DE2215160A1 - Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen, enzymatisch aktiven Erzeugnisses - Google Patents

Description

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des Produits iJestle 3.Λ. in Vevey,3chwei-

Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen, enzymatisch

aktiven Erzeugnisses

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines enzymatisch aktiven Erzeugnisses, das in Wasser oder In wässrigen Ileciien unlöslielt ist.

Die enzymatisehen Reaktionen, insbesondere die enzymatisch bedingten Hydrolysen, beruhen im allgemeinen auf der Einwirkung eines oder mehrerer in^yme, die in einem das Substrat.enthaltendem lledium gelost tiittd. Unter dem Begriff "Substrat* soll in nachBtehende^ydslgi stoffliche imbstanz verstände«" «#r&en, die der !Einwirkung des Enzyms unterworfea itmrdßn sq£1* Wenn das anzym in dem Reactionsmedium gelöst ist, kann es nur sehr schwer von ae.n Substrat isoliert werden, und es ist dann im allgemeinen notweaiij, wenn maa die Reaktion anzuhalten winsoht* das Enzym uiwir^nun ^tJ, nstohmit z.J. durch lirhitzun^, und demzufolge kann i>tu in-dynt nicht wiedergewonnen werden.

diener iHchfcailu hat mi*n schon Verfahren zur

Herstellung von wasserunlöslichen Erzeugnissen vorgeschlagen» die eine Enzym-Aktivität besitzen. Die mit Hilfe dieser Erzeugnisse durchgeführten, enzymatisehen Heafct&OHen können entweder so durchgeführt werden, daß das Substrat eine mit dem unlöslichen Erzeugnis beladene Kolonne durchströmt oder das Erzeugnis in der das Substrat enthaltenden Lösung dispergiert und dann mechanisch von dem unlöslichen Erzeugnis getrennt wird, z.3. durch Filtern oder durch Zentrifugieren.

Zu den bekannten Verfahren zur Herstellung von unlöslich gemachten Enzymen zählt die Adsorption des Enzyms auf einem unlösliohen Träger, seine Einkapselung in eine polymere Matrix, seine Vernetzung mit Hilfe bifunktioneller Substanzen und seine Fixierung durch kovalente Bindung an einen unlöslichen Träger,

Die Erzeugnisse, die-durch Adsorption des Enzyms an einen unlöslichen Träger erhalten werden, haben den Naohteil_# daß sie nur wea|g haltbar slad. Öle In eine polymere Matrix eingekapselten Enzyme weisen zwar eine gute Haltbarkeit auf, haben jedoch nur eine begrenzte Aktivität gegenüber Substraten, deren MoIeJk Üe in ihren Abmessungen mit denen der Zwischenräume der polymeren Matrix vergleichbar sind. Die Verfahren zur Un|ösall<Nafflachung <iurch Vernetzung haben schließlich den Nachteil, daß eine größere Anzahik von Bindungen vorhanden 1st und häufig ein vorabergehender Schutz der aktiven Gruppen des iin^yms nötig ist. Die Verfahren' zur Unlösbarmachung durch Vernetzung gestatten es häufig auch nicht, die Erzeugnisse auf einfache rfeiae in Gestalt von Kugeln odar KögtteTQ zu gewinnen, die naeh ihrer Grou'e zur aujf ihrim; der erwähnten mechanischen Abscheide verfahren <;ee**$net stud.

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Die Verfahren zur Fixierung eines Enzyms an einen unlöslichen Träger durch kovalente Bindung, insbesondere an einen in Wasser unlöslichen polymeren Stoff* erfordern gewöhnlich eine kostspielige Vorbehandlung der Trägerstoffe wie etwa die Erzeugung reaktiver Zwlschengruppen, z.B. durch Diazotierung, oder die Anwendung von Copolymeren. Ferner ist die Art der Verbindungen zwischen dem !Trägerstoff and dem Enzym häufig von Nachteil für die Unversehrtheit der aktiven Gruppen des Enzyms* und es erweist sich als notwendig, diese Letzteren durch eine Vorbehandlung des Enzyms zu schätzen.

