DE2429398A1 - Verfahren zum unloeslichmachen von aktiven proteinen - Google Patents

Verfahren zum unloeslichmachen von aktiven proteinen

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DE2429398A1
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Emile Braye
Jean-Pierre Mareschi
Suzanne Sebesi
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Orsan
Air Liquide SA
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Orsan
Air Liquide SA
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    • Y10S530/813—Carrier is a saccharide
    • Y10S530/814—Cellulose or derivatives thereof

Description

Dr. Hans-Heinrich Willrath
Dr. Dieter Weber DipL-Phys. Klaus Seiffert
PATENTANWÄLTE
D —62 WIESBADEN 18. Juni 1974
2429398 ?"*ϋ1327_ _ _. I/Wh
Gustav-Freytag-Straße 25 •S (06121) 372720 Telegrammadresse: WILLPATENT
Serie 2081
L'Air Liquide, Societe Anonyme pour 1'Etude et I1Exploitation des Procedes
Georges Claude, 75, Quai1d'Orsay, 75007 Paris und Orsan, les Produits Organiques du Santerre,,16 - 18, rue Ballu, 75009 Paris, Frankreich
Verfahren zum Unlöslichmachen von aktiven Proteinen
Priorität; E.N. 73 22.627 vom 21. Juni 1973 in Frankreich
Die Erfindung betrifft die Unlöslichmachung von aktiven Proteinen durch Kombination einer chemischen Aktivierung des Trägers und Vernetzung der aktiven Proteine und des Trägers mittels intermolekularen Drücken. Der Träger spielt also eine aktive Rolle in der Vernetzungsstufe. Bekanntlich besteht ein erhebliches Interesse an der Unlöslichmachung von Enzymen, und die
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Bilanz von Verfahren zur Herstellung von Präparaten von auf einem unlöslichen Träger fixierten Enzymen ist von mehreren Verfassern, insbesondere I.H. Silman und E. Katchalski, Ann. Rev. Biochem. (1966) 35 873, Guilbault (1970), Anal. Chem. 42 5 334 R. und P. Cuatrecäsas und Mitarbeitern (1971) Ann. Rev. Biochem. 259 beschrieben wurden. Die Unlöslichmachung von Enzymen ist nach vier grundsätzlichen Arbeitsweisen durchgeführt worden.
Sie kann durch physikalische Adsorption an einem inerten Träger oder an Ionenaustauschharzen erfolgen. Bei der Adsorption gibt es indessen eine ständige Gefahr der Enzymdesorption, und die Anwendung ist deshalb begrenzt. Der Ionenaustausch ist zum ersten Mal 1966 zur Adsorption einer Amylocylase an Dimethylaminoäthylcellulose ausgenutzt worden. Bernfeld und Wan (Science 142, 678, 1963) haben als erste eine Technik zum Unlöslichmachen durch Einschluß in den Poren eines Gels beschrieben.
Die Fixierung durch covalente Bindung an einen in Wasser unlöslichen Träger ist am häufigsten verwendet worden. Die erhaltenen Enzymderivate bieten allgemein beachtenswerte Eigenschaften, hinsichtlich der Widerstandsfähigkeit gegen verschiedene Denaturierungsfaktoren. Die Fixierung wird vermittels funktioneller Gruppen des Enzyms durchgeführt, die nicht die aktive Fläche beeinträchtigen. Bei dieser Art der Unlöslichmachung lassen sich eine Fixierung auf dem vorher aktivierten Träger und eine Fixierung mittels eines polyfunktionellen Agens unterscheiden.
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Bei der Fixierung auf einem aktivierten Träger wird eine funktioneHe Gruppe des Trägers genügend reaktionsfähig gemacht, um auf das Enzym einwirken zu können. E. Brown (1970) Tetrahedron 25, 2i39;Axen (1967) Nature 214, 1302, Porath (1967) Nature 215, 1491, P. Monsan (1971) CR. Acad. Sc. Paris, 273, Seiten 33 bis 36 Serie undfranzösische Patentschrift 2 133 370 beschreiben die grundsätzlichen Methoden, die auf diesem Prinzip beruhen.
