DE2413694A1

DE2413694A1 - Fixiertes enzympraeparat

Info

Publication number: DE2413694A1
Application number: DE2413694A
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Ishimatsu; Shoji Kimura; Shigeki Shigesada
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1973-05-30
Filing date: 1974-03-21
Publication date: 1974-12-05
Also published as: NL172762B; NL172762C; NL7405654A; GB1441543A; FR2231683A1; DE2413694B2; IT1017010B; DE2413694C3; FR2231683B1

Description

•Prioritäten: 30. Mai 1973, Japan, Nr. 60678

30. Mai 1973, Japan, Nr. 60679

Die Erfindung betrifft ein enzymatisch aktives Material, in welchem ein Enzym und Mikrobenzellen durch chemische Bindung an eine unlösliche Matrize unbeweglich gemacht bzw. fixiert sind, sowie ein kontinuierliches Verfahren zur Duichführung einer enzymatischen Reaktion, bei dem das fixierte, enzymatisch aii^ive Material oder Präparat verwendet wird.

Bis heute sind zahlreiche verschiedene Aktivitäten unterschiedlicher Enzyme sowie daraus resultierende Verwendungszwecke in weitem Maß untersucht und erkannt worden. Biese Enzyme sind ihrer Hatur nach Proteine und sind daher in Wasser löslich. Die Folge davon ist natürlich, daß die meisten dieser Enzyme während ihrer Anwendung gelöst werden und verlorengehen.

Es existieren zahlreiche Anwendungsawecke, bei denen Kikrobenzellen* denen die Wachstumsfunktion fehlt, die jedoch enzymatisch^ Aktivität haben (sogenannte luhende Kikroorganismenzellen), für verschiedene Enzymreaktionen verwendet werden. In diesem Fall sind äwar die Zellen selbst unlöslich, die in ihnen

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enthaltenen aktiven Enzyme werden Jedoch im Laufe der Anwendung herausgelöst und gehen verloren. Damit solche Enzyme und Mikroorganismenzellen ihre biologische Aktivität während langer Dauer beibehalten können, wurden in den letzten Jahren zahlreiche Versuche unternommen, sie in unbewegliche, auf einem wasserunlöslichen Träger angeordnete Substanzen überzuführen, um ihre enzymatische Aktivität zu verlängern.

Die zu diesem Zweck bisher angewendeten Methoden sind jedoch ini Hinblick auf die technische Anwendung mit folgenden verschiedenen Nachteilen behaftet:

1.) Träger, deren Verwendung zusammen mit Enzymen zur Herstellung von unlöslich gemachten Enzymen unerläßlich ist, sind teuer.

2.) Die zur Reaktion zwischen den Trägern und Enzymen zur Herstellung dieser Materialien verwendeten Verfahren sind kompliziert.

3.) Die auf diese Weise unlöslich gemachten Enzyme zeigen ausgeprägt niedere enzymatische Aktivität im Vergleich mit der Aktivität der gleichen Enzyme in der ursprünglichen Form vor ..dem Unlöslichmachen.

4.) Die Substratspezifität, welche die unlöslich gemachten Enzyme zeigen, v/eicht manchmal von der Substratspezifität ab, welche die gleichen Enzyme in ihrer ursprünglichen Form vor dem Unlöslichmachen zeigen. Die Verringerung einer solchen Spezifität ist im Hinblick auf hochmolekulare Substrate besonders deutlich.

5.) Zum Unlöslichmachen einer großen Vielfalt von Enzymen ist kein Träger universal anwendbar«

Unter diesen Umständen bestand seit langem ein Bedürfnis nach einer universellen Methode zur Herstellung von leicht zugang-, liehen und billigen hochaktiven unbeweglich gemachten Enzym-

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materialien.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die verschiedenen Nachteile der vorstehend beschriebenen bekannten Methoden und Materialien zu überwinden und ein neues, technisch vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von unbeweglich gemachten Enzympräparaten zugänglich zu machen. Zu diesem Zweck wurden erfindungsgemäß verschiedene Polymere synthetisiert, die verschiedene funktionelle Gruppen aufweisen, und es wurden Untersuchungen über Methoden vorgenommen, verschiedene Enzyme an diese Polymeren zu binden. Dabei wurde gefunden, daß Vinylpyridin-modifizierte Copolymere am besten zur Vereinigung mit Enzymen geeignet sind. Diese !Feststellung liegt der Erfindung zugrunde.

Gegenstand der Erfindung sind daher neue, technisch wertvolle, unbeweglich gemachte Enzym-Materialien, insbesondere wasserunlösliche enzymatisch aktive Materialien, die durch Adsorption eines biologisch aktiven-Enzyms oder von enzymatisch aktiven Mikroorganismenzellen an einem Anionenaustauscherharz, das in der Moleküleinheit einen quaternären Pyridinring enthält, gebildet werden.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzym-Materials bzw. Enzym-Präparats sowie die Verwendung dieses Materials.
Die Bezeichnung ·

"fixierte bzw. unbeweglich gemachte Enzym-Materialien", die erfindungsgemäß verwendet wird, bezieht sich auf Materialien, die durch Bindung von Enzymen und Mikroorganismenzellen an Träger erhalten wurden, die durch Copolymerisation von Vinylpyridin oder dessen Derivaten mit einem oder mehreren Monomeren, die copolymerisierbare aromatische Vinylverbindungen, äthylenisch ungesättigte Verbindungen und dienisch ungesättigte Verbindungen

sein können, und Quaternisieren des Stickstoffatom des Pyridinrings der erhaltenen Copo3.ymeren, hergestellt wurden.

Mit Hilfe des erfindungsgemÜßen Verfahrens können Enzyme und Mi-

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kroorganismenzellen als Gastsubstanz auf diesen Trägern in die unbewegliche Form übergeführt werden, ohne daß ihre biologische Aktivität beeinträchtigt wird. Die Verwendung der so hergestellten Materialien ermöglicht es, daß verschiedene Enzym-Reaktionen in einem kontinuierlichen Reaktionssystem durchgeführt werden, was unter Verv/endung von üblichen wasserlöslichen Enzymen nicht möglich war. Die Erfindung ist daher von großer industrieller Bedeutung.

Die erfindungsgemäß verwendeten Träger können insbesondere mit den gewünschten Eigenschaften und in gewünschter Form hergestellt werden, indem die Herstellungsbedingungen in geeigneter Weise eingestellt werden. Es ist daher für die Erfindung charakteristisch, daß die Träger in Übereinstimmung mit der Ausbildung der Gefäße für die enzymatische Reaktion hergestellt werden, die den Arten der Enzyme und Mikroorganismenzellen, die unlöslich gemacht werden sollen, und den entsprechenden charakteristischen Enzym-Reaktionen angepaßt sind, und daß unter Verwendung dieser Träger die unlöslich gemachten Enzym-Materialien hergestellt v/erden.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt folgende vier Verfahrensstufen:

1.) Herstellung von Copolymeren, in denen Vinylpyridineinheiten oder Einheiten von Vinylpyridin-Derivaten in den Copolymermolekülen gebunden sind.

2.) Herstellung von wasserunlöslichen, zum Anionenaustausch geeigneten Matrix-Substanzen durch Quaternisieren der Pyridinringe dieser Copolymeren.

J.) Herstellung von unbeweglich gemachten Enzym-Materialien durch Kombination dieser Matrizen mit Enzymen oder Mikroorganismenzellen.

4·.) Kontinuierliche katalytisch^ Umsetzung der Substrate mit den

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unbeweglich zu machenden oder zu fixierenden Enzym-Materialien.

Die einzelnen Stufen des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden nachstehend ausführlicher erläutert.

