DE2941881C2

DE2941881C2 - Organisch-anorganisches Matrixmaterial für immobilisierte Enzyme und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2941881C2
Application number: DE2941881A
Authority: DE
Inventors: Joseph Deerfield Beach Fla. Levy; Ronald Paul Forest Ill. Rohrbach
Original assignee: UOP LLC
Current assignee: Honeywell UOP LLC
Priority date: 1978-10-16
Filing date: 1979-10-16
Publication date: 1983-11-10
Also published as: FR2453898B1; IT1125483B; FR2453898A1; IT7926535A0; DE2941881A1; GB2033399A; DK436379A; CA1128917A; GB2033399B; ES485047A1

Description

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Es ist bekannt, wasserlösliche Enzyme in immobilisierter oder trägerfixierter Form zum Beispiel auf analytischen, medizinischen und industriellen Anwendungsgebieten zu verwenden. In dieser Form werden sie beispielsweise als Packungen von Kolonnen oder in w gerührten Reaktoren etwa zur industriellen Herstellung von Lebensmitteln oder alkoholischen Getränken, zur Auftrennung von Aminosäuren, zur Modifizierung von Penic'llin unter Bildung verschiedener Substrate desselben, beim Zartmachen von Fleisch, für Detergenszusammensetzungen, bei der Lederherstellung, bei der Verwendung von Carbohydrasen, bei der Stärkehydrolyse, Rohrzuckerinversion. Glucoseisomerisierung, bei der Verwendung von Nucleasen für die Geschmackssteuerung oder bei der Verwendung von Oxidasen bei der Oxidationsverhinderung und bei der Farbsteuerung von Nahrungsmittelprodukten eingesetzt. Durch die Immobilisierung lassen sich die Enzyme aus den Lösungen zur Wiederverwendung isolieren. Im allgemeinen ergibt die Immobilisierung auch eine bessere Umgebungs- und Strukturbeständigkeit, ein Minimum an Auslaufproblemen und Problemen der Materialhandhabung sowie die Möglichkeit, die Aktivität des Enzyms zu steigern.

Es sind verschiedene allgemeine Methoden und Modifikationen derselben zur Immobilisierung und Trägerfixierung von Enzymen bekannt Eine erste Methode besteht in einer bloßen Adsorption des Enzyms auf der Oberfläche eines Trägers. Man bekommt bei dieser Methode nur schwache Bindungskräfte zwischen dem Träger und dem Enzym, so daß letzteres relativ leicht desorbiert und ausgewaschen wird. Gemäß der US-PS 35 56 945 wird das Enzym in ähnlicher Weise über Silanol-Gruppen eines anorganischen Trägers direkt an diesen gebunden. Die US-PS 35 19 538 befaßt sich mit trägerfixierten Enzymen, bei denen die Enzyme chemisch über ein intermediäres Silankupplungsmittel an einen anorganischen Träger gebunden sind.

Eine andere allgemeine Methode besteht darin, ein Enzym in einem Gelgitter oder Polymer&e-üst einzuschließen. Solchermaßen trägerfixierte Enzyme haben verminderte Aktivität und schlechte mechanische Festigkeit in kontinuierlichen Fließsystemen, was zu einer Veränderung der Teiichengrößen und Porengrößen und als Folge hiervon zu Verstopfungen der Apparatur und zur Freisetzung von Enzym führt. Außerdem können einige Porengrößen auch so klein werden, daß große Diffusionshindernisse für den Transport des Substrates und Produktes zu einer Reaktionsverzögerung führen, und dies trifft besonders dann zu, wenn man ein Substrat mit hohem Molekulargewicht verwendet. Methoden unter Polymerisieren mit Röntgen- oder y-Strahlen sind aufwendig und nicht für großtechnischen Maßstab geeignet und bergen die Gefahr einer Deaktivierung der Enzyme in sich.

Eine weitere allgemeine Methode ist die Vernetzung des Enzyms selbst oder auch mit dem Träger mit Hilfe bifunktioneller Substanzen. Diese Methode führt zu einem Mobilitätsmangel des Enzyms und einer sterischen Hinderung seiner aktiven Gruppen, da es nicht die für maximale Aktivität erforderliche Konfiguration einnehmen kann. Dies führt zu einer erheblichen Deaktivierung des Enzyms. Solche Verfahren sind in den US-PSen 37 96 634 und 37 05 084 beschrieben, bei denen das Enzym zunächst als Schicht auf Kieselsäureteilchen bzw. einem makroporösen Reaktorkern absorbiert und anschließend mit sich selbst vernetzt wird. Ein ähnliches Verfahren betrifft die US-PS 36 54 083. bei dem das Enzym mit einem organischen wasserlöslichen Träger vernetzt wird. Die so hergestellten immobilisierten Enzyme haben geringe Festigkeit und verminderte Aktivität.

