DE10006760B4

DE10006760B4 - Herstellung eines Protein Biosensors mit einer definierten Bindematrix

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Publication number: DE10006760B4
Application number: DE2000106760
Authority: DE
Inventors: Günter Dr. Tovar; Jürgen Dr. Bernhagen; Afroditi Dr. Kapurniotu; Christian Dipl.-Chem. Hoffmann; Christian Dr. Schneider-Fresenius
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2000-02-15
Filing date: 2000-02-15
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2020-02-16
Also published as: WO2001061352A8; WO2001061352A3; WO2001061352A2; DE10006760A1; AU4643201A

Abstract

Bindematrix, umfassend einen Träger mit einer erste funktionelle Gruppen aufweisenden Oberfläche und an den Träger immobilisierte modifizierte Proteine, die die ersten funktionellen Gruppen bindende komplementäre, im Wildtyp-Protein nicht vorkommende, zweite funktionelle Gruppen aufweisen, wobei die Proteine durch eine die zweite funktionelle Gruppe aufweisende unnatürliche Aminosäure oder durch eine als Strep Tag I, Strep Tag II oder Oligohistidingruppe ausgeführte zweite funktionelle Gruppe modifiziert sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Detektion von Stoffen, insbesondere eine immobilisierte Proteine aufweisende Bindematrix, Verfahren zur Herstellung derselben sowie deren Verwendung in der medizinischen Forschung und Diagnostik.
In der angewandten Mikrobiologie und der Biotechnologie existieren verschiedene Verfahren zum Fixieren von Enzymen, enzymproduzierenden Mikroorganismen und Zellen als Biokatalysatoren auf bestimmten Trägern. So werden native Enzyme bei der Lagerung oder beim einmaligen Batch-Ansatz durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Aktivität reduziert, so dass, insbesondere aufgrund der hohen Herstellkosten von Enzymen es wünschenswert ist, Enzyme zu stabilisieren. Dabei sollte über einen langen Zeitraum eine möglichst hohe Aktivität unter den unterschiedlichsten Belastungen beibehalten werden. Zudem sollte ein wiederholter Einsatz der Proteine oder Enzyme unter technischen Bedingungen möglich sein. Bekannt ist es daher, die Proteine zu immobilisieren, wobei die Bindung eines Proteins, zum Beispiel eines Enzyms, an einen Träger vorzugsweise so erfolgt, dass die dreidimensionale Struktur am aktiven Zentrum des Enzyms nicht verändert wird. Zudem darf die Substrat-Spezifität eines Enzyms beziehungsweise die biologische Aktivität des Proteins durch die Immo bilisierung nicht verlorengehen. Die Immobilisierung kann durch Bindung an Träger, durch Quervernetzung der Proteine untereinander, durch Verkapselung oder durch Einschluss in zum Beispiel semipermeable Membranen erfolgen.
Von besonderer Bedeutung ist dabei die Immobilisierung an Trägern. Die Bindung an einen Träger erfolgt im allgemeinen durch Adsorptionsionenbindung oder kovalente Bindung.

In Weetall, Advances in Molecular amid Cell Biology, Bd. 15A (1996), 161–192, ist die Herstellung immobilisierter Proteine, die über Silan-Kopplungsmittel kovalent an anorganische Träger gebunden sind, beschrieben. Chatelier et al. beschreiben in J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Bd. 7, Nr. 7 (1995), 601–622, optimierte Strategien zur kovalenten Bindung von Proteinen an Polymeroberflächen. Aus Inman "Covalent attachment of ligands to supports by using heterobifuncitonal reagents", in: Affinity Chromatography and Related Techniques (Herausgeber: Gribnau, Visser and Nivard), 1982, S. 217–233, ist die Verwendung heterobifunktioneller Reagenzien zur Anlagerung von Liganden an einen Träger bekannt. Ferner ist aus GBF Monogr. (Biosens.: Fundam., Technol. Appl.) 17 (1992), 527–530, die Verwendung einer bifunktionellen Verbindung zur Immobilisierung des Ankerproteins Avidin an der Oberfläche einer Kohlenstoffelektrode bekannt.

Kovalente Immobilisierungsmethoden von Proteinen an festen Oberflächen basieren auf Reaktionen unter Beteiligung komplementärer funktioneller Gruppen als Reaktionspartner zwischen Proteinen und Oberflächen der Träger. Dabei stellen die natürlich vorkommenden Aminosäuren und die in ihnen vorkommenden funktionellen Gruppen die in Frage kommenden Reaktionspartner der Proteine dar. Die Zahl der dadurch ermöglichten Reaktionen mit einer Festphase ist zwar groß, aber dennoch limitiert. Im Besonderen aber kommen die unterschiedlichen, für Immobilisierungsreaktionen in Frage kommenden Aminosäuren häufig mehrfach in Zielproteinen vor, so dass eine gerichtete Immobilisierung nicht oder nur ineffizient möglich ist.

So kommen die für die Immobilisierung in Frage kommenden Aminogruppen am N-terminalen Ende eines Proteins sowie in allen Lysinresten vor. Auch Arginin mit seiner Guanidiniumgruppe reagiert häufig, wenn primäre Amine zur Reaktion geführt werden sollen. So können in einem Protein mittlerer Größe (zum Beispiel 50 kDa mit circa 500 Aminosäuren) 20 bis 30 solcher reaktiven Gruppen vorkommen; die Immobilisierung ist entsprechend unspezifisch beziehungsweise nicht einmal definierbar. Eine Identifizierung der reagierenden Reste nach der Immobilisierung ist meßtechnisch praktisch nicht durchzuführen.

Bekannt ist eine Anzahl "semi-gerichteter" Immobilisierungsstrategien. Einige dersolchen basieren auf der Bildung nicht-kovalent verbundener Komplexe und werden, insbesondere unter Zuhilfenahme von molekularen Markierungen, wie zum Beispiel die Oligohistidin-Markierung, häufig eingesetzt. Oligohistidin-Markierungen an Proteinen, meist gentechnisch N- oder C-terminal fusioniert, sind weit verbreitet, können aber auch gentechnisch in der Mitte der Sequenz eingebracht werden. Andere C- oder N-terminale "Tags", also Markierungen, sind bekannt. Insgesamt können diese Tags oder analog dazu die als Liganden fungierenden Gruppen – wie diskutiert – in gewisser Weise ortsspezifisch an Proteinen angebracht werden und so eine gewisse gerichtete Proteinimmobilisierung ermöglichen.

Ein Nachteil dieser Technologien bleibt jedoch die Tatsache, dass nicht-kovalente Komplexe immer dem Massenwirkungsgesetz unterliegen und damit bei wechselnden externen Bedingungen (zum Beispiel Puffer, Medien, Temperatur) unterschiedlich stark auf der Oberfläche gebunden werden. Somit können sie die Stabilität einer kovalenten Bindung nicht erreichen.

Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass molekulare Markierungen in der Regel nur am N- oder C-terminalen Molekülende angefügt werden. Diese Positionen können für eine gerichtete Immobilisierung aus sterischen und funktionellen Gründen stören. C- oder N-terminale Molekülenden zeichnen sich darüber hinaus bei vielen Proteinen durch eine strukturelle Flexibilität und weniger stringente Konformationseinschränkungen aus. Dies kann Vorteile haben, wie im Falle von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen nach dem "Induced fit"-Prinzip. Es ist aber in der Regel nachteilig, wenn eine bestimmte Ausrichtung der immobilisierten Proteine angestrebt wird.

Darüber hinaus lassen sich strukturierte Oberflächen mit diesen unspezifischen Methoden nicht oder nur ineffizient gewinnen.

Der vorliegenden Erfindung liegt also das technische Problem zu Grunde, eine immobilisierte Proteine aufweisende Bindematrix zur Verfügung zu stellen, die die vorgenannten Nachteile überwindet.