1.) Herstellung des Copolymeren:

Die Bezeichnung "Copolymere" wird hier für Copolymere benutzt, die durch Copolymerisation von Vinylpyridin oder dessen Derivaten mit einem oder mehrern anderen Monomeren oder Polymeren durch geeignete Polymerisationsmethoden erhalten werden.

Zu Vinylpyridin und dessen Derivaten gehören 2-Vinylpyridin, ^--Vinylpyridin, 2-Methyl-5-vinylpyridin_> 5-Methyl-2-vinylpyridin, 3-Allylpyridin und verwandte Verbindungen, wie 1-Vinylchinolin und Vinylimidazol. Unter Berücksichtigung der Wirtschaftlichkeit und der Copolymerisierbarkeit mit anderen Monomeren ist es jedoch am wünschenswertesten, 4-Vinylpyridin, 2-Vinylpyridin und 2-Methyl-5-vinylpyridin zu verwenden. Zu anderen mit Vinylpyridin und dessen Derivaten copolymerisierbaren Monomeren gehören aromatische Vinylverbindungen, wie Styrol, oc-Methylstyrol und halogenierte Styrole, äthylenisch ungesättigte Verbindungen, wie Äthylen, Propylen, Acrylsäure, Methacrylsäure, Methylmethacrylat, Acrolein, Vinylacetat, Acrylnitril, Vinylchlorid, Acrylamid und N-Methylolacrylamid, Diene, wie Butadien, Isopren und Chloropren, und Divinylverbindungen, wie Divinylbenzol, Äthylenglycoldimethacrylat, Polyäthylenglycoldimethacrylat, Butandiolacrylat, Diallylphthalat und Methylenbisacrylamid.

Zu Polymeren, die mit Vinylpyridin copolymer!sierbar sind und die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, gehören Polybutadien, Polyisopren, Polychloropren, Styrol-Butadien-Copolymere, chloriertes Polyäthylen, Polypropylen, Polyvinylalkohol und dergleichen.

Die Herstellung von erfindungsgemaßen Copolymeren kann unter Verwendung irgendeiner der bekannten Copolymerisate nsmethoden

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vorgenommen werden. Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Copolymeren ist es am wichtigsten, daß die anzuwendende Copolymerisationsmethode und die Art des zu verwendenden Monomeren in dieser Stufe so gewählt werden, daß die in der anschließenden Stufe durch Quaternisierung dieser Copolymeren gebildeten Matrizen hydrophil sind und gleichzeitig in allen Lösungsmitteln, speziell in Wasser, unlöslich sind.

Im Hinblick auf diese Tatsache können die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Copolymeren angewendeten Verfahren grob in folgende beide Klassen unterteilt werden:

1.) Statistische Copolymerisation

»Venn die Methode der radikalischen Copolymerisation, wie beispielsweise als Suspensionspolymerisation und Emulsionspolymerisation, für die Copolymerisation angewendet wird, werden Copolymere erhalten, in denen Vinylpyridin und andere Monomere statistisch angeordnet sind. Obwohl diese Copolymeren in Wasser unlöslich sind, werden sie wasserlöslich, wenn sie in der anschließenden Stufe zur Modifizierung des Polymeren der Quaternisierung unterworfen werden. Aus diesem Grund sollten Vinylpyridin und Divinylverbindungen als wesentliche Komponenten verwendet werden, wenn die Copolymerisation mit Hilfe dieser Methoden durchgeführt wird. In diesem Fall sind wünschenswerte Divinylverbindungen Divinylbenzol und (Poly)äthylenglycoldimethacrylat.

Die Zusammensetzung und das Molekulargewicht von Monomeren, welche diese Copolymeren bilden, sind nicht kritisch, sondern können frei in der ^T,7eise gewählt werden, daß der vorgesehene Zweck der schließlich gebildeten Matrizen erfüllt wird. Für praktische Zwecke liegt die Menge von Vinylpyridin oder dessen Derivaten, die in den Copolymeren vox^liegen, wünschenswei"terweise im Bereich von 2o bis 99 Mol-%, vorzugsweise 5o bis 95 Mol-%, und die der Divinylverbindungen χει Bereich von o,5 bis 3o Mol-%, vorzugsweise 1 bis 2o Mol-%.

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Wenn "beispielsweise die Menge des einpolymerisierten Vinylpyridins 2o Mol-% nicht überschreitet, und wenn die Menge der Livinylverbindung 3o Mol-% übersteigt, haben die gebildeten Matrizen geringere Hydrophilie und Anionenaustauschkapazität, und die
Menge der damit kombinierten Enzyme und Mikroorganismenzellen
wird proportional vermindert, so daß es unmöglich wird, unbeweglich gemachte Enzym-Materialien mit hoher Wirksamkeit herzustellen.

Wenn andererseits die Menge des einpolymerisierten Vinylpyridins 99 Mol-% überschreitet, und wenn die Menge der damit copolymerisierten Divinylverbindungen nicht über o,5 Mol-% liegt, werden
die gebildeten Matrizen partiell in Wasser gelöst und werden infolgedessen instabil.

Zu bevorzugten Beispielen von Copolymeren, die mit Hilfe der
statistischen Copolymerisationsmethode hergestellt v/erden können, gehören daher Vinylpyridin-Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, Vinylpyridin-Methylmethacrylat-Divinylbenzol-Copolymere und
Vinylpyridin-lthylenglycoldimethacrylat-Copolymere.

2.) Block- und Pfropf-Copolymerisation

Wenn zur Copolymerisation die Methoden der Block-Copolymerisation und Pfropf-Copolymerisation angewendet werden, werden Copolymere erhalten, in denen Vinylpyridin und andere Monomere oder Polymere in Form von Blöcken angeordnet sind. V.'enn diese anderen Monomeren oder Polymeren hydrophob sind, werden in der nachfolgenden Stufe der Polymermodifikation, in der die Copolymeren quaternisiert werden, um die Hydrophilie der Vinylpyridineinheiten zu
erhöhen, die Copolymerisate als ganzes hydrophil, bleiben jedoch im wesentlichen unlöslich in Wasser, weil die aus den anderen Monomeren gebildeten Bereiche des Polymeren immer noch ihre hydrophoben Eigenschaften beibehalten. In diesem Fall ist es daher
nicht speziell notwendig, Vernetzungsmittel zu verwenden, wie
Divinylverbindungen. Im Fall der Block-Copolymerisation sind
die wünschenswertesten Monomeren zur Copolymerisation mit Vinylpyridin Styrol und Methylmetliacrylat. Im Fall der Pfropf-Copolymerisation gehören zu wünschenswerten Grundpolymeren Styrol-

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Butadien-Copolymere, chloriertes Polyäthylen und dergleichen. Die' Art (Zusammensetzung) und das Molekulargewicht von Monomeren, die zur Herstellung der Copolymeren verwendet werden, können frei in der Weise gewählt werden, daß sie dem Endverwendungszweck der gebildeten Endprodukte (Matrizen) genügen. Für praktische Zwecke liegt die Menge an Vinylpyridin oder dessen Derivaten, die in die Copolymeren einpolymerisiert werden soll, vorteilhaft im Bereich von 25 "bis 75 Mol-%, vorzugsweise 4-o "bis 6o Mol-%.

Wenn die Menge des einpolymerisierten Vinylpyridine 25 Mol-% nicht überschreitet, haben die Matrizen unzureichende Hydrophilie und Anionenaustauschkapazitat, und die Menge des damit zu kombinierenden Enzyms und der Mikroorganismenzellen wird proportional vermindert, so daß die Matrizen ungeeignet für die vorgesehenen Anwendungszwecke werden. Eine Menge von mehr als 75 Mol-% ist ebenfalls unerwünscht, weil die gebildeten Matrizen instabil gegenüber V/asser sind.

