DE1442139A1 - Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven,wasserunloeslichen Substanzen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven,wasserunloeslichen Substanzen

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DE1442139A1
DE1442139A1 DE19631442139 DE1442139A DE1442139A1 DE 1442139 A1 DE1442139 A1 DE 1442139A1 DE 19631442139 DE19631442139 DE 19631442139 DE 1442139 A DE1442139 A DE 1442139A DE 1442139 A1 DE1442139 A1 DE 1442139A1
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Description

Terfahren gur Herstellung von enzymatisch aktiven« wasser- MTii gallchen Subst^n^en»
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven, wasserunlöslichen, trägergebundenen Enzymen· Ferner betrifft die Erfindung die Herstellung enzymatisch aktiver Substanzen, die an Cellulose gebundene Enzyme aufweisen« Andere und weitere Ziele der Erfindung sind
weiter unten beschrieben·
sowie dem britischen Patent Nr.916 In den israelitischen Patenten Hr. 13950 und Hr. 15448/
sind enzymatisch aktive Substanzen beschrieben, in denen Enzyme aa polymere Träger gebunden sind. SrfindungsgemäS besteht ein sehr einfaches und zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven, wasserunlSsliohen Substanzen, bestehend aus EnzymmolekOlen, die über ihre für die enzymati s ehe Aktivität nicht unbedingt notwendigen funktionellen
BAD OFUGJNAL
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Gruppen an Cellulose gebunden sind, darin, daß man zunächst Bromacetylcellulose (BAC) herstellt und daran Enzymmoleküle bindet, und zwar vorzugsweise über Schwefelwasserstoffgruppen oder über otoder £ -Aminogruppen der Enzymmoleküle oder über die Imidazolgruppe von Histidin. Die Verbindungen nach der Erfindung können durch die allgemeine Formel
Cell -(-0-C-
O (I)
dargestellt werden, worin "Cell11 Cellulose bedeutet, X für die -NH-, -S- oder Imidazolgruppe steht und Z ein Molekül des Enzyms bezeichnet, von welchem die -S-, -HH- oder Imidazolgruppen einen Seil darstellen.
Die Verbindungen gemäß der Formel I werden hergestellt durch umsetzen von Cellulose in beliebiger Form (Pulver-, Blattform oder dergl.) mit Bromacetylbromid zu einer Verbindung der allgemeinen Formel:
Cell-η Br-CO-CH2-Br -^ CeIl-(O-CO-CB2-Br)n
die dann mit einem geeigneten Enzym zur Reaktion gebracht wird, welches funktioneile Gruppen aufweist, die geeignet sind zur covalenten Bindung der erwähnten Enzymmoleküle ohne Zerstörung der enzymatisohen Aktivität, wobei sich Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ergeben.
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Die Bindungsreaktion kann dargestellt werden durch folgendes Reaktionsschema:
+ m HX-Z —^ Cell + m HBr
\ (-000CH2X-Z)n
wobei X und Z die gleiche Bedeutung wie oben haben.
Zum besseren Verständnis der Erfindung dienen die folgenden. Beispiele: ..-.»*■
Beispiel It -.·-..·. , ■ - ■ ■- eis
WBT&ttllWm voft wasserunlöslichem Irypsin. tsüS Stuf· At Bereitung von Bromacetyl-Cellulose (BAO).
Methode I. Eine Mischung aus 30 g Cellulose-Pulver (Genuine Whatman Oellulosepulver, Standard Grade")» 300 g Broaeeeigaäure und 80 omr Dioxan wurden bei Raumtemperatur über Facht gerührt; dann wurden 75 cnr Bromacetylbromid zugefügt und 8,Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt· Es wurde eine viskose Lösung erhalten und Teile der Cellulose löstet sicsJr*u£. Dae Gemiich wurde dann in 2 1 einer Wasser-Eis-Miecäung gegossen und der sich bildende weiße Hiderschlag oehraalsiait Vaseer> mit 0,6 normaler Kaliumbicarbonat-Lösrnng «nd wltdenr mit Wasser gewaschen. Me Ausbeute betrug 33 g BAO-I mit einem Gehalt an 20,1 Gewichtsprozent Brom (d.h. durchschnittlich 0,6 restliches Bromacetyl je Glucose einheit).
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Methode II. Eine Mischung aus 5 g Cellulosepulver, 100 g Bromessigsäure, 100 g Bromacetylbromid und 40 cnr Dioxan wurde 130 Stunden bei 5O0C geschüttelt. Der frei werdende Bromwasserstoff wurde mittels eines durch das Reaktionsgemisch hindurchgeleiteten Stickstoffstromes kontinuierlich entfernt, so daß ein stärkerer Abbau der Cellulose vermieden wurde. Die Ausbeute betrug 7»7 g BAC-II, enthaltend 32,5 $> Brom, (d.h. im Durchschnitt 1,3 restliches Bromacetyl je Grlucoseeinheit). Das Produkt erwies sich als leicht löslich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, wie u.a. Aceton, Dioxan, Dimethylformamid und Dirnethylsulfoxyd.
