DE2516935B2 - Mit silanen gepfropfte kieselsaeure und ihre verwendung - Google Patents
Mit silanen gepfropfte kieselsaeure und ihre verwendungInfo
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- C04B20/00—Use of materials as fillers for mortars, concrete or artificial stone according to more than one of groups C04B14/00 - C04B18/00 and characterised by shape or grain distribution; Treatment of materials according to more than one of the groups C04B14/00 - C04B18/00 specially adapted to enhance their filling properties in mortars, concrete or artificial stone; Expanding or defibrillating materials
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Description
Gegenstand der Erfindung ist die im vorstehenden Hauptanspruch näher bezeichnete gepfropfte Kieselsäure
und ihre Verwendung zum Fixieren von Enzymen.
Anorganische Trägerstoffe sind im allgemeinen bekannte Produkte, deren chemische Beschaffenheit
jedoch für manche Verwendungszwecke, beispielsweise zum Fixieren von Enzymen, verändert werden muß,
indem man auf die Trägerstoffe eine Gruppe aufpfropft, die die Fixierung bzw. Bindung zwischen Trägermaterial
und Enzym verbessert. So wurde bereits versucht, Silane auf anorganische Trägerstoffe aufzupfropfen und
dadurch eine gewisse Anzahl von unmittelbaren Fixierungen zwischen Trägermaterial und bestimmten
Enzymen zu ermöglichen.
In anderen Fällen muß häufig ein Kupplungsvermittler
wie Dicyclohexylcarbodiimid, Thiophosgen oder Glutaraldehyd mitverwendet werden, wenn eine dauerhafte
Fixierung zwischen gepfropftem Trägermaterial und Enzym erreicht werden soll.
Weiterhin wurden bereits jodhaltige Polymere als Trägermaterial erprobt; diese Stoffe werden aber von
Lösungsmitteln, Temperaturen und Drücken beeinträchtigt, wodurch ihre Anwendung beschränkt ist;
außerdem enthalten sie zahlreiche jodhaltige Gruppen, die sich nachteilig auf die Aktivität des später fixierten
Enzyms auswirken können.
Die erfindungsgemäß entwickelte, mit Silanen gepfropfte Kieselsäure kann auf zahlreichen Anwendungsgebieten
eingesetzt werden und ist unempfindlich gegenüber Lösungsmitteln,Temperaturen und Drücken.
Im Gegensatz zu dem aus der DT-OS 20 51 292 bekannten und für die Herstellung von Kunststoflzementen
verwendeten, mit Silanen bzw. Siloxanen gepfropften Calciumsilicat eignet sie sich zum Fixieren
von Enzymen, wobei sich neue Reaktionen durchführen lassen. Es brauchen dabei keine Kupplungsvcrmittler
verwendet zu werden und außerdem werden zu viele aktive Stellen vermieden. Vor allem läßt sich in
einfacher Weise und mit ausgezeichneten Ausbeuten die dauerhafte Fixierung von Enzymen bewirken, die
gegenüber Faktoren der Denaturierung beständig ist.
Die erfindungsgemäß gepfropfte Kieselsäure wird dadurch erhalten, daß man ein Halogenalkylsilan, das 1
bis 3 reaktionsfähige Gruppen besitzt, mit den Hydroxylgruppen der Kieselsäure zur Reaktion bringt.
Die Kieselsäure weist eine Korngrößenverteilung von 40 μιη bis 5 mm auf und eine spezifische Oberfläche im
Bereich von 2 bis 600 m2/g, voezugsweise von 20 bis
70 m2/g im Falle der nachfolgenden Fixierung von Enzymen sowie einen Porendurchmesser von 5 bis
1000 nm und ein Porenvolumen von 0,5 bis 1,8 ml/g.