Konkrete Beispiele für bevorzugte Copolymere, die durch Block- und Pfropf-Copolymerisation gebildet werden, sind Vinylpyridin-Styrol-Blockcopolymeres, Vinylpyridin-Methylmethacrylat-Block-Gopolymeres und Pfropf-Copolymere aus Vinylpyridin und chloriertem Polyäthylen.

Welche Methode unter den vorstehend erläuterten gewählt wird, hängt von der Art der Matrizen ab, die hergestellt werden sollen.

Wenn eine Matrize in amorpher Pulverform gewünscht wird, eignet sich für diesen Zweck ein Copolymeres, das durch radikalische Emulsions-Copolymerisation oder ionische Block-Copolymerisation gebildet wird. Wenn eine Matrize in Form von porösen Perlen erforderlich ist, eignet sich für diesen Zweck ein Copolymeres, das durch radikalische Suspensions-Copolymerisation gebildet wurde. Wird eine Matrize in Form eines Films gewünscht, so kann sie hergestellt werden, indem zuerst ein Copolymeres durch ionische Block-Copolymerisation oder Pfropf-Copolymerisation hergestellt wird und anschließend das resultierende Copolymerisate mit Hilfe

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der Gießmethode zu einem Film verarbeitet wird.

Die Verfahren zur Herstellung der Copolymeren können daher so gewählt werden, daß sie der endgültigen Form Rechnung tragen, in der die unbeweglich gemachten Enzym-Präparate vorliegen sollen.

2.) Herstellung des Trägers

Die Bezeichnung "Träger" wird in dieser Beschreibung und den . Patentansprüchen zur Bezeichnung von wasserunlösuchen Anionenaustauschern benutzt, die durch Quaternisieren des Pyridinrings von Copolymeren erhalten werden, die in der vorstehend unter 1.) beschriebenen Weise hergestellt wurden.

Die Quaternisierung des Stickstoffatoms des Pyridinrings erfolgt am vorteilhaftesten durch Anwendung der Quaternisierungsreaktion eines Amins mit Hilfe eines Halogenierungsm.ittels, speziell eines Halogenalkyl-Reagens. Zu wünschenswerten Alkylhalogeniden gehören Methylchlorid, Methylbromid, Propylbromid, Ivlethyljodid und ähnliche Verbindungen.

Außer diesen Verbindungen eignen sich zu diesem Zweck auch Schwefelverbindungen, wie Schwefeldioxid, Schwefeltrioxid, Thionylchlorid und Dimethylsulfat, Carbonylderivate, wie Benzylchlorid, Säurechloride und Säureanhydride, Metallhalogenide, wie Aluminiumtrichlorid, Kupferchlorid und Cobaltchlorid, und hochmolekulare saure Verbindungen, wie langkettige Alkylsulfonate, Polystyrolsulfonat und Polyacrylsäure.

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist die Verwendung von Alkylhalogeniden und Alkylsulfaten besonders wünschenswert im Hinblick auf die Wirksamkeit des Quaternisierungsvorgangs. Die Bedingungen der Quaternisierung lassen sich unverändert sehr leicht einstellen, wenn sie auch in Abhängigkeit von der speziellen Art der zu verwendenden Quaternisierungsmittel variabel sind. Wenn beispielsweise ein Alkylhalogenid verwendet wird, kann der Pyridinring praktisch

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quantitativ quaternisiert werden, indem ein trockenes Polymeres und das Alkylhalogenid in ein druckempfindliches Gefäß gegeben werden und die Reaktanten vier bis fünf Stunden auf eine Temperatur von 7o bis 13o°C erhitzt werden.

Die erfindungcgemäß hergestellten und verwendeten Träger, die Anionenaustauscherharze darstellen, haben eine Gesamt-Anionenaustauschkapazität in der Größenordnung von 1,5 bis 5>o mXq/g-. Insbesondere solche mit einer Kapazität in der Größenordnung von 2,5 bis 4,5 mÄq/g sind wünschenswert.

3.) Herstellung des unbeweglich gemachten Enzym-Materials

Zu typischen Enzymen und Mikroorganismenzellen, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen unbeweglich gemachten Enzym-Materialien verwendet werden können, gehören bakterielle Protease, Aminoacylase, Adenosindesaminase, AMP-Desaminase, Amidase, oC-Amylase, ^-Amylase, Glucoamylase, Succinylglucoamylase, Lactatdehydrogenase, Trypsin, Papain, Ribonuclease, Dextranase, Glucoseoxidase, Penicillinacylase, Chymotrypsin, Ficin, Pepsin, Carboxypectidase, Streptokinase, Urease, Invertase, Ivlaltase, Lactase, Lipase, Cellulase, Gatalase, Melibiase, Tyrosinase, Aspartase, Glucoseisomerase, Phenoloxidase und Racemase sowie Mikroorganismenzellen, welche die Aktivität dieser Enzyme beibehalten haben. Die Bindung der vorstehend beschriebenen verschiedenen Enzyme und der entsprechenden Mikroorganismenzellen an die vorstehend angegebenen Träger kann sehr leicht erfolgen, indem die Träger in wässrige Lösungen der Enzyme oder wässrige Suspensionen der Mikroorganismenzellen jeder gewünschten Konzentration in einem pH-Bereich eingebracht werden, in welchem die gewählten Enzyme und Mikroorganismenzellen stabil sind. Durch die Berührung der beiden Materialien werden die erfindungsgemäß angestrebten unbeweglich gemachten Enzym-Materialien gebildet. Die Reaktion der Bindung ist innerhalb kurzer Zeit vervollständigt.

Die Temperatur der Bindungsreaktion kann innerhalb eines wei-

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ten Bereiches gewählt werden, sofern sie unterhalb des Werts liegt, von dem an die Aktivität der Enzyme beeinträchtigt wird. Es ist wünschenswert, die Temperatur im Bereich von 5 bis 2o C zu wählen.

Wie vorstehend erläutert wurde, erfolgt die Bindung zwischen den Trägern und Enzymen oder Mikroorganismenzellen zur Herstellung der unbeweglich gemachten Enzym-Materialien mit Hilfe eines sehr einfachen Verfahrens unter milden Bedingungen, verglichen mit denen der üblichen Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet daher große technische Vorteile.

Bei der Reaktion der Bindung zwischen dem Träger und dem Enzym führt die Zugabe einer Substanz, die anschließend als Substrat für die enzymatische Reaktion dient, und eines Metallions, das dazu dient, diese enzymatische Reaktion zu beschleunigen, zu dem Reaktionssystem, dazu, daß in wirksamer V/eise verhindert wird, daß die resultierenden unbeweglich gemachten enzymatisch aktiven Substanzen in ihrer enzymatischen Aktivität verschlechtert werden.

Falls erforderlich, können die in vorstehender V/eise hergestellten unbeweglich gemachten Enzym-Materialien mit Pufferlösungen gewaschen werden, die für die darin enthaltenen Enzyme geeignet sind, oder können mit gereinigtem Wasser gewaschen werden, um sie von nicht gebundenem Enzym zu befreien,und können danach durch Gefriertrocknung lyophilisiert werden, um sie in vollständig trockener Form während langer Dauer aufzubewahren.

Die biologische Aktivität dieser unbeweglich gemachten Enzym-Materialien wurde -mit den notwendigen Abwandlungen- mit Hilfe eines Verfahrens untersucht, das zur Bestimmung der Aktivität der. ursprünglichen Enzyme vor dem Einbau in diese Materialien verwendet wurde, und die Lebensdauer dieser Akti\^rität wurde durch Analyse der kontinuierlichen Enzym-Reaktion unter Verwendung einer Füllkörperkolonne bestimmt. Dabei wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Enzym-Materialien ihre biologische Aktivität

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während langer Dauer beibehalten. Die erfindungsgemäßen unbweglich gemachten Enzym-Materialien haben sich daher als ausgezeichnet erwiesen.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Träger zeigen zahlreiche Vorteile. So haben sie beispielsweise hohe Jonenaustauschkapazität, zeigen hohe Hydrophilie trotz ihrer Unlöslichkeit in Wasser und anderen Lösungsmitteln} sie ermöglichen die Bindung einer großen Menge von Enzym und Mikroorganismenzellenj sie haben keine störende Wirkung auf die an sie gebundenen Enzyme (aufgrund der Neutralität des Grundpolymeren des Trägers), und die in den Materialien vorliegenden Enzyme behalten die gleiche enzymatisch^ Aktivität bei, welche die entsprechenden ursprünglichen Enzyme vor der Bindung an die Träger aufweisen.

