DE4129901A1

DE4129901A1 - Gepfropftes polyamid fuer die affinitaets-chromatographie und immobilisierung von bioliganden - verfahren zu ihrer herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE4129901A1
Application number: DE19914129901
Authority: DE
Inventors: Detlef Dr Mueller-Schulte
Original assignee: MUELLER SCHULTE DETLEF DR
Current assignee: MUELLER SCHULTE DETLEF DR
Priority date: 1991-09-09
Filing date: 1991-09-09
Publication date: 1993-03-11

Description

Gegenstand der Erfindung sind Polymere aus Polyamid, auf die Polymere mit Oxiran-, Hydroxyl-, Isocyanat-, Carboxyl- oder Aldehydgruppen aufgepfropft und zur kovalenten Bindung von Affinitäts-Liganden oder Biomolekülen befähigt sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Trägern für die Affinitäts-Chromatographie sowie für die Biomolekül-Immobilisierung auf der Basis von Polyamiden durch Aufpfropfen von hydroxyl-, carboxyl-, iso cyanat-, oxiran- oder aldehydgruppenhaltigen Vinylmonomeren unter Verwendung von Gamma-Strahlen oder ionisierenden Strahlen entweder direkt oder mittels der Vorbestrahlungs technik. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der gekoppelten Träger zur Trennung von Biomolekülen. Durch die Einführung obiger Monomere in das Basispolymer wird dieses so funktionalisiert, daß es möglich wird, Liganden in Form von Peptiden, Proteinen, Enzymen, Anti körpern, Nukleotiden, Oligosacchariden an die strahlen modifizierte Matrix kovalent zu binden und dadurch die Träger zur affinitätschromatographischen Auftrennung von biologisch-biochemischen Lösungen zu benutzen.

Die heutezutage gebräuchlichen Träger für die Affinitäts-Chromatographie bestehen vorwiegend aus modifizierten Dextranen, Agarose, Polyacrylamid/Agarose, Komposit-Trägern oder anorganischen Trägern auf der Basis von Silikaten. Die Ligandenbindungskapazität und damit die Leistungsfähigkeit dieser organischen Medien wird in erster Linie durch den Vernetzungsgrad (crosslinking) bestimmt, durch den die Matrix eine bestimmte Quellfähigkeit und damit Porosität erhält. Die Fähigkeit des Gels mehr oder weniger zu quellen stellt demnach ein direktes Maß für die Beladungsdichte der Liganden dar. Dieser Sachverhalt bedingt jedoch einen entscheidenden Nachteil insofern, als die Porosität direkt mit der mechanischen Stabilität der Gele zusammenhängt. Je poröser ein Träger ist, desto mechanisch instabiler wird er. Dies bedeutet, daß bei hohen Flußraten, die man heute in der Chromatographie anstrebt, das Gel komprimiert wird und durch den entstehenden Gegen druck die Auftrennschärfe praktisch verlorengeht. Um diesen offensichtlichen Nachteil der "soft" Gele zu umgehen, geht der Trend in den letzten Jahren dahin, die Gele höher zu vernetzten und gleichzeitig, um die damit einhergehende Kapazitätsverringerung zu kompensieren, die Teilchengrößen (Beadgrößen) zu verkleinern. Die heute gebräuchlichsten Beadgrößen für die "Fast-Flow" Chromato graphie liegen im Bereich von 10 bis 50 µm. Anorganische Träger auf der Basis von Silikaten oder porösen Gläsern stellen demgegenüber äußerst rigide Materialien dar und können dementsprechend mit hohen Flußraten gefahren werden. Dieser Vorteil relativiert sich jedoch insofern, als aufgrund der geringen Bindungskapa zitäten Träger mit sehr geringer Teilchengröße - teilweise unter 5 µm - verwendet werden und bei solchen Teilchen größen bereits enorme Pumpleistungen erforderlich sind, um einen akzeptablen Fluß zu erreichen. Ein weiterer Grund, weshalb Silikate kaum Eingang in den Bereich der Protein auftrennung gefunden haben, liegt in der chemischen Struktur dieser Träger begründet. Infolge der vorhandenen Silanolgruppen neigen die Silikate sehr stark zur unspezifischen Protein-Adsorption, ein Nachteil, den man häufig durch Beschichten (coaten) mit hydrophilen Polymeren zu umgehen versucht hat.

Synthetische organische Copolymere auf der Basis von Acrylaten sind in DE 22 37 316 beschrieben. Die mechanische Stabilität dieser Medien liegt zwischen der der Soft-Gele und der anorganischer Träger. Einschränkungen hinsichtlich der Gebrauchsfähigkeit dieses Trägers müssen auch hier wegen der Neigung zur unspezifischen Adsorption aufgrund partiell hydrophober Eigenschaften gemacht werden.

Eine interessante Alternative zu den herkömmlichen Trägern stellen Medien dar, die durch Pfropfung von Vinylmonomeren auf polymere Substrate gewonnen werden. Die Modifikations breite dieser Technik ist praktisch unbegrenzt, da unter Zuhilfenahme ionisierender Strahlung, vorzugsweise Gamma- Strahlen, eine Vielzahl von Monomeren auf nahezu sämtliche bekannte Polymersubstrate gepfropft werden können. Diese Technik ist in der Vergangenheit genutzt worden, um u. a. auch neue Träger für die Immobilisierung von Enzymen zu synthetisieren. So beschreiben Beddows et al. Verfahren zur Pfropfung von Hydroxyäthyl-methacrylat auf Polyäthylen (J. Appl. Polymer Sci, 35, 1980, 135) sowie Pfropfungen auf Naturgummi (Radiat. Phys. Chem. 36, 1990, 703). Die Nachteile dieser Verfahren und Produkte sind einerseits der Gebrauch von Polyäthylen und Gummi als Substrate, die aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften äußerst ungünstige Substrate für eine Immobilisierung darstellen, andererseits sind die beschriebenen Verfahren umständlich, da das gepfropfte Hydroxyäthyl-methacrylat für die anschließende Kopplung erst zu einer Carboxyl-Funktion hydrolysiert werden muß. Die Nachteile von Verfahren und Produkten dokumentieren sich entsprechend in niedrigen Enzym- Aktivitätsraten.

