DE2501840C3 - Verfahren zur Unlöslichmachung eines Enzyms - Google Patents

Verfahren zur Unlöslichmachung eines Enzyms

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DE2501840C3 DE2501840A DE2501840A DE2501840C3 DE 2501840 C3 DE2501840 C3 DE 2501840C3 DE 2501840 A DE2501840 A DE 2501840A DE 2501840 A DE2501840 A DE 2501840A DE 2501840 C3 DE2501840 C3 DE 2501840C3
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unlöslichmachung eines Enzyms durch die Bindung des Enzyms an ein Pfropf-Copolymeres.
Enzyme sind natürliche Katalysatoren von proteinischem Charakter und sind gewöhnlich wasserlöslich. In den letzten Jahren hat die Verwendung von Enzymen in kommerziellen und industriellen Verfahren aufgrund ihrer leichten Handhabbarkeit, ihrer hohen Spezifität und ihrer schnellen Wirkung immer größere Beachtung gefunden. Da Enzyme relativ teuer sind, ist es aus ökonomischen Gründen wünschenswert, die Enzyme in mehreren Ansätzen oder — bei einem kontinuierlichen Verfahren — über eine verlängerte Zeitdauer verwenden zu können und die Verluste an Enzymen zu vermeiden, die durch Abgang zusammen mit dem Reaktionsprodukt entstehen. So wurde schon vorgeschlagen, die Enzyme an einen unlöslichen Träger
chemisch zu binden, d.h. Enzym/Träger-Verbünde herzustellen. Dabei wurde jedoch gefunden, daß die Aktivität der nach den bekannten Verfahrensweisen unlöslich gemachten Enzyme wesentlich geringer ist als die der korrespondierenden natürlichen Enzyme.
So wird in der DE-OS 2317 352 eine perlförmige Zusammensetzung beschrieben, auf der Grundlage eines durch ein Cyanhalogenid aktivierten wasserunlöslichen Polysaccharids oder Polysaccharidderivats, das als Matrize zur Kupplung aminogruppenhaltiger Substanzen geeignet ist, die eine zur Verringerung des pH-Werts ihrer wäßrigen Lösung auf unterhalb etwa 5 wasserlösliche Säure, mindestens ein wasserlösliches Polysaccharid und 0 bis 4% Wasser enthält Diese Zusammensetzung unterscheidet sich von der vorliegenden Erfindung dadurch, daß die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur ^solubilisierung eines Enzyms betrifft, bei dem spezifische Verbindungen auf die Oberfläche tines inerten polymeren Trägers aufgepfropft werden und dieser Träger dann mit einem Cyanhalogenid aktiviert wird. Erfindungsgemäß wird eine spezifische Umwandlung der Nitrogruppe an dem Pfropfmolekül in einer Amino-, Diazo- oder Isothiocyanatogruppe durchgeführt Im Gegensatz dazu findet diese Umwandlung bei den bekannten Zusammensetzungen nicht statt. Die bekannten Zusammensetzungen können nur mit Substanzen verwendet werden, die an das Substrat gebunden werden können.
Es wird angenommen, daß bei den bekannten Enzym/Träger-Verbunden die Enzymmoleküle an den Träger in gleichförmiger Verteilung über die dreidimensionale Struktur des Trägers gebunden sind. Ein wichtiger Faktor, der die Reduktion der Aktivität von unlöslich gemachten Enzymen bestimmt, ist die Zeit, die das Substrat zur Diffusion von der Lösung durch den Träger bis zu dem gebundenen Enzymmolekül und das Reaktionsprodukt zur Diffusion vom Ort seiner Entstehung in die Reaktionslösung braucht.
Es wurde nun gefunden, daß lange Diffusionszeiten und verringerte Aktivitäten vermieden werden, wenn die gebundenen Enzymmoleküle im wesentlichen auf der Oberfläche des Trägers sitzen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Unlöslichmachung eines Enzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
0 p-Nitrostyrol oder p-Nitrophenylacrylat auf die Oberfläche eines inerten polymeren Trägers aufpfropft,
ii) die Nitrogruppe der aufgepfropften Moleküle in eine Amino-, Diazo- oder Isothiocyanatgruppe
überführt und
iii) das Enzym an die Amino-, Diazo- oder Isothiocyanatgruppe kovalent bindet, wobei ein enzymatisch aktiver Enzym/Träger-Verbund erhalten wird.