Die Erfindung löst das ihr zu Grunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung einer Bindematrix, umfassend einen Träger, insbesondere einen anorganischen Träger oder einen Kunststoffträger mit einer erste funktionelle Gruppen aufweisenden Oberfläche und an die ersten funktionellen Gruppen gebundene modifizierte Proteine, die eine komplementäre, im Wildtyp-Protein nicht vorkommende, zweite funktionelle Gruppe aufweisen, wobei die Proteine durch eine die zweite funktionelle Gruppe aufweisende unnatürliche Aminosäure oder durch eine als Strep Tag I, Strep Tag II oder Oligohistidingruppe ausgeführte zweite funktionelle Gruppe modifiziert sind.

Die Erfindung stellt also eine Bindematrix bereit, die einen Träger, insbesondere einen anorganischen oder Kunststoff-Träger umfasst, wobei die Oberfläche dieses Trägers erste funktionelle Gruppen aufweist und wobei an diese erste funktionellen Gruppen modifizierte Proteine gebunden sind, deren Modifikation ebenfalls in mindestens einer – zweiten – funktionellen Gruppe besteht. Die zweite funktionelle Gruppe kommt im Wildtyp-Protein nicht vor. Es handelt sich dabei um eine Gruppe, die entweder in einer unnatürlichen Aminosäure angeordnet ist oder als Strep Tag I, Strep Tag II oder Oligohistidingruppe ausgeführt ist. Die Bindung der ersten funktionellen Gruppe des Trägers mit dem Protein, insbesondere mit der zweiten funktionellen Gruppe des Proteins, kann eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung, wie zum Beispiel eine Adsorption oder nicht-kovalente Affinitätsbindung, sein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer ersten funktionellen Gruppe eine auf die Oberfläche des Trägers aufgebrachte chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer zweiten funktionellen Gruppe eines zu immobilisierenden Proteins derart zu interagieren, dass eine Bindung, kovalenter oder nicht-kovalenter Art, zwischen den beiden Bindungspartnern stattfinden kann.

Die erste funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe des Trägers ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkylketongruppe, insbesondere Methylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Biotin, Desthiobiotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplexe, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.

Die zweite funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe des zu immobilisierenden Proteins, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminosäure des Proteins angeordnete zweite funktionelle Gruppe, ist ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die erste funktionelle Gruppe erläutert, enthält. Eine erfindungsgemäße Bindematrix weist also an ihrer Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe auf, die kovalent oder nicht-kovalent mit einer zweiten funktionellen Gruppe eines zu immobilisierenden Proteins verknüpft ist, wobei die erste funktionelle Gruppe eine andere Gruppe als die zweite funktionelle Gruppe ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, d.h. in der Lage sein eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen.

Wird erfindungsgemäss als erste funktionelle Gruppe z.B. eine Alkylketongruppe, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe verwendet, ist die zweite funktionelle Gruppe, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminogruppe des Proteins angeordnete zweite Gruppe, eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe.

Wird erfindungsgemäss umgekehrt eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe als erste funktionelle Gruppe verwendet, ist erfindungsgemäss die zweite funktionelle Gruppe, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminogruppe des Proteins angeordnete zweite Gruppe, eine Alkylketon, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe. Wird erfindungsgemäss eine Thiolgruppe als erste funktionelle Gruppe verwendet, ist die zweite komplementäre funktionelle Gruppe, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminogruppe des Proteins angeordnete zweite Gruppe, eine Thioestergruppe. Wird als erste funktionelle Gruppe eine Thioestergruppe verwendet, ist erfindungsgemäss die zweite funktionelle Gruppe, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminogruppe des Proteins angeordnete zweite Gruppe, eine Thiolgruppe.

Wird erfindungsgemäss als erste funktionelle Gruppe ein Metallionenchelatkomplex verwendet, ist die zweite funktionelle komplementäre Gruppe eine Oligohistidingruppe. Wird als erste funktionelle Gruppe eine Oligohistidingruppe verwendet, ist die zweite funktionelle komplementäre Gruppe, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminogruppe des Proteins angeordnete zweite Gruppe, ein Metallionenchelatkomplex.

Wird als erste funktionelle Gruppe Strep-Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin verwendet, wird als zweite komplementäre funktionelle Gruppe, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminogruppe des Proteins angeordnete zweite Gruppe, Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt. Wird als erste funktionelle Gruppe Strepta vidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt, wird als zweite komplementäre funktionelle Gruppe Strep Tag I, Strep Tag II, Biotin oder Desthiobiotin eingesetzt.

Wird in einer weiteren Ausführungsform Chitin oder ein Chitinderivat als erste funktionelle Gruppe eingesetzt, wird als zweite funktionelle komplementäre Gruppe, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminogruppe des Proteins angeordnete zweite Gruppe, eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt. Wird als erste funktionelle Gruppe eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt, wird als zweite funktionelle komplementäre Gruppe, insbesondere die in einer unnatürlichen Aminogruppe des Proteins angeordnete zweite Gruppe, Chitin oder ein Chitinderivat eingesetzt.

Die vorgenannten ersten und/oder zweiten funktionellen Gruppen werden vorzugsweise mittels eines Spacers mit dem zu immobilisierenden Protein bzw. dem Träger verbunden bzw. mittels eines Spacers an den Träger oder in das Protein eingeführt. Der Spacer dient also einerseits als Abstandshalter der funktionellen Gruppe zu Träger bzw. Protein, andererseits als Träger für die funktionelle Gruppe. Ein derartiger Spacer kann erfindungsgemäss Alkylengruppen mit 2 bis 50 C-Atomen darstellen, der in bevorzugter Ausführungsform substituiert ist und Heteroatome aufweist. Der Spacer kann flexibel und/oder linear sein. Bei Verwendung eines Spacers in Zusammenhang mit einer ersten funktionellen Gruppe bindet der Spacer, vorzugsweise kovalent, an eine Seitenkette einer Aminosäure des Proteins, wobei die Aminosäure an die die Bindung erfolgt, eine natürliche oder unnatürliche Aminosäure sein kann. Sofern die Aminosäure eine natürliche Aminosäure ist, wird sie durch die Bindung an den Spacer und die damit verbundene funktionelle erste Gruppe zu einer unnatürlichen Aminosäure im Sinne der Erfindung.

Sofern der Spacer eine zweite funktionelle Gruppe mit einem Träger verbindet, geschieht dies vorzugsweise über eine auf dem Träger angeordnete Ankergruppe, die vorzugsweise als Silan mit reaktiven Gruppen ausgeführt ist, z.B. die mit Si-OH-Gruppen der Oberfläche des vorzugsweise oxidischen Si-Trägers kovalente Si-O-Si-Bindungen (Siloxanbindungen) ausbilden kann.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung verbindet der Spacer die funktionelle Gruppe mit dem Protein oder Träger, wobei die funktionelle Gruppe auch als Bestandteil des Spacers, d.h. eine seiner funktionellen Gruppen angesehen werden kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden als erste funktionelle Gruppe die Methylketongruppe, die Aldehydgruppe, die Hydrazingruppe, die Hydrazidgruppe, die Thiolgruppe oder die Thioestergruppe verwendet, die mittels eines Spacers, z.B. im Fall einer Alkylketongruppe mittels Lävu linsäure, mit einer Seitenkette einer in dem zu immobilisierenden Protein vorhandenen natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure verbunden werden bzw. durch den Spacer in das Protein eingeführt werden. Sofern die Verbindung zu einer natürlichen Aminosäure erfolgt, wird diese durch die Bindung mit dem die funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer zu einer unnatürlichen Aminosäure.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Träger ein chemisch inerter Stoff verstanden, der als Gerüst für das immobilisierte Protein dient. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Träger ein Träger, der aus einem oxidischen Trägermaterial besteht oder dieses im Wesentlichen enthält. In besonders bevorzugter Ausführungsform enthält der Träger Siliciumdioxid, ein Silikat, Zinkdioxid, Tonerde (Al₂O₃), SiO₂·Al₂O₃, TiO₂, Fe₂O₃, Ag₂O, Cr₂O₃, Ta₂O₅, ZrO₂, einen Zeolith, technisches Glas und/oder Indiumzinnoxid in wesentlichen Mengen, insbesondere zu mehr als 80 Gew.-%, oder besteht aus mindestens einer dieser Substanzen. Das anorganische Trägermaterial kann auch in Form von Quarz, Kieselerde, Kieselgur, Silicagel und/oder SiO₂-Pulver vorliegen. Besonders bevorzugt ist es, als Träger einen Silicium-Wafer zu verwenden. Der Träger kann jedoch auch ein Träger aus Kunststoff, zum Beispiel Polypropylen oder Polystyrol sein, zum Beispiel in Form einer Mikrotiterplatte. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der, vorzugsweise anorganische, Träger, insbesondere der Silicium-Wafer, silanisiert, vorzugsweise nach vorhergehender Hydrophilisierung.

