DE1770882C3 - Natürliche oder synthetische organische, freie Hydroxylgruppen aufweisende Polymere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung - Google Patents

Description

-C₂H₄-NHC

NH,

NH,

oder

-C₂H₄- N(C₂H₅),

enthaltendes Polymeres mit einer Verbindung der allgemeinen Formel

Z N

\ / V
C C

Il I

N N

C
Y

wobei X ein Chlor- oder Fluoratom, Y ein Halogenatom oder einen der Reste

-NH,

- O—CH₂-COOH

-NH-CH₂-COOH -S-CH₂-COOH -NH-C₂H₄-SO₃H

-0-C₄H₈-N(C₂H₅J₃

-NH-C₆H₄-SO₃H

-Q-C₆H₄-COOH

oder

-NH-C₂H₄-OH -0-C₂H₄ -OH

-NH-C₃H₆-NH(C₂H₄OH)₂

und Z ein Halogenatom bedeuten, in an sich bekannter Weise umsetzt.

3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Träger, an welche eine proteolytisches Enzym, eine Hydrolase, eine Dehydrogenase, eine Kinase, eine Oxydase, eine Amidase, ein Antigen oder Antikörper unter Abspaltung eines Halogenatomes, nämlich Chlor oder Fluor vom Triazinring, chemisch gebunden werden.

Die Erfindung betrifft natürliche oder synthetische organische, freie Hydroxylgruppen aufweisende Poly-

mere, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung gemäß den vorstehenden Patentansprüchen.

Bekanntlich kann die Verwendbarkeit von Enzymen als Katalysatoren, und die Verwendung von anderen biologisch aktiven Substanzen, wie Antigenen und Antikörpern, verbessert werden, wenn diese empfindlichen Eiweißkörper an feste Träger gebunden werden. Solche verbesserten Anwendungsmöglichkeiten bestehen beispielsweise darin, daß die an feste Träger gebundenen aktiven Substanzen leichter aus dem Umsetzungsgemisch mit dem umzusetzenden Substrat abgetrennt werden können oder daß die umzusetzende Substratlösung kontinuierlich an den festen Trägern mit den daran gebundenen aktiven Eiweißkörpern vorbeiströmen kann. Ferner ist festgestellt worden, daß die thermische Stabilität eines an einen festen Träger gebundenen Enzyms häufig größer und entsprechend die Empfindlichkeit gegenüber pH-Wert-Schwankungen häufiger kleiner ist als die entsprechenden Eigenschaften freier Enzyme.

Es sind verschiedene Möglichkeiten bekanntgeworden, um Enzyme an feste Träger zu binden. Beispielsweise können nach einem Beitrag von M. A. M i t ζ in Nature 189, Seite 576 (1961) Trypsin und Chymotrypsin über einen überbrückenden Rest an Carboxymethylcellulose und entsprechend Ribonuclease oder Chymotrypsin wiederum über einen überbrückenden Rest an Benzy!cellulose gebunden werden; als überbrückender Rest dient hier jeweils die Azidgruppe. Ferner wurde von R. A χ e η und Mitarbeitern (vgl. Nature 210, Seiten 367,369 (1966) und 214, Seiten 1302/1304 (1967) Peptide und Proteine mittels Halogencyan-Verbindungen oder Isothiocyanaten an Polysacharide gebunden; unter anderem wurden Cellulose, Stärke oder vemetztes Dextran mit wäßrigen Lösungen von Chlorcyan, Bromcyan oder Jodcyan umgesetzt, und diese reaktiven Zwischenprodukte mit Glycol-Leucin oder Chymotrypsin zur Reaktion gebracht. Für ein solches Reaktionsprodukt aus vernetzten! Dextran und Chymotrypsin wird eine enzymatische Aktivität gegenüber ATEE (N-acetyl-tyrosin-äthylester) von etwa 20% der Aktivität des freien Enzyms festgestellt; in gleicher Weise wurde für verschiedene Chymotrypsin-Dextran-Präparate mit Isothiocyanaten als überbrückende Reste eine durchschnittliche enzymatische Aktivität von etwa 25% gefunden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zwischenprodukte aus freie Hydroxylgruppen aufweisenden Polymeren mit überbrückerden Resten für die chemisehe Bindung von Enzymen und anderen biologisch aktiven Substanzen bereitzustellen, welche aufgrund ihrer Reaktivität und sonstigen Eigenschaften besonders gut als Träger für Enzyme und andere biologisch aktive Substanzen geeignet sind.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung brauchbaren organischen Polymere mit freien Hydroxylgruppen können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Geeignete natürliche Polymere sind beispielsweise Cellulose, Stärke, Dextran, vernttztes Dextran oder Proteine wie etwa Wolle; geeignete synthetische Polymere sind beispielsweise Polyvinylalkohol oder teilweise hydrolysiertes Polyvinylacetat. Besonders gute Ergebnisse werden mit Cellulose erhalten, welche dank einer Vorbehandlung Diäthylaniinoäthylreste enthält. Für die praktische Anwendung und Weiterverarbeitung der erfindungsgemäßen Zwischenprodukte hat es sich als besonders zweckmäßig erwiesen, wenn das Polymer die Form eiiics Blattes, etwa eines Filterpapiers, aufweist

