WO1996009547A2 - Verfahren zur untersuchung der wechselwirkung von biomolekülen mittels oberflächen-plasmon-resonanz - Google Patents

Verfahren zur untersuchung der wechselwirkung von biomolekülen mittels oberflächen-plasmon-resonanz Download PDF

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WO1996009547A2
WO1996009547A2 PCT/EP1995/003731 EP9503731W WO9609547A2 WO 1996009547 A2 WO1996009547 A2 WO 1996009547A2 EP 9503731 W EP9503731 W EP 9503731W WO 9609547 A2 WO9609547 A2 WO 9609547A2
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poly
biosensor unit
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Peter Steinlein
Wolfgang Zauner
Bianca Habermann
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Boehringer Ingelheim International Gmbh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/26—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one amino group bound to the carbon skeleton, e.g. lysine

Definitions

  • the invention relates to the study of
  • Macromolecules e.g. (Poly) peptide (poly) peptide or (poly) peptide-DNA interactions have been reported in the past
  • a recently developed method is based on the optical phenomenon of surface plasmon resonance ("Surface Plasmon Resonance", SPR).
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • Glass support which has a gold layer on one side, to which a hydrogel matrix made of carboxymethyl-dextran is covalently attached via a barrier layer provided with linker groups
  • the hydrogel matrix serves on the one hand
  • hydrogel matrix is generally a (poly) peptide, the following methods have hitherto been used on the hydrogel matrix:
  • Process 1) is associated with the risk that, due to the non-directional chemical reaction between the hydrogel-forming substance and the
  • (Poly) peptide takes place, the biological and / or biophysical properties of which are influenced in a way that is difficult or impossible to define. That can have the consequence that the immobilized (poly) peptide is not or not completely in its native, biologically active form because, for example, the
  • Section of the molecule that is to interact with the reactant has been blocked by a chemical grouping or has become inaccessible due to a change in the conformation of the molecule.
  • Sandwich immunoassays e.g. in the ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) technique.
  • ELISA Enzyme linked Immunosorbent Assay
  • the present invention was based on the object of a method for investigating the interaction of (poly) peptides with reactants using SPR provide the disadvantages of the known
  • affinity peptides Use of genetic engineering methods as fusion proteins with sequence segments that have high affinity for a ligand (so-called affinity peptides)
  • Immobilized metal chelate affinity chromatography is a wide one
  • nitrilotriacetic acid derivatives have particularly advantageous properties, which include the extremely high affinity for certain metal ions, for example Cu 2+ , Ni 2+ or Zn 2+ . So far, this method has been widely used using nickel as the metal ion and
  • Nitrilotriacetic acid as a complexing agent in the
  • the present invention thus relates to a method for investigating the interaction of a (poly) peptide with a reaction partner by means of a
  • Biosensor unit in which the through the
  • Interaction triggered surface plasmon resonance is determined in a metallic layer at the interface of two media which are permeable to electromagnetic radiation and have a different refractive index, the medium with a lower refractive index being an aqueous medium in which the (poly) peptide is present in an immobilized form and with the
  • Reaction partner is brought into contact.
  • the invention relates to a biosensor unit for examining the
  • Reaction partner by determining the surface plasmon resonance in a metallic layer at the interface of two media with different permeability for electromagnetic radiation
  • Refractive index is an aqueous medium.
  • Biosensor unit is characterized in that a chelating agent, possibly in a form complexed with a metal ion, is bound to its surface facing the aqueous medium.
  • the aqueous phase is a biocompatible porous matrix, in particular a hydrogel.
  • hydrogel formers there is basically no restriction with regard to the hydrogel formers, provided that they are suitable for the SPR process, especially with regard to the required diffusion of the biomolecules in the
  • Hydrogel matrix is basically given.
  • suitable hydrogel formers are polysaccharides, such as agarose, dextran, carragen, alginates, starch, cellulose or derivatives of these polysaccharides, such as e.g.
  • Carboxymethyl derivatives or water-swellable organic polymers, such as polyvinyl alcohol, polyacrylic acid,
  • Polyacrylamide or polyethylene glycol are examples of Polyacrylamide or polyethylene glycol.
  • a particularly suitable hydrogel consists of dextran, which with regard to the covalent binding of the
  • Hydrogel layer and its binding to the metal layer, which is optionally carried out via an organic barrier layer, was among others. in PCT application WO 90/05303 and by Löfas and Johnsson, 1990.
  • the chelating agent is bound to the reactive groups of the hydrogel.
  • the hydrogel former is a dextran which has carboxymethyl groups as reactive groups.
  • the (poly) peptide is a fusion (poly) peptide which, in addition to its biologically active section, has an affinity peptide which contains at least two adjacent histidine residues.
  • the chelating agent is on
  • NTA Nitrilotriacetic acid
  • R can be an alkylene bridge of the type (CH 2 ) n - which can be substituted or unsubstituted, with the proviso that the substituent does not adversely affect the function of the chelating agent, and n is an integer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 means, the alkylene group being of sufficient size
  • R can mean an aromatic bridge member which consists of one or more one or more
  • polynuclear aromatics which can optionally also be an aromatic heterocycle, is built up, or in which R can mean an aralkyl bridge member in which the aromatic part either directly or via an alkyl group of the type (CH 2 ) n -, in which n is a whole Number 1, 2, 3, 4 or 5 may mean to which Y or to which the ⁇ -C atom adjacent to the carboxyl group may be bound, and in which Y is a reactive group, in particular an NH 2 or an SH group.
  • R can mean an aralkyl bridge member in which the aromatic part either directly or via an alkyl group of the type (CH 2 ) n -, in which n is a whole Number 1, 2, 3, 4 or 5 may mean to which Y or to which the ⁇ -C atom adjacent to the carboxyl group may be bound, and in which Y is a reactive group, in particular an NH 2 or an SH group.
  • R examples are methylene, ethylene, n-propylene or iso-propylene or o-, m-, p-phenylene or ⁇ , ⁇ '-naphthylene.
  • the NTA derivative can also have the general formula Y-R1-CH (COOH) -N (CHR2COOH) 2 , in which R1 is a group with that indicated for R.
  • R2 can be an alkyl group of the type CH 3 (CH 2 ) n -, which is substituted, for example with OH or Cl, or may be unsubstituted, and n may be an integer 1, 2, 3, 4 or 5, or where R2 may be a branched alkyl group such as iso-propyl, t-butyl or iso-butyl, or where R2 is a aromatic bridge member of the meaning given for R, and wherein Y is a reactive group, in particular an NH 2 ⁇ or an SH group.
  • R and R1 are selected in such a way that on the one hand the ability to complex in comparison to
  • unbound NTA is influenced as little as possible and on the other hand the distance to the surface of the
  • Biosensor unit is small enough not to irritate the SPR phenomena.
  • R2 is selected so that the
  • the ability of the chelating agent to complex with the metal ion to be chelated and with the substance to be investigated is not adversely affected.
  • Ligands usually a His (6) modified
  • Y is a reactive group with which the chelating agent contacts the surface of the biosensor unit, in particular the reactive groups contained in the hydrogel matrix, is bound.
  • the reactive group of the chelating agent is thus placed on the reactive group surface of the biosensor unit, in particular the hydrogel matrix;
  • a particularly preferred reactive group Y is an NH 2 group attached to the modified ones
  • Carboxymethyl groups of dextran binds.
  • Other reactive groups Y which are suitable for covalent bonding, are SH groups, which are stable
  • reducing agents e.g. Mercaptoethanol, which is often used in the purification or synthesis of
  • the chelating agent can be reacted via its reactive groups using methods known for the coupling of (poly) peptides, e.g. by means of N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) (see e.g. Cuatrecasas and Parikh, 1972).
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC dimethylaminopropyl carbodiimide
  • Transition metal ions are primarily suitable as metal ions, preferably
  • Transition metal ions of the fourth period are particularly preferred, of which Ni 2+ is particularly preferred.
  • NTA derivatives are the N- (5-amino-1-carboxypentyl) described by Hochuli et al., 1987
  • His-Tag proteins are used (so-called “His-Tag proteins”), reference is made to the European patent application EP-A-282 042; Examples include (His) 6 proteins in which the affinity peptide has six histidine residues side by side.
  • Biosensor chips possibly via a reactive one
  • hydrogel matrix is generally preferred, above all because its structure makes it a structure that is quite similar to the physiological conditions inside the cell and therefore for the
  • the present invention has the decisive advantage that the biosensor surface can be completely regenerated. This makes it possible to carry out series tests under comparable conditions.
  • the biosensor unit according to the invention fulfills the following conditions imposed on the regeneration: 1) The (poly) peptide bound to the metal chelate can be completely removed. 2) When reloaded, the surface of the biosensor unit does not lose any binding capacity for a (poly) peptide to be immobilized.