Eine weitere Strahlenpfropfung ist in der US-Patentschrift 33 22 661 beschrieben. Auch hier werden Polyolefine als Substrate verwendet, die, um eine Pfropfung zu ermöglichen, im ersten Schritt peroxidiert werden müssen. Die dort beschriebenen Produkte sind aufgrund der verwendeten Substrate und Monomere völlig ungeeignet für die Immo bilisierung irgendwelcher Liganden oder Biomoleküle. K. C. Hou beschriebt im US-Patent 46 63 163 die Synthese von Ionenaustauschergelen durch kovalente Bindung synthetischer Polymere auf Zellulosederivate. Die beschriebenen Verfahren sind recht aufwendig, so werden zur Darstellung bestimmter Ionenaustauscher bis zu acht Einzelschritte unter Anwendung hoher Reaktionstemperaturen (80-90°C) benötigt. Die bei den Soft-Gelen beschriebenen mechanischen Instabilitäten werden auch bei diesem Verfahren nicht beseitigt, da die verwendete Zellulose auch zur Kategorie der Soft-Gele gehört. Die Möglichkeiten der Bindung von Affinitäts liganden sind darüber hinaus bei diesem Verfahren nicht gegeben.

Die Herstellung von Polyurethan-Elastomeren durch Pfropfung von Acrylaten auf Polybutadien und anschließende Umsetzung mit polyfunktionellen Isocyanaten zur Verbesserung der Dehneigenschaften sind im US-Patent 42 02 950 beschrieben. Das vorliegende Verfahren ist sehr aufwendig und benötigt mehrere Einzelreaktionen. Die Praktikabilität des Verfah rens wird ferner durch Verwendung sehr bedenklicher Lösungsmittel wie Benzol drastisch eingeschränkt. Die Verwendung der Produkte bleibt auf den reinen Textilsektor beschränkt.

In der DE-OS 38 11 042 wird die Pfropfung von Vinylmonomeren auf hydroxylgruppenhaltige Substrate zur Herstellung von Ionenaustauschern beschrieben Das Verfahren bedient sich zur Pfropfinitiierung Cer(IV)-Salze. Diese Pfropftechno logie ist auf hydroxylgruppenhaltige Substrate beschränkt und beschreibt lediglich die Herstellung von Ionenaus tauschern. Die Variationsbreite, so wie sie durch die Strahlenpfropfung gegeben ist, bietet diese Technik nicht. Im Kanadischen Patent 12 23 859 wird die Strahlenpfropfung auf verschiedene Polymersubstrate beschrieben, die als Träger für die Affinitäts-Chromatographie und Biomolekül- Immobilisierung geeignet sind. Die Kopplung der Biomole küle und der mit hydroxyl-, carboxyl- oder amidgruppen haltigen Monomeren gepfropften Träger wird mit den bekannten Kopplungsagentien BrCN, Dicyclohexylcarbodiimid und Glutaraldehyd bewerkstelligt. Die Kopplungen mittels BrCN erfordern aufwendige Sicherheitsmaßnahmen und führen ferner zu Verknüpfungen, die hydrolyseanfällig sind (J. Lasch und R. Kölsch, Eur. J. Biochem., 82, 1978, 101). Das gleiche Problem resultiert aus den Glutaraldehyd-Verknüp fungen. Beide Verfahren sind daher ungeeignet für die Kopplung hochwirksamer Protein-Liganden, so wie sie beispielsweise in Form von Antikörpern für die Immun affinitäts-Chromatographie erforderlich sind.

Die Verwendung von Lösungsmitteln, die, wie in der vorliegenden Erfindung noch zu zeigen ist, einen essen tiellen Einfluß auf den gesamten Pfropfprozeß hat, bleibt bei diesem Verfahren auf die Verwendung von Aceton, Wasser und Äthanol beschränkt, ohne irgendeinen funktionellen Zusammenhang zwischen der Verwendung der Lösungsmittel, der verschiedenen Substrate und dem Pfropfverfahren herzu stellen. Dadurch, und aufgrund des Umstandes, daß bei allen früheren Pfropfverfahren lediglich nur eine Vinylmonomer komponente verwendet wird, werden für eine ausreichende Pfropfung < 10 Gew.-% hohe Strahlendosen von 1 bis 10 Mrad notwendig. Diese hohen Dosen führen jedoch dazu, daß das Substrat durch den strahlenbedingten Abbau nachhaltig geschädigt wird, d. h., durch die Fragmentierung der Molekül ketten wird die Festigkeit des Substrates beeinträchtigt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Trägerme dien mit geeigneter mechanischer Stabilität, auf die mittels strahlungsinduzierter Pfropfung Vinylmonomere entsprechender Funktionalität so aufgebracht werden, daß Affinitäts-Liganden und Biomoleküle in effizienter Weise und hoher Ausbeute an die Matrix gekoppelt werden können. Darüber hinaus wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt, wie durch gezielte Auswahl von Monomeren und Comonomeren, die in einer speziellen Lösungsmittelmischung gelöst sind und simultan gepfropft werden, der Pfropfprozeß gegenüber bekannten Verfahren einerseits deutlich verbessert wird und dem so erzeugten Produkt andererseits überraschend neue produktive Eigenschaften verliehen werden können. Die Auswahlkriterien für Polyamid als Pfropfmatrix sind zum einen die gute mechanische, chemische und biologische Stabilität, zum anderen sind die Polyamide unter allen herkömmlichen Kunststoffen die Materialien mit den ausge prägtesten hydrophilen Eigenschaften. Dieser Parameter ist von entscheidender Bedeutung, da bei der Affinitäts-Chroma tographie unspezifische Adsorptionen unbedingt minimal sein müssen. Für die Pfropfung lassen sich prinzipiell sämtliche Poly amid-Typen, vorzugsweise jedoch Polyamid 6 und 66, verwen den.

