DE2633259A1

DE2633259A1 - Verfahren zur herstellung von unbeweglich gemachten enzymen

Info

Publication number: DE2633259A1
Application number: DE19762633259
Authority: DE
Inventors: Isao Kaetsu; Minoru Kumakura; Masaru Yoshida
Original assignee: Japan Atomic Energy Research Institute
Current assignee: Japan Atomic Energy Agency
Priority date: 1975-07-23
Filing date: 1976-07-23
Publication date: 1977-01-27
Also published as: DE2633259C3; DE2633259B2; US4226938A

Description

PATEiNTANVJAUTH

SCHIFF ν. FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBB1NGHAUS

MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MÖNCHEN 9S

JAPAN ATOMIC ENERGY RESEARCH INSTITUTE

DA-12 211

DIPL. CHEM. DR. OTMAR DlTTMANN (_Τ1β76) KARL LUDWIG SCHIFF DIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER DIPL. INS. PETER STREHL DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF DIPL. ING. DIETER EBBINQHAUS TELEFON (O89) 48 SO 54. TELEX 5-23 666 AURO D TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN

23. Juli 1976

Prioritäten: 23- Juli 1975, Japan, Nr. 89207/75 23. Juli 1975, Japan, Nr. 89209/75

Verfahren zur Herstellung von unbeweglich gemachten Enzymen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Unbeweglichmachen oder Fixieren von Enzymen oder enzymhaltigen Mikroorganismenzellen, bei dem Enzyme in einem wässrigen Medium unlöslich gemacht werden und auf einem Träger oder einer Unterlage fixiert werden.

Es ist gut bekannt, daß Enzyme als Katalysator, der in wirksamer Weise zahlreiche chemische Reaktionen katalysiert, die mit üblichen chemischen Katalysatoren nicht durchgeführt werden können, verwendet werden. Sie sind daher unerläßliche Substanzen auf dem Gebiet der Nahrungsmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie und anderen Gebieten der Technik. Bisher werden bei den meisten enzymatischen Reaktionen Enzyme in der wässrigen Phase eingesetzt und sie werden zusammen mit Abfallflüssigkeiten nach der Reaktion verworfen. In den meisten Fällen ist es sowohl in technischer, als auch in wirtschaftlicher Hinsicht äußerst schwierig, Enzyme aus dem Reaktionsgemisch wiederzugewinnen, um sie erneut zu verwenden.

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Enzymatische Reaktionen werden daher stets ansatzweise durchgeführt. Wenn daher ein Verfahren aufgefunden wird, welches ermöglicht, Enzyme unlöslich zu machen und in einer solchen Form unbeweglich zu machen, in der die Substrate kontinuierlich mit ihnen in Berührung gebracht werden können, so ist es möglich, daß die Enzyme wiederholt verwendet werden und daß Verfahren unter Anwendung enzymatischer Reaktionen kontinuierlich durchgeführt werden können.

Man hat bereits versucht, Enzyme chemisch mit wasserunlöslichen Substanzen zu kombinieren, wie synthetischen Makromolekülen, um sie zu fixieren. Die Aktivität der Enzyme ist Jedoch äußerst empfindlich gegenüber Veränderungen ihrer Molekülarstruktur und in den meisten Fällen werden Enzyme durch eine solche chemische Fixierung merklich inaktiviert. Diese Verfahren lassen sich daher nicht mit Erfolg für praktische Anwendungszwecke einsetzen. Es wurde auch bereits ein Verfahren beschrieben, bei dem Enzyme an einem Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, aktive Terra alba (Weißerde) und dergleichen adsorbiert werden (US-PS 2 717 852). Bei Anwendung dieses Verfahrens wird jedoch das adsorbierte Enzym leicht desorbiert, wenn es wiederholte Male für die Reaktion verwendet wird. Das Verfahren ist ungeeignet wegen der kurzen Gebrauchsdauer des Enzymmaterials.

Außerdem ist die sogenannte Einschlußmethode bekannt. So wurden beispielsweise Verfahren beschrieben, bei denen ein wasserlösliches Monomeres, wie Acrylamid, in einer ein Enzym enthaltenden Lösung polymerisiert wurde (K. Kawashima et al., Biotech. Bioeng. 16_, 609, 1974) und ein Verfahren, bei dem Polyvinylalkohol in seiner ein Enzym enthaltenden wässrigen Lösung vernetzt wird (H. Maeda et al., Biotech, Bioeng. 1_5_, 827_f 1973). Diese Polymeren haben jedoch die Eigenschaft, daß sie in Gegenwart von Wasser stark quellen und daß sich daher die Einschlußmasse im Zustand eines klumpigen Gels, welches frei von Poren oder Hohlräumen ist, befindet. Es ist daher erforderlich, den Klumpen zu trocknen und zu pulverisieren, um ihn in eine Form überzuführen, in welcher

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das Enzym in Kontakt mit einer als Substrat dienenden Substanz gebracht werden kann. Dies ist eine mühsame Behandlung und ruft darüber hinaus in hohem Maß die Möglichkeit der Desorption und/oder Desaktivierung des Enzyms während der Behandlung hervor.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und wirksames Verfahren zum Uhbeweglichmachen . oder Fixieren von Enzymen zur Verfugung zu stellen, bei welchem lang anhaltende " Enzymaktivität gewährleistet wird.

