подвергаются целому ряду воздействий, в том числе с низкому рН, колебаниям температуры, различным компонентам буферов и ионной силе, и, зачастую, высокой концентрации белка в окончательной композиции. Чтобы быть эффективной, однако, совместная композиция должна сохранять достаточную активность Гд и гиалуронидазы. Таким образом, совместная композиция Гд и гиалуронидазы должна быть предусмотрена в виде стабильного раствора для хранения в виде водного раствора, качество которого не ухудшается в течение длительного периода времени. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены стабильные жидкие совместные композиции Гд и гиалуронидазы. Совместные композиции предусмотрены в виде дозированных форм, которые могут быть использованы непосредственно для инъекции, т.е. без разбавления до применения.

Было установлено, что совместная композиция, полученная добавлением гиалуронидазы, обозначаемой гНиРН20, к препарату Гд перед введением, не была стабильной при комнатной температуре. Добавление соли повышает стабильность композиции, в частности, поддерживает активность гиалуронидазы в композиции. Таким образом, в дополнение к содержанию эффективного количества Гд и гиалуронидазы, стабильная совместная композиция по настоящему документу также содержит не менее 50 мМ хлорида щелочного металла, например, №С1 или КС1. Как правило, стабильная совместная композиция также содержит аминокислоты, например, глицин, в качестве стабилизатора, и ее рН составляет приблизительно от 4 до 5. В целом, отношение гиалуронидазы к Гд в совместной композиции выше, чем при отдельном подкожном введении тех же продуктов (Гд и гиалуронидазы) при таком же количестве Гд, например, при последовательном введении.

Как правило, стабильная совместная композиция представляет собой жидкую композицию. Хранение совместной композиция непосредственно в жидком виде и стабильность при хранении в жидком виде удобно простотой введения без восстановления и возможностью поставлять композицию в заполненных, готовые к применению шприцах или в виде препаратов для многократного введения. Таким образом, жидкие совместные композиции обеспечивают готовые к применению препараты Гд и гиалуронидазы для подкожного введения субъекту без необходимости точного и стерильного восстановления препарата и ожидания просветления раствора до введения препарата субъекту. Это упрощает процедуру введения композиции субъекту врачом. Кроме того, процесс производства жидких лекарственных форм является упрощенным и более эффективным по сравнению с процессом изготовления лиофилизированной формы, так как всех этапы производства жидкой лекарственной формы проводят в водном растворе без процесса сушки, например, лиофилизации или сублимационной сушки. Соответственно это также более экономически эффективно. Стабильные совместные композиции могут быть предусмотрены в виде жидкого раствора в контейнере или шприце. Такие совместные композиции удобно вводить человеку или другим млекопитающим как фармацевтический препарат без дополнительного восстановления, при этом введение может осуществлять врач или сам пациент.

Кроме того, благодаря своей высокой стабильностью при хранении совместные композиции могут содержать высокую концентрацию белка в диапазоне от 10 до 22% Гд, например, от 10 до 20% Гд, без негативного воздействия на биологическую активность (активности) Гд из-за агрегации белка и/или фрагментации в процессе длительного хранения. Такая стабильность не только обеспечивает эффективность совместных композиций Гд, но и снижает возможные риски нанесения ущерба субъекту. Таким

- 18 026112 образом, стабильные совместные композиции по настоящему документу сохраняют активность гиалуронидазы и активность 1д при минимизации самоассоциации и агрегации 1д. В целом, активность сохраняется при температуре до 32°С, например, приблизительно от 0 до 32°С, как правило, приблизительно от 28 до 32°С. Устойчивость совместной композиции сохраняется в течение длительного периода времени, например, в течение дней, недель, месяцев, лет или более. Совместные композиции имеют то преимущество, что они устойчивы в жидком виде при хранении в течение длительного периода времени по меньшей мере в течение 6 месяцев. В одном примере стабильные совместные композиции стабильны в жидком виде по меньшей мере в течение 1 года и более, например, от 1 года до 2 лет, например, 1 год, 2 года или более при стандартной температуре холодильника (приблизительно 4 ± 2°С, или приблизительно 28°С, или в пределах от 0-10°С). В другом примере совместные композиции устойчивы в жидком виде при хранении при комнатной температуре (в диапазоне 18-32°С, например, от 28 до 32°С) в течение не менее шести месяцев. Например, стабильные совместные композиции при хранении при комнатной температуре, как правило, имеют срок годности по меньшей мере приблизительно от 6 месяцев до 18 месяцев, например, 6 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев или более.

В следующих разделах описаны композиции по настоящему документу, в том числе примеры иммуноглобулинов и гиалуронидазы в композициях, способы их получения и способы применения стабильных совместных композиций для лечения поддающихся лечению 1д заболеваний и состояний.

С. Иммуноглобулин и получение иммуноглобулинов

В настоящем документе предусмотрены иммуноглобулины (1д, также известные как иммуноглобулины, гамма-глобулины или 1дС), которые могут быть изготовлены в виде стабильных композиций с гиалуронидазой. Стабильные совместные композиции могут быть использованы для лечения поддающихся лечению 1д заболеваний и состояний.

Иммуноглобулины представляют собой гамма-глобулиновые белки, производимые гуморальной иммунной системой и обнаруживаемые в плазме высших животных. 1д усиливают иммунную систему путем модуляции активности комплемента, подавления продукции аутоантител, насыщения или блокирования Рс рецепторов на макрофагах и В-лимфоцитах, а также подавления продукции воспалительных медиаторов, таких как цитокины, хемокины и металлопротеиназы. 1д включают пять классов или изотипов антител (1дС, 1дА, 1дМ, 1дЕ и 1дЭ) и различные подклассы, каждый со своими особенностями. 1дС является наиболее преобладающим классом 1д в крови и играет важную роль во вторичной иммунной реакции и защите тканей от инфекции. Табл. 2 иллюстрирует типичное количество иммуноглобулинов в сыворотке крови, хотя при получении препаратов 1д для лечения используемые стадии очистки могут изменить соотношение того или иного класса или классов иммуноглобулинов. Например, для обогащения смеси иммуноглобулинов 1дС или определенным подтипом 1дС может быть использована хроматография на сефарозе с белком А, белком С или белком Н (см., например, Наг1о\у и Ьапе (1999) Икшд АпИЬой1е8, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге88; Наг1о\у и Ьапе (1988) АпйЬоФек, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогаШгу Ргекк; патент США № 5180810).

Таблица 2. Сывороточные иммуноглобулины

Класс 1§	Уровень в сыворотке, мг/мл (%)	Функции
180	1200 (77)	Главный класс Ιβ у человека, вторичный иммунный ответ, защита от инфекции
1бА	200(13)	Защита слизистых оболочек
1ёМ	150 (9)	Главный Ιβ для первичного иммунного ответа
Ιεϋ	2(01)	Регуляция В клеток
№	□ 1 (следы)	Главный Ιβ при аллергии

1. Получение и очистка

Препараты иммуноглобулинов по настоящему документу могут быть получены из любого подходящего исходного материала. Например, иммуноглобулины могут быть выделены из крови человека или животного, например, из человеческой донорской сыворотки, или получены другими способами, например, с помощью технологии рекомбинантной ДНК или гибридомной технологии. Таким образом, препараты иммуноглобулинов могут включать моноклональные или рекомбинантные иммуноглобулины. Например, иммуноглобулин может быть получен из тканей, культуры гибридомы лимфоцитов, плазмы или сыворотки крови или рекомбинантных клеточных культур с помощью любой подходящей процедуры, например, осаждения (спиртовое фракционирование по Кону или фракционирования полиэтиленгликолем), хроматографических методов (ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, иммуноаффинной хроматографии); ультрацентрифугирования или электрофоретического получения (см., например, Соки и др. (1946), 1. Ат. 8ос. Скет. 68: 459-75; Опс1еу и др. (1949) 1. Ат. Скет. 8ос., 71:541-50; Вагапйет и др. (1962) Уох 8апд, 7: 157-74, КоЬ1е1 и др. (1967) Уох 8апд, 13:93-102, патенты США № 5122373 и 5177194). Как правило, иммуноглобулин получают из содержащих гамма-глобулин продуктов, полученных спиртовым фракционированием и/или ионообменной и аффинной хроматографией, хорошо известными специалистам в этой области.

- 19 026112

Для обогащения конкретным изотипом или подтипом иммуноглобулина могут быть использованы дополнительные препаративные стадии. Например, для обогащения смеси иммуноглобулинов 1§С или конкретным подтипом 1§С может быть использована хроматография на сефарозе с белком А, белком С или белком Н (см., например, Наг1оте и Ьане (1999) Иктд АйФоФек, Со1Ь §ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк; Наг1о№ и Ьане (1988) АйФоФек, А ^аЬο^аίο^у Маииа1, Со1Ь §ргшд НагЬог ^аЬο^аίο^у Ргекк; патент США № 5180810).

a. Метод Кон-Онкли

Обычные промышленные способы очистки иммуноглобулинов из плазмы крови основаны на холодном спиртовом фракционировании, при котором совместно выпадают в осадок группы белков на основе их изоэлектрической точки при данной концентрации спирта и при минусовых температурах, указанный метод был разработан Коном и изменен Онкли (см., например, СоЬи и др. (1946), ί. Ат. §ое. СЬет. 68: 459-75; Онс1еу и др. (1949) 1. Ат. СЬет. §ое., 71: 541-50). Использование спирта в процессе очистки может инактивировать потенциально загрязняющие вирусы, однако, с ростом температуры и концентрации спирта, способ Кон-Онкли может привести к денатурации и агрегированию белков. Агрегаты с высоким молекулярным весом могут действовать как комплексы антиген-антитело, имея возможность свободно фиксировать комплемент.

b. Измененный метод Кон-Онкли

Для предотвращения нежелательных последствий метода Кон-Онкли для получения и очистки 1д был разработаны модифицированный способ Кон-Онкли. Известно множество процедуры, которые могут быть адаптированы и приспособлены для производства препаратов 1д по настоящему документу. Специалист в данной области способен получить препараты 1д в соответствии с известными и доступными в данной области техники способами.

Как правило, 1д получают с применением первичного холодного фракционирования этанолом и вторичного фракционирования, которое может включать, например, одну или несколько из следующих стадий, применяемых для получения продукта с низкой анти-комплементной активностью (АС), а именно разделение агрегатов 1д с помощью обычных способов, таких как ультрацентрифугирование или хроматография, химическая модификация молекулы 1д алкоголизацией, алкилированием, сульфированием и обработкой восстановителями (см., например, патент США 6875848); инкубация в умеренно кислой среде (рН 4.0) с пепсином, плазмином и иммобилизованным трипсином или без них, фракционирование плазмы крови человека с помощью полиэтиленгликоля (Роюои и др. (1964) ВюсЫт. ВюрЬук. Ас1а. 82: 463-475), включение полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве средства для очистки материала, полученного после фракционирования по Кону (фракция II и ΙΙ+ΙΙΙ, см., например, патенты США № 4093606 и 4165370), методы фракционирования, которые используют полиэтиленгликоль в качестве осадителя, а также другие способы, описанные в патентах США № 4093606, 4126605, 3966906, 4124576, и другие подобные способы очистки с помощью полиэтиленгликоля (ЕР 0246579), обработка В-пропиолактоном; для устранения нежелательных загрязняющих веществ из исходных материалов для получения препаратов Ι§ также используют ионообменную хроматографию (см., например, патент США № 3869436, ЕР 91300790 и \УО 94/29334). В ЕР 0440483 описана комбинация способов, полезная для получения продукта для внутривенного введения, основанная на ионообменной хроматографии и диафильтрации в слабокислой среде, ферментативном расщеплении; обработке растворителем/детергентом и диафильтрации и ультрафильтрации. Другие способы также описаны в данной области техники и известны специалистам в данной области (см., например, патенты США 5177194 и 6875848).

Обычно используют очищенную фракцию ΙΙ по Кону. Фракция ΙΙ по Кону, как правило, содержит приблизительно 95 процентов ^С, а также четыре остальные подтипа Ιβ. Различные подтипы Ι§ представлены во фракции ΙΙ приблизительно в той же пропорции, как они находятся в объединенной плазме крови человека, из которой они получены. Фракцию ΙΙ дополнительно очищают до получения вводимой композиции. Например, фракция ΙΙ может быть растворена в холодном очищенном водном растворе спирта, и примеси могут быть удалены с помощью осаждения и фильтрации. После окончательной фильтрации суспензию иммуноглобулинов может подвергнуть диализу или диафильтрации (например, с помощью ультрафильтрационной мембраны с номинальным пределом исключения по молекулярной массе менее 100000 дальтон) для удаления спирта. Раствор может быть сконцентрирован или разбавлен до получения желаемой концентрации белка и может быть дополнительно очищен с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области.

в. Инактивация вирусов

Препараты Ι§ должны быть обработаны для удаления вирусного загрязнения. Существует два способа удаления вирусов: инактивация вирусов и отделение вирусов. Инактивация вирусов делает их неактивными, например, химически изменяя липидную и белковую оболочки или полностью денатурируя вирус. Примеры способов инактивации вирусов включают, но не ограничиваются нагреванием (пастеризацией), обработкой растворителем/детергентом (δ/ϋ) и воздействием кислой среды (низкого рН). δ/ϋ процесс является наиболее широко используемым способом инактивации вирусов при работе с плазмой крови в промышленности, используемым для инактивации вирусов, содержащих липидный слой. Например, было продемонстрировано вирулицидное действия δ/Ό процесса против ΥδΥ (вируса везику- 20 026112 лярного стоматита), Синдбис вируса, ВИЧ, вируса гепатита В (ΗΒν) и ΗСV (вируса гепатита С).

Отделение вирусов является способом, при котором происходит полное удаление всех вирусов из образца. Примеры способов отделения или удаления вирусов включают, но не ограничиваются холодным фракционированием этанолом, разделением фаз или осаждением ПЭГ, аффинной хроматографией, ионообменной или гель-хроматографией и нанофильтрацией.

ά. Концентрирование белка

Иммуноглобулины могут быть получены в различных концентрациях. Например, 1д может быть получен при концентрации белка приблизительно 3-25% 1д, как правило, при концентрации приблизительно от 10 до 22%, например, 10-20% вес./об. Например, концентрация препаратов 1д может составлять приблизительно от 18 до 22% 1д вес./об. Согласно изобретению препараты 1д, как правило, получают при концентрации 1д приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% и более. Конечная концентрация белка в значительной степени зависит от способа получения и очистки. В настоящем документе предусматривается, что любой препарат иммуноглобулинов может быть использован в настоящем документе в стабильной совместной композиции с гиалуронидазой. Специалист в данной области, может эмпирически определить соответствующую концентрацию 1д для включения в стабильные совместные композиции по настоящему документу. Выбор препарата 1д будет зависеть от целого ряда факторов, таких как путь введения, состояние пациента и тип заболевания, подлежащего лечению.

Например, могут быть использованы любые известные или существующие препараты 1д. К ним относятся препараты 1д, обычно используемые для внутривенного введения (ΐνΐθ). В общем, препараты 1д для внутривенного введения имеют концентрацию белка от 3 до 12% вес./об. или приблизительно 10% вес./об. Например, ΐνΐθ коммерчески доступен как Саптипс® ΝΡ, Р1еЪодатта® 5%, Саттадагб®® Μςιιίά. θаттада^ά® 8/Ό, θатиηеx®, ГОеедат® ΕΝ, ОСадат® и Ро1удат® 8/Ό. Как правило, для получения таких препаратов используют способ холодного спиртового фракционирования, при этом способы, используемые для выделения и очистки иммуноглобулинов, и способы уменьшения потенциального загрязнения вирусом отличаются для разных препаратов.

Кроме того, в композициях и способах, предусмотренных в настоящем документе, могут быть использованы другие препараты, разработанные в настоящее время для внутримышечного и подкожного введения. Например, препараты ΐ§ для внутримышечного введения и подкожного введения коммерчески доступны как θаша8ΤΑN® 8/Ό и ^уад1оЪш® соответственно. Как правило, для получения таких препаратов используют способ холодного спиртового фракционирования из плазмы крови человека, при этом концентрация ΐ§θ составляет от 15 до 18% или от 10 до 22% соответственно. В предварительной заявке США № 61/181606 описано получение высокоочищенного и концентрированной композиции иммуноглобулина из объединенной плазмы для подкожного введения.

е. Примеры препаратов Ц ί. 10% ΐ§

Примером препарата ΐβ является иммуноглобулин для внутривенного введения С1оЪи1т Шгауепоик (Нитап), 10% (ΐνΐθ, 10%, продающийся как θашшада^ά®, ВаХег НеаННсаге СогрогаЧоп), который представляет собой жидкий препарат немодифицированного ΐβθ с таким же отношением подклассов ΐ§θ, как в нормальной плазме. Препарат содержит интактный кристаллизующийся фрагмент (Рс) и антигенсвязывающий фрагмент (РаЪ) антитела. Препарат содержат 100 мг/мл белка, по меньшей мере 98% из которого представляют собой ΐ§θ, ΐ§Α присутствует в концентрации 37 мкг/мл и ΐ§Μ присутствуют только в следовых количествах. Осмолярность препарата сходна с физиологической осмолярностью и не содержит добавленного сахара, ионов натрия или консервантов. В препарат для стабилизации при рН 4,6 до 5,1 входит глицин. Для его получения применяют модифицированный метод холодного спиртового фракционирования по Кон-Онкли с дальнейшей очисткой в виде непрерывного процесса за счет применения катионообменной хроматографии и анионообменной хроматографии. Производственный процесс также включает в себя 3 независимых стадии инактивации или удаления вирусов: обработку растворителем/детергентом (8/0), нанофильтрацию и инкубацию при низких значениях рН и повышенной температуре. Получение 10% препарата ΐνΐθ описано в примере 1.

ΐΐ. Высоко концентрированные препараты ΐ§ (например, 20% ΐ§)

Получение высококонцентрированных препаратов иммуноглобулина описано в предварительной заявке США № 61/181606. Примерами препаратов, содержащих 18-22% высоко очищенного Ц являются изотонические жидкие препараты иммуноглобулина (по меньшей мере 95% ΐ§θ) в 0,25 мМ глицине при рН от 4,4 до 4,9, описанные в приведенных ниже примерах.

Высококонцентрированные препараты ΐ§θ, описанные в настоящем документе, производятся с помощью процесса, включающего множество одинаковых или аналогичных стадий с процессом получения традиционных препаратов ΐνΐθ (например, 10% ΐ§). Дополнительные стадии ультрафильтрации/диафильтрации с применением открытых мембранных каналов со специально разработанным дополнительным отмыванием и специальная рецептура в конце процесса получения приводят к получению композиции ΐ§ с приблизительно в два раза большей концентрацией белка (200 мг/мл) по сравнению с

- 21 026112 известными 1УЮ (например, Оаттадатб Ыдшфбез негативного влияния на выход и устойчивость при хранении. Для большинства коммерчески доступных ультрафильтрационных мембран концентрация 1дО 200 мг/мл не может быть достигнута без больших потерь белка. Указанные мембраны раньше забиваются, следовательно, с их помощью трудно достичь приемлемого отмывания после фильтрации. Таким образом, необходимо было использовать открытую конфигурацию мембранных каналов. Кроме того, для получения необходимой концентрации 1д без значительной потери белка (менее 2% потери) использовали специально разработанное дополнительное отмывание, при этом повышенная концентрация белка 200 мг/мл не влияет на инактивацию вирусов на стадии инкубации при низком рН.

Общий процесс получения высококонцентрированной композиции 1д включает в себя следующие стадии, которые описаны более подробно в примере 2. Во-первых, криопреципитат отделяют от ранее замороженной плазмы, получая жидкую крио-плазму, которую обрабатываются на следующей стадии для получения супернатанта (или фракции I). Изменение рН и добавление этанола, как правило, до 7 и от 20 до 25 об.% соответственно с последующим центрифугированием при пониженной температуре приводит к выпадению осадка. Полученный на этой стадии осадок отделяют, смешивают с микрокремнеземом и фильтруют, все стадии выполняют при низкой температуре, как правило, от 2 до 8°С. Фильтрат смешивают с полисорбатом-80 и дигидратом цитрата натрия и перемешивают при 2-8°С.

Затем получают осадок О аналогично стадии осаждения II по Кону с помощью изменения рН и концентрации спирта. Осадок О растворяют и фильтруют через пористый фильтр с номинальным размером пор 0,2 мкм (например, фильтр Сипо ΥΚ.06 или его эквивалент) для получения прозрачного фильтрата. Для последующей обработки растворителем/детергентом, как правило, используют 1,0% (об./об.) Тритон Х-100, 0,3% (об./об.) Твин-80 и 0,3% (об./об.) ΤΝΒΡ при 18-25°С, по меньшей мере в течение 60 мин, после чего проводят катионообменную хроматографию, анионообменную хроматографию и нанофильтрацию, используя, например, фильтр ЛкаЫ Р1апоуа 35Ν или его эквивалент. После нано фильтрации фильтрат концентрируют до концентрации белка 5 ± 1% вес./об. путем ультрафильтрации. В некоторых примерах ультрафильтрацию проводят в кассете с открытыми каналами, где ультрафильтрационная мембрана имеет номинальный порог пропускания по молекулярному весу (ΝΜ\νί'.Ό) 50 кДа или менее. После завершения стадии ультрафильтрации концентрат подвергают диафильтрации против 0,25 М раствора глицина с низким рН. Как правило, минимальный объем обмениваемого буфера в 6 раз превышает первоначальный объем концентрата, и раствор концентрируют до концентрации белка более 20% вес./об. После диафильтрации и концентрирования рН раствора, как правило, составляет от 4,4 до 4,9. Для композиции концентрацию раствора белка доводят до 20% вес./об., например, 20,4 ± 0,4% вес./об. буфером для диафильтрации. Полученный раствор дополнительно стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр с абсолютным размером пор 0,2 мкм и менее. Затем раствор разливают в стерильные контейнеры для окончательной герметизации и отбирают образцы для тестирования. Последним шагом является хранение в герметичных емкостях при 30-32°С в течение длительного периода времени, например, от 21 до 22 дней.

Включение стадий ультрафильтрации и получения композиции в процессе получения является улучшением по сравнению с применяемыми ранее способами очистки и концентрирования 1д, которое привело к получению препаратов с более высокой концентрацией 1д без значительной потери активности 1д при сохранении низкого рН в окончательной композиции. Как правило, продукты имеют концентрацию белка не менее 18% вес./об., из которого большая часть (как правило, не менее 95%) представляет собой 1дО, и рН в диапазоне рН 3-6, что способствует инактивации патогенов, таких как вирусы, которые могут присутствовать в плазме. Благодаря высокой концентрации 1д и, следовательно, уменьшенному вводимому объему, высококонцентрированные препараты пригодны для подкожного введения. В некоторых вариантах 1д продукты имеют вязкость не более 18 мПа-с и поэтому также могут быть пригодны для внутривенного введения. Простое разведение также может дать возможность вводить препараты внутривенного.

2. Стабильность при хранении

Финальные очищенные композиции 1д должны сохранять активность 1д и не проявлять чрезмерную агрегацию. При хранении препаратов 1д для уменьшения агрегации и улучшения стабильности могут быть использованы, например, стабилизующие белок вспомогательные вещества или корректировка рН раствора.

а. Стабилизирующие белок вспомогательные вещества

Способы повышения стабильности препаратов 1д что хорошо известны в уровне техники и включают добавлении в препарат 1д стабилизирующих белок вспомогательных веществ. Известные вспомогательные вещества включают, но не ограничиваются сахарами, полиолами, аминокислотами, аминами, солями, полимерами и поверхностно-активными веществами. Например, в патенте США 4499073 описана стабилизация за счет ионной силы и рН раствора для хранения; в патенте Японии 54020124 раскрыто добавление аминокислот в препарат для внутримышечного введения, что делает препарат стабильным и безопасным для использования после хранения; в патентах 1Р 57031623 и 1Р 57128635 раскрыто применение аргинина и/или лизина с №·ιί'.Ί в препаратах с 5-15% 1д для достижения долгосрочной стабильности

- 22 026112 препаратов для внутримышечного введения; в патенте ίΡ 4346934 раскрыто применение раствора низкой проводимостью (менее 1 миллисименса) с рН 5,3 до 5,7 и, по желанию, с одним или несколькими стабилизаторами, в том числе ΡΕΟ, человеческим сывороточным альбумином и маннитом, в патенте США 4439421 описано добавление гидрофильных макромолекул, полиолов и других белков для стабилизации против образования анти-комплемента; в патенте США 5945098 раскрыта стабилизация изотонических растворов добавлением аминокислот (от 0,1 до 0,3 М глицина) и неионогенных поверхностно-активных веществ (полисорбата и ΡΕΟ), в патенте США 4186192 раскрыты различные добавки, в том числе аминокислоты, в №0 2005/049078 раскрыта стабилизация мальтозой, и, кроме того, глицином в концентрации до 0,1 М, в патенте США 4362661 раскрыто применение нейтральных и основных аминокислот для придания стабильности 5% препаратам 1д. Стабильный жидкие композиции могут быть приготовлены с применением углеводородов в водной среде с очень низкой ионной силой и рН 4,25 (патент США № 4396608) или слабокислой среде с рН 5-6 (ЕР 0278422).

Образование димеров в препаратах 1д также можно контролировать. Например, в патенте США № 5871736 раскрыты препараты 1д, в частности, жидкие препараты, содержащие один или несколько амфифильных стабилизаторов против образования димеров. Амфифильные стабилизаторы включают никотиновую кислоту и ее производные, в частности, никотинамид, в основном в сочетании с аминокислотами с незаряженными липофильными боковыми цепями, например, фенилаланином, метионином, лейцином, изолейцином, пролином и валином.

Ь. рН

Препараты 1д могут быть получены способами, известными в данной области, такими как любые описанные здесь способы. Как правило, однако, рН финального препарата доводят до относительно высоких значений рН, а именно до диапазона рН от 4,0 до 7,4. Было установлено, что рН препаратов иммуноглобулинов является важным фактором, влияющим на содержание мономеров 1§О в конечном продукте. Как правило, препараты с 5% содержанием иммуноглобулинов имеют рН 4,2 ± 0,5. Препараты с 10% содержанием иммуноглобулинов наиболее стабильны при рН 5,2 ± 0,2. Оптимальный рН получают с помощью различных способов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, оптимальный рН можно определить с помощью данных эксклюзионной хроматографии, а также данных термической стабильности и титров различных препаратов при различных значениях рН.

Ό. Гиалуронидаза (хиалуронидаза)

В настоящем документе предусмотрены стабильные совместные композиции, содержащие иммуноглобулин и гиалуронидазу, как правило, растворимую гиалуронидазу. Гиалуронидазы являются членами большого семейства ферментов, которые разрушают гиалуроновую кислоту, которая является одним из важнейших компонентов внеклеточного матрикса и основной составляющей интерстициального барьера. Катализируя гидролиз гиалуроновой кислоты, основной составляющей интерстициального барьера, гиалуронидазы снижают вязкость гиалуроновой кислоты, тем самым увеличивая проницаемость тканей. Таким образом, гиалуронидазы использовали, например, как диспергирующие агенты или агенты, способствующие распространению, в сочетании с другими препаратами, лекарствами и белками для повышения их дисперсности и доставки. Примерами гиалуронидаз для совместных композиций по настоящему документу являются растворимые гиалуронидазы.

Существуют три основных класса гиалуронидаз: гиалуронидазы млекопитающих, бактериальные гиалуронидазы и гиалуронидазы пиявок, других паразитов и ракообразных.

Гиалуронидазы млекопитающих представляют собой эндо-З-Ы-ацетилгексозаминидазы, которые гидролизуют β 1 —>4 гликозидные связи гиалуроновой кислоты с образованием олигосахаридов различной длины, таких как тетрасахариды и гексасахариды. Они обладают гидролилитической и трансгликозидазной активностями и могут разрушать гиалуроновую кислоту и хондроитин сульфаты, такие как С4-8 и С6-8. Гиалуронидазы этого типа включают, но не ограничиваются гиалуронидазой коровы (бычьей) (8ΕΟ ГО N0: 10 и 11), мыши (8ΕΟ ГО N0: 17-19, 32), свиньи (8ΕΟ ГО N0: 20-21), крысы (8ΕΟ ГО N0: 2224, 31), кролика (8Ε0 ГО N0: 25), овцы (бараньей) (8Ε0 ГО N0: 26 и 27), орангутанга (8Ε0 ГО N0: 28), обезьяны циномолгус (8Ε0 ГО N0: 29), морской свинки (8Ε0 ГО N0: 30) и человека.

Гиалуронидазы млекопитающих могут быть в свою очередь разделены на активные в нейтральной среде гиалуронидазы, преимущественно получаемые из экстрактов семенников, и активные в кислой среде гиалуронидазы, преимущественно присутствующих в таких органах, как печень. Примеры активных в нейтральной среде гиалуронидаз включают РН20, включая, но не ограничиваясь РН20 из различных видов, таких как овечья (8Ε0 ГО N0: 27), бычья (8Ε0 ГО N0: 11) и человеческая (8Ε0 ГО N0: 1) ΡΗ20. ΡΗ20 человека (также известная как 8ΡΑΜ1 или поверхностный белок сперматозоидов РН20), как правило, прикреплен к мембране с помощью гликозилфосфатидилинозитольного (ΟΡΙ) якоря. Указанный белок в природе участвует в адгезии сперматозоида к яйцеклетке и способствует проникновению сперматозоида через слой кумулюсных клеток путем расщепления гиалуроновой кислоты.

Помимо человеческой РН20 (также называемой 8ΡΑΜ1) в геноме человека были идентифицированы пять гиалуронидазоподобных генов, НУАШ, ΗΥΑΣ2, ΗΥΑΣ3, ΗΥΑΣ4 и ΗΥΑΣΡ1. ΗΥΑΣΡ1 является псевдогеном, а для ΗΥΑΣ3 (8Ε0 ГО N0: 38) не была показана ферментативная активность по отношению

- 23 026112 к какому-либо известному субстрату. НУЛЬ-4 (полипептид-предшественник приведен в §ЕЦ ГО N0: 39) является хондроитиназой и проявляет слабую активность по отношению к гиалуронану. НУАЬ1 (полипептид-предшественник приведен в §ЕЦ ГО N0: 36) является активным в кислой среде ферментом, и РН20 (полипептид-предшественник приведен в §ЕЦ ГО N0: 1) является активным в нейтральной среде ферментом. Активные в кислой среде гиалуронидазы, такие как НУАЬ1 и ΗΥΛΣ2 (полипептидпредшественник приведен в §ЕЦ ГО N0: 37), обычно не проявляют каталитическую активность при нейтральном рН (т.е. рН 7). Например, ΗΥΑΕΙ проявляет слабую каталитическую активность ίη νίίΓΟ при рН 4,5 (Ργο8ϊ и др., (1997) Апа1. ВюсЬет. 251: 263-269). НУАЬ2 является активным в кислой среде ферментом с очень низкой удельной активностью ίη νίίΓΟ. Гиалуронидазоподобные ферменты также можно классифицировать на ферменты, которые, как правило, прикреплены к мембране через гликозилфосфатидил-инозитольный (СР1) якорь, такие как человеческий НУАЬ2 и человеческий РН20 ГОапПко\ЬсЬΜίαβΚονα и др., (2003) Ргос №ιΐ1 Асай δα υδΑ 100 (8): 4580-5), и ферменты, которые являются, как правило, растворимыми, такие как человеческий НУАЬ1 (ΡΓΟδί и др., (1997) ВюсЬет ВюрЬук Кек Соттип. 236 (1): 10-5).

1. РН20

РН20, как и другие гиалуронидазы млекопитающих, является эндо-З-Ы-ацетилгексозаминидазой, которая гидролизует β^4 гликозидные связи гиалуроновой кислоты с образованием олигосахаридов различной длины, таких как тетрасахариды и гексасахариды. Он обладает гидролитической и трансгликозидазной активностью и может деградировать гиалуроновую кислоту и хондроитин сульфаты, такие как С.'4-δ и С.'6-δ. В естественных условиях фермент участвует в адгезии сперматозоида и яйцеклетки и помогает проникновению сперматозоида через слой кумулюсных клеток посредством расщепления гиалуроновой кислоты. РН20 находится на поверхности сперматозоидов и в произошедшей из лизосомы акросоме, где он связан с внутренней акросомной мембраной. РН20 плазмалеммы обладает гиалуронидазной активностью только при нейтральном рН, в то время как РН20 внутренней акросомной мембраны обладает активностью в нейтральной и кислой среде. В дополнение к функции гиалуронидазы РН20 также является рецептором ГК-индуцированной клеточной сигнализации и рецептором для /опа ре11иайа (прозрачной зоны), окружающей яйцеклетку.

Примеры белков РН20 включают, но не ограничиваются полипептидами РН20 человека (полипептид-предшественник приведен в δΞΟ ГО N0: 1, зрелый полипептид приведен в δΞΟ ГО N0: 2), быка (δΞΟ ГО N0: 11), кролика (δΞΟ ГО N0: 25), барана (δΞΟ ГО N0: 27), обезьяны циномолгус (δΞΟ ГО N0: 29), морской свинки (δΞΟ ГО N0: 30), крысы (δΞΟ ГО N0: 31) и мыши (δΞΟ ГО N0: 32).

Бычий РН20 является полипептидом-предшественником из 553 аминокислот (δΞΟ ГО N0: 11). Выравнивание бычьего РН20 с человеческим РН20 показывает наличие только слабой гомологии с множеством разрывов от аминокислоты 470 до соответствующего карбоксильного конца из-за отсутствия 0Р1 якоря в бычьем полипептиде (см., например, Ьгой Οί (2007) Ехрей 0ρίη. Эгид. ЭеК. 4: 427-440). Наличие 0Р1 якоря не прогнозируется в РН20 многих других видов кроме человека. Таким образом, бараньи и бычьи полипептиды РН20 естественно существуют в виде растворимых форм. Бычий РН20 очень непрочно связан с мембраной, он не заякорен в ней с помощью чувствительного к фосфолипазе якоря (Ьа1апсейе и др., (2001) Вю1 Вергой. 65(2):628-36). Эта уникальная особенность бычьей гиалуронидазы позволила использовать растворимую бычью гиалуронидазу из яичек в виде экстракта для клинического применения (^уйаке®, Нуа1аке®).

мРНК человеческого РН20, как правило, транслируется с образованием полипептида-предшественника из 509 аминокислот (δΞΟ ГО N0: 1), содержащего сигнальную последовательность из 35 аминокислот на Оконце (аминокислотные остатки 1-35) и сигнал присоединения гликозилфосфатидилинозитольного (0Р1) якоря из 19 аминокислот на С-конце (аминокислотные остатки 491-509). Зрелый РН20, таким образом, представляет собой полипептид из 474 аминокислот, приведенный в δΞΟ ГО N0: 2. После проникновения полипептида-предшественника в ЭР и удаления сигнального пептида С-концевой сигнал присоединения 0Р1 отщепляется для облегчения ковалентного присоединения 0Р1 якоря к новообразованной С-концевой аминокислоте в положении, соответствующем положению 490 полипептидапредшественника, приведенного в δΞΟ ГО N0: 1. Образуется 0Р1-заякоренный зрелый полипептид из 474 аминокислот с аминокислотной последовательностью, приведенной в δΞΟ ГО N0: 2.

По сравнению с другими гиалуронидазами, в том числе гиалуронидазами яда медоносной пчелы и мыши, РН20 обезьяны и морской свинки, РН20 человека содержит общую с ними область из 340 аминокислот с 57 консервативными аминокислотами (см., например, Агтшд еί а1. (1997) Еиг. 1. ВюсЬет., 247:810-814). В число консервативных аминокислот входят четыре образующих дисульфидные мостики остатка цистеина в позициях 25, 189, 203 и 316 в последовательности аминокислот, приведенной в δΞΟ ГО N0: 2 (соответствующие остаткам 60, 224, 238 и 351 в последовательности аминокислот, приведенной в δΞΟ ГО N0: 1). Для формирования корового гиалуронидазного домена дисульфидные связи образуются между остатками цистеина С60 и С351, а также между остатками С224 и С238. Тем не менее, для проявления каталитической активности в нейтральной среде ферменту необходимы дополнительные остатки цистеина на карбоксильном конце, таким образом, аминокислоты с 36 по 464 из δΞΟ ГО N0: 1 содержат

- 24 026112 минимально активный домен человеческой гиалуронидазы РН20. Еще четыре дисульфидные связи образуются между остатками цистеина С376 и С387, С381 и С435, С437 и С443, С458 и С464 в полипептиде с 8ЕЦ ГО N0: 1 (соответствующие остаткам С341 и С352, С346 и С400, С402 и С408, С423 и С429 зрелого полипептида, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 2 соответственно).

Кроме того, другие консервативные остатки, вероятно, участвуют в связывании субстрата и катализе. Аминокислотные остатки в позициях 111, 113, 176, 249 и 252 в 8ЕЦ ГО N0: 2, как представляется, участвуют в активности РН20, так как мутации в этих положениях делают фермент лишенным ферментативной активности или приводят к наличию лишь остаточной активности по сравнению с РН20 дикого типа, не содержащим мутации (см., например, Агпипд с( а1. (1997) Еиг. 1. Вюейет., 247: 810-814).

В человеческом РН20 существуют семь потенциальных сайтов Ν-гликозилирования в положениях N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 полипептида, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 1. Для формирования корового гиалуронидазного домена дисульфидные связи образуются между остатками цистеина С60 и С351, а также между остатками С224 и С238. Поскольку аминокислоты с 36 до 464 из 8ЕЦ ГО N0: 1, по-видимому, содержат минимальный активный домен человеческой гиалуронидазы РН20, сайт N гликозилирования N-490 не требуется для надлежащей активности гиалуронидазы.

2. Растворимые гиалуронидазы

Для стабильных совместных композиций по настоящему документу предусмотрены, как правило, растворимые гиалуронидазы. Растворимые гиалуронидазы при экспрессии в клетках секретируются в среду. Растворимость можно продемонстрировать по распределению белков в водную фазу раствора Тритона Х-14. Таким образом, следует понимать, что растворимые гиалуронидазы не включают гиалуронидазы, которые содержат ΟΡΙ якорь, который делает полипептид прикрепленным к клеточной мембране. Например, полноразмерная человеческая РН20 (зрелая форма приведена в 8ЕЦ ГО N0: 2) содержит ΟΡΙ якорь и не растворяется. Напротив, бычьи и овечьи полипептиды РН20 не содержат ΟΡΙ якорь, достаточный для прикрепления к мембране, и, следовательно, считаются растворимыми белками. Кроме того, растворимые гиалуронидазы, включенные в совместные композиции по настоящему документу, как правило, являются существенно очищенными белками. Кроме того, растворимые гиалуронидазы сохраняют гиалуронидазную активность. Например, растворимая человеческая РН20 сохраняет активность в нейтральной среде.

Растворимые гиалуронидазы включают любые гиалуронидазы, которые не содержат ΟΡΙ якорь или якорь, достаточный для прикрепления к мембране, включая, но не ограничиваясь НУАЬ1, бычьей РН20 и бараньей РН20, их аллельными вариантами и другими их вариантами. Например, растворимые гиалуронидазы включают любые гиалуронидазы, которые были модифицированы для того, чтобы быть растворимыми. Например, гиалуронидазы, которые содержат ΟΡΙ якорь, можно сделать растворимыми усечением и удаление всего или части ΟΡΙ якоря. В одном примере, человеческую гиалуронидазу РН20, которая обычно заякорена в мембране через ΟΡΙ якорь, можно сделать растворимой усечением и удалением всего или части ΟΡΙ якоря на С-конце. Растворимые гиалуронидазы также включают активные в нейтральной среде и активные в кислой среде гиалуронидазы, однако гиалуронидаза для подкожного введения представляет собой активную в нейтральной среде гиалуронидазу.

Примером растворимой гиалуронидазы является РН20 из любого вида, например, любая приведенная в 8ЕЦ ГО N0: 1,2, 11, 25, 27, 30, 31 и 32 гиалуронидаза, или их усеченная форма без всего или части С-концевого ΟΡΙ якоря, при условии, что гиалуронидаза растворима и сохраняет гиалуронидазную активность. Также растворимые гиалуронидазы включают аллельные варианты или другие варианты любой из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31 и 32 и их усеченных форм. Аллельные варианты и другие варианты известны специалистам в данной области и включают полипептиды, обладающие 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или большей идентичностью последовательности с любой из 8ЕЦ ГО N0: 1,2, 11, 25, 27, 30, 31 и 32 или их усеченными формами.

Как правило, в совместных композициях по настоящему документу используют растворимую человеческую РН20. Хотя также могут быть использованы гиалуронидазы, такие как РН20, других животных, такие препараты являются потенциально иммуногенными, так как они являются белками животного происхождения. Например, у значительной части пациентов проявляется первичная сенсибилизация после потребления пищи, а поскольку речь идет о животных белках, все пациенты имеют риск последующих сенсибилизации. Таким образом, не человеческие препараты не могут быть пригодны для хронического использования. Если предпочтительны не человеческие препараты, то в настоящем документе предполагается, что у таких полипептидов может быть снижена иммуногенность. Такие модификации хорошо известны специалистам в данной области.

а. Растворимая человеческая РН20

Примером растворимых гиалуронидаз является растворимая человеческая РН20. Были получены растворимые формы рекомбинантной человеческой РН20, которые могут быть использованы в совместных композициях по настоящему изобретению. Получение таких растворимых форм РН20 описано в опубликованных заявках США № 2005-0260186 и 2006-0104968.

Например, растворимые полипептиды включают усеченные с С-конца варианты полипептидов, которые включают последовательность аминокислот с 1 аминокислоты до 464 из 8ЕЦ ГО N0: 1. Раствори- 25 026112 мые формы включают, но не ограничиваются любыми полученными укорочением С-конца полипептидами, содержащими последовательность с 1 аминокислоты до 467-483 например, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 и 483 аминокислоты. При экспрессии в клетках млекопитающих Юконцевая сигнальная последовательность из 35 аминокислот отщепляется во время процессинга и зрелая форма белка секретируется. Таким образом, зрелые растворимые полипептиды содержат аминокислоты с 36 до 464 из БЕЦ ГО N0: 1. Например, зрелые растворимые полипептиды содержат аминокислоты от 36-467 до 36-483, например, с 36 до 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 и 483 из БЕЦ ГО N0: 1. Мутанты с делецией, у которых аминокислотная последовательность заканчивается между позициями аминокислот 477 и 483 (по последовательности полипептида-предшественника, приведенной в БЕЦ ГО N0: 1), демонстрируют более высокую активность секретируемой гиалуронидазы по сравнению с полноразмерной ОРГ-заякоренной формой. Таким образом, примеры растворимых гиалуронидаз включают растворимые человеческие полипептиды РН20, включающие 442, 443, 444, 445, 446 или 447 аминокислот в длину, приведенные в любой из БЕЦ ГО N0: 4-9, или их аллельные или видовые, или другие варианты.

Ь. Рекомбинантная человеческая растворимая РН20 (гНиРН20)

Была получена рекомбинантная растворимая форма человеческой РН20, обозначенная гНиРН20, которая может быть получена и очищена с помощью описанных здесь методов. Получение таких растворимых форм рекомбинантной человеческой РН20 описано в заявках США 11/065716 и 11/238171 (опубликованы как 20040268425; 20050260186 и 20060104968) и в примере 3 ниже. Примерами таких полипептидов являются полипептиды, получаемые из молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих аминокислоты 1-482 (приведены в БЕЦ ГО N0: 3). Такой пример молекулы нуклеиновой кислоты приведен в БЕЦ ГО N0: 49. При пост-трансляционном процессинге удаляется сигнальная последовательность из 35 аминокислот, что приводит к гНиРН20 из 447 аминокислот (БЕЦ ГО N0: 4). Полученная очищенная гНиРН20 характеризуется неоднородностью на С-конце белка за счет активности пептидаз, присутствующих в культуральной среде. Как правило, гНиРН20 получают в клетках, которые обеспечивают правильное ^гликозилирование для сохранения активности, таких как клетки СНО (например, ΌΟ44 клетки СНО).

3. Гликозилирование

Гликозилирование, включая N и О-гликозилирование некоторых гиалуронидаз может иметь большое значение для их каталитической активности и стабильности. Хотя изменение типа гликана, модифицирующее гликопротеин, может драматически влиять на антигенность белка, структурный фолдинг, растворимость и стабильность, считается, что большинство ферментов не требуют гликозилирования для оптимальной ферментативной активности. Гиалуронидазы в этом отношении уникальны, так как устранение ^гликозилирования может привести к почти полной инактивации. Таким образом, для таких гиалуронидаз наличие ^связанных гликанов имеет решающее значение для активности фермента.

^связанные олигосахариды делят на несколько основных типов (олигоманнозные, сложные, гибридные, сульфатированные), включающих (Маη)з-О1сNАс-О1сNАс-ядро, присоединенное через амидный азот остатка Акп, включенного в последовательность -Акп-Хаа-ТЬг/Бег (где Хаа не является Рго). Было сообщено о гликозилировании по -Акп-Хаа-Сук-сайту в белке С системы свертывания. В некоторых случаях гиалуронидаза может содержать Югликозидные и О-гликозидные связи. Например, РН20 включает О-связанные олигосахариды, а также ^связанные олигосахариды. Существует семь потенциальных сайтов ^гликозилирования N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 в человеческом РН20, пример которого приведен в БЕЦ ГО N0: 1. Как отмечалось выше, ^гликозилирование по позиции N490 не требуется для гиалуронидазной активности.

4. Модификации гиалуронидазы для улучшения ее фармакокинетических свойств

Гиалуронидазы для совместных композиций по изобретению могут быть модифицированы для улучшения их фармакокинетических свойств, например, увеличения их периода полураспада ίη У1уо и/или их активности. Модификации гиалуронидаз для использования в совместных композициях по изобретению могут включать присоединение, непосредственное или через линкер, через ковалентную или другую стабильную связь фрагментов полимеров, таких как фрагмент декстрана, полиэтиленгликоля (пегилирование (ПЭГ)) или сиаловой кислоты, или других подобных полимеров, такие как природные или сахаридные полимеры.

Известно, что пегилирование лекарственных средств повышает устойчивость к протеолизу, увеличивает период полувыведения и снижает антигенность и иммуногенность. Таким образом, ковалентное или другое стабильное присоединение (конъюгация) полимерных молекул, таких как фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), к гиалуронидазе может придать полезные свойства композиции фермент-полимер. Такие свойства включают улучшение биосовместимости, продление периода полураспада белка (и ферментативной активности) в крови, клетках и/или в других тканях в субъекте, эффективное экранирование белка от протеаз и гидролиза, улучшение биораспределения, улучшение фармакокинетики и/или фармакодинамики и повышение растворимости в воде.

Примеры полимеров, которые могут быть конъюгированы с деградирующим гиалуронан ферментом, включают природные и синтетические гомополимеры, такие как полиолы (т.е. поли-ОН), полиамины (т.е. поли-МН₂) и поликарбоксикислоты (например, поли-СООН), и дополнительно гетерополимеры,

- 26 026112

т.е. полимеры, включающие одну или более различных связывающихся групп, например гидроксильные группы и аминогруппы. Примеры подходящих полимерных молекул включают полимерные молекулы, выбранные из полиалкиленоксидов (ПАО), таких как полиалкиленгликоли (ПАГ), включая полипропиленгликоли (ИНГ), метоксиполиэтиленгликоли (мПЭГ) и полипропиленгликоли, ПЭГ-глицидиловые эфиры (Ерох-ПЭГ), ПЭГ-оксикарбонилимидазолы (СИГ-ПЭГ), разветвленные полиэтиленгликоли (ПЭГ), поливиниловых спиртов (ПВС), поликарбоксилатов, поливинилпирролидона, поли-Э,Ь-аминокислот, полиэтилен-ко-малеинового ангидрида, полистирол-ко-малеинового ангидрида, декстранов, в том числе карбоксиметилдекстранов, гепарина, гомологичных альбуминов, целлюлозы, в том числе метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, карбоксиэтилцеллюлозы и гидроксипропилцеллюлозы, гидролизатов хитозана, крахмалов, таких как гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал, гликогена, агарозы и их производных, гуаровой камеди, пуллулана, инулина, ксантановой камеди, каррагинана, пектина, гидролизатов альгиновой кислоты и биополимеров.

Как правило, полимеры представляют собой полиалкиленоксиды (ПАО), такие как полиэтиленоксиды, такие как ПЭГ, как правило, мПЭГ, которые по сравнению с полисахаридами, такими как декстран, пуллулан и тому подобное, включают несколько реактивных групп, способных к сшиванию. Как правило, полимеры представляют собой нетоксичные полимерные молекулы, такие как (м)полиэтиленгликоль (мПЭГ), которые могут быть ковалентно конъюгированы с деградирующим гиалуронан ферментом (например, к группам на поверхности белка) с использованием относительно простых химических методов.

Подходящие для присоединения к гиалуронидазе полимерные молекулы включают, но не ограничиваются полиэтиленгликолем (ПЭГ) и производными ПЭГ, такими как метоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), ПЭГ -глицидиловые эфиры (Ерох-ПЭГ), ПЭГ -оксикарбонилимидазол (СИГ-ПЭГ), разветвленные ПЭГ и полиэтиленоксид (ПЭО) (см., например, КоЪейв и др., Айуаисей Игид ИеПуегу Кеу1е^, 2002 год, 54: 459-476; Нате апй 2айрвку, δ (изд.) Ро1у(е1йу1епе д1усо1), СНеппйгу апй Вю1од1са1 Аррйсайопв, ΑСδ δутро5^ит δе^^е5 680, 1997; МеНуаг и др., I. РЬагт РЬагтасеи! δα., 3 (1): 125-136, 2000; Нате, №-11иге Ре\ае\У5 2: 215 и далее (2003); и ТвиЪегу, I Вю1 СЬет 279 (37): 38118-24, 2004). Молекулярная масса полимерных молекул обычно лежит в пределах приблизительно от 3 кДа до 60 кДа. В некоторых вариантах полимерные молекулы, конъюгированные с белком, таким как гНиРН20, имеют молекулярную массу 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более 60 кДа.

Различные методы модификации полипептидов ковалентным присоединением (конъюгированием) ПЭГ или производными ПЭГ (т.е. пегилирования) известны в уровне техники (см., например, и.δ. 2006/0104968; υ.δ. 5,672,662; υ.δ. 6,737,505 и υ.δ. 2004/0235734). Методы пегилирования включают, но не ограничиваются использованием специализированных линкеров и конъюгирующих химических методов (см., например, Нате, Айу. Игид ИеНу. Кеу. 54:459-476, 2002), присоединением нескольких фрагментов ПЭГ к одному сайту конъюгирования (например, через использование разветвленных ПЭГ; см., например, Уегоиеве и др., Вюогд. Мей. СЬет. ЬеЬ. 12:177-180, 2002), сайт-специфическим пегилированием и/или монопегилированием (см., например, СЬартап и др., №-11иге Вю1есЬ. 17:780-783, 1999) и сайтнаправленным ферментативным пегилированием (см., например, δаΐо, Айу. Игид ИеНу. Кеу., 54:487-504, 2002) (см. также, например, Ьи и Рейх (1994) Гий I. Рерййе Рго!еш Кее. 43:127-138; Ьи и Рейх (1993) Рерййе Кее. 6:142-6, 1993; Рейх и др., (1995) Гий I. Рерййе Кее. 46:253-64; ВепЬаг и др., (1994) I. Вю1 СЬет 269:13398-404; Вгитеапи и др., (1995) I Гттипо1 154: 3088-95; см. также, Сайсей и др., (2003) Айу. Игид ИеНу. Кеу. 55 (10):1261-77 и Мойпеих (2003) РЬагтасоГОегару 23 (8 часть 2): 3-8).

По методам и методикам, описанным в уровне техники, можно получать белки, имеющие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более 10 ПЭГ или производных ПЭГ, присоединенных к одной молекуле белка (см., например, υ.δ. 2006/0104968).

В уровне техники описаны многочисленные реагенты для пегилирования. Такие реагенты включают, но не ограничиваются N-гидроксисукцинимидил(NНδ)-активированным ПЭГ, сукцинимидил-мПЭГ, мПЭГ ₂-Ы-гидроксисукцинимидом, мПЭГ-сукцинимидил-альфа-метилбутаноатом, мПЭГ-сукцинимидилпропионатом, мПЭГ-сукцинимидилбутаноатом, сукцинимидиловым эфиром мПЭГ-карбоксиметил-3гидроксибутановой кислоты, гомобифункциональным ПЭГ-сукцинимидилпропионатом, гомобифункциональным ПЭГ-пропиональдегидом, гомобифункциональным ПЭГ-бутиральдегидом, ПЭГмалеимидом, ПЭГ-гидразидом, ПЭГ-п-нитрофенил-карбонатом, мПЭГ-бензотриазолкарбонатом, ПЭГпропиональдегидом, мПЭГ-бутиральдегидом, разветвленным мПЭГ2-бутиральдегидом, мПЭГ-ацетилом, мПЭГ-пиперидоном, мПЭГ-метилкетоном, безлинкерным мПЭГ-малеимидом, мПЭГ-винилсульфоном, мПЭГ-тиолом, мПЭГ-ортопиридилтиоэфиром, мПЭГ-ортопиридилдисульфидом, Ртос-ПЭГ-ΝΉδ, ВосПЭГ-ΝΉδ, ПЭГ-МЖ-винилсульфоном, ПЭГ-МЖ-акрилатом, ПЭГ-МЖ-флуоресцеином и ПЭГ-ΝΉδбиотином (см., например, МопГагйии и др., Вюсоп)ида1е СЬет 6: 62-69, 1995; Уегопеве и др., I. ВюасНуе

СотрайЪ1е Ро1утегв 12:197-207, 1997;

4002531; υ.δ. 5643575; υ.δ. 5990237; υ.δ.

4179337;

5766581;

6113906;

υ.δ.

υ.δ.

υ.δ.

5122614;

5795569;

6214966;

υ.δ.

υ.δ.

υ.δ.

υ.δ.

5672662; υ.δ. 5183550; υ.δ. 5808096; υ.δ. 6258351; υ.δ.

5932462;

5324844;

5900461;

6340742;

υ.δ.

υ.δ.

υ.δ.

υ.δ.

6495659; υ.δ. 5446090; υ.δ. 5919455; υ.δ. 6413507; υ.δ.

6437025; υ.δ. 6448369; υ.δ. 6461802; υ.δ. 6828401; υ.δ. 6858736; υ.δ. 2001/0021763; υ.δ.

6737505; υ.δ. 5612460; υ.δ. 5985263; υ.δ. 6420339; υ.δ. 2001/0044526;

- 27 026112

υ.δ. 2001/0046481; υ.δ. 2002/0052430; υ.δ. 2002/0072573; υ.δ. 2002/0156047; υ.δ. 2003/0114647; υ.δ. 2003/0143596; υ.δ. 2003/0158333; υ.δ. 2003/0220447; υ.δ. 2004/0013637; υδ 2004/0235734; υ.δ. 2005/000360; υ.δ. 2005/0114037; υ.δ. 2005/0171328; υ.δ. 2005/0209416; ЕР 01064951; ЕР 0822199; νθ 00176640; νθ 0002017; νθ 0249673; νθ 9428024 и νθ 0187925).

Е. Способы получения нуклеиновых кислот, кодирующих растворимую гиалуронидазу и ее полипептиды

Приведенные в настоящем документе полипептиды гиалуронидазы могут быть получены хорошо известными в уровне техники методами очистки белков и экспрессии рекомбинантных белков. При получении полипептидов с помощью рекомбинантной технологии могут быть использованы любые известные специалистам в данной области методы выявления нуклеиновых кислот, которые кодируют желаемые гены. Для получения полноразмерной (то есть охватывающей всю кодирующую область) кДНК или клона геномной ДНК, кодирующих гиалуронидазу, может быть использован любой метод, доступный в уровне техники, такой как выделение из клеток или тканей. Модифицированные варианты гиалуронидазы могут быть сконструированы из полипептида дикого типа, например, путем сайт-направленного мутагенеза. Как правило, гиалуронидазы, в том числе растворимые гиалуронидазы, такие как гНиРН20, используемые в совместных композициях по настоящему документу, могут быть рекомбинантными или могут быть очищены или частично очищены из природных источников, таких как, например, экстракт из яичек.

Полипептиды можно клонировать или выделять с помощью любых доступных известных в уровне техники методов клонирования и выделения молекул нуклеиновых кислот. Такие методы включают ПЦР-амплификацию нуклеиновых кислот и скрининг библиотек, включая скрининг гибридизацией нуклеиновых кислот, скрининг с помощью антител и скрининг по активности.

Для выделения молекул нуклеиновых кислот, кодирующих желаемый полипептид, могут быть использованы методы амплификации нуклеиновых кислот, включая, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В качестве исходного материала, из которого может быть выделена желаемая кодирующая полипептид молекула нуклеиновой кислоты, может быть использован содержащий нуклеиновые кислоты материал. Например, в методах амплификации могут быть использованы препараты ДНК и РНК, клеточные экстракты, тканевые экстракты, образцы жидкостей (например, крови, сыворотки, слюны), образцы, взятые у здоровых и/или больных субъектов. В качестве источника исходного материала также могут быть использованы библиотеки нуклеиновых кислот. Для амплификации желаемого полипептида могут быть разработаны соответствующие праймеры. Например, праймеры могут быть разработаны на основе экспрессируемых последовательностей, с которых синтезируется желаемый полипептид. Праймеры могут быть разработаны на основе обратной трансляции аминокислотной последовательности полипептида. Для подтверждения кодирования желаемого полипептида может быть определена последовательность молекул нуклеиновых кислот, полученных в результате амплификации.

К кодирующей полипептид молекуле нуклеиновой кислоты могут быть присоединены дополнительные нуклеотидные последовательности, в том числе линкерные последовательности, содержащие сайты рестрикции для клонирования синтетического гена в вектор, например, в вектор экспрессии белка или в вектор, предназначенный для амплификации кодирующей белок последовательности ДНК. Кроме того, с кодирующей полипептид молекулой нуклеиновой кислоты могут быть функционально связаны дополнительные нуклеотидные последовательности, являющиеся функциональными элементами ДНК. Примеры таких последовательностей включают, но не ограничиваются промоторными последовательностями, способствующими внутриклеточной экспрессии белка, и последовательностями для секреции, например гетерологичными сигнальными последовательностями, предназначенными для облегчения секреции белка. Такие последовательности известны специалистам в данной области. Дополнительные последовательности нуклеотидных остатков, такие как последовательности оснований, кодирующие связывающие белки районы, также могут быть связаны с кодирующей фермент молекулой нуклеиновой кислоты. Такие районы включают, но не ограничиваются последовательностями остатков, которые способствуют поглощению фермента конкретными клетками-мишенями или которые кодируют белки, способствующие такому поглощению, или которые иным образом изменяют фармакокинетику продукта синтетического гена. Например, ферменты могут быть связаны с ПЭГ-фрагментами.

Кроме того, могут быть добавлены метки или другие фрагменты, например, способствующие обнаружению или аффинной очистке полипептида. Например, с кодирующей фермент молекулой нуклеиновой кислоты могут быть связаны дополнительные последовательности нуклеотидных остатков, такие как последовательности оснований, кодирующие эпитопную метку или другой обнаруживаемый маркер. Примеры таких последовательностей включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие Шк-метку (например, 6хШк, НННННН; δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 54) или Р1а§-метку (ΌΥΚΌΌΌΌΚ; δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 55).

Выявленные и выделенные нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в соответствующий вектор клонирования. Может быть использовано большое количество известных в уровне техники систем вектор-хозяин. Возможные векторы включают, но не ограничиваются плазмидами или модифицированными вирусами, причем векторная система должна быть совместима с используемой клеткой-хозяином. Такие векторы включают, но не ограничиваются бактериофагами, такими как производные бактериофага лям- 28 026112 бда, или плазмидами, такими как рСМУ4, рВК322 или рИС плазмиды, или производные вектора В1ие8спр£ ОЩИадеие. Ьа Ло11а. Калифорния). Другие векторы экспрессии включают вектор экспрессии НΖ24, приведенный в качестве примера в настоящем документе. Вставка в вектор клонирования, например, может быть осуществлена путем лигированием фрагмента ДНК в вектор клонирования, который обладает комплементарными липкими концами. Вставка может осуществляться с использованием векторов клонирования ТОРО (Ιηνίίτο^η, СагНЪаб, Калифорния). Если для фрагментации ДНК использовали комплементарные сайты рестрикции, которых нет в векторе клонирования, концы молекулы ДНК могут ферментативно модифицированы. Кроме того, любой желаемый сайт может быть получен лигированием нуклеотидных последовательностей (линкеров) на концах ДНК, эти лигированные линкеры могут содержать специфические химически синтезированные олигонуклеотиды, кодирующие последовательность, распознаваемую эндонуклеазой рестрикции. В альтернативном методе расщепленный вектор и ген белка могут быть модифицированы достраиванием гомополимерного хвоста. Рекомбинантные молекулы могут быть введены в клетки с помощью, например, трансформации, трансфекции, инфекции, электропорации и сонопорации, в результате чего образуются многие копии последовательности гена.

В конкретных вариантах трансформация клеток хозяина рекомбинантными молекулами ДНК, которые включают выделенный ген белка, кДНК или синтезированные последовательности ДНК, позволяет получать множество копий гена. Таким образом, ген может быть получен в больших количествах в растущих трансформантах выделением рекомбинантных молекул ДНК из трансформантов и, при необходимости, получением вставленного гена из выделенной рекомбинантной ДНК.

Как правило, гиалуронидазу, в том числе растворимую форму РН20, получают с применением систем экспрессии белков, которые способствуют правильному ^гликозилированию для сохранения активности полипептида, так как гликозилирование важно для каталитической активности и стабильности гиалуронидазы. Такие клетки включают, например, клетки яичников китайского хомяка (СНО) (например, клетки СНО ΌΟ44).

1. Векторы и клетки

Для рекомбинантной экспрессии одного или более желаемых белков, таких как любые описанные здесь белки, нуклеиновые кислоты, содержащие всю кодирующую белок нуклеотидную последовательность или ее часть, могут быть вставлены в соответствующий вектор экспрессии, т. е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей белок последовательности. Необходимые сигналы транскрипции и трансляции также могут содержаться в нативном промоторе гена фермента и/или в его фланкирующих районах.

Кроме того, предусмотрены векторы, которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент. Клетки, содержащие векторы, также предусмотрены. Клетки включают эукариотические клетки и прокариотические клетки, и векторы представляют собой любые подходящие для использования в них векторы.

Предусмотрены прокариотические и эукариотические клетки, включая клетки эндотелия, содержащие векторы. Такие клетки включают бактериальные клетки, клетки дрожжей, клетки грибов, археи, растительные клетки, клетки насекомых и животные клетки. Клетки используют для получения белка с помощью выращивания описанных выше клеток в условиях, в которых закодированные белки экспрессируются клеткой, и извлечения экспрессированного белка. Для целей настоящего изобретения, например, фермент может быть секретирован в среду.

В настоящем документе предусмотрены векторы, которые содержат последовательности нуклеотидов, кодирующие растворимый полипептид гиалуронидазы, связанный с нативной или гетерологичной сигнальной последовательностью, или несколько его копий. Векторы могут быть выбраны для экспрессии фермента в клетке, вектор также может обеспечивать секрецию экспрессированного фермента.

Для экспрессии кодирующей последовательности белка могут быть использованы различные системы хозяин-вектор. Они включают, но не ограничиваются, системами клеток млекопитающих, инфицированных вирусом (например, вирусом осповакцины, аденовирусом и другими вирусами); системами клеток насекомых, инфицированных вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмами, такими как дрожжи, содержащие дрожжевые векторы, или бактериями, трансформированными бактериофагом, ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Экспрессионные элементы векторов варьируют по силе и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин-вектор может быть использован любой подходящий транскрипционный и трансляционный элемент.

Для конструирования векторов экспрессии, содержащих химерный ген, включающий соответствующие сигналы контроля транскрипции/трансляции и кодирующие белок последовательности, могут быть использованы любые методы вставки фрагментов ДНК в вектор, известные специалистам в данной области. Эти методы могут включать рекомбинацию и синтез ДНК ίη νίίτο или рекомбинацию ίη νίνο (генетическую рекомбинацию).

Экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, его домены, производные, фрагменты или гомологи, можно регулировать с использованием второй последовательности нуклеиновой кислоты, что приводит к экспрессии генов или их фрагментов в трансформированном молекулой (молекулами) рекомбинантной ДНК хозяине. Например, экспрессией белков можно управлять с по- 29 026112 мощью любого промотора/энхансера, известного в уровне техники. В одном варианте, промотор не является нативным для генов желаемого белка. Промоторы, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются ранним промотором δν40 (Ветпо1к( и СНатЬоп. Ыа1иге 290: 304-310 (1981)), промотором, содержащимся в 3'-длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (УашашоЮ и др., Се11 22:781791 (1980)), промотором тимидин киназы герпеса (^адпет и др., Ргос. Ν-(1. Асай. δα υδΑ 75:1441-1445 (1981)), регуляторными последовательностями гена металлотионеина (Вгшйег и др., Ыа(иге 296:39-42 (1982)); промоторами прокариотических векторов экспрессии, включающими промотор β-лактамазы (йау и др., (1981). Ргос. Ыа(1. Асай. δα υδΑ 75: 5543) или ТАС промотор (ОеВоет и др., Ргос. ЫаЙ. Асай. δα υδΑ 80:21-25 (1983)), см. также икеГи1 Рто(ешк Ггот РесотЬтаШ Вас(еПа в журнале δ^πΙίΓχ Атепсап 242:79-94 (1980); векторы экспрессии растений включают промотор нопалин-синтетазы (Неггата-Ек(ге11а и др., №Циге 305:209-213 (1984)), промотор 35δ РНК вируса мозаики цветной капусты (Сатйет и др., Νηс1ею Ас1Й8 Кек. 9:2871 (1981)) и промотор фермента фотосинтеза рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Неггега-Ек(ге11а и др., №1иге 310: 115-120 (1984)); промоторные элементы дрожжей и других грибов включают промотор Са14, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор фосфоглицеролкиназы, промотор щелочной фосфатазы; районы контроля транскрипции животных, которые проявляют тканеспецифичность и которые были использованы в трансгенных животных, включают контролирующий район гена эластазы I, который активен в ацинарных клетках поджелудочной железы (δ^ίΓΐ и др., Се11 35:639-646 (1984); Θτηίΐζ и др., Со1й δρήη§ НагЬог δутρ. ОпаШ. Вю1 50:399-409 (1986); МасПопа1й, Нера(о1оду 7:425-515 (1987)); контролирующий район гена инсулина, активный в бета-клетках поджелудочной железы (НапаПап и др., №1иге 315: 115-122 (1985)), контролирующий район генов иммуноглобулинов, который активен в лимфоидных клетках (СгокксПей1 и др., Се11 35: 647-658 (1984); Айатк и др., №Циге 318:533-538 (1985);. А1ехапйег и др., Мо1. Се11 Вю1. 7: 1436-1444 (1987)), контролирующий район вируса опухоли молочной железы мыши, активный в яичках, молочной железе, лимфоидных и тучных клетках (Ьейет и др., Се11 45: 485-495 (1986)), контролирующий район гена альбумина (Ртскей и др., Сепек апй Пеуе1 7:268276 (1987)), активный в печени, контролирующий район гена альфа-фетобелка, активный в печени (Кгат1аиГ и др., Мо1 Се11 Вю1 5: 1639-1648 (1985); Наттег и др., δ^ι^ 235: 53-58 1987)), контролирующий район гена альфа-1-антитрипсина, активный в печени (Ке1кеу и др., Сепек апй Пеуе1 7: 161-171 (1987)), контролирующий район гена бета-глобина, активный в миелоидных клетках (Модгат и др., №)(иге 375: 338-340 (1985); КоШак и др., Се11 46:89-94 (1986)), контролирующий район гена основного белка миелина, активный в олигодендроцитах мозга (Кеаййеай и др., Се11 45:703-712 (1987)), контролирующий район гена легких цепей-2 миозина, активный в скелетных мышцах (δίκ-πιτ №Циге 374: 283-286 (1985)) и контролирующий район гена гонадотропного рилизинг-гормона, активный в гонадотрофоцитах гипоталамуса (Макоп и др., δ^ι^ 234: 1372-1378 (1986)).

В конкретном варианте используют вектор, который содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей желаемый белок или его домен, фрагмент, производное или гомолог, вектор также содержит одну или несколько точек начала репликации и, по желанию, один или более селективных маркеров (например, ген устойчивости к антибиотику). Примеры плазмидных векторов для трансформации клеток Е.соП включают, например, векторы экспрессия рЦЕ (доступные от Οίадеп, Уа1епаа, Калифорния, см. также литературу, опубликованную Ц1адеп для описания системы). рЦЕ вектор включает промотор бактериофага Т5 (распознается РНК полимеразой Е.соП), двойной участок репрессии в Ьас-операторе для жестко регулируемой высокой экспрессии рекомбинантных белков в Е.соП, синтетический сайта связывания рибосом №δ II) для эффективной трансляции, последовательность, кодирующую 6хН1к метку, (о и Т1 терминаторы транскрипции, точку начала репликации Со1Е1 и ген бета-лактамазы для устойчивости к ампициллину. рОЕ вектор позволяет присоединять 6хНк метку на Ν-конце или С-конце рекомбинантного белка. Такие плазмиды включают рЦЕ 32, рЦЕ 30 и рЦЕ 31, которые включают полилинкеры для всех трех рамок считывания и обеспечивают экспрессию белков с Ν-концевой 6хНк меткой. Другие примеры плазмидных векторов для трансформации клеток Е.соП включают, например, векторы экспрессии рЕТ (см. патент США 4952496; вектор доступен №уадеп, Майкоп, Висконсин, см., также опубликованную Шуадеп литературу с описанием системы). Такие плазмиды включают рЕТ11а, которая содержит промотор Т71ас, Т7 терминатор, индуцируемый 1асоператор Е.соП, и ген 1ас-репрессора; рЕТ12а-с содержит промотор Т7, терминатор Т7 и сигнал секреции отрТ из Е.соП; рЕТ15Ь и рЕТ19Ь (Шуадеп, Майкоп, Висконсин) содержат лидерную последовательность Нк-Тад™ для очистки на Нк колонке и сайт расщепления тромбином, который позволяет осуществить расщепление после очистки на колонке, Т7-1ас промоторный район и Т7 терминатор.