In bevorzugter Ausführung erlaubt die Verwendung von metallischen Trägern den Einsatz von elektrischen Detektionsverfahren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Oberfläche des Trägers, insbesondere des Silicium-Wafers, Mikrostrukturen mit unterschiedlichen Funktionalitäten aufweist, hergestellt beispielsweise durch Photolithographie oder Prägetechniken. Schließlich kann vorgesehen sein, dass die Mikrostrukturen der Oberflächen mit photolytisch oder thermolytisch aktivierbaren Schutzgruppen versehen sind, die eine lithographische Modifizierung der Oberfläche erlauben.

Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, dass die Bindematrix mehrere verschiedene Komponenten, das heißt erste funktionelle Gruppen, an ihrer Oberfläche aufweist.

In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Anzahl der ersten funktionellen Gruppen durch Zugabe von Verdünnersilanen bei der vorzugsweise vorgesehenen Silanisierung variiert werden kann. Unter dem Begriff Verdünnersilan wird ein keine ersten funktionellen Gruppen tragendes Organosilan verstanden, das überdies nicht in der Lage ist, einen die erste funktionelle Gruppe tragenden Spacer zu binden. Vozugsweise wird das Verdünnersilan eingesetzt, um neben dem Verdünnungseffekt auch die unspezifische Bindung von Proteinen zu reduzieren. In bevorzugter Ausführungsform weist das Verdünnersilan von der Silankopfgruppe ausgehend 2 bis 20 Alkylengruppen auf, an die vorzugsweise 2 bis 6 Oxoethylengruppen anschließen und durch z.B. eine Hydroxygruppe oder Methylethergruppe terminiert sind.

In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Verdünnersilane der Bindematrix durch entsprechende Alkylkettenlänge den Self-Assembly-Effekt begünstigen. Zudem kann vorgesehen sein, dass diese Verdünnersilane, die bei der Silanisierung des Trägers verwendet werden, die unspezifische Adsorption von Proteinen an der Bindematrix durch zugefügte entsprechende funktionelle Einheiten, wie zum Beispiel Oligoethylenglycoleinheiten, verringern. Erfindungsgemäß können auch andere chemische Verbindungen eingesetzt werden, sofern sie bezüglich ihres unspezifischen Bindungsverhaltens Protein-abweisend wirken.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protein ein mindestens zwei über eine Amidbindung miteinander verbundene Aminosäuren umfassendes Molekül verstanden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann ein Protein also auch ein Peptid, zum Beispiel eine Oligopeptid, ein Polypeptid, oder ein Teil, zum Beispiel eine Domäne davon, sein. Ein derartiges Protein kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann durch gentechnische Methoden gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche oder/und ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Das Protein kann gegenüber der Wildtyp-Form derivatisiert sein, beispielsweise Glycosylierungen aufweisen, es kann verkürzt sein, es kann mit anderen Proteinen fusioniert sein oder mit Molekülen anderer Art, wie bei spielsweise Kohlenhydraten verbunden sein. In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt das Protein die Ras-bindende Domäne (RBD) der Raf-Kinase dar (beschrieben in Nassar et al., Nature (1995) 375, 554–560). RBD ist die Ras-Bindungsdomäne der Raf-Kinase und vermittelt in der Zelle oder auch in vitro die Bindung und Umsetzung von GTP-Ras (ras: Onkogen aus Rattensarcomvirus; GTP: Guanosintriphosphat). So werden Zellregulationsvorgänge, insbesondere Zellwachstums- und Zellcyclusvorgänge reguliert.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird RBD nach peptidsynthetischen Methoden oder durch In vitro-Translation hergestellt. Dabei werden in bevorzugter Ausführungsform bei der Herstellung unnatürliche, vorzugsweise Linker/Spacer-tragende, Aminosäuren gezielt eingebaut, so dass nachfolgend eine gerichtete und mit dem Erhalt der biologischen Aktivität von RBD als GTP-Ras-Bindungspartner kompatible Immobilisierung von RBD möglich ist. Die Anwendung des Prinzips des Einbaus unnatürlicher Aminosäuren ermöglicht darüber hinaus den gezielten und selektiven Einbau von Fluorophoren oder anderen Markern an diesen unnatürlichen Aminosäuren.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist das zu immobilisierende Protein, also zum Beispiel RBD, im Vergleich zum Wildtyp-Protein modifiziert, das heißt, weist zweite funktionelle Gruppen auf, die im Wildtyp-Protein nicht vorkommen.

In besonders bevorzugter Weise können diese Modifikationen darin bestehen, dass in dem Protein natürlicherweise vorkommende Aminosäuren durch unnatürliche Aminosäuren ausgetauscht sind, das heißt, in einer bestimmten Position eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure entfernt und an gleicher Stelle eine unnatürliche Aminosäure inseriert wird. Dieses Einfügen einer unnatürlichen Aminosäure kann durch das Einfügen eines Stop-Codons an der gewünschten Stelle, das Verwenden Einsatz mit der entsprechenden unnatürlichen Aminosäurebeladenen Suppressor-tRNA and eines damit durchgeführten invitro Translationsansatzes geschehen. Derartige unnatürliche Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäurefunktion und einen Rest R aufweisen und nicht über einen natürlich vorkommenden genetischen Code definiert sind, zum Beispiel L-(6,7-Dimethyoxy-coumaryl)-Alanin. In besonders bevorzugter Weise weisen diese Aminosäuren eine Alkylketongruppe (-COR) oder eine Aldehydgruppe (-CHO), Thioestergruppe, Thiolgruppe, Hydrazingruppe oder Hydrazidgruppe auf.

Diese unnatürlichen Aminosäuren können durch gentechnologische Verfahren oder während einer chemischen Synthese des Proteins in das Protein eingefügt werden, vorzugsweise zusammen mit Spacern oder Linkern.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist also zumindest eine Aminosäure des Proteins, insbesondere eine unnatürliche Aminosäure des Proteins, derivatisiert, insbe sondere durch Einführung einer Alkylketongruppe, Thiolgruppe, Aldehydgruppe, Thioestergruppe, Hydrazingruppe oder/und Hydrazidgruppe. Insbesondere wird eine der vorhergehenden Funktionen über einen Spacer mit der Seitenkette einer unnatürlichen Aminosäure verbunden bzw. der Spacer weist eine solche Funktion auf. Der Spacer kann in bevorzugter Ausführungsform flexibel oder linear sein, und z.B. eine Kettenlänge von 2 bis 50 Atomen aufweisen. Der Spacer ist in weiterer bevorzugter Ausführung durch ggf. substituierte und/oder Heteroatome enthaltende Alkylengruppen gebildet. In bevorzugter Ausführungsform enthält der Spacer 1 oder mehrere Oxyethylengruppen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Spacer durch die Bindung einer Seitenkette einer Aminosäure des Proteins, z.B. Lysin, an Lävulinsäure (4-Oxopentansäure) gebildet, wobei gleichzeitig eine Methylketongruppe eingeführt wird und der Spacer demgemäss aus Seitenkette und Lävulinsäure gebildet wird.