Es wurde nun gefunden, daß dieses Ziel erreicht werden kann, wenn ein Enzym oder enzymhaltige Mikroorganismenzellen an einem bestimmten Adsorptionsmittel der nachstehend angegebenen Gruppe A in einer wässrigen Lösung oder Dispersion des Enzyms adsorbiert werden und danach die so erhaltene Dispersion mit einem Monomeren der nachstehend angegebenen Gruppe B vermischt wird, und das Monomere unter Bildung eines porösen Gels polymerisiert wird, welches das unbeweglich gemachte Enzym oder die unbeweglich gemachten Zellen enthält.

Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Enzyme zunächst in einem wässrigen Medium an einem pulverförmigen Adsorptionsmittel adsorbiert werden und zu dem adsorbierten Material ein wassermischbares Monomeres zugesetzt wird, wird dieses Monomere unter Bildung eines porösen Gels polymerisiert, durch welches eine Substratlösung frei passieren kann. Das so gebildete Enzymmaterial hat lang anhaltende Aktivität und daher 'können die Enzyme in einfacher Weise aus dem Reaktionssystem abgetrennt werden und wiederholte Male verwendet werden.

Nachstehend werden die erfindungsgemäß eingesetzten Materialen näher erläutert.

Gruppe A: Adsorbentien

Dazu gehören als Adsorptionsmittel wirksame anorganische natürliche

ρ π q ·-■· ^ !, ι 1 1 ft -3

Erden, synthetische anorganische Adsorptionsmittel, Polypeptide, natürliche und synthetische amorphe Kohlenhydrat-Adsorptionsmittel.

Gruppe B: Hydrophile Monomere.

Dazu gehören Acrylat- oder Methacrylatester oder deren Gemische der allgemeinen Formel

CH₀=CX-C-O-(CH₀ L·-OH
d. _n <£. τι

0 oder

CH₀=CX-C-O-(R¹0) -R²

in denen R eine Gruppe -CH₀CH₀- oder -CH(CH,)CH_O- bedeutet, R für ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Gruppe der Formel CH₀=CX-C- steht; X ein Wasserstoffatom oder eine

^ Il

Methylgruppe und η eine ganze Zahl von 2, 3 oder 4 und m eine ganze Zahl von 2 bis 20, vorzugsweise 4 bis 14, insbesondere 4 bis 12 bedeuten.

Die Korngröße des pulverförmigen Adsorptionsmittels sollte 0,1 mm bis 5 mm, vorzugsweise 0,5 mm bis 3 mm betragen.

Das Monomere der Gruppe B kann in einer Menge von nicht mehr als 30 % der Gesamtmenge der Monomeren durch eines oder mehrere andere polymerisierbare Monomere (nachstehend als Monomere der Gruppe C bezeichnet) ersetzt werden.

Das Verhältnis von Wasser und polymerisierbaren Monomeren (B und C) schwankt in Abhängigkeit von den für das gebildete Gel gewünschten Eigenschaften, wie Porosität, Dichte, Porenverteilung und dergleichen und ist daher ein wichtiger Faktor, der die Wirksamkeit der Fixierung des Enzyms und dergleichen beeinflußt. Gewöhnlich werden das Monomere oder die Monomeren, bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, in einer Menge von 0,5 bis 80 %, vorzugsweise 1 bis 60 % und insbesondere 5 bis 50 % verwendet.

Die Menge des Adsorptionsmittels, d.h. der Materialien der Gruppe A, wird meist so gewählt, daß sie bis zu dem Gewicht der verwendeten Lösung beträgt, obwohl auch eine größere Menge eingesetzt

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werden kann. Die bevorzugte Menge läßt sich leicht durch einen einfachen Versuch bestimmen.

Die Menge des in dem Gel zu fixierenden Enzyms unterliegt keiner speziellen Beschränkung. Sie hängt von der Adsorptionskapazität des verwendeten Adsorptionsmittels ab.

Die Polymerisation kann mit Hilfe radikalischer Initiatoren oder mit Hilfe von Lichtstrahlung oder ionisierender Strahlung durchgeführt werden. Die meisten Enzyme sind instabil gegenüber Wärme und es ist daher vorteilhaft, die Polymerisation bei tiefen Temperaturen unter der Einwirkung von Licht oder ionisierender Strahlung durchzuführen. Andererseits sind einige Enzyme empfindlich gegen Strahlung und v/erden dadurch inaktiviert. Bei solchen Enzymen wird die Polymerisation durch Erhitzen in Gegenwart eines radikalbildenden Katalysators, vorzugsweise in Gegenwart eines Redoxkatalysatorsystems, bei möglichst niederer Temperatur durchgeführt. Wenn Licht oder Strahlung angewendet wird, kann die Polymerisation bei sehr tiefen Temperaturen, wie -200° C durchgeführt werden, die bevorzugten Temperaturen liegen jedoch zwischen 0° C und -80° C, insbesondere zwischen -20° C und -80° C.

Die Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht darauf, daß eingeschlossene Enzyme hohe Aktivität beibehalten, daß diese Enzyme nicht leicht von dem Träger freigesetzt werden und die unbeweglich gemachten Enzyme daher lange Lebensdauer haben.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher erläutert.