Der inerte polymere Träger kann irgendein geeignetes natürliches oder synthetisches Basispolymeres sein, auf welches p-Nitrostyrol oder p-Nitrophenylacrylat aufgepfropft ist Bevorzugte Träger sind Polyvinylchlorid, Polyäthylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyacrylamid, Cellulose, Wolle und langkettige Kohlenhydrate wie Stärke und modifizierte Dextrose, z. B. »Sephadex« (eingetragenes Markenzeichen). Der am meisten bevorzugte Träger ist Polyvinylchlorid, das in einem flüssigen Medium dispergiert ist, in welchem es im wesentlichen unlöslich ist
Der Träger kann die Gestalt von Perlen, Pellets, Pulver, Platten, Röhrchen oder dgl. haben. Gegebenenfalls kann der polymere Träger selbst eine aufgepropfte polymere Hülle haben, wobei auf den Kern eines Polymeren, z.B. Polypropylen, eine Hülle ausgehend von einem Monomeren, z. B. Styrol, aufgepfropft ist
Enzyme sind sowohl der chemischen, als auch der physikalischen Inaktivierung zugänglich. Das Verfahren der Erfindung sollte daher in einer Weise durchgeführt werden, die die bekannten Ursachen der Inaktivierung vermeidet Wenn daher die Verwendung einer Diaza- oder Amino- oder Isothiocyanatgruppe die Inaktivierung eines bestimmten Enzyms zur Folge hat, so sollte eine der anderen Gruppen zur Herstellung des Enzym/Träger-Verbunds mit diesem bestimmten Enzym eingesetzt werden.
Das Aufpfropfen von p-Nitrostyrol oder p-Nitrophenylacrylat auf das Basispolymer wird vorzugsweise durch ultraviolette oder ionisierende Strahlen induziert Die Strahlung kann dabei von irgendeiner geeigneten Quelle herstammen, z. B. einer Röntgen-, γ- oder Elektronen-Strahlquelle. Geeignete Bedingungen zum Aufpfropfen irgendeines der Monomeren auf ein gegebenes Basispolymer sind an und für sich bekannt, jedoch sollten insbesondere die folgenden Punkte beachtet werden:
(1) Die Bestrahlung wird vorzugsweise in einer hohen Dosisrate und für eine kurze Zeit abgegeben. Dadurch wird das Aufpfropfen auf der Oberfläche gegenüber dem Aufpfropfen innerhalb des Trägers maximiert.
(2) Das Lösungsmittel sollte vorzugsweise den Träger nicht zum Quellen bringen; denn dadurch würde das Aufpfropfen auf der Oberfläche relativ vermindert.
(3) Die Umsetzung sollte in der Weise ausgeführt werden, daß nur eine möglichst geringfügige Homopolymerisation des Monomeren stattfindet.
(4) Die Umsetzung wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel durchgeführt, in welchem der Träger unlöslich und das Monomere löslich ist.
In einem typischen Beispiel wird eine Dosis von 1 bis 10 Mrad bei einer Dosisrate von 10 krad/h bis 1 Mrad/sec, am meisten bevorzugt von 50 krad/h bis 1 Mrad/min, in Luft genommen, wobei der Träger Polypropylen- oder Polyvirylchloridpulver in einer 1 bis 40 Gew.-%igen monomeren Lösung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. Dimethylformamid oder Methanol, suspendiert ist
Die Nitrogruppe des Monomeren kann in an sich bekannter Weise zu einer Amino-, Diazo- oder Isothiocyanatgruppe reduziert werden. Wenn die Nitrogruppe zu einer Aminogruppe reduziert wird, kann das Enzym an die Aminogruppe unter Verwendung eines Kondensationsmittels wie N.N-Dicyclohexylcarbodiimid oder N-Äthyl-5-phenylisoxazoli-
um-3-sulfonat, kovalent gebunden werden. Alternativ kann die Aminogruppe in eine Diazo- oder Isothiocyanatgruppe übergeführt werden, an die das Enzym direkt gebunden werden kann.
Es wird angenommen, daß die erfindungsgemäße Umsetzung spezifisch für p-Nitrostyrol und p-Nitrophenylacrylat ist Die Tabelle I zeigt die Spezifität der Reaktion und den Unterschied zwischen p-Nitrostyrol und m-Nitrostyrol als Reaktanten.