Bei der Unlöslichmachung vermittels eines polyfunktioneilen Agens wird dieses zunächst auf dem Träger fixiert und dann das Enzym damit in Kontakt gebracht. Beispiele von polyfunktioneilen Mitteln sind von Kay (1967) Nature 216, 514, H.H. Weetall (1968) Eiochim. Biophys. Acta 185, 464 und Neurath (1970) FEBS-Briefe 8, 5, 253 angegeben worden. Unter den bei diesen verschiedenen Methoden untersuchten unlöslichen Trägern trifft man besonders auf Cellulose und ihre Derivate. Micheel und Envers (Makromol. Chem. 3, 200, 1949)" haben zum ersten Mal die Methode mit Azid von Curtins eingesetzt, um die Cellulose zu aktivieren und darauf die Enzyme zu fixieren. Parallel zu dieser Aktivierungstechnik der Cellulose und ihrer Derivate wurde die Methode mit Bromacetyl von Jagendorpf (Biochem. Biophys. Acta 78, 516, 1963) beschrieben, welche die Bildung einer Diazoverbindung nach Campbell u.a. (Proc. Nat. Acad. Sc. U.S. 37, 575, 1951), diejenige mit Carbodiimid von Weetall (Anal. Biochem. 14, 159 - 162, 1966) und diejenige mit Cyanohalogeniden von Axen u.a. (Nature 214, 1302 - 1304) umfaßt.
Unter den durch diese Methoden fixierten Enzymen sind Peroxydasen, Chymotrypsin, Trypsin, Polynucleotid-Phosphoryläse,
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ß-Galactosidase, eine Lactat-Deshydrogeriase und Bromelain beschrieben worden.
Eine andere interessante Methode zur Unlöslichmachung ist unter der Bezeichnung der Vernutzung durch covalente Bindung des Enzyms durch bifunktionelle Mittel bekannt. Diese Methode besteht darin, daß man ihre Enzymmoleküle (frei oder adsorbiert) unter sich vermittels eines polyfunktionellen Reaktionsmittels nach einer der Techniken verbindet, die in den Arbeiten von Silman und Katchalski Ann. Rev. Biochem. (1966) 35873, Heynes (1969) Biochem. Biophys. res. Commun 36, 235, Selegny (1968) CR. Acad. Sei. 266, 1431 und in der französischen Patentschrift 1 604 982 beschrieben sind. Die Methoden der chemischen Fixierung von Enzymen besitzen jedoch Mangel. Insbesondere ist festzustellen, daß die Ausbeuten niedrig, die Gestehungskosten hoch und die Enzyme häufig während der Fixierungsphase denaturiert sind.
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Unlöslichmachen von aktiven Proteinen durch Kombination einer chemischen Aktivierung des Trägers und Vernetzung der Proteine und des Trägers mittels intermolekularer Brückenbildung. Die Methode der chemischen Aktivierung des Trägers ist ein einfaches Verfahren, das gestattet, eine große Zahl von funktioneilen Gruppen zu fixieren, die sich mittels Anlagerungsmethoden an die Enzyme anlagern lassen, die am wenigsten denaturierbar sind.
Gemäß der Erfindung wird die unlöslichmachung von aktiven Proteinen durchgeführt, indem man zunächst die chemische Aktivierung des Trägers bestehend aus einem Polymer mit ursprünglich
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freien Hydroxyl- oder Carboxylgruppen durch ein Halogenierungsmittel in organischen Lösungsmitteln durchführt und dann eine der Aminogruppen fixiert, indem man den aktivierten Träger in dem organischen Lösungsmittel mit bifunktionellen Aminierungsmitteln fixiert; außerdem nimmt man die Vernetzung der aktiven Proteine durch Behandlung der chemisch aktivierten Träger mit dem zu vernetzenden Protein vor und gibt dann den intermolekularen Brückenbildner hinzu.
Der unlösliche Träger kann unter Cellulose und ihren Derivaten, insbesondere Carboxymethylcellulose, Polyacrylsäure, Methylmetacrylsäure, Polyaminosäuren, die man aus basischen oder sauren Aminosäuren erhält, und Polyvinylalkohol ausgewählt werden.
Das bei der chemischen Aktivierung verwendete Halogenierungsmittel kann unter Thiony!halogeniden, Sulfury'lhalogeniden, PhosphQrtri— und -pentahalogeniden, Phosporoxyhalogeniden und p-Toluolsulfoxidhalogeniden ausgewählt werden. Gemäß einer Durchführungsweise der Erfindung erfolgt die chemische Aktivierung in der Wärme bei einer Temperatur von höchstens 90° c.