Wie bereits ausgeführt, müssen diese erfindungsgemäßen Zwischenprodukte neben den freien Hydroxylgruppen zusätzlich ausgewählte, symmetrisch substituierte Triazinylreste und einen der nachfolgenden Substituenten, nämlich

-C₂H₄NH(C₂H₄OH)₂
-C₂H₄-N(C₂H₅J₃
-C₂H₄-NH₂(C₂H₄-OH)
-C₂H₄-NH₃

-C₂H₄-NHC

NH,

NH,

oder

-C₂H₄-N(C₂H₅),

erhalten. Sowohl die unmittelbaren Substituenten an organischen Polymeren wie die organischen Reste an der s-Triazinylgruppe können in einem wäßrigen Medium mit biologischem pH-Wert eine positive Ladung aufweisen; solche biologischen pH-Werte liegen in der Regel zwischen 2 und 10. insbesondere zwischen 5 und 9.

Eine solche positive Ladung, die an den Resten Y der s-Triazinyl-Gruppe (abgesehen vom Halogenatom) und den Substituenten des Polymers jeweils in wäßrigem Medium bei biologischen pH-Werten auftreten kann, ist von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung. Obwohl die entsprechenden Zusammenhänge noch nicht in allen Einzelheiten geklärt sind, wird vermutet, daß solche positiven Ladungen die Konfiguration des zu bindenden Enzyms (oder der anderen biologischen aktiven Substanzen) in günstiger Weise beeinflußt, so daß sowohl die Reaktion des Enzyms (oder der anderen biologisch aktiven Substanzen) mit den reaktionsbereiten Resten X am Triazinylring unter milden Bedingungen glatt vonstatten geht, als auch das chemisch gebundene Enzym (oder eine andere der biologisch aktiven Substanzen) für die nachfolgende Umsetzung mit einem Substrat in günstiger Konfiguration vorliegt. Darüber hinaus fördern die positiven Ladungen an den Substituenten, welche unmittelbar an das Polymer gebunden sind, die Umsetzung zwischen dem freie Hydroxylgruppen aufweisenden Polymer mit dem substituierten Triazinylrest.

Einige dieser bereits genannten Reste Y am Triazinylring, bzw. der genannten Substituenten, besitzen bereits auf Grund des in diesen Resten enthaltenen quartemären Ammoniumions eine positive Ladung. An anderen, zur Bildung von Zwitterionen befähigten Verbindungen können sich in wäßrigem Medium infolge von Protonenwanderungen Zentren mit positiver Ladung ausbilden. Die verbleibenden Reste und Substituenten werden in wäßrigem Medium bei den vorgesehenen pH-Werten zwischen 2 und 10, insbesondere zwischen 5 und 9, auf Grund ihrer Basizität protoniert und nehmen dadurch eine positive Ladung an. Im Hinblick auf diese Ausführungen werden beispielsweise besonders gute Ergebnisse dann erhalten,

wenn für Y ein Rest mit der folgenden Formel
-NHC₃H₆NH(C₂H₄OH)₂

verwendet wird

Die Einführung der genannten Substituenten in Polymere mit freien Hydroxylgruppen kann nach verschiedenen bekannten Verfahren erfolgen; geeignete Verfahren sind beispielsweise mit den USA.-Patentschriften 26 23 042 und 26 23 041, ferner in Beiträgen in der Kolloid-Zeitschrift 41, S. 152 (1927) und im J.A.C.S. 78, S. 751 <1956) beschrieben.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung dieser Zwischenprodukte kann die Umsetzung zwischen den Polymeren und der Triazinverbindung in wäßrigem Medium durchgeführt werden, wenn beide Ausgangskomponenten in Wasser löslich sind. Dank der Substituenten Y sind die aufgeführten Triazinverbindungen zumeist in Wasser gut löslich. Die Beendigung der Umsetzung zwischen den beiden Komponenten in wäßrigem Medium kann sehr einfach durch Herabsetzung des pH-Wertes erfolgen; eine weitere Möglichkeit besteht in der Zugabe von Natriumchlorid-Lösung.