Ein weiteres wesentliches Merkmal ist die Tatsache, daß das Enzym und der Träger nicht mit der Festigkeit einer bloßen ionischen Adsorption, sondern mit der Festigkeit einer covalenten Bindung aneinander gebunden sind, so daß das Enzym nicht leicht von dem Träger freigesetzt werden kann. Es wurde bestätigt, daß all diese Vorteile aus der speziellen Tatsache resultieren, daß erfindungsgemäß Copolymere verwendet werden, in denen Vinylpyridin oder dessen Derivate als Hauptkomponente vorliegen. Diese Kombination wurde bisher nicht verwirklicht. Durch die Erfindung wurde es zum erstenmal ermöglicht, unbeweglich gemachte Enzym-Materialien mit außerordentlichen Eigenschaften herzustellen.

4·.) Kontinuierliche Umwandlung eines Substrats durch Katalyse durch das unbeweglich gemachte Enzym-Material Enzyme und enzymatisch aktive Mikroorganismenzellen sind sehr wertvoll und haben daher ausgedehnte Verwendung für industrielle Anwendungszwecke gefunden. Da jedoch die Enzyme leicht in V/asser löslich sind, ist es unvermeidbar erforderlich, daß die enzymatischen Reaktionen anteilweise durchgeführt werden. Die einmal für Reaktionen eingesetzten Enzyme bleiben in den Raaktionsgemischen gelöst und können daher nicht zur wieder-

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holten Verwendung zurückgewonnen werden. Im Fall eines Enzym-Reaktionssystems, in welchem das Reaktionsprodukt die Reaktion
stört, wird verhindert, daß die Reaktion über eine gewisse Grenze hinaus abläuft.

Wie vorstehend erläutert wurde, sind die üblichen Methoden der Enzymanwendung von zahlreichen Schwierigkeiten begleitet. Unter diesen Umständen hat man Methoden zum Unlöslichmachen von Enzymen und zum Unbeweglichmachen von Mikroorganismenzellen als wirsame Maßnahmen zur Lösung dieser Probleme erwartet.

So erlaubt speziell das Unlöslichmachen von Enzymen und das Unbeweglichmachen von Mikroorganismenzellen, daß die resultierenden Präparate in einem zyklischen Verfahren während langer Dauer angewendet werden'und daß die Enzym-Reaktionen .in einem kontinuierlichen Vorgang durchgeführt werden. Die technischen Gebiete, auf denen Enzyme verwendet werden, können daher im Hinblick auf die Verfahrensweise rationalisiert werden und im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit stark verbessert werden.

Da die erfindungsgemäßen Träger mit Hilfe eines rein chemischen Syntheseverfahrens hergestellt werden, können sie in einer reichen Vielfalt der Arten erhalten werden, indem die Polymerisationsmethode, die Bedingungen der Polymerisation und die Zusammensetzung des Monomergemisches in geeigneter Weise gewählt werden. Demnach können unbeweglich gemachte Enzym-Materialien in jeder beliebigen Form erhalten werden, welche den speziell verwendeten verschiedenen Reaktionsgefäßen angepaßt ist.

Unter den verschieden möglichen Reaktionsgefäßen ist eine Püllkörperkolonne (Kolonne mit Füllkörperschicht) besonders wirksam. Bei Verwendung dieses speziellen Reaktionsgefäßes kann die gewünschte Enzym-Reaktion in einfacher V/eise kontinuierlich und im wesentlichen automatisch während langer Dauer durchgeführt werden, indem lediglich die Kolonne mit dem unbeweglich gemachten Enzym-Material, das in Form von Perlen oder Pulver hergestellt wurde, bis zu einer festgelegten Kapazität gefüllt wird und mit

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einem gegebenen Substrat in festgelegter Beschickungsrate beschickt wird.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kolonne mit dem unbeweglich gemachten Enzym-Material in Verbindung mit einem inaktiven Verdünnungsmittel gefüllt.

Dieser Zusatz des Verdünnungsmittels dient dazu, mögliches Verstopfen oder Kanalbildung in der Kolonne zu verhindern und infolgedessen das Reaktionssystem in stabilem Zustand zu halten.

Zu Beispielen für zu diesem Zweck geeigneten Verdünnungsmitteln gehören Holzpulver, Glasperlen, Cellulosepulver, Kunststoffperlen, Diatomeenerde,Celite und andere anorganische Substanzen. Es kann auch jede ähnliche Substanz verwendet werden, soweit sie inaktiv ist.

Nachstehend v/erden Herstellungsbeispiele 1 bis 13 angegeben, um die Herstellung von erfindungsgemäß verwendeten Trägern zu erläutern.

Bei s2> iel1

Herstellung von quaternisiertem (2-Vinylpyridin-Styrol)-BlockcopolymereiL

Ein Reaktor mit einem Fassungsvermögen von 1,5 Liter, aus welchem die Luft vollständig mit trockenem Ή_ο verdrängt war, wurde mit 8oo cnr gereinigtem Tetrahydrofuran und 55y2 cnr (o,4-8 Mol) gereinigtem Styrol (nachstehend als "St" bezeichnet) beschickt und von außen gekühlt, bis die Temperatur des Inhalts auf -2o G gefallen war. Danach wurden 2,ο I,üllimol n-3utyllithium dem Reaktorinhalt zugesetzt, um die Polymerisation einzuleiten. Etwa 3o Minuten danach wurden 5o?4- cm-^ (o,4-8 Mol) gereinigtes 2-Vinylpyridin (nachstehend als ^H2-VP" bezeichnet) zugesetzt, und die Reaktion wurde weitere 3o Minuten fortgesetzt. Dann wurde eine geringe Menge n-Propanol zugesetzt, \im die Polymerisation zu unterbrechen, und das Reaktionsgemisch wurde in eine große Volumenmen-

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ge V/asser eingeführt, um das gebildete Polymere abzutrennen. Das erhaltene Polymere wurde dann getrocknet. Die Umwandlung betrug 1oo %. Die Analyse des Copolymerisats durch IR- und NMR-Spektroskopie zeigte, daß 2-VP und St im wesentlichen äquimolar in einem der Block-Copolymerisation entsprechenden Muster gebunden waren. Eine Glaskolonne mit einem Innendurchmesser von 3 cm wurde schichtweise mit 2o g des pulverförmigen 2-VP-St-Block-Copolymeren (Korngröße gemäß ASTM-Sieb mit 6o bis 1oo Maschen) und dampfförmiges Methylbromid wurde während etwa 2 Stunden in einer Beschickungsrate von 1oo cnr/Min. durchgeleitet. Das so erhaltene quaternisierte Block-Copolymere zeigte eine Gewichtserhöhung von 7 Si die anzeigte, daß die entsprechende Menge Methylbromid gebunden worden war. Dieses Copolymere blieb ungelöst in Tetrahydrofuran, Methanol und V/asser. Es zeigte sich, daß es eine Anionenaustauschkapazität von etwa ^₁5 mÄq/g hatte. Diese Anionenaustauschkapazität wurde mit Hilfe der Silbernitrat-Titrationsmethode bestimmt.