Zu spezifischen Beispielen für Adsorptionsmittel der Gruppe A gehören aktive Terraalba (Weißerde), Bentonit, Kaolin und andere Silicatraaterialien, Aluminiumoxid, Silicagel, Molekularsiebe, Aktivkohle, Ionenaustauscherharze, Stärke, Amylopectin, Amylose, Cellulose, Cellulosenitrat, Celluloseacetat, Cellulosebutyrat, Cellulosephosphat, Hydroxäthylcellulose,Carboxymethylcellulose, Cyanäthylcellulose, Stärkephosphat, Stärkenitrat, Carboxy-methyl-

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stärke, Hydroxyäthylstärke, Agar, Gelatine, Collagen und dergleichen.

Zu spezifischen Beispielen für Monomere der Gruppe B gehören Hydroxyäthylmethacrylat, Hydroxyäthylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Hydroxypropylacrylat, Hydroxybutylmethacrylat, Hydroxybutylacrylat, Diäthylenglycolmonomethacrylat, Diäthylenglycolmonoacrylat, Triäthylenglycolmonomethacrylat, Triäthylenglycolmonoacrylat, Tetraäthylenglycolmonomethacrylat, Tetraäthylenglycolmonoacrylat, Polyäthylenglycolmonomethacrylat, Polyäthylenglycolmonoacrylat, Methoxydiäthylenglycolmethacrylat, Methoxydiäthylenglycolacrylat, Methoxytriäthylenglycolmethacrylat, Methoxytriäthylenglycolacrylat, Methoxytetraäthylenglycolmethacrylat, Methoxytetraäthylenglycolacrylat, Diathylenglycoldimethacrylat, Diäthylenglycoldiacrylat, Triäthylenglycoldimethacrylat, Triäthylenglycoldiacrylat, Tetraäthylenglycoldimethacrylat, Tetraäthylenclycoldiacrylat, Polyäthylenglycoldimethacrylat, Polymethylenglycoldiacrylat und dergleichen.

Zu spezifischen Beispielen für Monomere der Gruppe C gehören Styrol, Divinylbenzol, Vinyltoluol, oc-Methyl styrol, Vinylalkyläther, Vinylpyridin, Vinylpyrrolidon, Vinylcarbazol, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Acrylnitril, Methacrylnitril, Methylolacrylamid, Diacetonacrylamid, t-Butylacrylamid, Methylen-bis-acrylamid, Methylacrylat, Methylmethacrylat, Äthylacrylat, Äthylmethacrylat, n-Propylacrylat, n-Propylmethacrylat, Isopropylacrylat, Isopropylmethacrylat, Butylacrylat, Butylmethacrylat, Isobutylacrylat, Isobutylmethacrylat, Octylacrylat, Octylmethacrylat, Cyclohexylacrylat, Cyclohexylmethacrylat, Laurylacrylat, Laurylmethacrylat, Stearylacrylat, Stearylmethacrylat, Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Phenylacrylat, Phenylmethacrylat, Benzylacrylat, Benzylmethacrylat,,Diäthylaminoäthylacrylat, Diäthylaminoäthylmethacrylat, Vinylacetat, Vinylpropionat, Itaconsäure, Itaconsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Triallylcanurat, Diallylitaconat, Diallylsuccinat, Diallylmaleat, Dipropargylmaleat, Trimethyloläthantriacrylat, Trimethyloläthan-

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trimethacrylat, Trimethylolpropantriacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Trimethylolbutantriacrylat, Trimethylolbutantrimethacrylat, Glycerinmonoacrylat, Glycerinmonomethacrylat, Äthylenglycoldiacrylat, Äthylenglycoldimethacrylat, Neo.pentylglycoldiacrylat, Neopentylglycoldimethacrylat, Pentandiolmonoacrylat und -diacrylat, Pentandiolmonomethacrylat und -dimethacrylat, Hexandiolmonoacrylat und -diacrylat, Hexandiolmonomethacrylat und -dimethacrylat, Heptandiolmonoacrylat und -diacrylat, Heptandiolmonoacrylat und -diacrylat, Heptandiolmonomethacrylat und -dimethacrylat und dergleichen.

Zu spezifischen Beispielen für Enzyme, auf welche sich das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich anwenden läßt, gehören «-Amylase, ß-Amylase, Glucoamylase, Cellulase, Hemicellulase, #-Glucosidase, Invertase, Urease, Alkoholdehydrierungs-Enzym (Dehydrogenase), Milchsäure dehydrierendes Enzym (Milchsäuredehydrogenase), Glucoseoxidase, Hexokinase, Q-Aminosäure-Oxidase, Arginase, Papain, Ficin, Rennin, Trj^psin, Glucoseisomerase, L-Glutarsäure-Decarboxylase, alkalische Protease, saure Protease und dergleichen.

Erfindungsgemäß werden Materialien,die unbeweglich gemachte Enzyme enthalten, hergestellt, welche den freien Durchtritt von Substratlösungen, an denen enzymatische Reaktionen eintreten, ermöglichen. Die Materialien werden in wirksamer Weise durch die kombinierte Anwendung eines Adsorptionsmittels der Gruppe A und eines polymerisierbaren Monomeren der Gruppe B erhalten. Wenn ein Adsorptionsmittel der Gruppe A in Kombination mit einem wasserlöslichen Monomeren verwendet wird, welches nicht der Gruppe B angehört, wie Acrylamid, so absorbiert das gebildete Polymere Wasser und bildet ein gequollenes Ifydrogel, welches das Adsorptionsmittel enthält, an welchem das Enzym adsorbiert ist, wobei keine Poren oder Hohlräume verbleiben. Daher kann das eingeschlossene Enzym nicht mit einer als Substrat dienenden Substanz in Berührung gebracht werden, solange es nicht getrocknet und pulverisiert worden ist. Während dieser Behandlungen wird jedoch das Enzym inaktiviert oder

B 0 9 8 [U / 1 1 θ 3

von dem Träger freigesetzt.