Tabelle 1
% Monomer, aufgepfropft auf Polypropylen11) ausgehend von verschiedenen Monomeren
Monomer
% aufgepfropftes Monomer11)
p-Nitrostyrol
m-Nitrostyrol
p-Nitrophenylacrylat
a) Polypropylenpulver (5 g), suspendiert in einer 30%-igen monomeren Lösung in DMF (6 ml); Bestrahlung: Dosis 3 Mrad, Dosisrate 200 rad/h in Luft, Cobalt 60-Strahlungsquelle.
b) Berechnet aufgrund der Elementaranalyse.
Die nachfolgende Tabelle II zeigt das Aufpfropfen von p-Ntrostyroi auf verschiedene Basispolymere. Die Proben wurden wie üblich unter Verwendung von Polypropylen, hoch-dichtem Polyäthylen, niedrig-dichtem Polyäthylen und Polyvinylchlorid (PVC) als Basispolymere hergestellt. '
Zusätzlich wurden einige Proben von unterschiedlicher Beschaffenheit bestrahlt. Darunter fallen (a) Basispolymere, bestehend aus einem PolypropyJenkern, auf den Styrol zuvor bis zu einem Ausmaß von 10% (w/w) aufgepfropft wurde; (b) PVC gelöst in einer 50%igen Lösung von p-Nitrostyrol in Dimethylformamid (DMF); und (c) PVC suspendiert in einer 30%igen Lösung von p-Nitrostyrol in Methanol. Da PVC in DMF löslich war, wurde die Probe unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel hergestellt mit dem Ziel, die Effekte beim Aufpfropfen auf Lösliches und Unlösliches zu vergleichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt; sie lassen erkennen, daß unter denselben Bestrahlungsbedingungen die PVC-Proben einen erheblich höheren aufgepfropften Anteil ergaben als die
so anderen Polymeren. Es ist weiter ersichtlich, daß PVC, wenn es im unlöslichen Zustand aufgepfropft wurde, einen doppelt so hohen aufgepfropften Anteil aufwies, als bei Aufpfropfung im gelösten Zustand. Die nachstehend aufgeführten Proben wurden in ihre Isothiocyanatderivate übergeführt, und danach wurde das Enzym Trypsin daran gebunden.
Tabelle II
Verschiedene Basispolymere mit p-Nitrostyrold) hfl als Monomer
Basispolymer
% aufgepfropftes Monomera)
Polypropylen (PP) 5
Niedrig-dichtes Polyäthylen (NDPE) 4
' Hoch-dichtes Polyäthylen (HDPE) 3
Fortsetzung
Basispolymer
% aufgepfropftes Monomer1)
Polyvinylchlorid (PVC 1) 8
Polyvinylchlorid11) (PVC 2) 13
Polyvinylchloride (PVC 3) 15
Polystyrol-g-polypropylen (PS) 4
a) Berechnet aufgrund der Elementaranalysen.
b) 50% p-Nitrostyrol in DMF.
c) 30% p-Nitrostyrol in Methanol.
d) Basispolymer (5 g), suspendiert in einer 30%-igen monomeren Lösung in DMF (6 ml); Bestrahlung: Dosis 3 Mrad Dosisrate 200 krad/h in Luft, Cobalt-60-Strahlungsquelle.
Tabelle V
Effekt der Gesamtstrahlungsdosis auf das Aufpfropfen auf lösliches PVC3)
Gesamtstrahlungsdosis (Mrad) % Pfropf-Copolyniier13)
1 6.0
2 tf.2
3 8.9
4 9.1
a) PVC (Ig), gelöst in 30% p-Nitrostyrol in DMF (5 ml); Bestrahlung: Dosisrate 200 krad/h in Luft, Cobalt-60-Strahlungsquelle.
b) Berechnet aufgrund der Elementaranalysen.
Die nachfolgende Tabelle IH zeijjt die Aktivität der 20 Trypsin/Polymer-Verbunde, die durch Bindung des Enzyms Trypsin an die Pfropf-Copolymeren aus Tabelle II erhalten werden.
