DE2219063A1 - Enzymatisch aktive Substanz, deren Herstellung und Verwendung - Google Patents

Description

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1A - 337 19. April 1972

BESBARCH CORPORATION, »•w York, N.Y., V.St.A.

Enzymatisch, aktiv· Substanz, deren Herstellung und Verve ndu nc

Di· Erfindung betrifft «in· enzymatisch, aktiv· Substanz, sowie deren Herstellung und Verwendung,

Enzym« sind Prot«inkatalysator*n, welche sich, für ein· Vielfalt von industriellen und wissenschaftlichen Anwendungen «ignen und insbesondere in d«r pharmazeutischen Industrie, der Papierindustrie und d«r Textilindustrie od«r dergleichen, Ihr· Wirksamkeit ist hoch spezifisch. und si· führen im allgemeinen nicht zu wesentlichen Mengen von unerwünschten N«b«nprodukt«n. Enzymreaktionen sind industriell vorteilhaft, da si« keine großen Investitionen hinsichtlich Varmeübertragungseinrichtungen •rfordern und leicht mehrstufig durchführbar sind· Daher werden di· mit d«r Abtrennung von Zwischenprodukte verbundenen Problem· auf «in Minimum reduziert·

Ein wesentlich·* Problem mit dem sieh die Fachwelt lange beschäftigt hat, ist jedech di· Schwierigkeit bei der Abtrennung and Wiedergewinnung des Enzymmaterials. In

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den meisten industriell verwendeten Verfahren wird die enzymatisch· Reaktion durch einfaches Vermischen des Enzyms mit dem Substrat durchgeführt, worauf das Enzym inaktiviert und/oder von dem Produkt zurückgewonnen wird oder wonach nicht umgesetztes Substrat nachfolgt. Sine solche Verfahrensweise ist Jedoch oft für das Produkt schädlich und führt zu einem unumgänglichen Verlust großer Mengen des Enzyms, da das Enzym gewöhnlich nicht zurückgewonnen wird oder bei einer Zurüokgewinnung nur in geringen Ausbeuten anfällt.

Sin weiteres ernsthaftes Problem besteht darin, daß die Enzyme gewöhnlich in wässriger dispergierter Form vorliegen. Demzufolge haben Enzyme, welche in dieser Form aufbewahrt werden, eine begrenzte Lebensdauer oder Lagerfähigkeit· Dies ist insbesondere der Fall, wenn sie in verdünnter Form gelagert werden· Sie verlieren rasch ihre Aktivität beim Lagern.

Zur Überwindung dieses Problems wurde ein Verfahren entwickelt um die Enzyme zu immobilisieren oder an einen

inerten unlöslichen Träger zu binden. Nach Beendigung der enzymatischen Reaktion kann das unlösliche Enzym-Material von dem nicht umgesetzten Substrat oder von dem Produkt durch herkömmliche Techniken, wie z. B. durch Ultrafiltration oder dergleichen abgetrennt werden.

Die Auswahl eines geeigneten inerten Trägers bereitete jedvch Schwierigkeiten. Der Träger muß nicht nur inert gegenüber dem Enzym sein, er muß vielmehr auch auf die katalytische Aktivität des Enzyms keinen hemmenden Einfluss haben, nooh zu unerwünschter unspezifischer Adsorption führen. Darüber hinaus sollte das Trägermaterial zu einem Minimum an sterisoher Hinderung in Bezug auf die

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Knsrm-8ubetratr«akti*a fuhren« Β· wurde bereite eine groBe Ti·If alt τοκ Trägermateriallea vergeschlägern, Je aaoh der speziellem. Bnsymreaktiea und je aaoh de« epeziellea Knsjrau-Solehe herkömmlich verwendeten Trägermaterialien umfaaeen z. B. synthetische Polymere, wie Polyamide, Cellnlese-Derivate, verschiedene Teae «ad Xoaea-Auatausch-Harse_t insbesondere DKAK-Cellulese aad SKlK-Sexträne, siehe Susukl et al·, l«r. Blei. Ch··., Band 30, Xr. 8, Seiten 807-812 (1?66)« Bekannte Arten der IsMobilisiernnf von Knxjnsen umfassen s. B. die direkte kovalente Bindan«, die indirekte 'Bindung duroh eine interaediäre Verbiaduac, die Yernetsnag des BnsTMB oder da· Binschli*Bea des Baxya· i« Poljreer- «itter.

Keine dieser bekannten Teohniken oder Trac*rsubstanz«n ist Yollstäadi» befriedigend. Syathetisohe PelyaerMtterialien sind teeer «ad bJLafig aicht leicht B»«ftnglioh· Sar<tb«r hinan· erfordern sie oft eine Spexialbehandluac na das Bnsya oheaiaoh an da· Trägermaterial se binden· Die Celiolese-Berivate eignen eioh im allceaeinen nloht als Trac«raat«riali«a ftr Carbehydrasea, da Kohlenhydrate Sabstrat· dieser Bnsjae sind. Ieaea-Avataneohar-larz·, vie «. B. SKIK-Cellalese «Ad SSlK-Sexträn siad sieht allgemein anwendbar· Bei den Mieten bekannten iaaobilislerten Basya-Pr&paratem stellt die Kniyafreigabe fts Träger ein schwerwiegend·· Froblea dar· Die··· Froblosi ist insbesondere sehwierig wenn Aaiyla·· am Tem gebunden ist· Da· Bnsya wird hier wahrend der hydrelrtisch·· Reaktion der Stärke freigeaotst·

Bin weiterer Baohteil der herk«m«ü.ieh«n Terfahrea aar IasKbilisieraag Tea Bnaraea besteht darin, daS sich «alöslich· ?astea, Teilehea euer KVraohea bilde·. PtLr eine Reihe von lawendangea bieten derartige Basyapräparate

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erhebliche Schwierigkeit·!!, insbesondere bei Anwendung in großen Mafiatab oder bei kontinuierlichen Langzeit-▼erfahren.