  • a metal ion-saturated chelate surface which contains a ligand, e.g. a His (6) protein has bound
  • several options are available. On the one hand, the ligand can pass through
  • Acid treatment e.g. 10 mM acetic acid
  • the metal ion load remains largely stable, depending on the metal ion used.
  • the bound protein can be combined with the metal ion by adding another strong chelating agent, e.g. 100 mM EDTA, from the
  • the stability of the metal ion bond to the chelating agent must be determined in individual cases and is, among other things. depends on the stability of the ligand metal ion complex.
  • the method of regenerating the chelate surface with other chelating agents is preferable to the first method, considering the reproducibility of the method.
  • Macromolecule with affinity for ligand 1, but not for the metal chelate surface can be achieved under conditions that remove ligand 2
  • Affinity chromatography can be applied.
  • the present invention can advantageously be used for biochemical cleaning
  • the invention relates to a biosensor kit for investigating the interaction of a (poly) peptide with a reaction partner using SPR.
  • the kit contains an SPR biosensor unit in a first one, a chelating agent in another container, and a salt for complexing with the chelating agent in another container
  • Container a reagent for the regeneration of the surface and optionally one or more reference proteins in one or more further containers.
  • a surface of the biosensor unit is preferably a hydrogel layer. The is convenient
  • Chelating agent in the form of a deep-frozen solution the concentration and buffer solution being switched off with regard to the coupling to the surface of the biosensor unit.
  • Preferred chelating agents are
  • Nitrilotriacetic acid derivatives especially N- (5-amino- 1-carboxypentyl) iminodiacetic acid and
  • the metal salt is preferably nickel sulfate, preferably in the form of a stock solution which can be diluted with a view to the desired degree of loading of the surface.
  • a surface of the biosensor unit consists of a hydrogel with reactive groups, in particular of a carboxymethylated dextran, these are
  • N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) carbodiimide which are preferably in the form of frozen solutions which are suitable for activation in terms of concentration and buffer solution.
  • the reagent for deactivating the N-hydroxysuccinimide groups remaining after coupling of the (poly) peptide to the biosensor surface is ethanolamine in a suitable concentration and
  • Buffer solution preferably also in frozen form.
  • the reagent for regenerating the biosensor surface is preferably a chelating agent, in particular EDTA.
  • test proteins which may be present in further containers preferably have an affinity peptide with several histidine residues and are in the form of
  • Hydrogel layer from the bisosensor unit appears to be difficult to carry out in a reproducible manner.
  • Biosensor unit can be used.
  • the chelating agent was immobilized according to the method recommended by the manufacturer of the biosensor chips carried out. Because of the low relative
  • BSA bovine serum albumin
  • Chelating agent modified biosensor chip surface is very small, no binding to the modified surface was observed.
  • the binding capacity of the surface for the test protein is, as shown in Example 4, directly correlated with that
  • Nickel ion concentration used for loading The setting of the nickel ion concentration enables simple adjustment of the
  • the present invention relates to the nitrilotriacetic acid derivative of the formula N ⁇ , N ⁇ -Di (1-carboxyethyl) -2,6-diaminohexanoic acid.
  • This chelation can be like the well known
  • Nitrilotriacetic acid derivatives also for the
  • immobilized metal chelate affinity chromatography can be used to purify proteins and peptides.
  • Fig. 1 Immobilization of N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid on the dextran surface of a biosensor unit
  • Fig. 2 Indirect determination of the loading of the
  • Fig. 3 Regeneration with bovine serum albumin
  • Fig. 4 Determination of the non-specific binding of a
  • Trifluoromethanesulfonic acid (Merck) was slowly added dropwise and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The precipitate formed was separated off, the solution was mixed with 30 ml of water and almost to dryness
  • the solution was added dropwise to 10 volumes of diethyl ether for 1.5 h at room temperature.
  • the precipitation was washed 3 times with ether and dried.
  • the precipitate formed was separated off, the solution was mixed with
  • HBS buffer 10 mM HEPES (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazino] ethanesulfonic acid), 150 mM NaCl and 5 mM MgCl 2 , pH 7.4) at 25 ° C
  • a CM5 biosensor chip was used for immobilization
  • This biosensor unit has a hydrogel surface made of carboxymethylated dextran.
  • the activation of the hydrogel surface was carried out by injecting 35 ⁇ l of a 0.05 M N-hydroxysuccininimide (NHS) /0.2 M N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) solution (Flow rate 5 ⁇ l / min).
  • NHS N-hydroxysuccininimide
  • EDC dimethylaminopropyl
  • the surface was 35 ul of a solution of 15 mg / ml
  • N- (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid in 1 M NaOH was injected at a flow rate of 3 ul / min.
  • Unsaturated surface binding sites were found by injecting 35 ⁇ l of a 1 M solution of
  • Immobilization is indicated in the figure.
  • Bovine serum albumin (BSA, Sigma) was injected into 100 ml running buffer.
  • the sensorgram (Fig. 2) shows
  • Running buffer injected and regenerated with EDTA (ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid). For calculating 3 (baseline,
  • Injection maximum and bound protein t 1) the resonance was 30 s before the injection of bovine serum albumin (baseline), 30 s before the end of the injection of the
  • Bovine serum albumin injection maximum
  • Example 1 To determine the non-specific binding of the protein to the surface, the surface described in Example 1 was regenerated with EDTA, as described in Example 3, and 20 ⁇ l of a test protein solution were injected at a flow rate of 5 ⁇ l / min. After renewed regeneration of the surface with EDTA and loading with
  • Binding behavior of different proteins were 40 ⁇ l of solutions (10 ⁇ g / ml in running buffer) of a chicken protein in the sequence listing
  • the protein was further purified via a
  • Bovine serum albumin in contrast to the His (6) - modified chicken protein, saturates the
  • the surface loaded with the His (6) -modified chicken protein for saturation can be used to search for interacting with this protein
  • Proteins e.g. Cell culture supernatants from
  • Cell culture supernatants from different cell lines are injected.
  • the binding of an interacting partner can be demonstrated by increasing the resonance after the injection.
  • the sensorgram is shown in FIG. 7.
  • the surface shows a binding behavior comparable to that described in Example 2 and modified with N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid.

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Abstract

Verfahren und regenerierbare Biosensoreinheit sowie geeignete Kits zur Untersuchung der Wechselwirkung von Biomolekülen mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR), wobei einer der Reaktionspartner, ein (Poly)Peptid, mittels Metallchelat an die Oberfläche der Biosensoreinheit gekoppelt ist. Bevorzugt als Chelatbildner sind Nitrilotriessigsäure-Derivate, mit denen Proteine mit einem Histidin-Reste enthaltenden Affinitätspeptid gebunden werden können.

Description

Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung von Biomolekülen mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz
Die Erfindung bezieht sich auf die Untersuchung der
biospezifischen Wechselwirkung von Molekülen.
Die Analyse intermolekularer Wechselwirkungen von
Makromolekülen, z.B. (Poly) Peptid- (Poly) Peptid- oder (Poly)- Peptid-DNA- Interaktionen wurde in der Vergangenheit im
allgemeinen unter Gleichgewichtsbedingungen statt. Die
Untersuchung kinetischer Parameter konnte bis vor kurzem, mit wenigen Ausnahmen, nicht oder nur mit Schwierigkeiten
durchgeführt werden, weil sie größere Mengen und einen höheren Reinheitsgrad der Makromoleküle erforderte bzw. weil die vorhandenen Methoden, wie die Affinitätschromatographie oder immunologische Methoden, nicht schnell genug sind, um
biospezifische Wechselwirkungen zu verfolgen.
Eine kürzlich entwickelte Methode beruht auf dem optischen Phänomen der Oberflächen-Plasmon-Resonanz ("Surface Plasmon Resonance", SPR). Die Auswertung von optischen Signalen, die mit Veränderungen des Brechungsindex an der biospezifischen Grenzfläche korrelieren und die bei Konzentrationsänderungen der Makromoleküle, hervorgerufen z.B. durch Bindung der
Reaktionspartner aneinander, erhalten werden, ermöglicht nunmehr, diese Analyse in Echtzeit durchzuführen. Dabei kann mit geringeren Mengen an Makromolekülen ohne radioaktive oder fluoreszierende Markierungen gearbeitet werden, und es werden auch an die Reinheit des Makromoleküls weniger hohe
Anforderungen gestellt. Diese Methode wurde u.a. in den PCT- Anmeldungen WO 90/05295 und WO 90/05303 geoffenbart.
Das am weitesten verbreitete System, das auf der "Surface Plasmon Resonance" -Methode beruht und kommerziell erhältlich ist (BIACoreTM, Pharmacia Biosensor), weist als eines der Hauptelemente neben dem optischen System und den Probentransporteinrichtungen eine Bisosensoreinheit in Form eines sog. Biosensor-Chips auf. Dieser besteht aus einem
Glasträger, der auf einer Seite eine Goldschicht aufweist, an welche über eine mit Linkergruppen versehene Sperrschicht kovalent eine Hydrogelmatrix aus Carboxymethyl-Dextran
gebunden ist. Die Hydrogelmatrix dient einerseits der
Immobilisierung eines der Reaktionspartner, andererseits der Bereitstellung des für die Analyse der biospezifischen
Wechselwirkung des immoblisierten Makromoleküls mit seinem Reaktionspartner erforderlichen Milieus (Stenberg et al., 1991).
