DE10114134A1

DE10114134A1 - Verfahren zur Herstellung modifizierter Hydroxypolymere mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen und deren Verwendung

Info

Publication number: DE10114134A1
Application number: DE10114134A
Authority: DE
Inventors: Victor Prisyazhnoy; Tatjana Bobrovink; Serguej Ovodov
Original assignee: BIOGENES
Current assignee: BIOGENES
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2001-03-19
Publication date: 2002-11-28

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein effizientes Verfahren zur kontrollierten Einführung einer oder mehrerer verschiedener funktioneller Gruppen in Polyhydroxypolymere, ohne die Grundstruktur des Ausgangspolymers zu verändern. In einer Anwendungsform der Erfindung werden photoaktivierbare Gruppen als funktionelle Gruppen eingeführt. DOLLAR A Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Hydroxypolymeren als Träger einer oder einer Vielzahl funktioneller Gruppen, die über die Carbamatgruppe(n) kovalent mit dem Rückgrat des Polymers verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung aus einem Hydroxypolymer in einem polaren aprotischen Lösungsmittel oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel mit einer Carbonsäure oder einem Gemisch verschiedener Carbonsäuren, einem azidgruppentragenden Reagenz und einer organischen Base bei erhöhter Temperatur umgesetzt wird, wobei das gebildete Polymer isoliert wird und wobei die Carbonsäure(n), das azidgruppenübertragende Reagenz und die organische Base in Mengen verwendet werden, um einen kontrollierten Modifizierungsgrad der Polyhydroxyverbindung zu erreichen.

Description

Die Erfindung betrifft ein effizientes Verfahren zur kon trollierten Einführung einer oder mehrerer verschiedener funktioneller Gruppen in ein Polyhydroxypolymer, ohne die Grundstruktur des Ausgangspolymers zu verändern. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Methode zur Einführung von photoaktivierbaren funktionellen Gruppen.

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der resul tierenden mit funktionellen Gruppen modifizierten Hydroxy polymere als Carrier für die kovalente Bindung von Protei nen, Peptiden und anderen Biomolekülen. In einer bevorzug ten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung mit photoaktivierbaren funktionellen Gruppen modifizierter Hydroxypolymere für die Modifizierung von Oberflächen durch photochemische Kopplung dieser Polymere an die Oberflächen. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur nachträglichen Modifizierung polymermodi fizierter Oberflächen durch kovalente Bindung von Proteinen an die restlichen photoaktiven Gruppen durch sekundäre Pho toaktivierung.

Die Bindung von Proteinen oder kleinen Molekülen an synthe tische oder natürliche Hydroxypolymere hat viele Vorteile für die medizinische und industrielle Anwendung. Derartige Modifizierungen können Biokompatibilitäten erhöhen, Immun antworten reduzieren oder verbessern, modifizierte Proteine in Lösungen stabilisieren. Darüber hinaus besitzen derart modifizierte Proteine eine verlängerte Halbwertzeit in bio logischen Systemen. Andererseits können synthetische oder natürlich vorkommende Polymere eine Vielzahl kleiner phar makologisch aktiven Moleküle binden und transportieren. Derartige Konjugate können für lipophile Substanzen die Wasserlöslichkeit erhöhen, für instabile Verbindungen die Halbwertzeit in Körperflüssigkeiten verlängern und im Falle einiger Antibiotika die Toxizität verringern.

Weiterhin ist bekannt, dass die Beschichtung von Oberflä chen verschiedener Materialien mit künstlichen oder natür lich vorkommenden Hydroxypolymeren (z. B. Dextranen oder Po lyethylenglykolen) die Befeuchtbarkeit und die Biokompati bilität hydrophober Oberflächen steigert und vor unspezifi scher Bindung von Proteinen schützt. Derartige Modifizie rungen sind für die Herstellung langlebiger biologischer Implantate von Bedeutung.

Andererseits erlaubt die Bindung von Proteinen und Peptiden an derart modifizierte Oberflächen die Entwicklung defi nierter Oberflächen für die Förderung spezifischer Zell wechselwirkungen.

Da Hydroxypolymere bezüglich direkter Reaktionen mit Prote inen oder niedrigmolekularen biologisch aktiven Verbindun gen mehr oder minder inert sind, muss für eine chemische Kopplung eine Aktivierung durchgeführt werden.