Das Halogenalkylsilan entspricht der allgemeinen Formel
X-(CH2In-Si-B
in der X für ein Chlor-, Brom- oder Jodatom steht, η eine
ganze Zahl von 3 bis 11 ist und A, B und C gleich oder
verschieden sein können und jeweils ein Chloratom, eine Methoxy-, Äthoxy-, Methyl- oder Äthylgruppe
bedeuten mit der Maßgabe, daß zumindest einer der Substituenten A, B oder C mit einer OH-Gruppe der
Kieselsäure reagieren kann.
Zu den besonders geeigneten Verbindungen zum Aufpfropfen gehören
Triäthoxybrompropylsilan,
Trimethoxyjodpropylsilan,
Triäthoxyjodpropylsilan.Triäthoxychlorbutylsilan, Trichlorchlorpropylsilan,
Dimethylchlorchlorpropylsilanund
Methyldichlor-jodundecylsilan.
Das Aufpfropfen wird auf an sich bekannte Weise in einem organischen Lösungsmittel oder in Wasser
durchgeführt sowie bei Atmosphärendruck oder unter Überdruck sowie allgemein in der Wärme.
Die erfindungsgemäß gepfropfte Kieselsäure eignet sich als Träger für großtechnische Katalysatoren, für
chromatographische Zwecke und insbesondere zum Fixieren von Enzymen.
Im letzteren Falle lassen sich zahlreiche unterschiedliche
Enzyme fixieren, beispielsweise Oxydoreduktasen wie Glucoseoxidase und Hydrolasen wie Lipase,
Pectinase, Tripsin, Urease, Glucoamylase und Λ-Aminoacylase.
Die Fixierung des Enzyms erfolgt unter Anwendung beliebiger bekannter Verfahren entweder in der Kälte
in einer wäßrigen Lösung, deren pH auf einen mit dem Enzym verträglichen Wert gepuffert ist, oder aber in der
Wärme in Kohlenwasserstoff- oder Chlorkohlenwasserstoff-Lösungsmitteln entsprechend einem älteren Vorschlag
(DT-OS 24 39 923).
Die Wahl des Verfahrens hängt ab von der Beschaffenheit des Enzyms. Ebenso richten sich die
Auswahl des Trägermaterial und der aufzupfropfenden Halogenverbindung nach der Eigentümlichkeit und den
Reaktionseigenschaften des Enzyms.
Die auf diese Weise fixierten Enzyme sind besonders beständig und widerstandsfähig gegenüber Denaturierungseinflüssen,
pH-Wert und Temperatur.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
100 g Kieselsäure-Mikrokügelchen mit Korngrößenverteilung 100 bis 200 μπι, spezifische Oberfläche
44 m3/g, Porendurchmesser 6G nm und Porenvolumen ^
0,9 ml/g, wurden 4 h im Vakuum bei 1500C getrocknet
Das trockene Pulver wurde in 200 ml einer Lösung aus 20 g Triäthoxy-brompropylsilan in Xylol gegeben und
das Gemisch 8 h auf 1400C erwärmt Nach dem Abkühlen wurde die gepfropfte Kieselsäure abgeschleudert,
mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt enthielt 0,4 Gew.-% Brom.
Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch mit einer ,5
Lösung aus 20 g Trimethoxy-jodpropylsilan gelöst in 200 ml XyIo! gearbeitet und das Gemisch zum Sieden
erhitzt. Das fertige Produkt enthielt 0,45 Gew.-% Jod.
20
Kieselsäurepulver mit Korngröße 200 bis 400 μηι,
spezifische Oberfläche 50 m2/g, Porendurchmesser 60 nm und Porenvolumen 1,1 ml/g wurde 4 h im
Vakuum bei 1500C getrocknet. Die getrocknete Kieselsäure wurde zusammen mit 250 ml Toluol
enthaltend 10 g Triäthoxychlorbutylsilan im Autoklav unter autogenem Druck (5 bar) 2 h auf 19O°C erhitzt.
Nach dem Abkühlen wurde die gepfropfte Kieselsäure abgeschleudert, mit Toluol und anschließend mit Aceton
gewaschen und schließlich getrocknet. Das fertige Produkt enthielt 0,7 Gew.-% Chlor.