Примером вектора для экспрессии в клетках млекопитающих является вектор экспрессии 4Ζ24. Вектор экспрессии Ж24 был получен из вектора рС1 (Рготеда). Он содержит ДНК, кодирующую беталактамазный ген устойчивости (АтрК), точку начала репликации Р1, немедленный ранний энхансер/промоторный район цитомегаловируса (СМУ) и концевой сигнал полиаденилирования δν40 (δν40). Вектор экспрессии также включает внутренний сайт посадки рибосомы (ΙΚΚδ) от вируса ЕСМУ (С1оп(есП) и ген дигидрофолатредуктазы мыши (ПНРК).

- 30 026112

2. Экспрессия

Растворимая гиалуронидаза может быть получена любым методом, известным специалистам в данной области, в том числе ш νί\Ό и ш уйго методами. Желаемые белки могут быть экспресссированы в любом организме, подходящем для получения необходимого количества белка и необходимой формы белка, требуемых для введения и лечения. Хозяева в системах экспрессии включают прокариотические и эукариотические организмы, такие как Е. сой, дрожжи, растения, клетки насекомых, клетки млекопитающих, в том числе клеточные линии человека, и трансгенных животных. Хозяева систем экспрессии могут отличаться уровнями экспрессии белка, а также типом пост-трансляционных модификаций, которые присутствуют на экспрессированных белках. Выбор хозяина системы экспрессии может быть сделан на основе перечисленных и других факторов, таких как нормативные ограничения и соображения безопасности, издержки производства и необходимость очистки и способы очистки.

Многие векторы экспрессии доступны и известны специалистам в данной области и могут быть использованы для экспрессии белков. Выбор вектора экспрессии зависит от выбора хозяина системы экспрессии. В общем, векторы экспрессии могут включать транскрипционные промоторы и, по желанию, энхансеры, сигналы трансляции и сигналы терминации транскрипции и трансляции. Векторы экспрессии, которые используют для стабильной трансформации, обычно имеют селективные маркеры, которые позволяют отбирать и поддерживать трансформированные клетки. В некоторых случаях для амплификации числа копий вектора могут быть использованы точки начала репликации.

Полипептиды растворимой гиалуронидазы также могут быть использованы или экспрессированы в виде гибридных белков. Например, может быть получен гибридный фермент с дополнительной функцией. Примеры гибридных ферментов включают, но не ограничиваются гибридными белками с сигнальными последовательностями, такими как метки для локализации, такие как Н1к₆ метка или тус метка, или метки для очистки, такие как ОЗТ, и последовательности для направления секреции белков и/или ассоциации с мембраной.

а. Прокариотические клетки

Прокариоты, особенно Е. сой, представляют собой системы для получения большого количества белка. Трансформация Е. сой представляет собой простой и быстрый метод, хорошо известный специалистам в данной области. Векторы экспрессии Е. сой могут содержать индуцибельный промотор, полезный для стимулирования высоких уровней экспрессии белка и для экспрессии белков, которые проявляют токсичность для клеток-хозяев. Примеры индуцибельных промоторов включают 1ас-промотор, 1гр промотор, гибридный 1ас промотор, Т7 и ЗР6 РНК промоторы и термочувствительный ХР_Ъ промотор.

Белок может быть экспрессирован в цитоплазматической среде Е. сой. Цитоплазма представляет собой восстановительную среду, и для некоторых молекул это может привести к образованию нерастворимых телец включения. Для ресолюбилизации белков могут быть использованы восстанавливающие агенты, такие как дитиотреитол и β-меркаптоэтанол, и денатурирующие агенты, такие как гуанидин-НС1 и мочевина. Альтернативный подход состоит в экспрессии белка в периплазматическом пространстве бактерий, которое предоставляет окислительную среду, шаперонин-подобные белки и дисульфидизомеразы, что приводит к образованию растворимого белка. Как правило, с экспрессируемым белком сливают лидерную последовательность, которая направляет белок в периплазму. Затем лидерная последовательность удаляется сигнальной пептидазой внутри периплазмы. Примеры лидерных последовательностей, направляющих белки в периплазму, включают лидерную последовательность ре1В гена пектатлиазы и лидерную последовательность гена щелочной фосфатазы. В некоторых случаях периплазматическая экспрессия приводит к утечке экспрессированного белка в культуральную среду. Секреция белков позволяет быстро и просто очистить белки от культурального супернатанта. Не секретируемые белки могут быть получены из периплазмы с помощью осмотического лизиса. Как и при цитоплазматической экспрессии, в некоторых случаях белки могут стать нерастворимыми и для облегчения растворения и рефолдинга белков могут быть использованы денатурирующие агенты и восстановители. Температуры индукции и культивирования также могут влиять на уровень экспрессии и растворимость белков, как правило, используются температуры между 25 и 37°С. Как правило, бактерии производят агликозилированные белки. Таким образом, если для функционирования белки требуют гликозилирования, то гликозилирование могут быть осуществлено ш уйго после очистки из клетки-хозяина.

й. Дрожжевые клетки

Дрожжи, такие как Зассйаготусек сегеуЙ1ае, ЗсЫ/окассйаготусек ротйе, Уагго\\аа йро1уйса, К1иууеготусек 1асйк и РюЫа рак1ог1к, являются хорошо известными дрожжевыми хозяевами систем экспрессии и могут быть полезны для получения белков, таких как описано в настоящем документе. Дрожжи могут быть трансформированы эписомными репликативными векторами или стабильной интеграцией в хромосомы путем гомологичной рекомбинации. Как правило, для регулирования экспрессии генов используются индуцируемые промоторы. Примеры таких промоторов включают промоторы ОАЬ1, ОАЕ7, ОАЕ5 и металлотионеиновые промоторы, такие как СИР1, АОХ или другие промоторы Рюша или других дрожжей. Для отбора и поддержания трансформированной ДНК векторы экспрессии часто включают селективные маркеры, такие как ЬЕШ, ТКР1, Н1З3 и ИКА3. Экспрессируемые в дрожжах белки часто

- 31 026112 являются растворимыми, а коэкспрессия с шаперонинами, такими как Βίρ и протеиндисульфидизомераза, может повысить уровень экспрессии и растворимость белка. Кроме того, экспрессируемые в дрожжах белки могут быть направлены для секреции с использованием слитого сигнального пептида секреции, такого как сигнал секреции альфа-фактора типа спаривания дрожжей из 8асскаготусек сегеуыае. и слитого сигнального пептида белков поверхности клетки дрожжей, таких как адгезивный рецептор спаривания Ада2р или глюкоамилаза Агхи1а айетшуогапк. Для удаления слитой последовательности из полипептидов после секреции может быть введен сайт расщепления протеазой (например, протеазой Кех-2). Дрожжи также способны к гликозилированию мотива Акп-Х-8ег/Ткг.

с. Клетки насекомых

Клетки насекомых, в частности при использовании системы бакуловирусной экспрессии, полезны для экспрессии полипептидов, таких как полипептиды гиалуронидазы. Клетки насекомых и личинки насекомых экспрессируют высокие уровни белка и способны осуществлять большинство посттрансляционных модификаций высших эукариот. Бакуловирусы имеют ограниченный диапазон хозяев, что повышает безопасность и снижает нормативные ограничения, присущие системам эукариотической экспрессии.

Как правило, в векторах экспрессии для высокого уровня экспрессии белка используют промотор полиэдрина бакуловируса. Обычно используемые бакуловирусные системы включают такие бакуловирусы как вирус ядерного полиэдроза АиЮдгарка саНГописа (АсЖУ) и вирус ядерного полиэдроза ВотЬух топ (ВпАРУ) и линии клеток насекомых, такие как 8Г9, полученные из 8ройор1ега Ггид1регйа, Ркеийа1ека итрипФа (А78) и Оапаик р1ех1ррик (Ό]θΝ1). Для достижения высокого уровня экспрессии нуклеотидную последовательность молекулы, которая будет экспрессирована, присоединяют непосредственно после инициаторного кодона полиэдрина вируса. Сигналы секреции млекопитающих точно процессируются в клетках насекомых и могут быть использованы для секреции экспрессированного белка в культуральную среду. Кроме того, клеточные линии Ркеийа1ека ишрипс1а (А78) и Оапаик р1ех1ррик (ОрМ) производят белки, гликозилирование которых похоже на гликозилирование в клеточных системах млекопитающих.

Альтернативной системой экспрессии в клетках насекомых является использование стабильно трансформированных клеток. Для экспрессии могут быть использованы такие клеточные линии, как 8сктейег 2 (82) и Кс клетки (Огокоркка те1аподак1ег) и С7 клетки (Аейек а1Ьорю1и8). Для достижения высокого уровня экспрессии может быть использован промотор металлотионеина ЭгокоркНа с индукцией тяжелыми металлами кадмием и медью.

Векторы экспрессии, как правило, поддерживают за счет использования селективных маркеров, таких как неомицин и гигромицин.

й. Клетки млекопитающих

Для экспрессии белков, включая полипептиды растворимой гиалуронидазы, могут быть использованы системы экспрессии млекопитающих. Экспрессионные конструкции могут быть введены в клетки млекопитающих посредством вирусной инфекции, например, с помощью аденовируса, или путем прямого переноса ДНК, например, с помощью липосом, фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана и физических методов, таких как электропорация и микроинъекция. Векторы экспрессии для клеток млекопитающих обычно включают сайт кэпирования мРНК, ТАТА-бокс, последовательность инициации трансляции (консенсусную последовательность Козака) и элементы полиаденилирования. Для бицистронной экспрессии с другим геном, таким как селективный маркер, могут быть использованы 1КЕ8 элементы. Такие векторы для достижения высокого уровня экспрессии часто включают промоторы и энхансеры транскрипции, например промотор-энхансер 8У40, промотор цитомегаловируса человека (СМУ) и длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса (К8У). Указанные промоторы-энхансеры действуют во многих типах клеток. Также для экспрессии могут быть использованы тканеспецифичные и специфичные к определенным типам клеток промоторы и энхансерные районы. Примеры промоторных/энхансерных районов включают, но не ограничиваются районами из таких генов, как ген эластазы I, ген инсулина, гены иммуноглобулинов, промоторным/энхансерным районом вируса опухоли молочной железы мыши, ген альбумина, ген альфа-фетобелка, альфа-1-антитрипсина, бета-глобина, основного белка миелина, легкой цепи-2 миозина и гонадотропного рилизинг-гормона. Для отбора и поддержания клеток с экспрессионными конструкциями могут быть использованы селективные маркеры. Примеры селективных маркеров включают, но не ограничиваются генами гигромицинфосфотрансферазы, аденозиндезаминазы, ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы, аминогликозидфосфотрансферазы, дигидрофолатредуктазы и тимидинкиназы. Например, экспрессию можно проводить в присутствии метотрексата для отбора клеток, экспрессирующих ген дигидрофолатредуктазы. Слитые с сигнальными молекулами клеточной поверхности, такими как ТСК-ζ и Рс_ЕК1-у, белки могут непосредственно экспрессироваться в активном состоянии на поверхность клеток.

Для экспрессии в млекопитающих доступны многие клеточные линии, включая клетки мыши, крысы, человека, обезьяны, курицы и хомяка. Примеры линий клеток включают, но не ограничиваются СНО. Ва1Ь/3Т3, НеЬа, МТ2, мышиными Ν8Ο (не секретирующие) и другими клеточными линиями миеломы, гибридомными и гетерогибридомными клеточными линиями, лимфоцитами, фибробластами, 8Р2/0, СО8, МН3Т3, НЕК293, 2938, 293Т, 2В8 и НКВ клетками. Также доступны адаптированные к бессыворо- 32 026112 точной среде клеточные линии, что облегчает очистку секретируемых белков из культуральной среды. Примеры включают клетки СНО-δ (1пуйго§еп, СагкЪаб, Калифорния, лот № 11619-012) и бессывороточную линию клеток ΕΒΝΑ-Ι (Р1ат и др., (2003) Вю1ес1то1 Вюепд. 84: 332-42). Также доступны линии клеток, адаптированные для роста в специальной среде, оптимизированной для максимальной экспрессии. Например, СНО клетки ΌΟ44 адаптированы для роста в суспензионной культуре в свободной от продуктов животного происхождения среде с химически описанным составом.

е. Растения

Для экспрессии белков, таких как любые описанные в настоящем изобретении белки, могут быть использованы трансгенные клетки растений и растения. Экспрессионные конструкции, как правило, переносят в растения с использованием прямого переноса ДНК, такого как бомбардировка микрочастицами и ПЭГ-опосредованный перенос в протопласты, или с использованием агробактериальной трансформации. Векторы экспрессии могут включать промоторные и энхансерные последовательности, элементы терминации транскрипции и элементы контроля трансляции. Векторы экспрессии и методы трансформации, как правило, отличаются для двудольных хозяев, таких как АгаЫбор818 и табак, и однодольных хозяев, таких как кукуруза и рис. Примеры промоторов растений, используемых для экспрессии, включают промотор вируса мозаики цветной капусты, промотор нопалинсинтазы, промотор рибулозобисфосфаткарбоксилазы и промотор убиквитина и ИВЦ3. Для облегчения отбора и поддержания трансформированных клеток часто используют селективные маркеры, такие как гигромицин, фосфоманнозоизомераза и неомицинфосфотрансфераза. Трансформированные клетки растений можно поддерживать в культуре в виде клеток, агрегатов (каллусной ткани) или регенерировать в целые растения. Трансгенные клетки растений также могут включать генетически модифицированные водоросли, предназначенные для получения полипептидов гиалуронидазы. Поскольку паттерны гликозилирования у растений отличаются от гликозилирования в клетках млекопитающих, это может повлиять на выбор белков, продуцируемых в этих хозяевах.

3. Способы очистки

Способы очистки полипептидов, в том числе инсулина и деградирующих гиалуронан ферментов или других белков из клетки-хозяина зависят от выбранной клетки-хозяина и системы экспрессии. В случае секреции белки, в общем, являются очищенными из культуральной среды после удаления клеток. В случае внутриклеточной экспрессии клетки могут быть лизированы, и белки очищают из экстракта. Если для экспрессии используют трансгенные организмы, такие как трансгенные растения и животные, в качестве исходного материала для получения экстракта лизированных клеток могут быть использованы ткани или органы. Кроме того, получение белков в трансгенных животных может включать получение полипептидов в молоке или яйцах, которые могут быть собраны, и затем при необходимости белки могут быть выделены и очищены с использованием стандартных способов, известных в уровне техники.

Белки, такие как полипептиды растворимой гиалуронидазы могут быть очищены с использованием стандартных способов очистки белков, известных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь 8Ό8РАОЕ, эксклюзионной хроматографией и хроматографией по размеру, осаждением сульфатом аммония, хелатной хроматографией и ионообменной хроматографией, такой как анионообменная хроматография. Для увеличения эффективности очистки и улучшения чистоты получаемых препаратов может быть использована аффинная очистка. Например, для аффинной очистки могут быть использованы антитела, рецепторы и другие молекулы, которые связывают гиалуронидазу. В экспрессионных конструкциях к белку может быть добавлена аффинная метка, такая как тус эпитоп, гибридная последовательность О8Т или Ηίδ6, и аффинная очистка может быть проведена с помощью тус антител, смолы с глутатионом и Νί-смолы соответственно. Чистота может быть оценена любым способом, известным в уровне техники, включая гель-электрофорез, окрашивание и спектрофотометрические методы.

Р. Получение, композиции (состава) и введение иммуноглобулинов и полипептидов растворимой гиалуронидазы

В настоящем документе предусмотрены совместные композиции 1д и гиалуронидазы, которые являются стабильными в виде жидких композиций в течение длительного периода времени по меньшей мере в течение 6 месяцев при температуре до 32°С, например, при температуре приблизительно от 0°С до 32°С. Повышенная стабильность характеризуется увеличенным временем хранения, снижением фрагментации, снижением образования агрегатов, снижением образования димером и/или уменьшением обесцвечивания при сохранении активности 1д и гиалуронидазы. Такие совместные композиции могут быть предусмотрены как готовые к применению жидкие композиции без необходимости дополнительного восстановления и/или дополнительного разведения. Полученные стабильные совместные композиции могут быть легко использованы врачами и пациентами в виде лекарственных форм для непосредственного введения или инъекции. Например, совместные композиции могут быть введены инфузией или инъецированы дома или в любом другом месте.

Растворимые гиалуронидазы в совместной композиции с иммуноглобулином позволяют осуществлять усиленную доставку иммуноглобулина в желаемый участок тела, увеличивая биодоступность иммуноглобулина. Таким образом, совместные композиции позволяют достичь повышенной концентрации иммуноглобулина и/или для более быстро достичь необходимой концентрации иммуноглобулина после

- 33 026112 подкожного введения по сравнению с традиционными методами подкожного введения для обеспечения, например, более мощного и/или более быстрого ответа на введенную дозу. Кроме того, совместные композиции 1д с растворимой гиалуронидазой также позволят вводить более низкие дозы 1д для достижения определенного ответа. Наконец, способность растворимой гиалуронидазы увеличивать объемный поток жидкости вблизи места инъекции или инфузии также может улучшить другие аспекты фармакологической доставки. Например, увеличение объемного потока жидкости может способствовать оттоку и распространению введенной жидкости из места инъекции (снижение потенциально болезненных или других негативных последствий инъекции). Для подкожной инфузии особенно важно обеспечить возможность введения более высоких доз. В дополнение к увеличению биодоступности совместные композиции 1д с гиалуронидазой обеспечивают более безопасный и более удобный путь введения по сравнению с обычным внутривенным путем введения.

Предусмотренные в настоящем документе совместные композиции стабильны в течение длительного периода времени, в том числе при различных температурах. Например, совместные композиции по настоящему документу являются стабильными и сохраняют активность 1д и гиалуронидазы при температуре до 32°С в течение не менее 6 месяцев. Например, совместные композиции стабильны при температуре холодильника, например, при 2-8°С, например, при приблизительно 4°С по меньшей мере в течение 6 месяцев-4 лет, например, от 1 до 2 лет, например, в течение 6 месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 3 лет или по меньшей мере 4 лет или более. В другом примере совместные композиции являются стабильными и сохраняют активность при комнатной температуре, например, при 18-32°С, как правило, 20-32°С, например, 28-32°С, по меньшей мере от 6 месяцев до 1 года, например, 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев или по меньшей мере 1 год и более.

В частности, стабильные совместные композиции обладают низким или неопределяемым уровнем агрегации и/или фрагментации 1д при хранении в течение определенных периодов времени. Способы оценки агрегации и фрагментация известны специалистам в данной области и описаны в разделе О ниже. После хранения в течение определенного периода времени, как указано выше, как правило, не более чем от 0,5 до 5% 1д, например, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2%, не более 1% и, как правило, не более 0,5% 1д в совместной композиции образует агрегаты по данным ΗΡ8Εί'.' (высокопроизводительной эксклюзионной хроматографии) или другим методам.

Кроме того, 1д и гиалуронидаза в стабильной композиции по настоящему документу сохраняют одну или несколько активностей из начальных активностей 1д и гиалуронидазы перед хранением. Специалист в данной области знаком с активностью 1д и гиалуронидазы и может оценить такую активность. В разделе О описаны примеры активностей и тестов для оценки активности. Как правило, стабильные жидкие совместные композиции по настоящему документу сохраняют после хранения не менее 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более исходной активности белка до хранения, как правило, не менее 70-95% от первоначальной активности. Например, стабильная жидкая совместная композиция сохраняет при хранении более 70%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95%, более 98%, более 99% или более 99,5% от первоначальной активности соответствующих белков до хранения.

1. Композиции (составы) и дозы

Совместные композиции по настоящему документу предусмотрены в жидком виде. Совместные композиции содержат иммуноглобулин, гиалуронидазу, по меньшей мере 0,05 М хлорида щелочного металла, например, по меньшей мере 0,05 М хлорида натрия (№С1) или 0,05 М хлорида калия (КС1). Для уменьшения агрегации и сохранения активности 1д и гиалуронидазы совместные композиции также имеют определенный скорректированный рН. В некоторых примерах совместные композиции не содержат иных ингредиентов (кроме воды или подходящего растворителя). В других примерах совместные композиции также содержат разбавители, носители или другие вспомогательные вещества.

Как правило, соединения включают в фармацевтические композиции с применением способов и процедур, хорошо известных в данной области (см., например, Αηδβΐ ΙηίΓοάυοΙίοη ίο ΡΙιαπηαίχιιΙίοαΙ Όοδаде Εοπηδ. ΕοιιΠίι Εάίΐίοη, 1985, 126). Фармацевтически приемлемые композиции получают в соответствии с требованиями регулирующего органа или другого органа в соответствии с общепризнанной фармакопеей для использования на животных и для человека. Композиция должна соответствовать способу введения.

Совместные композиции могут быть предусмотрены как фармацевтический препарат в жидкой форме, в виде растворов, сиропов и суспензий. В жидком виде фармацевтические препараты могут быть предусмотрены в виде концентрированного препарата, который необходимо развести до терапевтически эффективной концентрации перед применением. Как правило, препараты предусмотрены в дозированной форме, которая не требует разбавления для применения. Такие жидкие препараты могут быть получены обычными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сорбитольный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные жиры), эмульгаторы (например, лецитин или гуммиарабик); неводные носители (например, миндальное масло, масляные эфиры или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-пгидроксибензоаты или сорбиновая кислота). В другом примере фармацевтические препараты могут быть

- 34 026112 представлены в лиофилизированной форме для разведения водой или другим подходящим носителем перед применением.

рН стабильных совместных композиций по настоящему документу таков, что Ιβ в совместной композиции не агрегирует и/или Ι§ и гиалуронидаза сохраняют активность, как описано в разделе С. Оптимальный рН может быть получен с помощью способов составления композиции, известных специалистам в данной области техники. Например, оптимальный рН можно определить путем оценки агрегации и активности при различных рН с применением различных способов, известных специалистам в данной области, например, как описано в разделе С. Такие анализы и оценки включают, но не ограничиваются эксклюзионной хроматографией, ЖРЕС, данными теплостойкости, определением титра различных препаратов и/или анализами гиалуронидазной активности. Как правило, в совместных композициях по настоящему документу рН может колебаться от 4,0 до 8,0 при измерении этого параметра в концентрированном растворе совместной композиции. Как правило, для обеспечения максимального содержания мономера в пределах указанного диапазона предпочтительны более низкие значения рН. Соответственно совместные композиции по настоящему документу обычно имеют рН по меньшей мере приблизительно от 4,0 до 7,4, как правило, по меньшей мере приблизительно от 4,0 до 6,0 и, как правило, от 4,4 до 4,9. Как уже отмечалось, указанный рН измеряют в концентрированном растворе препарата. рН можно регулировать при помощи подкисляющих агентов для снижения рН или подщелачивающих агентов для повышения рН. Примеры подкисляющих агенты включают, но не ограничиваются уксусной кислотой, лимонной кислотой, серной кислотой, соляной кислотой, раствором однозамещенного фосфата натрия и фосфорной кислотой. Примеры подщелачивающих агентов включают, но не ограничиваются раствором двухзамещенного фосфата натрия, карбоната натрия или гидроксида натрия.

Для получения жидкой композиции по настоящему документу может быть использован любой буфер, если он не оказывает отрицательного влияния на стабильность совместной композиции и поддерживает необходимый диапазон рН. Примеры особенно подходящих буферов включают сукцинатный, ацетатный, фосфатный, цитратный, аконитатный, малатный и карбонатный. Специалисту в данной области, однако, очевидно, что предусмотренные здесь композиции не ограничены определенным буфером, если буфер обеспечивает приемлемый уровень стабильности рН или буферной емкости в указанном диапазоне. Как правило, буфер имеет достаточную буферную емкость в интервале рН приблизительно 1 от его рК (ЕасЬтан еί а1. 1986). Пригодность буфера можно оценить с помощью опубликованных таблиц рК или эмпирически, как хорошо известно в данной области. рН раствора можно регулировать до желаемой конечной точки, как описано выше, например, используя любую приемлемую кислоту или основание.

а. Иммуноглобулин

Ι§ в совместной композиции предусмотрен в концентрации приблизительно от 5% до 22% вес./об., например, в концентрации приблизительно 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 120 мг/мл, 150 мг/мл, 180 мг/мл, 200 мг/мл, 220 мг/мл, 250 мг/мл и более. Как правило, Ιβ в совместной композиции предусмотрен в количестве, которое составляет от 10% (100 мг/мл) до 20% (200 мг/мл), например, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% и более.

Препараты иммуноглобулинов по настоящему документу могут быть изготовлены в виде фармацевтических композиций для введения одной или несколькими дозами. Обычно, как уже отмечалось в настоящем документе, Ιβ в совместной композиции представлен в таком количестве, что она готова к применению и дополнительного разведения не требуется. В зависимости от того, предусмотрена ли совместная композиция для введения одной или несколькими дозами, специалист в данной области может эмпирически определить точное количество Ιβ в совместной композиции.

Как правило, иммуноглобулин предусмотрен в терапевтически эффективном количестве для конкретного режима дозирования. Терапевтически эффективная концентрация может быть определена эмпирически тестированием соединений в известных ίη νίίτο и ίη νίνο системах, например, с помощью предусмотренных здесь анализов. Концентрация выбранного иммуноглобулина в композиции зависит от скоростей поглощения, инактивации и выведения комплекса, физико-химических характеристик комплекса, графика дозирования и вводимого количества, а также других факторов, которые известны специалистам в данной области. Например, подразумевается, что точная дозировка и длительность лечения зависят от типа подвергающейся лечению ткани и могут быть определены эмпирически с использованием известных протоколов анализа или путем экстраполяции ίη νίίτο или ίη νίνο данных. Следует отметить, что значения концентрации и дозировки могут изменяться в зависимости от возраста пациента. Также подразумевается, что для любого конкретного субъекта с течением времени в зависимости от индивидуальных потребностей и профессионального суждения лица, осуществляющего контроль за введением препарата, схема дозирования должна быть скорректирована и что приведенные здесь диапазоны концентрации приведены только в качестве примеров и не предназначены для ограничения диапазонов концентраций. Количество вводимого для лечения заболевания или состояния, например поддающегося лечению Ιβ заболевания или состояния выбранного препарата иммуноглобулина может быть определено стандартными клиническими способами. Кроме того, чтобы помочь определить оптимальный диапазон доз, могут быть использованы анализы на животных и ίη νίίτο. Таким образом, точная дозировка, которая может быть определена эмпирически, может зависеть от особенностей препарата иммунноглобулина,

- 35 026112 режима и графика введения и с растворимой гиалуронидазой, пути введения, вида заболевания и тяжести заболевания.

Например, препараты ΐ§ могут быть введены в фармацевтические композиции для достижения режимов введения (дозы и частоты), в соответствии с которыми изготавливают и вводят для лечения конкретных поддающихся лечению ΐβ заболеваний или состояний современные препараты ΐ§ для внутривенного введения (ΐνΐθ). Специалисты в данной области знакомы с режимами введения препаратов ΐνΐθ для лечения конкретных заболеваний или состояний. Например, в разделе Н ниже приведены примеры режимов введения ΐ§ (дозы и частоты) для конкретных заболеваний и состояний. Другие режимы введения хорошо известны специалистам в данной области. При необходимости, конкретные дозы и длительность лечения могут быть подобраны эмпирически или экстраполированы.

Например, в качестве отправной точки для определения соответствующих доз могут быть использованы примеры доз внутривенно вводимых иммуноглобулинов. Доза может быть определена на основе ряда факторов, таких как масса тела человека, общее состояние здоровья, возраст, активность конкретного используемого соединения, пол, диета, время введения, скорость выделения, комбинация препаратов, тяжесть и течение заболевания, а также предрасположенность пациента к заболеванию и мнение лечащего врача. Как правило, дозы иммуноглобулинов составляют приблизительно от 100 мг на кг массы тела (то есть 100 мг/кг массы тела) до 2 г/кг массы тела. Подразумевается, что вводимое количество зависит от подвергаемого лечению состояния и, по желанию, допускаемых побочных эффектов. Дозировка может быть эмпирически определена для каждого заболевания с помощью признанных моделей.

В одном из примеров ΐ§ предусмотрен в количестве, которое позволяет вводить подкожно дозу, эквивалентную одной месячной ΐν дозе для конкретного подвергающегося лечению состояния. В таком примере препарат иммуноглобулина может быть получен для введения одной дозой в количестве, достаточном для осуществления введения один раз в месяц, но может быть предусмотрен и в меньшем количестве для введения несколькими дозами. Например, одну месячную дозу препарата ΐβ можно вводить ежедневно, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц. Введение можно продолжать в течение нескольких месяцев или лет. Конкретная месячная ΐν доза зависит от заболевания, подлежащего лечению, и, следовательно, может меняться.

Примеры диапазонов доз для подкожного введения ΐ§ составляют приблизительно от 1 грамма (г) до 200 г, например, 1 грамм (г), 5 г, 10 г, 20 г, 30 г, 40 г, 50 г, 60 г, 70 г, 80 г, 90 г, 100 г или 200 г. Конкретная доза и композиция зависят от показаний и субъекта. Например, доза может составлять од 50 мг/кг массы тела (МТ) до 600 мг/кг МТ, например, 50 мг/кг массы тела (МТ), 100 мг/кг массы тела, 200 мг/кг массы тела, 300 мг/кг массы тела, 400 мг/кг массы тела, 500 мг/кг массы тела, 600 мг/кг массы тела и более. При необходимости доза может быть определена эмпирически. Для достижения указанных доз вводимые подкожно объемы содержащих ΐ§ совместных композиций могут составлять приблизительно от 10 мл до 700 мл, например, от 100 до 500 мл, например, от 200 мл до 400 мл. Например, вводимые подкожно одной дозой объемы содержащих ΐ§ совместных композиций могут составлять приблизительно 10 мл, 20 мл, 30 мл, 40 мл, 50 мл, 100 мл, 200 мл, 300 мл, 400 мл, 500 мл, 600 мл, 700 мл или более. Например, жидкая совместная композиция 10% ΐ§ (100 мг/мл) для описанных здесь применений может быть введена в объеме от 200 мл до 700 мл для достижения одной дозы ΐ§ от 20 г до 70 г. В другом примере жидкая совместная композиция 20% ΐ§ (200 мг/мл) для описанных здесь применений может быть введена в объеме от 100 мл до 350 мл для достижения аналогичной одной дозы ΐ§ от 20 г до 70 г. Как уже отмечалось, при введении несколькими дозами ΐ§ может быть предусмотрен в совместной композиции в меньшем количестве.

Ъ. Гиалуронидаза

Выбранные гиалуронидазы, в частности растворимая гиалуронидаза, например, гНиРН20, входит в совместные композиции в концентрации, которая составляет приблизительно от 50 ед./мл до 300 ед./мл, например, 50 ед./мл, 75 ед./мл, 100 ед./мл, 150 ед./мл, 200 ед./мл, 300 ед./мл, 400 ед./мл или 500 ед./мл, как правило, от 100 ед./мл до 300 ед./мл, как правило, от 75 ед./мл до 350 ед./мл. При желании, гиалуронидаза может быть представлена в большей концентрации, например, в концентрации приблизительно от 1000 ед./мл до 5000 ед./мл, например, 1000 ед./мл, 1500 ед./мл, 2000 ед./мл, 4000 ед./мл или 5000 ед./мл.

Гиалуронидаза в совместной композиции может быть предусмотрена в виде фармацевтической композиции для введения одной или несколькими дозами. Как уже отмечалось выше для ΐ§, гиалуронидаза в совместной композиции обычно предусмотрена в таком количестве, при котором композиция готова к применению без дополнительного разведения. В зависимости от того, предусмотрена ли композиция в виде единичной дозированной формы или множественной дозированной формы, специалист в данной области может эмпирически определить точное количество гиалуронидазы, которое необходимо включить в совместную композицию.

Как правило, выбранная гиалуронидаза, в частности растворимая гиалуронидаза, например, гНиРН20, входит в совместные композиции в количестве, достаточном для оказания терапевтически полезного эффекта ΐβ при отсутствии нежелательных побочных эффектов для пациента. Терапевтически эффективная концентрация может быть определена эмпирически путем тестирования полипептидов в известных ίη νίΙΐΌ и ίη угуо системах, например, с помощью анализов, описанных в настоящем документе

- 36 026112 или известных в данной области техники (см., например, Тайат и др., (1996) Апа1. Вюсйет., 240: 60-67; Рбосато и др., (1997) 1 Уио1о§у, 71: 1417-1427; 8ибо и др., (1996) Апйуиа1 Кек. 32: 9-18; Вийагб и др., (1995) У1го1о§у, 209:52-59; В1апсй1 и др., (1996) Апа1. Вюсйет, 237: 239-244; Ната1аке и др., (1996) йЛегУ1го1о§у 39:249-258; 81ешкий1ег и др., (1998) Вюсйет, 37:8899-8905; П'8ои/а и др., (1995) 1 Сеп. Уио1., 76:1729-1736; Такекййа и др., (1997) Апа1. Вюсйет., 247:242-246; см. также, например, 81ιίιηίζιι и др., (1994) 1. Уио1. 68:8406-8408; М1/Шаш и др., (1996) 1. Уио1. 70:7219-7223; М1/Шаш и др., (1996) Вюсйет Вюрйук Кек Соттип, 227:822-826; Ьи и др., (1996) Ργθο. Ν·ιΐ1. Асаб. 8α (И8А), 93:1412-1417; Найт и др., (1996) Уио1о§у, 226:318-326; Но и др., (1996) 1. Сеп. УнШ, 77:1043-1054;. Мй/Шаш и др., (1995) Вюсйет Вюрйук Кек Соттип, 212:906-911; Сйо и др., (1997) 1. Уио1. Ме1й 65:201-207), а затем экстраполирована на дозу для человека.

Например, терапевтически эффективные дозы гиалуронидазы для однократного введения составляют приблизительно от 500 единиц до 500000 единиц, например, от 1000 единиц до 100000 единиц. Например, гиалуронидазу можно вводить, в частности, подкожно, в количестве приблизительно 500 единиц, 1000 единиц, 2000 единиц, 5000 единиц, 10000 единиц, 30000 единиц, 40000 единиц, 50000 единиц, 60 000 единиц, 70 000 единиц, 80 000 единиц, 90 000 единиц, 100 000 единиц или более. Как уже отмечалось, гиалуронидаза могут быть предусмотрена в меньшем количестве при введении совместной композиции несколькими дозами.

В некоторых примерах, дозы могут быть предусмотрены в виде отношения к количеству вводимого Ι§. Например, гиалуронидаза может быть введена в количестве от 10 ед./грамм (г) Ι§ до 2000 ед./г Ι§ или более, например, в количестве приблизительно 10 ед./г, 20 ед./г, 30 ед./г, 40 ед./г, 50 ед./г, 60 ед./г, 70 ед./г, 80 ед./г, 90 ед./г, 100 ед./г, 150 ед./г, 200 ед./г, 250 ед./г, 300 ед./г, 400 ед./г, 500 ед./г, 1000 ед./г, 1500 ед./г, 2000 ед./г, 3000 ед./г Ι§ или более. В целом, отношение гиалуронидазы к Ι§ в совместной композиции выше, чем указанное отношение при раздельном подкожном введении указанных композиций (Ι§ и гиалуронидазы) при том же количестве Ιβ. Таким образом, как правило, это соотношение составляет не менее 100 ед./г, как правило 250 ед./г или более, например, от 100 ед./г до 3000 ед./г Ι§, например, от 250 ед./г до 1000 ед./г, в частности от 250 ед./г до 750 ед./г, например, 500 ед./г Ι§. Например, совместная композиция, содержащая 100 ед./мл гиалуронидазы, при введении в совместную композицию с 20% Ι§ (200 мг/мл) приводит к соотношению приблизительно 500 ед./г Ι§. Как правило, вводимый одной дозой подкожно объем может составлять приблизительно от 10 мл до 700 мл, например, от 50 мл до 500 мл, например, от 100 мл до 400 мл. Например, вводимый одной дозой подкожно объем может составлять приблизительно 10 мл, 20 мл, 30 мл, 40 мл, 50 мл, 100 мл, 200 мл, 300 мл, 400 мл, 500 мл, 600 мл, 700 мл и более.

с. Хлорид щелочного металла

Предусмотренные совместные композиции содержат хлорид щелочного металла в концентрации не менее 0,05 М. Хлорид щелочного металла включает, но не ограничивается хлоридом натрия (№С1) или хлоридом калия (КС1). Как правило, хлориды щелочных металлов, например, №·ιθ или КС1, включают в композицию для стабильности и сохранения гиалуронидазной активности. Точное количество соли может быть эмпирически определено специалистом в данной области. Например, количество соли в композициях можно определить путем оценки агрегации и активности при различных концентрациях соли с применением различных способов, известных специалистам в данной области, например, как описано в разделе С. Как правило, совместные композиции по настоящему документу содержат хлорид натрия в количестве приблизительно от 0,05 М до 0,3 М, например, приблизительно 0,05 М, 0,06 М, 0,07 М, 0,08 М, 0,09 М, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М и более. Как правило, количество соли составляет от 0,05 М до 0,25 М, например, 0,15 М.

б. Аминокислотный стабилизатор

Совместные композиции по настоящему документу содержат аминокислотные стабилизаторы, которые способствуют стабильности препарата. Стабилизатор может представлять собой неполярные и основные аминокислоты. Примеры неполярных и основных аминокислот включают, но не ограничиваются аланином, гистидином, аргинином, лизином, орнитином, изолейцином, валином, метионином, глицином и пролином. Например, аминокислотный стабилизатор может представлять собой глицин или пролин, как правило, глицин. Стабилизатор может представлять собой одну аминокислоту или может представлять комбинацию 2 или более таких аминокислот. Аминокислотные стабилизаторы могут представлять собой природные аминокислоты, аналоги аминокислот, модифицированные аминокислоты или эквиваленты аминокислот. Как правило, аминокислоты представляют собой Ь-аминокислоты. Например, если в качестве стабилизатора используют пролин, как правило, это Ь-пролин. Можно также использовать эквиваленты аминокислот, например, аналоги пролина.

Как правило, в раствор добавляют эффективное для поддержания иммуноглобулина в мономерной форме количество одной или нескольких аминокислот. Концентрация аминокислотного стабилизатора, например, глицина, включенного в жидкую совместную композицию, составляет от 0,1 М до 1 М аминокислоты, как правило, от 0,1 до 0,75 М, как правило, от 0,2 М до 0,5 М, например, по меньшей мере приблизительно 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М, 0,5 М, 0,6 М, 0,7 М, 0,75 М и более. Аминокислоты, например глицин, могут быть использованы в форме фармацевтически приемлемой

- 37 026112 соли, такой как гидрохлорид, гидробромид, сульфат, ацетат и т.д. Чистота аминокислоты, например глицина, должна составлять по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 99,5% или более.

е. Другие агенты

По желанию, совместные композиции могут включать в себя вспомогательные вещества, такие как разбавитель, адъювант, наполнитель, или носитель, с которым вводят гиалуронидазу или 1д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Кетт§1ои'к РЬагтасеийса1 δс^еисек Е. ν. Магйи. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения, как правило, в очищенном или частично очищенном виде вместе с подходящим количеством носителя, обеспечивающим форму лекарственного средства для надлежащего введения пациенту. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильную жидкость, такую как вода и масло, в том числе масло нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такое как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и кунжутное масло. Вода является типичным носителем, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидкого носителя, особенно в качестве раствора для инъекций.

Фармацевтически приемлемые носители, используемые в препаратах для парентерального введения, включают водные носители, неводные носители, антимикробные агенты, изотонические агенты, буферы, антиоксиданты, местные анестетики, суспендирующие и диспергирующие агенты, эмульгаторы, изолирующие агенты или хелатообразователи и другие фармацевтически приемлемые вещества. Примеры водных сред включают раствор хлористого натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, изотонический раствор декстрозы для инъекции, стерильную воду для инъекций, раствор Рингера с декстрозой и лактатом для инъекций. Неводные парентеральные среды включают жирные масла растительного происхождения, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и арахисовое масло. К препаратам для парентерального введения, упакованным в контейнеры с множественными дозированными формами, могут быть добавлены противомикробные препараты в бактериостатических или фунгистатических концентрациях, включая фенолы или крезолы, ртутные консерванты, бензиловый спирт, хлорбутанол, метиловый и пропиловый эфиры п-оксибензойной кислоты, тимеросал, хлорид бензалкония и хлорид бензетония. Изотонические агенты включают хлорид натрия и декстрозу. Буферы включают фосфатный и нитратный буферы. Антиоксиданты включают бисульфат натрия. Местные анестетики включают гидрохлорид прокаина. Суспендирующие и диспергирующие агенты включают натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Эмульгаторы включают полисорбат 80 (Твин-80). Изолирующие агенты или хелаторы ионов металлов включают ЭДТА. Фармацевтические носители также включают этиловый спирт, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль для смешиваемых с водой сред и гидроксид натрия, соляную кислоту, лимонную кислоту или молочную кислоту для доведения рН.

Композиции наряду с активным ингредиентом могут содержать наполняющий агент, такой как лактозу, сахарозу, дикальция фосфат или карбоксиметилцеллюлозу; смазку, такую как стеарат магния, стеарат кальция и тальк, и связующее, такое как крахмал, натуральные смолы, такие как камедь, гуммиарабик, желатин, глюкоза, патока, поливинилпирролидон, целлюлоза и ее производные, повидон, кроссповидоны и другие подобные связующие, известные специалистам в данной области.

К совместной композиции, которая может включать любое количество фармацевтически приемлемых белков или пептидов, могут быть добавлены белки-наполнители. Как правило, белок-наполнитель выбран по его способности при введении млекопитающему не вызывать иммунный ответ. Например, для применения в фармацевтических препаратах хорошо подходит человеческий сывороточный альбумин. Другие подходящие фармацевтические наполнители представляют собой крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен гликоль, воду и этанол. Наполнитель входит в композицию в концентрации, достаточной для предотвращения адсорбции белка поверхностью сосуда или флакона. Концентрация наполнителя будет варьировать в зависимости от природы наполнителя и концентрации белка в совместной композиции.

Композиция, по желанию, также может содержать небольшие количества смачивателя или эмульгатора, или буферных агентов, например, ацетата, цитрата натрия, производных циклодекстрина, сорбитанмонолаурата, ацетата натрия, триэтаноламина, триэтаноламинолеата и других подобных агентов.

2. Дозированные формы

Совместные композиции по настоящему документу могут быть предусмотрены в виде единичных или множественных дозированных форм. Например, если совместная композиция по настоящему документу остается стабильной на протяжении длительного периода времени, совместные композиции могут быть предусмотрены в виде множественных дозированных форм для введения в интервале дней, недель, месяцев или лет. Кроме того, жидкие совместные композиции могут быть предусмотрены в виде единичных дозированных форм. Концентрацию фармацевтически активного соединения подбирают так, чтобы инъекция обеспечивала эффективное количество соединения для получения желаемого фармакологического эффекта. Например, каждая единичная доза содержит определенное количество терапевти- 38 026112 чески активного соединения, достаточное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем, носителем или растворителем. Точная доза зависит от возраста, веса и состояния пациента или животного, как известно в данной области техники.

Дозированные формы могут быть введены частями, или может быть введено несколько дозированных форм одновременно. Множественная дозированная форма представляет собой множество одинаковых единичных дозированных форм, упакованных в один контейнер для введения отдельными единичными дозированными формами. Таким образом, множественные дозированные формы представляют собой множество единичных дозированных форм, которые не разделены в упаковке.

Дозированные препараты для парентерального введения упакованы в ампулы, флаконы или шприцы с иглами. Объем жидкого раствора, содержащего фармацевтически активное соединение, зависит от подвергаемого лечению заболевания и конкретного изделия, выбранного для упаковки. Все препараты для парентерального введения должны быть стерильными, как известно и практикуется в данной области техники. Если препарат предназначен для введения несколькими дозами, композиция может содержать бактериостатические агенты.

3. Введение

Совместные композиции по настоящему документу, как правило, предусмотрены для парентерального введения, например, подкожного введения. В связи с увеличением биодоступности Гд в совместных композициях с гиалуронидазой иммуноглобулины можно вводить подкожно при дозах и частоте, которые используют при введении современных препаратов Гд для внутривенного введения (ТОО).

Преимуществом по сравнению с современными композициями Гд для подкожного введения является более благоприятный режим введения, например, более редкое введения совместных композиций гиалуронидазы/Гд. При более редком или меньшем по количеству введении могут быть уменьшены побочные эффекты, связанные с токсичностью препарата. Как правило, при подкожном введении Гд улучшается фармакокинетика и/или фармакодинамика. Кроме того, подкожное введение Гд также имеет преимущества по сравнению с внутривенной инфузией. Например, подкожная инфузия может быть проведена пациентом или членом его семьи, а не квалифицированной медсестрой, инфузию можно проводить при более высокой скорости, так что Гд можно вводить в течение 1-3 ч по сравнению с 5-10 ч для обыкновенного ТОЮ введения, отсутствует потребность в катетеризованной вене, отсутствуют характерные для инфузии побочные эффекты, такие как тромбоз, головная боль, тромбофлебит, тошнота, уменьшена вероятность других нежелательных эффектов, также инфузию можно проводить дома или в любом другом месте.

Подкожное введение также предпочтительно, так как гиалуронидазу необходимо вводить таким образом, чтобы она достигала интерстиции кожи или ткани, тем самым разрушая интерстициальное пространство для последующей доставки иммуноглобулина. Таким образом, предусмотрено прямое введение под кожу, например, путем подкожного введения.

Введение может быть локальным, местным или системным зависимости от подвергаемого лечению места. Локальное введение в область, нуждающуюся в лечении, можно осуществить, например, локальной инфузией, местным нанесением, например, в сочетании с повязкой после операции, путем инъекции с помощью катетера, с помощью свечи или с помощью имплантатов. Как правило, местное введения достигается путем инъекции, например, из шприца или другого изделия, содержащего инъекционное устройство, такое как иглу. В другом примере местное введение может быть достигнуто путем инфузии, например, с применением насоса или другого подобного устройства.

Также предусмотрены другие способы введения. Фармацевтическая композиция может быть предусмотрена в соответствующих лекарственных формах для каждого пути введения.

Наиболее подходящий путь в каждом конкретном случае зависит от ряда факторов, таких как характер заболевания, прогрессирование заболевания, тяжесть заболевания и особенности используемой композиции. Другие пути введения включают, например, любой путь, известный специалистам в данной области, включая внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, внутрикожное введение, введение внутрь опухоли, внутрибрюшинное, эпидуральное, вагинальное, ректальное, местное, отикальное, трансдермальное введение или введение другим путем. Композиции, подходящие для таких путей введения, известны специалистам в данной области.

Композиции также могут быть введены с другими биологически активными веществами последовательно, с перерывом или в одной композиции. Введение также может включать системы с управляемым высвобождением, в том числе композиции с контролируемым высвобождением и устройства для контролируемого высвобождения, например, с помощью насоса.

В настоящем документе предусмотрено подкожное введение, как правило, являющееся инъекцией или инфузией. Композиции для инъекций могут быть приготовлены в соответствующих формах, в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, пригодных для растворения или суспендирования в жидкости для инъекций, или в виде эмульсий. Как правило, совместные композиции по настоящему документу готовят в виде жидкостей. Инъекционные композиции предназначены для местного и системного введения. Для целей настоящего изобретения местное введение требуется для прямого введения в область разрушенной интерстиции. Препараты для парентерального введения включают стерильные гото- 39 026112 вые для инъекций растворы, стерильные сухие растворимые продукты, такие как лиофилизированные порошки, которые необходимо смешать с растворителем непосредственно перед использованием, включая гиподермальные таблетки, стерильные готовые для инъекций суспензии, стерильные сухие нерастворимые продукты, которые необходимо смешать со средой непосредственно перед использованием, и стерильные эмульсии. Растворы могут быть водными или неводными. При внутривенном введении подходящие носители включают физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер (РВ8) и растворы, содержащие сгущающие и солюбилизирующие агенты, такие как глюкоза, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль, и их смеси.

Для уменьшения процессов деградации конкретных соединений, например, протеолитической деградации и иммунного воздействия через антигенный и иммуногенный ответ могут быть использованы некоторые методы введения. Примером таких методов является местное введение в подвергающуюся лечению область. Считается, что пегилирование лекарственного средства повышает устойчивость к протеолизу, увеличивает период полураспада в сыворотке и снижает антигенность и иммуногенность. Примеры методов пегилирования известны в уровне техники (см., например, Ьи и Рейх, Ιηί. ί. Рерйбе Рго1ет Ке8., 43: 127-138, 1994; Ьи и Рейх, Рерйбе Ке8., 6: 142-6, 1993; Рейх и др., Ιηί. ί. Рерйбе Ке8., 46: 253-64, 1995; Βеηйа^ и др., ί. Вю1. Сйет., 269: 13398-404, 1994; Вгитеагш и др., ί Iттииο1, 154: 3088-95, 1995;см. также Сайсей и др. (2003) Αάν. Эгид ЭеПу. Кеу. 55(10):1261-77 и Μοϋ^^ (2003) Рйа^тасοίйе^ару 23 (8 часть 2): с. 3-8). Пегилирование также может быть использовано для доставки молекул нуклеиновой кислоты ίη νίνο. Например, пегилирование аденовируса может увеличить стабильность и улучшить перенос генов (см., например, СТеид и др., (2003) Рйагт. Ке8. 20 (9): 1444-51).

При введении больших объемов введение проводят, как правило, путем инфузии. Введение субъектам можно проводить при скорости инфузии от 0,5 мл/кг массы тела/ч до 5 мл/кг МТ/ч, например, приблизительно 0,5 мл/кг МТ/ч, 1 мл/кг МТ/ч, 2 мл/кг МТ/ч, 3 мл/кг МТ/ч, 4 мл/кг МТ/ч или 5 мл/кг МТ/час. Скорость инфузии может быть подобрана эмпирически и, как правило, зависит от переносимости субъекта. При возникновении во время инфузии неблагоприятных реакций скорость инфузии может быть уменьшена до скорости, которая ниже той, при которой имеют место неблагоприятные реакции. Если неблагоприятные реакции исчезают в ответ на снижение скорости, скорость инфузии по усмотрению врача может быть постепенно увеличена. Подкожная инфузия совместных композиций Ι§ может осуществляться за счет силы тяжести, инфузионного насоса или инъекции желаемой дозы, например, полной дозы 20-30 граммов. Как правило, для инфузии могут быть использованы внутривенные инфузионные насосы. Совместные композиции ^/гиалуронидазы можно вводить при скорости приблизительно 5 мл/ч, 10 мл/ч, 30 мл/ч, 60 мл/ч, 120 мл/ч, 240 мл/ч или 300 мл/ч. Скорость инфузии может быть увеличена в течение курса лечения тех пор, пока инфузия переносится пациентом. Как правило, время проведения инфузии составляет приблизительно 0,5 ч, 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 2,5 ч, 3 ч, 4 ч и более. Благодаря высокой скорости инфузии при подкожном введения совместных композиций Ι§ и гиалуронидазы время инфузии значительно снижено по сравнению с обыкновенной терапией ΙνΙΟ. Если время инфузии превышает желаемый предел, на усмотрение врача и пациента может быть использовано второе место для одновременной инфузии. Второе место обычно расположено по меньшей мере в 10 см от первого.

Способы инфузии известны специалистам в данной области и находятся в компетенции лечащего врача. Как правило, соответствующая доза совместной композиции ^/гиалуронидазы может быть помещена в стандартный мешок для Ιν введения. Например, может быть использован инфузионный набор без отверстия для выравнивания давления, имеющий Υ-образный порт вблизи его конца. В выбранное субъектом место может быть введена игла для подкожной инфузии 24Ο, но из-за большого объема раствора для инфузии для введения рекомендуется использовать область живота и бедер. Гиалуронидаза и Ι§ могут быть предусмотрены в одном устройстве с Υ-образным портом. Для инфузии под действием силы тяжести или насоса также могут быть использованы другие изделия, включая, но не ограничиваясь пробирками, бутылками, шприцами или другими контейнерами.

В случае, если инфузия не переносится пациентом (например, вызывает умеренную и тяжелую местную реакцию), может быть использовано второе место инфузии, так что субъект получает полную дозу.

Кроме того, следует понимать, что стабильные совместные композиции по настоящему документу возможно применять в режимах дозирования с периодическим введением. Например, частота введения может быть ежедневной, каждый день или через день, в течение интервала времени, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней. В других примерах режим введения является ежененедельным, например, раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, раз в пять недель, раз в шесть недель или реже. Таким образом, препарат ^/гиалуронидазы может быть введен сразу или может быть разделена на несколько меньших доз для введения через промежутки времени. Выбранный препарат ^/гиалуронидазы можно вводить одной или несколькими дозами в течение лечения, например, в течение нескольких часов, дней, недель или месяцев. В некоторых случаях предпочтительно непрерывное введение. Понятно, что точная дозировка и курс введения зависит от показаний и переносимости введения пациентом.

Кроме того, предполагается, что точная дозировка и длительность лечения зависят от подвергаемо- 40 026112 го лечению заболевания и могут быть определены эмпирически с применением известных протоколов тестирования или путем экстраполяции ш νίνο или ш νίίΓΟ данных. Следует отметить, что концентрация и дозировка также может изменяться в зависимости от тяжести подвергаемого лечению состояния. Необходимо подчеркнуть, что для любого конкретного субъекта с течением времени должен быть персонально скорректирован режим введения в зависимости от индивидуальных потребностей и профессионального суждения лица, вводящего композицию или контролирующего введение композиции, также необходимо подчеркнуть, что указанные здесь диапазоны концентраций приведены только в качестве примеров и не предназначены для ограничения применения композиций и комбинаций. Композиции можно вводить каждый час, каждый день, каждую неделю, каждый месяц, каждый год или один раз. Как правило, режимы введения выбирают таким образом, чтобы уменьшить токсичность. Следует отметить, что лечащий врач решает, как и когда следует прекратить, прервать или изменить терапию в сторону снижения дозы из-за токсичности или нарушений в работе костного мозга, печени, почек или других тканей. Также лечащий врач знает, как и когда, напротив, следует изменить лечение в сторону более высоких доз, если клинический ответ не является адекватным (за исключением токсичных побочных эффектов).

Ο. Способы оценки устойчивости, активности, биодоступности и фармакокинетики

Стабильность и активность ί§ и гиалуронидазы в композициях могут быть оценены с применением различных ш νίίΓΟ и ш νίνΟ анализов, которые известны специалистам в данной области. В уровне техники описаны различные аналитические методы измерения стабильности белков, которые описаны, Рерййе апй Рго1ет Эгид ОеШегу, 247-301, УтсеШ Ьее Ей., Магсе1 Эеккег. 1пс., №\ν Υογ1<. Κ.Υ., РиЬк. (1991) и 1опек, А. Айу. Эгид ОеГОегу Кеу. 10: 29-90 (1993). Стабильность может быть измерена при выбранной температуре в течение выбранного периода времени.

Для оценки устойчивости совместной композиция важны анализы для оценки размера молекулы 1д (который меняется, например, вследствие агрегации, денатурации и/или фрагментация). Кроме того, стабильность жидких композиций также могут быть оценена любыми анализами, которые измеряют биологическую активность 1д и гиалуронидазы в композициях. Такие анализы хорошо известны в данной области. В дополнение к оценке стабильности совместной композиция, такие тесты могут быть использованы, например, для определения соответствующей дозы иммуноглобулина и гиалуронидазы, а также частоты введения для лечения. Кроме того, известные специалисту в данной области анализы также могут быть выполнены для оценки фармакокинетических свойств подкожно вводимого иммуноглобулина, в том числе его биодоступности и переносимости.

1. Размер молекул

Основные параметром для оценки стабильности является молекулярный размер, так как изменение размера может быть результатом деградации, денатурации, агрегации или фрагментации. Агрегация 1д является общей проблемой при хранении содержащих 1д продуктов. Агрегаты нежелательны, поскольку они могут взаимодействовать с системой комплемента в крови пациента и приводить реакции активации комплемента. Способность 1д связывать комплемент значительно увеличивается в результате денатурации, в частности, при агрегации до высокой молекулярной массы. Механизм связывания комплемента с указанными агрегатами идентичен связыванию с комплексами антиген-антитело, Магсик, Ό. М., (1960) ί. 1ттипо1. 84:273-284. В случае 1дО, известно, что образование сайта связывания комплемента требует наличия двух молекул, расположенных близко друг к другу. Поэтому возможно, что необходимо критическое сближение молекул, а не какое-либо изменение конформации.

Способы измерения стабильности 1д известны в данной области техники, включая описанные здесь способы, например, в раскрытых здесь примерах. Существуют различные способы для оценки стабильности белковых композиций, в том числе композиций антител или иммуноглобулинов, основанные на физико-химических свойствах белков, а также на их биологической активности. Например, для изучения агрегации, фрагментации и денатурации белков используют такие методы, как поглощение с переносом заряда, термический анализ, флуоресцентную спектроскопию, круговой дихроизм, ЯМР, восстановительный капиллярный электрофорез (гСОЕ), а также высокопроизводительную эксклюзионную хроматографию (ΗРδЕС). См., например, \Уапд еί а1., 1988, ί. о£ Рагеп1ега1 δ^ι^ & ТесЬпо1оду 42(кирр): δ4-δ26. гСОЕ и ΗРδЕС являются самыми распространенными и простыми способами оценки изменения размера молекул за счет образования белковых агрегатов, деградации и фрагментации белка. Кроме того, может быть непосредственно определена антикомплементная активность (АСА).

Например, стабильные жидкие композиции могут быть оценены ΗРδЕС или гСОЕ, где процент площади пиков отражает содержание недеградировавшего белка. В одном примере белок наносят на ТокоЬ Вюкер ΤδΚ 03000 δν 600 х 7,5 мМ колонку. Белок элюируют. Элюированный белок обнаруживают с применением УФ-поглощения при 280 нм. В качестве контроля в анализе используют стандартный образец, а результаты представляют как процент площади пика мономерного продукта по отношению ко всем другим пиками за исключением пика стандарта. Пики, элюированнные раньше, чем пик мономера, учитываются как процент агрегации.

АСА титр также может быть определен, как описано в европейской Фармакопее (Еигореап РЬагтасорега, 1997, 2^пй ей. Раг1 ίί. Магкоппеиуе, 8.А., δηΐπΐ Кийлпе, Ргапсе). Как правило, АСА титр является обя- 41 026112 зательным техническим требованием для внутривенного (IV) введения и не имеет значения для подкожного введения совместной композиции. Таким образом, в настоящем документе АСА титр обычно не является определяющим показателем для совместных композиций, которые изготовлены для подкожного введения.

В анализе АСА измеряют количество комплемента, которое связывается в смеси стандартизированного количества комплемента и белка (см., например, Ра1тег, Ό. Р., \УНа1су. δ. И., Сотр1етеп1 Ихайоп Тек!, Мапиа1 οί С1шюа1 ЬаЬога1огу 1ттипо1оду (ред. N. К. Коке, е1 а1., Атепсап 8оае1у ίοτ М1сгоЬю1о§у, Χνακίιίηβίοιτ Ό. С, 1986) сс. 57-66.; Мауег, М. М., ОиаШПаОуе С РьхаОоп Апа1ук1к, Сотр1етеп! апб Сотр1етеп! Р1ха1юп, Ехрег1теп1а1 1ттипосйет!к1гу (ред. Е. А. КаЬа! апб М. М. Меуег, Тйотак, 8ргш§йе1б, III., 1961), с 214-216, 227-228). Красные кровяные тельца, которые были сенситизированы инкубацией с антителами против красных кровяных телец, добавляют к смеси комплемент/белок. При наличии свободного комплемента (не связанного с белком) указанные сенсибилизированные клетки лизируются, высвобождая гемоглобин, который можно детектировать количественно как степень лизиса. Параллельно сенсибилизированные эритроциты также добавляют в контрольную смесь буфера с комплементом, где степень лизиса принимают за 100%. Разница между фактическим количеством комплемента, необходимым для 100% лизиса, и количеством свободного комплемента в присутствии белка равно количеству комплемента, фактически связанного с белком, или антикомплементной активности. Одна единица активности АСА (одна СН50 единица) является количеством белка, способным активировать 50% комплемента в оптимально оттитрованной системе комплемента и красных клеток крови/гемолизина. Как правило, приемлемый титр АСА составляет менее 50% СН50 единиц, связываемых с мг белка.

В качестве другого примера, путем измерения изменения количества растворимого белка в растворе с течением времени может быть легко определено изменение распределения молекулярного размера, например, из-за образования агрегатов, при хранении жидкой совместной композиции.

Количество растворимого полипептида в растворе может быть количественно измерено с помощью ряда аналитических методов. Такие анализы включают, например, обращеннофазную (КР) высокоэффективную жидкостную хроматографию и абсорбционную УФ-спектроскопию. Для разделения растворимых полипептидов, которые присутствуют в виде растворимых агрегатов, и полипептидов, которые присутствуют в неагрегированной, биологически активной молекулярной форме, может быть проведено определение образования растворимых и нерастворимых агрегатов во время хранения жидких лекарственных форм, например, с помощью аналитического ультрацентрифугирования.

В еще одном примере, например, стабильность совместной композиции может быть оценена путем нагревания готового продукта до температуры 57°С и инкубации при этой температуре в течение четырех часов при тестировании продукта на образование визуально заметного осадка (см., например, Собе οί Ребега1 КещйаОопк 21, Рооб апб Итадк, 640, 101а (в ред. апрель 1978 года)). В модификации способа (см., например, Регпапбек апб ЬипбЫаб, ^х 8апд 39:101-112 (1980)) приблизительно 2 мл тестируемого продукта нагревают при 57°С в течение четырех часов, а затем оценивают изменение степени опалесценции, измеряемой как пропускание при 580 нм с помощью лабораторного спектрофотометра (см. патент США № 4597966).

δΌδ-РАОЕ также может быть использован для оценки агрегации и/или фрагментации. Может быть измерена плотность или радиоактивность каждой полосы, окрашенной или помеченной радиоизотопной меткой, и может быть получен % плотности или % радиоактивности полосы, представляющей собой недеградировавший белок.

Как правило, по данным любого из вышеперечисленных анализов, например НР8ЕС или тСОЕ, совместные композиции обладают низкой агрегацией, влоть до неопределяемых уровней. Например, агрегация составляет не более чем 5%, не более чем 4%, не более чем 3%, не более чем 2%, не более чем 1%, как правило, не более чем 0,5 вес.% белка и менее вплоть до неопределяемого уровня фрагментации, то есть 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, или 99% или более или 99,5% или более от общей площади пиков присутствует в пике (пиках), представляющих собой интактные антитела или их фрагменты. Например, как правило, приемлемые уровни агрегации составляют > 90% мономеров и олигомеров/димеров, < 5% агрегатов, > 5% фрагментов.

2. Биологическая активность

а. Иммуноглобулин

Способность иммуноглобулина выступать в качестве терапевтического агента может быть оценена щ уйго или ш угуо. Например, чтобы оценить способность иммуноглобулинов нейтрализовывать вирусную или бактериальную инфекцию могут быть выполнены анализы ш уйго (Шеткйа е! а1., (1994) I ЬаЬ С1т Меб 123: 241-6). Другие тесты щ уйго могут быть использованы для оценки других биологических активностей иммуноглобулинов. Например, способность препаратов иммуноглобулинов взаимодействовать с продуктами комплемента и модулировать их активацию, связывать антиидиотипические антитела, связывать Рс рецепторы на макрофагах, подавлять активность различных медиаторов воспаления, в том числе цитокинов, хемокинов и металлопротеиназ можно оценить с использованием любых способов, известных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь ИФА, вестерн-блоттингом, нозернблоттингом и проточной цитометрией для оценки экспрессии маркеров. Например, эффект иммуногло- 42 026112 булина на экспрессию рецепторов хемокинов на мононуклеарных клетках периферической крови можно оценить, используя проточную цитометрию (Τι^δΐ е! а1., (2006) Еиг I №иго1о§у 13(12):1359-63). В другом примере действие иммуноглобулина на металлопротеиназу в макрофагах можно оценить, используя нозерн-блоттинг (Зйар1го е! а1., (2002) Сапсег 95:2032-2037).

Чтобы оценить терапевтическую активность иммуноглобулинов также могут быть выполнены исследования ш νί\Ό с применением моделей на животных. Иммуноглобулин может быть введен животным, инфицированным одним или несколькими микроорганизмами, и их влияние на прогрессирование инфекции можно оценить, например, путем измерения количества микроорганизмов или измерения веса в качестве маркера течения болезни. Терапевтический эффект иммуноглобулинов также может быть оценен на животных с применением моделей заболеваний и состояний, при которых показано лечение с применением иммуноглобулинов. Такие модели на животных известны в уровне техники и включают, но не ограничиваются моделями на животных сцепленной с Х-хромосомой агаммаглобулинемии (ХЬА), ЗСШ, синдрома Вискотта-Олдрича, болезни Кавасаки, синдрома Гийена-Барре, ΙΤΡ, полимиозита, миастенического синдрома Ламберта-Итона, миастении и синдрома Мерч-Вольтмана (С’/Пгот е! а1. (1985) I 1ттипо1 134:2276-2280, Е11те1ег е! а1., (2000) I Ехр Меб. 192: 1611-1624, Ойпо (2006) Эгид ^^δсоνе^у Тобау: ^^δеаδе Мобек 3:83-89, Оуа1/и е! а1. (1988) I Ехр Меб 2017-2022, Нашей е! а1., (2002) В1ооб 100:20872093, З!гоп§геа!ег е! а1., (1984) Абйгйк Кйеит. 27: 433-42, К1т е! а1. (1998) Аппак ΝΥ Асаб За 841 :670676, СЬ^^δίабоδδ е! а1. (2000) Сйп. 1ттипо1 94: 75-87, Зоттег е! а1., (2005) Ьапсе! 365: 1406-1411 и патент США № 7309810).

Ъ. Гиалуронидаза

Гиалуронидазную активность можно оценить с помощью способов, хорошо известных в данной области. В одном примере активность измеряют с помощью анализа микромутности. Анализ основан на образовании нерастворимого осадка при связывании гиалуроновой кислоты с сывороточным альбумином. Активность измеряют с помощью инкубации гиалуронидазы с гиалуронатом натрия (гиалуроновой кислотой) в течение определенного периода времени (например, 10 мин) и последующего осаждения нерасщепленного гиалуроната натрия при добавлении подкисленного сывороточного альбумина. Уменьшение мутности образца измеряют при 640 нм после дополнительного периода инкубации. Снижение мутности в результате активности гиалуронидазы по отношению к гиалуронату натрия является показателем ферментативной активности гиалуронидазы. В другом примере активность гиалуронидазы измеряют с помощью микротитрования, при котором оставшуюся биотинилированную гиалуроновую кислоту определяют после инкубации с гиалуронидазой (см., например, ΡϊΌδΙ и З!егп (1997) Апа1. Вюсйет. 251: 263-269, опубликованную заявку США № 20050260186). Свободные карбоксильные группы глюкуроновых остатков гиалуроновой кислоты биотинилированы, и биотинилированная гиалуроновая кислота ковалентно связана с планшетом. После инкубации с гиалуронидазой остаточную биотинилированную гиалуроновую кислоту определяют с помощью авидин-пероксидазной реакции и сравнивают с количеством гиалуроновой кислоты после реакции со стандартом гиалуронидазы известной активности. Другие анализы для измерения активности гиалуронидазы также известны в уровне техники и могут быть использованы в методах по настоящему изобретению (см., например, Эефесй и др., (1995) Апа1. Вюсйет. 229: 35-41; Така1и^1и и др., (2003) Апа1. Вюсйет. 322: 257-263).

Способность деградирующего гиалуронан фермента действовать в качестве агента для распространения или диффузии также может быть оценена. Например, краситель трипановый синий можно вводить мышам без волосяного покрова под кожу с деградирующим гиалуронан ферментом или без него. Затем для определения способности деградирующего гиалуронан фермента действовать в качестве агента для распространения может быть измерена область распространения красителя, например, с помощью микроциркуля (патент США № 20060104968).

3. Фармакокинетика и переносимость

Исследования фармакокинетики и переносимости могут быть выполнены с применением моделей на животных и могут быть выполнены в ходе клинических исследований с пациентами. Животные, применяемые в моделях, включают, но не ограничиваются мышами, крысами, кроликами, собаками, морскими свинками и приматами за исключением человека, такими как обезьяна циномолгус или макакрезус. В некоторых случаях исследования фармакокинетики и переносимости проводят с применением здоровых животных. В других примерах исследования проводят с применением моделей заболеваний на животных, для которых используют терапию иммуноглобулинами, например, любых моделей заболеваний и состояний на животных, описанных ниже.