Wenn dagegen ein Monomeres der Gruppe B verwendet wird, so ist dieses mit Wasser mischbar und das ein Enzym enthaltende Adsorptionsmittel wird gut in der Mischung dispergiert. Wenn nun das Gemisch der Polymerisationsbehandlung unterworfen wird, bildet das Monomere ein poröses Polymermaterial, welches aus der wässrigen Phase abgeschieden wird und das Adsorptionsmittel enthält, an welchem das Enzym adsorbiert ist.

Wenn bei den bekannten Verfahren ein Enzym in ein Polymeres eingeschlossen wurde, so trat eine beträchtliche Freisetzung und/oder Inaktivierung des Enzyms ein. Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Enzym beständig an einem Adsorptionsmittel adsorbiert ist und das Adsorptionsmittel von einem Polymeren eingeschlossen wird, besteht daher keine Möglichkeit, daß das Enzym freigesetzt und inaktiviert wird. Wenn jedoch das Enzym einfach an einem Adsorptionsmittel adsorbiert wird oder bloß in einem Polymeren eingeschlossen wird, wird das Enzym von dem Träger freigesetzt, wenn es mehrere Male verwendet wird. Erfindungsgemäß wird ein Enzym an einem Adsorptionsmittel adsorbiert und außerdem in die dreidimensional..versetzte Struktur eines Polymeren eingeschlossen, so daß ein Enzymmaterial mit guter Beständigkeit gebildet wird.

Das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene imobilisierte Enzymmaterial hat poröse Struktur und das Enzym liegt dem- ' nach in einem Zustand vor, in welchem es leicht mit einer Substratsubstanz in Kontakt gebracht ,werden kann, welche die dreidimensionale Struktur des Polymeren passiert, ohne daß irgend eine Nachbehandlung erforderlich wird.

Die Erfindung beruht auf der spezifischen Auswahl einer Kombination aus einem Adsorptionsmittel und einem speziellen poljTnerisierbaren Monomeren, die aus dem bisherigen Stand der Technik nicht herleitbar war.

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Bei der praktischen Durchführung der Erfindung kann eine Dispersion, die ein Adsorptionsmittel der Gruppe A, an welchem ein Enzym adsorbiert ist, ein Monomeres der Gruppe B und Wasser enthält, in eine Kolonne gegeben werden, die mit einem am unteren Ende angeordneten Hahn versehen ist und das Monomere in dieser Kolonne polymerisiert werden. Dabei wird ein Polymeres in einem porösen Gelzustand gebildet, welches sich aus dem Wasser abscheidet, und eine enzymatisch^ Reaktion kann kontinuierlich durchgeführt v/erden, indem eine Substratlösung bei geöffnetem Bodenhahn in das obere Ende der Kolonne gegossen wird. Wenn ein Teil des Monomeren der Gruppe B durch ein polyfunktionelles Monomeres (ausgewählt aus der Gruppe C) ersetzt wird, so tritt Vernetzung ein oder wird verstärkt und in dem gebildeten Polymeren bildet sich eine dreidimensionale vernetzte Struktur aus. Die Enzyme werden daher besser eingeschlossen, wobei aber der Durchtritt der Substratlösung ermöglicht wird.

Das heißt, daß durch selektive Zugabe eines Monomeren der Gruppe C die Porosität des gebildeten Polymeren weitgehend variiert werden kann, wenn auch die Porosität durch das Verhältnis von Wasser und des Monomeren der Gruppe B allein geregelt werden kann. Da viele der Monomere der Gruppe C schlechte Wassermischbarkeit haben oder wasserunlöslich sind, wird durch ihre Zugabe die Affinität des gebildeten Polymeren gegenüber Wasser modifiziert. Die Menge des zu verwendenden Monomeren der Gruppe C ist daher in der vorher angegebenen Weise beschränkt. Wenn eine zu hohe Menge dieses Monomeren verwendet wird, so wird das gebildete Monomere makroskopisch heterogen und das Ziel der Erfindung kann nicht erreicht werden.

Wenn anstelle von Enzymen enzymbildende Mikroorganismen verwendet werden, so können einige dieser Mikroorganismen als solche unverändert eingesetzt werden, einige davon werden jedoch angewendet, nachdem ihre Zellen zerstört worden sind, beispielsweise mit Hilfe von Ultraschallwellen und dergleichen.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher anhand von praktischen Beispielen erläutert.

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Beispiel 1

Ein Anteil von 250 jug ct-Amylase wurde in 0,8 ml einer Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 6,9) gelöst. Die so erhaltene Enzymlösung wurde in eine Glasampulle mit einem Außendurchmesser von 1 cm gegeben und 0,4 g pulverisiertes Silicagel wurde zugesetzt. Nachdem das Enzym an dem Silicalgel adsorbiert war, wurde 0,2 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat zugegeben und dann wurde die Ampulle an der Luft zugeschmolzen. Der Inhalt der Ampulle wurde mit der Gammastrahlung von Kobalt 60 bei -24° C in einer Dosisrate von 1 χ 10 R/h während einer Stunde bestrahlt. Dabei wurde eine aus einem porösen Polymeren bestehenden Masse in einer Polymerisationsausbeute von 97,8 % erhalten.