Es wurde ein Hydrogel hergestellt, indem in einem 2 !-Becherglas 230 ml einer wäßrigen Schwefclsäurelösung
(120 g/l) unter Rühren tropfenweise mit einer Natriumsilicatlösung (220 g/l SiO2) versetzt wurde.
Sobald der pH-Wert 3,8 betrug, wurde das erhaltene Sol zusammen mit 2 Tropfen Natriumalkylsulfonat in 8 1
Trichloräthylen eingegossen und das Gemisch kräftig gerührt. Nach einigen Minuten hatten sich Hydrogelkügelchen
gebildet. Darauf wurde 1 1 ammoniakalisches Wasser mit pH-Wert 9 zugesetzt und dann filtriert.
Die Kügelchen wurden dreimal mit 0,1 η Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen. Das erhaltene
Hydrogel enthielt 80 Gew.-% Wasser; die Korngröße der Kügelchen lag unterhalb 200 μηι.
In einem Kolben wurden 120 g obiges Hydrogel, 15 g Triäthoxy-jodpropylsilan und 200 ml Benzol zusammengegeben
und das Gemisch auf 8O0C erwärmt; durch azeotrope Destillation wurden 95 ml Wasser zurückgewonnen.
Nach dem Abkühlen wurde das gepfropfte Produkt abgeschleudert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
Die spezifische Oberfläche des erhaltenen Trägermaterials betrug 425 m2/g, sein Porenvolumen 1,1 ml/g und
der Jodgehalt 2,1 Gew.-%.
Nach dem Absitzenlassen wurde das Trägermaterial dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und
anschließend die Aktivität bestimmt.
Der Komplex aus Enzym und Trägermaterial wurde jeweils in 10 ml einer 3gew.-°/oigen Stärkelösung in
einem 0,1 m Acetatpuffer νοπϊ pH-Wert 4 bis 5 gegeben
und unter Rühren 10 min bei 400C in Berührung miteinander gelassen.
Nach dem Abtrennen wurde in der flüssigen Phase die Menge oder Dosis freigesetzter reduzierender Zucker
bestimmt, und zwar colorimetrisch mit 3,5-Dinitrosalicylsäure. Es wurden nacheinander mehrere Waschgänge
und Aktivitätsmessungen durchgeführt. Zwischen jeder Messung wurden die Komplexe Träger-Enzym in
2 m Kochsalzlösung aufbewahrt.
Es wurden folgende Ergebnisse erzielt, zurückgeführt auf Glucose und angegeben in μΜοΙ freigesetzte
Glucose je Minute und je Gramm Träger:
Beispiel 5
fixierung von Glucoamylase in wäßrigem Medium
fixierung von Glucoamylase in wäßrigem Medium
Das Enzym wurde auf das gepfropfte Trägermaterial gemäß Beispiel 1 (Versuch A) sowie auf das gepfropfte
Trägermaterial gemäß Beispiel 2 (Versuch B) fixiert.
1 g Träger wurde zu 20 ml einer 0,1 m Acctatpufferlösung vom pH-Wert 4 bis 5 enthaltend 20 mg
Glucoamylasc gegeben und die erhaltene Dispersion 18 h bei 4°C gerührt.
Aktivität
Versuch A
Versuch B
Ursprünglich | 8,5 | 1.4 |
Nach 5 Tagen | 5 | 1 |
Nach 10 Tagen | 0 | 0,7 |
Fixierung von Glucoamylase in organischem Medium
Hs wurde wie in Beispiel 5 gearbeitet mit der Abwandlung, daß 1 g Trägermaterial zu 30 ml einer
Dispersion aus wasserfreiem Chloroform und 50 mg Glucoamylase gegeben wurde. Das Gemisch wurde
mittels Schallbehandlung in Bewegung und 2 h unter Rückfluß gehalten. Anschließend wurde das Lösungsmittel
im Vakuum abgezogen.