Die Erfindung bezieht sich im wesentlichen auf ein unlösbares Erzeugnis« das eine enzymatlsohe Aktivität besitzt, und das durch Fixierung eines Enzyms auf einem in Wasser unlöslichen Polymer nach einem besonders einfachen Verfahren erhalten wird. Sie bezieht sich insbesondere auf ein Erzeugnis;, das eise «nzymatische Aktivität aufweist und In einem wässrigem Üedlam unlöslich ist. Dieses Erzeugnis 1st dadurch gekennzeichnet, daß es «im !Covalent an freie Aldehydgruppen gebundenes Enzym darstellt* ils ihrerseits an ein unlösliches oxydiertes Polysaccharid angelagert sind.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur ÄersteULiung dieses Erzeugnisses. Pas Erzeugnis kann in enzymatisehen Reaktionen anstelle les entsprechenden lösliehen Enzyms benutzt werden und läßt sich dann nach beendeter fieükfclon durch aiechanische Abscheidung wiadergewinnen.

Unter freien Aldehydgruppen sind nachstehend iildshyclgröppen ju verstauen, die 3icn an oxydierten Polysacchariden befinden und

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chemische Verbindungen mit anderen Stoffen eingehen Können.

Es ist bekannt, daß die Oxidation eines Polysaccharides, wie Cellulose, die Bildung freier Aldehydgruppen durch Oxidation der alkoholischen Funktionen bewirkt, die in der Kette des Polymers enthalten sind. Demgemäß kann die Oxidation eines unlöslichen Polysaccharides wie Cellulose durch ein Perjodat z.B. NatrlumperJodat, ein unlösliches Polymer ergeben, das 10 - 12 % reduzierende Gruppen aufweist, d.h. eine Anzahl von freien Aldehydgruppen, die 10 - 12 % der Anzahl von GlukosemoleK ilen des Polymers ausmachen.

Der experimentelle Nachweis dieser Aldehydgruppen sowie ihre quantitative Bestimmung können vorzugsweise nach dem Verfahren von Park und Johnson (Bestimmung von reduzierenden Zuckern) in der Anwendung guf unlösliche Stoffe durchgeführt werden, wie dies von J.S.Thompson und G.D.Schockman in der Zeitschrift Analytical Biochemistry, 1968, Heft 22, S.260 - 268 beschrieben ist.

Das Verfahren nach der Erfindung 1st auf Enzyme anwendoar, die Wirkstoffgruppen enthalten, die unter Ausbildung von covalenten Bindungen fiit den freien Aldehydgruppen des Polysaccharide reagieren. Zu diesen Wirkstoffgruppen gehören z.B. die freien Aminogruppen gewisser Aminosäuren wie Lysin, insbesondere die C- Aminogruppe des Lysins.

Die Fixierung des Lysins an das unlösliche oxidierte FoIvsaccharid wird durch rüschen des Jiuzyms und des Polymeren unter H'ihren in einer Pufferlösung während mehrerer Stunde.ι ο.Λ oiuoi· Temperatur erreicht, die unterhalb der Inaktivierung stjmuorutur

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des Enzyms liegt. Die unlösbare Komplexverbindung, die durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einer Pufferlösung gewaschen wird, kann dann lyophilisiert werden.

Die Er^eotiisse, die bei dar Ausführung des Verfahrens nach ier Erfindung erhalten werden, naben die Tatsache bestätigt, Ja» die nachstehend aufgeführten Parameter beziglich der Reaktion der fixierung des Enzymö an das Polymer nicht kritisch sind.

ooweit die Art des Reaktionsmediums mit der Reinheit dos Enzyms und des Polymeren vereinbar ist, ibt dieses keinen merkbaren Einfluß auf die Heaktion aus. Obwohl dies nicht unbedingt nocwsniii; ist, werden das Polymere und das Enzym vorzugsweise in 3iner Pufferlösung gemischt, um die optimalen Bedingungen, für die Erreichung und Einhaltung der weiter unten angegebenen pil-Werte einzuhalten.

Andererseits setzen die Enzymmengen und die Mengen an aufzuwendenden oxidierten Polysacchariden und ihre Konzentrationen keine kritischen Grenzen. Die Mengen und Konzentrationen können in rtbnin^i^kelt von ier Art der ileaktionnteilnehmer so gewählt werlen, da'J eine optimale Fixierung der Enzyme erfolgt.