Фармакокинетика при подкожном введении иммуноглобулина может быть оценена путем измерения таких параметров, как максимальная (пиковая) концентрация иммуноглобулина в сыворотке крови (С_макс), пиковое время (т.е. время достижения максимальной концентрации иммуноглобулина в сыворотке крови, Т_макс), минимальная концентрация иммуноглобулина в плазме (то есть минимальная концентрация в плазме между введениями иммуноглобулина; период полувыведения (Т_1/2) и площадь под кривой (т.е. площадь под кривой зависимости концентрации иммуноглобулина в крови от времени, АИС) после введения. Абсолютную биодоступность подкожно введенного иммуноглобулина определяются путем сравнения площади под кривой для иммуноглобулина при подкожном введении (АИС подкожно)

- 43 026112 с АИС иммуноглобулина после внутривенного введения (АИС внутривенно). Абсолютная биодоступность (Р) может быть рассчитана по формуле: Р = ([АИС]подкожно х доза подкожно)/([АИС] внутривенно х доза внутривенно). Концентрацию иммуноглобулина в плазме крови после подкожного введения можно измерить с помощью любого способа, известного в данной области техники, подходящего для оценки концентрации иммуноглобулина в образцах крови. Примеры способов включают, но не ограничиваются ИФА и нефелометрией.

Чтобы оценить эффект от увеличения или уменьшения концентрации иммуноглобулина и/или гиалуронидазы в дозе в фармакокинетических исследованиях могут быть исследованы широкие диапазоны доз и различные частоты введения. Такие фармакокинетические свойства подкожно вводимого иммуноглобулина, как биодоступность, также могут быть оценены при одновременном введении гиалуронидазы и без нее. Например, иммуноглобулин в сочетании с гиалуронидазой или без нее можно вводить подкожно собакам, таким как гончие породы бигл. Другой группе гончих также можно ввести иммуноглобулин внутривенно. Образцы крови могут быть отобраны через различные промежутки времени, и количество иммуноглобулина в плазме может быть определено, например, с помощью нефелометрии. АИС может быть измерена и биодоступность подкожно вводят иммуноглобулин вводят с или без гиалуронидаза может быть определена. Такие исследования могут быть выполнены, чтобы оценить эффект совместного введения с гиалуронидазой на такие фармакокинетические свойства, как биодоступность подкожно вводимого иммуноглобулина.

Исследования для оценки безопасности и переносимости также известны в уровне техники и могут быть использованы в настоящем изобретении. После подкожного введения иммуноглобулина с одновременным введением гиалуронидазы или без такого введения может быть отслежено развитие любых побочных реакций. Побочные эффекты могут включать реакции на инъекцию, такие как отек или припухлость, головную боль, лихорадку, слабость, дрожь, покраснение лица, головокружение, крапивницу, затрудненное дыхание или чувство стеснения в груди, тошноту, рвоту, озноб, боли в спине, груди, мышечные спазмы, судороги или конвульсии, изменения кровяного давления и анафилактические реакции или реакции тяжелой гиперчувствительности. Как правило, для оценки эффекта от увеличения или уменьшения концентрации иммуноглобулина и/или гиалуронидазы в исследованиях безопасности и переносимости используют различные диапазоны доз и частоты дозирования.

Н. Способы лечения и терапевтическое применение

Совместные композиции 1д/гиалуронидазы по настоящему документу могут быть использованы для лечения любого состояния, которое подвергается лечению иммуноглобулином. Иммуноглобулин (1д) можно вводить подкожно в совместных композициях с гиалуронидазой для лечения любого состояния, которое подвергается лечению иммуноглобулином. В этом разделе приведены примеры терапевтического применения совместных композиций 1д/гиалуронидазы. Понятно, что совместные композиции 1д/гиалуронидазы по настоящему документу могут быть использованы в способах, процессах или применениях для лечения любых заболеваний и состояний, описанных ниже, а также других заболеваний и состояний, которые поддаются лечению 1д, как известно специалистам в данной области техники. В частности, предусмотрено подкожное введение совместных композиций. Дозы вводимого 1д одинаковы или аналогичны по сравнению с вводимыми внутривенно дозами и известны специалистам в данной области. Режим введения и частота введения могут отличаться от внутривенного режима введения, как это описано в настоящем документе. Терапевтические применения, описанные ниже, приведены в качестве примеров и не ограничивают применение способов, описанных в настоящем документе.

Например, совместные композиции по настоящему документу могут быть использованы для лечения иммунодефицитов, таких как первичные иммунодефицита, такие как сцепленная с Х-хромосомой агаммаглобулинемия, гипогаммаглобулинемия, и приобретенные нарушения иммунитета (вторичный иммунодефицит), например, характеризующиеся низким уровнем антител, воспалительные и аутоиммунные заболевания и острые инфекции. Области терапевтического применения включают, но не ограничиваются заместительной терапией иммуноглобулинами и иммуномодулирующей терапией при различных иммунологических, гематологических, неврологических, воспалительных, кожных и/или инфекционных заболеваниях и состояниях. В некоторых примерах иммуноглобулин вводят для усиления иммунного ответа у здоровых пациентов, например, после контакта с инфекционными агентами (например, случайный укол иглой). Совместные композиции 1д по настоящему документу также могут быть использованы для лечения рассеянного склероза (особенно ремиттирующего рассеянного склероза или РРС), болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Выявление таких заболеваний или состояний находится в компетенции лечащего врача.

Совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы могут назначаться в комбинации с другими агентами, используемыми для лечения указанных заболеваний и состояний. Например, другие вещества, которые могут быть введены, включают, но не ограничиваются антибиотики, химиотерапевтическими агентами, стероидными противовоспалительными агентами, нестероидными противовоспалительными агентами, а также другими иммуномодулирующими агентами, такими как цитокины, хемокины и факторы роста.

- 44 026112

При необходимости, конкретные дозы, длительность и протокол лечения могут быть подобраны эмпирически или экстраполированы. Например, примеры доз для внутривенного введения иммуноглобулина могут быть использованы в качестве отправной точки для определения соответствующих доз. Дозы могут быть подобраны на основе ряда факторов, таких как масса тела человека, общее состояние здоровья, возраст, активность конкретного используемого соединения, пол, диета, время введения, скорость выделения, комбинация препаратов, тяжесть и течения заболевания, а также предрасположенность пациента к заболеванию и мнение лечащего врача. Примеры доз иммуноглобулина и гиалуронидазы приведены в данном описании. Понятно, что вводимое количество зависит от подвергающегося лечению состояния и, по желанию, допускаемых побочных эффектов. Дозировка может быть эмпирически определена с помощью признанных моделей для каждого расстройства.

После улучшения состояния пациента, если необходимо, можно вводить подкожно поддерживающую дозу иммуноглобулина в сочетании с гиалуронидазой, при этом дозировка, лекарственная форма, частота приема или их сочетание могут быть изменены. В некоторых случаях при любом рецидиве симптомов заболевания субъекту может потребоваться лечение с перерывами в течение долгого времени.

1. Первичный и вторичный иммунодефициты.

a. Первичный иммунодефицит

Всемирной организацией здравоохранения признаны более 80 первичных иммунодефицитов, которые встречаются приблизительно у 1 из 10000 субъектов. Эти заболевания характеризуются наличием внутреннего дефекта в иммунной системе, при котором в некоторых случаях организм не в состоянии производить любые антитела или достаточное количество антител против инфекции. В других случаях клеточные механизмы борьбы с инфекцией не в состоянии работать должным образом. Иммуноглобулин может быть использован для лечения первичных иммунодефицитов с дефицитом антител. Таким образом, пациентам с такими заболеваниями иммуноглобулин можно вводить в качестве заместительной иммуноглобулиновой терапии.

Как правило, первичные иммунодефициты являются наследственными расстройствами. Примерами первичных иммунодефицитов включают, но не ограничивается обычным вариабельным иммунодефицитом (СУГО), избирательным дефицитом ^А, дефицитом ΙβΟ, сцепленной с Х-хромосомой агаммаглобулинемией (ХЬА), тяжелым комбинированным иммунодефицитом (δΟΌ), нарушениями системы комплемента, атаксией, телеангиэктазией, гиперпродукцией Ι§Μ, синдромом Вискотта-Олдрича.

Совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы можно вводить подкожно пациентам с первичным иммунодефицитом с дефицитом антител в дозах, аналогичных дозам, используемым при внутривенном введении иммуноглобулина. Примеры доз включают, например, дозы иммуноглобулина от 100 мг/кг массы тела до 800 мг/кг массы тела с интервалами в четыре недели. Доза, так же как и частота введения, может быть увеличена или уменьшена в зависимости от клинического ответа.

b. Вторичный иммунодефицит

Вторичный или приобретенный иммунодефицит не является результатом наследственных генетических аномалий, а возникает у лиц, у которых иммунная система пострадала от факторов, находящихся вне иммунной системы. Примеры включают, но не ограничиваются травмами, вирусами, химиотерапией, токсинами и загрязнением окружающей среды. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) является примером вторичного иммунодефицита, вызываемым вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), при котором исчезновение Т-лимфоцитов делает организм не в состоянии бороться с инфекцией.

Другой пример, гипогаммаглобулинемия, вызывается отсутствием В-лимфоцитов, характеризуется низким уровнем антител в крови и может возникнуть у пациентов с хроническим лимфолейкозом (СЬЬ), множественной миеломой (ММ), неходжкинской лимфомой (ΝΉΕ) и другими соответствующими злокачественными опухолями в результате связанной с лейкемией иммунной дисфункции и связанной с лечением иммуносупрессии. Пациенты с приобретенной гипогаммаглобулинемией, возникшей в результате таких гемобластозов, и пациенты, перенесшие трансплантацию пост-гемопоэтических стволовых клеток, восприимчивы к бактериальным инфекциям. Недостаток гуморального иммунитета в значительной степени ответственен за повышенный риск заражения, заболеваемости и смертности у этих пациентов, особенно в случае инкапсулированных микроорганизмов. Например, δί^ерΐοсοссик р^нто^ие, НаеторЫ1ик тЛиен/ае и δίарЬу1οсοссик аигеик, а также ^ед^οηе11а и ШсагШа крр. являются бактериальными возбудителями, которые часто вызывают пневмонию у пациентов с СЬЬ. Также не наблюдаются оппортунистические инфекции, такие как Рηеитοсукΐ^к сапшк грибки, вирусы и микобактерии. Количество и тяжесть инфекций у таких пациентов может быть значительно снижена путем введения иммуноглобулинов (ΟηίЙЬк е1 а1. (1989) В1оос1 73:366-368; СЬаре1 е1 а1. (1994) 1.апсе1 343:1059-1063).

Таким образом, совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы можно вводить подкожно таким пациентам для профилактики рецидивов инфекции. Примеры доз включают дозы, которые используют для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с приобретенной гипогаммаглобулинемией, возникшей в результате гемобластозов. Например, препарат, содержащий приблизительно 400 мг/кг массы тела иммуноглобулина, можно вводить подкожно каждые 3-4 недели. В другом примере, в тех случаях, когда в сыворотке пациента содержание ΙβΟ меньше 4 г/л, в течение первого месяца терапии может быть введена дополнительная доза 400 мг/кг массы тела. Количество вводимого иммуноглобулина

- 45 026112 и частота введения может быть увеличена или уменьшена в случае необходимости.

2. Воспалительные и аутоиммунные заболевания

a. Болезнь Кавасаки

Болезнь Кавасаки является острым, лихорадочным мультисистемным заболеванием детей и младенцев, часто затрагивающим коронарные артерии. Она также известна как синдром лимфатических узлов, заболевание узлов кожи и слизистых оболочек, детский полиартрит и синдром Кавасаки. Болезнь Кавасаки плохо изучена, представляет собой самопроизвольный васкулит, который влияет на многие органы, в том числе кожу, слизистые оболочки, лимфатические узлы, стенки кровеносных сосудов и сердце. На второй неделе заболевания на стадии выздоровления может возникнуть аневризма коронарных артерий. Хотя причина заболевания неизвестна, есть свидетельства, что характерный васкулит является результатом иммунной реакции, характеризующейся активацией Т-клеток и макрофагов неизвестным антигеном, секрецией цитокинов, поликлональной В-клеточной гиперактивностью и образованием аутоантител к эндотелиальным клеткам и клеткам гладкой мускулатуры. У генетически предрасположенных лиц один или несколько неохарактеризованных распространенных инфекционных агентов, возможно, с суперантигенной активностью, могут вызвать заболевание.

Введенный в начале болезни Кавасаки иммуноглобулин может предотвратить патологию коронарных артерий. Подкожное введение совместных композиций иммуноглобулинов/гиалуронидазы пациентам с продолжающимся воспалением, связанным с болезнью Кавасаки, может улучшить симптомы. Примеры доз включают дозы, которые используют для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с болезнью Кавасаки. Например, пациенту с болезнью Кавасаки можно ввести дозу иммуноглобулина приблизительно 1-2 г/кг массы тела пациента. Она может быть введена, например, четырьмя дозами по 400 мг/кг массы тела в течение четырех дней подряд. В другом примере иммуноглобулин вводят разовой дозой 1 г/кг массы тела в течение 10-часового периода. Количество вводимого иммуноглобулина может быть увеличено или уменьшено в случае необходимости.

b. Хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия

Хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (СОГР) является неврологическим расстройством, характеризующимся прогрессирующей слабостью и нарушением сенсорной функции в ногах и руках. Расстройство, которое иногда называют хронической рецидивирующей полинейропатией, обусловлено повреждением миелиновой оболочки периферических нервов. Хотя болезнь может развиться в любом возрасте и у обоих полов, ί'.ΌΙΡ чаще встречается у молодых людей, у мужчин чаще, чем у женщин. Заболевание часто проявляется такими симптомами, как покалывание или онемение (начиная с пальцев рук и ног), слабость рук и ног, потеря глубоких сухожильных рефлексов (арефлексия), усталость и необычные ощущения. ί'.ΌΙΡ тесно связана с синдромом Гийена-Барре и считается хроническим аналогом этого острого заболевания. Специфических лабораторных диагностических тестов не разработано, но характерные клинические и лабораторные данные помогают отличить это заболевание от других опосредованных иммунной системой нейропатических синдромов.

Исследования показывают, что лечение иммуноглобулином уменьшает симптомы заболевания (уап 8с1кик е! а1. (2002) Ьапсе! Ыеиго1. 1: 497-498). Таким образом, совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы можно вводить подкожно пациентам с СЭ1Р с использованием способов, описанных в настоящем документе. Примеры доз включают дозы, которые используют для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с СОГР. В одном примере пациенту с СОГР вводят подкожно иммуноглобулин в сочетании с гиалуронидазой в дозе приблизительно 2 г/кг массы тела. Она может быть введена, например, пятью дозами по 400 мг/кг массы тела в течение пяти дней подряд. Количество вводимого иммуноглобулина может быть увеличено или уменьшено в случае необходимости.

c. Синдром Гийена-Барре

Синдром Гийена-Барре является неврологическим аутоиммунным заболеванием с воспалительной демиелинизацией периферических нервов. Первые симптомы включают в себя различные степени слабости или покалывания в ногах, которое может распространиться на руки и верхнюю часть тела. Эти симптомы могут увеличивать интенсивность вплоть до полного отказа мышц, пациент становится практически полностью парализованным, что приводит к опасному для жизни состоянию. Хотя восстановление, как правило, является существенным или полным у большинства пациентов, сообщается о стойкой утрате трудоспособности в приблизительно 20% всех случаев и смерти от 4 до 15% пациентов. Синдром Гийена-Барре может иметь место через несколько дней или недель после проявления симптомов респираторной или желудочно-кишечной вирусной инфекции. В некоторых случаях синдром могут вызвать хирургическое вмешательство или прививки. Расстройство может развиться в течение нескольких часов или дней, или это может занять от 3 до 4 недель. Для диагностики может быть использован тест на скорость нервной проводимости (ЫСУ). В некоторых случаях в диагностике может быть использована спинномозговая пункция, так как спинномозговая жидкость при синдроме Гийена-Барре обычно содержит больше белка, чем нормальных людей.

Хотя для синдрома Гийена-Барре не существует никакого известного лечения, лечение иммуноглобулином может уменьшить тяжесть заболевания и ускорить выздоровление. Совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы могут быть введены подкожно пациентам в соответствующей дозе 1д,

- 46 026112 например, аналогичной дозе, используемой для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с синдромом Гийена-Барре. Например, пациенту с синдромом Гийена-Барре может быть подкожно введен иммуноглобулин в сочетании с гиалуронидазой в дозе приблизительно 2 г/кг массы тела. Доза может быть введена, например, пятью дозами по 400 мг/кг массы тела в течение пяти дней подряд. Количество вводимого иммуноглобулина может быть увеличено или уменьшено, например, в зависимости от тяжести заболевания и клинического ответа на терапию, который может быть легко оценен специалистом в данной области.

ά. Идиопатическая тромбоцитоиеническая пурпура

Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ГТР), также известная как первичная иммунная тромбоцитопеническая пурпура и аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура, представляет собой уменьшение количества тромбоцитов (тромбоцитопению), возникающее в результате снижения выживаемости тромбоцитов из-за антитромбоцитарных антител. При очень низком уровне тромбоцитов (например, < 30 х 10⁹ л^-1) может произойти кровоизлияние в кожу (пурпура) и слизистые оболочки. Образование тромбоцитов в костном мозге (мегакариопоэз) у пациентов с ГТР морфологически нормален. В некоторых случаях присутствуют дополнительные нарушения функции тромбоцитов, вызванные связыванием антител с гликопротеинами на поверхности тромбоцитов. ГТР может проявиться в острой и хронической формах. Приблизительно 80% взрослых пациентов с ГТР имеют хроническую форму заболевания. Самый высокий уровень заболеваемости хронической ГТР наблюдается у женщин в возрасте 15-50 лет, хотя согласно некоторым сообщениям заболеваемость увеличивается с возрастом. ГТР является относительно распространенным заболеванием у пациентов с ВИЧ-инфекцией. Хотя ГТР может развиться на любой стадии инфекции, ее интенсивность увеличивается по мере прогрессирования ВИЧ-инфекции.

Исследования показали, что иммуноглобулин может быть использован для лечения пациентов с ГТР (Ообеаи е1 а1. (1993) В1ооб 82(5): 1415-21; Ообеаи е1 а1. (1999) Вг. ί. Наета1о1. 107(4): 716-9). Совместные композиции иммуноглобулина/ гиалуронидазы могут быть введены подкожно пациентам в соответствующей дозе Гд, например, аналогичной дозе, используемой для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с ГТР. Например, пациенту с ГТР может быть подкожно введен иммуноглобулин в сочетании с гиалуронидазой в дозе приблизительно 1-2 г/кг массы тела. Дозу можно вводить в течение нескольких дней, или препарат может быть введен одной дозой. В некоторых примерах иммуноглобулин вводят пятью дозами по 400 мг/кг массы тела в течение нескольких дней подряд. В другом примере в зависимости от количества тромбоцитов и клинической реакции вводят дозу 1 г/кг массы тела в течение 1-2 дней подряд. Количество вводимого иммуноглобулина и частота введения могут быть увеличены или уменьшены в зависимости от, например, количества тромбоцитов и клинического ответа на терапию, который может быть легко оценен специалистом в данной области.

е. Воспалительные миопатии

Воспалительные миопатии представляют собой группу мышечных заболеваний, связанных с воспалением и дегенерацией скелетной мышечной ткани. Эти приобретенные нарушения характеризуются значительной мышечной слабостью и наличием воспалительной реакции в мышцах.

ί. Дерматомиозит

Дерматомиозит (ΌΜ) является наиболее легко распознаваемой воспалительной миопатией благодаря характерной сыпи в виде неоднородного, темного, красноватого или лилового высыпания на веках, щеках и переносице, на спине или верхней части грудной клетки, локтях, коленях и пальцах. У некоторых пациентов под кожей возникают кальцинированные узелки или твердые шишки. Высыпание часто предшествует мышечной слабости, которая обычно развивается в течение недели, но может развиться в течение нескольких месяцев или даже дней. Дерматомиозит может возникнуть в любом возрасте, у детей или взрослых, и чаще встречается у женщин, чем мужчин. У приблизительно одной трети пациентов с ΌΜ наблюдается затрудненное глотание. Более 50% детей с ΌΜ имеют жалобы на мышечные боли и повышенную чувствительность, в то время как этот симптом обычно наблюдается у менее чем 25% взрослых с ΌΜ.

ΐΐ. Полимиозит

Полимиозит (РМ) в отличие от дерматомиозита не характеризуется наличием сыпи, и мышечная слабость обычно развивается медленнее, чем при ΌΜ. У многих пациентов с РМ проявляются трудности при глотании. В некоторых случаях пациенты также жалуются на затрудненное дыхание за счет мышечной недостаточности. У одной трети пациентов с РМ наблюдается боль в мышцах. Болезнь чаще поражает женщин, чем мужчин и редко поражает людей в возрасте до 20 лет, хотя были описаны случаи.

ίίί. Миозит с тельцами включения

Миозит с тельцами включения (ΣβΜ) очень похож на полимиозит. Возникновение мышечной слабости при ΣβΜ, как правило, проявляется постепенно, в течение нескольких месяцев или лет. Заболевание отличается от РМ тем, что затрагивает проксимальные и дистальные мышцы, хотя, как правило, только проксимальные мышцы затронуты при РМ. Типичные признаки включают слабость сгибателей запястья и сгибателей пальцев. Атрофия предплечья и четырехглавой мышцы при различной степени слабости в других мышцах является характерным признаком заболевания. Приблизительно половина пациентов, страдающих ΣβΜ, имеют трудности с глотанием. Симптомы !ΕΜ обычно проявляются после

- 47 026112 лет, хотя заболеванию подвержены все возрастные группы. ΙΒΜ чаще встречается у мужчин, чем у женщин. Приблизительно один из десяти случаев ΙΒΜ может быть наследственным.

Исследования показывают, что введение иммуноглобулина может принести пользу пациентам с этой воспалительной миопатией. Иммуноглобулин может увеличить силу мышц, уменьшить воспаление и уменьшить прогрессирование заболевания и его тяжесть (Эа1ака5 е1 а1. (1993) N. Εη§1. ί. Мей. 329(27): 1993-2000; Па1ака5 е1 а1. (2001) \ΪΊΐΓο1ομ\ 56(3):323-7; Па1ака5 (2004) ГВата^. ТЬег. 102(3): 177-93; №аЬег е1 а1. (2000) ί. №иго1. 247(1):22-8). Совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы могут быть введены подкожно пациентам с ΌΜ, РМ или ΙΒΜ в соответствующей дозе 1д, например, аналогичной дозе, используемой для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с ΌΜ, РМ или ΙΒΜ. Например, может быть введена доза иммуноглобулина 2 г/кг массы тела, как правило, в течение нескольких дней, например, пятью дозами по 400 мг/кг массы тела в течение нескольких дней подряд.

ί. Миастенический синдром Ламберта-Итона

Миастенический синдром Ламберта-Итона (ΕΕΜ8) является редким аутоиммунным заболеванием нервно-мышечной передачи, впервые описанным клинически при раке легких, а затем и в случаях, когда опухоль не была обнаружена. Пациенты с ΕΕΜ8 имеют пресинаптический дефекта нервно-мышечной передачи. Болезнь клинически характеризуется проксимальной мышечной слабостью с увеличением силы после физических упражнений, умеренными окуломоторными симптомами, подавленными сухожильными рефлексами и вегетативной дисфункцией (сухость во рту, запоры, эректильная недостаточность). Подкожное введение совместных композиций иммуноглобулина/гиалуронидазы пациентам с ΕΕΜ8 может улучшить симптомы. Примеры доз 1д в совместных композициях включают дозы, которые используют для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с ΕΕΜ8. Например, пациенту с ΕΕΜ8 можно вводить иммуноглобулин в дозе 2 г/кг массы тела несколькими дозами. Например, пять доз иммуноглобулина по 400 мг/кг массы тела можно вводить в течение пяти дней подряд. Количество вводимого иммуноглобулина может быть увеличено или уменьшено в случае необходимости.

д. Мультифокальная моторная нейропатия

Мультифокальная моторная нейропатия (ММН) с блоком проведения является приобретенной иммунной демиелинизирующей нейропатией с медленно прогрессирующей слабостью, фасцикуляцией и судорогами без существенных сенсорных нарушений. Длительность заболевания до постановки диагноза составляет от нескольких месяцев до более чем 15 лет. Точная причина ММИ неизвестна. Гистологические и электродиагностические исследования показывают наличие демиелинизирующего и аксонального повреждений. В первую очередь страдают моторные нервы, хотя мягкая демиелинизация была продемонстрирована и для чувствительных нервов. Эффективность лечения иммуномодуляторами и иммуносупрессорами также поддерживает гипотезу о иммунной природе ММИ. Титры анти-ОМ1 антител повышены более чем у половины пациентов с ММИ. Хотя роль анти-ОМ1 антител в заболевании неизвестна, их присутствие может быть использовано в качестве диагностического маркера для ММИ.

Подкожное введение совместных композиций иммуноглобулина/гиалуронидазы пациентам с ММИ может улучшить их симптомы. Примеры доз 1д для совместных композиций включают дозы, которые используют для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с ММИ. Например, пациенту с ММИ можно вводить иммуноглобулин в дозе 2 г/кг массы тела несколькими дозами. Например, пять доз иммуноглобулина по 400 мг/кг массы тела можно вводить в течение пяти дней подряд. В другом примере доза иммуноглобулина 1 г/кг массы тела может быть введена в течение 2 дней подряд. Для некоторых пациентов могут быть предусмотрена поддерживающая терапия, которая может включать, например, дозы от 400 мг/кг массы тела до 2 г/кг массы тела каждые 2-6 недели. Количество вводимого иммуноглобулина может быть увеличено или уменьшено в случае необходимости с учетом реакции пациента.

Ь. Миастения

Миастения (миастения гравис, МО) является хроническим аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется различной степенью слабости скелетных мышц тела. Заболевание связано с наличием антител к ацетилхолиновому рецептору (АХР) или мышечной тирозинкиназе (Ми8К) в нервномышечном соединении, хотя у некоторых пациентов антитела не обнаруживаются. Клинические признаки МО включают периодическую слабость и утомляемость произвольно сокращающихся мышц, в частности мышцы, поднимающей верхнее веко, глазных, бульбарных мышц, мышц конечностей и дыхательных мышц. Пациенты обычно жалуются на односторонне или двустороннее опускание век (птоз), двоение в глазах (диплопию), затруднение глотания (дисфагию) и проксимальную мышечную слабость. Слабость дыхательной мускулатуры в тяжелых случаях или при острых тяжелых обострениях (миастеническом кризисе) может привести к дыхательной недостаточности. Миастения встречается во всех этнических группах и у обоих полов. Заболевание чаще всего затрагивает молодых и взрослых женщин до 40 лет и старше, мужчин старше 60 лет, но может возникнуть в любом возрасте. В некоторых случаях тимэктомия проводит к уменьшению симптомов.

Иммуноглобулин может быть использован, например, в качестве поддерживающей терапии для пациентов с умеренной и тяжелой МО, как правило, когда другие способы лечения оказались неэффективными или вызывают серьезные побочные эффекты, иммуноглобулин также может быть введен до тимэктомии или во время обострения заболевания (миастенического кризиса). Совместные композиции имму- 48 026112 ноглобулина/гиалуронидазы могут быть введены пациентам с МС подкожно с использованием способов, описанных в настоящем документе. Примеры доз 1д в совместных композициях включают дозы, которые используют для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с МС. Например, пациенту с МС для поддерживающей терапии можно вводить дозу от 400 мг/кг массы тела до 2 г/кг массы тела каждые 4-6 недель. До тимэктомии или во время миастенического кризис может быть введена доза 1-2 г/кг массы тела несколькими дозами, например, пятью дозами по 400 мг/кг массы тела в течение пяти дней подряд. В другом примере доза 1 г/кг массы тела может быть введена в течение 2 дней подряд.

ί. Синдром Мерч-Вольтмана

Синдром Мерч-Вольтмана, также известный как синдром не гнущегося человека (δРδ) является редким неврологическим расстройством с признаками аутоиммунного заболевания. Пациенты проявляют симптомы, связанные с мышечной ригидностью, осложненной эпизодическими спазмами. Мышечная ригидность распространяется на осевые мышцы, прежде всего, брюшной полости и грудопоясничные, а также проксимальные мышцы конечностей. Как правило, совместное сокращение туловищных агонистических и антагонистических мышц приводит к гиперлордозу. Реже, вовлечение дыхательных мышц приводит к затрудненному дыханию и вовлечение мышц лица приводит к похожему на маску выражению лица.

Лечение иммуноглобулином может привести к снижению твердости мышц и повышению чувствительности у пациентов с синдромом Мерч-Вольтмана (Эа1акак е1 а1. (2001) Ν. Еид1. ί. Мей. 345(26): 18706). Совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы можно вводить подкожно пациентам с синдромом Мерч-Вольтмана с использованием способов, описанных в настоящем документе. Примеры доз 1д в совместных композициях включают дозы, которые используют для внутривенного введения иммуноглобулина пациентам с синдром Мерч-Вольтмана. Например, иммуноглобулин можно вводить в дозе 400 мг/кг массы тела в течение пяти дней подряд. Для некоторых пациентов может быть предусмотрена поддерживающая терапия, которая может включать, например, введение иммуноглобулина в дозе 12 г/кг массы тела каждые 4-6 недели. Количество вводимого иммуноглобулина может быть увеличено или уменьшено в случае необходимости.

3. Острые инфекции

Также была показана антимикробная активность иммуноглобулинов в отношении ряда бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, вызванных, например, НаеторЫ1ик юДиеи/ае типа В, Ркеийотоиак аетидшока типа А и В, δΐарЬу1ососсик аигеик, стрептококками группы В, пневмококками типов 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, 23, аденовирусами типов 2 и 5; цитомегаловирусом, вирусом Эпштейна-Барр УСА, вирусом гепатита А, вирусом гепатита В, вирусом простого герпеса-1, вирусом простого герпеса-2; вирусом гриппа А, вирусом кори, вирусом парагриппа типов 1, 2 и 3, вирусом полиомиелита, вирусом ветряной оспы, АкретдШик и Саий1йа А1Ь1саик. Таким образом, совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы можно вводить подкожно пациентам с бактериальными, вирусными и грибковыми инфекциями для усиления иммунной защиты пациента и лечения указанных заболеваний. В некоторых примерах также вводят антибиотики и другие противомикробные препараты.

4. Другие заболевания и состояния

Примеры других заболеваний и состояний, поддающихся лечению 1д, не описанные выше, включают, но не ограничиваются ятрогенным иммунодефицитом, острым рассеянным энцефаломиелитом; АИСА-положительным системным некротическим васкулитом, аутоиммунной гемолитической анемией; буллезным пемфигоидом, рубцовым пемфигоидом; синдромом Эванса (включая аутоиммунную гемолитическую анемию с иммунной тромбоцитопенией); фетоматеринской/ неонатальной аллоиммунной тромбоцитопенией (РМА1Т/ИА1Т); гемофагоцитарным синдромом, трансплантацией аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с высоким риском, 1дМ парапротеиновой невропатией, трансплантацией почки, рассеянным склерозом, опсоклонус-миоклонус атаксией, листовидной пузырчаткой, обыкновенной пузырчаткой, посттрансфузионной пурпурой; токсическим эпидермальным некролизом/синдромом Стивена Джонсона (ТЕИ/δΙδ), синдромом токсического шока, системной красной волчанкой, множественной миеломой, сепсисом, трансплантацией костного мозга, В-клеточными опухолями и болезнью Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера, например, может поддаваться лечению с помощью внутривенного введения иммуноглобулина (см., например, Эойе1 е1 а1. (2004) ί. Иеиго1. Иеигокигд. РкусЫайу 75: 1472-4; δо1отои е1 а1. (2007) Сшт. Орш. Мо1. ТЬег. 9: 79-85; Ке1кш е1 а1. (2008) №итоЬю1 А§ш§). Препараты 1д содержат антитела, которые связывают бета-амилоид (АВ), который является центральным компонентом бляшек в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Таким образом, 1д может способствовать клиренсу АВ из мозга и блокировать токсическое действие АВ на клетки мозга. Таким образом, совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы можно вводить подкожно пациентам с болезнью Альцгеймера с использованием способов, описанных в настоящем документе. Субъекты для лечения включают пациентов с легкой, средней или тяжелой степенью заболевания болезнью Альцгеймера. Выбор пациентов для такого лечения находится в компетенции лечащего врача. Совместные композиции иммуноглобулина/гиалуронидазы можно вводить каждую неделю, каждые две недели или раз в месяц. Лечение может продолжаться в течение нескольких месяцев или лет. Совместные композиции могут быть введены при

- 49 026112 дозе 1д приблизительно от 200 мг/кг массы тела до 2 г/кг массы тела раз в неделю или раз в две недели, как правило, по меньшей мере от 200 мг/кг до 2 г/кг массы тела по меньшей мере один раз в месяц. Лечение иммуноглобулином может увеличить уровень анти-амилоидных бета-антител у пациента по сравнению с уровнем до начала лечения.

I. Изделия и наборы

Фармацевтические композиции иммуноглобулина и гиалуронидазы предусмотренные в настоящем документе, могут быть упакованы в виде изделий, содержащих упаковочный материал, фармацевтическую композицию, эффективную для лечения поддающихся лечению 1д заболеваний или состояний, и этикетку, которая указывает, что композиции предназначены для лечения поддающихся лечению 1д заболеваний и состояний. Примеры изделий включают контейнеры, в том числе контейнеры с одной камерой и двумя камерами. Контейнеры включают, но не ограничиваются, пробирками, бутылками и шприцами. Контейнеры могут также включать иглу для подкожного введения.

Предусмотренные изделия содержат упаковочный материал. Упаковочные материалы, используемые для упаковки фармацевтических препаратов, хорошо известны специалистам в данной области. См., например, патенты США № 5323907, 5052558 и 5033352, каждый из которых включен здесь в качестве ссылки в полном объеме. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничиваются блистерной упаковкой, бутылками, трубками, ингаляторами, насосами, пакетами, флаконами, контейнерами, шприцами и любым упаковочным материалом, подходящим для выбранной композиции и способа введения и лечения. В настоящем документе предусмотрен широкий спектр комбинаций соединений и композиций, так как существует множество способов лечения любого поддающегося лечению 1д заболевания или нарушения.

Совместные композиции иммуноглобулина и растворимой гиалуронидазы также могут быть предусмотрены в виде наборов. Наборы могут включать фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, и объект для введения. Например, композиции могут быть снабжены устройством для введения, таким как шприц, ингалятор, дозирующий колпачок, пипетка или аппликатор. Набор может, по желанию, включать в себя инструкции для применения, включающие дозы, режимы введения и инструкции по способам введения. Наборы также могут включать в себя фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, и объект для установления диагноза. Например, такие наборы могут включать в себя объект для измерения концентрации, количества и активности 1д.

ί. Примеры

Приведенные далее примеры предназначены только для иллюстративных целей и не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение Саттадагй Ысций (10% композиция иммуноглобулина (1д))

Саттадагй Ысций (10% 1д) получали из больших объемов плазмы крови человека, исследованной на инфекционные агенты. Иммуноглобулины были очищены из плазмы с применением модифицированного холодного этанольного способа фракционирования по Кон-Онкли (Сокп и др. (1946), ί. Ат. Скет. 8ос. 68:459-467), а также катионообменной и анионообменной хроматографии (Текскпег е! а1. (2007) Уох 8апд. 92:42-55). Очищенный белок затем подвергали трем независимым стадиям инактивации/удаления вирусов: обработке растворителем/детергентом (8/О) (Ного\\к/ е! а1. (1994) В1оой Соади1. ПЬпп. 5(3):821 -828; КгеП е! а1. (2003) ТгапкГикюп 43: 1023-1038), 35 нм нанофильтрации (НататоЮ е! а1. (1989) Уох 8апд. 56: 230-236; Уиака е! а1. (1991) 1. Сеп. Уио1. 72:2021-2024), и инкубации при низком рН при повышенной температуре (КетрГ е! а1. (1991) ТгапкГикюп 31: 423-427; Ьоше е! а1. (1994) Вю1одюа1к 22:13-19). Процедура 8/Ό включала обработку смесью три-н-бутил-фосфата, октоксинола-9 и полисорбата-80 при 18-25°С в течение минимум 60 мин (Ро1к1ег и др., (2008) Уох 8апд. 94: 184-192).

Окончательные препараты, используемые в исследованиях, представляли собой 10% жидкие препараты с высокой степенью очистки и концентрацией иммуноглобулина С (1д) в 0,25 мМ глицине при рН 4,6-5,1 (при измерении в концентрированном растворе).

Глицин служит стабилизирующим и буферным агентом, при этом в препарат не было добавлено Сахаров, натрия или консервантов. Все образцы 10% 1д (например, образцы ЬЕ12Н020, ЬЕ12Н062, ЬЕ12Н173, ЬЕ12Р047) были в значительной степени схожи. Осмоляльность составляла от 240 до 300 мОсмоль/кг и была сходна с физиологической осмоляльностью. Распределение подклассов 1д в изготовленном в соответствии с описанным выше процессом продукте было близко к нормальному распределению плазмы, где не менее 98% белка представляло собой 1дС, средняя концентрация 1дА составляла 37 мкг/мл (ни один из указанных препаратов не имел концентрацию 1дА > 140 мкг/мл), 1дМ присутствовал только в следовых количествах. Функции Рс и РаЬ были сохранены. Активность активатора прекаликреина не была обнаружена.

Пример 2. Получение 8иЬЦ NС 20% (20% 1д)

А. Получение концентрированной очищенной композиции 1д а. Краткое описание

Ранее замороженную объединенную плазму от доноров сначала разделяли криопреципитацией для отделения различных факторов свертывания крови и ингибиторов, а затем фракционировали с помощью модифицированного метода холодного спиртового фракционирования по Кону, как описано Текскпег е!

- 50 026112 а1. (2007) Уох 8апд. 92:42-55. Спиртовое фракционирование дало основную фракцию Ιβ. называемую осадок С, которую затем обрабатывали для получения конечного продукта с применением хроматографической очистки. Затем применяли катионообменную (КМ-сефароза Гак! Г1о\\') и анионообменную хроматографию (АNX-сефароза Гак! Г1о\у). Чтобы обеспечения высокого уровня безопасности с точки зрения потенциального вирусного загрязнения в процесс получения были введены три отдельных стадии инактивации/удаления вирусов, которые дополняли друг друга по действию, а именно: обработка растворителем/детергентом (смесь 1% Тгйоп Х-100, 0,3% три-н-бутил-фосфата и 0,3% полисорбата-80), нанофильтрация (Акай1 Ρ1аηоνа 35 нм), а также инкубация при низком рН (4,7) в течение 3 недель при повышенной температуре.

Ь. Разделение криопреципитата

Ранее замороженную объединенную плазму от доноров крови, уже проверенную на безопасность и качество, размораживали при температуре не выше 6°С. Для разделения твердой и жидкой фракций, образовавшихся при размораживании плазмы, образец центрифугировали при охлаждении. Жидкую часть (также называемую крио-плазма, которую получают после удаления нерастворимых при охлаждении белков центрифугированием из свежей размороженной плазмы) затем охлаждают до 0 ± 1°С и ее рН доводят до 7. Крио-плазму использовали для отделения различных факторов свертывания крови и ингибиторов до последующего холодного спиртового фракционирования. Для адсорбции факторов свертывания крови и ингибиторов из крио-плазмы до очистки 8иЬ0 NС 20% были выбраны семь методов, которые обозначены как методы 1-7 и приведены в табл.3.

Таблица 3. Методы адсорбции факторов свертывания и ингибиторов из крио-плазмы

Стадия	смола	Гепарин	Адсорбция
1	2	3	4	5	6	7
Криопреиипитацня	-	-	X	X	X	X	X	X	X
ΡΕΪΒΑ	0,5ε ОЕАЕсефадекс/л	-		X	X
Фактор IX	0,5еВЕАЕ- сефадекс/л	2000 ед/мл				X	X	X	X
Фактор VII	120 мг А1(ОН)з/л	750 ед/мл						X	X
Антитромбин	1§ОЕАЕ- сефадекс/л	80000 ед/мл			X		X	X

Для доклинического получения 8иЬЦ NС 20% в качестве исходного материала для спиртового фракционирования по Кону для сравнения широкого спектра различных стадий адсорбции выбрали продукты, полученные методом 1 (плазма без стадии адсорбции), 3 (плазма после РЕГОА, адсорбция АТ-ΙΙΙ) и 6 (плазма после адсорбции Р-ΙΧ, Р-УП, АТ-ΙΙΙ). Различные процессы адсорбции описаны в Тексйиег е! а1. (2007) Уох 8апд. 92:42-55; Но1к1ег е1 а1. (2008) Уох 8апд. 94: 184-192; в патентах США № 6395880 и 5409990, а также в Ρ^оΐЬ^отЬ^п сотр1ех: Вгитте1йшк, Ме!йобк оГ Ρ1акта ΡιόΝπ РгасйопаРоп (РМ. Сиг1тд, Асабетю Ρΐ€88, 1980).

с. Фракционирование

ί. Получения супернатанта Фракции 1

К перемешиваемой плазме добавляли предварительно охлажденный этанол до целевой концентрации этанола 8% об./об., после чего температуру понижали до -2-0°С для выпадения осадка. Супернатант (или Фракцию Ι) собирали после центрифугирования.

ΐΐ. Осадок фракций ΙΙ и ΙΙΙ

Во Фракции 1 рН доводили до 7, а концентрацию этанола до 20-25% об./об., после чего понижали температуру. Затем для отделения жидкой и твердой фракций проводили центрифугирование (Фракции ΙΙ + ΙΙΙ супернатант).

Ш. Экстракция из осадка фракций ΙΙ и ΙΙΙ

Для ресуспендирования Фракций ΙΙ + ΙΙΙ использовали холодный буфер для экстракции (5 мМ однозамещенный фосфат натрия, 5 мМ ацетат, рН 4,5 ± 0,2, проводимость от 0,7 до 0,9 мСм/см) при отношении осадка к буферу для экстракции 1:15. Процесс экстракции проводили при 2-8°С.

ίν. Обработка микрокремнеземом и фильтрация

Микрокремнезем (например, аэросил 380 или его эквивалент) добавляли к суспензии до концентрации приблизительно 40 г/кг суспензии (или эквивалентно 1,8 г/л крио-плазму) и перемешивали при 2-8°С в течение 50-70 мин. Жидкую и твердую фракции разделяли фильтрацией при 2-8°С с помощью фильтра (НуГ1о 8ирег-Се1, \Уог1б Мшега1к Шс, суспензияО,5 кг/кг) с последующей промывкой фильтр-пресса буфером для экстракции.

ν. Фракционирование осадка С

Фильтрат смешивали с полисорбатов-80 до концентрации 0,2% вес./об. при перемешивании в течение 30 мин при 2-8°С. Затем в раствор в течение еще 30 мин при перемешивании добавляли обезвоженный цитрат натрия до концентрации 8 г/л при 2-8°С. рН доводили до 7,0 ±0,1 1М гидроксидом натрия или 1 М уксусной кислотой. Затем в раствор добавляли холодный этанол до концентрации приблизи- 51 026112 тельно 25% об./об., после чего проводили стадию осаждения, похожую на осаждение II по Кону (СоЬп с1 а1. (1946) 1. Ат. СЬет. 8ос. 68:459-467).

νί. Ресуспендирование осадка С и обработка растворителем/детергентом

Осадок растворяли и фильтровали через фильтр с номинальным размером пор 0,2 мкм (например, фильтр Сипо ΥΚ.06 или его эквивалент), получали прозрачный фильтрат, который использовали для обработки растворителем/детергентом (8/Ώ).

Первой стадией инактивации вирусов является 8/Ό обработка ресуспендированного осадка С. Смесь для δ/Ό обработки содержала 1,0% (об./об.) Тритон Х-100, 0,3% (об./об.) Твин-80 и 0,3% (об./об.) три-н-бутил-фосфата, обработку проводили при 18-25°С в течение 60 мин.

б. Катионообменная хроматография

Затем δ/ϋ-содержащий раствор белка пропускали через катионообменную колонку (карбоксиметил(КМ)-сефароза Га81 йоте) для удаления растворителя и детергента. После вымывания 8/Ό реагентов адсорбированный белок затем элюировали элюирующим буфером с высоким рН (рН 8,5 ±0,1).

е. Анионообменная хроматография рН элюата доводили до 6 и раствор разбавляли до соответствующей проводимости, после чего пропускали через уравновешенную анионообменную колонку (ΑΝΧ-сефароза Гай йоте). Проходящий через колонку во время нанесения и отмывания раствор собирали для дальнейшей обработки.

Г. Нанофильтрация

На втором из трех этапов инактивации вирусов раствор с колонки, полученный на последней стадии, подвергали нанофильтрации с получением нанофильтрата (АкаЫ Р1апо\'а 35 нм фильтр).

д. Ультрафильтрация и диафильтрация

Концентрацию глицина в нанофильтрате доводили до 0,25 М, нанофильтрат еще более концентрировали до концентрации белка 5 ± 1% вес./об. путем ультрафильтрации, рН доводили до 5,2 ± 0,2. Для того, чтобы достичь более высокой концентрацией белка для подкожного введения, ультрафильтрацию проводили в кассете с открытыми каналами и ультрафильтрационной мембраной (МтШроге РеШеоп Вютах) с номинальным пропусканием по молекулярной массе (NМ^СΟ) 50 кДа или менее, которая была специально разработана для продуктов с высокой вязкостью.

Концентрат подвергали диафильтрации против 0,25 М раствора глицина с рН 4,2±0,2. Минимальный объем обмена составлял 10 х первоначальных объемов концентрата. В ходе ультрафильтрации/диафильтрации температуру раствора поддерживали на уровне 4-20°С. После диафильтрации раствор концентрировали до концентрации белка минимум 22% вес./об. при 2-8°С.

Для изъятия всего остаточного белка в системе и увеличения концентрации белка, было проведено отмывание после фильтрации первой большой ультрафильтрационной системы. Чтобы гарантировать, что весь белок были отмыт, промывание проводили по меньшей мере 2 мертвыми объемами в режиме рециркуляции. Затем после промывки первой ультрафильтрационной системы полученный раствор концентрировали до концентрации белка не менее 22% вес./об. с помощью второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, оснащенной тем же типом мембраны, размер которой составлял 1/10 или менее от первой мембраны. Полученный после отмывания концентрат добавляли к основному объему раствора. Вторую ультрафильтрационную систему также промывали и температуру раствора доводили до 2-8°С.

Ь. Композиция

Для композиции концентрацию раствора белка корректировали до 20,4 ± 0,4% мас./об. с помощью раствора, полученного после отмывания второй меньшей системы ультрафильтрации, и/или буфером диафильтрации. рН доводили до 4,4-4,9 при необходимости.

ί. Дальнейшая стерилизация

Композиции затем стерилизовали сначала фильтрацией через мембранный фильтр с абсолютным размером пор 0,2 мкм или менее, стерильно разливали в контейнеры для окончательной герметизации и отбирали образцы для тестирования. Окончательную стадию инактивации/удаления вирусов проводили путем хранения закрытых емкостей при 30-32°С в течение 21-22 дней.

Таким образом, полученные 20% композиции 1д представляли собой высокоочищенные изотонические жидкие композиции иммуноглобулина (по меньшей мере 95% гамма-глобулина) в 0,25 мМ глицине при рН от 4,4 до 4,9. Окончательные препараты, используемые в исследованиях, представляли собой образцы 8^0107Ν^ 8С0020ЖС и 8С0030ЖС.

В. Характеристика доклинических образцов

Доклинические образцы 8№0107Ν^ δС00207NС и δС00307NС произвели в масштабе 200 л и характеризовали в соответствии с табл.4. О чистоте препарата свидетельствовал низкий уровень основных примесей, содержание которых было значительно ниже 0,1% от общего 1дС. Распределение молекулярного размера (Μ8Ό) в 20% 1д продукте на заключительном этапе процесса было схоже с Μ8Ό 10% 1д (Саттадагб Ыцшб). Это показывает, что увеличение концентрации до 20% белка не оказывает негативного воздействия на целостность молекулы 1дС.

- 52 026112

Таблица 4. Характеристика образцов διώβ N0 20%

		Стерильные растворы
Анализ/Метод	Образец	8С001071ЧС	8000207Ν	8С00307УС
Всего белка/У Ф	г/л плазмы	3,4	3,7	3,7
(ес/ нефелометрия	г/л плазмы	3,0	3,0	3,0
1ВА/ЕЫ5А	г/л плазмы	<0,001	<0,001	<0,001
1ц\1 / ЕЫ8А	г/л плазмы	<0,001	<0,001	<0,001
Μδϋ (НРЬС)	% агрегатов	0,1	0,1	0,1
% олиго/димсров	4,6	4,5	3,2
% мономеров	95,2	95,4	96,6
% фрагментов	0,1	0	0,1
№ образца исходного материала		Осадок С УИЕЬС171	Осадок С ΥΝΕΪ,Ο173	Осадок С ЬВ0790301

Предварительные критерии качества для полученных образцов были определены на основе нормативных требований США и Европы (РИА и ЕМЕА) для подкожных препаратов иммуноглобулинов человека, характеристик современного применяемого продукта для подкожного введения (δυВСυVIΑ, лицензирован для подкожного введения в Европе) и характеристик Оаттадагй Ыцшй. Три полученных образца характеризовали на их чистоту с помощью соответствующих антител и сравнивали полученные данные с результатами доклинического 10% образца Гд с тройной инактивацией вирусов (ТУК). В табл. 5 приведены результаты титров антител и факторы обогащения для трех доклинических διιΗΟ N0 20% образцов и доклинического образца Оаттадагй Ысций. Результаты демонстрируют один порядок величин для обоих образцов.

Таблица 5. Сравнение качества διιΗΟ N0 20% и 10% Гд ТУК

διιΗΟ N0 20%. Выход продукта и содержание связанных с процессом получения примесей являются удовлетворительными и все технические требования к продукту являются выполненными для всех трех образцов.

- 53 026112

Таблица 6. Контроль качества финального образца 8иЪЦ N0 20%

	8С0010719С	8С00207ИС	5С00307ХС
	система анализа	Единицы
Функциональная целостность Рс	Связывание Гс	% от ВРН для образца 3	15,8	138	164
Антнкомплемент ная активность	ЕР метод	%	41,1	41,5	41,2
Антнкомплемент ная активность	ЕР метод	СН50 Ед/мг	41,4	41,8	41,6
Активность активатора поекалликпеина	хромогенный	ЕД/мл	<0,6	1,004	1,237
Антн-А гемагглютнны, по евпопейской	гемагглютинацня	Разведение: 1	8	16	8
Антн-В гемагглютнннны, по европейской	гем а ггл юти на ци я	Разведение: 1	4	4	2
Анти-О	гемагглютинацня		удовл.	удовл.	удовл.
Исключение пирогенкостк, по европейской фармакопее н Своду федеральных нормативных актов <СРК>	кролик	подъем °С	свободно от пирогенов	свободно от пирогенов	свободно от пирогенов
Бактериальные эндотоксины по электрофорезу на ацетате	Хромогенный САЕ	ЕД/мл %	<1,2 99,6	1,8 99,8	<1,2 99,5
Распределение по молекулярному весу (мономеры + цимеры)	8Е-НРЬС	%	99,2	99,3	99,2
Распределение по молекулярному весу (полимеры)	8Е-НРЬС	%	0,2	0,2	0,3
Распределение по молекулярному весу (фрагменты)	ЯЕ-НРЬС	%	0,6	0,5	0,5
1йА по европейскому стандарту	ЕЫ8А	мкг/мл	20	20	30
18М	ЕЫ8А	мкг/мл	1,1	1,0	1,2
|£С	нефелометрия	мг/мл	177	165	163
Белок (тотальный)	УФ	мг/мл	201	203	202
Белок	по азоту	мг/мл	202	208	203
Глицин	НР1С	мг/мл	14,7	14,5	14,7
Полисорбат 80	Спектрофотометр ня	мкг/мл	<250	<250	<250
ΤΝΒΡ	Газовая хромтаография	мкг/мл	<оз	<0,3	<03
Октоксннол 9	Ионная хроматография	мкг/мл	<3	<3	<3
Стерильность	Мембранная фильтрация	нет данных	стерильно	стерильно	стерильно
Осмолярность		мосмоль/кг	298	298	299
рН, неразбавленный	потенциометрия		5,1	5,2	5,3

	система анализа	Единицы
Внешний вид	Визуальное наблюдение		удовл	удовл	удовл
этанол	Газовая хромтаография	мкг/мл	<20	<20	<20
изопропанол	Газовая хромтаография	мкг/мл	<20	<20	<20
Алюминий по атомно-	Фотометрия	мкг/л	<50	<50	<50
Кремний, атомноэмиссионная спектрометрия с	Ионная электронная	мкг/л	3466	17270	21180
Гепарин		ЕД/мл	<0,0075	<0,0075	<0,0075

Измеряемые в процессе получения доклинических образцов параметры и характеристика промежуточных и конечного продукта показали отсутствие существенных различий между тремя партиями. Все полученные образцы соответствовали техническим требованиям к продукту независимо от типа исход- 54 026112 ного материала (осадок О УХЕЬО171, УХЕЬО173 или ЬВ0790301).

С. Исследование хранения 20% композиции 1д

Для того чтобы оценить стабильность при хранении 20% препарата 1д, 3 доклинических описанных выше препарата (ЗС00107ЫО, ЗС00207ЫО, ЗС00307ЫО) и контрольный образец (1дОЗС 62/1) хранили при 2-8°С и 28-30°С (только контрольный образец) в течение 18 месяцев. Для определения распределения молекулярного размера (МЗЭ) и стабильности образцов использовали высокопроизводительную эксклюзионную хроматографию. Основным параметром для оценки стабильности являлся молекулярный размер, где изменение размера может быть результатом деградации, денатурации, агрегации или фрагментации.

МЗЭ в доклинических образцах после хранения при 2-8°С в течение 12 месяцев показаны в табл. 7. В табл. 8 приведено МЗЭ для контрольного образца 1дОЗС 62/1 при 2-8°С и 28-30°С после хранения в течение 18 месяцев. Полученные данные подтвердили, что продукт соответствует стандартным требованиям при хранении в течение 18 месяцев при 2-8°С и 28-30°С.

Таблица 7. МЗЭ доклинических образцов 20% 1д при 2-8°С

	-(НР-8ЕС) <%)-
Образец	месяц	агрегатов (>450 кДа)	Олиго/димеров + мономеров	фрагментов (<70кДа)
зсоокпмй	0	03	953	04
3	0,4	993	04
4	0,5	993	0,2
ъ	0,5	993	0,2
Образец	месяц	агрегатов (>450 кДа)	Олиго/димеров + мономеров	фрагментов (<70кДа)
12	0,7	994	оз
$С00207Г9С	0	03	993	0,2
3	0,4	993	04
4	0,5	993	04
б	0,6	994	04
12	оз	99,0	04
8СО0307ХС	0	03	993	04
3	03	993	04
4	0,6	994	04
6	0,7	994	04
12	0,9	983	0,2
Техническое требование		<5	>90	<5

Таблица 8. МЗЭ образца 1дОЗС 62/1 при 2-8°С и 28-30°С

	М8О (НР-8ЕС) (%)
Образец	°С	Месяц	агрегатов (>450 кДа)	Олиго/ димеров + мономеров	фрагментов (<70кДа)
1§С8С 62/1	2-8	0	04	99,5	0,3
1	04	99,7	04
3	04	99,6	0,2
6	оз	99,4	03
12	0,4	99,3	03
18	0,4	994	0,4
28-30	0	0,2	993	оз
1	04	994	0,6
3	03	98,7	1,0
6	0,6	98,0	1,4
12	1,2	95,6	34
18	1,9	93,5	3,8
Техническое требование			<5	>90	<5

Ό. Изучение стабильности различных композиций и концентраций 1д

Стабильность при хранении высококонцентрированной композиции белка (14-20%) с низким рН (0,25 М глицин рН 4,4-4,9) сравнивали со стабильностью высококонцентрированной композиции белка с нейтральным рН (22,5 г/л глицина, 3 г/л ЫаС1, рН 7,0), которую в настоящее время используют для внутримышечного и подкожного введения иммуноглобулинов.

Все эксперименты начинали с нанофильтрата с концентрацией белка 5%. Проводили 10х обмен буфера против 0,15 М глицина (наименьшая исследованная концентрация глицина), после чего проводили конечное концентрирование до целевой концентрации более 20% белка с помощью 0,5 м полиэфирсульфоновой мембраны МПНроге с пропусканием по молекулярной массе 30К (стандартное пропускание). Полученные образцы готовили и хранили при низком рН (4,7) альтернативно инкубацию при низком рН проводили в большом объеме, после чего образцы готовили в нейтральном рН (7,0) и хранили при 2-8°С или при 28-30°С в течение 3 месяцев. Через 3 месяца для определения содержания агрегатов и фрагментов с помощью высокопроизводительной эксклюзионной хроматографии проводили определение распределения молекулярного размера. Критерии приемлемости были определены следующим образом:

- 55 026112 содержание мономеров и олигомеров/димеров > 90%; агрегатов < 5%, фрагментов < 5%. Был определен АСА титр, как описано в Европейской Фармакопее. Приемлемый АСА титр (титр антител) был определен на уровне менее 50% СН50 единиц на мг белка.

В табл.9 и 10 показано содержание агрегатов и фрагментов, а также АСА титр после 3 месяцев хранения при 28-30°С и 2-8°С соответственно для стандартной композиции (рН 4,7, 0,25 М глицин или рН 7,0, 22,5 г/л глицина, 3 г/л ЫаС1) при различных концентрациях белка. Эти данные ясно показывают, что при низком рН композиция демонстрировала более низкую агрегацию и низкий АСА титр после 3 месяцев хранения при 28-30°С. Все АСА титры композиции при рН 7,0 были выше критерия приемлемости, определенного для данного теста.

Результаты хранения при 2-8°С подтверждают тенденцию, наблюдаемую при 28-30°С. АСА титры были ниже критерия приемлемости, хотя композиции с рН 7,0 имеют более высокие значения. Концентрация белка не влияет на результаты тестирования.

Таблица 9. Фрагментация, агрегация и значения АСА после 3 месяцев хранения при 28-30°С при рН 4,7 и рН 7,0 при различных концентрациях белка

	Фрагменты, %	Агрегаты, %	АСА титр, %
Белок	рН4,7	рН 7,0	рН 4,7	рН 7,0	рН 4,7	рН7,0
14%	1,35	1,50	0,10	0,92	44,1	52,0
16%	1,24	1,38	0,08	0,91	40,5	53,1
18%	1,24	1,60	0,11	0,93	40,3	52,4
20%	1,35	1,52	0,12	0,93	37,5	62,7

Таблица 10. Фрагментация, агрегация и значения АСА после 3 месяцев хранения при 2-8°С при рН 4,7 и рН 7,0 при различных концентрациях белка

	Фрагменты, %	Агрегаты, %	АСА титр, %
Белок	рН 4,7 П	рН 7,0	рН 4,7	рН 7,0	рН 4,7	рН 7,0
14%	0,36	1,80	0,16	1,09	38,3	46,5
16%	0,30	0,51	0,11	1,01	37,4	44,7
18%	0,33	1,10	0,17	0,86	35,8	39,8
20%	0,33	1,98	0,20	1,06	36,1	46,0

Было исследовано влияние различных процедур концентрирования на Μ8Ό и титр АСА. Первая используемая процедура представляла собой фильтрацию через 0,5 м полиэфирсульфонную мембрану Мййроге с пропусканием по молекулярной массе 30К (стандартное пропускание), как описано выше, а вторая процедура представляла собой фильтрацию через 0,5 м полиэфирсульфонную мембрану Мййроге с открытым экраном, подходящую для растворов с высокой вязкостью. Полученные после отмывания мембраны фракции для увеличения выхода концентрировали с помощью второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы с меньшей поверхностью мембраны (0,1 м², открытый экран).

В табл. 11 и 12 показаны Μ8Ό и титр АСА после хранения в течение 3 месяцев при 28-30°С или 28°С соответственно композиции с низким рН (4,7) при различных концентрациях белка. Данные показали аналогичные результаты для обеих концентраций после 3 месяцев хранения. Полученные значения при 2-8°С подтвердили результаты, полученные при 28-30°С. Концентрация не влияет на стабильность продукта, хотя адекватное отмывание после фильтрации может быть достигнуто только с открытыми мембранами.

Таблица 11. Фрагментация, агрегация и значения АСА после 3 месяцев хранения при 28-30°С при рН 4,7 при различных способах концентрации белка

	Фрагменты, %	Агрегаты, %	АСА титр
Белок	Стандартная мембрана	Открытая мембрана	Стандартная мембрана	Открытая мембрана	Стандартная мембрана	Открытая мембрана
14%	1,35	0,92	0,10	0,21	44,1	42,6
16%	1,24	1,09	0,08	0,20	40,5	40,9
18 %	1,24	0,96	0,11	0,23	40,3	40,7
20%	1,35	0,98	0,12	0,30	37,5	41,6

Таблица 12. Фрагментация, агрегация и значения АСА после 3 месяцев хранения при 2-8°С при рН 4,7 при различных способах концентрации белка

	Фрагменты, %	Агрегаты, %	АСА титр
Белок	Стандартная мембрана	Открытая мембрана	Стандартная мембрана	Открытая мембрана	Стандартная мембрана	Открытая мембрана
14%	0,36	0,27	0,16	0,17	38,3	39,6
16%	0,30	0,22	0,11	0,14	37,4	38,3
18%	0,33	0,23	0,17	0,18	35,8	39,6
20%	0,33	0,22	0,20	0,20	36,1	39,9

- 56 026112

Пример 3

Получение растворимой рекомбинантной человеческой РН20 (гНиРН20) А. Получение линии клеток, экспрессирующих растворимую гНиРН20

Для трансфекции в клетки яичников китайского хомячка (СНО клетки) была использована плазмида Н224 (приведенная в δΡΟ ГО N0: 52) (см., например, заявки США № 10795095, 11/065716 и 11/238171). Плазмидный вектор экспрессии растворимой гНиРН20 Н224 включал в качестве основы вектор РС1 (Рготеда), ДНК, кодирующую аминокислоты 1-482 человеческой гиалуронидазы РН20 (ЬЕО ГО N0: 49), внутренний сайт посадки рибосомы (ΙΚΉδ) вируса ЕСМУ (С1оп(есП) и ген дигидрофолатредуктазы мыши (ПНРК). Основа РС1 также включала ДНК, кодирующую ген бета-лактамазы (АтрК), ориджин репликации Г1, немедленную раннюю энхансер/промоторную область цитомегаловируса (ЦМВ), химерный интрон и поздний сигнал полиаденилирования δν40. ДНК, кодирующая растворимую гНиРН20, содержала сайт Мк1 и консенсусную последовательность Козака до триплета метионина в аминокислотной позиции 1 нативной 35 аминокислотной сигнальной последовательности человеческой РН20, а также стоп-кодон после ДНК, кодирующей тирозин, соответствующий аминокислотной позиции 482 человеческой гиалуронидазы РН20, приведенной в δΡΟ ГО N0: 1, после стоп-кодона располагался сайт рестрикции ВатН1. Конструкт рС1-РН20-1КЕ^-ПНРК^У40ра (Ж24), следовательно, приводит к синтезу одного вида мРНК с промотора ЦМВ, которая кодирует аминокислоты 1-482 человеческой РН20 (приведена в δΡΟ ГО N0: 3) и аминокислоты 1-186 дигидрофолатредуктазы мыши (приведена в δЕ^ ГО N0: 53), разделенные внутренним сайтом посадки рибосомы (ΙΡΡδ).

Не трансфицированные клетки СНО ЭС44 растили в модифицированной С1ВС0 СЭ-СН0 среде для ПНРК(-) клеток, дополненной с 4 мМ глутамина и 18 мл/л плюроника Р68/л (СЬсо), и для подготовки к трансфекции высевали при плотности 0,5 х 10⁶ клеток/мл в перемешиваемые на шейкере колбы. Клетки выращивали при температуре 37°С и 5% СО₂ в увлажненном инкубаторе при скорости перемешивания 120 об/мин. Экспоненциально растущие не трансфицированные клетки СНО ЭС44 были проверены на жизнеспособность до трансфекции.

Шестьдесят миллионов жизнеспособных клеток из не трансфицированной культуры клеток СНО ЭС44 осаждали и ресуспендировали до плотности 2х 10⁷ клеток в 0,7 мл 2 х буфера для трансфекции (2 х НеΒδ: 40 мм НЕРЕδ, рН 7,0, 274 мМ №С1, 10 мМ КС1, 1,4 мм №-ьНР0₊ 12 мМ декстроза). К каждой аликвоте ресуспендированных клеток добавляли 0,09 мл (250 мкг) линеаризованной плазмиды Н224 (линеаризовали расщеплением С1а1 (№те Епд1апй Вю1аЬк) в течение ночи), и раствор клетки/ДНК перенесли в кюветы для электропорации ВТХ (Сепйошск) с 0,4 см зазором при комнатной температуре. Была проведена электропорация с отрицательным контролем без добавления плазмидной ДНК к клеткам. Смесь клетки/плазмида подвергли электропорации при разряде конденсатора в 330 У и емкости 960 мкФ или 350 В и 960 мкФ.

После электропорации клетки переносили из кювет в 5 мл модифицированной СЭ-СН0 среды для ПНРК(-) клеток, дополненной 4 мМ глутамина и 18 мл/л плюроника Ε6δ/τ (СЬсо), и позволяли расти в лунках 6-луночных планшетов для культивирования тканей без отбора в течение 2 дней при температуре 37°С и 5% СО2 в увлажненном инкубаторе.

Через два дня после электропорации из каждой лунки отбирали 0,5 мл культуральной среды, которую проверяли на наличие гиалуронидазной активности, используя анализ микромутности, описанный в Примере 4.

Таблица 13. Начальная гиалуронидазная активность трансфецированных 4Ζ24 клеток СНО ЭС44 через 40 ч после трансфекции

	Разведение	Активность, ед/мл
Трансфекция 1 (330В)	1 к 10	0,25
Трансфекция 2 350В	1 к 10	0,52
Отрицательный контроль	1 к 10	0,015

Клетки после трансфекции 2 (350 В) собирали из культуральных лунок, подсчитывали и разбавляли до 1х 10⁴-2х10⁴ жизнеспособных клеток/мл. Аликвоту 0,1 мл клеточной суспензии переносили в каждую лунку пяти 96-луночных круглодонных планшетов для культивирования ткани. В каждую содержащую клетки лунку добавляли 100 мкл СЭ-СН0 среды (С1ВС0), содержащей 4 мМ добавки С1и(аМАХ™-1 (С1ВС0™, 1пуйгодеп СогрогаПоп) и не содержащей гипоксантин и тимидин (конечный объем 0,2 мл).

В 5 планшетах при выращивании без метотрексата было идентифицировано десять клонов (табл.

21).

- 57 026112

Таблица 14. Гиалуронидазная активность идентифицированных клонов

ГО планшет/лунка	Относительная гиалуронидазная активность
1СЗ	261
2С2	261
зт	261
ЗЕ5	243
ЗС6	174
208	103
1В9	304
2ϋ9	273
4Ш0	302

Шесть клонов Н224 наращивали в культуре и переносили в перемешиваемые колбы в виде суспензий по одной клетке. Клоны 3Ό3, 3Е5, 2О8, 2Ό9, 1Е11 и 4Ό10 помещали в 96-луночные круглодонные планшеты для культивирования ткани с использованием двумерного бесконечного разведения, при котором клетки разводили 1:2 вниз по планшету и 1:3 вдоль планшета, начиная с 5000 клеток в верхней левой лунке. Для обеспечения необходимых факторов роста в первые дни роста в культуре разбавленные клоны растили в присутствии 500 не трансфицированных клеток СНО ЭС44 на лунку. На каждый субклон отвели десять планшетов, 5 из которых содержали 50 нМ метотрексат, а 5 планшетов метотрексата не содержали.

Клон 3Ό3 дал 24 обнаруживаемых субклонов (13 в отсутствие обработки метотрексатом и 11 при обработке 50 нМ метотрексатом). Значительную гиалуронидазную активность определили в супернатантах 8 из 24 субклонов (> 50 ед./мл), эти 8 субклонов растили в колбах Т-25 для культивирования ткани. Клоны, полученные с помощью обработки метотрексатом, культивировали в присутствии 50 нМ метотрексата. Клон 3Ό35Μ культивировали в присутствии 500 нМ метотрексата и получили клоны, производящие более 1000 ед./мл при культивировании во колбах (клон 3Ό35Μ; или Оеп1 3Ό35Μ). Затем получили банк клеток (МСВ) 3Ό35Μ.

В. Получение и очистка Оеп 1 человеческой РН20

a. Культивирование в 5-л биореакторе

Флакон с 3Ό35Μ размораживали и клетки растили в перемешиваемых на шейкере колбах, затем в 1 л вращающихся колбах в СЭ-СН0 среде (Гпуйгодеп, Саг1кЬаб, Калифорния) с добавлением 100 нМ метотрексата и О1иίаΜАΚС™-1 (Гпуйгодеп). Клетки переносили из вращающихся колб в 5-л биореактор (Вгаип) при плотности инокуляции 4х10⁵ жизнеспособных клеток/мл. Температура была установлена на 37°С, рН 7,2 (начальная установка), количество растворенного кислорода составляло 25%, подача воздуха составляла 0-100 см /мин. На 168 ч добавили 250 мл питательной среды # 1 (СО СН0 с 50 г/л глюкозы). На 216 ч добавили 250 мл питательной среды # 2 (СО СН0 с 50 г/л глюкозы и 10 мМ бутирата натрия), на 264 ч вновь добавили 250 мл питательной среды # 2. Окончательная продуктивность составила 1600 ед. на мл с максимальной плотностью клеток 6 х 10⁶ клеток/мл. Добавление бутирата натрия резко повысило продукцию растворимой гНиРН20 на завершающей стадии получения.

Кондиционированную среду от клона 3Ό35Μ очищали глубинной фильтрацией и тангенциальной проточной диафильтрацией в 10 НЕРЕБ мМ рН 7,0. Растворимую гНиРН20 затем последовательно очищали с помощью хроматографии на ионообменной Ц-сефарозе (РЬагтааа), гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе (РЬагтааа), на фенилборонате (Рготейск) и хроматографии на гидроксианатите (Вюгаб, ГОсЬтопб, Калифорния).