Die Niederschläge wurden mit destilliertem Wasser und mit Kochsalzlösung gewaschen und anschließend
die Aktivität bestimmt. Man erhielt:
Aktivität
Versuch Λ
Versuch B
Ursprünglich | 15,6 | 1,2 |
Nach 5 Tagen | 11 | 0,7 |
Nach 10 Tagen | 4,5 | 0 |
Der Vergleich zeigt, daß Kieselsäure mit einem bromhaltigen Pfropfreis mehr Enzym fixiert als
Kieselsäure mit einem jodhaltigen Pfropfreis.
Beispiel 7
Fixierung von Glucoseoxidase in wäßrigem Medium
Fixierung von Glucoseoxidase in wäßrigem Medium
Das Enzym wurde wie in Beispiel 5 beschrieben
60 fixiert. Die enzymatisch^ Aktivität wurde wie folgt bestimmt:
1 g Komplex aus Träger und Enzym, 20 ml einer Lösung aus 18 g/l Glucose in 0,1 m Acetatpuffer mit pH-Wert
5,6 enthaltend 100 mg/l o-Dianisidin und 40 μΙ einer Peioxidaselösung enthaltend 2 mg/ml in 0,1 m Acetatpul
fer von pH-Wert 5,b wurden miteinander vermischt.
In Abhängigkeit von der Zeit wurden die Absorptionsäncierungen
bei 460 nm beobachtet.
25 1(3
Die Ergebnisse, angegeben in μΜοΙ freigesetztes
HjOi/min/g Träger lauten wie folgt:
Versuch A: ursprüngliche Aktivität Aktivität nach 1 Monat
Versuch B: ursprüngliche Aktivität Aktivität nach 1 Monat
3,8 1,76 4 1,88
Der Vergleich zeigt, daß die Fixierung des Enzyms in wäßrigem Medium zu sehr ähnlichen Ergebnissen führt,
unabhängig davon, ob das Trägermaterial eine bromhaltige oder eine jodhaltige aufgepfropfte Gruppe trägt.
Versuch A:
Versuch B:
ursprüngliche Aktivität Aktivität nach 1 Monrt ursprüngliche Aktivität
Aktivität nach 1 Monat
2,60 0,80 5,20 5,20
Fixierung von Pectinase in wäßrigem Medium
•
Fixierung von Glucoseoxidase in organischem Medium
Das Enzym wurde wie in Beispiel 6 beschrieben fixiert und die enzymatische Aktivität gemäß Beispiel 7
bestimmt. Man erhielt folgende Ergebnisse:
Die Fixierung des Enzyms auf einem Träger mit jodhaltigem Pfropfreis erwies sich als besser als die
Fixierung auf Träger mit bromhaltigem Pfropfreis. Außerdem erwies sich der Komplex aus jodhaltigem
Träger und Enzym als beständiger in der Zeit.
35 Aktivität
Versuch
Versuch R
Ursprünglich
N ach 2 Tagen
Nach 3 Tagen
Nach 5 Tagen
13,30
13,30
13,30
12.70
13,30
13,30
12.70
11,80
10,85
8,20
7,50
Wie in den vorangegangenen Beispielen wurde das Enzym auf gepfropfte Kieselsäure gemäß Beispiel 1
(Versuch A) und auf gepfropfte Kieselsäure gemäß Beispiel 2 (Versuch B) fixiert.
Zu 8 mg Pectinase gelöst in 20 ml Wasser wurden 2 g gepfropfte Kieselsäure gegeben und das Ganze 24 h bei
4°C gerührt. Nach dem Absitzenlassen wurde der Komplex aus Träger und Enzym dreimal mit 20 ml
destilliertem Wasser, dreimal mit 20 mi 1 m Kochsalzlösung unu schließlich dreimal mit 20 ml 0,1 m Acetatpuffer
von pH-Wert 4 gewaschen.