Schließlich besteht eine vierte allgemeine Methode in einer kovalenten Bindung des Enzyms an ein Polymer, das seinerseits r.uf einem inerten Träger niedergeschlagen ist. Diese Methode erfordert im allgemeinen aufwendige Vorbehandlungen, besonders durch Diazoticrung. Außerdem ist diese Methode auf bestimmte Stoffkombinationen beschränkt, da das Polymer adsorptiv fest auf dem Träger haften und sich andererseits mit dem Enzym unter Ausbildung kovalenter Bindungen umsetzen muß.

Die US-PS 39 59 080 beschreibt ein Matrixmaterial für immobilisierte Enzyme, das durch Umsetzen eines organischen Polymers mit vernetzbaren Säurehydrazid- oder Säureazidgruppen mit einem bifunktionelten Vernetzungsmittel, wie Glutaraldehyd, erhalten wurde. Dieses Matrixmaterial hat aber schlechte mechanische Stabilität.

Schließlich betreffen auch die GB-PSen 14 85 122 und

14 85123 organische Malrixmaterialien, die über bifunktionelle Monomere an ein Enzym gebunden werden. Solche Matrixmaterialien besitzen geringe Deformationsbeständigkeit und Abriebbeständigkeit insbesondere in großen Durchlaufapparaten.

Die der Erfindung zugrunde Hegende Aufgabe bestand somit darin, ein Matrixmaterial für immobilisierte Enzyme mit erhöhter Deformations- und Abriebbeständigkeit und mit möglichst geringer Aktivitätseinbuße durch die Immobilisierung zu bekommen.

Das erfindungsgemäße organisch-anorganische Matrixmaterial für immobilisierte Enzyme aus einem an einem porösen anorganischen wasserunlöslichen festen Träger fixierten Polymermaterial ist dadurch gekennzeichnet, daß das Polymermaterial ein Umsetzungsprodukt von Aminopolystyrol und einem bifunktionellen Monomer ist, endständig funktioneile Gruppen besitzt und durch Einschluß in den Poren des Trägers an diesem fixiert ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man in den Pore·« eines porösen anorganischen wasserunlöslichen Yesten Trägers ein Umsetzungsprodukt von Aminopolystyrol und einem bifunktionellen Monomer in situ bildet.

Zweckmäßig lagen man ein Aminopolystyrolsalz auf 2% dem Träger aus einer wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert kleiner als 7 ab und setzt anschließend die resultierende Zusammensetzung aus f^minopolystyrol und festem Träger mit einem bifunktionellen Monomeren unter Bildung des erwünschten organisch-anorgani- jo sehen Matrixmaterials um.

Nach einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist der Träger γ- Tonerde mit daran gebundenem Umsetzungsprodukt von Amk.opolysi/rol und einem Überschuß von Glutaraldehyd. -Dieses Matrixmaterial r> erhält man zweckmäßig, indem man da^ Chlorwasserstoffsäuresalz von Aminopolystyrol auf -/-Tonerde aus einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 1 bis 4 ablagert, danach die resultierende Zusammensetzung aus Aminopolystyrol und y-Tonerde ■»« mit einem GlutaraldchydUberschuß umsetzt und das resultierende organisch-anorganische Matrixmaterial gewinnt.

Eine andere Methode besteht darin, daß man einen festen porösen anorganischen, wasserunlöslichen Trä- -n ger mit einem Styrolmonomeren behandelt, die Zusammensetzung aus Styrol und festem Träger Polymerisationsbedingungen unterzieht, die resultierende Zusammensetzung aus Polystyrol und festem Träger nitriert, die nitrierte Zusammensetzung aus Polystyrol '>" und festem Träger reduziert und danach die resultierende Zusammensetzung aus Aminopolystyrol und festem Träger mit einem bifunktionellen Monomeren unter Bildung des erwünschten organisch-anorganischen Matrixmaterials umsetzt. r>

Bei den erfindungsgemäßen Matrixmaterialien ist das Umsetzungsprodukt oder Copolymermaterial von Aminopolystyrol und bifunktioneilem Monomer im wesentlichen in den Poren des porösen Trägers eingeschlossen. Das Umsetzungsprodukt oder Copolymer enthält daran t>o hängende Gruppen, die endständig angeordnete, funktiönelle Reste enthalten, die es ermöglichen, ein Enzym kovalent an diese Gruppe zu binden.