Neben den erwähnten Eigenschaften kann überraschenderweise die Glastemperatur der Polyamide, die zwischen 50 und 75°C liegt, und sich grundsätzlich von der der Polyolefine und anderer Polymere unterscheidet, dazu genutzt werden, das Pfropfverfahren zu optimieren und das gepfropfte Produkt entsprechend den Anforderungen für die Immobilisierung zu verbessern. Polyamid, so wie es bei früheren Pfropfungen verwendet wurde, sowie die anderen erwähnten Pfropfsubstrate weisen in der Regel eine hohe Kristallinität - bis zu 80% - auf. Nun ist bekannt, daß die Pfropfung praktisch ausschließlich in den amorphen Bereichen der Polymersubstrate stattfindet und erst mit zunehmender Pfropfung die kristallinen Berei che auf Kosten der amorphen abgebaut werden. Die Verwendung amorpher Substrate hat jedoch gegenüber den partiell kri stallinen Polymeren den Vorteil, daß die Diffusion der Monomeren, die der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei allen Pfropfprozessen ist, durch die Beseitigung der kri stallinen Bereiche und die dadurch bedingte Strukturauf lockerung drastisch beschleunigt wird. Parallel mit der Strukturauflockerung geht auch die Zunahme der Porosität, so daß hierdurch überraschenderweise ein synergetischer Effekt erzielt wird dergestalt, daß sowohl der Pfropfpro zeß als auch die Bindungskapazität des Trägers im Sinne des oben dargelegten Zusammenhanges zwischen Porosität und Liganden-Bindungskapazität positiv beeinflußt wird.

Da die Glastemperaturen der Polyamide deutlich oberhalb der Raumtemperatur (50-75°C) liegen, ist es im Gegensatz zu den früher benutzten Polymersubstraten wie PVC, Poly vinylidenfluorid, Polystyrol, PTFE etc. möglich, durch einfaches Aufschmelzen des Polyamides und anschließendes Abkühlen ein vollständig amorphes Produkt zu erhalten. Die Herstellung der amorphen Polyamide geschieht üblicherweise durch Aufheizen des Polymeren oberhalb des Schmelzpunktes, vorzugsweise in einer hochsiedenden, inerten Flüssigkeit, und sofortiges Abkühlen in Eiswasser oder einer Trocken eismischung. Als Aufschmelzmedien haben sich hochsiedende Flüssigkeiten wie Paraffinöl, Silikonöl oder Glycerin bewährt. Beim Abkühlvorgang muß gewährleistet sein, daß die Abkühlgeschwindigkeit sehr viel größer ist als die Rekri stallisationsgeschwindigkeit, um so den amorphen Zustand quasi einzufrieren. Neben der Verfahrens- und Produktverbesserung im Hinblick auf erhöhte Porosität und Pfropfausbeuten durch die Ver wendung amorpher Polymere, kann darüber hinaus gezeigt werden, daß die Pfropfung durch die Zugabe von 0,35 bis 8 Vol.-% eines nicht reaktiven Monomeren, d. h. eines Monomeren mit nicht kupplungsfähigen Seitengruppen wie z. B. N-Vinyl pyrrolidon, Acrylamid, Methacrylamid, Maleinsäureanhydrid, Allylharnstoff (letztere vier Komponenten als 20%ige wäßrige Lösungen) zu der Pfropfmischung, die Pfropfef fizienz gegenüber herkömmlichen Verfahren, die nur eine Monomerenkomponente verwenden, um den Faktor 100 gesteigert werden kann. So werden z. B. in der oben zitierten Kana dischen Patentschrift 12 23 859 Hydroxyäthyl-methacrylat mittels einer Strahlendosis von 9 Mrad unter Vakuum ge pfropft. Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt dagegen lediglich Strahlendosen zwischen 0,1 und 0,2 Mrad unter Normalluftbedingungen. Diese Verbesserung der Strahlen ausbeute wird dadurch ermöglicht, daß durch die Zugabe von nicht reaktiven Comonomeren die Verteilung der Monomeren in der Pfropfphase verbessert wird und so der Pfropfprozeß beschleunigt wird. Bei der Verwendung von nur einer Mono merkomponente kommt es häufig in der Pfropfphase zu einer ungünstigen Verteilung der Vinylmonomeren, woraus erhöhte Homopolymerisation oder Kettenabbruch resultiert.

Während bei herkömmlichen Pfropfverfahren in der Regel nur eine Vinylkomponente verwendet wird, so bleibt auch die Verwendung von Lösungsmitteln bei den bisherigen Pfrop fungen auf einige wenige empirisch ausgesuchte Lösungs mittel beschränkt, wobei in der Regel nur eine Komponente pro Pfropfansatz verwendet wird (A. A. Armstrong und H. A. Rutherford, Text. Res. J. 33, 1963, 264; A. K. Mukherje und B. D. Gupta, J. Appl. Polymer Sci., 30, 1985, 2655; P. L. Nayak et al., Angew. Makromol. Chemie, 161, 1988, 9; Can. Patent 12 23 859).