Saher besteht ein Bedarf für einen besseren Knzyaträger, welcher in beliebige Feraeη gebracht werden kann und soait als strukturelle· Bauteil eines Reaktienssysteas verwendet werden kann, so daß Trennprobleae vollständig beseitigt werden. Insbesondere besteht ein Bedarf für Meabranträger oder filaab.nl lohe Träger an welche die Enzyme koaplex gebunden werden können, ohne daß es zu einer Behinderung der katalytischem Aktivität koset, so daß die ensyaatiechen Reaktionen in einfacher Veise vonstatten

gehen, wenn aan das Substrat über die aktive Meabran oder über den aktiven FiIa laufen läßt.

Es 1st daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine enxyaatisch aktive Substanz in Meabranfora zu schaffen, sowie ein Torfahrβη zur Herstellung einer derartigen enzyaatisoh aktiven Substanz In Meabranfera und eine Verwendung dieser enzymatisch aktiven Substanz für ensyaatische Reaktionen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgeaäß durch eine Proteinoder Pelypeptid-Neabran alt koaplex gebundenea Snzya gelöst.

Das erfladungsgeaäße Verfahren zur Herstellung einer solchen enzymatisch aktiven Substanz ist dadureh gekennzeioh· not, daß eine Protein- oder Polypeptld-Meabran bis zur aaxiaalen Quellungekapazität gequollen wird und sodann in eine wässrige Lösung eines Xnzyas eingetaucht wird bis das Sn.zya keaplex an die Neabran gebunden ist*

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Membranen können sowohl aus synthetischen Polypeptiden als auch, aus natürlichen Proteinen in modifizierter oder unmodifizierter Fon bestehen. Zum Beispiel wird in einem Fall die Enzymirnmobillsierung dadurch erreicht, daß eine Proteinmembran gequollen wird, vorauf diese Membran während einer genügend langen Zeitdauer in eine wässrige Enzymdispersion eingetaucht wird um das Enzym komplex an das Protein zu binden·

Der Komplexierungsmechanismus zwischen den Enzymen einerseits und den Proteinmembranen oder den filmähnlichen Proteinträgera. andererseits umfasst die Ausbildung Von mehrfachen Yassersteffbindungen, von Salzbindungen und rom ▼an der Yaals-Yeehselwirkungen· Sie Komplexbildung verläuft besonders leicht bei eine« pH-Yert zwischen dem isoelektrischen Punkt des Enzyms und dem isoelektrischen Punkt der Proteinmembran·

Erfindungsgemäß kann eine große Vielfalt von synthetischen Polypeptiden und Naturproteinen verwendet werden· Zum Beispiel können die folgenden natürlichen Proteine verwendet werdens Kollagen, Zein, Casein, Ovalbumin, YeiMngluten, Fibrinogen, Myosin, Muooprotein oder dergleichen* Ferner sind z. B. die folgenden synthetischen Polypeptide geeignet! Polyglutamat, Polyaspartat, Polyphenylalanin, PoIytyrosin und Copolymere des Leucine mit p-Amino-phenylalanin.

Die Auswahl eines speziellen synthetischen Polypeptide oder eines speziellen Naturproteins in modifizierter oder unmodifizierter Form hängt unter anderem von der Natur des zu komplexierenden Enzyms ab, sowie von der Natur des umzusetzenden Substrats und von den Reaktionsbedingungen· Kollagen und Zein sind bevorzugte Naturproteine, da sie gegenüber einer großen Zahl von Enzymen inert sind. Die folgende Beschreibung bezieht sich in der Hauptsache auf

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Kollag·α und Zein· Selbstverständlich können auch. Membranen aas anderen Vertreter» der oben genannten synthetischen Polypeptide und Maturproteine eingesetzt werden·

Bei einer Aasführungsfora wird eis Kollagenfilm in herkömmlicher Weise durch Gießen einer Kollagendispersion hergestellt. Sodann wird dieser Film gequollen, «it Wasser gewaschen und in eine Enzymlösung eingetaucht. Ss wird gekühlt gelagert, usi de« Enzym Gelegenheit zn geben, in die Kollageneiesibran einzudiffundieren. Der Film kann sodann auf eine Basis aufgebracht werden, wie z. B. auf einen Celluloseaoetatfllm. Schließlich wird der FiIa getreoknet. Kollagen ist ein Hydroxyprolin-Glycin-Protein. Es bildet den organischen Hauptbestandteil tob tierische« Bindegewebe und von Knochen. Chemisch unterscheidet sich Kollagen von anderen Proteinen durch einen ungewöhnlich hohen Glycin-Gehalt. Etwa 1/3 der Aminosäurereste im Kollagen besteht ans Glycin« Ferner hat Kollagen einen hohen Gehalt an Prolin und Hydroxyprolin. Hinsichtlich seines Gehaltes an Hydroxyglyein nisnt das Kollagen unter den Proteinen eine Senderstellung ein. Der Gehalt des Kollagens an aromatischen und schwefelhaltigen Aminosäuren ist Bemerkenswert gering. Das Kollagen kann in guten Ausbeuten aus Körperteilen Ton einer großen Tie1zahl τοη Säugetieren und Fischen gewonnen werden· Häufig wird Kollagen aus Schweinesehnen, Schafsehnen und Rindersehnen gewonnen, sowie aus Sohweinehaut, aus Gerbereiabfällen, wie z. B. aus nicht für die Ledergewinnung verwendbaren Kalbsfellen, sowie aus Ossein, welches aus Rinderknochen durch Säurebehandlung unter Entfernung des Kalziumphosphats und anschließende Trocknung erhalten wird·

Eine brauchbare Methode zur Herstellung einer Kollagen-Membran besteht aus folgenden Schrittenι Die Kollagenquelle wird zunächst; Bit einer ßnxymlüsung behandelt um das Elastin aufzulösen, weLoh.es die Kollagsnfaseru umgibt und verbindet, Für diessn Zweck kommen z. B,