Tabelle VI
Wirkung der Gesamtstrahlungsdosis beim Aufpfropfen auf unlösliches PVC3)
Tabelle III Esterase-Aktivität")
ja
Analyse der Trypsin/Polymer-Verbunde ja
Enzym/Träger-Verbund ja
pp-Trypsin ja
NPDE-Trypsin ja
HDPE-Trypsin ja
PVCl-Trypsin ja
PVC2-Trypsin
PVC3-Trypsin
PS-Trypsin
a) Spektrometrisches Verfahren unter Verwendung von BAEE als Substrat
b) Die Aktivität erwies sich als proportional zu der an den Träger gebundenen Menge an Protein (Enzym).
Die nachfolgende Tabelle IV zeigt die Auswirkung bei wachsender Monomerenkonzentration im Reaktionsmedium und die Tabellen V und VI die Auswirkung bei Anstieg der Gesamtstrahlungsdosis jeweils auf das Aufpfropfen von Monomer auf Polymer.
Tabelle IV
Monomer, aufgepfropft bei verschiedenen Monomerenkonzentrationen")
% Monomer
% aufgepfropftes Monom er*J
Gesamtstrahlungsdosis (Mrad)
25 % aufgepfropftes
Monomer Ό
8.3
11.7
11.9
18.8
35
40
45
50
12.0
20.6
21.6
24.4
39.0
6.6 6.8 9.0 8.9
14.4
a) PVC-Pulver (1 g), gelöst in verschiedenen Konzentrationen von p-Nitrostyrol in DMF (5 ml); Bestrahlung: Gesamtdosis 3 Mrad, Dosisrate 200 krad/h in Luft, Cobalt 60-Strahlungsquelle.
b) Berechnet aufgrund der Elementaranalyse.
55
eo
65 PVC (Ig), suspendiert in 33% p-Nitrostyrol in Methanol (5 ml); Bestrahlung: bei 200 krad/h in Luft aus einer Cobalt-60-Strahlungsquelle.
b) Berechnet aufgrund der Elementaranalyse.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
(a) Die Herstellung eines auf der Oberfläche
aufgepfropften innerlich inerten Copolymeren,
Poly-(p-nitrostyrol)-g-PoIypropylen,
unter initiierung durch ionisierende Strahlung
Polypropylenpulver wird in einer Lösung von p-Nitrostyrol in Ν,Ν-Dimethylformamid oder Methanol (30%) suspendiert und diese Suspension wird einer y-Bestrahlung von einer Gesamtdosis von bis zu 10 Mrad bei einer Dosisrate von 200 bis 400 krad/h aufgesetzt. Aus dem Reaktionsprodukt werden Nitrostyrolmonomere und Homopolymere durch 75stündige Extraktion mit einem Gemisch aus Chloroform und benzol (3:1) in einem Soxhlet-Extraktor abgetrennt. Das extrahierte Produkt wird zur Entfernung von Chloroform und Benzol für weitere 24 Stunden in einem Soxhlet-Extraktor mit Methanol extrahiert. Anschließend wird es zur Entfernung von Methanol im Vakuum bei 70° C getrocknet. Die Elementaranaiyse zeigte einen aufgepfropften Anteil von 4% an.
(b) Die Reduktion des Poly-(p-nitrostyrol)-g-polypropylene zu Poly-(p-aminostyrol)-g-polypropyleifi
Das erhaltene Copolymer (10 g) wird in einen 500 ml Zweihals-Kolben in etwa 100 ml Ν,Ν-Dimethylformamid eingebracht. Dann wird unter Rühren im Ölbad auf 100°C erhitzt und eine Lösung von Zinn-(II)-chlcirid, SnCl2 · 2 H2O(IOO g) in Ν,Ν-Dimethylformamid (25 ml)
zugegeben; das Rühren bei 100°C wird noch 6 Stunden fortgesetzt. Nach Zusatz von 100 ml 10 molarer Salzsäure wird weitere 6 Stunden bei 1000C gerührt. Anschließend wird das gekühlte Reaktionsgemisch durch einen Sinterglas-Büchner-Trichter gefiltert und das Harz wird abwechselnd mit Ν,Ν-Dimethylformamid (6 χ 50 ml) und Salzsäure (6 N, 6 χ 50 ml) gewaschen, zuletzt mit Ν,Ν-Dimethylformamid (50 ml).
(c) Überführung des Poly-(p-aminostyrol)-
g-polypropylens in Poly-(p-isothiocyanato-
styrol)-g-polypropylen.