Dieses Gel wurde in kleine Stücke zerteilt und ohne Reinigung, Trocknung oder Pulverisation für die nachstehend beschriebene enzymatische Reaktion verwendet. Die Gelstücke wurde zu 5 ml einer 2 5^-igen Lösung von löslicher Stärke gegeben und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 40° C durchgeführt. Die verbliebene enzymatische Aktivität wurde kolorimetrisch mit Hilfe der 3,5-Dinitrosalicylsäure-Methode bestimmt.

Die verbleibende Aktivität des Enzyms wird durch den prozentualen Anteil der Aktivität des unbeweglich gemachten und verwendeten Enzyms gegenüber der Aktivität des Enzyms in freier Form dargestellt. Die Ergebnisse nach der Wiederholung der Reaktion sind in Tabelle 1 gezeigt.

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-H-

Tabelle 1

Methode zum	Prozentualer Anteil der verbliebenen Aktivität, be zogen auf die Aktivität vor dem Unbeweglichmachen	Nach 10 Vers.	Nach 100 Vers.·	Nach 200 Vers.	Nach 400 Vers.	Nach 600 Vers.
UHD ewe g-Li eil— machen des Enzyms	Nach 1 Versuch	85,1	84,3	83,6	82,4	81,1
Gemäß Bei spiel 1	85,4	33,4	27,2	24,3	20,2	18,4
Bekannte Einschluß methode *	59,6	3,2	-	-■	-	-
Adsorp tions- methode **	96,3

Unbeweglichmachen des Enzyms durch Polymerisation der gleichen Menge an 2-Hydroxyäthylmethacrylat, welches der Enzymlösung zugesetzt wird.

Unbeweglichmachen des Enzyms durch einfache Adsorption an der gleichen Menge pulverisiertem Silicagel, welches der Enzymlösung zugesetzt wird.

Ficht feststellbar.

Beispiel 2

Anstelle der in Beispiel 1 eingesetzten 0,2 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat wurden 0,14 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat und 0,06 g Methylolacrylamid verwendet und es wurde das gleiche Enzym in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 unbeweglich gemacht. Die verbliebene enzymatische Aktivität wurde in der gleichen Weise bestimmt. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

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Tabelle-2

Anzahl der	Reaktionsversuche	1	,5	10	,9	100	1
Verhiiebene	Aktivität (96)	88	87	88,

Im Vergleich mit dem Fall, in welchem nur 2-Hydroxyäthylmethacrylat verwendet wurde, war die verbliebene Aktivität etwas erhöht. Es ist ersichtlich, daß durch Zugabe von Methylolacrylamid die Löslichkeit der Monomeren modifiziert wird und daß das so gebildete Polymere aus dem ¥asser in feiner dispergiertem Zustand abgeschieden wird und daher das Enzym leichter mit dem Substrat in Berührung gebracht wird.

Beispiel 3

Anstelle der in Beispiel 1 verwendeten 0,2 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat wurden in diesem Beispiel 0,14 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat und 0,06 ml Diallylitaconat verwendet und das gleiche Enzym wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unbeweglich gemacht. Die verbliebene Aktivität wurde in gleicher Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Anzahl der	Reaktionsversuche	1	1	10	,2	100	9
Verbliebene	Aktivität (90	89,	89	88,

Im Vergleich mit dem Versuch, in welchem nur 2-Hydroxyäthylmethacrylat verwendet wurde, war hier die verbliebene Aktivität etwas erhöht. Dies ist dadurch zu erklären, daß durch Zugabe von Diallylitaconat eine dichtere vernetzte Struktur gebildet wird und dadurch das Enzym besser eingeschlossen wird.

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Beispiel 4

Ein Anteil von 600,11g Glucoamylase wurde in 0,9 ml einer Essigsäure-Puff erlö sung (pH 4,5) gelöst und die so erhaltene Enzymlösung wurde in eine Glasampulle mit einem Außendurchmesser von 1 cm gegeben. Dann wurde 0,2 g Kaolin zugesetzt. Nachdem das Enzym an dem Kaolin adsorbiert war, wurde 0,1 ml Triäthylenglycolmonomethacrylat zugegeben und danach wurde die Ampulle in einer Stickstoffatmosphäre zugeschmolzen. Der Inhalt der Ampulle wurde mit der Gammastrahlung von Kobalt 60 bei -52° C in einer Dosisrate von 1 χ 10 R/h während 2 Stunden bestrahlt. Dabei wurde ein poröses Polymergel in einer Polymerisationsausbeute von 87,1 % erhalten.

Dieses Gel wurde ohne Reinigung, Trocknung und Pulverisation in winzige Stücke zerteilt und zu 5 ml einer 2-%igen Maltoselösung in einer Essigsäure-Pufferlösung (pH 4,5) gegeben. Die Lösung wurde zur Durchführung der Reaktion 30 Minuten bei 40° C stehen gelassen. Die Aktivität des Enzyms wurde durch die Menge an Glucose mit Hilfe des Glucose-Bestimmungsreagenz (Nagase Sangyo K. K.) bestimmt und die verbliebene Aktivität wurde daraus berechnet. Die Ergebnisse, die bei Wiederholung der Reaktion erhalten wurden, sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Methode zum Qnbeweglich machen des Enzyms	Prozentualer Anteil der verbliebenen Aktivität, be zogen auf die Aktivität vor dem Unbeweglichmachen	Nach 10 Vers.	Nach 100 Vers.	Nach 300 Vers.	Nach 500 Vers.	Nach 700 Vers.
Gemäß Bei spiel 4	Nach 1 Versuch	78,8	78,0	77,1	76,4	75,0
Einfache Einschluß- methode *	79,1	34,9	29,8	24,1	20,2	16,4
Adsorp tions- methode **	61,4	1,4	-	-	-	-
98,2

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* Unbeweglichmachen des Enzyms durch Polymerisation der gleichen Menge Triäthylenglycolmonomethacrylat, die der Enzymlösung zugesetzt wird.