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proteolytiache inijnM ana pflanzlichen «dar tieriachen Qnellen im Frage« Daneben eignen al oh. J «doch, an oh. andara Eazyae. Sadaaa wird dia Kollagenqnelle ait Yasaer gewaachen und dia 18·Iichaη Protaiaa uad Lipoida werdea durch Behändlung ait einer verdünnten wäaarigea Löauag eineacbalatiaierangaaittela, via z. B. daa Tetranatriuaaalzea der Äthylendiaain-tetraeaaigaäure aatfarat. Sadaaa vardan dia Ko Hagenfaaera ia aiaar geeigneten Säure, vie z. B. ia Cyaaaaaigatnra, gaquallaa, vobai eich aiaa Kollagaafaaardisparaiaa auabildat (Heohetadt, at al., VS-PS 2.920.ΘΘ0)· Diaaa Biaparaiaa kaum aodana ia aiae faaigaata Maabraafora fagoeaaa adar axtrndiart vardaa« Dia gatrookaata Kallagaa-■aabraa wird aadaaa w&araad 48 a aai 60 ⁰C and 95 f relativer Faucktickait aachbahaadalt adar fixiert odar gehärtet. Ferner ktSnaen geeignete Maabraaaa geaKA BR-PS 1· 153*551 doroh elektrische Aeseheidaag daa Kellageaa aas dar Kellageafaaardispareiaa gaweaaea werdea· Haaea daa gaaaaataa Mathadaa dar Herstellaag vea Kellageaaeabraaea eignen sich aatmrlich aaoh alia anderen Taehaikea zur Karstelluag soloher Mevaraaea. Terz ^aweise ha se a dia arfiadaagagaaUlA ▼erweadetea Kallagaaaasbraaaa eine Dicke tob 0,005 ■■» bi· 0,1 bob «ad iaaaeaeadere tob 0,01 an aia 0,05 an. Weaa die Meabraadioke gariager ala 0,005 ana ist, m· hat dia Meaaraa kaiaa genttgeade Festigkeit. Faraar ist aa auglioh, eafl aich bei diesen geringea Diokaa kaia vellstäadiger zasaaaeahäageader FiIa eaae Perea, Looker adar aadara atraktaralle Defekte aasbildet. Yaaa dia Dicke 0,1 aa übersteigt, ao ataigaa dia Kosten naaetig aa ohne dafi die Laiataagafihigkeit dar arfiadaagagaaKSaa Meabran aach erheblich ansteigt. Natürlich iat die erfiadungageaaBe Haabraa anch aeoh bei gröflerea Dickaa Toll funktioasf&hig.

Für apesieHe Zwaeka können dia Meabranen aech aadara Steffe aathalten. Weichmacher konaea verwendet werden, aa

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■ um

die Molekular· Struktur der Membran zu modifizieren. Hierdurch wird «in· Kettenverschiebung «ad daait ein· grufiere Elastizität bewirkt. Durch Zusetzung von Anfeaohtungsaittela eder Befeuohtungsaitteln kana die Wasseraufnahaekapazität günstig beeinflusst werde κ. Dar ob. Zugabe ▼on Vernetzungsmittel^ durch. Wärmefixierung oder durch Gerbang, z« B. daran Chromgerbung oder durch Formaldehydgerbang nach herkSaalichea Verfahren kann eine Hydrolyse ▼eraieden werden. Ferner kunnen auf diese Weise zusätzliohe Bindnngsstellen fttr das Enzym gebildet werden, so daß auf diese Weise die Ensyaabserption verbessert wird·

Sodann wird die Kellagenaembran für die Koaplexierung ait des Enzya vorbereitet» Dies geschieht ia allgeaeinen durch Quellen ait einer organischen Säure» welche ein niedriges Molekulargewicht hat oder in einigen Fällen durch Quellen alt einer geeigneten Base, so daß der pH-Vert ia Bereich ▼on etwa 2 bis 12 liegt· Geeignete Säuren nafassen z. B« Milchsäure and Cyanessigsäare· Falls erwünscht, können Veiohaacher oder andere oben genannte Zusätze während der Quellstuf· zugesetzt werden· Die Quellung wird durchgeführt, indea die Meabran während 1/2 bis 1 h, je nach den speziellen Badbedingungen, ia allgeaeinen bei Ziaaerteaperatur in das Quellungsbad eingetaucht wird. Venn zu lange gequollen wird, so besteht die Gefahr, daß das Kollagen in lösliche Gelatine uagewandelt wird. Die Meabran wird auf Grund der Acidität der organischen Säure und auf Grund der Veiohaacherwirkung der organischen Säure gequollen« Weitere Zusätze sind nicht erforderlich* Auf Grand der Säurebehandlung keaat eine Veränderung der Wasseraufnahmefähigkeit zustande« Haoh der Quellungsbehandlung wird die gequollene Kollagenaeabran sorgfältig ait Wasser gewaschen bis der pH-Wert der Meabran innerhalb eines Bereiches liegt, in dea das jeweilige Enzjra an die Meabran keaplex gebunden werden kann«

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Sedana wird di· gequollene und gespült· Membran in «in· wässrig· Snzrmlösung eingetaucht bis dl· Komplexieruag der Membraa alt dem Bnzym beendet ist. Gewöhnlioh nimmt di·»· Stuf· etwa 1Θ h bis 2 Tag· la Anspruch. Wahrend dieser Zeitdauer sollt· di· Temperatur bei k °G bis 20 ⁹C, je aach dem sp«zi«ll«a ang·wandten lazy·, gehalten werden· Nach dem Waschen wird die Maximale Bnzymaufnähme durch Aktivitätsmessung bestimmt. Diese Messung zeigt an, ob die Komplexieruag beeadet ist« Der Bnzym-Kollagen-Komplex sollte sorgfältig getrocknet werden, vorzugsweise etwa bei Zimmertemperatur oder bei eiaer niedrigeren Temperatur, so daß das komplex gebundene Enzym nicht zerstört oder besohädigt wird.