Das Harz wird mit einem Gemisch aus Ν,Ν-Dimethylformamid (90 ml) und Triälhylamin (5 ml) behandelt. Zur vollständigen Neutralisation wird noch 10 Minuten gerührt, und das Harz wird sodann gefiltert und mit Ν,Ν-Dimethylformamid gewaschen. Anschließend wird das Harz in einen 3-Hals-Kolben (500 ml) in Ν,Ν-Dimethylformamid (100 ml) eingebracht und auf etwa 4°C gekühlt. Sodann wird unter heftigem mechanischen Rühren gleichzeitig tropfenweise Schwefelkohlenstoff (25 ml) und Triäthylamin (50 ml) hinzugefügt. Nach Auffüllung des Reaktionsgemisches mit Ν,Ν-Dimethylformamid, bis der Kolben fast voll ist, darf das Reaktionsgemisch unter fortgesetztem heftigen Rühren im Verlauf von 4 Stunden Raumtemperatur annehmen. Nach dem erneuten Abkühlen auf 4° C wird Chlorameisensäureäthylester (45 ml) tropfenweise und unter Rühren hinzugefügt, wonach das Reaktionsgemisch im Verlauf von 12 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt wird. Das Harz wird filtriert und mit Chloroform gewaschen, bis alles sichtbare Triäthylammoniumchlorid entfernt worden ist Schließlich wird mit Pyridin (50 ml) und dann mit Methanol (5 χ 50 ml) gewaschen und im Vakuum bei 5O0C getrocknet.
(d) Die kovalente Bindung des Enzyms Trypsin an
Poly-(p-isothiocyanatostyrol)-g-polypropylen
Das Harz (500 mg) wird in einem Bicarbonat-Puffer (pH 9,6; 0,1 M; 10 ml) suspendiert und unter leichtem Schütteln auf 5° C gekühlt. Die Suspension wird mit einer Lösung von Trypsin in einem Bicarbonat-Puffer (10 mg/ml, 5 ml) versetzt. Nach 16stündigem Schütteln bei 5° C wird die Suspension zentrifugiert und die
10
15
20
25
30
35 überstehende Flüssigkeit abdekantiert. DerTrypsin/Copolymer-Verbund wird mit Wasser gewaschen und zur Entfernung der ungebundenen Enzyme zentrifugiert. Anschließend wird der Verbund gefriergetrocknet.
Zur Bestimmung der Trypsin-Aktivität wird der Verbund (20 mg) in einem Phosphatpuffer (pH 7,6; 0,1 M; 1,0 ml) bei 37°C suspendiert. Eine Lösung von Ν,Ν-Dimethylcasein (käuflich bei BDH Chemicals Limited, Poole, Dorset, England) in einem Phosphatpuffer (0,05%; 1,0 ml) wird zugsetzt, und das Gemisch wird 30 Minuten lang inkubiert. Zur Beendigung der Proteolyse wird das Reaktionsgemisch in einem Reagenzglas 20 Sek. auf 100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird ein Boratpuffer (pH 10,0; 0,1 M; 1,0 ml) zugesetzt und das Gemisch bei 25°C equilibriert. Eine "wäßrige Lösung von 2,4,6-Triniifubenzoisuifonsäure (1,1 M; 20 μΐ) wird zugesetzt und das Gemisch wird bei 25°C 25 Minuten unter Schütteln inkubiert. Die Trinitrophenylierung der freien Aminogruppen in der enzymatischen Zusammensetzung wird durch Zusatz einer frisch bereiteten Lösung von Natriumdihydrogenphosphat (0,2 M, 2,0 ml) und Natriumsulfit (0,8 mg) beendet. Nach dem Zentrifugieren wird die molare Konzentration an trinitrophenylierten Aminogruppen — und damit die gespaltenen Peptid-Bindungen — spektrofotometrisch bei 420 nm gegen einen Standard bestimmt, der den Phosphatpuffer ohne Zusatz des Enzymverbunds enthält.
Beispiel 2
Die Herstellung des auf der Oberfläche
aufgepfropften, innerlich inerten Copolymeren
Poly-(p-nitrostyrol)-g-polypropylen
durch UV-Bestrahlung
Polypropylenpulver wird in eine Lösung von p-Nitrostyrol in Methanol (30%) mit einem Gehalt an -Benzoinäthyläther (10%) suspendiert und die Suspension wird magnetisch gerührt Sodann wird die Lösung mit UV-Strahlen aus einer Wotan-W2-Lampe aus einer Entfernung von 10 cm 4 Stunden lang bestrahlt. Nach Beendigung der Bestrahlung wird wie in Beispiel 1 aufgearbeitet. Der Anteil des aufgepfropften Monomeren betrug 11,5%.