Entsprechend dieser Aufgabe der Erfindung besteht das in der Aktivierungsphase benutzte organische Lösungsmittel aus einem gegebenenfalls substituierten aromatischen Kohlenwasserstoff, wie Benzol, Halogenbenzol, Nitrobenzol, Benzonitril, Toluol oder Xylol. Das organische Lösungsmittel kann unter Dimethylformamid, Formamid und Dimethylsulfoxid ausgewählt werden.
Gemäß einer vorteilhaften Ausfuhrungsform der Erfindung kann das organische Lösungsmittel eine geringe Menge.Pyridin in der Größenordnung von einigen Prozenten enthalten.
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Nach einer anderen Ausfuhrungsform der Erfindung nimmt man die chemische Aktivierung in der Kälte, d.h. bei einer Temperatur zwischen O C und Umgebungstemperatur vor. Das Pyridin ist bei Durchführung der Aktivierung in der Kälte das bevorzugte Lösungsmittel.
Man kann jedoch vorteilhafte Abwandlungen vornehmen, indem man Gemische aus einem starken Anteil Pyridin ergänzt entweder mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff, wie vorstehend beschrieben, oder mit Dimethylformamid, Formamid und Dimethylsulfoxid benutzt.
Gemäß der Erfindung kann das durch das Halogenierungsmittel in aktiven Kontakt gebracht bifunktionelle Aminierungsmxttel aus Verbindungen ausgewählt werden, die durch die Formeln NH2-NH2, NH3-R1-NH2 und HN-R1-NH
R2 R3-
wiedergegeben werden. Hierin bedeutet R1 einen Alkylrest mit höchstens 20 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit mindestens einem Phenylring oder einem Hydroxyalkylrest, der höchstens 20 Kohlenstoffatome enthält, R2 und R^ gleich oder verschieden sind und einen niederen Alkylrest oder einen Phenylkern bedeuten.
Gemäß einem Merkmal der Erfindung werden die aktiven Proteine und der chemisch aktivierte Träger durch intermolekulare Brükkenbildner vernetzt. Hierfür kann man bekannte polyfunktionelle Mittel, wie Glutaraldehyd oder Bisdiazobenzidin benutzen. Es wurde gefunden, daß der Brückenbildner auch aus einem Dihalogenaceton, insbesondere Dichloraceton, bestehen kann.
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Das Verfahren der Erfindung ist anwendbar auf jedes Protein, wie eine Protease, Amylase, Lipase oder Ribonuclease. Die Erfindung hat weite Anwendungsbereiche hinsichtlich der Fixierung von Enzymen auf einem Träger unter guten physikochemisehen Bedingungen und Ausbeuten. Das übliche Anwendungsgebiet ist die enzymatisch^ Katalyse, insbesondere von enzymatischen Reaktoren. Die Verbesserung der Haltbarkeitseigenschaften der fixierten Enzyme bietet die Möglichkeit ihrer Verwendung auf allen Anwendungsgebieten, wo die freien Proteine benutzt werden und wo sie eine genügende Haltbarkeit besitzen: In gewissen Detergenszusammensetzungen oder in der Nahrungsmittelindustrie, wie Klärung des Bieres und Entfernung unerwünschter Proteine.
Die Fixierung von Aminogruppen auf der Cellulose kann besondere Verwendungen dieser modifizierten Polysaccharide, wie Membranen- und Anionenaustauscher, gestatten.. Es lassen sich also auf diese Weise Anwendungsgebiete der Cellulose finden und das Verfahren bei Membranen auf Grundlage von Cellulose mit aktiven Proteinen ausnutzen. Cellulose wird in verschiedenen technischen Chromatographiemethoden stark verwendet. Sie kann daher nach der Behandlung gemäß der Erfindung einen brauchbaren Träger für die Affinitätschrömatographie nach Fixierung eines spezifischen Verhinderers des Enzyms, das isoliert werden soll, darstellen.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung vorteilhafter Ausführungsformen der Erfindung.