Lediglich in der CIP-Application, USA, SN 07 150 417 wird erstmals ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Ver wendung bestimmter Lösungsmittel und dem Polymersubstrat durch die Verwendung des Löslichkeitsparameter-Konzeptes hergestellt Die Anwendung der Löslichkeitsparameter wird jedoch in der zitierten Arbeit rein qualitativ und empirisch behandelt. Es werden keine Angaben darüber gemacht, welche Löslich keitsparameterwerte für welches Polymer optimal sind.

In der vorliegenden Arbeit kann nun gezeigt werden, daß durch die Verwendung solcher Lösungsmittel, die einen Löslichkeitsparameter von 9 bis 15 (cal/cm^-3)^1/2 (Quelle Polymer Handbook, Hrsg. Brandrup, Immergut, 3. Auflage, 1989) aufweisen, die Pfropfung gegenüber früheren Verfahren verbessert werden kann. Diese Werte liegen im gleichen Be reich wie die Löslichkeitsparameter für das Pfropfsubstrat Polyamid (13,5 bis 15 (cal/cm^-3)^1/2). Durch die Ähnlichkeit der energetischen. Eigenschaften des Lösungsmittels mit de nen des Polymeren wird die Quellung des Polymersubstrates besonders gefördert und die Diffusion der Monomeren in das Substratinnere entsprechend beschleunigt. Lösungsmittel mit den bezeichneten Eigenschaften, die vorzugsweise für die Pfropfung verwendet werden können, sind z. B. Chloroform, Benzylalkohol, Furan, Chlorbenzol, Dioxan, Aceton, Isobutylalkohol, Tetrahydrofuran, Äthyl acetat, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Methylacetamid, Piperidin, Methanol, Pyrrolidon, Propylalkohol. Diese Lösungsmittel werden in der Regel als binäre, ternäre oder quarternäre Mischungen im Pfropfansatz verwendet. Die Mengen der zugesetzten Lösungsmittel beträgt in der Regel zwischen 50 und 80 Vol.-%, vorzugsweise zwischen 65 und 75 Vol.-%, wobei die Konzentrationen der einzelnen Komponenten zwischen 4 und 38 Vol.-% betragen. Eine besonders deutliche Verbesserung des Pfropfprozesses wird jedoch überraschenderweise erst dadurch ermöglicht, daß neben den Lösungsmittel der oben beschriebenen Art zusätzlich solche Lösungsmittel verwendet werden, die über hohe Wasserstoff-Bindungs-Parameter von < 9 (cal/cm^-3)^1/2 verfügen (Quelle K. L. Hoy, Tables of Solubility Para meters, Union Carbide Corp., South Charleston, USA, 1969) und in der Pfropfmischung in einer Konzentration von 1 bis 10 Vol.-%, vorzugsweise 3 bis 6 Vol.-%, vorliegen. Der über raschende Effekt dieser Lösungsmittel begründet sich dar aus, daß die stark ausgeprägten intermolekularen Wasser stoff-Brückenbindungen des Polyamids aufgebrochen werden und durch die Auflockerung der Mikrostruktur die Diffusion der Monomeren begünstigt wird. Erst die Zugabe von Lösungs mitteln mit diesen Wasserstoff-Bindungs-Parametern ermög licht einen synergetischen Effekt, derart, daß zum einen der Pfropfprozeß deutlich begünstigt wird, zum anderen die Zugänglichkeit des polymeren Trägers für die Bindung der Bioliganden erhöht wird. Die Verwendung dieser Lösungsmittel macht darüber hinaus eine andere Maßnahme überflüssig, die in der CIP-Appli cation SN 07 150 417 beschrieben wird, nämlich die Verwendung von Dialkylaminoäthyl-(meth)acrylaten, die, als Comonomere in das Pfropfcopolymer eingeführt, aufgrund ihrer Ladung zur Auflockerung der Kolloidstruktur des polymeren Trägers beitragen sollen. Dieses Verfahren führt jedoch insofern zu einem sehr nachteiligen Effekt, als infolge der Ladungen das Polymere quasi Ionenaustauscher-ähnliche Eigenschaften erhält mit ausgeprägter Neigung zur Protein-Adsorption. Dieser Effekt ist jedoch bei Affinitätsträgern höchst uner wünscht, da unspezifische Proteinadsorptionen hierbei möglichst minimal sein müssen. Lösungsmittel mit den oben beschriebenen Wasserstoff-Bindungseigenschaften sind z. B. Ameisensäure, Trichloressigsäure, Essigsäure, 1,4-Butan diol, Äthylencyanhydrin, Hydrazin, Monoäthanolamin, 1,3- Propandiol, 1,5-Pentandiol. Zur Verbesserung speziell der mechanischen Eigenschaften der Polymerträger können Di- und Triacrylate wie z. B. Äthylenglykol-dimethacrylat, Triäthylenglykol-dimeth acrylat, Trimethylolpropan-triacrylat, N,N′-Methylen-bis acrylamid, Äthylenglycol-diacrylat simultan mit den bisher beschriebenen Monomeren und Comonomeren gepfropft werden. Es kommt dadurch zur Vernetzung der Matrix, die über raschenderweise deutlich zur Verbesserung der Rigidität des Trägers beiträgt. Durch gezielte Wahl der Konzentration der Vernetzer-Monomere werden die sonstigen günstigen Eigen schaften des Trägers im Hinblick auf die Liganden-Bindungs kapazität praktisch nicht negativ beeinflußt. Dieser Um stand eröffnet den erfindungsgemäßen Produkten erweiterte Anwendungsmöglichkeiten. In diesem Zusammenhang sei vor allem die technische Chromatographie genannt, die aufgrund der benötigten großen Gelvolumina auf unbedingt mechanisch stabile Medien angewiesen ist. Die erfindungsgemäßen Matri zes erfüllen diese Forderungen vollständig.