Sofern die einzusetzende unnatürliche Aminosäure bereits eine Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Hydrazidgruppe oder Hydrazidgruppe aufweist, ist eine vorgenannte Derivatisierung nicht mehr nötig. Es kann auch vorgesehen sein, eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure, z.B. Lysin, zu modifizieren, zum Beispiel durch Derivatisierung deren Seitenkette insbesondere deren primärer Aminogruppe, mit der Carbonsäurefunktion der Lävulinsäure. Der Einbau von z.B. Lävulinsäure (4-Oxopentansäure) in eine unnatürliche Aminosäure ermöglicht es, an definierter Stelle der Sequenz eine Ketofunktion einzubauen, die dann se lektiv z.B. mit einem Hydrazin oder Hydrazid zu Hydrazon reagieren kann, zum Beispiel zwecks kovalenter Immobilisierung der RBD (Canne et al., J. Am. Chem. Soc., 117; 2998–3007 (1995)). In der besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gemäß der das Protein RBD ist, kann in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vorgesehen sein, die unnatürlichen Aminosäuren an den Positionen 64, 106, 108 oder 109 (bezogen auf die Aminosäuresequenz des natürlicherweise vorkommenden RBD, Nassar et al., a.a.O.) von RBD einzufügen. In den vorgenannten Ausführungsformen, die die vorstehend beschriebenen derivatisierte unnatürliche Aminosäuren aufweisende Proteine betreffen, weist die Oberfläche des Trägers entsprechende, komplementäre zweite funktionelle Gruppen, z.B. Hydrazid-Gruppen als zweite funktionelle Gruppen auf, die z.B. eine kovalente Bindung zwischen Protein und Träger gewährleisten. Eine kovalente Bindung zwischen zu immobilisierendem Protein und Trägeroberfläche kann auch z.B. über Thioester-Bindungen erfolgen, gemäß der eine Säurefunktion und ein Thiol, jeweils auf Träger oder Protein angeordnet, miteinander reagieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Modifikation des Proteins dadurch vorgenommen sein, dass dem Protein Tags, also Markierungen, insbesondere mindestens drei Histidin-Reste, vorzugsweise Oligohistidine, hinzugefügt werden, vorzugsweise an den C-Terminus oder den N-Terminus. Die Tags können jedoch auch intramolekular angeordnet sein. In einer solchen Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, insbesondere die silanisierte Oberfläche des Trägers, durch Aufbringen von Metallchelatkomplexen mit funktionellen Gruppen zu versehen. Auf diese Weise kann eine nicht-kovalente Bindung der Metallchelatkomplexe mit dem Oligohistidin-Rest des zu immobilisierenden Proteins erreicht werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt die Metallkomponente des Metallchelatkomplexes ein zweiwertiges Metallkation, insbesondere Nickel²⁺, dar. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Metallchelatkomplex Nickel-NTA (NTA: Nitrilotriessigsäure), insbesondere ein Derivat davon. Der Metallchelatkomplex, insbesondere Ni-NTA oder ein Derivat davon, ist in bevorzugter Ausführungsform an der Oberfläche des Trägers gebunden, z.B. mittels einer Bindung zwischen einer primären Aminogruppe des NTA-Derivats und einer Oberflächen-gebundenen Epoxygruppe.

Die Erfindung sieht in bevorzugter Weise vor, dass die Oberfläche des Trägers vor Aufbringen der ersten funktionellen Gruppe mit einer weiteren funktionellen Gruppe versehen wird, z.B. eine Epoxygruppe, die die Bindung der ersten funktionelle Gruppe an die Oberfläche ermöglicht.

Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, die Modifizierung des Proteins dadurch vorzunehmen, dass diesem, vorzugsweise am C-Terminus oder N-Terminus, mindestens ein Strep-Tag z.B. Strep Tag I oder Strep Tag II oder Biotin oder Desthiobiotin hinzugefügt wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter einem Strep Tag auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern sie Streptavidin oder/und dessen Äquivalente binden können. Der Begriff Streptavidin erfasst im Sinn der vorliegenden Erfindung also auch dessen funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente. In dieser Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, insbesondere anorganischen Trägers, vorzugsweise die silanisierte Oberfläche des Trägers, mit Streptactin, Avidin, Neutravidin oder Streptavidin zu versehen. Die erfindungsgemäß vorgesehene Bindung zwischen zu immobilisierendem Protein und Oberfläche des Trägers erfolgt also durch eine Affinitätsbindung zwischen z.B. Strep-Tag und z.B. Streptavidin. Es ist auch möglich, das z.B. Streptavidin am Protein und z.B. das Strep-Tag als funktionelle Gruppe des Trägers vorzusehen. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß auch möglich, mehrere der genannten Modifikationen an einem zu immobilisierenden Protein vorzunehmen, zum Beispiel eine unnatürliche Aminosäure, die Oligohistidin- und/oder Strep-Tags enthält, in ein Protein einzuführen.

In bevorzugter Ausführungsform wird das zu immobilisierende Protein, insbesondere RBD, ortspezifisch und nativ durch:

a) Einführung einer Linker-tragenden unnatürlichen Aminosäure, zum Beispiel an Position 108, durch peptidsynthetische, gentechnische oder in vitro-Translationsmethoden,
b) durch Einführung eines C-terminalen His-Tags,
c) durch Einführung anderer C- oder N-terminaler Tags,
d) durch Einführung intramolekularer Tags oder
e) durch Schutzgruppen-dirigierte Spezifizierung (selektives Einbringen und Abspalten von peptidsynthetischen Schutzgruppen an gewünschten Stellen)

immobilisiert. Eine ortsspezifische Einführung von Markern erfolgt gleichermaßen, beziehungsweise im Besonderen nach den Prinzipien a) und e).

Die Erfindung sieht also vor, mit unnatürlichen Aminosäuren oder spezifischen Histidin- und/oder Strep-Tags modifizierte Proteine mit dazu komplementär reaktiven Oberflächen derart zur Bindung zu bringen, dass eine geeignete spezifische kovalente oder nicht-kovalente Anbindung der Proteine und damit eine Immobilisierung dieser erfolgt. In vorteilhafter Weise behalten die gebundenen Proteine dabei vollständig ihre biologische Funktion bei. Durch die bereitgestellten Linker zwischen Träger- und Proteinoberfläche wird den sterischen Anforderungen für eine Immobilisierung von Proteinen unter Erhalt deren Aktivität genüge getan. Zudem ermöglicht die Erfindung auch den ortsspezifischen Einbau von Reporter- oder Markergruppen, zum Beispiel Fluorophoren, Spin-Labeln, Goldpartikeln für Lichtstreuung etc. in Positionen, die die funktionellen Eigenschaften der Proteine nicht beeinträchtigen. Die Vorteile der vorliegenden Vorrich tung und des vorliegenden Verfahrens zur spezifischen und gerichteten Immobilisierung und Markierung von Proteinen im Vergleich zum Stand der Technik resultieren aus den spezifischen chemischen Reaktionen zwischen Proteinen, die mit unnatürlichen Aminosäuren oder spezifischen Gruppen modifiziert wurden und komplementär reaktiven Festphasen sowie aus der selektiven Modifikation des zu immobilisierenden Proteins. Die immobilisierten und gegebenenfalls erfindungsgemäß auch markierten Proteine sind durch den Erhalt ihrer nativen Konformation stabiler gegen enzymatischen oder chemischen Abbau und behalten ihre biologischen Funktionen bei. Dabei werden insbesondere die biologischen Aktivitäten, die auf Protein-Proteinwechselwirkungen beruhen, durch die immobilisierten Proteine weiter vermittelt. Insbesondere bei konformationell empfindlichen Proteinen, deren Struktur durch Veränderungen in der Umgebung, wie zum Beispiel bei der Immobilisierung gegeben, möglicherweise geändert wird, kann die Wahrscheinlichkeit und Vorhersagbarkeit der Immobilisierung bei Erhalt der biologischen Aktivität drastisch verbessert werden. Bei solchen Proteinen kann man nun eine native Immobilisierung entwickeln, wohingegen bisher einer eventuellen nativen Immobilisierung ein jahrelanges Experimentieren nach dem Versuchs- und Irrtums-Prinzip vorausging.

