AT359456B - Verfahren zur herstellung eines neuen, biologisch aktiven wasserunloeslichen produktes - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 
 EMI1.1 
 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 der Verfahrensschritte nicht zwingend. Beispielsweise kann die Hydrolyse vor der Bindung an die biologisch aktive Substanz stattfinden. Das   Poly (vinylencarbonat),   das als Ausgangsmaterial eingesetzt wird, kann während der Umsetzung intermediär oder auch durch besondere Verfahrensschritte in Polyhydroxymethylen   übergehen.   So kann man beispielsweise als Ausgangsmaterial eingesetztes Poly (vinylencarbonat) zunächst mit dem Spacer umsetzen ; die aus dieser Umsetzung resultierende Verbindung, die weder Poly (vinylencarbonat) noch Polyhydroxymethylen ist, kann man-dann einer Hydrolyse unterwerfen und das Hydrolyseprodukt, das wieder weder Polymethylencarbonat noch Polyhydroxymethylen ist, mit der biologisch aktiven Substanz umsetzen. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen biologisch aktiven Produkte weisen demnach ein wasserunlösliches Poly (hydroxymethylen) auf, an das eine biologisch aktive Substanz unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität gebunden ist. In diesen Produkten a) ist die Trägermatrix Polyhydroxymethylen, b) sind die biologisch aktiven Substanzen Stoffe wie Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, andere Plasmaproteine, Blutgruppensubstanzen, Phythämagglutinine, Antibiotika, Vitamine oder Hormone, Peptide oder Aminosäuren oder synthetisch hergestellte Effektoren. 



   Polyhydroxymethylen ist ein synthetisches Polymeres mit einer durchgehenden Kohlenstoff-Kette. Jedes Kohlenstoffatom trägt ein Wasserstoffatom und eine Hydroxylgruppe. Seine Herstellung und seine Eigenschaften sind unter anderem beschrieben von N. D. Field, J. R. Schaefgen, J. Polymer   Sci.,   Bd. 58,533-543 (1962) und G. Smets, K. Hayashi, J. Polymer Sci.. Bd. 29, 257-274 (1958). 



  Es ist durch basische oder saure Hydrolyse aus Polyvinylencarbonat herstellbar. Im weiteren Sinne ist das Polyhydroxymethylen als Derivat des Polyvinylencarbonats aufzufassen. Die Bindung der Effektoren an das Polyhydroxymethylen kann erreicht werden durch Umsetzung des Polyvinylencarbonats über die bekannte aminolytische Reaktion eines Cyclocarbonatringes des Polyvinylencarbonats mit einem primären Amin,   z. B.   mit Hexamethylendiamin, zu einem über eine Urethan- 
 EMI2.1 
 
 EMI2.2 
 
 EMI2.3 
    :"Spacer"bezeichnetes   Zwischenglied an die Matrix kovalent zu binden. 



   Die Spacer-Substanzen sind meist Kohlenwasserstoffgerüste der Länge um 1 bis 2 nm. Zwei 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 
 EMI3.1 
 
 EMI3.2 
 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 
Die   erfindungsgemäss   erhältlichen, biologisch aktiven Produkte eignen sich für die meisten Anwendungsverfahren, die bisher für andere an hydrophile, wasserunlösliche Träger gebundene Effektoren bekanntgeworden sind. Es können demnach Enzyme wasserunlöslich gemacht werden. Die unlöslichen Enzyme werden zunehmend zur Bestimmung von Substraten in Analysenautomaten und als sogenannte Enzymelektroden verwendet. Wegen der erhöhten Stabilität eignet sich eine Reihe trägergebundener Enzyme für die Durchführung technisch enzymatischer Umsetzungen. 



   Trägergebundene, biologisch aktive Produkte haben wegen ihrer Eigenschaft als spezifische Adsorbentien eine breite Anwendung in der Affinitätschromatographie gefunden. Mit Hilfe von trägergebundenen natürlichen oder synthetischen Enzyminhibitoren gelingt die Hochreinigung von Enzymen, während die Enzyme als Effektoren insbesondere zur Gewinnung natürlicher Enzyminhibitoren aus Rohextrakten hervorragend geeignet gefunden wurden. Trägergebundene wasserunlösliche Antigene werden zur Isolierung der zugehörigen Antikörper verwendet, die auf diese Weise frei von andern Serumbestandteilen und frei von andern Antigenen erhalten werden.   Affinitätschromatographisch   können auch nicht präzipitierbare Antikörper sowie solche, die wegen ihrer geringen Konzentration im Serum nicht fällbar sind, isoliert und auch quantitativ bestimmt werden. 