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Beispiel 1
Fixierung von Proteasen auf Cellulose und Carboxymethylcellulose
A. Chemische Aktivierung des Trägers und Fixierung von Aminogruppen
15g Cellulose oder Carboxymethylcellulose werden in 200 ml Benzol oder Toluol mit ungefähr 3 % Pyridin und 5 ml Thionylchlorid suspendiert. Man erwärmt 2 Stunden auf 80° C und läßt über Nacht bei Umgebungstemperatur stehen. Man wäscht die Cellulose mit dem Lösungsmittel, führt sie wieder in das Lösungsmittel ein, dem man 5 % Äthylendiamin und 3 % Pyridin zusetzt. Man bringt mindestens 2 Stunden zum Kochen, wäscht mit Lösungsmittel, dann reichlich mit Wasser und trocknet im Vakuum. Die Cellulose und ihre Derivate sind entsprechend dem Lösungsmittel und der Stärke des Angriffes auf das Polysaccharid mehr oder weniger gefärbt. Die Elernentaranalyse zeigt, daß der Gehalt an Chlorion höchstens 20 % erreichen kann (Analyse mit Silbernitrat). Infrarotanalyse zeigt das Auftreten von -C-NH-,
Il
C-NH- Banden und das Vorhandensein von NH^-Gruppen an den Polysacchariden.
B. Vernetzung der Proteasen auf dem Träger
1 g Cellulose oder Carboxymethylcellulose behandelt nach den Stufen 1 und 2 wird mit 2 ml Phosphatpuffer von pH 6,8 0,02 η enthaltend 10 mg/ml einer Protease, der Subtilopeptidase, in Berührung gebracht. Man läßt in Vakuum bei 4° C bis zur Verdampfung des Wassers stehen und setzt dann 2 ml etwa 3 %-ige
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Glutaraldehydlösung zu. Das vernetzte Enzym wird so auf dem Träger verankert. Man wäscht reichlich mit einer sauren Natriumcarbonat- und Natriumchloridlösung. Die proteolytische Restaktivität des Polysaccharide entspricht an reinem Enzymgewicht einem Fixierungsverhältnis von. etwa 0,5 Gewichts-%.
Beispiel 2
Chemische Aktivierung des Trägers und Fixierung von Aminogruppen,
A. 15 g Cellulose oder Carboxymethylcellulose werden in 100 ml Pyridin suspendiert. Man rührt 4 Stunden bei Umgebungstemperatur und bringt dann die Temperatur der Suspension auf 4° C. Darauf setzt man sehr langsam 5 ml Thionylchlorid zu und rührt 3 Stunden weiter. Man wäscht reichtlich mit Pyridin.
Parallel hierzu bereitet man eine 20 %-ige Lösung von Diaminodipheny!methan in Benzol. 100 ml diener Lösung versetzt man langsam mit 15 g in vorstehender Weise aktivierten Polysaccharids. Man rührt 2 Stunden und wäscht dann reichlich mit Benzol. Die Polysaccharidfaser besitzt Seitenketten, die an ihrem freien Ende eine Aminfunktion,aufweisen. Diese Verbindung wird als Derivat 1 bezeichnet.
B. Das Derivat 1 gibt man sehr langsam zu 100 ml einer 10g Dichloraceton enthaltenden Acetonlösung. Man rührt 4 Stunden und wäscht dann reichlich mit Aceton, das man unter Vakuum entfernt. Das Polysaccharid besitzt an den Seitenkettenenden Cl""-Gruppen, die mit den Amingruppen reagieren. Diese Verbindung wird als Derivat 2 bezeichnet.
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Das Derivat 2 suspendiert man in 50 ml 0,04 m Phosphatpuffer pH 7,0 enthaltend 10 mg/ml gereinigte Subtiopeptidase A. Die Temperatur hält man unter Rühren 48 Stunden auf 4° C. Man wäscht mit mehreren Litern einer Natriumchlorid- und sauren Natriumcarbonatlösung.
Die proteolytische Restaktivität des Polysaccharids entspricht an reinem Enzymgewicht einem Fixierungsverhältnis von etwa 0,5 Gewichts-%.
Beispiel 3
Anwendung der chemischen Aktivierung auf die Affinitätschromatographie .
Reinigung von d-Chymotrypsin durch Wechselwirkung mit einem auf Carboxymethylcellulose fixierten spezifischen Verhinderer. Man suspendiert 10 g Carboxymethylcellulose von schwachem Subsitutionsgrade in 50 ml Benzol und 50 ml Pyridin. Sehr langsam gibt man 5 ml Thionylchlorid zu, wobei man jede Erwärmung vermeidet. Man rührt 2 Stunden und wäscht dann reichlich mit Benzol und Pyridin.