Es sind zwei fundamentale Methoden zur Kopplung von zwei oder mehreren unterschiedlichen Molekülen an Hydroxypolyme re bekannt. Die erste besteht in der direkten Aktivierung der Hydroxygruppen mit Hilfe von Bromcyan, 1-Cyano-4- dimethylaminopyridin Tetrafluoroborate (CDAP), Tosylchlorid oder Tresylchlorid. Die derart modifizierten Hydroxygruppen können mit hoch- oder niedermolekularen Stoffen, die entwe der eine Thiol- oder aber eine primäre oder sekundäre Ami nogruppe tragen, reagieren. Ebenfalls bekannt ist eine an dere Variante eines direkten Zugangs. Einige Hydroxypolyme re enthalten zwei vicinale Hydroxylgruppen (z. B. Dextrane, Mannane, Zellulose oder Stärke), die durch Natriummetajodat teilweise oxidiert, nachfolgend zu Aldehydgruppen unter C- C-Bindungspaltung umgewandelt werden können. Die so verän derten Polymere sind in der Lage, mit verschiedenen primäre Aminogruppen enthaltenden Verbindungen unter Bildung von Schiffschen Basen und nachfolgender reduktiven Amminierung zu stabilen sekundären Aminoverbindungen zu reagieren.

Für die Aktivierung spezifischer Mitglieder der Gruppe der Hydroxypolymere - Ethylenglycole verschiedener Molmassen - wird die Oxidation primärer Hydroxygruppen zu Aldehyden im Beisein von Carbodiimiden durch DMSO eingesetzt. Proteine oder niedermolekulare Liganden können so unter milden an die oxidierten Hydroxypolymere gekoppelt werden. Diese Me thode ist jedoch nur schwer zu kontrollieren, so dass die Reproduzierbarkeit des Verfahrens schlecht ist. Ein weite rer Nachteil der beschrieben Methode ist die fehlende Mög lichkeit gerichtet bzw. definiert zu koppeln. Ein weiterer wesentlich gravierender Nachteil aller auf Oxydation basie renden Methoden besteht darin, dass das Rückgrat der ent stehenden Dialdehydpolymere eine komplett andere Struktur aufweist, als die ursprünglich eingesetzten Ausgangspolyme re. Hiermit handelt es sich somit nicht um eine Modifizie rung von Polymeren, sondern um eine Synthese neuer Polyme re.

In einigen Fällen wird für die Kopplung zwischen dem Poly mer und dem niedermolekularen Ligand ein Spacer benötigt, um die sterische Hinderungen auszuschließen oder zur Redu zierung von Konformationsänderungen im Falle von Proteinen als Ligand zu erzielen (Penyol et al. (4). Biotechnol. Bi oeng. 60: 518-523 (1998)).

Eine zweite Möglichkeit der Kopplung von zwei oder mehreren unterschiedlichen Molekülen an Hydroxypolymere ist die so genannte Heteroligation. Dabei wird das Hydroxypolymer und die der Konjugationspartner mit unterschiedlichen chemi schen Gruppen modifiziert, die nacheinander selektiv abrea gieren können.

Die am häufigsten verwendeten funktionellen Gruppen sind:

1. Maleimid - Sulfhydrylgruppe (Thioether, vgl. Bild 1)
2. Vinylsulfon - Sulfhydrylgruppe (Thioether, vgl. Bild 1)
3. Haloalkyl - Sulfhydrylgruppe (Thioether, vgl. Bild 1)
4. Aldehyd - Hydrazidgruppe (Hydrazone)
5. Aldehyd - Hydroxylaminogruppe (Oxime)
6. Aldehyd - 1,2-Aminothiolgruppe (Thiazolidine)
7. Sulfhydryl - Sulfhydrylgruppe (Disulfide)

Die Heteroligation erlaubt die Herstellung mehr oder weni ger definierter Proteinpolysaccaride oder Peptidpolysacca ride, jedoch mit dem Nachteil aller Heteroligations- Methoden, dass sie mehrstufige Prozesse darstellen (vgl. z. B. Bild 2), mit konsequenterweise niedrigen Ausbeuten.

Es ist weiterhin bekannt, dass Isocyanate in neutraler nichtwässriger Umgebung leicht mit Hydroxylgruppen zu sta bilen Carbamaten reagieren. Ungeachtet der Tatsache, dass Isocyanate hochreaktive Verbindungen sind, ist deren Ein satz für die Modifizierung von Hydroxylgruppen aufgrund ih rer geringen Stabilität problematisch.

Ziel der Erfindung war es, eine einfache und bequeme Metho de zur Einführung unterschiedlicher funktioneller Gruppen in Polyhydroxypolymere zu entwickeln. Weiterhin war Ziel dieser Erfindung, Hydroxypolymere mit funktionellen Grup pen, die in der Lage sind Peptide, Proteine und andere Bio moleküle direkt und in hohen Ausbeuten zu binden, zugäng lich zu machen. Die erfindungsgemäßen Polymere sollen dar über hinaus gute Befeuchtbarkeit und Biokompatibilität be sitzen, um nichtspezifische Bindungen von Proteinen zu ver hindern.

Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe derart gelöst, dass eine neue Methode für eine effiziente Modifizierung von Hydroxypolymeren entwickelt wurde, bei der eine Lösung des Hydro xypolymers in einem polaren aprotischen Lösungsmittel oder einer Mischung dieser Lösungsmittel mit einer Carbonsäure oder einer Mischung unterschiedlicher Carbonsäuren, einer azidgruppenübertragenden Verbindung und einer organischen Base bei erhöhter Temperatur reagiert, in der die Carbon säure(n), das azidgruppenübertragende Reagenz und die orga nische Base in Mengen eingesetzt werden, die einen kontrol lierten Grad an Modifizierung des Polymers zulassen. So wurden die resultierenden Hydroxypolymere mit einem oder mehreren unterschiedlichen funktionellen Gruppen derart mo difiziert, dass sie kovalent über eine oder mehrere Carba matgruppen am Rückgrat des Hydroxypolymers gebunden wurden, ohne die Grundstruktur des Hydroxypolymers zu ändern.

Als Ausgangsmaterial wurden im erfindungsgemäßen Verfahren natürliche oder synthetische Polymere verwendet. Dies sind beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich: Dextrane, Dextranderivate bzw. -copolymere, Cellulosederivate und - copolymere, Polyvinylalkohole, Mannan, Mannanderivate bzw. -copolymere, Arabinogalactan, seine Derivate und Copolyme re, Polysucrose, Agarose, Stärke, Stärkederivate und Copo lymere, Polyethylen- bzw. Polypropylenglycole etc.

Einstufen-Modifizierung

In einer Ausführungsform der Erfindung kann die Modifizie rung in einer Einstufenreaktion durch Lösung des Hydroxypo lymers, der Carbonsäure bzw. der Mischung der unterschied lichen Carbonsäuren, des azidgruppenübertragenden Reagenzes und der organischen Base in einem polaren aprotischen Lö sungsmittel oder einer Mischung dieser Lösungsmittel bei erhöhter Temperatur durchgeführt werden. Die Einstufen- Modifizierung ist in Bild 4 schematisch dargestellt. In ei ner bevorzugten Ausführungsform der Einstufenreaktion wird das Hydroxypolymer in einem aprotischen Lösungsmittel oder einer Mischung dieser Lösungsmittel gelöst und die Carbon säure bzw. deren Mischung, das azidgruppenübertragende Rea genz und die organische Base bei erhöhter Temperatur inku biert hinzugegeben.

Zweistufenreaktion

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Modifizierung der Hydroxypolymere schrittweise wie in Bild 5 dargestellt, durchgeführt werden. Dabei wird eine Mi schung des Hydroxypolymers in einem polaren aprotischen Lö sungsmittel oder einer Mischung dieser Lösungsmittel, eine erste Carbonsäure, das azidgruppenübertragende Reagenz und die organische Base bei erhöhter Temperatur zur Reaktion gebracht und anschließend zu einer Mischung der zweiten Carbonsäure, des azidgruppenübertragenden Reagenzes und der organische Base hinzugefügt und die entstehende Mischung bei erhöhter Temperatur inkubiert. Der entstehenden Mi schung können weitere Carbonsäuren, je nach gewünschter Art der Modifizierung des Hydroxypolymers, in der beschriebe nen Weise hinzugefügt werden

Erfindungsgemäß kann die für die Modifizierung verwendete Carbonsäure ein carboxylgruppenenthaltendes substituiertes Arylketon z. B. ein Derivat des Benzophenons

in dem n = 0-12 und dessen substituierte (z. B. am Ring) Deri vate oder Acetylbenzoesäure und deren Derivate, die mit UV- Licht aktiviert werden können und in denen

n = 0-12 ist bzw. dessen substituierte (z. B. am Ring) Deriva te oder verschiedene Derivate der 1,2,3-Thiadiazole-4- carbonsäure mit

n = 0-12 sein.

In Abhängigkeit vom Ziel der Modifizierung kann als Carbon säure eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure in der

n = 0-12
oder verschiedene Maleimidogruppen enthaltende Säuren

in denen n = 0-12
oder verschiedne Dicarbonsäurederivate:

in denen n = 0-12, verwendet werden.

Als azidgruppenübertragendes Reagenz für die in situ Um wandlung von Carboxylgruppen in Acylazide können erfin dungsgemäß beispielsweise Diarylphosphorylazide, Dial kylphosphorylazide oder Trimethylsilylazide, bevorzugt Diphenylphosphorylazide oder Diethylphosphorylazide verwen det werden.