Wie bereits ausgeführt, können als Reaktionspartner für das organische Polymer auch solche Triazinverbindungen verwendet werden, deren Substituenten lediglich aus Halogenatomen bestehen. Besonders dann, wenn das organische Polymer neben den Hydroxylgruppen solche Substituenten enthält, welche ihrerseits eine primäre Aminogruppe enthalten, dann hat sich die Verwendung von Cyanurchlorid als symmetrisch substituierte Triazinverbindung besonders bewährt Im Anschluß an diese Umsetzung ist es allerdings erforderlich, daß alle Spuren von nicht umgesetztem Cyanurchlorid sorgfältig aus dem Reaktionsprodukt entfernt werden, bevor das Reaktionsprodukt mit dem ausgewählten Enzym oder der sonstigen biologisch aktiven Substanz zur Reaktion gebracht wird. Eine einfache und praktische Möglichkeit zur Entfernung von nichtumgesetztem Cyanurchlorid besteht in der Umsetzung mit N-(3-Aminopropyl)-diäthanolamin.

Ein weiterer Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der obengenannten Zwischenprodukte als Träger, an welche ein proleolytisches Enzym, eine Hydrolase, eine Dehydrogenase, eine Kinase, eine Oxydase, eine Amidase, ein Antigen oder ein Antikörper unter Abspaltung eines Halogenatoms, nämlich Chlor oder Fluor, chemisch gebunden werden. Die chemische Bindung eines dieser ausgewählten Enzyme oder der ausgewählten biologisch aktiven Substanz an das erfindungsgemäße Zwischenprodukt erfolgt dabei über den Triazinring, an dem das Halogenatom X, nämlich Chlor oder Fluor, gegen das Enzym oder die bioligisch aktive Substanz ausgetauscht wird. Im Ergebnis dient somit der Triazinring als überbrückender Rest zwischen organischen Polymeren und dem zu bindenden Enzym, bzw. der zu bindenden biologisch aktiven Substanz.

Bei der Bindung des Enzyms bzw. der biologisch aktiven Substanz an das Zwischenprodukt muß beachtet werden, daß solche Verbindungen in der Regel recht empfindlich sind, so daß bei der Umsetzung hohe Temperaturen und extreme pH-Werte vermieden werden sollen. Zweckmäßigerweise erfolgt die Umsetzung bei Raumtemperatur und möglichst bei neutralem pH-Wert; in einigen Fällen ist es zweckmäßig, bei schwach alkalischem pH-Wert, beispielsweise im Bereich von 7 bis 8,6 zu arbeiten, da in diesem Bereich eine erhöhte Unisetzungsgeschwindigkeit beobachtet wird. Der Austausch des Halogenatoms X am Triazinring gegen das zu bindende Enzym, bzw. die zu bindende biologisch aktive Substanz, hängt weiterhin von der Natur des Restes Y am Triazinring ab. Mit solchen Ausgangsstoffen, wo Y ein Halogenatom bedeutet, kann diese Reaktion in wenigen Minuten abgeschlossen sein; bedeutet Y dagegen einen der anderen obengenannten Reste, so verläuft die Reaktion langsamer und kann bis zur vollständigen Umsetzung

ίο mehrere Stunden erfordern. Nachdem das Enzym oder die biologisch aktive Substanz in der genannten Weise an das erfindungsgemäße Zwischenprodukt gebunden worden ist, werden die im Reaktionsprodukt noch vorhandenen Halogenatome zweckmäßigerweise desaktiviert, was beispielsweise durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem aliphatischen Amin erfolgen kiinn.

Im Rahmen dieser erfindungsgemäßen Verwendung können zahlreiche verschiedene Enzyme oder biologisch aktive Substanzen an die erfindungsgemäßen Zwischenprodukte chemisch gebunden werden. Hierzu gehören beispielsweise Enzyme tierischen, pflanzlichen oder mikrobiologischen Ursprungs, beispielsweise proteolytische Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin und Papain; Hydrolasen wie — Galactosidase, Ribonuclease, ■ Alkali-Phosphatase, Amyloglucosidase und Dextranase; Dehydrogenasen wie Milchsäure-Dehydrogenase; Kinasen wie Kreatin-Phosphokinase und Pyruvat-Kinase; Oxydasen wie Glucose-Oxydase; Amidasen wie etwa Penicillin-Amidase; ferner Antigene und Antikörper.