Wie erläutert, werden die Oberflächen des Trägers durch chemische Modifizierungsreaktionen mit spezifischen funktionellen Gruppen ausgebildet. Diese funktionellen Gruppen weisen dabei eine chemische Reaktivität auf, die geeignet ist, mit spezifischen in Proteine eingebrachten funktionellen Gruppen zu reagieren. Die Bindung dieser Proteine erfolgt entweder kovalent über eine chemische Reaktion zwischen Protein und Oberfläche, vorzugsweise über eine Hydrazid-Lävulinsäure-Reaktion, durch eine nicht-kovalente Affinitätsbindung, vorzugsweise die Metallchelatbindung einer Oligohistidin-Gruppe an Oberflächen gebundene Metallionenchelatkomplexe, oder die hochaffine Bindung eines Strep-Tags an Streptavidin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, dass das Protein mit Detektionsmarkern markiert ist, beispielsweise mittels Fluorophoren, Spin-Labeln, Goldpartikeln, radioaktiven Markern oder ähnlichem. In besonders bevorzugter Weise sind diese Marker, insbesondere Fluorophoren, in der Lage, bei der Bindung eines in einem Assay nachzuweisenden Bindungspartners an das gebundene Protein eine spezifische Änderung der Fluoreszenzemission zu zeigen. Die Fluorophoren können in das zu immobilisierende Protein mittels Aminosäuren, insbesondere unnatürlicher Aminosäuren, eingefügt werden. Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzmarker sind zum Beispiel N-Methyl-Aza-Tryptophan oder Coumarin-Derivate, wie DCA (6,7-Dimethoxy-4-coumaryl) oder NBD (N-β-7-nitrobenzofurazan-L-N-diaminopropionsäure). Sofern das erfindungsgemäß besonders bevorzugte RBD als zu immobilisierendes Protein eingesetzt wird, können die Fluorophore zum Beispiel an den Positionen 55, 91 oder 108 eingeführt sein, bezogen auf die bereits erwähnte Nummerierung (Nassar et al., a.a.O).

Erfindungsgemäß können auch Fluorophore eingesetzt werden, die eine Einzelmoleküldetektion ermöglichen, zum Beispiel die Fluoreszenzfarbstoffe CyDye (Amersham Pharmacia Freiburg) oder Alexa (Molecular Probes, Eugene, USA) an der Position 91 von RBD.

Die erfindungsgemäß ermöglichte Detektion von oberflächengebundenen Liganden des immobilisierten Proteins, insbesondere RBD, also zum Beispiel die Detektion von Ras, kann zum Beispiel durch Matrixunterstützte Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) erfolgen. Die massenspektroskopische Detektion umfasst die Identifizierung und Charakterisierung der gebundenen Liganden in situ sowie die ortsaufgelöste Analytik. Die Detektion der oberflächengebundenen Liganden kann durch Fluoreszenzspektroskopie erfolgen. Die Bindung des Liganden an den erfindungsgemäß immobilisierten Festphasen-Liganden, also das Protein, ruft eine Änderung der Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzmarker hervor, die eine Quantifizierung der Bindungsereignisse ermöglicht. Die Fluoreszenzanregung kann mit monochromatisiertem Weißlicht oder Laserlicht erfolgen. Erfindungsgemäß kann die Detektion mittels einer Fernfeldoptik oder einer Nahfeldoptik erfolgen, die durch Lichtleiter auf die Oberfläche der Bindematrix geführt wird oder wobei die Bindematrix direkt auf dem Lichtleiter fixiert ist. Die Detektionmethode kann die Bindung von Ras-GTP von der des Ras-GDP unterscheiden. Somit kann ein invasiver erfindungsgemäßer Biosensor aufgebaut und bereitgestellt werden.

Die Erfindung betrifft also auch Verfahren zum Nachweis von Protein-Proteininteraktionen, insbesondere zum Nachweis einer Interaktion von RBD mit Ras oder Derivaten, funktionellen oder strukturellen Äquivalenten, Analoga, Agonisten, Antagonisten oder ähnlichem von Ras, insbesondere zum Zweck der medizinischen Forschung und Diagnostik, wobei eine vorgenannte Vorrichtung, also die erfindungsgemäße Bindematrix eingesetzt wird, um die vorgenannten Bindungspartner des immobilisierten Proteins, zum Beispiel von RBD, zu identifizieren. Gemäß dieses Verfahrens wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer die zu untersuchenden Substanzen enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht und eine Wechselwirkung oder die Hemmung einer Wechselwirkung nachgewiesen. Das vorgenannte Verfahren zum Nachweis von Protein-Proteininteraktionen stellt also auch ein Verfahren zum Identifizieren oder Screenen von potentiellen Liganden des erfindungsgemäß immobilisierten Proteins, also des Festphasen-Liganden, dar.

Ebenso betrifft die Erfindung Verfahren zum quantitativen Isolieren von mit dem erfindungsgemäß immobilisierten Festphasen-Liganden reagierenden, das heißt bindenden Substanzen, insbesondere Proteinen.

In besonders bevorzugter Weise können die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung auch eingesetzt werden, um Stoffe zu identifizieren, die als Modulatoren, zum Beispiel Verstärker, Induktoren oder Hemmstoffe für die, insbesondere physiologischen, Interaktionen der Proteine untereinander fungieren, die also bei spielsweise als Hemmstoff für die Bindung von RBD mit Ras oder anderen biologischen Effektoren der Raf-Kinase dienen. Derartige nachzuweisende Hemmstoffe können gentechnisch veränderte körpereigene Proteine, chemische synthetisierte Verbindungen aus Substanzbibliotheken oder andere, zum Beispiel unbekannte Substanzen sein, die gegebenenfalls therapeutischen Nutzen mit sich bringen können.

In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, ein Protein zu immobilisieren, das einen ersten von zwei Reaktanten trägt oder diesen darstellt und die Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ersten Reaktanten durch eine geeignete Detektionsmethode nachweist. Dabei kann vorzugsweise auch vorgesehen sein, dass die Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ersten Reaktanten in Gegenwart oder Anwesenheit eines potentiellen Modulators, zum Beispiel Induktors oder Inhibitors durch geeignete Detektionsmethoden nachgewiesen wird und so potentielle Induktoren oder Inhibitoren in ihrer Wirksamkeit, zum Beispiel als Arzneimittel, überprüft werden können. Die zu überprüfenden potenziellen Induktoren oder Inhibitoren können zum Beispiel aus Substanzbibliotheken stammen. In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass der Inhibitor oder der zweite Reaktant, also zum Beispiel ein Protein, ein in Genomsequenzier-Projekten identifiziertes Protein ist.