Zur Immobilisierung eines der Reaktionspartner, der im
allgemeinen ein (Poly) Peptid ist, an die Hydrogelmatrix wurden bisher die folgenden Methoden verwendet:
1) Direkte, irreversible Immobilisierung an die
Hydrogel-Oberfläche des Biosensorchips mittels chemischer Methoden.
2) Direkte, irreversible Immobilisierung des
biotinylierten Reaktionspartners an
hydrogelgebundenes Streptavidin oder Avidin
3) Indirekte, reversible Immobilisierung durch Bindung über einen hydrogelgebundenen Antikörper des Reaktionspartner
Diese Verfahren weisen jedoch verschiedene Nachteile auf: Verfahren 1) ist von dem Risiko behaftet, daß aufgrund der nicht-gerichteten chemischen Reaktion zwischen hydrogelbildender Substanz und dem
(Poly) Peptid, die, in Abhängigkeit der verwendeten
Methode, bevorzugt an primären Aminogruppen,
Kohlenhydratgruppen oder freien Thiolgruppen des
(Poly) Peptids stattfindet, dessen biologische und/oder biophysikalische Eigenschaften in einer nicht oder nur schwer definierbaren Weise beeinflußt werden. Das kann zur Folge haben, daß das immobilisierte (Poly) Peptid nicht bzw. nicht vollständig in seiner nativen, biologisch aktiven Form vorliegt, weil z.B. der
Abschnitt des Moleküls, der mit dem Reaktionspartner interagieren soll, durch eine chemische Gruppierung blockiert oder aufgrund einer Konformationsänderung des Moleküls unzugänglich geworden ist. Da für die
Biotinylierung von Makromolekülen grundsätzlich
ähnliche Methoden wie für die Kopplung von
(Poly) Peptiden verwendet werden, treffen diese
Nachteile und somit die Beschränkungen des Verfahrens auch auf das unter 2) angeführte Verfahren zu. Beide Verfahren weisen den zusätzlichen Nachteil auf, daß eine Regeneration der Hydrogeloberfläche, die eine wesentliche Vereinfachung des Verfahrens bei der
Durchführung von Serienanalysen mit demselben
(Poly) peptid darstellen würde, unter Beibehaltung der biologischen und biophysikalischen Aktivität sehr schwierig ist.
Diese Nachteile können durch Verwendung von Antikörpern (Verfahren 3) umgangen werden, wobei prinzipiell dieselben Verfahren angewendet werden, wie bei
Sandwich- Immunoassays, z.B. in der ELISA (Enzyme linked Immuno-sorbent Assay)-Technik. Die Anwendung dieses Verfahrens ist jedoch durch das Erfordernis der
Verfügbarkeit von monoklonalen, hochaffinen Antikörpern mit Spezifität für das (Poly) Peptid eingeschränkt. Eine weitere Beschränkung besteht darin, daß die Antikörper nicht mit Epitopen interagieren dürfen, die für die Wechselwirkung mit den zu untersuchenden
Reaktionspartnern von Bedeutung sind.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung von (Poly) Peptiden mit Reaktionspartnern mittels SPR bereitzustellen, das die Nachteile der bekannten
Verfahren nicht aufweist.
Es stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung,
Proteine, deren Sequenz aufgeklärt ist, unter
Verwendung gentechnischer Methoden als Fusionsproteine mit Sequenzabschnitten, die hohe Affinität für einen Liganden aufweisen (sog. Affinitätspeptiden)
herzustellen. Die immobilisierte Metallchelat- Affinitätschromatographie (IMAC) ist ein weit
verbreitetes Verfahren zur Reinigung von Proteinen und Peptiden, bei dem derartige Fusionsproteine mittels Affinitätspeptid an immobilisierte Metallchelate gebunden werden. Unter den verschiedenen Chelatbildnern aus der Gruppe der Iminodiessigsäurederivate zeigen Nitrilotriessigsäurederivate besonders vorteilhafte Eigenschaften, zu denen die extrem hohe Affinität für bestimmte Metallionen, z.B. Cu2+, Ni2+ oder Zn2+ gehört. Breite Anwendung fand bislang dieses Verfahren unter Verwendung von Nickel als Metallion und
Nitrilotriessigsäure als Komplexbildner in der
Reinigung rekombinanter Fusionsproteine, die ein
Äffinitätspeptid mit mindestens einem Histidinrest direkt oder indirekt gebunden aufweisen. Derartige Reinigungsverfahren rekombinanter Proteine wurden unter anderem in den europäischen Patentanmeldungen Nr.
184 355 (wobei Iminodiessigsäure als Komplexbildner verwendet wird) und Nr. 282 042 (wobei
Nitrilotriessigsäure und Proteine mit einem
Äffinitätspeptid mit mindestens zwei benachbarten
Histidinresten beschrieben werden) geoffenbart.
Zur Lösung der im Rahmen der vorliegenden Erfindung gestellten Aufgabe wurde von der Überlegung
ausgegangen, das von der Metallchelat- Affinitätschromatographie bekannte Prinzip für die SPR- Methode auszunutzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung eines (Poly) Peptids mit einem Reaktionspartner mittels einer
Biosensoreinheit, in welcher die durch die
Wechselwirkung ausgelöste Oberflächen-Plasmon-Resonanz in einer metallischen Schicht an der Grenzfläche zweier für elektromagnetische Strahlung durchlässiger Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex bestimmt wird, wobei das Medium mit geringerem Brechungsindex ein wässeriges Medium ist, in welchem das (Poly) Peptid in immobilisierter Form vorliegt und mit dem
Reaktionspartner in Berührung gebracht wird. Das
Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das
(Poly) Peptid über ein Metallchelat immobilisiert ist.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt eine Biosensoreinheit für die Untersuchung der
Wechselwirkung eines (Poly) Peptids mit einem
Reaktionspartner mittels Bestimmung der Oberflächen- Plasmon-Resonanz in einer metallischen Schicht an der Grenzfläche zweier für elektromagnetische Strahlung durchlässiger Medien mit unterschiedlichem
Brechungsindex, wobei das Medium mit geringerem
Brechungsindex ein wässeriges Medium ist. Die
Biosensoreinheit ist dadurch gekennzeichnet, daß an seine dem wässerigen Medium zugewandte Oberfläche ein Chelatbildner, gegebenenfalls in mit eine' Metallion komplexierter Form, gebunden ist.
In einem bevorzugten Aspekt ist die wässerige Phase eine biokompatible poröse Matrix, insbesondere ein Hydrogel. Hinsichtlich der Hydrogelbildner besteht grundsätzlich keine Beschränkung, sofern ihre Eignung für das SPR-Verfahren, insbesondere im Hinblick auf die erforderliche Diffusion der Biomoleküle in der
Hydrogelmatrix, grundsätzlich gegeben ist. Beispiele für geeignete Hydrogelbildner sind Polysaccharide, wie Agarose, Dextran, Carragen, Alginate, Stärke, Zellulose bzw. Derivate dieser Polysaccharide, wie z.B.
Carboxymethylderivate, oder wasserquellbare organische Polymere, wie Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure,
Polyacrylamid oder Polyethylenglycol.
Ein besonders geeignetes Hydrogel besteht aus Dextran, welches im Hinblick auf die kovalente Bindung des
(Poly) Peptids mit reaktiven Gruppen, z.B. Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Aldehyd-, Carbonyl-, Epoxy- oder Vinylgruppen, versehen ist. Die Ausführung der
Hydrogelschicht und deren Bindung an die Metallschicht, welche gegebenenfalls über eine organische Sperrschicht erfolgt, wurde u.a. in der PCT-Anmeldung WO 90/05303 sowie von Löfas und Johnsson, 1990, beschrieben. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Chelatbildner an die reaktiven Gruppen des Hydrogels gebunden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Hydrogelbildner ein Dextran, das als reaktive Gruppen Carboxymethylgruppen aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das (Poly) Peptid ein Fusions- (Poly) Peptid, das neben seinem biologisch aktiven Abschnitt ein Äffinitätspeptid aufweist, das mindestens zwei benachbarte Histidinreste enthält. In diesem Fall ist der Chelatbildner ein
Nitrilotriessigsäure (NTA) -Derivat der allgemeinen
Formel Y-R-CH(COOH)-N(CH2COOH)2, worin R eine Alkylenbrücke des Typs (CH2)n- bedeuten kann, die substituiert oder unsubstituiert sein kann, mit der Maßgabe, daß der Substituent nicht nachteilig die Funktion des Chelatbildners beeinflußt, und n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 bedeutet, wobei die Alkylengruppe bei genügender Größe
gegebenenfalls auch eine oder mehrere Alken- oder Alkin-Teilstrukturen aufweisen kann, oder, worin R ein aromatisches Brückenglied bedeuten kann, das aus einem oder mehreren ein- oder
mehrkernigen Aromaten, der gegebenenfalls auch ein aromatischer Heterozyklus sein kann, aufgebaut wird, oder, worin R ein Aralkyl-Brückenglied bedeuten kann, in dem der aromatische Teil entweder direkt oder über eine Alkylgruppe des Typs (CH2)n-, worin n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeuten kann, an Y oder an das der Carboxylgruppe benachbarte α-C-Atom gebunden sein kann, und worin Y eine reaktive Gruppe, insbesondere eine NH2-oder eine SH-Gruppe, ist.