Stufe B: Kupplung von Trypsin«
1 mg Trypsin (50 1° MgSO,, N.B.C. "Güteklasse für chemische und Forschungszwecke" - "for chemical and investigational use") wurden 3 Minuten gerührt mit 1 g BAC-I (vorher homogenisiert) in 50 cnr "Yeronal-Puffer" (veronal buffer) (0,06-molar) mit einem pH-Wert von 8,6. Das Produkt (Tryp-BAC-I) wurde abzentrifugiert und siebenmal mit Wasser gewaschen, rast alles Trypsin war an den Träger gebunden.
Ein weiterer Versuch zur Kupplung von Trypsin mit BAC-II wurde in 45 #iger Lösung von Aceton in Veronal-Puffer (veronal buffer) mit einem pH-Wert von 8,6 durchgeführt. Die Analyse der wasserunlöslichen Derivate (Tryp-SAC-II) auf Gesamtetickstoff zeigte, daß 100.mg BAC-Il 27 mg Trypsin binden·
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Untersuchung der Aktivität von trägergebundenem Trypsin! A. Gegenüber Substraten mit niederem Molekulargewicht.
Die Aktivität von Tryp-BAO-I gegenüber 5 mg L-lysinäthylester in 5 ca. Wasser bei pH 6 wurde geprüft durch Titration mit einem pH-Wert-Titrationsgerät (pH-stat titrator) mit automatischer Aufzeichnung, Modell TTT-1. Es wurde gefunden, daß 100 mg unlösliches Tryp-BAO-I in seiner Aktivität 60 bis 70 mg natürlichem Trypsin entsprachen (d.h. das gebundene Trypsin ist zu 60 - 70 # aktiv).
Analog wurde die Aktivität von Tryp-BAO-II gegenüber 5 mg Benzoyl-Ii-Argininäthylester, gelöst in 5 cur Wasser, bei pH 6 geprüft. Es wurde gefunden, daß 100 mg Tryp-BAC-II eine Aktivität besitzen, die 4,2 mg natürlichem Trypsin entspricht.
B. fl-egenüber Substraten mit hohem Molekulargewicht.
Die Aktivität von Tryp-BAO-I gegenüber Casein wurde nach Koni te (M. Eunitz J. Gen. Hiysiol. ^O , 291 (1947) ) geprüft. Die Aktivität von 100 mg Tryps-SAC-I entsprach derjenigen von 23 mg natürlichem Trypsin.
Di· enzymatisch· Aktivität von Tryp-BAO-I verschlechterte sich nicht während 3-monatiger lagerung, vorausgesetzt, daß das Kuppeln durch eine Nachbehandlung mit Merkaptoäthanol ergänzt wurde, dessen Menge ausreichte, um mit den ungebundenen Bromgruppen zu reagieren.
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— & —
Beispiel II. Bereitung von trägergebundenem Chymotrypsin:
500 mg homogenisiertes BAC-I wurden 4 Minuten ge-
•z
rührt mit 10 mg Chymotrypsin, gelöst in 4-0 cnr Veronal-Puffer (veronal buffer) ( 0f06 molar, pH 8,6), und 60 cnr Wasser, das Produkt (Chym-BAC-I) wurde abzentrifugiert und siebenmal mit Wasser gewaschen. Für Chym-BAC-I ergab sich eine 45 #ige Aktivität gegenüber Ii-Iyrosin-lthylester. Die enzymatische Aktivität von Chym-BAC-I war nach 3-monatiger lagerung nicht zurückgegangen, vorausgesetzt, daß das Kuppeln durch eine Nachbehandlung mit Merkaptoäthanol ergänzt wurde, dessen Menge dazu ausreichte, um mit den ungebundenen Bromgruppen zu reagieren.