Im folgenden sei ein zweites Beispiel für die Herstellung eiaes Bnzym-Kemplexes mit einem natürlichen Protein beschrieben. Bin Zeinfilm wird hergestellt, indem man eine Zeialösaag in herkömmlicher Weise ze einem Film gießt* Bs wird das gleiche Verfahren wie bei der Herstellung des Kollagenfilms angewandt, außer daß bei der Quellung des Zeiafilms Weichmacher als Quellungshilfen zugesetzt werden, wie z. B. 1,5-**atan-diel.

Zoia ist das Pxolamia (alkehel-lösliohes Protein) der Maiskörner. Bs ist das einzige im Handel erhältich· Pxolamia und «in·· der wenigen leioat zugänglichen Pflanzenproteine. Zein fladet sich la erster Liaie im Badosperms des Maiskoras· Die Meng· aa alk«hel-18sliohem Protein steht la direkter Beziehung zum Oesamtproteingehalt im Cndosperm. Der Zeiagehalt liegt bei 2,2 bis 10,4 +, bezogen auf die Trockensubstanz iron verschiedenen Maisproben.

Zola zeichaet sieh im Yergleieh za dea meisten anderen Proteinen duroh eiaea relativ geriagea Gehalt aa hydrephilea Gruppen aus. Der hohe Anteil aa aicht-pelaren Seitenketten (Kehlenwassersteffgrupyen) und Säureamld-Seitenkettea bewirkt die Löslichkeit des Zeias la organischen Lösungs-

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mitteln, weshalb da· Zein ale Prolamin klassifiziert wird.

Sin in Handel erhältliches Zein ist Argo-Zein G-2OO, hergestellt durch Cera Products Refining Company, Argo, Illinois, Die Filmgiefilösungen können auf der Basis von reinen Komponente η hergestellt werden, wobei stan den Wassergehalt des Bonzeins and der anderen Komponenten berücksichtigen mu£. Die Giefilösuagen werden durch Auflösung des Proteins in des ausgewählten organischen Lösungsmittel enter leichter Rührung bei Zimmertemperatur während 1 bis 2 h hergestellt. Während dieser Zeitdauer findet eine vollständige AeflBseng statt· Xmfolgenden werden einige Beispiele geeigneter Lösungsmittel genannt! 81 % (Gewicht/Gewicht) Isoprepylalkehel und K % Ithyleaglyool-monoäthyl-äther. Die Klaren Lös engen, welche 20 bis 30 Gewichtsprozent trockenes Zein enthalten, haben eine Bernsteinfärbang. Härtengsmittel, wie z. B. Formaldehyd und Weichmacher können kurz vor dem GieBea des Films zugesetzt werden* VatürIioh kann Jede beliebige herkömmliche Methode zur Herstelleng v®a leinmembranem angewandt werden«

Srfindungsgemäfl eignen sich insbesondere Zelnmembraaen mit einer Dioke von 0,005 mm bis 0,1 mm. Sedann wird die Zeinmembran für die Komplexiereng mit dem Bnzym verbe»reitet. Dies geschieht daroh Qeellang mit einem Weichmacher, falls beim FilmgleAen kein Weichmacher zugesetzt werde« Geeignete Weiehmaoher sind 1,5-Oetaa-diel, Gljoorin end Sorbit. Dies geschieht der oh Kintamhen der Membran in ein Bad τοη 2 % (Gowicht/Oowicht) des Weichmachers im Wasser während 10 h bei Zimmertemperatur. Sodann wird die

geqeellene Membran mit Seidenpapier getrocknet end in eine wässrige Bnsymlösung eingetaeoht, bis die Komplexiereng beendet ist. GewShnlioh bedarf es hierse eimer Zeitdauer ▼on 10 h bis 2 Tagen. Dabei seilte die Temporater in

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einem Bereich, von k ⁰C bis 20 °C, je nach den eingesetzten lazjr· gehalten werden. Der Enzym-Zein-Komplex sollte aorgfKitig getrocknet werden, vorzugsweise etwa bei Zimmertemperatur oder bei einer niedrigen Temperatur, so daß das Komplex gebundene Enzym nicht zerstört wird.

Tür die Komplexierung mit Katurproteisaon, wie z. B» Mit Kollagen, oder Zein oder dergleichen, eignen sieh viel® verschiedene Proteine je nach der speziellen Anwendung. Ie folgenden sei eine Auswahl der geeigneten Enzym· aufgezählt* Amylasen, Lysozym, Xavextaee, Wreaee,,

transf erase, Carboxyl -Beterase ₉ Arjl-*Effit«raae₀ Lip&se,

Pektinesterase, Glecoaejlaee _t Aisylo^efetia Oligo-1,6-gluoosidas«, P©lygalaetrar©Kiaee,

β-G-lnoosidaee, ^-Galaetotsidi&s® _t Crl«e«s««O

Oxydase, Brenzkatechin-Oxydatse, Eatalaoe, Lipoxydase, Glno&se-Xseacrase, Pee.ta.fitomaiien, Xylose-iseaerase, Sulfit-oxy«l»ß®, Penicillinase, CarbonanhycSra®« _$

steroid- ^¹ -dehydrogenaee, ίί"Ά-Έ.γύτ®χγΐΆΒ® mud säureacylasen· Es könaeiä m.ucL· varträglieh®

von Snzyven und Multienzynsjeteae ac. das Eeliages. komplex

gebunden werden.

Insbesondere geeignet sind Lysozya, Invertase, Urease und Aaylasen. Lysozya hat verbreitete Anwendung zur Hydrolyse von Mikroorganismen in der pharmazeutischen Forschung gefunden, sowie bei der Abwasserbehandlung. Es wird entweder allein oder in Kombination ait anderen Enzymen und/oder Bakterien angewandt, line besonders wichtige Anwendung des Lysozym-Proteinmembrankomplexes ist die Lysis von Zellen.

Invertase oder fi-D-Practefuranosidase findet in der Nahrungsmittel- und Geträndelndustrie sowie in der Analyse Anwendung. Xnvertase kann dazu verwendet werden, die

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Hydrolyse von Saccharose zu Glucose und Fructose oder die Inversion von Zucker zu katalysierea. Invertase ist bei der Hydrolyse von β-D-Fructofuranesylbindungen in Saccharose, Rafflnose, Gentianose und Methyl- und ß-Fructofructose wirksam. Sine besonders wichtige Anwendung des Invertase-Proteinmembrankomplexes ist die kontinuierliche Hydrolyse von Saccharose.