Durch Wiederholung der Verfahrensweise des Beispiels 1, mit der Abänderung, daß o,72 Mol 2-VP und o,24- Mol St verwendet wurden, wurde ein quaternisiertes Block-Polymeres hergestellt. Es wurde gefunden, daß das resultierende Copolymere eins Anionenaustauschkapazität von 4-,6 mÄq/g hatte.

B e i_s_p_ i e_l 3

Durch Wiederholung der Verfahrensweise gemäß Beispiel 1, mit der Abänderung, daß o,24 Mol 2-VP und o,72 Mol St verwendet wurden, wurde ein quaternisiertes Block-Copolymeres hergestellt. Das resultierende Copolymerisat zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 2,5 lalq/g.

B_e_i_s_£_i_e 1_ 4

Herstellung eines quaternisierten statistischen (2-Vinylpyridin-

Styrol-Divinylbenzol) -Copolymeren:

Ein Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 2 Liter, in

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welchem die Luft mit trockenem Np verdrängt war, wurde zuerst mit 1.000 g Wasser und 1o g Polyvinylalkohol als Suspensionsstabilisator und danach mit 25o g 2-VP und 1o g Divinylbenzol (nachstehend als "DVBz" bezeichnet) beschickt. Der Reaktorinhalt wurde unter Rühren bei einer Temperatur von 7o°C gehalten. Dann wurden 2 g Benzolperoxid zugesetzt, um die Polymerisation zu initiieren. In etwa 2o-stündiger Reaktion wurde ein Copolymeres erhalten, welches in Form von Perlen auskristallisierte.Das Copolymere wurde durch Filtration abgetrennt, gründlich mit Methanol und Wasser gewaschen und getrocknet. Der Umsatz betrug 95 %· Die Elementaranalyse zeigte, daß dieses Copolymere Styrol und 2-Vinylpyridin in äquimolaren Mengen enthielt und eine vernetzte Struktur hatte. In einen Autoklaven aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 5oo cnr wurden 1oo g des statistischen (2-VP-St-DVBz)-Copolymeren in Form von Perlen (Siebgröße entsprechend einem JlSTM-Sieb mit 1o bis 1oo Maschen) und 1oo g Methylbromid gegeben und 5 Stunden bei 8o°C umgesetzt. Am Ende der Reaktion wurde der Autoklaveninhalt von nicht umgesetztem Methylbromid befreit, und das Reaktionsprodukt wurde getrocknet. Das so erhaltene quaternisierte Polymere zeigte einen Gewichtsanstieg von 4o g, wodurch angezeigt wurde, daß die entsprechende Menge an Methylbromid gebunden worden war. Dieses Polymere erwies sich als unlöslich in allen Lösungsmitteln und zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 5,6 mÄq/g.

B e_i s_g i e 1 _5

Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholen der Verfahrensweise des Beispiels 4 erzielt, jedoch mit der Abänderung, daß 575 g 2-VP und 125 S St verwendet wurden. Das resultierende Copolymere zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 4,5 mÄq/g.

B_e_i_s_p__i_e_l 6

Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, indem die Verfahrensweise des Herstellungsbeispiels 4 wiederholt wurde, mit der Abänderung, daß 575 g 4-Vinylpyridin (als "4-VP" bezeichnet) anstelle von 2-VP und 125 g Methylmethacrylat (nachstehend als "MMA" bezeichnet) anstelle von Styrol verwendet wurden. Das resultierende Copoly-

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mere zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 4,3 mÄq/g.

?_2_i_2«E_i_®_i 2

Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholung der Verfahrensweise des Herstellungsbeispiels 4 erzielt, mit der Abänderung, daß 2o g Äthylenglycoldimethacrylat (nachstehend als "EDMA" bezeichnet) anstelle von Divinylbenzol verwendet wurden. Es zeigte sich, daß das resultierende Copolymere eine Anionenaustauschkapazität von 3i5 mÄq/g hatte.

Beispiel8

Ein Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 2 Liter, in . welchem die Luft mit trockenem Stickstoff verdrängt war, wurde zuerst mit 1.ooo g reinem Wasser und 3° g Natrium-Fettsäureseife als Emulgator und danach mit 25o g 4-VP, 25o g St und 1o g DVBz beschickt. Ferner wurden 1,5 g t-Dodecylmercaptan als MoIekulargewichts-Modifiziermittel zugegeben. Der Reaktorinhalt wurde unter Rühren bei einer Temperatur von 5o°C gehalten. Dann wurden 1,5 S Kaliumpersulfat als Katalysator zugegeben, um die Polymerisation einzuleiten. Nach etwa 2o-stündiger Polymerisation wurde das gebildete Polymere durch Zugabe von 2 Liter Aceton aus dem Reaktionsgemisch ausgefällt. Das ausgefällte Polymere wurde durch Filtration abgetrennt, gründlich mit reinem V/asser gewaschen und getrocknet. Der Umsatz wurde zu 9o % festgestellt. Die Elementaranalyse zeigte, daß dieses Copolymere St und 4-VP in äquimolaren Mengen enthielt und eine vernetzte Struk tur hatte. Dann wurden I00 g des in vorstehender V/eise hergestellten pulverförmigen Polymeren (Korngröße entsprechend einem ASTM-Sieb mit I00 bis 2oo Maschen) mit Hethylbromid quaternisiert, wobei die Verfahrensweise des Beispiels 4 wiederholt wurde. Das resultierende Polymere erwies sich als unlöslich in allen Lösungsmitteln und hatte eine Anionenaustauschkapazität von 3,4 mlq/g.

Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholung der Verfahrenswei se des Herstellungsbeispiels 8 erzielt, mit der Ausnahme, daß

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13694

375 S 2-VP anstelle von 4-VP und 125 S KMA anstelle von St verwendet wurden. Das resultierende Polymere zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 4,5 miiq/g.

Die Herstellung von unbeweglich gemachten Enzym-Präparaten gemäß der Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben.

B_e_i s P_i_e_l Io

Herstellung eines unbeweglich gemachten Aminoacylase-Präparats

2 g des in dem Herstellurigsbeispiel 1 erhaltenen quaternisierten Block-Gopolymeren (Teilchengröße entsprechend einem ASTM-Sieb mit 6o bis 1oo Maschen) wurden über Nacht in 1oo cm^ einer o,1m Phosphatpufferlösung mit einem pH-wert von 8,ο gelegt, und das resultierende gepufferte Polymere wurde abfiltriert, um als feuchtes Trägermaterial verwendet zu werden. Dann wurde dieser feuchte Träger einer Lösung zugesetzt, die durch Auflösen von

1 g einer handelsüblichen Aminoacylase (Aktivität I0.000 E/g) aus einer Spezies des Genus Aspergillus in 1oo ml einer o,1m Phosphatpufferlosung mit einem pH-'*7ert von 8,ο gebildet war und in dieser Lösung suspendiert. Die Suspension wurde 2 Stunden bei 4 C gerührt. Danach wurde die Suspension zentrifugiert, und der resultierende Niederschlag wurde mehrere Male mit o,1m Phosphatpufferlösung vom pH 8,ο gewaschen. Der so erhaltene Niederschlag wurde schließlich lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 2,3 g. Die Proteinkonzentration in der überstellenden Flüssigkeit, die bei der vorstehend beschriebenen Reaktion erhalten wurde, wurde mit Hilfe des Lowry-Verfahrens (J. Biol. Chem., 193, 26 (1951)) analysiert, wobei gezeigt werden konnte, daß sie völlig frei von Protein war. Dies zeigt klar die Tatsache an, daß die gesamte Menge der verwendeten Aminoacylase an den Träger gebunden wurde. Dann wurde die enzymatische Aktivität des so erhaltenen unbeweglich gemachten Aminoacylane-Präparats nach folgender Methode geprüft: ein Gemisch aus 1o mg der Testprobe, 1 cm^ reinem Wasser,

2 cnr einer o,1m Phosphatpufferlösung von pH 8,ο und 1 cm o,1m N-Acetyl-DL-metliionin (pH 8,o, enthaltend 5)O x 1o~ m Co⁺⁺) wurde

409849/0693

3o Minuten bei 37°C gebrütet. Das freigesetzte Methionin wurde durch Colorimetrie mit Hilfe von Ninhydrin bestimmt. Die Aktivitätseinheiten wurden unter der Annahme angegeben, daß die Einheit, 1 Einheit/g, der Menge entspricht, die zur Bildung von Ί uMol Methionin aus 1 g einer gegebenen Probe unter festgelegten Bedingungen entspricht. Es wurde gefunden, daß das in diesem Beispiel erhaltene unbeweglich gemachte Aminoacylase-Präparat eine Aktivität von etwa 1.5oo Einheiten/g hatte.