Растворимую гНиРН20, связавшуюся с Ц-сефарозой, элюировали 400 мМ №С1 в том же буфере. Элюат разбавляли 2М раствором сульфата аммония до конечной концентрации 500 мМ сульфата аммония и пропускали через колонку с фенилсефарозой (низкозамещенная) с последующим связыванием в тех же условиях на фенилборонатной смоле. Растворимую гНиРН20 элюировали с фенилсефарозной смолы НЕРЕБ рН 6,9 после отмывания при рН 9,0 50 мМ бицином без сульфата аммония. Элюат загружали на керамический гидроксиапатитный носитель при рН 6,9 в 5 мМ фосфате калия и 1 мМ СаС1₂ и элюировали 80 мМ фосфатом калия, рН 7,4 с 0,1 мМ СаС1₂.

Полученная очищенная растворимая гНиРН20 обладала удельной активностью более 65000 ИБР единиц/мг белка по данным анализа микромутности (пример 4) с использованием стандарта сравнения ИБР. Очищенную кРН20 элюировали в виде одного пика градиентом от 0,1% ТРА/Н₂₀ до 0,1% ТРА/90% ацетонитрил/10% Н₂₀ с 24 до 26 мин с колонки со стирол-дивинилбензольным носителем РЬагташа 5КРС, при анализе методом БОБ-электрофореза белок давал одну широкую полосу, соответствующую 61 кДа, после обработки РNОАБЕ-Ρ белок давал узкую полосу, соответствующую 51 кДа. Юконцевое секвенирование показало, что лидерный пептид эффективно удалялся.

b. Наращивание культуры клеток в 100 л биореакторе для культивирования клеток

Для отдельной очистки растворимой гНиРН20 из четырех различных колб с клетками 3Ό35Μ и по- 58 026112 лучения 4 отдельных партий кНиРН20 НиА0406С, НиА0410С, НиА0415С и НиА0420С использовали масштабирование процесса получения. Клетки из каждой колбы отдельно наращивали и культивировали в 125 л биореакторе, затем белок очищали с использованием колоночной хроматографии. Для оценки таких параметров как выход фермента на протяжении всего процесса отбирали пробы. В приведенном ниже описании процесса указаны примеры условий для таких процессов и параметров, как запуск биореактора и объем питательной среды, плотность клеток при переносе и объемы отмывания и элюции. Точные цифры незначительно отличались для каждой партии, они подробно описаны в табл.15-22.

Четыре колбы с клетками 3Ό35Μ размораживали на водяной бане при 37°С, затем добавляли СЭСН0 среду, содержащую 100 нМ метотрексата и 40 мл/л О1йаМАХ, и клетки центрифугировали. Клетки ресуспендировали в 125 мл встряхиваемой колбе в 20 мл свежей среды, после чего колбу помещали в инкубатор с 7% СО₂ при 37°С. Клетки растили в объеме 40 мл в 125-мл колбе при перемешивании на шейкере. Когда плотность клеток достигла 1,5-2,5х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 125 мл вращающейся колбе в объеме 100 мл. Колбу инкубировали при 37°С, 7% СО2. Когда плотность клеток достигла 1,5-2,5х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 250 мл вращающейся колбе в объеме 200 мл, колбы инкубировали при 37°С и 7% С02. Когда плотность клеток достигла 1,5-2,5х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 1 л вращающейся колбе в объеме 800 мл, колбы инкубировали при 37°С и 7% СО2. Когда плотность клеток достигла 1,5-2,5х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 6 л вращающейся колбе в объеме 5 л, колбы инкубировали при 37°С и 7% СО2. Когда плотность клеток достигла 1,5-2,5х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 36 л вращающейся колбе в объеме 20 л, колбы инкубировали при 37°С и 7% С02.

125-л реактор стерилизовали паром при 121°С и 20 Рδί (фунт на квадратный дюйм), после чего добавляли 65 л СЭ-СН0. Перед использованием реактора его проверили на загрязнение. Когда плотность клеток в 36 л вращающейся колбе достигла 1,8-2,5х 10 клеток/мл, 20 л культуры клеток перенесли из 36 л вращающейся колбы в 125 л биореактор (Вгаип), в результате чего окончательный объем составил 85 л, а плотность посева была около 4х10⁵ клеток/мл. Температуру установили на 37°С, рН 7,2; уровень растворенного кислорода составлял 25% ± 10%; скорость вращения крыльчатки 50 об/мин; давление в емкости 3 фунта на квадратный дюйм; количество барботируемого воздуха 1 л/мин; подача воздуха 1 л/мин. Каждый день содержимое реактора исследовали на количество клеток, рН, проводили анализ среды, анализ продукции и устойчивости белка. Во время культивирования добавляли питательные вещества. На 6 день добавили 3,4 л питательной среды # 1 (СО СН0 + 50 г/л глюкозы + 40 мл/л О1ШаМАХ™-1) и температуру культивирования изменили на 36,5°С. На 9 день добавили 3,5 л питательной среды # 2 (СО СН0 + 50 г/л глюкозы + 40 мл/л О1йаМАХ™-1 + 1,1 г/л бутирата натрия) и температуру культивирования изменили на 36°С. На 11 день добавили 3,7 л питательной среды # 3 (СО СН0 + 50 г/л глюкозы + 40 мл/л О1иίаΜΑX™-1 + 1,1 г/л бутирата натрия) и температуру культивирования изменили на 35,5°С. Клетки из реактора собирали на 14 день или когда жизнеспособность клеток падала ниже 50%. Процесс приводил к получению растворимой гНиРН20 с ферментативной активностью 1600 ед./мл при максимальной плотности клеток 8 млн клеток/мл. При сборе клеток культуру исследовали на микоплазму, биологическое загрязнение, эндотоксин и вирусы ш νίίΓΟ и ш νίνΟ, вирусные частицы обнаруживали просвечивающим электронным микроскопом (ПЭМ), а также исследовали ферментативную активность.

Сто литров собранной из биореактора клеточной культуры фильтровали через серию одноразовых фильтров с полиэфирсульфонным фильтрующим материалом ^айогшк): сначала фильтровали через картридж с порами 8,0 мкм, затем 0,65 мкм, 0,22 мкм, и, наконец, через 0,22-мкм фильтр δа^ίоρо^е 2000 см² в 100 л стерильный баллон для хранения. Культуру сконцентрировали в 10 раз с использованием двух ТРР со спиральными полиэфирсульфонными 30 кДа фильтрами ΜVС0 (МПЬроге), затем 6 х проводили замену буфера на 10 мМ ΗЕРЕδ, 25 мМ №^0₄, рН 7,0 с помощью последнего 0,22 мкм фильтра и среду переносили в 20 л стерильный баллон для хранения. В табл. 15 приведены данные, относящиеся к культивированию клеток, их сбору, стадиям концентрирования и замены буфера.

- 59 026112

Таблица 15. Данные по культивированию клеток, их сбору, стадиям концентрирования и замены буфера

Параметр	НИА0406С	НИА04010С	НИА0415С	Н11А0420С
Время от размораживания до внесения в 100 л биореактор (дней)	21	19	17	18
Плотность инокуляции в 100 л (х 10 клеток/мл)	0,45	0,33	0,44	0,46
Время удвоения количества клеток при логарифмическом росте (ч)	29,8	27,3	29,2	23,5
Макс, плотность клеток 10 клеток/мл)	5,65	8,70	6,07	9,70
Жизнеспособность собранных клеток (%)	41	48	41	41
Титр собранной среды(ед/мл)	1964	1670	991	1319
Время вЮО л биореакторе (дней)	13	13	12	13
Объем очищенной среды (мл)	81800	93300	91800	89100
Анализ собранного отфильтрованного фермента (ед/мл)	2385	1768	1039	1425
Анализ сконцентрированного фермента (ед/мл)	22954	17091	8561	17785
Анализ сконцентрированного фермента при замене буфера (ед/мл)	15829	11649	9915	8679
Анализ сконцентрированного отфильтрованного фермента после замены буфера (ед/мл)	21550	10882	9471	8527
Объем после концентрирования и замены буфера (мл)	10699	13578	12727	20500
Отношение количества единиц фермента/собранный фермент	0,87	0,96	1,32	1,4

Готовили ионообменную колонку с О сефарозой (ΡЬа^тас^а) (3 л смолы, высота 20 см, диаметр 14 см). Для определения рН, проводимости и анализа на эндотоксин были взяты образцы после промывки. Колонку уравновешивали 5 объемами 10 мМ Трис, 20 мМ №₂80₄, рН 7,5. На О колонку при скорости 100 см/час наносили сконцентрированную диафильтрованную среду. Колонку промывали 5 объемами 10мМ Трис, 20 мМ №₂80₄, рН 7,5 и 10 мМ ΗΕΡΕ8, 50 мМ №С1, рН 7,0. Белок элюировали 10 мМ ΗΕΡΕ8, 400 мМ №С1, рН 7,0 и фильтровали через 0,22-мкм фильтр в стерильную емкость.

Затем проводили гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе (ΡЬа^тас^а). Готовили колонку с фенилсефарозой (Ρ8) (9,1 л смолы, высота 29 см, диаметр 20 см). Колонку уравновешивали 5 объемами 5 мМ фосфата калия с 0,5 М сульфатом аммония, 0,1 мМ СаС1₂, рН 7,0. К элюированному, как описано выше, белку добавляли 2М раствор сульфата аммония, 1 М фосфат калия и 1 М СаС12 до конечных концентраций 5 мМ, 0,5 М и 0,1 мМ соответственно. Белок загружали на Ρ8 колонку при скорости 100 см/час. При скорости 100 см/час через колонку пропускали 5 мМ фосфат калия, 0,5 М сульфат аммония и 0,1 мМ СаС12, рН 7,0. Прошедший через колонку раствор пропускали через 0,22-мкм фильтр и собирали в стерильную емкость.

Затем очищенный на Ρ8 белок загружали на аминофенилборонатную колонку (Ρ^οΜеά^С8) (6,3 л смолы, высота 20 см, диаметр 20 см), которую предварительно уравновесили 5 объемами 5 мМ фосфата калия с 0,5 М сульфатом аммония. Белок пропускали через колонку со скоростью 100 см/ч и колонку промывали 5 мМ фосфатом калия с 0,5 М сульфатом аммония, рН 7,0. Затем колонку промывали 20 мМ бицином с 100 мМ №С1, рН 9,0, белок элюировали 50 мМ ΗΕΡΕ8, 100 мМ №С1 рН 6,9 и собирали через стерильный фильтр и в 20 л стерильную емкость. Элюат исследовали на наличие микрофлоры, определяли концентрацию белка и активность фермента.

Колонку с гидроксиапатитом (ΒίοΚπά) (1,6 л носителя, высота 10 см, диаметр 14 см) уравновешивали 5 мМ фосфатом калия с 100 мМ №С1, 0,1 мМ СаС1₂ рН 7,0. Для определения рН, проводимости и анализа на эндотоксин были взяты образцы после промывки. К очищенному на аминофенилборонатной смоле белку добавляли фосфат калия и СаС12 до конечной концентрации 5 мМ фосфата калия и 0,1 мМ СаС12, раствор наносили на колонку с гидроксиапатитом при скорости 100 см/ч. Колонку промывали 5 мМ фосфатом калия, рН 7,0 с 100 мМ №С1, 0,1 мМ СаС1₂, затем 10 мМ фосфатом калия, рН 7,0 с 100 мМ №С1, 0,1 мМ СаС1₂. Белок элюировали 70 мМ фосфатом калия с рН 7,0, элюат фильтровали через 0,22 мкм фильтр в 5 л стерильную емкость для хранения. Элюат исследовали на наличие микрофлоры, определяли концентрацию белка и активность фермента.

Очищенный на колонке с гидроксиапатитом белок затем пропускали через 20 нМ фильтр для удаления вирусов с помощью резервуара для нагнетания давления. Белок вносили в резервуар Όν20 для нагнетания давления и фильтровали (ΡοΠ ί’οΓροπιΙίοη) через υ1ίίροΓ Όν20 фильтр с 20 нм порами (Ρη11 ίΌΓροπιΙίοη) в стерильную 20-л емкость для хранения. Фильтрат исследовали на концентрацию белка, ферментативную активность, содержание олигосахаридов, проводили характеризацию моносахаридов и

- 60 026112 сиаловых кислот и связанных с процессом выделения и очистки примесей. Белок в фильтрате затем концентрировали до 1 мг/мл, используя систему тангенциальной проточной фильтрации (ТРР) δа^ίοсοη δ1^ ^айогшк) с пределом исключения 10 кД по молекулярной массе (М^СО). Фильтр подготавливали, промывая НΕРΕδ/солевым раствором (10 мМ НΕРΕδ, 130 мМ №С1, рН 7,0), и пермеат исследовали на рН и проводимость. После концентрирования раствор белка тестировали на концентрацию белка и ферментативную активность. Затем концентрированный белок перевели 6х в буфер 10 мМ НΕРΕδ, 130 мМ №С1, рН 7,0. Концентрированный белок пропускали через 0,22-мкм фильтр в 20-л стерильную емкость для хранения. Раствор белка исследовали на концентрацию белка, ферментативную активность, количество свободных сульфгидрильных групп, проводили характеризацию олигосахаридов и определяли осмолярность.

В табл. с 16 по 22 приведены данные, относящиеся к каждой из стадий очистки, описанных выше, для каждой партии клеток 3Ό35Μ.

Таблица 16. Данные по очистке белка на О сефарозе

Параметр	III 1.4(1406('	Н1А0410С	НиА0415С	Н11А042ОС
Нанесенный объем (мл)		13524	12832	20418
Отношение нанесенный объем/объем смолы	3,1	4,9	4,5	7,3
Объем колонки (мл)	2770	3840	2855	2880
Объем элюата (мл)	5108	5923	5759	6284
Конц, белка в элюате (мг/мл)	2,8		2,80	2385
Анализ активности в элюате (ед/мл)	24493	25583	18321	21052
Выход фермента (%)	65	107	87	76

Таблица 17. Данные по очистке белка на колонке с фенилсефарозой

Параметр	ΗΡΑ04ΐΙ6(^	НИА0410С	Н11А0415С	НиА0420С
Объем до добавления исходного раствора (мл)	5670	5015	5694	6251
Нанесенный объем (мл)	7599	6693	7531	8360
Объем колонки (мл)		9420	9340	9420
Отношение нанесенный объем/объем смолы	0,8	0,71	0382	0,89
Объем элюата (мл)	16144	18010	16960	17328
Конц, белка в элюате (мг/мл)	0,4	0333	0333	038
Анализ активности в элюате (ед/мл)	8805	5385	4472	7309
Выход белка (%)	41	40	36	37
Выход фермента (%)	102	88	82	96

Таблица 18. Данные по очистке белка на амино(	зенилборонатной колонке
Параметр	Н1,40406С	Н1А0410С	ТГОА0415С	Н1А0420С
Нанесенный объем (мл)	16136	17958	15931	17884
Отношение нанесенный объем/объем смолы	2399	ЗД5	3358	2398
Объем колонки (мл)	5400	5700	3500	3300
Объем элюата (мл)	17393	22084	20585	19143
Конц, белка в элюате (мг/мл)	0,0	ОЗОЗ	ОЗОЗ	0354
Конц. белка в фильтрованном элюате (мг/мл)	не определяли	0353	0,00	0,04
Анализ активности в элюате (ед/мл)	4050	2410	1523 “	~ 4721
Выход белка (%)	0	11 ......	11	12
Выход фермента (%)	не определяли	41	40	69

Таблица 19. Данные по очистке белка на гидроксиапатитной колонке

Параметр	ниА04обс	НиАОДЮС	ниА0415с	Н11А0420С
Объем до добавления исходного раствора (мл)	15343	20799	20540	19103
Отношение нанесенный объем/объем смолы	10,95	1338	14,19	12,81
Объем колонки (мл)	1500	1540	1452	1500
Нанесенный объем (мл)	15429	20917	20745	19213
Объем элюата (мл)	4100	2415	1935	2419
Конц, белка в элюате (мг/мл)	ηοΐ 1ез(е(1	034	0317	0323
Конц. белка в фильтрованном элюате (мг/мл)	Па	ΝΑ	0317	па
Анализ активности в элюате (ед/мл)	14051	29089	20424	29825
Выход белка (%)	Νοί 1ез1е<1	93	53	73
Выход фермента (%)	87	118	140	104

- 61 026112

Таблица 20. Данные по фильтрации на ΌΥ20

Параметр	нилошс	Н11А0410С	НиА0415С	НиА0420С
Начальный объем (мл)	4077	2233	1917	2419
Объем фильтрата (мл)	4602	3334	2963	3504
Конц, белка в фильтрате (мг/мл)	0,1	ΝΑ	0,09	ΝΑ
Конц. белка в фильтрованном элюате (мг/мл)	ΝΑ	0,15	0,09	0,16
Выход белка (%)	по! 1ез!е<1	93	82	101

Таблица 21. Окончательные данные по концентрации

Параметр	нилодобс	НиА0410С	Н11А0415С	Н11А0420С
Начальный объем (мл)	4575	3298	2963	3492
Объем концентрата (мл)	562	407	237	316
Конц, белка в концентрате (мг/мл)	0,9	1,24	1,16	1,73
Выход белка (%)	111	102	103	98

Таблица 22. Данные по замене бус	тера в окончательном препарате
Параметр	НПЛ0406С	нилодюс	НиА0415С	НиА0420С
Начальный объем (мл)	562	407	237	316
Конечный объем концентрата после замены буфера (мл)	594	516	310	554
Конц, белка в концентрате (мг/мл)	1,00	0,97	0,98	1,00
Конц. белка в фильтрованном концентрате (мг/мл)	0,95	0,92	0,95	1,02
Выход белка (%)	118	99	110	101

Очищенную и сконцентрированную растворимую гНиРН20 асептически перенесли в стерильные колбы на 5 и 1 мл. Раствор белка пропускали через 0,22-мкм фильтр к контролируемому оператором насосу, который использовали для заполнения колб, которое контролировали гравиметрически. Колбы были закрыты пробками и дополнительно завинчивающимися крышками. Закрытые колбы визуально проверяли на наличие посторонних частиц, а затем подписывали. Затем колбы мгновенно заморозили погружением в жидкий азот не более чем на 1 мин и хранили при <-15°С (-20±5°С).

С. Получение клеток Оеп2, продуцирующих растворимую человеческую РН20 (гНиРН20)

Клетки Оеп1 линии 3Э35М, описанные выше, адаптировали к более высоким уровням метотрексата и получали 2 поколение клонов (Оеп 2). Клетки 3Э35М из стабильных метотрексат-содержащих культур высевали в СО СНО среду, содержащую 4мМ О1и!аМАХ-1™ и 1,0 мкМ метотрексата. Клетки адаптировали к повышенному уровню метотрексата и пассировали их 9 раз в течение 46 дней при 37°С и 7% СО2 в увлажненном инкубаторе. Выросшую популяцию клеток клонировали методом предельных разведений в 96-луночных планшетах для культивирования ткани, содержащих среду с 2,0 мкМ метотрексата. Примерно через 4 недели клоны идентифицировали и клон 3Е10В был выбран для культивирования. 3Е10В клетки выращивали в среде СО СНО, содержащей 4 мМ О1и!аМАХ-1™ и 2,0 мкМ метотрексата в течение 20 пассажей. Из клеточной линии 3Е10В получили банк клеток, клетки заморозили и использовали для последующих исследований.

Культивирование клеточной линии продолжали, выращивая 3Е10В клетки в среде СО СНО, содержащей 4 мМ О1и!аМАХ-1™ и 4,0 мкМ метотрексата. После 12 пассажа клетки заморозили во флаконах, получив банк клеток для исследования (КСВ).

Один флакон из КСВ разморозили и культивировали в среде, содержащей 8,0 мкМ метотрексата. Через 5 дней концентрацию метотрексата в среде увеличили до 16,0 мкм, затем через 18 дней до 20,0 мкМ. Клетки после 8 пассажа в среде, содержащей 20,0 мкМ метотрексата, клонировали методом предельных разведений в 96-луночных планшетах для культивирования ткани, содержащих среду СО СНО с 4 мМ О1и!аМАХ-1™ и 20,0 мкМ метотрексата. Клоны идентифицировали через 5-6 недель, клон 2В2 был выбран для культивирования в среде, содержащей 20,0 мкМ метотрексата. После 11 пассажа клетки 2В2 заморозили во флаконах в виде банка клеток для исследования (КСВ).

Полученные 2В2 клетки являются дефектными по дигидрофолатредуктазе (ОНРК-) клетками СНО ΌΟ44, экспрессирующими растворимую рекомбинантную человеческую РН20 (гНиРН20). Растворимая РН20 присутствует в 2В2 клетках при количестве копий приблизительно 206 копий/клетку. Саузернблоттинг анализ расщепленной Зре1, ХЪа1 и ВатШ/Ншб III геномной ДНК клеток 2В2 с использованием специфичного к гНиРН20 зонда показал следующий профиль расщепления рестриктазами: при расщеплении ДНК ЗреI была выявлена одна крупная полоса гибридизации ~ 7,7 Кб и четыре минорных полосы гибридизации (~ 13,9, ~ 6,6, ~ 5,7 и ~ 4,6 Кб); при расщеплении ДНК XЪаI была выявлена одна крупная

- 62 026112 полоса гибридизации ~ 5,0 Кб и две минорных полосы гибридизации (~ 13,9 и ~ 6,5 Кб), при расщеплении ДНК ВатНРНшй III выявили одну крупную полосу гибридизации ~1,4 Кб. Анализ последовательности мРНК транскрипта показал, что полученная кДНК (ЪЕЦ ГО ΝΟ: 56) идентична исходной последовательности (ЬЕЦ ГО ΝΟ: 49) за исключением одной пары оснований в положении 1131, в котором наблюдался тимидин (Т) вместо ожидаемого цитозина (С). Это молчащая мутация, не влияющая на аминокислотную последовательность.

Ό. Получение растворимой гНиРН20 Сеи2 в 300-л биореакторе для культивирования клеток

Колбу с Н224-2В2 клетками разморозили и клетки растили в перемешиваемых на шейкере колбах, затем в 36 л вращающихся колбах в СГО-СНО среде Диуйгодеи, Саг1кЬай, Калифорния) с добавлением 20 мкМ метотрексата и С1и1аМАКС™-1 Диуйгодеи). Колбу с клетками разморозили при 37°С на водяной бане, к содержимому добавили среду и клетки центрифугировали. Клетки ресуспендировали в 125 мл колбе в 20 мл свежей среды при перемешивании, колбу помещали в инкубатор при 37°С, 7% СО₂. Клетки растили в объеме 40 мл в 125 мл встряхиваемой колбе. Когда плотность клеток превысила 1,5x10 клеток/мл, культуру растили в 125 мл вращающейся колбе в объеме100 мл. Колбу инкубировали при 37°С, 7% СО₂. Когда плотность клеток превысила 1,5х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 250 мл вращающейся колбе в объеме 200 мл, колбу инкубировали при 37°С, 7% СО2. Когда плотность клеток превысила 1,5 х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 1 л вращающейся колбе в объеме 800 мл и инкубировали при 37°С, 7% СО2. Когда плотность клеток превысила 1,5х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 6 л вращающейся колбе в объеме 5000 мл и инкубировали при 37°С, 7% СО2. Когда плотность клеток превысила 1,5х10⁶ клеток/мл, культуру растили в 36 л вращающейся колбе в объеме 32 л и инкубировали при 37°С, 7% СО2.

Реактор объемом 400 л стерилизовали и в него добавляли 230 мл СГО-СНО среды. Перед использованием реактор был проверен на загрязнение. Приблизительно 30 л клеток перенесли из 36 л вращающейся колбы в 400-л биореактор (Вгаии) при плотности посева 4,0х10⁵ жизнеспособных клеток/мл и общем объеме 260 л. Температуру установили на 37°С, рН 7,2; скорость вращения крыльчатки 40-55 об/мин; давление в емкости 3 фунта на квадратный дюйм; количество барботируемого воздуха 0,5-1,5 л/мин; подача воздуха 3 л/мин. Каждый день содержимое реактора исследовали на количество клеток, рН, проводили анализ среды, анализ продукции и устойчивости белка. В ходе культивирования также добавляли питательные вещества. Через 120 ч (день 5) добавили 10,4 л питательной среды # 1 (4х СГОСНО + 33 г/л глюкозы + 160 мл/л С1и1аМАХ-1™ + 83 мл/л Υеакΐо1аΐе + 33 мг/л гНи Инсулин). Через 168 ч (день 7) добавили 10,8 л питательной среды # 2 (2 х СГО-СНО + 33 г/л глюкозы + 80 мл/л С1и1аМАХ-1™ + 167 мл/л Υеакΐо1аΐе + 0,92 г/л бутирата натрия), температуру культивирования изменили на 36,5°С. Через 216 ч (день 9) добавили 10,8 л питательной среды # 3 (1 х СГО-СНО + 50 г/л глюкозы + 50 мл/л С1и1аМАХ-1™ + 250 мл/л Υеакΐо1аΐе + 1,80 г/л бутирата натрия), температуру культивирования изменили на 36°С. Через 264 ч (день 11) добавили 10,8 л питательной среды # 4 (1 х СГО-СНО + 33 г/л глюкозы + 33 мл/л С1и1аМАХ-1™ + 250 мл/л Υеакΐо1аΐе + 0,92 г/л бутират натрия), температуру культивирования изменили на 35,5°С. Добавление питательной среды резко повысило продукцию растворимой гНиРН20 на завершающей стадии получения. Клетки из реактора собирали на 14 или 15 день, или когда жизнеспособность клеток падала ниже 40%. Процесс приводил к получению растворимой гНиРН20 с ферментативной активностью 17000 ед./мл при максимальной плотности клеток 12 млн клеток/мл. При сборе клеток культуру исследовали на микоплазму, биологическое загрязнение, эндотоксин и вирусы ш уйго и ш У1уо, вирусные частицы обнаруживали просвечивающим электронным микроскопом (ПЭМ), а также исследовали ферментативную активность.

Культуру прокачивали перистальтическим насосом через четыре параллельно соединенных модуля системы фильтрации МППк1ак (Мййроге), каждый из которых содержал слой диатомовой земли размером 4-8 мкм и слой диатомовой земли размером 1,4-1,1 мкм, а затем целлюлозную мембрану, после чего жидкость проходила через вторую систему фильтрации Мййк1ак (Мййроге), содержащую слой диатомовой земли размером 0,4-0,11 мкм и слой диатомовой земли размером <0,1 мкм, а затем целлюлозную мембрану, затем жидкость проходила через последний 0,22-мкм фильтр и ее собирали в стерильную одноразовую гибкую емкость вместимостью 350 л. К собранной культуральной жидкости добавляли ЭДТА до 10 мМ и 10 мМ Трис до рН 7,5. Культуральную жидкость сконцентрировали 10 х с помощью устройства для проточной тангенциальной фильтрации (ТРР) с использованием четырех полиэфирсульфонных (РΕδ) фильтров δ^ίΓΟΗ^ ТРР 0аг1опоик) с пределом исключения по молекулярной массе 30 кДа а затем 10хзаменили буфер на 10 мМ Трис с 20мМ Иа^О₄, рН 7,5 и перенесли через 0,22-мкм фильтр в 50 л стерильную емкость для хранения.

В сконцентрированной диафильтрованной собранной жидкости инактивировали вирусы. До инактивации вирусов готовили 10% раствор Тритона Х-100 с 3% три(н-бутил)фосфатом (ТИВР). Сконцентрированную диафильтрованную собранную жидкость обрабатывали 1% Тритоном Х-100 с 0,3% ТИВР в течение 1 ч в 36 л стеклянном реакционном сосуде непосредственно перед очисткой на О колонке.

Е. Очистка растворимой гНиРН20 из Сеи2

Была подготовлена колонка с ионообменным носителем О сефарозой (Рйагташа) (9 л смолы, высота 29 см, диаметр 20 см). Для определения рН, проводимости и анализа на эндотоксин были взяты образ- 63 026112 цы после промывания колонки. Колонку уравновешивали 5 объемами 10 мМ Трис, 20 мМ №₂8О₄, рН 7,5. На О колонку при скорости 100 см/ч наносили сконцентрированную диафильтрованную среду после инактивации вирусов. Колонку промывали 5 объемами 10 мМ Трис, 20 мМ Ν;·ι₂δΟ₊ рН 7,5 и 10 мМ НЕРЕδ, 50 мМ №С1, рН 7,0. Белок элюировали 10 мМ НЕРЕδ, 400 мМ №С1, рН 7,0 и фильтровали через 0,22 мкм фильтр в стерильную емкость. Элюат исследовали на наличие микрофлоры, определяли концентрацию белка и гиалуронидазную активность. В начале и в конце процесса измеряли поглощение ^А280.

Затем проводили гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе (Рйагтааа). Готовили колонку с фенилсефарозой (Р8) (19-21 л смолы, высота 29 см, диаметр 30 см). Для определения рН, проводимости и анализа на эндотоксин были взяты образцы после промывания колонки. Колонку уравновешивали 5 объемами 5 мМ фосфата калия с 0,5 М сульфатом аммония, 0,1 мМ СаС1₂, рН 7,0. К элюированному с О сефарозы белку добавляли 2М раствор сульфата аммония, 1 М фосфат калия и 1 М СаС12 до конечных концентраций 5 мМ, 0,5 М и 0,1 мМ соответственно. Белок загружали на Рδ колонку при скорости 100 см/ч и прошедший через колонку раствор собирали. Колонку промывали при скорости 100 см/ч 5 мМ фосфатом калия с 0,5 М сульфатом аммония и 0,1 мМ СаС1₂, рН 7,0, прошедший через колонку раствор собирали. Объединенный прошедший через колонку раствор пропускали через 0,22-мкм фильтр и собирали в стерильную емкость. Собранный раствор исследовали на наличие микрофлоры, определяли концентрацию белка и энзиматическую активность.

Готовили колонку с аминофенилборонатной смолой (РгоМейс). Для определения рН, проводимости и анализа на эндотоксин были взяты образцы после промывания колонки. Колонку уравновешивали 5 объемами 5 мМ фосфата калия с 0,5 М сульфатом аммония. Затем прошедшую через Рδ жидкость, содержащую очищенный белок, загружали на аминофенилборонатную колонку со скоростью 100 см/час. Колонку промывали 5 мМ фосфатом калия с 0,5 М сульфатом аммония, рН 7,0. Колонку промывали 20 мМ бицином с 0,5 М сульфатом аммония, рН 9,0. Колонку промывали 20 мМ бицином с 100 мМ хлоридом натрия, рН 9,0. Белок элюировали 50 мМ НЕРЕδ с 100 мМ №С1, рН 6,9, элюат пропускали через стерильный фильтр в стерильную емкость. Элюат исследовали на наличие микрофлоры, определяли концентрацию белка и энзиматическую активность.

Готовили колонку с гидроксиапатитом (Ыо-Каб). Для определения рН, проводимости и анализа на эндотоксин были взяты образцы после промывания колонки. Колонку уравновешивали 5 мМ фосфатом калия с 100 мМ №С1, 0,1 мМ СаС1₂, рН 7,0. К очищенному на аминофенилборонатной смоле раствору белка добавляли фосфат калия до конечной концентрации 5 мМ и СаС12 до конечной концентрации 0,1 мМ, раствор наносили на колонку при скорости 100 см/ч. Колонку промывали 5 мМ фосфатом калия, рН 7 с 100 мМ №С1, 0,1 мМ СаС1₂. Затем колонку промывали 10 мМ фосфатом калия, рН 7 с 100 мМ №С1, 0,1 мМ СаС12. Белок элюировали 70 мМ фосфатом калия, рН 7,0, элюат пропускали через 0,22-мкм стерильный фильтр в стерильную емкость. Элюат исследовали на наличие микрофлоры, определяли концентрацию белка и энзиматическую активность.

Очищенный на колонке с гидроксиапатитом белок затем пропускали через фильтр для удаления вирусов. Сначала проводили подготовку стерильного фильтра ^гокай (§а^ιο^^ик). промывая его 2 л 70 мМ фосфата калия, рН 7,0. Перед использованием профильтрованный буфер исследовали на рН и электропроводность. Очищенный на колонке с гидроксиапатитом раствор белка затем прокачивали с помощью перистальтического насоса через 20 нМ фильтр для удаления вирусов. Профильтрованный раствор белка в 70 мМ фосфате калия, рН 7,0, пропускали через 0,22-мкм фильтр в стерильную емкость. Фильтрат исследовали на концентрацию белка, ферментативную активность, содержание олигосахаридов, проводили характеризацию моносахаридов и сиаловых кислот. Образец также тестировали на связанные с процессом выделения и очистки примеси.

Белок в фильтрате затем концентрировали до 10 мг/мл, используя систему тангенциальной проточной фильтрации (ТРР) δа^ιοсοη 5Псе (5аг1ог^1ик) с пределом исключения 10 кД по молекулярной массе ^ν^). Фильтр подготавливали, промывая его 10 мМ гистидином с 130 мМ №С1, рН 6,0, пермеат исследовали на рН и проводимость. После концентрирования раствор белка тестировали на концентрацию белка и ферментативную активность. Затем концентрированный белок перевели 6х в 10 мМ гистидиновый буфер с 130 мМ №С1, рН 6,0. Концентрированный белок пропускали через 0,22-мкм фильтр в 20 л стерильную емкость для хранения. Раствор белка исследовали на концентрацию белка, ферментативную активность, количество свободных сульфгидрильных групп, проводили характеризацию олигосахаридов и определяли осмолярность.

Стерильной профильтрованный раствор белка асептически переносили порциями по 20 мл в 30-мл стерильные тефлоновые колбы (№1депе). Затем колбы мгновенно замораживали и хранили при -20 ± 5°С.

Р. Сравнение данных о продукции и очистке растворимой гНиРН20 из Оеп1 и растворимой гНиРН20 из Оеп2

Продукция и очистка растворимой гНиРН20 из Оеп2 в 300-л биореакторе для культивирования клеток характеризуется некоторыми изменениями в технологии по сравнению с продукцией и очисткой рас- 64 026112 творимой гНиРН20 из Оеп1 в 100 л биореакторе для культивирования клеток. В табл. 23 приведены примеры различий в технологии (в дополнение к обычному изменению масштаба).

Таблица 23. Сравнение методов Оеп1 и Оеп2

Различия процесса	Растворимая гНиРН20 Сеп1	растворимая гНиРН20 Сеп2
Линия клеток	ЗЦ35М	2В2
Используемая для наращивания клеток среда	Содержит 0,10 мкМ метотрексат (0,045 мг/л)	Содержит 20 мкМ метотрексат (9 мг/л)
Среда для дальнейшего культивирования в объеме 6 л	Содержит 0,10 мкМ метотрексат	Не содержит метотрексат
36 л вращающаяся колба	Без дополнительных приспособлений	Оснащена устройствами для определения и контроля рН, уровня растворенного кислорода, барботирования и скорости подачи воздуха.
	Рабочий объем 20 л.	Рабочий объем 32 л
Конечный рабочий объем в биореакторе	Приблизительно 100 л в 125 л биореакторе (начальный объем культуры + 65 л)	Приблизительно 300 л в 400 л биореакторе (начальный объем культуры + 260 л)
Культуральная среда в биореакторе	без рекомбинантного человеческого инсулина	5,0 мг/л рекомбинантного человеческого инсулина
Объем питательной среды	Составляла 4% от объема клеточной культуры в биореакторе, т.е. 3,4,3,5 апс! 3,7 л, что приводило к желаемому объему в биореакторе ^92 л.	Составляла 4% от объема клеточной культуры в биореакторе, т.е. ίθ,4, 10,8, 11,2 и 11,7 л, что приводило к желаемому объему в биореакторе
Питательная среда	Питательная среда №1: СО СНО + 50 г/л глюкозы + 8 мМ О1ЩаМАХ™-1 Питательная среда №2 (СО СНО + 50 г/л глюкозы + 8 мМ СИйаМАХ + 1,1 г/л $о<1шт Ви1уга1е Питательная среда М3: СО СНО + 50 г/л глюкозы + 8 мМ О1и(аМАХ +1,1 г/л бутират натрия	Питательная среда №1: 4* СО СНО + 33 г/л глюкозы + 32 мМ О1и(атах + 16,6 г/л Уеа5Тс1аге + 33 мг/л рекомбинантного человеческого инсулина Питательная среда №2:2* СО СНО + 33 г/л глюкозы + 16 мМ ОИагпах + 33,4 г/л Уеа5(о1а(е + 0,92 г/л бутират натрия Питательная среда №3: 1 х СО СНО + 50 г/л глюкозы + 10 мМ С1и(атах + 50 г/л Уеа5(о1а1е + 1,80 г/л бутирата натрия
		Питательная среда #4:1 х СО СНО + 33 г/л глюкозы + 6.6 мМ ОЫатах + 50 г/л Уеа51о1а1е + 0,92 г/л бутирата натрия
Фильтрация клеточной культуры из биореактора	4 полиэфирсульфонных фильтра (8,0 мкМ, 0,65 мкМ, 0,22 мкМ и 0,22 мкМ) последовательно	1 стадия - четыре модуля параллельно, каждый со слоем диатомовой земли размером 4-8 мкМ слоем диатомовой земли размером 1,4-1,1 мкМ, затем с целлюлозной мембраной. 2 стадия — один модуль со слоем диатомовой земли размером 0,40,11 мкм и со слоем диатомовой земли размером <0,1 мкм, затем с целлюлозной мембраной, 3 стадия - 0,22 мкМ полиэфирсульфонный фильтр
		300 л емкость для хранения
	100 л емкость для хранения	К собранной клеточной культуре добавляли ЭДТА до 10 мМ, 10 мМ Трис до рН 7,5.
Концентрирование и замена буфера до хроматографии	Концентрат 2 ТРР с МйНроге 8р1га1 Фильтр ЗОКМХУСО полиэфирсульфонный	Концентрировали с использованием фильтра $аЛогшз ЗаПозйсе ТРГЗОК М\УСО
	Замена буфера для 6* концентрата на 10 мМ НЕРЕ8 с 25мМ НаС1, рН 7,0	Замена буфера для 10« концентрата на 10 мМ Тп5 с 20 мМ Йа;5О.|, рН 7,5
	20 л стерильная емкость для хранения	50 л стерильная емкость для хранения
Инактивация вирусов до хроматографии	Не проводили	Инактивацию вирусов проводили добавлением 1% ТритонаХ-100 с 0,3% трибутилфосфата, рН 7,5,
1 стадия очистки (ζ) сефароза)	Не измеряли поглощение	Поглощение А280 измеряли в начале и в конце процесса
Фильтрация от вирусов после хроматографии	Фильтр Ра1) ОУ-20 (20 нм)	Фильтр 5аг4опиз Угоозап (20 нм)
Концентрирование и замена буфера после хроматографии	Буфер НЕРЕЗ/солевой раствор рН 7,0 Белок концентрировали до 1 мг/мл	гистидин/солевой раствор, рН 6,0 Белок концентрировали до 10 мг/мл

- 65 026112

Пример 4

Определение активности растворимой гиалуронидазы гНиРН20 с помощью анализа микромутности

Гиалуронидазную активность растворимой гНиРН20 в образцах, таких как клеточные культуры, полученные в процессе очистки фракции и очищенные растворы определяли с помощью анализа мутности, который основан на образовании нерастворимого осадка при связывании гиалуроновой кислоты с сывороточным альбумином. Активность измеряли, инкубируя растворимую гНиРН20 с гиалуронатом натрия (гиалуроновой кислотой) в течение определенного периода времени (10 мин), а затем осаждая нерасщепленный гиалуронат натрия добавлением подкисленного сывороточного альбумина. Мутность полученного образца измеряли при 640 нм после 30-минутной инкубации. Снижение мутности в результате ферментативного расщепления гиалуроната натрия являлось мерой гиалуронидазной активности растворимой гНиРН20. В методе использовали калибровочную кривую, полученную с использованием разведений стандарта сравнения растворимой гНиРН20, измерения активности образца проводили относительно этой калибровочной кривой.

Разведения образца готовили в растворе для разведения ферментов. Раствор для разведения ферментов готовили растворением 33,0 ± 0,05 мг гидролизованного желатина в 25,0 мл 50 мМ реакционного буфера Р1РЕ8 (140 мМ №С1, 50-мМ Р1РЕ8, рН 5,5) и 25,0 мл 8^Р1, затем в растворе разводили 0,2 мл 25% раствора человеческого сывороточного альбумина и смесь вортексировали в течение 30 с. Раствор готовили не ранее чем за 2 ч до использования и хранили на льду. Образцы разводили раствором для разведения ферментов до приблизительно 1-2 ед./мл. Как правило, максимальное шаговое разведение не превышало 1:100 и начальный объем образца для первого разведения составлял не менее 20 мкл. Минимальные объемы образцов, необходимые для проведения анализа, составляли: образцы, полученные в ходе выделения, и фракции РРЬС (жидкостная хроматография быстрого разрешения) - 80 мкл; культуральные супернатанты - 1 мл; концентрированный материал - 80 мкл; очищенный образец или образец на заключительном этапе подготовки - 80 мкл. Разведения готовили в трех повторностях в 96-луночных планшетах с низким связыванием белка, 30 мкл каждого разведения переносили в планшеты ОрШих с черным/прозрачным дном (ВО Вюкаепсек).

Для получения стандартной кривой в растворе для разведения ферментов готовили разведения известной растворимой гНиРН20 с концентрацией 2,5 ед./мл, которые добавили в планшет ОрШих в трех повторностях. Использовали разведения 0 ед./мл, 0,25 ед./мл, 0,5 ед./мл, 1,0 ед./мл, 1,5 ед./мл, 2,0 ед./мл, и 2,5 ед./мл. В качестве отрицательного контроля в планшете предусмотрели лунки без реагента, которые содержали только 60 мкл раствора для разведения ферментов. Затем планшет закрывали и нагревали в течение 5 мин при 37°С. Крышку снимали и содержимое планшета перемешивали на шейкере в течение 10 с. После перемешивания планшет снова нагревали и в устройство для внесения жидкостей МИЬТГОКОР 384 Шсций НапйЬпд Эеу1се вносили теплый 0,25 мг/мл раствор гиалуроната натрия (готовят растворением 100 мг гиалуроната натрия (ЬгГеСоге Вютейюа1) в 20,0 мл 8\УР1. Раствор перемешивали, осторожно вращая и/или покачивая емкость при температуре 2-8°С в течение 2-4 ч или до полного растворения). Реакционный планшет переносили в устройство МИЬТГОКОР 384 и реакцию начинали, нажимая клавишу Старт, что приводило к добавлению 30 мкл раствора гиалуроната натрия в каждую лунку. Планшет вынимали из МИЬТГОКОР 384 и встряхивали в течение 10 с, а затем нагревали с закрытой крышкой. Планшет инкубировали при 37°С в течение 10 мин.

Реакцию останавливали с помощью МИЬТГОКОР 384, в который загрузили сывороточный рабочий раствор и увеличили вносимый объем до 240 мкл. (25 мл исходного сывороточного раствора [1 объем лошадиной сыворотки (81дта) разбавляли 9 объемами 500 мМ ацетатного буферного раствора и рН доводили до 3,1 соляной кислотой] добавляли к 75 мл 500 мМ ацетатного буферного раствора). Планшет вынимали из нагревающего блока и помещали в МИЬТГОКОР 384, который добавлял по 240 мкл сывороточного рабочего раствора в лунку. Планшет вынимали и встряхивали в течение 10 секунд. Через 15 мин мутность образцов измеряли при 640 нм, гиалуронидазную активности (в ед./мл) каждого образца определяли сравнением со стандартной кривой.

Удельную активность (ед./мг) рассчитывали делением гиалуронидазной активности (ед./мл) на концентрацию белка (мг/мл).

Пример 5. Влияние хлорида натрия на стабильность гНиРН20

Использовали раствор гНиРН20 10 мг/мл при рН 6,5 в гистидин/НС1 и 130 мМ хлорид натрия (ΝγιΟ'Ί). Как показано в табл. 24, было получено в общей сложности 6 различных препаратов, содержащих следующие компоненты: 25 мМ Трис, рН 7,3, 100 пг/мл гНиРН20, 0,01% Твин 80 и №С1 (0, 50, 100, 150, 200 или 250 мМ). Растворы перенесли в 2-мл стеклянные флаконы с резиновыми пробками и запечатали алюминиевыми крышками. Один набор флаконов хранили при 40°С в течение четырех дней, а другой набор хранили в холодильнике при температуре 2-8°С.

- 66 026112

Таблица 24. Композиция гНиРН20 с №С.’1

После 4 дней хранения каждую из композиций, указанных в табл. 24 тестировали на ферментативную гиалуронидазную активность с применением анализа микромутности, описанного в Примере 4. Для оценки уровня агрегатов использовали эксклюзионную хроматографию (8ЕС) при следующих условиях: 1х РВ8, Тозо Вю8аепсе С2000 8^ХЬ колонка, скорость 1 мл/мин.

В табл. 25 показаны результаты исследования, в том числе активность гиалуронидазы (ед./мл), % площади основного пика (процент гНиРН20, которая содержится в основном пике) и % площади пика агрегатов (процент гНиРН20, которая содержится в пике агрегатов) для каждой композиции. Результаты показывают, что стабильность гНиРН20 при инкубации при 40°С зависит от концентрации №С1: увеличение концентрации №С1 привело к увеличению ферментативной активности гНиРН20. Образцы, которые хранили при 2-8°С, сохраняли схожий уровень ферментативной активности гНиРН20 на протяжении всего исследования независимо от состава. В отсутствие №С1 при повышенных температурах (40°С) вся ферментативная активность гНиРН20 была потеряна.

Результаты, приведенные в табл.25, также показывают влияние концентрации №С.'1 на уровень агрегации гНиРН20. Уровень агрегации увеличивается с уменьшением концентрации №С1 в образцах, которые хранили при температуре 40°С. Для образцов, которые хранили при 2-8°С существенных изменений не наблюдалось.

Таким образом, результаты показывают, что в диапазоне исследованных концентраций №С1 (0-250 нМ) существует прямая связь между концентрацией №С1 и повышением стабильности гНиРН20, из чего следует, что для повышения стабильности гНиРН20 при повышенной температуре концентрацию №С1 необходимо поддерживать как можно выше в пределах ограничений по растворимости и тоничности.

Таблица 25. Ферментативная активность и результаты 8ЕС для образцов, хранившихся в течение 4 дней при 40 и 28°С

	Ферментативная активность	Главный пик, %	Пик агрегатов, %
Композиция	2-8°С	40 °С	2-8 °С	40 °С	2-8 °С	40 °С
0 мМ ШС1	10430	<ΙΌϋ	99,40	0,00	0,60	100,00
50мМЧаС1	12370	3070	99,34	22,05	0,66	77,95
100мМйаС1	12580	9930	99,47	72,81	0,53	27,19
150мМИаС]	12750	11180	99,48	88,16	0,52	11,84
200мМ№С1	13660	13340	99,64	96,22	0,36	3,78
250мМЧаС1	11370	11090	100,00	98,05	0,00	1,95

Пример 6. Стабильность совместных композиций гНиРН20 и 1д

А. Стабильность совместных композиций 10% 1д или 20% 1д с гНиРН20

Состав композиции гНиРН20 был следующим: 1 мл содержал 1048071 единиц рекомбинантный человеческий гиалуронидазы из партии НИВ0702СА (получен с применением Сеп2, как описано в примере 3) в 10 мМ гистидине и 130 мМ хлориде натрия (№С1) при рН 6,0. До смешивания с иммуноглобулином гНиРН20 разбавляли до 100 000 ед./мл, используя 10 мМ гистидин +130 мМ №С1, рН 6,0. Для этого 200 мкл исходного раствора гНиРН20 разводят 1896 мкл гистидин/ШО буфера, рН 6,0.

Предварительно разбавленную гНиРН20 добавляли к различным композициям 1д в 0,25 М глицине при рН от 4,4 до 4,9 с получением окончательной концентрации в растворе 100 ед./мл или 300 ед./мл. Использовали одну из трех 10% партий 1д, полученных при крупномасштабном выделении (ЬЕ12Н020, ЬЕ12НО62 и ЬЕ12Н173), или одну из трех доклинических партий 20% 1д (8^0107Ν^ 8С00207NС и 8Ο)0307Ν^. как описано в табл. 26. Растворы фильтровали через 0,2 мкм фильтр и переносили порциями по 1 мл в стерильные 5 мл стеклянные флаконы. Ампулы хранили при температуре 2-8°С или при 2832°С. Таким образом, полученные совместные композиции гНиРН20 и 1д были получены в 0,25 М глицине при рН от 4,4 до 4,9.

- 67 026112

Таблица 26. Совместные композиции гНиРН20 и 10% ί§ или 20% ί§

Описание образца	Количество 10% 1С или 20% 1С	Количество тНиРН20, разбавленной до 100000 ЕД/мл
10% Ю	50,00 мл	0
10% 10+100 ЕД/мл гНиРН20	49,95 мл	50 мкл
10% ΙΟ + 300 ЕД/мл гНиРН20	49,85 мл	150 мкл
20% ΙΟ	50,00 мл	0
20% 10+100 ЕД/мл гНиРН20	49,95 мл	50 мкл
20% 10 + 300 ЕД/мл гНиРН20	49,85 мл	150 мкл

После 0 (начало), 1, 3, 6, 12, 24 и 36 недель (только при 2-8°С) хранения один образец каждой из 6 композиции, указанных в табл.26, из каждой камеры для хранения (2-8°С и 28-32°С) изымали и анализировали на гиалуронидазную активность с применением анализа микромутности, описанного в пример 4. Для оценки воздействия на Ц через 0 (начало) и 6 месяцев хранения с помощью высокопроизводительной эксклюзионной хроматографии (НР^ЕС) на ΤδΚ О 3000 δν 600 х 7,5 мм колонке (ТокоЬ Вюкаепсе) в содержащей ДМСО буферной системе (Ко1апсЬ и др. (2006) ТгапкГикюп, 46:21959-1977) в композиции, содержащей 20% ί§, было исследовано распределение молекулярного размера ί§.

В табл. 27 приведена гиалуронидазная активность (ед./мл) в 7 временных точках (0, 1, 3, 6, 12, 24 и 36 недель) для каждой совместной композиции при температуре хранения 2-8°С. В табл. 28 приведена гиалуронидазная активность (ед./мл) в 6 временных точках (0, 1, 3, 6, 12 и 24 недели) для каждой совместной композиции при температуре хранения 28-32°С. Значительная устойчивая потеря гиалуронидазной активности наблюдалась для 10 и 20% совместных композиций с ί§, которые хранили при 28-32°С в течение 24 недель, что указывает на нестабильность гНиРН20. Совместные композиции 10% ί§ были стабильны в течение 9 месяцев хранения при 2-8°С, в то время как активность гНиРН20 несколько снизилась в 20% ί§ совместных композициях. Распределение молекулярного размера ί§ в композиции, содержащей 20% ί§, было неизменным при обеих температурах после 6 месяцев хранения (табл.29 и 30).

Таблица 27. Гиалуронидазная активность (ед./мл) совместных композиций после хранения при температуре 2-8°С

Образец	Недели
0 (начало)	1	3	6	12	24	36
ЕЕ12Н020+ 100 ЕД/мл	99,2	95,4	97,3	101	93	92	98
1Е12Н0201 300 ЕД/мл	298,5	321,7	285,9	299	283	271	291
БЕ12Н062+ 100 ЕД/мл	108,5	97,5	99,6	103	99	92	102
ЬЕ12Н062+ 300 ЕД/мл	325	306,8	297,9	302	273	279	300
ЬЕ12Н173+100 ЕД/мл	103,1	95,9	97,3	107	98	99	106
ЬЕ12Н173+ 300 ЕД/мл	295,0	291,2	281,8	293	282	296	292
ЗС00107№3+ 100 ЕД/мл	94,0	97,8	81,4	85	87	78	66
8000107ΝΟ+ 300 ЕД/мл	284,3	280,2	264,0	261	245	223	210
ЗС002071ЯО+ 100 ЕД/мл	99,7	93,1	91,0	86	83	84	69
ЗС00207ЫО+ 300 ЕД/мл	286	277	266,2	244	263	227	197
8(200307140+ 100 ЕД/мл	92,8	95,0	82,7	87	83	82	68
8С003071ЧО+ 300 ЕД/мл	254,3	281,4	274,3	245	247	230	256

Таблица 28. Гиалуронидазная активность (ед./мл) совместных композиций после хранения при 28-32°С

Образец	Недели
0(начало)	1	3	6	12	24
ЬЕ12Н020+ 100 ЕД/мл	99,2	84,9	59,6	36	22	5
ЬЕ12Н020+ 300 ЕД/мл	298,5	259,3	185,4	104	57	19
ЬЕ12Н062+ 100 ЕД/мл	108,5	88,2	60,1	43	29	10
1Έ12Η062+ 300 ЕД/мл	325	266,2	185,6	129	76	28
ΙΈ12Η173+ 100 ЕД/мл	103,1	70,5	39,6	24	13	1
ЬЕ12Н173+300 ЕД/мл	295,0	210,1	122,0	60	31	9
8<300107ΝΟ+ 100 ЕД/мл	94,0	83,1	57,4	43	49	32
8С001071ЧО+ 300 ЕД/мл	284,3	242,2	182,0	124	148	96
8000207ΝΟ+ 100 ЕД/мл	99,7	84,5	61,1	46	51	35
8000207ΝΟ+ 300 ЕД/мл	286	251	198,1	131	145	106
8€00307ΝΟ+ 100 ЕД/мл	92,8	82,7	67,9	48	52	34
8С00307140+ 300 ЕД/мл	254,3	253,6	209,7	140	157	106

- 68 026112

Таблица 29. Распределение молекулярного веса 1д при хранении совместной композиции 20% 1д с гНиРН20 при 2-8°С

Образец	0(начало)	6 месяцев
>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа	>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа
5СО01О7МС	0,67	'12,56“'	86,50	0,27	0,70	13,50	85,50	0,30
5С00107]ЧС +100 ЕД/мл гНиРН20	0,62	12,39	86,75	0,24	0,70	13,59	85,43	0,28
8€00107Ν€ + 300 ЕД/мл гНиРто	0,65	12,38	86,70	0,26	0,69	13,80	85,19	0,32
8С00207ΝΟ	0,73	П?25“	' 8576 “	0,Т6	0,86	“14,52	'84,34'	0,28 '
5С0О2О7МС +100 ЕД/мл гНиРН20	0,75	13,22	85,74	0,29	0,86	14,61	84,21	0,32
8С002071ЧС + 300 ЕД/мл гНиРНЗО	0,77	13,39	85,63	0,21	0,83	14,57	84,30	0,30
8С00307ИС	0,93	11,76	87,06	0,25	1,01	12,78	85,96	0,25
5С00307Г<С +100 ЕД/мл гНиРН20	0,96	11,91	86,94	0,20	ЦЙ	13,04	85,62	0,31
8С00307Г4С + 300 ЕД/мл гНиРНЗО	0,91	12,00	86,86	0,23	0,99	12,88	85,85	0,27

Таблица 30. Распределение молекулярного веса 1д при хранении совместной композиции 20% 1д с гНиРН20 при 28-32°С

Образец	0 (начало)	6 месяцев
>450 кДа	—350 кДа	-160 кДа	<60 кДа	>450 кДа	—350 кДа	-160 кДа	<60 кДа
5С001О71\ГС	0,67	12,56	86,50	0,27	0,50	12,53	85,94	1,02
8С00107МС +100 ЕД/мл гНиРН20	0,62	12,39	86,75	0,24	0,47	12,41	86,10	1,02
8€00107Ν€ + 300 ЕД/мл гНиРН20	0,65	12,38	86,70	0,26	0,52	12,41	85,97	1,09
8С00207МС	0,73	13,25	85,76	0,26	0,44	13,21	85,42	0,94
$С0О207ГЧС + 100 ЕД/мл гНиРН20	0,75	13,22	85,74	0,29	0,42	13,15	85,52	0,91
8€00207ΝΟ + 300 ЕД/мл гНиРН20	0,77	13,39	85,63	0,21	0,47	13,01	85,62	0,90
5С0030715С	0,93	11,76	87,06	0,25	0,47	11,91	86,78	0,84
5€ΟΟ307ΝΟ + 100 ЕД/мл гНиРН20	0,96	11,91	86,94	0,20	0,50	11,85	86,78	0,87
8С003071ЧС + 300 ЕД/мл гНиРН20	0,91	12,00	86,86	0,23	0,40	11,50	87,21	0,89

В. Стабильность совместных композиций 10% 1д с гНиРН20 и хлоридом натрия (0-150 мМ)

Для улучшения стабильности гНиРН20 в совместных композициях было исследовано влияние хлорида натрия (№С1). Совместную композицию 300 ед./мл гНиРН20 (образец НиВ0702СА, получен с помощью Сеп2, как описано в примере 3) и 10% 1д (образец ЬЕ12Р047) готовили, как описано в примере 7А выше, с добавление №)С1 в 4 различных концентрациях (0, 50, 100 и 150 мМ). Совместные композиции хранили при 2-8°С или при 28-32°С. Таким образом, полученные совместные композиции гНиРН20 и 1д были приготовлены в 0,25 М глицине при рН 4,6-5,1 (измеряли в разбавленном растворе) в присутствии различных количеств №С1.

После 0 (начало), 1, 3, 6, 12, 18 и 24 недель хранения один образец каждой совместной композиции (с концентрацией №)С1 0, 50, 100 и 150 мМ) из каждой камеры для хранения (2-8°С и 28-32°С) изымали и анализировали на гиалуронидазную активность с применением анализа микромутности, описанного в пример 4. Для оценки агрегации 1д с помощью высокопроизводительной эксклюзионной хроматографии (НР^ЕС) на ТδК С 3000 δν 600 х 7,5 мм колонке (ТокоП Вюкаепсе) в содержащей ДМСО буферной системе (Ко1апсП и др. (2006) ТгапкГикюп, 46:21959-1977) было исследовано распределение молекулярного размера 1д.

В табл. 31 и 32 показана гиалуронидазная активность (ед./мл) в 7 временных точках (0, 1, 3, 6, 12, 18 и 24 недели) для каждой совместной композиции. Результаты показывают, что стабильность совместной композиции гНиРН20 с 10% 1д в присутствии 50, 100 или 150 мМ №)С1 оставалась неизменной в течение 24 недель хранения при 2-8°С, в то время как стабильность гНиРН20 улучшилась для образцов, хранящихся при 28-32°С. Гиалуронидазная активность совместных композиций с концентрацией №)С1 0 мМ при хранении при температуре 28-32°С резко снизилась.

Табл. 33 и 34 показывают, что №)С1 незначительно увеличивает димеризацию 1д (~ 350 кДа) при обеих температурах хранения и агрегацию 1д (> 450 кДа) при 28-32°С, при этом все значения остаются в пределах технических требований к Мδ^ (>90% мономер/димер, <5% агрегатов, <5% фрагментации)

- 69 026112 после 6 месяцев хранения.

Несмотря на негативное влияние добавления №·ιί'.Ί на антикомплементную активность (АСА) (ее увеличение) композиции Ιβ при хранении при 28-32°С, АСА титр является необходимым параметром для внутривенного ^У) введения и не имеет значения для подкожного введения совместной композиции.

Таблица 31. Гиалуронидазная активность (ед./мл) 10% Iβ/^НиΡН20 совместной композиции с №·ιί'.Ί после хранения при температуре 2-8°С

Концентрация соли	Недели
0 (начало!	1	2	3	6	12	18	24
0 мМ 1ЧаС1	276	288	269	289	317	264	276	274
50 мМ	292	286	296	306	320	287	276	295
100 мМ	285	295	273	315	319	287	281	288
150 мМ	294	280	301	305	327	294	277	298

Таблица 32. Гиалуронидазная активность (ед./мл) 10% Iβ/^НиΡН20 совместной композиции с №С1 после хранения при 28-32°С

Концентрация СОЛИ	Недели
0 /_____ .4	1	2	3	6	12	18	24
0 мМ МаС1	276	232	237	216	201	121	109	81
50 мМ	292	288	280	301	302	247	225	223
100 мМ	285	286	280	292	315	277	253	258
150 мМ	294	314	272	298	323	221	253	276

Таблица 33. Распределение молекулярного размера Ιβ в 10% Iβ/^НиΡН20 совместной композиции с №·ιί'.Ί после хранения при температуре 2-8°С

Образец	0 (начало)	6 месяцев
>450 кДа	-350 кДа	Ί60 кДа	<60 кДа	>450 кДа	'350 кДа	Ί60 кДа	<60 кДа
0 мМ МаСГ	0,16	8,21	91,01	0,61	0,16	11,29	87,98	0,58
50 мМ 1ЧаС1	0,17	8,99	90,24	0,60	0,22	12,54	86,62	0,62
100 мМ ЯаС1	0,19	9,03	90,13	0,64	0,23	12,97	86,17	0,63
150 мМ ИаС1	0,19	9,08	90,13	0,61	0,24	12,93	86,30	0,53

Таблица 34. Распределение молекулярного размера Ιβ в 10% Iβ/^НиΡН20 совместной композиции с №-1С1 после хранения при 28-32°С

Образец	0(начало)	6 месяцев
>450 кДа	~350 кДа	~160 кДа	<60 кДа	>450 кДа	~350 кДа	-160 кДа	<60 кДа
0 мМ 1ЧаС1	0,16	8,21	91,01	0,61	0,35	9,37	88,77	1,51
50мМЖС1	0,17	8,99	90,24	0,60	0,75	10,83	86,85	1,57
100 мМ ХаС1	0,19	9,03	90,13	0,64	0,87	11,20	86,38	1,55
150 мМ 1ЧаС|	0,19	9,08	90,13	0,61	1,02	11,15	86,18	1,66

С. Стабильность совместных композиций 10% Ιβ или 20% Ιβ с гНиГН20 и хлоридом натрия (0-50 мМ)

Было исследовано влияние хлорида натрия на стабильность совместных композиций 10% Ιβ или 20% Ιβ с гНиГН20 при хранении при 28-32°С. Совместные композиции 300 ед./мл гНиГН20 (образец НИВ0702СА, получен с помощью Сеп2, как описано в примере 1) с 10% Ιβ (образец ЬЕ12Р047) и 300 ед./мл гНиГН20 (образец НИВ0702СА; получен с помощью Сеп2, как описано в примере 1) с 20% Ιβ (образец 8С00108NС) были получены, как описано в примере 6В выше, с концентрациями №-1С1 0, 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мМ. Таким образом, полученные совместные композиции £4^^0 и Ιβ были приготовлены в 0,25 М глицине при рН 4,6-5,1 (измеряли в разбавленном растворе) в присутствии различных количеств №С1.

После 0 (начало), 1, 3, 6, 12, 18 и 24 недель хранения один образец каждой совместной композиции (с концентрацией №·ιί'.Ί 0, 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мМ) изымали и анализировали на гиалуронидазную активность с применением анализа микромутности, описанного в Пример 4. Для оценки агрегации Ιβ с помощью высокопроизводительной эксклюзионной хроматографии (НΡ-8ЕС) на Т8К С 3000 8\У 600 х 7,5 мм колонке (Токой Вюкаепсе) в содержащей ДМСО буферной системе (Ко1апсй и др. (2006) ТгапкГикюп,

- 70 026112

46:21959-1977) было исследовано распределение молекулярного размера Гд.

В табл. 35 и 36 показана гиалуронидазная активность (ед./мл) в различных временных точках (0, 1, 3, 6, 12 и 24 недели) для каждой совместной композиции. Результаты показывают, что стабильность совместной композиции гНиРН20 с 10% Гд в присутствии высоких концентраций №С1 (20, 30, 40 и 50 мМ) оставалась относительно неизменной в течение 24 недель хранения при 28-32°С. Гиалуронидазная активность совместных композиций с концентрацией №С1 менее 20 мМ при хранении при температуре 2832°С резко снизилась. Стабильность совместной композиции гНиРН20 с 20% Гд остается относительно неизменной на протяжении 24 недель хранения при 28°-32°С при всех концентрациях №С1.

Хлорид натрия незначительно увеличивает димеризацию Гд (~ 350 кДа) и агрегацию Гд для 10% и 20% Гд совместных композиций при 28°-32°С. Эффект агрегации Гд менее выражен для 20% Гд (т.е. при более высокой концентрации Гд) (табл. 37 и 38).

Таблица 35. Гиалуронидазная активность (ед./мл) 10% Гд/гНиРН20 совместной композиции с №С1 после хранения при 28-32°С

Концентрация СОЛИ	Недели
0	1	3	6	12	24
0 мМ	292	260	225	211	135	<87
5 мМ	294	247	242	225	162	<87
10 мМ	272	255	242	240	177	91
20 мМ	281	302	261	259	232	154
30 мМ	279	273	256	261	229	180
40 мМ	274	254	266	275	246	196
50 мМ	275	254	278	281	252	200

Таблица 36. Гиалуронидазная активность (ед./мл) 20% Гд/гНиРН20 совместной композиции с №С1 после хранения при 28-32°С

Концентрация СОЛИ	Недели
0	1	3	6	12	24
0 мМ	267	264	251	238	212	138
5 мМ	290	261	249	242	214	143
10 мМ	276	264	262	232	207	141
20 мМ	314	249	274	239	222	155
30 мМ	252	253	276	241	211	162
40 мМ	273	240	275	242	216	170
50 мМ	289	238	266	234	232	165

Таблица 37. Распределение молекулярного размера Гд в 10% Гд/гНиРН20 совместной композиции с №С1 после хранения при 28-32°С

Образец	0(начало)	6 месяцев
>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа	>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа
0 мМ N301	0,16	9,35	90,01	0,48	0,19	7,08	91,69	1,04
5 мМ N»01	0,16	9,53	89,71	0,60	0,21	7,66	91,11	1,02
10 мМ 6аС1	0,16	9,77	89,52	0,56	0,22	8,20	90,52	1,05
20 мМ ЯаС1	0,17	9,96	89,27	0,60	0,26	8,42	90,27	1,05
30 мМ ИаС1	0,17	10,25	89,06	0,53	0,30	9,07	89,59	1,04
40 мМ 6аС1	0,17	10,48	88,82	0,53	0,34	9,06	89,56	1,05
50 мМ ΝβΟΙ	0,18	10,55	88,72	0,54	0,39	9,22	89,33	1,07

- 71 026112

Таблица 38. Распределение молекулярного размера 1д в 20% 1д/гНиРН20 совместной композиции с ЫаС1 после хранения при 28-32°С

Образец	0 (начало)	6 месяцев
>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа	>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа
0 мМ Νη€Ι	0,32	14,65	84,72	0,31	0,34	11,77	87,18	0,71
5 мМ №С1	0,32	14,70	84,70	0,27	0,34	11,57	87,35	0,74
10 мМ ИаС1	0,35	14,86	84,48	0,31	0,35	12,05	86,94	0,67
20 мМ №С1	0,30	14,95	84,48	0,27	0,37	12,17	86,76	0,69
30 мМ ΝβΟ	0,32	15,12	84,29	0,27	0,40	12,60	86,32	0,68
40 мМ N30	0,32	14,92	84,48	0,27	0,47	12,68	86,16	0,69
50 мМ Ν3Ο	0,33	15,00	84,36	0,30	0,45	12,56	86,34	0,65

Ό. Стабильность гНиРН20 в совместных композициях с 10% ΐ§ или с 20% ΐ§ в присутствии хлорида натрия (100-250 мМ) или аминокислот (500 мМ)

Была изучена стабильность гНиРН20 в совместных композициях, содержащих 10% ΐ§ или 20% ΐ§ с гНиРН20 и хлоридом натрия или аминокислотными стабилизаторами. Совместные композиции 100 ед./мл или 300 ед./мл гНиРН20 (образец НИВ0702СА, получен с помощью θеη2, как описано в примере 3) с 10% ΐ§ (в 0,25 М глицине с рН 4,4) (образец ЙЕ12Р047) или 20% ΐ§ (образец 8С00108ЫС) были получены, как описано в пример 6А выше. Образцы содержали ЫаС1 (концентрация 100, 150 или 250 мМ), глицин (500 мМ) или пролин (500 мМ). Совместные композиции хранили при 2-8°С или при 28-32°С. Таким образом, полученные совместные композиции гНиРН20 и ΐ§ были приготовлены в 0,25 М глицине при рН 4,6-5,1 в присутствии различных количеств ЫаС1, глицина и пролина.

После 0 (начало), 1, 3, 6 и 12 (только для 300 ед./мл) недель хранения один образец каждой совместной композиции (с концентрацией ЫаС1 100, 150, 250 мМ, глицином в концентрации 500 мМ или пролином в концентрации 500 мМ) изымали и анализировали на гиалуронидазную активность с применением анализа микромутности, описанного в Пример 4. Для оценки агрегации ΐ§ с помощью высокопроизводительной эксклюзионной хроматографии (НР-8ЕС) на Т8К θ 3000 8ν 600 ± 7,5 мм колонке (Токой Вюкаепсе) в содержащей ДМСО буферной системе (Ко1апсй и др. (2006) ТгапкГикюп, 46:21959-1977) было исследовано распределение молекулярного размера 1д.

В табл.39 и 41 показана гиалуронидазная активность (ед./мл) в 5 временных точках (0, 1, 2, 3 и 6 недель) для совместных композиций, содержащих 100 ед./мл гНиРН20 и 10% или 20% ΐ§ соответственно. В табл.40 и 42 показана гиалуронидазная активность (ед./мл) в 6 временных точках (0, 1, 2, 3, 6 и 12 недель) для совместных композиций, содержащих 100 ед./мл гНиРН20 и 10% или 20% ΐ§ соответственно. Результаты показывают, что аминокислоты в высокой концентрации (500 мМ глицина или 500 мМ пролина) были менее эффективны для стабилизации гНиРН20 в 10% ΐ§ или 20% ΐ§ совместных композициях с гНиРН20, чем ЫаС1.