Urease ist ein hoch spezifisches Enzym, welches die Umwandlung von Harnstoff in Ammoniumcarbonat katalysiert. Urease vird oft dazu verwendet, den Harnstoffgehalt in Urinproben zu bestimmen. Vegen dieser hoch spezifischen Wirksamkeit kann man die erfindungegemäfie Urease-Proteinkomplexmembran in künstlichen Mieren anwenden« Darüber hinaus können Urease-Proteinkomplexmembranen für die wiederholte Hydrolyse von Harnstoff verwendet werden, wie z. B* für die Behandlung vpn menschlichem Urin oder dergleichen·

tf-Amyläse wird als "verflüssigendes Enzym* bezeichnet» Ss hydrolysiert allgemein Stärke, Olykogen und Dextrane. fi-Amylase dient zur Erzeugung von Maltose aus Zacker, Glykogen und Dextran. Andere geeignete Amylasen sind I^-Gluoosidase, Amyloglueosidase, Amylo-1,6- ftf-glucosidase (Snzym zur Entfernung von Verzweigungen), Oligo-1,6-gluoesidase (Limit-Dextrinase), Xsomaltase und Isotriase· Der Aasdruck "Amyläse" bezieht sich somit auf eines oder mehrere dieser und anderer Amylasen. Sine besonders wichtige Anwendung des Amylase-Proteinkomplexes gemäß vorliegender Erfindung ist die kontinuierliche Hydrolyse von Stärke durch kontinuierliches Überleiten eines Stärkesubstrate über die enzymatisch aktive Membran·

Mehrere Enzyme können gleichzeitig komplex an die Proteinmembran gebunden werden. Bs ist z. B. erwünscht, o(-Amy la se zusammen mit anderen Enzymen komplex zu binden, da «^-Amylase das Stärkemolekül in unspezifischer Weise spaltet, so daß

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reaktiv· Stellen für ander· spezifischere Enzyme gebildet werdeα.

Die auf diese Weise gebildeten !«mobilisierten Komplexe haben eine none enzymatisch* Aktivität. Wenn ein enzymatisch aktives Substrat mit diesen Komplexen in Berührung gebracht wird, se verbleibt während der gesamten Reaktionsdauer eine konstante Menge des Enzyme am Trägermaterial, so daß eine besondere Abtrennung vie bei herkömmlichen Verfahren nicht erforderlich ist. Ferner wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Enzym-Proteinkomplexe auch bei langen Lagerangszeiten stabil sind und daß sie wiederholt ausgewaschen werden können, ohne daß es zu einem¹wesentlichen Verlost der enzymatischem Aktivität kommt.

Die Art der komplexen Bindung des Snzyms an die Preteinmembran ist nicht bekannt· Ss wird jedoch angenommen, daß der Komplexiernngsmechanismus zwischen der Proteinmembran oder dem filmähnlichen Proteinträger einerseits und dem Enzym andererseits die Bildung einer Vielzahl von Wasβer-Stoffbindungen, sowie von Salzbindungen und von van der Vaals-Yeohselwirkungen umfasst« Die Komplexbildung geht besonders leicht bei einem pH-Wert zwischen dem isoelektrischen Punkt des Enzyms und der Proteinmembran vonstatten· Ss meß betont werden, daß die Herstellungen von Membranen» z· B. aus Kellagenfilmea oder dergleichen, dem Fachmann wohl bekannt sind· So ist das US-Patent 2.92Ο.ΟΘΟ, welches oben erwähnt wurde, eine unter vielen Veröffentlichungen, welche die Herstellung von Kollagenfilmen und-Membranen betreffen.

Zm folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

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Beispiel 1 (Lyiozy)

Di···· Beispiel zeigt di· Herstellung und die Verwendung •ine· LysozYa-Kollag«n-M«abrankoapl«xes ·

1 ca³ «in·· O,025 η dicken Kollag«n-Pila· (während 48 h bei 55 °C und bei 90 £ relativer Feuchtigkeit nacherhitzt) wurde in einer Milchsäurelösung (pH »3) gequollen und sodann 5 sin in fliefiendea Leitungswasser gewaschen· Sodann wurde der gewaschene FiIa in eine Enzya-Lösung von 250 ag Lysozya in 15 er Wasser eingetaucht und bei 2 C während i4 h so belassen. Sodann wurde der behandelte FiIa auf Celluloseacetat aufgebracht und bei Ziaaerteaperatur getrocknet· Auf diese Weise erhielt aan eine Lyeozya-Kollag«n-Koapl«xa«abran.

Eine Lösung von Mikrooeoous-lyaodoictikus (300 ag getrockneter Zellen pro Liter) wurde dazu verwendet, die enzyaatiach· Aktivität des Koaplexes zu bestiaaen. Dabei wurde die Abnahae der optischen Dichte der Bakterienlösung bei 450 au geaessen. Der getrocknete Meabrankeaplex wurde zunächst ait 10 1 flioBendea Wasser gewaschen und seine anfängliche enzyaatisohe Aktivität wurde geaessen· Diese Bestimmung erfolgte auf der Basis der Abnahae der optischen Dichte aach einer Reaktieasdauer von 30 ain, dividiert durch die anfängliche optische Dichte. Der Koaplex wurde zwischen den einzelnen Sxperiaenten ait 2 1 Wasser gewaschen. Die anfängliche Aktivität betrug 0,538, entsprechend einer Auflösung von 53*8 % der Zellen. Die zweite Wiederholung ergab eine Aktivität von 0,420, entsprechend einer Auflösung von 42 £; die dritte Wiederholung ergab eine Aktivität von 0,489, entsprechend einer Auflösung von 48,9 % und das vierte Sxperiaent ergab eine Aktivität von 0,533, entsprechend einer Auflösung ven 53,3 5t.