Als Beispiele für R seien Methylen, Ethylen, n-Propylen oder iso-Propylen bzw. o-, m-, p-Phenylen oder β,β'- Naphtylen genannt.
Das NTA-Derivat kann auch die allgemeine Formel Y-R1- CH (COOH)-N(CHR2COOH)2, aufweisen, worin R1 eine Gruppe mit der für R angegebenen
Bedeutung sein kann, und, worin R2 eine Alkylgruppe des Typs CH3(CH2)n- sein kann, die substituiert, z.B. mit OH oder Cl, oder unsubstituiert sein kann, und n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeuten kann, oder, worin R2 eine verzweigte Alkylgruppe, wie iso- Propyl, t-Butyl oder iso-Butyl sein, kann, oder, worin R2 ein aromatisches Brückenglied der für R angegebenen Bedeutung sein kann, und worin Y eine reaktive Gruppe, insbesondere eine NH2~oder eine SH-Gruppe, ist.
R bzw. R1 werden dahingehend ausgewählt, daß einerseits die Komplexierungsfähigkeit im Vergleich zum
ungebundenen NTA möglichst wenig beeinflußt wird und andererseits der Abstand zur Oberfläche der
Biosensoreinheit genügend gering ist, um die SPR- Phänomene nicht zu irritieren.
R2 wird dahingehend ausgewählt, daß die
Komplexierungsfähigkeit des Chelatbildners mit dem zu chelierenden Metallion sowie mit der zu untersuchenden Substanz nicht negativ beeinflußt wird.
Die Eignung von Substituenten R bzw. R1, oder R2 kann z.B. durch Bindungsstudien mit einem geeigneten
Liganden, in der Regel einem His (6)-modifizierten
Polypeptid, überprüft werden. Substituenten mit
negativem Einfluß auf die Komplexierungsfähigkeit reduzieren die Affinität des Liganden; Substituenten, welche die unspezifische Bindung des Liganden
beeinflussen, erhöhen die Bindung des Liganden für den nicht mit einem Kation komplexierten Chelator. Y ist eine reaktive Gruppe, mit der der Chelatbildner an die Oberfläche der Biosensoreinheit, insbesondere an die in der Hydrogelmatrix enthaltenen reaktiven Gruppen, gebunden wird. Die reaktive Gruppe des Chelatbildners wird somit auf die reaktiven Gruppen Oberfläche der Biosensoreinheit, insbesondere der Hydrogelmatrix abgestellt; besonders bevorzugt ist als reaktive Gruppe Y eine NH2-Gruppe, die an die modifizierten
Carboxymethylgruppen des Dextrans bindet. Andere reaktive Gruppen Y, die zur kovalenten Bindung geeignet sind, sind SH-Gruppen, die in eine stabile
Thioetherbindung überfuhrt werden können. Diese
Thioetherbindung ist der Disulfidbindung unter
Berücksichtigung der Stabilität in Gegenwart
reduzierender Agenzien, wie z.B. Mercaptoethanol, das häufig in der Reinigung oder Synthese von
(Poly) Peptiden verwendet wird, überlegen.
Der Chelatbildner kann über seine reaktiven Gruppen mittels für die Kopplung von (Poly) Peptiden bekannter Methoden, z.B. mittels N-Hydroxysuccinimid (NHS) und N-Ethyl-N' - (dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) (s. z.B. Cuatrecasas und Parikh, 1972), an das Hydrogel gebunden werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete
Chelatbildner sind in der US-A-4, 877, 830, der
EP-A 253 303, der WO 90/12803 sowie in den Arbeiten von Hochuli und Piesecki, 1992, und Yokoyama et al., 1993, beschrieben. Als Metallionen kommen in erster Linie Ubergangsmetallionen in Frage, bevorzugt
Ubergangsmetallionen der vierten Periode. Darunter sind besonders bevorzugt Ionen des Mangans, Kobalts, Nickels oder Kupfers, worunter Ni2+ besonders bevorzugt ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders
bevorzugt sind als NTA-Derivate die von Hochuli et al., 1987, beschriebene N-(5-Amino-1-carboxypentyl)
iminodiessigsäure sowie Nα,Nα-Di(1-carboxyethyl)-2,6- diaminohexansäure und als damit komplexiertes Metallion Nickel.
Bezüglich der Herstellung der Fusions-(Poly) Peptide, die im Hinblick auf die Bindungsfähigkeit an das bevorzugte Metallchelat mindestens zwei benachbarte Histidinreste aufweisen und auf die die vorliegende Erfindung in ihrer bevorzugten Ausführungsform
angewendet wird (sog. "His-Tag-Proteine"), wird auf die europäische Patentanmeldung EP-A-282 042 verwiesen; Beispiele dafür sind (His) 6-Proteine, in denen das Äffinitätspeptid sechs Histidinreste nebeneinander aufweist.
Im Prinzip ist auch eine direkte Kopplung des
Chelatbildners an die Metalloberfläche des
Biosensorchips, gegebenenfalls über eine reaktive
Gruppen aufweisende organische Sperrschicht, möglich. Bezüglich solcher Sperrschichten wird auf die
Offenbarung der WO 90/05303 verwiesen.
Die Immobilisierung des (Poly) Peptids in der
Hydrogelmatrix ist jedoch generell bevorzugt, vor allem deshalb, weil sie aufgrund ihrer Struktur eine den physiologischen Verhältnissen im Zellinneren recht ähnliche Struktur darstellt und dadurch für die
Untersuchung der Wechselwirkung von Biomolekülen die natürliche Umgebung angenähert wird.
Die vorliegende Erfindung weist den entscheidenden Vorteil auf, daß die Biosensoroberfläche vollständig regenerierbar ist. Damit ist es möglich, Serienversuche unter vergleichbaren Bedingungen durchzuführen.
Die erfindungsgemäße Biosensoreinheit erfüllt die folgenden, an die Regenerierung gestellten Bedingungen: 1) Das an das Metallchelat gebundene (Poly) Peptid kann vollständig entfernt werden. 2) Bei neuerlicher Beladung verliert die Oberfläche der Biosensoreinheit keine Bindungskapazität für ein zu immobilisierendes (Poly) Peptid.
3) Die Bindungseigenschaften des immobilisierten
(Poly) Peptids werden nicht beeinflußt.
Zur Regeneration einer metalliongesättigten Chelat- Oberfläche, die einen Liganden, z.B. ein His(6)- Protein, gebunden hat, stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung. Einerseits kann der Ligand durch
Säurebehandlung (z.B. 10 mM Essigsäure) entfernt werden, wobei die Metallionbeladung, abhängig vom verwendeten Metallion, größtenteils stabil bleibt.
Falls erforderlich, kann das gebundene Protein zusammen mit dem Metallion durch Zugabe eines weiteren, starken Chelatbildners, wie z.B. 100 mM EDTA, aus der
immobiliserten Chelatbindung entfernt werden. Die
Stabilität der Metallionenbindung an den Chelatbildner muß im Einzelfall bestimmt werden und ist u.a. von der Stabilität des Liganden-Metallionenkomplexes abhängig. Das Verfahren zur Regeneration der Chelatoberfläche mit anderen Chelatbildnern ist, mit Rücksichtnahme auf die Reproduzierbarkeit des Verfahrens, der ersten Methode vorzuziehen.
Im Einzelfall ist ebenfalls zu überprüfen, ob die
Regeneration einer sandwichartigen Oberfläche, z.B.