Außer organischen Lösungsmitteln kann überraschenderweise auch mit wäßrigen Metallsalzlösungen, in denen die Monome ren und Comonomeren gelöst sind, ein ähnlicher synerge tischer Pfropfeffekt wie oben erzielt werden. Dieser über raschende Effekt erklärt sich aus der Tatsache, daß Wasser einen sehr hohen H-Bindungs-Parameter aufweist (24 (cal/cm ^-3)^1/2), der somit praktisch analoge Eigenschaften auf die Pfropfung ausübt wie die oben beschriebenen Lösungsmittel gemische. Die Metallsalze werden durchweg als 0,002- bis 0,2 molare wäßrige Lösungen eingesetzt. Die Konzentration der Metallsalzlösung in der Pfropfmischung beträgt in der Regel 55 bis 80 Vol.-%. Als Metallsalze kommen z. B. Cu(II)-Salze, Fe(II)- oder Fe(III)-Salze sowie Mohr′sches Salz zur Anwen dung. Es ist seit langem bekannt, daß Salze der angegebenen Art vielfach in der Pfropftechnik eingesetzt werden, um Homo polymerisation während des Pfropfvorganges zu unterdrücken. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch gezeigt, daß der synergetische Effekt, den die wäßrige Metall salzlösung ausübt, überraschenderweise nur in Gegenwart von mindestens einer Comonomerenkomponente, die allgemein 1 bis 12 Vol.-%, vorzugsweise 3 bis 7 Vol.-%, im Pfropfansatz ausmacht, zum Tragen kommt.

Um zu solchen Träger zu gelangen, an die Affinitäts-Li ganden oder Biomoleküle in Form von Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Enzymen, Oligosacchariden sowie Poly- oder Oligonukleotiden kovalent gebunden werden können, werden bevorzugt hydroxyl-, epoxy-, carboxyl-, isocyanat- oder aldehydgruppenhaltige Monomere wie z. B. 2-Hydroxyäthyl methacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, 2-Isocyanatoäthyl methacrylat, Acrolein, N-Methylolacrylamid, N-Acryloyl-2- amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol aus den oben beschriebenen Lösungen gepfropft. Die hydroxylhaltigen Polymere können nach den bekannten Methoden mittels Tresylchlorid, Tosylchlorid, 2-Fluor-1- methyl-pyridinium-toluol-4-sulfonat, Cyanurchlorid, 1,1′- Carbonyldiimidazol, p-Nitrophenylchlorocarbonat z. B. akti viert werden. Die carboxylgruppenhaltigen Träger können entsprechend mittels 1-Hydroxy-benzotrial, N-Hydroxy succinimid, Dicyclohexylcarbodiimid oder dessen Derivate nach den bekannten Methoden aktiviert und für die Kopplung genutzt werden (Methods in Enzymology, Vol. 135, Part B). Aufgrund der deutlich gesteigerten Pfropfeffizienz des er findungsgemäßen Verfahrens gegenüber früheren Techniken kann die Konzentration der Monomeren im Pfropfansatz niedrig gehalten werden. Sie liegt in der Regel zwischen 15 und 40 Vol.-%, eine gegenüber den üblicherweise verwendeten Konzentrationen von 50 bis 80 Vol.-% relativ niedriger Wert.

Mit den erfindungsgemäßen Produkten lassen sich praktisch sämtliche heute in der Affinitäts-Chromatographie gebräuch lichen Liganden koppeln. Mit Hilfe der neuen Träger können dementsprechend Biomoleküle wie Antikörper, Enzyme, Blut faktoren, Nukleinsäuren oder Glycoproteine fraktioniert werden. Der Vorteil der erfindungsgemäßen Träger gegenüber herkömmlichen Medien besteht darin, daß neben der struktur bedingten Kapazitätssteigerung auch gleichzeitig die Kon formation hochmolekularer Liganden aufgrund der als Spacer fungierenden gepfropften Molekülketten präserviert wird, ein Umstand, der vor allem für die Immunaffinitäts-Chro matographie genutzt werden kann, da in diesem Falle spezi fische Antikörper als Affinitäts-Liganden gekoppelt werden. Im folgenden wird die Erfindung anhand einiger Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

10 g Polyamid-6-Pulver mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 100 µm werden in 50 ml Silikonöl suspendiert und auf 230°C aufgeheizt und bei dieser Temperatur 1 Min. belassen. Danach wird die Suspension in eine Aceton-Trockeneis-Mischung rasch eingerührt. Das gewonnene amorphe Produkt wird abfiltriert, mit Aceton und Methanol nachgewaschen und im Ölpumpen-Vakuum getrocknet. 1 g dieses Produktes wird mit 2,5 ml 2-Hydroxyäthyl methacrylat, 0,1 ml 20%iger Methacrylamid Lösung und 5 ml einer 0,005molaren Mohrsalz-Lösung versetzt und anschließend in einer Gamma-Strahlenquelle mit 0,15 Mrad bestrahlt. Die Dosis beträgt 0,05 Mrad/Stdn. Das gepfropfte Material wird anschließend abgesaugt und mehrfach mit Methanol und Dimethylformamid nachgewaschen bis das Filtrat frei von jeglichen Reaktionsprodukten ist. Das Produkt wird im Vakuum getrocknet. Es resultiert eine Pfropfausbeute von 95 Gew.-% 0,5 g des Pfropfcopolymeren werden mit 5 ml 1 N NaOH und 3 ml Epichlorhydrin versetzt und unter ständigem Rühren für zwei Stdn. bei 55°C umgesetzt. Das aktivierte Polymer enthält gemäß Titration mit Na₂S₂O₃ (L. Sundberg und J. Porath. J. Chromatogr. 90, 1974, 89) 850 µMol/g Oxirangruppen. 5 mg Streptavidin, gelöst in 5 ml 1 N K-Phosphat-Puffer, werden mit dem aktivierten Träger für 24 Stdn. bei Raumtemperatur inkubiert. Das mehrfach abwechselnd mit 0,5 N K-Phosphat-Puffer/ 0,1% Tween, pH 7,5, und PBS-Puffer, pH 7,2, gewaschene Produkt wird anschließend mit 5 mg biotinyliertem Schaf-Antikörper, gelöst in 2 ml PBS-Puffer, für 10 Minuten inkubiert. Der gesamte Antikörper wird dabei von dem Harz gebunden.