Beispiele anorganischer Träger, die als eine Komponente der Matrixmaterialien nach der Erfindung benutzt ^6ä werden können, bestehen beispielsweise aus solchen porösen Materialien, wie Tonerde, die Porendurchmesser im Bereich von 100 Ä bis zu 55 000 Ä haben und die auch eine scheinbare Schüttdichte im Bereich von 0,1 bis 0,6 haben. Die Oberfläche des speziellen anorganischen porösen Trägers variiert in einem relativ großen Bereich, wobei dieser Bereich bei 1 bis 500 m²/g und bevorzugt bei 5 bis 400 mVg liegt. Die Gestalt des anorganischen porösen Trägermaterials variiert je nach der speziellen Trägertype. Beispielsweise kann das Trägermaterial in kugeliger Form, in feinteiliger Form im Bereich von feinen Teilchen bis zu Makrokugeln, als ein keramischer Monolith, der gegebenenfalls mit ein^m porösen anorganischen Oxid beschichtet sein kann, in der Form einer Membran oder in der Form keramischer Fasern allein oder zu einem Tuch gewebt, als Kieselsäure, als Gemische von Metalloxiden. Sandteilchen, Zeolithen oder Glimmer vorliegen. Die Teilchengröße kann auch über einen weiten Bereich variieren und hängt wiederum von der speziellen Trägertype und auch von dem Substrat uiid der Type der Vorrichtung, in welcher das immobilisierte Enzym verwendet werden soll, ab. Wenn beispielsweise der Träger in Kugelform vorliegt, können die Kugeln im Größenbereich mit einem Durchmesser von 0,25 bis 635 mm vorliegen, wobei der bevorzugte Größenbereich bei 0,79 bis 3,17 mm liegt. Wenn der Träger in Teilchenform vorliegt, kann die Teilchengröße auch im Bereich zwischen diesen Grenzen liegen. Wenn der Träger in der Form keramischer Fasern vorliegt, können die Fasern im Bereich von 0,5 bis 20 .um Durchmesser vorliegen oder, wenn der Träger in der Form einer Membran vorliegt, kann die Membran ein keramisches Material sein, das zu einem dünnen Bogen gegossen wurde.

Die porösen Trägermaterialien können auch mit verschiedenen Oxiden der oben beschriebenen Type beschichtet sein oder aus Gemischen derselben bestehen, oder sie können in sie eingelagert verschiedene andere anorganische Materialien, wie Borphosphat, enthalten, wobei diese anorganischen Materialien dem Trägermaterial spezielle Eigenschaften verleihen. Eine besonders brauchbare Trägerform besteht aus einem Keramikkörper, der die hier für Materialien nach der Erfindung beschriebene Porosität haben kann, oder er kann eine Bienenwabenform mit verbindenden Makrokanälen in dem gesamten Träger haben, wie Materialien, die gewöhnlich als Monolithe bekannt sind und mit verschiedenen Typen von poröser Tonerde, von porösem Zirkonoxid oder Titanoxid beschichtet sein können. Die Verwendung einer solchen Trägertype hat den besonderen Vorteil, daß sie den freien Fluß hochviskoser Substrate gestattet, die oftmals bei gewerblich angewendeten enzymkatalysierten Reaktionen auftreten.

Eine Komponente des organischen Anteils des Matrixifiaterials ist ein Aminopolystyrol. während die andere Komponente ein bifunktionelles Monomeres ist. Das bifunktionellc Monomere als Reaktionspartner ist in genügendem Überschuß vorhanden, wie er benötigt wird, um daran hängende endständig funktionell Gruppen zu erzeugen, wobei das bifunktionellc Monomere in einem Überschuß ven 2 bis 50 Mol. bezogen auf die reaktiven Reste des Trägers, vorliegt und wobei der bevorzugte Bereich ein Überschuß von 4 bis 25 Mol ist.

Die funktioneilen Gruppen des bifunktionellen Monomeren sind bekannte reaktive Reste, die in der Lage sind, leicht eine Bindung mit Aminogruppen einzugehen, wie Carbonylreste. Acylrcste oder Isocyanatoreste. Die reaktiven Gruppen der bifunktionellen