Metallchelat-Ligand 1-Ligand 2 (wobei Ligand 1 ein (Poly) Peptid mit hoher Affinität zur
Metallchelatoberfläche darstellt und Ligand 2 ein
Makromolekül mit Affinität zu Ligand 1, jedoch nicht zur Metallchelatoberfläche), unter Bedingungen erreicht werden kann, die die Entfernung des Liganden 2
ermöglichen, ohne die Bindung von Ligand 1 an die
Chelatoberfläche zu beeinflussen. Insbesondere können hierfür Lösungen mit hohen Salzkonzentrationen verwendet werden, wie sie in der klassischen
Affinitätschromatographie angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung kann neben den klassischen Anwendungsgebieten der SPR-Methode vorteilhaft für biochemische Reinigungen eingesetzt werden, um
Fraktionen, die das gesuchte Protein enthalten, zu verifizieren. Dieses Verfahren ist den klassischen Reinigungsverfahren nicht nur hinsichtlich der
Präzision und Geschwindigkeit sondern auch hinsichtlich der Einfachheit um ein Vielfaches überlegen.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt einen Biosensor-Kit für die Untersuchung der Wechselwirkung eines (Poly) Peptids mit einem Reaktionspartner mittels SPR. Der Kit enthält in einem ersten eine SPR- Biosensoreinheit, in einem weiteren Behälter einen Chelatbildner, in einem weiteren Behälter ein Salz eines zur Komplexierung mit dem Chelatbildner
geeigneten Metalls, in einem oder mehreren weiteren Behältern die Reagenzien für die Aktivierung der
Oberfläche der Biosensoreinheit, gegebenenfalls in einem weiteren Behälter ein Reagens zur Deaktivierung der Oberfläche, gegebenenfalls in einem weiteren
Behälter ein Reagens zur Regenerierung der Oberfläche sowie gegebenenfalls in einem oder mehreren weiteren Behältern ein oder mehrere Vergleichsproteine.
Vorzugsweise ist eine Oberfläche der Biosensoreinheit eine Hydrogelschicht. Zweckmäßig liegt der
Chelatbildner in Form einer tiefgefrorenen Lösung vor, wobei Konzentration und Pufferlösung im Hinblick auf die Kopplung an die Oberfläche der Biosensoreinheit abgestellt sind. Bevorzugte Chelatbildner sind
Nitrilotriessigsäure-Derivate, insbesondere N-(5-Amino- 1-carboxypentyl) iminodiessigsäure sowie
Nα,Nα-Di (1-carboxyethyl)-2,6-diaminohexansäure.
Bevorzugt ist das Metallsalz Nickelsulfat, vorzugsweise in Form einer Stammlösung, die im Hinblick auf den gewünschten Beladungsgrad der Oberfläche verdünnt werden kann.
In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, bei der eine Oberfläche der Biosensoreinheit aus einem Hydrogel mit reaktiven Gruppen, insbesondere aus einem carboxymethyliertem Dextran, besteht, sind die
Reagenzien zur Aktivierung der Biosensoroberfläche N-Hydroxysuccinimid und
N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimid, die vorzugsweise in Form tiefgefrorener Lösungen vorliegen, die hinsichtlich Konzentration und Pufferlösung zur Aktivierung geeignet sind. In der bevorzugten
Ausführungsform ist das Reagens zur Deaktivierung der nach Kopplung des (Poly) Peptids verbleibenden N- Hydroxysuccinimid-Gruppen an der Biosensoroberfläche Ethanolamin in geeigneter Konzentration und
Pufferlösung, vorzugsweise ebenfalls in tiefgefrorener Form.
Das Reagens zur Regenerierung der Biosensor-Oberfläche ist vorzugsweise ein Chelatbildner, insbesondere EDTA.
Die gegebenenfalls in weiteren Behältern vorhandenen Testproteine weisen vorzugsweise ein Äffinitätspeptid mit mehreren Histidinresten auf und liegen als
Standardlösungen in Konzentrationen und Pufferlösungen vor, die zur Überprüfung der Beladung der Biosensor- Oberfläche geeignet sind. In den im Rahmen der vorliegenden Erfindung
durchgeführten Versuchen wurde gemäß der bevorzugten Ausführungsform sowie der Einfachheit halber die
Kopplung in der Hydrogelmatrix vorgenommen, weil die kommerziell erhältlichen Biosensoreinheiten von sich aus eine Dextranmatrix aufweisen und die für die direkte Kopplung notwendige Entfernung dieser
Hydrogelschicht aus der Bisosensoreinheit in einer reproduzierbaren Art und Weise nur schwer durchführbar erscheint.
Zur Bindung der Chelatbildner
N-(5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure bzw.
Nα,Nα-Di (1-carboxyethyl)-2,6-diaminohexansäure an die Biosensor-Hydrogeloberfläche wurde die Kopplungsmethode mittels N-Hydroxysuccinimid verwendet. Dabei wurde der Chelatbildner, der eine freie, primäre Aminogruppe enthält, an die modifizierte Dextran-Hydrogeloberfläche einer kommerziell erhältlichen Biosensoreinheit
(BIACore) kovalent gekoppelt. Als Chelatbildner wurde ein Derivat von Nitrilotriessigsäure synthetisiert, das direkt zur Immobilisierung verwendet werden kann. Die Synthese des Derivats entspricht weitgehend der
publizierten Methode (Hochuli et al., 1987; und
Europäische Patentschrift 339 389), mit dem
Unterschied, daß zur Abspaltung der Schutzgruppe, anstelle der beschriebenen Hydrierung, in Gegenwart von Palladium auf Kohle eine Abspaltung durch eine Säure
(Trifluoressigsäure/Trifluormethansulfonsäure)
vorgenommen wurde. Das so erhaltene Material kann, da es weitgehend frei von anorganischen Verunreinigungen ist, direkt zur Kopplung an die Oberfläche der
Biosensoreinheit eingesetzt werden.
Die Immobilisierung des Chelatbildners wurde nach dem vom Hersteller der Biosensorchips empfohlenen Verfahren durchgeführt. Da aufgrund des geringen relativen
Molekulargewichts der Nitrilotriessigsäurederivate eine direkte Bestimmung der immobilisierten Menge instrumentenbedingt nicht möglich ist, wurde die relative Menge indirekt über die Bestimmung der
Bindungskapazität für ein Protein nachgewiesen. Dazu erwies sich kommerziell erhältliches Rinderserumalbumin (BSA) als geeignet.
Es wurde festgestellt, daß die Affinität des Test- (Poly) Peptids für die Nickelionen-freie, mit
Chelatbildner modifizierte Biosensorchipoberfläche sehr gering ist, es war keine Bindung an die modifizierte Oberfläche zu beobachten. Die Bindungskapazität der Oberfläche für das Testprotein ist, wie in Beispiel 4 dargestellt, direkt korreliert mit der
Nickelionenkonzentration, die zur Beladung verwendet wird. Die Einstellung der Nickelionenkonzentration ermöglicht eine einfäche Abstimmung der
Bindungskapazität auf die experimentellen
Erfordernisse.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt das Nitrilotriessigsäure-Derivat der Formel Nα,Nα-Di (1-carboxyethyl)-2,6-diaminohexansäure. Dieser Chelatbilder kann wie die bekannten
Nitrilotriessigsäure-Derivate auch für die
immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie zur Reinigung von Proteinen und Peptiden angewendet werden. Figurenübersicht:
Fig. 1: Immobilisierung von N-(5-Amino-1- carboxypentyl) iminodiessigsäure an die Dextranoberfläche einer Biosensoreinheit
Fig. 2: Indirekte Bestimmung der Beladung der
Dextranoberfläche mit N-(5-Amino-1- carboxypentyl) iminodiessigsäure mittels Rinderserumalbumin
Fig. 3: Regenerierung der mit Rinderserumalbumin
beladenen Biosensor-Oberfläche mittels EDTA
Fig. 4: Bestimmung der unspezifischen Bindung eines
Proteins an die Biosensor-Oberfläche
Fig. 5: Bestimmung der Bindungsfähigkeit eines Proteins an die Biosensor-Oberfläche in Abhängigkeit der Nickelkonzentration
Fig. 6: Bindungsfähigkeit verschiedener Proteine an die mit N-(5-Amino-1-carboxypentyl)- iminodiessigsäure/Ni2+ beladene Biosensor- Oberfläche
Fig. 7: Bindung eines His (6)-modifizierten Proteins an eine mit Nα,Nα-Di (1-carboxyethyl)-2,6- diaminohexansäure beladene Biosensor-Oberfläche
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1 a) Synthese von N-(5-Amino-1-carboxypentyl)- iminodiessigsäure
4.17 g Bromessigsäure (Aldrich) wurden in 15 ml 2M NaOH gelöst und auf 0°C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden unter Rühren eine Lösung von 4.2 g Nε-Benzyloxycarbonyl-
L-Lysin (Fluka) in 22.5 ml 2 M NaOH langsam zugetropft. Nach 2 Stunden wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht weitergerührt. Anschließend wurde die Lösung 2 Stunden auf 50°C erwärmt und dann langsam mit 45 ml 1 M HCl versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit 0.1 M HCl gewaschen und getrocknet (5 g Produkt, theoretische Ausbeute 5.9 g). 0.87 g des oben erhaltenen Derivates wurden in 10 ml Trifluoressigsäure (Merck) gelöst. Zur klaren Lösung wurde auf Eis 1 ml
Trifluormethansulfonsäure (Merck) langsam zugetropft und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt, die Lösung wurde mit 30 ml Wasser versetzt und fast bis zur Trockene
eingeengt. Ein Aliquot dieser Lösung wurde auf einer PDIO-Säule (Pharmacia) mit Wasser als Laufmittel
aufgetrennt. Die Ninhydrin-positiven, neutralen
Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. b) Synthese von Nα,Nα-Di (1-carboxyethyl)-2,6- diaminohexansäure
5.35 g 2-Brompropionsäure (35 mmol) wurden in 15 ml 2 M NaOH gelöst und auf 0°C gekühlt. Unter Rühren wurde eine Lösung von 4.2 g Nε-Benzyloxycarbonyl-L-lysin
(15 mmol) in 22.5 ml 2M NaOH bei Raumtemperatur langsam zugetropft und über Nacht bei 70°C gerührt. Die Lösung wurde nach Abkühlung langsam mit 45 ml 1 M HCl
versetzt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit 0.1 M HCl gewaschen und getrocknet. Zur Abspaltung der Z-Schutzgruppe wurde der Niederschlag in der minimalen Menge Trifluoressigsäure gelöst und auf Eis 0.1 Volumen Trifluormethansulfonsäure zugetropft. Nach
1.5 h Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung in 10 Volumen Diethylether getropft. Der Niederschlag wurde 3x mit Ether gewaschen und getrocknet. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt, die Losung wurde mit
30 ml Wasser versetzt und fast bis zur Trockene eingeengt. Ein Aliquot dieser Lösung wurde auf einer PDIO-Saule (Pharmacia) mit Wasser als Laufmittel aufgetrennt. Die Ninhydrin-positiven, neutralen
Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Die Identität der Verbindung wurde mittels Protonen-NMR- Analyse bestätigt.