Die Erfindung betrifft also auch die Verwendung der vorgenannten Bindematrix zur Identifizierung von Modulatoren oder Effektoren, insbesondere der RBD/ras-Interaktion.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorgenannten Bindematrix zur Detektion von ras-GTP als Tumormarker in Krebszellen.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Bindematrix. Gemäß der erfindungsgemäßen Verfahrensweise wird in einem ersten Schritt der Träger, vorzugsweise nach vorhergehender Hydrophilisierung, silanisiert. Die Silanisierung erfolgt z.B. mit einem Organosilan, insbesondere SiR₁R₂R₃R₄, wobei R₁ bis R₃ hydrolysierbare Gruppen wie Alkoxygruppen oder Halogenide, bevorzugt Chloride, und R₄ ein organischer Rest ist, der als Spacer mit einer ersten funktionellen Gruppe oder als Bindestelle für einen die erste funktionelle Gruppe tragenden Spacer ausgeführt sein kann. Sofern in einer Ausführungsform der Erfindung R₄ als die erste funktionelle Gruppe aufweisender Spacer ausgeführt ist, kann das zu immobilisierende Protein direkt aufgebracht werden.

Sofern in einer anderen Ausführungsform der Erfindung R₄ als Bindestelle, z.B. als Epoxygruppe, für den die erste funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer ausgeführt ist, werden im Anschluss an die Silanisierung die ersten funktionellen Gruppen auf die Oberfläche aufgebracht, das heißt, zum Beispiel die Hydrazid-Gruppen, der Metallionenchelatkomplex oder Streptavidin. Die Bindung des die ersten funktionellen Gruppen tragenden Spacers mit der Bindestelle kann z.B. durch Bindung einer Aminogruppe des Spacers mit der Epoxygruppe erfolgen. In einem weiteren Schritt wird das Protein immobilisiert, wobei je nach Oberflächenmodifikation die entsprechende Proteinmodifikation zu wählen ist.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
Synthese des Linkermoleküls Hydrazidsilan 4
1.1 Synthese des Undecenylhydrazid 1
Unter Argonatmosphäre werden 50 ml (200 mmol) Undecenylethylester in 400 ml absolutem Methanol (über Mg) gelöst, danach 15 ml (300 mmol) Hydrazinhydrat zugegeben. Die Reaktionslösung wird 18 h unter Rückfluss erhitzt, dann langsam abgekühlt. Die entstandenen weißen Nadeln werden abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Gegebenenfalls wird umkristallisiert.
Ausbeute: 16,438 g. Smp (Schmelzpunkt) 90–91°C.
1.2 Synthese des Undecenyl-N_α-triphenylmethylhydrazid 2
4,5 g (10 mmol) 1 und 7,1 g (22 mmol) Tritylbromid werden in 50 ml trockenem Dichlormethan suspendiert und 1 h gerührt. Dann werden 5,6 ml (40 mmol) Triethylamin in 10 ml trockenem Dichlormethan innerhalb von 20 min zugetropft. Nach Zugabe von 50 ml absolutem Methanol wird 90 min auf 50°C erhitzt. Nun wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezo gen und der Rückstand in 100 ml Diethylether aufgenommen. Nach dreimaliger Extraktion mit 50 ml 10 %iger Zitronensäure und dreimaliger Extraktion mit 50 ml Wasser wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Abziehen des Lösungsmittels erhält man das Produkt 2. Gegebenenfalls wird in Diethylether umkristallisiert.
1.3 Synthese des geschützten Silanhydrazid 3
Unter Argon werden 20 mmol von 2 in 30 ml trockenem Dichlormethan gelöst und eine Spatelspitze Platinkatalysator (Hexachloroplatinsäure) zugegeben. Nach Versetzen der Lösung mit 11 ml (100 mmol) Dimethylchlorsilan lässt man 18 h bei Raumtemperatur unter Rückfluss reagieren. Das Lösungsmittel (Sdp (Siedepunkt) 40°C) und das überschüssige Dimethylchlorsilan (Sdp 36°C) werden abdestilliert. Der Rückstand, das Produkt und die geringe Menge an eingesetztem Katalysator (Microporefilter, Hexan) werden unter Vakuum getrocknet.
1.4 Synthese von 4
Verbindung 3 wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, eine Spatelspitze Palladium auf Aktivkohle zugefügt und 24 h unter Wasserstoffatmosphäre gerührt. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel und entstandenes Triphenylmethan unter Vakuum abdestilliert. Verbindung 4 bleibt als entstandenes Produkt zurück.
Beispiel 2
Synthese des Silanverdünners Triethylenglykolmonomethylethersilan 5
2.1 Syntmethylether von Undecenyltriethylenglycolmonomethylether 6 (Whitesides et al. JACS 1991 (113), 122–0).
Unter Argon werden 6,6 ml (42 mmol) Triethylenglykolmonomethylether vorgelegt, 680 μl 50 %ige Natronlauge zugegeben und 30 min bei 100°C gerührt. Nach Versetzen des Reaktionsgemisches mit 3,6 ml (17 mmol) Undecenylbromid wird 24 h bei 100°C unter Rückfluss kochen gelassen, dann gekühlt und mit insgesamt 250 ml Hexan 6 mal extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand unter Ölpumpenvakuum getrocknet.
Ausbeute: circa 5 g.
2.2 Synthese von Triethylenglykolmonomethylethersilan 5
Die Hydrosilylierung erfolgt analog der Synthese von 3. Anstelle von 2 wird 6 eingesetzt.
Beispiel 3
Aufbringen der Silane auf hydrophilisierten (Hydroxyfunktionalisierung) oxidischen Oberflächen (Silicium-Wafer)
3.1 Vorbereitung der Oberflächen
Die Silicium-Wafer werden in Stücke gespalten mit einer Fläche von circa 70 mm², dann 1 h in eine 2%ige wässrige HELLMANEX-Lösung getaucht und 5 min mit Ultraschall behandelt, danach erfolgt ein Spülen der Oberflächen mit Reinstwasser und ein Abblasen mit Argon. Die Hydrophilisierung wird erreicht durch 30-minütiges Erhitzen der Wafer in 20 ml NH₃/H₂O₂ (3:1 v/v), dann erfolgt wiederum Spülen mit Wasser und Trocknen im Argonstrom.
3.2 Die Funktionalisierung der Wafer mit Silanen
Die hydrophilisierten Oberflächen werden unter Argonstrom in Eppendorf-Reaktionsgefäße mit einer Lösung von circa 2 μl Silan beziehungsweise Silangemisch, also Hydrazidsilan 4, mit Verdünnersilanen, also Triethylenglykolmonomethylethersilan 5, und 2 μl Triethylamin in 1,2 ml absolutem Toluol getaucht. Nach 1-stündigem Schütteln lässt man das Silan 4 12 h auf die Oberfläche einwirken. Danach werden die silanisierten Wafer 2 h bei 125°C gehalten. Darauf extrahiert man die Proben 2 h im Soxhlet-Extraktor, um physisorbiertes Silan 4 zu entfernen. Danach wird gegebenenfalls im Argonstrom getrocknet.
Beispiel 4
Methoden zur Bewertung der Oberflächen
Ellipsometrie
Die Messungen wurden mit einem Gerät der Firma Optrel GbR durchgeführt. Das Ellipsometer ist ein optisches Gerät mit folgendem Strahlengang: Laser – Polarisator (Glan-Thompson-Prisma) – Kompensator (Phasenretardierungsplatte) – Probe – Analysator (Glan-Thompson-Prisma) – Detektor (Silicium-Photodiode). Der Polarisator wird bei festgehaltenem Kompensator so positioniert, dass das elliptisch polarisierte Licht nach dem Kompensator durch die Reflexion an der Probe in linear polarisiertes Licht transformiert wird und damit durch den Analysator ausgelöscht werden kann. Aus der Stellung von Polarisator und Analysator kann man Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Oberfläche (Brechungsindex, Schichtdicke) ziehen.
Beispiel 5
Synthese des Silanverdünners Tetraethylenglykolsilan 7
Die Synthese erfolgt analog Beispiel 2. Statt 42 mmol (6,6 ml) Triethylenglykolmonomethylether wird 84 mmol (14,6 ml) Tetraethylenglykol eingesetzt.
Ausbeute: circa 5 g.
Beispiel 6
Ligation zwischen dem Hydrazid auf der Oberfläche und einem Lävulinsäure-modifiziertes RBD (hergestellt gemäss Beispiel 10) (analog V. Cornish et al., JACS 1996 (118), 8150–8151).
Man lässt eine 2 μM Lösung des mit Lävulinsäure modifizierten Proteins in 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,8; 0,5 M NaCl) 90 min auf einen hydrazidfunktionalisierten Wafer (Funktionalisierung siehe Beispiel 3) einwirken, spült anschließend mit Puffer und Wasser und trocknet im Argonstrom.
Beispiel 7
Synthese von RBD (Ras-Bindungsdomäne) mit dem Fluorophor 7-Nitrobenzofurazan
Synthese der N_α-Boc-N_β-RBD-L-diaminopropionsäure:

7.1 Die unnatürliche Aminosäure N_α-Boc-L-diaminopropionsäure (1,96 mmol) wird in 30 ml Ethanol/Wasser 1:1 suspendiert. Nach Zugabe von 2,3 mmol Triethylamin löst sich die Aminosäure vollständig. 7-Nitro-4-chlorbenzofurazan (2,2 mmol) wird, in 35 ml Ethanol gelöst, zugegeben. Nach 6 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Die Ausbeute an markierter unnatürlicher Aminosäure beträgt circa 70% (bezogen auf die Aminosäure).
7.2 Peptidsynthese: Die Peptide wurden durch Festphasensynthese unter Verwendung der Boc-Schutzgruppenstrategie synthetisiert. Die RBD wurde in zwei Segmenten hergestellt. Einem N-terminalen Teil (AS 51–95) (AS-Nummerierung bezogen auf Nassar et al. a.a.O.), der die fluoreszierende unnatürliche Aminosäure enthält und einem C-terminalen Segment (AS 96–131). Die Ligation der Peptide erfolgte nach der Methode von Kent (Dawson et al., Science 266, 1994) unter Ausnutzung eines Thioesters am C-Terminus des N-terminalen Segments und eines Cysteins am N-Terminus des C-terminalen Segments. Die fluoreszierende Aminosäure wurde an Position 91 eingebaut.

Beispiel 8
Wechselwirkung der markierten Ras-Bindungsdomäne (RBD) mit aktiviertem Ras. Die eingeführte fluoreszierende Aminosäure erlaubt die Bestimmung der Kd-Werte für die Wechselwirkung von markierter RBD und aktiviertem Ras. Da die Assoziation und Dissoziation des Komplexes aus beiden Proteinen sehr schnell ist, werden Stopped-flow Techniken genutzt. Die bestimmten Kd-Werte sind vergleichbar mit denen für Wildtyp-RBD und aktiviertem Ras.
Beispiel 9
Bindung von markierten RBD an eine Ni-NTA Oberfläche und Detektion von aktiviertem Ras im Vergleich zu Ras (GDP).
Der His-Tag am C-Terminus der markierten RBD erlaubt die Immobilisierung des Proteins auf Ni-NTA Oberflächen (Qiagen, Hilden). Es konnte gezeigt werden, dass die immobilisierte RBD die Detektion von aktivierten Ras auf der Oberfläche, unter Aus nutzung der Fluoreszenz der eingebauten fluoreszierenden Aminosäuren, ermöglicht. Dies wurde auch am Beispiel der onkogenen Ras-Mutante Q61L gezeigt, die GTP wesentlich langsamer hydrolysiert als Wildtyp-Ras. Die immobilisierte, markierte RBD zeigt nur eine Fluoreszenzänderung bei Zugabe von Ras/Q61L/GTP und nicht bei Zugabe von Ras/Q61L/GDP.
Beispiel 10
Synthese von RBD (96–131) mit der Festphasenpeptidsynthese nach der Fmoc-Strategie unter Einführung selektiver Schutzgruppen an ausgewählten Positionen, Ligation mit NBD-markiertem RBD (50–95) und Lävulinsäure-vermittelte Immobilisierung auf Silicium-Wafern (dargestellt in Beispiel 6).
Bei der Fmoc-SPPS-Synthese von RBD (96–131) wurde an Position 108 Dde-geschütztes Lysin eingebaut. Nach Beendigung der Synthese wurde Dde selektiv abgespalten und Lävulinsäure an Position 108 gekoppelt. Das Peptid wurde entschützt und vom Harz abgespalten. Danach erfolgte eine Ligation mit NBD-markiertem Fragment (50–95) (siehe oben). NBD, Läv-RBD wurde dann an einen Hydrazid-funktionalisierten Wafer (siehe oben) immobilisiert. Die native Bindung wurde durch spezifische Bindung von GTP-Ras (siehe oben) nachgewiesen.
Beispiel 11
Synthese von RBD (96–131) mit der Festphasenpeptidsynthese nach der Fmoc-Strategie, Immobilisierung in eine NH2-Gruppen-spezifisch funktionalisierte Mikrotiterplatte und Ligation mit NBD-markiertem RBD (50–95). RBD (96–131) wurde wie in Beispiel 10 synthetisiert. Alle Schutzgruppen wurden abgespalten und das Peptid vom Harz gespalten. Es erfolgte dann eine Immobilisierung von RBD (96–131) nach Standardmethoden in eine Maleinsäureanhydrid-funktionalisierte Mikrotiterplatte. Da hier nur primäre Aminogruppen reagieren, erfolgte die Immobilisierung durch kovalente Anknüpfung von Lys-106, -108, oder -109. Anschließend wurde unter einer Variation der Ligationsmethode nach Kent dieses RBD-Fragment in der Platte mit NBD-markiertem RBD (50–95) ligiert. Über Nα immobilisiertes RBD (96–131) kann man nach dieser Ligierungsmethode nicht ligieren, weshalb eine Immobilisierungsspezifizierung nur durch 3 Lysinreste gegeben war. Das so immobilisierte RBD war biologisch aktiv und band GTP-Ras.
Beispiel 12
Synthese von RBD (96–131) mit der Festphasenpeptidsynthese nach der Fmoc-Strategie auf Tritylharz, Immobilisierung in eine NH2-Gruppen-spezifisch funktionalisierte Mikrotiterplatte und Ligation mit NBD-markiertem RBD (50–95). RBD (96–131) wurde wie in Beispiel 10 synthetisiert. Das Peptid wurde selektiv vom Harz gespalten ohne Abspaltung der Schutzgruppen. Im Anschluss wurde die Dde-Gruppe von Lys-108 selektiv abgespalten. Es erfolgte dann eine Immobilisierung von geschütztem RBD (96–131) nach Standardmethoden in eine Maleinsäureanhydridfunktionalisierte Mikrotiterplatte. Da nur Lys-108 frei war, erfolgte die Immobilisierung hochspezifisch über Rest 108. Dieser Rest war in einem Computer-Design vorab als ideal zur Immobilisierung ausgewählt worden, da Lys-108 maximal weit von der Ras-Bindungsstelle entfernt ist; die Immobilisierung sollte also nicht mit der biologischen Aktivität interferieren. Nun folgte eine Abspaltung der restlichen Schutzgruppen in der Platte. Anschließend wurde unter einer Variation der Ligationsmethode nach Kent dieses RBD-Fragment in der Platte mit NBD-markiertem RBD (50–95) ligiert. Das so immobilisierte RBD war biologisch hochaktiv und band GTP-Ras etwa 7-mal so gut wie RBD, welches nach Beispiel 11 immobilisiert wurde.
Beispiel 13:
Vorbereitung und Silanisierung der Silicium-Wafer mit (3-Glycidoxypropyl)dimethylethoxysilan erfolgt entsprechend Beispiel 3.
Die silanisierten Wafer werden 4 h bei 60°C jeweils in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit einer Suspension von 2 mg N-(5-amino-1-carboxypentyl)-iminodiessigsäure und 100 μl NEt₃ in 1,2 ml DMF/Methanol (1:1 v/v) getaucht, mit Reinstwasser gespült und im Argonstrom getrocknet. Die NTA-funktionalisierten Proben werden nun 1 h in eine Lösung von 10 mg NiSO₄·6H₂O in 1,2 ml H₂O getaucht, mit Reinstwasser gespült und im Argonstrom getrocknet.
Die Ligation des His-Tag-Proteins (zum Beispiel RBD) erfolgt in einer circa 5 μM Proteinlösung in Tris/HCl-Puffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl·6H₂O, 50 mM Tris) pH 7,4 innerhalb von 90 min. Danach wird mit Reinstwasser gespült und im Argonstrom getrocknet.