** Unbeweglichmachen des Enzyms durch einfache Adsorption an der gleichen Menge an Kaolin.

nicht feststellbar.
Beispiel 5

Ein Anteil von 100 mg eines Glucoseisomerase bildenden Strahlenpilzes (Streptomyces phaeochromogenensis) wurde aus einer Kolonie dieses Pilzes gewonnen und ohne Zerkleinerung in 4,5 ml der Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 6,9) dispergiert. Dazu wurde 1,0g pulverisierte Aktivkohle zugefügt. Nachdem die Dispersion gut mit der Aktivkohle in Berührung gebracht worden war, wurde 0,5 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat mit einem Gehalt an 5 % Äthylenglycoldimethacrylat zugesetzt. Das Gemisch wurde in eine Ampulle gegeben und die Ampulle wurde verschlossen. Es wurde dann mit Gammastrahlung von Kobalt 60 bei einer Temperatur von -78° C in einer Dosisrate von 1 χ 10 R/h während einer Stunde bestrahlt. Dabei wurde eine polymere Gelmasse, die das unbeweglich gemachte Enzym enthielt, in einer Polymerisationsausbeute von 92,9 % erhalten.

Die Gelmasse wurde in winzige Stücke zerteilt und während einer Stunde bei 40° C mit einer wässrigen Lösung zur Durchführung der Reaktion in Berührung gehalten, die 2 % Glucose als Substrat enthielt. Die enzymatische Aktivität wurde als Menge Fructose nach der Cystein-Carbazol-Methode bestimmt und der prozentuale Anteil der verbliebenen Aktivität wurde berechnet. Die bei Wiederholung der Reaktion erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

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Tabelle 5

Methode zum Unbeweglich machen des Enzyms	Prozentualer Anteil der verbliebenen Aktivität, be zogen auf die Aktivität vor dem Unbeweglichmachen	Nach 10 Vers.	Nach 100 Vers.	Nach 300 Vers.	Nach 500 Vers.	Nach 700 Vers.
Gemäß Bei spiel 5	Nach 1 Versuch	76,3	75,7	75,1	74,2	73,6
Einfache Einschluß methode *	76,4	58,4	46,9	37,1	27,0	18,4
Adsorp tions- methode **	71,4	2,1	-	-	-	-
98,2

* Unbeweglichmachen des Enzyms durch Polymerisation der gleichen Menge des vorstehend angegebenen Monomerengemisehes, welches der Enzymlösung zugesetzt wird.

** Unbeweglichmachen des Enzyms durch einfacheAdsorption an der gleichen Menge pulverisierter Aktivkohle.

nicht feststellbar.
Beispiel 6

Ein Anteil von 2500^g O(-Amylase wurde in 8 ml einer Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 6,9) gelöst und zu der Lösung wurden 4 g Gelatinepulver und 2 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat zugegeben und gut eingemischt. Das Gemisch wurde in eine lange zylindrische Glasampulle mit einem Innendurchmesser von 10 mm gegeben und beide Enden der Ampulle wurden an der Luft verschlossen. Der Inhalt der Ampulle"wurde mit Gammastrahlung von Kobalt 60 bei -78° C in einer Dosisrate von 1 χ 10 R/h während einer Stunde bestrahlt. Dabei wurde mit einer Polymerisationsausbeute von 95,8 % ein

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poröses Polymergel enthalten.

Beide Enden der Ampulle wurden abgeschnitten und eine 2 %-ige wässrige Lösung von löslicher Stärke wurde kontinuierlich in einer Fließrate von 5 ml/h bei 40° C in das obere Ende der Kolonne gegossen. Der Vorgang wurde bis zu 30 Tagen fortgesetzt.

Die verbliebene enzymatische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms in der Kolonne wurde kolorimetrisch mit Hilfe der 3,5-Dinitrosalicylsäuremethode bestimmt.

Die verbliebene Aktivität wird durch den prozentualen Anteil der Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms gegenüber der Aktivität des Enzyms in freier Form dargestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 6

Methode zum Unbeweglich machen des Enzyms	Prozentualer, Anteil der verbliebenen Aktivität, be zogen auf die Aktivität vor dem Unbeweglichmachen	Nach 10 Tagen	Nach 20 Tagen	Nach 30 Tagen
Gemäß Bei spiel 6	Nach 1 Tag	87,4	87,3	87,1
Einfache Einschluß- methode *	87,4	24,5	20,1	18,4
Adsorp- tions- methode **	32,3	-	-	-
2,0

Unbeweglichmachen des Enzyms durch Polymerisation der gleichen Menge.2-Hydroxyäthylmethacrylat, welches der Enzymlösung zugesetzt wird