Хлорид натрия при всех исследованных концентрациях повышал агрегацию 1д (> 450 кДа) после хранения при 28°-32°С во всех совместных композициях. Все совместные композиции, содержащие 500 мМ пролина, через 6 недель хранения при 28°-32°С имеют пониженное содержание димеров ΐ§ (~ 350 кДа) и увеличенное содержание мономеров (~ 160 кДа). Содержание димеров ΐ§ также было снижено в совместных композициях с глицином, хотя и не так выражено, как в совместных композициях с пролином (табл.43 и 44). Высокая концентрация пролина оказалась эффективной в ингибировании агрегации белка при рефолдинге путем эффективного блокирования неспецифических гидрофобных взаимодействий между белками (Китаг и др. (1998) Вюсйет. Мо1. Вю1. 1п!. 4:59-517).

Таблица 39. Гиалуронидазная активность (ед./мл) совместной композиции 10% ΐ§ и 100 ед./мл гНиРН20 со стабилизатором после хранения при 28-32°С

- 72 026112

Таблица 40. Гиалуронидазная активность (ед./мл) совместной композиции 10% 1д и 300 ед./мл γΗηΡΗ20 со стабилизатором после хранения при 28-32°С

Таблица 41. Гиалуронидазная активность (ед./мл) совместной композиции 20% 1д и 100 ед./мл γΗηΡΗ20 со стабилизатором после хранения при 28-32°С

Концентрация стабилизатора	Недели
0(начало)	1	2	3	6	12
100 мМ МаС1	268	313	262	256	223	214
150 мМ НаС1	252	292	249	260	232	202
250 мМ ЫаС1	262	302	270	254	236	213
500 мМ глицин	285	286	291	244	221	191
500 мМ пролин	308	303	242	248	230	197

Таблица 42. Гиалуронидазная активность (ед./мл) совместной композиции 20% 1д и 300 ед./мл γΗηΡΗ20 со стабилизатором после хранения при 28-32°С

Концентрация стабилизатора	Недели
0(начало)	1	2	3	6	12
100 мМ ЫаС1	268	266	264	226	237	255
150 мМ№С1	252	256	270	220	231	261
250мМ1ЧаС1	262	243	273	246	243	273
500 мМ глицин	285	257	289	211	230	267
500 мМ пролин	308	257	268	231	229	259

Таблица 43. Распределение молекулярного размера 1д в совместной композиции 10% ^/γΗιιΡΗ20 с №С1, глицином или пролином после хранения при 28-32°С

Образец	0 (начало)	б месяцев
>450 кДа	-350 кДа	-НО кДа	<60 кДа	>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа
10% Ю +100 ЕД/мл гНиРН20 + 250 мМ ΝηϋΙ	0,15	10,92	88,35	0,59	0,50	9,58	89,13	0,80
10% 1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 250 мМ 1ЧаС1	0,14	11,05	88,27	0,54	0,46	9,59	89,11	0,84
10%1С+100 ЕД/мл ιΉιιΡΙΙ20 + 150 мМ Νβεί	0,14	11,07	88,15	0,65	0,45	9,71	88,97	0,87
10%1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 150 мМ ΝβΟΙ	0,14	11,42	87,82	0,62	0,45	9,76	89,09	0,70
10% 1С +100 ЕД/мл гНиРН20 + 100 мМ ΝαϋΙ	0,18	11,29	87,91	0,63	0,38	9,36	89,53	0,74
10% 1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 100 мМ МаС1	0,13	11,43	87,89	0,55	0,38	9,32	89,52	0,78
10% 1С +100 ЕД/мл гНиРН20 + 500 мМ глицин	0,16	10,67	88,55	0,62	0,12	8,12	90,92	0,84
10%1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 100 мМ глицин	0,16	10,80	88,43	0,61	0,16	8,17	90,95	0,73
10% 10+100 ЕД/мл гНиРШО + 500 мМ пролин	0,14	9,55	89,75	0,56	0,11	5,53	93,58	0,78
10% 1С + 300 ЕД/МЛ гНиРН20 + 100 мМ пролин	0,14	9,43	89,86	0,57	0,12	5,65	93,52	0,71

- 73 026112

Таблица 44. Распределение молекулярного размера Н в совместной композиции 20% ^^^^0 с №С1, глицином или пролином после хранения при 28-32°С

Образец	0 (на	чало!	6 месяцев
>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа	>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа
20% к;+1оо Е>мл гНиРН20 + 2250 мМ №С1	0,25	15,03	84,28	0,44	0,48	12,55	86,37	0,60
20%1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 250 мМ 1ЧаС1	0,26	15,12	84,16	0,46	0,51	12,53	86,36	0,59
20% 1С +100 ЕД/мл гНиРН20 + 150 мМ ЯаС1	0,26	15,32	83,97	0,45	0,45	12,74	86,12	0,69
20% 1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 150 мМ ΝαϋΙ	0,25	15,21	84,08	0,46	0,47	12,78	86,13	0,61
20% 1С +100 ЕД/мл гНиРН20 + 100 мМ №С1	0,24	15,40	83,87	0,50	0,43	12,69	86,24	0,65
20%1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 100 мМ №С1	0,25	15,53	83,81	0,42	0,48	12,72	86,17	0,63
Образец	0(начало!	6 месяцев
>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа	>450 кДа	-350 кДа	-160 кДа	<60 кДа
20% 1С +100 ЕД/мл гНиРН20 + 500 мМ глицин	0,21	14,40	84,99	0,39	0,22	12,31	86,90	0,56
20% 1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 100 мМ глицин	0,21	14,38	85,00	0,41	0,22	12,47	86,73	0,58
20% 1С +100 ЕД/мл гНиРН20 + 500 мМ пролин	0,25	15,47	83,83	0,45	0,24	10,18	88,92	0,66
20% 1С + 300 ЕД/мл гНиРН20 + 100 мМ пролин	0,25	15,72	83,54	0,49	0,24	10,35	88,81	0,61

Пример 7

Исследование воздействия совместных композиций гНиРН20 с 10% Н или 20% Н на юкатанских мини-свиньях

А. Схема эксперимента

Была исследована возможность подкожного введения раствора совместной композиций гНиРН20 с 10% или 20% иммуноглобулином Д§) (130 мМ №С1, 10 мМ гистидин, рН 6,6) юкатанским минисвиньям, эффект сравнивали с последовательным введением гНиРН20 и раствора ^. Для каждого раствора с применением нескольких концентраций гНиРН20 также был оценен ответ на введение.

Восемнадцать самцов юкатанских мини-свиней весом 18,4-23,2 кг (δΝδ Рагтз) распределяли в одну или две из одиннадцати групп лечения, как показано в табл.45, так что в каждой группе использовали три свиньи. Все композиции вводили подкожно в спину самцам свиней под наркозом с помощью 10 О изогнутой на 90 градусов иглы Хубера. Для последовательного введения гНиРН20 и ^О вводили последовательно с использованием одной иглы точно в то же место, используя простую смену шприца. Между введением гНиРН20 и НО не требовалось и не вводилось какой-либо задержки. До двух различных композиций из разных групп тестировали на каждой свинье в максимальном объеме 110 мл в месте инъекции. Инфузии длились приблизительно 20 мин для совместных композиций и 22-28 мин при последовательном введении.

Таблица 45. Схема эксперимента

Группа	Преперат	Тип введения	Объем дозы (мл)
	100 мл 10% ΙΟ	Совместная композиция	100
2	100 мл 10% Ю / гНиРН20 (50 ЕД/мл)	Совместная композиция	100
3	100 мл 10% 10 / гНиРН20 (100 ЕД/мл)	Совместная композиция	100
4	100 мл 10% 10 / гНиРН20 (300 ЕД/мл)	Совместная композиция	100
5	50 мл 20% Ю	Совместная композиция	50
6	50 мл 20% ΙΟ / гНиРН20 (50 ЕД/мл)	Совместная композиция	50
7	50 мл 20% ΙΟ / гНиРН20 (100 ЕД/мл)	Совместная композиция	50
8	50 мл 20% ΙΟ / гНиРН20 (300 ЕД/мл)	Совместная композиция	50
9	10 мл гНиРН20 (150 ЕД/мл) + 100 мл 10% 10	Последовательно	110
10	20 мл гНиРН20 (150 ЕД/мл) + 50 мл 20% 10	Последовательно	60
11	20 мл гНиРН20 (150 ЕД/мл) + 50 мл 20% 10	Последовательно	70

- 74 026112

После введения проводили наблюдение места инъекции. Для измерения постоянного давления (мм рт. ст.), требующегося для введения каждой композиции, использовали специальные датчики, для полного анализа крови (СВС) и анализа на гамма-иммуноглобулины (1дС) отбирали образцы крови. В конце исследования через 3 дня после введения всех животных подвергали эвтаназии и из места инъекции 1, места инъекции 2 и контрольной области (образец забирали из далекой от мест двух инъекций области) изымали два образца (А и В), которые хранили в 10% нейтральном буферном растворе формалина и оценивали с помощью световой микроскопии (№уа Ра1ко1оду, РС, 8ап П1едо, СА). Образец А представлял собой срез толщиной 2-3 мМ через центр места инъекции, а образец В представлял собой срез толщиной 2-3 мМ, взятый с края изъятого места инъекции.

В. Исследование места инъекции

В течение 5 мин после введения только 10% 1д (~ 25 мл инфузии, группа 1) у всех трех свиней был виден отчетливый пузырь. Приблизительно через 10 мин после введения только 20% 1д (~ 25 мл инфузии, группа 5) также был виден отчетливый пузырь. Площадь наблюдаемого пузыря увеличилась для всех композиций, содержащих гНиРН20 (в том числе для последовательного введения), по сравнению с введением только 1д, что свидетельствует о большей дисперсии жидкости при применении гНиРН20 (табл. 46).

Введение совместных композиций гНиРН20 с 10 и 20% 1д привело к значительному снижению отвердения кожи при всех концентрациях гНиРН20 (места введения оставались мягкими) и уменьшению порозовения/покраснения кожи при всех концентрациях гНиРН20. Последовательное введение дало аналогичные показатели порозовения/покраснения по сравнению с совместными композициями. Появление порозовения/покраснения в месте инъекции, наблюдаемое после введения, полностью исчезало в течение 24 ч для всех групп (табл. 46).

Таблица 46. Изучение места инъекции

Группа	Преперат	Средняя площадь пузыря (ст)	Наблюдения
1	100 мл 10% ΙΘ	97,5	слегка розовый; плотный
2	100 мл 10% ΙΟ / гНиРН20 (50 ЕД/мл)	91,7	слегка розовый; мягкий
3	100 мл 10% 1О / гНиРН20 (100 ЕД/мл)	180,3	слегка розовый/розовый; мягкий
4	100 мл 10% ΙΟ / гНиРН20 (300 ЕД/мл)	178,0	слегка розовый/розовый; мягкий
5	50 мл 20% 10	95,2	Розовый/красный; плотный
6	50 мл 20% 10 / гНиРН20 (50 ЕД/мл)	102,6	Розовый/красный; мягкий
7	50 мл 20% Ю / гНиРН20 (100 ЕД/мл)	111,9	слегка розовый/розовый; мягкий
8	50 мл 20% 10 / гНиРН20 (300 ЕД/мл)	111,1	Нормальный; мягкий
9	10 мл гНиРН20 (150 ЕД/мл) + 100 ил 10% 10	173,5	Нормальный; мягкий
10	20 мл гНиРН20 (150 ЕД/мл) + 50 ил 20% ΙΟ	116,8	Нормальный/слегка розовый; мягкий
11	20 мл гНиРН20 (150 ЕД/мл) + 50 мл 20% 10	131,4	Нормальный/слегка розовый; мягкий

С. Измерение давления

В табл. 47 приведены средние значения измерения давления. Через 2,5 мин и ранее после введения только 20% 1д (группа 5) давление было больше диапазона измерения (> 460 мм рт.ст.) для всех трех свиней. Измеряемые значения давления для двух из трех свиней были вне диапазона измерения в группе 6 и для одной свиньи в каждой из групп 7 и 8. В каждой из групп 1 и 2 значения давления для одной свиньи также были вне диапазона измерений. Результаты показывают, что необходимое для проведения инъекции давление было снижено для всех совместных композиций, содержащих гНиРН20.

Таблица 47. Анализ для измерения среднего давления

Группа	количество	Среднее давление (мм.рт.ст.)	Максимальное повышении давления (мм.рт.ст.)	Максимальное давление (мм.рт.ст.)	Время подъема давления до максимал ь ного (мин)	Время поддержания максимального давления (мин)
	2	242	266	281	2,7	5,1
2	2	209	Ν/Α*	223	Ν/Α*	4,0
3	3	164	0,3	223	0,3	4,1
4	3	289	0,5	255	0,5	2,3
5	0	Ν/Α	Ν/Α	Ν/Α	Ν/Α	Ν/Α
6	1	164	250	250	1,6	1,6
7	2	179	215	215	0,7	0,7
8	2	194	188	203	1,6	4,6
9	3	117	119	125	1,9	4,9
10	3	241	232	261	3,8	12,9
11	3	241	281	264	4,7	15,2

Ν/А - нет данных, >460 мм рт.ст.

Ν/А* - кривую роста давления невозможно интерпретировать

- 75 026112

Ό. Полный анализ крови и анализ ©О в плазме

Для полного анализа крови (СВС) кровь отбирали в пробирки К₃ ЭДТА до введения (~ 2,0 мл) и через 30 мин после введения (~ 2,0 мл). Образцы хранили при температуре 4°С до анализа (Вюдиап!, Шс., Сан-Диего, Калифорния). Результаты СВС не дали никаких конкретных негативных указаний, связанных с безопасностью препарата. Для большинства свиней образцы остались в пределах нормальных уровней СВС (нормальные значения СВС получены от 3Ν3 Рагпъ). Пять из восемнадцати свиней имели невидимые сгустки в образцах и не могли быть оценены.

Для подтверждения системной биодоступности человеческого ©О после подкожного введения кровь для анализа на гамма-иммуноглобулин ОдО) собирали в пробирки с цитратом натрия до введения (~ 2,0 мл) и в конце исследования (~ 4,0 мл). Образцы центрифугировали при 4°С в течение 10 мин при 3000 оборотов в минуту, плазму разделяли на аликвоты и образцы хранили при температуре -20°С до анализа. Общее увеличение содержания ©О наблюдалось у всех животных через 3 дня после введения, как показано в табл. 48. Уровень ©О в плазме крови для каждой свиньи отражает среднее значение для двух различных способов введения, которые применяли к свинье (за исключением свиней 7-9, которые получили только одно введение).

Таблица 48. ©О анализ

Свинья, №	Группа (группы)	1еС(г/л)
До введения	После
1	1 и 2	3,46	8,53
2	1 и2	2,97	9,27
3	1 и2	4,35	9,03
4	Зи4	6,67	10,51
5	3 и4	3,81	10,15
б	3 и4	4,79	9,83
7	5	4,96	6,06
«	5	3,50	5,94
9	5	3,73	6,86
10	6 и 7	2,83	8,19
11	6 и 7	3,47	10,08
12	6 и 7	4,08	11,12
13	8и9	5,07	9,62
14	8и9	4,02	8,82
15	8и9	3,94	8,63
16	10и 11	3,97	9,25
17	10и 11	4,60	9,68
18	10и И	4,76	9,51

Е. Результаты гистопатологического исследования

Гистологические изменения были представлены в эпидермисе, дерме и подкожной ткани и включали смешанное лейкоцитарное воспаление, отек и кровоизлияние. Каждое гистологическое изменение оценивали по степени тяжести по следующей схеме:

отсутствует: 0;

присутствует, не оценивается: 0;

минимальное: 1;

мягкое: 2;

умеренное: 3;

выраженное: 4.

Гистологические изменения приведены по встречаемости и средней тяжести по группам в табл. 4951.

Таблица 49. Краткое описание гистологических изменений 10% © + гНиРН20

Гистологические изменения	Группа
1	2	3	4
Смешанное лейкоцитарное воспаление, подкожно	6/6*	6/6	5/6	6/6
Средним показатель тяжести изменений в группе **	1,83	1,00	1,00	1,17
Отек, подкожно	6/6	5/6	6/6	5/6
Средний показатель тяжести изменений в группе	2,00	0,83	1,00	1,17
Кровоизлияние, подкожно	3/6	3/6	2/6	1/6
Средний показатель тяжести изменений в группе	0,67	0,50	0,33	0,33
Сумма средних показателей тяжести изменений в группе	4,50	2,33	2,33	2,67

* Количество затронутых срезов /количество исследованных срезов ** Сумма оценок степени тяжести изменений в группе, деленная на количество исследованных срезов в группе

- 76 026112

Таблица 50. Краткое описание гистологических результатов 20% Ц + гНиРН20

Гистологические изменения	Группа
5	6	7	8
Смешанное лейкоцитарное воспаление, подкожно	6/6*	6/6	5/6	6/6
Средний показатель тяжести изменений в группе **	1,00	1,17	1,00	2,17
Отек, подкожно	6/6	6/6	5/6	5/6
Средний показатель тяжести изменений в группе	1,17	1Д7	1,17	2,00
Кровоизлияние, подкожно	0/6	2/6	0/6	1/6
Средний показатель тяжести изменений е группе	0,00	0,33	0,00	0,17
Сумма средних показателей тяжести изменений в группе	2,17	2,67	2,17	4,34

* Количество затронутых срезов /количество исследованных срезов ** Сумма оценок степени тяжести изменений в группе, деленная на количество исследованных срезов в группе

Таблица 51. Краткое описание гистологических результатов - последовательное введение

Гистологические изменения	Группа
9	10	11
Смешанное лейкоцитарное воспаление, подкожно	616*	6/6	6/6
Средний показатель тяжести изменений в группе **	1,17	1,17	1,17
Отек, подкожно	5/6	6/6	6/6
Средний показатель тяжести изменений е группе	1,50	1,67	1,83
Кровоизлияние, подкожно	1/6	3/6	1/6
Средний показатель тяжести изменении е группе	0,17	0,67	0,17
Сумма средних показателей тяжести изменений в группе	2,84	3,51	3,17

* Количество пострадавших срезов /количество исследованных срезов ** Сумма оценок степени тяжести изменений в группе, деленная на количество исследованных срезов в группе

Ответ на введение Ц и гНиРН20 качественно сходен для всех групп в данном исследовании. Ответ на введение характеризовался смешанным лейкоцитарным воспалением, отеком и кровоизлиянием в подкожную ткань в местах инъекций. В табл. 52 приведено сравнение средних показателей тяжести изменений для всех групп.

Таблица 52. Краткое описание средних показателей тяжести изменений для группы

Группа	Преперат	Тип введения	Сумма средних показателей тяжести изменений в группе
1	100 мл 10% Ю	Совместная композиция	4,50
2	100 мл 10% ΙΟ / гНиРН20 (50 ЕД/мл)	Совместная композиция	2,33
3	100 мл 10% КЗ / гНиРН20 (100 ЕД/мл)	Совместная композиция	2,33
4	100 мл 10% КЗ / гНиРН20 (300 ЕД/мл)	Совместная композиция	2,67
5	50 мл 20% ΙΟ	Совместная композиция	2,17
6	50 мл 20% КЗ / гНиРН20 (50 ЕД/мл)	Совместная композиция	2,67
7	50 мл 20% 10 / гНиРН20 (100 ЕД/мл)	Совместная композиция	2,17
8	50 мл 20% ΙΟ / гНиРН20 (300 ЕД/мл)	Совместная композиция	4,34
9	10 мл гНнРН20 (150 ЕД/мл) + 100 мл 10% 10	Последовательно	2,84
10	20 мл гНиРН20 (150 ЕД/мл) + 50 мл 20% ΙΟ	Последовательно	3,51
11	20 мл гНиРН20 (150 ЕД/мл) + 50 мл 20% ΙΟ	Последовательно	3,17

- 77 026112

На основе средних показателей тяжести изменений для групп наиболее тяжелые ответы в местах инъекции были связаны с введением 100 мл 10% 1д (группа 1) и с введением 50 мл 20% 1д совместной композиции с 300 ед./мл гНиРН20 (группа 8). Реакция на введение 100 мл совместной композиции 10% 1д с 50, 100 и 300 ед./мл гНиРН20 (группы 2-4) была похожа на ответ после введения 50 мл 20% 1д (группа 5), совместной композиции 50 и 100 ед./мл гНиРН20 с 20% 1д (группы 6 и 7) и последовательного введения 10 мл гНиРН20 (150 ед./мл) со 100 мл 10% 1д (группа 9). Тем не менее, последовательное введение 10 или 20 мл гНиРН20 (150 ед./мл) и 50 мл 20% 1д (группы 10 и 11) привело к более тяжелому ответу, чем аналогичное введение совместных композиций (группы 6 и 7). Контрольные срезы кожи содержали мало гистологических изменений, которые можно отнести к диффузии введенных композиций из мест инъекции, и некоторые случайные изменения, не связанные с композициями.

Р. Заключение

Полученные результаты подтвердили возможность подкожного введения совместных композиций гНиРН20 с 10 и 20% 1д юкатанским мини-свиньям. Возможно введение только 1д (10 или 20%), хотя оно приводит к отвердению и порозовению/покраснению кожи от умеренной до тяжелой степени. При введении совместных композиций с гНиРН20 уменьшилось давление, необходимого для проведения инъекций, значительно снизилось отвердение кожи, а также ее порозовение/покраснение. Наблюдаемая область образования пузыря при введении всех композиций, которые содержали гНиРН20, была схожей или увеличенной по сравнению с введением только 1д, что подтверждает большую дисперсию жидкости при введении с гНиРН20. Также возможно применять последовательное введение, при котором наблюдали аналогичные показатели давления, порозовения/покраснения и образования пузыря, как при введении совместных композиций. Гистопатологические изменения, присутствующие в глубоких подкожных тканях, объясняются введением композиций и включают смешанное лейкоцитарное воспаление, отек и кровоизлияние, где наиболее тяжелые реакции вызывает введение только 10% 1д и совместной композиции 20% 1д с гНиРН20 (300 ед./мл).

Если какие-либо изменения будут очевидны специалистам в данной области, то подразумевается, что настоящее изобретение ограничено только прилагаемой формулой изобретения.

- 78 026112

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Бакстер Интернэшнл, Инк.

Бакстер Хелскэа, С.А.

Тешнер, Волфганг Сватос, Сонья Брукшвайгер, Леопольд Вебер, Альфред Шварц, Гпнс-Питер Лей, Лаура <120> СТАБИЛЬНЫЙ СОВМЕСТНЫЙ СОСТАВ, СОДЕРЖАЩИЙ ХИАЛУРОНИДАЗУ И ИММУНОГЛОБУЛИН, И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ <130> 3800020-00137/3088РС <140> Еще нет <141> Настоящим <150> ИЗ 61/277,045 <151> 2009-09-17 <160> 56 <170> ЕазЬЗЕф для Игпбомз версии 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> белок <213> Ното заргепз <220>

<223> предшественник человеческой РН20 <400> 1

МеЬ

С1у

ναι

Ней

Ьуз

РНе

Ьуз

Нтз

11е

РНе

РНе

Агд

Зег

РНе

Уа1

Ьуз

1

5

10

15

Зег

Зег

С1у

ναι

Зег

С1п

11е

ναι

РНе

ТНг

РНе

Ьеи

Ьеи

11е

Рго

Суз

20

25

30

- 79 026112

Суз

Ъеи

ТЪг 35

Ъеи

Азп

РЪе

Агд

А1а 40

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго 45

Азп

Уа1

Рго

РЪе

Ъеи

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РЪе

Суз

Ъеи

С1у

Ъуз

РЪе

50

55

60

Азр

С1и

Рго

Ъеи

Азр

МеЪ

Зег

Ъеи

РЪе

Зег

РЪе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

ТЪг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТЪг

11е

РЪе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ъеи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТЪг

С1у

Уа1

ТЪг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Ъуз

11е

Зег

Ъеи

С1п

Азр

Низ

Ъеи

Азр

Ъуз

А1а

Ъуз

115

120

125

Ъуз

Азр

11е

ТЪг

РЪе

Туг

МеЪ

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ъеи

С1у

МеЪ

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТЪг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ъуз

Рго

145

150

155

160

Ъуз

Азр

Уа1

Туг

Ъуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ъеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Ъеи

Зег

Ъеи

ТЪг

С1и

А1а

ТЪг

С1и

Ъуз

А1а

Ъуз

С1п

С1и

РЪе

180

185

190

С1и

Ъуз

А1а

С1у

Ъуз

Азр

РЪе

Ъеи

Уа1

С1и

ТЪг

11е

Ъуз

Ъеи

С1у

Ъуз

195

200

205

Ъеи

Ъеи

Агд

Рго

Азп

Низ

Ъеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ъеи

РЪе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Низ

Низ

Туг

Ъуз

Ъуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РЪе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ъуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ъеи

Зег

Тгр

Ъеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТЪг

А1а

Ъеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ъеи

Азп

ТЪг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

ТЪг

Ъеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Ъуз

11е

Рго

Азр

А1а

Ъуз

Зег

Рго

Ъеи

Рго

Уа1

РЪе

А1а

Туг

ТЪг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РЪе

ТЪг

Азр

С1п

Уа1

Ъеи

Ъуз

РЪе

Ъеи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Ъеи

Уа1

Туг

ТЪг

РЪе

С1у

С1и

ТЪг

Уа1

А1а

Ъеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТЪг

Ъеи

Зег

11е

МеЪ

Агд

Зег

МеЪ

Ъуз

Зег

Суз

Ъеи

340

345

350

- 80 026112

Ней

Ней

Азр 355

Азп

Туг

МеН

С1и

ТНг 360

11е

Теи

Азп

Рго

Туг 365

11е

11е

Азп

ναι

ТНг

Теи

А1а

А1а

Туз

МеН

Суз

Зег

С1п

Уа1

Теи

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

ναι

Суз

11е

Агд

Туз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Теи

Низ

Теи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РНе

А1а

11е

С1п

Теи

С1и

Туз

С1у

С1у

Туз

РНе

ТНг

405

410

415

ναι

Агд

С1у

Туз

Рго

ТНг

Теи

С1и

Азр

Теи

С1и

С1п

РНе

Зег

С1и

Туз

420

425

430

РНе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТНг

Теи

Зег

Суз

Туз

С1и

Туз

А1а

Азр

435

440

445

ναι

Туз

Азр

ТНг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

РНе

Теи

Туз

Рго

Рго

МеН

С1и

ТНг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

465

470

475

480

РНе

Туг

Азп

А1а

Зег

Рго

Зег

ТНг

Теи

Зег

А1а

ТНг

МеН

РНе

11е

Уа1

485

490

495

Зег

11е

Теи

РНе

Теи

11е

11е

Зег

Зег

Уа1

А1а

Зег

Теи

500

505

<210> 2 <211> 474 <212> белок <213> Ното зариепз <220>

<223> зрелая РН20 <400> 2

Теи	Азп	РНе	Агд	А1а	Рго	Рго
1				5
А1а	Тгр	Азп	А1а	Рго	Зег	С1и
			20
Теи	Азр	МеН	Зег	Теи	РНе	Зег
		35
ТНг	С1у	С1п	С1у	Уа1	ТНг	11е
	50					55

Уа1	11е	Рго 10	Азп	Уа1	Рго	РНе	Теи 15	Тгр
РНе	Суз	Теи	С1у	Туз	РНе	Азр	С1и	Рго
	25					30
РНе	11е	С1у	Зег	Рго	Агд	11е	Азп	А1а
40					45
РНе	Туг	Уа1	Азр	Агд	Теи	С1у	Туг	Туг

- 81 026112

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТАг

С1у

Уа1

ТАг

Уа1

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

65

70

75

80

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

Азр

ΗΪ8

Ьеи

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьуз

Азр

11е

85

90

95

ТАг

РАе

Туг

МеА

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

МеА

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТАг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

Уа1

115

120

125

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

Уа1

С1п

Ьеи

130

135

140

Зег

Ьеи

ТАг

С1и

А1а

ТАг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РАе

С1и

Ьуз

А1а

145

150

155

160

С1у

Ьуз

Азр

РАе

Ьеи

Уа1

С1и

ТАг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Агд

165

170

175

Рго

Азп

ΗΪ8

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РАе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Η^з

180

185

190

ΗΪ5

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РАе

Азп

Уа1

С1и

11е

195

200

205

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

ТАг

А1а

Ьеи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТАг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

ТАг

225

230

235

240

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Ьуз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РАе

А1а

Туг

ТАг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

РАе

ТАг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РАе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

Туг

275

280

285

ТАг

РАе

С1у

С1и

ТАг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

290

295

300

С1у

ТАг

Ьеи

Зег

11е

МеА

Агд

Зег

МеА

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Азр

305

310

315

320

Азп

Туг

МеА

С1и

ТАг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

Уа1

ТАг

Ьеи

325

330

335

А1а

А1а

Ьуз

МеА

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

ΗΪ8

Ьеи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РАе

ТАг

Уа1

Агд

С1у

370

375

380

- 82 026112

Ьуз 385	Рго	ТЬг	Ьеи	С1и	Азр 390	Ьеи	С1и
Зег	Суз	Туг	Зег	ТЬг 405	Ьеи	Зег	Суз
ТЬг	Азр	А1а	Уа1 420	Азр	Уа1	Суз	11е
РЬе	Ьеи	Ьуз 435	Рго	Рго	МеЬ	С1и	ТЬг 440
А1а	Зег 450	Рго	Зег	ТЬг	Ьеи	Зег 455	А1а
РЬе 465	Ьеи	11е	11е	Зег	Зег 470	Уа1	А1а

460

Зег Ьеи

С1п	РЬе	Зег	С1и	Ьуз	РЬе	Туг	Суз
		395					400
Ьуз	С1и	Ьуз	А1а	Азр	Уа1	Ьуз	Азр
	410					415
А1а	Азр	С1у	Уа1	Суз	11е	Азр	А1а
425					430
С1и	С1и	Рго	С1п	11е	РЬе	Туг	Азп
				445
ТЬг	МеЬ	РЬе	11е	Уа1	Зег	11е	Ьеи

<210> 3 <211> 482 <212> белок <213> Ното зартепз <220>

<223> предшественник гНиРН20 <400> 3

МеЬ	С1у	Уа1	Ьеи	Ьуз	РЬе	Ьуз	Нтз
1				5
Зег	Зег	С1у	Уа1	Зег	С1п	11е	Уа1
			20
Суз	Ьеи	ТЬг	Ьеи	Азп	РЬе	Агд	А1а
		35					40
РЬе	Ьеи	Тгр	А1а	Тгр	Азп	А1а	Рго
	50					55
Азр	С1и	Рго	Ьеи	Азр	МеЬ	Зег	Ьеи
65					70
11е	Азп	А1а	ТЬг	С1у	С1п	С1у	Уа1
				85
С1у	Туг	Туг	Рго	Туг	11е	Азр	Зег
			100
С1у	11е	Рго	С1п	Ьуз	11е	Зег	Ьеи

115 120

11е	РЬе 10	РЬе	Агд	Зег	РЬе	Уа1 15	Ьуз
РЬе	ТЬг	РЬе	Ьеи	Ьеи	11е	Рго	Суз
25					30
Рго	Рго	Уа1	11е	Рго	Азп	Уа1	Рго
				45
Зег	С1и	РЬе	Суз	Ьеи	С1у	Ьуз	РЬе
			60
РЬе	Зег	РЬе	11е	С1у	Зег	Рго	Агд
		75					80
ТЬг	11е	РЬе	Туг	Уа1	Азр	Агд	Ьеи
	90					95
11е	ТЬг	С1у	Уа1	ТЬг	Уа1	Азп	С1у
105					110
С1п	Азр	Нтз	Ьеи	Азр	Ьуз	А1а	Ьуз
				125

- 83 026112

Ьуз

Азр 130

11е

ТНг

РНе

Туг

МеЬ 135

Рго

УаЬ

Азр

Азп

Ьеи 140

С1у

МеЬ

А1а

УаЬ

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТНг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

145

150

155

160

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

УаЬ

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

С1и

А1а

ТНг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РНе

180

185

190

С1и

Ьуз

А1а

С1у

Ьуз

Азр

РНе

Ьеи

УаЬ

С1и

ТНг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

195

200

205

Ьеи

Ьеи

Агд

Рго

Азп

НЬз

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РНе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

НЬз

НЬз

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РНе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТНг

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТНг

С1п

С1п

Зег

Рго

УаЬ

260

265

270

А1а

А1а

ТНг

Ьеи

Туг

УаЬ

Агд

Азп

Агд

УаЬ

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

УаЬ

275

280

285

Зег

Ьуз

11е

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

УаЬ

РНе

А1а

Туг

ТНг

290

295

300

Агд

11е

УаЬ

РНе

ТНг

Азр

С1п

УаЬ

Ьеи

Ьуз

РНе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Ьеи

Уа1

Туг

ТНг

РНе

С1у

С1и

ТНг

УаЬ

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТНг

Ьеи

Зег

11е

МеЬ

Агд

Зег

МеЬ

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

340

345

350

Ьеи

Ьеи

Азр

Азп

Туг

МеЬ

С1и

ТНг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТНг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеЬ

Суз

Зег

С1п

УаЬ

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

НЬз

Ьеи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РНе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РНе

ТНг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Ьуз

Рго

ТНг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РНе

Зег

С1и

Ьуз

420

425

430

РНе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТНг

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

435

440

445

- 84 026112

ναι

Туз 450

Азр

ТЬг

Азр

А1а

ναι 455

Азр

ναι

Суз

11е

А1а 460

Азр

С1у

Уа1

Суз

11е

Азр

А1а

РЬе

Теи

Туз

Рго

Рго

Ме!

С1и

ТЬг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

465

470

475

480

РЬе Туг <210> 4 <211> 447 <212> белок <213> Ното зариепз <220>

<223> растворимая гНиРН20 1-447 <400> 4

Теи

Азп

РЬе

Агд

А1а

Рго

Рго

να1

11е

Рго

Азп

να1

Рго

РЬе

Теи

Тгр

1

5

10

15

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РЬе

Суз

Теи

С1у

Туз

РЬе

Азр

С1и

Рго

20

25

30

Теи

Азр

Ме!

Зег

Теи

РЬе

Зег

РЬе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

11е

Азп

А1а

35

40

45

ТЬг

С1у

С1п

С1у

να1

ТЬг

11е

РЬе

Туг

να1

Азр

Агд

Теи

С1у

Туг

Туг

50

55

60

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТЬг

С1у

να1

ТЬг

να1

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

65

70

75

80

С1п

Туз

11е

Зег

Теи

С1п

Азр

Нтз

Теи

Азр

Туз

А1а

Туз

Туз

Азр

11е

85

90

95

ТЬг

РЬе

Туг

Ме!

Рго

να1

Азр

Азп

Теи

С1у

Ме!

А1а

να1

11е

Азр

Тгр

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТЬг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Туз

Рго

Туз

Азр

να1

115

120

125

Туг

Туз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Теи

να1

С1п

С1п

С1п

Азп

να1

С1п

Теи

130

135

140

Зег

Теи

ТЬг

С1и

А1а

ТЬг

С1и

Туз

А1а

Туз

С1п

С1и

РЬе

С1и

Туз

А1а

145

150

155

160

С1у

Туз

Азр

РЬе

Теи

να1

С1и

ТЬг

11е

Туз

Теи

С1у

Туз

Теи

Теи

Агд

165

170

175

Рго

Азп

Нтз

Теи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Теи

РЬе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Низ

180

185

190

- 85 026112

ΗΪ3

Туг

Туз 195

Туз

Рго

С1у

Туг

Азп 200

С1у

Зег

Суз

РНе

Азп 205

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Теи

Зег

Тгр

Теи

Тгр

Азп

С1и

Зег

ТНг

А1а

Теи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Теи

Азп

ТНг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

ТНг

225

230

235

240

Теи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Туз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

Туз

Зег

Рго

Теи

Рго

Уа1

РНе

А1а

Туг

ТНг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

РНе

ТНг

Азр

С1п

Уа1

Теи

Туз

РНе

Теи

Зег

С1п

Азр

С1и

Теи

Уа1

Туг

275

280

285

ТНг

РНе

С1у

С1и

ТНг

Уа1

А1а

Теи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

290

295

300

С1у

ТНг

Теи

Зег

11е

МеН

Агд

Зег

МеН

Туз

Зег

Суз

Теи

Теи

Теи

Азр

305

310

315

320

Азп

Туг

МеН

С1и

ТНг

11е

Теи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

Уа1

ТНг

Теи

325

330

335

А1а

А1а

Туз

МеН

Суз

Зег

С1п

Уа1

Теи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

Туз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Теи

Низ

Теи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

Азп

РНе

А1а

11е

С1п

Теи

С1и

Туз

С1у

С1у

Туз

РНе

ТНг

Уа1

Агд

С1у

370

375

380

Туз

Рго

ТНг

Теи

С1и

Азр

Теи

С1и

С1п

РНе

Зег

С1и

Туз

РНе

Туг

Суз

385

390

395

400

Зег

Суз

Туг

Зег

ТНг

Теи

Зег

Суз

Туз

С1и

Туз

А1а

Азр

Уа1

Туз

Азр

405

410

415

ТНг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

11е

Азр

А1а

420

425

430

РНе

Теи

Туз

Рго

Рго

МеН

С1и

ТНг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

РНе

Туг

435

440

445

<210> 5 <211> 446 <212> белок <213> Ното зариепз <220>

- 86 026112 <223> растворимая гНиРН20 1-446 <400> 5

Ьеи

Азп

Рке

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

Рке

Ьеи

Тгр

1

5

10

15

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

Рке

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

Рке

Азр

С1и

Рго

20

25

30

Ьеи

Азр

Мек

Зег

Ьеи

Рке

Зег

Рке

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

11е

Азп

А1а

35

40

45

Ткг

С1у

С1п

С1у

Уа1

Ткг

11е

Рке

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

С1у

Туг

Туг

50

55

60

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

Ткг

С1у

Уа1

Ткг

Уа1

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

65

70

75

80

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

Азр

Нтз

Ьеи

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьуз

Азр

11е

85

90

95

Ткг

Рке

Туг

Мек

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

Мек

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

Ткг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

Уа1

115

120

125

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

Уа1

С1п

Ьеи

130

135

140

Зег

Ьеи

Ткг

С1и

А1а

Ткг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

Рке

С1и

Ьуз

А1а

145

150

155

160

С1у

Ьуз

Азр

Рке

Ьеи

Уа1

С1и

Ткг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Агд

165

170

175

Рго

Азп

Нтз

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

Рке

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Нтз

180

185

190

ΗΪ5

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

Рке

Азп

Уа1

С1и

11е

195

200

205

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

Ткг

А1а

Ьеи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

Ткг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

Ткг

225

230

235

240

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Ьуз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

Рке

А1а

Туг

Ткг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

Рке

Ткг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

Рке

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

Туг

275

280

285

Ткг

Рке

С1у

С1и

Ткг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

- 87 026112

290

295

300

С1у

ТАг

Ьеи

Зег

11е

МеА

Агд

Зег

МеА

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Азр

305

310

315

320

Азп

Туг

МеА

С1и

ТАг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

Уа1

ТАг

Ьеи

325

330

335

А1а

А1а

Ьуз

МеА

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

ΗΪ8

Ьеи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РАе

ТАг

Уа1

Агд

С1у

370

375

380

Ьуз

Рго

ТАг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

Ьуз

РАе

Туг

Суз

385

390

395

400

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

Уа1

Ьуз

Азр

405

410

415

ТАг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

11е

Азр

А1а

420

425

430

РАе

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

МеА

С1и

ТАг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

РАе

435

440

445

<210> 6

<211> 445

<212> белок

<213> Ното

зартепз

<220>

<223> растворимая гНиРН20 1-

-445

<400> 6

Ьеи Азп РАе

Агд А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

РАе

Ьеи

Тгр

1

5

10

15

А1а Тгр Азп

А1а Рго

Зег

С1и

РАе

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

РАе

Азр

С1и

Рго

20

25

30

Ьеи Азр МеА

Зег Ьеи

РАе

Зег

РАе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

11е

Азп

А1а

35

40

45

ТАг С1у С1п

С1у Уа1

ТАг

11е

РАе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

С1у

Туг

Туг

50

55

60

Рго Туг 11е

Азр Зег

11е

ТАг

С1у

Уа1

ТАг

Уа1

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

- 88 026112

70 75 80

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи 85

С1п

Азр

ΗΪ8

Ьеи

Азр 90

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьуз

Азр 95

11е

ТАг

РАе

Туг

МеА

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

МеА

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТАг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

Уа1

115

120

125

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

Уа1

С1п

Ьеи

130

135

140

Зег

Ьеи

ТАг

С1и

А1а

ТАг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РАе

С1и

Ьуз

А1а

145

150

155

160

С1у

Ьуз

Азр

РАе

Ьеи

Уа1

С1и

ТАг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Агд

165

170

175

Рго

Азп

ΗΪ8

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РАе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Η^з

180

185

190

ΗΪ5

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РАе

Азп

Уа1

С1и

11е

195

200

205

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

ТАг

А1а

Ьеи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТАг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

ТАг

225

230

235

240

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Ьуз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РАе

А1а

Туг

ТАг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

РАе

ТАг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РАе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

Туг

275

280

285

ТАг

РАе

С1у

С1и

ТАг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

290

295

300

С1у

ТАг

Ьеи

Зег

11е

МеА

Агд

Зег

МеА

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Азр

305

310

315

320

Азп

Туг

МеА

С1и

ТАг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

Уа1

ТАг

Ьеи

325

330

335

А1а

А1а

Ьуз

МеА

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

ΗΪ8

Ьеи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РАе

ТАг

Уа1

Агд

С1у

370

375

380

Ьуз

Рго

ТАг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

Ьуз

РАе

Туг

Суз

- 89 026112

385

390

395

400

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

^еи

Зег

Суз

^уз

С1и

^уз

А1а

Азр

να1

^уз

Азр

405

410

415

ТАг

Азр

А1а

ναι

Азр

ναι

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

να1

Суз

11е

Азр

А1а

420

425

430

РАе

^еи

^уз

Рго

Рго

Меб

С1и

ТАг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

435 440 445 <210> 7 <211> 444 <212> белок <213> Ното зарбепз <220>

<223> растворимая гНиРН20 1-444 <400> 7

^еи

Азп

РАе

Агд

А1а

Рго

Рго

να1

11е

Рго

Азп

να1

Рго

РАе

^еи

Тгр

1

5

10

15

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РАе

Суз

^еи

С1у

^уз

РАе

Азр

С1и

Рго

20

25

30

^еи

Азр

Меб

Зег

^еи

РАе

Зег

РАе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

11е

Азп

А1а

35

40

45

ТАг

С1у

С1п

С1у

να1

ТАг

11е

РАе

Туг

να1

Азр

Агд

^еи

С1у

Туг

Туг

50

55

60

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТАг

С1у

να1

ТАг

να1

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

65

70

75

80

С1п

^уз

11е

Зег

^еи

С1п

Азр

Нтз

^еи

Азр

^уз

А1а

^уз

^уз

Азр

11е

85

90

95

ТАг

РАе

Туг

Меб

Рго

να1

Азр

Азп

^еи

С1у

Меб

А1а

να1

11е

Азр

Тгр

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТАг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

^уз

Рго

^уз

Азр

να1

115

120

125

Туг

^уз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

^еи

να1

С1п

С1п

С1п

Азп

να1

С1п

^еи

130

135

140

Зег

^еи

ТАг

С1и

А1а

ТАг

С1и

^уз

А1а

^уз

С1п

С1и

РАе

С1и

^уз

А1а

145

150

155

160

С1у

^уз

Азр

РАе

^еи

Уа1

С1и

ТАг

11е

^уз

^еи

С1у

^уз

^еи

^еи

Агд

165

170

175

- 90 026112

Рго

Азп

Низ

Теи 180

Тгр

С1у

Туг

Туг

Теи 185

РТе

Рго

Азр

Суз

Туг 190

Азп

Низ

ΗΪ5

Туг

Туз

Туз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РТе

Азп

Уа1

С1и

11е

195

200

205

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Теи

Зег

Тгр

Теи

Тгр

Азп

С1и

Зег

ТТг

А1а

Теи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Теи

Азп

ТТг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

ТТг

225

230

235

240

Теи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Туз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

Туз

Зег

Рго

Теи

Рго

Уа1

РТе

А1а

Туг

ТТг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

РТе

ТТг

Азр

С1п

Уа1

Теи

Туз

РТе

Теи

Зег

С1п

Азр

С1и

Теи

Уа1

Туг

275

280

285

ТТг

РТе

С1у

С1и

ТТг

Уа1

А1а

Теи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

290

295

300

С1у

ТТг

Теи

Зег

11е

МеТ

Агд

Зег

МеТ

Туз

Зег

Суз

Теи

Теи

Теи

Азр

305

310

315

320

Азп

Туг

МеТ

С1и

ТТг

11е

Теи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

Уа1

ТТг

Теи

325

330

335

А1а

А1а

Туз

МеТ

Суз

Зег

С1п

Уа1

Теи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

Туз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Теи

Низ

Теи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

Азп

РТе

А1а

11е

С1п

Теи

С1и

Туз

С1у

С1у

Туз

РТе

ТТг

Уа1

Агд

С1у

370

375

380

Туз

Рго

ТТг

Теи

С1и

Азр

Теи

С1и

С1п

РТе

Зег

С1и

Туз

РТе

Туг

Суз

385

390

395

400

Зег

Суз

Туг

Зег

ТТг

Теи

Зег

Суз

Туз

С1и

Туз

А1а

Азр

Уа1

Туз

Азр

405

410

415

ТТг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

11е

Азр

А1а

420

425

430

РТе

Теи

Туз

Рго

Рго

МеТ

С1и

ТТг

С1и

С1и

Рго

С1п

435 440 <210> 8 <211> 443 <212> белок

- 91 026112 <213> Ното зартепз <220>

<223> растворимая гНиРН20 1-443 <400> 8

Ьеи

Азп

РЬе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

РЬе

Ьеи

Тгр

1

5

10

15

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РЬе

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

РЬе

Азр

С1и

Рго

20

25

30

Ьеи

Азр

МеЬ

Зег

Ьеи

РЬе

Зег

РЬе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

11е

Азп

А1а

35

40

45

ТЬг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТЬг

11е

РЬе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

С1у

Туг

Туг

50

55

60

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТЬг

С1у

Уа1

ТЬг

Уа1

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

65

70

75

80

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

Азр

Нтз

Ьеи

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьуз

Азр

11е

85

90

95

ТЬг

РЬе

Туг

МеЬ

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

МеЬ

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТЬг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

Уа1

115

120

125

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

Уа1

С1п

Ьеи

130

135

140

Зег

Ьеи

ТЬг

С1и

А1а

ТЬг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РЬе

С1и

Ьуз

А1а

145

150

155

160

С1у

Ьуз

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

С1и

ТЬг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Агд

165

170

175

Рго

Азп

Нтз

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РЬе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Нтз

180

185

190

Нтз

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РЬе

Азп

Уа1

С1и

11е

195

200

205

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

ТЬг

А1а

Ьеи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТЬг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

ТЬг

225

230

235

240

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Ьуз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РЬе

А1а

Туг

ТЬг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

- 92 026112

РНе

ТНг

Азр 275

С1п

Уа1

Теи

Туз

РНе 280

Теи

Зег

С1п

Азр

С1и 285

Теи

Уа1

Туг

ТНг

РНе

С1у

С1и

ТНг

Уа1

А1а

Теи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

290

295

300

С1у

ТНг

Теи

Зег

11е

МеН

Агд

Зег

МеН

Туз

Зег

Суз

Теи

Теи

Теи

Азр

305

310

315

320

Азп

Туг

МеН

С1и

ТНг

11е

Теи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

Уа1

ТНг

Теи

325

330

335

А1а

А1а

Туз

МеН

Суз

Зег

С1п

Уа1

Теи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

Туз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Теи

Нтз

Теи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

Азп

РНе

А1а

11е

С1п

Теи

С1и

Туз

С1у

С1у

Туз

РНе

ТНг

Уа1

Агд

С1у

370

375

380

Туз

Рго

ТНг

Теи

С1и

Азр

Теи

С1и

С1п

РНе

Зег

С1и

Туз

РНе

Туг

Суз

385

390

395

400

Зег

Суз

Туг

Зег

ТНг

Теи

Зег

Суз

Туз

С1и

Туз

А1а

Азр

Уа1

Туз

Азр

405

410

415

ТНг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

11е

Азр

А1а

420

425

430

РНе

Теи

Туз

Рго

Рго

МеН

С1и

ТНг

С1и

С1и

Рго

435 440 <210> 9 <211> 442 <212> белок <213> Ното зариепз <220>

<223> растворимая гНиРН20 1-442 <400> 9

Теи

Азп

РНе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

РНе

Теи

Тгр

1

5

10

15

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РНе

Суз

Теи

С1у

Туз

РНе

Азр

С1и

Рго

20

25

30

Теи

Азр

МеН

Зег

Теи

РНе

Зег

РНе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

11е

Азп

А1а

35

40

45

- 93 026112

ТЬг

С1у 50

С1п

С1у

Уа1

ТЬг

11е 55

РЬе

Туг

Уа1

Азр

Агд 60

Ьеи

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТЬг

С1у

Уа1

ТЬг

Уа1

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

65

70

75

80

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

Азр

Нтз

Ьеи

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьуз

Азр

11е

85

90

95

ТЬг

РЬе

Туг

МеЬ

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

МеЬ

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТЬг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

Уа1

115

120

125

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

Уа1

С1п

Ьеи

130

135

140

Зег

Ьеи

ТЬг

С1и

А1а

ТЬг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РЬе

С1и

Ьуз

А1а

145

150

155

160

С1у

Ьуз

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

С1и

ТЬг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Агд

165

170

175

Рго

Азп

Нтз

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РЬе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Нтз

180

185

190

Нтз

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РЬе

Азп

Уа1

С1и

11е

195

200

205

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

ТЬг

А1а

Ьеи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТЬг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

ТЬг

225

230

235

240

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Ьуз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РЬе

А1а

Туг

ТЬг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

РЬе

ТЬг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РЬе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

Туг

275

280

285

ТЬг

РЬе

С1у

С1и

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

290

295

300

С1у

ТЬг

Ьеи

Зег

11е

МеЬ

Агд

Зег

МеЬ

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Азр

305

310

315

320

Азп

Туг

МеЬ

С1и

ТЬг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

Уа1

ТЬг

Ьеи

325

330

335

А1а

А1а

Ьуз

МеЬ

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

Нтз

Ьеи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

- 94 026112

Азп РАе А1а 11е С1п Ьеи С1и Ьуз С1у С1у Ьуз РАе ТАг Уа1 Агд С1у 370 375 380

Ьуз Рго ТАг Ьеи С1и Азр Ьеи С1и С1п РАе Зег С1и Ьуз РАе Туг Суз

385 390 395 400

Зег Суз Туг Зег ТАг Ьеи Зег Суз Ьуз С1и Ьуз А1а Азр Уа1 Ьуз Азр

405 410 415

ТАг Азр А1а Уа1 Азр Уа1 Суз 11е А1а Азр С1у Уа1 Суз 11е Азр А1а

420 425 430

РАе Ьеи Ьуз Рго Рго МеА С1и ТАг С1и С1и

435 440 <210> 10 <211> 450 <212> белок <213> Воз Ааигиз <220>

<223> гиалуронидаза <400> 10

МеА	Агд	Рго	РАе	Зег	Ьеи	С1и	Уа1
1				5
А1а	А1а	Нгз	Ьеи	Ьеи	Рго	Уа1	Суз
			20
МеА	ТАг	С1п	С1у	Зег	Агд	Азр	Рго
		35					40
ТАг	11е	Тгр	Азп	А1а	Азп	ТАг	С1и
	50					55
Азр	Уа1	Азр	11е	Зег	11е	РАе	Азр
65					70
РАе	Агд	С1у	Рго	Азп	МеА	ТАг	11е
				85
Туг	Рго	Туг	Туг	ТАг	Зег	А1а	С1у
			100
С1п	Азп	А1а	Зег	Ьеи	Азп	А1а	Нгз
		115					120
Ьеи	А1а	А1а	МеА	Рго	С1и	Рго	Агд
	130					135
Тгр	С1и	А1а	Тгр	Агд	Рго	Агд	Тгр

Зег	Ьеи 10	Нгз	Ьеи	Рго	Тгр	А1а 15	МеА
ТАг	Ьеи	РАе	Ьеи	Азп	Вей	Вей	Зег
25					30
Уа1	Уа1	Рго	Азп	С1п	Рго	РАе	ТАг
				45
Тгр	Суз	МеА	Вуз	Вуз	Нгз	С1у	Уа1
			60
Уа1	Уа1	ТАг	Азп	Рго	С1у	С1п	ТАг
		75					80
РАе	Туг	Зег	Зег	С1п	Вей	С1у	ТАг
	90					95
С1и	Рго	Уа1	РАе	С1у	С1у	Вей	Рго
105					110
Ьеи	А1а	Агд	ТАг	РАе	С1п	Азр	11е
				125
РАе	Зег	С1у	Вей	А1а	Уа1	11е	Азр
			140
А1а	РАе	Азп	Тгр	Азр	ТАг	Вуз	Азр

- 95 026112

145

150

155

160

11е

Туг

Агд

С1п

Агд

Зег

Агд

А1а

Ьеи

Уа1

С1п

Ьуз

С1п

Нтз

Рго

Азр

165

170

175

Тгр

Ьеи

А1а

Рго

Агд

Уа1

С1и

А1а

А1а

А1а

С1п

Азр

С1п

РНе

С1и

С1у

180

185

190

А1а

А1а

С1и

С1и

Тгр

МеН

А1а

С1у

ТНг

Ьеи

Ьуз

Ьеи

С1у

С1п

А1а

Ьеи

195

200

205

Агд

Рго

С1п

С1у

Ьеи

Тгр

С1у

РНе

Туг

Азп

РНе

Рго

С1и

Суз

Туг

Азп

210

215

220

Туг

Азр

РНе

Ьуз

Зег

Рго

Азп

Туг

ТНг

С1у

Агд

Суз

Рго

Ьеи

Азп

11е

225

230

235

240

Суз

А1а

С1п

Азп

Азр

С1п

Ьеи

С1у

Тгр

Ьеи

Тгр

С1у

С1п

Зег

Агд

А1а

245

250

255

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Ьеи

С1и

С1у

ТНг

Ьуз

Ьуз

260

265

270

ТНг

С1п

МеН

РНе

Уа1

С1п

Нтз

Агд

Уа1

А1а

С1и

А1а

РНе

Агд

Уа1

А1а

275

280

285

А1а

С1у

А1а

С1у

Азр

Рго

Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

Рго

Туг

МеН

С1п

Ьеи

290

295

300

РНе

Туг

Азр

МеН

ТНг

Азп

Нтз

РНе

Ьеи

Рго

А1а

С1и

С1и

Ьеи

С1и

Нтз

305

310

315

320

Зег

Ьеи

С1у

С1и

Зег

А1а

А1а

С1п

С1у

А1а

А1а

С1у

Уа1

Уа1

Ьеи

Тгр

325

330

335

Уа1

Зег

Тгр

Ьеи

Зег

ТНг

Зег

ТНг

Ьуз

С1и

Зег

Суз

С1п

А1а

11е

Ьуз

340

345

350

С1и

Туг

Уа1

Азр

ТНг

ТНг

Ьеи

С1у

Рго

Зег

11е

Ьеи

Азп

Уа1

ТНг

Зег

355

360

365

С1у

А1а

Агд

Ьеи

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

Зег

С1у

Нтз

С1у

Агд

Суз

370

375

380

А1а

Агд

Агд

Рго

Зег

Туг

Рго

Ьуз

А1а

Агд

Ьеи

11е

Ьеи

Азп

Зег

ТНг

385

390

395

400

Зег

РНе

Зег

11е

Ьуз

Рго

ТНг

Рго

С1у

С1у

С1у

Рго

Ьеи

ТНг

Ьеи

С1п

405

410

415

С1у

А1а

Ьеи

Зег

Ьеи

С1и

Азр

Агд

Ьеи

Агд

МеН

А1а

Уа1

С1и

РНе

С1и

420

425

430

Суз

Агд

Суз

Туг

Агд

С1у

Тгр

Агд

С1у

ТНг

Агд

Суз

С1и

С1п

Тгр

С1у

435

440

445

МеН Тгр 450

- 96 026112 <210> 11 <211> 553 <212> белок <213> Воз Наигиз <220>

<223> РН20 <400> 11

МеН

Агд

МеН

Теи

Агд

Агд

Нбз

Нбз

11е

Зег

РНе

Агд

Зег

РНе

А1а

С1у

1

5

10

15

Зег

Зег

С1у

ТНг

Рго

С1п

А1а

Уа1

РНе

ТНг

РНе

Теи

Теи

Теи

Рго

Суз

20

25

30

Суз

Теи

А1а

Теи

Азр

РНе

Агд

А1а

Рго

Рго

Теи

11е

Зег

Азп

ТНг

Зег

35

40

45

РНе

Теи

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Уа1

С1и

Агд

Суз

Уа1

Азп

Агд

Агд

50

55

60

РНе

С1п

Теи

Рго

Рго

Азр

Теи

Агд

Теи

РНе

Зег

Уа1

Туз

С1у

Зег

Рго

65

70

75

80

С1п

Туз

Зег

А1а

ТНг

С1у

С1п

РНе

11е

ТНг

Теи

РНе

Туг

А1а

Азр

Агд

85

90

95

Теи

С1у

Туг

Туг

Рго

Нбз

11е

Азр

С1и

Туз

ТНг

С1у

Туз

ТНг

Уа1

РНе

100

105

110

С1у

С1у

11е

Рго

С1п

Теи

С1у

Азп

Теи

Туз

Зег

Нбз

МеН

С1и

Туз

А1а

115

120

125

Туз

Азп

Азр

11е

А1а

Туг

Туг

11е

Рго

Азп

Азр

Зег

Уа1

С1у

Теи

А1а

130

135

140

Уа1

11е

Азр

Тгр

С1и

Азп

Тгр

Агд

Рго

ТНг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Туз

145

150

155

160

Рго

Туз

Азр

Уа1

Туг

Агд

Азр

С1и

Зег

Уа1

С1и

Теи

Уа1

Теи

С1п

Туз

165

170

175

Азп

Рго

С1п

Теи

Зег

РНе

Рго

С1и

А1а

Зег

Туз

11е

А1а

Туз

Уа1

Азр

180

185

190

РНе

С1и

ТНг

А1а

С1у

Туз

Зег

РНе

МеН

С1п

С1и

ТНг

Теи

Туз

Теи

С1у

195

200

205

Туз

Теи

Теи

Агд

Рго

Азп

Нбз

Теи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Теи

РНе

Рго

Азр

210

215

220

Суз

Туг

Азп

Нбз

Азп

Нбз

Азп

С1п

Рго

ТНг

Туг

Азп

С1у

Азп

Суз

Рго

- 97 026112

225 230 235 240

Азр

Уа1

С1и

Ьуз

Агд 245

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи 250

С1и

Тгр

Ьеи

Тгр

Ьуз 255

С1и

Зег

ТАг

А1а

Ьеи

РАе

Рго

Зег

Уа1

Туг

Ьеи

Азп

11е

Агд

Ьеи

Ьуз

Зег

260

265

270

ТАг

С1п

Азп

А1а

А1а

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

С1п

С1и

А1а

11е

275

280

285

Агд

Ьеи

Зег

Ьуз

11е

А1а

Зег

Уа1

С1и

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РАе

Уа1

290

295

300

Туг

А1а

Агд

Рго

Уа1

РАе

ТАг

Азр

С1у

Зег

Зег

ТАг

Туг

Ьеи

Зег

С1п

305

310

315

320

С1у

Азр

Ьеи

Уа1

Азп

Зег

Уа1

С1у

С1и

11е

Уа1

Зег

Ьеи

С1у

А1а

Зег

325

330

335

С1у

11е

11е

МеА

Тгр

С1у

Зег

Ьеи

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

МеА

С1п

Зег

340

345

350

Суз

МеА

Азп

Ьеи

С1у

ТАг

Туг

Ьеи

Азп

ТАг

ТАг

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

355

360

365

11е

Азп

Уа1

ТАг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеА

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

Η^з

370

375

380

Азп

С1и

С1у

Уа1

Суз

ТАг

Агд

Ьуз

Η^з

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

385

390

395

400

Η^з

Ьеи

Азп

Рго

МеА

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

ТАг

С1у

С1и

С1у

С1у

Ьуз

405

410

415

Туг

ТАг

Уа1

Рго

С1у

ТАг

Уа1

ТАг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1п

Ьуз

РАе

Зег

420

425

430

Азр

ТАг

РАе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

А1а

Азп

11е

Η^з

Суз

Ьуз

Ьуз

Агд

435

440

445

Уа1

Азр

11е

Ьуз

Азп

Уа1

Η^з

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Суз

МеА

А1а

С1и

Азр

450

455

460

11е

Суз

11е

Азр

Зег

Рго

Уа1

Ьуз

Ьеи

С1п

Рго

Зег

Азр

Η^з

Зег

Зег

465

470

475

480

Зег

С1п

С1и

А1а

Зег

ТАг

ТАг

ТАг

РАе

Зег

Зег

11е

Зег

Рго

Зег

ТАг

485

490

495

ТАг

ТАг

А1а

ТАг

Уа1

Зег

Рго

Суз

ТАг

Рго

С1и

Ьуз

Η^з

Зег

Рго

С1и

500

505

510

Суз

Ьеи

Ьуз

Уа1

Агд

Суз

Зег

С1и

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

ТАг

С1п

Ьуз

515

520

525

А1а

Суз

С1п

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Ьуз

Азп

11е

Зег

Туг

С1п

Зег

Рго

11е

530

535

540

- 98 026112

С1п Азп 11е Туз Азп С1п ТЬг ТЬг Туг 545 550 <210> 12 <211> 331 <212> белок <213> Уезри1а νи1да^^з <220>

<223> гиалуронидаза А <400> 12

Зег

С1и

Агд

Рго

Туз

Агд

Уа1

РЬе

Азп

11е

Туг

Тгр

Азп

Уа1

Рго

ТЬг

1

5

10

15

РЬе

Ме!

Суз

Нгз

С1п

Туг

Азр

Теи

Туг

РЬе

Азр

С1и

Уа1

ТЬг

Азп

РЬе

20

25

30

Азп

11е

Туз

Агд

Азп

Зег

Туз

Азр

Азр

РЬе

С1п

С1у

Азр

Туз

11е

А1а

35

40

45

11е

РЬе

Туг

Азр

Рго

С1у

С1и

РЬе

Рго

А1а

Теи

Теи

Зег

Теи

Туз

Азр

50

55

60

С1у

Туз

Туг

Туз

Туз

Агд

Азп

С1у

С1у

Уа1

Рго

С1п

С1и

С1у

Азп

11е

65

70

75

80

ТЬг

11е

Нгз

Теи

С1п

Туз

РЬе

11е

С1и

Азп

Теи

Азр

Туз

11е

Туг

Рго

85

90

95

Азп

Агд

Азп

РЬе

Зег

С1у

11е

С1у

Уа1

11е

Азр

РЬе

С1и

Агд

Тгр

Агд

100

105

110

Рго

11е

РЬе

Агд

С1п

Азп

Тгр

С1у

Азп

Ме!

Туз

11е

Нгз

Туз

Азп

РЬе

115

120

125

Зег

11е

Азр

Теи

Уа1

Агд

Азп

С1и

Нгз

Рго

ТЬг

Тгр

Азп

Туз

Туз

Ме!

130

135

140

11е

С1и

Теи

С1и

А1а

Зег

Туз

Агд

РЬе

С1и

Туз

Туг

А1а

Агд

РЬе

РЬе

145

150

155

160

Ме!

С1и

С1и

ТЬг

Теи

Туз

Теи

А1а

Туз

Туз

ТЬг

Агд

Туз

С1п

А1а

Азр

165

170

175

Тгр

С1у

Туг

Туг

С1у

Туг

Рго

Туг

Суз

РЬе

Азп

Ме!

Зег

Рго

Азп

Азп

180

185

190

Теи

Уа1

Рго

С1и

Суз

Азр

Уа1

ТЬг

А1а

Ме!

Нгз

С1и

Азп

Азр

Туз

Ме!

