JP5048332B2

JP5048332B2 - 特定の原子配置を有するポリマー誘導体

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Publication number: JP5048332B2
Application number: JP2006533335A
Authority: JP
Inventors: ハリス，ジェイ．ミルトン; コズロウスキ，アントニ; ピー．マクマヌス，サミュエル; ディー．ベントレイ，マイケル; エー．チャールズ，スティーブン
Original assignee: ネクターセラピューティクス
Priority date: 2003-05-23
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2024-05-21
Also published as: PT2644206T; HUE043911T2; AU2004251602A1; EA200501863A1; US7887789B2; CY1121759T1; WO2005000360A2; TR201907313T4; EP1626741A2; ES2725808T3; LT2644206T; EP2644206B1; PL2644206T3; CA2510040C; JP2007500278A; EA011351B1; ZA200505157B; WO2005000360A3; CA2510040A1; EP2644206A2

Description

発明の分野
本発明は一般に、特定の内部構造配向性(internal structural orientation）を含んで成る新規ポリマー試薬、並びにこれらの新規ポリマー試薬の結合体に関連する。加えて、本発明は、当該ポリマー試薬を合成するための方法及び当該ポリマー試薬を活性剤及び他の物質に対して結合させる方法に関連する。更に、本発明は、医薬調製物並びに前記結合体を患者に対して投与するための方法に関連する。

発明の背景
科学者及び医者は、患者に対してデリバリーするのに適した形態に活性剤を開発する試みにおける多くの挑戦に直面する。ポリペプチドである活性剤は、往々にして、経口経路よりも注射を介して投与されている。この方法において、ポリペプチドは、胃のタンパク質分解解裂環境に曝されることなく全身循環へと導入される。しかしながら、ポリペプチドの注射にはいくつかの欠点がある。例えば、多くのポリペプチドは半減期が比較的短く、それによって注射を繰り返す必要があり、それは往々にして不都合且つ痛い。更に、いくつかのポリペプチドは、ポリペプチドを分解するために患者の免疫系が活性化されて良い１又は複数の免疫反応を誘導しうる。従って、活性剤の例えば、ポリペプチドのデリバリーは、往々にして、活性剤が注射によって投与された場合でさえも問題をはらんでいる。

活性剤を注射によりデリバリーする問題を解決することにおいていくつかの成功が達成されている。例えば、活性剤と水溶性ポリマーを結合することにより、免疫源性及び抗原性が減少したポリマー−活性剤結合体がもたらされる。加えて、これらポリマー活性剤結合剤は、腎臓を介するクリアランスの減少及び/又全身循環における酵素による分解の減少の結果として、往々にして半減期は、未結合体と比べて非常に増加している。より長い半減期を有する結果、ポリマー活性剤接合体は、頻繁に投与する回数が減り、これにより痛みのある注射及び病院を頻繁に訪れる不都合が減ることに成る。更に、ごく僅かにのみ可溶性である活性剤は、水溶性ポリマーに対して結合している場合、水中溶解性が有意に増加する。

ポリエチレングリコールは、局所及び内部使用のため、その証明されているその安全性並びにFDAによる承認により、活性剤に対して結合させられている。活性剤がポリエチレングリコール又は「PEG」のポリマーに対して結合させられている場合、この結合した活性剤は、通常「PEG化されている」とよばれる。市販されて認められているPEG化活性剤の例えば、PEGASYS（登録商標）PEG化インターフェロンα2a(Hoffmann-La RoChe,Nutley,NJ)、PEG-INTRON（登録商標） PEG化インターフェロンα2b(Schering Corp.,Kennilworth,NJ)、及びNEULASTA（登録商標）PEG-フィルグラスチム(Amgen InC.,Thuosand Oaks,CA)は、活性剤の結合形態の投与は、未結合の対を超える有意な利点を有しうる。ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン(Zalipsky(1993)BioConjug.Chem.vol.4(No.4)：pp.296〜299)及びポリ(エチレングリコール)に対して結合したフルオロウラシル(Ouchiら(1992)Drug Des.DisCov.vol.9(No.1)：pp.93〜105)も調製されている。Harrisらは、医薬に対するPEG化の効果のレビューを供している（Harrisら(2003)Nat.Rev.Drug DisCov.vol.2(No.3)：pp.214〜212）。

これらの成功にもかかわらず、水溶性ポリマーの活性剤に対する結合には課題が残っている。かかる課題は、活性成分を比較的長いポリエチレングリコール分子に対して結合することによる活性剤の脱活性化である。比較的ン外ポリエチレングリコール分子は、より高い溶解度を有する対応する活性剤ポリマー結合体を提供するだろうが、かかる長いポリエチレングリコール分子を担持する結合体は、in vivoで実質上不活性であることが知られている。これらの結合体は、相対的なポリエチレングリコール鎖の長さ(それは活性剤全体周辺を有効に「ラッピング」し、それにより活性のために必要な有効なリガンドに対するアクセスを遮断する)により、不活性であると仮説立てられる。

比較的巨大なポリエチレングリコール成分を担持する不活性結合体に関連した問題は、一部、「枝分かれ」形態のポリマーを使用することにより解決する。かかる「枝分かれ」形態のポリマーの例は、Harrisらの米国特許第5,932,462号に記載されている。本明細書中で記載のように、「mPEG2-N-ヒドロキシスクシンイミド」は、生物学的に活性のあるタンパク質上でアクセス可能なアミノ基(例えば、コンフォメーション構造により物理的に遮断されていないアミノ基)に対して結合されて良い。この枝分かれしたポリマー(約４０,０００Daの分子量を有する)は、Nektra TherapeutiCs(Huntsvill,AL)から入手可能であり、そして以下の構造：

(式中、PEG₂₀kは、分子量約２０，０００Daを有するメトキシ末端キャップドポリエチレングリコール誘導体である)
を有する。

この枝分かれしたポリマーをインターフェロンα-2aに結合させることにより、インターフェロンα-2aを当該ポリマーに対して結合させるアミド結合を含む結合体がもたらされる。概略として、当該結合体は、次のように表されうる。

この結合体は、PEG化インターフェロンα-2aのPEGASYS（登録商標）ブランドとして入手可能であり、成人のC型肝炎を治療するために示されている。

代わりに、枝分かれしたポリマーを使用することは、比較的巨大なポリマーに関連した問題、有用な結合体を調製することに対する他の持続するいくつかの課題を解決しうる。例えば、結合体のin vivo分解速度は往々にして許容できないほどに長すぎるかあるいは短すぎる。詳細に、in vivo分解速度は一般に(必ずではないが)、活性剤をポリマーに対して結合させる一組の原子のいくつかの部分における加水分解の速度によって支配されている。従って、比較的迅速な加水分解速度によりin vivo半減期が非常に短すぎて許容できない結合体をもたらし、その一方で、比較的遅い加水分解は、in vivo半減期が非常に長すぎて許容できない結合体をもたらしうる。結果的に、独特の炭素の組(ポリマー自身並びに対応する接合体の両方において)を有するポリマーは、独特の加水分解速度をもたらすことがき、それは順番に結合体の分解のin vivo速度に影響を与える。

所定の活性剤とmPEG2-N-ヒドロキシスクシンイミドの結合体の加水分解は、代謝産物の１つが約２０，０００Daの分子量を有することを前提とすれば、１つのmPEG「枝」を他のものに対して連結する原子の鎖において生じる。かかる解裂のための原子の鎖における位置は、ポリマー中mPEG部分の１つに近接して位置する

成分内にある。この

成分は解裂のための最も可能性ある部分であり、その理由は、１つのmPEG枝を他に対して連結する鎖中の他の原子のみが、メチレン基を含んで成る一組の炭素原子であり、メチレン基は、

成分よりもin vivo分解に対して比較的一層安定だからである。解裂により分離されたポリマーの形態はmPEG-OHである。従って、少なくともある部分において、独特の加水分解速度をもたらす、mPEG-OHを形成させることが好ましい。

しかしながら、加水分解速度を「カスタマイズ」できうるようなポリマーを提供することが望ましい。例えば、PEG化インターフェロンα-2aの典型的な週間投与について、加水分解速度がより遅いことで、投与する間の期間が長くなりさえもする。加えて、in vivo半減期が長すぎる結合体は、当該結合体の加水分解に対する感受性を高めることによって向上させられて良い。

独特の加水分解速度を有するポリマーの拡大されたパレット(expanded palette)は、研究者及び科学者が活性剤ポリマー結合体を「カスタマイズ」し、(とりわけ)水溶性及び/又はin vivoでの分解の速度を所望なように増加できるようにするだろう。更に、独特の加水分解速度を有するポリマーは、枝分かれポリマーに対してのみ使用されて良いのみならず、他の形態(例えば、線状又は腕が多数ある)にも使用されて良い。従って、「カスタマイズ」された分解速度を供するために独特の原子の組を(とりわけ)提供するポリマーに対する要請が残っている。出願人の最も知るところによれば、本明細書中で記載のポリマー、結合体、調製物、及び方法は新規であり且つ当業界での提示は完全にない。

従って、本発明の目的は、構造：

(式中、「水溶性ポリマー」とは水溶性ポリマーであり、各「−＼＼−」は独立して、直接共有結合又はスペーサー成分を示し；R¹はHであるかあるいは有機基であり；そしてZは反応性の基である)
を含んで成るポリマー試薬を提供することである。式（Ｉ）に記載したように、水溶性ポリマーは、

成分の窒素原子に対して近接しており、そして反応性基のZは、

成分のカルボニル炭素原子に対して近接している。

成分を担持するポリマー成分は本発明によって包含されているが、酸素原子を

のカルボニル炭素原に近接して有し、それによって、往々にして「カルバメート」又は「ウレタン」基と呼ばれる、

がもたらされることが好適である。他の官能基がポリマー試薬内又はポリマー試薬上に存在していても良い。

本発明の他の目的は、R¹がHであるポリマー試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、イオウ原子が

成分のカルボニル炭素原子に対して結合しており、それによって

成分がもたらされるポリマー試薬を提供することである。

本発明の更なる目的は、−N(R²)−成分が、

成分のカルボニル炭素原子に対して結合しており、それによって、R²がH又は有機基である

成分を供するポリマー試薬を提供することである。

本発明の更なる目的は、水溶性ポリマーがポリ(アルキレンオキシド)である、ポリマー試薬を提供することである。

本発明の更なる目的は、上記ポリマー試薬を調製するための方法であって：
(i)保護された反応性基又は反応性基に対する前駆体及び１又は複数のヒドロキシル基を含んで成る前駆体分子を提供し；
（ii）酸前駆体分子の１又は複数のヒドロキシル基の少なくとも１つをアミノ基との反応のために活性化し、活性化させた前駆体分子を形成し；
（iii）共有結合する条件下で、１又は複数の活性化させたヒドロキシル基の少なくとも１つを、アミノ基を有する水溶性ポリマーと接触させ、それによって水溶性ポリマー部分及び保護された反応性基又は反応性基に対する前駆体を含んで成るポリマーを形成させ；そして
（iv）保護された反応性を、存在する場合、脱保護する
段階を含んで成る。

本発明の更なる目的は、水溶性ポリマー、

成分、及び医薬的に許容できる活性剤を含んで成り、ここで
(i)当該水溶性ポリマーは、直接共有結合を介して又は第一のスペーサー成分を介して

成分の窒素原子に対して結合しており；
(ii)薬理活性剤は、直接共有結合又は第二のスペーサー成分を介して

成分のカルボニル炭素原子に対して結合しており；そして
(iii)R¹はHであるかあるいは有機基である、
ポリマー結合体を提供することである。

本発明の更なる目的は、本明細書中にで提供したようなポリマー試薬を活性剤剤と適切な条件下で接触させて結合体を形成さる段階を含んで成る結合体を提供することである。典型的に、活性剤は当該ポリマーに対して、当該ポリマー試薬と活性剤上の官能基(例えば、アミン)間の反応を介して結合する。

本発明の更なる目的は、本明細書中に記載のような活性剤−ポリマー結合体を医薬賦形剤との組み合わせにおいて提供することである。

本発明の更なる目的は、治療上有効な量の本明細書中に記載のような活性剤−ポリマー結合体を投与する段階を含んで成る薬理活性剤をデリバリーするための方法を供することである。

本発明の更なる目的、利点及び新規特徴は、以下の記載に開示されており、ある部分において、次のとおり、当業者に明らかになるだろう。

一の実施態様において、ポリマー試薬が提供されており、それは水溶性ポリマーと反応性基との間に位置する

成分を含んで成り提供されている。内部構造配置は、従って、(ｉ)

成分中の窒素が水溶性ポリマーの近傍にあり、(ii)

成分中のカルボニル炭素が反応性基の近傍に位置し、そして(iii)R¹がH又は有機基であり、当該有機基は典型的に、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールであるからなる群から選択されている。

本発明のポリマー試薬は、水溶性ポリマー、

成分、及び反応性基をも含んで成り、ここで(i)水溶性ポリマーは、直接共有結合を介して又は第一のスペーサー成分のいずれかを介して

成分の窒素原子に対して結合しており；(ii)当該反応性基は、
直接共有結合を介して又は第二のスペーサー成分のいずれかを介して

成分のカルボニル炭素原子に対して結合しており；そして(iii)R¹は先に規定のとおりである。

本発明のポリマー試薬に関して、任意の水溶性ポリマーがポリマー試薬中の水溶性ポリマーとして働き、そして本発明は、この点に関して限定がない。しかし好適なポリマー、は１つの末端をエンドキャッピングされている。加えて、約１２０，０００Da未満の平均分子量を有するポリマーが好適である。

他の実施態様において、本発明のポリマー試薬を調製する方法が供されている。簡潔に、当該方法は、保護された反応性基から成る前駆体分子又は反応性基に対する前駆体及び１又は複数のヒドロキシル基を含んで成る前駆体分子を提供することを伴う。前駆体分子の１又は複数のヒドロキシル基の少なくとも１つが活性化され(それにより活性化された前駆体分子が形成される)、従って１又は複数のヒドロキシル基はアミノ基と反応するだろう。この後、活性化された前駆体分子は共有結合条件下に置かれ、そしてアミノ基を有する水溶性ポリマーと接触させられ、それによって２者が化学的に反応する。この次の反応により、水溶性ポリマーと活性化した前駆体分子間での共有結合の形成がもたらされ、それは順に水溶性ポリマー部分と保護された反応性基又は反応性基に対する前駆体を含んで成るポリマーを形成する。典型的に、このポリマーは、所望の反応性基を伴うポリマーを機能化させるために更に様々な試薬と反応させられて良い。前駆体分子が保護された反応性基を含んで成る場合、この方法は、反応性基を保護する基を除去する脱保護段階を有利に含んで成る。任意に、ポリマーを単離するための段階は、ポリマーがより純粋な形態において供給されて良いように行われている。

本発明の更なる他の実施態様において、結合体は、水溶性ポリマー、

成分、及び活性剤を含んで成り提供されており、ここで(i)当該水溶性ポリマーは、直接共有結合を介して又は第一のスペーサー成分のいずれかを介して

成分の窒素原子に対して結合しており；(ii)当該薬理活性剤は、
直接共有結合を介して又は第二のスペーサー成分のいずれかを介して

のカルボニル炭素原子に対して結合しており；そして(iii)R¹はH又は有機基である。有利に、本明細書中において供されているポリマー試薬に対して共有結合して良い全ての活性剤は、使用されている特定の活性剤に限定されない。

本発明の更なる実施態様において、結合体を調製する方法が提供されており、当該方法は、本明細書中で提供されたようなポリマー試薬と活性剤を、結合体を提供するためにて適した条件下で反応させる段階を含んで成る。

本発明の更に他の実施態様において、医薬製剤が提供されており、それは本発明の結合体を医薬賦形剤との組み合わせにおいて含んで成る。当該医薬製剤は、全ての型の製剤を包含し、そして特に注射に適した、例えば再生されて良い粉末など並びに懸濁及び溶液の形態を含んで成る。

本発明の更なる実施態様において、結合体を投与するための方法が提供されており、当該方法は、患者に対して本明細書に供された治療上有効な量の結合剤を投与する段階を含んで成る。典型的に、必ずではないが、当該結合体は、医薬製剤の一部として提供されている。結合体を投与するための任意の方法が使用され、そして本発明は、これに関して限定されない。しかしながら、好適な実施態様において、結合体は注射を介して投与されている。

本発明を詳細に述べる前に、本発明は特定のポリマー、合成技術、活性剤に限定はされず、多彩であることを理解されたい。

本明細書及び特許請求の範囲において使用されている場合、単数形態の「a」、「an」及び「the」は、背景において特に規定されていない限り複数をも含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「ポリマー」については単一ポリマー並びに２以上の同じ又は異なる結合体を意味し、「賦形剤」については、単一の賦形剤並びに２以上の同じ又は異なる賦形剤などを意味する。

本発明を説明及び主張することにおいて、以下の用語が次の定義に従い使用されるだろう。

「PEG」又は「ポリエチレングリコール」及び「ポリ(エチレングリコール)」とは、本明細書中で使用されている場合、任意の水溶性ポリ(酸化エチレン)を包含し、そして同義的に使用されている。典型的に、PEGは、本発明中で使用されるために「−(OCH₂CH₂)_m」又は「−O(CH₂CH₂O)_m」を含んで成り、ここで_mは２〜４０００であり、そしてPEG全体の末端基及び構造は多彩でありうる。本明細書中に記載した場合、PEGは、末端の酸素が置換されているか否かに依存して「CH₂-CH₂-O(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂」及び「-(CH₂CH₂O)_m-」をも含む。PEGが更にスペーサー成分を含んで成る場合(下に詳細に記載にされている)、スペーサー成分を含んで成る原子が水溶性ポリマーに対して共有結合している場合、酸素-酸素結合(即ち、「−O−O−」又は過酸化結合)の形成をもたらさない。明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、「PEG」は様々な末端構造又は「エンドキャッピング」基などを有する構造を含むことを思い出すべきである。「PEG」とは、大多数、即ち５０％超のサブユニットが-CH₂CH₂O-であることを意味する。一つの通常使用されるPEGは、末端をキャッピングされているPEGである。本発明において使用される特異的PEGの形態としては、様々な分子量、構造又は幾何学(例えば、枝分かれ、直線状、分岐したPEG、多官能性、多量体など)を有するPEGであり、下に更なる詳細が記載されている。

用語「エンドキャップ」又は「末端キャップ」とは、本明細書中、同義的に使用されており、末端キャッピング成分を有する末端(terminal)又は末端(endpoint)を意味する。典型的に、PEGに関して、エンドキャッピング成分とは、ヒドロキシ又はC₁〜₂₀アルコキシ基を含んで成る。従って、エンドキャッピング成分の例としては、アルコキシ(例えば、メトキシ、エトキシ及びベンジルオキシ)、並びにアリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロなどが挙げられる。末端ヒドロキシ基及びアルコキシ基は、構造が伸びている場合、どのようにして繰り返し酸化エチレンモノマーが規定されているか［例えば、「−(OCH₂CH₂)m」又は「CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)m-CH₂CH₂-」］に依存して、繰り返し酸化エチレンモノマーが繰り返し酸化エチレンモノマーの末端酸素原子が含まれて良いことが思い出されるべきである。加えて、前記エンドキャッピング成分の飽和、不飽和、置換及び未置換形態各形態が描かれている。更に、エンドキャッピング基は、シラン又は脂質(例えば、リン脂質)であっても良い。エンドキャッピング基は検出可能な標識をも有利に含んで成る。ポリマーが検出可能な標識を含んで成るエンドキャッピング基を有している場合、注目のポリマーが結合するポリマー及び/もしくは成分(例えば、活性剤)の量もしくは位置は、適切な検出装置を使用することによって特定されて良い。かかる標識としては、限定されないが、蛍光成分、化学発光成分、酵素を標識することにおいて使用される成分、比色分析(例えば、色素)、金属イオン、放射活性成分などが挙げられる。適切な検出装置としては、測光器、フィルム、スペクトロメーターなどが挙げられる。