Darauf wurde die enzymatische Aktivität wie folgt bestimmt:
2 g Komplex aus Träger und Enzym wurden in 10 ml einer 1%igen Lösung aus PolygalaciJronsäuie in 0,01 m
Acetatpuffer, pH-Wert 4, dispergiert und die Dispersion 10 min auf 35°C erhitzt.
5 ml dieses Mediums wurden zum Abtrennen der nicht umgewandelten Polygalacturonsäure mit 0,3 ml
einer wäßrigen 9%igen Zinksulfatlösung und mit 0,3 ml einer 0,5 η Natronlauge versetzt. Nach dem Zentrifugieren wurde die in dem überstehenden Teil vorhandene
D-Galacturonsäure mit Hilfe der Dinitrosalicylat-Me
thode bestimmt.
Diese Messung der enzymatischen Aktivität wurde: nach 2, 3 und 5 Tagen wiederholt. Zwischen jeder
Bestimmung wurden die Komplexe aus Träger und Enzym gewaschen, indem sie mit jeweils 20 ml 2 m
Kochsalzlösung 15 h lang in Berührung gehalten und anschließend mil destilliertem Wasser und mit Acetatpuffer
gewaschen wurden.
Es wurden folgende Ergebnisse erzielt, ausgedrückt in
uMol hydrolysierte Galacturonsäure/min/g Träger.
Der Vergleich zeigt, daß der Träger mit bromhaltigem Pfropfreis mehr Enzym fixiert als der Träger mit
jodhaltigem Pfropfreis. Außerdem gibt der Träger mit bromhaltigem Pfropfreis einen dauerhafteren Komplex.
Die Wirkung des Komplexes aus Träger mit bromhaltigem Pfropfreis und Pectinase wurde darauf
für kontinuierlichen Betrieb getestet: in eine 20 cm hohe und 1 cm weite Säule wurden 6 g Komplex gegeben. Die
mit Hilfe eines Thermostaten bei 25° C gehaltene Säule wurde mit einer 0,4%igen Polygalacturonsäure-Lösung
in 0,01 m Acetatpuffer vom pH-Wert 4 gespeist in einer
Menge von 52 ml/h.
Die Säu'e arbeitete ohne Aktivitätsveriust während 10 Tagen mit einem Hydrolysegrad von 42%. Dies zeigt
die gute Beständigkeit des Komplexes aus Träger und Enzym.
Beispiel 10
Fixierung von Pectinase in organischem Medium auf die gepfropften Kieselsäuren gemäß Beispiel 1 und 2
In 50 ml wasserfreiem Benzol wurden mittels Schallbehandlung 500 mg handelsübliche Pectinase
dispergiert und anschließend 2 g des gepfropften Trägers aus Beispiel 1 bzw. Beispiel 2. Das Ganze wurde
zum Sieden erhitzt und 1 h bei dieser Temperatur gehalten.
Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgezogen und der erhaltene Komplex aus Träger und
Enzym dreimal mit 20 ml destilliertem Wasser, dreimal mit 20 ml Im Kochsalzlösung und schließlich dreimal
mit 20 ml 0,1 m Acetatpuffer vom pH-Wert 4 gewaschen.
Die enzymatische Aktivität wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 9 bestimmt. Man erhielt folgende
Ergebnisse:
Versuch A: Anfangsaktivität
Aktivität nach 2 Tagen
Versuch B: Anfangsaktivitäl
Aktivität nach 2 Tagen
10,15
10,15
4,70
3,80
Wie in Beispiel 9 fixierte der Träger mit dem bromhaltigen Pfropfreis mehr Enzym als der Träger mit
dem jodhaltigen Pfropfreis.
Beispiel 11
Fixierung von (X-Aminoacylase in wäßrigem Medium
Es wurde wie in den vorangegangenen Beispielen mit den gepfropften Kieselsäuren gemäß Beispiel 1 und 2
gearbeitet.