Beispiel 2

1 g amorphes Polyamid-Pulver, gemäß Beispiel 1, wird mit 2 ml Glycidyl-methacrylat, 0,2 ml N-Vinylpyrrolidon, 0,08 ml Äthylenglykol-dimethacrylat, 0,5 ml Dimethylformamid, 4 ml Äthylacetat und 4 ml Methanol versetzt und 2 Stdn. mit einer Strahlendosis von 0,06 Mrad/Stdn. bestrahlt. Das Reaktionsprodukt wird analog Beispiel 1 gewaschen und getrocknet. Die Pfropfausbeute beträgt 111 Gew.-%. An diesen Träger können Liganden mit Mercaptyl-, Carboxyl-, Hydroxyl- und Aminogruppen nach den bekannten Verfahren direkt gekoppelt werden.

Beispiel 3

0,5 g gepfropfter Träger, gemäß Beispiel 2, wird mit 5 ml 1 M Hexamethylendiamin Lösung, pH 12,0, 12 Stdn. bei 40°C umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und mehrfach mit Wasser nachgewaschen. 5 ml 0,1 M Na-Phosphat-Puffer- Lösung, pH 7,2, die 10% Glutaraldehyd enthält, werden sodann für 4 Stdn. bei 30°C mit dem Träger inkubiert. Das gewonnene Produkt wird abgesaugt und mit Wasser und Na- Phosphat-Puffer nachgewaschen, bis das Filtrat frei von Aldehyd ist. 4 ml 0,025 M NaCNBH₃ enthaltender PBS-Puffer, pH 7,2, in dem 7,5 mg anti-HGH IgG gelöst sind, wird für 10 Stdn. bei Raumtemperatur mit dem aktivierten Träger inkubiert. Es werden 6,8 mg IgG gebunden.

Beispiel 4

1 g Polyamid-66-Pulver mit einer mittleren Teilchengröße von 20 µm wird mit 3 ml 2-Hydroxyäthyl-methacrylat, 0,24 ml N-Vinylpyrrolidon, 0,3 g Trichloressigsäure, 4 ml Furan und 3,5 ml Methanol versetzt und 4 Stdn. mit einer Strahlendosis von 0,04 Mrad/Stdn. bestrahlt. Nach Waschen und Trocknen gemäß Beispiel 1 ergibt sich eine Pfropfausbeute von 118 Gew.-%. Das Produkt wird analog Beispiel 1 mit Epichlorhydrin in 1 N NaOH aktiviert. Der Oxirangehalt beträgt 1030 µMol/g.

Beispiel 5

1 g Polyamid-6-Pulver, mittlere Teilchengröße 100 µm, wird mit 2,5 ml Hydroxyäthylmethacrylat, 0,35 ml N- Vinylpyrrolidon, 0,24 ml 20%ige wäßrige Acrylamid-Lösung und 5 ml 0,005 M Cu(II)sulfat-Lösung versetzt und eine Stunde mit 0,12 Mrad bestrahlt. Es resultiert eine Pfropfausbeute von 88 Gew.-%. 0,5 g des im Vakuum getrockneten Produktes wird mit 5 ml absolutem Aceton, das 2 g Tosylchlorid und 0,01 M Äthanol amin enthält, versetzt und 30 Min. bei 25°C gerührt. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und so lange mit Aceton nachgewaschen, bis das Filtrat frei von Tosylchlorid ist. Danach wird mit Wasser und PBS-Puffer, pH 7,2, mehrfach nachgewaschen. Der aktivierte Träger wird mit 10 mg anti-Insulin IgG, gelöst in 3 ml 0,2 M HEPES-HCl-Puffer, pH 7,8, versetzt und 12 Stdn. bei 4°C gerührt. Danach wird abgesaugt und mehrfach mit HEPES-Puffer nachgewaschen. Eine Lösung von 3 mg Human- Insulin, gelöst in 3 ml PBS-Puffer, pH 7,2, wird für 5 Min. mit dem Affinitätsträger inkubiert. Es werden 0,8 mg Insulin gebunden.

Beispiel 6

0,25 g des mit Glycidyl-methacrylat gepfropften Trägers, gemäß Beispiel 2, werden mit 1,5 ml Mercaptopropionsäure versetzt und unter Schütteln 10 Stdn. bei 35°C umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und mehrfach mit Wasser bis zur absoluten Reinheit des Filtrates gewaschen. Das carboxylgruppenhaltige Produkt wird zunächst mehrfach mit Tetrahydrofuran gewaschen und anschließend mit 5 ml Tetrahydrofuran, in dem 322 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 147 mg 1-Hydroxy-benzotriazol gelöst sind, versetzt und für 2 Stdn. bei 25°C aktiviert. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und mehrfach bis zur Reinheit des Filtrates mit Tetrahydrofuran nachgewaschen. Nach 20stündiger Inkubation einer 3 ml PBS-Puffer-Lösung, pH 7,2, die 1,5×10-5 M J¹²⁵ radioaktiv markiertes Rinder-Albumin enthält, werden 85% Protein gebunden.