ポリマーに関して、「天然には生じない」とは、ポリマーのその実体が天然においては発見されないことを意味する。しかし、天然には生じないポリマーは、全体的なポリマー構造が天然において発見されない限り、天然に生じる１又は複数のサブユニット又はサブユニットの断片を含んで良い。

用語「水溶性」とは、「水溶性ポリマー」にあるように、室温で水中に溶解性である水溶性のポリマーである。典型的に、水溶性ポリマーの溶液は、当該溶液をろ過した後に、約７５％以上、一層好適には、約９５％以上の光を透過するだろう。重量に基づいて、水溶性ポリマー又はそのセグメントは、好適に、水中に３５％(重量で)以上可溶性である、一層好適には水中に約５０％(重量で)以上可溶性である、更に一層好適には水中に約７０％(重量で)以上可溶性であり、そして一層好適には水中に約８５％(重量で)以上可溶性である。しかし、水溶性ポリマー又はセグメントは水中で約９５％(重量で)又は完全に水中に可溶性である。

本発明の水溶性ポリマーの背景において、例えば、PEGの分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれかとして表されて良い。特に他に断りがない限り、本明細書中で分子量に関する全ての参照は、重量平均分子量を意味する。分子量の決定、即ち、数平均及び重量平均は、ゲル透過型クロマトグラフィー又は他の液体クロマトグラフィー技術を使用することで測定されて良い。分子量値を測定するための他の方法も使用されて良く、例えば、平均分子量数を特定するためにエンド基分析の使用又は束一的な特性(例えば、フリーズ−ピント(Freezing-point depression)沈着、沸点評価、又は浸透圧)又は重量平均分子量を特定するために光散乱技術、超遠心もしくは粘度計が使用されて良い。本発明のポリマー試薬は典型的に多分散性であり(即ち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量は等しくない)、約１．２未満の低分散性の多分散性値、一層好適には、約１．１５未満、更に好適には約１．１０未満、更になお好適には、約１．０５未満、そして好適には約１.０３未満を有するように処理する。

本明細書中で使用されている場合、「カルボン酸」とは、官能基

［又は「−COOH」又は「−C(O)OH」として表されている］成分を有する成分、並びにカルボン酸の誘導体であり、かかる誘導体としては、例えば、保護されたカルボン酸が挙げられる。従って、特に断りがない限り、用語「カルボン酸」には、酸形態のみならず、対応するエステル及び保護形態も含まれる。カルボン酸の保護基及び他の保護基の例は、Greene ら“PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,”第6,第3版,John Wiley and Sons, Inc., New Yorkl, 1999（P.454〜493）に記載されている。

用語「反応性」又は「活性化した」とは、特定の官能基と共に使用された場合、他の分子上で求電子試薬又は求核試薬と容易に反応する反応性官能基を意味する。これは、反応をするために、強力な触媒又は非常に実用的ではない反応条件を必要とする基(即ち、「反応性がない」又は「不活性」基)のものとは対照的である。

用語「保護」、「保護基(protecting group)」及び「保護基(protective group)」とは、所定の反応条件下で、分子中に存在する特定の化学反応性官能基の反応を妨害又は遮断する成分(即ち、保護基)が存在することを意味する。保護基は、保護されている化学反応基の種類並びに使用される反応条件及びもしあれば、更なる反応又は保護基が存在に依存して変化して良い。当業界で公知の保護基は、上記Greeneらにおいて発見することができる。

「活性化されたカルボン酸」とは、親カルボン酸よりも反応性である、詳細には、求核性アシル置換基に対して一層反応性であるカルボン酸の機能的誘導体を意味する。活性化されたカルボン酸としては、限定されないが、酸ハロゲン化物(例えば、酸塩化物)、無水物、アミド及びエーテルが挙げられる。

本明細書中で使用したように、用語「官能基」又はその同義語は、その保護形態も包含する。

用語「スペーサー」及び「スペーサー成分」とは、本明細書中で使用されている場合、水溶性ポリマー部分と官能基の末端などの成分を相互連結するために任意に使用されている原子又は原子の集まりをいう。スペーサー成分は、加水分解に対して安定であるかあるいは生理学的加水分解可能又は酵素的分解可能な結合を含みうる。

「アルキル」とは、炭化水素鎖、典型的には長さ約１〜２０原子の炭化水素鎖をいう。かかる炭化水素鎖は、好適であるが、必ずではなく、飽和しており、そして枝分かれしている又は直鎖状であって良いが、典型的には直鎖が好適である。アルキル基の例としては、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル(即ち、２−ペンチル)、１−エチルプロピル(即ち、３−ペンチル)、３−メチルペンチルなどが挙げられる。本明細書中で使用した場合、「アルキル」とは、３以上の炭素原子が引用されている場合、シクロアルキルを含む。

「低級アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を含み、そして直鎖状又は枝分かれであって良いアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ-ブチル、イソブチル、及びtert−ブチルが挙げられる。

「シクロアルキル」とは、３〜約１２個の炭素原子、一層好適には、３〜約８個の炭素原子からなる飽和又は未飽和環状炭化水素鎖の例えば、ブリッジ、融合、又はスピロ環状化合物をいう。

「干渉しない置換基」とは、分子中に存在する場合、典型的に当該分子中に含まれる他の官能基と反応性ではない基をいう。

用語「置換」とは、例えば、「置換されたアルキル」にあるように、１又は複数の干渉しない置換基の例えば、限定ではないが：C₃〜C₈シクロアルキルの例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど；ハロの例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨード；シアノ；アルコキシ、フェニル；置換されたフェ二ルなどにより置換されている成分(例えば、アルキル基)を意味する。「置換されたアリール」とは、置換基のような１又は複数の干渉しない基を有するアリールである。フェニル環上での置換について、置換基は、任意の位置(即ち、オルト、メタ又はパラ)であって良い。

「アルコキシ」とは−O−R基を意味し、ここでRはアルキル又は置換されたアルキルであり、好適にC_１〜C₂₀アルキル(例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ベンジルオキシなど)、好適にはC₁〜C₇でアルキルある。

本明細書中で記載した場合、「アルケニル」とは、枝分かれした又は枝分かれしていない長さ１５原子の炭化水素基を意味し、二重結合を１つ以上含み、例えば、エテニル、n−プロペニル、イソプロペニル、n-ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデシルなどが挙げられる。

用語「アルキニル」とは、本明細書中で使用されている場合、長さ２〜１５原子の枝分かれした又は枝分かれしていない炭化水素基を意味し、三重結合を１つ以上含み、例えば、エチニル、n−ブチニル、イソペンチニル、オクチニル、デシニルなどが挙げられる。

「アリール」とは、それぞれが５又は６個の中心炭素原子を有する１又は複数の芳香族環を意味する。アリールとは、ナフチルにあるように縮合していて良い、又はビフェニルにあるように融合していなくとも良い多数のアリール環を意味する。アリール環は１又は複数の環状炭化水素、ヘテロアリール、又は複数環と結合している又は結合していなくとも良い。本明細書中で使用した場合、「アリール」にはヘテロアリールが挙げられる。

「ヘテロアリール」とは、１〜４個のヘテロ原子、好適には、O、N、又はSもしくはその組み合わせを含むアリール基である。ヘテロアリール基は、１又は複数の環状炭化水素、ヘテロ環、アリール、又はヘテロアリール環と融合しても良い。

「複素環」又は「複素環式（Heterocyclic）」とは、不飽和又は芳香族特性が有無であり且つ炭素ではない原子を１つ以上有する、５〜１２個の原子、好適には５〜７個の原子の１又は複数の環を意味する。好適なヘテロ原子としては、イオウ、酸素及び窒素が挙げられる。

「置換されたヘテロアリール」とは、置換基として、１又は複数の干渉しない基を有する基である。

「置換された複素環」とは、干渉しない置換基により形成された１又は複数の側鎖を有する複素環を意味する。

「求電子物質」とは、イオンもしくは原子もしくは原子の集合を意味し、それはイオン性であって良く、求核物質と反応することができる求電子性の中心、即ち、電子を求める中心を有する。

「求核物質」とは、イオンもしくは原子もしくは原子の集合を意味し、それはイオン性であって良く、求核物質を求めることができる求電核性の中心、即ち求核性の中心である中心を有する。

「生理学的に解裂可能」もしくは「加水分解可能」もしくは「分解可能」な結合とは、生理条件下で水と反応する(即ち、加水分解される)比較的弱い結合である。結合の水中での加水分解傾向は、一般に、２つの中心原子を連結する一般の結合の種類に依存するのみでなく、それら中心原子に対して結合した置換基にも依存するだろう。適切な、加水分解に不安定又は弱い結合としては、限定されないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケトン、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。

「酵素により分解可能な結合」とは、１又は複数の酵素によって分解に委ねられる結合である。

「加水分解安定」な結合(linkage)又は結合(bond)とは、化学的な結合の、典型的に共有結合を意味し、それは実質的に水中で安定であり、即ち、長期に渡りなんら分かる程度に、生理的な条件下で加水分解を受けない結合を意味する。加水分解に安定な結合の例としては、限定ではないが、次のものが挙げられる：炭素−炭素結合(例えば、脂肪族鎖)、エーテル、アミド、ウレタンなどである。一般に、加水分解に安定な結合とは、生理条件下で約１〜２％未満の加水分解率を示すものである。代表的な化学結合の加水分解率は、標準的な化学の教科書において発見されて良い。

用語「活性剤」又は「生物活学的に活性のある剤」及び「薬理活性剤」は、本明細書中同義的に使用されており、そして往々にして有利なin-vivo又はin-vitroで証明されて良い薬理効果、効果を供する、全ての剤、薬物、化合物、物質又は混合物の組成物を含むことを規定している。これには、食品、食品補助剤、栄養剤、栄養補助剤、薬物、ワクチン、抗体、ビタミン及び他の有利な剤が挙げられる。本明細書中で使用されている場合、これらの用語には更に、患者において局所的又は全身的な効果を生み出す生理学的又は薬理学的に活性のある物質が含まれる。

「医薬的に許容できる賦形剤」及び「医薬的に許容できる担体」とは、本発明の組成物中に含まれて良く且つ患者に対して有意な悪影響を及ぼさない賦形剤をいう。

「薬理学的に有効な量」、「薬生理学的に有効な量」及び「治療上有効な量」とは、所望のレベルの活性剤及び/又は結合体を血流中で又は標的組織中で提供するために必要である、ポリマー−活性剤結合体の量、すなわち、典型的には医薬製剤中に存在する量を意味するために同義的に使用されている。正確な量は、多くの因子の例えば、粒状活性剤、医薬製剤の成分及び物理的特性、目的とされた患者集団、患者の懸念に依存するだろうし、そして当業者によって、本明細書中に供された情報及び関連文献から入手可能な情報に依存して容易に決定されて良い。

本発明の背景において、「多官能性」とは、官能基を３個以上有するポリマーを意味し、ここで当該官能基は同じ又は異なっていて良い。本発明の多官能性ポリマーは典型的に約３〜１００個の官能基を、又は３〜５０個の官能基を、又は３〜２５個の官能基を、又は３〜１５個の官能基を、又は３〜１０個の官能基を、又は３、４、５、６、７、８、９又は１０個の官能基をポリマー骨格中に含むだろう。「二官能性」ポリマーとは、２個の、同じ(即ち、ホモニ官能性)又は異なる(即ち、ヘテロ二官能性)官能基がその中に含まれているポリマーを意味する。

ポリマーの幾何学的又は全体構造について「分岐」とは、１つのポリマー「腕」(即ち、単一の水溶性ポリマー)を有する二官能性ポリマーを意味し、ここで、両方の官能基は、枝分かれする原子として働く原子に対して結合(直接もしくは１もしくは複数の原子を介して)している二官能性ポリマーを意味し、それは順番に水溶性ポリマーに対して(直接又は１又は複数の原子を介して)結合している。

「枝分かれした」とは、ポリマー又はポリマーの全体構造に対して引用された場合、２以上のポリマーの「腕」を有するポリマーを意味する。枝分かれしたポリマーは、２つのポリマー腕、３つのポリマー腕、４つのポリマー腕、６つのポリマー腕、８つのポリマー腕、又は腕をそれ以上の腕有しうる。一つの特定の高度に枝分かれしたポリマーは、デンドリチックポリマー又はデンドリマーであり、本発明の目的のために、それは、枝分かれしたポリマーとは異なる構造を有するものであると考えられている。

「デンドリマー」又は「デンドリチックポリマー」は球状の、全ての結合が中心の重要な点又は核から、一定の枝分かれパターン及び各枝分かれ点に寄与する繰り返し単位を伴い放射状に現れるサイズ単分散性ポリマーである。デンドリマーは、所定の樹状特性の例えば、コアの包み込みを示し、それらを特異的な他の形態のポリマー、例えば、枝分かれしたポリマーにする。

本明細書中に記載の塩基性及び酸性反応性物質には、中性、帯電した及び任意の対応するその塩の形態が挙げられる。

用語「患者」とは、本明細書中で記載の結合体を投与することによって予防又は治療されて良い症状を患う又は傾向を有する生物を意味し、そしてヒト及び動物の両方を含む。

「有機基」とは、共有結合により他の原子に対して結合して良い炭素含有成分を意味する。有機基の例としては、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択されたものが挙げられる。

「任意」又は「任意に」とは、副次的に記載された環境が生じうる又は生じず、従って、当該記載は、所定の環境が生じる場合及びそれが生じない場合を含む。

本明細書中で使用された場合、「ハロ」識別子（例えば、フルオロ、クロロ、ヨード、ブロモなど）は、ハロゲンが分子に対して結合している場合に一般に使用されており、ここで接尾辞「イド（ide）」（例えば、フルオリド、クロリド、ヨージド、ブロミドなど）はイオン形態が使用されており、ハロゲンがその独立イオン形態（例えば、脱離基が分子を脱離する場合）において存在する場合に使用されている。

本発明の背景において、構造又は式に関して与えられている様々な定義は、背景により他の規定がない限り、様々な構造において繰り返されていることを認識すべきである。従って、ポリマー試薬について例えば、定義「POLY」、「スペーサー成分」、「（Z）」などは、本明細書中に定義された水溶性ポリマー結合体に対して同等に適用可能である。

次いで、本発明の最初の実施態様において、独特のポリマー試薬が提供されている。理論に束縛されることが望まれないが、出願人は、本明細書中に記載のポリマー試薬の個々の特性は、原子の独々の配向性が原因となっていると考えている。例えば、本明細書中に記載のポリマー試薬が、活性成分に対して結合して結合体を形成する場合、in vivoでの加水分解の速度は、同じ原子を有するが、異なる配列において並べられている結合体の加水分解の速度とは異なる。加水分解の代替速度（alternative）を供することに加えて、本明細書中に記載のポリマー試薬は、従来技術のポリマー試薬を超える更なる利点を有する。

本発明のポリマーは、詳細な態様に概略を示した３つの個別の成分を含んで成る。これら３つの成分は、次の通りである：繰り返しモノマー単位を含んで成る水溶性ポリマー；カルボニルの炭素原子に対して共有結合した窒素原子を含んで成る成分；及び反応性基である。ポリマーの３つの成分は、特異的な配向がなされており、従って、前記成分の窒素原子は、ポリマーの繰り返しモノマー部分に対して近接しており、しかも炭素原子は反応性基に対して近接している。本発明の背景において「近接」とは、空間又は絶対配置の観点において最も近いというよりも、原子を結合する最も近接した経路(Closest path)についで、「最も近い」ことをいうが解されるだろう。

従って、ポリマーは概略的に次の式で示されて良い。

（式中、「水溶性ポリマー」とは、繰り返しモノマーユニットを含んで成る水溶性ポリマーであり；各「−＼＼−」は独立して共有結合又はスペーサー成分に対して向けられており；R¹はH又は有機基であり；そしてZは反応性基である）。

式Iにおいて記載されているように、

成分の窒素は、水溶性ポリマーに対して近接しており、そしてカルボニルの炭素原子は、反応性基「Z」に対して近接している。

従って、本発明のポリマー試薬は、水溶性ポリマーと反応性基との間に位置する

成分を含んで成り、ここで：（i）

成分中の窒素原子は、水溶性ポリマーに対して近接しており；
（ii）

成分中のカルボニル炭素原子は、反応性基に対して近接しており；そして（iii）R¹は先に記載の通りである。水溶性ポリマーは、直接共有結合を解して又は第一スペーサー成分のいずれかを介して

成分の窒素原子に対して結合している。反応性基は、

成分のカルボニル炭素原子に対して、直接共有結合又は第二のスペーサー成分のいずれかを介して結合している。

加えて、本発明のポリマー試薬は、水溶性ポリマー、

成分、及び反応性基を含んで成るように記載されており、ここで：（i）水溶性ポリマーは、

成分の窒素原子に対して直接共有結合又は第一スペーサー成分のいずれかを介して近接しており；（ii）反応性基は

成分中の窒素原子に対して、直接共有結合を解して又は第二スペーサー成分のいずれかを介して結合しており；そして（iii）Rは、先に記載の通りである。

成分（式中、R¹はHである又は有機基である）は、単独考慮した場合アミド成分でありそして隣接する原子とは異なる。しかし、ポリマー中

成分は、より巨大な構造の一部であることを思い出さなければならない。例えば、酸素原子は、好適に、

成分のカルボニル炭素原子に対して直接結合しており、それによって

成分が供され、それは往々にして「カルバメート」又は「ウレタン」に言及されている。類似して、イオウ素原子は、

成分のカルボニル炭素原子に対して任意に結合していて良く、それによって

成分が提供される。加えて、−N(R²)−成分は、

成分のカルボニル炭素に対して結合して良く、それによって

成分が提供され、ここで、R²はH又は有機基である。最後に、

成分を参照した場合、

成分は置換されて良く、従って、本発明は

成分に単に限定されない。

本明細書中で、以降化学構造を記載する目的で、

成分が参照されるだろう。本発明の目的において、しかし

成分(式中、酸素原子はカルボニル炭素原子に対して結合していない)、

成分、

成分、

成分、及び

成分は、

が参照されている場合に、置換されて良い。

成分に関して、窒素原子の一つの結合は、隣接するカルボニル炭素の炭素原子（カルボニル炭素）に対して結合しており、他の原子は、水溶性ポリマーに対して又はスペーサー成分のいずれかに対して直接結合し、そして第三の結合は、置換基「R¹」に対して結合する。R¹は、任意の干渉しない置換基である。R¹は、典型的に、必ずではないが、H又は有機基である。しかし、R¹がHであることが好適である。R¹が有機基であるこれらの場合、好適な有機基としては、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択されたものが挙げられる。好適な有機基の詳細な例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、seC-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tertペンチル、及びピペリドニルからなる群から選択されたものが挙げられる。

脱離基に関して、「Z」は、適切な条件下で適切な試薬と反応する全ての基である。好適な反応性成分としては、求核物質及び求電子試薬からなる群から選択されたものが挙げられる。かかる反応性基としては、ヒドロキシ（−OH）、エステル、エステル、オルトエステル、カルボネート、カルボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、ケトン、ビニルケトン、ケトン水和物、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオケタールヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、ジチオケタール、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、スルホン、スルホン、アミン、ヒドラジド、チオール、ジスルフィド、チオールハイドレート、カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド

、スクシンイミド

ベンゾトリアゾール

、ビニルスルホン、クロロエチルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、チオスルホネート、トレシレート、シラン、-(CH₂)_rCO₂H、-(CH₂)_r'CO₂NS、-(CH₂)_r'CO₂Bt、-(CH₂)_rCH(OR)₂、-(CH₂)_rCHO、-(CH₂)₂-NH₂、-(CH₂)_rM、-(CH₂)_r-S-SO₂-R、(式中(r)は1〜12であり(r')は0〜5でありRはアリーリ又はアルキルであり、NSはN-スクシニミジルであり、Btは1-ベンゾトリアゾリルであり、そしてMはN-マレイミジルである)並びに前者の全ての保護された形態及び活性化形態からなる群から選択されている。

全ての反応性基、及び特にマレイミド及びアルデヒドに関して、任意のリンカーを、反応性基をポリマーに対して結合させることができる。従って、例えばリンカーは反応性基をスペーサー成分又は枝分かれ成分(存在する場合)に対して結合させることができる。加えて、スペーサー成分も枝分かれ成分も存在しない場合、リンカーは反応性基を

成分のカルボニル炭素に対して直接結合させることができる。リンカーは、炭素原子を４個以上含んで成る直鎖状飽和非環式炭化水素の例えば、テトラメチレン、ペンタメチレン、及びヘキサメチレン、並びに炭素原子を４個以上含んで成る枝分かれした飽和非環式炭化水素を含んで成る。一つの実施態様において、結合の炭化水素部分は、構造-（CR₃R₄）_g-（式中、R³は独立してH、アルキル、又はシクロアルキルであり、各R⁴は、独立してH、アルキル、又はシクロアルキルであり、そして（g）は、３〜約２０であり、好適には４〜約１２である）。好適な実施態様において、各R³とR⁴はHである。枝分かれ非環式炭化水素実施態様において、立体障害を最小にするため、反応性基（例えば、マレイミド）に対して最も近い２つの炭素原子の１又は複数において枝分かれを生じさせることが好適である。他の実施態様において、結合の炭化水素部分は、飽和二価非環式炭化水素を含み、そして構造-（CR³R⁴）_p-C_3〜12シクロアルキル-（CR³R⁴）_q-（式中、pとqは独立して０〜約１０、好適に０〜約６（例えば、０、１、２、３、４、５又は６）でありそしてR³とR⁴は、先に規定したとおりである）を含む。二価シクロアルキル（例えば、シクロアルキレン）基は好適にC_3〜8シクロアルキレンの例えば、様々な異性体形態のシクロプロパジル（例えば、１，１-、シス１，２-、又はトランス-１，２-シクロプロピレン）、シクロブタジル、シクロペンタジル、シクロヘキサジル、及びシクロヘプタジルである。シクロアルキレン基は、１又は複数のアルキル基の、好適にC_1〜6アルキル基により置換されて良い。

水溶性ポリマーに関して、本発明のポリマー試薬は、１以上の水溶性ポリマー部分を含んで成る。非ペプチド性且つ水溶性であり、２〜約３００の末端を有する水溶性ポリマーは、好適に本発明において有用である。適切な水溶性ポリマーの例は、限定ではないが、ポリ（アルキレングリコール）の例えば、ポリ（エチレングリコール）（「PEG」）、水溶性を有するエチレングリコールとポリエチレングリコールのコポリマー、ポリ（オレフィン系アルコール）、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカライド)、ポリ(αヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリフォスファジン、ポリオキサゾリン、ポリ(N−アクリロイルモルホリン)であり、例えば米国特許第5,629,384号に記載されている。比較的高水溶性が所望されているいくつかの実施態様において、水溶性ポリマーはポリ(酸化ポリエチレン)ではない。

各水溶性ポリマーの繰り返し単位は多くの異なる配列を有することができ、例えば、限定されないが、ホモポリマー（水溶性ポリマーを含んで成る各モノマーユニットが同じである）、交互コポリマー（第一のモノマーユニットは一貫して水溶性ポリマー内の第二のモノマー単位で一貫して交互になっている）、ランダムポリマー（第一のモノマーユニットが一貫性なく水溶性ポリマー内の第二のモノマーユニットにより置換される）、ブロックコポリマー（２以上の第一ポリマーユニットが２以上の第二モノマーユニットと水溶性ポリマー中で交互になっている）、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、及びブロックトリポリマーからなる群から選択されたものが挙げられる。

水溶性ポリマーは好適に、しかし必ずではないが、ポリ（エチレングリコール）（「PEG」）又はその誘導体である。しかし、類縁ポリマーも本発明を実施することにおいて有用であり、そして用語「PEG」又は「ポリ（エチレングリコール）」の使用は、本発明において絶対的であることを意味しておらず且つ限定されていないと解するべきである。従って、用語「PEG」は、直線状、枝分かれした又は多腕形態におけるポリ（エチレングリコール）の例えば、アルコキシPEG、二官能性PEG、分岐PEG、枝分かれPEG、ペンダントPEG、又は分解可能な結合を有するPEGが本明細書中間十分に記載されている。

本発明の有用な形態において、遊離又は非結合PEGは両方の末端にヒドロキシル基を有して終結する直線状ポリマー：

（（m'）は典型的に0〜4000の範囲である）
である。

上記ポリマー、α-、ω-ジヒドロキシポリ（エチレングリコール）は、簡単な形態においてHO-PEG-OHとして表されて良く、ここで記号-PEG-は以下の構造単位：

（式中（m'）は上記のとおりである）
を示しうる。

本発明において有用である他の種類のPEGは、簡単にメトキシ-PEG-OH、又は簡潔にmPEGであり、ここで１つの末端は比較的不活性なメトキシ基であり、一方他の末端はヒドロキシル基である。mPEGの構造を下に与えている。

（式中、（m'）は上記の通りである）

上記形態のPEGに加えて、ポリマーは、上記任意のポリマーを含む、当該ポリマー中１もしくは複数の弱いもしくは分解可能な結合を伴い調製されても良い。例えば、PEGは、加水分解に委ねられるポリマー中のエステル結合を伴い調製されて良い。下に示すように、この加水分解により、ポリマーの、低分子量の断片への解裂がもたらされる。

他の加水分解により分解可能な結合である、ポリマー骨格内で分解可能な結合として有用なものは：炭酸塩結合；例えばアミンとアルデヒドの反応によりもたらされるイミン結合（例えば、OuChiら、（1997）Polymer Preprints vol.38（No.1）：pp.582〜583を参照のこと）；例えば、アルコールをリン酸基と反応させることによって形成されたリン酸エステル；例えば、ヒドラジンとアルデヒドの反応によって典型的に形成されたヒドラゾン結合；例えば、アルデヒドとアルコールの反応によって典型的に形成されたアセタール結合；例えば、ギ酸塩とアルコールの反応によって形成されているオルトエステル結合；例えば、PEGなどのポリマーの末端におけるアミン基、及び他のPEG鎖のカルボキシル基によって形成されたアミド結合；例えば末端のイソシアネート基を有するPEGとPEGアルコールの反応から形成されたウレタン結合；例えばPEGの末端におけるアミン基、及びペプチドのカルボキシル基によって形成されたペプチド結合；及び例えば、ポリマーの末端におけるフォスフォラミダイト（phosphoramidite）基、とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されたオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。

当業者には、用語ポリ（エチレングリコール）又はPEGは、上記PEG形態の全てを含むかあるいは示すことが理解されるだろう。

水溶性ポリマー(ポリマー試薬)の分子量は様々であって良いが、分子量は、１又は複数の以下の値を満たすだろう。約100Da超;200Da超;400Da超;500Da超；750Da超;900Da超;1,000Da超,1,400Da超;1,500Da超,1,900Da超;2,000Da超;2,200Da超;2,500Da超;3,000Da超;4,000Da超;4,900Da超;5,000Da超;6,000Da超;7,000Da超;7,500Da超、9,000Da超;10,000Da超; 11,000Da超;14,000Da超、15,000Da超;16,000Da超;19,000Da超;20,000Da超;21,000Da超;22,000Da超、25,000Da超;及び30,000Da超。本明細書中で有用である、全ての与えられた水溶性ポリマー部分の最大の限界は、約300,000Daであると解される。

水溶性ポリマー(並びに全体ポリマー試薬)の分子量は、ある範囲の分子量内の値として表されて良い。範囲の例としては：約100Da〜約100,000Da;約500Da〜約80,000Da;約1,000Da〜約60,000Da;約2,000Da〜約50,000Da;及び約5,000Da〜約40,000Daが挙げられる。

水溶性ポリマー試薬内の水溶性ポリマー(並びに全体ポリマー試薬)の分子量の例としては、約100Da、約200Da、約300Da、約400Da、約500Da、約600Da、約700Da、約750Da、約800Da、約900Da、約1,000Da、約2,000Da、約2,200Da、約2,500Da、約3,000Da、約4,000Da、約4,400Da、約5,000Da、約6,000Da、約7,000Da、約7,500Da、約8,000Da、約9,000Da、約10,000Da、約11,000Da、約12,000Da、約13,000Da、約14,000Da、約15,000Da、約20,000Da、約22,500Da、約25,000Da、約30,000Da、約40,000Da、約50,000Da、約60,000Da、約75,000Da、及び約80,000Daが挙げられる。

PEGに関して、
「-(CH₂CH₂0)_m-」又は「-(OCH₂CH₂)_m」を繰り返し酸化エチレンモノマーを含んで成る構造が提供されており、（m）に関する好適な値としては：約3〜約3,000;約10〜約3,000;約15〜約3,000;約20〜約3,000;約25〜約3,000;約30〜約3,000;約40〜約3,000;約50〜約3,000;約55〜約3,000;約75〜約3,000;約100〜約3,000;及び約225〜約3,000が挙げられる。

本明細書中で使用された場合、用語「水溶性ポリマー」は、生物適合性であり且つ非免疫源であり、そして生物適合性ではなく且つ非免疫源性でない全ての水溶性ポリマーを特異的に排除する水溶性ポリマーが挙げられる。生物適合性に関して、物質は、もし当該物質の使用に関連して有利な効果が、単独で又は他の物質（例えば、活性剤）を伴い、生組織（例えば患者に対する投与）において、任意の有害な効果を上回ることが医者、例えば、内科医によって確認された場合、生物適合性であると考えられている。非免疫源性に関して、もし物質のin vivoでの意図した使用において不都合な反応を（例えば、抗体の形成）生じない場合には非免疫源性であると考えられ、又はもし免疫反応が生み出されれば、かかる反応は、医者によって臨床的に有意である又は重要であるとは認められない。本明細書中に記載の水溶性ポリマー部分並びに結合体は、生物適合性であり且つ非免疫源性である。

当業者は、水溶性ポリマーに関する上記の議論は全く限定的ではなく且つ単に例示であり、そして上記の性質を有するポリマー性物質は熟考されていることに気付くだろう。本明細書中で記載されている場合、用語「ポリマー性試薬」とは一般に、水溶性ポリマー及び官能基を含んで成る分子全体をいう。用語「水溶性ポリマー」とは、一般に、例えば、ポリマー試薬、前駆体分子、結合体などのより巨大な分子構造の１つの部分を論議することにおいて使用するために用いられている。

本明細書中で記載のポリマー試薬及び他の構造の各部分（例えば、官能基、活性剤、水溶性ポリマーなど）は、直接共有結合を介して互いに結合している。一層典型的に、しかしながら、各部分は、各部分を一体化された全体へと結合する働きをする１又は複数の原子からなるスペーサー成分を介して結合させられている。

ポリマー性試薬と他の構造体の様々な部分が介する好適なスペーサー成分はとしては、本明細書中、炭素、窒素、酸素、及び/又はイオウ原子の鎖が挙げられる。この原子の鎖に対する結合は、１又は複数の他の原子の例えば、炭素、窒素、酸素、イオウ、及び水素であって良い。鎖は短くて良く且つ２〜５個の少ない原子の鎖を含んで成る。より長い例えば、１０、１５、又はそれ以上の長さの鎖も熟考されている。加えて、スペーサー成分は、飽和、不飽和、並びに芳香族でありうる原子の環を含んで成りうる。スペーサー成分が存在する場合、好適に全ての枝分かれ原子を除き、約１〜２０個の原子の配列を含んで成る。好適に、スペーサー成分（全ての枝分かれ原子を含む）をなす原子は、酸素、炭素、窒素、イオウ及び水素原子のいくらかの組み合わせを含んで成る。ポリマー試薬中の各スペーサー成分（例えば、第一のスペーサー成分、第二のスペーサー成分、第三のスペーサー成分）は、当該ポリマー中に存在する他のスペーサー成分と同じ又は異なっていて良い。

スペーサー成分の限定ではない例は：-O-、-S-、-C(O)- 、-O-C(O)- 、-C(O)-O-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)- 、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-0-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH₂-、-CH₂-C(O)-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-、-C(O)-O-CH₂-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-NH-CH₂-、-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-CH₂-、-C(O)-CH₂-、-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)、-NH-CH₂-CH₂-NH-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-[CH₂]_0-6-(OCH₂CH₂)_0-2-、-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-、-0-C(O)-CH₂-、-O-C(O)-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、二価シクロアルキル基、-N(R²)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、O-C(O)-NH-[CH₂]-(OCH₂CH₂) n、及び2以上のこれらの組み合わせであり、ここで、（ｆ）は0〜6であり、（ｎ）は0〜20(好適に、0〜10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及び好適には4であり)であり、R²はH又は有機基である。好適な二価シクロアルキル基は構造-（CR³R⁴)_ｐ-C_3〜12シクロアルキル- （CR³R⁴)_ｐであり、ここでp及びqはそれぞれ独立して、0〜約10、好適には0〜約6(例えば、0、1、2、3、4、5又は6)であり、各R³は独立して、H、アルキル、又は他のシクロアルキル(例えば、シクロアルキレン)基であり、R⁴は独立してH、アルキル又は他のシクロアルキルである。他の２価シクロアルキルとしては例えば、C_3〜8シクロアルキル、例えば、様々なシクロプロパジルの異性体の(例えば、1,1-、シス-11,2-,又はトランス-1,2-シクロプロピレン)、シクロブタジニル、シクロペンタジル、シクロヘキサジル、及びシクロヘプタジルが挙げられる。シクロアルキレン基は、１又は複数のアルキル基、好適にC_l-C₆アルキル基により置換されて良い。

カルボニル及びそれに対して結合する炭素原子の両方を含んで成る任意のスペーサー成分に関して、スペーサー成分は任意にカルボニルに対して隣接する炭素原子に結合した有機基を含む。通常、カルボニル炭素に対して直接隣接する炭素原子は、α炭素とよばれている。従って、任意のスペーサー成分中のα炭素は、それに対して結合したなどの小アルキル基(例えば、メチル基)を有することができる。

ポリマー試薬の全体構造は、多くの異なる形態をとることができる。例えば、ポリマー試薬は、直線状、枝分かれ状、多腕、樹状、又は分岐状であって良い。本発明の直鎖構造は、下の式II及びIIaに対応する。しかし、ポリマー試薬は、枝分かれ又は多腕構造のいずれかを有することが好適である。概して、かかるポリマーは２以上の水溶性ポリマーを有し、そして活性剤の周辺を取り囲むより巨大な、一層密なポリマー「雲」を作り出し、それにより結合に使用できる有効な数の結合部位を減らすことができる。下の式III 、III a、IIIb、及びIIIb₁は、２つの水溶性ポリマーを含んで成る枝分かれ状構造である。枝分かれ状構造は、３つの水溶性ポリマーを含んでも良い。多腕ポリマーは他方、かかる水溶性ポリマーを４以上含んで成る。ポリマーのデンドリマー形態は、１又は複数の原子を含んで成るコアに対して最大限に連結したいくつかの（例えば3〜50）個別の水溶性ポリマーを有する。２以上のポリマー試薬を含んで成る全ての特定のポリマー試薬について、各水溶性ポリマーは、同じ又は異なっていて良い。更に、水溶性ポリマーの同じ又は異なる組み合わせは、ポリマー試薬が３以上のポリマーを含んで成る場合に使用されて良いが、ポリマー中の各水溶性ポリマーは、他のポリマーと同じであることが好適である。

ポリマー試薬の枝分かれ形態に関して、当該ポリマーの合計分子量について適切な範囲の例は（本質的に２つの水溶性ポリマー部分の組み合わせ重量に基づいて）次の分子量（重ねて、分子量の観点から表した）：約200Da〜約200,000Da;約1,000Da〜約100,000Da;約2,000Da〜約120,000Da;約4,000Da〜約100,000Da;約5,000Da〜約90,000Da;約10,000Da〜約80,000Da、及び約15,000Da〜約60,000Daである。一層詳細に、本発明のポリマーの枝分かれした種類の分子量(Da)は、次の１つに対応する：約400;約1,000;約1,500;約2,000;約3000;約4,000;約10,000;約15,000;約20,000;約30,000;約40,000;約50,000;約60,000;約80,000,約90,000,約100,000、約120,000、約160,000又は約200,000。

本明細書中に記載のポリマー試薬の一般構造を考えれば、当業者は、当業界で記載されたポリマー試薬に対する所定の違いを理解するだろう。例えば、多くの従来技術のポリマー試薬は多くの問題を被り、その問題は、ポリマー試薬を、活性剤に対して結合させるためには不適切にする。例えば、いくつかの従来技術の試薬は、すぐに置換できる官能基、例えば反応性基（例えば、エステル）を有さない。当業者が、すぐに置換できる反応性基（例えば、メチレン（-CH₂-）基）を欠くポリマー試薬を結合させることを試みても、そのようにするための条件は非常に厳しい（例えば、強アルカリ条件）ので、活性剤が分解しやすい。更に、いくつかの従来技術の試薬は、結合の有効な部位上で置換された２つの基（例えば、カルボニル基）を有し、それにより往々にして、基が近接している結果として静電効果及び/又は反応性が低下することが理由で、不完全な結合がもたらされる。

単一の水溶性ポリマーがポリマーの全体構造において存在する場合、ポリマーの構造は好適に式（II）に対応する。

（式中、
POLYは水溶性ポリマーであり(例えば、PEG又はmPEG);
(a)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1);
(b)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1);
R¹はHであるかあるいは有機基であり(例えば、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択されている);
X¹は、存在する場合、第一スペーサー成分であり;
X²は、存在する場合、第二スペーサー成分であり;そして
Zは、反応性基である）。

更に、ポリマーが１つの水溶性部分のみを全体構造中に含んで成る場合、当該構造は式IIaにも対応する

（式中、
POLY1は、水溶性ポリマーであり(例えば、PEG又はmPEG);
(a)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(b)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(c)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(d)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
各R¹は独立してHであるかあるいは有機基であり、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールなどからなる群から選択されている);
X¹は、存在する場合、第一スペーサー成分であり;
X²は、存在する場合、第二スペーサー成分であり;
X³は、存在する場合、第三スペーサー成分であり;
X⁴は、存在する場合、第四スペーサー成分であり;そして
各Zは、独立して反応性基である）。

加えて、２つの水溶性ポリマーがポリマー試薬の全体構造中に存在する場合、当該構造は、式IIIに対応する。

（式中、
POLY¹は、水溶性ポリマーであり(例えば、PEG又はmPEG);
POLY²は、水溶性ポリマーであり(例えば、PEG又はmPEG);
(a)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(b)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(C)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(d)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(f')は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(g')は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(h)は0,1,2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(j)は0〜20であり(即ち、0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19又は20である);
各R¹は独立してHであるかあるいは有機基でありアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールなどからなる群から選択されている);
X¹は、存在する場合、第一スペーサー成分であり;
X²は、存在する場合、第二スペーサー成分であり;
X⁵は、存在する場合、第五スペーサー成分であり;
X⁶は、存在する場合、第六スペーサー成分であり;
X⁷は、存在する場合、第七スペーサー成分であり；
X⁸は、存在する場合、第八スペーサー成分であり；
R⁵は、枝分かれ成分であり；そして
各Zは、独立して反応性基である）。