Als organische Base zur Neutralisierung der Carbonsäure werden erfindungsgemäß tertiäre Amine, bevorzugt Pyridin oder seine Derivate, Trialkylamine (z. B. Triethylamin, Ethyldiisopropylamin), Aryldialkylamine und deren Heteroanaloga verwendet.

Als organisches Lösungsmittel werden erfindungsgemäß He xaalkylphosphorsäuretriamide (z. B. Hexamethylphosphorsäu retriamid, Hexaethylphosphorsäuretriamid), N-Alkylpyrrolidone (z. B. N-Methylpyrrolidon, N-Ethyl-pyrrolidon), Dialkylsulfoxide (z. B. Dimethylsulfoxid, Diethylsulfoxid), Sulfolane, Dimethylformamid, Dimethylacetamid eingesetzt.

Die Umsetzung erfolgt erfindungsgemäß bei Temperaturen von 70-100°C, bevorzugt bei 80-90°C und in einer beson ders bevorzugten Variante bei 85°C. Die Reaktion benötigt üblicherweise eine Zeit von 4-24 Stunden, bei einer bevor zugten Reaktionsführung jedoch 12-16 Stunden. Die Reaktion wird bevorzugt unter Schutzgas (z. B. Argon, Neon, Stick stoff) durchgeführt.

Der Grad einer Hydroxypolymermodifizierung ist in sehr ein facher Weise dargestellt. Er hängt vom molaren Verhältnis zwischen der Carbonsäurekomponente und dem Gehalt der Hydroxylgruppen eines Hydroxypolymers ab. Diese Eigenschaft des Modifizierungsvorganges ermöglicht die Einführung von funktionell interessanten Gruppen in den Hydroxypolymer in einer kontrollierbaren Weise. Eine weitere entscheidende Komponente eines Reaktionsgemisches (eine organische Base und ein azidgruppenübertragendes Agens) wird immer im äqui molarem Verhältnis zur carbonsauren Komponente verwendet. Die Art eines polaren aprotischen Lösungsmittels hängt le diglich von der Löslichkeit des Hydroxypolymers ab. Jedoch kann in dieser Reaktion das Hydroxypolymer auch als fester Bestandteil eingeführt werden. Die Temperatur und Dauer der Modifizierungsreaktion hängen von der Struktur der Carbon säure ab.

Die hergestellten, modifizierten Hydroxpolymere der vorlie genden Erfindung können in jeder geeigneten Weise verwendet werden, einschließlich der Oberflächenmodifizierung, Prote in- oder Peptidkonjugation oder der kovalenten Immobilisie rung von Biomolekülen an diesen Träger.

Die photoaktivierbaren Polymere der vorliegenden Erfindung sind in Wasser gelöst in der Lage, beliebige Kunststoff oberflächen zu modifizieren, zum Beispiel verschiedene Ar ten von Polyolefinen (Polystyrole, Polymethylmethacrylate, Polyacrylsäureester, Polyacrylnitrile, Polyvinylchloride), Polyoxymethylene, Polycarbonate, Polyamide, Polyimide, Po lyurethane, Polyphenole, Epoxidharze, Polyester, Silikon. Andere Oberflächen wie Glas, Keramik, Quarz oder pyrolyti sche Kohlenstoffe eignen sich zur Modifizierung nach Modi fizierung durch Siloxane, die Alkyl-, Alkenyl- oder andere funktionelle Gruppen enthalten, die sich für photochemische Additionsreaktionen eignen. Dies bedeutet, dass jede Oberfläche, die eine C-H Bindung besitzt (=N-CH_x, -S-CH_x, =CH-CH₂-, -CH₂- oder -CH₃) eignet sich zur Modifizierung ge mäß der vorliegenden Erfindung.