Ebenso können die fleaktionsparameter, wie der pH-^ert und iie i'3!np3ratur, in sehr weiten Jrenzen variiert werden, soweit jid lie Heinheit des Enzyms nicht beeinträchtigen. Obschon die Oüotan Er,^3bai^3e boi einem ρ I-Wert zwischen 7 und 3 errolsht worucn, ..au ι die i'ⁿixierun^ Jo.s simyms auf dem oxidierten PoIy-ViCuharli la ^inoai pil-i3ereioh .erfolgen, der zwischen 1 und 11 Ho, I. Etjjiiao Harm auch die HeakHonstemperatui·, obschon ale vor- ' Viicjiwi 4wl3cfio/i 0 C und HaumLe.nporatur liegt, «tfüj

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temperatur des jeweiltgejtt Enzyms l&agt-«.

Auch die deatctionszöitau Können 4*t jA&fc&ea,O*»#as33i zyrla&haa einigen einüben *ö»4 m&ftt&pen Stünden aotefaitoi»·

üie SewtiÄötig· 4©i· unlöslichen kompleite» i|te^1i|»ätmeen aus Polysacoiiarid und Enzym naoh dei* frlKler\&0i^imm$ktm$. keäm auf j öde geel^iet© Meise iBeehaimsch er'f<ilgei%r ^.ß. inj*oh 2ötifcrifuglepen, ?llterti oder l^igfl^esem·

ule naohsfceiienaea Beispiele öaptÄltera die Ausi*ahJ?tmg des Verfahrens zur HersteHwög äös SrzeugÄl^ses naoh der Äpfiitd-ung_k die jödoch nicht auf dlö hierbei aiagegöböiaen Wepte und* füiwungebedingtßigen tieschränkt sain soll.

Iä d1k©#sa B&lsjiie5.«a ättid di« Äktlvitätea dot»

J>ezogen auf dl© Aictlvlfrät ©in&r glelot*en

Vföjm die n&ch de« Zefttrlen«iyraati&che Älrbivität aufweist so kann M& Menge des stog^faltenea: wniösliohen Enay»s »acft uatei* BerüeJcsieirtlgiKig ä&r 'iktSÄehe bes^otee% werden, sia3 4ie if erhaltnlsse zwisBHeja ange^allea^ unloalioftsn iöi^y» und iänz.yauneugö aliatfrssits und ^iflfeheii 'lern Gewic&fc d#s unlöslte^ien Erzeugnisses und ü&m Gesanitgewlatffc des mltalnander umgeuets:ten Polysacehaftlds ίϊΜ Snzyos änd3rerstiibs glolcti Wenn die iberstehönde Lösung aliie ^

d.h., wenn das la das !iöaktloaiijie

vollütündiij fixiert war-UM l-'st. ist <iitiiJ3* ^:Uäj^©i»£uIi^ij,ii*fc nicht !»ehr uoisebrvioht, und es ist ύ&η& ^ο&ΐίο,ιαί,,» dLo /Iea,;o unloallchen ^n.'.yaia ««a oe^rfctRiiai^ -.. j. Juroh

BAD ORKSfNAL

Stimmung des Gesamt« ticks toff β eijaer bes-tiawtfee» Menge des hergestellten unlöslichen Srzeugnissea.

Beispiel 1

10 g Zellulose werden bei ^⁰C In 2 Litern einer 0,5-molaren wässrigen Natriumper,}odatlö©ung oxidiert. Nach der Oxidationsreaktion wird das Per^odat titriert.

Nach einer Reaktionszeit von 125 Stunden 1st das Perjodat verbraucht, wobei 0^5 Mol Perjodat Je Glukoseeinheit im Riysaccharld benötigt werden, worauf man die Oxidation durch Zugabe von Äthylenglykol abbrioht, paa unlösliche oxidierte Polysaccharid wird zweimal oit destilliertem Wasser gewaschen und dann getrocknet. Es enthält 10 « 12 S reduzierende Gruppen.

Man stellt dann eine Pufferlösung aus 0,2-molarem Natriumbarbit?al-Chlorhy(J,rat her, die man auf ^lnen pH-Wert von 8,0 einstellt. In diese Pufferlö#i»ig gibt man dann 100 mg oxidierte Zellulose, die zuvor mit öü mg kristallisiertem Papaln versetzt worden ist. Die «Mischung wird dann 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, worauf das unlösliche Produkt abzentrlfugiert wird. Die überstehende Flüssigkeit weist keine enzymatische Aktivität auf. Das unlösliche Hrodttkt wird dreimal in einer Pufferlösung gewaschen, die ie Li*er Lösung 1,210 g Cysteinchlorhydrat, 13,5 g Äaliumpho$jphajfc und ZO ml einer 0,1-nonailen Oinatrium-Äthyleiitilamiatetraaoetat-Lösung enthält utod deren pi-Wert auf 7,2 eingestellt ist» worauf das Produkt zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen wird.