Monomeren sind vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise durch Ketten voneinander getrennt, die 4 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten. Die reaktiven Reste der bifunktioneüen Bindungen sind daher in der Lage, sich kovalent sowohl mit der Aminopolystyrolkomponente des Matrixmaterials als auch anschließend, nach dem Auswaschen von unumgesetzten Materialien, mit den Aminogruppen des Enzyms zu verbinden, welches in einer nachfolgenden Stufe zugesetzt wird, wobei dieses Enzym dann kovalent an die reaktive funktionelle Gruppe in dem Endabschnitt der an dem Träger hängenden Kette gebunden wird. Das dann erhaltene immobilisierte Enzym hat hohe Aktivität und hohe Stabilität Bei einem großen Oberschuß an bifunktionellem Monomer enthält das Matrixmaterial daran hängende Gruppen, weiche Abstandshaltermoleküle bilden, wobei diese Moteküle sich von dem Matrixmaterial aus erstrecken und an den Endabschnitten reaktive Reste haben, die mit dem Enzym reagieren. Durch diese Abstandshalter können die Enzyme eine größere Mobilität haben und gestatten so, daß die katalytische Aktivität des Enzyms für längere Zeitdauer auf einem hohen Wert bleibt, wenn das Enzym nach eiuer der bekannten Methoden immobilisiert wurde.

Beispiele von Enzymen, die durch die kovalente Bindungsreaktion an das erfindungsgemäße Matrixmaterial immobilisiert werden können und die eine Aminogruppe enthalten, welche mit einem Aldehyd-, Isocyanato-, Acyl- oder Esterrest der Gruppe reagieren kann, die an dem in den Poren eines porösen Trägermaterials eingeschlossenen Polymermaterial hängt, sind beispielsweise Trypsin, Papain, Hexokinase, Betagalactosidase (Lactase), Feigenprotease, Bronzelain, Lactassedehydrogenase, Glucoamylase, Chymotrypsin, Pronase, Glucoseisomerase, Acylase, Invertase, Amylase, Glucoseoxidase, Pepsin, Rennin, Protease. Xylanase und Cellulase. Obwohl oben als funktionelle Reste Aldehydgruppen oder Isocyanatogruppen erwähnt wurden, liegt es auch innerhalb des Erfindungsgedankens, daß sie andere funktionelle Reste sein können. die in drr Lage sind, mit Carboxyl-, Sulfhydryl- oder anderen Resten, die gewöhnlich in Enzymen vorliegen, zu reagieren.

Die Herstellung der Matrixmaterialien nach der Erfindung erfolgt vorzugsweise in Ansätzen. Bei einer bevorzugten Herstellungsmethode wird das anorganische Trägermaterial mit einer "lösung, bevorzugt mit einer wäßrigen Lösung, eines Aminopolystyrolsalzes behandelt, wobei die wäßrige Lösung auf einem pH-Wert kleiner als 7 und vorzugsweise im Bereich von I bis 4 gehalten wird. .Seispiele von Aminopolystyrolsalzen. die verwendet werden können, sind das Chlorwasserstoffsäuresalz, das Schwefelsäuresalz, das Salpetersäurcsalz und das Phosphorsäuresalz von Aminopolystyrol. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung wird auf dem 5;, erwünschten V/ert durch Zugabe einer Säure, wie der oben genannten, gehalten. Nach Beendigung der Zugabe des Säuresalzes des Aminopoly.styrols, welche bevorzugt bei Umgebungstemperatur und Atmosphärendruck erfolgt, wird das Gemisch zweckmäßig unter Vakuum während einer Zeitdauer, die im Bereich von 0.5 bis 4 Stunden oder mehr liegen kann, gehalten. Nach Beendigung der Reaktionszeit wird die unadsorbierte Lösung entfernt, und man läßt den behandelten Träger an der Luft trocknen. Danach wird die organisch-anorganische Zusammensetzung mit einem ausreichend großen Überschuh eines bifunktionellen Monomeren in einem Molverhältnis Von 2 bis 50 in bezug auf den Aminogruppengehalt des anfänglichen. Aminopolystyrols behandelt. Das bifunktionells Monomere wird auch vorzugsweise in einer wäßrigen Lösung zugegeben, die nach der Umsetzung mit dem AminGpolystyrol enifernt wird, und das resultierende Matrixmaterial wird gewaschen, um bifunktionelles Monomeres, das noch vorhanden sein kann, abzutrennen. Das Verfahren kann in einem Temperaturbereich von 4 bis 6O⁰C, vorzugsweise bei 20 bis 25" C, durchgeführt werden.