Da Photogruppen (basierend auf Acetophenon oder Benzophe non) hydrophobe Eigenschaften besitzen, während Hydropoly mer hydrophil sind, erfolgt die Verbindung des erfindungs gemäß entstehenden photoaktivierbaren Polymers mit der hyd rophoben Oberfläche in orientierter Weise. Das bedeutet, dass sich photoaktivierbare Polymere mit der Photogruppe in Richtung der Oberfläche orientieren und mit dem polymeren Rückgrat von der Oberfläche weg. Der Assoziierungsgrad kann durch Veränderung des Molekulargewichts des Hydroxypolymers, des Beladungsgrades des Hydroxypolymers (Anzahl der Photogruppen pro Molekül des Hydroxypolymers), oder durch die Verwendung verschiedener lyotroper Salze (Natrium-, Ka lium- oder Lithium- Phosphat, Sulphat oder Chlorid) zur "Aussalzung", reguliert werden. Ein derartig an der Ober fläche orientiertes und assoziiertes photoaktivierbares Po lymer wird dann ultraviolettem oder sichtbarem Licht ausge setzt, um das Polymer kovalent mit der Oberfläche zu ver binden. Der Vorgang der Photoaktivierung kann dadurch regu liert werden, dass ein Teil der Photogruppen in der Photo reaktion mit der Oberfläche nicht einbezogen wird und somit zur nachfolgenden Protein-Photoimmobilisierung mit der hyd ropolymer-modifizierten Oberfläche benutzt werden kann.

Weiterhin wird die Erfindung anhand der folgenden Bilder und Beispiele dargestellt.

Bild 1 veranschaulicht ein Schema, das die Kopplung von Thiolliganden, z. B. modifizierte oder native Pro teine, an Polymere beschreibt, die Maleimid, Vi nylsulfon- oder Haloalkyl-Gruppen enthalten.

Bild 2 veranschaulicht ein bekanntes Schema der Aktivie rung von Hydroxypolymeren,

Bild 3 veranschaulicht ein Schema der Aktivierung von Hydroxypolymeren in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung.

Bild 4 veranschaulicht das Schema einer einstufigen Mo difizierung des Hydroxypolymers durch zwei verschiedene Carbonsäuren in Übereinstimmung mit ei ner Ausführungsform der Erfindung

Bild 5 veranschaulicht ein Schema einer schrittweisen Modifizierung des Hyroxypolymers durch drei ver schiedene Carbonsäuren in Übereinstimmung mit ei ner Ausführungsform der Erfindung.

Beispiele Beispiel 1

1000 mg Dextran T-500 wurden in 100 ml DMSO suspendiert, mit einem Magnetrührer gerührt und die entstehende Suspen sion wurde auf 50°C erwärmt. Nach vollständiger Auflösung des gesamten Dextrans wurden dieser klaren Lösung 0,211 g (1 mmol) 6-Maleinimidocapronsäure und 0,171 ml (0,129 g, 1 mmol) trockenes N-Ethyldiisopropylamin unter ständigem Rüh ren zugefügt. Die entstandene Mischung wurde eine weitere Stunde bei konstanter Temperatur (50°C) inkubiert, um die 6-Maleinimidcapronsäure aufzulösen und mit 0,216 ml (0,275 g, 1 mmol) Diphenylphosphoroylazid versetzt. Die Tem peratur des Reaktionsgemisches wurde auf 80°C erhöht und die Reaktion wurde bei dieser Temperatur unter Rühren mit einem Magnetrührer fortgeführt. Nach 12 Stunden bei 80°C wurde die Reaktion durch tropfenweises Hinzufügen von 100 ml kaltem Wasser beendet und der ausgefallene Niederschlag des modifizierten Dextrans wurde abzentrifugiert. Der Nie derschlag wurde 3 Mal mit 100 ml Ethanol gewaschen, dann in 100 ml Wasser gelöst und die Lösung gegen Wasser (3 × 3000 ml) dialysiert. Die Dextrankonzentrationen in der entstan denen Lösung wurden mittels Phenolschwefelsäure bestimmt. Die Anzahl der eingeführten Maleinimid-Gruppen wurde durch Titration mit 2-Mercaptoethanol nach folgender Methode be stimmt. 100 µl einer 10 mM 2-Mercaptoethanol-Lösung in 100 mM HEPES, pH 6,8, 2 mM EDTA wurden 900 µl einer modifizier ten Dextran-T-500-Lösung im gleichen Puffer hinzugefügt und im Dunkeln 120 Minuten bei 25°C inkubiert. Anschließend wurden 9 ml 1 mM 4,4'-Dipyridyldisulfid im gleichen Puffer dem Reaktionsgemisch zugefügt und weitere 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Ab sorption des Reaktionsgemisches bei 324 nm gemessen und die Anzahl der nicht reagierten Sulfhydrylgruppen über den mo laren Extinktionskoeffizienten von 22.000 M^-1cm^-1 für 4- Thiopyridon bestimmt. Parallel wurde die Messungen einer Probe mit nichtmodifiziertem Dextran T-500 durchgeführt und die Anzahl der eingeführten Maleimid- Gruppen aus der Dif ferenz der Absorptionen bestimmt. Die Anzahl der eingeführ ten Maleimid-Gruppen wurde mittels Rücktitration mit Mer captoethanol bestimmt. Die Ausbeute an modifiziertem Dextran lag bei 940 mg (94%) und die Präparation hatte ei nen durchschnittlichen Beladungsgrad von 400 Maleinimid- Gruppen pro 500 kDa.