195

200

205

Зег

Тгр

Теи

РЬе

Азп

Азп

С1п

Азп

Уа1

Теи

Теи

Рго

Зег

Уа1

Туг

Уа1

- 99 026112

210

215

220

Агд

С1п

С1и

Вей

ТВг

Рго

Азр

С1п

Агд

11е

С1у

Вей

Уа1

С1п

С1у

Агд

225

230

235

240

Уа1

Вуз

С1и

А1а

Уа1

Агд

11е

Зег

Азп

Азп

Вей

Вуз

Нгз

Зег

Рго

Вуз

245

250

255

Уа1

Вей

Зег

Туг

Тгр

Тгр

Туг

Уа1

Туг

С1п

Азр

С1и

ТВг

Азп

ТВг

РВе

260

265

270

Вей

ТВг

С1и

ТВг

Азр

Уа1

Вуз

Вуз

ТВг

РВе

С1п

С1и

11е

Уа1

11е

Азп

275

280

285

С1у

С1у

Азр

С1у

11е

11е

11е

Тгр

С1у

Зег

Зег

Зег

Азр

Уа1

Азп

Зег

290

295

300

Вей

Зег

Вуз

Суз

Вуз

Агд

Вей

С1п

Азр

Туг

Вей

Вей

ТВг

Уа1

Вей

С1у

305

310

315

320

Рго

11е

А1а

11е

Азп

Уа1

ТВг

С1и

А1а

Уа1

Азп

325

330

<210> 13 <211> 340 <212> белок <213> Уезри1а уи1дагбз <220>

<223> гиалуронидаза В <400> 13

Азр Агд ТВг 11е Тгр Рго Вуз Вуз С1у РВе Зег 11е Туг Тгр Азп 11е 1 5 10 15

Рго ТВг Нгз РВе Суз Нгз Азп РВе С1у Уа1 Туг РВе Вуз С1и Вей Вуз 20 25 30

С1п РВе Азп 11е Вуз Туг Азп Зег Меб Азп Азп РВе Агд С1у С1и ТВг 35 40 45

11е Зег Вей РВе Туг Азр Рго С1у Азп РВе Рго Зег Меб Уа1 Вей Вей 50 55 60

Вуз Азп С1у ТВг Туг С1и 11е Агд Азп С1и С1у Уа1 Рго С1п Вуз С1у

70 75 80

Азп Вей ТВг 11е Нгз Вей С1и С1п РВе ТВг Вуз С1и Вей Азр С1и 11е

90 95

Туг Рго Вуз Вуз 11е А1а С1у С1у 11е С1у Уа1 11е Нгз РВе Нгз Азп

100 105 110

100 026112

Тгр

Агд

Рго 115

11е

РНе

Агд

Агд

Азп 120

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

Ьуз 125

11е

Азп

Ьуз

Азр

11е

Зег

11е

Азр

Ьеи

Уа1

Агд

Ьуз

С1и

НЬз

Рго

Ьуз

Тгр

Азр

Ьуз

130

135

140

Зег

МеЬ

11е

С1и

Ьуз

С1и

А1а

Зег

Азп

Агд

РНе

С1и

ТНг

Зег

А1а

Ьуз

145

150

155

160

11е

РНе

МеЬ

С1и

Ьуз

ТНг

Ьеи

Ьуз

Ьеи

А1а

Ьуз

С1и

11е

Агд

Ьуз

Ьуз

165

170

175

ТНг

С1и

Тгр

С1у

Туг

НЬз

С1у

Туг

Рго

НЬз

Суз

Ьеи

Зег

С1у

Зег

ТНг

180

185

190

Азр

Ьуз

Рго

Зег

РНе

Азр

Суз

Азр

А1а

Ьеи

Зег

МеЬ

Зег

С1и

Азп

Азр

195

200

205

Ьуз

МеЬ

Зег

Тгр

Ьеи

РНе

Азп

Азп

С1п

Азп

Уа1

Ьеи

Ьеи

Рго

Зег

11е

210

215

220

Туг

Ьеи

Ьуз

Азп

Уа1

Ьеи

Ьуз

Рго

Азр

С1и

Ьуз

11е

НЬз

Ьеи

Уа1

С1п

225

230

235

240

С1и

Агд

Ьеи

Ьуз

С1и

А1а

11е

Агд

11е

Зег

Ьуз

Азп

РНе

Ьуз

НЬз

Ьеи

245

250

255

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

Рго

Туг

Тгр

Тгр

Туг

ТНг

Туг

С1п

Азр

Ьуз

С1и

Зег

260

265

270

11е

РНе

Ьеи

ТНг

С1и

А1а

Азр

Уа1

Ьуз

Азп

ТНг

РНе

Ьуз

С1и

11е

Ьеи

275

280

285

ТНг

Азп

С1у

А1а

Азр

СЬу

11е

11е

11е

Тгр

С1у

Уа1

Зег

Туг

С1и

Ьеи

290

295

300

ТНг

Азр

Агд

Ьуз

Агд

Суз

С1и

Ьуз

Ьеи

Ьуз

С1и

Туг

Ьеи

МеЬ

Ьуз

11е

305

310

315

320

Ьеи

С1у

Рго

11е

А1а

РНе

Ьуз

Уа1

ТНг

Ьуз

А1а

Уа1

Ьуз

С1и

Азп

ТНг

325

330

335

Рго Ьеи Азп РНе

340

<210>	14
<211>	382
<212>	белок
<213>	АрЬз теЫЬГега
<220>
<223>	гиалуронидаза

101 026112 <400> 14

МеА 1

Зег

Агд

Рго

Ьеи 5

Уа1

11е

ТАг

С1и

С1у 10

МеА

МеА

11е

С1у

Уа1 15

Ьеи

Ьеи

МеА

Ьеи

А1а

Рго

11е

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьеи

С1у

РАе

Уа1

С1п

Зег

20

25

30

ТАг

Рго

Азр

Азп

Азп

Ьуз

ТАг

Уа1

Агд

С1и

РАе

Азп

Уа1

Туг

Тгр

Азп

35

40

45

Уа1

Рго

ТАг

РАе

МеА

Суз

ΗΪ8

Ьуз

Туг

С1у

Ьеи

Агд

РАе

С1и

С1и

Уа1

50

55

60

Зег

С1и

Ьуз

Туг

С1у

11е

Ьеи

С1п

Азп

Тгр

МеА

Азр

Ьуз

РАе

Агд

С1у

65

70

75

80

С1и

С1и

11е

А1а

11е

Ьеи

Туг

Азр

Рго

С1у

МеА

РАе

Рго

А1а

Ьеи

Ьеи

85

90

95

Ьуз

Азр

Рго

Азп

С1у

Азп

Уа1

Уа1

А1а

Агд

Азп

С1у

С1у

Уа1

Рго

С1п

100

105

110

Ьеи

С1у

Азп

Ьеи

ТАг

Ьуз

ΗΪ8

Ьеи

С1п

Уа1

РАе

Агд

Азр

Нтз

Ьеи

11е

115

120

125

Азп

С1п

11е

Рго

Азр

Ьуз

Зег

РАе

Рго

С1у

Уа1

С1у

Уа1

11е

Азр

РАе

130

135

140

С1и

Зег

Тгр

Агд

Рго

11е

РАе

Агд

С1п

Азп

Тгр

А1а

Зег

Ьеи

С1п

Рго

145

150

155

160

Туг

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Зег

Уа1

С1и

Уа1

Уа1

Агд

Агд

С1и

Нтз

Рго

РАе

Тгр

165

170

175

Азр

Азр

С1п

Агд

Уа1

С1и

С1п

С1и

А1а

Ьуз

Агд

Агд

РАе

С1и

Ьуз

Туг

180

185

190

С1у

С1п

Ьеи

РАе

МеА

С1и

С1и

ТАг

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

Ьуз

Агд

МеА

Агд

195

200

205

Рго

А1а

А1а

Азп

Тгр

С1у

Туг

Туг

А1а

Туг

Рго

Туг

Суз

Туг

Азп

Ьеи

210

215

220

ТАг

Рго

Азп

С1п

Рго

Зег

А1а

С1п

Суз

С1и

А1а

ТАг

ТАг

МеА

С1п

С1и

225

230

235

240

Азп

Азр

Ьуз

МеА

Зег

Тгр

Ьеи

РАе

С1и

Зег

С1и

Азр

Уа1

Ьеи

Ьеи

Рго

245

250

255

Зег

Уа1

Туг

Ьеи

Агд

Тгр

Азп

Ьеи

ТАг

Зег

С1у

С1и

Агд

Уа1

С1у

Ьеи

260

265

270

Уа1

С1у

С1у

Агд

Уа1

Ьуз

С1и

А1а

Ьеи

Агд

11е

А1а

Агд

С1п

МеА

ТАг

275

280

285

ТАг

Зег

Агд

Ьуз

Ьуз

Уа1

Ьеи

Рго

Туг

Туг

Тгр

Туг

Ьуз

Туг

С1п

Азр

290

295

300

102 026112

Агд

Агд

Азр

ТНг

Азр

Теи

Зег

Агд

А1а

Азр

Теи

С1и

А1а

ТНг

Теи

Агд

305

310

315

320

Туз

11е

ТНг

Азр

Теи

С1у

А1а

Азр

С1у

РНе

11е

11е

Тгр

С1у

Зег

Зег

325

330

335

Азр

Азр

11е

Азп

ТНг

Туз

А1а

Туз

Суз

Теи

С1п

РНе

Агд

С1и

Туг

Теи

340

345

350

Азп

Азп

С1и

Теи

С1у

Рго

А1а

Уа1

Туз

Агд

11е

А1а

Теи

Азп

Азп

Азп

355

360

365

А1а

Азп

Азр

Агд

Теи

ТНг

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Уа1

Азр

С1п

Уа1

370

375

380

<210> 15 <211> 331 <212> белок <213> Е>о11сНоуезри1а таси1аНа <220>

<223> гиалуронидаза <400> 15

Зег С1и Агд Рго Туз Агд Уа1 РНе Азп 11е Туг Тгр Азп Уа1 Рго ТНг 1 5 10 15

РНе МеН Суз Нгз С1п Туг С1у Теи Туг РНе Азр С1и Уа1 ТНг Азп РНе 20 25 30

Азп 11е Туз Нгз Азп Зег Туз Азр Азр РНе С1п С1у Азр Туз 11е Зег 35 40 45

11е РНе Туг Азр Рго С1у С1и РНе Рго А1а Теи Теи Рго Теи Туз С1и 50 55 60

С1у Азп Туг Туз 11е Агд Азп С1у С1у Уа1 Рго С1п С1и С1у Азп 11е

70 75 80

ТНг 11е Низ Теи С1п Агд РНе 11е С1и Азп Теи Азр Туз ТНг Туг Рго

90 95

Азп Агд Азп РНе Азп С1у 11е С1у Уа1 11е Азр РНе С1и Агд Тгр Агд

100 105 110

Рго 11е РНе Агд С1п Азп Тгр С1у Азп МеН МеН 11е Низ Туз Туз РНе

115 120 125

Зег 11е Азр Теи Уа1 Агд Азп С1и Низ Рго РНе Тгр Азр Туз Туз МеН

130 135 140

11е С1и Теи С1и А1а Зег Туз Агд РНе С1и Туз Туг А1а Агд Теи РНе

103 026112

145

150

155

160

Мек

С1и

С1и

Тйг

Ьеи

Ьуз

Ьеи

А1а

Ьуз

Ьуз

Тйг

Агд

Ьуз

С1п

А1а

Азр

165

170

175

Тгр

С1у

Туг

Туг

С1у

Туг

Рго

Туг

Суз

Рйе

Азп

Мек

Зег

Рго

Азп

Азп

180

185

190

Ьеи

Уа1

Рго

Азр

Суз

Азр

А1а

Тйг

А1а

Мек

Ьеи

С1и

Азп

Азр

Ьуз

Мек

195

200

205

Зег

Тгр

Ьеи

Рйе

Азп

Азп

С1п

Азп

Уа1

Ьеи

Ьеи

Рго

Зег

Уа1

Туг

11е

210

215

220

Агд

Нтз

С1и

Ьеи

Тйг

Рго

Азр

С1п

Агд

Уа1

С1у

Ьеи

Уа1

С1п

С1у

Агд

225

230

235

240

Уа1

Ьуз

С1и

А1а

Уа1

Агд

11е

Зег

Азп

Азп

Ьеи

Ьуз

Нтз

Зег

Рго

Ьуз

245

250

255

Уа1

Ьеи

Зег

Туг

Тгр

Тгр

Туг

Уа1

Туг

С1п

Азр

Азр

Тйг

Азп

Тйг

Рйе

260

265

270

Ьеи

Тйг

С1и

Тйг

Азр

Уа1

Ьуз

Ьуз

Тйг

Рйе

С1п

С1и

11е

А1а

11е

Азп

275

280

285

С1у

С1у

Азр

С1у

11е

11е

11е

Тгр

С1у

Зег

Зег

Зег

Азр

Уа1

Азп

Зег

290

295

300

Ьеи

Зег

Ьуз

Суз

Ьуз

Агд

Ьеи

Агд

С1и

Туг

Ьеи

Ьеи

Тйг

Уа1

Ьеи

С1у

305

310

315

320

Рго

11е

Тйг

Уа1

Азп

Уа1

Тйг

С1и

Тйг

Уа1

Азп

325 330 <210> 16 <211> 367 <212> белок <213> РоИзкез аппи1агтз <220>

<223> гиалуронидаза <400> 16

Туг

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Рго

Азр

Зег

Уа1

Рйе

Азп

11е

11е

Тйг

Азр

Азр

1

5

10

15

11е

Зег

Нтз

С1п

11е

Ьеи

Зег

Агд

Зег

Азп

Суз

С1и

Агд

Зег

Ьуз

Агд

20

25

30

Рго

Ьуз

Агд

Уа1

Рйе

Зег

11е

Туг

Тгр

Азп

Уа1

Рго

Тйг

Рйе

Мек

Суз

104 026112

35

40

45

ΗΪ8

С1п

Туг

С1у

МеТ

Азп

РТе

Азр

С1и

Уа1

ТТг

Азр

РТе

Азп

11е

Туз

50

55

60

ΗΪ8

Азп

Зег

Туз

Азр

Азп

РТе

Агд

С1у

С1и

ТТг

11е

Зег

11е

Туг

Туг

65

70

75

80

Азр

Рго

С1у

Туз

РТе

Рго

А1а

Теи

МеТ

Рго

Теи

Туз

Азп

С1у

Азп

Туг

85

90

95

С1и

С1и

Агд

Азп

С1у

С1у

Уа1

Рго

С1п

Агд

С1у

Азп

11е

ТТг

11е

Η^з

100

105

110

Теи

С1п

С1п

РТе

Азп

С1и

Азр

Теи

Азр

Туз

МеТ

ТТг

Рго

Азр

Туз

Азп

115

120

125

РТе

С1у

С1у

11е

С1у

Уа1

11е

Азр

РТе

С1и

Агд

Тгр

Туз

Рго

11е

РТе

130

135

140

Агд

С1п

Азп

Тгр

С1у

Азп

ТТг

С1и

11е

Η^з

Туз

Туз

Туг

Зег

11е

С1и

145

150

155

160

Теи

Уа1

Агд

Туз

С1и

ΗΪ8

Рго

Туз

Тгр

Зег

С1и

Зег

МеТ

11е

С1и

А1а

165

170

175

С1и

А1а

ТТг

Туз

Туз

РТе

С1и

Туз

Туг

А1а

Агд

Туг

РТе

МеТ

С1и

С1и

180

185

190

ТТг

Теи

Туз

Теи

А1а

Туз

Туз

ТТг

Агд

Туз

Агд

А1а

Туз

Тгр

С1у

Туг

195

200

205

Туг

С1у

РТе

Рго

Туг

Суз

Туг

Азп

Уа1

ТТг

Рго

Азп

Азп

Рго

С1у

Рго

210

215

220

Азр

Суз

Азр

А1а

Туз

А1а

ТТг

11е

С1и

Азп

Азр

Агд

Теи

Зег

Тгр

МеТ

225

230

235

240

Туг

Азп

Азп

С1п

С1и

11е

Теи

РТе

Рго

Зег

Уа1

Туг

Уа1

Агд

Η^з

С1и

245

250

255

С1п

Туз

Рго

С1и

С1и

Агд

Уа1

Туг

Теи

Уа1

С1п

С1у

Агд

11е

Туз

С1и

260

265

270

А1а

Уа1

Агд

11е

Зег

Азп

Азп

Теи

С1и

Η^з

Зег

Рго

Зег

Уа1

Теи

А1а

275

280

285

Туг

Тгр

Тгр

Туг

Уа1

Туг

С1п

Азр

Туз

МеТ

Азр

11е

Туг

Теи

Зег

С1и

290

295

300

ТТг

Азр

Уа1

С1и

Туз

ТТг

РТе

С1п

С1и

11е

Уа1

ТТг

Азп

С1у

С1у

Азр

305

310

315

320

С1у

11е

11е

11е

Тгр

С1у

Зег

Зег

Зег

Азр

Уа1

Азп

Зег

Теи

Зег

Туз

325

330

335

Суз

Туз

Агд

Теи

Агд

С1и

Туг

Теи

Теи

Азп

ТТг

Теи

С1у

Рго

РТе

А1а

340

345

350

Уа1

Азп

Уа1

ТТг

С1и

ТТг

Уа1

Азп

С1у

Агд

Зег

Зег

Теи

Азп

РТе

105 026112

355 360 365 <210> 17 <211> 462 <212> белок <213> Миз тизси1из <220>

<223> гиалуронидаза <400> 17

Меб

^еи

С1у

^еи

ТАг

С1п

Нгз

А1а

С1п

^уз

να1

Тгр

Агд

Меб

^уз

Рго

1

5

10

15

РАе

Зег

Рго

С1и

να1

Зег

Рго

С1у

Зег

Зег

Рго

А1а

ТАг

А1а

С1у

Нгз

20

25

30

^еи

^еи

Агд

11е

Зег

ТАг

^еи

РАе

^еи

ТАг

^еи

^еи

С1и

^еи

А1а

С1п

35

40

45

να1

Суз

Агд

С1у

Зег

να1

να1

Зег

Азп

Агд

Рго

РАе

11е

ТАг

να1

Тгр

50

55

60

Азп

С1у

Азр

ТАг

Нгз

Тгр

Суз

^еи

ТАг

С1и

Туг

С1у

να1

Азр

να1

Азр

65

70

75

80

να1

Зег

να1

РАе

Азр

να1

να1

А1а

Азп

^уз

С1и

С1п

Зег

РАе

С1п

С1у

85

90

95

Зег

Азп

Меб

ТАг

11е

РАе

Туг

Агд

С1и

С1и

^еи

С1у

ТАг

Туг

Рго

Туг

100

105

110

Туг

ТАг

Рго

ТАг

С1у

С1и

Рго

να1

РАе

С1у

С1у

^еи

Рго

С1п

Азп

А1а

115

120

125

Зег

^еи

να1

ТАг

Нгз

^еи

А1а

Нгз

ТАг

РАе

С1п

Азр

11е

^уз

А1а

А1а

130

135

140

Меб

Рго

С1и

Рго

Азр

РАе

Зег

С1у

^еи

А1а

να1

11е

Азр

Тгр

С1и

А1а

145

150

155

160

Тгр

Агд

Рго

Агд

Тгр

А1а

РАе

Азп

Тгр

Азр

Зег

^уз

Азр

11е

Туг

Агд

165

170

175

С1п

Агд

Зег

Меб

С1и

^еи

να1

С1п

А1а

С1и

Нгз

Рго

Азр

Тгр

Рго

С1и

180

185

190

ТАг

^еи

να1

С1и

А1а

А1а

А1а

^уз

Азп

С1п

РАе

С1п

С1и

А1а

А1а

С1и

195

200

205

А1а

Тгр

Меб

А1а

С1у

ТАг

^еи

С1п

^еи

С1у

С1п

να1

^еи

Агд

Рго

Агд

210

215

220

106 026112

С1у

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

С1у

РЬе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Азп

Азр

РЬе

225

230

235

240

Ьеи

Зег

Ьеи

Азп

Туг

ТЬг

С1у

С1п

Суз

Рго

Уа1

РЬе

Уа1

Агд

Азр

С1п

245

250

255

Азп

Азр

С1п

Ьеи

С1у

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1п

Зег

Туг

А1а

Ьеи

Туг

Рго

260

265

270

Зег

11е

Туг

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Ьеи

МеЬ

С1у

ТЬг

С1у

Ьуз

Зег

С1п

МеЬ

275

280

285

Туг

Уа1

Агд

Нтз

Агд

Уа1

С1п

С1и

А1а

Ьеи

Агд

Уа1

А1а

11е

Уа1

Зег

290

295

300

Агд

Азр

Рго

Нтз

Уа1

Рго

Уа1

МеЬ

Рго

Туг

Уа1

С1п

11е

РЬе

Туг

С1и

305

310

315

320

МеЬ

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

С1и

С1и

Ьеи

С1и

Нтз

Зег

Ьеи

С1у

325

330

335

С1и

Зег

А1а

А1а

С1п

С1у

Уа1

А1а

С1у

А1а

Уа1

Ьеи

Тгр

Ьеи

Зег

Зег

340

345

350

Азр

Ьуз

ТЬг

Зег

ТЬг

Ьуз

С1и

Зег

Суз

С1п

А1а

11е

Ьуз

А1а

Туг

МеЬ

355

360

365

Азр

Зег

ТЬг

Ьеи

С1у

Рго

РЬе

11е

Уа1

Азп

Уа1

ТЬг

Зег

А1а

А1а

Ьеи

370

375

380

Ьеи

Суз

Зег

С1и

А1а

Ьеи

Суз

Зег

С1у

Нтз

С1у

Агд

Суз

Уа1

Агд

Нтз

385

390

395

400

Рго

Зег

Туг

Рго

С1и

А1а

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Азп

Рго

А1а

Зег

РЬе

Зег

405

410

415

11е

С1и

Ьеи

ТЬг

Нтз

Азр

С1у

Агд

Рго

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

С1у

ТЬг

Ьеи

420

425

430

Зег

Ьеи

Ьуз

Азр

Агд

А1а

С1п

МеЬ

А1а

МеЬ

Ьуз

РЬе

Агд

Суз

Агд

Суз

435

440

445

Туг

Агд

С1у

Тгр

Агд

С1у

Ьуз

Тгр

Суз

Азр

Ьуз

Агд

С1у

МеЬ

450

455

460

<210>	18
<211>	473
<212>	белок
<213>	Миз тизси1из

<220>

<223> гиалуринидаза 2

107 026112 <400> 18

МеЬ 1

Агд

А1а

С1у

Ьеи 5

С1у

Рго

11е

11е

ТЬг 10

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи 15

С1и

Уа1

А1а

Тгр

А1а

С1у

С1и

Ьеи

Ьуз

Рго

ТЬг

А1а

Рго

Рго

11е

РЬе

ТЬг

20

25

30

С1у

Агд

Рго

РЬе

Уа1

Уа1

А1а

Тгр

Азп

Уа1

Рго

ТЬг

С1п

С1и

Суз

А1а

35

40

45

Рго

Агд

Нтз

Ьуз

Уа1

Рго

Ьеи

Азр

Ьеи

Агд

А1а

РЬе

Азр

Уа1

Ьуз

А1а

50

55

60

ТЬг

Рго

Азп

С1и

С1у

РЬе

РЬе

Азп

С1п

Азп

11е

ТЬг

ТЬг

РЬе

Туг

Туг

65

70

75

80

Азр

Агд

Ьеи

С1у

Ьеи

Туг

Рго

Агд

РЬе

Азр

А1а

А1а

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

85

90

95

Нтз

С1у

С1у

Уа1

Рго

С1п

Азп

С1у

Зег

Ьеи

Суз

А1а

Нтз

Ьеи

Рго

МеЬ

100

105

110

Ьеи

Ьуз

С1и

Зег

Уа1

С1и

Агд

Туг

11е

С1п

ТЬг

С1п

С1и

Рго

С1у

С1у

115

120

125

Ьеи

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

Азп

130

135

140

Тгр

С1п

С1и

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Агд

С1п

Зег

Зег

Агд

С1п

Ьеи

Уа1

А1а

145

150

155

160

Зег

Агд

Нтз

Рго

Азр

Тгр

Рго

Зег

Азр

Агд

Уа1

МеЬ

Ьуз

С1п

А1а

С1п

165

170

175

Туг

С1и

РЬе

С1и

РЬе

А1а

А1а

Агд

С1п

РЬе

МеЬ

Ьеи

Азп

ТЬг

Ьеи

Агд

180

185

190

Туг

Уа1

Ьуз

А1а

Уа1

Агд

Рго

С1п

Нтз

Ьеи

Тгр

С1у

РЬе

Туг

Ьеи

РЬе

195

200

205

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Нтз

Азр

Туг

Уа1

С1п

Азп

Тгр

С1и

Зег

Туг

ТЬг

210

215

220

С1у

Агд

Суз

Рго

Азр

Уа1

С1и

Уа1

А1а

Агд

Азп

Азр

С1п

Ьеи

А1а

Тгр

225

230

235

240

Ьеи

Тгр

А1а

С1и

Зег

ТЬг

А1а

Ьеи

РЬе

Рго

Зег

Уа1

Туг

Ьеи

Азр

С1и

245

250

255

ТЬг

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Уа1

Нтз

Зег

Агд

Азп

РЬе

Уа1

Зег

РЬе

Агд

Уа1

260

265

270

Агд

С1и

А1а

Ьеи

Агд

Уа1

А1а

Нтз

ТЬг

Нтз

Нтз

А1а

Азп

Нтз

А1а

Ьеи

275

280

285

Рго

Уа1

Туг

Уа1

РЬе

ТЬг

Агд

Рго

ТЬг

Туг

ТЬг

Агд

С1у

Ьеи

ТЬг

С1у

290

295

300

108 026112

Теи

Зег

С1п

Уа1

Азр

Теи

11е

Зег

ТНг

11е

С1у

С1и

Зег

А1а

А1а

Теи

305

310

315

320

С1у

Зег

А1а

С1у

Уа1

11е

РНе

Тгр

С1у

Азр

Зег

С1и

Азр

А1а

Зег

Зег

325

330

335

МеН

С1и

ТНг

Суз

С1п

Туг

Теи

Туз

Азп

Туг

Теи

ТНг

С1п

Теи

Теи

Уа1

340

345

350

Рго

Туг

11е

Уа1

Азп

Уа1

Зег

Тгр

А1а

ТНг

С1п

Туг

Суз

Зег

Тгр

ТНг

355

360

365

С1п

Суз

Низ

С1у

Низ

С1у

Агд

Суз

Уа1

Агд

Агд

Азп

Рго

Зег

А1а

Азп

370

375

380

ТНг

РНе

Теи

Низ

Теи

Азп

А1а

Зег

Зег

РНе

Агд

Теи

Уа1

Рго

С1у

Низ

385

390

395

400

ТНг

Рго

Зег

С1и

Рго

С1п

Теи

Агд

Рго

С1и

С1у

С1п

Теи

Зег

С1и

А1а

405

410

415

Азр

Теи

Азп

Туг

Теи

С1п

Туз

Низ

РНе

Агд

Суз

С1п

Суз

Туг

Теи

С1у

420

425

430

Тгр

С1у

С1у

С1и

С1п

Суз

С1п

Агд

Азп

Туг

Туз

С1у

А1а

А1а

С1у

Азп

435

440

445

А1а

Зег

Агд

А1а

Тгр

А1а

С1у

Зег

Низ

Теи

ТНг

Зег

Теи

Теи

С1у

Теи

450

455

460

Уа1

А1а

Уа1

А1а

Теи

ТНг

Тгр

ТНг

Теи

465

470

<210> 19 <211> 412 <212> белок <213> Миз тизси1из <220>

<223> гиалуринидаза 3 <400> 19

МеН 11е МеН Низ Теи С1у Теи МеН МеН Уа1 Уа1 С1у Теи ТНг Теи Суз 1 5 10 15

Теи МеН Низ С1у С1п А1а Теи Теи С1п Уа1 Рго С1и Низ Рго РНе Зег 20 25 30

Уа1 Уа1 Тгр Азп Уа1 Рго Зег А1а Агд Суз Туз А1а Низ РНе С1у Уа1 35 40 45

Низ Теи Рго Теи Азр А1а Теи С1у 11е Уа1 А1а Азп Низ С1у С1п Низ 50 55 60

109 026112

РАе

Нгз

С1у

С1п

Азп

11е

Зег

11е

РАе

Туг

Вуз

Азп

С1п

РАе

С1у

Вей

65

70

75

80

Туг

Рго

Туг

РАе

С1у

Рго

Агд

С1у

ТАг

А1а

Нгз

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

85

90

95

С1п

А1а

Уа1

Зег

Вей

Азр

Нгз

Нгз

Вей

А1а

Агд

А1а

А1а

Нгз

С1п

11е

100

105

110

Вей

Нгз

Зег

Вей

С1у

Зег

Зег

РАе

А1а

С1у

Вей

А1а

Уа1

Вей

Азр

Тгр

115

120

125

С1и

С1и

Тгр

Туг

Рго

Вей

Тгр

А1а

С1у

Азп

Тгр

С1у

Рго

Нгз

Агд

С1п

130

135

140

Уа1

Туг

Вей

А1а

А1а

Зег

Тгр

Уа1

Тгр

ТАг

С1п

С1п

МеА

РАе

Рго

С1у

145

150

155

160

Вей

Азр

Рго

С1п

С1и

С1п

Вей

Нгз

Вуз

А1а

Нгз

ТАг

Зег

РАе

С1и

С1п

165

170

175

А1а

А1а

Агд

А1а

Вей

МеА

С1и

Туг

ТАг

Вей

С1п

Вей

С1у

Агд

ТАг

Вей

180

185

190

Агд

Рго

Зег

С1у

Вей

Тгр

С1у

РАе

Туг

Агд

Туг

Рго

А1а

Суз

С1у

Азп

195

200

205

С1у

Тгр

Нгз

Вуз

МеА

А1а

Зег

Азп

Туг

ТАг

С1у

Нгз

Суз

Нгз

А1а

А1а

210

215

220

11е

ТАг

ТАг

С1п

Азп

ТАг

С1п

Вей

Агд

Тгр

Вей

Тгр

А1а

А1а

Зег

Зег

225

230

235

240

А1а

Вей

РАе

Рго

Зег

11е

Туг

Вей

Рго

Рго

Агд

Вей

Рго

Вей

А1а

Туг

245

250

255

Агд

С1п

А1а

РАе

Уа1

Агд

Нгз

Агд

Вей

С1и

С1и

А1а

РАе

Агд

Уа1

А1а

260

265

270

Вей

Вей

С1и

Нгз

Зег

Нгз

Рго

Вей

Рго

Уа1

Вей

А1а

Туг

Зег

Агд

Вей

275

280

285

ТАг

Нгз

Агд

Зег

Зег

С1у

Агд

РАе

Вей

Зег

Вей

Азр

Азр

Вей

МеА

С1п

290

295

300

ТАг

11е

С1у

Уа1

Зег

А1а

А1а

Вей

С1у

ТАг

А1а

С1у

Уа1

Уа1

Вей

Тгр

305

310

315

320

С1у

Азр

Вей

Зег

РАе

Зег

Зег

Зег

С1и

С1и

Вуз

Суз

Тгр

Агд

Вей

Нгз

325

330

335

Азр

Туг

Вей

Уа1

С1у

ТАг

Вей

С1у

Рго

Туг

Уа1

11е

Азп

Уа1

ТАг

Вуз

340

345

350

А1а

Азр

МеА

А1а

Суз

Зег

Нгз

С1п

Агд

Суз

Нгз

С1у

Нгз

С1у

Агд

Суз

355

360

365

А1а

Агд

Вуз

Азр

Рго

С1у

С1п

МеА

С1и

А1а

РАе

Вей

Нгз

Вей

С1п

Рго

370

375

380

110 026112

Азр Азр Зег Теи С1у А1а Тгр Азп Зег РНе Агд Суз Нгз Суз Туг Зег 385 390 395 400

С1у Тгр А1а С1у Рго ТНг Суз Теи С1и Рго Туз Рго

405 410 <210> 20 <211> 435 <212> белок <213> Зиз зсгоГа <220>

<223> гиалауронидаза <400> 20

МеН

А1а

А1а

Нгз

Теи

Теи

Рго

11е

Суз

ТНг

Теи

РНе

Теи

Азп

Теи

Теи

1

5

10

15

Зег

Уа1

А1а

С1п

С1у

Зег

Агд

Азр

Рго

Уа1

Уа1

Теи

Азп

Агд

Рго

РНе

20

25

30

ТНг

ТНг

11е

Тгр

Азп

А1а

Азп

ТНг

С1п

Тгр

Суз

Теи

Туз

Агд

Нгз

С1у

35

40

45

Уа1

Азр

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Уа1

РНе

С1и

Уа1

Уа1

Уа1

Азп

Рго

С1у

С1п

50

55

60

ТНг

РНе

Агд

С1у

Рго

Азп

МеН

ТНг

11е

РНе

Туг

Зег

Зег

С1п

Теи

С1у

65

70

75

80

ТНг

Туг

Рго

Туг

Туг

ТНг

Зег

А1а

С1у

С1и

Рго

Уа1

РНе

С1у

С1у

Теи

85

90

95

Рго

С1п

Азп

А1а

Зег

Теи

Азр

Уа1

Нгз

Теи

Азп

Агд

ТНг

РНе

Туз

Азр

100

105

110

11е

Теи

А1а

А1а

МеН

Рго

С1и

Зег

Азп

РНе

Зег

С1у

Теи

А1а

Уа1

11е

115

120

125

Азр

Тгр

С1и

А1а

Тгр

Агд

Рго

Агд

Тгр

А1а

РНе

Азп

Тгр

Азр

А1а

Туз

130

135

140

Азр

11е

Туг

Агд

С1п

Агд

Зег

Агд

А1а

Теи

Уа1

С1п

Туз

С1п

Нгз

Рго

145

150

155

160

Азр

Тгр

Рго

А1а

Рго

Тгр

Уа1

С1и

А1а

А1а

А1а

С1п

Азр

С1п

РНе

С1п

165

170

175

С1и

А1а

А1а

С1п

ТНг

Тгр

МеН

А1а

С1у

ТНг

Теи

Туз

Теи

С1у

С1п

ТНг

111 026112

180

185

190

Ьеи

Агд

Рго

Η^з

С1у

Ьеи

Тгр

С1у

РАе

Туг

С1у

РАе

Рго

Азр

Суз

Туг

195

200

205

Азп

Туг

Азр

РАе

С1п

Зег

Зег

Азп

Туг

ТАг

С1у

С1п

Суз

Рго

Рго

С1у

210

215

220

Уа1

Зег

А1а

С1п

Азп

Азр

С1п

Ьеи

С1у

Тгр

Ьеи

Тгр

С1у

С1п

Зег

Агд

225

230

235

240

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Рго

Зег

А1а

Ьеи

С1и

С1у

ТАг

Азп

245

250

255

Ьуз

ТАг

С1п

Ьеи

Туг

Уа1

С1п

Η^з

Агд

Уа1

Азп

С1и

А1а

РАе

Агд

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

А1а

А1а

С1у

Азр

Рго

Азп

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

Рго

Туг

А1а

С1п

275

280

285

11е

РАе

Η^з

Азр

МеА

ТАг

Азп

Агд

Ьеи

Ьеи

Зег

Агд

С1и

С1и

Ьеи

С1и

290

295

300

Η^з

Зег

Ьеи

С1у

С1и

Зег

А1а

А1а

С1п

С1у

А1а

А1а

С1у

Уа1

Уа1

Ьеи

305

310

315

320

Тгр

Уа1

Зег

Тгр

С1и

Азп

ТАг

Агд

ТАг

Ьуз

С1и

Зег

Суз

С1п

Зег

11е

325

330

335

Ьуз

С1и

Туг

Уа1

Азр

ТАг

ТАг

Ьеи

С1у

Рго

РАе

11е

Ьеи

Азп

Уа1

ТАг

340

345

350

Зег

С1у

А1а

Ьеи

Ьеи

Суз

Зег

С1п

А1а

Уа1

Суз

Зег

С1у

Η^з

С1у

Агд

355

360

365

Суз

Уа1

Агд

Агд

Рго

Зег

Η^з

ТАг

С1и

А1а

Ьеи

Рго

11е

Ьеи

Азп

Рго

370

375

380

Зег

Зег

РАе

Зег

11е

Ьуз

Рго

ТАг

Рго

С1у

С1у

С1у

Рго

Ьеи

ТАг

Ьеи

385

390

395

400

С1п

С1у

А1а

Ьеи

Зег

Ьеи

Ьуз

Азр

Агд

Уа1

С1п

МеА

А1а

С1и

С1и

РАе

405

410

415

С1п

Суз

Агд

Суз

Туг

Рго

С1у

Тгр

Агд

С1у

ТАг

Тгр

Суз

С1и

С1п

С1п

420

425

430

С1у ТАг Агд

<210>	435 21
<211>	419
<212>	белок
<213>	Зиз зсгоГа

<220>

112 026112 <223> гиалуронидаза 3 <400> 21

Меб 1

ТВг

Меб

С1п

Ъеи 5

С1у

Ъеи

А1а

Ъеи

Уа1 10

Ъеи

С1у

Уа1

А1а

Меб 15

Суз

Ъеи

С1у

Суз

С1у

С1п

Рго

Ъеи

Ъеи

Агд

А1а

Рго

С1и

Агд

Рго

РВе

Суз

20

25

30

Уа1

Ъеи

Тгр

Азп

Уа1

Рго

Зег

А1а

Агд

Суз

Ъуз

А1а

Агд

РВе

С1у

Уа1

35

40

45

Нгз

Ъеи

Рго

Ъеи

С1и

А1а

Ъеи

С1у

11е

ТВг

А1а

Азп

Нгз

С1у

С1п

Агд

50

55

60

РВе

Нгз

С1у

С1п

Азп

11е

ТВг

11е

РВе

Туг

Ъуз

Зег

С1п

Ъеи

С1у

Ъеи

65

70

75

80

Туг

Рго

Туг

РВе

С1у

Рго

Агд

С1у

ТВг

А1а

Нгз

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

85

90

95

С1п

А1а

Уа1

Зег

Ъеи

Азр

Нгз

Нгз

Ъеи

А1а

Агд

А1а

А1а

Туг

С1п

11е

100

105

110

Нгз

Агд

Зег

Ъеи

Агд

Рго

С1у

РВе

ТВг

С1у

Вей

А1а

Уа1

Ъеи

Азр

Тгр

115

120

125

С1и

С1и

Тгр

Суз

Рго

Ъеи

Тгр

А1а

С1у

Азп

Тгр

С1у

Агд

Агд

С1п

А1а

130

135

140

Туг

С1п

А1а

А1а

Зег

Суз

А1а

Тгр

А1а

С1п

Агд

Уа1

Туг

Рго

Азп

Ъеи

145

150

155

160

Азр

Рго

С1п

С1и

С1п

Ъеи

Суз

Ъуз

А1а

Агд

А1а

С1у

РВе

С1и

С1и

А1а

165

170

175

А1а

Агд

А1а

Ъеи

Меб

С1и

Азр

ТВг

Ъеи

Агд

Ъеи

С1у

Агд

Меб

Ъеи

Агд

180

185

190

Рго

Нгз

С1у

Ъеи

Тгр

С1у

РВе

Туг

Нгз

Туг

Рго

А1а

Суз

С1у

Азп

С1у

195

200

205

Тгр

Нгз

С1у

ТВг

А1а

Зег

Азп

Туг

ТВг

С1у

Нгз

Суз

Нгз

А1а

А1а

А1а

210

215

220

Ъеи

А1а

Агд

Азп

ТВг

С1п

Ъеи

Туг

Тгр

Ъеи

Тгр

А1а

А1а

Зег

Зег

А1а

225

230

235

240

Ъеи

РВе

Рго

Зег

11е

Туг

Ъеи

Рго

Рго

С1у

Ъеи

Рго

Рго

А1а

Туг

Нгз

245

250

255

С1п

А1а

РВе

Уа1

Агд

Туг

Агд

Ъеи

С1и

С1и

А1а

РВе

Агд

Уа1

А1а

Ъеи

260

265

270

Уа1

С1у

Нгз

Рго

Нгз

Рго

Ъеи

Рго

Уа1

Ъеи

А1а

Туг

А1а

Агд

Ъеи

ТВг

275

280

285

Нгз

Агд

Азп

Зег

С1у

Агд

РВе

Ъеи

Зег

С1п

Азр

С1и

Ъеи

Уа1

С1п

ТВг

113 026112

290

295

300

11е

С1у

Уа1

Зег

А1а

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

Уа1

Уа1

Ьеи

Тгр

С1у

305

310

315

320

Азр

Ьеи

Зег

РНе

Зег

Зег

Зег

С1и

С1и

С1и

Суз

Тгр

НЬз

Ьеи

Агд

С1у

325

330

335

Туг

Ьеи

Уа1

С1у

ТНг

Ьеи

С1у

Рго

Туг

Уа1

11е

Азп

Уа1

ТНг

Агд

А1а

340

345

350

А1а

МеЬ

А1а

Суз

Зег

НЬз

С1п

Агд

Суз

НЬз

С1у

НЬз

С1у

Агд

Суз

А1а

355

360

365

Тгр

С1п

Азр

Рго

С1у

С1п

Ьеи

Ьуз

Уа1

РНе

Ьеи

НЬз

Ьеи

НЬз

Рго

С1у

370

375

380

С1у

Зег

Рго

С1у

А1а

Тгр

С1и

Зег

РНе

Зег

Суз

Агд

Суз

Туг

Тгр

С1у

385

390

395

400

Тгр

А1а

С1у

Рго

ТНг

Суз

С1п

С1и

Рго

Агд

Рго

С1и

Ьеи

С1у

Рго

С1и

405

410

415

С1и

А1а

ТНг

<210> 22 <211> 449 <212> белок <213> КаЬЬиз погчедЬсиз <220>

<223> гиалуронидаза 1 <400> 22

МеЬ	Ьуз	Рго	РНе	Зег	Рго	С1и	Уа1
1				5
А1а	А1а	НЬз	Ьеи	Ьеи	Агд	ТНг	Туг
			20
Ьеи	А1а	С1п	С1у	Суз	Агд	С1у	Зег
		35					40
ТНг	Уа1	Тгр	Азп	А1а	Азр	ТНг	НЬз
	50					55
Азр	Уа1	Азр	Уа1	Зег	Уа1	РНе	Азр
65					70
РНе	С1п	С1у	Рго	Азп	МеЬ	ТНг	11е
				85

Зег	Рго	Азр	Рго	Суз	Рго	А1а	ТНг
	10					15
ТНг	Ьеи	РНе	Ьеи	ТНг	Ьеи	Ьеи	С1и
25					30
МеЬ	Уа1	Зег	Азп	Агд	Рго	РНе	11е
				45
Тгр	Суз	Ьеи	Ьуз	Азр	НЬз	С1у	Уа1
			60
Уа1	Уа1	А1а	Азп	Ьуз	С1и	С1п	Азп
		75					80
РНе	Туг	Агд	С1и	С1и	Ьеи	С1у	ТНг
	90					95

114 026112

Туг

Рго

Туг

Туг 100

ТЬг

Рго

ТЬг

С1у

С1и 105

Рго

Уа1

РЬе

С1у

С1у 110

Теи

Рго

С1п

Азп

А1а

Зег

Теи

Уа1

ТЬг

Нгз

Теи

А1а

Нгз

А1а

РЬе

С1п

Азр

11е

115

120

125

Туз

А1а

А1а

Ме!

Рго

С1и

Рго

Азр

РЬе

Зег

С1у

Теи

А1а

Уа1

11е

Азр

130

135

140

Тгр

С1и

А1а

Тгр

Агд

Рго

Агд

Тгр

А1а

РЬе

Азп

Тгр

Азр

Зег

Туз

Азр

145

150

155

160

11е

Туг

С1п

С1п

Агд

Зег

Ме!

С1и

Теи

Уа1

Агд

А1а

С1и

Нгз

Рго

Азр

165

170

175

Тгр

Рго

С1и

ТЬг

Теи

Уа1

С1и

А1а

С1и

А1а

С1п

С1у

С1п

РЬе

С1п

С1и

180

185

190

А1а

А1а

С1и

А1а

Тгр

Ме!

А1а

С1у

ТЬг

Теи

С1п

Теи

С1у

С1п

Уа1

Теи

195

200

205

Агд

Рго

Агд

С1у

Теи

Тгр

С1у

Туг

Туг

С1у

РЬе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

210

215

220

Туг

Азр

РЬе

Теи

Зег

Рго

Азп

Туг

ТЬг

С1у

С1п

Суз

Зег

Теи

Зег

11е

225

230

235

240

Нгз

Азр

С1п

Азп

Азр

С1п

Теи

С1у

Тгр

Теи

Тгр

Азп

С1п

Зег

Туг

А1а

245

250

255

Теи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Теи

Рго

А1а

А1а

Теи

Ме!

С1у

ТЬг

С1у

Туз

260

265

270

Зег

С1п

Ме!

Туг

Уа1

Агд

Туг

Агд

Уа1

С1п

С1и

А1а

РЬе

Агд

Теи

А1а

275

280

285

Теи

Уа1

Зег

Агд

Азр

Рго

Нгз

Уа1

Рго

11е

Ме!

Рго

Туг

Уа1

С1п

11е

290

295

300

РЬе

Туг

С1и

Туз

ТЬг

Азр

Туг

Теи

Теи

Рго

Теи

С1и

С1и

Теи

С1и

Нгз

305

310

315

320

Зег

Теи

С1у

С1и

Зег

А1а

А1а

С1п

С1у

А1а

А1а

С1у

А1а

Уа1

Теи

Тгр

325

330

335

11е

Зег

Зег

С1и

Туз

ТЬг

Зег

ТЬг

Туз

С1и

Зег

Суз

С1п

А1а

11е

Туз

340

345

350

А1а

Туг

Ме!

Азр

Зег

ТЬг

Теи

С1у

Рго

РЬе

11е

Теи

Азп

Уа1

ТЬг

Зег

355

360

365

А1а

А1а

Теи

Теи

Суз

Зег

С1и

А1а

Теи

Суз

Зег

С1у

Агд

С1у

Агд

Суз

370

375

380

Уа1

Агд

Нгз

Рго

Зег

Туг

Рго

С1и

А1а

Теи

Теи

ТЬг

Теи

Зег

Рго

А1а

385

390

395

400

Зег

РЬе

Зег

11е

С1и

Рго

ТЬг

Нгз

Азр

С1у

Агд

Рго

Теи

Зег

Теи

Туз

115 026112

405

410

415

С1у

ТНг

Ьеи

Зег

Ьеи

Ьуз

Азр

Агд

А1а

С1п

МеН

А1а

МеН

Ьуз

РНе

Ьуз

420

425

430

Суз

Агд

Суз

Туг

Агд

С1у

Тгр

Зег

С1у

С1и

Тгр

Суз

Ьуз

Ьуз

С1п

Азр

435 440 445

МеН <210> 23 <211> 473 <212> белок <213> КаННиз погуедгсиз <220>

<223> гиалуронидаза 2 <400> 23

МеН 1

Агд

А1а

С1у

Ьеи 5

С1у

Рго

11е

11е

ТНг 10

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи 15

С1и

Уа1

А1а

Тгр

А1а

Зег

С1и

Ьеи

Ьуз

Рго

ТНг

А1а

Рго

Рго

11е

РНе

ТНг

20

25

30

С1у

Агд

Рго

РНе

Уа1

Уа1

А1а

Тгр

Азп

Уа1

Рго

ТНг

С1п

С1и

Суз

А1а

35

40

45

Рго

Агд

Нгз

Ьуз

Уа1

Рго

Ьеи

Азр

Ьеи

Агд

А1а

РНе

Азр

Уа1

С1и

А1а

50

55

60

ТНг

Рго

Азп

С1и

С1у

РНе

РНе

Азп

С1п

Азп

11е

ТНг

ТНг

РНе

Туг

Туг

65

70

75

80

Азр

Агд

Ьеи

С1у

Ьеи

Туг

Рго

Агд

РНе

Азр

А1а

А1а

С1у

МеН

Зег

Уа1

85

90

95

Нгз

С1у

С1у

Уа1

Рго

С1п

Азп

С1у

Зег

Ьеи

Суз

А1а

Нгз

Ьеи

Рго

МеН

100

105

110

Ьеи

Ьуз

С1и

А1а

Уа1

С1и

Агд

Туг

11е

С1п

ТНг

С1п

С1и

Рго

А1а

С1у

115

120

125

Ьеи

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

Азп

130

135

140

Тгр

С1п

С1и

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Агд

С1п

Зег

Зег

Агд

С1п

Ьеи

Уа1

А1а

145

150

155

160

Зег

Агд

Нгз

Рго

Азр

Тгр

Рго

Зег

Азр

Агд

11е

Уа1

Ьуз

С1п

А1а

С1п

116 026112

165

170

175

Туг

С1и

РАе

С1и

РАе

А1а

А1а

Агд

С1п

РАе

МеА

Ьеи

Азп

ТАг

Ьеи

Агд

180

185

190

Туг

Уа1

Ьуз

А1а

Уа1

Агд

Рго

С1п

Η^з

Ьеи

Тгр

С1у

РАе

Туг

Ьеи

РАе

195

200

205

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Η^з

Азр

Туг

Уа1

С1п

Азп

Тгр

Азр

Зег

Туг

ТАг

210

215

220

С1у

Агд

Суз

Рго

Азр

Уа1

С1и

Уа1

А1а

С1п

Азп

Азр

С1п

Ьеи

А1а

Тгр

225

230

235

240

Ьеи

Тгр

А1а

С1и

Азп

ТАг

А1а

Ьеи

РАе

Рго

Зег

Уа1

Туг

Ьеи

Азр

Ьуз

245

250

255

ТАг

Ьеи

А1а

Зег

Зег

Ьуз

Η^з

Зег

Агд

Азп

РАе

Уа1

Зег

РАе

Агд

Уа1

260

265

270

С1п

С1и

А1а

Ьеи

Агд

Уа1

А1а

Η^з

ТАг

Η^з

Η^з

А1а

Азп

Η^з

А1а

Ьеи

275

280

285

Рго

Уа1

Туг

Уа1

РАе

ТАг

Агд

Рго

ТАг

Туг

ТАг

Агд

Агд

Ьеи

ТАг

С1и

290

295

300

Ьеи

Азп

С1п

МеА

Азр

Ьеи

11е

Зег

ТАг

11е

С1у

С1и

Зег

А1а

А1а

Ьеи

305

310

315

320

С1у

Зег

А1а

С1у

Уа1

11е

РАе

Тгр

С1у

Азр

Зег

Уа1

Туг

А1а

Зег

Зег

325

330

335

МеА

С1и

Азп

Суз

С1п

Азп

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Туг

Ьеи

ТАг

С1п

ТАг

Ьеи

Уа1

340

345

350

Рго

Туг

11е

Уа1

Азп

Уа1

Зег

Тгр

А1а

ТАг

С1п

Туг

Суз

Зег

Тгр

ТАг

355

360

365

С1п

Суз

Η^з

С1у

Η^з

С1у

Агд

Суз

Уа1

Агд

Агд

Азп

Рго

Зег

А1а

Зег

370

375

380

ТАг

РАе

Ьеи

Η^з

Ьеи

Зег

Рго

Зег

Зег

РАе

Агд

Ьеи

Уа1

Рго

С1у

Агд

385

390

395

400

ТАг

Рго

Зег

С1и

Рго

С1п

Ьеи

Агд

Рго

С1и

С1у

С1и

Ьеи

Зег

С1и

Азр

405

410

415

Азр

Ьеи

Зег

Туг

Ьеи

С1п

МеА

Η^з

РАе

Агд

Суз

Η^з

Суз

Туг

Ьеи

С1у

420

425

430

Тгр

С1у

С1у

С1и

С1п

Суз

С1п

Тгр

Азп

Η^з

Ьуз

Агд

А1а

А1а

С1у

Азр

435

440

445

А1а

Зег

Агд

А1а

Тгр

А1а

С1у

А1а

Η^з

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Ьеи

С1у

Ьеи

450

455

460

Уа1

А1а

МеА

ТАг

Ьеи

ТАг

Тгр

ТАг

Ьеи

465 470

117 026112 <210> 24 <211> 412 <212> белок <213> Каккиз погуедгсиз <220>

<223> гиалуронидаза 3 <400> 24

Мек

11е

Тйг

С1п

Ьеи

С1у

Ьеи

Тйг

Ьеи

Уа1

Уа1

С1у

Ьеи

Тйг

Ьеи

Суз

1

5

10

15

Ьеи

Уа1

Нгз

Уа1

С1п

А1а

Ьеи

Ьеи

С1п

Уа1

Рго

С1и

Рйе

Рго

Рйе

Зег

20

25

30

Уа1

Ьеи

Тгр

Азп

Уа1

Рго

Зег

А1а

Агд

Суз

Ьуз

Тйг

Агд

Рйе

С1у

Уа1

35

40

45

Нгз

Ьеи

Рго

Ьеи

Азр

А1а

Ьеи

С1у

11е

11е

А1а

Азп

Нгз

С1у

С1п

Агд

50

55

60

Рйе

Нгз

С1у

С1п

Азп

11е

Тйг

11е

Рйе

Туг

Ьуз

Азп

С1п

Рйе

С1у

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Рго

Туг

Рйе

С1у

Рго

Агд

С1у

Тйг

А1а

Нгз

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

85

90

95

С1п

А1а

Уа1

Зег

Ьеи

Азр

Нгз

Нгз

Ьеи

А1а

С1п

А1а

А1а

Нгз

С1п

11е

100

105

110

Ьеи

Нгз

Азп

Ьеи

С1у

Зег

Зег

Рйе

А1а

С1у

Ьеи

А1а

Уа1

Ьеи

Азр

Тгр

115

120

125

С1и

С1и

Тгр

Туг

Рго

Ьеи

Тгр

А1а

С1у

Азп

Тгр

С1у

Тйг

Нгз

Агд

С1п

130

135

140

Уа1

Туг

С1п

А1а

А1а

Зег

Тгр

А1а

Тгр

А1а

С1п

С1п

Мек

Рйе

Рго

Азр

145

150

155

160

Ьеи

Азп

Рго

С1п

С1и

С1п

Ьеи

Нгз

Ьуз

А1а

С1п

Тйг

С1у

Рйе

С1и

С1п

165

170

175

А1а

А1а

Агд

А1а

Ьеи

Мек

С1и

Нгз

Тйг

Ьеи

Агд

Ьеи

С1у

С1п

Мек

Ьеи

180

185

190

Агд

Рго

Нгз

С1у

Ьеи

Тгр

С1у

Рйе

Туг

Агд

Туг

Рго

Уа1

Суз

С1у

Азп

195

200

205

С1у

Тгр

Нгз

Азп

Мек

А1а

Зег

Азп

Туг

Тйг

С1у

Нгз

Суз

Нгз

Рго

А1а

210

215

220

11е

11е

Тйг

Агд

Азп

Тйг

С1п

Ьеи

Агд

Тгр

Ьеи

Тгр

А1а

А1а

Зег

Зег

225

230

235

240

118 026112

А1а

Ьеи

РЬе

Рго

Зег 245

11е

Туг

Ьеи

Рго

Рго 250

Агд

Ьеи

Рго

Рго

А1а 255

Туг

Нтз

С1п

ТЬг

РЬе

Уа1

Агд

Нтз

Агд

Ьеи

С1и

С1и

А1а

РЬе

Агд

Уа1

А1а

260

265

270

Ьеи

ТЬг

С1у

Нтз

А1а

Нтз

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

А1а

Туг

Уа1

Агд

Ьеи

275

280

285

ТЬг

Нтз

Агд

Зег

Зег

С1у

Агд

РЬе

Ьеи

Зег

Ьеи

Азр

Азр

Ьеи

МеЬ

С1п

290

295

300

ТЬг

11е

С1у

Уа1

Зег

А1а

А1а

Ьеи

С1у

А1а

А1а

С1у

Уа1

Уа1

Ьеи

Тгр

305

310

315

320

С1у

Азр

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

Зег

Зег

С1и

С1и

С1и

Суз

Тгр

Агд

Ьеи

Нтз

325

330

335

Азр

Туг

Ьеи

Уа1

С1у

ТЬг

Ьеи

С1у

Рго

Туг

Уа1

11е

Азп

Уа1

ТЬг

Ьуз

340

345

350

А1а

А1а

ТЬг

А1а

Суз

Зег

Нтз

С1п

Агд

Суз

Нтз

С1у

Нтз

С1у

Агд

Суз

355

360

365

Зег

Тгр

Ьуз

Азр

Рго

С1у

С1п

МеЬ

С1и

А1а

РЬе

Ьеи

Нтз

Ьеи

С1п

Рго

370

375

380

Азр

Азр

Азп

Ьеи

С1у

А1а

Тгр

Ьуз

Зег

РЬе

Агд

Суз

Агд

Суз

Туг

Ьеи

385

390

395

400

С1у

Тгр

Зег

С1у

Рго

ТЬг

Суз

Ьеи

С1и

Рго

Ьуз

Рго

405

410

<210> 25 <211> 545 <212> белок <213> 0гусЬо1адиз сиптси1из <220>

<223> РН20 <400> 25

МеЬ С1у Уа1 Ьеи Ьуз РЬе Ьуз Нтз 11е РЬе РЬе С1у Зег А1а Уа1 С1и 1 5 10 15

Ьеи Зег С1у Уа1 РЬе С1п 11е Уа1 РЬе 11е РЬе Ьеи Ьеи 11е Рго Суз 20 25 30

Суз Ьеи ТЬг А1а Азп РЬе Агд А1а Рго Рго Уа1 11е Рго Азп Уа1 Рго 35 40 45

РЬе Ьеи Тгр А1а Тгр Азп А1а Рго ТЬг С1и РЬе Суз Ьеи С1у Ьуз Зег

119 026112

55 60

С1у

С1и

Рго

Теи

Азр

МеН

Зег

Теи

РНе

Зег

Теи

РНе

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

Туз

Азп

Туз

ТНг

С1у

С1п

С1у

11е

ТНг

11е

РНе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Теи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Рго

Низ

ТНг

С1у

А1а

11е

Уа1

Низ

С1у

100

105

110

Агд

11е

Рго

С1п

Теи

С1у

Рго

Теи

С1п

С1п

Низ

Теи

ТНг

Туз

Теи

Агд

115

120

125

С1п

С1и

11е

Теи

Туг

Туг

МеН

Рго

Туз

Азр

Азп

Уа1

С1у

Теи

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Теи

Рго

ТНг

Тгр

Теи

Агд

Азп

Тгр

Туз

Рго

145

150

155

160

Туз

Азр

11е

Туг

Агд

11е

Туз

Зег

11е

С1и

Теи

Уа1

Туз

Зег

С1п

Низ

165

170

175

Рго

С1п

Туг

Азп

Низ

Зег

Туг

А1а

ТНг

С1и

Туз

А1а

Туз

Агд

Азр

РНе

180

185

190

С1и

Туз

А1а

С1у

Туз

Азр

РНе

МеН

С1и

С1и

ТНг

Теи

Туз

Теи

С1у

Агд

195

200

205

Теи

Теи

Агд

Рго

Азп

Низ

Теи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Теи

РНе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Низ

Низ

Туг

Азр

Туз

Рго

Азп

Теи

Туг

Туз

С1у

Зег

Суз

РНе

225

230

235

240

Азр

11е

С1и

Туз

Туз

Агд

Азп

Азр

Азр

Теи

Зег

Тгр

Теи

Тгр

Туз

С1и

245

250

255

Зег

ТНг

А1а

Теи

РНе

Рго

Зег

Уа1

Туг

Теи

ТНг

Зег

Агд

А1а

Агд

Зег

260

265

270

А1а

ТНг

А1а

Теи

Зег

Туз

Теи

Туг

Уа1

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Низ

С1и

275

280

285

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Туз

11е

Рго

Азр

Азр

Туз

Зег

Рго

Теи

Рго

Азп

290

295

300

РНе

Уа1

Туг

ТНг

Агд

Теи

Уа1

РНе

ТНг

Азр

С1п

11е

РНе

С1п

РНе

Теи

305

310

315

320

Зег

Низ

Низ

Азр

Теи

Уа1

Туг

ТНг

11е

С1у

С1и

11е

Уа1

А1а

Теи

С1у

325

330

335

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

Уа1

Тгр

С1у

Зег

С1п

Зег

Теи

А1а

Агд

Зег

МеН

340

345

350

Туз

Зег

Суз

Теи

Низ

Теи

Азр

Азп

Туг

МеН

Туз

ТНг

11е

Теи

Азп

Рго

355

360

365

120 026112

Туг Суз 385

Теи 370 С1п

11е С1и

Азп С1п

Уа1 С1у

ТНг Уа1 390

Теи 375 Суз

А1а ТНг

А1а Агд

Туз Туз

МеН Азп 395

Суз 380 Тгр

Азп Азп

С1п Рго

Уа1 Азп

Теи Азр 400

Туг

Теи

Нгз

Теи

Азп

Рго

С1у

Азп

РНе

А1а

11е

С1п

Теи

С1у

Зег

Азп

405

410

415

С1у

ТНг

Туг

Туз

Уа1

Азр

С1у

Туз

Рго

ТНг

Теи

ТНг

Азр

Теи

С1и

С1п

420

425

430

РНе

Зег

Туз

Азп

РНе

С1п

Суз

Зег

Суз

Туг

ТНг

Азп

Теи

Азп

Суз

Туз

435

440

445

С1и

Агд

ТНг

Азр

МеН

Азп

Азп

Уа1

Агд

ТНг

Уа1

Азп

Уа1

Суз

А1а

Уа1

450

455

460

С1и

Азп

Уа1

Суз

11е

Азр

ТНг

Азп

Уа1

С1у

Рго

С1п

А1а

Уа1

ТНг

Туг

465

470

475

480

А1а

Рго

Туз

С1и

Туз

Туз

Азр

Уа1

А1а

Нгз

11е

Теи

Зег

Азп

ТНг

ТНг

485

490

495

Зег

11е

Азп

Зег

Зег

ТНг

ТНг

МеН

Зег

Теи

Рго

РНе

Рго

Агд

Туз

Нгз

500

505

510

Уа1

Зег

С1у

Суз

Теи

Теи

Уа1

Теи

Суз

МеН

Туг

Зег

С1п

Туг

Теи

Азп

515

520

525

11е

Суз

Туг

Агд

Теи

Уа1

А1а

11е

С1у

11е

С1п

Нгз

С1у

Туг

Туг

Теи

530 535 540

Туз

545 <210> 26 <211> 476 <212> белок <213> Оугз аггез <220>

<223> гиалуронидаза 2 <400> 26

МеН 1

Тгр

ТНг

С1у

Теи 5

С1у

Рго

А1а

Уа1

ТНг 10

Теи

А1а

Теи

Уа1

Теи 15

Уа1

Уа1

А1а

Тгр

А1а

ТНг

С1и

Теи

Туз

Рго

ТНг

А1а

Рго

Рго

11е

РНе

ТНг

20

25

30

121 026112

С1у

Агд

Рго 35

РАе

Уа1

Уа1

А1а

Тгр 40

Азр

Уа1

Рго

ТАг

С1п 45

Азр

Суз

С1у

Рго

Агд

Нтз

Ьуз

МеА

Рго

Ьеи

Азр

Рго

Ьуз

Азр

МеА

Ьуз

А1а

РАе

Азр

50

55

60

Уа1

С1п

А1а

Зег

Рго

Азп

С1и

С1у

РАе

Уа1

Азп

С1п

Азп

11е

ТАг

11е

65

70

75

80

РАе

Туг

Агд

Азр

Агд

Ьеи

С1у

МеА

Туг

Рго

Нтз

РАе

Азп

Зег

Уа1

С1у

85

90

95

Агд

Зег

Уа1

Нтз

С1у

С1у

Уа1

Рго

С1п

Азп

С1у

Зег

Ьеи

Тгр

Уа1

Нтз

100

105

110

Ьеи

С1и

МеА

Ьеи

Ьуз

С1у

Нтз

Уа1

С1и

Нтз

Туг

11е

Агд

ТАг

С1п

С1и

115

120

125

Рго

А1а

С1у

Ьеи

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

С1и

Азр

Тгр

Агд

Рго

Уа1

Тгр

130

135

140

Уа1

Агд

Азп

Тгр

С1п

Азр

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Агд

Агд

Ьеи

Зег

Агд

С1п

145

150

155

160

Ьеи

Уа1

А1а

Зег

Нтз

Нтз

Рго

Азр

Тгр

Рго

Рго

С1и

Агд

11е

Уа1

Ьуз

165

170

175

С1и

А1а

С1п

Туг

С1и

РАе

С1и

РАе

А1а

А1а

Агд

С1п

РАе

МеА

Ьеи

С1и

180

185

190

ТАг

Ьеи

Агд

РАе

Уа1

Ьуз

А1а

РАе

Агд

Рго

Агд

Нтз

Ьеи

Тгр

С1у

РАе

195

200

205

Туг

Ьеи

РАе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Нтз

Азр

Туг

Уа1

С1п

Азп

Тгр

С1и

210

215

220

ТАг

Туг

ТАг

С1у

Агд

Суз

Рго

Азр

Уа1

С1и

Уа1

Зег

Агд

Азп

Азр

С1п

225

230

235

240

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

А1а

С1и

Зег

ТАг

А1а

Ьеи

РАе

Рго

Зег

Уа1

Туг

245

250

255

Ьеи

С1и

С1и

ТАг

Ьеи

А1а

Зег

Зег

ТАг

Нтз

С1у

Агд

Азп

РАе

Уа1

Зег

260

265

270

РАе

Агд

Уа1

С1п

С1и

А1а

Ьеи

Агд

Уа1

А1а

Азр

Уа1

Нтз

Нтз

А1а

Азп

275

280

285

Нтз

А1а

Ьеи

Рго

Уа1

Туг

Уа1

РАе

ТАг

Агд

Рго

ТАг

Туг

Зег

Агд

С1у

290

295

300

Ьеи

ТАг

С1у

Ьеи

Зег

С1и

МеА

Азр

Ьеи

11е

Зег

ТАг

11е

С1у

С1и

Зег

305

310

315

320

А1а

А1а

Ьеи

С1у

А1а

А1а

С1у

Уа1

11е

Ьеи

Тгр

С1у

Азр

А1а

С1у

РАе

325

330

335

ТАг

ТАг

Зег

Азп

С1и

ТАг

Суз

Агд

Агд

Ьеи

Ьуз

Азр

Туг

Ьеи

ТАг

Агд

122 026112

340

345

350

Зег

^еи

Уа1

Рго

Туг

Уа1

Уа1

Азп

Уа1

Зег

Тгр

А1а

А1а

С1п

Туг

Суз

355

360

365

Зег

Тгр

А1а

С1п

Суз

Нтз

С1у

Нтз

С1у

Агд

Суз

Уа1

Агд

Агд

Азр

Рго

370

375

380

Азп

А1а

Нтз

ТАг

РАе

^еи

Нтз

^еи

Зег

А1а

Зег

Зег

РАе

Агд

^еи

Уа1

385

390

395

400

Рго

Зег

Нтз

А1а

Рго

Азр

С1и

Рго

Агд

^еи

Агд

Рго

С1и

С1у

С1и

^еи

405

410

415

Зег

Тгр

А1а

Азр

Агд

Азп

Нтз

^еи

С1п

ТАг

Нтз

РАе

Агд

Суз

С1п

Суз

420

425

430

Туг

^еи

С1у

Тгр

С1у

С1у

С1и

С1п

Суз

С1п

Тгр

Азр

Агд

Агд

Агд

А1а

435

440

445

А1а

С1у

С1у

А1а

Зег

С1у

А1а

Тгр

А1а

С1у

Зег

Нтз

^еи

ТАг

С1у

^еи

450

455

460

^еи

А1а

Уа1

А1а

Уа1

^еи

А1а

РАе

ТАг

Тгр

ТАг

Зег

465

470

475

<210> 27 <211> 114 <212> белок <213> Очтз агтез <220>

<223> частичная последовательность РН20 <400> 27 ^еи Туг Уа1 Агд Азп Агд Уа1 Агд С1и А1а 11е Агд ^еи Зег ^уз 11е 1 5 10 15

А1а Зег Уа1 С1и Зег Рго ^еи Рго Уа1 РАе Уа1 Туг Нтз Агд Рго Уа1 20 25 30

РАе ТАг Азр С1у Зег Зег ТАг Туг ^еи Зег С1п С1у Азр ^еи Уа1 Азп 35 40 45

Зег Уа1 С1у С1и 11е Уа1 А1а ^еи С1у А1а Зег С1у 11е 11е Меб Тгр 50 55 60

С1у Зег ^еи Азп ^еи Зег ^еи ТАг Меб С1п Зег Суз Меб Азп ^еи С1у

70 75 80

Азп Туг ^еи Азп ТАг ТАг ^еи Азп Рго Туг 11е 11е Азп Уа1 ТАг ^еи

123 026112

90 95

А1а А1а Туз МеТ Суз Зег С1п Уа1 Теи Суз С1п С1и С1п С1у Уа1 Суз

100 105 110

11е Агд <210> 28 <211> 414 <212> белок <213> Ропдо рудтаеиз <220>

<223> гиалуронидаза 3 <400> 28

МеТ 1

ТТг

ТТг

Агд

Теи 5

С1у

Рго

А1а

Теи

Уа1 10

Теи

С1у

Уа1

А1а

Теи 15

Суз

Теи

С1у

Суз

С1у

С1п

Рго

Теи

Рго

С1п

Уа1

Рго

С1и

Агд

Рго

РТе

Зег

20

25

30

Уа1

Теи

Тгр

Азп

Уа1

Рго

Зег

А1а

Η^з

Суз

Туз

Зег

Агд

РТе

С1у

Уа1

35

40

45

Η^з

Теи

Рго

Теи

Азп

А1а

Теи

С1у

11е

11е

А1а

Азп

Агд

С1у

С1п

Η^з

50

55

60

РТе

Η^з

С1у

С1п

Азп

МеТ

ТТг

11е

РТе

Туг

Туз

Азп

С1п

Теи

С1у

Теи

65

70

75

80

Туг

Рго

Туг

РТе

С1у

Рго

Туз

С1у

ТТг

А1а

Η^з

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

85

90

95

С1п

А1а

Теи

Рго

Теи

Азр

Агд

Η^з

Теи

А1а

Теи

А1а

А1а

Туг

С1п

11е

100

105

110

Η^з

Η^з

Зег

Теи

Агд

Рго

С1у

РТе

А1а

С1у

Рго

А1а

Уа1

Теи

Азр

Тгр

115

120

125

С1и

С1и

Тгр

Суз

Рго

Теи

Тгр

А1а

С1у

Азп

Тгр

С1у

Агд

Агд

Агд

А1а

130

135

140

Туг

С1п

А1а

А1а

Зег

Тгр

А1а

Тгр

А1а

С1п

С1п

Уа1

РТе

Рго

Азр

Теи

145

150

155

160

Азр

Рго

С1п

С1и

С1п

Теи

Туг

Туз

А1а

Туг

ТТг

С1у

РТе

С1и

С1п

А1а

165

170

175

А1а

Агд

А1а

Теи

МеТ

С1и

Азр

ТТг

Теи

Агд

Уа1

А1а

С1п

А1а

Теи

Агд

180

185

190

Рго

Η^з

С1у

Теи

Тгр

С1у

РТе

Туг

Η^з

Туг

Рго

А1а

Суз

С1у

Азп

С1у

195

200

205

124 026112

Тгр

Нтз 210

Зег

МеЬ

А1а

Зег

Азп 215

Туг

ТЬг

С1у

Агд

Суз 220

Нтз

А1а

А1а

ТЬг

Ьеи

А1а

Агд

Азп

ТЬг

С1п

Ьеи

Нтз

Тгр

Ьеи

Тгр

А1а

А1а

Зег

Зег

А1а

225

230

235

240

Ьеи

РЬе

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Рго

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Рго

А1а

Нтз

Нтз

245

250

255

С1п

А1а

РЬе

Уа1

Агд

Нтз

Агд

Ьеи

С1и

С1и

А1а

РЬе

Агд

Уа1

А1а

Ьеи

260

265

270

Уа1

С1у

Нтз

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

А1а

Туг

Уа1

Агд

Ьеи

ТЬг

Нтз

Агд

Агд

275

280

285

Зег

С1у

Агд

РЬе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

Азр

Ьеи

Уа1

С1п

ТЬг

11е

С1у

Уа1

290

295

300

Зег

А1а

А1а

Ьеи

С1у

А1а

А1а

С1у

Уа1

Уа1

Ьеи

Тгр

С1у

Азр

Ьеи

Зег

305

310

315

320

Ьеи

Зег

Зег

Зег

С1и

С1и

С1и

Суз

Тгр

Нтз

Ьеи

Нтз

Азр

Туг

Ьеи

Уа1

325

330

335

Азр

ТЬг

Ьеи

С1у

Рго

Туг

С1у

11е

Азп

Уа1

ТЬг

Агд

А1а

А1а

МеЬ

А1а

340

345

350

Суз

Зег

Нтз

С1п

Агд

Суз

Нтз

С1у

Нтз

С1у

Агд

Суз

А1а

Агд

Агд

Азр

355

360

365

Рго

С1у

С1п

МеЬ

С1и

А1а

РЬе

Ьеи

Нтз

Ьеи

Тгр

Рго

Азр

С1у

Зег

Ьеи

370

375

380

С1у

Азр

Тгр

Ьуз

Зег

РЬе

Зег

Суз

Нтз

Суз

Туг

Тгр

С1у

Тгр

А1а

С1у

385

390

395

400

Рго

ТЬг

Суз

С1п

С1и

Рго

Агд

Ьеи

С1у

Рго

Ьуз

С1и

А1а

Уа1

405 410 <210> 29 <211> 510 <212> белок <213> Масаса Газстси1агтз <220>

<223> РН20 <400> 29

МеЬ

С1у

Уа1

Ьеи

Ьуз

РЬе

Ьуз

Нтз

11е

РЬе

РЬе

Агд

Зег

РЬе

Уа1

Ьуз

1

5

10

15

Зег

Зег

С1у

Уа1

Зег

С1п

11е

Уа1

РЬе

ТЬг

РЬе

Ьеи

Ьеи

11е

Рго

Суз

125 026112

20

25

30

Суз

Ьеи

ТАг

Ьеи

Азп

РАе

Агд

А1а

Рго

Рго

11е

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

35

40

45

РАе

Ьеи

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РАе

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

РАе

50

55

60

Азп

С1и

Рго

Ьеи

Азр

МеА

Зег

Ьеи

РАе

ТАг

Ьеи

МеА

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

Уа1

ТАг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТАг

11е

РАе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Ьеи

ТАг

ТАг

С1у

Уа1

ТАг

Уа1

Η^з

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Ьуз

Уа1

Зег

Ьеи

С1п

Азр

Η^з

Ьеи

Азр

Ьуз

Зег

Ьуз

115

120

125

С1п

Азр

11е

Ьеи

РАе

Туг

МеА

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

МеА

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТАг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