Bei einer anderen bevorzugten Herstellungsmethode wird ein Emulsionssystem hergestellt, das das Styrol zusammen mit Additiven, wie Natriumhydrogenphosphat oder Natriumlauryisulfat in wäßriger Lösung enthält. Der feste Träger, der in einer Form vorliegen kann, die oben im einzelnen diskutiert wurde, wie als Pellets, Perlen oder Monolithe, wird in die Lösung gelegt, und man läßt ihn die Emulsion während einer Zeit, die im Bereich von 0,5 bis 2 Stunden liegen kann, absorbieren, vorzugsweise bei Unteratmosphärendruck, gewöhnlich in einem Vakuum. Nach Beendigung der Adsorptionsperiode wird dann das Gemisch auf eine Temperatur im Bereich von 50 ins 100⁰C erhitzt, wobei zweckmäßig ein Polymerisationskatalysator, wie Kaliumpersulfat, benutzt wird. Nach einer Polymerisationszeit, die im Bereich von 2 bis 4 Stunden liegen kann, wird das Erhitzen unterbrochen, und der Träger, der das poi^merisierte Styrol enthält, wird aus der wäßrigen Lösung gewonnen, mit destilliertem Wasser und einem Lösungsmittel, wie Aceton oder Benzol gewaschen, um unumgesetztes Styrol zu entfernen. Alternativ kann das Styrol auch polymerisiert werden, ohne zu einer Emulsionspolymerisation Zuflucht zu nehmen. Wenn diese Herstellungsmethode angewendet wird, wird der Träger nur dem flüssigen Styrolmonomer zugesetzt, und man läßt den Träger das Styrol vorzugsweise unter Vakuum während einer vorbestimmten Zeitdauer adsorbieren. Am Ende dieser Adsorptionsperiode wird Wasser und ein Katalysator, wie Kaliumpersulfat, zugesetzt, das Gemisch wird dann auf den oben erwähnten Temperaturbereich erhitzt, und man läßt die Polymerisation ablaufen. Am Ende der Polymerisationsperiode wird die Zusammensetzung aus Polystyrol und festem Träger in ähnlicher Weise, wie oben beschrieben, gewonnen.

Sodann erfolgt eine Nitrierung durch Zugabe der Zusammensetzung aus Polystyrol uikI festem Träger zu einem Nitrierungsmittel, wie Salpetersäure und vorzugsweise zu 90%iger rauchender Salpetersäure. Die Zugabe erfolgt mit relativ geringer Geschwindigkeit, während man die Salpetersäure vorzugsweise auf einer Temperatur unter Umgebungstemperatur im Bereich von 0 bis 10°Ciiält. indem man mit Hilfe eines Eisbades oder mit Kühlschlangen äußerlich kühlt. Solche niedrigen Temperaturen sind jedoch nicht kritisch für den Erfolg der Nitrierungsreaktion. und gegebenenfalls können auch höhere Temperaturen angewendet werden. Die Nitrierung erfolgt beispielsweise während 1 bis 4 Stunden oder mehr, wonach die: nitrierte Zusammensetzung gewonnen und wieder mit Wasser und einem Lösungsmittel Gewaschen wird.

Danach wird die Zusammensetzung aus Nitropolystyrol und festem Träger einer wäßrigen Lösung zugesetzt, die ein Reduktionsmittel, wie Nat.riunvdiihionit, enthält, wonach die Lösung auf eine Temperatur im Bereich von 50 bis 100⁰C erhitzt und auf dieser Temperatur eine Zeit gehalten wird, ν 'e 0,5 bis 2 Stunden. Am Ende dieser Zeitperiode wird das Material aus Aminopolystyrol und Träger gewonnen, gewaschen, unter Vakuum getrock-

net und vorzugsweise unter einer .Stickstoffatmosphäre gehalten. Dieses Material aus Aminopolystyrol und festem Träger wird nun mit einem ausreichend großen Überschuß von bifunktionellem Monomeren mit einem Molverhältnis von 2 bis 50, bezogen auf die Aminogrup- '· pen des Aminopolystyrols. behandelt. Dieses bifunktionelle Monomere wird vorzugsweise in einer wäßrigen Lösung zugesetzt, wobei das gebildete Umsetzungsprodukt im wesentlichen in den Poren des anorganischen Trägers eingeschlossen ist. Das Trägermatrixmatcrial '" wird dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um unumgeset/tes bifunktionellcs Monomeren /u entfernen.

Die Bindung des En/yms an das Matrixmaterial erfolgt gewöhnlich in einer wäßrigen Lösung. Nach '■ Entfernung der unumgesetzten Materialien mit herkömmlichen Mitteln, wie durch Waschen, bleibt das Enzym, das kovalent an die hängenden fiinküonalisierten Gruppen gebunden ist. an deren Endabsehnitte fixiert. F.s ist daher leicht ersichtlich, daß das gesamte -'" Immobilisierungsverfahren in einfacher und billiger Weise durchgeführt werden kann, wie beispielsweise in einer mit den anorganischen Trägern gepackten Kolonne, indem man wäßrige oder billige Lösungsmittelmedien verwendet. Das Verfahren wird in der Weise -'"> durchgeführt, daß man ein Minimum an Betriebsstufen benutzt und außerdem leicht die überschüssigen Reaktionspartner, ungebundenes Enzym und fertige Zusammensetzung gewinnt bzw. rückgewinnt.