式II、（IIa）、及びIIIにより包含される構造を有する好適なポリマー試薬とは、各水溶性ポリマーが(即ち、POLY^l及び/又はPOLY²)がポリ(酸化アルキン)の例えば、ポリ(酸化エチレン)であるものだ。好適に、必ずではないが、ポリ(酸化エチレン)は、メチル、ベンジル又はヒドロキシル基により一方の末端においてエンドキャッピングされるだろう。特に好適なエンドキャッピングされたポリ(酸化エチレン)は以下の構造の一つに対応するものである：H₃C-(OCH₂CH₂)_m-又はH₃C-(OCH₂CH₂)_m-O-C(O)-NH-[CH₂]_f-(OCH₂CH₂)_n-（式中、(m)は2〜4000であり、(f)は0〜6であり、(n)は0〜20である）。

ポリマー中に現れ且つ式II、IIa又IIIによって包含されているスペーサー成分は(それが第一スペーサー成分、第二スペーサー成分又は第三スペーサー成分であるかどうかに関わらず)独立して、上記のとおり、一般にスペーサー成分として規定されている。しかし、「X^l」及び「X⁵」として命名されている各スペーサー成分は、-O-、-O-CH₂-、-O-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-及び-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-(OCH₂CH₂)₂-から成る群から選択されていることが好適である。「X²」及び「X⁶」として命名されているスペーサー成分は好適に、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂(OR²)-、-CH₂-CH(OR²)-CH(OR²)-、-N(R²)-、からなる群から選択されており、R²は、Hであるかあるいは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択されている。「X⁸」と命名されているスペーサー成分は好適に、-O-、-O-CH₂-、-O-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)- 、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、及び-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-(CH₂CH₂O)_n-CH₂-CH₂-CH₂-（式中、(n)は0〜20である）から成る群から選択されている。任意に、X⁸は更なる枝分点又はいくつかの枝分点を含み、ここには更なる反応性基が存在し、それによって「分枝状」配置が供される。本発明において使用されて良い他の「分枝状」配置は、PCT/US99/05333に更に完全に記載されている。

式IIIにおいて枝分かれ成分R⁵は、3以上の原子に対する結合を提供することができうる任意の枝分かれ成分であって良い。好適に、しかしながら、R⁵は、飽和アルキル、置換飽和アルキル、

（式中、（p）は１〜１０（例えば、１,２,３,４,５,６,７,８,９又は１０）であり（q）は１〜１０（例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９又は１０）である）からなる群から選択されている。

式II、IIa及びIIIに示されるように、反応性の基「Z」は、上記の任意の反応性基であって良く、当該反応性基は、カルボン酸、アルデヒド、スルホン、エステル、スクシンイミド、及びマレイミドからなる群から選択されることが好適である。代表的なスペーサー成分(例えば、X²、X⁴及びX⁸)並びにZ組み合わせの例としては、

（式中、(r)は1〜12であり(例えば、0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11、又は12であり)、（ｒ'）は0〜5（例えば、0,1,2,3,4又は5）でありそしてR⁶アリール又はアルキルである）
が挙げられる。

当業者によって理解されるように、本発明は多量のポリマーを包含する。限定的ではない、本発明のポリマーの例が下に供されている。

例えば、式IIIにより始まりそしてR⁵を

（式中、(p)及び(q)の各々は１である）として規定し、そして（p）及び（q）は１であり、(b)及び(f')の各々が0の場合、下の式（IIIa）に対応する構造を有するポリマーをもたらす。

(式中、POLY¹、POLY²、(a)、(c)、(g')、(j)、(h)、R¹、X⁷、X⁸及びZは先に規定したとおりである)。

式IIIは、順番に、式IIIbに対応する構造を有するポリマー試薬を提供するために規定されていて良い。特に、式IIIから始まり、そして各R¹をHとして、POLY¹及びPOLY²の各々をH₃C-(OCH₂CH₂)m-（式中、(m)は2〜4000である）として、(a)及び(e)の各々を１として、X¹及びX⁵の各々を-O-C(O)-NH-[CH₂]f-(OCH₂CH₂)_n-（式中、(f)は0〜6であり、そして(n)は0〜20である）として規定することにより、式IIIbに対応する構造を有するポリマー試薬がもたらされる。

（式中、各(m)は2〜4000であり、各(f)は独立して0〜6であり、そして各(n)は独立して0〜20であり、そして(g')、(h)、(j)、X7、X8及びZは先に記載のとおりである）。

式IIIbは順番に、更に、式IIIcに対応する構造を有するポリマー試薬を提供するために規定されて良い。詳細に、式IIIbから始まりそして(g')及び(j)の各々を0として、(h)を１として、X⁸を-CH₂-CH₂-CH₂-として、そしてZをカルボン酸として規定することにより、下の式IIIcに対応する構造を有するポリマーがもたらされる。

（式中、各 (m)は2〜4000であり、各(f)は独立して0〜6であり、そして各(n)は独立して0〜20(例えば、0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19又は20である)。

任意に、式IIIcはカルボン酸のα又はβ炭素のいずれかに対して連結したアルキル基をも含むことができる。当該構造のカルボン酸のα炭素上のアルキル基(例えば、メチル)について、当該構造は式IIIb₁に対応する

加えて、式IIIaは、他の好適なポリマーを提供するために規定されて良い。特に、式IIIaにより始まりそしてPOLY¹及びPOLY²の各々をH₃C- (OCH₂CH₂)_m（式中、(m)は2〜4000である）として、(a)、(c)、(g')の各々及び(j)を0として、(h)を1として、X8を-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-として、そしてZを

として規定することにより、次のような構造を有するポリマーがもたらされる。

（式中、各（m）は2〜4000である）

更なるポリマー試薬は以下のとおりである：

（式中、全ての変数は先に規定したとおりであり、ここで各(n')は0〜100、一層好適には0〜40、そして最も好適には0〜20である）。

所定の場合、本発明のポリマー試薬は、ケトン成分、即ち、２つの個別の炭素原子が、各々カルボニル成分の炭素原子に対して結合している成分を含まない。加えて、

成分が、いくつかの場合において環状構造（例えば、マレイミド）の一部ではないことが好適である。更に、例えば、

成分が、反応性基よりも水溶性ポリマーに対してのほうが近いことも好適である。それは、例えば、水溶性ポリマーにおいて最も近い原子から出発して反応性基に至るために必要な原子の数の観点において測定した場合、反応性基において最も近い原子から出発して反応性基に至るための原子の数を比べて測定することによる。

本発明は、本明細書中に記載のポリマー試薬を調製する方法をも含む。当該方法は、(i)保護された反応性基(又は未保護の反応性基は、所定の方法段階を行った場合に変化しないような反応性基である)又は反応性基に対する前駆体及び１又は複数のヒドロキシル基を含んで成る前駆体分子を提供することを含んで成る。保護された反応性基又は前駆体反応性基及び１又は複数のヒドロキシル基からなるいくつかの前駆体分子は市販されていて入手可能である。加えて、前駆体分子の未保護形態が合成されそして（もし必要なら）常用の技術を使用することで保護されて良い。

多くの適切な前駆体分子の形態があるが、本発明はこれに関して、限定がなされておらず、好適な前駆体分子は２つのヒドロキシル基を有する。好適な適切な前駆体分子の例は下の式（IV）に対応する。

（式中、PGは保護基である）

この試薬は、実施例１に記載したとおり、合成によって調製されて良い。

好適な保護基の例としては、メチル、エチル、t-ブチル、及びベンジルからなる群から選択されている。特に好適な保護基はメチルである。

本発明のポリマー試薬を調製するための方法は、(ii)前駆体分子の１又は複数のヒドロキシル基の１つ以上を、アミノ基との反応のために、活性化し、活性化された前駆体分子を形成させることを含んで成る。当業界で公知の全ての適切な活性化剤が使用されて良いが、ジ(N-スクシニミジル)カーボネート(DSC)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'エチルカルボジイミド、1,1'カルボニルジイミダゾール(CDI)、1,1'-カルボニルド(1,2,4-トリアゾ−ル)(CDT)、ビス(4-ニトロフェニル)カルボネート、p-ニトロフェニルクロロカーボネート、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)、フォスジーン、トリフォスゲン、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、ジベンゾイルカーボネート(diBTC)、N-ヒドロキシスクシンイミド及びDCC、N-ヒドロキシフタルイミド及びDCC、及びとりチアゾリジンチオンからなる群から選択された活性化剤を使用することが好適である。典型的に、活性化剤が前駆体分子の１又は複数のヒドロキシル基との接触が可能になるように前駆体分子が入っている容器に対して加えられている。

本発明のポリマー試薬を調製するための方法の他の段階は(iii)共有結合反応条件下で、１又は複数の活性化されたヒドロキシル基の少なくとも１つを、アミノ基を有する水溶性ポリマーと接触させ、それによって水溶性ポリマー部分及び保護された反応性基又は反応性基に対する前駆体からなるポリマーを形成することを含む。当業者は、共有結合を達成するために、pH、温度などの条件を適切である通常の実験により決定することができる。例えば、前記結合段階は、数回、一組の様々な条件下(例えば、様々なpH、様々な温度、溶媒など)で行われて良い。各一組の条件からもたらされる水溶性ポリマー部分及び保護された反応性基の量を測定する(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって)ことによって、それにより前記結合段階を実施するために最も適切である組の条件を特定することが可能である。

アミン基を有するほぼ全ての水溶性ポリマーが使用されて良いが、以下のポリマーの１つ使用することが特に好適である：

（式中、（m）は2〜4000である）。

アミン基を有する水溶性ポリマーは、当業者に公知の技術を使用することでde novo合成されて良く、そしてNektar Therapeutics (Huntsville, AL)などのサプライヤーを通じて商業的に獲得することができうる。

保護基が前駆体分子中に存在する場合、ポリマー試薬を調製するための方法は(iv)保護された反応性基を脱保護し、それによってポリマーを形成する段階をも伴う。当該脱保護段階は、特定の保護基を除去するために適した任意の方法を使用することで行われて良い。任意の特異的な保護基に関して、適当な脱保護方法は当業者に周知である。加えて、適当な脱保護方法は、関連文献の例えば上記Greeneらに記載がある。アルキル基エステル（例えば、メチルエステル）として保護されている酸基を脱保護するための好適な方法は、保護基を有する分子を塩基により触媒された加水分解に対して暴露することである。保護反応基を支持する分子が入っている反応容器に対して加えるために適した塩基の例としては、限定はされないが、無機水酸化物の例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及び弱酸の金属塩の例えば、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、クエン酸カリウム、酢酸カリウムなどが挙げられる。酸が触媒する加水分解もオルトエステルにより行われて良いが、当業者は、酸が触媒する加水分解の後に、それらの誘導体による塩基が触媒する加水分解の組み合わせも使用しうる。アセタールにより、酸が触媒する加水分解は効率的であるが、塩基が触媒する加水分解は非効的である。ベンジルエステル又はベンジルエーテルにより、触媒還元が効率的であるが、酸又は塩基により触媒される加水分解も有効エステルである。

ポリマー試薬を調製するための方法は、任意に、ポリマー試薬が形成された場合にそれを単離する更なる段階を含んで成る。ポリマーを単離する公知の方法が使用されて良いが、クロマトグラフィーの例えば、イオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーを使用することが好適である。択一的に又は加えて、当該方法は、ポリマーが形成されたらそれを精製する段階を含む。重ねて、標準的な当業者に公知の精製方法がポリマーを精製するために使用されて良い。

本発明の方法によって調製される任意のポリマーに関して、前記方法は更に、当該ポリマーを変換し (任意の脱保護段階の前後で)、従ってそれが特異的な反応性基を担持するような能力を有利に供する。従って、当業者周知の方法を使用することで、当業者は反応性基(例えば、活性エステル、チオール、マレイミド、アルデヒド、ケトンなど)を含むように官能化されて良い。

ポリマー試薬を調製するための様々な段階が適切な溶媒中で行われている。当業者は、特定の溶媒が任意の反応段階のために適切であるかどうかを特定することができる。しかしながら、往々にして、溶媒は好適に非極性溶媒又は極性溶媒である。非極性溶媒の限定ではない例としては、ベンゼン、キシレン及びトルエンが挙げられる。特に好適な非極性溶媒としては、トルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、及びt-ブチルアルコールが挙げられる。極性溶媒の例としては、限定ではないが、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、t-ブチルアルコール、DMSO(ジメチルスルホキシド)、HMPA(ヘキサメチルホスホラミド)、DMF(ジメチルホルムアミド)、DMA(ジメチルアセトアミド)、及びNMP(N-メチルピロリドン)が挙げられる。

本発明は、水溶性ポリマー部分、

成分及び、任意に薬理活性剤を含んで成る結合体をも含む。結合体は以下のような内部構造配向性を有する：(i)水溶性ポリマー部分は、

成分の窒素原子に対して直接共有結合又は第一スペーサー成分のいずれかを介して結合しており、
；(ii)薬理活性剤は、直接共有結合又は第二スペーサー成分のいずれかを介して

成分のカルボニル炭素原子に対して結合しており；そして(iii)R¹はH又は有機基である。

単一の水溶性ポリマーが前記結合体の全体構造中に存在する場合、当該結合体の構造は好適に、式Vに対応するだろう。

（式中：
POLY¹は水溶性ポリマーであり(例えば、PEG又はmPEG);
(a)は0、1、2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(b)は0、1、2又は3であり(そして好適に0又は1であり);
R¹はHである又は有機基であり(例えば、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールから選択されている）；
X¹は、存在する場合、第一スペーサー成分であり；
X²は、存在する場合、第二スペーサー成分であり；そして
活性剤は、薬理活性剤である）。

２つの水溶性ポリマーが前記結合体の全体構造中に存在する場合、当該結合体の構造は好適に、式VIに対応するだろう。

（式中：
POLY¹は水溶性ポリマーであり(例えば、PEG又はmPEG);
POLY²は水溶性ポリマーであり(例えば、PEG又はmPEG);
(a)は0、1、2又は3であり(そして好適には0又は1であり);
(b)は0、1、2又は3であり(そして好適に0又は1であり);
(e)は0、1、2又は3であり(そして好適に0又は1であり);
(f')は0、1、2又は3であり(そして好適に0又は1であり);
(g')は0、1、2又は3であり(そして好適に0又は1であり);
(h)は0、1、2又は3であり(そして好適に0又は1であり);
（j）は0〜20であり（即ち、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14，15，16，17，18，19又は20）；
各R¹は独立してHである又は有機基であり(例えば、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールから選択されている）；
X¹は、存在する場合、第一スペーサー成分であり；
X²は、存在する場合、第二スペーサー成分であり；
X⁵は、存在する場合、第五スペーサー成分であり；
X⁶は、存在する場合、第六スペーサー成分であり；
X⁷は、存在する場合、第七スペーサー成分であり；
X⁸は、存在する場合、第八スペーサー成分であり；
R⁵な枝分かれ成分であり；そして
活性剤は、薬理活性剤である）。

本明細書中に記載のポリマー試薬は、生物活性剤又は界面活性剤に対する結合のために有用である。本明細書中に記載のポリマー試薬との反応のために適している好適な基としては、求電子基及び求核基が挙げられる。基の例としては、第一アミン(例えば、ポリペプチドのリジン残基又は他のN末端の側鎖に由来するアミン)、アルコール(例えば、セリン又はスレオニン残基の側鎖に由来する第一アルコール)、チオール、ヒドジン、ヒドラジド、及びスルフヒドリルが挙げられる。かかる、本明細書中に記載のポリマー試薬との反応に適した基は当業者に公知である。従って、本発明は、結合条件の下で、活性剤を本明細書中に記載のポリマー試薬と接触させる段階を含んで成る、結合体を調製するための方法を供する。

適切な結合条件は、時間、温度、pH、試薬濃度、１又は複数の試薬官能基、活性剤上の使用可能な官能基、溶媒などポリマー試薬と活性剤との結合を行うのに十分なものである。当業者に公知のように、特異的な条件は、とりわけ活性剤、所望の結合の種類、反応混合物中の他の物質の濃度に依存する。任意の特定の場合において結合を行うために十分な条件は、当業者により本明細書中の記載、関連文献の引用、及び/又は通常の実験が読むこまれることによって決定されて良い。

例えば、ポリマー試薬がN-ヒドロキシスクシンイミド活性エステル(例えば、スクシニミジルスクシネート、スクシニミジルプロピオネート、及びスクシニミジルブタノエート)を含み、そして活性剤がアミン基(例えば、ポリペプチド上の末端アミン基及び/又はリジン含有ポリペプチドのεアミン)を含む場合、結合は、室温において、pH約7.5〜約9.5で行われて良い。加えて、ポリマー試薬がビニルスルホン反応性基又はマイレイミド基を含み、そして薬理活性剤がスルフヒドリル基(例えば、システイン含有又はメチオニン含有ポリペプチドのスルフヒドリル基)を含む場合、結合は室温において、pH約7〜約8.5 で行われて良い。更に、ポリマー試薬と結合している反応性基がアルデヒド又はケトンであり、そして薬理活性剤が第一アミンを含む場合、結合は、薬理活性剤の第一アミンがポリマーのアルデヒド又はケトンと反応する還元アミド化によって行われて良い。還元アミノ化をpH約6〜約9.5において行うことで、薬理活性剤とポリマーが、イミン結合を介して結合した結合体がもたらされる。その後、イミン含有結合体を適切な還元剤の例えば、NaCNBH₃により処理することにより、イミンが第二アミンへと還元される。例えば、これら及び他の結合反応に関する更なる情報に関しHermanson"Bioconjugate Techniques, "Academic Press, 1996を参照されたい。

例となる結合条件としては、結合反応を約4〜約10のpH、例えば、約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5又は10.0のpHで行うことが挙げられる。この反応は約5分〜約72時間、好適には、約30分〜約48時間、そして最も好適には、約4時間〜約24時間で進められるだろう。結合体が生じる温度は、典型的に、必ずではないが、約0℃〜約40℃であり、そして往々にして、室温以下である。結合反応は、往々にしてリン酸バッファー溶液、酢酸ナトリウム、又は類似の系を使用することで行われている。

試薬濃度に関して、過剰のポリマー試薬が典型的に活性剤と組み合わされている。いくつかのケースにおいて、しかしながら、活性剤の反応性基に対してポリマー試薬上に化学量論量の反応性基を有することが好適である。従って、例えば、2つの反応性基を有する1モルのポリマー試薬が2モルの反応性剤と結合することが好適である。ポリマー試薬と活性剤の比としては約 1:1(ポリマー試薬：活性剤)、1.5：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、8：1又は10：1が挙げられる。この結合反応は、実質上更なる結合が生じなくなるまで進み、それは一般に経時反応の進行をモニタリングすることによって特定されて良い。

反応の進行は、反応混合物からアリコートを様々な時点で取り出し、当該混合物を、SDS-PAGE又はMALDI-TOFマススペクトロメトリーなどの任意の適当な分析方法によってモニタリングされて良い。一度、形成された結合体の量又は残留する未結合ポリマー試薬の量に関して、プラトーに達したら、反応が完了したと考えられる。典型的に、結合反応は、どこでも数分〜数時間(例えば、5分〜24時間以上)かかる。生じる混合産物は、好適に、しかし必ずではなく、過剰のポリマー試薬、未結合の反応物(例えば、活性剤)、及び不都合な多重結合物質を分離するために精製されている。次いで生じる結合体は、MALDI、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、及び/又はクロマトグラフィーなどの分析方法を使用することで特性決定されて良い。