10 ml 0,1 m Phosphatpuffer mit pH-Wert 7 enthaltend 10 ml Enzym und 1 g Träger wurden unter Rühren oder
Schütteln 48 h bei 4°C in Berührung miteinander gehalten. Anschließend wurde dekantiert und der
Komplex aus Trägermaterial und Enzym dreimal mit 10 ml destilliertem Wasser und zehnmal mit 10 ml 1 m
Kochsalzlösung gewaschen.
Darauf wurde die enzymalische Aktivität gemessen.
1 g des Komplexes aus Träger und Enzym und 10 ml 0,1 m Lösung aus Acetyl-DL-methionin in 0,1 m
Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 wurden 30 min zusammen auf 4O0C erwärmt. Das freigesetzte L-Methionin
wurde mit Ninhydrin bestimmt.
Die Ergebnisse, angegeben in μΜοΙ freigesetztes
L-Methionin je min und je g Träger lauten wie folgt:
Kieselsäure mit bromhaltigem Pfropfreis —
Aktivität: 100
Kieselsäure mit jodhaltigem Pfropfreis —
Aktivität: 30
Beispiel 12
Fixierung von Trypsin '5
Fixierung von Trypsin '5
Die Versuche wurden wiederum mit den gepfropften Kieselsäuren der Beispiele 1 (Versuch A) und 2 (Versuch
B) durchgeführt.
2 mg Trypsin wurden mittels Schallbehandlung in 20 ml Hexan dispergiert; anschließend wurden 2 g
Trägermaterial zugegeben und das Ganze 1 h auf Siedetemperatur erhitzt. Anschließend wurde Hexan
abgedampft und der Komplex aus Träger und Enzym dreimal mit 20 ml destilliertem Wasser und dreimal mit
20 ml 1 m Kochsalzlösung gewaschen.
Die erhaltenen Komplexe aus Träger und Enzym wurden mit 1 ml Wasser und darauf mit 9 ml einer
0,3gewichtsprozentigen Caseinlösung in einem 0,025 m Phosphat-Citratpuffer vom pH-Wert 7 versetzt. Die
Dispersionen wurden während 10 min auf 37°C erwärmt. Nach dem Abkühlen und Absitzenlassen
wurden jeweils 4 ml Lösung entnommen und mit 4 ml einer 10gew.-%igen wäßrigen Trichloressigsäure versetzt;
das überschüssige Casein fiel aus und wurde abfiltriert: anschließend wurde der Peptidgehalt im
Filtrat mit Hilfe der Methode von L ο w r y bestimmt.
Die Komplexe aus Träger und Enzym wurden erneut mit 1 m Kochsalzlösung gewaschen; eine weitere
Messung der enzymatischen Aktivität wurde nach 1 Woche durchgeführt.
Folgende Ergebnisse wurden erzielt, angegeben in μg
freigesetzte Peptide/ml/min/g Träger:
Versuch A: Anfangsaktivität 34,5
Aktivität nach 1 Woche 20,5
Versuch B: Anfangsaktivität 4,5
Aktivität nach 1 Woche 4.5
Die Kieselsäure mit bromhaltigem Pfropfreis fixiert mehr Enzym als die Kieselsäure mit jodhaltigem
Pfropfreis. Letztere gibt aber einen beständigeren Komplex.
0,5 g des erhaltenen Komplexes wurden in 5 ml 0,025 m Phosphatpuffer, pH-Weirt 7, suspendiert und
2 min lang mit diesem in Berührung gelassen. Darauf wurden 2 ml wäßrige Harnstofflösung enthaltend ;!0 g
Harnstoff/1 zugegeben und wiederum 2 min in Beiührung
gelassen. Die Reaktion wurde durch Abfiltrieren unterbrochen. Das Filtrat wurde mit 5 ml 0,1 η Salzsäure
versetzt und die überschüssige Salzsäure mit 0,05 η Natronlauge zurücktitriert.
Das Waschen des Niederschlags und Messen der Aktivität wurden mehrere Male wiederholt. Die
Ergebnisse, angegeben in μΜοΙ NH3, die in 2 min erzeugt werden, sind in der folgenden Tabelle
sammengefaßt.