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** Unbeweglichmachen des Enzyms durch Vermischen mit der gleichen Menge an Gelatinepulver

nicht feststellbar.
Beispiel 7

Anstelle der in Beispiel 6 verwendeten 2 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat wurden Gemische von 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Hexandioldiacrylat in unterschiedlichen Mengenverhältnissen verwendet und das gleiche Enzym wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 unbeweglich gemacht. Die verbliebene Aktivität wurde in gleicher Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Anteil an 2-Hydroxy- äthylmethac^lat (rnl)	1,	9	1,8	1	,7	1	,6	1	,4	1	,2
Anteil an Hexandiol- diacrylat (ml)	0,	1	0,2	0	,3	0	,4	0	,6	0	,8
Verbliebene Aktivität nach 30 Tagen konti nuierlicher Durch führung der Reaktion (%)	89,	9	89,8	90	,6	89	,9	88	,5	78	,2

Es ist ersichtlich, daß durch Zugabe von Hexandioldiacrylat die Wasseraffinität und Vernetzungsdichte des Polymeren modifiziert wurden und eine Struktur gebildet wurde, in welcher die als Substrat dienende Substanz leichter diffuniert.

Beispiel 8

Anstelle der in Beispiel 6 verwendeten 2 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat wurde ein Gemisch aus 1,5 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat, 0,3 ml Vinylpyrrolidon und 0,2 ml Äthylendimethacrylat verwendet

'6 09884/118 3-

und das gleiche Enzym wurde in gleicherweise wie in Beispiel 6 unbeweglich gemacht. Die verbliebene Aktivität des Enzyms nach 30-tägiger kontinuierlicher Durchführung der Reaktion betrug 90,2 %.

Beispiel 9

Ein Anteil von 6000 /ig Glucoamylase wurde in 7 ml der Essigsäure-Pufferlösung (pH 4,5) gelöst und zu der Lösung wurden 6,0 g Stärke und 3 ml Triäthylenglycolmonomethacrylat zugefügt und gut eingemischt. Das Gemisch wurde in eine lange zylindrische Glasampulle mit einem Innendurchmesser von 20 mm gegeben und die Ampulle wurde in einer Stickstoffatmosphäre zugeschmolzen. Der Inhalt der Ampulle wurde mit Gammastrahlung von Kobalt 60 bei -24° C in einer Dosisrate von 5 x 10 R/h während 2 Stunden bestrahlt und durch Abschneiden beider Enden der Ampulle wurde eine Kolonne, die mit dem das unbeweglich gemachte Enzym enthaltenden Polymergel gefüllt v/ar, erhalten. Die Polymerisationsausbeute betrug 91,3 %

Die enzymatische Reaktion wurde durchgeführt, indem eine 2 %-ige Maltoselösung in einer Fließrate von 4 ml/h bei 40° C durch die mit dem Polymergel gefüllte Kolonne geleitet wurde. Die verbliebene Aktivität des Enzyms in der Kolonne wurde kolorimetrisch mit Hilfe des Glucose-Bestimmungsreagenz (Nagase Sangyo K. K.) bestimmt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.

	Tabelle 8	Nach 10 Tagen	*	Nach 30 Tagen
		84,4	verbliebenen Aktivität, be vor dem Unbeweglichmachen	84,1
Methode zum Unbeweglich machen des Enzyms	Prozentualer Anteil der zogen auf die Aktivität	30,2	Nach 20 Tagen	18,0
Gemäß Bei spiel 9	Nach 1 Tag	2,1 ·	84,3	-
Einfache Einschluß methode *	84,4		24,4
Adsorp- tions- methode **	40,2	-
	10,2

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* Unbeweglichmachen des Enzyms durch Polymerisation der gleichen Menge Triäthylenglycolmonomethacrylat, die der Enzymlösung zugesetzt v/ird

** Unbeweglichmachen des Enzyms durch Vermischen mit der gleichen Menge an Stärke

nicht feststellbar
Beispiel 10

1 g Cellulose wurde in 8 ml der Essigsäure-Pufferlösung (pH 4,5) gelöst und -5 g Carboxymethylcellulose-Pulver und 2 ml 2-Hydroxyäthylmethacrylat, die 5 % Trimethylolpropantrimethacrylat enthielten, wurden zugegeben und gut eingemischt. Das Gemisch wurde in eine lange zylindrische Glasampulle gegeben, deren Innendurchmesser 10 mm betrug, und die Ampulle wurde an der Luft zugeschmolzen.

Der Inhalt der Ampulle wurde bei -48° C während 2 Stunden in einer Dosisrate von 1 χ 10 R/h mit der Gammastrahlung von Co 60.bestrahlt. Auf diese Weise wurde eine Kolonne erhalten, die mit dem das unbeweglich gemachte Enzym enthaltenden Polymergel gefüllt war, nachdem beide Enden der Ampulle abgeschnitten wurden. Die Polymerisationsausbeute betrug 96,4 %.

Die enzymatische Reaktion wurde kontinuierlich durchgeführt, indem eine 2 %-ige Celluloselösung in einer Fließrate von 6 ml/h
bei 40° C durch die Kolonne geleitet wurde. Die verbliebene Aktivität des Enzyms in der Kolonne wurde kolorimetrisch mit Hilfe der Phenolmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9
gezeigt.