Claims

Bindematrix, umfassend einen Träger mit einer erste funktionelle Gruppen aufweisenden Oberfläche und an den Träger immobilisierte modifizierte Proteine, die die ersten funktionellen Gruppen bindende komplementäre, im Wildtyp-Protein nicht vorkommende, zweite funktionelle Gruppen aufweisen, wobei die Proteine durch eine die zweite funktionelle Gruppe aufweisende unnatürliche Aminosäure oder durch eine als Strep Tag I, Strep Tag II oder Oligohistidingruppe ausgeführte zweite funktionelle Gruppe modifiziert sind.
Bindematrix nach Anspruch 1, wobei das Protein die Ras-bindende Domäne der Raf-Kinase (RBD) ist.
Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die erste funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die unnatürliche Aminosäure eine zweite funktionelle Gruppe aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Thi olgruppe, Thioestergruppe, Hydrazingruppe und Hydrazidgruppe.
Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die erste und/oder zweite funktionelle Gruppe über Spacer mit der Oberfläche des Trägers verbunden ist oder Bestandteil eines Spacers ist.
Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die unnatürliche Aminosäure an den Positionen 64, 106, 108 oder 109 von RBD vorliegt.
Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die zweite funktionelle Gruppe, insbesondere die Alkylketongruppe, die Aldehydgruppe, die Thiolgruppe, die Thioestergruppe, die Hydrazingruppe oder/und die Hydrazidgruppe, mit einer Ankergruppe des Trägers verbunden ist.
Bindematrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe, insbesondere der die funktionelle Gruppe tragende Spacer, über ein Silanderivat mit der Oberfläche des Trägers kovalent verbunden ist.
Bindematrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Metallionenchelatkomplexe als Metallkomponente zweiwertige Kationen enthalten.
Bindematrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Metallionenchelatkomplex ein Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriessigsäure)-Derivat ist.
Bindematrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger ein oxidischer anorgani scher Träger, insbesondere Silicium, SiO₂, SiO, Si-likate, Al₂O₃, SiO₂·Al₂O₃, ZrO₂, Fe₂O₃, Ag₂O, Zr₂O₃, Ta₂O₅, Zeolith, TiO₂, Glas, Indiumzinnoxid oder Gemische davon enthält oder aus diesen besteht.
Bindematrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anorganische Träger in Form von Quarz, Kieselgel, Kieselgur, Silicagel oder SiO₂-Pulver vorliegt.
Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Träger ein Kunststoffträger ist, insbesondere Polypropylen oder Polystyrol oder Gemische davon enthält oder aus diesen besteht.
Bindematrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche des Trägers Mikrostrukturen aufweist, insbesondere durch Lithographie oder Prägetechniken erzeugte Mikrostrukturen.
Bindematrix nach Anspruch 14, wobei die Bindematrix photolytisch oder thermolytisch aktivierbare Schutzgruppen aufweist.
Bindematrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche des, vorzugsweise anorganischen, Trägers silanisiert ist, vorzugsweise nach vorhergehender Hydrophilisierung.
Bindematrix nach Anspruch 16, wobei die Silanisierung unter Verwendung eines Silanverdünners durchgeführt wurde.
Bindematrix nach Anspruch 17, wobei als Silanverdünner ein Oligoethylenglycol enthaltendes Silan zugegeben wurde.
Bindematrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein Marker aufweist.
Bindematrix nach Anspruch 19, wobei die Marker Fluorophore, Spin-Label, radioaktive Markierungen oder Goldpartikel sind, insbesondere angebracht an Aminosäuren des Proteins, vorzugsweise deren Seitenketten.
Bindematrix nach Anspruch 20, wobei das Fluorophor N-Methyl-Aza-Tryptophan oder Coumarin-Derivate wie DCA (6,7-Dimethoxy-4-Coumaryl) oder NBD (N-β-7-nitro-benzofurazan-L-N-diaminopropionsäure) ist.
Bindematrix nach Anspruch 21, wobei die Fluorophore an den Positionen 55, 91 oder 108 von RBD eingeführt sind.
Bindematrix nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei Fluorophore eingesetzt werden, die eine Einzelmoleküldetektion ermöglichen.
Bindematrix nach Anspruch 23, wobei das Fluorophor CyDye oder Alexa ist, vorzugsweise eingeführt an der Position 91 von RBD.
Verfahren zur Herstellung einer ein immobilisiertes Protein aufweisenden Bindematrix, wobei ein anorganischer oder Kunststoff-Träger silanisiert, erste funktionelle Gruppen auf die silanisierte Oberfläche des Trägers aufgebracht und komplementäre zweite funktionelle Gruppen aufweisende modifizierte Proteine mit dieser Oberfläche derart in Kontakt gebracht werden, dass eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen des Proteins und der Oberfläche stattfindet, und wobei die Proteine durch eine die zweite funktionelle Gruppe aufweisende unnatürliche Aminosäure oder durch eine als Strep Tag I, Strep Tag II oder Oligohistidingruppe ausgeführte zweite funktionelle Gruppen modifiziert sind.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die ersten funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazidgruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei die zweiten funktionellen Gruppen der unnatürlichen Aminosäure ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei die ersten funktionellen Gruppen unter Verwendung eines Spacers mit dem Träger verbunden werden oder Bestandteil des Spacers sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei das Protein RBD ist.
Verfahren zur Identifizierung und/oder Detektion von Bindungspartnern eines Proteins, wobei das in einer Bindematrix nach einem der Ansprüchen 1 bis 24 immobilisierte Protein mit einem potentiellen Bindungspartner in Kontakt gebracht und eine Bindung nachgewiesen wird.
Verfahren zur Identifizierung und/oder Detektion einer Substanz, die eine Interaktion zwischen einem immobilisierten Protein und dessen Interaktionspartner modifiziert, fördert oder hemmt, wobei ein an einer Bindematrix gemäss den Ansprüchen 1 bis 24 immobilisiertes Protein zusammen mit dessen Interaktianspartner in Gegenwart oder Abwesenheit der zu testenden Substanz inkubiert und eine Auswirkung der Substanz auf die Interaktion zwischen immobilisiertem Protein und dessen Bindungspartner nachgewiesen wird.
Verwendung einer Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Detektion der Bindungspartner von RBD.
Verwendung der Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Detektion von Hemmstoffen der Interaktion von RBD mit seinen Bindungspartnern.
Verwendung der Bindematrix nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Detektion von ras-GTP als Tumormarker in Krebszellen.