ポリマー活性剤結合体は、様々な結合物質を獲得/単離するために精製されて良い。択一的に、そして一層好適に、結合体を形成するために使用される低分子量(例えば、約20,000Da、一層好適には約10,000Da未満)のポリマー試薬に関して、活性剤あたりの水溶性ポリマー部分の分配を達成するために混合産物が精製されて良い。例えば、混合産物は、活性剤（例えばタンパク質）に１分子につき、ポリマー試薬１、２、３、４又は５分子の結合を、典型的には活性剤（例えば、タンパク質）１分子につきおよそ平均の結合を達成するために精製されて良い。最終結合反応混合物の精製に関する戦略は、多くの因子、例えば、使用したポリマー試薬の分子量、特定の活性剤、所望の投与計画、並びに残留活性及び個々の結合体のin vivo特性に依存するだろう。

もし所望されれば、様々な分子量を有する結合体がゲルろ過クロマトグラフィーを使用することで単離されて良い。即ち、ゲルろ過クロマトグラフィーが使用され、様々な数のポリマー：活性剤比(例えば、1−mer、2-mer、3-merなど。ここで「1-mer」とは、1ポリマー試薬：活性剤、「2-mer」とは、2ポリマー試薬：活性剤などを意味する)へ、それらの様々な分子量（ここで、様々なとは、本質的に水溶性ポリマー部分の平均分子量に対応する）に依存して分画される。例えば、分子量100,000Daのタンパク質が合計分子量約20,000Daを(枝分かれ状PEGの各ポリマー「腕」は、約10,000Daを有する)を有する枝分かれ状PEGに対して結合する反応において、生じる反応混合物は未修飾タンパク質(約100,000Daの分子量を有する)、モノPEG化されたタンパク質(約120,000Daのタンパク質を有する)、ジPEG化タンパク質(約140,000Daの分子量を有する)などの混合物を含みうる。

この方法は、分子量を有するPEGと様々なポリマー活性剤結合体を分離するために使用されて良い一方で、この方法は一般に、タンパク質内に様々なポリマー結合部位を有する位置異性体を分離するためには無効である。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーは、互いにPEG 1-mers、2-mers、3-mersなどの混合物を分離するために使用されて良いが回収された各PEG-mer 組成物が活性剤内の様々な反応性アミノ基（例えばリシン残基）に対して結合したPEGを含む。

この種類の分離を行うために適切なゲルろ過カラムとしては、Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)から入手可能なSephadexカラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、所望の分画範囲に依存するだろう。溶出は一般に、例えばリン酸塩、酢酸塩などの適切なバッファーを使用することで行われている。回収された各分は、多くの様々な方法の例えば(i)タンパク質含量に関する280nmでの光学密度(OD)、(ii)ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質分析、(iii)PEG含量に関するヨード試験(Simsら(1980) Anal. Biochem, vol.107: pp.60〜63)、並びに(iv)ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)、しかる後のヨウ化バリウムによる染色によって分析されて良い。

位置異性体の分離は、逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC) C18 カラム (Amersham Biosciences又はVydac)を使用する逆相高性能クロマトグラフィーによって又はAmersham Biosciencesから入手可能なSepharoseイオン交換カラムなどのイオン交換カラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーによって行われて良い。いずれの方法も、同じ分子量を有するポリマー活性剤異性体(位置異性体)を分離するために使用されて良い。

本明細書中に記載のポリマー試薬は、共有結合又は非共有結合のずれかによって多くの物体に対して結合させられて良い。その物体とは例えば、フィルム、化学分離及び精製表層、固層支持体、金属表層の例えば、金、チタン、アルミニウム、タンタル、ニオブ、アルミニウム、鉄、及びそれらの酸化物、酸化シリコン、マクロ分子(例えば、タンパク質、ポリペプチドなど)、及び小分子が挙げられる。更に、ポリマー試薬も、生化学センサー、生体電子工学スイッチ及びゲートにおいて使用されて良い。ポリマー試薬は、ペプチド合成のための担体、ポリマー被覆表層及びポリマー移植体の調製のため、親和性分配（partitioning）のためのポリマー−リガンド結合体を調製するため、架橋した又は架橋していないヒドロゲルを調製するため、及びバイオリアクターのためのポリマー−コファクター付加体を調製するためにも使用されて良い。

本明細書中に提示されたようなポリマー試薬に対して結合させることにおいて使用するための生物活性物質は、以下の任意の１又は複数のものであって良い。適切な剤は、例えば、睡眠薬及び鎮静剤、精神賦活剤、精神安定剤、呼吸器系薬、抗痙攣剤、筋弛緩剤、抗パーキンソン病剤(ドーパミンアンタゴニスト)、鎮痛剤、抗炎症剤、抗不安薬(不安緩解剤)、食欲抑制剤、抗偏頭痛剤、筋収縮剤、抗感染症剤(抗細菌剤、抗ウィルス剤、抗真菌剤、ワクチン)、抗関節炎薬、抗マラリア剤、制吐剤、抗てんかん剤、気管支拡張剤、サイトカイン、成長因子、抗がん剤、抗血栓剤、抗高血圧剤、血管拡張剤、抗不整脈剤、抗喘息剤、ホルモン剤の例えば、避妊薬、交感神経興奮剤、利尿剤、脂質調節剤、抗アンドロゲン剤、抗寄生虫剤、抗凝固剤、新生物、抗新生物剤、血糖降下剤、栄養剤及びサプリメント、成長サプリメント（growth supplements）、抗腸炎剤、ワクチン、抗体、診断剤、及び造影剤からなる群から選択されて良い。

一層詳細に、活性剤は、多くの構造種類のなかの１つに分類されて良く、例えば、限定されないが、小分子(好適には不溶性小分子)、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、多糖類、ステロイド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪、電解質などである。好適に、本明細書中に記載ポリマーに対して活性剤を結合させるための活性剤は、アミノ基を有する又は、択一的に、本明細書中に記載のポリマーに対して結合させるための適切なアミノ基の少なくとも１つ含むために修飾されている。

共有結合のために適した活性剤の詳細の例としては、限定されないが、アガルシダーゼ、アレファセプト、アスパラギナーゼ、アムドキソビール（amdoxovir）(DAPD)、アンチド、ベカプレルミン、カルシトニン、シアノビリン、デニルキンジフチトクス（denileukin diftitox）、エリスロポエチン(EPO)、EPOアゴニスト(WO 96/40749に記載のように、例えば、長さ約10〜40アミノ酸及び特定のコア配列を含んで成る)、ドルナーゼα、赤血球生成刺激タンパク質(NESP)、凝集因子の例えば、V因子、VII因子、VIIa因子、VIII因子、 IX因子、X因子、XII因子、Xm因子、von Willebrand因子、セレダーゼ、セレザイム、α-グルコシダーゼ、コラーゲン、シクロスポリン、αデフェンシン、βデフェンシン、デスモプレッシン、エキセジン-4、顆粒求コロニー刺激因子 (GCSF)、トロンボポイエチン(TPO)、α-1プロテナーゼ阻害物質、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)、フィブリノゲン、フィルグラスチム、成長ホルモンのヒト成長ホルモン(hGH)、ソマトロピン（somatropin）、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、GRO-β、 GRO-β抗体、骨形成タンパク質の例えば、骨形態形成タンパク質-2、骨形態形成タンパン質-6、OP-1; 酸性繊維芽細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、CD-40リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン(LMWH)、インターフェロの例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω、インターフェロンτ、コンセンサスインターフェロン;インターロイキン及びインターロイキンレセプターの例えば、インターロイキン-1レセプター、インターロイキン-2、インターロイキン-2融合タンパク質、インターロイキン-1レセプターアンタゴニスト、インターロイキン-3、インターロイキン-4, インターロイキン-4レセプター、インターロイキン-6、インターロイキン-8, インターロイキン-12、インターロイキン-13 レセプター、インターロイキン-17レセプター; ラクトフェリン及びラクトフェリン断片、黄体形成ホルモン放出ホルモン (LHRH)、インスリン、プロインスリン、インスリン類似物(例えば、米国特許第5,922,675号に記載のモノアシル化インスリン)、アミリン、C-ペプチド、ソマトスタチン、ソマトスタチン類似物の例えば、オクテオチド、バドプレッシン、卵胞刺激ホルモン(FSH)、インフルエンザワクチン、インスリン様成長因子(IGF)、インスリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、プラスミノゲン活性化物質の例えば、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、及びテネテプラーゼ;神経成長因子(NGF)、オステオプロテゲリン、血小板誘導成長因子、組織成長因子、形質転換成長因子-1、血管内皮細胞増殖因子、白血病阻害因子、ケラチノサイト成長因子(KGF)、グリア成長因子(GGF)、T細胞レセプター、CD分子/抗原、腫瘍壊死因子(TNF)、単球化学誘引タンパク質-1、内皮細胞増殖因子、甲状腺ホルモン(PTH)、グルカゴン様ペプチド、ソマトトロピン、チモシンα1、ラスブリカーゼ、チモシン1IIb/IIIa阻害物質、チモシンβ10、チモシンβ9、チモシンβ4、α-1アンチトリプシン、フォスフォジエステラーゼ(PDE)化合物、VLA-4(最晩期抗原-4)、VLA-4阻害物質、ビスリン酸塩、呼吸器系シンシチウムウィルス抗体、のう胞性繊維症膜貫通型調節物質 (CFTR)遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ(Dnase)、殺細菌性/透過性増大タンパク質(BPI)、及び抗-CMV抗体である。モノクローナル抗体の例としては、エタネルセプト(IgG1のFc部分に対して結合したヒト75kD TNF レセプターの細胞外リガンド結合部から成るダイマー融合タンパク質)、アブシキシマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アレムッズマブ、Bリンパ球多に対する抗体、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ、ベルチリムマブ、CDP-571、CDP-860、CDP-870、セツキシマブ、クレノリキシマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、フォントリズマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、イブリツモマブチウキセタン（ibritumomab tiuxetan）、インフリキシマブ、イノリモマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レルデリムマブ、オリズマブ、放射性標識したlym-1、メテリムマブ、メポリズマブ、ミツモマブ、ムロモナド-CD3、ネバクマブ、ナタリズマブ、オズリモマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、ペムツモマブ、ペキセリズマブ、rhuMAb-VEGF、リツキシマブ、サツモマブペンデチド、セビルマブ、シプリズマブ、トシツマブ、I¹³¹トシツモマブ、トランスツヅマブ、ツビルマブ及びビジリズマブを含む。

共有結合のために適切な更なる剤としては、限定ではないが、例えば、タクリン、メマンチン、リバスチグミン、ガランタミン、ドネペジル、レベチラセタム、レパグリニド、アトルバスタチン、アレファセプト、タダラフィル、バルデナフィル、シルデナフィル、フォサムプレナビル、オセルタミビル、バラシクロビル及びバルガンシクロビル、アバレリクス、アデフォビール、アルフゾシン、アロセトロン、アミフォスチン、アミオダロン、アミノカプロン酸、アミノ馬尿酸ナトリウム、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、アモルジピン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アプレピタント、アリピプラゾール、アスパラギン酸塩、アタザナビール、アトモキセチン、アントラサイクリン、ベクサロテン、ビカルタミド、ベロマイシン、ボルテゾミブ、ブセレリン、ブスルファン、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシン、シラスタチンナトリウム、シスプラチン、クラドリビン、クロドロンート、シクロフォスファミド、シプロテロン、シトラビン、カンプトテンシン、13-シスレチノイン酸、全てのトランスレチノイン酸；ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダプトマイシン、ダウノルビシン、デフェロキサミン、デキサメタゾン、ジクロフェナク、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウタステリド、エレトリプタン、エムトリシタビン、エンフビルチド、エプレレノン、エピルビシン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、エトポシド、エキセメスタン、エザチミベ、フェンタニル、フェキソフェナジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメストロン、フルタミド、フルチカゾン、ホンダパリヌクス、フルベストラント、γ−ヒドロキシブチレート、ゲフェチニブ、ゲミシタビン、エピネフリン、L-ドーパ、ヒドロキシウレア、イコデキストリン、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イトラコナゾール、ゴセレリン、ラロニダーゼ、ランソプラゾール、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、リシノプリル、ロボチロキシンナトリウム、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルフラン、メマンチン、メルカプロプリン、メキノール、メタラミノールビタルトレート、メトトレキセート、メトクロプラミド、メキシレチン、ミグルスタット、マイトマイシン、ミトタン、マイトキサントロン、モダフィニル、ナロキソン、ナプロキセン、ネビラピン、ニコチン、ニルタミド、ニトタゾサニド、ニチシノン、ノレチンドロン、オクトレオチド、オキサリプラチン、パロノセトロン、パミドロネート、ペメトレキセド、ペルゴリド、ペントスタチン、ピルカマイシン、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、プロクロルペラジン、オンダンセトロン、パロノセトロン、オキサリプタン、ラチトレキシド、ロスバスタチン、シロリムス、ストレプトゾシン、ピレクロリムス、セルタコナゾール、タクロリムス、タモキシフェン、テガセロド、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、テトラヒドロカンナビノール、タリドミド、チオグアニン、チオテパ、チオトロピウム、トピラメート、トポテカン、トレプロスチニル、トレチノイン、バルデコキシブ、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリコナゾール、ドラセトロン、グラニセトロン、フォルモテロール、フルチカゾン、ロイプロリド、ミダゾラム、アルプラゾラム、アンフォテリシンB、ポドフィロトキシン、ヌクレオシド抗ウィルス剤、アロイルヒドラゾン、スマトリプタン、エレトリプタン、マクロライドの例えば、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシトロマイシン、クラリトロマイシン、ダベルシン、アジトロマイシン、フルリトロマイシン、ジリトロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロラタジン、デスロラタジン、ルーコマシン、ミオカマイシン、ロキタマイシン、及びアジトロマイシン及びスウィノライドA；フルオロキノロンの例えば、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲラパフロキサシン、レモフロキサシン、スパロフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イリロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシン、及びシタフロキサシン；アミノグリコシドの例えば、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、及びストレプトマイシン、バノコマシシン、テイコプラニン、ランポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメテート;ポリキシミンの例えば、ポリミキシンB、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネム系物質;ペニシリンの例えば、ペニシリナーゼ感受性剤の例えば、ペニシリンG、ペニシリンV；メチシリン、オキサシリン、シクロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、ナフシリン;グラム陰性微生物活性剤の例えば、アンピシリン、アモキシリン、及びヘタシリン、シリン、及びガランピシリン;抗シュードモナスペニシリンの例えば、カルベニシリン、チカルシリン、アゾロシリン、メズロシリン、及びピペラシリン;セファロスポリンの例えば、セフドポキシミン、セフプロジル、セフトブテン、セフチゾキシム、セトリアキソン、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラドリン、セフォキシチン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロール、セファドロキシル、セファログリシン、セフロキシム、セフォラニド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフォキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフメタゾール、セフタジジム、ロラカルベフ、及びモキサラクタム、モノバクタムの例えば、アズトレオナム;及びカルバペナムの例えば、イミペネム、メロペネム、及びエルトラペネム、ペンタミジンイセチオネート、アルブテロールスルフェート、リドカイン、メタプロテレノールスルフェート、ベクロメタゾンジプレピオネート、トリアムシノロンアセトアミド、ブデソニドアセトニド、サルメテロール、イプラトリピウムブロミド、フルニソリド、クロモリンナトリウム及び酒石酸エルゴタミン; タキサンの例えば、パクリタキセル;SN-38、及びチルフォスチンが挙げられる。

本明細書中に記載の好適なポリマーに対して結合させるために好適な小分子としては、天然に生じるアミノ基を少なくとも３個以上有するものが挙げられる。これらとして好適な分子としては、アミノ馬尿酸ナトリウム、アンフォテリシンB、ドキソルビシン、アミノカプロン酸、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、重酒石酸メタラミノール、パミドロン酸二ナトリウム、ダウノルビシン、レボチロキシンナトリウム、シラスタチンナトリウム、メキシレチン、セファレキシン、デフェロキサミン、及びアミフォスチンが挙げられる。

本明細書中に記載のポリマーに対して結合させるための好適なペプチド又はタンパク質としては、EPO、IFN-a、IFN-β、コンセンサスIFN、VII因子、VIII因子を削除されたB−ドメイン、FIX因子、GCSF、GMCSF、hGH、インスリン、FSH、GLP-1活性を有するペプチド、デスモプレッシン、アモドキシビール、及びPTHが挙げられる。

上記の生物活性剤の例は、適宜、類似物、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害物質、異性体、及び医薬的に許容できるその塩を網羅することを意味する。ペプチド及びタンパク質に関して、阻害物質は、合成、組換え、天然、グリコシル化された、及び非グリコシル化された形態並びにその生物活性断片を網羅することを意味する。加えて、用語「活性剤」とは、結合前の活性剤を並びに結合後の活性剤「残基」を意味することを網羅する。

特に好適な薬理活性剤は、グルカゴン様ペプチド(GLP-1)レセプターに対してアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有するペプチドである。GLP-1及びその薬理活性アンタゴニスト誘導体は、in vivoでβ細胞によるインスリン分泌を刺激しそしてグルカゴン刺激を阻害する。GLP-1レセプターのためのかかるアンタゴニストは、インスリン生産の調節のために有用である。

結合体として有用であるGLP-1関連因子としては、限定ではないが、次の:天然GLP-1;エキセンジン-3;エキセンジン-4;エキセンジン-4(1-30);エキセンジン-4 (1-30)アミド; エキセンジン-4(1-28)アミド;^l4Leu、²⁵Phe エキセンジン-4アミド;^l4Leu、²⁵Pheエキセンジン-4(1-28)アミド;^l4Leu、²²Ala、²⁵Pheエキセンジン-4(1-28)アミド、又はその薬理学的に活性を有する誘導体である。これらの剤及び他のGLP-1レセプターに対してアゴニスト活性を有する剤はW099/07404に記載されており且つ次の式Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Gly Thr Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Ser Lys Gln Xaa₉ Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Leu Lys Asn Gly Gly Xaa_l4 Ser Ser Gly Ala Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈-Z, (配列番号:1)（式中、Xaa₁はHis、Arg又はTyrであり;Xaa₂はSer、Gly、Ala又はThrであり;Xaa₃はAsp又はGluであり;Xaa₄はPhe、Tyr又はナフチルアラニンであり;Xaa₅はThr又はSerであり;Xaa₆はSer又はThrであり;Xaa₇はAsp又はGluであり;Xaa₈はLeu、Ile、Val、ペンチルグリシン又はMetであり;Xaa₉はLeu、Ile、ペンチルグリシン、Val又はMetであり;Xaa₁₀はPhe、Tyr又はナフチルアラニンであり;Xaa₁₁はIle、Val、Leu、ペンチルグリシン、tert-ブチルグリシン又はMetであり;Xaa_l2はGlu又はAspであり;Xaa₁₃はTrp、Phe、Tyr又はナフチルアラニンであり;Xaa₁₄、Xaa₁₅、Xaa_l6及びXaa_l7は独立してPro、ホモプロリン、³Hyp、⁴Hyp、チオプロリン、N-アルキルグリシン、N-アルキルペンチルグリシン又はN-アルキルアラニンであり;Xaa_l8はSer、Thr又はTyrであり;そしてZは-OH又は-NH₂である）に対応する構造を有する。

他のGLP-1アゴニストは、米国特許第6,583,111号に記載されている。本明細書中で記載の特に好適なアゴニストとしては、NH₂-His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-Gly³⁷-OH(配列番号:2)、NH²-His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-NH₂(配列番号:3)、及びNH₂-His7-Val-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH (配列番号:4)が挙げられる。

結合体として有用である更なる因子の例としては、限定されないが、WO01/23420に記載のものが挙げられる。本明細書中に記載のように、多くの次のようなポリペプチドが常用の固体ベースの合成技術(as described in ペプチドSynthesis Protocols (1994), Volume 35 by Micheal W. Pennington & Ben M. Dunnに記載の通り)によってそして/又は組み替えベースの技術によって調製されて良い。特に好適な配列としては次のものが挙げられる。