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Tabelle 9

Methode zum	Prozentualer Anteil der verbliebenen Aktivität, be zogen auf die Aktivität vor dem Unbev/eglichmachen	Nach 10 Tagen	Nach 20 Tagen	Nach 30 Tagen
unDewegiicxi— machen des Enzyms	Nach 1 Tag	72,1	71,3	70,9
Gemäß Bei spiel 10	72,4	26,4	20,2	17,1
Einfache Einschluß- Qjethode *	31,4	1,1	-	-
Adsorp tions- methode **	3,4

Unbeweglichmachen des Enzyms durch Polymerisation der gleichen Menge Trimethylolpropanmethacrylat, die zu der Enzymlösung zugesetzt wird.

Unbeweglichmachen des Enzyms durch Vermischen mit der gleichen Menge an Carboxymethylcellulose.

nicht feststellbar.

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Claims

- -3Θ - Patentansprüche

1. Verfahren zum Unbeweglichmachen von Enzymen oder enzymhaltigen Zellen, bei dem das Enzym an einem Adsorptionsmittel adsorbiert wird, dadurch gekennzeichnet , daß man die Enzyme oder enzymhaltigen Zellen in einem wässrigen Medium an einem Adsorptionsmittel der Gruppe A adsorbiert, welches eine adsorptionsfähige anorganische natürliche Erde, ein synthetisches anorganisches Adsorptionsmittel, Aktivkohle, ein natürliches oder synthetisches amorphes adsorptionsfähiges Kohlenhydrat oder Polypeptid darstellt,

die so erhaltene Dispersion mit mindestens einem polymerisierbaren Monomeren der Gruppe B vermischt, der Monomere der allgemeinen Formeln

CH₂=CX-C-O-CCH₂)_n-0H oder CH₂=CX-C-O-(R¹0)_m~R²

8 S

angehören, worin R¹ eine Gruppe -CH₂CH₂- oder -CH(CH₃)CH₂-,

R ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Gruppe der Formel CH₀=CX-C- bedeuten, X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, η eine ganze Zahl von 2, 3 oder 4 und m eine ganze Zahl von 2 bis 20 bedeuten,

und das Monomere in dem Gemisch unter Bildung eines wasserunlöslichen Polymermaterials, welches die Enzyme oder enzymhaltigen Zellen eingeschlossen enthält, polymerisiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Adsorptionsmittel der Gruppe A aktive Terra alba, Bentonit, Kaolin, Aluminiumoxid, Silicagel, Molekularsiebe,

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Aktivkohle, Ionenaustauscherharze, Stärke, Amylose, Amylopectin, Cellulose, Cellulosenitrat, Celluloseacetat, Cellulosebutyrat, Cellulosephosphat, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Cyanäthylcellulose, Stärkephosphat, Stärkenitrat, Carboxymethylstärke, Hydroxyäthylstärke, Agar, Gelatine oder Collagen verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man als Monomeres B eine Verbindung der allgemeinen Formel

CH₉=CX-C-O(CH₀) -OH oder CH₀=CX-C-O-(R¹O)_7n-R² c. Ii et η d. Ii m

0 0

1 2

verwendet, worin R eine Gruppe -CHpCH₀-, R ein Wasserstoffatom, X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, η die Zahl 2, 3 oder 4 und m die Zahl 2, 3 oder 4 bedeuten.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man als Monomeres der Gruppe B 2-Hydroxyäthylmethacrylat oder Triäthylenglycolmonomethacrylat verwendet.

5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man dem Monomeren der Gruppe B ein zweites Monomeres C zusetzt, dessen Wassermischbarkeit von der des Monomeren der Gruppe B verschieden'ist, wobei der Anteil des Monomeren C bis zu 30Gew.-% des Gesamtgewichts der Monomeren beträgt.

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel der Gruppe A aktive Terra alba, Bentonit, Kaolin, Aluminiumoxid, Silicagel, Molekularsiebe, Aktivkohle, Ionenaustauscherharze, Stärke, Amylose, Amylopectin, Cellulose, Cellulosenitrat, Celluloseacetet,~Cellulosebutyrat, Cellulosephosphat, Hydroxycellulose, Carboxymethylcellulose, Cyanäthylcellulose, Stärkephosphat, Stärkenitrat, Carboxymethylstärke, Hydroxyäthylstärke, Agar, Gelatine oder Collagen einsetzt, als wassermischbares Monomeres der Gruppe B eine Verbindung der allgemeinen Formel

CH₀=CX-C-O-[CiLp)-OH oder CH₀=CX-C-O-(R¹O)-R² d. „ έ. η d. „ η

0 0

1 2

verwendet, worin R eine Gruppe -CH^CHg-, R ein Wasserstoffatom, X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, η die Zahl 2, 3 oder 4 und m die Zahl 2, 3 oder 4 bedeuten, und als zweites Monomeres C ein polyfunktionelles teilweise wassermischbares Monomeres verwendet .

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß man die Polymerisation mit Hilfe ionisierender Strahlung bei Temperaturen unter 0 C durchführt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch g e - kennzeichnet , daß man als Adsorptionsmittel Silicagel, Kaolin, Aktivkohle, Gelatine, Stärke oder Carboxymethylcellulose verwendet.

6 0 9 B 8 A / 1 1 8 3

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Monomeres B 2-Hydroxyäthylmethacrylat oder Triäthylenglycolmonomethacrylat und als zweites Monomeres
Methylolacrylamid, Diallylitaconat, Athylenglycoldimethacrylat, Hexandioldiacrylat, Vinylpyrrolidon oder Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.

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