   In den zur Erläuterung der Erfindung nachstehend aufgeführten Beispielen ist aufgezeigt, dass ein nach einem einzigen Verfahren hergestellter Träger sich für die Bindung der verschiedensten Effektoren eignet und dass der Grundkörper Polyhydroxymethylen durch geeignete Substitution zur Bindung jedes gewünschten Effektors geeignet gemacht werden kann. 



   Ferner wird beispielhaft aufgezeigt, wie die matrixgebundenen Effektoren eingesetzt werden können. 



   Beispiel 1 : Umsetzung von Polyvinylqncarbonat mit einer biologisch aktiven Verbindung und anschliessender Hydrolyse der restlichen Zyklocarbonatgruppen. 



   1 g aus Dimethylformamid/Methanol ungefälltes Polyvinylencarbonat wird in einer Lösung von 20 mg Trypsin (Enzymklassifikation 3. 4. 4. 4) mit insgesamt 3600 EU   [=   Enzymeinheiten 
 EMI4.1 
 
61 M Natriumchloridlösung gewaschen. 



   Der Filterrückstand wird anschliessend in 10 ml 0, 2 M Natriumbicarbonatlösung suspendiert und 24 h bei   37 C   gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert der Suspension durch Zugabe von 1 M NaOH zwischen 9,0 und 9, 5 gehalten. 



   Das Polymere wird durch Filtrieren über eine Glasfritte von der Lösung getrennt und mit 50 ml 1 M Natriumchloridlösung gewaschen. 



   Das Polymere enthält 31% der eingesetzten Enzymaktivität an Trypsin. 
 EMI4.2 
 : Polyhydroxymethylen-Pepsin-Verbindung.8, 0 g aus Dimethylformamid/Methanol   umgefälltes Polyvinylencarbonat,   hergestellt nach N. D. Field, J. R. Schaefgen,   J. Polymer Sei.,   Bed. 58, Seite 534 (1962), wird bei Raumtemperatur in einer Lösung von 7,5 g Hexamethylendiamin in 180 ml Methanol suspendiert und 48 h bei Raumtemperatur gerührt, abgesaugt, mit Methanol ausgewaschen und in einer Lösung von 10 g Natriummethylat in 300 ml   96% igem Methanol   4 Tage bei Raumtemperatur suspendiert, mit Methanol und dann sehr intensiv mit Wasser ausgewaschen.

   Eine getrocknete Probe des über einen Spacer von 6   eH 2 -Gruppen   mit primären Aminogruppen substituierten Polyhydroxymethylen-Adsorbens hatte einen Stickstoffgehalt von 5,   7%.   



   Herstellung des trägergebundenen Effektors ; Effektor : Pepsin. 



   20 g   (M-Amino-n-hexyl)-substituiertes   Polyhydroxymethylen, hergestellt wie oben angegeben, werden in 400 ml (0, 2 Mol) Natriumphosphat, PH 10, suspendiert. Der Suspension werden unter Rühren 40 ml einer   25%igen Glutardialdehydlösung   zugesetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird über eine Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 4   l   (0, 2 Mol) Natriumacetatpuffer, p   4,   0, gewaschen. Anschliessend wird das Reaktionsprodukt in 500 ml einer Lösung 
 EMI4.3 
 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 



   Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Pepsin :
Proteolytische Spaltung von Immunglobulinen. 



   Das Adsorbens nach vorliegendem Beispiel wird in   0,   Mol Acetatpuffer, PH 4, 0, suspendiert und davon eine Aktivitätsbestimmung nach Anson durchgeführt. Die Suspension enthält insgesamt 21000 Einheiten Pepsin in gebundener und mit diesem Test nachweisbarer Form. Zur proteolytischen Spaltung von Human-Immunglobulin G wird das Pepsin-Adsorbens abfiltriert und der Rückstand 
 EMI5.1 
 Der Spaltansatz wird 24 h bei   370C gerührt.   Nach Abfiltrieren des trägergebundenen Pepsins wird das Filtrat mit 1250 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Das dabei entstehende Präzipitat wird abzentrifugiert ; es enthält das F (ab) 2-Fragment des Immunglobulins mit dessen Antikörperaktivität. Der Abguss wird verworfen.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung eines neuen biologisch aktiven wasserunlöslichen Produktes, dadurch gekennzeichnet, dass man Poly (vinylencarbonat), gegebenenfalls über eine oder mehrere bifunktionelle organische Verbindungen, mit einer natürlichen oder synthetischen biologisch aktiven Substanz umsetzt und die restlichen Cyclocarbonatgruppen hydrolysiert.