Beispiel 2

1000 mg Dextran T-70 wurden in 100 ml NMP (N- Methylpyrrolidon) unter Rühren mit einem Magnetrührer sus pendiert und die entstandene Suspension auf 110°C erwärmt. Nach vollständiger Auflösung des gesamten Dextran wurden dieser klaren Lösung 0,226 g (1 mmol) Benzophenon-4- Carbonsäure und 0,139 ml (0,101 g, 1 mmol) trockenes Triethylamin unter ständigem Rühren zugefügt. Die entstan dene Mischung wurde eine weitere Stunde bei konstanter Temperatur (110°C) inkubiert, um die Benzophenon-4- Carbonsäure zu lösen und mit 0,216 ml (0,275 g, 1 mmol) Diphenylphosphoroylazid versetzt. Die Temperatur des roylazid versetzt. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde auf 120°C erhöht und die Reaktion bei dieser Tempera tur unter Rühren auf dem Magnetrührer fortgeführt. Nach ei ner Inkubation von 12 Stunden bei 120°C wurde die Reaktion auf 25°C abgekühlt und anschließend durch tropfenweise Zu gabe von 100 ml kaltem Wasser beendet. Der Niederschlag des modifizierten Dextrans wurde abzentrifugiert, 3 mal mit 100 ml Ethanol gewaschen, in 100 ml Wasser gelöst und die Lö sung wurde gegen Wasser dialysiert (3 × 3000 ml). Die Dextrankonzentrationen in der entstandenen Lösung wurden durch Phenolschwefelsäure bestimmt. Die Anzahl der einge führten Benzophenongruppen wurde mittels spektrophotometri scher Analyse bestimmt. Die Ausbeute dieses modifizierten Dextran lag bei 905 mg (90,5%) und die Präparation hatte einen durchschnittlichen Beladungsgrad von 70 Maleinimid- Gruppen pro 70 kDa.

Beispiel 3

Modifiziertes Dextran T-70, gemäß Beispiel 2 zubereitet, wurde in doppelt destilliertem Wasser in einer Konzentrati on von 1 mg/ml gelöst. Die entstandene Lösung wurde in zwei 96-Well Mikrotiterplatten (50 µl pro Well) verteilt. Nach der Inkubation über Nacht in einer Feuchtkammer bei 4°C wurde die Platte viermal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Die erste Platte wurde einem UV-Licht hoher In tensität (0,5-3 mW/cm², 320 nm, 5 Min) ausgesetzt. Die zweite Platte wurde als Kontrolle geführt nicht dem UV- Licht ausgesetzt. Beide Platten wurden viermal mit doppelt destilliertem Wasser, welches 0,01% Triton X-100 enthielt, gewaschen. Das anhaftende Dextran T-70 wurde mit 20 mM NaIO₄ in 50 mM Natriumazetatpuffer, pH 5,0 (50 µl pro Well) innerhalb von 60 Min. im Dunkeln oxidiert. Die Oxidation wurde durch Zugabe von 50 µl pro Well einer 60 mM Lösung aus Ethylenglycol in Wasser beendet. Nach einer weiteren Inku bation von 30 Min. wurden beide Platten viermal mit doppelt destilliertem Wasser, welches 0,01% Triton X-100 enthielt, gewaschen. Dann wurden beide Platten wie folgt für den in direkten ELISA vorbereitet: eine 100 µl Probe einer Lösung aus 100 mM HEPES-Puffer, 5 mM NaCNBH₃, pH 7,2, die humanes α-Fetoprotein (AFP) in einer Konzentration von 5 µg/ml ent hielt, wurde in die Wells auf der Platte zugefügt. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurde die Platte viermal mit PBS, welches 0,01% Triton X-100 enthielt, gewaschen und durch 2% BSA in PBS 1 Stunde bei Zimmertemperatur blo ckiert. 100 µl Proben eines 1 µg/ml monoklonalen Anti-AFP- IgG wurden den entsprechenden Probewells hinzugefügt. Als Negativkontrolle wurde dieselbe Lösung aus nichtspezifi schem Maus-IgG verwendet. Die Probeplatten wurden in einer Feuchtkammer bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Anschlie ßend wurde viermal mit Tris-Puffer-Kochsalzlösung (TBS, 50 mM Tris, pH 7,8, 150 mM Natriumchlorid), die 0,01% Triton X-100 enthielt, gewaschen. Die Bestimmung der gebundenen Antikörper wurde mit einem Ziege-Anti-Maus IgG (Fc- spezifisch) alkalischen Phosphatasekonjugat durchgeführt. Die Quantifizierung der gebundenen Enzyme wurde mit Hilfe von Paranitrophenol-haltigem Substratpuffer in einem Bio- Rad Modell 450 Mikroplattenlesegerät durchgeführt. Alle Wells in der Platte, die dem UV-Licht ausgesetzt waren, zeigten sehr starke positive Signale nach 5-minütiger Inku bation mit Paranitrophenol-haltigem Substratpuffer, außer den negativen Kontroll-Wells. Andererseits zeigten alle Wells in der Platte, die dem UV-Licht nicht ausgesetzt wa ren, sehr schwache Signale wie bei den Wells der Negativ kontrolle auf der ersten Platte. Dieses Beispiel zeigte, dass modifiziertes Dextran T-70 sich nach UV-Bestrahlung kovalent mit der Oberfläche einer Styropor 96-Well-Platte verbindet und für eine nachfolgende kovalente Immobilisie rung von Protein an einer Kunststoffoberfläche eingesetzt werden kann.