Beispiel 7

0,5 g gemäß Beispiel 4 gepfropfter und aktivierter Träger werden mit 3 ml 1 N K-Phosphat-Puffer, pH 7,5, in dem 5 mg Concanavalin A gelöst sind, versetzt und für 25 Stdn. bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Träger bindet 3,2 mg Concanavalin A und kann direkt zur Auftrennung von Glycoproteinen nach den bekannten Verfahren eingesetzt werden.

Beispiel 8

0,5 g epoxy-aktiviertes Polyamid-Pulver, gemäß Beispiel 1, wird mit 3 ml 1 M K-Phosphat-Puffer, der 10 mg anti-Human- Serum-Albumin IgG enthält, versetzt und bei 20°C für 25 Stdn. geschüttelt. Es werden 3,1 mg IgG gebunden.

Beispiel 9

0,5 g Glycidyl-methacrylat gepfropfter Träger, gemäß Beispiel 2, wird mit 0,5 g Adipinsäuredihydrazid, gelöst in 5 ml 0,2 M Bicarbonat-Puffer, pH 9,5, 20 Stdn. bei 40°C umgesetzt. Das Produkt wird anschließend abgesaugt und bis zur Reinheit des Filtrates mit Wasser nachgewaschen. Danach werden 2 ml 0,4 M Mercaptoäthanol-Lösung für 10 Stdn. bei 25°C inkubiert, um restliche Oxirangruppen zu blockieren. Es wird abgesaugt und mehrfach mit Wasser nachgewaschen. Es entsteht ein Hydrazid-Träger, an den aldehydgruppenhaltige Liganden nach den bekannten Methoden durch einfaches Inkubieren gebunden werden können.

Beispiel 10

1,5 g Polyamid 12, mittlere Teilchengröße 100 µm, wird mit 5 ml 2-Hydroxyäthyl-methacrylat, 1 ml N-Vinylpyrrolidon, 0,1 ml Trimethylolpropan-trimethacrylat, 7 ml 1,4 Dioxan und 5 ml Methanol versetzt und 2 Stunden mit einer Dosis von 0,08 Mrad/Stdn. bestrahlt. Es fällt eine Pfropfausbeute von 69 Gew.-% an.

Beispiel 11

10 g Polyamid 12, mittlere Teilchengröße 70 µm, wird mit 15 ml 2-Hydroxyäthyl-methacrylat, 6 ml 20%ige wäßrige Acrylamid-Lösung, 1 ml 1%ige wäßrige N,N′-Methylen-bis acrylamid-Lösung, 3 ml Dimethylsulfoxid, 10 ml Methanol und 10 ml Pyrrolidon versetzt und 5 Stunden mit einer Gesamtdosis von 0,17 Mrad bestrahlt. Es resultiert eine Pfropfausbeute von 91 Gew.-%.

Beispiel 12

1 g amorphes Polyamid-6-Pulver, gemäß Beispiel 1, wird mit 3 ml Glycidyl-methacrylat, 0,5 ml N-Vinylpyrrolidon, 0,5 ml Trimethylolpropan-trimethacrylat, 0,5 ml Ameisensäure, 1 ml Formamid, 5,2 ml Methanol und 6,4 ml N-Methylacetamid, das zuvor kurz aufgeschmolzen wurde, versetzt und über einen Zeitraum von 3 Stdn. mit 0,05 Mrad/Stdn. bestrahlt. Es resultiert eine Pfropfausbeute von 94 Gew.-%.

Beispiel 13

6 g Polyamid-12-Pulver, mittlere Teilchengröße 70 µm, wird mit 10 ml 2-Hydroxyäthyl-methacrylat, 2 ml wäßrige 20%ige Acrylamid-Lösung, 0,2 ml Äthylenglykol-dimethacrylat, 1 ml Äthylformamid, 12 ml Methanol und 12,5 ml Tetrahydrofuran versetzt und 20 Stunden mit einer Strahlendosis von 0,009 Mrad/Stdn. bestrahlt. Nach den üblichen Wasch- und Trockenvorgängen resultiert eine Pfropfausbeute von 74 Gew.-%.

Beispiel 14

1 g amorphes Polyamid-Pulver, gemäß Beispiel 1, wird mit 3 ml Acrolein, 0,1 ml N-Vinylpyrrolidon, 4 ml Dimethylsulfoxid und 1 ml Dioxan versetzt und über einen Zeitraum von 20 Min. mit einer Strahlendosis von 0,26 Mrad/Stdn. bestrahlt. Es resultiert eine Pfropfausbeute von 18 Gew.-%.

Beispiel 15

1 g amorphes Polyamid-Pulver, gemäß Beispiel 1, wird mit 5 ml 0,05 M Cu(II)-sulfat-Lösung, die 20 Vol.-% Acrylsäure und 10 Vol% einer 20%igen wäßrigen Acrylamid-Lösung enthält, versetzt und 10 Stdn. mit einer Strahlendosis von 0,02 Mrad/Stdn. bestrahlt. Die Pfropfausbeute beträgt 16 Gew.-%.

Beispiel 16

1 g amorphes Polyamid-Pulver, gemäß Beispiel 1, wird mit 5 ml 0,05 M Cu(II)-sulfat-Lösung, die 20 Gew.-% Maleinsäureanhydrid und 20 Vol.-% Acrylsäure enthält, versetzt und 10 Stdn. mit einer Dosis von 0,02 Mrad/Stdn. bestrahlt. Die Pfropfausbeute beträgt 20 Gew.-%.

Beispiel 17

1 g Polyamid-6-Pulver, mittlere Teilchengröße 100 µm, wird mit 3 ml 2-Hydroxyäthyl-methacrylat, 1 ml 2- Isocyanatoäthyl-methacrylat, 0,2 ml N-Vinylpyrrolidon, 4,5 ml Methanol, 5,5 ml Chloroform und 2 ml Tetrahydrofuran versetzt und 3 Stunden mit einer Strahlendosis von 0,08 Mrad/Stdn. bestrahlt Es resultiert eine Pfropfausbeute von 22 Gew.-%.