ポリペプチド配列番号
Ac-HSDAVFTENYTKLRKQNIeAAKKYLNDLKKGGT-NH₂ 5
Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT-NH₂ 6
Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT 7
HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT 8
Ac-HSDAVFTEN(CH30-Y)TKLRKQNIeAAKKYLNDLKK-NH₂ 9
HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKK 10
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKK-NH₂ 11
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKGGT 12
HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLLNGGT 13
HSDAVFTDNYTKLRKQLAAKKYLNDILNGGT 14
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKGGT 15
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKK-NH₂ 16
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNDLKKGGT 17
HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGTSWCEPGWCR 18
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNDIKKGGT 19
HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDIKKGGT 20
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSIKKGGT 21
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKNGGT 22
HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNSIKKGGT 23
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKGGT 24
HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDIKNGGT 25
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSIKNGGT 26
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKGG 27
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKG 28
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKK 29
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKQ 30
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKNQ 31
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKKRY 32
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKK 33
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKN 34
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILK 35
HSDAVFTDNYTELRKQMAVKKYLNSILN 36
HSDAVFTDNYTRLREOMAVKKYLNSILN 37
HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNSILN 38
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSILN 39
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNDILN 40
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKN 41
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSILK 42
HSDAVFTDNYTRLRKOMAAKKYLNSIKK 43
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKKRY 44
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKKR 45
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKK 46
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKRY 47
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKKRY 48
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKKR 49
DAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKK 50
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKNKRY 51
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKK 52
HSDAVFTDNYTRLRKQIAAKKYLQTIKK 53
HSDGIFTESYSRYRKQMAVKKYLAALKKKRYKQRVKNK 57
HSDAVFTENYTRLRKQMAVKKYLNSLKK-NH₂ 58
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLSAVRHGQT-NH₂ 59
HSDGIFTDSYSRYRKOMAVKKYLAAVKQGGT-NH₂ 60
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVKKYLAAVRHG-NH₂ 61
SWCEPGWCRHSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT 62
HSDAVFTDNYTRLRKOLAAKKYLNDILKGGT 63
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDILNGGT 64
HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDILKGGT 65
HSDGIFTDSYSRYRKQLAAKKYLADVKKGGT 66
HSDGIFTDSYSRYRKQLAAKKYLADVKK 67
HSDGIFTDSYSRYRKQLAVKKYLAAVKK 68
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVKK 69
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKK 70
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKR 71
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY 72
HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNTIKNKRY 73
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKNKRY 74
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLQSIKNKRY 75
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNTIKNKRY 76
HSDAVFTDQYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKRY 77
HSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLNTIKNKRY 78
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAHKYLNSIKNKRY 79
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKHYLNSIKNKRY 80
HSDAVFTDQYTRLRKQLAAHKYLNTIKNKRY 81
HSDAVFTDQYTRLRKOLAAKHYLNTIKNKRY 82
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKKKR 83
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKKKR 84
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKNKRY 85
HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKKKR 86
HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKKK 87
HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKNKRY 88
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKKRY 89
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKKR 90
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKK 91
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNK 92
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HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNGR 142
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HSOAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNPR 148
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNQR 149
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNRR 150
HSDAVFTDNYTRLRKOMAAKKYLNSIKNSR 151
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNTR 152
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNVR 153
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNWR 154
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNYR 155
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKA 156
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKD 157
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKE 158
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKF 159
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKG 160
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKH 161
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKI 162
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKK 163
HSDAVFTDNYTRLRKOMAAKKYLNSIKNKL 164
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKM 165
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKN 166
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKP 167
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKQ 168
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKS 169
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKT 170
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKV 171
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKW 172
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKY 173
HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRYSWCEPGWCR 174
HSDAVFTDDYTRLRKEVAAKKYLESIKDKRY 175
ESDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 176
HKDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 177
HSKGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 178
HSDKIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 179
HSDGKFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 180
HSDGIKTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 181
HSDGIFKDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 182
HSDGIFTKSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 183
HSDGIFTDKYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH₂ 184
HSDGIFTDSKSRYRKOMAVKKYLAAVL-NH₂ 185
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HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLKAVL-NH₂ 199
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAKVL-NH₂ 200
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAKL-NH₂ 201
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVK-NH₂ 202
HSDAVFTDNYTRLRKOMAAKKYLNSIKNRI 322
HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIKNRI 323
HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIKNRI 324
HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIKNRI 325
HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIKNRI 326
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIPNRI 327
HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIPNRI 328
HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIPNRI 329
HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIPNRI 330
HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIPNRI 331
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIQNRI 332
HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIQNRI 333
HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIONRI 334
HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIQNRI 335
HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIQNRI 336
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIRNRI 337
HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIRNRI 338
HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIRNRI 339
HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIRNRI 340
HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIRNRI 341

GLP-1活性を有するペプチドアゴニストの更なる例は、米国特許第6,528,486号に記載されており、そして例えば、H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)₆-NH₂(配列番号:342)、H-Lys₆-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)₆-NH₂(配列番号343)、H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH₂(配列番号:344)、H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH₂(配列番号:345)、H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH₂(配列番号:346)、H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val- Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)₆-NH₂(配列番号:347)、H-(Lys)₆-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu- Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)₆-NH₂(配列番号:348)、及びH-Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu- Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)₆-NH₂(配列番号:349)である。

全てのアミノ酸略記には、次のような典型的且つ通常認められている形態を使用する:フェニルアラニンはPhe又はFであり;ロイシンはLeu又はLであり;イソロイシンはIle又はIであり;メチオニンはMet又はMであり;バリンはVal又はVであり;セリンはSer又はSであり;プロリンはPro又はPであり;スレオニンはThr又はTであり;アラニンはAla又はAであり;チロシンはTyr又はYであり;ヒスチジンはHis又はHであり;グルタミンはGln又はQであり; アスパラギンはAsn又はNであり;リジンはLys又はKであり;アスパラギン酸はAsp又はDであり;グルタミン酸はGlu又はEであり;システインはCys又はCであり;トリプトファンはTrp又はWであり;アルギニンはArg又はRであり;そしてGlycineはGly又はGである。アセチル化されたペプチドは接尾辞「Ac」を有する。

本発明は、本明細書中、医薬賦形剤との組み合わせとして提供されている結合体を含んで成る医薬組成物を含む。一般に、結合体それ自身は固体形態(例えば、沈殿物)にあり、それは、固体又は液体形態のいずれかであって良い医薬賦形剤と組み合わされて良い。

賦形剤の例としては、限定ではないが、炭水化物、無機塩、抗微生物剤、抗酸化物質、界面活性剤、バッファー、酸、塩基及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたものが挙げあげられる。

炭水化物の例えば、糖、糖誘導体の例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化したシュガー、及び/又は糖ポリマーが賦形剤として存在して良い。特異的な炭化水素賦形剤としては、例えば:単糖類の例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボースなど;に糖類の例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど;多糖類の例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストリン、デキストラン、デンプンなど;及びアルジトールの例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール(グルシトール)、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどが挙げられる。

賦形剤としては、無機塩又はバッファーの例えば、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

調製物は、微生物増殖を阻害又は阻止するために抗微生物剤をも含むことができる。本発明のために適した抗微生物剤の限定ではない例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェネチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

抗酸化物質も調製物中に存在していて良い。抗酸化物質は、酸化を予防するために使用されており、従って、調製物の結合体又は他の成分の分解を防ぐ。本発明において使用するための適切な抗酸化物質としては、例えば、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

界面活性剤は、賦形剤として存在して良い。例となる界面活性剤としては: ポリソルベート、例えば「Tween 20」及び「Tween 80」並びにプルロニクスの例えば、F68及びF88(その両方は、BASF, Mount Olive, New Jerseyから入手可能である);ソルビタンエステル;脂質の例えば、リン脂質の例えば、レクチン及び他のフォスフォチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン(しかし好適にはリポソーム形態ではない)、脂肪酸及び脂肪酸エステル;ステロイドの例えば、コレステロール; 及びキレート剤の例えば、EDTA、亜鉛及び他のかかる適切な陽イオンが挙げられる。

酸又は塩基は調製物中で賦形剤として存在していて良い。使用されて良い限定ではない酸の例としては、塩化水素酸、酢酸、リン酸、クエン酸、マレイン酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸及びそれらの組み合わせから選択されたものが挙げられる。適切な塩基の例としては、限定ではないが、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

医薬製剤は、全ての種類の製剤を網羅しそして特に、再生され並びに懸濁及び溶液であって良い粉末など、注射に適したものである。組成物中、結合体の量(即ち、本明細書中に記載の活性剤とポリマーとの間で形成された結合体)は、多くの因子に依存して変化するだろうが、任意に組成物が単位投与容器（例えば、バイアル）において保存されている場合、治療上有効な用量であって良い。加えて、医薬組成物はシリンジにおいて保存されて良い。治療上有効な量は、どの量が臨床上有効な終点を生み出すかどうかを特定するために増加量の結合体を反復投与することによって実験的に特定されて良い。

組成物中での個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の特定の必要量に依存して変化するだろう。典型的に、任意の個々の賦形剤の至適量は、通常の実験によって、即ち、様々な量の賦形剤（低〜高量に及ぶ）を含む組成物を調製し、安定性及び他のパラメーターを検証し、そして至適性能が、有意な逆効果を伴わずに付随する範囲を特定することによって決定されて良い。

しかしながら、一般に、賦形剤は、約1重量%〜約99重量%、好適に約5重量%〜98重量%、一層好適には約15〜95%重量%の賦形剤が、そして30重量%未満が最も好適である。

これら前記医薬賦形剤は、"Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19版, Williams & Williams, (1995), the"Physician's Desk Reference", 52版., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), 及びKibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版, American Pharmaceutical Association, Washington, D. C.,2000に記載の賦形剤を伴っている。

本発明の医薬組成物は、典型的に、しかし必ずではなく、注射を介して投与されて良く、従って投与直前には一般に液体溶液又は懸濁である。医薬製剤は、他の形態の例えば、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、粉末などの形態をとって良い。他の投与の方法としては、肺、直腸、経皮、経粘膜、経口、鞘内、皮下、動脈内なども挙げられる。

先に記載のように、結合体は静脈内注射によって、又は好適さにはおとるが、筋肉内又は皮下注射によって投与されて良い。非経口投与のための適切な製剤の種類としては、すぐに注射できる溶液、使用前に溶媒と組み合わせるための乾燥粉末、すぐ注射するための懸濁、使用前にビヒクルと組み合わせるための乾燥不溶性組成物、並びにとりわけ、投与前に希釈するためのエマルション及び液体濃縮物が挙げられる。

本発明は、本明細書中に記載の結合体を、当該結合体による治療と反応性である症状を患う患者に対して投与するための方法をも提供する。本発明は、治療上有効な量の結合体（好適には医薬調製物の一部として提供される）を投与することを含んで成る。投与の方法は、特定の結合体を投与することによって改善又は予防されて任意の症状を治療するために使用されて良い。当業者は、どの症状が、特異的な結合体により有効に治療できるかを理解するだろう。実際に投与される投与量は、年齢、体重、及び対象者の全体症状並びに治療される症状の症度、医者の判断、及び投与される結合体に依存して変化するだろう。治療上有効な量は、当業者に周知であり、そして/又は関連する参考文献及び刊行物に記載されている。一般に、治療上有効な量は、約0.001mg〜100mg、好適には0.01mg/日〜75mg/日、そして一層好適には0.10mg/日〜50mg/日の範囲で変化するだろう。

任意の量の結合体(再度、好適に、医薬製剤の一部として提供されている)の単位投与量が、医者の判断、患者の要請などに依存して様々な投与計画で投与されて良い。特異的な投与計画が当業者に公知であろう又は通常の方法を使用することで実験的に決定されて良い。例となる投与計画としては、限定ではないが、１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回、及びそれらの組み合わせが挙げられる。一度臨床上の終点に達すると、組成物を投与することが中断される。

本発明の結合体を投与する１つの利点は、個々の水溶性ポリマー部分が解裂されて良いことである。かかる結果は、ポリマーサイズが理由で、体からの除去が潜在的な問題である場合、有利である。任意に、各水溶性ポリマー部分の解裂は、ウレタン、アミド、炭酸塩又エステル含有結合などの生理的に解裂可能及び/又は酵素的に解裂可能結合の使用を介して促されている。このようにして、結合体の除去(個々の水溶性ポリマー部分の解裂を介する)は、所望の除去特性を提供するだろうポリマー分子サイズ及び所定の種類の官能基を選択することによって調節されて良い。当業者はポリマーの適切な分子サイズ並びに解裂可能な官能基を特定することができる。例えば、当業者は、最初に通常の実験を使用することで、適切な分子サイズそして様々なポリマー重量及び解裂可能な官能基を有する様々なポリマー誘導体を最初に調製することによって解裂可能な官能基を特定でき、当該ポリマー誘導体を患者に対して投与して心拍数及び/又は尿を採取することによってクリアランスプロファイルを（心拍数又は採尿などを介して）獲得することができる。各試験された結合体について１組のクリアランスプロファイルが獲得されれば、適切な結合体が同定されて良い。

本発明は、その好適な特定の実施態様との結合において記載されているが、上記記載並びに以下の例は、例示を目的としており、本発明を限定しないことが理解されるだろう。本発明範囲内の他の観点、利点及び変更は本発明が属する業界の当業者に周知だろう。

本明細書中で参考にした全ての書籍、特許、特許出願、及び刊行物はその全体を参照によって組み込まれている。

実施例
本発明の実施は特に断らない限り、当業者に公知である常用の有機合成技術を使用するだろう。
かかる技術は刊行物中に十分説明されている。例えば、J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure,第4版 (New York: Wiley- Interscience, 1992), supra. を参照のこと。

下の例において、使用される数(例えば、量、温度など)に関して正確にするための努力がなされているが、実験的なエラー及び偏差は幾分考慮されるべきである。他に断りがない限り、温度は℃でありそして圧力は海水位における大気圧又は付近である。全ての試薬は、特に示されない限り商業的に獲得されて良い。以下の略記は本明細書中で使用さて良い。

実施例1グリセロールベース先駆体分子の調製

シス-1,3-O-ベンジリデングリセロール(7.2g,0.040mol)(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)のトルエン(100ml)中溶液を、トルエンを蒸留して飛ばすことによって共沸騰的に乾燥させた。この乾燥させた化合物を無水トルエン(100ml)中に溶かしてtert-ブタノール(60ml、0.060mol)中のカリウムtert-ブトキシドの1.OM溶液及び1-(3-ブロモプロピル)-4-メチル-2,6,7-トリオキサビシクロ[2,2,2]オクタン(14.0g、0.0558mol)を加え、そして混合物をアルゴン雰囲気の下100℃で一晩に渡り撹拌した。混合物をろ過して溶媒を減圧下で蒸留して15.7gの固体産物(化合物5-02)を獲得した。NMR (d6-DMSO):0.74ppm(s,3H),1.61ppm(m,4H),1.88ppm(m,2H),3.44ppm(t,2H),3.81ppm (s,6H),4.05ppm(m,4H),5.55ppm(s,1H),7.37ppm(m,5H)。

概略的に、反応は次のように示している。

5-02の加水分解
化合物5-02(15.Og)を、アセトニトリル(150 ml)と蒸留水(35 ml)の混合物中に溶かした。次いで、H₃P0₄の10%溶液を、pHを4.5にするために加えた。この混合物を1時間に渡りpH=4.5で撹拌した。NaCl(2g)を加えて、そしてpHを7.5に調節した。産物をCH₂C1₂(600及び150ml)で抽出した。

抽出物を乾燥させ(MgS0₄)そして溶媒を減圧下で蒸留させて固体産物(化合物6-02)を獲得した。収量は14.2gであると決定された。NMR(d₆-DMSO): 0.78ppm(s,3H),1.79ppm(m,2H),2.41ppm(t,2H),3.25ppm(m,6H),3.49ppm(t,2H),4.05ppm(m,4H),4.48ppm(t,3H),5.56ppm(s,1H),7.37ppm(m,5H)。

概略的に、反応を次のとおり示している。

化合物 6-02(14.2g)を、アセトニトリル(80ml)と蒸留水(80ml)の混合物中に溶かした。次いで、NaOHの6%溶液を加えてpHを12.5に調製した。この溶液を5.5時間に渡りpH12.3〜12.8で撹拌し、NaOHの6%溶液を周期的に添加することによって維持した。NaCl(5g)を加えてpHを7.5へと5% H₃P0₄で調整した。非酸性不純物をCH₂Cl₂(2度の処理、最初は300mlを使用し、そして2回目は200mlを使用する)で抽出した。溶液のpHを3へとH₃P0₄により調節し、産物をCH₂C₁₂(2度の処理、最初は300mlを使用し、そして2回目は200mlを使用する)で抽出した。

抽出物を乾燥(MgSO₄)させ、そして溶媒を減圧下で蒸留した。生じる産物(化合物 7-02)は収量8.7gであった。
NMR(d₆-DMSO)：1.76ppm(m,2H),2.31ppm(t,2H),3.46ppm(t,2H),4.05ppm(m,4H),5.56ppm(s,1H),7.37ppm(m,5H)。

概略的に、反応を次の通り示している。

化合物7-02(8.0g)を無水メタノール(120ml)中に溶かして、溶解させ、濃H₂S0₄(1.6ml)を加えた。この溶液を4時間に渡り室温で撹拌した。NaHCO₃(8%溶液)を加えて混合物のpHを7.5に調節した。この産物をCH₂Cl₂ (2度の処理、各々100mlを使用する)で抽出した。

抽出物を乾燥させ(MgS0₄)そして揮発性化合物を減圧下(0.05 mm Hg)60℃で蒸留して除いた。生じる産物(化合物8-02)は収量が4.8gであった。NMR(d6-DMSO):1.72ppm(m,2H),2.37ppm(t,2H),3.20ppm(m,1H),3.42ppm(bm,4H),3.49ppm(t,2H),3.59ppm(s,3H),4.46ppm(t,2H)。

概略的に、反応を下の通り示している

実施例２「mPEG2 _（40K） −ブタン酸,N−Hヒドロキシスクシンイミドエステル」の調製

前駆体分子中のヒドロキシル基の活性化
化合物8-02(2.0g、0.0208当量)を無水アセトニトリル(50ml)及び無水ピリジン(2.2ml、0.272mol)中に溶かしてN,N-ジスクシニミジルカーボネート(5.86g、0.0229mol、DSC)を加えた。この溶液を一晩アルゴン雰囲気の下で撹拌した。次いで、この混合物をろ過し、溶媒を蒸留させた。粗製の産物をCH₂Cl₂(50ml)に溶かして、5%H₃P0₄溶液で洗浄した。次いで、この溶液を乾燥させ(MgSO₄)、そして溶媒を蒸留して除いた。生じる産物(化合物9-02)は2.8gの収量を有した。NMR(d₆-DMSO):1.76ppm(m,2H),2.35ppm(t,2H),2.82ppm(s,8H),3.56ppm(t,2H),3.58ppm(s,3H),3.96ppm(m,1H),4.37ppm(m,2H),4.52ppm(m,2H).