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- 15 Beispiel 2 (invertase)

Di···« Beispiel 1i«eciir*ibt die Herstellung und Verwendung eines Invertase-Kollagen-Komplexes· 1,5 ea^ oio.ee 0,025 »■ dicken Kollagen-Films (ungegerbt und mindestens 2 Mocate bei Zimmertemperatur gelagert) wurden in einer Milchsäurelösung (pH β 3) gequollen. Der Film wurde sodann während 1/2 b> in Wasser gewaschen und der gewaschen· FiIi wurde in •in· Lösung τοη 14O mg Invertase in 10 cm ¥ass@r eingetaucht und in einem Kühlschrank über Macht stehengelassen» Sodann wurde der behandelte Film auf ein Celluloseacetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Ber getrocknete Film stellt eine Kollagen-Xnvertase-Komplex membran dar, welche bei dem nachfolgendem Versuch einer Saccharosehydrolyee verwendet wurd«u

400 cwP einer 6^-Saccharoeelö©«iig nrardea ale Siabstrat bei dem Enzym-Versuch verwendet« Di© e&asyaatisch« Aktivität wurde in einem Umlaufreaktersyst«m polarimetrifficli. verfolgte Nach Bestimmung der Aktivität des Films wurde dieser ia 2 1 Wasser gewaschen und die Aktivität wurde wiederum g®- messen* Dieses Verfahren wurde mehr als 20 mal wiederholt, wobei insgesamt mit mehr als ^O 1 Wasser gewaschen wurde* Die enzymatisch^ Aktivität des Invertase-Eollagen-Komplexvs nahm allmählich nach dem Waschen ab,um schließlich einen stabilen Grenzwert zu erreichen, welcher beim Waschen mit mehr als 10 1 Wasser konstant blieb. Die gesamte bis zu diesem Zeitpunkt abgelaufene Zeit betrug 13 Tag·.

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Tabelle 1

fr ^-, j w ι. $ invertierte Saccharose nach

Zahl der Waschungen £₀ ^_{n Reaktlon8dau#r}

25 C pH 5 - 6

1 50

5 ^O

10 38

15 30

20 28

25 26

30 25

35 25

l|0 Zk

Die enzymatisch* Aktivität dee Invertaeβ-Komplexe· bei der stabilen unteren Grenze entspricht einer Reaktionsgeschirindigkeit von 1,73 * 10 mol/l/min. Wenn mn dem Komplex den gleichen Umsatz zuschreibt wie dem freien Enzym (370 Mole Saccharose pro Mol Enzym pro Sekunde) so entspricht die obige Reaktionsgeschwindigkeit einer Aktivität von 21,4 mg Invertase in 1 1 einer 6$igen Saccharose-Lösung. Da nur 1,5 cm*' eines Invertase-Komplexes für die. Hydrolyse von JfOO Gwr Substrat verwendet wurden, so wird die an 1,5 cm Membran gebundene Menge Invertase ze 8,56 mg berechnet oder zu 5,7 «g Invertase pro 1 owr des Komplexes«

Diese Serie von Experimenten wurde über eine Zeitdauer von

ο 3 13 Tagen durchgeführt. Der Komplex wurde bei 2 C in 5 destilliertem Wasser aufbewahrt, wenn er nicht gebraucht wurde.

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Beispiel 3 (Urea»·) Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Verwen-

3 dung von Urease~Kollagen-Membranen· 1 cm eines OpE5 ■»» dicken Kollagen-Files (während 48 h bei 60 ⁰C und 95 $ relativer Feuchtigkeit nacherhitzt) vurde in einer Milchsäurelösung (pH « 3) gequollen und sodann 1/2 h lang in Wasser gewaschen. Der gewaschene FiIa wurde in eine Enzymlösung von 200 ag Urease in 15 car Wasser während 16 h eingetaucht. Sodann wurde der File auf ein Celluloseacetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet·

Vor der Verwendung wurde der Membran-Urease-Komplex mit 5 1 Wasser gewaschen und 5 Tage bei die Urease-Aktivität gemessen wurde,

5 1 Wasser gewaschen und 5 Tage bei 2 ⁰C gelagert, ehe

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Tab·11· 2
HydroIy*· von Harnetorf »it dem Ürease-Kollagen-Membrankomplex

Tag Konzentration * hydrolysiertor Harnstoff während angegebener pH der Harnstoff d.Harnst off- HHaktionsdaaer lösung

lSsang „ "" "

3,3 χ 1Q~^J M Potentiometrische Messung Verwendung Ton anfang- end-

(anfanglich) Kessler«β lieh gültig

Reagenz

O	1	b	5	100
co		8
OO	2	8	100
*·»	3	8	10
cn	k		1
N)
	1
CO	1
	1
	1

0,21 i»	(30	min)
0,3 i	(20	H)
0,20 $	(16C	) min)
7,6 *	(2OC	> min)
C
^k £	(20	min)
7,6 *	(20	min)
3,8 *	(20	min)
99 *	(20	h)

8 £ (20 min)
5 * (20 min)
99* (20 h)

7,30
7,30

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7,90

A 3

a. Bei allen Experimenten zur Hydrolyse von 50 cm^J Harnstofflösung wurde 1 cm des Membraakemplexes verwendet.

b_# Der am k. Tag verwendete Membrankemplex.wurde vor der Verwendung am 5. Tag in 50 cm einer Enzymlösung (100 mg Urease/50 cm"*) während 14 h eingetaucht und sodann mit 2 Wasser gewaschen.

c. Durchschnitt von zwei Experimenten·

00

Di« Urease-Aktivität wurde durch direkte potentiometrisohe Messung der Ammoniumionenkonzentration unter Verwendung einer kationenempfindlichen Slektrode, Bookman '39137, verfolgt* Ferner wurde eine colorimetriache Messung ait Hilfe ▼on Nessler's Reagenz durchgeführt« Aiamoniuiiisulfat wurde verwendet, üb in beiden Fällen eine Standardkurve zn erhalten» Bin Tropfen eines frisch hergestelltem Kessler*s Reagenz wurde zu 2 «1 Substratlösung gegeben und die Farbintensität wurde spektral fotometrisch bei einer Wellenlänge von 430 Bp gemessen· Drei Konzentrationen Ton Harnstoff, nämlich 3,3 χ ΙΟ"¹, 3,3 χ 10~² und 3,3 x 1O™³ mol in destilliertem Wasser wurden verwendet. Bio Aktivität des Membrankomplexes wurde während 1 Woche getestet· Die