Claims

1. Affinitätsträger auf der Basis von Polyamiden, auf die Polymere aufgepfropft sind, dadurch gekennzeichnet, daß die gepfropften Polymeren zu 70 bis 98% aus Vinylmonomeren mit funktionellen kupplungsfähigen Seitengruppen der allgemeinen Formel I worin R¹ H oder CH₃, X -OH, -(CH₂)_2-6-OH, -NHOH, oder -CH₂CH₂-NCO bedeuten kann, und zu 2 bis 30% aus Comonomeren mit nicht kupplungsfähigen Gruppen bestehen.

2. Affinitätsträger gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die Comonomeren N-Vinylpyrrolidon, Acrylamid, Methacrylamid, Maleinsäureanhydrid oder Allylharnstoff oder Mischungen derselben sind.

3. Affinitätsträger auf der Basis von Polyamiden, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropfcopolymeren gemäß Anspruch 1 zu 0,05 bis 5% mit Vinylmonomeren, die mindestens zwei reaktive Vinyl-Funktionen enthalten, vernetzt sind.

4. Affinitätsträger gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vinylmonomere Acrolein ist.

5. Affinitätsträger gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Pfropfcopolymere eine durch Reaktion eines oxirangruppentragenden Pfropfcopolymeren mit einem Diamin erzeugte Aminogruppe enthält.

6. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern, dadurch gekennzeichnet, daß kupplungsfähige seitengruppentragende Vinylmonomere der allgemeinen Formel (I), die in einem organischen Medium gelöst sind, in Gegenwart mindestens einer nicht kupplungsfähigen Seitengruppen tragenden Comonomeren-Komponente durch Bestrahlen mit Gamma- oder sonstigen ionisierenden Strahlen auf ein Polyamidsubstrat mit mikropartikulärer Flachmembran-, Hohlfaser- oder Tube-Geometrie aufgepfropft werden.

7. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropfung in einer Lösung, die 0,05 bis 5 Vol.-% eines Di- oder Triacrylates oder eines Di- oder Trimethacrylates enthält, durchgeführt wird.

8. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern, dadurch gekennzeichnet, daß mikropartikuläres, amorphes Polyamid, erhältlich durch Aufschmelzen des Polyamids in einer inerten, das Polyamid nicht lösenden, hochsiedenden Flüssigkeit und anschließendes Abkühlen in einem Kältebad, gemäß Ansprüchen 6 und 7 gepfropft wird.

9. Verfahren zur Herstellung eines Affinitätsträgers gemäß Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyamid zuerst mit Gamma-Strahlen vorbestrahlt wird und anschließend mit der Pfropflösung in Kontakt gebracht wird.

10. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern gemäß Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropflösung 15 bis 40 Vol.-% Vinylmonomere enthält.

11. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern gemäß Ansprüchen 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropfung in einer organischen Phase, die zu 55 bis 80 Vol.-% aus einer binären, ternären oder quaternären Mischung solcher organischen Lösungsmittel besteht, deren Löslich keitsparameter zwischen 9 und 15 (cal/cm^-3)^1/2 liegt, durchgeführt wird, wobei eine Komponente zwischen 4 und 38 Vol.-% ausmacht, durchgeführt wird.

12. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern gemäß Ansprüchen 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropflösung 0,35 bis 8 Vol.-% Comonomere in Form von N- Vinylpyrrolidon oder wäßrigen Acrylamid-, Methacrylamid-, Allylharnstoff- oder Maleinsäureanhydrid-Lösungen oder Mischungen derselben enthält.

13. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern gemäß Ansprüchen 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropfung in einer Lösung, die 2 bis 12 Gew.-% Trichlor essigsäure enthält, durchgeführt wird.

14. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern auf der Basis von Polyamiden, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropfung wasserlöslicher Monomere gemäß Formel (I) in einer Mischung, die 55 bis 80 Vol.-% einer wäßrigen 0,001- bis 0,2molaren Metallsalzlösung enthält, in Gegenwart von 1 bis 12 Vol.-% mindestens einer Comonomeren-Komponente gemäß Anspruch 12 durchgeführt wird.

15. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern gemäß Ansprüchen 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropfung in einer Lösung, die 1 bis 12 Vol.-% eines Lösungsmittels mit einem Wasserstoff-Bindungs-Parameter < 9 (cal/cm^-3)^1/2 enthält, durchgeführt wird.

16. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern mit Aminoseitengruppen, dadurch gekennzeichnet, daß die oxirangruppenhaltigen Pfropfcopolymeren nach Ansprüchen 1 bis 13 und 15 mit einem Diamin aus wäßriger Phase umgesetzt wird.

17. Verfahren zur Herstellung von Affinitätsträgern nach Ansprüchen 1 bis 13 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß die oxirangruppenhaltigen Pfropfcopolymere mit Polyethylen glykolen einer Molmasse von 100 bis 3000 umgesetzt werden.

18. Verfahren zur Herstellung aldehydgruppenhaltiger Affinitätsträger, dadurch gekennzeichnet, daß die oxirangruppen haltigen Pfropfcopolymere nach Ansprüchen 1 bis 13 und 15 mit Mineralsäuren hydrolysiert werden, und die enstandenen viccinalen Hydroxyl-Gruppen mit Perjodaten zu Aldehydfunktionen oxidiert werden.

19. Verwendung der Affinitätsträger gemäß Ansprüchen 1 bis 5 zur Fraktionierung von Biopolymeren.