145

150

155

160

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

С1п

А1а

ТАг

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РАе

180

185

190

С1и

Ьуз

А1а

С1у

Ьуз

Азр

РАе

МеА

Ьеи

С1и

ТАг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Агд

195

200

205

Зег

Ьеи

Агд

Рго

Азп

Η^з

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РАе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Η^з

Η^з

Туг

Агд

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РАе

Азр

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТАг

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТАг

С1п

С1п

Зег

Уа1

Уа1

260

265

270

Уа1

А1а

ТАг

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Ьуз

11е

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Азп

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РАе

Уа1

Туг

А1а

290

295

300

Агд

Ьеи

Уа1

РАе

ТАг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РАе

Ьеи

Зег

Агд

С1и

С1и

305

310

315

320

Ьеи

Уа1

Зег

ТАг

Ьеи

С1у

С1и

ТАг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

Зег

Ьеи

Зег

11е

ТАг

Агд

Зег

МеА

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

126 026112

340

345

350

Ьеи

Ьеи

Азр

ТНг

Туг

МеЬ

С1и

ТНг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТНг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеЬ

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Ьуз

Азр

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

НЬз

Ьеи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РНе

Азр

11е

Агд

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РНе

ТНг

405

410

415

Уа1

НЬз

С1у

Ьуз

Рго

ТНг

Уа1

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1и

РНе

Зег

С1и

Ьуз

420

425

430

РНе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

ТНг

Азп

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

Ьуз

Азр

ТНг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

Зег

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

Уа1

С1и

ТНг

С1и

С1у

Зег

Рго

Рго

465

470

475

480

11е

РНе

Туг

Азп

ТНг

Зег

Зег

Зег

ТНг

Уа1

Зег

ТНг

ТНг

МеЬ

РНе

11е

485

490

495

Уа1

Азп

11е

Ьеи

РНе

Ьеи

11е

11е

Зег

Зег

Уа1

А1а

Зег

Ьеи

500

505

510

<210> 30

<211> 529

<212> белок

<213> СачЬа

рогсеЫиз

<220>

<223> РН20

<400> 30

МеЬ С1у А1а

РНе

ТНг

РНе

Ьуз

НЬз

Зег

РНе

РНе

С1у

Зег

РНе

Уа1

С1и

1

5

10

15

Суз Зег С1у

Уа1

Ьеи

С1п

ТНг

Уа1

РНе

11е

РНе

Ьеи

Ьеи

11е

Рго

Суз

20

25

30

Суз Ьеи А1а

Азр

Ьуз

Агд

А1а

Рго

Рго

Ьеи

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

Ьеи

35

40

45

Ьеи Тгр Уа1

Тгр

Азп

А1а

Рго

ТНг

С1и

РНе

Суз

11е

С1у

С1у

ТНг

Азп

127 026112

50

55

60

С1п

Рго

Ьеи

Азр

МеЬ

Зег

РЬе

РЬе

Зег

11е

Уа1

С1у

ТЬг

Рго

Агд

Ьуз

65

70

75

80

Азп

11е

ТЬг

С1у

С1п

Зег

11е

ТЬг

Ьеи

Туг

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

С1у

85

90

95

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Рго

Нтз

ТЬг

С1у

А1а

11е

Уа1

Нтз

С1у

С1у

100

105

110

Ьеи

Рго

С1п

Ьеи

МеЬ

Азп

Ьеи

С1п

С1п

Нтз

Ьеи

Агд

Ьуз

Зег

Агд

С1п

115

120

125

Азр

11е

Ьеи

РЬе

Туг

МеЬ

Рго

ТЬг

Азр

Зег

Уа1

С1у

Ьеи

А1а

Уа1

11е

130

135

140

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТЬг

Тгр

ТЬг

Агд

Азп

Тгр

Агд

Рго

Ьуз

145

150

155

160

Азр

11е

Туг

Агд

Азп

Ьуз

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Зег

С1п

Нтз

Рго

165

170

175

С1п

Туг

Азп

Нтз

Зег

Туг

А1а

Уа1

А1а

Уа1

А1а

Ьуз

Агд

Азр

РЬе

С1и

180

185

190

Агд

ТЬг

С1у

Ьуз

А1а

РЬе

МеЬ

Ьеи

С1и

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

Зег

195

200

205

Ьеи

Агд

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РЬе

Рго

Азр

Суз

Туг

210

215

220

Азп

ТЬг

Нтз

РЬе

ТЬг

Ьуз

Рго

Азп

Туг

Азр

С1у

Нтз

Суз

Рго

Рго

11е

225

230

235

240

С1и

Ьеи

С1п

Агд

Азп

Азп

Азр

Ьеи

С1п

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

Азр

Зег

ТЬг

245

250

255

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

Уа1

Туг

Ьеи

ТЬг

Зег

Агд

Уа1

Агд

Зег

Зег

С1п

260

265

270

Азп

С1у

А1а

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Нтз

С1и

Зег

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Ьуз

Ьеи

МеЬ

Азр

Азр

Ьуз

Азп

Рго

Ьеи

Рго

11е

Туг

Уа1

Туг

11е

290

295

300

Агд

Ьеи

Уа1

РЬе

ТЬг

Азр

С1п

ТЬг

ТЬг

ТЬг

РЬе

Ьеи

С1и

Ьеи

Азр

Азр

305

310

315

320

Ьеи

Уа1

Нтз

Зег

Уа1

С1у

С1и

11е

Уа1

Рго

Ьеи

С1у

Уа1

Зег

С1у

11е

325

330

335

11е

11е

Тгр

С1у

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Агд

Зег

Ьеи

Уа1

Зег

Суз

11е

340

345

350

С1у

Ьеи

С1и

Азп

Туг

МеЬ

Ьуз

С1у

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Рго

Туг

Ьеи

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТЬг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеЬ

Суз

С1у

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

Ьуз

Азп

С1п

128 026112

370

375

380

С1у

11е

Суз

ТАг

Агд

Вуз

Азр

Тгр

Азп

ТАг

Азп

ТАг

Туг

Вей

Нгз

Вей

385

390

395

400

Азп

А1а

ТАг

Азп

РАе

Азр

11е

С1и

Вей

С1п

С1п

Азп

С1у

Вуз

РАе

Уа1

405

410

415

Уа1

Нгз

С1у

Вуз

Рго

Зег

Вей

С1и

Азр

Вей

С1п

С1и

РАе

Зег

Вуз

Азп

420

425

430

РАе

Нгз

Суз

Зег

Суз

Туг

ТАг

Азп

Уа1

А1а

Суз

Вуз

Азр

Агд

Вей

Азр

435

440

445

Уа1

Нгз

Азп

Уа1

Агд

Зег

Уа1

Азп

Уа1

Суз

ТАг

А1а

Азп

Азп

11е

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

Уа1

Вей

Азп

РАе

Рго

Зег

Вей

Азр

Азр

Азр

Азр

С1и

Рго

465

470

475

480

Рго

11е

ТАг

Азр

Азр

ТАг

Зег

С1п

Азп

С1п

Азр

Зег

11е

Зег

Азр

11е

485

490

495

ТАг

Зег

Зег

А1а

Рго

Рго

Зег

Зег

Нгз

11е

Вей

Рго

Вуз

Азр

Вей

Зег

500

505

510

Тгр

Суз

Вей

РАе

Вей

Вей

Зег

11е

РАе

Зег

С1п

Нгз

Тгр

Вуз

Туг

Вей

515

520

525

Вей

<210> 31

<211> 512

<212> белок

<213> КаААиз

пог^ед1сиз

<220>

<223> РН20

<400> 31

МеА С1у С1и

Вей

С1п РАе

Вуз

Тгр

Вей

РАе

Тгр

Агд

Зег

РАе

А1а

С1и

1

5

10

15

Зег С1у С1у

ТАг

РАе С1п

ТАг

Уа1

Вей

11е

РАе

Вей

РАе

11е

Рго

Туг

20

25

30

Зег Вей ТАг

Уа1

Азр Туг

Агд

А1а

ТАг

Рго

Уа1

Вей

Зег

Азр

ТАг

ТАг

35

40

45

РАе Уа1 Тгр

Уа1

Тгр Азп

Уа1

Рго

ТАг

С1и

А1а

Суз

Уа1

С1и

Азп

Уа1

55 60

129 026112

ТНг

С1и

Рго

11е

Азр

Теи

Зег

РНе

РНе

Зег

Теи

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

Туз

ТНг

А1а

11е

С1у

С1п

Рго

Уа1

ТНг

Теи

РНе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Теи

85

90

95

С1у

Азп

Туг

Рго

Нгз

11е

Азр

А1а

С1п

С1п

ТНг

С1и

Нгз

Нгз

С1у

С1у

100

105

110

11е

Рго

С1п

Туз

С1у

Азр

Теи

ТНг

ТНг

Нгз

Теи

Уа1

Туз

А1а

Туз

С1и

115

120

125

Азр

Уа1

С1и

Агд

Туг

11е

Рго

ТНг

Азр

Туз

Теи

С1у

Теи

А1а

11е

11е

130

135

140

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТНг

Тгр

МеН

Агд

Азп

Тгр

ТНг

Рго

Туз

145

150

155

160

Азр

11е

Туг

Агд

Азп

Туз

Зег

11е

С1и

Теи

Уа1

С1п

А1а

А1а

Азр

Рго

165

170

175

А1а

11е

Азп

11е

ТНг

С1и

А1а

ТНг

Уа1

Агд

А1а

Туз

А1а

С1п

РНе

С1и

180

185

190

С1у

А1а

А1а

Туз

С1и

РНе

МеН

С1и

С1у

ТНг

Теи

Туз

Теи

С1у

Туз

Нгз

195

200

205

11е

Агд

Рго

Туз

Нгз

Теи

Тгр

С1у

РНе

Туг

Теи

РНе

Рго

Азр

Суз

Туг

210

215

220

Азп

Азп

Туз

РНе

С1п

Уа1

Азр

Азп

Туг

Азр

С1у

С1п

Суз

Рго

Азр

Уа1

225

230

235

240

С1и

Туз

Туз

Агд

Азп

Азр

Азр

Теи

Азр

Тгр

Теи

Тгр

Туз

С1и

Зег

ТНг

245

250

255

С1у

Теи

Туг

Рго

Зег

Уа1

Туг

Теи

Туз

Туз

Азр

Теи

Туз

Зег

Зег

Агд

260

265

270

Туз

А1а

ТНг

Теи

Туг

Уа1

Агд

Туг

Агд

Уа1

Теи

С1и

Зег

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Туз

Уа1

Зег

Азр

С1и

Зег

Азп

Рго

Уа1

Рго

11е

РНе

Уа1

Туг

11е

290

295

300

Агд

Теи

Уа1

РНе

ТНг

Азр

Нгз

Уа1

Зег

С1и

Туг

Теи

Теи

С1и

Азр

Азр

305

310

315

320

Теи

Уа1

Азп

ТНг

11е

С1у

С1и

11е

Уа1

А1а

С1п

С1у

ТНг

Зег

С1у

11е

325

330

335

11е

11е

Тгр

Азр

А1а

МеН

Зег

Теи

А1а

С1п

Агд

Зег

А1а

С1у

Суз

Рго

340

345

350

11е

Теи

Агд

С1п

Туг

МеН

Туз

ТНг

ТНг

Теи

Азп

Рго

Туг

11е

Уа1

Азп

355

360

365

Уа1

ТНг

Теи

А1а

А1а

Туз

МеН

Суз

Зег

С1п

ТНг

Теи

Суз

Туз

С1и

Туз

130 026112

370

375

380

С1у

МеН

Суз

Зег

Агд

Ьуз

ТНг

С1и

Зег

Зег

Азр

А1а

Туг

Ьеи

Нгз

Ьеи

385

390

395

400

Азр

Рго

Зег

Зег

РНе

Зег

11е

Азп

Уа1

ТНг

С1и

А1а

С1у

Ьуз

Туг

С1и

405

410

415

Уа1

Ьеи

С1у

Ьуз

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

Азр

Ьеи

С1и

Туг

РНе

Зег

С1и

Нгз

420

425

430

РНе

Ьуз

Суз

Зег

Суз

РНе

Зег

Ьуз

МеН

ТНг

Суз

С1и

С1и

ТНг

Зег

Азр

435

440

445

МеН

Агд

Зег

11е

С1п

Азр

Уа1

Азп

Уа1

Суз

МеН

С1у

Азр

Азп

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи

С1у

Рго

Азп

Зег

А1а

РНе

Нгз

Ьеи

Ьеи

Рго

С1у

465

470

475

480

Ьуз

С1у

Ьеи

Ьеи

Ьеи

МеН

ТНг

ТНг

Ьеи

А1а

Нгз

11е

Ьеи

Нгз

Нгз

Ьеи

485

490

495

Рго

Нгз

Азр

11е

РНе

Уа1

РНе

Рго

Тгр

Ьуз

МеН

Ьеи

Уа1

Зег

ТНг

Рго

500

505

510

<210> 32 <211> 512 <212> белок <213> Миз тизси1из <220>

<223> РН20 <400> 32

МеН С1у С1и Ьеи Агд РНе Ьуз Нгз Ьеи РНе Тгр С1у Зег РНе Уа1 С1и 1 5 10 15

Зег С1у С1у ТНг РНе С1п ТНг Уа1 Ьеи 11е РНе Ьеи Ьеи 11е Рго Суз 20 25 30

Зег Ьеи ТНг Уа1 Азр Туг Агд А1а А1а Рго 11е Ьеи Зег Азп ТНг ТНг 35 40 45

РНе Ьеи Тгр 11е Тгр Азп Уа1 Рго ТНг С1и Агд Суз Уа1 С1у Азп Уа1 50 55 60

Азп Азр Рго 11е Азр Ьеи Зег РНе РНе Зег Ьеи 11е С1у Зег Рго Агд

70 75 80

Ьуз ТНг А1а ТНг С1у С1п Рго Уа1 ТНг Ьеи РНе Туг Уа1 Азр Агд Ьеи

131 026112

90 95

С1у

^еи

Туг

Рго 100

Нтз

11е

Азр

А1а

Азп 105

С1п

А1а

С1и

Нтз

Туг 110

С1у

С1у

11е

Рго

С1п

Агд

С1у

Азр

Туг

С1п

А1а

Нтз

^еи

Агд

^уз

А1а

^уз

ТАг

115

120

125

Азр

11е

С1и

Нтз

Туг

11е

Рго

Азр

Азр

^уз

^еи

С1у

^еи

А1а

11е

11е

130

135

140

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТАг

Тгр

^еи

Агд

Азп

Тгр

^уз

Рго

^уз

145

150

155

160

Азр

Азп

Туг

Агд

Азп

^уз

Зег

11е

С1и

^еи

Уа1

С1п

Зег

ТАг

Азп

Рго

165

170

175

С1у

^еи

Зег

11е

ТАг

С1и

А1а

ТАг

С1п

^уз

А1а

11е

С1п

С1п

РАе

С1и

180

185

190

С1и

А1а

С1у

Агд

^уз

РАе

Меб

С1и

С1у

ТАг

^еи

Нтз

^еи

С1у

^уз

РАе

195

200

205

^еи

Агд

Рго

Азп

С1п

^еи

Тгр

С1у

Туг

Туг

^еи

РАе

Рго

Азр

Суз

Туг

210

215

220

Азп

Азп

^уз

РАе

С1п

Азр

Рго

^уз

Туг

Азр

С1у

С1п

Суз

Рго

А1а

Уа1

225

230

235

240

С1и

^уз

^уз

Агд

Азп

Азр

Азп

^еи

^уз

Тгр

^еи

Тгр

^уз

А1а

Зег

ТАг

245

250

255

С1у

^еи

Туг

Рго

Зег

Уа1

Туг

^еи

^уз

^уз

Азр

^еи

^уз

Зег

Азп

Агд

260

265

270

С1п

А1а

ТАг

^еи

Туг

Уа1

Агд

Туг

Агд

Уа1

Уа1

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

^уз

Уа1

С1у

Азп

А1а

Зег

Азр

Рго

Уа1

Рго

11е

РАе

Уа1

Туг

11е

290

295

300

Агд

^еи

Уа1

РАе

ТАг

Азр

Агд

ТАг

Зег

С1и

Туг

^еи

^еи

С1и

Азр

Азр

305

310

315

320

^еи

Уа1

Азп

ТАг

11е

С1у

С1и

11е

Уа1

А1а

^еи

С1у

ТАг

Зег

С1у

11е

325

330

335

11е

11е

Тгр

Азр

А1а

Меб

Зег

^еи

А1а

С1п

Агд

А1а

А1а

С1у

Суз

Рго

340

345

350

11е

^еи

Нтз

^уз

Туг

Меб

С1п

ТАг

ТАг

^еи

Азп

Рго

Туг

11е

Уа1

Азп

355

360

365

Уа1

ТАг

^еи

А1а

А1а

^уз

Меб

Суз

Зег

С1п

ТАг

^еи

Суз

Азп

С1и

^уз

370

375

380

С1у

Меб

Суз

Зег

Агд

Агд

^уз

С1и

Зег

Зег

Азр

Уа1

Туг

^еи

Нтз

^еи

385

390

395

400

Азп

Рго

Зег

Нтз

РАе

Азр

11е

Меб

^еи

ТАг

С1и

ТАг

С1у

^уз

Туг

С1и

132 026112

405

410

415

Уа1

Ъеи

С1у

Азп

Рго

Агд

Уа1

С1у

Азр

Ъеи

С1и

Туг

РВе

Зег

С1и

Нгз

420

425

430

РВе

Ъуз

Суз

Зег

Суз

РВе

Зег

Агд

Меб

ТВг

Суз

Ъуз

С1и

ТВг

Зег

Азр

435

440

445

Уа1

Ъуз

Азп

Уа1

С1п

Азр

Уа1

Азп

Уа1

Суз

Уа1

С1у

Азр

Азп

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Ъуз

А1а

Ъуз

Уа1

С1и

Рго

Азп

Рго

А1а

РВе

Туг

Ъеи

Ъеи

Рго

С1у

465

470

475

480

Вуз

Зег

Ъеи

Ъеи

РВе

Меб

ТВг

ТВг

Ъеи

С1у

Нгз

Уа1

Ъеи

Туг

Нгз

Ъеи

485

490

495

Рго

С1п

Азр

11е

РВе

Уа1

РВе

Рго

Агд

Ъуз

ТВг

Ъеи

Уа1

Зег

ТВг

Рго

500 505 510 <210> 33 <211> 807 <212> белок

<213> ЗбарВу1ососсиз	: аигеиз
<220>
<223> гиалуронидаза
<400> 33
Меб ТВг Туг Агд 11е	Ъуз Ъуз Тгр С1п Ъуз Ъеи Зег ТВг 11е ТВг Ъеи
1 5	10 15
Ъеи Меб А1а С1у Уа1	11е ТВг Ъеи Азп С1у С1у С1и РВе Агд Зег Уа1
20	25 30
Азр Ъуз Низ С1п 11е	А1а Уа1 А1а Азр ТВг Азп Уа1 С1п ТВг Рго Азр
35	40 45
Туг С1и Ъуз Ъеи Агд	Азп ТВг Тгр Ъеи Азр Уа1 Азп Туг С1у Туг Азр
50	55 60
Ъуз Туг Азр С1и Азп	Азп Рго Азр Меб Ъуз Ъуз Ъуз РВе Азр А1а ТВг
65	70 75 80
С1и Ъуз С1и А1а ТВг	Азп Ъеи Ъеи Ъуз С1и Меб Ъуз ТВг С1и Зег С1у
85	90 95
Агд Ъуз Туг Ъеи Тгр	Зег С1у А1а С1и ТВг Ъеи С1и ТВг Азп Зег Зег
100	105 110
Низ Меб ТВг Агд ТВг	Туг Агд Азп 11е С1и Ъуз 11е А1а С1и А1а Меб
115	120 125
Агд Азп Рго Ъуз ТВг	ТВг Ъеи Азп ТВг Азр С1и Азп Ъуз Ъуз Ъуз Уа1

133 026112

130 135 140

Ьуз

Азр

А1а

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

Η^з

Ьуз

Азп

А1а

Туг

С1у

Ьуз

С1и

Рго

145

150

155

160

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

Ьуз

С1и

Ьеи

Зег

С1и

Азп

РАе

ТАг

Ьуз

ТАг

ТАг

С1у

165

170

175

Ьуз

Азп

ТАг

Азп

Ьеи

Азп

Тгр

Тгр

Азр

Туг

С1и

11е

С1у

ТАг

Рго

Ьуз

180

185

190

Зег

Ьеи

ТАг

Азп

ТАг

Ьеи

11е

Ьеи

Ьеи

Азп

Азр

С1п

РАе

Зег

Азп

С1и

195

200

205

С1и

Ьуз

Ьуз

Ьуз

РАе

ТАг

А1а

Рго

11е

Ьуз

ТАг

РАе

А1а

Рго

Азр

Зег

210

215

220

Азр

Ьуз

11е

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

С1у

Ьуз

А1а

С1и

Ьеи

А1а

Ьуз

С1у

С1у

225

230

235

240

Азп

Ьеи

Уа1

Азр

11е

Зег

Ьуз

Уа1

Ьуз

Ьеи

Ьеи

С1и

Суз

11е

11е

С1и

245

250

255

С1и

Азр

Ьуз

Азр

МеА

МеА

Ьуз

Ьуз

Зег

11е

Азр

Зег

РАе

Азп

Ьуз

Уа1

260

265

270

РАе

ТАг

Туг

Уа1

С1п

Азр

Зег

А1а

ТАг

С1у

Ьуз

С1и

Агд

Азп

С1у

РАе

275

280

285

Туг

Ьуз

Азр

С1у

Зег

Туг

11е

Азр

Η^з

С1п

Азр

Уа1

Рго

Туг

ТАг

С1у

290

295

300

А1а

Туг

С1у

Уа1

Уа1

Ьеи

Ьеи

С1и

С1у

11е

Зег

С1п

МеА

МеА

Рго

МеА

305

310

315

320

11е

Ьуз

С1и

ТАг

Рго

РАе

Азп

Азр

Ьуз

ТАг

С1п

Азп

Азр

ТАг

ТАг

Ьеи

325

330

335

Ьуз

Зег

Тгр

11е

Азр

Азр

С1у

РАе

МеА

Рго

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

С1у

С1и

340

345

350

МеА

МеА

Азр

Ьеи

Зег

Агд

С1у

Агд

А1а

11е

Зег

Агд

С1и

Азп

С1и

ТАг

355

360

365

Зег

Η^з

Зег

А1а

Зег

А1а

ТАг

Уа1

МеА

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

370

375

380

Азр

А1а

МеА

Азр

Азр

Зег

ТАг

Ьуз

А1а

Ьуз

Туг

Ьуз

Ьуз

11е

Уа1

Ьуз

385

390

395

400

Зег

Зег

Уа1

С1и

Зег

Азр

Зег

Зег

Туг

Ьуз

С1п

Азп

Азр

Туг

Ьеи

Азп

405

410

415

Зег

Туг

Зег

Азр

11е

Азр

Ьуз

МеА

Ьуз

Зег

Ьеи

МеА

ТАг

Азр

Азп

Зег

420

425

430

11е

Зег

Ьуз

Азп

С1у

Ьеи

ТАг

С1п

С1п

Ьеи

Ьуз

11е

Туг

Азп

Азр

МеА

435

440

445

Азр

Агд

Уа1

ТАг

Туг

Η^з

Азп

Ьуз

Азр

Ьеи

Азр

РАе

А1а

РАе

С1у

Ьеи

134 026112

450 455 460

Зег 465

МеТ

ТТг

Зег

Туз

Азп 470

Уа1

А1а

Агд

Туг

С1и 475

Зег

11е

Азп

С1у

С1и 480

Азп

Теи

Туз

С1у

Тгр

Η^з

ТТг

С1у

А1а

С1у

МеТ

Зег

Туг

Теи

Туг

Азп

485

490

495

Зег

Азр

Уа1

Туз

Η^з

Туг

Η^з

Азр

Азп

РТе

Тгр

Уа1

ТТг

А1а

Азр

МеТ

500

505

510

Туз

Агд

Теи

Зег

С1у

ТТг

ТТг

ТТг

Теи

Азр

Азп

С1и

11е

Теи

Туз

Азр

515

520

525

ТТг

Азр

Азр

Туз

Туз

Зег

Зег

Туз

ТТг

РТе

Уа1

С1у

С1у

ТТг

Туз

Уа1

530

535

540

Азр

Азр

С1п

Η^з

А1а

Зег

11е

С1у

МеТ

Азр

РТе

С1и

Азп

С1п

Азр

Туз

545

550

555

560

ТТг

Теи

ТТг

А1а

Туз

Туз

Зег

Туг

РТе

11е

Теи

Азп

Азр

Туз

11е

Уа1

565

570

575

РТе

Теи

С1у

ТТг

С1у

11е

Туз

Зег

ТТг

Азр

Зег

Зег

Туз

Азп

Рго

Уа1

580

585

590

ТТг

ТТг

11е

С1и

Азп

Агд

Туз

А1а

Азп

С1у

Туг

ТТг

Теи

Туг

ТТг

Азр

595

600

605

Азр

Туз

С1п

ТТг

ТТг

Азп

Зег

Азр

Азп

С1п

С1и

Азп

Азп

Зег

Уа1

РТе

610

615

620

Теи

С1и

Зег

ТТг

Азр

ТТг

Туз

Туз

Азп

11е

С1у

Туг

Η^з

РТе

Теи

Азп

625

630

635

640

Туз

Рго

Туз

11е

ТТг

Уа1

Туз

Туз

С1и

Зег

Η^з

ТТг

С1у

Туз

Тгр

Туз

645

650

655

С1и

11е

Азп

Туз

Зег

С1п

Туз

Азр

ТТг

С1п

Туз

ТТг

Азр

С1и

Туг

Туг

660

665

670

С1и

Уа1

ТТг

С1п

Туз

Η^з

Зег

Азп

Зег

Азр

Азп

Туз

Туг

С1у

Туг

Уа1

675

680

685

Теи

Туг

Рго

С1у

Теи

Зег

Туз

Азр

Уа1

РТе

Туз

ТТг

Туз

Туз

Азр

С1и

690

695

700

Уа1

ТТг

Уа1

Уа1

Туз

С1п

С1и

Азр

Азр

РТе

Η^з

Уа1

Уа1

Туз

Азр

Азп

705

710

715

720

С1и

Зег

Уа1

Тгр

А1а

С1у

Уа1

Азп

Туг

Зег

Азп

Зег

ТТг

С1п

ТТг

РТе

725

730

735

Азр

11е

Азп

Азп

ТТг

Туз

Уа1

С1и

Уа1

Туз

А1а

Туз

С1у

МеТ

РТе

11е

740

745

750

Теи

Туз

Туз

Туз

Азр

Азр

Азп

ТТг

Туг

С1и

Суз

Зег

РТе

Туг

Азп

Рго

755

760

765

135 026112

С1и

Зег 770

Тйг

Азп

Зег

А1а

Зег 775

Азр

11е

С1и

Зег

Ьуз 780

11е

Зег

Мек

Тйг

С1у

Туг

Зег

11е

Тйг

Азп

Ьуз

Азп

Тпг

Зег

Тйг

Зег

Азп

С1и

Зег

С1у

785

790

795

800

Уа1

Нтз

Рйе

С1и

Ьеи

Тйг

Ьуз

805 <210> 34 <211> 371 <212> белок <213> Зкгеркососсиз руодепез Ьаскегторйаде Н4489А <220>

<223> гиалуронидаза <400> 34

Мек 1

Тйг

С1и

Азп

11е 5

Рго

Ьеи

Агд

Уа1

С1п 10

Рйе

Ьуз

Агд

Мек

Зег 15

А1а

Азр

С1и

Тгр

А1а

Агд

Зег

Азр

Уа1

11е

Ьеи

Ьеи

С1и

С1у

С1и

11е

С1у

20

25

30

Рйе

С1и

Тйг

Азр

Тйг

С1у

Рйе

А1а

Ьуз

Рйе

С1у

Азр

С1у

С1п

Азп

Тйг

35

40

45

Рйе

Зег

Ьуз

Ьеи

Ьуз

Туг

Ьеи

Тйг

С1у

Рго

Ьуз

С1у

Рго

Ьуз

С1у

Азр

50

55

60

Тйг

С1у

Ьеи

С1п

С1у

Ьуз

Тйг

С1у

С1у

Тйг

С1у

Рго

Агд

С1у

Рго

А1а

65

70

75

80

С1у

Ьуз

Рго

С1у

Тйг

Тйг

Азр

Туг

Азр

С1п

Ьеи

С1п

Азп

Ьуз

Рго

Азр

85

90

95

Ьеи

С1у

А1а

Рйе

А1а

С1п

Ьуз

С1и

С1и

Тйг

Азп

Зег

Ьуз

11е

Тйг

Ьуз

100

105

110

Ьеи

С1и

Зег

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Ьуз

Зег

А1а

Уа1

Туг

Зег

Ьуз

А1а

С1и

115

120

125

Зег

Ьуз

11е

С1и

Ьеи

Азр

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Зег

Ьеи

Тйг

С1у

С1у

11е

Уа1

130

135

140

Тйг

С1у

С1п

Ьеи

С1п

Рйе

Ьуз

Рго

Азп

Ьуз

Зег

С1у

11е

Ьуз

Рго

Зег

145

150

155

160

Зег

Зег

Уа1

С1у

С1у

А1а

11е

Азп

11е

Азр

Мек

Зег

Ьуз

Зег

С1и

С1у

165

170

175

А1а

А1а

Мек

Уа1

Мек

Туг

Тйг

Азп

Ьуз

Азр

Тйг

Тйг

Азр

С1у

Рго

Ьеи

136 026112

180

185

190

МеН

11е

Теи

Агд

Зег

Азр

Туз

Азр

ТНг

РНе

Азр

С1п

Зег

А1а

С1п

РНе

195

200

205

Уа1

Азр

Туг

Зег

С1у

Туз

ТНг

Азп

А1а

Уа1

Азп

11е

Уа1

МеН

Агд

С1п

210

215

220

Рго

Зег

А1а

Рго

Азп

РНе

Зег

Зег

А1а

Теи

Азп

11е

ТНг

Зег

А1а

Азп

225

230

235

240

С1и

С1у

С1у

Зег

А1а

МеН

С1п

11е

Агд

С1у

Уа1

С1и

Туз

А1а

Теи

С1у

245

250

255

ТНг

Теи

Туз

11е

ТНг

Низ

С1и

Азп

Рго

Азп

Уа1

С1и

А1а

Туз

Туг

Азр

260

265

270

С1и

Азп

А1а

А1а

А1а

Теи

Зег

11е

Азр

11е

Уа1

Туз

Туз

С1п

Туз

С1у

275

280

285

С1у

Туз

С1у

ТНг

А1а

А1а

С1п

С1у

11е

Туг

11е

Азп

Зег

ТНг

Зег

С1у

290

295

300

ТНг

А1а

С1у

Туз

МеН

Теи

Агд

11е

Агд

Азп

Туз

Азп

С1и

Азр

Туз

РНе

305

310

315

320

Туг

Уа1

С1у

Рго

Азр

С1у

С1у

РНе

Низ

Зег

С1у

А1а

Азп

Зег

ТНг

Уа1

325

330

335

А1а

С1у

Азп

Теи

ТНг

Уа1

Туз

Азр

Рго

ТНг

Зег

С1у

Туз

Низ

А1а

А1а

340

345

350

ТНг

Туз

Азр

Туг

Уа1

Азр

С1и

Туз

11е

А1а

С1и

Теи

Туз

Туз

Теи

11е

355

360

365

Теи Туз Туз 370 <210> 35 <211> 1628 <212> белок <213> С1озНгибиит рег£гипдепз <220>

<223> гиалуронидаза <400> 35

МеН 1

Азп

Ьуз

Азп

11е 5

Агд

Туз

11е

11е

ТНг 10

Зег

ТНг

Уа1

Теи

А1а 15

А1а

МеН

ТНг

11е

Зег

Уа1

Теи

Рго

Зег

Азп

Теи

Уа1

Уа1

РНе

А1а

ТНг

Азр

- 137 026112

20

25

30

С1у

11е

ТЬг

С1и

Азп

РЬе

Туг

С1и

11е

Туг

Рго

Туз

Рго

С1п

С1и

11е

35

40

45

Зег

Туг

Зег

С1у

С1у

С1и

РЬе

С1п

11е

Зег

Азр

С1и

11е

Азп

11е

Уа1

50

55

60

Туг

Азр

Азр

С1у

11е

Азр

ТЬг

Туг

ТЬг

Туз

Туз

Агд

Уа1

Азр

С1и

Уа1

65

70

75

80

Теи

С1и

А1а

Зег

Азп

Теи

С1и

А1а

ТЬг

Уа1

Зег

Азп

С1и

11е

Уа1

Рго

85

90

95

С1у

Туз

ТЬг

Азп

РЬе

Теи

Уа1

С1у

11е

Азп

С1и

Зег

С1у

С1у

Уа1

Уа1

100

105

110

Азр

Азп

Туг

РЬе

Азп

Туз

Азп

11е

Рго

Нгз

Азр

С1и

Зег

РЬе

РЬе

Азр

115

120

125

С1и

Туз

Ме!

Азр

А1а

Азп

11е

Уа1

Зег

Уа1

Туз

Азр

С1у

Уа1

11е

С1у

130

135

140

Уа1

11е

С1у

С1и

Азр

ТЬг

Азр

Зег

А1а

РЬе

Туг

С1у

Уа1

ТЬг

ТЬг

Теи

145

150

155

160

Туз

Нгз

Уа1

РЬе

Азп

С1п

Теи

С1и

С1и

С1у

Азп

Туз

11е

С1п

Зег

РЬе

165

170

175

Агд

А1а

Азр

Азр

Туг

А1а

С1и

Уа1

А1а

Нгз

Агд

С1у

РЬе

11е

С1и

С1у

180

185

190

Туг

Туг

С1у

Азп

Рго

Тгр

Зег

Азп

С1и

Азр

Агд

А1а

С1и

Теи

Ме!

Туз

195

200

205

РЬе

С1у

С1у

Азр

Туг

Туз

Теи

Азп

С1п

Туг

Уа1

РЬе

А1а

Рго

Туз

Азр

210

215

220

Азр

Рго

Туг

Нгз

Азп

Зег

Туз

Тгр

Агд

Азр

Теи

Туг

Рго

С1и

С1и

Туз

225

230

235

240

Теи

Зег

С1и

11е

Туз

Туз

Теи

А1а

С1п

Уа1

С1у

Азп

С1и

ТЬг

Туз

Азп

245

250

255

Агд

Туг

Уа1

Туг

А1а

Теи

Нгз

Рго

РЬе

Ме!

Азп

Азп

Рго

Уа1

Агд

РЬе

260

265

270

Азр

ТЬг

С1и

С1и

Азп

Туг

С1п

Азп

Азр

Теи

С1у

Уа1

11е

Туз

А1а

Туз

275

280

285

РЬе

ТЬг

С1п

Теи

Теи

С1и

Азп

Азр

Уа1

Агд

С1п

РЬе

А1а

11е

Теи

А1а

290

295

300

Азр

Азр

А1а

Зег

А1а

Рго

А1а

С1п

С1у

А1а

Зег

Ме!

Туг

Уа1

Туз

Теи

305

310

315

320

Теи

ТЬг

Азр

Теи

ТЬг

Агд

Тгр

Теи

С1и

С1и

С1п

С1п

Зег

ТЬг

Туг

Рго

325

330

335

Азр

Теи

Туз

ТЬг

Азр

Теи

Ме!

РЬе

Суз

Рго

Зег

Азр

Туг

Туг

С1у

Азп

138 026112

340

345

350

С1у

Зег

Зег

А1а

С1п

Ьеи

Ьуз

С1и

Ьеи

Азп

Ьуз

А1а

С1и

Азр

Азп

Уа1

355

360

365

Зег

11е

Уа1

МеЬ

ТНг

С1у

С1у

Агд

11е

Тгр

С1у

С1и

Уа1

Азр

С1и

Азп

370

375

380

РНе

А1а

Азп

Азп

РНе

МеЬ

Азп

Азп

11е

Зег

ТНг

С1и

С1у

НЬз

Рго

С1у

385

390

395

400

Агд

А1а

Рго

РНе

РНе

Тгр

11е

Азп

Тгр

Рго

Суз

Зег

Азр

Азп

Зег

Ьуз

405

410

415

С1п

НЬз

Ьеи

11е

МеЬ

С1у

С1у

Азп

Азр

ТНг

РНе

Ьеи

НЬз

Рго

С1у

Уа1

420

425

430

Азр

Рго

Зег

Ьуз

11е

Азр

С1у

11е

Уа1

Ьеи

Азп

Рго

МеЬ

С1п

С1п

А1а

435

440

445

С1и

А1а

Азп

Ьуз

Зег

А1а

Ьеи

РНе

А1а

11е

А1а

Азр

Туг

А1а

Тгр

Азп

450

455

460

11е

Тгр

Азр

Азп

Ьуз

С1и

С1и

А1а

Азр

С1и

Азп

Тгр

Азп

Азр

Зег

РНе

465

470

475

480

Ьуз

Туг

МеЬ

Азр

НЬз

С1у

ТНг

А1а

С1и

С1и

ТНг

Азп

Зег

Зег

Ьеи

А1а

485

490

495

Ьеи

Агд

С1и

11е

Зег

Ьуз

НЬз

МеЬ

11е

Азп

С1п

Азп

МеЬ

Азр

С1у

Агд

500

505

510

Уа1

Агд

Рго

Ьеи

С1п

С1и

Зег

Уа1

С1и

Ьеи

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

С1и

А1а

515

520

525

РНе

Ьуз

С1п

Ьуз

Туг

Азр

Зег

С1у

А1а

Зег

11е

Ьуз

С1и

Азр

А1а

Ьеи

530

535

540

С1и

Ьеи

11е

А1а

С1и

РНе

ТНг

Азп

Ьеи

С1п

Ьуз

А1а

А1а

Азр

Туг

Туг

545

550

555

560

Ьуз

Азп

Азп

Рго

С1у

Азп

С1и

Агд

ТНг

Агд

Азр

С1п

11е

11е

Туг

Тгр

565

570

575

Ьеи

Азп

Суз

Тгр

С1и

Азр

ТНг

МеЬ

Азр

А1а

А1а

11е

С1у

Туг

Ьеи

Ьуз

580

585

590

Зег

А1а

11е

А1а

11е

С1и

С1и

С1у

Азр

Азр

С1и

А1а

А1а

Тгр

А1а

Азп

595

600

605

Туг

Зег

С1и

А1а

С1п

С1у

А1а

РНе

С1и

Ьуз

Зег

Ьуз

ТНг

Туг

С1у

РНе

610

615

620

НЬз

Туг

Уа1

Азр

НЬз

ТНг

С1и

Туг

А1а

С1и

Уа1

С1у

Уа1

С1п

НЬз

11е

625

630

635

640

Уа1

Рго

РНе

11е

Ьуз

Зег

МеЬ

С1у

С1п

Азп

Ьеи

Зег

Уа1

Уа1

11е

С1у

645

650

655

139 026112

Зег

11е

Уа1

Азр 660

Рго

Азп

Агд

11е

11е 665

А1а

ТАг

Туг

11е

Зег 670

Азп

Агд

С1п

Азр

А1а

Рго

ТАг

С1у

Азп

Рго

Азр

Азп

11е

РАе

Азр

Азп

Азп

А1а

675

680

685

Зег

ТАг

С1и

Ьеи

Уа1

Туг

Ьуз

Азп

Рго

Азп

Агд

11е

Азр

Уа1

С1у

ТАг

690

695

700

Туг

Уа1

С1у

Уа1

Ьуз

Туг

Зег

Азп

Рго

11е

ТАг

Ьеи

Азп

Азп

Уа1

С1и

705

710

715

720

РАе

Ьеи

МеА

С1у

А1а

Азп

Зег

Азп

Рго

Азп

Азр

ТАг

МеА

С1п

Ьуз

А1а

725

730

735

Ьуз

11е

С1п

Туг

ТАг

Уа1

Азр

С1у

Агд

С1и

Тгр

11е

Азр

Ьеи

С1и

С1и

740

745

750

С1у

Уа1

С1и

Туг

ТАг

МеА

Рго

С1у

А1а

11е

Ьуз

Уа1

С1и

Азп

Ьеи

Азр

755

760

765

Ьеи

Ьуз

Уа1

Агд

С1у

Уа1

Агд

Ьеи

11е

А1а

ТАг

С1и

А1а

Агд

С1и

Азп

770

775

780

ТАг

Тгр

Ьеи

С1у

Уа1

Агд

Азр

11е

Азп

Уа1

Азп

Ьуз

Ьуз

С1и

Азр

Зег

785

790

795

800

Азп

Зег

С1у

Уа1

С1и

РАе

Азп

Рго

Зег

Ьеи

11е

Агд

Зег

С1и

Зег

Тгр

805

810

815

С1п

Уа1

Туг

С1и

С1у

Азп

С1и

А1а

Азп

Ьеи

Ьеи

Азр

С1у

Азр

Азр

Азп

820

825

830

ТАг

С1у

Уа1

Тгр

Туг

Ьуз

ТАг

Ьеи

Азп

С1у

Азр

ТАг

Зег

Ьеи

А1а

С1у

835

840

845

С1и

РАе

11е

С1у

Ьеи

Азр

Ьеи

С1у

Ьуз

С1и

11е

Ьуз

Ьеи

Азр

С1у

11е

850

855

860

Агд

РАе

Уа1

11е

С1у

Ьуз

Азп

С1у

С1у

С1у

Зег

Зег

Азр

Ьуз

Тгр

Азп

865

870

875

880

Ьуз

РАе

Ьуз

Ьеи

С1и

Туг

Зег

Ьеи

Азр

Азп

С1и

Зег

Тгр

ТАг

ТАг

11е

885

890

895

Ьуз

С1и

Туг

Азр

Ьуз

ТАг

С1у

А1а

Рго

А1а

С1у

Ьуз

Азр

Уа1

11е

С1и

900

905

910

С1и

Зег

РАе

С1и

ТАг

Рго

11е

Зег

А1а

Ьуз

Туг

11е

Агд

Ьеи

ТАг

Азп

915

920

925

МеА

С1и

Азп

11е

Азп

Ьуз

Тгр

Ьеи

ТАг

РАе

Зег

С1и

РАе

А1а

11е

11е

930

935

940

Зег

Азр

С1и

Ьеи

С1и

Азп

А1а

С1у

Азп

Ьуз

С1и

Азп

Уа1

Туг

ТАг

Азп

945

950

955

960

ТАг

С1и

Ьеи

Азр

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

А1а

Ьуз

С1и

Азр

Уа1

ТАг

Ьуз

Ьеи

140 026112

	965	970	975
11е Рго ТВг Азр	Азр 11е	Зег Ъеи Азп Низ С1у С1и Туг 11е	С1у Уа1
980		985 990
Вуз Ъеи Азп Агд	11е Ъуз	Азр Ъеи Зег Азп 11е Азп Ъеи С1и	11е Зег
995		1000 1005
Азп Азр ТВг С1у	Ъеи Ъуз	Ъеи С1п Зег Зег Меб Азп С1у Уа1	С1и Тгр
1010		1015 1020
ТВг С1и 11е ТВг	Азр Ъуз	Азп ТВг Ъеи С1и Азр С1у Агд Туг	Уа1 Агд
1025	1030	ι 1035	1040
Ъеи 11е Азп ТВг	Зег Азп	С1и А1а Уа1 Азп РВе Азп Ъеи ТВг	Ъуз РВе
	1045	1050	1055
С1и Уа1 Азп Зег	Азп С1и	Уа1 Туг С1и Рго Зег Ъеи Уа1 Азр	А1а Туг
1060	1065 1070
Уа1 С1у Азр Азр	С1у А1а	Ъуз Ъуз А1а Уа1 Азр С1у Азр Ъеи	Ъуз ТВг
1075		1080 1085
Агд Уа1 Ъуз РВе	Ъеи С1у	А1а Рго Зег ТВг С1у Азр ТВг 11е	Уа1 Туг
1090		1095 1100
Азр Ъеи С1у С1п	С1и 11е	Ъеи Уа1 Азр Азп Ъеи Ъуз Туг Уа1	Уа1 Ъеи
1105	1110	1115	1120
Азр ТВг С1и Уа1	Азр Низ	Уа1 Агд Азр С1у Ъуз 11е С1п Ъеи	Зег Ъеи
	1125	1130	1135
Азр С1у С1и ТВг	Тгр ТВг	Азр А1а 11е ТВг 11е С1у Азр С1у	Уа1 С1и
1140	1145 1150
Азп С1у Уа1 Азр	Азр Меб	РВе Зег ТВг Рго Ъеи Ъуз Азп С1у	Туг Ъуз
1155		1160 1165
Низ С1у Азп С1п	Зег С1у	С1у 11е Уа1 Рго 11е Азр Зег А1а	Туг Уа1
1170		1175 1180
С1и С1у Азр Азп	Ъеи Азп	С1п Ъуз А1а Агд Туг Уа1 Агд 11е	Ъеи РВе
1185	1190	1195	1200
ТВг А1а Рго Туг	Агд Низ	Агд Тгр ТВг Уа1 11е Азп С1и Ъеи	Меб 11е
	1205	1210	1215
Азп Азп С1у С1и	Туг 11е	Зег ТВг Уа1 Азп Азр Рго ТВг Туг	11е Зег
1220	1225 1230
Азп Рго 11е С1и	С1и Агд	С1у РВе А1а Рго Зег Азп Ъеи Агд	Азр С1у
1235		1240 1245
Азп Ъеи ТВг ТВг	Зег Туг	Ъуз Рго Азп ТВг Азп Азп С1у С1и	11е Зег
1250		1255 1260
С1и С1у Зег 11е	ТВг Туг	Агд Ъеи Зег С1и Ъуз ТВг Азр Уа1	Агд Ъуз

1265 1270 1275 1280

- 141 026112

Уа1

ТЬг

11е

Уа1

С1п 1285

Зег )

С1у

Зег

Зег

11е 1290

Зег 1

Азп

А1а

Ьуз

Уа1 МеЬ 1295

А1а

Агд

Уа1

С1у

Азр

С1у

Зег

С1и

Азп

Уа1

ТЬг

Азр

С1п

Тгр

Уа1 С1п

1300

1305

1310

Ьеи

С1у

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

Зег

Ьеи

Азп

С1и

РЬе

11е

Азп

Агд

Азр Туг

1315

1320

1325

Азп

Азп

11е

Туг

С1и

11е

Ьуз

11е

С1и

Тгр

ТЬг

Азр

Уа1

А1а

Рго Азп

1330

1335

1340

11е

Туг

С1и

11е

11е

ТЬг

Ьеи

Азп

С1п

С1и

РЬе

С1и

РЬе

Рго

Уа1 Азп

1345

1350

1355

1360

Азр

Зег

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

Туг

Азр

С1и

Ьеи

11е

Азп

Ьеи

Зег

С1у Азр

1365

1370

1375

С1и

Туг

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

РЬе

С1и

ТЬг

Ьеи

Ьуз

С1и

А1а

Ьеи

Азп С1и

1380

1385

1390

А1а

Ьуз

Зег

11е

Ьеи

Азр

Азр

Зег

Азп

Зег

Зег

С1п

Ьуз

Ьуз

11е Азр

1395

1400

1405

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьуз

А1а

С1и

С1и

Агд

Ьеи

Азр

Ьеи Агд

1410

1415

1420

А1а

ТЬг

Азр

РЬе

С1и

Азр

РЬе

Азп

Ьуз

Уа1

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1у

Азп Зег

1425

1430

1435

1440

Ьеи

Уа1

С1и

С1и

С1и

Туг

ТЬг

А1а

С1и

Зег

Тгр

А1а

Ьеи

РЬе

Зег С1и

1445

1450

1455

Уа1

Ьеи

С1и

А1а

А1а

Азп

С1и

А1а

Азп

Ьуз

Азп

Ьуз

А1а

Азр

Туг ТЬг

1460

1465

1470

С1п

Азр

С1п

11е

Азп

С1п

11е

Уа1

11е

Азр

Ьеи

Азр

А1а

Зег

11е Ьуз

1475

1480

1485

А1а

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Азп

Ьеи

С1у С1и

1490

1495

1500

Ьеи

11е

Азп

С1п

С1у

Ьуз

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

С1и

Зег

Уа1

С1и

С1у РЬе

1505

1510

1515

1520

Азп

Уа1

С1у

С1и

Туг

Нтз

Ьуз

С1у

А1а

Ьуз

Азр

С1у

Ьеи

ТЬг

Уа1 С1и

1525

1530

1535

11е

Азп

Ьуз

А1а

С1и

С1и

Уа1

РЬе

Азп

Ьуз

С1и

Азр

А1а

ТЬг

С1и С1и

1540

1545

1550

С1и

11е

Азп

Ьеи

А1а

Ьуз

С1и

Зег

Ьеи

С1и

С1у

А1а

11е

А1а

Агд РЬе

1555

1560

1565

Азп

Зег

Ьеи

Ьеи

11е

С1и

С1и

Зег

ТЬг

С1у

Азр

РЬе

Азп

С1у

Азп С1у

1570

1575

1580

Ьуз

11е

Азр

11е

С1у

Азр

Ьеи

А1а

МеЬ

Уа1

Зег

Ьуз

Азп

11е

С1у Зег

- 142 026112

1585	1590	1595	1600
ТНг ТНг Азп	ТНг Зег Ьеи	Азр Ьеи Азп Ьуз Азр С1у Зег	11е Азр С1и
	1605	1610	1615
Туг С1и 11е	Зег РНе 11е	Азп Нтз Агд 11е Ьеи Азп
	1620	1625

<210> 36 <211> 435 <212> белок <213> Ното зартепз <220>

<223> гиалуронидаза-1 [Предшественник] <400> 36

МеН

А1а

А1а

Нтз

Ьеи

Ьеи

Рго

11е

Суз

А1а

Ьеи

РНе

Ьеи

ТНг

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

Азр

МеН

А1а

С1п

С1у

РНе

Агд

С1у

Рго

Ьеи

Ьеи

Рго

Азп

Агд

Рго

РНе

20

25

30

ТНг

ТНг

Уа1

Тгр

Азп

А1а

Азп

ТНг

С1п

Тгр

Суз

Ьеи

С1и

Агд

Нтз

С1у

35

40

45

Уа1

Азр

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Уа1

РНе

Азр

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Рго

С1у

С1п

50

55

60

ТНг

РНе

Агд

С1у

Рго

Азр

МеН

ТНг

11е

РНе

Туг

Зег

Зег

С1п

Ьеи

С1у

65

70

75

80

ТНг

Туг

Рго

Туг

Туг

ТНг

Рго

ТНг

С1у

С1и

Рго

Уа1

РНе

С1у

С1у

Ьеи

85

90

95

Рго

С1п

Азп

А1а

Зег

Ьеи

11е

А1а

Нтз

Ьеи

А1а

Агд

ТНг

РНе

С1п

Азр

100

105

110

11е

Ьеи

А1а

А1а

11е

Рго

А1а

Рго

Азр

РНе

Зег

С1у

Ьеи

А1а

Уа1

11е

115

120

125

Азр

Тгр

С1и

А1а

Тгр

Агд

Рго

Агд

Тгр

А1а

РНе

Азп

Тгр

Азр

ТНг

Ьуз

130

135

140

Азр

11е

Туг

Агд

С1п

Агд

Зег

Агд

А1а

Ьеи

Уа1

С1п

А1а

С1п

Нтз

Рго

145

150

155

160

Азр

Тгр

Рго

А1а

Рго

С1п

Уа1

С1и

А1а

Уа1

А1а

С1п

Азр

С1п

РНе

С1п

165

170

175

С1у

А1а

А1а

Агд

А1а

Тгр

МеН

А1а

С1у

ТНг

Ьеи

С1п

Ьеи

С1у

Агд

А1а

180

185

190

143 026112

Теи

Агд

Рго 195

Агд

С1у

Теи

Тгр

С1у 200

РНе

Туг

С1у

РНе

Рго 205

Азр

Суз

Туг

Азп

Туг

Азр

РНе

Теи

Зег

Рго

Азп

Туг

ТНг

С1у

С1п

Суз

Рго

Зег

С1у

210

215

220

11е

Агд

А1а

С1п

Азп

Азр

С1п

Теи

С1у

Тгр

Теи

Тгр

С1у

С1п

Зег

Агд

225

230

235

240

А1а

Теи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

МеН

Рго

А1а

Уа1

Теи

С1и

С1у

ТНг

С1у

245

250

255

Туз

Зег

С1п

МеН

Туг

Уа1

С1п

Низ

Агд

Уа1

А1а

С1и

А1а

РНе

Агд

Уа1

260

265

270

А1а

Уа1

А1а

А1а

С1у

Азр

Рго

Азп

Теи

Рго

Уа1

Теи

Рго

Туг

Уа1

С1п

275

280

285

11е

РНе

Туг

Азр

ТНг

ТНг

Азп

Низ

РНе

Теи

Рго

Теи

Азр

С1и

Теи

С1и

290

295

300

Низ

Зег

Теи

С1у

С1и

Зег

А1а

А1а

С1п

С1у

А1а

А1а

С1у

Уа1

Уа1

Теи

305

310

315

320

Тгр

Уа1

Зег

Тгр

С1и

Азп

ТНг

Агд

ТНг

Туз

С1и

Зег

Суз

С1п

А1а

11е

325

330

335

Туз

С1и

Туг

МеН

Азр

ТНг

ТНг

Теи

С1у

Рго

РНе

11е

Теи

Азп

Уа1

ТНг

340

345

350

Зег

С1у

А1а

Теи

Теи

Суз

Зег

С1п

А1а

Теи

Суз

Зег

С1у

Низ

С1у

Агд

355

360

365

Суз

Уа1

Агд

Агд

ТНг

Зег

Низ

Рго

Туз

А1а

Теи

Теи

Теи

Теи

Азп

Рго

370

375

380

А1а

Зег

РНе

Зег

11е

С1п

Теи

ТНг

Рго

С1у

С1у

С1у

Рго

Теи

Зег

Теи

385

390

395

400

Агд

С1у

А1а

Теи

Зег

Теи

С1и

Азр

С1п

А1а

С1п

МеН

А1а

Уа1

С1и

РНе

405

410

415

Туз

Суз

Агд

Суз

Туг

Рго

С1у

Тгр

С1п

А1а

Рго

Тгр

Суз

С1и

Агд

Туз

420

425

430

Зег МеН Тгр

435
<210>	37
<211>	473
<212>	белок
<213>	Ното зариепз

144 026112 <220>

<223> гиалуронидаза-2 [Предшественник] <400> 37

Меб 1

Агд

А1а

С1у

Рго 5

С1у

Рго

ТАг

Уа1

ТАг 10

^еи

А1а

^еи

Уа1

^еи 15

А1а

Уа1

А1а

Тгр

А1а

Меб

С1и

^еи

^уз

Рго

ТАг

А1а

Рго

Рго

11е

РАе

ТАг

20

25

30

С1у

Агд

Рго

РАе

Уа1

Уа1

А1а

Тгр

Азр

Уа1

Рго

ТАг

С1п

Азр

Суз

С1у

35

40

45

Рго

Агд

^еи

^уз

Уа1

Рго

^еи

Азр

^еи

Азп

А1а

РАе

Азр

Уа1

С1п

А1а

50

55

60

Зег

Рго

Азп

С1и

С1у

РАе

Уа1

Азп

С1п

Азп

11е

ТАг

11е

РАе

Туг

Агд

65

70

75

80

Азр

Агд

^еи

С1у

^еи

Туг

Рго

Агд

РАе

Азр

Зег

А1а

С1у

Агд

Зег

Уа1

85

90

95

Нтз

С1у

С1у

Уа1

Рго

С1п

Азп

Уа1

Зег

^еи

Тгр

А1а

Нтз

Агд

^уз

Меб

100

105

110

^еи

С1п

^уз

Агд

Уа1

С1и

Нтз

Туг

11е

Агд

ТАг

С1п

С1и

Зег

А1а

С1у

115

120

125

^еи

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

С1и

Азр

Тгр

Агд

Рго

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

Азп

130

135

140

Тгр

С1п

Азр

^уз

Азр

Уа1

Туг

Агд

Агд

^еи

Зег

Агд

С1п

^еи

Уа1

А1а

145

150

155

160

Зег

Агд

Нтз

Рго

Азр

Тгр

Рго

Рго

Азр

Агд

11е

Уа1

^уз

С1п

А1а

С1п

165

170

175

Туг

С1и

РАе

С1и

РАе

А1а

А1а

С1п

С1п

РАе

Меб

^еи

С1и

ТАг

^еи

Агд

180

185

190

Туг

Уа1

^уз

А1а

Уа1

Агд

Рго

Агд

Нтз

^еи

Тгр

С1у

РАе

Туг

^еи

РАе

195

200

205

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Нтз

Азр

Туг

Уа1

С1п

Азп

Тгр

С1и

Зег

Туг

ТАг

210

215

220

С1у

Агд

Суз

Рго

Азр

Уа1

С1и

Уа1

А1а

Агд

Азп

Азр

С1п

^еи

А1а

Тгр

225

230

235

240

^еи

Тгр

А1а

С1и

Зег

ТАг

А1а

^еи

РАе

Рго

Зег

Уа1

Туг

^еи

Азр

С1и

245

250

255

ТАг

^еи

А1а

Зег

Зег

Агд

Нтз

С1у

Агд

Азп

РАе

Уа1

Зег

РАе

Агд

Уа1

260

265

270

С1п

С1и

А1а

^еи

Агд

Уа1

А1а

Агд

ТАг

Нтз

Нтз

А1а

Азп

Нтз

А1а

^еи

275

280

285

145 026112

Рго

Уа1 290

Туг

Уа1

РАе

ТАг

Агд 295

Рго

ТАг

Туг

Зег

Агд 300

Агд

Пей

ТАг

С1у

Пей

Зег

С1и

МеА

Азр

Пей

11е

Зег

ТАг

11е

С1у

С1и

Зег

А1а

А1а

Пей

305

310

315

320

С1у

А1а

А1а

С1у

Уа1

11е

Пей

Тгр

С1у

Азр

А1а

С1у

Туг

ТАг

ТАг

Зег

325

330

335

ТАг

С1и

ТАг

Суз

С1п

Туг

Пей

Пуз

Азр

Туг

Пей

ТАг

Агд

Пей

Пей

Уа1

340

345

350

Рго

Туг

Уа1

Уа1

Азп

Уа1

Зег

Тгр

А1а

ТАг

С1п

Туг

Суз

Зег

Агд

А1а

355

360

365

С1п

Суз

Нгз

С1у

Нгз

С1у

Агд

Суз

Уа1

Агд

Агд

Азп

Рго

Зег

А1а

Зег

370

375

380

ТАг

РАе

Пей

Нгз

Пей

Зег

ТАг

Азп

Зег

РАе

Агд

Пей

Уа1

Рго

С1у

Нгз

385

390

395

400

А1а

Рго

С1у

С1и

Рго

С1п

Пей

Агд

Рго

Уа1

С1у

С1и

Пей

Зег

Тгр

А1а

405

410

415

Азр

11е

Азр

Нгз

Пей

С1п

ТАг

Нгз

РАе

Агд

Суз

С1п

Суз

Туг

Пей

С1у

420

425

430

Тгр

Зег

С1у

С1и

С1п

Суз

С1п

Тгр

Азр

Нгз

Агд

С1п

А1а

А1а

С1у

С1у

435

440

445

А1а

Зег

С1и

А1а

Тгр

А1а

С1у

Зег

Нгз

Пей

ТАг

Зег

Пей

Пей

А1а

Пей

450

455

460

А1а

А1а

Пей

А1а

РАе

ТАг

Тгр

ТАг

Пей

465 470 <210> 38 <211> 417 <212> белок <213> Ното заргепз <220>

<223> гиалуронидаза-3 [Предшественник] <400> 38

МеА

ТАг

ТАг

С1п

Пей

С1у

Рго

А1а

Пей

Уа1

Пей

С1у

Уа1

А1а

Пей

Суз

1

5

10

15

Пей

С1у

Суз

С1у

С1п

Рго

Пей

Рго

С1п

Уа1

Рго

С1и

Агд

Рго

РАе

Зег

20

25

30

- 146 026112

Уа1

Ьеи

Тгр 35

Азп

Уа1

Рго

Зег

А1а 40

Нтз

Суз

С1и

А1а

Агд 45

РЬе

С1у

Уа1

Нтз

Ьеи

Рго

Ьеи

Азп

А1а

Ьеи

С1у

11е

11е

А1а

Азп

Агд

С1у

С1п

Нтз

50

55

60

РЬе

Нтз

С1у

С1п

Азп

МеЬ

ТЬг

11е

РЬе

Туг

Ьуз

Азп

С1п

Ьеи

С1у

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Рго

Туг

РЬе

С1у

Рго

Агд

С1у

ТЬг

А1а

Нтз

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

85

90

95

С1п

А1а

Ьеи

Рго

Ьеи

Азр

Агд

Нтз

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

А1а

Туг

С1п

11е

100

105

110

Нтз

Нтз

Зег

Ьеи

Агд

Рго

С1у

РЬе

А1а

С1у

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

Азр

Тгр

115

120

125

С1и

С1и

Тгр

Суз

Рго

Ьеи

Тгр

А1а

С1у

Азп

Тгр

С1у

Агд

Агд

Агд

А1а

130

135

140

Туг

С1п

А1а

А1а

Зег

Тгр

А1а

Тгр

А1а

С1п

С1п

Уа1

РЬе

Рго

Азр

Ьеи

145

150

155

160

Азр

Рго

С1п

С1и

С1п

Ьеи

Туг

Ьуз

А1а

Туг

ТЬг

С1у

РЬе

С1и

С1п

А1а

165

170

175

А1а

Агд

А1а

Ьеи

МеЬ

С1и

Азр

ТЬг

Ьеи

Агд

Уа1

А1а

С1п

А1а

Ьеи

Агд

180

185

190

Рго

Нтз

С1у

Ьеи

Тгр

С1у

РЬе

Туг

Нтз

Туг

Рго

А1а

Суз

С1у

Азп

С1у

195

200

205

Тгр

Нтз

Зег

МеЬ

А1а

Зег

Азп

Туг

ТЬг

С1у

Агд

Суз

Нтз

А1а

А1а

ТЬг

210

215

220

Ьеи

А1а

Агд

Азп

ТЬг

С1п

Ьеи

Нтз

Тгр

Ьеи

Тгр

А1а

А1а

Зег

Зег

А1а

225

230

235

240

Ьеи

РЬе

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Рго

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Рго

А1а

Нтз

Нтз

245

250

255

С1п

А1а

РЬе

Уа1

Агд

Нтз

Агд

Ьеи

С1и

С1и

А1а

РЬе

Агд

Уа1

А1а

Ьеи

260

265

270

Уа1

С1у

Нтз

Агд

Нтз

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

А1а

Туг

Уа1

Агд

Ьеи

ТЬг

275

280

285

Нтз

Агд

Агд

Зег

С1у

Агд

РЬе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

Азр

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

290

295

300

11е

С1у

Уа1

Зег

А1а

А1а

Ьеи

С1у

А1а

А1а

С1у

Уа1

Уа1

Ьеи

Тгр

С1у

305

310

315

320

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Зег

С1и

С1и

С1и

Суз

Тгр

Нтз

Ьеи

Нтз

Азр

325

330

335

Туг

Ьеи

Уа1

Азр

ТЬг

Ьеи

С1у

Рго

Туг

Уа1

11е

Азп

Уа1

ТЬг

Агд

А1а

340

345

350

147 026112

А1а

МеТ

А1а 355

Суз

Зег

Η^з

С1п

Агд 360

Суз

Η^з

С1у

Η^з

С1у 365

Агд

Суз

А1а

Агд

Агд

Азр

Рго

С1у

С1п

МеТ

С1и

А1а

РТе

Пей

Η^з

Пей

Тгр

Рго

Азр

370

375

380

С1у

Зег

Пей

С1у

Азр

Тгр

Пуз

Зег

РТе

Зег

Суз

Η^з

Суз

Туг

Тгр

С1у

385

390

395

400

Тгр

А1а

С1у

Рго

ТТг

Суз

С1п

С1и

Рго

Агд

Рго

С1у

Рго

Пуз

С1и

А1а

405

410

415

Уа1

<210> 39 <211> 481 <212> белок <213> Ηото зартепз <220>

<223> гиалуронидаза-4 [Предшественник] <400> 39

МеТ	Пуз	Уа1	Пей	Зег	С1и	С1у	С1п
1				5
Уа1	Η^з	Пей	ТТг	Зег	Тгр	Пей	Пей
			20
Зег	Суз	Пей	Пуз	Рго	А1а	Агд	Пей
		35					40
11е	А1а	А1а	Тгр	Азп	А1а	Рго	ТТг
	50					55

Пей	Пуз 10	Пей	Суз	Уа1	Уа1	С1п 15	Рго
11е	РТе	РТе	11е	Пей	Пуз	Зег	11е
25					30
Рго	11е	Туг	С1п	Агд	Пуз	Рго	РТе
				45
Азр	С1п	Суз	Пей	11е	Пуз	Туг	Азп

Теи Агд Теи Азп Теи Пуз МеТ РТе Рго Уа1 11е С1у Зег Рго Пей А1а 65 70 75 80

Пуз А1а Агд С1у С1п Азп Уа1 ТТг 11е РТе Туг Уа1 Азп Агд Пей С1у

90 95

Туг Туг Рго Тгр Туг ТТг Зег С1п С1у Уа1 Рго 11е Азп С1у С1у Пей

100 105 110

Рго С1п Азп 11е Зег Пей С1п Уа1 Η^з Пей С1и Пуз А1а Азр С1п Азр

115 120 125

11е Азп Туг Туг 11е Рго А1а С1и Азр РТе Зег С1у Пей А1а Уа1 11е

130 135 140

Азр Тгр С1и Туг Тгр Агд Рго С1п Тгр А1а Агд Азп Тгр Азп Зег Пуз

148 026112

145

150

155

160

Азр

Уа1

Туг

Агд

С1п

Туз

Зег

Агд

Туз

Теи

11е

Зег

Азр

МеН

С1у

Туз

165

170

175

Азп

Уа1

Зег

А1а

ТНг

Азр

11е

С1и

Туг

Теи

А1а

Туз

Уа1

ТНг

РНе

С1и

180

185

190

С1и

Зег

А1а

Туз

А1а

РНе

МеН

Туз

С1и

ТНг

11е

Туз

Теи

С1у

11е

Туз

195

200

205

Зег

Агд

Рго

Туз

С1у

Теи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Теи

Туг

Рго

Азр

Суз

Нгз

210

215

220

Азп

Туг

Азп

Уа1

Туг

А1а

Рго

Азп

Туг

Зег

С1у

Зег

Суз

Рго

С1и

Азр

225

230

235

240

С1и

Уа1

Теи

Агд

Азп

Азп

С1и

Теи

Зег

Тгр

Теи

Тгр

Азп

Зег

Зег

А1а

245

250

255

А1а

Теи

Туг

Рго

Зег

11е

С1у

Уа1

Тгр

Туз

Зег

Теи

С1у

Азр

Зег

С1и

260

265

270

Азп

11е

Теи

Агд

РНе

Зег

Туз

РНе

Агд

Уа1

Нгз

С1и

Зег

МеН

Агд

11е

275

280

285

Зег

ТНг

МеН

ТНг

Зег

Нгз

Азр

Туг

А1а

Теи

Рго

Уа1

РНе

Уа1

Туг

ТНг

290

295

300

Агд

Теи

С1у

Туг

Агд

Азр

С1и

Рго

Теи

РНе

РНе

Теи

Зег

Туз

С1п

Азр

305

310

315

320

Теи

Уа1

Зег

ТНг

11е

С1у

С1и

Зег

А1а

А1а

Теи

С1у

А1а

А1а

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

Азр

МеН

Азп

Теи

ТНг

А1а

Зег

Туз

А1а

Азп

Суз

ТНг

340

345

350

Туз

Уа1

Туз

С1п

РНе

Уа1

Зег

Зег

Азр

Теи

С1у

Зег

Туг

11е

А1а

Азп

355

360

365

Уа1

ТНг

Агд

А1а

А1а

С1и

Уа1

Суз

Зег

Теи

Нгз

Теи

Суз

Агд

Азп

Азп

370

375

380

С1у

Агд

Суз

11е

Агд

Туз

МеН

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

Туг

Теи

Нгз

Теи

385

390

395

400

Азп

Рго

А1а

Зег

Туг

Нгз

11е

С1и

А1а

Зег

С1и

Азр

С1у

С1и

РНе

ТНг

405

410

415

Уа1

Туз

С1у

Туз

А1а

Зег

Азр

ТНг

Азр

Теи

А1а

Уа1

МеН

А1а

Азр

ТНг

420

425

430

РНе

Зег

Суз

Нгз

Суз

Туг

С1п

С1у

Туг

С1и

С1у

А1а

Азр

Суз

Агд

С1и

435

440

445

11е

Туз

ТНг

А1а

Азр

С1у

Суз

Зег

С1у

Уа1

Зег

Рго

Зег

Рго

С1у

Зег

450

455

460

149 026112

Ьеи Мек Тйг Ьеи Суз Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а Зег Туг Агд Зег 11е С1п 465 470 475 480