Das Matrixmaterial kann auch kontinuierlich herge- !" stellt werden. Eine Methode, die angewendet werden kann, wird in der Weise durchgeführt, daß man eine Menge des festen Trägers in irgendeiner erwünschten Form, wie als Pulver, Pellets oder Monolithe in eine geeignete Apparatur gibt, die gewöhnlich aus einer '■ Kolonne besteht, wonach eine vorzugsweise wäßrige Lösung eines Aminopolystyrolsalzes eingeführt wird üFiü in r\.oniiiKi ΠΊΐΐ ucfn ι rägCf ϊπΐΐ, uiS icl/icicr Ulli der Lösung gesättigt ist. Die wäßrige Lösung wird auf einem pH-Wert kleiner als 7 und vorzugsweise auf einem ⁴" pH-Wert im Bereich von I bis 4 gehalten, indem man eine geeignete Säure zugibt. Nach Sättigung des Trägers läßt man den Überschuß ablaufen, und das bifunktionelle Monomere wird vorzugsweise in wäßriger Lösung auf die Kolonne aufgegeben, wobei dieses ⁴"> bifunktionelle Molekül in einem Überschuß im Bereich von 2 bis 50 Mol, bezogen auf den Aminogehalt des Aminopolystyrols. vorliegt. Die Bildung des Matrixmaterial kann 1 bis 22 Stunden benötigen. Nach der erwünschten Verweilzeit wird das überschüssige Mono- '" mere, wie Glutaraldehyd. entfernt, indem man es ablaufen läßt, und danach wird sorgfältig mit Wasser gewaschen, um unumgesetzte Materialien zu entfernen.

B e i s ρ i e I 1 -₅

In diesem Beispiel wurde 1 g poröse Tonerde mit einer Teilchengröße von 0,4 bis 0,7 mm, einer scheinbaren Schüttdichte von 034 und einem Porengrößenbereich von 200 Ä bis 10 000 Ä mit 10 ml eines 5%igen (Gewicht je Volumen) Aminopolystyrol mit einem Molekulargewicht von 22 000, gelöst in wäßriger 0,1 N Salzsäure, vermischt. Die beiden Komponenten wurden bei Raumtemperatur miteinander vermischt, und man ließ 1 Stunde stehen. Am Ende dieser Zeit wurde die Lösung entgast, filtriert, und der feste Träger, der darauf adsorbiertes Aminopoiystyro! enthielt, wurde getrocknet Danach wurde die Zusammensetzung mit 10 ml einer l,5°/oigen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd, die einen pH-Wert von 1.4 hatte, vermischt und I Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Am Ende dieser einstündigen Periode wurde der überschüssige Glutaraldehyd dekantiert, und das organisch-anorganische Matrixmaterial wurde sorgfältig mehrmals mit Wasser gewaschen. Das fertige immobilisierte Enzym wurde dann durch Behandlung des Matrixmaterials mit 6482 Einheiten einer handelsüblichen Glucoamylu.se hergestellt. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgte während einer Zeit von 16 Stunden, während die Temperatur mit Hilfe eines Eisbades auf 4°C gehalten wurde. Am Ende der I6stündigen Periode wurde das restliche und ungebundene Enzym mit Wasser in einer Na triumehloridlösung ausgewaschen.

Das immobilisierte Enzym wurde in eine Säule gepackt, und eine 30%ige Lösung (Gewicht je Volumen) von Stärke wurde über die Perlen geleitet, während die Temperatur auf bC'C gehalten wurde. Die Stärkelösung wurde während 2 Stunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min, über die Perlen geschickt. Danach wurde die gebildete Glucoscmenge bestimmt. Es wurde gefunden, daß die Aktivität des immobilisierten Enzyms 3240 Einheiten je Gramm bei der Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min, war. Die Einheit wird als die Anzahl der Mikromole Glucose definiert, die je Minute je Gramm immobilisierten Enzyms gebildet wird.

Beispiel 2

Das obige Experiment wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß das Enzym, nämlich Glucoamylase, mit Hilfe eines bekannten lsopropanolausfällungsverfahrcns gereinigt wurde, was zu einer l,3lachen Erhöhung der Reinheit des Enzyms führt. Wenn dieses gereinigte Enzym in ähnlicher Weise wie oben immobilisiert und benutzt wurde, um Stärke in Glucose umzuwandeln, wurde gefunden, daß das immobilisierte Enzym eine Aktivität von 4070 Einheiten je Gramm bei einer riieügescnwindigkeii von 2 ml/Min, besaß.