3
Membran wurde in 50 esr destilliertes Wasser eingetaucht, bei Zimmertemperatur gelagert, wenn sie nicht verwendet

3 wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß bei Verwendung von 1 cm

Membra&komplex, welcher zuvor sehen 1 Woche lang - verwendet

—3 wurde, während 20 h bei 50 ml «ia«nr 3»3 x 10 solaren

Lösung eine 99$ig· Hydrolyse stattfand, Beispiel k (Amyläse)

Dieses Beispiel zeigt die Bildung und Verwendung einer

Amylase-Kollagen-Komplexmembran. 2 cnr eines Kollagen-Films mit einer Dicke von 0,038 mm (während 48 h bei 60 °C und 95 Ί» relativer Feuchtigkeit nacherhitzt) wurde in einer Milohsäurelösung (pH = 3) während 1/2 h gequollen. Sodann wurde der Film während 5 "in unter fließendem Leitungswasser gewaschen und der gewaschene Film wurde

3 in eine Lösung von 200 mg Malzamylase in 15 car Wasser eingetaucht und 15 h bei 2 ⁰C so belassen· Bs bestand keine Notwendigkeit, die überschüssige Bnzymlösung zu entfernen und der so behandelte Film wurde unmittelbar auf einen Celluloseacetatfilm mit einer Dicke von 0,025 bis 0,05 mm aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet, Die getrocknete Kollagen-Amylase-Komplexmembran wurde

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3 für di· Hydrolyse von Stärk· verwendet. 50 cm einer

Stärkelösung ward· als Substrat bei dee Enzymversuoh verwendet. Di· enzymatisch* Aktivität wurde anhand der Abnahme der Intensität der Blaufärbung dee Stärk·»*·«- komplexes gemessen (Veränderung der eptisohen Dichte bei 400 au). Ein Standard-Jod-Reagaaz wurde durch Auflesen von 30 g KaliuBajodid und 3 g J₉ in 1 1 destillierten Wasser

3 hergestellt« 1 Tropfen von diesem Reagenz wurde zu 20 ob des umgesetzten Substrats gegeben, welches während 15 Bd.η bei ho ⁰C Bd.t 2 on der Amylase-Kollagen-Komplexmembran behandelt worden war« Di· Absorption bei 400 mn wurde gemessen.

Die folgenden Ergebnisse der Stärke-Hydrolyse mit der Kollagen-Amylase-Komplexmembran, welche vor Durchführung des Experimentes mit 10 1 Wasser gewaschen wurde, wurden gemessen· Nach 15 Bd.η wechselte die Färbung der Jod-Stärke-Lösung von Blau nach Violett, entsprechend dem Abbau der Stärke-Molekül· von einem anfänglichen durchschnittlichen Polymerisationsgrad von mehr als 30 bis zu einem endgültigen durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 10 bis 15· Beim ersten Experiment bei einer Umsetzung von 50 cm einer i£igen Stärke-Lösung während 15 »in bei ^O ⁰C in Gegenwart von 2 oar des Films ergab sich eine Amyläse-Aktivität von 0,700, gemessen als Quotient der Abnahm· der optischen Dichte bei 400 mn, dividiert durch die anfängliche optische Dichte bei 400 mn. Der Komplex wurde mit 2 1 Wasser gewaschen« Beim zweiten Experiment ergab sich eine Amylase-Aktivität von 0,325· Sodann wurde wiederum gewaschen und es wurde eine Amyläse-Aktivität von 0,500 beim dritten Experiment festgestellt.

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Beispiel 5 (Collulase)

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und Verwendung eines Gellulase-Kollagen-Komplexes. 1 cm eines 0,038 mm dicken Kollagen-Films (während 30 h bei 55 °C and 95 $ relativer Feuchtigkeit nacherhitzt und sodann 2 Monate bei Zimmertemperatur gelagert) wurde in einer Milchsäure lös «ng (pH a 3) gequollen· Der gequollene PiIa wurde sodann 1/2 ti lang in Wasser gewaschen und der gewaschene Film wurde in eine Lösung von 200 Mg Cellulase in 10 em? Yasser eingetaucht und 14 h bei 4 *C belassen· Sedann wurde der so behandelte Film auf ein Cellulose» acetat-Substrat aufgebracht und bei Ziaaerteaperatur getrocknet· Der getrocknete FiIa wurde in 1 1 Yasser wahrend 2 Wochen bei k ⁹C gewaschen, bevor er bei den nachstehenden Experimenten der Hydrolyse von Carboxyl-methyl-otLlulese (CMC) verwendet wurde· 50 ca*' 1,5 ^ CMG wurden als Substrat fur den Snzyaversuoh verwendet. Die enzym*tische Aktivität wurde durch Terfelgung der Abnahme der relativen Viskosität des Substrats mit einem Qstwald-Vlskosimeter festgestellt. Zwischen den einzelnen Experimenten wurde der Film mit 2 1 Wasser gewaschen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt*

Tabelle 3 Tersuch Abnahme der relativen Viskosität

während 30 min bei 20 ⁰C

Vergleich 12,90

1 10,75

2 7,74

3 5,60 k 5.43
5 5,27

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Aus diesen Ergebnissen ersieht mn, daß nach, fünf Experimenten der Cellulase-Kollagen-Komplex noch befähigt war, die Viskosität des Substrats auf weniger als die Hälfte des ursprünglichen Wertes zn senken· Während des fünften Versuchs wurde die relative Viskosität des Substrats nach 18 h Reaktionsdauer auf 1,43 gesenkt.