B_e_i_s_2_i_e_l_e ii

Die nachstehende Tabelle 1 zeigt verschiedene unbeweglich gemachte Aminoacylase-Materialien, die unter Verwendung verschiedener Träger erhalten wurden, die in den vorstehend angegebenen Beispielen zur Herstellung der Träger erhalten wurden. Die Bedingungen des Unlöslichmachens und die Methode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität, die in Beispiel 1o beschrieben sind, wurden auch in diesem Pall mit erforderlichen Modifizierungen angewendet.

409849/0693

Tabelle

Beispiel ! I '

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co

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12

13
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5
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2-VP-St-Block-Copolymeres

2-VP-St-DVBz-Copolymeres

2-VP-St-DVBz-Gopolyiaeres

4-VP-IIMA-DVBz-Copolymeres

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(*1) Die Werte in dieser Spalte wurden erhalten, indem die Proteinkonzentration der obenstehenden Flüssigkeit der jeweiligen Reaktionsgemische mit Hilfe des Lowry-Verfahrens geprüft wurde.

(*2) Die Werte in dieser Spalte wurden erhalten, indem die Bestimmung unter Verwendung von N-Acetyl-DL-methionin als Substrat durchgeführt wurde.

Herstellung von unbeweglich gemachten Glucoamylase-Präparaten

In Tabelle 2 sind bevorzugte Ausführungsformen des Unbeweglichmachens einer handelsüblichen Glucoamylase (Aktivität 5·ο°ο E/g) aus einer Spezies des Gsnus Ehizopus auf verschiedenen Trägern gezeigt, die in den angegebenen Beispielen zur Trägerherstellung erhalten wurden.

409849/0693

Tabelle

Beispiel ·
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(*1) Der Anteil der gebundenen Glucoamylase wurde bestimmt, indem die Proteinkonzentration in der überstehenden Flüssigkeit des jeweiligen'Reaktionsgemisches mit Hilfe des Lowry-Verfahrens ge.prüft wurde.

(*2) Die enzymatisch^ Aktivität wurde nach folgender Methode bestimmt: Ein Gemisch aus 1o mg einer gegebenen Probe, 1 cnr reinem Wasser und 9 cm einer o,56 /o-igen Lösung von löslicher Stärke (in o,1m Acetatpuffer von pH 4-, 5) wurde 3o Minuten bei 4-O⁰G bebrütet. Das resultierende Gemisch wurde mit Hilfe der DNS-Methode auf reduzierenden Zucker geprüft. Die Aktivitätseinheiten wurden angegeben, indem als Einheit, 1 E/g, die Menge angenommen wurde, die 1o mg reduzierenden Zucker aus 1 g einer gegebenen Probe unter festgesetzten Bedingungen erzeugt.

Herstellung von unbeweglich gemachten Glucoseisomerase-Präparaten.

In Tabelle 3 sind bevorzugte Ausführungsformeη für das Unlöslichmachen handelsüblicher Mikroorganismenzellen gezeigt, die Glucose isomer aseaktivität zeigen (Aktivität 1.ooo GIE) und einer Spezies des Genus Streptomyces angehören. Dabei wurden verschiedene Träger verwendet, die in den vorstehend angegebenen Beispielen zur Trägerherstellung erhalten wurden.

409849/0693

Tabelle

ι Bei- Beispiel
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Gluco-

Zusammensetzung des Ausgangspolymeren

verwendete

Menge .Bedingungen des ¹Unbeweglichma- ^;chens

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- 2oo Maschen) ^:

4-VP-St-DVBz-Copolymeres (I00'

- 2oo Maschen) ,

2-VP-MMA-DVBz- ; Copolymeres (2oo

- 4oo Maschen) ;'

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1,1

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(*1) Die Werte des Anteils an gebundenem Enzym und gebundenen Zellen wurden festgestellt, indem die Proteinkonzentration der überstehenden Flüssigkeit· der Reaktionsgemische nach dem Lowry-Verfahren geprüft wurde.

(*2) Die Enzymaktivität wurde mit Hilfe eines modifizierten Takasaki-Verfahrens bestimmt (Agricultural Biological Chemistry, Vol. 3o, 124-8 (196o)). Die Aktivitätseinheiten wurden angegeben, indem als Einheit 1 GIE die Menge angenommen wurde, die zur Bildung von 1 mg Fructose aus 1 g einer gegebenen Probe während 60 Minuten bei 7o°C führt.

2-£_i_S_.E_i_£_i_2 25_bis_28

Herstellung von verschiedenen unbeweglich gemachten Enzym-Präparaten

Tabelle 4- zeigt bevorzugte Ausführungsformen für das Unbeweglichmachen von G-lucoseoxidase, alkalischer Protease und Invertase auf verschiedenen Trägern, die in den angegebenen Beispielen der Trägerherstellung erhalten worden waren.

409849/0 693

Tabelle

Bei- ■: spiel'

Beispiel

Träger

I Enzym u.Zellen

Zusammensetzung verwendete Art

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Art der Verwendung

Ausbeu-

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Enzym u.Zellen

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tät

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26

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2-VP-St-DVBz-Copolymeres (6o - 1oo Maschen)

2-VP-St-DVBz-Copolymeres (6o ,- 1oo Maschen

•Copolymeres (1ooj - 2oo Maschen) '

2-VP-St-DVBz-Copolymeres (6o - Λ ο ο Maschen

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(1) 2 g Träger wurde mit ο,Im Acetatpuffer (pH 5j5) gepuffert.

(2) Glucoseoxidase (der Sigma Chemical Company, Type II, Aktivität: 18.900 E/g).

(3) 1 g Enzym wurde in 1oo ml o,1m Acetatpuffer (pH 5»5) gelöst.

(4) 2 g Träger wurden mit o,1 m Phosphatpuffer (pH 8,o) gepuffert,

(5) Alkalische Protease (Handelsprodukt, Aktivität: 3o.ooo E/g).

(6) 1 g Enzym wurde in 1oo ml o,1m Phosphatpuffer (pH 8,o) gelöst.

(7) 2 g Träger wurden mit o,1m Acetatpuffer (pH 5»o) gepuffert.

(8) Invertase (Sigma Chemical Company, Aktivität: I00.000 E/g).

(9) 1 g Enzym wurde in I00 ml o,1m Acetatpuffer (pH 5>o) gelöst.

(*1) Die Werte für den Anteil an gebundenen Enzymen und Zellen wurden in gleicher Weise wie in den vorhergehenden Beispielen mit Hilfe des Lovvry-Verfahrens bestimmt.

(*2) Bestimmt durch die Titrationsmethode (Soc. Chem. Ind. (London), Monograph 11, 72 (1961)). Me Aktivitätseinheiten wurden unter der Voraussetzung angegeben, daß einer Einheit/g die Menge entspricht, die zur Oxidation von 1,ouMol Glucose zu Gluconsäure durch 1 g einer gegebenen Probe bei pH 5>1 bei 35°C während einer Minute befähigt ist.