Ьеи <210> 40 <211> 467 <212> белок <213> Ното зартепз <220>

<223> зНиРН20, предшественник 1-467 <400> 40

Мек

С1у

Уа1

Ьеи

Ьуз

Рйе

Ьуз

Нтз

11е

Рйе

Рйе

Агд

Зег

Рйе

Уа1

Ьуз

1

5

10

15

Зег

Зег

С1у

Уа1

Зег

С1п

11е

Уа1

Рйе

Тйг

Рйе

Ьеи

Ьеи

11е

Рго

Суз

20

25

30

Суз

Ьеи

Тйг

Ьеи

Азп

Рйе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

35

40

45

Рйе

Ьеи

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

Рйе

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

Рйе

50

55

60

Азр

С1и

Рго

Ьеи

Азр

Мек

Зег

Ьеи

Рйе

Зег

Рйе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

Тйг

С1у

С1п

С1у

Уа1

Тйг

11е

Рйе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

Тйг

С1у

Уа1

Тйг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

Азр

Нтз

Ьеи

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

115

120

125

Ьуз

Азр

11е

Тйг

Рйе

Туг

Мек

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

Мек

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

Тйг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

145

150

155

160

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

Тйг

С1и

А1а

Тйг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

Рйе

180

185

190

С1и

Ьуз

А1а

С1у

Ьуз

Азр

Рйе

Ьеи

Уа1

С1и

Тйг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

150 026112

195

200

205

Ьеи

Ьеи

Агд

Рго

Азп

Η^з

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РАе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Η^з

Η^з

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РАе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТАг

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТАг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

ТАг

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Ьуз

11е

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РАе

А1а

Туг

ТАг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РАе

ТАг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РАе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Ьеи

Уа1

Туг

ТАг

РАе

С1у

С1и

ТАг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТАг

Ьеи

Зег

11е

МеА

Агд

Зег

МеА

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

340

345

350

Ьеи

Ьеи

Азр

Азп

Туг

МеА

С1и

ТАг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТАг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеА

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

Η^з

Ьеи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РАе

ТАг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Ьуз

Рго

ТАг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

Ьуз

420

425

430

РАе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

Ьуз

Азр

ТАг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е Азр А1а 465 <210> 41 <211> 477

151 026112 <212> белок <213> Ηото зартепз <220>

<223> зΗиРΗ20, предшественник 1-477 <400> 41

МеА

С1у

Уа1

Ьеи

Ьуз

РАе

Ьуз

Η^з

11е

РАе

РАе

Агд

Зег

РАе

Уа1

Ьуз

1

5

10

15

Зег

Зег

С1у

Уа1

Зег

С1п

11е

Уа1

РАе

ТАг

РАе

Ьеи

Ьеи

11е

Рго

Суз

20

25

30

Суз

Ьеи

ТАг

Ьеи

Азп

РАе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

35

40

45

РАе

Ьеи

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РАе

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

РАе

50

55

60

Азр

С1и

Рго

Ьеи

Азр

МеА

Зег

Ьеи

РАе

Зег

РАе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

ТАг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТАг

11е

РАе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТАг

С1у

Уа1

ТАг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

Азр

Η^з

Ьеи

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

115

120

125

Ьуз

Азр

11е

ТАг

РАе

Туг

МеА

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

МеА

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТАг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

145

150

155

160

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

ТАг

С1и

А1а

ТАг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РАе

180

185

190

С1и

Ьуз

А1а

С1у

Ьуз

Азр

РАе

Ьеи

Уа1

С1и

ТАг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

195

200

205

Ьеи

Ьеи

Агд

Рго

Азп

Η^з

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РАе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Η^з

Η^з

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РАе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТАг

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТАг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

152 026112

260

265

270

А1а

А1а

ТНг

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Ьуз

11е

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РНе

А1а

Туг

ТНг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РНе

ТНг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РНе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Ьеи

Уа1

Туг

ТНг

РНе

С1у

С1и

ТНг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТНг

Ьеи

Зег

11е

МеЬ

Агд

Зег

МеЬ

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

340

345

350

Ьеи

Ьеи

Азр

Азп

Туг

МеЬ

С1и

ТНг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТНг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеЬ

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

НЬз

Ьеи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РНе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РНе

ТНг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Ьуз

Рго

ТНг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РНе

Зег

С1и

Ьуз

420

425

430

РНе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТНг

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

Ьуз

Азр

ТНг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

РНе

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

МеЬ

С1и

ТНг

С1и

С1и

465 470 475 <210> 42 <211> 478 <212> белок <213> Ното зарЬепз <220>

<223> зНиРН20,	предшественник 1-478
<400> 42
МеЬ С1у Уа1 Ьеи	Ьуз РНе Ьуз НЬз 11е	РНе	РНе Агд Зег РНе Уа1 Ьуз
1	5	10	15

- 153 026112

Зег

Зег

С1у

Уа1 20

Зег

С1п

11е

Уа1

РВе 25

ТВг

РВе

Ъеи

Ъеи

11е 30

Рго

Суз

Суз

Ъеи

ТВг

Ъеи

Азп

РВе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

35

40

45

РВе

Ъеи

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РВе

Суз

Ъеи

С1у

Ъуз

РВе

50

55

60

Азр

С1и

Рго

Ъеи

Азр

Меб

Зег

Ъеи

РВе

Зег

РВе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

ТВг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТВг

11е

РВе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ъеи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТВг

С1у

Уа1

ТВг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Ъуз

11е

Зег

Ъеи

С1п

Азр

Нгз

Ъеи

Азр

Ъуз

А1а

Ъуз

115

120

125

Вуз

Азр

11е

ТВг

РВе

Туг

Меб

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ъеи

С1у

Меб

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТВг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ъуз

Рго

145

150

155

160

Ъуз

Азр

Уа1

Туг

Ъуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ъеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Ъеи

Зег

Ъеи

ТВг

С1и

А1а

ТВг

С1и

Ъуз

А1а

Ъуз

С1п

С1и

РВе

180

185

190

С1и

Ъуз

А1а

С1у

Ъуз

Азр

РВе

Ъеи

Уа1

С1и

ТВг

11е

Ъуз

Ъеи

С1у

Ъуз

195

200

205

Ъеи

Ъеи

Агд

Рго

Азп

Нгз

Ъеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ъеи

РВе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Нгз

Нгз

Туг

Ъуз

Ъуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РВе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ъуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ъеи

Зег

Тгр

Ъеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТВг

А1а

Ъеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ъеи

Азп

ТВг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

ТВг

Ъеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Ъуз

11е

Рго

Азр

А1а

Ъуз

Зег

Рго

Ъеи

Рго

Уа1

РВе

А1а

Туг

ТВг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РВе

ТВг

Азр

С1п

Уа1

Ъеи

Ъуз

РВе

Ъеи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Ъеи

Уа1

Туг

ТВг

РВе

С1у

С1и

ТВг

Уа1

А1а

Ъеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

154 026112

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТТг

Пей

Зег

11е

МеТ

Агд

Зег

МеТ

Пуз

Зег

Суз

Пей

340

345

350

Пей

Пей

Азр

Азп

Туг

МеТ

С1и

ТТг

11е

Пей

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТТг

Пей

А1а

А1а

Пуз

МеТ

Суз

Зег

С1п

Уа1

Пей

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Пуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Пей

Η^з

Пей

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РТе

А1а

11е

С1п

Пей

С1и

Пуз

С1у

С1у

Пуз

РТе

ТТг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Пуз

Рго

ТТг

Пей

С1и

Азр

Пей

С1и

С1п

РТе

Зег

С1и

Пуз

420

425

430

РТе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТТг

Пей

Зег

Суз

Пуз

С1и

Пуз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

Пуз

Азр

ТТг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

РТе

Пей

Пуз

Рго

Рго

МеТ

С1и

ТТг

С1и

С1и

Рго

465

470

475

<210> 43

<211> 479

<212> белок

<213> Ηото

зартепз

<220>

<223> зΗиРΗ20, предшественник 1·

-479

<400> 43

МеТ С1у Уа1

Пей Пуз

РТе

Пуз

Η^з

11е

РТе

РТе

Агд

Зег

РТе

Уа1

Пуз

1

5

10

15

Зег Зег С1у

Уа1 Зег

С1п

11е

Уа1

РТе

ТТг

РТе

Пей

Пей

11е

Рго

Суз

20

25

30

Суз Пей ТТг

Пей Азп

РТе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

35

40

45

РТе Пей Тгр

А1а Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РТе

Суз

Пей

С1у

Пуз

РТе

50

55

60

155 026112

Азр

С1и

Рго

Теи

Азр

МеН

Зег

Теи

РНе

Зег

РНе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

ТНг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТНг

11е

РНе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Теи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТНг

С1у

Уа1

ТНг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Туз

11е

Зег

Теи

С1п

Азр

Низ

Теи

Азр

Туз

А1а

Туз

115

120

125

Туз

Азр

11е

ТНг

РНе

Туг

МеН

Рго

Уа1

Азр

Азп

Теи

С1у

МеН

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТНг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Туз

Рго

145

150

155

160

Туз

Азр

Уа1

Туг

Туз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Теи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Теи

Зег

Теи

ТНг

С1и

А1а

ТНг

С1и

Туз

А1а

Туз

С1п

С1и

РНе

180

185

190

С1и

Туз

А1а

С1у

Туз

Азр

РНе

Теи

Уа1

С1и

ТНг

11е

Туз

Теи

С1у

Туз

195

200

205

Теи

Теи

Агд

Рго

Азп

Низ

Теи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Теи

РНе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Низ

Низ

Туг

Туз

Туз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РНе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Туз

Агд

Азп

Азр

Азр

Теи

Зег

Тгр

Теи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТНг

А1а

Теи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Теи

Азп

ТНг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

ТНг

Теи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Туз

11е

Рго

Азр

А1а

Туз

Зег

Рго

Теи

Рго

Уа1

РНе

А1а

Туг

ТНг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РНе

ТНг

Азр

С1п

Уа1

Теи

Туз

РНе

Теи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Теи

Уа1

Туг

ТНг

РНе

С1у

С1и

ТНг

Уа1

А1а

Теи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТНг

Теи

Зег

11е

МеН

Агд

Зег

МеН

Туз

Зег

Суз

Теи

340

345

350

Теи

Теи

Азр

Азп

Туг

МеН

С1и

ТНг

11е

Теи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТНг

Теи

А1а

А1а

Туз

МеН

Суз

Зег

С1п

Уа1

Теи

Суз

С1п

С1и

С1п

156 026112

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

^уз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

^еи

Нтз

^еи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

^еи

С1и

^уз

С1у

С1у

^уз

РАе

ТАг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

^уз

Рго

ТАг

^еи

С1и

Азр

^еи

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

^уз

420

425

430

РАе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

^еи

Зег

Суз

^уз

С1и

^уз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

^уз

Азр

ТАг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

РАе

^еи

^уз

Рго

Рго

Меб

С1и

ТАг

С1и

С1и

Рго

С1п

465

470

475

<210> 44 <211> 480 <212> белок <213> Ното зартепз <220>

<223> зНиРН20, предшественник 1-480 <400> 44

Меб С1у Уа1 ^еи ^уз РАе ^уз Нтз 11е РАе РАе Агд Зег РАе Уа1 ^уз 1 5 10 15

Зег Зег С1у Уа1 Зег С1п 11е Уа1 РАе ТАг РАе ^еи ^еи 11е Рго Суз 20 25 30

Суз ^еи ТАг ^еи Азп РАе Агд А1а Рго Рго Уа1 11е Рго Азп Уа1 Рго 35 40 45

РАе ^еи Тгр А1а Тгр Азп А1а Рго Зег С1и РАе Суз ^еи С1у ^уз РАе 50 55 60

Азр С1и Рго ^еи Азр Меб Зег ^еи РАе Зег РАе 11е С1у Зег Рго Агд

70 75 80

11е Азп А1а ТАг С1у С1п С1у Уа1 ТАг 11е РАе Туг Уа1 Азр Агд ^еи

90 95

С1у Туг Туг Рго Туг 11е Азр Зег 11е ТАг С1у Уа1 ТАг Уа1 Азп С1у

100 105 110

С1у 11е Рго С1п ^уз 11е Зег ^еи С1п Азр Нтз ^еи Азр ^уз А1а ^уз

115 120 125

157 026112

Ьуз

Азр 130

11е

ТНг

РНе

Туг

МеН 135

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи 140

С1у

МеН

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТНг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

145

150

155

160

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

С1и

А1а

ТНг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РНе

180

185

190

С1и

Ьуз

А1а

С1у

Ьуз

Азр

РНе

Ьеи

Уа1

С1и

ТНг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

195

200

205

Ьеи

Ьеи

Агд

Рго

Азп

Нтз

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РНе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Нтз

Нтз

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РНе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТНг

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТНг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

ТНг

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Ьуз

11е

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РНе

А1а

Туг

ТНг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РНе

ТНг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РНе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Ьеи

Уа1

Туг

ТНг

РНе

С1у

С1и

ТНг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТНг

Ьеи

Зег

11е

МеН

Агд

Зег

МеН

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

340

345

350

Ьеи

Ьеи

Азр

Азп

Туг

МеН

С1и

ТНг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТНг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеН

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

Нтз

Ьеи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РНе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РНе

ТНг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Ьуз

Рго

ТНг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РНе

Зег

С1и

Ьуз

420

425

430

РНе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТНг

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

158 026112

435 440 445

Уа1

Туз 450

Азр

ТЬг

Азр

А1а

Уа1 455

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а 460

Азр

С1у

Уа1

Суз

11е

Азр

А1а

РЬе

Теи

Туз

Рго

Рго

Ме!

С1и

ТЬг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

465

470

475

480

<210> 45 <211> 481 <212> белок <213> Ното заргепз <220>

<223> зНиРН20, предшественник 1-481 <400> 45

Ме!

С1у

Уа1

Теи

Туз

РЬе

Туз

Нгз

11е

РЬе

РЬе

Агд

Зег

РЬе

Уа1

Туз

1

5

10

15

Зег

Зег

С1у

Уа1

Зег

С1п

11е

Уа1

РЬе

ТЬг

РЬе

Теи

Теи

11е

Рго

Суз

20

25

30

Суз

Теи

ТЬг

Теи

Азп

РЬе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

35

40

45

РЬе

Теи

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РЬе

Суз

Теи

С1у

Туз

РЬе

50

55

60

Азр

С1и

Рго

Теи

Азр

Ме!

Зег

Теи

РЬе

Зег

РЬе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

ТЬг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТЬг

11е

РЬе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Теи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТЬг

С1у

Уа1

ТЬг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Туз

11е

Зег

Теи

С1п

Азр

Нгз

Теи

Азр

Туз

А1а

Туз

115

120

125

Туз

Азр

11е

ТЬг

РЬе

Туг

Ме!

Рго

Уа1

Азр

Азп

Теи

С1у

Ме!

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТЬг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Туз

Рго

145

150

155

160

Туз

Азр

Уа1

Туг

Туз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Теи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Теи

Зег

Теи

ТЬг

С1и

А1а

ТЬг

С1и

Туз

А1а

Туз

С1п

С1и

РЬе

180

185

190

159 026112

С1и

Ьуз

А1а 195

С1у

Ьуз

Азр

РЬе

Ьеи 200

Уа1

С1и

ТЬг

11е

Ьуз 205

Ьеи

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Агд

Рго

Азп

Нтз

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РЬе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Нтз

Нтз

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РЬе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТЬг

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТЬг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

ТЬг

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Ьуз

11е

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РЬе

А1а

Туг

ТЬг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РЬе

ТЬг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РЬе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Ьеи

Уа1

Туг

ТЬг

РЬе

С1у

С1и

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТЬг

Ьеи

Зег

11е

МеЬ

Агд

Зег

МеЬ

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

340

345

350

Ьеи

Ьеи

Азр

Азп

Туг

МеЬ

С1и

ТЬг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТЬг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеЬ

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

Нтз

Ьеи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РЬе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РЬе

ТЬг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Ьуз

Рго

ТЬг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РЬе

Зег

С1и

Ьуз

420

425

430

РЬе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

Ьуз

Азр

ТЬг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

РЬе

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

МеЬ

С1и

ТЬг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

465

470

475

480

РЬе <210> 46

160 026112 <211> 483 <212> белок <213> Ното зарЬепз <220>

<223> зНиРН20, предшественник 1-483 <400> 46

МеЬ

С1у

Уа1

Ьеи

Ьуз

РНе

Ьуз

НЬз

11е

РНе

РНе

Агд

Зег

РНе

Уа1

Ьуз

1

5

10

15

Зег

Зег

С1у

Уа1

Зег

С1п

11е

Уа1

РНе

ТНг

РНе

Ьеи

Ьеи

11е

Рго

Суз

20

25

30

Суз

Ьеи

ТНг

Ьеи

Азп

РНе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

35

40

45

РНе

Ьеи

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РНе

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

РНе

50

55

60

Азр

С1и

Рго

Ьеи

Азр

МеЬ

Зег

Ьеи

РНе

Зег

РНе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

ТНг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТНг

11е

РНе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТНг

С1у

Уа1

ТНг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

Азр

НЬз

Ьеи

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

115

120

125

Ьуз

Азр

11е

ТНг

РНе

Туг

МеЬ

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

МеЬ

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТНг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

145

150

155

160

Ьуз

Азр

Уа1

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

С1и

А1а

ТНг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РНе

180

185

190

С1и

Ьуз

А1а

С1у

Ьуз

Азр

РНе

Ьеи

Уа1

С1и

ТНг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

195

200

205

Ьеи

Ьеи

Агд

Рго

Азп

НЬз

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РНе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

НЬз

НЬз

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РНе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТНг

А1а

Ьеи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТНг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

161 026112

260

265

270

А1а

А1а

ТАг

Пей

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Пуз

11е

Рго

Азр

А1а

Пуз

Зег

Рго

Пей

Рго

Уа1

РАе

А1а

Туг

ТАг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РАе

ТАг

Азр

С1п

Уа1

Пей

Пуз

РАе

Пей

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Пей

Уа1

Туг

ТАг

РАе

С1у

С1и

ТАг

Уа1

А1а

Пей

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТАг

Пей

Зег

11е

МеА

Агд

Зег

МеА

Пуз

Зег

Суз

Пей

340

345

350

Пей

Пей

Азр

Азп

Туг

МеА

С1и

ТАг

11е

Пей

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТАг

Пей

А1а

А1а

Пуз

МеА

Суз

Зег

С1п

Уа1

Пей

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Пуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Пей

Нгз

Пей

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

Пей

С1и

Пуз

С1у

С1у

Пуз

РАе

ТАг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Пуз

Рго

ТАг

Пей

С1и

Азр

Пей

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

Пуз

420

425

430

РАе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

Пей

Зег

Суз

Пуз

С1и

Пуз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

Пуз

Азр

ТАг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

РАе

Пей

Пуз

Рго

Рго

МеА

С1и

ТАг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

465

470

475

480

РАе Туг Азп <210> 47 <211> 432 <212> белок <213> Ното заргепз <220>

<223> зрелая зНиРН20 36-467 <400> 47

162 026112

Ьеи 1

Азп

РЬе

Агд

А1а 5

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго 10

Азп

Уа1

Рго

РЬе

Ьеи 15

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РЬе

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

РЬе

Азр

С1и

Рго

20

25

30

Ьеи

Азр

МеЬ

Зег

Ьеи

РЬе

Зег

РЬе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

11е

Азп

А1а

35

40

45

ТЬг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТЬг

11е

РЬе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Ьеи

С1у

Туг

Туг

50

55

60

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТЬг

С1у

Уа1

ТЬг

Уа1

Азп

С1у

С1у

11е

Рго

65

70

75

80

С1п

Ьуз

11е

Зег

Ьеи

С1п

Азр

Нтз

Ьеи

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьуз

Азр

11е

85

90

95

ТЬг

РЬе

Туг

МеЬ

Рго

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1у

МеЬ

А1а

Уа1

11е

Азр

Тгр

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТЬг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

Уа1

115

120

125

Туг

Ьуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Ьеи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

Уа1

С1п

Ьеи

130

135

140

Зег

Ьеи

ТЬг

С1и

А1а

ТЬг

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

С1п

С1и

РЬе

С1и

Ьуз

А1а

145

150

155

160

С1у

Ьуз

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

С1и

ТЬг

11е

Ьуз

Ьеи

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Агд

165

170

175

Рго

Азп

Нтз

Ьеи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Ьеи

РЬе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Нтз

180

185

190

Нтз

Туг

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РЬе

Азп

Уа1

С1и

11е

195

200

205

Ьуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Ьеи

Зег

Тгр

Ьеи

Тгр

Азп

С1и

Зег

ТЬг

А1а

Ьеи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

ТЬг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

ТЬг

225

230

235

240

Ьеи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

Ьуз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

Ьуз

Зег

Рго

Ьеи

Рго

Уа1

РЬе

А1а

Туг

ТЬг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

РЬе

ТЬг

Азр

С1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

РЬе

Ьеи

Зег

С1п

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

Туг

275

280

285

ТЬг

РЬе

С1у

С1и

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

290

295

300

С1у

ТЬг

Ьеи

Зег

11е

МеЬ

Агд

Зег

МеЬ

Ьуз

Зег

Суз

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Азр

163 026112

305

ТАг 325

310

Рго

Туг 330

315

320 Ьеи

Азп

Туг

МеА

С1и

11е

Ьеи

Азп

11е

11е

Азп

Уа1

ТАг 335

А1а

А1а

Ьуз

МеА

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

Нтз

Ьеи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РАе

ТАг

Уа1

Агд

С1у

370

375

380

Ьуз

Рго

ТАг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

Ьуз

РАе

Туг

Суз

385

390

395

400

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

Уа1

Ьуз

Азр

405

410

415

ТАг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

11е

Азр

А1а

420

425

430

<210> 48 <211> 448 <212> белок <213> Ното зартепз <220>

<223> зрелая зНиРН20 36-483 <400> 48

Ьеи Азп РАе Агд А1а Рго Рго Уа1 11е Рго Азп Уа1 Рго РАе Ьеи Тгр 1 5 10 15

А1а Тгр Азп А1а Рго Зег С1и РАе Суз Ьеи С1у Ьуз РАе Азр С1и Рго 20 25 30

Ьеи Азр МеА Зег Ьеи РАе Зег РАе 11е С1у Зег Рго Агд 11е Азп А1а 35 40 45

ТАг С1у С1п С1у Уа1 ТАг 11е РАе Туг Уа1 Азр Агд Ьеи С1у Туг Туг 50 55 60

Рго Туг 11е Азр Зег 11е ТАг С1у Уа1 ТАг Уа1 Азп С1у С1у 11е Рго

70 75 80

С1п Ьуз 11е Зег Ьеи С1п Азр Нтз Ьеи Азр Ьуз А1а Ьуз Ьуз Азр 11е

90 95

ТАг РАе Туг МеА Рго Уа1 Азр Азп Ьеи С1у МеА А1а Уа1 11е Азр Тгр

164 026112

100

105

110

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТАг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

^уз

Рго

^уз

Азр

Уа1

115

120

125

Туг

^уз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

^еи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

Уа1

С1п

^еи

130

135

140

Зег

^еи

ТАг

С1и

А1а

ТАг

С1и

^уз

А1а

^уз

С1п

С1и

РАе

С1и

^уз

А1а

145

150

155

160

С1у

^уз

Азр

РАе

^еи

Уа1

С1и

ТАг

11е

^уз

^еи

С1у

^уз

^еи

^еи

Агд

165

170

175

Рго

Азп

Нтз

^еи

Тгр

С1у

Туг

Туг

^еи

РАе

Рго

Азр

Суз

Туг

Азп

Нтз

180

185

190

Нтз

Туг

^уз

^уз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РАе

Азп

Уа1

С1и

11е

195

200

205

^уз

Агд

Азп

Азр

Азр

^еи

Зег

Тгр

^еи

Тгр

Азп

С1и

Зег

ТАг

А1а

^еи

210

215

220

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

^еи

Азп

ТАг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

А1а

А1а

ТАг

225

230

235

240

^еи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

Зег

^уз

11е

245

250

255

Рго

Азр

А1а

^уз

Зег

Рго

^еи

Рго

Уа1

РАе

А1а

Туг

ТАг

Агд

11е

Уа1

260

265

270

РАе

ТАг

Азр

С1п

Уа1

^еи

^уз

РАе

^еи

Зег

С1п

Азр

С1и

^еи

Уа1

Туг

275

280

285

ТАг

РАе

С1у

С1и

ТАг

Уа1

А1а

^еи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

Уа1

11е

Тгр

290

295

300

С1у

ТАг

^еи

Зег

11е

Меб

Агд

Зег

Меб

^уз

Зег

Суз

^еи

^еи

^еи

Азр

305

310

315

320

Азп

Туг

Меб

С1и

ТАг

11е

^еи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

Уа1

ТАг

^еи

325

330

335

А1а

А1а

^уз

Меб

Суз

Зег

С1п

Уа1

^еи

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

340

345

350

11е

Агд

^уз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

^еи

Нтз

^еи

Азп

Рго

Азр

355

360

365

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

^еи

С1и

^уз

С1у

С1у

^уз

РАе

ТАг

Уа1

Агд

С1у

370

375

380

^уз

Рго

ТАг

^еи

С1и

Азр

^еи

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

^уз

РАе

Туг

Суз

385

390

395

400

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

^еи

Зег

Суз

^уз

С1и

^уз

А1а

Азр

Уа1

^уз

Азр

405

410

415

ТАг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

11е

Азр

А1а

165 026112

420 425 430

РНе Теи Туз Рго Рго МеН С1и ТНг С1и С1и Рго С1п 11е РНе Туг Азп

435 440 445 <210> 49 <211> 1446 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>

<223> ДНК, кодирующая растворимую гНиРН20 предшественник <400> 49 аНдддадНдс НааааННсаа дсасаНсННН ННсадаадсН ННдННаааНс аадНддадНа 60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

НсссадаНад	ННННсассНН	ссННсНдаНН
ссНссНдННа	ННссаааНдН	дссНННссНс
сННддааааН	ННдаНдадсс	асНадаНаНд
аНааасдсса	ссдддсаадд	НдННасааНа
НасаНадаНН	сааНсасадд	адНаасНдНд
саадассаНс	Нддасааадс	Наадааадас
ддааНддсНд	ННаННдасНд	ддаадааНдд
ааадаНдННН	асаадааНад	дНсНаННдаа
сНсасададд	ссасНдадаа	адсаааасаа
дНададасНа	НааааННддд	ааааННасНН
НННссддаНН	дННасаасса	НсасНаНаад
дНадаааНаа	ааадаааНда	НдаНсНсадс

ссаНдННдсН	НдасНсНдаа	НННсададса
НдддссНдда	аНдссссаад	НдааННННдН
адссНсННсН	сНННсаНадд	аадсссссда
ННННаНдННд	аНадасННдд	сНасНаНссН
ааНддаддаа	Нсссссадаа	даНННссННа
аННасаНННН	аНаНдссадН	адасааНННд
адасссасНН	дддсаадааа	сНддааассН
ННддННсадс	аасааааНдН	асаасННадН
дааНННдааа	аддсадддаа	ддаНННссНд
сддссаааНс	асННдНдддд	ННаННаНсНН
ааасссддНН	асааНддаад	ННдсННсааН
НддННдНдда	аНдааадсас	НдсНсНННас

780

- 166 026112

ссакссаккк 840	акккдаасас	ксадсадкск	сскдкадскд	скасаскска	кдкдсдсаак
сдадкксддд 900	аадссаксад	адкккссааа	акасскдакд	сааааадксс	асккссддкк
кккдсакака 960	сссдсакадк	ккккаскдак	саадккккда	аакксскккс	ксаадакдаа
сккдкдкака 1020	сакккддсда	ааскдккдск	скдддкдскк	скддааккдк	аакакдддда
асссксадка 1080	каакдсдаад	какдааакск	кдсккдсксс	кадасаакка	сакддадаск
акаскдаакс 1140	сккасакаак	саасдксаса	скадсадсса	ааакдкдкад	ссаадкдскк
кдссаддадс 1200	ааддадкдкд	какааддааа	ааскддаакк	саадкдаска	кскксасскс
аасссадака 1260	аккккдскак	ксаасккдад	аааддкддаа	адкксасадк	асдкддаааа
ссдасасккд 1320	аадасскдда	дсааккккск	дааааакккк	аккдсадскд	ккакадсасс
ккдадккдка 1380	аддадааадс	кдакдкаааа	дасаскдакд	скдккдакдк	дкдкаккдск
дакддкдкск	дкакадакдс	ккккскаааа	ссксссакдд	адасадаада	ассксааакк

1440 ккскас

1446 <210> 50 <211> 509 <212> белок <213> Ното зартепз <220>

<223> РН20, вариант Р48А <400> 50

Мек

С1у

Уа1

Ьеи

Ьуз

Рйе

Ьуз

Нтз

11е

Рйе

Рйе

Агд

Зег

Рпе

Уа1

Ьуз

1

5

10

15

Зег

Зег

С1у

Уа1

Зег

С1п

11е

Уа1

Рпе

Тйг

Рйе

Ьеи

Ьеи

11е

Рго

Суз

- 167 026112

20

25

30

Суз

Пей

ТТг

Пей

Азп

РТе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

А1а

35

40

45

РТе

Пей

Тгр

А1а

Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РТе

Суз

Пей

С1у

Пуз

РТе

50

55

60

Азр

С1и

Рго

Пей

Азр

МеТ

Зег

Пей

РТе

Зег

РТе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

ТТг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТТг

11е

РТе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Пей

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТТг

С1у

Уа1

ТТг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Пуз

11е

Зег

Пей

С1п

Азр

Η^з

Пей

Азр

Пуз

А1а

Пуз

115

120

125

Пуз

Азр

11е

ТТг

РТе

Туг

МеТ

Рго

Уа1

Азр

Азп

Пей

С1у

МеТ

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТТг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Пуз

Рго

145

150

155

160

Пуз

Азр

Уа1

Туг

Пуз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Пей

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Пей

Зег

Пей

ТТг

С1и

А1а

ТТг

С1и

Пуз

А1а

Пуз

С1п

С1и

РТе

180

185

190

С1и

Пуз

А1а

С1у

Пуз

Азр

РТе

Пей

Уа1

С1и

ТТг

11е

Пуз

Пей

С1у

Пуз

195

200

205

Пей

Пей

Агд

Рго

Азп

Η^з

Пей

Тгр

С1у

Туг

Туг

Пей

РТе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Η^з

Η^з

Туг

Пуз

Пуз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РТе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Пуз

Агд

Азп

Азр

Азр

Пей

Зег

Тгр

Пей

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТТг

А1а

Пей

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Пей

Азп

ТТг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

ТТг

Пей

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Пуз

11е

Рго

Азр

А1а

Пуз

Зег

Рго

Пей

Рго

Уа1

РТе

А1а

Туг

ТТг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РТе

ТТг

Азр

С1п

Уа1

Пей

Пуз

РТе

Пей

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Пей

Уа1

Туг

ТТг

РТе

С1у

С1и

ТТг

Уа1

А1а

Пей

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

168 026112

Уа1

11е

Тгр

С1у 340

ТАг

Ьеи

Зег

11е

МеА 345

Агд

Зег

МеА

Ьуз

Зег 350

Суз

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Азр

Азп

Туг

МеА

С1и

ТАг

11е

Ьеи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

Уа1

ТАг

Ьеи

А1а

А1а

Ьуз

МеА

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

Суз

С1п

С1и

С1п

370

375

380

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ьеи

Η^з

Ьеи

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

Ьеи

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РАе

ТАг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Ьуз

Рго

ТАг

Ьеи

С1и

Азр

Ьеи

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

Ьуз

420

425

430

РАе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

Ьуз

Азр

ТАг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

РАе

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

МеА

С1и

ТАг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

465

470

475

480

РАе

Туг

Азп

А1а

Зег

Рго

Зег

ТАг

Ьеи

Зег

А1а

ТАг

МеА

РАе

11е

Уа1

485

490

495

Зег

11е

Ьеи

РАе

Ьеи

11е

11е

Зег

Зег

Уа1

А1а

Зег

Ьеи

500 505 <210> 51 <211> 509 <212> белок

<213> Ηото зартепз

<220>

<223> предшественник

. РΗ20,

вариант

Ь499И

<400> 51

МеА С1у

Уа1 Ьеи Ьуз

РАе

Ьуз

Η^з

11е

РАе

РАе

Агд

Зег

РАе

Уа1

Ьуз

1

5

10

15

Зег Зег

С1у Уа1 Зег

С1п

11е

Уа1

РАе

ТАг

РАе

Ьеи

Ьеи

11е

Рго

Суз

20

25

30

Суз Ьеи

ТАг Ьеи Азп

РАе

Агд

А1а

Рго

Рго

Уа1

11е

Рго

Азп

Уа1

Рго

35

40

45

РАе Ьеи

Тгр А1а Тгр

Азп

А1а

Рго

Зег

С1и

РАе

Суз

Ьеи

С1у

Ьуз

РАе

169 026112

55 60

Азр

С1и

Рго

Теи

Азр

МеН

Зег

Теи

РНе

Зег

РНе

11е

С1у

Зег

Рго

Агд

65

70

75

80

11е

Азп

А1а

ТНг

С1у

С1п

С1у

Уа1

ТНг

11е

РНе

Туг

Уа1

Азр

Агд

Теи

85

90

95

С1у

Туг

Туг

Рго

Туг

11е

Азр

Зег

11е

ТНг

С1у

Уа1

ТНг

Уа1

Азп

С1у

100

105

110

С1у

11е

Рго

С1п

Туз

11е

Зег

Теи

С1п

Азр

Нгз

Теи

Азр

Туз

А1а

Туз

115

120

125

Туз

Азр

11е

ТНг

РНе

Туг

МеН

Рго

Уа1

Азр

Азп

Теи

С1у

МеН

А1а

Уа1

130

135

140

11е

Азр

Тгр

С1и

С1и

Тгр

Агд

Рго

ТНг

Тгр

А1а

Агд

Азп

Тгр

Туз

Рго

145

150

155

160

Туз

Азр

Уа1

Туг

Туз

Азп

Агд

Зег

11е

С1и

Теи

Уа1

С1п

С1п

С1п

Азп

165

170

175

Уа1

С1п

Теи

Зег

Теи

ТНг

С1и

А1а

ТНг

С1и

Туз

А1а

Туз

С1п

С1и

РНе

180

185

190

С1и

Туз

А1а

С1у

Туз

Азр

РНе

Теи

Уа1

С1и

ТНг

11е

Туз

Теи

С1у

Туз

195

200

205

Теи

Теи

Агд

Рго

Азп

Нгз

Теи

Тгр

С1у

Туг

Туг

Теи

РНе

Рго

Азр

Суз

210

215

220

Туг

Азп

Нгз

Нгз

Туг

Туз

Туз

Рго

С1у

Туг

Азп

С1у

Зег

Суз

РНе

Азп

225

230

235

240

Уа1

С1и

11е

Туз

Агд

Азп

Азр

Азр

Теи

Зег

Тгр

Теи

Тгр

Азп

С1и

Зег

245

250

255

ТНг

А1а

Теи

Туг

Рго

Зег

11е

Туг

Теи

Азп

ТНг

С1п

С1п

Зег

Рго

Уа1

260

265

270

А1а

А1а

ТНг

Теи

Туг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Уа1

Агд

С1и

А1а

11е

Агд

Уа1

275

280

285

Зег

Туз

11е

Рго

Азр

А1а

Туз

Зег

Рго

Теи

Рго

Уа1

РНе

А1а

Туг

ТНг

290

295

300

Агд

11е

Уа1

РНе

ТНг

Азр

С1п

Уа1

Теи

Туз

РНе

Теи

Зег

С1п

Азр

С1и

305

310

315

320

Теи

Уа1

Туг

ТНг

РНе

С1у

С1и

ТНг

Уа1

А1а

Теи

С1у

А1а

Зег

С1у

11е

325

330

335

Уа1

11е

Тгр

С1у

ТНг

Теи

Зег

11е

МеН

Агд

Зег

МеН

Туз

Зег

Суз

Теи

340

345

350

Теи

Теи

Азр

Азп

Туг

МеН

С1и

ТНг

11е

Теи

Азп

Рго

Туг

11е

11е

Азп

355

360

365

170 026112

Уа1

ТАг 370

Ней

А1а

А1а

Ьуз

МеА 375

Суз

Зег

С1п

Уа1

Ней 380

Суз

С1п

С1и

С1п

С1у

Уа1

Суз

11е

Агд

Ьуз

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

Азр

Туг

Ней

Η^з

Ней

385

390

395

400

Азп

Рго

Азр

Азп

РАе

А1а

11е

С1п

Ней

С1и

Ьуз

С1у

С1у

Ьуз

РАе

ТАг

405

410

415

Уа1

Агд

С1у

Ьуз

Рго

ТАг

Ней

С1и

Азр

Ней

С1и

С1п

РАе

Зег

С1и

Ьуз

420

425

430

РАе

Туг

Суз

Зег

Суз

Туг

Зег

ТАг

Ней

Зег

Суз

Ьуз

С1и

Ьуз

А1а

Азр

435

440

445

Уа1

Ьуз

Азр

ТАг

Азр

А1а

Уа1

Азр

Уа1

Суз

11е

А1а

Азр

С1у

Уа1

Суз

450

455

460

11е

Азр

А1а

РАе

Ней

Ьуз

Рго

Рго

МеА

С1и

ТАг

С1и

С1и

Рго

С1п

11е

465

470

475

480

РАе

Туг

Азп

А1а

Зег

Рго

Зег

ТАг

Ней

Зег

А1а

ТАг

МеА

РАе

11е

Уа1

485

490

495

Зег

11е

Тгр

РАе

Ней

11е

11е

Зег

Зег

Уа1

А1а

Зег

Ней

500 505 <210> 52 <211> 6630 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> ΗΖ24 вектор <400> 52

АсааАаААдд	ссаААадсса	АаААаААсаА	АддААаАаАа	дсаАаааАса	аАаААддсАа
ААддссаААд	саАасдААдА	аАсАаАаАса	АааАаАдАас	аАААаАаААд	дсАсаАдАсс
ааАаАдассд	ссаАдААддс	аААдаААаАА	дасАадААаА	АааАадАааА	сааААасддд
дАсаААадАА	саАадсссаА	аАаАддадАА	ссдсдААаса	АаасААасдд	АаааАддссс
дссАддсАда	ссдсссаасд	асссссдссс	аААдасдАса	аАааАдасдА	аАдААсссаА
адАаасдсса	аАадддасАА	АссаААдасд	АсааАдддАд	дадАаАААас	ддАааасАдс

- 171 026112

ссасккддса 420	дкасаксаад	кдкаксакак	дссаадкссд	ссссскаккд	асдксаакда
сддкааакдд 480	сссдсскддс	аккакдссса	дкасакдасс	ккасдддаск	кксскасккд
дсадкасакс 540	касдкаккад	ксаксдскак	кассакддкд	акдсддкккк	ддсадкасас
саакдддсдк 600	ддакадсддк	ккдасксасд	дддаккксса	адкскссасс	ссаккдасдк
саакдддадк 660	ккдккккддс	ассаааакса	асдддасккк	ссаааакдкс	дкаакаассс
сдссссдккд 720	асдсааакдд	дсддкаддсд	кдкасддкдд	даддкскака	каадсададс
ксдкккадкд 780	аассдксада	ксаскадаад	скккаккдсд	дкадкккакс	асадккааак
кдскаасдса 840	дксадкдскк	скдасасаас	адксксдаас	ккаадскдса	даадккддкс
дкдаддсаск 900	дддсаддкаа	дкаксааддк	касаадасад	дкккааддад	ассаакадаа
аскдддсккд 960	ксдадасада	даадаскскк	дсдкккскда	каддсасска	ккддксккас
кдасакссас 1020	кккдсскккс	кскссасадд	кдкссасксс	садкксаакк	асадскскка
аддскададк 1080	асккаакасд	асксаскака	ддскадсакд	ддадкдскаа	аакксаадса
сакскккккс 1140	адаадскккд	ккаааксаад	кддадкаксс	садакадккк	ксасскксск
кскдакксса 1200	кдккдсккда	скскдааккк	сададсасск	сскдккаккс	сааакдкдсс
ккксскскдд 1260	дсскддаакд	ссссаадкда	аккккдкскк	ддаааакккд	акдадссаск
адакакдадс 1320	сксккскскк	ксакаддаад	сссссдаака	аасдссассд	ддсааддкдк
касаакаккк 1380	какдккдака	дасккддска	скакссккас	акадакксаа	ксасаддадк
ааскдкдаак 1440	ддаддааксс	сссадаадак	ккссккасаа	дассакскдд	асааадскаа
дааадасакк 1500	асаккккака	кдссадкада	саакккддда	акддскдкка	ккдаскддда
адаакддада	сссасккддд	саадаааскд	дааасскааа	дакдкккаса	адаакаддкс

1560

- 172 026112

НаННдааННд 1620	дННсадсаас	ааааНдНаса	асННадНсНс	асададдсса	сНдадааадс
аааасаадаа 1680	НННдаааадд	садддаадда	НННссНддНа	дадасНаНаа	ааННдддааа
аННасННсдд 1740	ссаааНсасН	НдНддддННа	ННаНсННННН	ссддаННдНН	асаассаНса
сНаНаадааа 1800	сссддННаса	аНддаадННд	сННсааНдНа	даааНааааа	даааНдаНда
НсНсадсНдд 1860	ННдНддааНд	ааадсасНдс	НсНННассса	НссаНННаНН	НдаасасНса
дсадНсНссН 1920	дНадсНдсНа	сасНсНаНдН	дсдсааНсда	дННсдддаад	ссаНсададН
ННссааааНа 1980	ссНдаНдсаа	ааадНссасН	НссддННННН	дсаНаНассс	дсаНадНННН
НасНдаНсаа 2040	дННННдаааН	НссНННсНса	адаНдаасНН	дНдНаНасаН	ННддсдааас
НдННдсНсНд 2100	ддНдсННсНд	дааННдНааН	аНддддаасс	сНсадНаНаа	НдсдаадНаН
даааНсННдс 2160	ННдсНссНад	асааННасаН	ддадасНаНа	сНдааНссНН	асаНааНсаа
сдНсасасНа 2220	дсадссаааа	НдНдНадсса	адНдсНННдс	саддадсаад	дадНдНдНаН
ааддааааас 2280	НддааННсаа	дНдасНаНсН	НсассНсаас	ссадаНааНН	ННдсНаННса
асННдадааа 2340	ддНддааадН	НсасадНасд	Нддаааассд	асасННдаад	ассНддадса
аННННсНдаа 2400	аааННННаНН	дсадсНдННа	НадсассННд	адННдНаадд	адааадсНда
НдНаааадас 2460	асНдаНдсНд	ННдаНдНдНд	НаННдсНдаН	ддНдНсНдНа	НадаНдсННН
НсНаааассН 2520	сссаНддада	садаадаасс	НсаааННННс	НасНдаддаН	ссаНадсНаа
сдссссНсНс 2580	ссНссссссс	сссНаасдНН	асНддссдаа	дссдсННдда	аНааддссдд
НдНдсдНННд 2640	НсНаНаНдНН	аННННссасс	аНаННдссдН	сННННддсаа	НдНдадддсс
сддааассНд 2700	дсссНдНсНН	сННдасдадс	аННссНаддд	дНсНННсссс	НсНсдссааа
ддааНдсаад	дНсНдННдаа	НдНсдНдаад	даадсадННс	сНсНддаадс	ННсННдаада

2760

- 173 026112

сааасаасдЬ 2820	сЬдЬадсдас	ссЬЬЬдсадд	садсддаасс	ссссассЬдд	сдасаддЬдс
сЬсЬдсддсс 2880	аааадссасд	ЬдЬаЬаадаЬ	асассЬдсаа	аддсддсаса	ассссадЬдс
сасдЬЬдЬда 2940	дЬЬддаЬадЬ	ЬдЬддааада	дЬсаааЬддс	ЬсЬссЬсаад	сдЬаЬЬсаас
ааддддсЬда 3000	аддаЬдссса	дааддЬассс	саЬЬдЬаЬдд	даЬсЬдаЬсЬ	ддддссЬсдд
ЬдсасаЬдсЬ 3060	ЬЬасаЬдЬдЬ	ЬЬадЬсдадд	ЬЬааааааас	дЬсЬаддссс	сссдаассас
ддддасдЬдд 3120	ЬЬЬЬссЬЬЬд	ааааасасда	ЬдаЬаадсЬЬ	дссасаассс	асадсддссд
сЬдссаЬсаЬ 3180	ддЬЬсдасса	ЬЬдаасЬдса	ЬсдЬсдссдЬ	дЬсссааааЬ	аЬддддаЬЬд
дсаадаасдд 3240	адассЬассс	ЬддссЬссдс	Ьсаддаасда	дЬЬсаадЬас	ЬЬссааадаа
Ьдассасаас 3300	сЬсЬЬсадЬд	дааддЬааас	адааЬсЬддЬ	даЬЬаЬдддЬ	аддаааассЬ
ддЬЬсЬссаЬ 3360	ЬссЬдадаад	ааЬсдассЬЬ	Ьаааддасад	ааЬЬааЬаЬа	дЬЬсЬсадЬа
дадаасЬсаа 3420	адаассасса	сдаддадсЬс	аЬЬЬЬсЬЬдс	саааадЬЬЬд	даЬдаЬдссЬ
ЬаадасЬЬаЬ 3480	Ьдаасаассд	дааЬЬддсаа	дЬааадЬада	саЬддЬЬЬдд	аЬадЬсддад
дсадЬЬсЬдЬ 3540	ЬЬассаддаа	дссаЬдааЬс	аассаддсса	ссЬсадасЬс	ЬЬЬдЬдасаа
ддаЬсаЬдса 3600	ддааЬЬЬдаа	адЬдасасдЬ	ЬЬЬЬсссада	ааЬЬдаЬЬЬд	дддаааЬаЬа
аасЬЬсЬссс 3660	адааЬассса	ддсдЬссЬсЬ	сЬдаддЬсса	ддаддааааа	ддсаЬсаадЬ
аЬаадЬЬЬда 3720	адЬсЬасдад	аадааадасЬ	ааасдсдЬдд	ЬассЬсЬада	дЬсдасссдд
дсддссдсЬЬ 3780	сдадсадаса	ЬдаЬаадаЬа	саЬЬдаЬдад	ЬЬЬддасааа	ссасаасЬад
ааЬдсадЬда 3840	ааааааЬдсЬ	ЬЬаЬЬЬдЬда	ааЬЬЬдЬдаЬ	дсЬаЬЬдсЬЬ	ЬаЬЬЬдЬаас
саЬЬаЬаадс 3900	ЬдсааЬааас	аадЬЬаасаа	саасааЬЬдс	аЬЬсаЬЬЬЬа	ЬдЬЬЬсаддЬ
Ьсадддддад	аЬдЬдддадд	ЬЬЬЬЬЬааад	саадЬаааас	сЬсЬасаааЬ	дЬддЬааааЬ

3960

- 174 026112

сдаАааддаА 4020	ссдддсАддс	дАааАадсда	ададдсссдс	ассдаАсдсс	сААсссааса
дААдсдсадс 4080	сАдааАддсд	ааАддасдсд	сссАдАадсд	дсдсаААаад	сдсддсдддА
дАддАддААа 4140	сдсдсадсдА	дассдсАаса	сААдссадсд	сссАадсдсс	сдсАссАААс
дсАААсААсс 4200	сААссАААсА	сдссасдААс	дссддсАААс	сссдАсаадс	АсАаааАсдд
дддсАсссАА 4260	АадддААссд	аАААадАдсА	ААасддсасс	Асдассссаа	аааасААдаА
АадддАдаАд 4320	дААсасдАад	АдддссаАсд	сссАдаАада	сддАААААсд	сссАААдасд
ААддадАсса 4380	сдААсАААаа	АадАддасАс	ААдААссааа	сАддаасаас	асАсаасссА
аАсАсддАсА 4440	аААсААААда	АААаАааддд	аААААдссда	АААсддссАа	ААддААаааа
ааАдадсАда 4500	АААаасаааа	аАААаасдсд	ааААААааса	аааАаААаас	дсААасааАА
АссАдаАдсд 4560	дАаААААсАс	сААасдсаАс	АдАдсддАаА	ААсасассдс	аАаАддАдса
сАсАсадАас 4620	ааАсАдсАсА	даАдссдсаА	адААаадсса	дссссдасас	ссдссаасас
ссдсАдасдс 4680	дсссАдасдд	дсААдАсАдс	АсссддсаАс	сдсААасада	саадсАдАда
ссдАсАссдд 4740	дадсАдсаАд	АдАсададдА	АААсассдАс	аАсассдааа	сдсдсдадас
дааадддссА 4800	сдАдаАасдс	сАаАААААаА	аддААааАдА	саАдаАааАа	аАддАААсАА
адасдАсадд 4860	АддсасАААА	сддддаааАд	Адсдсддаас	сссАаАААдА	ААаАААААсА
аааАасаААс 4920	аааАаАдАаА	ссдсАсаАда	дасааАаасс	сАдаАаааАд	сААсааАааА
аААдааааад 4980	даададАаАд	адАаААсаас	аАААссдАдА	сдсссААаАА	сссААААААд
сддсаААААд 5040	ссААссАдАА	АААдсАсасс	садааасдсА	ддАдааадАа	ааадаАдсАд
аадаАсадАА 5100	дддАдсасда	дАдддААаса	АсдаасАдда	АсАсаасадс	ддАаадаАсс
ААдададААА	Асдссссдаа	даасдААААс	сааАдаАдад	сасААААааа	дААсАдсАаА

5160

- 175 026112

д!ддсдсдд! 5220	а!!а!сссд!	а!!дасдссд	ддсаададса	ас!сдд!сдс	сдса!асас!
а!!с!садаа 5280	!дас!!дд!!	дад!ас!сас	сад!сасада	ааадса!с!!	асдда!ддса
!дасад!аад 5340	адаа!!а!дс	ад!дс!дсса	!аасса!дад	!да!аасас!	дсддссаас!
!ас!!с!дас 5400	аасда!сдда	ддассдаадд	адс!аассдс	!!!!!!дсас	ааса!ддддд
а!са!д!аас 5460	!сдсс!!да!	сд!!дддаас	сддадс!даа	!даадсса!а	ссааасдасд
адсд!дасас 5520	сасда!дсс!	д!адсаа!дд	саасаасд!!	дсдсааас!а	!!аас!ддсд
аас!ас!!ас 5580	!с!адс!!сс	сддсаасаа!	!аа!адас!д	да!ддаддсд	да!ааад!!д
саддассас! 5640	!с!дсдс!сд	дссс!!ссдд	с!ддс!дд!!	!а!!дс!да!	ааа!с!ддад
ссдд!дадсд 5700	!ддд!с!сдс	дд!а!са!!д	садсас!ддд	дссада!дд!	аадссс!ссс
д!а!сд!ад! 5760	!а!с!асасд	асддддад!с	аддсаас!а!	дда!даасда	аа!адасада
!сдс!дада! 5820	адд!дсс!са	с!да!!аадс	а!!дд!аас!	д!садассаа	д!!!ас!са!
а!а!ас!!!а 5880	да!!да!!!а	ааас!!са!!	!!!аа!!!аа	аадда!с!ад	д!даада!сс
!!!!!да!аа 5940	!с!са!дасс	аааа!ссс!!	аасд!дад!!	!!сд!!ссас	!дадсд!сад
ассссд!ада 6000	ааада!сааа	дда!с!!с!!	дада!сс!!!	!!!!с!дсдс	д!аа!с!дс!
дс!!дсааас 6060	ааааааасса	ссдс!ассад	сдд!дд!!!д	!!!дссдда!	саададс!ас
саас!с!!!! 6120	!ссдаадд!а	ас!ддс!!са	дсададсдса	да!ассааа!	ас!д!!с!!с
!ад!д!адсс 6180	д!ад!!аддс	сассас!!са	адаас!с!д!	адсассдсс!	аса!асс!сд
с!с!дс!аа! 6240	сс!д!!асса	д!ддс!дс!д	ссад!ддсда	!аад!сд!д!	с!!ассддд!
!ддас!саад 6300	асда!ад!!а	ссдда!аадд	сдсадсдд!с	дддс!даасд	ддддд!!сд!
дсасасадсс	садс!!ддад	сдаасдасс!	асассдаас!	дада!асс!а	садсд!дадс

6360

- 176 026112

какдадааад	сдссасдскк	сссдааддда	даааддсдда	саддкакссд	дкаадсддса
6420 дддксддаас	аддададсдс	асдадддадс	ккссаддддд	ааасдсскдд	какскккака
6480 дксскдксдд	дккксдссас	скскдасккд	адсдксдакк	кккдкдакдс	ксдксадддд
6540 ддсддадсск	акддааааас	дссадсаасд	сддссккккк	асддкксскд	дссккккдск
6600 ддссккккдс		ксасакддск		сдасадакск

6630 <210> 53 <211> 186 <212> белок <213> Миз тизси1из <220>

<223> дигидрофолатредуктаза <400> 53

Уа1 1

Агд

Рго

Ьеи

Азп 5

Суз

11е

Уа1

А1а

Уа1 10

Зег

С1п

Азп

Мек

С1у 15

11е

С1у

Ьуз

Азп

С1у

Азр

Ьеи

Рго

Тгр

Рго

Рго

Ьеи

Агд

Азп

С1и

Рйе

Ьуз

20

25

30

Туг

Рйе

С1п

Агд

Мек

Тйг

Тйг

Тйг

Зег

Зег

Уа1

С1и

С1у

Ьуз

С1п

Азп

35

40

45

Ьеи

Уа1

11е

Мек

С1у

Агд

Ьуз

Тйг

Тгр

Рйе

Зег

11е

Рго

С1и

Ьуз

Азп

50

55

60

Агд

Рго

Ьеи

Ьуз

Азр

Агд

11е

Азп

11е

Уа1

Ьеи

Зег

Агд

С1и

Ьеи

Ьуз

65

70

75

80

С1и

Рго

Рго

Агд

С1у

А1а

Нтз

Рйе

Ьеи

А1а

Ьуз

Зег

Ьеи

Азр

Азр

А1а

85

90

95

Ьеи

Агд

Ьеи

11е

С1и

С1п

Рго

С1и

Ьеи

А1а

Зег

Ьуз

Уа1

Азр

Мек

Уа1

100

105

110

Тгр

11е

Уа1

С1у

С1у

Зег

Зег

Уа1

Туг

С1п

С1и

А1а

Мек

Азп

С1п

Рго

115

120

125

С1у

Нтз

Ьеи

Агд

Ьеи

Рйе

Уа1

Тйг

Агд

11е

Мек

С1п

С1и

Рйе

С1и

Зег

130

135

140

Азр

Тйг

Рйе

Рйе

Рго

С1и

11е

Азр

Ьеи

С1у

Ьуз

Туг

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Рго

177 026112

145

150

155

160

С1и

Туг

Рго

С1у

Уа1

Ней

Зег

С1и

Уа1

С1п

С1и С1и Ьуз

С1у 11е

Ьуз

165

170

175

Туг

Ьуз

РЬе

С1и

Уа1

Туг

С1и

Ьуз

Ьуз

Азр

180

185

<210> 54 <211> 6 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Нтз бад <400> 54

Нтз Нтз Нтз Нтз Нтз Нтз

5 <210> 55 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Р1ад бад <400> 55

Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз 1 5 <210> 56 <211> 1449 <212> ДНК <213> Ното зартепз <220>

- 178 026112 <223> последовательность Сеп2 мРНК

	<400> 56 абдддадбдс	бааааббсаа	дсасабсббб	ббсадаадсб	ббдббааабс	аадбддадба
60	сссадабад	ббббсассбб	ссббсбдабб	ссабдббдсб	бдасбсбдаа	бббсададса
120	ссбссбдбба	ббссааабдб	дссбббссбс	бдддссбдда	абдссссаад	бдааббббдб
180	сббддааааб	ббдабдадсс	асбадабабд	адссбсббсб	сбббсабадд	аадсссссда
240	абааасдсса	ссдддсаадд	бдббасааба	ббббабдббд	абадасббдд	сбасбабссб
300	басабадабб	саабсасадд	адбаасбдбд	аабддаддаа	бсссссадаа	дабббссбба
360	саадассабс	бддасааадс	баадааадас	аббасабббб	абабдссадб	адасаабббд
420	ддаабддсбд	ббаббдасбд	ддаадаабдд	адасссасбб	дддсаадааа	сбддааассб
480	ааадабдббб	асаадаабад	дбсбаббдаа	ббддббсадс	аасаааабдб	асаасббадб
540	сбсасададд	ссасбдадаа	адсаааасаа	даабббдааа	аддсадддаа	ддабббссбд
600	дбададасба	бааааббддд	ааааббасбб	сддссааабс	асббдбдддд	ббаббабсбб
660	бббссддабб	дббасаасса	бсасбабаад	ааасссддбб	асаабддаад	ббдсббсааб
720	дбадааабаа	ааадааабда	бдабсбсадс	бддббдбдда	абдааадсас	бдсбсбббас
780	ссабссаббб	абббдаасас	бсадсадбсб	ссбдбадсбд	сбасасбсба	бдбдсдсааб
840	сдадббсддд	аадссабсад	адбббссааа	абассбдабд	сааааадбсс	асббссддбб
900	бббдсабаба	сссдсабадб	ббббасбдаб	саадббббда	ааббссбббс	бсаадабдаа
960 <	сббдбдбаба сабббддсда	аасбдббдсб	сбдддбдсбб	сбддааббдб	аабабдддда

1020 асссбсадба баабдсдаад бабдааабсб бдсббдсбсс бадасаабба сабддадасб 1080

- 179 026112

аНасНдааНс 1140	сННасаНааН	саасдНсаса	сНадсадсса	аааНдНдНад	НсаадНдсНН
Ндссаддадс 1200	ааддадНдНд	НаНааддааа	аасНддааНН	саадНдасНа	НсННсассНс
аасссадаНа 1260	аННННдсНаН	НсаасННдад	аааддНддаа	адННсасадН	асдНддаааа
ссдасасННд 1320	аадассНдда	дсааННННсН	даааааНННН	аННдсадсНд	ННаНадсасс
ННдадННдНа 1380	аддадааадс	НдаНдНаааа	дасасНдаНд	сНдННдаНдН	дНдНаННдсН
даНддНдНсН	дНаНадаНдс	ННННсНаааа	ссНсссаНдд	адасадаада	ассНсаааНН

1440

ННсНасНда

1449

Claims (52)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Стабильная жидкая композиция для подкожного введения, содержащая иммуноглобулин (1д) и растворимую гиалуронидазу, где композиция имеет рН от приблизительно 4 до приблизительно 5 включительно, 1д присутствует в концентрации от 10 до 22% вес./об.; растворимая гиалуронидаза присутствует в концентрации от 50 до 500 ед./мл и в соотношении от 100 единиц гиалуронидазы на грамм 1д (ед./г 1д) до 3000 ед./г 1д; композиция содержит хлорид щелочного металла в концентрации от 0,05 до 0,25 М, и хлорид щелочного металла представляет собой хлорид натрия или хлорид калия, за счет чего композиция стабильна при температурах вплоть до 32°С в течение по меньшей мере 6 месяцев.
2. 2. Стабильная жидкая композиция по п.1, дополнительно содержащая аминокислотный стабилизатор в количестве от 0,1 до 1 М.
3. 3. Стабильная жидкая композиция по п.2, где аминокислотный стабилизатор выбран из аланина, гистидина, аргинина, лизина, орнитина, изолейцина, валина, метионина, глицина и пролина.
4. 4. Стабильная жидкая композиция по п.2 или 3, где аминокислотный стабилизатор представляет собой глицин или пролин.
5. 5. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.2-4, где аминокислотный стабилизатор присутствует в количестве, которое составляет по меньшей мере 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М, 0,5 М, 0,6 М, 0,7 М или 0,75 М.
6. 6. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.2-5, где аминокислотный стабилизатор присутствует в количестве 0,25 М.
7. 7. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-6, где концентрация 1д составляет по меньшей мере 10% вес./об., 11% вес./об., 12% вес./об., 13% вес./об., 14% вес./об., 15% вес./об., 16% вес./об., 17% вес./об., 18% вес./об., 19% вес./об., 20 или 21% вес./об.
8. 8. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-7, где содержание 1д составляет от приблизительно 10% вес./об. до приблизительно 20% вес./об.
9. 9. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-8, где 1д представляет собой 1д плазмы крови человека.
10. 10. Стабильная жидкая композиция по п.9, где 1д плазмы крови человека очищен способом, включающим спиртовое фракционирование.
11. 11. Стабильная жидкая композиция по п.10, где 1д, входящий в композицию, дополнительно очищен одним или несколькими способами, выбранными из осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ), ионообменной хроматографии, диафильтрации или ультрафильтрации.
12. 12. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-11, где 1д, входящий в композицию, под- 180 026112 вергнут инактивации вирусов, выбранной из инкубации при рН 4,0 без пепсина, обработки растворителем и детергентом и нанофильтрации.
13. 13. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-12, где 1д содержит 1дО, 1дА и 1дМ.
14. 14. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-13, где 1д содержит более 95% 1дО.
15. 15. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-14, где хлорид щелочного металла представляет собой Ν;·ιΟ и Ν;·ιΟ присутствует в концентрации 0,05 М, 0,08 М, 0,09 М, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М или 0,25 М.
16. 16. Стабильная жидкая композиция по п.15, где №С1 присутствует в концентрации 0,15 М.
17. 17. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-16, где растворимая гиалуронидаза представляет собой РН20 или ее усеченную форму.
18. 18. Стабильная жидкая композиция по п.17, где РН20 выбрана из овечьей, бычьей или усеченной человеческой РН20.
19. 19. Стабильная жидкая композиция по п.17 или 18, где РН20 представляет собой усеченную человеческую РН20 и усеченная человеческая РН20 выбрана из полипептидов с последовательностью аминокислот, приведенной в любой из 8ЕО ГО ΝΟ: 4-9, или их вариантов, обладающих по меньшей мере 99% идентичностью с любой из последовательностей, приведенных в 8ЕО ГО ΝΟ: 4-9.
20. 20. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-19, где растворимая гиалуронидаза содержит аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕО ГО ΝΟ: 4-9.
21. 21. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-20, где растворимая гиалуронидаза содержится в концентрации, которая составляет 50 ед./мл, 100 ед./мл, 200 ед./мл, 300 ед./мл, 400 ед./мл или 500 ед./мл.
22. 22. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-21, где растворимая гиалуронидаза содержится в концентрации, которая составляет от приблизительно 75 ед./мл до приблизительно 350 ед./мл.
23. 23. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-22, где растворимая гиалуронидаза содержится при соотношении 100 ед./г 1д, 150 ед./г 1д, 200 ед./г 1д, 250 ед./г 1д, 300 ед./г 1д, 400 ед./г 1д, 500 ед./г 1д, 600 ед./г 1д, 700 ед./г 1д, 800 ед./г 1д, 900 ед./г 1д, 1000 ед./г 1д, 1200 ед./г 1д, 1500 ед./г 1д, 1800 ед./г 1д, 2000 ед./г 1д или 3000 ед./г 1д.
24. 24. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-23, где соотношение растворимой гиалуронидазы и 1д составляет от 250 ед./г 1д до 1000 ед./г 1д или от 250 ед./г 1д до 750 ед./г 1д.
25. 25. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-24, которая имеет рН от 4,4 до 4,9.
26. 26. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-25, где композиция предназначена непосредственно для введения без разбавления.
27. 27. Стабильная жидкая композиция по п.26, где количество 1д составляет от примерно 1 г до примерно 200 г, от примерно 1 г до примерно 100 г, от примерно 10 г до примерно 100 г, от примерно 5 г до примерно 50 г, от примерно 6 г до примерно 50 г, от примерно 5 г до примерно 100 г.
28. 28. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-27, где композиция предназначена непосредственно для введения без разбавления и количество 1д составляет по меньшей мере приблизительно 1 г, 2 г, 3 г, 4 г, 5 г, 10 г, 20 г, 30 г, 40 г, 50 г, 60 г, 70 г, 80 г, 90 г, 100 г или 200 г.
29. 29. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-28, где композиция предназначена непосредственно для введения без разбавления и количество гиалуронидазы в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 500 единиц, 1000 единиц, 2000 единиц, 5000 единицы, 10000 единиц, 30000 единиц, 40000 единиц, 50000 единиц, 60000 единиц, 70000 единиц, 80000 единиц, 90000 единиц, 100000 единиц или более.
30. 30. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-29, где количество гиалуронидазы в композиции составляет от 500 единиц до 500000 единиц или от 1000 единиц до 100000 единиц.
31. 31. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-30, которая стабильна при 28-32°С в течение 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев или более.
32. 32. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-31, которая стабильна при 0-10°С в течение 6 месяцев, 1 года, 2 лет или более.
33. 33. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-32 для применения при лечении поддающегося лечению 1д заболевания или состояния.
34. 34. Стабильная жидкая композиция по п.33, где поддающееся лечению 1д заболевание или состояние выбрано из первичного иммунодефицита, вторичного иммунодефицита, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и острых инфекций.
35. 35. Стабильная жидкая композиция по любому из пп.1-34, где хлоридом щелочного металла является хлорид натрия.
36. 36. Набор, содержащий стабильную жидкую композицию по любому из пп.1-35 и инструкции по применению.
37. 37. Контейнер, содержащий стабильную жидкую композицию по любому из пп.1-35.
38. 38. Контейнер по п.37, представляющий собой пробирку, бутылку или флакон.
39. 39. Контейнер по п.37, который представляет собой шприц.
40. 40. Контейнер по любому из пп.37-39, дополнительно включающий иглу для инъекции.

    - 181 026112
41. 41. Контейнер по любому из пп.37-40, где стабильная жидкая композиция предназначена для введения одной дозой или множеством доз.
42. 42. Набор, содержащий контейнер по любому из пп.37-41, а также приспособление для инфузии композиции.
43. 43. Способ лечения поддающегося лечению 1д заболевания или состояния, включающий подкожное введение субъекту стабильной жидкой композиции по любому из пп.1-35.
44. 44. Способ по п.43, где композицию вводят таким образом, чтобы количество вводимого 1д было, по существу, таким же, как при внутривенном введении 1д для лечения поддающегося лечению 1д заболевания или состояния.
45. 45. Способ по п.43 или 44, где поддающееся лечению 1д заболевание или состояние выбрано из первичного иммунодефицита, вторичного иммунодефицита, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и острых инфекций.
46. 46. Способ по любому из пп.43-45, где поддающееся лечению 1д заболевание или состояние представляет собой первичный иммунодефицит и первичный иммунодефицит выбран из обычного вариабельного иммунодефицита (СУГО), избирательного дефицита 1дА, дефицита 1дС. дефицита специфических антител, нарушений системы комплемента, врожденной агаммаглобулинемии, атаксии, телеангиэктазии, гиперпродукции 1дМ, синдрома Вискотта-Олдрича, тяжелого комбинированного иммунодефицита (8СГО), первичной гипогаммаглобулинемии, первичного иммунодефицита с дефицитом антител, сцепленной с Х-хромосомой агаммаглобулинемии (ХЬА) или гипогаммаглобулинемии младенцев.
47. 47. Способ по любому из пп.43-46, где поддающееся лечению 1д заболевание или состояние является приобретенным иммунодефицитом, вторичным по отношению к гемобластозам, и гемобластоз выбран из хронического лимфолейкоза (СЬЬ), множественной миеломы (ММ) и неходжкинской лимфомы (ИНЬ).
48. 48. Способ по любому из пп.43-47, где поддающееся лечению 1д заболевание или состояние представляет собой воспалительное или аутоиммунное заболевание, и воспалительное или аутоиммунное заболевание выбрано из болезни Кавасаки, хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии, синдрома Гийена-Барре, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, полимиозита, дерматомиозита, миозита с тельцами включения, миастенического синдрома Ламберта-Итона, мультифокальной моторной нейропатии, миастении и синдрома Мерч-Вольтмана.
49. 49. Способ по любому из пп.43-48, где поддающееся лечению 1д заболевание или состояние представляет собой острую бактериальную, вирусную или грибковую инфекцию, и острая бактериальная, вирусная или грибковая инфекция вызвана одним из НаешорЫ1и8 шЛиеп/ае типа В, Ркеиботоиак аегищиока типа А и В, §1арйу1ососси8 аигеик, стрептококками группы В, пневмококками типов 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, 23, аденовирусами типов 2 и 5; цитомегаловирусом, вирусом Эпштейна-Барр УСА, вирусом гепатита А, вирусом гепатита В, вирусом простого герпеса-1, вирусом простого герпеса-2; вирусом гриппа А, вирусом кори, вирусом парагриппа типов 1, 2 и 3, вирусом полиомиелита, вирусом ветряной оспы, АкретдШик и СаиШба А1Ысаи8.
50. 50. Способ по любому из пп.43-49, где поддающееся лечению 1д заболевание или состояние выбрано из ятрогенных иммунодефицитов, острого рассеянного энцефаломиелита; АИСА-положительного системного некротического васкулита, аутоиммунной гемолитической анемии; буллезного пемфигоида, рубцового пемфигоида; синдрома Эванса; фетоматеринской/неонатальной аллоимунной тромбоцитопении; гемофагоцитарного синдрома, состояния, вызванного трансплантацией аллогенных гемопоэтических стволовых клеток с высоким риском, 1дМ парапротеиновой невропатии, состояния, вызванного трансплантацией почки, рассеянного склероза, опсоклонус-миоклонус атаксии, листовидной пузырчатки, обыкновенной пузырчатки, посттрансфузионной пурпуры; токсического эпидермального некролиза/синдрома Стивена Джонсона, синдрома токсического шока, болезни Альцгеймера, системной красной волчанки, множественной миеломы, сепсиса, В-клеточных опухолей; паранеопластической мозжечковой дегенерации без антител и состояния, вызванного трансплантацией костного мозга.
51. 51. Применение стабильной жидкой композиции по любому из пп.1-25 и 28-35 для приготовления лекарственного средства для лечения поддающегося лечению 1д заболевания или состояния.
52. 52. Применение по п.51, где поддающееся лечению 1д заболевание или состояние выбрано из первичного иммунодефицита, вторичного иммунодефицита, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и острых инфекций.