12g £-Aminocapronsäure gelöst in 100 ml Wasser versetzt man langsam mit den vorstehend aktivierten 10 g Carboxymethylcellulose. Man rührt 3 Stunden und wäscht reichlich mit Wasser. Die Carboxymethylcellulose besitzt eine freie CarboxyIfunktion, die von der £-Aminocapronsäure stammt. Man fixiert einen mit d-Chymotrypsin verträglichen Verhinderer, nämlich N-Acetyl-D-tryptophan (+) auf der Carboxymethylcellulose am Ende der £-Aminocapronsäure. Diese Fixierung erfolgt durch eine Konden-
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sationsmethode mit Hilfe eines Carbodiimide zwischen der freien Carboxylfunktion und der Aminogruppe des Verhinderers.
Die so modifizierte Carboxymethylcellulose wird auf eine Kolonne aufgebracht und mit einem 0/1 Mol Tris-Puffer pH 8,0 ins
Gleichgewicht gebracht. In demselben Puffer löst man ein Gemisch von Proteasen einschließlich (A-Chymotrypsin und gibt auf die
Kolonne auf. Lediglich das d-Chymotrypsin wird spezifisch durch den Verhinderer zurückgehalten. Es ergibt sich also eine Reinigung des dv-Chymotrypsins.
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Claims (13)

  1. Patentansprüche
    t\J Verfahren zum Unlöslichitiachen von aktiven Proteinen durch Kombination einer chemischen Aktivierung des Trägers und Vernetzung der aktiven Proteine und des Trägers mittels intermolekularem Brückenbildner, dadurch gekennzeichnet/ daß man die chemische Aktivierung des Trägers, der aus einem ursprünglich freie Hydroxyl- oder Carboxylgruppen enthaltenden Polymers besteht, mit einem Halogenierungsmittel in organischem Lösungsmittel durchführt, dann Aminogruppen am Kontakt des aktivierten Trägers im Lösungsmittel mit bifunktionellen Aminierungsmitteln fixiert und daß man außerdem die Vernetzung der aktiven Proteine mittels Kontaktes des chemisch aktivierten Trägers mit dem zu vernetzenden Protein und anschließender Zugabe des intermolekularen Brückenbildners bewirkt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Cellulose oder deren Derivat, insbesondere Carboxymethylcellulose, Polyacrylsäure, Methylmetacrylsäure, Polyaminosäuren oder Polyvinylalkohol besteht.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das zur chemischen Aktivierung benutzte Halogenierungsmittel aus Thionylhalogenid, SuIfurylhalogenid, Phosphortri- oder -pentahalogenid, Phosphoroxyhalogenid oder p-Toluolsulfoxidhalogenid besteht.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Aktivierung in der Wärm bei einer Temperatur
    höchstens gleich 90° C erfolgt.
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  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der chemischen Aktivierung benutzte organische Lösungsmittel aus einem gegebenenfalls substituierten aromatischen Kohlenwasserstoff/wie Benzol, Halogenbenzol, Nitrobenzol, Benzonitril, Toluol oder Xylol besteht.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der chemischen Aktivierung benutzte organische Lösungsmittel aus Dimethylformamid, Formamid oder Dimethylsulfoxiä besteht.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel eine sehr geringe Menge Pyridin enthält.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Aktivierung in der Kälte erfolgt.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel aus Pyridin besteht.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel aus einer Mischung mit einem starken Anteil Pyridin ergänzt durch ein Lösungsmittel nach Anspruch 5 oder 6 besteht.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das bifunktionelle Aminderivat aus Verbindung der Formeln
    NH2-NH2, NH2-R1-NH2 und HN-]
    Ra *5
    besteht, worin R einen Alkylrest mit höchstens 20 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls durch mindestens einen Phenylkern
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    oder einen Hydroxyalkylrest mit höchstens 20 Kohlenstoffatomen substituiert ist, bedeutet, E^ und R3 gleich oder verschieden sind und jeweils einen niederen Alkylrest oder einen Phenylkern bedeuten.
  12. 12. Verfahren nach.einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Brückenbildner aus einem Dihalogenaceton, insbesondere Dichloraceton, besteht.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Brückenbildner aus einem polyfunktionellen Mittel, wie Glutaraldehyd oder Bisdiazobenzidxn, besteht.
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