•30 249/171

Claims (11)

25 öl 840 Patentansprüche:
1. Verfahren zur Unlöslichmachung eines Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man
i) p-Nitrostyrol oder p-Nitrophenylacrylat auf die Oberfläche eines inerten polymeren Trägers aufpfropft,
ii) die Nitrogruppe der aufgepfropften Moleküle in eine Amino-, Diazo- oder Isothiocyanatgruppe überführt, und
In) das Enzym an die Amino-, Diazo- oder Isothiocyanatgruppe kovalent bindet, wobei ein enzymatisch aktiver Enzym/Träger-Verbund erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der polymere Träger Polyvinylchlorid, Polyäthylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyacrylamid, Wolle, Cellulose oder ein langkettiges Kohlenhydrat ist
3. Verfahren nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomere auf den polymeren Träger in einem Lösungsmittel aufgepfropft wird, in welchem das Monomere löslich und der polymere Träger unlöslich ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufpfropfen des Monomeren auf das Poljmer durch UV- oder ionisierende Strahlung initiiert wird
5 Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die UV- oder ionisierende Strahlung in hoher Dosis angewandt wird zum Zwecke der Maximierung der Oberflächenaufpfropfung des Monomeren auf den polymeren Träger.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die UV- oder ionisierende Strahlung in einer Dosis von 1 bis 10 Mrad (Megarad) bei einer Dosisrate von 50 krad/h bis 1 Mrad/min angewandt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomere in der Lösrag in einer Menge von 1 bis 40 Gew.-% enthalten ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitrogruppe des Monomers zu einer Aminogruppe reduziert und mit Hilfe eines Kondensationsmittels an das Enzym kovalent gebunden wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Kondensationsmittel Ν,Ν-Dicyclohexyl-carbodiimid oder N-Äthyl-5-phenylisoxazoIium-3-sulfonat ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitrogruppe des Monomeren zu einer Aminogruppe reduziert und anschließend in eine Diazo- oder Isothiocyanatgruppe übergeführt wird, bevor die kovalente Bindung direkt an das Enzym geschlossen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Trypsin uder ein anderes proteolytisches Enzym ist
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179401A (en) * 1971-07-08 1979-12-18 Garnett John L Preparation of heterogeneous catalysts including the steps of radiation grafting of an alpha unsaturated monomer to a metal or to an organic polymer
US4210723A (en) * 1976-07-23 1980-07-01 The Dow Chemical Company Method of coupling a protein to an epoxylated latex
US5241012A (en) * 1987-05-19 1993-08-31 Applied Immune Sciences, Inc. Activated and conjugated polystyrene substrate
DK55990D0 (da) * 1990-03-02 1990-03-02 Risoe Forskningscenter Faste baerematerialer til anvendelse i biosystemer
WO2001059455A2 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Acspurt B.V. Immobilization of bioactive species
US20030068317A1 (en) * 2001-04-20 2003-04-10 William Lee High capacity methods for separation, purification, concentration, immobilization and synthesis of compounds and applications based thereupon
US20080070274A1 (en) * 2001-12-10 2008-03-20 William Lee High capacity, methods for separation, purification, concentration, immobilization and synthesis of compounds and applications based thereupon
GB2407467B (en) * 2003-10-24 2007-01-10 Guy Darell Unwin Food heating
EP2669009A1 (de) * 2012-05-31 2013-12-04 Studiengesellschaft Kohle mbH Verfahren zur Immobilisierung von Katalysatoren auf Textilmaterialien, hergestellte Textilmaterialien und Verwendung dieser Materialien

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3247133A (en) * 1956-06-18 1966-04-19 American Mach & Foundry Method of forming graft copolymer ion exchange membranes
BE547688A (de) 1957-10-26
GB1172768A (en) * 1966-04-26 1969-12-03 Ici Australia Ltd New Graft Copolymers

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Publication number Publication date
FR2258395A1 (de) 1975-08-18
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AU7722475A (en) 1976-07-15

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