Beispiel 2
Kopplung von N-(5-Amino-1-carboxypentyl)- iminodiessigsäure an die Dextran-Oberfläche einer SPR- Biosensoreinheit
Alle Schritte der Immobilisierung wurden in dem
BIACoregerat (Pharmacia) mit HBS-Puffer (10 mM HEPES (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazino]-ethansulfonsäure), 150 mM NaCl und 5 mM MgCl2, pH 7.4) bei 25°C
durchgeführt.
Zur Immobilisierung wurden ein Biosensorchip CM5
(Pharmacia Biosensor, Certified Grade) verwendet.
(Diese Biosensoreinheit weist eine Hydrogeloberfläche aus carboxymethyliertem Dextran auf.) Die Aktivierung der Hydrogeloberfläche wurde mittels Injektion von 35 μl einer 0.05 M N-Hydroxysuccininimid (NHS)/0.2 M N- Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) -Lösung (Flußrate 5 μl/min) durchgeführt. Zur Kopplung der in Beispiel 1 beschriebenen N-(5-Amino-1- carboxypentyl) iminodiessigsäure an die aktivierte
Oberfläche wurden 35 μl einer Losung von 15 mg/ml
N-(5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure in 1 M NaOH bei einer Flußrate von 3 μl/min injiziert. Nicht abgesättigte Bindungsstellen der Oberfläche wurden durch Injektion von 35μl einer 1 M Lösung von
Ethanolamin (pH 8.5) abgesättigt (Flußrate 5 μl/min). Zur Konditionierung der Oberfläche wurden 10 μl einer 100 mM EDTA-Lösung (pH 8 mit NaOH eingestellt)
injiziert und die Oberfläche mit 4 μl einer 0.1 M
NiSO4/0.2 M CH3-COONa-Lösung beladen (Flußrate
5 μl/min). Der Verlauf dieser Immobilisierung ist in Fig. 1 anhand der Änderung der Oberflächen-Plasmon- Resonanz dargestellt. Die einzelnen Schritte der
Immobilisierung sind in der Figur gekennzeichnet.
Da aufgrund seiner geringen relativen Molmasse (Mr 295) die Beladung der Oberfläche mit dem Chelatbildner nicht direkt bestimmt werden kann, wurde die Beladung
indirekt bestimmt, indem unter konstanten Fluß
(5 μl/min) 35 μl einer Lösung von 1 g
Rinderserumalbumin (BSA, Sigma) in 100 ml Laufpuffer injiziert wurde. Das Sensorgramm (Fig. 2) zeigt
signifikante Bindung des Proteins an die Oberfläche. Anhand von Serienversuchen mit einer standardisierten Lösung dieses Proteins wurde die Reproduzierbarkeit der Oberflächenimmobilisierung bestätigt.
Beispiel 3
Regenerierbarkeit der N-(5-Amino-1- carboxypentyl) iminodiessigsäure-Oberfläche
Um die Regenerierbarkeit der N-(5-Amino-1- carboxypentyl) iminodiessigsäure-Oberfläche zu
untersuchen, wurden zwanzigmal in Folge die Oberfläche unter konstantem Fluß (5 μl/min), wie in Beispiel 2 beschrieben, mit Ni2+-Ionen beladen, 35 μl einer Lösung von 1 g Rinderserumalbumin (BSA, Sigma) in 100 ml
Laufpuffer injiziert und mit EDTA (Ethylendiamin- N,N,N',N'-tetraessigsäure) regeneriert. Zur Berechnung der in Fig. 3 dargestellten Daten (Basislinie,
Injektionsmaximum und gebundenes Protein t=1) wurde die Resonanz 30 s vor Injektion des Rinderserumalbumins (Basislinie), 30 s vor Ende der Injektion des
Rinderserumalbumins (Injektionsmaximum) und 30 sec nach Injektion des Rinderserumalbumins (Gebundenes Protein t=1) bestimmt.
Zur Entfernung des gebundenen Proteins erwies sich EDTA (100 mM, pH 8) als am besten geeignet. Wie in Fig. 3 dargestellt, kann weder ein Aktivitätsverlust der
Oberfläche bei neuerlicher Beladung (Injektionsmaximum, gebundenes Protein t=1) noch ein Verbleiben des
gebundenen Proteins nach Regeneration (Basislinie) festgestellt werden. Da EDTA die chelatgebundenen
Nickel-Ionen entfernt, muß nach der Regenerierung der Oberfläche eine erneute Beladung mit Ni2+-Ionen
erfolgen.
Beispiel 4
Effekt der Ni2+-Konzentration auf die Protein- Bindungsfähigkeit
Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung des Proteins an die Oberfläche wurden die in Beispiel 1 beschriebene Oberfläche mit EDTA regeneriert, wie in Beispiel 3 beschrieben, und 20 μl einer Testprotein-Lösung bei einer Flußrate von 5μl/min injiziert. Nach erneuter Regeneration der Oberfläche mit EDTA und Beladung mit
4 μl einer 0,1 M NiSO4/0.2 M CH3-COONa-Lösung (Flußrate
5 μl/min) wurden abermals 20 μl der Testprotein-Lösung injiziert. Wie in Fig. 4 dargestellt, ist in
Abwesenheit von Ni2+ keine Bindung an die Oberfläche zu beobachten, nach Beladung der Oberfläche mit Ni2+ kann eine Absättigung der Oberfläche mit Testprotein
festgestellt werden.
Um die Bindungsfähigkeit der Oberfläche in Abhängigkeit der Ni2+-Konzentration zu bestimmen, wurde die in
Beispiel 1 beschriebene Ni2+-N-(5-Amino-1- carboxypentyl) iminodiessigsäure Oberfläche mit EDTA, wie in Beispiel 3 beschrieben, regeneriert und mit jeweils 4 μl einer Ni2+-Lösung (0,1 M NiSO4/0.2 M CH3- COONa, Flußrate 5 μl/min) der angegebenen
Konzentrationen beladen. Nach der Beladung mit Nickel wurde Protein injiziert und die Resonanz an t=1
bestimmt. Die Auftragung der gemessenen Resonanz gegen die Konzentration der Nickelionenlösung (Fig. 5) zeigt, daß eine vollständige Beladung der Oberfläche mit 4μl einer
100 μM Ni2+-Lösung erreicht wird. Geringere
Konzentrationen zeigen in Abhängigkeit der
Konzentration nur unvollständige Beladung der
Oberfläche.