Beispiel 4

550 mg Polyethylenglykol(550)-monomethyläther wurden in 20 ml Toluen gelöst. Zu dieser Lösung wurden 164 mg (1 mmol) 4-Acetylbenzoesäure und 0,171 ml (0,129 g, 1 mmol) trocke nes N-Ethyldiisopropylamin unter ständigem Rühren zugefügt. Die entstandene Mischung wurde eine weitere Stunde bei gleichbleibender Temperatur (50°C) inkubiert, um die 4- Acetylbenzoesäure vollständig zu lösen und mit 0,216 ml (0,275 g, 1 mmol) Diphenylphosphoroylazid versetzt. Die Tem peratur des Reaktionsgemisches wurde auf 100°C erhöht und die Reaktion bei dieser Temperatur unter Rühren auf dem Magnetrührer fortgeführt. Nach einer Inkubation von 12 Stunden bei 100°C wurde die Reaktion auf 50°C abgekühlt und durch tropfenweise Zugabe von 10 ml Ethanol beendet. Der modifizierte Polyethylenglykol(550)-monomethyläther präzi pitierte bei Zugabe von trockenem Diethyläther, nachdem das Volumen des Reaktionsgemisches am Rotationsverdampfer auf 5 ml reduziert wurde. Die Fällung wurde fünfmal wiederholt.

Der Grad der Modifizierung der Endgruppen wurde durch spektrophotometrische Analyse bestimmt, Ausbeute 89%.