Bedingungen beim Aufbewahren im Kühlschrank
Trocken
bei 4° C
bei 4° C
Suspendiert in
Phosphatpul fcr
Phosphatpul fcr
Ursprünglich | 200 | 200 |
Aktivität | ||
nach 4 Tagen | 266 | 278 |
nach 11 Tagen | 218 | 283 |
nach 19 Tagen | 168 | 268 |
nach 27 Tagen | 187 | 228 |
Beispiel 13
Fixierung von Urease
In 150 ml Chloroform wurden 1 g Urease und 6 g gepfropfte Kieselsäure gemäß Beispiel 2 dispergiert und
das Ganze 1 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wurde das Chloroform abgezogen und der Komplex aus
Träger und Enzym dreimal mit 20 ml 0.1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 und dann dreimal mit 20 m 2 m
Kochsalzlösung gewaschen.
Der Vergleich zeigt, daß die Aktivität praktisch konstant bleibt mit der Zeit, unabhängig davon, wi; der
Komplex aus Träger und Enzym aufbewahrt wird.
Beispiel 14
Fixierung von Lipase
Fixierung von Lipase
Die Fixierung wurde in wäßrigem Medium auf den gepfropften Kieselsäuren gemäß Beispiel 1 (Versuch A),
2 (Versuch B) und 3 (Versuch C) durchgeführt.
Im Versuchsröhrchen wurden jeweils 20 ml einer l%igen Lipaselösung in destilliertem Wasser urd 2 g
Träger eingebracht Die Röhrchen wurden dann langsam und regelmäßig 24 h lang bei 40C geschüt :elt.
Die erhaltenen Komplexe aus Träger und L'nzym wurden von der Lipaselösung mittels Absitzen lassen
abgetrennt und dreimal mit 25 ml destilliertem V/asser gewaschen. Darauf wurden sie in 20 ml einer 2"/oigen
Lösung von Salzen der Gallensäuren in destilliertem Wasser suspendiert, und zwar während 3 h bei 4° C
unter langsamem Schütteln, um das schwach an den Träger gebundene Enzym zu desorbieren. Die Komplexe
wurden darauf mit destilliertem Wasser gewaschen.
Die enzymatische Aktivität wurde gemäß der Methode von Desnuelle, angewandt auf eine
Olivenölemulsion, bestimmt Die freigesetzten Fettsäuren wurden potentiometrisch bei konstantem pH-Wert
titriert
Die enzymatische Aktivität angegeben in μΑςυϊνβ-lenten
freigesetzter Fettsäure/min/g Träger, betrug:
In Versuch A: 8
In Versuch B: 6
In Versuch C: 14
In Versuch B: 6
In Versuch C: 14
Der Komplex erhalten durch Fixieren von Lipase auf Kieselsäure mit chlorhaltigem Pfropfreis, besitzt somit
die stärkste Aktivität
Claims (2)
1. Mit Silanen gepfropfte Kieselsäure, die erhalten worden ist durch Aufpfropfen von Halogenalkylsilanen
der allgemeinen Formel
X-(CH2)„-Si-B |0
in der X ein Chlor-, Brom- oder Jodatom darstellt, π eine ganze Zahl von 3 bis 11 ist und A, B und C gleich
oder verschieden sein können und jeweils für ein Chloratom oder eine Methoxy-, Äthoxy-, Methyloder
Äthylgruppe stehen mit der Bedingung, daß zumindest einer der Substituenten A, B oder C mit
einer OH-Gruppe des Trägermaterials reagieren kann, auf Kieselsäure mit einer Korngröße von
40 μΐη bis 5 mm, einer spezifischen Oberfläche von 2
bis 600 m2/g, einem Porendurchmesser von 5 bis
1000 nm und einem Porenvolumen von 0,5 bis 1,3 ml/g.
2. Verwendung der mit Silanen gepfropften Kieselsäure nach Anspruch 1 zum Fixieren von
Enzymen.
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