Beispiel III. Herstellung von trägergebundener Eibonuolease:
Zu 50 mg BAC-I in 10 cnr 0,1-molarer Natriumphoephatlösung wurden 10 mg Ribonuclease zugefügt. Das Heaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei 4°C gerührt. Nach fünfmaligem Waschen mit 0,2-molarem Natriumacetat (pH 6,0) und zweimaligem Waschen mit Wasser wurden die verbleibenden Bromgruppen durch Reaktion mit Merkaptoäthanol entfernt. Die enzymatische Aktivität wurde gegenüber Cytidin-2*»5f-cykl.-phosphat und BHA geprüft und verglichen mit natürlicher Ribonucleasen Die Aktivität gegenüber dem ersten Substrat war äquivalent derjenigen von 150 0 de» natürlichen Enzyms, während sie gegenüber dem zweiten Substrat äquivalent SOOq war·
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Die Aktivität des unlöslichen enzymatisehen Präparates nahm während dreimonatiger Lagerung nicht ab, vorausgesetzt, daß das Kuppeln durch eine Nachbehandlung mit Merkaptoäthanol ergänzt wurde, dessen Menge ausreichte, um mit den ungebundenen Bromgruppen zu reagieren·
Beispiel IV.
Stufe A: Bereitung von Jodacetylcellulose (IAO).
Bromacetylcellulose wurde entsprechend Beispiel I bereitet. Zu 100 mg Bromacetylcellulose mit 5t9 # Brom,, wurden 600 mg Natriumiodid und 5 cm' 95 #iger Äthylalkohol hinzugefügt und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Sie festen Bestandteile wurden abfiltriert, mit Alkohol, wässriger Sicarbonatlösung, Wasser, Alkohol und Äther gewaschen und getrocknet. Das Produkt enthielt 9»5 Gewichtsprozent Jod.
Stufe Bjl Kuppeln mit Modellverbindungen
Das Kuppeln mit Merkaptoäthanol, Phenylalalin und v , erfolgte
Polylysin wmx*» bei pH 6,0 bzw. 7,0 bzw. 8,9.x*xsca*»HffiBx Sie Geschwindigkeit und der Umfang der Reaktionen wurden unter Benutzung eines pK-Stat-Gerätee beobachtet.
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Claims (7)

Patentanspruch /" Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven, wasserunlöslichen Substanzen der allgemeinen !Formel Cell -(-0-C-CH2-X-Z)n worin "Cell" Cellulose "bedeutet, Z für ein Enzymmolekül steht und X eine für die enzymatisch^ Aktivität nicht wesentliche funktionelle Gruppe des Enzymmoleküls, vorzugsweise -BH-, -S-, eine Phenol- oder eine Imidazolgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet , daß man zunächst eine Verbindung der Formel ... CeIl-C-O-CO-CH2-X)n . ...,·. herstellt, worin "Cell" Cellulose bedeutet und Y für Brom oder Jod steht, worauf man mit dieser Verbindung über funktionelle Gruppen des Enzyms, die nicht wesentlich für seine enzymatische Aktivität sind, vorzugsweise über die Sulfhydryl- oder die Aminogruppe, Enzymmoleküle kuppelt·. . COPY 809800/U7U DR. ERICH NEUGEBAUER PAT E N TANWAIT MÜNCHEN β«, ZWEIBBÜCKENSTBASSE 10 o. lMovember 19 TELBFON (0811) 224337 TELEGRA II 11 ADRESSE: BAVARIAPATENT MOUCHES Patentansprüche Jf
1. Enzymatisch, aktive» wasserunlösliche Substanzen,
gekennzeichnet durch die allgemeine formel
Cell -(-0-C-CE2-X-Z)n
worin "Cell" Cellulose bedeutet, Z für ein Enzymmolekül steht* und X eine für die enzymatisch^ Aktivität nicht wesentliche funktioneile Gruppe des Enzymmoleküls, vorzugsweise -NH-, -S-eine Phenol- oder eine Imidazolgruppe bedeutet·
2. Enzymatisch aktive, wasserunlösliche Substanzen, gekennzeichnet durch an Bromacetylcellulose gebundenes Trypsin.
3. . Enzymatisch aktive, wasserunlösliche Substanzen, gekennz ei ohne t durch an Bromacetylcellulose gebundenes Chymotrypsin·
4· Enzymatisch aktive, wasserunlösliche Substanzen, ge kennzeichnet durch an Bromacetylcellulose gebundene Ribonuclease.
5. Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven, wasserunlöslichen Substanzen, definiert durch die allgemeine JOrmel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man zunächst eine Verbindung der Formel
Cell -(-0-CO-CH2-Y)3
80980S/07U
COPY
herstellt, worin "Cell" Cellulose bedeutet und Γ für Brom oder Jod steht, worauf man mit dieser Verbindung über funktioneile Gruppen des Enzyms, die nicht wesentlich für seine enzymatische Aktivität sind, vorzugsweise über die Sulfhydryl- oder die Aminogruppe, Enzymmoleküle kuppelt·
6. Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiven, wasserunlöslichen Substanzen wie in der Beschreibung beschrieben.
7. Enzymatisch aktive, wasserunlösliche Substanzen wie in der Beschreibung beschrieben.
80S80S/07 U
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