Beispiel 5

Modifizierter Polyethylenglykol(550)-monomethyläther, gemäß Beispiel 4 zubereitet, wurde in doppelt destilliertem Was ser in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Die ent standene Lösung wurde auf zwei 96-Well-Platten (50 µl pro Well) verteilt. Die erste Platte wurde UV-Licht hoher In tensität ausgesetzt (0,5-3 mW/cm², 254 nm, 5 Min). Die zweite als Kontrolle geführte Platte wurde dem UV-Licht nicht ausgesetzt. Anschließend wurden beide Platten viermal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und für den in direkten ELISA wie folgt vorbereitet: eine 100 µl Probe ei ner Lösung aus 100 mM BICIN-Puffer, pH 9,0, die humanes α- Fetoprotein (AFP) in einer Konzentration von 5 µg/ml ent hielt, wurde in die Wells der Mikrotiterplatte zugefügt. Nach der Inkubation über Nacht bei 4°C wurde die Platte viermal mit PBS, welches 0,01% Triton X-100 enthielt, gewa schen und mit 2% BSA in PBS 1 Stunde lang bei Raumtempera tur geblockt. 100 µl-Proben aus 1 µg/ml monoklonalem Anti- AFP-IgG wurden den entsprechenden Probe-Wells zugefügt. Als Negativkontrolle diente dieselbe Lösung eines nichtspe zifischen Maus-IgG. Die Probeplatten wurden in einer Feuchtkammer bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Anschlie ßend wurden sie viermal mit Trispuffer-Kochsalzlösung (TBS, 50 mM Tris, pH 7,8, 150 mM Natriumchlorid), welche 0,01% Triton X-100 enthielt, gewaschen. Die Bestimmung der gebun denen Antikörper wurde mit Hilfe eines Ziege-Anti-Maus IgG (Fc-spezifisch) alkalischen Phosphatasekonjugates durchge führt. Die Quantifizierung der gebundenen Enzyme wurde mit Hilfe eines p-Nitrophenolhaltigen Substratpuffers in einem Bio-Rad Modell 450 Mikroplattenlesegerät durchgeführt. Alle Wells in der Platte, die dem UV-Licht nicht ausgesetzt wa ren, zeigten stark positive Signale nach einer 5-minütigen Inkubation mit p-Nitrophenolhaltigem Substratpuffer, mit Ausnahme der Wells der Negativkontrolle. Andererseits zeig ten alle Wells in der Platte, die dem UV-Licht ausgesetzt waren, wie im Falle der Wells der Negativkontrolle in der ersten Platte, sehr schwache Signale. Dieses Beispiel zeigt, dass modifizierter Polyethylenglykol(550)- monomethyläther nach UV-Bestrahlung kovalent an die Ober fläche einer Styropor 96-Well-Platte gebunden wird und eine nachfolgende Absorption von Protein an der Kunststoffober fläche vollständig blockiert wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung modifizierter Hydroxypoly mere mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, kovalent durch Carbamatgruppe(n) an das Rückgrat des Polymers gebunden, umfassend das Umsetzen einer Lö sung eines Hydroxypolymers in einem polaren aproti schen Lösungsmittel oder einer Mischung dieser Lö sungsmittel mit einer Carbonsäure oder einer Mischung verschiedener Carbonsäuren, einem azidgruppenübertra genden Reagenz und einer organischen Base bei erhöh ter Temperatur und die Gewinnung des gebildeten Poly mers, wobei die Carbonsäure(n), das azidgruppen übertragende Reagenz und die organische Base in ef fektiven Mengen eingesetzt werden, um einen kontrol lierten Modifizierungsgrad der Polyhydroxyverbindung zu erreichen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem eine Mischung aus Carbonsäure(n), azidgruppenübertragendem Reagenz und organischer Base, bei erhöhter Temperatur inku biert, zu der Lösung des Hydroxypolymers in einem po laren aprotischen Lösungsmittel oder einer Mischung dieser Lösungsmittel zugefügt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem eine Mischung des Hydroxypolymers in einem polaren aprotischen Lö sungsmittel oder einer Mischung dieser Lösungsmittel, eine erste Carbonsäure, einem azidgruppenübertragenden Reagenz und einer organischen Base, bei erhöhter Temperatur inkubiert, einer zweiten Mischung aus ei ner zweiten Carbonsäure, einem azidgruppenübertragen den Wirkstoff und einer organischen Base zugefügt und die daraus entstehende Mischung anschließend bei er höhter Temperatur inkubiert wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, in welchem eine dritte, vierte, fünfte oder weitere Mischung mit einer drit ten, vierten, fünften oder weiteren Carbonsäure zuge fügt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem die Carbonsäu re aus Carbonsäurederivaten von Substanzen ausgewählt ist, die lichtaktivierbar sind.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem die Carbonsäure aus Carbonsäurederivaten photoaktivierbarer Ketone ausgewählt ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, in welchem die Carbonsäure ein Carbonsäurederivat des Benzophenons, Acetophenons oder Acetonaphthons ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, in welchem die Carbonsäu re 4-Benzoylbenzoesäure, 4-(4-Benzoylphenyl)- buttersäure oder 4-Acetylbenzoesäure ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem die Carbonsäu re aus Carbonsäuren mit ethylenisch ungesättigten Doppelbindungen ausgewählt ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem das azidgrup penübertragende Reagenz aus der Gruppe der Di arylphosphorylazide, Dialkylphosphorylazide und Tri methylsilylazide ausgewählt ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, in welchem das azid übertragende Reagenz Diphenylphosphorylazid oder Diethylphosphorylazid ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem die organische Base ausgewählt ist aus tertiären Aminen, insbesonde re Pyridin, Trialkylaminen, Aryldialkylaminen und He teroaryldialkylaminen.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem das polare aprotische Lösungsmittel aus der Gruppe der Hexaal kylphosphorsäure-Triamide, N-Alkylpyrrolidone, Dial kylsulfoxide und Sulfolane oder deren Gemische ausge wählt ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, in welchem das polare aprotische Lösungsmittel N-Methylpyrrolidon oder Di methylsulfoxid ist.

15. Verwendung von modifizierten Hydroxypolymeren mit pho toaktivierbaren Gruppen, die gemäß einem der Ansprü che 1 bis 14 hergestellt sind, zur Modifizierung von Oberflächen, die C-H Bindungen tragen, durch photo chemische Addition dieser Hydroxypolymere.

16. Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei an die restlichen photoaktivierbaren Gruppen, die nicht an der photochemischen Addition an die Oberfläche beteiligt sind, Proteine photoimmobilisiert werden.