Beispiel 5
Bindungsfähigkeit verschiedener Proteine an die N-(5- Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure-Oberfläche
Zur Untersuchung des unterschiedlichen
Bindungsverhaltens verschiedener Proteine wurden jeweils 40 μl von Lösungen (10 μg/ml in Laufpuffer) eines Hühnerproteins der im Sequenzprotokoll
dargestellten Sequenz, modifiziert mit His(6) ((His)6- SCF), von Rinderserumalbumin (Sigma) und von Lysozym aus Eiklar (Sigma) auf eine gemäß Beispiel 2
synthetisierte Biosensoroberfläche
injiziert. (Herstellung und Reinigung des Hühnerproteins erfolgten nach Expression in einem kommerziell erhältlichen Expressionvektor [pQE50, Diagen GmbH] nach dem vom Hersteller des Systems vorgegebenen
Reinigungsschema [The QIAexpressionist, Diagen GmbH, Protocol 3, S. 35 sowie Protocol 7, S. 45]. Zur
weiteren Reinigung wurde das Protein über eine
Anionenaustauschersäule vom Typ HQ/M [Perseptive
Biosystems, Freiburg] gereinigt und die
Proteinkonzentration mittels Bradford-Protein-Assay
[BioRad] bestimmt). Das Bindungsverhalten der einzelnen Proteine ist in Fig. 6 dargestellt: Lysozym (Mr 14300) sowie Rinderserumalbumin (Mr 68000) zeigen eine, trotz der relativ hohen Konzentration, geringe Resonanz; das His (6)-modifizierte Hühnerprotein (Mr 22000) hingegen bindet um ein vielfaches stärker an die Oberfläche. Desweiteren ist zu erkennen, daß Lysozym und
Rinderserumalbumin, im Gegensatz zu dem His (6)- modifizierten Hühnerprotein, eine Sättigung der
Oberfläche erreichen. Die mit dem His (6)-modifizierten Hühnerprotein zur Sättigung beladene Oberfläche kann zur Suche nach mit diesem Protein interagierenden
Proteinen, aus z.B. Zellkulturüberständen von
Hühnerzellinien, verwendet werden, indem
Zellkulturüberstände verschiedener Zellinien injiziert werden. Die Bindung eines interagierenden Partners kann durch die Verstärkung der Resonanz nach der Injektion nachgewiesen werden.
Beispiel 6
Bindung von (His)6-SCF an eine Nα,Nα-Di(1- carboxyethyl)-2,6-diaminohexansäure-Oberfläche
Es wurde eine Nα,Nα-Di (1-carboxyethyl)-2,6- diaminohexansäure-Oberfläche unter den exakt gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 2 für N- 5-Amino-1- carboxypentyl) iminodiessigsäure beschrieben,
hergestellt.
Zur Untersuchung des Bindungsverhaltens eines (His) 6- modifizierten Protein an diese Oberfläche, wurde die Oberfläche mit Ni2+-Ionen beladen und es wurden 40 μl einer Lösung (10 μg/ml in Laufpuffer) eines
Hühnerproteins der im Sequenzprotokoll dargestellten Sequenz, modifiziert mit His (6) ((His)6-SCF,
beschrieben in Beispiel 5) mit einer Flußrate von
5μl/min auf diese Oberfläche injiziert. Das Sensorgramm ist in Fig. 7 dargestellt. Die Oberfläche zeigt ein vergleichbares Bindungsverhalten wie die in Beispiel 2 beschriebene, mit N-(5-Amino-1-carboxypentyl)- iminodiessigsäure modifizierte Oberfläche. Anhand von Serienversuchen mit einer standardisierten Lösung des Proteins wurde die Reproduzierbarkeit der
Oberflächenimmobilisierung bestätigt.
Literatur
Cuatrecasas, P. and Parikh, 1972, J. Biochemistry 11,
2291.
Hochuli, E., H. Döbel und Schacher, A., 1987, J.
Chromatography 411, 177-184.
Hochuli, E. und Piesecki, S., 1992, Methods 4 (San
Diego), 66-72.
Löfas, S. and Johnsson, B., 1990, J. Chem. Soc., Chem.
Communications 1526.
Stenberg, E. et al., 1991, L. of Colloid and Interface
Science, 143, 513.
Yokoyama, T., Sigeko, A. und Masatoshi, K., 1993, Chem.
Lett. 2, 383-386.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung eines
(Poly) Peptids mit einem Reaktionspartner mittels einer Biosensoreinheit, in welcher die durch die Wechselwirkung ausgelöste Oberflächen-Plasmon- Resonanz in einer metallischen Schicht an der
Grenzfläche zweier für elektromagnetische Strahlung durchlässiger Medien mit unterschiedlichem
Brechungsindex bestimmt wird, wobei das Medium mit geringerem Brechungsindex ein wässeriges Medium ist, in welchem das (Poly) Peptid in immobilisierter Form vorliegt und mit dem Reaktionspartner in
Berührung gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß das (Poly) Peptid durch ein Metallchelat
immobilisiert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wässerige Medium eine biokompatible poröse Matrix, insbesondere ein Hydrogel, ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner über reaktive Gruppen des Hydrogels an die Oberfläche der Biosensoreinheit gebunden ist.
4. Verfahren nach An oruch 2 oder 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hydrogel ausgewählt ist aus der Gruppe Polysarchararide, wie Dextran, Agarose, Carragen, Alginate, Stärke, Zellulose, oder
Derivate davon, oder wasserquellbare organische Polymere, wie Polyvinylalkohl, Polyacrylsäure, Polyacrylamid oder Polyethylenglykol.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel ein Dextran ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Dextran als reaktive Gruppen
Carboxymethylgruppen aufweist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das (Poly) Peptid ein Fusions- (Poly) Peptid ist, das neben seinem
biologisch aktiven Abschnitt ein Äffinitätspeptid mit mindestens einem Histidinrest aufweist und der Chelatbildner ein Iminodiessigsäurederivat ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das (Poly) Peptid ein Äffinitätspeptid mit mindestens zwei benachbarten Histidinresten
aufweist und der Chelatbildner ein
Nitrilotriessigsäure-Derivat der allgemeinen Formel Y-R-CH(COOH)-N(CH2COOH)2 ist, worin R eine Alkylengruppe des Typs (CH2)n- bedeuten kann, die substituiert oder unsubstituiert sein kann, mit der Maßgabe, daß der Substituent nicht nachteilig die Funktion des Chelatbildners beeinflußt, und n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 bedeutet, wobei die Alkylengruppe bei genügender Größe gegebenenfalls auch eine oder mehrere Alken- oder Alkin-Teilstrukturen aufweisen kann, oder, worin R ein aromatisches Brückenglied
bedeuten kann, das aus einem oder mehreren ein- oder mehrkernigen Aromaten, der gegebenenfalls auch ein aromatischer Heterozyklus sein kann, aufgebaut wird, oder, worin R ein Aralkyl -Brückenglied bedeuten kann, in dem der aromatische Teil entweder direkt oder über eine Alkylgruppe des Typs (CH2)n-, worin n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeuten kann, an Y oder an das der Carboxylgruppe benachbarte α-C-Atom gebunden sein kann, und worin Y eine reaktive Gruppe, insbesondere eine NH2~oder eine SH-Gruppe, ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrilotriessigsäure-Derivat
N-(5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure ist.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das (Poly) Peptid ein Äffinitätspeptid mit mindestens zwei benachbarten Histidinresten
aufweist und der Chelatbildner ein
Nitrilotriessigsäure-Derivat der allgemeinen Formel Y-R1-CH(COOH)-N(R2CHCOOH)2 ist, worin R1 eine Gruppe mit der für R in Anspruch 8 definierten Bedeutung sein kann, und, worin R2 eine Alkylgruppe des Typs CH3(CH2)n- sein kann, die substituiert, z.B. mit OH oder Cl, oder unsubstituiert sein kann, und n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeuten kann, oder, worin R2 eine verzweigte Alkylgruppe, wie iso-Propyl, t-Butyl oder iso-Butyl, sein kann, oder, worin R2 ein aromatisches Brückenglied der für R in Anspruch 8 definierten Bedeutung sein kann, und worin Y eine reaktive Gruppe, insbesondere eine NH2-oder eine SH-Gruppe, ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitrilotriessigsäure-Derivat
Nα,Nα-Di(1-carboxyethyl)-2,6-diaminohexansäure ist .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatildner mit einem
Ubergangsmetallion , insbesondere der vierten
Periode, komplexiert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner mit Ni2+-Ionen kompexiert wird.
14. Nitrilotriessigsäure-Derivat der Formel
Nα,Nα-Di (1-carboxyethyl)-2,6-diaminohexansäure.
15. Verwendung des Nitrilotriessigsäure-Derivats nach Anspruch 14 zur Reiningung von Proteinen und
Peptiden mittels Metallchelat-
Affinitätschromatographie.
16. Biosensoreinheit für die Untersuchung der
Wechselwirkung eines (Poly) Peptids mit einem
Reaktionspartner mittels Bestimmung der Oberflächen- Plasmon-Resonanz in einer metallischen Schicht an der Grenzfläche zweier für elektromagnetische
Strahlung durchlässiger Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex, wobei das Medium mit geringerem Brechungsindex ein wässeriges Medium ist, dadurch gekennzeichnet, daß an die dem wässerigen Medium zugewandte Oberfläche der Biosensoreinheit ein
Chelatbildner, gegebenenfalls in mit einem Metallion komplexierter Form, gebunden ist.
17. Biosensoreinheit nach Anspruch 16, dadurch
gekennzeichnet, daß der Chelatbildner an die reaktiven Gruppen einer biokompatiblen porösen Matrix, insbesondere eines Hydrogels, gebunden ist.