概略的に、反応を下のように示している。

活性化された前駆体をアミン含有水溶性ポリマーとを結合させること
mPEG_(20K)-アミン(11g、0.00055 mol) (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL)、アセトニトリル(70ml)、及びトリエチルアミン(0.15ml)の溶液に対して、化合物9-02(0.119g,0.00050当量)を加えた。この混合物を3時間に渡り室温でアルゴン雰囲気の下で撹拌した。次いで、この溶媒を減圧下で蒸留して除いた。

概略的に、反応を下のように示している。

PEG2 _(40K) -ブタン酸の脱保護段階及びクロマトグラフィー精製
獲得した化合物10-2(本明細書中PEG2_(40K)-ブタン酸、メチルエステル)を150mlの蒸留水に溶かし、そしてこの溶液のpHを12.2へと5%NaOH溶液で調節した。この溶液を1.5時間に渡り12.0〜12.2の範囲のpHにおいて撹拌した。次いで、NaCl(1Og)を加えて、このpHを2.5へと5% H₃PO₄溶液で調整した。産物をCH₂Cl₂処理で抽出した。抽出物を乾燥(MgS0₄)させ、そして溶媒を減圧下で蒸留し9gの固体産物を獲得した。イオン交換クロマトグラフィー: PEG2_(40K)-ブタン酸85%、mPEG_(20K) アミン10%。産物を米国特許第5,932,462号に記載のようにしてイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、100%純粋産物を獲得した。 NMR(d₆-DMSO):1.72ppm(q,2H) 2.24ppm(t,2H), 3.24ppm(s,6H),3.51ppm(s,PEG骨格),3.99ppm(m,4H),7.19ppm(t,2H)。

概略的に、反応を下のように示している。

mPEG2_(40K)-ブタン酸はポリマー−活性剤結合体を形成する反応のためのポリマー試薬として使用されて良い。加えて、mPEG2_(40K)-ブタン酸は更にカルボン酸以外の官能基を有するポリマー試薬を提供するために更に反応させられて良い。例えば、N-mPEG2_(40K)-ブタン酸並びにアルデヒド、マレイミド、及びチオール誘導体の対応するスクシンイミドエステルは下に記載のとおりである。

mPEG2 _(40K) −ブタン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの調製

mPEG2_(40K)-ブタン酸(9.0g、0.000225mol)(上記のようにして調製した)を無水ジクロロメタン(70ml)中に溶かしそしてN-ヒドロキシスクシンイミド(0.0285g、0.000248mol)及び1,3-ジシクロカルボジイミド(0.0510g、0.000247mol)を加えた。この混合物を一晩室温で、アルゴン雰囲気の下で撹拌した。次に、溶媒の一部を減圧下で蒸留し、そして産物を室温でイソプロピルアルコールにより沈殿させ、そして真空下で乾燥させて8.6gの白色粉末を獲得した。NMR(d₆-DMSO):1.81ppm(q, 2H)2.70ppm(t,2H),2.81ppm(s,4H),3.24ppm(s,6H),3.51ppm(s,PEG骨格)、3.99ppm(m,4H),7.22ppm(t,2H)。

実施例3
「mPEG2 _(40K) -ブチルアルデヒド」の調製
テトラ(エチレングリコール)モノ-ブチルアルデヒド,ジエチルセタールの調製
HO-(CH₂CH₂0)₄CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

テトラ(エチレングリコール)(97.1g、0.500mol)及びトルエン(200ml)の混合物を、減圧下で蒸留させることによって（ロータリーエバポレーター）協沸点的に乾燥させた。この乾燥したテトラ(エチレングリコール)を無水トルエン(180ml)中に溶かして、tert-ブタノール中のカリウムtert-ブトキシドの１.0M溶液(120.0ml、0.120mol)及び4-クロロブチルアルデヒドジエチルアセタール(18.1g、0.100mol)(Alfa Aesar, Ward Hill, MA)を加えた。この混合物を95〜100℃でアルゴン雰囲気の下で一晩撹拌した。室温へと冷却した後、混合物をろ過し、そして溶媒を減圧下で蒸留した。粗製の産物を1000ml脱イオン水中に溶かし、そして生じる溶液を、活性炭を通してろ過した。塩化ナトリウム(100g)を加えて、産物をジクロロメタン(250、200及び150ml)で抽出した。産物を乾燥 (MgS0₄)させて溶媒を減圧下で蒸留させた(ロータリー蒸発によって)。

粗製の産物を300mlの10%リン酸バッファー(pH=7.5)中に溶かし、そして不純物を酢酸エチルで抽出した(2x50 ml)。生じる産物をジクロロメタンで抽出(200、150、及び100 ml)した。抽出物を(MgS0₄上で)乾燥させ、そして溶媒を減圧下で蒸留した(ロータリー蒸留によって）。収量：20.3g.NMR(d₆-DMSO):1.10ppm(t,CH₃-C-)1.51ppm(m,C-CH₂-CH₂-),3.49ppm(bm,-OCH₂CH₂0-),4.46ppm(t,-CH,アセタール), 4.58ppm(t,-OH)。純度:約100%(未反応の出発物質の兆候はない)。

テトラ(エチレングリコール)-α-メシレート-ω-ブチルアルデヒ、ジエチルアセタールの調製
CH₃-S(0)₂-0-(CH₂CH₂0)₄CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

テトラ(エチレングリコール)モノブチルアルデヒド、ジエチルアセタール(12.5g, 0.037mol)及びトルエン(120ml)の混合物を、減圧下で蒸留させることによって（ロータリーエバポレーター）協沸点的に乾燥させた。この乾燥したテトラ(エチレングリコール)モノブチルアルデヒド,ジエチルセタールを無水トルエン(100ml)中に溶かした。この溶液に対して、20mlの無水ジクロロメタン及び5.7mlのトリエチルアミン（0.041mol）を加えた。次いで、4.5gの塩化メタンスルホニル（0.039mol）を滴下して加えた。この溶液を室温、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。次に、炭酸ナトリウム（5g）を加え、混合物を１時間に渡り撹拌した。次いで溶液をろ過し、溶媒を減圧下で蒸留させた(ロータリー蒸発によって)。NMR(d₆-DMSO)1.10ppm(t,CH₃-C-) 1.51ppm(m,C-CH₂-CH₂-),3.17ppm(s,CH₃-メタンスルホネート),3.49ppm(bm,- OCH₂CH₂0-), 4.30ppm(m,-CH₂-メタンスルホネート),4.46ppm(t,-CH,アセタール).純度:約100%.

テトラ(エチレングリコール)-α−アミノ-ω-ブチルアルデヒド,ジエチルアセタール
H₂N-(CH₂CH₂0)₄CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

テトラ(エチレングリコール)-α-メシレート-ω-ブチルアルデヒド,ジエチルアセタール(14.0g)、濃水酸化アンモニウム(650ml)、及びエチルアルコール(60ml)の混合物を42時間に渡り室温で撹拌した。次いで、全ての揮発性物質を減圧下で蒸留して除いた。粗製の産物を150mlの脱イオン水中に溶かしてそして溶液のpHを12へと1.0M NaOHで調整した。産物をジクロロメタン(3x100ml)で抽出した。産物を乾燥(MgS0₄)させそして溶媒を減圧下で蒸留した(ロータリーエバポレーター)。収量10.6g. NMR(D₂0):1.09ppm(t,CH₃-C-)1.56ppm(m,C-CH₂-CH₂-), 2.69ppm(t,CH₂-N), 3.56ppm(bm,-OCH₂CH₂0-), 4.56ppm(t,-CH,アセタール).純度:約100%.

枝分かれmPEG2(40.3KDa)-ブチルアルデヒド, ジエチルアセタール

塩化メチレン（100ml）中のmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(実施例2)(5.0g、0.000125mol)の溶液に対して、テトラ(エチレングリコール)-α-アミノ-ω-ブチルアルデヒド,ジエチルアセタール(0.050g, 0.000148mol)及びトリエチルアミン(0.035ml)を加えて反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温において一晩撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用することで蒸発させて乾燥させた。粗製の産物を塩化メチレン中に溶かしてそしてイソプロパノール中で沈殿させた。湿った産物を減圧下で乾燥させた。収量4.8g. NMR(d₆-DMSO):1.10ppm(t,6H),1.51ppm(m,4H),1.67ppm(m,2H),2.12ppm(t,2H),3.12ppm(q,4H),3.24ppm(s,3H),3.51ppm(s,PEG骨格),3.99ppm(m,4H),4.46ppm(t,1H,アセタール).7.22ppm(t,2H),7.82ppm(t,1H).置換:約100%。

枝分かれmPEG2(40.3 KDa)-ブチルアルデヒド

枝分かれPEG2(40.3 KDa)-ブチルアルデヒド,ジエチルアセタール(4.8g)を100mlの水に溶かしてこの溶液のpHを希リン酸で調節した。この溶液を３時間に渡り室温で撹拌し、しかる後に0.5Mの水酸化ナトリウムを溶液のpHを7にするために十分に加えた。産物(枝分かれmPEG2(40.3KDa)-ブチルアルデヒド)を塩化メチレンで抽出し、そして無水硫酸マグネシウムで抽出した。この溶媒を減圧下で蒸留して除いた。収量4.2g. NMR(d₆-DMSO):1.67ppm(m,2H),1.76 ppm(p,-CH₂-CH₂-CHO-,2H),2.11ppm(t,2H),2.44ppm(dt,-CH₂-CHO),3.24ppm (s,-OCH₃,6H),3.51ppm(s,PEG骨格),3.99ppm(m,4H),7.24ppm(t,2H),7.83ppm(t, 1H),9.66ppm(t,-CHO).置換:約100%.

実施例4
mPEG2 _(40K) −マレイミドの調製

無水アセトニトリル（100ml）中のmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(実施例2)(5.0g, 0.000125mol)の溶液に対して、N-(3-マレイミドプロピオンアミド)エチレンジアミンをトリフルオロ酢酸塩の形態(0.042g,0.000129mol)においてそしてトリエチルアミン(0.050ml)を加え、そしてこの反応混合物を室温で一晩アルゴン雰囲気の下で撹拌した。溶媒を、ロータリーエバポレーターを使用することで蒸発させた。粗製の産物を少量の塩化メチレンに溶かし、イソプロピルアルコールで沈殿させた。産物を減圧下で乾燥させた。収率4.7g. NMR(d₆-DMSO):1.69ppm(m,2H),2.09ppm(t,2H) 2.31ppm(t,2H),3.03ppm(q,4H),3.12ppm(q,4H),3.24ppm(s,6H),3.51ppm(s,PEG 骨格),3.99ppm(m,4H),7.00ppm(s,2H,マレイミド),7.21ppm(t,2H),7.75ppm(t,1H), 7.96ppm(t,1H).

実施例5
mPEG2 _(40K) -チオールの調製

塩化メチレン（50ml）中のmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (実施例2)(5.0g,0.000125mol)の溶液に対して、シスタミンジヒドロクロリド(0.0142g、0.000126当量)及びトリエチルアミン(0.040ml)を加えて反応混合物を一晩アルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。次いで、ジチオトレイトール(0.054g, 0.000350mol)及びトリエチルアミン(0.25ml)を加え、そしてこの混合物をアルゴン雰囲気下室温で３時間に渡り撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用することで蒸発させて乾燥させた。粗製の産物を少量の塩化メチレン中に溶かしてイソプロピルアルコールで沈殿させた。湿った産物を減圧下で乾燥させた。収量4.8g. NMR(CDCl₃):1.68ppm(m,-SH,1H),1.35ppm(t,2H),2.65ppm(q,-CH₂SH,2H),3.15ppm(q,6H),3.36ppm(s,6H),3.65ppm(s,PEG骨格),4.15ppm(m,4H).置換:約100%。

実施例6
ペンタエリトリトールリンカーを有する「mPEG3 _（60K） -ブタン酸,N-ヒドロキシスクシンイミドエステル」の調製

ペンタエリトリトールエトキシレート(15/4EO/OH, Mn=797,Sigma-Aldrich) (100g、0.125mol)とトルエン(200ml)の混合物を、減圧下でトルエンを共沸点的に蒸発させて除くことによって乾燥させた。この乾燥したペンタエリトリトールエトキシレートを無水トルエン(150ml)及びtert-ブタノール中のカリウムtert−ブトキシドの(30ml、0.03mol)及び1-(3-ブロモプロピル)-4-メチル-2,6,7-トリオキサビシクロ[2,2,2]オクタン(6.3g,0.025mol)の1M溶液を加えた。次に、この混合物を80〜85℃で一晩、アルゴン雰囲気下で撹拌した。室温に冷却した後、混合物をろ過し、そして溶媒を減圧下で蒸留した。粗製の産物を800mlの脱イオン水中に溶かした。溶液のpHを2へと、5%リン酸により調整し、そしてこの溶液を室温で１5分に渡り撹拌した。次いで、pHを12へと1M水酸化ナトリウム溶液で再度調整し、そして溶液を2時間に渡り撹拌し、1M水酸化ナトリウムを周期的に加えることによって、pHを12に維持した。塩化ナトリウム(40g)を加え、そして未反応のペンタエリトリトールエトキシレートをジクロロメタンにより抽出した。次いで、pHを3へ5%リン酸で調整しそして産物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして溶媒を減圧下で蒸発させた。収量15g.NMR(d₆-DMSO):1.72ppm(q,2H)2.24ppm(t,2H),3.51ppm(s,60H),4.57ppm(t,3H)。

化合物2-04の調製

化合物1-04(15g、0.017mol)を無水メタノール(300ml)中に溶かし、そして濃硫酸(4ml)を加えた。この溶液を4時間に渡り室温で撹拌した。混合物のpHを、NaHCO₃(8%溶液)を加えて7.5に調整した。産物をCH₂Cl₂で抽出した。この抽出物を乾燥(MgS0₄)させて揮発性化合物を減圧下で蒸留して除いた。収量13.5g。NMR(d₆-DMSO):1.72ppm(q,2H),2.37ppm(t,2H),3.51ppm(s,60H),4.57ppm(t,3H)。

化合物3-04の調製

化合物2-04(13.5g、0.0444当量)を無水アセトニトリル(100ml)中に溶かして無水ピリジン(4.4ml、0.544mol)及びN,N-ジスクシニミジルカーボネート(12.40g、0.0484mol)を加えた。この溶液を室温でアルゴン雰囲気の下で一晩撹拌した。次いで、この混合物をろ過して溶媒を蒸留した。粗製の産物をCH₂Cl₂(200ml)中に溶かし、そして5%H₃P0₄溶液で洗浄した。次いで、この溶液を乾燥(MgSO₄)させ、そして溶媒を蒸留して除いた。収量16.5g. NMR(d₆-DMSO):1.72ppm(m,2H),2.37ppm(t,2H),2.82ppm(s,12H),3.50ppm(s,48H),3.70ppm(m,6H),4.45(m,6H)。

化合物4-04,(PEG3 _(60K) -ブタン酸,メチルエステル)の調製
mPEG_(20K)-アミン(15g、0.00075mol)(Nektar Therapeutics, Huntsville, AL)、アセトニトリル(70ml)、及びトリエチルアミン(0.15ml)、化合物 3-04(0.259g,0.00060当量)の混合物を加えた。この混合物を3時間に渡り室温で、アルゴン雰囲気の下撹拌した。次いで、溶媒を減圧下蒸留して除いた。

PEG3 _(60K) −ブタン酸の脱保護段階及びクロマトグラフィー精製
化合物4-04(PEG3 _(60K)−ブタン酸,メチルエステルという)を150mlの蒸留水中に溶かし、そして溶液のpHを5%NaOH溶液により12.2に調整した。生じる溶液を1.5時間に渡り12.0〜12.2の範囲のpHにおいて撹拌した。次いで、NaCl(10g)を加え、そしてpHを2.5へと5%H₃P0₄溶液で調整した。産物を CH₂Cl₂処理により抽出した。抽出物を乾燥(MgS0₄)し、そして溶媒を減圧下で蒸留して13.8gの固体産物を獲得した。イオン交換クロマトグラフィー:PEG3_(60K)-ブタン酸82%,M-PEG_(20K)-アミン18%。産物を米国特許第5,932,462号に記載のようにしてイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、100%純粋産物を獲得した。NMR(d₆-DMSO):1.72ppm(q,2H) 2.24ppm(t,2H),3.24ppm(s,6H),3.51ppm(s,PEG骨格),3.99ppm(m,6H),7.19ppm(t,3H)。

mPEG3 _(60K) -ブタン酸,N-ヒドロキシ酢スクシンイミドエステルの調製
獲得したmPEG3_(60K)-ブタン酸(先の段階)(9.0g,0.000225mol)を無水ジクロロメタン(70ml)に溶かし、そしてN-ヒドロキシスクシンイミド(0.0285g,0.000248mol)及び1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(0.0510g,0.000247mol)を加えた。この混合物をアルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。次いで、溶媒の一部を減圧下で蒸留して除き、そして産物を室温においてイソプロピルアルコールで沈殿させ、そして真空下で乾燥させ、8.6gの白色粉末を獲得した。NMR(d₆-DMSO):1.81ppm(q,2H) 2.70ppm(t,2H),2.81ppm(s,4H),3.24ppm(s,6H),3.51ppm(s,PEG骨格),3.99ppm(m,4H),7.22ppm(t,2H)。

実施例7
一官能性mPEGの調製
単一の水溶性ポリマーを含んで成る本発明のポリマーを調製している。3-ヒドロキシ-プロピオン酸,メチルエステルが化合物8-02に置き換わっていることを除いて、実施例２の手順に従う。

生じる化合物(「mPEG-プロピオン酸,メチルエステル」)は下の構造を有することが発見されている。

mPEG_(20K)-プロピオン酸,メチルエステルは対応するカルボン酸を提供することができる。例えば、メチルエステルは蒸留水中に溶かしてpHを約12へNaOH溶液を使用することで調整できる。この後、塩化ナトリウムなどの塩を加えて、そして適切な酸を使用することでpHを3にすることができる。対応するカルボン酸(mPEG_(20K)-プロピオン酸)を、塩化メチレン処理を使用し、残留する全ての溶媒を乾燥及び蒸発させて除くことにより抽出できうる。

mPEG_(20K)-プロピオン酸を、ポリマー−活性剤結合体を形成するためのポリマー試薬として使用することができうる。加えて、mPEG_(20K)-プロピオン酸をカルボン酸以外の官能基を有するポリマー試薬を提供するために更に反応させらることができうる。例えば、従来記載された技術を使用することで、mPEG_(20K)プロピオン酸の対応するN-ヒドロキシスキシンイミドエステル（実施例2を参照のこと)、アルデヒド(実施例3を参照のこと)、マレイミド(例4を参照のこと)、及びチオール(実施例5を参照のこと)誘導体が調整されて良い。

実施例8
ホモ二官能性PEGの調整
単一の水溶性ポリマー部分を含んで成る本発明のホモ二官能性ポリマーを調製している。アミン−PEG_(20K)−アミンをmPEG_(20K)−アミンに置換していること以外は実施例7の手順に従う。生じる化合物が以下の構造を有することを発見した。

mPEG_(20K)-ジプロピオン酸,メチルエステルは対応するジカルボン酸を提供することができる。例えば、mPEG_(20K)-ジプロピオン酸,メチルエステルを蒸留水中に溶かし、そしてpHを、NaOH溶液を使用することで約12に調製することができうる。この後、塩化ナトリウムなどの塩を加え、次いでpHを、適当な酸を使用することで、約3に調節することができる。対応するカルボン酸(mPEG_(20K)−ジプロピオン酸)を塩化メチレン処理を使用し、乾燥させ、塩化メチレン残留する全ての溶媒を蒸留することによって抽出できうる。

mPEG_(20K)-ジプロピオン酸を、ポリマー活性剤結合体を形成する反応のためのポリマー試薬（２つの活性剤を含んで成る）として使用することができうる。加えて、mPEG_(20K)-ジプロピオン酸を更に、カルボン酸以外の官能基を有するポリマー試薬を提供するために反応させられて良い。例えば、従来技術を使用することで、mPEG_(20K)プロピオン酸の対応するジN-ヒドロキシスキシンイミドエステル(例2を参照のこと)、ジアルデヒド(例3を参照のこと)、ジマエレイミド(例4を参照のこと)、及びジチオール(例5を参照のこと)を調製できうる。