Beispiel 3

Wie im obigen Beispiel I wurde I g Tonerde mit einer Teilchengröße von 0,5 bis 0.7 mm und einer scheinbaren Schüttdichte von 0.3 zu 10 ml einer Lösung zugesetzt, die 5 Volumen-% Aminopolystyrol, gelöst in wäßriger 0.1 N Salzsäure, enthielt. Das Gemisch wurde während 1 Stunde auf Raumtemperatur gehalten, wonach es entgast, filtriert und das Material aus Aminopolystyrol und Tonerde getrocknet wurde. Die getrockneten Perlen wurden dann zu 10 ml einer 1.5°/oigen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd zugesetzt, die einen pH-Wert von 1.4 hatte. Das Gemisch wurde 1 Stunde auf Raumtemperatur gehalten, und danach wurde der überschüssige Glutaraldehyd dekantiert. Das organischanorganische Matrixmaterial wurde mehrfach mit Wasser gewaschen und danach mit 1300 Einheiten Glucoseisomerase behandelt, die eine spezifische Aktivität von 8,5 Einheiten je Milligramm Protein besaß. Die Kupplung erfolgte bei einer Temperatur von 4° C während 22 Stunden. Die resultierende immobilisierte Glucoseisomerase, worin das Enzym kovalent an die freien Aldehydfunktionen des Umsetzungsproduktes von Aminopolystyrol mit überschüssigem Glutaraldehyd gebunden war, wurde sorgfältig mit Wasser und einer wäßrigen 2 M Natriumchloridlösung gewaschen, um unumgesetztes Enzym zu entfernen.

Das immobilisierte Enzym wurde als Packung in eine geeignete Säule gegeben, und eine 45%ige Fructoselösung, die einen pH-Wert von 8 besaß und 5 - 10~^JM

Magnesiumchlorid enthielt, wurde durch die Konjugatschicht bei einer Temperatur von hO'C während 2 Stunden geschickt. Die Glucose und die Fließgeschwindigkeit wurden bestimmt, und es wurde gefunden, daß dieses immobilisierte Enzym eine Aktivität von 700 Einheiten je Gramm bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min, mit einer Kupplungseffizienz von 60% hatte. Es wurde weiter bestimmt, daß das immobilisierte Eruym eine Halbwcrtzeit von 22 Tagen bei 60⁰C in kontinuierlichem Säulenbetrieb unter Verwendung einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min. Beschickung besaß.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wurde eine Tonerde mit einer

1 L'ilchcngröße von 0,18 bis 0.25 mm und einer scheinbaren Schüttdichte von 0,3 mit Aminopolystyrol und einem Überschuß von Glutaraldehyd in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unter Bildung eines organischanorganischen fviatnxiiiiliciuiis be-handCii. DiCSCS Würde mit Glucoseisomerase behandelt, die eine spezifische Aktivität von 15 Einheiten je Milligramm besaß. Die Kupplung wurde bewirkt, indem 2800 Enzymeinheiten dem Matrixmaterial bei einer Temperatur von 4"C während 22 Stunden angeboten wurden. Nach sorgfältigem Waschen des immobilisierten Enzyms wurde dieses als Packung in eine Säule gegeben, und eine Fructosebeschickung ähnlich der. die in Beispiel 3 oben beschrieben wurde, wurde durch die Schicht während

2 Stunden bei einer Temperatur von 60°C hindurchgeschickt. Das Produkt wurde bestimmt, und man fand, da j das immobilisierte Enzym eine Aktivität von 1200 Einheiten je Gramm mit einer Kupplungscffizicnz von 54% besaß.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wurde 1 g poröser Tonerdepellets von ? mm mit einer scheinbaren Schüttdichte von 0.344 und einem Porengrößenbereich von 200 Ä bis 10 000 Ä in eine Emulsion gegeben, die aus 0.5 g Natriumhydrogenphosphat. 0,5 g Natriumlaurylsulfat, 2 ml Styrol und 20 ml destilliertem Wasser hergestellt worden war. Man ließ die Perlen sich in dieser Emulsion unter Vakuum während einer Zeit von 1 Stunde vollsaugen, wonach das Gemisch dann während einer Zeit von 3 Stunden auf eine Temperatur von 100⁰C in Gegenwart von 0.5 g Kaliumpersulfat als Polymerisationskatalysator erhitzt wurde. Danach wurden die Perlen filtriert, um Flüssigkeit zu entfernen, und mit destilliertem Wasser und 100 ml Aceton gewaschen. Danach wurde langsam Ig Polystyrol-Tonerdeträger zu 50ml 90%iger rauchender Salpetersäure zugesetzt. Die Zugabe des Trägers zu der Säure erfolgte bei einer Temperatur von etwa OC bis IOC. wobei die Temperatur erreicht wurde, indem die Apparatur in einem Eisbad gekühlt wurde. Nach 2 Stunden wurde der nitrierte Träger entfernt und mit Wasser und Aceton gewaschen. Um die