Beispiel 6 (invertaao-Zoin)

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Verwendung eines Invertase-Zein-Komplexes. 2 cwr eines 0,038 mm dioken Zein-Films (mit Formaldehyd gegerbt) wurden in 2 % (Gewicht /Gewicht) 1,5-Pentandiol gequollen. Der Film wurde sedann mit Seidenpapier getrocknet und in eine Enzymlösuag Ton 20Θ mg Invertase in 15 em Wasser eingetaucht und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Der so behandelte Film wurde sodann auf ein Celluloseacetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Die getrocknete ZeIn-Invertase-Komplexmembran wurde bei den nachstehenden Experimenten zur Hydrolyse von Saccharose verwendet.

JlOO owr einer obigen Saccharose-Lösung wurden als Substrat bei der Feststellung der Enzym-Aktivität verwendet. Wie in Beispiel 2 wurde die Enzym-Aktivität in einem Umlaufreaktorsystem polarimetrisch verfolgt* Mach Messung der Aktivität des Komplexes wurde dieser mit 2 1 Wasser gewaschen und wieder verwendet. Die Ergebnisse sind in

Tabelle k zusammengestellt.

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Tabelle k

ZaJtLl der la 2 h invertierte Saccharose Waschungen bei 25 C und pH « 6

1 40

2 16 4 8 6 8

10 6

15 7

Di· enzymatische Aktivität des Invertase-Zein-Komplexes wurde allmählich bei den Waschungen verringert und erreichte schließlich einen stabilen Grenzwert ähnlich dem Kollagen-Invertase-Komplex gemäß Beispiel 2·

Beispiel 7 (Glucose-Isomerase)

Dieses Beispiel zeigt die Bilduag und Verwendung eines Glucose-Isemerase-Kollagen-lteiffiibraBkemplexee« 1 csr ttiiäess 0,025 ■■ dicken Kollagen-Films (während 28 h läei 60 ⁰C und 90 % relativer Feuchtigkeit nacherfeitzt) wurde in einer MilchsäurelSsung (pH =3) gequollen und aodann 5 "ia in fließende· Yasser gewaschen. Der gewaschene FiIa wurde sodann während 16 h bei 2 ⁰C in 55 o» Bnzyalösung eingetaucht. Die verwendete Enzvalösuag hatte eine eazyaatlsohe Gesasitaktivität von 5Λ * 10~⁵ Einheiten (1 Einheit s 1 sol gebildetes Produkt/sin). Der so behandelte FiIa wurde auf Celluloseacetat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet· Man erhielt so einen Glucose-Isomerase-Kollagen-Membrankomplex·

Dieser Membrankomplex wurde dazu verwendet, die Isomerisierung von D-Glucose zu katalysieren· Es wurde bei 60 °C und pH 7,2 mit 50 ml einer 9^ig*n gepufferten Lösung ge-

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- 2k -

arbeitet. Nach 2 h Reaktionsdauer wurde 1 al Reaktions-

lusung entnommen and die gebildete D-Fruoto·· wurde nach der Cystein-Carbazol-Methode (z. Disehe und E* Borenfreund, J. Biel. Chem., 1£2, 583, (1951)) bestirnt. Die anfänglich· Aktivität des Membrankemplexes betrag 8,3 χ 10~ Einheiten. Der Membrankomplex wurde sodann Bit 1,5 1 Wasser gewaschen und vor dem zweiten Versuch während 17h bei k C in 100 er Wasser gelagert. Bei dee zweiten Versuch zeigte sich eine geringe Zunahme der Aktivität, welche wahrscheinlich auf eine Zunahm· der Reaktionsteiaperatur von 60 auf 65 °C während des Versuchs zurückzuführen war. Die enzymatisch· Aktivität betrug 9,0 χ 10~⁶ Einheiten. Sodann wurde der Membrankomplex mit weiteren 1,5 1 Wasser gewaschen und in «i&em dritten Versuch bei 60 ⁰C verwendet. Die Enzym-Aktivität betrug sodann 8,7 χ ΙΟ*"⁶ Einheiten, Beim dritten Versuch werde der Membrankomplex während mehr als 6 h bei 60 ⁰C gehalten. Diese Ergebnisse zeigen die Stabilität und wiederholte Verwendbarkeit des Membrankomplexes.

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE

   1. Enzymatisch aktive Substanz, gekennzeichnet duroh «in· Protein- oder Polypeptid-Membran Mit komplex gebunden·»

   Enzjra,

   2« Enzymatisch aktive Substanz na ob. Anspruch 1, gekennzeichnet duroh eine Trookendicke der Membran von 0,005 ■■ bis 0,1

   3· Enzymatisch aktive Substanz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, daduroh gekennzeichnet, daß das Enzym eine Oxydereductase, eine Transferase, eine Hydroläse, eine Isomerase oder eine verträgliche Misohung derselben ist, insbesondere Lysozym, Urease, Amyläse, Invertase, Cellulase, Glucose-Isomerase oder eine verträgliche Mischung derselben.

   k. Enzymatisch aktive Substanz naoh einem der Ansprüche 1 bis 3, daduroh gekennzeichnet, daß die Membran aus Kollagen oder Zein besteht·

   5· Enzymatisch aktive Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis k, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran auf einem Träger aufgebracht ist, vorzugsweise auf Cellulose· acetat»

   6. Verfahren zur Herstellung der enzymatisch aktiven Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 5» daduroh gekennzeichnet, daß eine Protein- oder Polypeptid-Membran bis zur maximalen Quellungskapazität gequollen wird und sodann in eine wässrige Lösung eines Enzyms eingetaucht wird, bis das Enzym komplex an die Membran gebunden ist·

   BAD ORIGINAL 209846/1249

   7. Verfahren mach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß di· Meabran bei «in·« pH-Wert Ton 2 bie 12 gequollen wird,

   8. Verwendung der enzymatisch aktiven Substanz geaäfl eines der Ansprüche 1 bis 5 zur Hydrolyse tob Stärke, Zellen, Saccharose, Harnstoff und Cellulose und zur Isoaerisieruag von D-Oluoose.

   BAD

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