実施例9
結合
スルフヒドリル選択的反応性基を有するmPEG2_(40K)-マレイミド(実施例4) を配列番号1〜349に提供されているように、各々のポリペプチド配列と反応させている。

上記構造中、(m)は約454であるか/あるいは各水溶性ポリマーの分子量は、約20,000Daであり、従って分子量約40,000Daを有する試薬が提供される。

任意の特定のポリペプチドがスルフヒドリル基を欠く(例えば、ポリペプチドはメチオニンとシステイン残基の両方を欠く)範囲で、メチオニン又はシステイン残基は、常用の合成技術、例えばWO90/12874を使用することでポリペプチドに対して結合させることができうる。

各ペプチドについて、過剰のポリマーをポリペプチドが入っている反応容器に対して加える。反応条件には、室温で約7〜約8のpHを含む。約5時間後、ポリペプチドとポリマーの結合が生産される。

実施例10
多腕ポリマー
反応性基を１以上含んで成る多腕ポリマーを次のようにして調製している。

３当量のカルボン酸ビス-(2,5-ジオキソ-ピロルジン-1イル)エステルをトリエチルアミン中、メチル-D-グルコピラノシドと組み合わせ、下に示すような第一中間体を獲得した。

次いで、この第１中間体を僅かに過剰のmPEG_(1OK)-アミンに対して、トリエチルアミンの存在下で曝し、下に示すように第二中間体を獲得した。

次いで、この第２中間体を酸が触媒する加水分解に委ね、下に示すようにアルデヒド及びヘミアセタール形態を獲得している。

アルデヒドは3個の、10K PEGからなり、それによって全体30Kの枝分かれ構造が提供される。順番に、このアルデヒドは、酸を介して他の形態へと任意に転換されている(例えば、カルボン酸は、アルデヒドが穏和な酸性条件に曝された場合に形成される)。

この方法は、２つの腕並びに４つの腕を提供するために使用されて良い。

全ての手順の間、物質(例えば、２重置換された及びいくつかの４重に置換されている）の混合物が生産されて良い。加えて、全てのポリマーの位置異性体も可能である。

実施例11
ポリマー-EPO結合体−EPOのランダムPEG化
組換えエリスロポエチン「EPO」(大腸菌(E. coli)、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞又は他の資源中で生産されている)を枝分かれmPEG2₍₄₀ _KDa) -ブチルアルデヒド(例3に記載のようにして調製した)に対して加えている。

EPO(約2mg)を1mlの50mMリン酸バッファー(pH7.6)中に溶かし、そして枝分かれPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルのEPO濃度で加えている。還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液24時間に渡り室温で撹拌しそして、枝分かれPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させた。

反応混合物を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGEによって分析した。結合の程度の特定を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質を含む。タンパク質に対するPEG試薬の比を増加させることで結合の程度が高まる。

上記のことは、本発明の例となるタンパク質のランダムPEG化によりPEG化されたEPOタンパク質の分配が生じることが証明されている。もし所望されれば、反応混合物は、更に、下に記載のような個々の異性体を単離するために分離されて良い。

様々な分子量を有するPEG結合体がゲルろ過クロマトグラフィーにより分離されている。様々なPEG結合体は、異なる分子量に基づいて分画化されている(この場合、約40,000Da異なる)。詳細に、分離を、確認される分子量範囲において産物の効果的な分離をするために適したシリアルカラムシステムの例えば、Superdex200カラム(Amersham Biosciences)を使用することによって行って。産物を10ml酢酸バッファーにより1.5ml/分の流速において溶出させている。回収した画分(1ml)を、OD280nmによってタンパク質含量についてそしてヨード試験を使用することでPEG含量(Simsら(1980) Anal. Biochem. vol.107:pp.60〜63)について分析した。加えて、この結果を、SDS PAGEゲルを行い、しかる後のヨウ化バリウム染色によって視覚化できうる。溶出ピークに対する画分は、膜を使用する限外ろ過、及び凍結乾燥によって回収、濃縮されて良い。この方法は、同じ分子量を有する結合体の分離/精製をもたらすが、異なるPEG化部位を有する結合体（即ち、位置異性体）の分離をもたらさない。

位置異性体の分離を、RP-HPLC C18カラム(Amersham Biosciences or Vydac)を使用する逆相クロマトグラフィーによって行っている。この手順は、同じ分子量を有するPEG-生物分子異性体(位置異性体)を分離するために有効である。逆相クロマトグラフィーは、RP-HPLC C18 カラムを使用することで行われ、そして水/0.05%TFA(溶出液A)及びアセトニトリル/0.05%TFA(溶出液B)の勾配により溶出されている。

溶出したピークに対応する画分を回収し、アセトニトリル及びTFAを除去するために蒸発させ、しかる後に溶媒を除去し、個々の位置PEG異性体を単離する。

この例は、EPOの結合体を形成させることにおいて使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例12
ポリマー-EPO結合体の調製、EPOの-N-末端PEG化
組換えエリスロポエチン「EPO」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)を枝分かれmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3のようにして調製した)に対して結合させた。

EPO(約2mg)を1mlの0.1mM 酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルEPO濃度で加えている。還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

反応混合物を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGEによって分析した。結合の程度の特定を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質を含む。タンパク質に対するPEG試薬の比を増加させることで結合の程度が高まる。モノ結合物質をカラムクロマトグラフィーによって、遊離EPO及び高分子量物質を除去するために精製した。

N-末端PEG化の確認をペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するPEGの比率が高まることで、PEG化の程度が高まり、ポリ結合化されたタンパク質が獲得される。

上記のことは、本発明の代表的タンパク質のPEG化により、主にN-末端単一PEG化タンパク質が得られることが示される。

実施例13
GCSFのN-末端PEG化
組換え顆粒球コロニー刺激因子「GCSF」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)を枝分かれmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3のようにして調製した)に対して結合させた。

GCSF(約2mg)を1mlの0.1mM 酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルEPO濃度で加えている。還元剤NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

生じる反応混合物を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGEによって分析した。結合の程度の確認を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は主に、天然GCSF及びモノ結合したGCSFの混合物を含む。モノ結合物を、遊離GCSF及び高分子量物質を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって精製している。N末端PEG化の確認を、ペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するPEGの比率が高まることで、PEG化の程度が高まり、ポリ結合化されたタンパク質が獲得される。

この例は、GCSFの結合体を形成させることにおいてに使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例14
インターフェロン-αのN−末端PEG化
組換えインターフェロンα「IFN−α」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)を枝分かれmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3のようにして調製した)に対して結合させた。

IFN-α(約2mg)を1mlの0.1mM 酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルIFNの濃度で加えている。還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してをアミン結合を介して結合させている。

反応混合物を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGEによって分析した。結合の程度の特定を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は主に、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質の混合物を含む。モノ結合した物質を、遊離インターフェロンα及び高分子量物質を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって精製している。N-末端PEG化の確認をペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するPEGの比率が高まることで、PEG化の程度が高まり、ポリ結合化されたIFN-αが獲得される。

この例は、IFN-αの結合体を形成させることにおいて使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例15
ヒト成長ホルモンのN−末端PEG化
組換えヒト成長ホルモン「hGH」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)を枝分かれmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3のようにして調製した)に対して結合させた。

hGH(約2mg)を1mlの0.1mM酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルEPO濃度で加えている。5〜20倍mol過剰の還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

反応の進行を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGE又はMALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって分析している。結合の程度の確認を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質及び他の物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は主に、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質の混合物を含む。モノ結合した物質を、遊離hGH及び高分子量物質を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって精製している。N-末端結合の確認をペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するPEGの比率が高まることで、結合の程度が高まり、ポリ結合化されたhGHの集団が獲得される。

この例は、hGHの結合体を形成させるために使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例16
インターフェロンβのN−末端PEG化
組換えインターフェロンβ「INF−β」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)を枝分かれmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3のようにして調製した)に対して結合させた。

INF-β(約2mg)を1mlの0.1mM酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルINF-β濃度で加えている。5〜20倍mol過剰の還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

反応の進行を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGE又はMALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって分析している。結合の程度の確認を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は主に、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質の混合物を含む。モノ結合した物質を、遊離IFN-β及び高分子量物質を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって精製している。N-末端PEG化の確認をペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するPEG2（40kDa）の比率が高まることで、結合の程度が高まり、ポリ結合化されたINF-βの集団が獲得される。

この例は、INF-βの結合体を形成させるために使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例17
FSHのN−末端PEG化
組換え濾胞刺激ホルモン「FSH」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)をmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3のようにして調製した)に対して結合させた。

FSH(約2mg)を1mlの0.1mM酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルFSH濃度で加えている。5〜20倍mol過剰の還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

反応の進行を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGE又はMALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって分析している。結合の程度の確認を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は主に、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質の混合物を含む。モノ結合した物質を、遊離FSH及び高分子量物質を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって精製している。N-末端PEG化の確認をペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するmPEG2（40kDa）−ブチルアルデヒドの比率が高まることで、結合の程度が高まり、ポリ結合化されたFSHの集団が獲得される。

この例は、FSHの結合体を形成させることにおいて使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例18
因子VIIIのN−末端PEG化
組換え因子VIII「F8」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)をmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3のようにして調製した)に対して結合させた。

F8(約2mg)を1mlの0.1mM酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルF8濃度で加えている。5〜20倍mol過剰の還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

反応の進行を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGE又はMALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって分析している。結合の程度の確認を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質及び他の物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は主に、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質の混合物を含む。モノ結合した物質を、遊離F8及び高分子量物質を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって精製している。N-末端PEG化の確認をペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するmPEG2（40kDa）−ブチルアルデヒドの比率が高まることで、結合の程度が高まり、ポリ結合化されたF8の集団が獲得される。

この例は、F8の結合体を形成させることにおいてに使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例19
Bドメイン欠失因子VIIIのN−末端PEG化
組換えBドメイン欠失因子VIII「BDF8」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)をmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3のようにして調製した)に対して結合させた。

BDF8(約2mg)を1mlの0.1mM酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルF8濃度で加えている。5〜20倍mol過剰の還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

反応の進行を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGE又はMALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって分析している。結合の程度の確認は、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行われている。天然物質及びモノ結合した物質及び他の物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は主に、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質の混合物を含む。モノ結合した物質を、遊離BDF8及び高分子量物質を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって精製している。N-末端PEG化の確認をペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するmPEG2（40kDa）−ブチルアルデヒドの比率が高まることで、結合の程度が高まり、ポリ結合化されたBDF8の集団が獲得される。

この例は、BDD F8の結合体を形成させることにおいて使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例20
mPEG2 _（40k） −ブタン酸,N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用する因子VIIIのPEG化
組換え因子VIII「F8」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)をmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスキシンイミドエステル(例2のようにして調製した)に対して結合させた。

F8を水性液体に溶かし、そしてmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを１〜１０倍molF8濃度で加えて、反応溶液を形成させた。この反応溶液のpHを約8〜9.5に調整し、そして温度を室温で維持した。この反応溶液を数時間に渡り撹拌し、ポリマー試薬をF8に対して、アミド結合を介して結合可能にさせた。反応溶液を試験することで、結合がN-末端及びリジン部位の両方において生じたことを確かめた。

この例は、F8の結合体を形成させることにおいて使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例21
mPEG2 _（40k） −ブタン酸,N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用するBドメイン欠失因子VIIIのPEG化
組換えBドメイン欠失因子VIII「F8」(大腸菌、哺乳類細胞の例えば、チャイニーズハムスターオバリー細胞、又は他の資源中で生産された)をmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスキシンイミドエステル(実施例2のようにして調製した)に対して結合させた。

BDF8を水性液体に溶かし、そしてmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを１〜１０倍molF8濃度で加えて、反応溶液を形成させた。この反応溶液pHを約8〜9.5に調整し、そして温度を室温で維持した。この反応溶液を数時間に渡り撹拌し、ポリマー試薬のF8に対する、アミド結合を介して結合可能にさせた。反応溶液を試験することで、結合がN-末端及びリジン部位の両方において生じたことを確かめた。

実施例22
デスモプレッシンのN-末端PEG化
デスモプレッシンをmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3に記載のようにして調製した)に対して結合させた。

デスモプレッシン(約2mg)を1mlの0.1mM酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5XモルBDDF8濃度で加えている。5〜20倍mol過剰の還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

反応の進行を、結合の程度を特定するためにSDS-PAGE又はMALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって分析している。結合の程度の確認を、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーによって行っている。天然物質及びモノ結合した物質及び他の物質に関して示されたピークは約40,000Da異なる。生じる反応混合物は主に、天然タンパク質及びモノ結合したタンパク質の混合物を含む。モノ結合した物質を、遊離デスモプレッシン及び高分子量物質を除去するためにカラムクロマトグラフィーによって精製している。N-末端PEG化の確認をペプチドマッピングによって行っている。タンパク質に対するmPEG2（40kDa）−ブチルアルデヒドの比率が高まることで、結合の程度が高まり、ポリ結合化されたデスモプレッシンの集団が獲得される。

この例は、デスモプレッシンの結合体を形成させることにおいて使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例23
mPEG2 _(40k) −ブタン酸,N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用するデスモプレッシンのPEG化
デスモプレッシンをmPEG2_(40KDa)-ブチルアルデヒド(実施例2に記載のようにして調製した)に対して結合させた。

デスモプレッシンを水性液体に溶かし、そしてmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを１〜１０倍molデスモプレッシン濃度で加えて、反応溶液を形成させた。この反応溶液pHを約8〜9.5に調整し、そして温度を室温で維持した。この反応溶液を数時間に渡り撹拌し、ポリマー試薬をデスモプレッシンに対して、アミド結合を介して結合可能にさせた。反応溶液を試験することで、結合が生じたことを確かめた。

実施例24
アムドキシビル（DAPD)のPEG化
アムドキシビル（DAPD）をmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド(例3に記載のようにして調製した)に対して結合させた。

アムドキシビル(約2mg)を1mlの0.1mM酢酸ナトリウム(pH5)に溶かしてmPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒドを5Xモルアムドキシビル濃度で加えている。5〜20倍mol過剰の還元剤、NaCNBH₃を加え、そしてこの溶液を24時間に渡り4℃で撹拌し、mPEG2(40KDa)-ブチルアルデヒド試薬をタンパク質に対してアミン結合を介して結合させている。

反応の進行をSDS-PAGE又はMALDI-TOFマススペクトロメトリーによって分析している。

この例は、アムドキシビル8の結合体を形成させるために使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

実施例25
mPEG2 _(40k) −ブタン酸,N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用するアムドキシビルのPEG化
アムドキシビル（DAPD）をmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスキシンイミドエステル(例2のようにして調製した)に対して結合させた。

アムドキシビルを水性液体に溶かし、そしてmPEG2_(40K)-ブタン酸,N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを１〜１０倍molアムドキシビル濃度で加えて、反応溶液を形成させた。この反応溶液pHを約8〜9.5に調整し、そして温度を室温で維持した。この反応溶液を数時間に渡り撹拌し、ポリマー試薬をアムドキシビルに対して、アミド結合を介して結合可能にさせた。反応溶液を試験することで、結合が生じたことを確かめた。

この例は、アムドキシビルの結合体を形成させることにおいて使用される本発明のポリマー試薬の能力を証明する。

Claims

以下の構造：

（式中、
ＰＯＬＹ¹は、水溶性ポリマーであり；
ＰＯＬＹ²は、水溶性ポリマーであり；
（ａ）は０，１，２又は３であり；
（ｂ）は０，１，２又は３であり；
（ｅ）は０，１，２又は３であり；
（ｆ’）は０，１，２又は３であり；
（ｇ’）は０，１，２又は３であり；
（ｈ）は０，１，２又は３であり；
（ｊ）は０〜２０であり；
各Ｒ¹は独立してＨであるかあるいはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択されている有機ラジカルであり；
Ｘ¹は、存在する場合、長さが１〜２０原子の直鎖の第１スペーサー部分であり、ここで第１スペーサー部分は、炭素、窒素、酸素、硫黄及び水素から成る群からそれぞれ独立に選択された１又は複数の原子から構成されており；
Ｘ²は、存在する場合、長さが１〜２０原子の直鎖の第２スペーサー部分であり、ここで第２スペーサー部分は、炭素、窒素、酸素、硫黄及び水素から成る群からそれぞれ独立に選択された１又は複数の原子から構成されており；
Ｘ⁵は、存在する場合、長さが１〜２０原子の直鎖の第５スペーサー部分であり、ここで第５スペーサー部分は、炭素、窒素、酸素、硫黄及び水素から成る群からそれぞれ独立に選択された１又は複数の原子から構成されており；
Ｘ⁶は、存在する場合、長さが１〜２０原子の直鎖の第６スペーサー部分であり、ここで第６スペーサー部分は、炭素、窒素、酸素、硫黄及び水素から成る群からそれぞれ独立に選択された１又は複数の原子から構成されており；
Ｘ⁷は、存在する場合、長さが１〜２０原子の直鎖の第７スペーサー部分であり、ここで第７スペーサー部分は、炭素、窒素、酸素、硫黄及び水素から成る群からそれぞれ独立に選択された１又は複数の原子から構成されており；
Ｘ⁸は、存在する場合、長さが１〜２０原子の直鎖の第８スペーサー部分であり、ここで第８スペーサー部分は、炭素、窒素、酸素、硫黄及び水素から成る群からそれぞれ独立に選択された１又は複数の原子から構成されており；
Ｒ⁵は、

（式中、（ｐ）は１〜８であり、そして（ｑ）は１〜８である）からなる群から選択された枝分かれ部分であり；そして
Ｚは、生理活性剤の求電子部位又は求核部位との反応に適当な反応基である）を有する、ポリマー試薬。
（式中、（ｍ）は２〜４０００であり、（ｆ）は０〜６であり、そして（ｎ）は０〜２０である）の構造を有する、請求項１に記載のポリマー試薬。
前記式中、（ｆ）が２〜４であり、そして（ｎ）が０〜４である、請求項３に記載のポリマー試薬。
からなる群から選択された構造（式中、各（ｍ）は２〜４０００である）を有する、請求項１に記載のポリマー試薬。
からなる群から選択された構造（式中、各（ｍ）は２〜４０００であり、そしてＰＯＬＹ ¹ 、ＰＯＬＹ ² 、Ｒ ¹ 、Ｘ ¹ 、Ｘ ² 、Ｘ ⁵ 、Ｘ ⁶ 、Ｘ ⁷ 、Ｘ ⁸ 、ａ、ｂ、ｅ、ｆ’、ｇ’、ｊ及びｈはそれぞれ請求項１に定義されるとおりである）を有する、請求項１に記載のポリマー試薬。
からなる群から選択された構造（式中、ｍＰＥＧ _(20K) は２０，０００ダルトンの分子量を有するメトキシ末端キャップ化ポリエチレングリコールである）を有する、請求項１に記載のポリマー試薬。
からなる群から選択された構造（式中、各（ｍ）は２〜４０００であり、そして各（ｎ）は０〜２０である）を有する、請求項１に記載のポリマー試薬。
結合体を調製する方法であって、請求項１に記載のポリマー試薬と活性剤を適切な条件下で接触させ、それにより薬物結合体を提供する工程を含んで成る方法。
医薬賦形剤との組み合わせにおいて請求項８に従い調製した結合体を含んで成る、医薬製剤。
前記賦形剤が糖である、請求項９に記載の医薬製剤。
凍結乾燥形態における請求項９又は１０に記載の医薬製剤。
更に液体希釈剤を含んで成る、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
前記液体希釈剤が、注射用静菌水、水中５％デキストロース、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、生理食塩溶液、滅菌水、脱イオン水及びこれらの組み合わせからなる群から選択されている、請求項１２に記載の医薬製剤。
単位投与形態における、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
ガラスバイアル中に入れられている、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の医薬製剤。