-, Reduktion des nitrierten Polystyrol-Tonerdcirägcrs zu erreichen, wurde 1 g der Zusammensetzung zusammen mit I g Natriumdithionil zu 100 ml destilliertem Wasser zugesetzt. Das Gemisch wurde dann zu Sieden erhitzt und auf dieser Temperatur 1 Stunde gehalten. Danach

κι wurde der zusammengesetzte Träger aus Aminopolystyrol und Tonerde mit destilliertem Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten.

Der erhaltene Aminopolystyrol-Tonerdeträger wur-

ι , de dann mit 10 ml einer 50%igcn wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd, die einen pH-Wert von 3,5 besaß, während einer Zeit von I Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Danach wurde der überschüssige Glutaraldehyd dekantiert, und das organisch-anorganische Mairix-

M, material würde sorgfähig :;ii! Wasser mehr™«!.·, gewaschen, i.m unumgcsetzte Reagentien wirksam zu entfernen. Das fertige immobilisierte Enzym wurde dann hergestellt, indem das Matrixmaterial mit 8300 Einheiten einer handelsüblichen Glucoseamylase wäh-

j-, rend einer Zeit von 16 Stunden behandelt wurde, wobei die Temperatur des Gemisches auf etwa 4°C mit Hilfe eines Eisbades gehalten wurde. Sodann wurde das restliche und ungebundene Enzym mit Wasser und einer Natriumchloridlösung ausgewaschen.

jn Das immobilisierte Enzym wurde als Packung in eine Säule eingefüllt, und eine 30%ige Lösung (Gewicht je Volumen) von Stärke wurde über die Perlen mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min, während einer Zeit von 2 Stunden geschickt, während die Temperatur auf

j-, 6O⁰C gehalten wurde. Danach wurde die gebildete Glucosemenge bestimmt. Es wurde gefunden, daß die Aktivität des immobilisierten Enzyms 695 Einheiten je Gramm bei der Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min, war. Der Begriff »Einheit« wird als die Mikromolmenge

jn Glucose definiert, die je Minute je Gramm des immobilisierten Enzymkonjugates gebildet wurde.

Beispiel 6

Das Beispiel 5 wurde mit der Ausnahme wiederholt.

₄- daß das Enzym mit Hilfe eines bekannten Isopropanolausfällungsverfahrens gereinigt wurde. Wenn das gereinigte Enzym in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben immobilisiert und zur Umwandlung von Stärke in Glucose benutzt wurde, fand man. daß das

₃₍₎ immobilisierte Enzymkonjugat eine Aktivität von 852 Einheiten je Gramm bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min, besaß.

Claims

Patentansprüche:

I. Organisch-anorganisches Matrixmaterial für immobilisierte Enzyme aus einem an einem porösen anorganischen wasserunlöslichen festen Träger fixierten Polymermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymermateria! ein Umsetzungsprodukt von Aminopolystyrol und einem bifunktioneUen Monomer ist, endständig funktioneile Gruppen besitzt und durch Einschluß in den Poren des Trägers an diesem fixiert ist

Z Verfahren zur Herstellung eines organisch-anorganischen Matrixmaterials nach Ansprach I, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Poren eines porösen anorganischen wasserunlöslichen festen Trägers ein Umsetzungsprodukt von Aminopolystyrol und einem bifunktioneUen Monomer in situ bildet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man auf dem Träger ein Aminopolystyrolsalz aus einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert kleiner als 7 ablagert und anschließend mit einem bifunktioneUen Monomeren versetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminopolystyrolsalz das Hydrochlorid oder Schwefeisäuresalz von Aminopolystyrol verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4. dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminopolystyrol mit einem Oberschuß des bifunktioneUen Monomers umsetzt

6. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß man den Träger mit Styrolmonomeren behandelt, dieses in den Poren des Trägers polymerisiert, das so gebildete Polystyrol nitriert n und sodann reduziert und das so erhaltene Aminopolystyrol schließlich mit dem bifunktioneUen Monomeren umsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5. dadurch gekennzeichnet, daß man als bifunktionelles Mono- -to meres Glutaraldehyd verwendet.