18. Biosensoreinheit nach Anspruch 17, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hydrogel ausgewählt ist aus der Gruppe Polysacchararide, wie Dextran, Agarose, Carragen, Alginate, Stärke, Zellulose, oder
Derivate davon, oder wasserquellbare organische Polymere, wie Polyvinylalkohl, Polyacrylsäure, Polyacrylamid oder Polyethylenglykol.
19. Biosensoreinheit nach Anspruch 18, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hydrogel ein Dextran ist.
20. Biosensoreinheit nach Anspruch 19, dadurch
gekennzeichnet, daß das Dextran als reaktive
Gruppen Carboxymethylgruppen aufweist.
21. Biosensoreinheit nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner ein Iminodiessigsäurederivat ist.
22. Biosensoreinheit nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß Chelatbildner ein
Nitrilotriessiqsäure-Derivat der allgemeinen Formel Y-R-CH(COOH)-N1CH2COOH)2 ist, worin R eine Alkylengruppe des Typs (CH2)n- bedeuten kann, die substituiert oder unsubstituiert sein kann, mit der Maßgabe, daß der Substituent nicht nachteilig die Funktion des Chelatbildners beeinflußt, und n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 bedeutet, wobei die Alkylengruppe bei genügender Größe gegebenenfalls auch eine oder mehrere Alken- oder Alkin-Teilstrukturen aufweisen kann, oder, worin R ein aromatisches Brückenglied
bedeuten kann, das aus einem oder mehreren ein- oder mehrkernigen Aromaten, der gegebenenfalls auch ein aromatischer Heterozyklus sein kann, aufgebaut wird, oder, worin R ein Aralkyl-Brückenglied bedeuten kann, in dem der aromatische Teil entweder direkt oder über eine Alkylgruppe des Typs (CH2)n-, worin n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeuten kann, an Y oder an das der Carboxylgruppe benachbarte α- C-Atom gebunden sein kann, und worin Y eine reaktive Gruppe, insbesondere eine NH2-oder eine SH-Gruppe, ist.
23. Biosensoreinheit nach Anspruch 22, dadurch
gekennzeichnet, daß das Nitrilotriessigsäure- Derivat N-(5-Amino-1- carboxypentyl) iminodiessigsäure ist.
24. Biosensoreinheit nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß das (Poly) Peptid ein
Äffinitätspeptid mit mindestens zwei benachbarten Histidinresten aufweist und der Chelatbildner ein Nitrilotriessigsäure-Derivat der allgemeinen Formel Y-Rl-CH(COOH)-N(R2CHCOOH)2 ist, worin R1 eine Gruppe mit der für R in Anspruch 8 definierten Bedeutung sein kann, und, worin R2 eine Alkylgruppe des Typs CH3 (CH2)n- sein kann, die substituiert oder unsubstituiert sein kann, und n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeuten kann, oder, worin R2 eine verzweigte Alkylgruppe, z.B. iso-Propyl, t-Butyl oder iso-Butyl, sein kann, oder, worin R2 ein aromatisches Brückenglied der für R in Anspruch 8 definierten Bedeutung sein kann, und worin Y eine reaktive Gruppe, insbesondere eine NH2-oder eine SH-Gruppe, ist.
25. Biosensoreinheit nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß das Nitrilotriessigsäure- Derivat Nα,Nα-Di (1-carboxyethyl)-2,6- diaminohexansäure ist.
26. Biosensor-Kit für die Untersuchung der
Wechselwirkung eines (Poly) Peptids mit einem
Reaktionspartner mittels SPR, enthaltend in einem ersten Behälter eine SPR-Biosensoreinheit, in einem weiteren Behälter einen Chelatbildner, in einem weiteren Behälter ein Salz eines zur Komplexierung mit dem Chelatbildner geeigneten Metalls, in einem oder mehreren weiteren Behältern Reagenzien für die Aktivierung der Oberfläche der Biosensoreinheit, gegebenenfalls in einem weiteren Behälter ein
Reagens zur Deaktivierung der Oberfläche,
gegebenenfalls in einem weiteren Behälter ein
Reagens zur Regenerierung der Oberfläche sowie gegebenenfalls in einem oder mehreren weiteren Behältern ein oder mehrere Vergleichsproteine.
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998048281A1 (en) * 1997-04-24 1998-10-29 American Home Products Corporation Method for the identification and characterization of nuclear receptor ligands
US5955379A (en) * 1996-04-25 1999-09-21 Mcgill University Biosensor device and method
US6107080A (en) * 1996-04-25 2000-08-22 Mcgill University Biosensor device and method
US6130037A (en) * 1996-04-25 2000-10-10 Pence And Mcgill University Biosensor device and method
US6461490B1 (en) 1996-04-25 2002-10-08 Pence, Inc. Biosensor device and method
US6787368B1 (en) 1999-03-02 2004-09-07 Helix Biopharma Corporation Biosensor method for detecting analytes in a liquid
US8557194B2 (en) 2007-07-13 2013-10-15 Fujifilm Corporation Carrier, process for producing same, bioreactor, and chip for surface plasmon resonance analysis
US10048260B2 (en) 2007-12-12 2018-08-14 Electronics And Telecommunications Research Institute PS-SPCL searching apparatus and method using surface plasmon resonance

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2342767C (en) * 1998-09-03 2009-11-03 Trellis Bioinformatics, Inc. Multihued labels
AUPP856399A0 (en) * 1999-02-08 1999-03-04 Australian Membrane And Biotechnology Research Institute Improved compounds for protein binding
US7804592B2 (en) 2003-10-16 2010-09-28 Nard Institute, Ltd. Method for measuring a surface plasmon resonance and noble metal compound used for the same
AU2004282761A1 (en) * 2003-10-16 2005-04-28 Kabushiki Kaisha Nard Kenkyusho Method of measuring a surface plasmon resonance and noble metal compound used for the same
CN101261226B (zh) * 2007-03-08 2010-12-08 北京宏荣博曼生物科技有限责任公司 一种基于聚乙二醇的表面等离子共振仪芯片
JP2010197046A (ja) * 2007-05-28 2010-09-09 Tanaka Holdings Kk バイオセンサー
CN114797804B (zh) * 2022-03-29 2023-08-04 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种具有长连接臂的nta色谱介质及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4569794A (en) * 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
EP0253303A2 (de) * 1986-07-10 1988-01-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Neue Metallchelatharze
EP0282042A2 (de) * 1987-03-10 1988-09-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Neue Fusionsproteine und deren Reinigung
EP0339389A1 (de) * 1988-04-25 1989-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Diagnose-Hilfsmittel
WO1990005303A1 (en) * 1988-11-10 1990-05-17 Pharmacia Ab Sensing surfaces capable of selective biomolecular interactions, to be used in biosensor systems
WO1990012803A1 (en) * 1989-04-14 1990-11-01 Biogen, Inc. Process for purifying a protein
EP0485874A2 (de) * 1990-11-14 1992-05-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunsensorischer Wandler und Verfahren zu seiner Herstellung

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85137A (en) * 1987-01-21 1992-02-16 Ares Serono Res & Dev Ltd Method of assaying for a ligand using surface plasmon resonance effect

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4569794A (en) * 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
EP0253303A2 (de) * 1986-07-10 1988-01-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Neue Metallchelatharze
EP0282042A2 (de) * 1987-03-10 1988-09-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Neue Fusionsproteine und deren Reinigung
EP0339389A1 (de) * 1988-04-25 1989-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Diagnose-Hilfsmittel
WO1990005303A1 (en) * 1988-11-10 1990-05-17 Pharmacia Ab Sensing surfaces capable of selective biomolecular interactions, to be used in biosensor systems
WO1990012803A1 (en) * 1989-04-14 1990-11-01 Biogen, Inc. Process for purifying a protein
EP0485874A2 (de) * 1990-11-14 1992-05-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunsensorischer Wandler und Verfahren zu seiner Herstellung

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5955379A (en) * 1996-04-25 1999-09-21 Mcgill University Biosensor device and method
US6107080A (en) * 1996-04-25 2000-08-22 Mcgill University Biosensor device and method
US6130037A (en) * 1996-04-25 2000-10-10 Pence And Mcgill University Biosensor device and method
US6461490B1 (en) 1996-04-25 2002-10-08 Pence, Inc. Biosensor device and method
US6478939B1 (en) 1996-04-25 2002-11-12 Pence, Inc. Biosensor device and method
WO1998048281A1 (en) * 1997-04-24 1998-10-29 American Home Products Corporation Method for the identification and characterization of nuclear receptor ligands
US6787368B1 (en) 1999-03-02 2004-09-07 Helix Biopharma Corporation Biosensor method for detecting analytes in a liquid
US8557194B2 (en) 2007-07-13 2013-10-15 Fujifilm Corporation Carrier, process for producing same, bioreactor, and chip for surface plasmon resonance analysis
US10048260B2 (en) 2007-12-12 2018-08-14 Electronics And Telecommunications Research Institute PS-SPCL searching apparatus and method using surface plasmon resonance

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