(*3) Bestimmt mit Hilfe der Casein-Methode nach lOlin (Standard Biochemical Experiment, Kobundo, 2o7 (1953))· Die Aktivitätseinheiten wurden unter der Annahme angegeben, daß eine Einheit/g der Bildung einer solchen Menge nicht proteinartiger Substanz pro 1 g einer gegebenen Probe entspricht, daß eine Absorption bei 660 m^u. erzielt wird, die 1 TTyrosin entspricht, nachdem 1 Minute bei pH 8,0 bei 3°C stehengelassen wurde.

(*4) Bestimmt durch die Methode nach E. Fischer und L. Kohtes (HeIv. Chim. Acta., 34-, 1123 (195D). Die Einheiten der Enzymaktivität wurden unter der Annahme angegeben, daß die Einheit, 1 Einheit/g, der Menge entspricht, die 1 mg Hexose

409849/0693

aus Saccharose als Substrat nach 3 Minuten dauerndem Stehenlassen bei 2o°C freisetzt.

Ie 29_bis_32

Herstellung von unbeweglich gemachten Succinylglucoamylase-Präparaten

In Tabelle 5 sind bevorzugte Ausführungsformen für das Unlöslich machen von Succinyl-Derivaten von handelsüblicher Glucoamylase (Aktivität: 5·οοσ E/g) aus Spezies des Genus Rhizopus auf verschiedenen Trägern gezeigt, die in den angegebenen Beispielen zur Trägerherstellung erhalten wurden.

409849/0693

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Das Unbeweglichmachen wurde durchgeführt, indem Succinylglucoamylaselösung unter den gleichen Bedingungen de Unlöslichmachens,wie in Beispielen 15 bis 2o eingesetzt wurde.

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- 3ο -

(*1) Succinylierung der Glucoamylase: 1,o g handelsüblicher Glucoamylase wurde in 5o cur ο, 1m Phosphatpuffer (pH 7»o) gelöst. Unter Rühren des Gemisches bei Raumtemperatur wurde Bernsteinsäureanhydrid anteilweise zugesetzt. Wenn der pH-Wert des Gemisches nach der Reaktion unter 7,0 lag, wurde eine o,2m Natriumcarbonatlösung zugegeben, um den pH-Wert über 7,5 zu erhöhen, und dann wurde erneut Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt. Unter Wiederholung dieses Vorgangs wurde die Gesamtmenge an Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt. Der End-pH-Wert wurde auf 7jö eingestellt.

(*2) Bestimmt nach der gleichen Methode wie der gebundene Anteil an Glucoamylase in Beispielen 15 bis 2o.

(*3) Bestimmt in gleicher Weise wie die Einheiten der Enzym-Aktivität in Beispielen 15 bis 2o.

B e i s g_i e_l _33

Kontinuierliche Bildung von L-Methionin aus N-Acetyl-DL-methionin mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Aminoacylase-Präparats

Eine Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 1o mm und einer Höhe von 3oo mm, die bei 5o°C gehalten wurde, wurde mit 1 g des in Beispiel 1o hergestellten unbeweglich gemachten Aminoacylasematerials gefüllt. Sine o,2m - Lösung von N-Acetyl-DL-methionin (pH 7»o; 5 χ 1o~ m Co⁺⁺) wurde kontinuierlich in einer Strömungsrate von 5^cm /h von oben nach unten durch die Kolonne geleitet. Der aus dem Kolonnenboden abfließende Abstrom wurde colorimetrisch mit Hilfe der Ninhydrinmethode analysiert, um die Ausbeute an L-Methionin zu bestimmen. Nach 3o Tagen einer kontinuierlichen Reaktion wurde die Umwandlung von N-Acetyl-L-methionin in dem Ausgangsmaterial, N-Acetyl-DL-methionin, zu L-Methionin, zu 1oo % festgestellt.

Kontinuierliche Herstellung von L-2-Arainobuttersäure aus N-Acetyl-

409849/0693

DL-2~aminobuttersäure mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Amino acylase-Präparats

Die gleiche Kolonne "wie in Beispiel 33 wurde mit 1 g der unbeweglich gemachten Aminoacylase, die in Beispiel 14- hergestellt worden war, gefüllt. N-Acetyl-DL-2-aminobuttersäure (o,2m, pH 7*o, 5 x Io m Co ) wurde von oben nach unten kontinuierlich in einer Strömungsrate von 5 cnr/h durch die Kolonne geleitet. Die Reaktionstemperatur betrug 5o C. Nach 3o-tägiger kontinuierlicher Reaktion wurde gefunden, daß die Umwandlung von N-Acetyl-L-2-aminobuttersäure zu L-2-Aminobuttersäure 1oo % betrug.

Kontinuierliche Herstellung von Glucose aus Stärke mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Glucoamylase-Materials

Eine Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 15 iam void, einer Höhe von 3oo mm, die bei 4o C gehalten wurde, wurde mit 2,ο g des unbeweglich gemachten Glucoamylase-Materials gefüllt, das in Beispiel 17 hergestellt worden war. Eine Stärkelösung (3o % Gewicht/ Gewicht) (pH 4,5, Dextroseäquivalent = 2o) wurde von oben nach unten kontinuierlich in einer Pließrate von 5 cnr/h durch die Kolonne geleitet. Der aus dem Boden der Kolonne abfließende Abstrom wurde mit Hilfe der DNS-Methode analysiert, um die Ausbeute an Glucose zu bestimmen. Nach 3o~tägiger kontinuierlicher Reaktion wurde gefunden, daß die Umwandlung von Stärke in Glucose mehr als 95 % betrug. Die mit dem Produkt durchgeführte Papierchromatographie zeigte, daß kein Anzeichen der Bildung von Oligodextrose in dem Produkt vorhanden war.

Kontinuierliche Bildung von Fructose aus Glucose mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Glucoseisomerase-Materials

Eine Mantelkolonne mit 26 mm Innendurchmesser und 3oo mm Höhe, die bei 60⁰C geha3.ten wurde, wurde mit einem homogenen Gemisch

409B49/Ü693

aus 1,o g des unbeweglich gemachten Glucoseisomerase-Materials, das gemäß Beispiel 24- hergestellt worden war, und 3,ο g Cellulosepulver als Verdünnungsmittel (2oo - 4-oo Maschen ASTM-Sieb) gefüllt. Eine 3o %-ige (Gewicht/Gewicht) Glucoselösung (pH 8,o, 5 χ 1o Έ HgSO^'7HoO) wurde kontinuierlich in einer Strömungsrate von 5 cm /h von oben nach unten durch die Kolonne geleitet, Der aus dem Kolonnenboden abfließende Abstrom wurde mit Hilfe der Cystein-Carbazol-Methode analysiert, um die Ausbeute an Fructose zu bestimmen. In den frühen Stadien der Reaktion wurde die Bildung von Fructose in einer Menge entsprechend etwa 5o % der Glucose beobachtet (Isomerisierungsrate 5o %). Auch nach 3o-tägiger kontinuierlicher Reaktion war die Isomerisierungsrate immer noch höher als 4-7 %.

Kontinuierliche Herstellung von Gluconsäure aus Glucose unter Verwendung eines unbeweglich gemachten Glucoseoxidase-Präparats

In ein Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 1 Liter wurden 2 g der in Beispiel 25 hergestellten unbeweglich gemach-

7.

ten Glucoseoxidase und 5oo cnr einer 15-gewichtsprozentigen Glucoselösung (pH 5_?2) gegeben, und das Gemisch wurde bei 35⁰C gerührt, indem saubere Luft eingepreßt wurde, um die Reaktion durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde durch geeignete Zugabe von NaOH konstant auf einen pH-v7ert von 5»2 eingestellt. Nach 4-8-stündiger Reaktion wurde der Gehalt des Reaktionsgemisches an nicht umgesetzter Glucose geprüft. Die Analyse zeigte, daß 1oo % Glucose umgesetzt war. Durch Papierchromatographie des erhaltenen Produkts wurde festgestellt, daß es vollständig aus Gluconsäure bestand.