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Die enzymatlsche Aktivität dieses Erzeugnisses wird durch Vergleich mit einem Suostrat bestimmt, das eine Lösung aarstellt, die 2 · ΙΟ""** Hol ^-N-Benzoyl-DL-arginin-^-nitroanilid je Liter gepufferte Waschlösung mit einem pH^Wert von 7t2 sowie 5 Gew.% Dlmethylsulfoxid enthält. Die enzyinatische Aktivität wird durch Messung des freigesetzten p-Nitro-anllins bestimmt (Absoprtionsspectrum im ultravioletten Licht fur eine Wellenlänge von 4Κ)5 nm).

Die auf diese Weise gemessene enzymatische AKtivität deu unlöslicnen Produtctos liegt bei C5 ,&»

Beispiel 2

Man stellt eine 0,2 molare wässrige Lösung von Trlhydrooxymethylaminomethoin her, deren pH-We'rt mit Hilfe von Chlorwasserstoffsäure auf 3,0 eingestellt wird, llan setzt dann 0,08 Hol Calciumchlorid je Liter Lösung zu und verdinnt diese Pufferlösung um entsprechende Konzentrationen an frihydrox/methvl. amlnomethan und an Calciumchlorid von 0,05 und 0,02 mol je Liter zu erhalten.

Man gibt dann zu 50 ml dieser Pufferlösung 200 ng kristallisiertes 'frypsln und 250 mg oxidierte Cellulose, die wie nach dem Beispiel 1 erhalten wird. Die Lösuag wird dann bei 4⁰C 20 Stunden lang gerihrt. Das unlösliche Produkt wird dann \0z3ntrifugiert, dreimal mit der Pufferlösung und zweimal mit deacilliertem Wasser gewaschen und schließlich lyophiliüiert. i-iar. erhält auf diese Weise 190 mg unlösliches Produkt, das 30 tv; Trypsin enthalt, woi>ei diese Wen-,e an Trypsin durch Hcüsun"·

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dar, üeya.ntstioksfcoff^ehaltas bestimmt wird. 'Jubel ist zu bemerken, da J in diesem Jeispiel die oiim. AbzencrlfUf.;! jrea des unlüsliü.iin Produktes anfallende . dc rs ο jhende x'¹! issi^!7;keit eine enzyj) itijche Aktivität aufweist. Die enzvnaciisciio A^clvitJt io3 fint'allendea unlüslionc.. ProduUteo, die ^e^^nlber dein rleichen iuosfcr<,iO wie im Jeispiel 1 oejcihiiiit wird, lio^c uci 33 /°·

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Claims (7)

-IU- Patentansprüche;

1. Erzeugnis, das eine enzymatiscno ^Ktivitit aufweist und ii V/asser oder wasserh \lti'j;en Medien unlöslich ist, dadurcn ^kennzeichnet, dai3 das Erzeugnis eiu Covalent an freie „>ruppen gebundenes Eaz/m darstellt-, die Ihrerseits aa ^i . Uiilöslicnes oxidiertes Polysaccharid _Ooouaden sind.

2. Erzeu^piis naeh Ansprucn 1, dadurch ^elconn^eicir.u-, I das Enzym Papalα darstellt.

3. Erzeugnis nach Ausprucn 1, dadurch ^anerui^ichnot, _Λ^ das En j yni Trypsin darstelle.

Ί-. Erzeugnis nach ^aepruch 1, d^ durcu gerienazöicnnet, da diis Polysi-iccharid CeLlulose darstelle.

5· Verfahren zur Herstellung deo Erjougnisjjj nach 1, dadurch gekennzeichnet, daft das Enzym mit unlöslichem oxidiertem Polysaccharid dadurch zur xieaktlon ;;;ebracnt wird, dai.^ diese beiden Substanzen in einer Pufferlösung ;nitei vermischt werden, worauf das unlöslicne Erzeugni -, von dem uiii abgetrennt v;ird.

6. Verfahren riucri Anspruch 5» dadui'ch gekennzeichnet, der pH-Wert der Pufferlösung auf einen Wert zwischen 7 u.id ο eingestellt wird.

7. Verfanren nach nnsprucn 5> d *duroa ";ekennzolehnet, d Jaj unlösliche Erzeugais lyophilLsicrt wird.

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