Als Ergebnis dieser chemischen Bindung eines Enzyms oder dergleichen über Triazinringe an die erfindungsgemäßen Zwischenprodukte wird ein unlöslich gemachtes Enzym bzw. eine unlöslich gemachte biologisch aktive Verbindung erhalten. Für diese unlöslich gemachten höchst aktiven Verbindungen gibt es eine Reihe von Anwendungsmöglichkeiten. Hierzu gehören beispielsweise eine Vielzahl von enzymatisch katalysierten Reaktionen wie etwa die Herstellung von Penicillinen, das Klären von Bier, die Herstellung von Glucose, die Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren oder die Herstellung von L-Alanin durch Transaminierung. Weitere mögliche Einsatzgebiete dieser unlöslich gemachten aktiven Verbindungen sind die saure Hydrolyse von Kohlehydraten, die Verarbeitung von Abfallmaterialien, die gezielte Behandlung oder Veränderung von großen natürlichen Molekülen, wie Steroide, Alkaloide, Chloramphenicol oder Riboflavin; weitere Verwendungsmöglichkeiten sind die alkoholische und andere Gärungsprozesse, die Bindung von Stickstoff, die Bestimmung von A.T.P. mittels einem Luciferase-System, ferner biochemische Brennstoffzellen oder die Bindung von Kohlendioxid. Ein spezieller Verwendungszweck von Enzymen, welche chemisch an die erfindungsgemäßen Zwischenprodukte gebunden sind, ist die enzymatische Analyse, insbesondere die stufenweise erfolgende Analyse von Proteinen, wie etwa Ribonucleinsäure oder Desoxyribonucleinsäure. Weiterhin können solche Präparate zur Analyse von Harn verwendet werden, wobei zweckmäßigerweise im Anschluß an die enzymatische Trennung eine chromatographische Analyse der verschiedenen Bestandteile stattfindet.

Enzyme, welche wie oben beschrieben, über Triazin-

(15 ringe chemisch an die erfindungsgemäß vorgesehenen Polymere gebunden sind, weisen in dieser unlöslich gemachten Form eine überraschend hohe enzymatische Aktivität auf. Nach dem Stand der Technik (vgl.

R. Axe η und Mitarbeiter in Nature 214, Seite 1303 [1967]) weist unlöslich gemachtes Chymotrypsin, das über ßromcyan an vernetztes Dextran gebunden ist, gegenüber ATEE (N-Aceiyl-L-tyrosin-äihylester) etwa 20% der Aktivität des freien Enzyms auf. In gleicher Weise wurde für Chymotrypsin, das über Isothiocyanat-Gruppen an vernetztes Dextran gebunden war, gegenüber ATEE eine enzymatische Aktivität von etwa 14 bis 25% des freien Enzyms festgestellt (vgl. R. A χ e η und Mitarbeiter in Nature, 210, Seite 369 [1966]). Demgegenüber konnte für Chymotrypsin, das an erfindungsgeniäüe Zwischenprodukte gebunden worden war, gegenüber ATEE eine enzymatische Aktivität von 31% der Aktivität des freien Enzyms festgestellt werden, wie den nachfolgenden Ausführungen zu entnehmen ist.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

a) Herstellung von Chlor-carboxy-methylaminos-triazinyl-diäthylaminodiäthyl-Cellulose

5 ml destilliertes Wasser wurden mit 0,1 g 2,4-Dichlor-6-carboxymethylamino-s-triazin versetzt. Durch Zugabe von 1-n-Natriumhydroxid-Lösung wurde der pH-Wert auf 7 eingestellt, wobei das s-Triazin vollständig in Lösung ging. Diese wäßrige s-Triazin-Lösung wurde mit destilliertem Wasser auf 20 ml aufgefüllt und anschließend mit 0,4 g wasserfreiem Natriumcaibonat versetzt, welches sich rasch auflöste. Diese wäßrige Lösung wurde in eine Petri-Schale gegeben und in die Lösung 6 runde Papierblätter aus Cellulose, in welche vorher nach bekannten Verfahren Diäthylaminoäthy!- Gruppen eingeführt worden waren, eingetaucht. Diese Papierblätter wiesen einen Durchmesser von 2,5 cm auf und wurden bei 20 bis 25°C sanft innerhalb der wäßrigen Lösung in der Petri-Schale bewegt. Nach 3 Minuten wurde die wäßrige Lösung mit destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt und durch Zugabe von 1-n-Salzsäure der pH-Wert der Lösung auf etwa 2 herabgesetzt. Anschließend wurden die Papiere aus der angesäuerten Lösung herausgenommen und mit einem Gemisch aus verdünnter 1/50-n-Salzsäuie und Äthanol gewaschen, und im Anschluß daran nochmals mit einer l-n-Natriumchlorid-Lösung und daran anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Papierblätter wurden getrocknet und stellen eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Zwischenprodukts dar.

b) Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung:

Bindung von /i-Galactosidase an Chlor-Carboxymethylamino-s-triazinyl-diäthylaminoäthyl-Cellulose

Auf jedes der nach obigem Verfahren hergestellter Papierblätter, welche aus Chlor-carboxy-methylamino· s-triazinyl-diäthylaminodiäthyl-Cellulose bestehen, wurden 0,5 ml einer Lösung aus 0,005 g jS-Galactosidase ir 0,1 m-Phosphatpufferlösung (pH-Wert 8) aufgebracht Die Papierblätter mit der aufgebrachlen Enzymlösunj; wurden 2 Stunden bei 25"C gehalten. Anschließenc wurde jedes Papierblatt mit einer wäßrigen 2 r Harnstoff'/l-n-Natriumchlorid-Losung so lange gewä sehen, bis im Waschwasser keine enzymatische Aktivi tat festgestellt werden kann. An jedes etwa 0,04 § schwere Papierblatt waren etwa 5 Gew.-% Enzyrr gebunden. Bei der Bestimmung der enzymatischer Aktivität nach üblichen Verfahren wurden für da· gebundene Enzym 25% der Aktivität des freien gelöster Enzyms festgestellt.

Beispiel 2

a) Herstellung von 2,4-Dichlor-s-triazinyldiäthylaminoäthyl-Cellulose

Analog zu dem Beispiel la wurden Papierblätter au: 2,4-Dichlor-s-triazinyl-diäthylaminoäthyl-Cellulose her gestellt.

b) Diese frisch hergestellte Dichlor-s-triazinyl-di äthylaminoäthyl-Cellulose wurde chloridfrei gewaschet und anschließend in 5 ml 0,5 m Phosphatpuffer-Lösunj (pH 8,6) suspendiert: dieser Suspension wurden 2 m wäßrige Chymotrypsin-Lösung (20 mg Enzym/ml) züge setzt. Nach 10 Minuten bei 25°C wurde das Chymotryp sin-Ccllulose-Präparat durch Filtration abgetrennt, mi Phosphatpuffer-Zl-n-Natriumchlorid-Lösung gewä sehen und anschließend mit reinem Wasser gewascher Nach dem üblichen Verfahren (Abschätzung de Extinktionsunterschiede bei 280 nm zwischen den Reaktionsgemisch und dem Filtrat einschlicßlicl Waschwasser) ergab sich für das Chymotrypsin-Cellulo se-Präparat ein Anteil von 170 mg gebundenes Enzyn pro Gramm Präparat. Bei pH 9 zeigte dieses, ausgehen! von einem erfindungsgemäßen Zwischenprodukt herge stellte Chymotrypsin-Cellulose-Präparat in gepufferte! stark ionischer Lösung gegenüber ATEE eine enzymati sehe Aktivität von 31% der Aktivität des freien Enzyms

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Natürliche oder synthetische organische, freie Hydroxylgruppen aufweisende Polymere, als Träger für Enzyme und andere biologische aktive Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie s-Triazinyl-Reste der allgemeinen Formel

N X

Il I

N N

I γ

enthalten, wobei X ein Chlor- oder Fluoratom und Y ein Halogenatom oder einen der Reste

-NH₂

— O — CH₂-COOH -NH-CH₂-COOH -S-CH₂-COOH -NH-C₂H₄-SO₃H

-C)-C₄H₈-N(C₂H₅)., -NH-C₆H₄-SO₃H -0-C₆H₄-COOH -S-C₆H₄ -COOH -NH-C₂H₄-OH

— O — C₂H₄-OH

35

40

oder

-NH-C₁H₆-NH(C₂H₄OH)₂

bedeuten, und ferner die Substituenten

-C₂H₄-NH(C₂H₄OH)₂

-C₂H₄-N(C₂H₅).,

—C₂ H₄ — N H₂(C₂ H₄ — O H)

-C₂H₄-NH,

-C₂H₄-NHC

NH,

NH,

oder

-C₂H₄-N(C₂H₄I₂

enthalten.

2. Verfahren zur Herstellung der Polymeren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein natürliches oder synthetisches, freie Hydroxylgruppen aufweisendes und die Substituenten -C₂H₄-N H(C₂ H₄OH)₂ -C₂H₄-N(C₂H₅)J -C₂H₄-NH₂(C₂H₄-OH) -C₂H₄-NH,