Kontinuierliche Herstellung von Glucose und Fructose aus Saccharose mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Invertase-Präparats

Eine Kolonne mit 1o m Innendurchmesser und 3oo mm Höhe wurde

409849/0693

mit 1 g des in Beispiel 28 hergestellten unbeweglich gemachten Invertase-Materials gefüllt. Bei Raumtemperatur wurde eine 1o %-ige (Gewicht/Gewicht) Saccharoselösung vom pH-Wert 4·,5 von oben nach unten kontinuierlich in einer Fließrate von 5 cmVh durch die Kolonne geleitet. Der aus dem unteren Ende der Kolonne abfließende Abstroin wurde mit Hilfe der DNS-Methode und der Cystein-Carbazol-Methode analysiert, um die Umwandlung zu Glucose zu bestimmen. Selbst nach einem Monat einer kontinuierlichen Reaktion wurde die Umwandlung, von 1oo °/o noch aufrechterhalten.

B_e i s g i e__l 39

Kontinuierliche Herstellung von Glucose aus Stärke mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Succinylglucoamylase-Präparats

Die kontinuierliche Herstellung von Glucose aus Stärke wurde mit Hilfe von 2, ο g Succinylglucoamylase, die in Beispiel 3o erhalten wurde, in gleicher V/eise wie in Beispiel 35 durchgeführt .

Nach kontinuierlich durchgeführter Reaktion während 4-5 Tagen wurde gefunden, daß der Umwandlungsgrad von Stärke zu Glucose mehr als 97 °/° betrug.

409849/0693

Claims

1. Wasserunlösliches, enzymatisch, aktives unbeweglich gemachtes Enzym-Material, enthaltend eine "biologisch aktive Enzym-Substanz auf einem praktisch wasserunlöslichen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß es ein "biologisch aktives Enzym oder Mikroorganismenzellen mit Enzymaktivität ,gebunden an ein wasserunlösliches Anxonenaustauscherharz,enthält, in dessen Moleküleinheiten quaternisierte Pyridinringe vorliegen.

2« Enzym-Material nach Anspruch 1, dadurch gekennze ichn e t, daß es ein wasserunlösliches Anxonenaustauscherharz enthält, das durch Einwirkung eines Quaternisierungsreagens für das Stickstoffatom des Pyridinrings auf ein Copolymeres von Vinylpyridin oder eine³ Vinylpyridin-Derivats mit einem oder mehreren damit copolymerisierbaren Monomeren gebildet ist, die aromatische Vinylverbindungen, äthylenisch ungesättigte Verbindungen, dienisch ungesättigte Verbindungen oder ungesättigte Divinylverbindungen sein können.

3· Enzym-Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Anxonenaustauscherharz mit einer Gesamt-Anionenaustauschkapazität von 2,ο bis 5»ο mÄq/g aufweist .

4. Enzym-Material nach einem der Ansprüche 1 bis 3i dadurch gekennze ichnet, daß es als Anxonenaustauscherharz ein Copolymeres von 4-Vinylpyridin, 2-Vinylpyridxn oder

2-Methyi-5-vinylpyridin enthält.

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5. Enzym-Material nach einem der Ansprüche 2 "bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Anionenaustauscherharz enthält, in welchem als Einheiten von ungesättigten Divinylverbindungen Einheiten von Divinylbenzol oder (PoIy)-äthylenglycoldimethacrylat vorliegen.

6. Enzym-Material nach einem der Ansprüche 1 "bis 5j dadurch gekennzeichnet, daß es ein Anionenaustauscher-

. harz auf Basis eines durch Radikalpolymerisation hergestellten Copolymeren enthält.

7. Enzym-Material nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Anionenaustauscherharz auf Basis eines Copolymeren aus 2o bis 99 Mol-%, vorzugsweise 5o bis 55 Mol-%, Vinylpyridin oder eines Vinylpyridin-Derivats, o,5 bis 3o Mol-%, vorzugsweise 1 bis 2o Mol-%, der ungesättigten Divinyl-Verbindungen undό bis 7° Mol-% anderer Bestandteil e enthält.

8. Enzym-Material nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß es ein Anionenaustauscherharz auf Basis eines Block- oder Pfropf-Copolymerisate aufweist.

9. Enzym-Material nach Anspruch 8, dadurch g e k e η n-

z e ic h η e t, daß das Copolymere 25 bis 75 Mol-%, vorzugsweise 4o bis 6o Mol-%, Vinylpyridin- oder Vinylpyridinderivat-Einheiten enthält.

1o. Enzym-Material nach einem der Ansprüche 2 bis 9> dadurch

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•gekennzeichnet, daß es ein Anionenaustauscherharz enthält, in welchem die Pyridinringe mit Hilfe von Methyl-Chlorid, Methylbromid, Methyljodid oder Dimethylsulfat quaternisiert sind.

11. Enzym-Material nach einem der Ansprüche 1 "bis 1o, dadurch gekennzeichnet, daß es als biologisch aktive Enzym-Substanz Aminoacylase, Glucoamylase, Succinylglucoamy- · läse, Glucoseisomerase, Glucoseoxidase, alkalische Protease, Invertase oder Mikroorganismenzellen aufweist, die diese Enzyme enthalten·

12. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen, enzymatisch aktiven, unbeweglich gemachten Enzym-Materials durch Aufbringen einer biologisch aktiven Enzym-Substanz auf einen praktisch wasserunlöslichen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man 6in biologisch aktives Enzym oder Mikroorganismenzellen, die ein solches Enzym enthalten, mit einem wasserunlöslichen Anionenaustauscherharz umsetzt, in dessen Moleküleinheiten quaternisierte Pyridinringe vorliegen.

13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wasserunlösliches Anionenaustauscherharζ verwendet, das. ein Copolymeres von Vinylpyridin oder eines Derivats des Vinylpyridins mit einem oder mehreren Monomeren darstellt, die aromatische Vinylverbindungen, äthylenisch ungesättigte Verbindungen, dienisch ungesättigte Verbindungen und ungesättigte Divinylverbindungen sein können, die copolymerisierbar mit Vinylpyridin oder dessen Derivaten sind.

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14-. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wasserunlösliches Anionenaustauscherharz verwendet, dessen Pyridinringe mit Methylchlorid, Methylbromid, Methyljodid oder Dimethylsulfat quaternisiert sind.

15. Verfahren zur kontinuierlichen Umwandlung eines Substrats mit Hilfe eines Enzyms, dadurch gekennze ichnet, daß man als Enzym ein wasserunlösliches, enzymatisch aktives unbeweglich gemachtes Enzym-Material nach einem der Ansprüche 1 bis 11 verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man N-Ac etyl-DL-r amino säure mit Hilfe eines unbeweglich gemachten Aminoacylase-Materials kontinuierlich in eine L-Aminosäure überführt.

17. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß man Stärke mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoamylase kontinuierlich in Glucose überführt.

18. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß man Glucose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoseisomerase kontinuierlich in Fructose überführt.

19· Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß man Glucose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoseoxidase kontinuierlich in Gluconsäure überführt.

2o. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß man Stärke mit Hilfe von unbeweglich gemachter

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Succinylglucoamylase kontinuierlich in Glucose überführt.

21. Verfahren nach Anspruch 15j dadurch gekennze ichnet, daß man Saccharose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Invertase kontinuierlich in Glucose und Fructose überführt.

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